RU2478702C2 - ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И/ИЛИ НИЗКОГО pН В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК - Google Patents
ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И/ИЛИ НИЗКОГО pН В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2478702C2 RU2478702C2 RU2009139054/10A RU2009139054A RU2478702C2 RU 2478702 C2 RU2478702 C2 RU 2478702C2 RU 2009139054/10 A RU2009139054/10 A RU 2009139054/10A RU 2009139054 A RU2009139054 A RU 2009139054A RU 2478702 C2 RU2478702 C2 RU 2478702C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- cell culture
- cells
- culture
- temperature
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 124
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 200
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 174
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 173
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 93
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 31
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 46
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims description 29
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 140
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 72
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 68
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 68
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 62
- 239000000047 product Substances 0.000 description 55
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 29
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 29
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 13
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 12
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 12
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 12
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 9
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 8
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 7
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 5
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 4
- -1 Lex-A Proteins 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 4
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 3
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 2
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 2
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 1-butoxybutane Chemical compound CCCCOCCCC DURPTKYDGMDSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004066 1-hydroxyethyl group Chemical group [H]OC([H])([*])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- KVZLHPXEUGJPAH-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylpropanoic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O.CC(O)C(O)=O KVZLHPXEUGJPAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014447 Complement C1q Human genes 0.000 description 1
- 108010078043 Complement C1q Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017511 Interleukin-13 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000282852 Lama guanicoe Species 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100425758 Mus musculus Tnfrsf1b gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 101150009046 Tnfrsf1a gene Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- BMLSTPRTEKLIPM-UHFFFAOYSA-I calcium;potassium;disodium;hydrogen carbonate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].OC([O-])=O BMLSTPRTEKLIPM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000001739 density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008356 dextrose and sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N dipropyl ether Chemical compound CCCOCCC POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 102000035123 post-translationally modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005626 post-translationally modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- KIRKGWILHWJIMS-UHFFFAOYSA-K trisodium;1-amino-4-[4-[[4-chloro-6-(2-sulfonatoanilino)-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-3-sulfonatoanilino]-9,10-dioxoanthracene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S([O-])(=O)=O)C=C1NC(C=C1S([O-])(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O KIRKGWILHWJIMS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
- C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белка, представляющего собой растворимый рецептор, в культуре клеток млекопитающего, и может быть использовано в медицине для получения фармацевтических композиций растворимого рецептора. Способ предусматривает: (а) выращивание клеток млекопитающего в культуре при пониженной температуре в диапазоне от 27,0°С до менее чем 30,0°С; и (b) выращивание клеток в культуре при пониженном рН в диапазоне от 6,8 до менее чем 7,0. Вариант способа предусматривает: (а) выращивание указанной культуры клеток в диапазоне температур от 27,0°С до менее чем 30,0°С; причем уровень гликозилирования получаемого белка увеличивается при увеличении температуры или уменьшается при уменьшении температуры до определенного заранее уровня; и (b) выращивание указанной культуры клеток в диапазоне рН от 6,8 до менее чем 7,0; причем уровень гликозилирования получаемого белка увеличивается при увеличении рН или уменьшается при уменьшении рН до определенного заранее уровня. Изобретение позволяет получить белковый продукт - растворимый рецептор со сниженным количеством неправильно свернутых и/или агрегированных молекул. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 45 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно Предварительной Заявке США сер. №60/913,382, поданной 23 апреля, 2007, включенной в текст настоящей заявки в полном объеме посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к способам улучшения продуцирования белков культивируемыми клетками, в частности клетками млекопитающих. В частности, данное изобретение относится к способам получения белкового(ых) продукта(ов), например, гликопротеинового(ых) продукта(ов), в которых характеристики белкового продукта контролируют путем манипуляций с условиями, в которых находится культура клеток. Изобретение также относится к способам повышения терапевтической эффективности и/или иммуногенности белкового(ых) продукта(ов), например, гликопротеинового продукта(ов), продуцируемых клетками млекопитающих, например, путем управления гликозилированием белков и снижения агрегации и неправильного сворачивания белка за счет снижения температуры и/или рН клеточной культуры.
Уровень техники
[0003] Большую часть продуктов биотехнологии как коммерчески доступных, так и находящихся на стадии разработки, составляют белковые терапевтические средства. Существует значительная и продолжающая расти потребность в получении белка в культуре клеток животных, а также в улучшенных способах такого получения. Такие улучшенные способы нужны, поскольку клеточный аппарат клетки животного, как правило, должен вырабатывать много форм белковых лекарственных средств, таких как белки, подвергшиеся посттрансляционной модификации, в частности гликозилированные белки.
[0004] Обычной проблемой, возникающей при применении способов крупномасштабного получения терапевтических белков, является то, что значительную часть белкового продукта получают в неправильно свернутой или агрегированной форме, т.е. в форме агрегатов высокой молекулярной массой («HMWA»). Например, повышенная рекомбинантная экспрессия полипептидов в клетках может вызвать перегрузку аппарата эндоплазматического ретикулума (ЭР), что приводит к тому, что повышенное количество неправильно свернутых и/или агрегированных белков ускользает от механизма разрушения и выходит из ЭР. Таким образом, современные способы получения белка могут давать большую долю продукта, являющегося агрегированным, нефункциональным и, следовательно, бесполезного. Присутствие неправильно свернутого и/или агрегированного белка нежелательно, поскольку это может привести к неблагоприятным явлениям после введения, включая, но не ограничиваясь, возможную иммуногенность при введении (например, активацию комплемента или анафилаксию). Таким образом, избыточное неправильное сворачивание и/или агрегация терапевтического белка может привести к неудаче, например, в клинических испытаниях. В связи с этим, в данной области существует необходимость в новых способах ограничения или снижения неправильного сворачивания и/или агрегации белка.
[0005] Гликозилирование белков является обычным процессом посттрансляционной модификации, в ходе которого к поверхности белка в ЭР под действием ряда специализированных ферментов, гликотрансфераз и гликозидаз, присоединяются фрагменты сложных сахаров. Этот процесс может регулировать правильную укладку новосинтезированных полипептидов таким образом, чтобы только правильно свернутые белки могли покинуть ЭР, а неправильно свернутые подвергались расщеплению (разрушению). Характер гликозилирования белков влияет на нацеливание белков на их мишени, структуру, термодинамическую стабильность и ферментативную активность (см., напр., Solá et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2133-52; Solá and Griebenow (2006) FEBS Lett. 580:1685-90). Например, сиалирование N-гликанов связано с увеличением периода полужизни гликопротеинов, поскольку такие гликопротеины не распознаются рецепторами асиалогликопротеинов, которые направленно расщепляют несиалированные белки (см., напр., Bork et al. (2007) FEBS Letters 581:4195-98). Таким образом, изменения гликозилирования белков могут влиять на качество и эффективность продукта.
[0006] Более того, нарушенное гликозилирование белков может стать причиной иммуногенности конечного терапевтического белкового продукта. К белкам, продуцируемым в неприродных, субоптимальных условиях, могут присоединяться сахара и комбинации сахаров, не встречающиеся в природе на поверхности белков человека, что может привести к возникновению у пациента иммунной реакции (Jefferis (2006) Biotechnol. Prog. 21:11-16). Такое неприродное гликозилирование особенно часто встречается в таких белковых терапевтических средствах, как терапевтические средства на основе антител, например, терапевтические средства, содержащие белки слияния, содержащие Fc, например, терапевтические средства, содержащие белки слияния, содержащие растворимый Fc-рецептор.
[0007] По этим причинам Федеральное Управление по Лекарственным Средствам (FDA) требует, чтобы профили гликоформ терапевтических белков поддерживались в строгих рамках. Таким образом, в фармацевтической промышленности существует необходимость в способе получения терапевтических белков в культуре клеток, который позволял бы контролировать уровень гликозилирования белков.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Таким образом, настоящее изобретение представляет собой способ получения белка в культуре клеток, включающий не менее одного из: (а) выращивание клеток в культуре клеток при пониженной температуре; и (b) выращивание клеток в культуре клеток при пониженном рН; что обеспечивает снижение образования неправильно свернутых и/или агрегированных белков. Как вариант, клетки выращивают в культуре клеток при пониженной температуре и при пониженных значениях рН.
[0009] В предпочтительных вариантах реализации настоящее изобретение относится к изменению параметров рН и температуры, обеспечивающему снижение образования неправильно свернутых и/или агрегированных белков в культуре клеток млекопитающего, и в частности, в культуре клеток яичника китайского хомячка («СНО»). В предпочтительных вариантах реализации культура клеток продуцирует белок («получаемый белок», «продуцируемый белок»), представляющий собой растворимый рецептор, например, помимо прочих, белки TNFR-Fc или sIL-13R. В этих предпочтительных вариантах реализации пониженная температуре может лежать в диапазоне от 27.0°С до менее 30.0°С. В других предпочтительных вариантах реализации пониженный рН лежит в диапазоне от 6.80 до менее 7. Также можно использовать комбинацию рН и температуры в указанных выше диапазонах.
[0010] Согласно другому аспекту, изобретение представляет собой способ получения белка в культуре клеток, причем уровень гликозилирования получаемого белка регулируют путем изменения температуры и/или рН культуры клеток. Таким образом, уровень гликозилирования, например, без ограничения, сиалирование N-гликанов, можно повысить путем повышения температуры и/или рН или снизить путем понижения температуры и/или рН.
[0011] Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение представляет собой способ получения терапевтического белка при контроле параметров, указанных выше. Согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую терапевтический белок, полученный описанным выше способом, и фармацевтически приемлемый носитель.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0012] На ФИГ.1А представлены общие значения числа жизнеспособных клеток (ось Y; IVC [нормированные е9 клеток *день/л]), нормированные по средним значениям IVC в день сбора клеток, клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при 27.0°С [♦], 28.0°С [▲], 29.0°С [■] или при 30.0°С [○], в зависимости от времени (ось X; время культивирования в днях [d]); ФИГ.1В представляет жизнеспособность клеток (ось Y) для тех же клеток в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0013] На ФИГ.2А представлен профиль остаточной глюкозы (ось Y; глюкоза [г/л]) в культуре клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при 27.0°С [♦], 28.0°С [▲], 29.0°С [■] или при 30.0°С [○], в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]); ФИГ.2В представляет профиль глютамина (ось Y; глютамин [мМ]) для тех же клеток в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0014] На ФИГ.3А представлена концентрация лактата в средах (ось Y; лактат [г/л]) в культуре клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при 27.0°С [♦], 28.0°С [▲], 29.0°С [■] или при 30.0°С [○], в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]); ФИГ.3В представляет профиль аммония (ось Y; NH4 + [мМ]) для тех же клеток в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0015] На ФИГ.4А изображены значения удельной продуктивности клеток, представленные как интегральное среднее Qр (ось X; Инт. Ср. Qp [нормированное мг/е9 клеток/день]), приведенные к интегральным средним Qp среднего дневного урожая клеток, для культуры клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при 27.0°С [♦], 28.0°С [▲], 29.0°С [■] или при 30.0°С [○], в зависимости от времени (ось X; время культивирования в днях [d]); ФИГ.4В представляет титр TNFR-Fc (ось X; титр продукта [нормированные мг/л]), нормированный по средним значениям титра в день сбора, для тех же клеток в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0016] Влияние изменения температуры при получении (ось X; [°С]) в культуре клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, на продуцирование неправильно свернутого и/или агрегированного TNFR-Fc (ось Y; % неправильно свернутого/агрегированного продукта) представлено на ФИГ.5А; а влияние температуры на продукцию HMWA (ось Y; % продукта высокой молекулярной массы) представлено на ФИГ.5В.
[0017] Влияние изменения температуры получения (ось X; температура [°С]) в культуре клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, на процентную долю общего сиалирования (сиалирование N- и O-связанных гликанов) TNFR-Fc (ось Y; процентная доля общего сиалирования контрольного материала) показано на ФИГ.6А. В качестве контрольного материала использовали определенные аликвоты TNFR-Fc с известным и предпочтительным характером (паттерном) гликозилирования, с которым можно сравнить результаты теста. На ФИГ.6В показано влияние изменения температуры получения (ось X; температура [°С]) в культуре тех же клеток на общую процентную долю сиалированных (□) или процентную долю несиалированных (●) N-связанных гликанов (ось Y; Процент Общего Числа N-связанных Гликанов).
[0018] На ФИГ.7 показано влияние выращивания клеток при разной температуре (27.0°С [♦], 28.0°С [▲], 29.0°С [■] или 30.0°С [○]) на рН культуры клеток СНО (ось Y) в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0019] На ФИГ.8А представлены интегрированные значения числа жизнеспособных клеток (ось Y; IVC [нормированные е9 клеток *день/л]), нормированные по средним значениям IVC в день сбора клеток, для клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при заданных значениях рН, равных 7.20 [◊], 7.10 [■], 7.00 [♦], 6.90 [●] или 6.80 [▲] в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]); а на ФИГ.8В показана жизнеспособность тех же клеток (ось Y) в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0020] На ФИГ.9А представлен профиль глюкозы (ось Y; глюкоза [г/л]) культуры клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при заданных значениях рН, равных 7.20 [◊], 7.10 [■], 7.00 [♦], 6.90 [●] или 6.80 [▲], в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]); а на ФИГ.9В представлен профиль глютамина (ось Y; глютамин [мМ]) для одних и тех же клеток в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0021] На ФИГ.10А представлена концентрация лактата в средах (ось Y, лактат [г/л]) культуры клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при заданных значениях рН, равных 7.20 [◊], 7.10 [■], 7.00 [♦], 6.90 [●] или 6.80 [▲], в зависимости от времени (ось X, время культивирования [d]); на ФИГ.10В представлен профиль аммония (ось Y; NH4 + [мМ]) тех же клеток в зависимости от времени (ось X, время культивирования [d]).
[0022] На ФИГ.11А представлено отклонение рН клеточной культуры от заданных значений рН (ось X, рН культуры) для клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращиваемых при заданных значениях рН, равных 7.20 [◊], 7.10 [■], 7.00 [♦], 6.90 [●] или 6.80 [▲], в зависимости от времени (ось X, время культивирования [d]). На ФИГ.11В представлена осмоляльность (ось X; осмоляльность [мОсм/кг]) для одних тех же клеток, выращенных при заданных значениях рН, равных 7.20 [◊], 7.10 [■], 7.00 [♦], 6.90 [●] или 6.80 [▲], в зависимости от времени (ось X, время культивирования [d]).
[0023] На ФИГ.12А изображена удельная продуктивность клеток, представленная интегральным средним Qp (ось X; Инт. Ср. Qp [нормированное значение в мг/е9 клеток/день]), интегральное среднее Qp, нормированное по среднему значению в день сбора клеток для клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, выращенных при заданных значениях рН 7.20 [◊], 7.10 [■], 7.00 [♦], 6.90 [●] или 6.80 [▲] в зависимости от времени (ось X, время культивирования [d]); а на ФИГ.12В представлен титр TNFR-Fc (ось X; титр продукта [нормированное значение в мг/л]), нормированный по среднему титру в день сбора для тех же клеток в зависимость от времени (ось X, время культивирования [d]).
