RU2564437C2 - Method of determining general redox activity of phagocytes in nitroblue tetrazolium reduction test for leukaemia of cattle - Google Patents
Method of determining general redox activity of phagocytes in nitroblue tetrazolium reduction test for leukaemia of cattle Download PDFInfo
- Publication number
- RU2564437C2 RU2564437C2 RU2013158431/15A RU2013158431A RU2564437C2 RU 2564437 C2 RU2564437 C2 RU 2564437C2 RU 2013158431/15 A RU2013158431/15 A RU 2013158431/15A RU 2013158431 A RU2013158431 A RU 2013158431A RU 2564437 C2 RU2564437 C2 RU 2564437C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- added
- minutes
- mcl
- cattle
- well
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 22
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 14
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 title description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 3
- MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L tetrazolium blue Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 16
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления у крупного рогатого скота предрасположенности к лейкозу путем исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.The invention relates to veterinary immunology, namely to laboratory research methods, and can be used to identify in cattle a predisposition to leukemia by studying the oxygen-dependent metabolism of neutrophilic granulocytes.
Среди хронических инфекционных болезней сельскохозяйственных животных в последние годы удельный вес лейкоза крупного рогатого скота возрос до 60-63%.Among the chronic infectious diseases of farm animals in recent years, the proportion of leukemia in cattle has increased to 60-63%.
Современная система борьбы с лейкозом базируется на выявлении и удалении из стада больных и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Однако выявить инфицированных животных в инкубационной стадии не удается из-за уровня антител ниже пороговой чувствительности серологических реакций. Поэтому выявление повышенной чувствительности у крупного рогатого скота к инфекции ВЛКРС на основе методов оценки состояния иммунной системы является одним из важных элементов превентивных мер по управлению эпизоотическим процессом.The modern leukemia control system is based on the identification and removal from the herd of patients and those infected with the cattle leukemia virus (VLSC). However, it is not possible to identify infected animals in the incubation stage because of the level of antibodies below the threshold sensitivity of serological reactions. Therefore, the identification of hypersensitivity in cattle to VLSC infection based on methods for assessing the state of the immune system is one of the important elements of preventive measures to control the epizootic process.
Среди интегральных показателей иммунобиологической защиты наиболее адекватным параметром является фагоцитарная активность нейтрофилов крови. Системой фагоцитоза фиксируются многочисленные изменения внутренней среды организма. Особенно показательны в этом отношении нейтрофилы. Обмениваясь в циркуляции каждые 4-5 часов, они как бы фотографируют сдвиги, происходящие в этот период, являясь зеркалом гомеостаза.Among the integral indicators of immunobiological protection, the most appropriate parameter is the phagocytic activity of blood neutrophils. The phagocytosis system fixes numerous changes in the internal environment of the body. Neutrophils are especially indicative in this regard. Exchanging in the circulation every 4-5 hours, they kind of photograph the shifts that occur during this period, being a mirror of homeostasis.
О функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза, позволяет судить исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Одним из основных и наиболее объективных методов исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов является тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который основан на способности гранулоцитов фагоцитировать бесцветный краситель тетразолиевого ряда - НСТ и затем восстанавливать его в нерастворимый формазан темно-синего цвета с помощью НАД Н- и НАДФ Н-оксидаз.The functional state of the key cell of the body's antimicrobial resistance system, which responds to any changes in homeostasis, can be judged by the study of the oxygen-dependent metabolism of neutrophilic granulocytes. One of the main and most objective methods for studying the oxygen-dependent metabolism of neutrophilic granulocytes is the nitro blue tetrazolium test (HCT test), which is based on the ability of granulocytes to phagocytose a colorless dye of the tetrazolium series - HCT and then restore it to an insoluble dark blue formazan using NAD H - and NADPH N-oxidases.