[0024] На ФИГ.13А показано влияние изменения заданных значений рН культуры (ось X, рН) клеток СНО, трансфецированных TNFR- Fc, на продуцирование неправильно свернутого/агрегированного TNFR-Fc (ось Y; % неправильно свернутого/агрегированного продукта).На ФИГ.13В изображено влияние изменения заданных значений рН культуры (ось X, рН) на продуцирование HMWA (ось Y; % продукта высокой молекулярной массы).
[0025] Влияние изменения заданных значений рН (ось X; рН) в культуре клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, на процентную долю общего сиалирования TNFR-FC (ось Y; процентная доля общего сиалирования контрольного материала) показано на ФИГ.14А. ФИГ.14В представляет влияние изменения заданных значений рН клеточной культуры (ось X, рН) в культуре одних и тех же клеток, на общий процент сиалированных (□) или несиалированных (●) N-связанных гликанов (ось Y; процент общего количества N-связанных гликанов).
[0026] На ФИГ.15 изображен типичный профиль флюоресценции (ось Y; флюоресценция, измеренная в мВ) в зависимости от времени удерживания (ось X; минуты), описывающий сиалирование N-гликанов, которое определяли путем исследования освобожденных от меченых гидрозина 2-аминобензамидом-(2АВ) гликоформ белка с помощью Нормальной Фазовой Хроматографии.
[0027] На ФИГ.16 показаны профили флюоресценции (ось Y; мВ) в зависимости от времени удержания (ось X; минуты), описывающие сиалирование N-связанных гликанов, что наблюдалось благодаря исследованию освобожденных от гидразина 2-аминобензамид-(2АВ)-меченых гликоформ белка с помощью Нормальной Фазовой Хроматографии культуры клеток СНО, трансфецированных TNFR-Fc, при различных заданных значениях рН культуры.
[0028] На ФИГ.17 представлены: (А) плотность жизнеспособных клеток (ось Y; клеток/мл), (В) общая плотность клеток, включающая как жизнеспособные, так и не жизнеспособные клетки (ось Y; клеток/мл), (С) жизнеспособность клеток (ось Y) и (D) интегрированные значения числа жизнеспособных клеток (IVC) (ось Y; [е9 клеток *день/л]) для культуры клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращенных при 37.0°С [♦], 33.0°С [■], 32.0°С [●], 31.0°С [◊], 29.0°С [∆] или КТ [□] в течение определенного времени (ось X; время культивирования [d]).
[0029] На ФИГ.18 представлен титр sIL-13R как в форме димеров, так и в HMWA форме (ось Y; sIL-13R [мг/л]) для клеточных культур с повышенной экспрессией sIL-13R, выращиваемых при 37.0°С [♦], 33.0°С [■], 32.0°С [●], 31.0°С [◊], 29.0°С [∆] или КТ (комнатной температуре) [□], в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0030] На ФИГ.19А представлена скорость продукции sIL-13R (ось Y; Qp [мг/е9 клеток/d]) в течение разных временных интервалов (ось X) для культур клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращиваемых при 37.0°С, 33.0°С, 32.0°С, 31.0°С, 29.0°С или RT. На ФИГ.19В представлены интегральные средние удельной продуктивности клеток (ось Y; Инт. Ср. Qp [мг/е9 клеток/день]) в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]) для культур клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращиваемых при 37.0°С, 33.0°С, 32.0°С, 31.0°С, 29.0°С или КТ.
[0031] На ФИГ.20 представлен дневной удельный уровень потребления глюкозы (ось Y; Qglc [г/е9 клеток/ d]) для различных интервалов времени (ось X) для культур клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращенных при 37.0°С, 33.0°С, 32.0°С, 31.0°С, 29.0°С или КТ.
[0032] На ФИГ.21 представлен дневной удельный уровень потребления глютамина (ось Y; Qgln [ммоль/е9 клеток/ d]) для различных интервалов времени (ось X) для культур клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращенных при 37.0°С, 33.0°С, 32.0°С, 31.0°С, 29.0°С или КТ.
[0033] На ФИГ.22 представлена концентрация лактата (ось Y; лактат[г/л]) в культуральных средах культуры клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращенных при 37.0°С [♦], 33.0°С [■], 32.0°С [●], 31.0°С [◊], 29.0°С [∆] или КТ [□] в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0034] На ФИГ.23 представлена концентрация аммония (ось Y; аммоний [мМ]) в культуральных средах культуры клеток с повышенной экспрессией sIL-13R, выращенных при 37.0°С [♦], 33.0°С [■], 32.0°С [●], 31.0°С [◊], 29.0°С [∆] или КТ [□] в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0035] На ФИГ.24 представлено влияние температуры культуры клеток (ось X; температура продукции [°С]) на продуцирование HMWA (ось Y; % Продукта высокой молекулярной массы) на 9 день культивирования клеток, сверхэкспрессирующих sIL-13R.
[0036] На ФИГ.25 представлено влияние температуры культуры клеток (ось X; температура продуцирования [°С]) на продуцирование HMWA (ось Y; % Высокомолекулярные Продукты) в день 18 культивирования клеток с повышенной экспрессией sIL-13R.
[0037] На ФИГ.26А представлена процентная доля димера sIL-13R (ось Y; % димера sIL-13R), выделенного из общего белка sIL-13R, полученного в кондиционированной среде клетками с повышенной экспрессией sIL-13R, выращенными при 37.0°С [♦], 33.0°С [■], 32.0°С [●], 31.0°С [◊], 29.0°С [∆] или КТ [□], в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]). На ФИГ.26В представлена процентная доля HMWA (ось Y; % Продукта высокой молекулярной массы) относительно общего sIL-13R в кондиционированной среде клеток с повышенной экспрессией sIL-13R в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
[0038] На ФИГ.27 представлен титр димера sIL-13R (ось Y; только sIL-13R [мг/л в кондиционированной среде клеток, выращенных при 37.0°С [♦], 33.0°С [■], 32.0°С [●], 31.0°С [◊], 29.0°С [∆] или КТ [□], в зависимости от времени (ось X; время культивирования [d]).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0039] Превалирующей точкой зрения в получении лекарственных белков в культуре клеток млекопитающего является то, что температура в ходе фазы продуцирования должна быть, по крайней мере, 30.0°С, и значение рН должно составлять по меньшей мере 7. Однако выращивание клеток в культуре клеток при температуре фазы продуцирования продукта около 30.0°С и значениях рН около 7 может вести к повышенной агрегации белков (также упоминаемой здесь как агрегаты высокой молекулярной массы HMWA), и неправильному сворачиванию белков, и, таким образом, к выработке меньшего количества функционального и пригодного к использованию белка.
[0040] Согласно настоящему изобретению предложен новый способ получения белка в культуре клеток, который обеспечивает снижение неправильного сворачивания белка и снижение агрегации белков. Согласно другому аспекту изобретения предложены способы контроля уровня гликозилирования белка.
Белки, полученные способами согласно настоящему изобретению
[0041] Фразы «полипептид» или «полипептидный продукт» в настоящем описании являются синонимами терминов «белок» или «белковый продукт» соответственно и, в соответствии со значением, принятым в данной области, обозначают по меньшей мере одну цепь аминокислот, соединенных последовательными пептидными связями. В некоторых вариантах осуществления, «целевой (целевой) белок» или «целевой полипептид» и подобные соединения представляют собой белок, кодируемый молекулой экзогенной нуклеиновой кислоты, введенной путем трансфекции или трансформации в клетку-хозяина, напр., временно или постоянно трансфецированный или трансформированный в клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, в которых экзогенная ДНК, которой трансфецируют или трансформируют клетку-хозяина, кодирует "целевой белок", при этом последовательность нуклеиновой кислоты экзогенной ДНК определяет последовательность аминокислот. Такая последовательность может представлять собой последовательность, встречающуюся в природе, или, как вариант, последовательность, созданную человеком. В некоторых вариантах реализации, «целевой белок» представляет собой белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, являющейся эндогенной для клетки-хозяина. Экспрессия такого эндогенного целевого белка может быть изменена путем трансфецирования клетки-хозяина экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, которая может, например, содержать одну или более регуляторных последовательностей и/или кодировать белок, усиливающий экспрессию целевого белка. В вариантах осуществления настоящего изобретения целевой полипептид получают в культуре клеток, например, для последующей очистки.
[0042] Термин «гликопротеин», «гликозилированный белок» и им подобные относятся в белкам, содержащим остатки сахаров, например, олигосахаридные фрагменты, присоединенные к боковым цепям аспарагина (N-гликозилирование), либо к боковым цепям серина и/или треонина (O-гликозилирование). Например, одним из обычных типов N-гликозилирования белков является сиалирование белков (также известное как сиалирование N-гликанов). Гликозилирование большинства секреторных и мембранных белков (в том числе мембранных рецепторов) происходит в ЭР и/или аппарате Гольджи. Известно, что гликозилирование контролирует сворачивание и выход белков из ЭР. Кроме того, многие стадии процесса гликозилирования/дегликозилирования осуществляются в аппарате Гольджи. Современные представления о процессах гликозилирования как в ЭР, так и в аппарате Гольджи рассмотрены в Helenius et al. (2001) Science 291:2364-69; Parodi (2000) Biochem. J. 348:1-13; и Parodi (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:69-93. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, целевой полипептид представляет собой целевой гликопротеин, а целевой гликопротеин получают в культуре клеток, например, для последующей очистки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения целевой гликопротеин представляет собой рецептор и в т.ч. может представлять собой растворимый рецептор.
[0043] Способы и композиции согласно настоящему изобретению можно использовать для получения любого целевого белка, включая, но не ограничиваясь белками, обладающими фармацевтическими, диагностическими, сельскохозяйственными и/или любыми другими свойствами, полезными для коммерческого, экспериментального и другого использования. Кроме того, целевой белок может представлять собой белковое терапевтические средство. Конкретно, белковое терапевтическое средство (или терапевтический белок) представляет собой белок, оказывающий биологическое воздействие на участок тела, на который он непосредственно воздействует, или на участок тела, на который он воздействует удаленно через интермедиаты. В некоторых вариантах осуществления, белки, получаемые с использованием способов и/или композиций согласно настоящему изобретению, могут быть переработаны или модифицированы перед введением их пациенту в качестве терапевтических белков.
[0044] Настоящее изобретение может быть использовано для культивирования клеток для улучшенного получения любых терапевтических белков, таких как фармацевтические или коммерчески значимые ферменты, рецепторы, гибридные рецепторы, растворимые рецепторы, растворимые гибридные рецепторы, антитела (например, моноклональные и/или поликлональные антитела), антигенсвязывающие фрагменты антител, белки слияния, содержащие Fc, SMIP (низкомолекулярные блочные иммунотерапевтические средства), цитокины, гормоны, регулирующие факторы, факторы роста, факторы коагуляции/факторы свертывания крови, или антигенсвязывающие агенты. Приведенный выше перечень белков приведен лишь в качестве примера и не является исчерпывающим перечислением. Среднему специалисту будут известны и другие белки, которые могут быть получены в соответствии с настоящим изобретением, и он будет иметь возможность использовать способы, раскрытые в настоящем описании, для получения таких белков.
[0045] Термин "антитело" включает в себя белки, включающие по меньшей мере одну, а как правило две области VH (вариабельная область тяжелой цепи) или их части, и/или по меньшей мере одну, а как правило две области VL (вариабельная область легкой цепи) или их части. В других вариантах реализации, антитело представляет собой тетрамер, состоящий из двух тяжелых цепей иммуноглобулина и двух легких цепей иммуноглобулина, где тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов связаны друг с другом, например, дисульфидными связями. Антитела или их части могут быть получены из любого источника, включая, но не ограничиваясь, антитела грызунов, приматов (человека и других приматов), животных семейства верблюжьих, акул, а также рекомбинантным путем, например, химерные, гуманизированные и/или созданные in vitro, например, при помощи способов, хорошо известных специалистам.
[0046] Настоящее изобретение также охватывает "антигенсвязывающие фрагменты антител", включая (I) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из областей VL, VH, CL и CH1; (II) F (ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (III) фрагмент Fd, состоящий из областей VH и CH1; (IV) фрагмент Fv, состоящий из областей VL и VH одного плеча антитела, (V) фрагмента dAb, который состоит из области VH; (VI) вариабельная область животного смейства верблюдовых или камелизированная вариабельная область, например, область VHH; (VII) одноцепочечный Fv (ScFv); (VIII) биспецифичное антитело; и (IX) один или более антигенсвязывающих фрагментов иммуноглобулина, связанных с участком Fc. Кроме того, хотя две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются различными генами, они могут быть соединены рекомбинантными методами, при помощи синтетического линкера, позволяющего объединить их в одну белковую цепь, в которой области VL и VH объединяются СС образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv), см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83). Такие одноцепочечные антитела также подпадают под определения термина "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Эти фрагменты антител получают при использовании обычных методов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты оценены за функционирование по тому же принципу, что и интактные антитела.
[0047] Настоящее изобретение также включает однодоменные антитела. Однодоменные антитела могут включать антитела, гипервариабельные участки которых являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают, но не ограничиваются, следующими: тяжелые цепи антител, природные антитела, лишенные легких цепей, однодоменные антитела, полученные из обычных четырехцепочечных антител, искусственно созданные антитела и однодоменные скаффолды, отличные от полученных из антител. Однодоменные антитела могут быть любыми из уже известных антител или антител, которые станут известны в будущем. Однодоменные антитела могут быть получены из любого вида, включая, но не ограничиваясь, перечисленными: мышь, человек, верблюд, лама, коза, кролик, корова и акула. Согласно одному аспекту изобретения, однодоменные антитела согласно настоящему изобретению представляют собой природные однодоменные антитела, известные как тяжелоцепочечные антитела, лишенные легких цепей. Такие однодоменные антитела описаны, например, в WO 9404678. Для ясности, эта вариабельная область, полученная из тяжелоцепочечного антитела, естественным образом лишенного легких цепей, называется в настоящем описании VHH или нанотелом, чтобы отличить его от обычной VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такая молекула VHH может быть получена из антител, вырабатываемых животными семейства Верблюдовых, например, верблюд, лама, дромадер, альпака и гуанако. Другие виды, помимо Верблюдовых, могут вырабатывать тяжелоцепочечные антитела, естественным образом лишенные легких цепей; такие VHH входят в объем изобретения. Однодоменные антитела также включают IgNAR акулы, см., например, Dooley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:1846-1851 (2006).
[0048] Антитела, отличные от "биспецифичных" или "бифункциональных" антител, представляют собой антитела, все сайты связывания которых идентичны. "Биспецифичное " или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственно созданное гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелых/легких цепей и два различных сайта связывания. Биспецифичные антитела могут быть получены с помощью различных методов, включая слияние гибридом или соединение Fab-фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
[0049] В тех вариантах осуществления изобретения, в которых белок представляет собой антитело или фрагмент антитела, белок может содержать по меньшей мере одну или две полноразмерные тяжелые цепи и по меньшей мере одну одну или две легкие цепи. В альтернативном варианте, антитела или фрагменты антител могут содержать только антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный фрамент Fv). Антитела или фрагменты антител могут представлять собой моноклональные или моноспецифичные антитела. Антитела или фрагменты антител могут представлять собой антитела человека, химерные антитела, антитела с привитыми CDR (гипервариабельными участками) или созданные in vitro антитела. Кроме того, существуют варианты осуществления, в которых антитело содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В еще одном варианте реализации, антитело содержит легкую цепь, выбранную из, например, легких цепей каппа и лямбда. В одном из вариантов осуществления изобретения, константная область изменена, например, путем мутации, что обеспечивает изменение свойств антитела (например, увеличить или снизить одно или более из следующих свойств: связывание Fc-рецептора, гликозилирование антител, число остатков цистеина, функционирование эффекторной клетки или как компонентов системы комплемента). Обычно, антитела или фрагменты антител специфичным образом связываются с заранее определенным антигеном, например, с антигеном, связанным с каким-либо нарушением в организме (нейродегенеративным, метаболическим, воспалительным, аутоиммунным и/или злокачественным заболеванием).
[0050] Описанные в настоящей заявке белки дополнительно возможно включают фрагмент, усиливающий одно или более из следующих свойств: стабильность, функцию эффекторной клетки или связывание комплемента. Например, антитело или антигенсвязывающий возможно дополнительно содержит пегилированный фрагмент, альбумин или константную область тяжелой и/или легкой цепи.
[0051] Обычно антитела получают при помощи традиционных гибридомных технологий (Kohler et al., Nature 256:495 499 (1975)), методов рекомбинантной ДНК (патент США №4,816,567) или методик фагового дисплея с использованием библиотек антигенов (Clackson et al., Nature 352:624 628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 597 (1991)). Информацию о других разнообразных технологиях получения антител см. Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al.. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
[0052] Кроме того, антитела можно снабдить детектируемой или функциональной меткой. Такие метки включают радиоактивные метки (например, 131I или 99Тс), ферментные метки (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) и другие химические вещества (например, биотин).
[0053] «Низкомолекулярные блочные иммунотерапевтические средства» (SMIP™) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA) представляют собой одноцепочечные полипептиды, состоящие из связывающего домена для распознавания структуры антигена, лиганда (контррецептора) или подобной структуры, шарнирного участка полипептида, или включающего один остаток цистеина, или не содержащего остатков цистеина, и областей СН2 и СН3 иммуноглобулина (см. также www.trubion.com). SMIP и области их применения описаны, например, в опубликованных заявках на патенты США №2007/002159, 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534, и 2005/0238646, и аналогах указанных выше патентов, каждый из которых включен сюда посредством ссылки и в полном объеме.
[0054] В еще одном варианте осуществления, целевой белок представляет собой растворимый рецептор, например, белок слияния, включающий растворимый рецептор. Мембранные белки, в т.ч. рецепторы, обычно представляют собой гликозилированые белки. Соответственно, способы согласно настоящему изобретению являются чрезвычайно полезными в получении неагрегированных, правильно свернутых и гликозилированных белков, относящихся к растворимым рецепторам слияния.
[0055] Растворимые белки, например растворимые рецепторы, можно получать в соответствии с хорошо известными способами. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения, растворимый рецептор содержит внеклеточный участок рецептора или его фрагмент. В другом варианте осуществления, растворимый рецептор содержит два полипептида. Первый полипептид включает полноразмерный рецептор; как вариант, первый полипептид включает в себя полноразмерный рецептор, а, например, внеклеточный участок рецептора. В одном из вариантов осуществления, первый полипептид представляет собой полноразмерный цитокиновый рецептор; в альтернативном варианте первый полипептид короче, чем полноразмерный цитокиновый рецептор и представляет собой, например, внеклеточный участок цитокинового рецептора. Такой растворимый рецептор также может содержать дополнительный полипептид, например, последовательность полипептида GST, Lex-A, МВР или цепь, включая, например, иммуноглобулина, Fc-фрагмент, константную область тяжелой цепи различных изотипов, включая: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE.
[0056] В одном из вариантов осуществления, второй полипептид предпочтительно является растворимым. В некоторых вариантах осуществления, второй полипептид увеличивает время полужизни (в сыворотке или, например, время полужизни в циркулирующей крови) связанного с ним полипептида. В предпочтительных вариантах осуществления второй полипептид включает по меньшей мере участок полипептида иммуноглобулина. Полипептиды слияния, включающие иммуноглобулин, известны в данной области и описаны, например, в патентах США №5,516,964; 5,225,538; 5,428,130; 5,514,582; 5,714,147; и 5,455,165. Известно, что растворимые белки слияния подвержены агрегации в процессе продуцирования и поэтому способы согласно настоящему изобретению дают особенное преимущество при работе с культурами клеток, вырабатывающих белки данного типа.
[0057] В некоторых вариантах осуществления, второй полипептид содержит полноразмерный полипептид иммуноглобулина. В альтернативном варианте, второй полипептид содержит участок, меньший, чем полноразмерный полипептид иммуноглобулина, например, тяжелую цепь, легкую цепь, Fab, Fab2, Fv или Fc. Второй полипептид содержать тяжелую цепь полипептида иммуноглобулина. Также второй полипептид содержать Fc-фрагмент полипептида иммуноглобулина.
[0058] В одном из вариантов осуществления изобретения, растворимый рецепторный белок слияния содержит ингибитор фактора некроза опухолей. В некоторых вариантах осуществления, ингибиторы фактора некроза опухолей представляют собой фактор некроза опухолей альфа или бета (TNFR-1; ЕР 417,563, опубликованная 20 мap. 1991; и TNFR-2, ЕР 417,014, опубликованная 20 мap. 1991, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки и в полном объеме) экспрессируются согласно системам и способам настоящего изобретения (для обзора, см. Naismith and Sprang, J. Inflamm. 47(1-2): 1-7, 1995-96, помещено сюда посредством ссылки и в полном объеме). Согласно некоторым вариантам осуществления, ингибитор фактора некроза опухолей содержит растворимый рецептор TNF (фактора некроза опухолей). В некоторых вариантах осуществления, ингибиторы TNF согласно настоящему изобретению представляют собой растворимые формы TNFRI и TNFRII. В некоторых вариантах осуществления, ингибиторы TNF согласно настоящему изобретению представляют собой растворимые TNF-связывающие белки. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы TNF согласно настоящему изобретению представляют собой белки слияния, содержащие TNFR, например, TNFR-Ig или TNFR-Fc. В настоящем описании термин «этанерцепт» обозначает TNFR-Fc, который представляет собой димер, состоящий из двух молекул внеклеточной области р75 рецептора TNF-альфа, при этом каждая из молекул состоит из Fc-фрагмента IgG1 человека длиной 235 аминокислот. Согласно настоящему изобретению, клетки, экспрессирующие TNFR-Fc, выращивают в культуре клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН, что обеспечивает снижение количества неправильно свернутого белка и/или высокомолекулярных агрегатов в процессе получения (продуцирования) TNFR-Fc. Согласно некоторым вариантам осуществления, клетки, экспрессирующие TNFR-Fc, выращивают в культуре клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН, что позволяет регулировать уровень гликозилирования в процессе продуцирования TNFR-Fc.
[0059] В другом варианте осуществления настоящего изобретения, растворимым рецепторным белком слияния является sIL-13R. В настоящем описании растворимый рецептор IL-13 (sIL-13R) относится к рекомбинантным белкам слияния, содержащим внеклеточный домен (ECD) рецептора интерлейкина человека (IL)-13-альфа2 и Fc-фрагмент тяжелой цепи IgG1 человека. sIL-13R состоит из двух идентичных полипептидных цепей (т.е. представляет собой димер из полипептидных цепей), по-видимому, соединенных внутримолекулярными дисульфидными связями. Растворимый рецепторный белок слияния sIL-13R и его применение раскрыты в патенте США №. 5,710,023, включенном в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.
[0060] В некоторых вариантах осуществления, второй полипептид обладает более слабой эффекторной функцией, чем Fc-фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина дикого типа. К эффекторным функциям Fc-фрагмента относятся, например, связывание Fc-рецептора, связывание комплемента, Т-клеточная цитотоксичность (см., например, патент США №6,136,310). Методы анализа Т-клеточной цитотоксичности, эффекторной функции Fc-фрагмента, стабильности антител, известны. В одном из вариантов осуществления, второй полипептид не обладает сродством к Fc-рецептору. В альтернативном варианте осуществления, второй полипептид обладает слабым сродством или не обладает сродством к белку системы комплемента C1q.
[0061] Белки слияния, например растворимые рецепторные белки слияния, могут дополнительно иметь в своем составе линкерную последовательность, соединяющую растворимый белок или его фрагмент со второй молекулой. Например, белок слияния содержит пептидный линкер, например, пептидный линкер длиной от 2 до 20, более предпочтительно от 5 до 10 аминокислот.
[0062] В других вариантах осуществления, дополнительные последовательности аминокислот могут быть присоединены к N- или С-концу белка слияния, что облегчает экспрессию, детектирование и/или выделение и очистку. Например, растворимый рецепторный белок слияния может быть соединен с одной или более дополнительных молекул, включая GST, метку His6, метку FLAG. Например, белок слияния может быть дополнительно связан с белком слияния GST, при этом последовательности белка слияния присоединены к С-концу GST (т.е. глутатион S-трансферазы). Такие белки слияния могут улучшать растворимость, т.е. способствовать правильному сворачиванию белка, и таким образом облегчать очистку белка слияния.
Способы получения белка в культуре клеток
[0063] Термины "культура" и "клеточная культура" («культура клеток») в настоящем описании относятся к популяции клеток, которая находится в контакте с культуральной средой в условиях, подходящих для выживания и/или роста популяции клеток. В настоящем описании, эти термины могут относится к комбинации, содержащей популяцию клеток (например, культура клеток животного), и среду, с которой находится в контакте указанная популяция.
[0064] Клетки, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой рекомбинантные клетки-хозяева, например, эукариотические клетки-хозяева, т.е. клетки, трансфецированные экспрессионной конструкцией, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой полипептид, и клетки животных. Значение фразы "клетки животных" включает беспозвоночных, позвоночных, не являющихся млекопитающими (например, птиц, рептилий и амфибий), а также клетки млекопитающих. Неограничивающими примерами клеток беспозвоночных являются следующие клетки насекомых: Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori (шелковичный червь/тутовый шелкопряд). В предпочтительных вариантах осуществления культура клеток представляет собой культуру клеток млекопитающего.
[0065] Ряд линий клеток млекопитающих являются подходящими клетками-хозяевами для рекомбинантной экспрессии целевых полипептидов. Линии клеток-хозяев млекопитающих включают, например: COS, PER.C6, ТМ4, VERO076, MDCK, BRL-3A, W138, Нер G2, ММТ, MRC 5, FS4, СНО, 293Т, А431, 3Т3, CV-1, С3Н10Т1/2, Соlо205, 293, HeLa, клетки L, BHK, HL-60, FRhL-2, U937, НаК, Джуркат клетки, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x, миеломы мыши (например, SP2/0 и NS0) и С2С12 клетки, а также линии трансформированных клеток приматов, гибридомы, нормальные диплоидные клетки и штаммы клеток, полученные из культуры первичной ткани и первичных эксплантов in vitro. Любая эукариотическая клетка, которая обладает способностью к экспрессии целевого полипептида, может быть использована в предложенных способах. Многочисленные линии можно получить в коммерческих источниках, таких как Американская Коллекция Типовых Культур (АТСС). В одном из вариантов осуществления изобретения, культура клеток, например, крупномасштабная культура клеток, включает клетки СНО.
[0066] Хотя в некоторых вариантах осуществления культура клеток включает клетки млекопитающих, специалисту в данной области будет понятно, что рекомбинантным путем возможно получить целевые полипептиды низших эукариот, таких как дрожжи, или прокариот, таких как бактерии. Для специалиста в данной области будет очевидно, что условия культивирования для культуры клеток дрожжей и бактерий будут отличаться от условий культивирования клеток животных, и будет известно, как эти условия должны следует скорректировать для оптимизации роста клеток и/или продуцирования белка.
[0067] Подходящие штаммы бактерий включают Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium или любой штамм бактерий, обладающий способностью к экспрессии целевого полипептида. Экспрессия в бактерии может привести к образованию включений, содержащих рекомбинантный белок. Таким образом, для того чтобы получить активный или более активный продукт, может быть необходим рефолдинг рекомбинантного белка. Специалистам в данной области известно несколько способов получения правильно свернутого гетерологичного белка из бактериальных включений. Эти способы, как правило, включают солюбилизацию белка из включений, а затем полную денатурацию белка с помощью хаотропного агента. В случае, если в первичной последовательности аминокислот белка присутствуют остатки цистеина, часто необходимо осуществить рефолдинг в среде, обеспечивающей правильное образование дисульфидных связей (окислительно-восстановительная система). Основные способы рефолдинга известны специалистам в данной области и описаны, например, в Kohno (1990) Meth. Enzymol. 185:187-95, EP 0433225 и в Патенте США №5399677.
[0068] Штаммы дрожжей, подходящие для продуцирования полипептидов, включают штаммы Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces, Candida или любой штамм дрожжей, способный экспрессировать целевой полипептид.
[0069] Под термином "биореактор" в настоящем описании понимают любой сосуд, используемый для выращивания культуры клеток эукариот, например культуры клеток животных (например, культуры клеток млекопитающих). Биореактор может быть любого размера, подходящего для культивирования клеток, например клеток млекопитающих. Обычно объем биореактора будет составлять по меньшей мере 30 мл, или возможно по меньшей мере 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более, включая любые промежуточные значения объемов. Обычно в ходе культивирования контролируют внутренние условия в биореакторе, включая, рН и температуру, но не ограничиваясь ими. Термин "производственный биореактор" в настоящем описании обозначает конечный биореактор, используемый для продуцирования целевых полипептидов или белков. Объем производственного биореактора для крупномасштабного культивирования клеток обычно больше чем 100 мл и как правило составляет по меньшей мере около 10 литров или возможно 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более, или объем может иметь любые промежуточные значения. Подходящий биореактор или производственный биореактор может быть выполнен из любого материала, который подходит для поддержания культур клеток, суспендированных в среде, в условиях культивирования согласно настоящему изобретению и способствующего росту клеток и их жизнеспособности, включая стекло, пластик или металл; при это материал(ы) не должен оказывать нежелательного влияния на процесс экспрессии или стабильность производимого продукта, например лекарственного белкового продукта. Специалист в данной области будет знать о биореакторах и сможет выбрать подходящий для реализации настоящего изобретения.