НСТ-тест ставят в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (с антигеном). Спонтанный НСТ-тест отражает степень функционального раздражения нейтрофилов in vivo, являясь своеобразным зеркалом гомеостаза. Индуцированный НСТ-тест характеризует потенциальную способность нейтрофилов ответить «респираторным взрывом» на адекватное раздражение. Отношение показателей индуцированного НСТ к спонтанному тесту рассматривают как биохимический критерий готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу (полному уничтожению объекта) и называют функциональным резервом (Я.А. Юцковская, Е.В. Маркелова и др. / Патент РФ №2216739, кл. G01N 33/52).The HCT test is put in two versions: spontaneous and induced (with antigen). The spontaneous NBT test reflects the degree of functional irritation of neutrophils in vivo, being a kind of mirror of homeostasis. The induced HCT test characterizes the potential ability of neutrophils to respond with a “respiratory burst” to adequate irritation. The ratio of the indices of the induced HCT to the spontaneous test is considered as a biochemical criterion of the neutrophil's readiness for complete phagocytosis (complete destruction of the object) and is called a functional reserve (Ya.A. Yutskovskaya, E.V. Markelova et al. / RF Patent No. 2216739, class G01N 33 / 52).
Известен способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия (патент РФ №2415423, кл. G01N 33/48), который основан на микроскопическом подсчете в камере Горяева нейтрофильных гранулоцитов, содержащих в цитоплазме диформазан. Недостатками данного способа являются отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, и субъективность учета результатов реакции.A known method for determining the functional activity of neutrophils by the reduction reaction of nitro-blue tetrazolium (RF patent No. 2415423, class G01N 33/48), which is based on microscopic counting in the Goryaev chamber of neutrophilic granulocytes containing diformazan in the cytoplasm. The disadvantages of this method are the lack of quantitative registration of oxygen radicals generated by the neutrophil pool, and the subjectivity of taking into account the results of the reaction.
Перспективным в этом плане является исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов с помощью теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), основанного на оптическом измерении экстрагированного диформазана, позволяющего вести автоматизированный учет реакции и, соответственно, объективнее оценить функциональную активность клеток.Promising in this regard is the study of the oxygen-dependent metabolism of neutrophilic granulocytes using the nitro blue tetrazolium test (HCT test), based on the optical measurement of extracted diformazan, which allows automated reaction monitoring and, therefore, an objective assessment of the functional activity of cells.
Наиболее близким техническим решением к заявленному является методика определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия [B.C. Власенко, М.А. Бажин, Т.С. Дудоладова и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации / ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии. - Омск, 2010]. Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов центрифугированием на градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (ППД-туберкулина, БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест). Затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают содержимое лунок, после чего планшеты с ингредиентами инкубируют 20 минут при температуре 37°C. После инкубации планшет с пробами центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g. Отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора и центрифугируют 5 минут при 500 g. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют на иммуно-химическом анализатора при длине волны 630 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. После учета реакции определяют коэффициент стимуляции (К ст. НСТ) по формуле: отношение оптической плотности в стимулированных лунках к оптической плотности в контрольных лунках.The closest technical solution to the claimed one is the method for determining the total redox activity of phagocytes in the test for the reduction of nitro blue tetrazolium [BC Vlasenko, MA Bazhin, T.S. Dudoladova et al. Evaluation of the immune status in cattle with leukemia: guidelines / GNU VNIIIBTZh Russian Agricultural Academy. - Omsk, 2010]. The method for determining the total redox activity of phagocytes in the test for the reduction of nitro blue tetrazolium in cattle leukemia involves the isolation of neutrophilic granulocytes by centrifugation on a density gradient of ficoll-urographin (density 1.077 g / cm 3 ), the introduction of 100 μl of cell suspension into two parallel wells 96- well flat-bottom plate for enzyme immunoassay. 50 μl of buffered saline (PBS) or physiological saline (spontaneous HCT test) is added to one well of the tablet, and 50 μl of stimulant (PPD-tuberculin, BCG) in optimal dilution in PBS or physiological saline (induced HCT test) is added to the other well. ) Then, 50 μl of a 0.15% solution of nitro blue tetrazolium are added to both wells of the tablet and the contents of the wells are gently mixed, after which the ingredient plates are incubated for 20 minutes at 37 ° C. After incubation, the sample plate is centrifuged at 500 g for 10 minutes, the supernatant is separated, 200 μl of absolute ethanol are added, and the solution is centrifuged for 5 minutes at 500 g. The supernatant is separated, 200 μl of physiological saline is added to the cell pellet and centrifuged for 5 minutes at 500 g. To dissolve the formed diformazan, 130 μl of dimexide are added to each well and incubated at 60 ° C for 20 minutes. To visualize the reaction after incubation, 70 μl of a 2 M KOH solution are added to the wells, mixed thoroughly. The reaction results are recorded on an immunochemical analyzer at a wavelength of 630 nm and are expressed in arbitrary units of optical density. After taking into account the reaction, the stimulation coefficient (K st. HCT) is determined by the formula: the ratio of the optical density in the stimulated wells to the optical density in the control wells.