[0070] Термины «среда», «среда культуры клеток» и «культуральная среда» в настоящем описании относятся к раствору, содержащему питательные вещества, обеспечивающие рост клеток животного, например клеток млекопитающего, и также может относиться к среде в комбинации с клетками. Термин «среда для посева» (инокулят) относится к среде, используемой для формирования культуры клеток. Среда для посева может отличаться либо не отличаться по составу от среды, используемой в ходе остальной фазы клеточного роста. Обычно, растворы питательных сред содержат, помимо прочего, заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и следовые элементы, необходимые клетке для по меньшей мере минимального роста и/или выживания. Раствор также может содержать компоненты, усиливающие рост и/или выживание относительно минимального уровня, включая гормоны и факторы роста. Раствор, желательно, готовят таким образом, что он имеет рН и концентрации солей, оптимальные для выживания и пролиферации клеток. По меньшей мере в одном варианте осуществления, среда является определенной питательной средой. Определенная питательная среда - это среда, химический состав всех компонентов которой известен. В других вариантах осуществления изобретения, питательная среда может содержать аминокислоту(ы), полученную(ые) из любого источника способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь, аминокислотой(ами), полученной(ыми) как из добавки(ок) одной аминокислотной(ых), так и из добавки(ок) гидролизованных пептона(ов) или белка(ов) гидролизатной(ых) (включая животные и растительные источники). В других вариантах осуществления, питательная среда, используемая для фазы роста клеток, может включать концентрированную среду, т.е. среду, содержащую повышенные концентрации питательных веществ, обычно являющихся необходимыми и обычно добавляемыми в растущую культуру. Специалистам в данной области известно, какая культуральная среда, среда для посева, и т.д. подходит для культивирования конкретных клеток, например клеток животного происхождения (например, СНО клетки), а также известны количества глюкозы и других питательных веществ (например, глютамина, ионов металлов, следовых D элементов), или агентов, предназначенных для контроля других параметров культуры (например, пенообразования, осмоляльность), которыми должна характеризоваться питательная среда (см., например, Mather, J.P., et al. (1999) "Culture media, animal cells, large scale production," Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol.2:777-85; опубликованную заявку на патент США №2006/0121568; оба источника включены в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки). Настоящее изобретение также включает варианты таких известных сред, включая, например, обогащенные питательными веществами варианты таких сред. Термин «плотность клеток» в настоящем описании означает количество клеток, присутствующее в данном объеме среды. Термин «плотность жизнеспособных клеток» в настоящем описании относится к числу жизнеспособных клеток, присутствующих в данном объеме среды при данном наборе условий эксперимента.
[0071] Термин «жизнеспособность клеток» в настоящей заявке относится к способности клеток выживать в данных условиях культивирования или при экспериментальных изменениях. В настоящем описании этот термин также относится к отношению доли клеток, которые остаются живыми в течение определенного промежутка времени, к общему количеству живых и мертвых клеток в культуре в течение этого промежутка времени.
[0072] Термины «общая (интегрированная) плотность жизнеспособных клеток», «общее (интегрированное) число жизнеспособных клеток» или «IVC» в настоящем описании означают средние значения плотности жизнеспособных клеток в ходе цикла культивирования, умноженные на продолжительность культивирования. Если количество продуцированного белка пропорционально числу жизнеспособных клеток, присутствующих в ходе культивирования, интегрированная плотность жизнеспособных клеток является удобным инструментом оценки количества белка, продуцируемого в ходе культивирования.
[0073] Способы согласно настоящему изобретению можно применять к клеткам, выращиваемым в культуре периодическим способом (в «периодической культуре»), периодическим способом с подпиткой (в периодической культуре с подпиткой), выращиваемым в проточной культуре, модифицированной культуре с подпиткой (см. предварительную заявку США №60/954,922), периодической культуре с или для любого сочетания перечисленных выше способов культивирования.
[0074] Термин «периодическое культивирование» (периодическая культура) в настоящей заявке относится к способу культивирования клеток, в котором все компоненты, которые в конечном итоге будут использоваться при культивировании клеток, в том числе среду, а также сами клетки, вводят вначале процесса культивирования. Обычно периодическую культуру останавливают в некоторой точке и клетки и/или компоненты питательной среды собирают и, возможно, очищают.
[0075] Термин «периодическое культивирование с подпиткой» (периодическая культура с подпиткой, культура с подпиткой) в настоящем описании относится к способу культивирования клеток, в котором дополнительные компоненты вводят в культуру после начала культивирования. Вводимыми компонентами обычно являются питательные добавки для клеток, количество которых уменьшилось в ходе культивирования. Культуру с подпиткой обычно останавливают в некоторой точке и клетки и/или компоненты питательной среды собирают и, возможно, очищают.
[0076] Термин «проточное культивирование» (проточная культура) в настоящем описании относится к способу культивирования клеток, который предполагает добавление свежей питательной среды, либо непрерывно в течение определенного периода времени либо с перерывами также в течение определенного периода времени, к культуре (после начала культивирования) и одновременное удаление использованной среды. Свежая среда обычно обеспечивает питательные добавки для клеток, количество которых в ходе культивирования уменьшилось. Полипептидный продукт, который может присутствовать в использованной среде возможно подвергают очистке. Способ проточного культивирования также предусматривает удаление продуктов жизнедеятельности клеток (промывку) культуры клеток, выращиваемой в биореакторе.
[0077] Термин «модифицированное периодическое культивирование с подпиткой» в настоящем описании относится к способу культивирования клеток, сочетающему в себе способы культивирования с подпиткой и проточного культивирования. Способ модифицированного культивирования с подпиткой описан в предварительной заявке США №60/954,922, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки и в полном объеме.
[0078] Настоящее изобретение также можно использовать в процессах периодического культивирования с повторяющейся подпиткой. Считается, что уменьшение рН обеспечит лучший контроль, позволяя снизить неправильное сворачивание белка и/или агрегацию и модификацию гликозилирования в этом типе культуры клеток.
[0079] В одном варианте осуществления изобретения, способ включает первоначальную инокуляцию клеток в среду для посева во время фазы роста и одновременное переключение клеток на фазу продуцирования, и при этом температура и/или рН культуры клеток понижены. Фаза роста в настоящем описании относится к стадии культивирования клеток, на которой клетки выращивают до достижения плотности клеток, являющейся оптимальной для продуцирования белка.
[0080] В другом варианте осуществления, после фазы роста клетки возможно переводят в фазу продуцирования, которую возможно проводят при значениях температуры и/или рН, отличных от значений для фазы роста, например, при пониженной температуре и/или рН. В различных вариантах осуществления, культура клеток может быть переведена из фазы роста в фазу продуцирования на следующий день после посева. В других вариантах осуществления, культура клеток может быть переведена из фазы роста в фазу продуцирования продукта через пять дней после посева. При переводе культуры клеток из фазы роста в фазу продуцирования продукта переход может быть относительно постепенным. В альтернативном варианте, переход может быть резким. При постепенном переходе, температуру и/или рН можно постоянно изменять, например снижать. В альтернативном варианте, температуру и/или рН можно изменять с дискретными интервалами.
[0081] Фаза продуцирования при культивировании клеток - это стадия культивирования клеток, в ходе которой клетки выращивают в условиях, оптимальных для продуцирования целевого полипептида, например лекарственного полипептида. В ходе фазы продуцирования, пониженные значения температуры и/или рН можно выбрать, исходя из значений температуры и/или рН, при которых клетки остаются жизнеспособными, и уровень вырабатываемого белка наиболее высок, и при этом образование и накопление продуктов метаболизма, например молочной кислоты и аммиака, минимально, и при этом качество белкового продукта соответствующим образом контролируют, и/или любой комбинации перечисленных выше или других факторов, которые специалист сочтет важными.
[0082] В альтернативном варианте осуществления, способ согласно настоящему изобретению включает инокуляцию (посев) культуры клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН, благодаря чему не требуется изменения значений температуры и/или рН в начале фазы продуцирования. Специалистам известно, каким образом контролировать значения температуры и/или рН культуры клеток, чтобы значения температуры и/или рН не отклонялись от установленных заданных значений. Например, специалистам известны способы использования основания, например, карбоната натрия, для предотвращения снижения рН относительно заданного значения.
[0083] В приведенных ниже примерах культивирование клеток начинали при значениях рН среды более высоких, чем целевые заданные значения, и никаких специальных изменений не производили. Однако для специалистов также очевидно, что также можно использовать корректировку рН в ходе культивирования. Начало культивирования при низкой температуре без корректировки также возможно. Например, способ может состоять только из фазы продуцирования.
[0084] «Пониженная температура» в настоящем описании относится к значениям температуры, ниже обычно применяемых для выращивания клеток значений (для данного типа клеток). Например, в вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых клетки представляют собой клетки млекопитающих, предпочтительные значения температуры культуры клеток в фазе продуцирования находятся в промежутке от 24.0°С до менее 30.0°С, а более предпочтительно от 27.0°С до менее чем 30.0°С. К примеру, пониженная температура культуры клеток равна 24.0°С, 24.5°С, 25.0°С, 25.5°С, 26.0°С, 26.5°С. 27.0°С, 27.5°С, 28.0°С, 28.5°С, 29.0°С, 29.5°С, 29.6°С, 29.7°С, 29.8°С, и 29.9°С. В наиболее предпочтительном варианте осуществления пониженная температура культуры клеток равна примерно 29.5°С. Средний специалист сможет определить значения пониженной температуры для типов клеток, отличных от клеток млекопитающих, для каждого отдельного.
[0085] «Пониженный рН» в настоящем описании относится к значениям рН, которые ниже значений, обычно применяемых для выращивания клеток (для конкретного типа клеток). В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых клетки представляют собой клетки млекопитающих, предпочтительные значения рН культуры клеток в фазе продуцирования ниже 7.00. В различных вариантах осуществления изобретения, пониженные значения рН культуры клеток лежат в промежутке от 6.50 до менее 7.00, предпочтительно, от 6.80 до менее 7.00. Например, пониженные значения рН культуры клеток равны 6.80, 6.85, 6.90, 6.95, 6.96, 6.97, 6.98, и 6.99. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления пониженное значение рН культуры клеток равно примерно 6.95. Специалист сможет определить значения пониженного рН для типов клеток, отличных от клеток млекопитающих, для каждого отдельного случая.
[0086] Специалисту в данной области понятно, что, в зависимости от типа культуры клеток, значения температуры и рН, обычно применяемые для роста клеток (в отличие от пониженных температуры и рН), будут различаться. Например, значения температуры и рН, обычно применяемые для выращивания клеток млекопитающих, например, клеток СНО, выше 30.0°С (например, 37.0°С) и выше 7.00 (например, 7.20) соответственно. Также специалисту в данной области понятно, что, поскольку значения температуры и рН, обычно применяемые для роста клеток другого типа, например, клеток насекомых, будут отличаться от обычных значений для клеток млекопитающих, для таких клеток в способах согласно настоящему изобретению будут применять другие значения пониженной температуры и пониженного рН.
[0087] В нескольких вариантах осуществления изобретения, практикующий специалист может счесть полезным или необходимым периодически проверять определенные условия роста культуры клеток. Неограничивающие примеры параметров, которые будет полезно или необходимо отслеживать, включают следующие: температура, рН, растворенный кислород, плотность клеток, жизнеспособность клеток, интегрированное число жизнеспособных клеток, уровни лактата, уровни аммония, уровни глюкозы, уровни глютамина, осмоляльность, титр экспрессируемого полипептида и т.д. Специалистам в данной области известны многочисленные методики измерения указанных условий/параметров. Например, плотность клеток можно измерить при помощи гемоцитометра, автоматического устройства для подсчета количества клеток (например, счетчик Коултера, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) или контроля плотности клеток (например, CEDEX®, Innovatis, Malvern, PA). Плотность жизнеспособных клеток можно определить с помощью окрашивания образца клеток трипановым синим. Уровни лактата, аммония, глюкозы и глютамина, а также растворенный кислород и рН можно измерить, например, при помощи Химического Анализатора Bioprofile 400 (Nova Biomedical, Waltham, MA), который осуществляет измерения ключевых питательных веществ, метаболитов и газов в культуральной среде. Растворенный кислород и рН также можно измерить, используя анализатор газов крови (например, анализатор рН/газов крови Bayer Rapidlab 248 (Bayer HealthCare LLC, East Walpole, MA)). Температуру, рН и растворенный кислород также можно измерять при помощи различных методов исследования in-situ. Осмоляльность культуры клеток возможно измерить, например, с помощью осмометра точки замерзания. Также можно применять ВЭЖХ для определения, например, уровней лактата, аммония, или экспрессируемого полипептида, или белка. В одном варианте осуществления изобретения, уровень экспрессируемого полипептида можно определить, используя, например, ВЭЖХ с белком А. В качестве альтернативы, уровень экспрессируемого полипептида или белка можно определить при помощи стандартных методик, таких как окрашивание кумасси полиакриламидных гелей с додецилсульфатом натрия, Вестерн-блоттинг, анализ по Брэдфордау, метод Лоури, биуретовую реакцию и поглощение УФ. Может потребоваться контроль посттрансляционных модификаций экспрессируемого полипептида или белка, например гликозилирования. Также может быть полезен контроль других посттрансляционных модификаций экспрессируемого белка, например, фосфорилирования, и т.д. Для отслеживания определенных условий культивирования может потребоваться брать небольшие аликвоты культуры для анализа. Специалист в данной области поймет, что такое удаление может потенциально представлять опасность загрязнения культуры клеток и примет соответствующие меры для снижении риска такой контаминации.
[0088] В одном варианте осуществления, специалист будет отслеживать интегрированное число жизнеспособных клеток при пониженной температуре культивирования клеток и/или пониженном рН. Желательно, чтобы в результате культивирования клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН интегрированное число жизнеспособных клеток снижалось не более чем на 20%, более предпочтительно, не более чем на 20% (например, 15%). В другом варианте осуществления, практикующий специалист отслеживает жизнеспособность клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН. Желательно, чтобы в результате культивирования клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН, жизнеспособность клеток снижалась не более чем на 15%, более предпочтительно, не более чем на 5%.
[0089] Глюкоза является основным источником энергии для культуры клеток. Значительные отклонения в потреблении глюкозы культурой клеток могут указывать на негативное влияние условий культивирования клеток на состояние культуры клеток. Так, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, культивирование клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН приводит к минимальному изменению, например, снижению, потребления глюкозы культурой клеток.
[0090] Глютамин является альтернативным источником энергии для культуры клеток и представляет собой важный источник азота для различных молекул, например аминокислот, в культуре клеток. Так, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, культивирование клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН становится результатом минимального изменения, например, снижения, употребления глютамина культурой клеток.
[0091] В другом варианте осуществления изобретения, практикующий специалист отслеживает выработку продуктов метаболизма, например выработку лактата и аммония, культурой клеток. Так, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, культивирование клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН обеспечивает минимальные изменения, например, увеличение, выработки лактата и аммония культурой клеток. В некоторых вариантах осуществления, культивирование клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН может привести к минимизации выработки лактата и аммония культурой клеток.
[0092] Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, выращивание клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН приводит к минимальным изменениям интегрального среднего продуктивности и титра продукта. Термин «титр» в настоящем описании означает общее количество целевого полипептида, например целевого гликопротеина, вырабатываемого культурой клеток (например, культурой клеток животного), деленное на данный объем питательной среды; таким образом, «титр» означает концентрацию. Титр обычно выражают в единицах миллиграммов полипептида на литр питательной среды. Желательно, чтобы любое снижение продуктивности клеток и титра продукта, наблюдаемое в культуре, уравновешивалось уменьшением продукции неправильно свернутого и/или агрегированного белка, например снижением продукции HMWA.
[0093] В настоящем описании термин «агрегированный белок» относится к структурам из белков, т.е. агрегатам высокой молекулярной массы, которые представляют собой нефункциональный, субоптимальный или нежелательный продукт. Термин «неправильно свернутый белок» относится к белку, который подвергся неправильному сворачиванию, часто такой белок не может проявлять нормальную биологическую активность, например нормальную ферментативную активность. Специалисту известно, что белковые агрегаты могут содержать как правильно, так и неправильно свернутые белки. Агрегированные или неправильно свернутые белки часто образуются в культуре с повышенной экспрессией, например в культуре клеток с повышенной экспрессией целевого белка, например, целевого гликопротеина. Агрегацию могут вызвать, например, неспецифичные гидрофобные взаимодействия несвернутых цепей полипептида или взаимодействия интермедиатов сворачивания. В одном варианте осуществления изобретения, культивирование клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН обеспечивает снижение агрегации/образования неправильно свернутого белка по меньшей мере на 50%, предпочтительно, на 60%. Специалисту известны методики, необходимые для контроля за неправильным сворачиванием/агрегацией белка, например, ВЭЖХ гидрофобных взаимодействий.
[0094] Термин «агрегат высокой молекулярной массы» (HMWA) относится к нежелательному побочному продукту продуцирования белка, образующемуся в результате взаимодействия, по меньшей мере, двух белков. «Агрегат высокой молекулярной массы» может быть комплексом из двух одинаковых белков или целевого белка и других белков, находящихся в культуре клеток, например, белков клеток-хозяев. Ассоциация может осуществляться по любому механизму, включая, но не ограничиваясь перечисленными, ковалентное, нековалентное, дисульфидное, образование невосстанавливаемых поперечных связей. Специалисту понятно, что если белок активен в форме мультимера (например, в форме димера), т.е. когда для активности белка требуется более одной полипептидной цепи, термин «агрегат высокой молекулярной массы» относится к комплексу из двух или более таких мультимеров. В одном варианте осуществления изобретения, белок, активный в форме мультимера, представляет собой рецептор, например цитокиновый рецептор (например, sIL-13R). Еще в одном варианте осуществления, культивирование клеток при пониженной температуре и/или пониженном рН обеспечивает снижение содержания агрегатов высокой молекулярной массы на по меньшей мере 10%, предпочтительно на 40%, более предпочтительно на 50%, а наиболее предпочтительно 80% или, или снижение, равное любым промежуточным значениям. Специалисту в данной области известны методики слежения за образованием агрегатов высокой молекулярной массы, например высокоэффективная жидкостная гель-хроматография (гель-ВЭЖХ).
[0095] В еще одном варианте осуществления изобретения, температуру и рН в культуре клеток используют для изменения гликозилирования белков, например, сиалирования белков до определенного уровня. Например, понижение рН и/или температуры культуры клеток может привести к уменьшению как N-, так и O-связанного гликозилирования, например, к уменьшению сиалирования N-гликанов. Изменение гликозилирования белка (например, сиалирования) может влиять на стабильность, ферментативную активность, время существования в циркулирующей крови и иммуногенность терапевтического белка. Специалист может отслеживать степень гликозилирования (например, сиалирования), чтобы гарантировать, что изменение температуры и рН обеспечивает желаемые тип и уровень гликозилирования. Для мониторирования гликозилирования белкового продукта можно применять методы хроматографии, например хроматографию с нормальными фазами (НФХ).
[0096] В конце фазы продуцирования клетки собирают, а целевой полипептид собирают и очищают. В предпочтительном варианте в конце фазы продуцирования наблюдают сокращение уровня неправильного сворачивания и/или агрегации целевого белка при сохранении приемлемого рисунка гликозилирования. В одном из вариантов осуществления изобретения целевой полипептид в конце процесса образования находится в растворимой форме (например, целевой полипептид представляет собой растворимый рецептор, например цитокиновый растворимый рецептор). Такие растворимые формы полипептида можно очищать от кондиционированной среды.
[0097] Мембраносвязанные формы полипептида можно очистить путем приготовления общей фракции мембран из экспрессирующих клеток и экстрагирования мембран неионным детергентом, таким как TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San-Diego, CA, США). Белки цитозоля или белки ядра можно приготовить путем лизирования целых клеток (механическим путем, в сосуде Парра, путем обработки ультразвуком, детергентом, и т.д.), удаляя фракцию мембран клеток центрифугированием и сохраняя супернатант.
[0098] Полипептид можно очистить, используя и другие известные другие методы. Например, полипептид, полученный способами, раскрытыми в данном описании, можно концентрировать с помощью коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например аппарата для ультрафильтрации производства AMICON® или PELLICON® (Millipore, Billerica, MA). После стадии концентрирования, концентрат можно нанести на подложку для очистки, например, на материал для гель-фильтрации. В качестве альтернативы можно применить анионообменную смолу (например, колонку MonoQ, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, США); такая смола содержит матрицу или субстрат, дополнительно имеющий в своем составе группы диэтиламиноэтила (ДЭАЭ) или полиэтиленимина (ПЭИ). Для очистки можно использовать акриламидные, агарозные, декстрановые, целлюлозные или другие типы матриц, обычно применяемые для очистки белков. В качестве альтернативы, для очистки белков можно использовать катионообменную стадию. Подходящие катионообменные материалы включают различные нерастворимые матрицы, имеющие в своем составе сульфопропильные или карбоксиметильные группы (например, колонки S-SEPHAROSE®, Sigma-Aldrich, St. Louis, МО).
[0099] Очистка полипептида из супернатанта культуры также может включать одну или более стадий с использованием колонки с аффинными смолами, такими как конкавалин А - агароза, AF-HEPARIN650, гепарин-TOYOPEARL® или Цибакрон синий 3GA SEPHAROSE® (Tosoh Biosciences, San Francisco, CA, США); колонок гидрофобной хроматографии с использованием таких смол, как фенилэфирная, бутилэфирная или пропилэфирная; или иммуноаффинных колонок, в которых используются антитела к меченому белку. Наконец, для последующей очистки белка можно применить одну или более стадий ВЭЖХ с использованием гидрофобной ВЭЖХ среды, например, силикагеля, содержащего дополнительные метильные или другие алифатические группы (например, Ni-NTA колонки). В качестве альтернативы, полипептиды можно экспрессировать рекомбинантным путем в форме, облегчающей очистку. Например, полипептиды можно экспрессировать в форме белков слияния с такими белками, как белок, связывающий мальтозу (МВР), глутатион-S-трансфераза (GST) или тиоредоксин (TRX); наборы для экспрессии и очистки таких белков коммерчески доступны в New England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ, США) и Invitrogen (Carlsbad, CA, США) соответственно. Белки также можно пометить небольшим эпитопом (например, метками His, myc или Flag) и затем идентифицировать или очистить с использованием антитела, специфичного к выбранному эпитопу. Антитела к обычно используемым эпитопам доступны в многочисленных коммерческих источниках. Некоторые из упомянутых выше стадий очистки в различных комбинациях или в комбинации с другими известными методами можно применять для очистки целевого полипептида, например, терапевтического белка, полученного способами согласно настоящему изобретению.
Фармацевтические композиции
[00100] В некоторых вариантах осуществления изобретения белки, полученные в соответствии с одним или несколькими способами согласно настоящему изобретению, могут быть полезны в изготовлении фармацевтических средств. Белки, полученные в соответствии с одним или несколькими способами согласно настоящему изобретению, можно вводить пациенту или можно сначала приготовить для приема любым доступным путем, включая, например, парентеральный (например, внутривенный), внутрикожный, подкожный, оральный, назальный пути, введение через бронхи или глаза, чрескожный (наружное), введение через слизистую оболочку, ректальный и вагинальный пути, но не ограничиваясь перечисленными. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению обычно включают очищенный белок, экспрессируемый линией клеток млекопитающих, средство доставки (например, катионный полимер, переносчик пептидных молекул, поверхностно-активное вещество и т.д., как описано выше) в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Формулировка "фармацевтически приемлемый носитель" в настоящем описании включает нетоксичные материалы, которые не оказывают негативного влияния на эффективность биологической активности действующего компонента(ов), например растворители, дисперсную среду, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты, и подобные средства, подходящие для фармацевтического введения. Характеристики носителя будут зависеть от пути введения. Дополнительные активные соединения могут быть также включены в композиции.
[00101] Фармацевтические композиции изготавливают таким образом, чтобы они были совместимы с предполагаемым путем введения. Когда лекарственный белок, полученный в соответствии с одним или несколькими способами согласно настоящему изобретению, вводят в форме для орального введения, фармацевтическая композиция будет иметь форму таблетки, капсулы, порошка, раствора или эликсира. При введении внутрь в форме таблеток, фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать твердый носитель, такой как желатин, или адъювант. Таблетки, капсулы, порошки будут содержать приблизительно от 5 до 95% связывающего агента, а предпочтительно от приблизительно 25 до 90% связывающего агента. В случае введения в жидком виде могут быть добавлены жидкие носители, такие как вода, углеводороды, масла животного или растительного происхождения, такие как кунжутное масло, арахисовое масло (с учетом возникновения аллергических реакций в популяции), минеральные масла, или синтетические масла, или соевое масло. Жидкие формы фармацевтической композиции могут также содержать физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или других сахаридов или гликолей, таких как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. При введении в жидком виде, фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 0,5 до 90% от массы связывающего агента, а предпочтительно приблизительно от 1 до 50% от массы связывающего агента.
[00102] В случае если терапевтический белок, полученный в соответствии с одним или несколькими способами согласно в настоящему изобретению, вводят путем внутривенной, кожной или подкожной инъекции, указанный терапевтический белок будет иметь форму апирогенного, подходящего для парентерального введения водного раствора. Приготовление таких подходящих для парентерального введения растворов белка с учетом рН изотоничности, стабильности и т.п. находится в рамках компетенции специалистов в данной области. Предпочтительная фармацевтическая композиция для внутривенной, кожной или подкожной инъекции должна содержать, в дополнение к лекарственному белку, изотоническую среду, такую как инъекционный раствор хлористый натрий, инъекционный раствор Рингера, препарат декстрозы, инъекционный раствор декстрозы и хлористого натрия, инъекционный раствор Рингера, содержащий молочную кислоту, или другую среду, известную в данной области. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также содержать стабилизаторы, консерванты, буферы, антиоксиданты или другие добавки, известные специалистам в данной области.
[00103] Дополнительные лекарственные формы фармацевтических композиций, содержащих лекарственные белки, полученные одним или несколькими способами согласно настоящему изобретению, будут известны специалистам в данной области. Обычному специалисту в данной области также будет известна дозированная лекарственная форма, подходящая для белков, полученных в соответствии с настоящим изобретением.
[00104] Содержимое всех источников, патентов и заявок на патенты, цитируемых в тексте данной заявки, полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
[00105] Следующие Примеры приведены для облегчения понимания изобретения, но никоим образом не предполагают и не предназначены для ограничения объема изобретения. Примеры не включают в себя детального описания стандартных методов, например клонирования, трансфекции, и основных аспектов повышенной экспрессии белков в клеточных линиях. Такие методы известны средним специалистам.
Пример 1
Получение белка TNFR-Fc
Пример 1.1: Влияние Пониженной Температуры на Продуктивность Культуры Рекомбинантных Клеток СНО и на Качество Продукции Белка Слияния TNFR-Fc
Пример 1.1.1: Материалы и Методы
[00106] Клетки Яичника Китайского Хомячка (СНО) с повышенной экспрессией рекомбинантного TNFR-Fc помещали в одинаковых концентрациях и условиях в четыре отдельных лабораторных биореактора при 37.0°С. Клетки выращивали периодическим способом в культуре с подпиткой в течение одного дня, после чего изменяли температуру до 30.0°С, 29.0°С, 28.0°С или 27.0°С соответственно. Нижний предел заданного значения рН был равен 7.00. Из культуры ежедневно отбирали образец клеток для измерения различных параметров культуры клеток, например, общего числа жизнеспособных клеток, жизнеспособность клеток, профиля остаточной глюкозы, профиля остаточного лактата, концентраций лактата и аммония, интегрального среднего значений удельной продуктивности (Qp), титра продукта, уровней неправильно сложенного/агрегированного продукта, уровней агрегатов высокой молекулярной массы, уровней сиалирования и рН.
[00107] Общее число жизнеспособных клеток (IVC) подсчитывали путем измерения плотности клеток с использованием метода анализа плотности клеток (например, CEDEX®, Innovatis, Malvern, PA) и нормировали по средним величинам IVC в день сбора клеток. Средние величины IVC в день сбора клеток определяли путем расчета среднего арифметического общей плотности жизнеспособных клеток в день сбора (например, на 10 день) для всех исследованных экспериментальных условий. Затем все индивидуальные значения IVC нормировали по среднему IVC в день сбора клеток и получали нормированные значения.
[00108] Для измерения жизнеспособности клеток применяли окраску Трипановым синим с использованием метода измерения плотности клеток (например, CEDEX®, Innovatis, Malvern, PA). Кроме того, измеряли профиль остаточной глюкозы и профиль остаточного глютамина в культуре клеток с использованием Химического Анализатора BioProfile (Nova Biomedical, Waltham, MA). Концентрации продуктов метаболизма, лактата и аммония измеряли с использование химического анализатора BioProfile (Nova Biomedical, Waltham, MA).
[00109] Интегральное среднее продуктивности клеток (Qp) и титр продукта измеряли с использованием ВЭЖХ с белком А и нормировали относительно средних значений в день сбора клеток суммарного среднего Qp и титра. Средний титр в день сбора клеток определяли путем подсчета среднего арифметического титра в день сбора клеток (например, в день 10) для всех исследованных экспериментальных условий. Все индивидуальные значения титра затем приводили к титру среднего в день сбора и получали нормированные значения. Интегральную среднюю Qp среднего дневного урожая определяли путем подсчета среднего суммарного среднего Qp в день сбора для всех исследованных экспериментальных условий. Все индивидуальные значения затем нормировали по титру среднего в день урожая и получали нормированные значения.