Этот метод позволяет объективно оценивать различные состояния иммунной системы, в том числе выявлять иммунную недостаточность, вызванную вирусом лейкоза, но только в комплексе с другими иммунологическими параметрами после обработки полученных данных с помощью дискретно-динамического анализа. Отдельно взятый метод не позволяет достаточно эффективно выявить животных с предрасположенностью к лейкозу.This method allows you to objectively assess various conditions of the immune system, including detecting immune deficiency caused by the leukemia virus, but only in combination with other immunological parameters after processing the data using discrete-dynamic analysis. A single method does not allow sufficiently effective identification of animals with a predisposition to leukemia.
Техническим результатом заявленного способа является повышение точности и достоверности при выявлении животных с повышенной чувствительностью к инфекции ВЛКРС.The technical result of the claimed method is to increase the accuracy and reliability in identifying animals with hypersensitivity to infection of VLSC.
Технический результат достигается тем, что способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°C, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.The technical result is achieved by the fact that the method for determining the total redox activity of phagocytes in the test for the reduction of nitros blue tetrazolium in cattle leukemia involves the isolation of neutrophilic granulocytes from venous blood of cattle by centrifugation in a density gradient of ficoll-urographin (density 1,077 g / cm 3 ) , introducing 100 μl of cell suspension into two parallel wells of a 96-well flat-bottom plate for enzyme-linked immunosorbent assay, add to one well of the tablet 50 μl of buffered saline (PBS) or physiological saline (spontaneous HCT test), and in another 50 μl of stimulant (BCG) in optimal dilution in PBS or physiological saline (induced HCT test), then add to both wells of the tablet 50 μl of a 0.15% solution of nitros blue tetrazolium are mixed, incubated for 20 minutes at 37 ° C, centrifuged at 500 g for 10 minutes, the supernatant is separated, 200 μl of absolute ethanol are added and the solution is centrifuged for 5 minutes at 500 g, the supernatant is separated in cellular the first precipitate was added 200 μl of physiological saline, centrifuged for 5 minutes at 500 g, 130 μl of dimexide was added to each well and incubated at 60 ° C for 20 minutes, 70 μl of a 2 M KOH solution was added, mixed thoroughly, the reaction results were recorded using an immunochemical analyzer and expressed in arbitrary units of optical density, after taking into account the reaction, determine the stimulation coefficient, when determining the level of induced activity, 50 μl of levamisole in a final concentration of 0.5 μg / ml are additionally added to the well, the results of the op reaction edelyayut by the difference of the extinction at a wavelength of 630 and 490 nm stimulation factor (COP), defined as the ratio of the induced levels of cellular activity in spontaneous level at KS≤0,95 animal is considered sensitive to leukemic infection in cattle.
Отличительными признаками предложенного способа являются: при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола, а учет результатов реакции регистрируется по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Использование двухволнового метода измерения рекомендуется для уменьшения ошибок, вызванных присутствием в растворе посторонних окрашенных веществ или его мутностью [М.А. Годков, В.Ю. Зинкин / Патент РФ №2218567, кл. G01N 33/52 от 10.12.2003].Distinctive features of the proposed method are: when determining the level of induced activity, 50 μl of levamisole is additionally added to the well, and the reaction results are recorded by the difference in extinctions at a wavelength of 630 and 490 nm. The use of the two-wave measurement method is recommended to reduce errors caused by the presence of foreign colored substances in the solution or its turbidity [M.A. Godkov, V.Yu. Zinkin / RF Patent No. 22218567, cl. G01N 33/52 of 12/10/2003].