[00110] Уровни неправильно свернутого/агрегированного продукта измеряли при помощи ВЭЖХ гидрофобных взаимодействий, а уровни агрегатов высокой молекулярной массы измеряли при помощи гель-ВЭЖХ. Уровни полного и N-связанного сиалирования гликанов измеряли, исследуя 2-аминобензамид-(2-АВ)-меченые гликоформы белка при помощи хроматографии с нормальными фазами (НФХ). Величину полного сиалирования (N- и O-связанного) определяли как отношение процентной доли к величине полного сиалирования контрольного материала, т.е. аликвоты TNFR-Fc с известным и предпочтительным паттерном сиалирования. рН культуры клеток определяли путем измерения в автономном режиме при помощи анализатора газов крови (Bayer Rapidlab 248 рН/ анализатора газов крови (Вауег Healthcare LLC. East Walpole, MA)).
Пример 1.1.2. Результаты
[00111] Выращивание клеток при пониженной температуре оказывало минимальный эффект на значение IVC. В частности, низкие рабочие температуры привели к снижению конечного значения IVC; однако влияние снижения температуры культуры клеток до 27°С было незначительным: наблюдали снижение значения IVC лишь примерно на 20% (ФИГ.1А). Снижение температуры не оказало существенного влияния на выживаемость клеток; при самом низком значении температуры (т.е. 27°) снижение жизнеспособности клеток в день сбора составило 5% (ФИГ.1В).
[00112] Также результатом пониженного температурного режима было повышение профиля остаточной глюкозы, что свидетельствует о сниженном потреблении глюкозы культурой клеток (ФИГ.2А); тем не менее, профили глютамина не изменились значительно при пониженных значениях температуры (ФИГ.2В).
[00113] В некоторых случаях, на поздних стадиях культивирования клеток, культура клеток также может потреблять молочную кислоту и аммиак. Прекращение продукции молочной кислоты и аммиака или потребление молочной кислоты и аммиака способствует выживаемости клеток, продуктивности клеток и может влиять на увеличение титра полипептидного продукта. Результатом выращивания клеток при пониженной температуре было изменение общего потребления лактата во второй половине периодического культивирования с подпиткой (ФИГ.3А). Результатом снижения значений температуры стало также повышение продукции аммиака (ФИГ.3В). Результатом понижения значений температуры было падение значений удельной продуктивности клеток (падение Qp) (ФИГ.4А) и падение значений титра продукта (ФИГ.4В). Падение значений титра продукта является результатом снижения удельной продуктивности клеток и снижения интегрированного числа жизнеспособных клеток. Тем не менее, снижение значений титра продукта и продуктивности клеток компенсировалось значительным снижением доли неправильно свернутого и агрегированного продукта (ФИГ.5А). Более того, снижение температуры культивирования клеток оказывало значительное влияние на снижение доли агрегатов высокой молекулярной массы в культуре клеток (ФИГ.5В). Таким образом, понижение температуры клеток обеспечивало получение улучшенного белкового продукта TNFR-Fc.
[00114] Указанное понижение температуры коррелировало со снижением общего сиалирования продукта (как N-и O-связанного сиалирования) (ФИГ.6А). Действительно, наблюдали прямую зависимость между понижением температуры культуры клеток и снижением содержания сиалированных N-связанных гликанов (ФИГ.6В), что указывало на то, что должна быть выбрана температура продукции, позволяющая уравновесить положительный эффект снижения доли HMWA и неправильно свернутого белка, и нежелательный эффект снижения уровня гликозилирования. Например, культивирование клеток при пониженной до 29.5°С температуре обеспечивало значительное снижение концентрации как неправильно свернутого, так и агрегированного TNFR-Fc, и в то же время оказывало минимальное влияние на уровень гликозилирования TNFR-Fc.
[00115] Различия в суммарном потреблении лактата между культурами клеток, выращиваемыми при разных значениях температур, вели к различиям в значении рН культур клеток во время сбора (ФИГ. 7). Причиной является тот факт, что большее суммарное потребление лактата (молочной кислоты) вело к большему повышению рН культуры в результате снижения содержания кислоты в среде.
Пример 1.2: Влияние пониженного рН на продуктивность культуры рекомбинантных клеток СНО и на качество продуцируемого белка слияния TNFR-Fc
Пример 1.2.1: Материалы и Методы
[00116] Клетки яичника китайского хомячка (СНО) с повышенной экспрессией рекомбинантного TNFR-Fc вносили в одинаковых концентрациях при 37.0°С и заданных значениях рН, равных 7.20, 7.10, 7.00, 6.90 и 6.80. Для предотвращения снижения рН культур ниже заданных значений добавляли гидрокарбонат натрия основной. Средства контроля рН выше заданного значения не использовались. Биореакторы устанавливали на изменение температуры до 30.0°С в день 1 (один день после инокуляции, т.е. через один день после начала эксперимента). Различные параметры культуры клеток измеряли, как описано в Примере 1.1.1.
Пример 1.2.2: Результаты
[00117] Выращивание клеток при заданных значениях рН, отличающихся от значения рН, равного 7.00, на 0.2 единицы рН, приводило к слабому снижению IVC. В частности, выращивание клеток при рН, равном 6.80, приводило к снижению IVC примерно на 15% по сравнению с клетками, культивированными при рН, равном 7.00 (ФИГ.8А). Кроме того, культивирование клеток при рН, равном 7.20, вело к снижению жизнеспособности клеток (ФИГ.8В).
[00118] Кроме того, результатом пониженных заданных рабочих значений рН было снижение потребления глюкозы (ФИГ.9А). Профили глютамина не изменились значительно при культивировании клеток при заданных значениях рН от 6.80 до 7.10 (ФИГ.9В).
[00119] Вполне ожидаемо, что повышенные заданные рабочие значения рН обеспечивали повышение продукции лактата (ФИГ.10А). При заданном значении рН, равном 6.80, общего потребления лактата во второй половине периодического процесса с подпиткой не наблюдалось. Результатом понижения заданных рабочих значений рН было снижение продукции аммиака (ФИГ.10В).
[00120] Различия в общем потреблении лактата во второй половине эксперимента вели к отклонениям значений рН культур от заданных рабочих значений рН, поскольку для поддержания рН использовали только основание, и не использовали кислоту (ФИГ.11А). В результате различий в заданных значениях рН, лактатных профилях и добавлениях титрантов при разных значениях рН различалась также осмоляльность (ФИГ.11В).
[00121] Культивирование клеток при заданных значениях рН, отличающихся от рН, равного 7.00, на 0.2 единицы, вело к небольшому падению удельных продуктивностей клеток (например, Qp) (ФИГ.12А). Результатом применения заданного значения рН, равного 6.80 или 7.20, было снижение титров продукта вследствие снижения как удельных продуктивностей клеток, так и общего числа жизнеспособных клеток (ФИГ.12В).
[00122] Однако результатом снижения заданных рабочих значений рН было снижение неправильного сворачивание продукта и его агрегации (ФИГ.13А). Кроме того, при пониженных заданных значениях рН наблюдали значительное уменьшение доли агрегатов высокой молекулярной массы (ФИГ.13В).
[00123] Результатом снижения заданных рабочих значений рН был пониженный общий уровень сиалирования (как N-, так и O-связанные гликаны) (ФИГ.14А), а также пониженная доля сиалирования N-связанных гликанов (ФИГ.14В). Поскольку величину общего сиалирования (N- и O-связанного) определяли как процентную долю значения общего сиалирования контрольного материала, любые значения ниже 100% отражали снижение уровня общего сиалирования, а значения выше 100% отражали повышение уровня общего сиалирования. Паттерн гликозилирования можно представить как гликановый профиль гликопротеина (ФИГ.15). Результатом культивирования клеток при пониженной температуре было значительное изменение общего профиля гликозилирования (ФИГ.16) Хотя при пониженном рН не обнаружили новых гликоформ, значительно изменилось соотношение уже существующих гликоформ; результатом культивирования клеток при пониженном рН было снижение содержания сложных ди- и моносиалированных гликоформ. Из-за потенциально неблагоприятного влияния пониженного рН на гликозилирование белка рН культуры клеток необходимо выбирать таким образом, чтобы нежелательное влияние на гликозилирование белков было сбалансировано благоприятным влиянием на снижение продукции неправильно свернутого и/или агрегированного белка. Например, культивирование клеток при пониженном рН, равном 6.95, приводило к значительному снижению процентного содержания неправильно свернутого и агрегированного белка TNFR-Fc и при этом оказывало минимальный эффект на гликозилирование.
Пример 1.3: Обсуждение
[00124] Описанные исследования показывают, что температуры в диапазоне от 27.0°С до 30.0°С или рН в диапазоне установленных значений от 6.80 до 7.20 могут оказывать значительное влияние на рост клеток и удельную продуктивность культуры клеток. При этом в то время как изменение температуры всего на 1-2°С и установленных значений рН всего на 0.1-0.2 не оказывает значительного влияния на рост клеток и удельную продуктивность, наблюдали значительные (благоприятные) изменения в сворачивании белков и агрегации белков. Таким образом, небольшие различия в условиях культивирования, не оказывающие значительного влияния на рост, выживаемость или продуктивность клеток, могут в значительной степени изменять качество продукта, например, понижая неправильное сворачивание и агрегацию белка или влияя на процесс гликозилирования.
Пример 2
Влияние температуры на продукцию sIL-13R и оценка новой клеточной линии, продуцирующей sIL-13R
Пример 2.1: Материалы и Методы
[00125] Стабильно трансфецированные клетки яичника китайского хомячка (СНО), с повышенной экспрессией рекомбинантного гликопротеина sIL-13R инокулировали в биореакторы Applikon в концентрациях, равных 3×105 клеток/мл, в питательную среду с антивспенивателем Antifoam (Dow Corning Corporation, Midland, MI, США). При необходимости добавляли дополнительный антивспениватель. В качестве среды для культивирования использовали концентрированную питательную среду. Нижний предел заданных значений рН был равен 6.80. Заданное значение dO2 было равно 23%, с использованием 7% CO2/93% газа для продувки, при перемешивании 200 об/мин. Биореакторы устанавливали на изменение температуры с 37.0°С в день 5. Значения температуры фазы продуцирования были равны 37.0°С, 33.0°С, 32.0°С, 28.0°С, или комнатной температуре (КТ; около 24.0°С). Режимы подпитки для условий эксперимента суммированы в Таблице. Объемы подпитки приведены как проценты от объема культуры в биореакторе. Изменение температуры в культуре клеток проводили при концентрации 6×106 клеток/мл.
| Режимы подпитки биореактора | ||||||
| Условия эксперимента | 37.0°С | 33.0°C | 32.0°С | 31.0°C | 29.0°C | КT |
| ДЕНЬ | ||||||
| 3 | 10.2% | 10.2% | 10.2% | 10.2% | 10.2% | 10.2% |
| 5 | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% |
| 6 | 5% | |||||
| 7 | 10.2% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% |
| 9 | 10.2% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% |
| 11 | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% |
| 13 | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% | |
| 16 | 5% | 5% | 5% | 5% | ||
Пример 2.2. Результаты
[00126] Значения плотности жизнеспособных клеток, достигнутые после изменения температуры, были немного ниже при КТ (примерно 6×106 клеток/мл) и 29.0°С (примерно 7×106 клеток/мл), чем при более высоких значениях температуры (примерно 8×106 клеток/мл) (ФИГ.17А). Аналогично, значения общей плотности клеток после изменения температуры были немного ниже при КТ (примерно 6.5×106 клеток/мл) и 29.0°С (примерно 7.5×106 клеток/мл), чем при более высоких значениях температуры (примерно 8-9×106 клеток/мл) (ФИГ.17В). Выживаемость лучше поддерживали в культуре с подпиткой при низких значениях температуры (ФИГ.17С). Уровень отклонения значений выживаемости варьировал в зависимости от температуры; профили выживаемости культур при КТ и 29.0°С были значительно выше, чем у остальных культур 31.0°С, 32.0°С, 33.0°С и 37.0°С (ФИГ.17С).
[00127] К концу 18-дневного периода культивирования с подпиткой самый высокий титр (суммарный титр димера и HMWA sIL-13R) был достигнут в культуре с температурой 31.0°С, за которой следовала культура при 32.0°С (188 мг/л), 29.0°С культура (178 мг/л) и 33.0°С культура (151 мг/л) (ФИГ.18). КТ и 37.0°С культуры имели значительно более низкие титры. Удельная продуктивность клеток, или ежедневный удельный уровень продукции sIL-13R (Qp), линии клеток, продуцирующей sIL-13R, был значительно ниже при КТ и 37.0°С (ФИГ.19А). Также интегральные средние удельных продуктивностей, или интегральные средние Qp, были ниже при 37.0°С и КТ (ФИГ.19В). Интересен тот факт, что значительные увеличения в значениях удельной продуктивности, наблюдавшиеся к концу культивирования клеток в культурах при 37.0°С, 33.0°С, 32.0°С, и 31.0°С, соответствовали значительным снижениям выживаемости культур (данные не приведены).
[00128] Удельная скорость потребления глюкозы (Qglc) снижалась с понижением температуры (ФИГ.20). Удельная скорость потребления глютамина (Qgln) также, очевидно, уменьшалась с понижением температуры (ФИГ.21). Тем не менее следует отметить, что данные по удельной скорости потребления глютамина не учитывали разрушение глютамина в питательной среде, которое будет происходить тем активнее, чем выше температура. Таким образом, данные по влиянию температуры на удельную скорость потребления глютамина могут быть искажены. Профили концентрации лактата для КТ, 29.0°С, 31.0°С, и 32.0°С культур совпадали с максимальными концентрациями лактата или с концентрациями в день изменения температуры и затем снижались до 0.7 и 2.0 к/л к дню 18 (ФИГ.22). Для 33.0°С и 37.0°С культур профили лактата были такими же, как и у других культур в течение фазы роста, но значительно отличались в течение фазы продуцирования. Для 33.0°С культуры концентрация лактата не снизилась после изменения температуры и фактически осталась постоянной. Для культуры при 37.0°С уровень лактата повышался в течение всего срока периодического культивирования.
[00129] Концентрация аммиака в течение фазы продуцирования изменялась в зависимости от температуры (ФИГ.23). Для культуры при 29.0°С концентрация аммиака достигала пика примерно в день изменения температуры, снижалась в течение промежуточной стадии периодического культивирования, а затем возрастала в течение заключительной стадии периодического культивирования. При увеличении температуры до значения примерно 29.0°С увеличение концентрации аммиака в течение заключительной стадии периодического культивирования возрастало и происходило раньше. Для культуры при 37.0°С концентрация аммиака возрастала в течение всего цикла периодического культивирования с подпиткой. Для культуры при КТ уровни аммиака после изменения температуры оставались практически постоянными.
[00130] Пробы кондиционированной среды из описанных биореакторов исследовали на наличие агрегатов высокой молекулярной массы (HMWA) при помощи эксклюзионной хроматографии (гель-хроматографии) элюатов хроматографии с белком А для каждой культуры. Тенденцией, ставшей очевидной из результатов анализа линии клеток, был относительный рост процентной доли HMWA, присутствующего в кондиционированной среде, при повышении температуры (ФИГ.24 и ФИГ.25). Таким образом, низкие рабочие температуры при культивировании клеток обеспечивают снижение агрегации продукта sIL-13R.
[00131] Снижение процентной доли димера sIL-13R коррелировало с увеличением процентной доли HMWA. (ФИГ.26А и 26В). В КТ культуре наблюдали более низкий % HMWA, чем в других культурах (ФИГ.26В), а также более высокой процент образования димера. (ФИГ.26А). КТ культура и культура при 31.0°С давали одинаковый титр одного димера, а культура при 29.0°С давала самый высокий титр только димера (ФИГ.27).
[00132] Для подтверждения заключений, сделанных по результатам анализа методом гель-хроматографии, образцы кондиционированной среды исследовали, используя Вестерн блот. Наблюдали качественные различия в количествах sIL-13R, существующего в виде HMWA, в сравнении с димерной формой. Вестерн блот продемонстрировал тенденцию к увеличению количества агрегатов HMWA, присутствующих в кондиционированной среде, относительно количества присутствующего димера, с увеличением температуры (данные не приведены).
[00133] Описанные эксперименты демонстрируют важность влияния температурозависимых изменений жизнеспособности и плотности жизнеспособных клеток, удельной продуктивности и образования HMWA на волюметрическую продуктивность димера sIL-13R. Хотя культура при 31.0°С обеспечивала самый высокий титр (измерения включали в себя HMWA и димерную форму), культуры, выращиваемые при более низких температурах (например, 29.0°С), могут обеспечивать сравнимую или лучшую волюметрическую продуктивность, измеряемую как содержание только димера.
Claims (23)
1. Способ получения белка, представляющего собой растворимый рецептор, в культуре клеток млекопитающего, включающий
(a) выращивание клеток в культуре клеток при пониженной температуре, при этом значение указанной пониженной температуры находится в диапазоне от 27,0°С до менее 30,0°С; и
(b) выращивание клеток в культуре клеток при пониженном рН, при этом пониженное значение рН находится в диапазоне от 6,8 до менее 7,0, причем полученный белковый продукт характеризуется сниженным количеством неправильно свернутых и/или агрегированных белков.
(a) выращивание клеток в культуре клеток при пониженной температуре, при этом значение указанной пониженной температуры находится в диапазоне от 27,0°С до менее 30,0°С; и
(b) выращивание клеток в культуре клеток при пониженном рН, при этом пониженное значение рН находится в диапазоне от 6,8 до менее 7,0, причем полученный белковый продукт характеризуется сниженным количеством неправильно свернутых и/или агрегированных белков.
2. Способ по п.1, в котором культура клеток представляет собой крупномасштабную культуру клеток.
3. Способ по п.1, в котором культура клеток представляет собой периодическую культуру с подпиткой.
4. Способ по п.1, в котором культура клеток представляет собой культуру клеток СНО.
5. Способ по п.1, в котором растворимый рецептор представляет собой sIL-13R.
6. Способ по п.1, в котором растворимый рецептор представляет собой TNFR-Fc.
7. Способ по п.6, в котором пониженная температура составляет 29,5°С.
8. Способ по п.6, в котором пониженный рН составляет 6,95.
9. Способ по п.1, в котором получаемый белок представляет собой терапевтический белок.
10. Способ по п.9, дополнительно включающий этап выделения белка из культуры клеток.
11. Способ по п.10, в котором белок дополнительно очищают или перерабатывают в препарат.
12. Способ получения белка в культуре клеток млекопитающего, включающий
(a) выращивание указанной культуры клеток при значении температуры, которое находится в диапазоне от 27,0°С до менее 30,0°С, причем уровень гликозилирования получаемого белка увеличивается при увеличении температуры или уменьшается при уменьшении температуры до определенного заранее уровня и
(b) выращивание указанной культуры клеток при значении рН, которое находится в диапазоне от 6,8 до менее 7,0, причем уровень гликозилирования получаемого белка увеличивается при увеличении рН или уменьшается при уменьшении рН до определенного заранее уровня, при этом получаемый белок представляет собой растворимый рецептор.
(a) выращивание указанной культуры клеток при значении температуры, которое находится в диапазоне от 27,0°С до менее 30,0°С, причем уровень гликозилирования получаемого белка увеличивается при увеличении температуры или уменьшается при уменьшении температуры до определенного заранее уровня и
(b) выращивание указанной культуры клеток при значении рН, которое находится в диапазоне от 6,8 до менее 7,0, причем уровень гликозилирования получаемого белка увеличивается при увеличении рН или уменьшается при уменьшении рН до определенного заранее уровня, при этом получаемый белок представляет собой растворимый рецептор.
13. Способ по п.12, в котором гликозилирование белков представляет собой сиалирование N-гликанов.
14. Способ по п.12, в котором культура клеток представляет собой крупномасштабную культуру клеток.
15. Способ по п.12, в котором культура клеток представляет собой периодическую культуру с подпиткой.
16. Способ по п.12, в котором культура клеток представляет собой культуру клеток СНО.
17. Способ по п.12, в котором растворимый рецептор представляет собой TNFR-Fc.
18. Способ по п.12, в котором растворимый рецептор представляет собой sIL-13R.
19. Способ по п.12, в котором получаемый белок представляет собой терапевтический белок.
20. Способ по п.19, дополнительно включающий этап выделения белка из культуры клеток.
21. Способ по п.20, в котором белок дополнительно очищают или перерабатывают в препарат.
22. Способ получения фармацевтической композиции, включающий объединение терапевтического белка, полученного способом согласно пп.9, 10 или 11, и фармацевтически приемлемого носителя.
23. Способ получения фармацевтической композиции, включающий объединение терапевтического белка, полученного способом согласно пп.19, 20 или 21 и фармацевтически приемлемого носителя.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US91338207P | 2007-04-23 | 2007-04-23 | |
| US60/913,382 | 2007-04-23 | ||
| PCT/US2008/061123 WO2008131374A1 (en) | 2007-04-23 | 2008-04-22 | Use of low temperature and/or low ph in cell culture |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009139054A RU2009139054A (ru) | 2011-05-27 |
| RU2478702C2 true RU2478702C2 (ru) | 2013-04-10 |
Family
ID=39493848
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009139054/10A RU2478702C2 (ru) | 2007-04-23 | 2008-04-22 | ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И/ИЛИ НИЗКОГО pН В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК |
| RU2009138226/10A RU2009138226A (ru) | 2007-04-23 | 2008-04-22 | Способы производства белка с использованием соединений, препятствующих старению |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009138226/10A RU2009138226A (ru) | 2007-04-23 | 2008-04-22 | Способы производства белка с использованием соединений, препятствующих старению |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9988662B2 (ru) |
| EP (2) | EP2139986B1 (ru) |
| JP (3) | JP5557736B2 (ru) |
| KR (3) | KR101560421B1 (ru) |
| CN (3) | CN105039473A (ru) |
| AR (2) | AR066239A1 (ru) |
| AU (2) | AU2008242632B2 (ru) |
| BR (2) | BRPI0810511A2 (ru) |
| CA (2) | CA2684727C (ru) |
| CL (2) | CL2008001156A1 (ru) |
| CO (2) | CO6241165A2 (ru) |
| DK (2) | DK2139987T5 (ru) |
| ES (2) | ES2424217T3 (ru) |
| HK (1) | HK1216261A1 (ru) |
| HU (1) | HUE034776T2 (ru) |
| IL (2) | IL201720A (ru) |
| MX (2) | MX2009011362A (ru) |
| PA (2) | PA8777701A1 (ru) |
| PE (2) | PE20090731A1 (ru) |
| PL (2) | PL2139987T3 (ru) |
| PT (2) | PT2139987E (ru) |
| RU (2) | RU2478702C2 (ru) |
| SI (2) | SI2139987T1 (ru) |
| TW (2) | TW200902708A (ru) |
| WO (2) | WO2008131374A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200907426B (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732237C2 (ru) * | 2015-10-15 | 2020-09-14 | Элтеоджен, Инк. | Способ получения афлиберцепта |
| US12421322B2 (en) | 2017-11-01 | 2025-09-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody variant and isoform with lowered biological activity |
Families Citing this family (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
| CA2842964A1 (en) | 2006-09-13 | 2008-03-20 | Abbvie Inc. | Cell culture improvements |
| US9012180B2 (en) | 2007-03-02 | 2015-04-21 | Wyeth Llc | Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides |
| EP2188371B1 (en) | 2007-08-09 | 2017-12-20 | Wyeth LLC | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| WO2010034015A2 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Modulating the alternative complement pathway |
| NZ592095A (en) | 2008-10-20 | 2013-01-25 | Abbott Lab | Isolation and purification of il-12 and tnf-alpha antibodies using protein a affinity chromatography |
| AU2009307737B2 (en) | 2008-10-20 | 2015-07-23 | Abbvie Inc. | Viral inactivation during purification of antibodies |
| JP2013512674A (ja) * | 2009-12-02 | 2013-04-18 | アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド | Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための組成物および方法 |
| LT3330370T (lt) | 2010-04-26 | 2021-06-10 | Novartis Ag | Cho ląstelių auginimo būdas |
| NZ611862A (en) | 2010-12-28 | 2015-05-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Animal cell culturing method |
| US9062106B2 (en) | 2011-04-27 | 2015-06-23 | Abbvie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| WO2012170938A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Acceleron Pharma Inc. | Compositions and methods for increasing serum half-life |
| US9150645B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-10-06 | Abbvie, Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
| US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| EP2890782A1 (en) | 2012-09-02 | 2015-07-08 | AbbVie Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| HK1207960A1 (en) | 2013-03-12 | 2016-02-19 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
| WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| BR112015021993A8 (pt) * | 2013-03-15 | 2019-12-03 | Genentech Inc | polipeptídeo, métodos para sua produção, métodos para cultivo de uma célula, composição farmacêutica, kit, e meio de cultura celular |
| EP2978498B1 (en) * | 2013-03-26 | 2019-07-03 | Coherus Biosciences, Inc. | Protein production method |
| WO2014182658A1 (en) * | 2013-05-06 | 2014-11-13 | Abbvie Inc. | Compositions for cell culture and methods of using the same |
| US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
| US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| USD759075S1 (en) * | 2014-04-11 | 2016-06-14 | Nutonian, Inc. | Display screen with graphical user interface |
| USD759076S1 (en) * | 2014-04-18 | 2016-06-14 | Nutonian, Inc. | Display screen with graphical user interface |
| TW202204596A (zh) | 2014-06-06 | 2022-02-01 | 美商健臻公司 | 灌注培養方法及其用途 |
| EP3207132B1 (en) | 2014-10-15 | 2019-07-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of shifting an isoelectric profile of a protein product and uses thereof |
| AR104050A1 (es) | 2015-03-26 | 2017-06-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Proceso de producción con iones de cobre controlados |
| TW202440903A (zh) | 2015-08-04 | 2024-10-16 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法（一） |
| WO2017065559A1 (ko) * | 2015-10-15 | 2017-04-20 | (주)알테오젠 | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
| CN107460221B (zh) * | 2016-06-02 | 2021-01-15 | 正大天晴药业集团股份有限公司 | 一种降低抗pd-l1抗体中蛋白聚合物的细胞培养方法 |
| WO2018073365A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing an immunoconjugate |
| EP3571289A1 (en) * | 2017-02-17 | 2019-11-27 | Lonza Ltd | A method for producing biologic product variants |
| KR20240149973A (ko) * | 2017-10-16 | 2024-10-15 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 세포 배양에서 공정 변수를 제어하기 위한 원위치 라만 분광법 시스템 및 방법 |
| US20220364034A1 (en) * | 2018-11-02 | 2022-11-17 | WuXi Biologics Ireland Limited | Cell culture process by intensified perfusion with continuous harvest and without cell bleeding |
| MX2021010414A (es) * | 2019-03-04 | 2021-09-14 | Amgen Inc | Reversibilidad in vivo de especies de alto peso molecular. |
| AU2021205312A1 (en) | 2020-01-09 | 2022-07-14 | Mersana Therapeutics, Inc. | Site specific antibody-drug conjugates with peptide-containing linkers |
| JP2022184798A (ja) * | 2021-06-01 | 2022-12-13 | ファイザー・インク | ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを生産するための細胞培養方法 |
| KR102682066B1 (ko) * | 2021-10-12 | 2024-07-05 | 프레스티지바이오로직스 주식회사 | 항체 집단의 제조 방법 |
| AU2023411740A1 (en) * | 2022-12-23 | 2025-07-31 | Cell Exosome Therapeutics Inc. | Utilization of mesenchymal stem cells or culture supernatant thereof |
| CN120752329A (zh) * | 2023-02-03 | 2025-10-03 | 安进公司 | 细胞培养方法 |
| CN118166053B (zh) * | 2024-03-15 | 2025-02-07 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 一种制备低o-糖基化水平的重组人白蛋白的方法 |
| CN118006716B (zh) * | 2024-03-15 | 2024-09-10 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 制备高表达且低o-糖基化水平的重组人白蛋白的方法 |
| TWI891362B (zh) * | 2024-05-10 | 2025-07-21 | 國立臺灣大學 | 鴨蛋白水解物及其製備方法及增強肌肉耐力與抗疲勞用途 |
| WO2025248500A1 (en) | 2024-05-31 | 2025-12-04 | Janssen Biotech, Inc. | Antibody drug conjugates that target enpp3 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003044210A2 (en) * | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing insulin compounds |
| WO2003083066A2 (en) * | 2002-03-27 | 2003-10-09 | Immunex Corporation | Methods for increasing polypeptide production |
| RU2259212C2 (ru) * | 2001-03-16 | 2005-08-27 | Сербиос-Фарма С.А. | Способ получения фармацевтически активных рекомбинантных белков |