Левамизол - левовращающий оптический изомер тетрамизола, оказывающий влияние на механизмы иммунологической защиты организма. Основное его действие проявляется в усилении активности фагоцитов и Т-лимфоцитов в иммунологически дефектном организме, но не у здоровых [Последние достижения в клинической иммунологии / Под ред. Р.А. Томпсона. - М.: Медицина, 1983. - С.465-472].Levamisole is a levorotatory optical isomer of tetramisole, which affects the mechanisms of immunological defense of the body. Its main effect is manifested in increased activity of phagocytes and T-lymphocytes in an immunologically defective organism, but not in healthy ones [Recent advances in clinical immunology / Ed. R.A. Thompson. - M .: Medicine, 1983. - S.465-472].
Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.The invention is illustrated by specific examples of the method.
Пример 1. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве отбирают кровь от 5 коров, которых по результатам диагностических исследований признают носителями ВЛКРС (РИД-позитивные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по предлагаемому способу для изучения влияния различных концентраций левамизола (0,01; 0,1; 0,5; 5 и 50 мкг/мл) на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной вакциной БЦЖ активности. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.Example 1. In a dysfunctional leukemia farm, blood is taken from 5 cows, which, according to the results of diagnostic studies, are recognized as carriers of VLCKR (RID-positive). A blood test is carried out by stating the reduction reaction of nitro-blue tetrazolium according to the proposed method for studying the effect of various concentrations of levamisole (0.01; 0.1; 0.5; 5 and 50 μg / ml) on the optical density of the diformazan solution when determining the level of BCG vaccine-induced activity . The results of the studies are presented in table 1.
m±M
m ±
Из таблицы 1 видно, что линейное увеличение плотности наблюдается при увеличении концентрации левамизола от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Дальнейший подъем концентрации левамизола приводил к нелинейному изменению оптической плотности и даже ее уменьшению. Таким образом, для оценки восстановительно-окислительного метаболизма нейтрофилов у инфицированных ВЛКРС животных предпочтительно использовать левамизол в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.From table 1 it is seen that a linear increase in density is observed with an increase in the concentration of levamisole from 0.01 to 0.5 μg / ml. A further increase in the concentration of levamisole led to a nonlinear change in the optical density and even its decrease. Thus, it is preferable to use levamisole in a final concentration of 0.5 μg / ml to assess the redox metabolism of neutrophils in VLCC-infected animals.
Пример 2. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве исследуют 15 коров, которых по результатам диагностических исследований делят на 2 группы: 1-я группа - 5 здоровых (не реагирующих в РИД) коров и 2 группа - 10 животных вирусоносителей (РИД-положительные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.Example 2. In a dysfunctional leukemia farm, 15 cows are examined, which, according to the results of diagnostic studies, are divided into 2 groups: group 1 - 5 healthy (non-responsive to RID) cows and group 2 - 10 virus-carrying animals (RID-positive). A blood test is carried out by stating the reduction reaction of nitro-blue tetrazolium according to the known method and the proposed method with the addition of levamisole in determining the level of induced activity.
С этой целью выделяют нейтрофильные гранулоциты из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см3, затем в три параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл клеточной взвеси. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл, на пример физиологического раствора, (спонтанный НСТ-тест), в другую - 50 мкл предварительно растворенную, на пример, в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) вакцину БЦЖ и 50 мкл левамизола в конечной концентрации, не превышающей 0,5 мкг/мл (индуцированный вариант по предлагаемому способу), а в третью - вакцину БЦЖ в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) (индуцированный вариант по известному способу).To this end, neutrophilic granulocytes are isolated from venous blood of cattle by centrifugation in a density gradient of ficoll-urographin of 1.077 g / cm 3 , then 100 μl of cell suspension is introduced into three parallel wells of a 96-well flat-bottom plate for enzyme-linked immunosorbent assay. 50 μl, for example, physiological saline (spontaneous HCT test), is added to one well of the tablet, 50 μl previously dissolved, for example, BCG vaccine and 50 μl of levamisole at a final concentration, for example, in physiological saline (1000 μg / ml), not exceeding 0.5 μg / ml (induced variant according to the proposed method), and in the third - BCG vaccine in physiological saline (1000 μg / ml) (induced variant according to the known method).
Затем в лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15%-ного раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают. После внесения всех ингредиентов планшет с пробами инкубируют 20 минут при 37°C. Затем для остановки реакции и осаждения клеток, содержащих диформазан, планшет центрифугируют при 500 g 10 минут (например, на центрифуге LU-418, приспособленной для центрифугирования планшетов). Для фиксации осажденных клеток и последующего отмывания фиксированных клеток сначала отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и центрифугируют раствор 5 минут при 500 g и затем добавляют 200 мкл физиологического раствора и вновь центрифугируют в том же режиме. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют в его присутствии при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН и тщательным перемешиванием добиваются равномерного окрашивания раствора, результаты реакции регистрируют на иммунохимическом анализаторе по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. Затем определяют коэффициент стимуляции как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню.Then, 50 μl of a 0.15% solution of nitro blue tetrazolium are added to the wells of the plate and gently mixed. After making all the ingredients, the sample plate is incubated for 20 minutes at 37 ° C. Then, to stop the reaction and precipitate the cells containing diformazan, the plate is centrifuged at 500 g for 10 minutes (for example, on a LU-418 centrifuge adapted for centrifuging tablets). To fix the precipitated cells and then wash the fixed cells, the supernatant was first separated, 200 μl of absolute ethanol was added and the solution was centrifuged for 5 minutes at 500 g, and then 200 μl of physiological saline was added and centrifuged again in the same mode. To dissolve the formed diformazan, 130 μl of dimexide are added to each well and incubated in its presence at 60 ° C for 20 minutes. To visualize the reaction after incubation, 70 μl of a 2 M KOH solution is added to the wells and uniform mixing of the solution is achieved, the reaction results are recorded on an immunochemical analyzer by the difference in extinctions at a wavelength of 630 nm and 490 nm and are expressed in arbitrary units of optical density. Then determine the coefficient of stimulation as the ratio of the induced level of cellular activity to a spontaneous level.
В таблице 2 представлены результаты постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике (одно- и двухволновым методом) и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.Table 2 presents the results of the reduction reaction of nitro-blue tetrazolium according to the known method (single and two-wave method) and the proposed method with the addition of levamisole in determining the level of induced activity.
Из таблицы 2 видно, что у носителей ВЛКРС происходит усиление функциональной активности нейтрофилов в спонтанном и особенно в индуцированном варианте при постановке НСТ известным способом (259,12±9,59, 208,4±12,33 у.е. оп. пл.; Р<0,01).From table 2 it is seen that in carriers of VLCRS there is an increase in the functional activity of neutrophils in spontaneous and especially in the induced version when staging NBT in a known manner (259.12 ± 9.59, 208.4 ± 12.33 cu op. ; P <0.01).
Несколько иная картина наблюдается при постановке НСТ известным способом с использованием длины волны 630 нм. Отмечено недостоверное снижение показателей в спонтанном варианте (882,75±44,0, 986,8±39,5 у.е. оп. пл.; Р>0,05) при отсутствии выраженных изменений при стимуляции БЦЖ.A somewhat different picture is observed when staging the NBT in a known manner using a wavelength of 630 nm. An insignificant decrease in indices was observed in the spontaneous variant (882.75 ± 44.0, 986.8 ± 39.5 cu.e. opt. Pl; P> 0.05) in the absence of pronounced changes during BCG stimulation.
При постановке предлагаемым способом у инфицированных животных также установлено увеличение количества активированных нейтрофилов, однако не достигало достоверной разницы (236,37±9,07, 209,2±20,09 у.е. оп. пл.; Р>0,05).When staged by the proposed method in infected animals, an increase in the number of activated neutrophils was also found, but did not reach a significant difference (236.37 ± 9.07, 209.2 ± 20.09 cu op.pl .; P> 0.05) .
Следует отметить, что важным показателем НСТ-теста явилось не столько его повышение в спонтанном и индуцированных вариантах, сколько соотношение между стимулированным и спонтанным, т.е. коэффициент стимуляции (КС). Так, у носителей ВЛКРС при постановке НСТ известным способом при использовании как одно-, так и двухволнового метода этот показатель изменялся незначительно, тогда как при постановке предлагаемым способом с высокой степенью достоверности уменьшался (0,77±0,07, 1,11±0,12; Р<0,05).It should be noted that an important indicator of the HCT test was not so much its increase in spontaneous and induced variants, as the ratio between stimulated and spontaneous, i.e. stimulation coefficient (COP). So, for VLKRS carriers, when staging the NBT in a known manner, when using both the single and two-wave method, this indicator changed insignificantly, while when setting by the proposed method with a high degree of reliability it decreased (0.77 ± 0.07, 1.11 ± 0 , 12; P <0.05).
Таким образом, исходно низкий показатель стимулированной реакции по отношению к спонтанной у животных, инфицированных ВЛКРС, при постановке предлагаемым методом, свидетельствует о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов и, как следствие, высокой чувствительности к инфекции ВЛКРС.Thus, the initially low rate of a stimulated reaction with respect to spontaneous in animals infected with VLCC, when formulated by the proposed method, indicates a decrease in the body's resistance and low microbicidal activity of neutrophils and, as a result, a high sensitivity to VLCC infection.
Пример 3. Проводят исследование крови у 20 коров из благополучного по лейкозу хозяйства и у 20 из неблагополучного по лейкозу хозяйства путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известному способу и по предлагаемому способу. Вычисляют коэффициент стимуляции, по результатам которого животных делят на 3 группы. В 1-ю группу включают коров с низкими значениями коэффициента (КС≤0,95); во 2-ю - с КС от 0,96 до 1,10 и 3-ю - с высокими (КС≥1,11).Example 3. A blood test is carried out in 20 cows from a leukemia-friendly economy and in 20 from a leukemia-poor economy by setting up a nitro-blue tetrazolium reduction reaction by a known method and by the proposed method. The stimulation coefficient is calculated, according to the results of which the animals are divided into 3 groups. The 1st group includes cows with low coefficient values (KS≤0.95); in the 2nd - with CS from 0.96 to 1.10 and the 3rd - with high (COP ≥1.11).
Полученные данные были сопоставлены с результатами диагностических исследований на лейкоз (табл.3, 4). С этой целью ставили реакцию иммунодиффузии (РИД), основанную на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Животных, сыворотка крови которых дали положительный результат в РИД, признавали зараженными вирусом лейкоза и исследовали гематологическим методом, заключающимся в подсчете лейкоцитов в единице объема крови. При обнаружении повышенного их количества выводили лейкоцитарную формулу и оценивали статус животного по лейкозу согласно «лейкозному ключу» как здорового, подозрительного по заболеванию лейкозом или больного лейкозом [Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. - 2000. - №13-7-2/2130].The data obtained were compared with the results of diagnostic studies for leukemia (Tables 3, 4). For this purpose, an immunodiffusion reaction (RID) was set up based on the detection of specific antibodies to cattle leukemia virus antigens in blood serum. Animals whose blood serum tested positive in RID were recognized as infected with the leukemia virus and examined by the hematological method, which consists in counting leukocytes per unit volume of blood. If an increased number of them was detected, the leukocyte formula was derived and the animal’s leukemia status was assessed according to the “leukemia key” as a healthy, suspicious leukemia patient or patient with leukemia [Guidelines for the diagnosis of cattle leukemia / Department of Veterinary, Ministry of Agriculture of Russia. - 2000. - No. 13-7-2 / 2130].
При исследовании сыворотки крови в РИД от коров из благополучного хозяйства носителей ВЛКРС не было выявлено.In the study of blood serum in the RID from cows from a prosperous farm carriers VLKRS was not detected.
хозяйства (n=20)Values of stimulation coefficient in animals from safe
households (n = 20)
Из таблицы 3 видно, что у 90% животных из благополучного по лейкозу хозяйства при постановке НСТ-теста предлагаемым способом отмечена высокая микробицидная активность нейтрофилов (КС составил 1,11 и выше), тогда как при проведении НСТ-теста известным способом было установлено только 30% таких коров.From table 3 it is seen that in 90% of the animals from a leukemia-friendly farm, when setting up the NBT test, the proposed method showed a high microbicidal activity of neutrophils (CS was 1.11 and higher), while when conducting the NBT test in a known manner, only 30 % of such cows.
В неблагополучном хозяйстве при постановке известным способом (табл. 4) снижение коэффициента стимуляции ниже отметки 0,95 было отмечено у 12 из 20 животных (60%). При этом 8 животных являлись носителями ВЛКРС, а остальные 4 были РИД-отрицательными. В то же время при постановке предлагаемым способом со сниженным коэффициентом выявлено на 15% коров больше (75%), из них подавляющая часть была инфицирована ВЛКРС (11 из 15 голов), и только 4 животных были РИД-отрицательными.In a dysfunctional farm, when set up in a known manner (Table 4), a decrease in the stimulation coefficient below 0.95 was observed in 12 of 20 animals (60%). At the same time, 8 animals were carriers of VLCCR, and the remaining 4 were RID-negative. At the same time, when staged by the proposed method with a reduced coefficient, 15% more cows (75%) were detected, of which the overwhelming majority was infected with VLCCR (11 out of 15 animals), and only 4 animals were RID-negative.
Следует отметить, что среди 3-х животных с высоким значением коэффициента при постановке НСТ предлагаемым способом только у одного были обнаружены специфические антитела к антигенам ВЛКРС, при этом КС был резко повышен и составил 10,13. Дополнительным исследованием это животное было признано больным в гематологической стадии. Резкое повышение НСТ-положительных нейтрофилов и, как следствие, коэффициента стимуляции у больного лейкозом связано с развитием инфекционно-воспалительного осложнения. Об этом также могут свидетельствовать данные научной литературы [Тест восстановления нитросинего тетразолия у здоровых людей и больных острым лейкозом / В.Е. Логинский, В.В. Короткий // Лаб. дело. - 1978. - №1. - С.3-5].It should be noted that among 3 animals with a high coefficient when staging NBT by the proposed method, only one revealed specific antibodies to VLSC antigens, while the CS was sharply increased and amounted to 10.13. An additional study of this animal was recognized as a patient in the hematological stage. A sharp increase in HCT-positive neutrophils and, as a result, the stimulation coefficient in a patient with leukemia is associated with the development of an infectious-inflammatory complication. This can also be evidenced by the data of the scientific literature [Test recovery nitrosine tetrazolium in healthy people and patients with acute leukemia / V.E. Logininsky, V.V. Short // Lab. a business. - 1978. - No. 1. - S.3-5].
из неблагополучного хозяйства (п=20)The values of the coefficient of stimulation in animals
from a dysfunctional economy (n = 20)
Менее точные результаты получены при проведении НСТ известным способом. Так, с высокой активностью нейтрофилов (КС≥1,11) было установлено 5 коров, из них носителями ВЛКРС являлись 3, в том числе гембольная (КС=16,7), как и в случае постановки реакции предлагаемым способом.Less accurate results were obtained when conducting HCT in a known manner. So, with high activity of neutrophils (KS≥1.11), 5 cows were found, of which 3 VLKRS carriers were 3, including gembol (KS = 16.7), as in the case of setting the reaction by the proposed method.
Таким образом, результаты оценки окислительно-восстановительного метаболизма нейтрофилов в НСТ-тесте у коров из благополучного и неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота позволяют прийти к выводу о том, что высокая чувствительность к инфекции ВЛКРС отмечается при значениях КС≤0,95. При этом предлагаемый способ позволяет более точно и достоверно проводить оценку чувствительности к инфекции ВЛКРС и дает возможность диагностировать развитие инфекционно-воспалительных процессов у больных лейкозом животных.Thus, the results of evaluating the oxidation-reduction metabolism of neutrophils in the NBT test in cows from safe and unsuccessful cattle for leukemia lead to the conclusion that a high sensitivity to VLCRS infection is observed at values of CS ≤ 0.95. Moreover, the proposed method allows a more accurate and reliable assessment of the sensitivity to infection of VLSC and makes it possible to diagnose the development of infectious and inflammatory processes in patients with leukemia of animals.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013158431/15A RU2564437C2 (en) | 2013-12-26 | 2013-12-26 | Method of determining general redox activity of phagocytes in nitroblue tetrazolium reduction test for leukaemia of cattle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013158431/15A RU2564437C2 (en) | 2013-12-26 | 2013-12-26 | Method of determining general redox activity of phagocytes in nitroblue tetrazolium reduction test for leukaemia of cattle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013158431A RU2013158431A (en) | 2015-07-20 |
| RU2564437C2 true RU2564437C2 (en) | 2015-09-27 |
Family
ID=53611231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013158431/15A RU2564437C2 (en) | 2013-12-26 | 2013-12-26 | Method of determining general redox activity of phagocytes in nitroblue tetrazolium reduction test for leukaemia of cattle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2564437C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996042015A2 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Coulter International Corp. | Reagent and method for differential determination of leukocytes in blood |
| RU2408018C2 (en) * | 2008-12-22 | 2010-12-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИБТЖ СО Россельхозакадемии) | Method for assessment of cattle immune status in case of leucosis |
| RU2465588C1 (en) * | 2011-04-22 | 2012-10-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственный наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Diagnostic technique for cattle leukaemia |
-
2013
- 2013-12-26 RU RU2013158431/15A patent/RU2564437C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996042015A2 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Coulter International Corp. | Reagent and method for differential determination of leukocytes in blood |
| RU2408018C2 (en) * | 2008-12-22 | 2010-12-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИБТЖ СО Россельхозакадемии) | Method for assessment of cattle immune status in case of leucosis |
| RU2465588C1 (en) * | 2011-04-22 | 2012-10-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственный наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Diagnostic technique for cattle leukaemia |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВЛАСЕНКО B.C. И ДР. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации. ГНУ СО Россельхозакадемии. Омск, 2010. с.1-31. МОРОЗОВА О.В. И ДР. Оценка чувствительности лимфоцитов к левамизолу у крупного рогатого скота при лейкозе// Ветеринарный врач, 2012, N5, с.36-39. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013158431A (en) | 2015-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kettner et al. | Thrombocytopaenia in canine babesiosis and its clinical usefulness | |
| Yang et al. | Small intestinal bacterial overgrowth and evaluation of intestinal barrier function in patients with ulcerative colitis | |
| RU2564437C2 (en) | Method of determining general redox activity of phagocytes in nitroblue tetrazolium reduction test for leukaemia of cattle | |
| RU2180116C1 (en) | Method for evaluating ecological situation influence on population immunity status | |
| RU2465588C1 (en) | Diagnostic technique for cattle leukaemia | |
| RU2084894C1 (en) | Method of diagnosing syphilis | |
| Knotkova et al. | Blood profile in captive adult male leopard geckos (Eublepharis macularius). | |
| RU2549467C1 (en) | Method of determination of atherogenicity of immune complexes | |
| Makdam et al. | Relationship between Cystatin C with some hematological and biochemical parameters in neonatal calf diarrhea | |
| Rajković et al. | “Slow kill” treatment reduces DNA damage in leukocytes of dogs naturally infected with Dirofilaria immitis | |
| EP4244622B1 (en) | Method for diagnosing and monitoring sepsis | |
| US11913960B2 (en) | ELISA assay for measuring function of properdin and kits for conducting ELISA assays using anti-properdin antibodies | |
| RU2143696C1 (en) | Method of detection of sensibilization to medicinal allergens | |
| Ajayi Ajetomobi et al. | Kidney Function in Children with Severe Malaria Seen at the University of Ilorin Teaching Hospital, Ilorin | |
| RU2310196C2 (en) | Method for determination of sympatic-adrenal system activity | |
| Wagener et al. | Hyperfructosaminemia in alpacas (Vicugna pacos) is associated with hyperglycemia, hypofructosaminemia with decreased plasma proteins, and poor nutritional status | |
| Kaneva et al. | Study of eosinophil cationic protein serum levels in patients with toxocariasis | |
| RU2283498C1 (en) | Method for obtaining erythrocytic antigen for reaction of indirect hemagglutination in case of brucellosis | |
| RU2415423C2 (en) | Method for determining neutrophil capacity by nitroblue tetrazolium reduction reaction | |
| WO2014081933A1 (en) | Method of hemoglobin-f determination | |
| RU2549466C1 (en) | Instant method for assessing atherogenicity of immune complexes of human blood serum | |
| RU2811001C1 (en) | Method of predicting effector failure of cytotoxic cells by increasing concentrations of scd54, scd56, scd71 molecules in the blood | |
| Mondal et al. | Journal of Bioscience and Environment Research | |
| Ajetomobi et al. | Kidney Function in Children with Severe Malaria Seen at the University of Ilorin Teaching Hospital, Ilorin | |
| RU2008676C1 (en) | Method for assessing dysfunction of polymorphous-nuclear lymphocytes in case of purulent-septic infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171227 |