Family Cites Families (82)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US5225539A (en) * | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| DE768377T1 (de) | 1988-09-02 | 1998-01-02 | Dyax Corp | Herstellung und Auswahl von Rekombinantproteinen mit verschiedenen Bindestellen |
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| JPH0396383A (ja) | 1989-09-08 | 1991-04-22 | Riso Kagaku Corp | 画像形成装置 |
| DE10399023I2 (de) * | 1989-09-12 | 2006-11-23 | Ahp Mfg B V | TFN-bindende Proteine |
| GB8927546D0 (en) | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| US5859205A (en) * | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| US5610033A (en) | 1990-04-25 | 1997-03-11 | Novo Nordisk A/S | Method of producing proteins with FVIII activity and/or FVIII derivatives |
| US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| DK0585287T3 (da) | 1990-07-10 | 2000-04-17 | Cambridge Antibody Tech | Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer |
| GB9021679D0 (en) | 1990-10-05 | 1990-11-21 | Gorman Scott David | Antibody preparation |
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| WO1992009298A1 (en) | 1990-11-23 | 1992-06-11 | Peptide Technology Ltd. | The delay, prevention and/or reversal of cell senescence |
| CA2095633C (en) | 1990-12-03 | 2003-02-04 | Lisa J. Garrard | Enrichment method for variant proteins with altered binding properties |
| ES2287206T3 (es) | 1991-03-01 | 2007-12-16 | Dyax Corporation | Proceso para el desarrollo de mini-proteinas de union. |
| WO1992018619A1 (en) | 1991-04-10 | 1992-10-29 | The Scripps Research Institute | Heterodimeric receptor libraries using phagemids |
| EP0940468A1 (en) * | 1991-06-14 | 1999-09-08 | Genentech, Inc. | Humanized antibody variable domain |
| DE4122599C2 (de) | 1991-07-08 | 1993-11-11 | Deutsches Krebsforsch | Phagemid zum Screenen von Antikörpern |
| US6136310A (en) * | 1991-07-25 | 2000-10-24 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
| DE69330523D1 (de) | 1992-08-21 | 2001-09-06 | Vrije Universiteit Brussel Bru | Immunoglobuline ohne leichte ketten |
| US5399677A (en) * | 1993-12-07 | 1995-03-21 | Genetics Institute, Inc. | Mutants of bone morphogenetic proteins |
| SG47030A1 (en) | 1994-01-03 | 1998-03-20 | Genentech Inc | Thrombopoietin |
| US5516964A (en) * | 1994-01-21 | 1996-05-14 | Sun Company, Inc. (R&M) | Hydrocarbon isomerization using solid superacid catalysts comprising platinum metal |
| EP0822830B1 (en) | 1995-04-27 | 2008-04-02 | Amgen Fremont Inc. | Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice |
| EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
| US5705364A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
| US5721121A (en) * | 1995-06-06 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein |
| US5830761A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-03 | Genetics Institute, Inc. | Medium and methods for culturing mammalian cho cells |
| ES2176484T3 (es) * | 1995-08-18 | 2002-12-01 | Morphosys Ag | Bancos de proteinas/(poli)peptidos. |
| JP4306813B2 (ja) | 1995-09-19 | 2009-08-05 | アスビオファーマ株式会社 | 動物細胞の新規培養方法 |
| US5710023A (en) * | 1996-03-01 | 1998-01-20 | Genetics Institute, Inc. | IL-13 cytokine receptor chain |
| US6146847A (en) * | 1996-11-01 | 2000-11-14 | Genespan Corporation | Stabilized transient gene expression |
| EP1500329B1 (en) * | 1996-12-03 | 2012-03-21 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies that specifically bind human TNF alpha |
| ATE319745T1 (de) | 1997-05-21 | 2006-03-15 | Biovation Ltd | Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen |
| WO1999035255A2 (en) | 1998-01-12 | 1999-07-15 | Betagene, Inc. | Compositions and methods for regulated secretion from neuroendocrine cell lines |
| AU776910B2 (en) | 1998-12-08 | 2004-09-23 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Modifying protein immunogenicity |
| TR200504220T2 (tr) | 1998-12-17 | 2007-04-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem. |
| US7294481B1 (en) | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
| BR0010361A (pt) | 1999-04-30 | 2003-06-10 | Chiron Corp | Seq ências genÈmicas de neisseria e uso destas |
| JP3090657B1 (ja) | 1999-08-09 | 2000-09-25 | 伸子 蓮山 | ゼオライト製造方法およびゼオライト製造装置 |
| EP1103615A1 (en) | 1999-11-25 | 2001-05-30 | Universite De Geneve | Vectors capable of immortalizing non-dividing cells and cells immortalized with said vectors |
| AUPR038200A0 (en) * | 2000-09-26 | 2000-10-19 | Beta Peptide Foundation Pty Ltd, The | Compositions and methods for delaying, preventing, rejuvenating or reversing senescence |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| US6544076B2 (en) | 2001-07-10 | 2003-04-08 | Alan L. Pocrass | Dual function RJ connector |
| CA2417689C (en) | 2002-03-05 | 2006-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved methods for growing mammalian cells in vitro |
| GB0208041D0 (en) | 2002-04-08 | 2002-05-22 | Lonza Biologics Plc | Method of culturing animal cells |
| JP2005532057A (ja) | 2002-07-09 | 2005-10-27 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地 |
| SI1543106T1 (sl) | 2002-07-15 | 2007-08-31 | Immunex Corp | Postopki in mediji za nadziranje sialilacije proteinov, ki jih proizvajajo sesalske celice |
| US6924124B1 (en) | 2002-08-23 | 2005-08-02 | Immunex Corporation | Feeding strategies for cell culture |
| US7261893B2 (en) | 2002-10-22 | 2007-08-28 | Wyeth | Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor |
| JP4541157B2 (ja) | 2002-12-23 | 2010-09-08 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | タンパク質を製造するための哺乳類細胞培養法 |
| JP2007525176A (ja) | 2003-04-25 | 2007-09-06 | イミュネックス・コーポレーション | 組換えタンパク質発現の誘導剤 |
| CN1565631A (zh) * | 2003-06-27 | 2005-01-19 | 上海中信国健药业有限公司 | 肿瘤坏死因子受体－免疫球蛋白的融合蛋白用于急性肺损伤药物的用途 |
| KR101221862B1 (ko) | 2003-10-27 | 2013-01-14 | 와이어쓰 엘엘씨 | 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용한 고분자량응집체의 제거 |
| WO2005064013A1 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Bart Janssen | The use of carnosine metabolism-associated genes to determine genetic predisposition/susceptibility to diabetic nephropathy |
| EP2156852B1 (en) * | 2004-07-07 | 2011-04-13 | Coloplast A/S | Catheter comprising ESTANE 58212. |
| JP2008505174A (ja) | 2004-07-15 | 2008-02-21 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化Ｆｃ変異体 |
| US7700318B2 (en) | 2004-08-25 | 2010-04-20 | Amprotein Corporation | Chimeric polypeptide and use thereof |
| US7335491B2 (en) * | 2004-08-27 | 2008-02-26 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of anti-abeta |
| TWI384069B (zh) * | 2004-08-27 | 2013-02-01 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | 多胜肽之製法 |
| TWI364458B (en) * | 2004-08-27 | 2012-05-21 | Wyeth Res Ireland Ltd | Production of tnfr-lg |
| US7426440B2 (en) * | 2004-09-24 | 2008-09-16 | Nutritional Bioscience Ltd. | Repair and protection factor scoring method for bioactive agents |
| US20070102622A1 (en) | 2005-07-01 | 2007-05-10 | Olsen Richard I | Apparatus for multiple camera devices and method of operating same |
| WO2007011595A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Neural regeneration peptides and antioxidants protect neurons from degeneration |
| DE102005034616B4 (de) * | 2005-07-18 | 2008-07-03 | Elringklinger Ag | Brennstoffzelleneinheit und Brennstoffzellenstapel |
| AR058140A1 (es) * | 2005-10-24 | 2008-01-23 | Wyeth Corp | Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia |
| DK2041270T3 (da) * | 2006-07-13 | 2014-01-27 | Wyeth Llc | Fremstilling af glycoproteiner |
| US9012180B2 (en) | 2007-03-02 | 2015-04-21 | Wyeth Llc | Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides |
| EP2188371B1 (en) | 2007-08-09 | 2017-12-20 | Wyeth LLC | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| KR102889975B1 (ko) | 2021-09-15 | 2025-11-24 | 컨템포러리 엠퍼렉스 테크놀로지 (홍콩) 리미티드 | 배터리 셀, 배터리, 전기 장치, 배터리 셀의 제조 방법 및 기기 |
-
2008
- 2008-04-10 TW TW097112974A patent/TW200902708A/zh unknown
- 2008-04-21 PE PE2008000686A patent/PE20090731A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-04-22 PL PL08746528T patent/PL2139987T3/pl unknown
- 2008-04-22 ES ES08746528T patent/ES2424217T3/es active Active
- 2008-04-22 CN CN201510351048.1A patent/CN105039473A/zh active Pending
- 2008-04-22 WO PCT/US2008/061123 patent/WO2008131374A1/en not_active Ceased
- 2008-04-22 PE PE2008000691A patent/PE20090153A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-04-22 KR KR1020097024259A patent/KR101560421B1/ko active Active
- 2008-04-22 JP JP2010506424A patent/JP5557736B2/ja active Active
- 2008-04-22 BR BRPI0810511-1A2A patent/BRPI0810511A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-04-22 EP EP08746526.6A patent/EP2139986B1/en not_active Revoked
- 2008-04-22 AR ARP080101678A patent/AR066239A1/es unknown
- 2008-04-22 PA PA20088777701A patent/PA8777701A1/es unknown
- 2008-04-22 CA CA2684727A patent/CA2684727C/en active Active
- 2008-04-22 PT PT87465282T patent/PT2139987E/pt unknown
- 2008-04-22 MX MX2009011362A patent/MX2009011362A/es active IP Right Grant
- 2008-04-22 EP EP08746528.2A patent/EP2139987B9/en active Active
- 2008-04-22 SI SI200830998T patent/SI2139987T1/sl unknown
- 2008-04-22 SI SI200831866T patent/SI2139986T1/sl unknown
- 2008-04-22 RU RU2009139054/10A patent/RU2478702C2/ru active
- 2008-04-22 KR KR1020097023172A patent/KR101540124B1/ko active Active
- 2008-04-22 AU AU2008242632A patent/AU2008242632B2/en active Active
- 2008-04-22 MX MX2009011363A patent/MX2009011363A/es active IP Right Grant
- 2008-04-22 PL PL08746526T patent/PL2139986T3/pl unknown
- 2008-04-22 WO PCT/US2008/061125 patent/WO2008131375A1/en not_active Ceased
- 2008-04-22 CN CN200880013317.1A patent/CN101668845B/zh active Active
- 2008-04-22 TW TW097114607A patent/TW200902709A/zh unknown
- 2008-04-22 DK DK08746528.2T patent/DK2139987T5/da active
- 2008-04-22 CL CL2008001156A patent/CL2008001156A1/es unknown
- 2008-04-22 BR BRPI0810482-4A2A patent/BRPI0810482A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-04-22 AU AU2008242633A patent/AU2008242633B2/en active Active
- 2008-04-22 DK DK08746526.6T patent/DK2139986T3/en active
- 2008-04-22 AR ARP080101677A patent/AR066238A1/es unknown
- 2008-04-22 CN CN200880013275A patent/CN101679943A/zh active Pending
- 2008-04-22 US US12/107,264 patent/US9988662B2/en active Active
- 2008-04-22 US US12/107,533 patent/US12054762B2/en active Active
- 2008-04-22 ES ES08746526.6T patent/ES2646090T3/es active Active
- 2008-04-22 CL CL2008001159A patent/CL2008001159A1/es unknown
- 2008-04-22 HU HUE08746526A patent/HUE034776T2/en unknown
- 2008-04-22 PT PT87465266T patent/PT2139986T/pt unknown
- 2008-04-22 JP JP2010506425A patent/JP2010524504A/ja active Pending
- 2008-04-22 RU RU2009138226/10A patent/RU2009138226A/ru not_active Application Discontinuation
- 2008-04-22 KR KR20147030274A patent/KR20140132016A/ko not_active Ceased
- 2008-04-22 CA CA2685552A patent/CA2685552C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-04-23 PA PA20088778001A patent/PA8778001A1/es unknown
-
2009
- 2009-10-21 CO CO09117978A patent/CO6241165A2/es not_active Application Discontinuation
- 2009-10-22 IL IL201720A patent/IL201720A/en active IP Right Grant
- 2009-10-22 CO CO09118627A patent/CO6241166A2/es not_active Application Discontinuation
- 2009-10-22 ZA ZA200907426A patent/ZA200907426B/xx unknown
- 2009-10-22 IL IL201719A patent/IL201719A/en active IP Right Grant
-
2014
- 2014-01-31 JP JP2014016511A patent/JP5881755B2/ja active Active
-
2016
- 2016-04-13 HK HK16104245.7A patent/HK1216261A1/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2259212C2 (ru) * | 2001-03-16 | 2005-08-27 | Сербиос-Фарма С.А. | Способ получения фармацевтически активных рекомбинантных белков |
| WO2003044210A2 (en) * | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing insulin compounds |
| WO2003083066A2 (en) * | 2002-03-27 | 2003-10-09 | Immunex Corporation | Methods for increasing polypeptide production |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BORYS M.C. et al. Culture pH affects expression rates and glycosylation of recombinant mouse placental lactogen proteins by Chinese hamster ovary (CHO) cells. BIOTECHNOLOGY (NATURE PUBLISHING COMPANY). 1993, v.11, n.6, p.720-724. * |
| TRUMMER E. et al. Process parameter shifting. Part I. Effect of DOT, pH, and temperature on the performance of Epo-Fc expressing CHO cells cultivated in controlled batch bioreactors. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING. 2006, v.94, n.6, p.1033-1044. YOON S.K. et al. Effect of culture pH on erythropoietin production by chinese hamster ovary cells grown in suspension at 32.5 and 37.0 DEG C. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING. 2005, v.89, n.3, p.345-356. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732237C2 (ru) * | 2015-10-15 | 2020-09-14 | Элтеоджен, Инк. | Способ получения афлиберцепта |
| US11414476B2 (en) | 2015-10-15 | 2022-08-16 | Alteogen, Inc. | Method for producing fusion protein having IgG Fc domain |
| US12421322B2 (en) | 2017-11-01 | 2025-09-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody variant and isoform with lowered biological activity |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2478702C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И/ИЛИ НИЗКОГО pН В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК | |
| US20230365920A1 (en) | Use Of Perfusion To Enhance Production Of Fed-batch Cell Culture In Bioreactors | |
| CN1166772C (zh) | 调控由哺乳动物细胞培养物产生的蛋白质唾液酸化的方法 | |
| US6528286B1 (en) | Mammalian cell culture process for producing glycoproteins | |
| JP2020124216A (ja) | 糖タンパク質のグリカン含量のレベルを操作するためのプロセス | |
| US20140087423A1 (en) | Method for Controlling the Main Complex N-Glycan Structures and the Acidic Variants and Variability in Bioprocesses Producing Recombinant Proteins | |
| US9340592B2 (en) | CHO/CERT cell lines | |
| KR20160113710A (ko) | 관류 배지 | |
| HK1142624A (en) | Use of low temperature and/or low ph in cell culture | |
| WO2023079058A1 (en) | Cell culture with reduced production of lactate | |
| HK1017903B (en) | Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture |