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CN118166053B - 一种制备低o-糖基化水平的重组人白蛋白的方法 - Google Patents

一种制备低o-糖基化水平的重组人白蛋白的方法 Download PDF

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CN118166053B
CN118166053B CN202410295110.9A CN202410295110A CN118166053B CN 118166053 B CN118166053 B CN 118166053B CN 202410295110 A CN202410295110 A CN 202410295110A CN 118166053 B CN118166053 B CN 118166053B
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Tonghua Anruite Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种制备低O‑糖基化水平的重组人白蛋白的方法，包括在发酵过程中至少采取一种措施提高菌株的生长速率、降低蛋白质O‑糖基化水平，具体还包括S1、种子液制备；S2、将BSM培养基投入发酵罐，调节pH至5.0‑5.8、灭菌，待冷却后校正溶氧，设置温度和通气量，向培养基中加入已除菌的PTM1溶液，并再次调节培养基pH至5.0‑5.8；S3、将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧、设置转速；S4、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油补料；S5、甘油补料和甲醇补料同时流加，pH调至6.0‑6.5，降温；S6、流加甲醇补料；S7、发酵结束后，放罐，发酵产物离心，收集上清；本发明的方法可减少蛋白O‑糖基化，所表达的重组蛋白含有极低水平的糖基化修饰。

Description

一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，属于医药领域。
背景技术
人血清白蛋白是人血浆中含量最丰富的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量约66.5 kD。临床上广泛应用于失血创伤和烧伤等引起的休克、水肿或腹水等危重病症的治疗、以及低蛋白血症等。
不同于传统的基因重组药物，重组人血白蛋白在临床使用时输注总剂量一般需达到10 g或以上才能起到治疗作用。在高剂量蛋白背景条件下，如果重组人血白蛋白中含有一定量发生糖基化或者糖化的重组人血白蛋白，临床使用时这些非正常结构蛋白的输注总量也会被放大，可能造成临床过敏反应等危害。
白蛋白本身不存在N糖基化位点，但是在其S/T位点上可能具有一定程度的O-糖基化。尤其是酵母表达体系的重组产品，基于表达体系自身特性通常会产生一定程度的甘露糖基化，具有潜在的免疫原性，在人体内易被清除，半衰期短。因此，迫切需要寻找能够调控酵母表达体系重组蛋白的O-糖基化修饰的方法。
糖基化过程是由糖基转移酶催化，将糖供体上的糖基通过糖苷键连接到糖受体上，因此研究蛋白的糖基化修饰可以从糖供体、糖受体和糖基转移酶三方面入手。连接于酵母蛋白的第一个甘露糖是由多萜磷酸基甘露糖（Dol-P-Man）提供，有研究证实，敲除编码Dol-P-Man合成酶的基因，可使酵母蛋白O-糖基化完全丧失。此外，常用的去除酵母蛋白O-糖基化的方法还有取代或缺失可O-连的氨基酸残基，破坏或去除编码糖基转移酶的基因等。这些方法虽有效但存在明显的技术缺陷，有研究表明甘露糖基转移酶基因缺陷可能会影响细胞壁的完整性，导致细胞低活力；替换或缺失目的蛋白中可O-连的氨基酸残基则可能改变目的蛋白的性质及功能。
本发明旨在提供一种新的降低O-糖基化水平的方法，不涉及基因改造技术，操作简单，为酵母表达体系重组蛋白的糖基化调控提供参考。
发明内容
本发明提供了一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，可减少蛋白O-糖基化，所表达的重组蛋白含有极低水平的糖基化修饰。
为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，所述方法包括在发酵过程中至少采取一种措施提高菌株的生长速率，降低蛋白质O-糖基化水平；
所述措施包括至少改变下列一种发酵条件：
1）接种量；
2）种子液菌体浓度；
3）培养基初始pH；
4）培养温度；
5）通气量；
6）搅拌转速。
优选的，一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，包括以下步骤：
S1、种子液制备：取保存菌种进行平板划线，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中培养，待摇瓶种子OD600达到10-12时，作为上罐用种子液；
S2、将BSM培养基投入发酵罐，调节pH至5.0-5.8、灭菌，待冷却后校正溶氧，设置温度和通气量，向培养基中加入已除菌的PTM1溶液，并再次调节培养基pH至5.0-5.8；
S3、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉部分，将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧、设置转速，发酵期间通过调整转数和通气量维持溶氧20%以上；
S4、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油补料；
S5、甘油补料流加10-12小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，pH调至6.0-6.5，降温；
S6、补料流加2-3小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数；
S7、发酵结束后，放罐，发酵产物离心，收集上清。
优选的，采用氨水调节PH值。
优选的，步骤S1的菌种为CBS7435-rHSA，CBS7435-rHSA菌株采用以下方法制备：
R1、设计并合成重组人白蛋白DNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示；
R2、将优化后的序列连接到pPICZα A载体上，酶切位点为PmII和XbaI，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有zeocin的LB平板上，挑取单克隆转入含有zeocin的LB液体培养基中，重提质粒，经酶切鉴定和测序验证，表达质粒构建正确，命名为pPICZα A-rHSA；
R3、将质粒载体经Sac I酶切线性化后电转化入CBS7435感受态细胞中，将转化好的菌株涂布于含有zeocin的YPD抗性平板上，挑取阳性单克隆，获得重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA。
本发明中，SEQ ID NO.1为：
GACGCACATAAATCTGAAGTTGCACACCGTTTTAAGGACTTGGGTGAGGAAAATTTTAAAGCATTGGTCTTAATTGCCTTCGCACAGTATCTGCAGCAATGCCCCTTTGAAGATCACGTTAAATTAGTTAATGAGGTGACAGAATTTGCAAAGACTTGTGTTGCTGATGAATCTGCTGAGAATTGTGATAAATCACTGCATACGTTGTTTGGTGACAAGTTATGTACTGTGGCCACCTTACGAGAAACCTATGGCGAGATGGCTGATTGTTGTGCTAAGCAAGAGCCTGAAAGAAATGAATGTTTTCTACAGCATAAAGACGATAATCCAAACTTGCCTAGACTGGTGCGTCCAGAAGTTGACGTGATGTGTACCGCTTTTCACGATAATGAGGAAACCTTTTTGAAGAAGTACTTGTATGAGATCGCCCGTCGTCACCCATATTTCTATGCCCCAGAACTGCTGTTTTTCGCCAAGCGTTATAAAGCTGCTTTTACAGAGTGTTGCCAAGCTGCTGATAAGGCCGCATGCTTATTACCCAAGCTTGATGAGTTGAGAGATGAAGGCAAAGCCTCCTCCGCAAAACAAAGACTTAAATGTGCTTCTCTGCAGAAATTCGGTGAGAGAGCTTTCAAAGCTTGGGCAGTAGCAAGGCTAAGTCAGAGGTTTCCAAAAGCAGAATTCGCTGAGGTCTCTAAATTGGTTACCGATTTGACCAAGGTTCATACAGAATGCTGTCATGGTGATTTGTTGGAATGTGCAGATGACCGTGCTGATCTTGCAAAGTACATTTGTGAGAATCAGGACAGTATTTCTTCTAAGCTGAAGGAATGCTGCGAAAAGCCACTGCTTGAAAAAAGTCACTGCATCGCCGAGGTAGAAAACGATGAGATGCCAGCAGACTTGCCATCTCTTGCAGCAGACTTCGTTGAGTCAAAGGACGTCTGCAAAAATTACGCCGAAGCCAAAGATGTTTTTCTGGGTATGTTTCTGTACGAATACGCACGTAGACATCCAGACTACTCTGTAGTATTGTTGCTGAGGTTGGCTAAGACTTACGAGACCACTTTGGAGAAATGTTGTGCAGCTGCAGACCCACATGAATGTTATGCTAAAGTCTTTGATGAATTCAAACCTTTAGTCGAAGAGCCCCAAAACTTAATTAAGCAAAACTGTGAATTATTCGAACAGTTAGGTGAGTACAAGTTCCAGAATGCATTGCTAGTCCGTTATACTAAAAAAGTACCCCAAGTTTCAACCCCCACTTTAGTTGAGGTTTCCAGAAATTTGGGTAAGGTTGGTTCTAAATGCTGTAAGCACCCCGAGGCTAAAAGAATGCCATGTGCTGAGGATTATTTATCAGTAGTTCTAAACCAGCTATGTGTCCTTCATGAAAAAACTCCTGTCTCTGATAGGGTCACTAAATGTTGTACGGAGTCTTTAGTGAATAGACGACCTTGTTTTTCCGCTTTGGAAGTTGATGAGACTTACGTTCCTAAAGAGTTCAATGCCGAAACTTTTACCTTTCACGCTGATATCTGCACTTTATCTGAGAAGGAGCGTCAGATTAAGAAGCAAACCGCTCTTGTCGAGCTTGTTAAACATAAGCCTAAAGCTACAAAGGAACAATTGAAAGCCGTTATGGACGATTTTGCCGCTTTTGTTGAGAAGTGTTGCAAAGCTGACGATAAGGAGACTTGTTTCGCCGAAGAAGGCAAAAAACTGGTAGCAGCCTCACAAGCTGCTCTAGGTCTTTAA
优选的，步骤S1中，每1L的YPD液体培养基包括以下组分：酵母提取物5-10g，蛋白胨10-20g，葡萄糖10-20 g。
优选的，步骤S1中，菌种在YPD液体培养基的培养温度为28-30℃。
优选的，步骤S1中，摇瓶种子OD600为10。
优选的，步骤S2中，2次调整PH值均为5。
优选的，步骤S2中，每20L的BSM培养基包括以下组分：85%磷酸534 -600mL，二水合硫酸钙18.6 -20g，硫酸钾364 -400g，二水合硫酸镁298-320g，氢氧化钾82.6-100 g，甘油800 -850g。
进一步优选的，每20L的BSM培养基包括以下组分：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
优选的，步骤S2中，每500mL的PTM1溶液包括以下组分：五水硫酸铜3-5 g，碘化钾0.044-0.1 g，一水合硫酸锰1.5 -2g，二水合钼酸钠0.1-0.2 g，硼酸0.01-0.03g，氯化钴0.25-0.35 g，氯化锌10-12 g，七水合硫酸亚铁32.5 -35g，生物素0.1 -0.2g，硫酸2.5-3.0mL。
进一步优选的，步骤S2中，每500mL的PTM1溶液包括以下组分：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5 mL，定容至500 mL，过滤除菌。
优选的，甘油补料包括：甘油、纯化水、消泡剂和PTM1。
进一步优选的，甘油期补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM180mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
优选的，甲醇补料包括：甲醇、消泡剂。
进一步优选的，甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
与现有技术相比，应用本发明的技术方案的有益效果及显著进步在于：
1．本发明的方法是在发酵过程中通过提高菌株生长速率来降低蛋白O-糖基化水平，操作简单，便于控制。
2．本发明的方法无需破坏或去除任何糖基转移酶基因，避免了由于糖基转移酶基因缺陷可能对细胞完整性造成的负面影响。
3．本发明的方法无需缺失或替换含有糖基化位点的氨基酸残基，所表达的重组蛋白与天然蛋白氨基酸序列完全相同。
附图说明
为更清楚地说明本发明的技术方案，以下将对本发明的实施例使用的附图进行简单介绍。
图1为实施例1-3和对比例1-3的发酵过程中OD600值；
图2为实施例1-3和对比例1-3的发酵过程中湿重结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了更充分理解本发明，以下对本发明中的专业词汇进行解释说明。
本发明的“重组蛋白”：是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。体外重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达，哺乳动物细胞蛋白表达，酵母蛋白表达及昆虫细胞蛋白表达。生产的蛋白在活性和应用方法方面均有所不同。根据自身的下游运用选择合适的蛋白表达系统，提高表达成功率。
本发明的“培养基”：是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。
本发明的“发酵”：是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。发酵有时也写作酦酵，其定义由使用场合的不同而不同。通常所说的发酵，多是指生物体对于有机物的某种分解过程。发酵是人类较早接触的一种生物化学反应，如今在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用。其也是生物工程的基本过程，即发酵工程。对于其机理以及过程控制的研究，还在继续。
本发明的“菌种”：是用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。
本发明中所用重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA为自行构建，本发明中所有实施例均采用上述菌种进行发酵培养，其构建方法包括如下步骤：
S1、设计并合成重组人白蛋白DNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示；
S2、将优化后的序列连接到pPICZα A载体上，酶切位点为PmII和XbaI，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有zeocin的LB平板上，挑取单克隆转入含有zeocin的LB液体培养基中，重提质粒，经酶切鉴定和测序验证，表达质粒构建正确，命名为pPICZα A-rHSA；
S3、将质粒载体经Sac I酶切线性化后电转化入CBS7435感受态细胞中，将转化好的菌株涂布于含有zeocin的YPD抗性平板上，挑取阳性单克隆，获得重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA。
其中，SEQ ID NO.1为：
GACGCACATAAATCTGAAGTTGCACACCGTTTTAAGGACTTGGGTGAGGAAAATTTTAAAGCATTGGTCTTAATTGCCTTCGCACAGTATCTGCAGCAATGCCCCTTTGAAGATCACGTTAAATTAGTTAATGAGGTGACAGAATTTGCAAAGACTTGTGTTGCTGATGAATCTGCTGAGAATTGTGATAAATCACTGCATACGTTGTTTGGTGACAAGTTATGTACTGTGGCCACCTTACGAGAAACCTATGGCGAGATGGCTGATTGTTGTGCTAAGCAAGAGCCTGAAAGAAATGAATGTTTTCTACAGCATAAAGACGATAATCCAAACTTGCCTAGACTGGTGCGTCCAGAAGTTGACGTGATGTGTACCGCTTTTCACGATAATGAGGAAACCTTTTTGAAGAAGTACTTGTATGAGATCGCCCGTCGTCACCCATATTTCTATGCCCCAGAACTGCTGTTTTTCGCCAAGCGTTATAAAGCTGCTTTTACAGAGTGTTGCCAAGCTGCTGATAAGGCCGCATGCTTATTACCCAAGCTTGATGAGTTGAGAGATGAAGGCAAAGCCTCCTCCGCAAAACAAAGACTTAAATGTGCTTCTCTGCAGAAATTCGGTGAGAGAGCTTTCAAAGCTTGGGCAGTAGCAAGGCTAAGTCAGAGGTTTCCAAAAGCAGAATTCGCTGAGGTCTCTAAATTGGTTACCGATTTGACCAAGGTTCATACAGAATGCTGTCATGGTGATTTGTTGGAATGTGCAGATGACCGTGCTGATCTTGCAAAGTACATTTGTGAGAATCAGGACAGTATTTCTTCTAAGCTGAAGGAATGCTGCGAAAAGCCACTGCTTGAAAAAAGTCACTGCATCGCCGAGGTAGAAAACGATGAGATGCCAGCAGACTTGCCATCTCTTGCAGCAGACTTCGTTGAGTCAAAGGACGTCTGCAAAAATTACGCCGAAGCCAAAGATGTTTTTCTGGGTATGTTTCTGTACGAATACGCACGTAGACATCCAGACTACTCTGTAGTATTGTTGCTGAGGTTGGCTAAGACTTACGAGACCACTTTGGAGAAATGTTGTGCAGCTGCAGACCCACATGAATGTTATGCTAAAGTCTTTGATGAATTCAAACCTTTAGTCGAAGAGCCCCAAAACTTAATTAAGCAAAACTGTGAATTATTCGAACAGTTAGGTGAGTACAAGTTCCAGAATGCATTGCTAGTCCGTTATACTAAAAAAGTACCCCAAGTTTCAACCCCCACTTTAGTTGAGGTTTCCAGAAATTTGGGTAAGGTTGGTTCTAAATGCTGTAAGCACCCCGAGGCTAAAAGAATGCCATGTGCTGAGGATTATTTATCAGTAGTTCTAAACCAGCTATGTGTCCTTCATGAAAAAACTCCTGTCTCTGATAGGGTCACTAAATGTTGTACGGAGTCTTTAGTGAATAGACGACCTTGTTTTTCCGCTTTGGAAGTTGATGAGACTTACGTTCCTAAAGAGTTCAATGCCGAAACTTTTACCTTTCACGCTGATATCTGCACTTTATCTGAGAAGGAGCGTCAGATTAAGAAGCAAACCGCTCTTGTCGAGCTTGTTAAACATAAGCCTAAAGCTACAAAGGAACAATTGAAAGCCGTTATGGACGATTTTGCCGCTTTTGTTGAGAAGTGTTGCAAAGCTGACGATAAGGAGACTTGTTTCGCCGAAGAAGGCAAAAAACTGGTAGCAGCCTCACAAGCTGCTCTAGGTCTTTAA
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
1.1、培养基配制
YPD：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L，高压蒸汽灭菌。
PTM1：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5mL，定容至500 mL，过滤除菌。
BSM：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
甘油补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM1 80 mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
1.2、种子液制备：取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，挑取单菌落接种于1 LYPD液体培养基，于30℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到12时，作为上罐用种子液。
1.3、将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30 min，待冷却后校正溶氧0%，设置温度30℃，通气量20 L/min，罐压0.05 Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。
1.4、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉1 L左右，使接种前罐内体积约19 L。将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧100%，设置转速300 rpm，发酵期间通过调整转数（300 rpm-1000 rpm）和通气量维持溶氧20%以上。
1.5、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油，参数要求不变。
1.6、甘油补料流加10小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，pH调至6.0，温度降至25℃，其他参数要求不变。
1.7、混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数，按情况做具体调整。
1.8、发酵132 h后结束，放罐。发酵产物8000 rpm离心20分钟，收集上清。
实施例2
2.1、培养基配制
YPD：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，定容至500 mL，高压蒸汽灭菌。
PTM1：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5mL，定容至500 mL，过滤除菌。
BSM：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
甘油补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM1 80 mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
2.2、种子液制备：取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，挑取单菌落接种于500mL YPD液体培养基，于30℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到12时，作为上罐用种子液。
2.3、将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30 min，待冷却后校正溶氧0%，设置温度30℃，通气量20 L/min，罐压0.05 Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。
2.4、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500 mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧100%，设置转速300 rpm，发酵期间通过调整转数（300rpm-1000 rpm）和通气量维持溶氧20%以上。
2.5、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油，参数要求不变。
2.6、甘油补料流加10小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，pH调至6.0，温度降至25℃。
2.7、混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数，按情况做具体调整。
2.8、发酵132 h后结束，放罐。发酵产物8000 rpm离心20分钟，收集上清。
实施例3
3.1、培养基配制
YPD：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，定容至1 L，高压蒸汽灭菌。
PTM1：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5mL，定容至500 mL，过滤除菌。
BSM：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
甘油补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM1 80 mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
3.2、种子液制备：取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，挑取单菌落接种于1 LYPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。
3.3、将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至5.0，121℃灭菌30 min，待冷却后校正溶氧0%，设置温度28℃，通气量20 L/min，罐压0.05 Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至5.0。
3.4、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉1 L左右，使接种前罐内体积约19 L。将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧100%，设置转速300 rpm，发酵期间通过调整转数（300 rpm-1000 rpm）和通气量维持溶氧20%以上。
3.5、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油，参数要求不变。
3.6、甘油补料流加10小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，pH调至6.0，温度降至25℃。
3.7、混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数，按情况做具体调整。
3.8、发酵132 h后结束，放罐。发酵产物8000 rpm离心20分钟，收集上清。
对比例1
4.1、培养基配制：
YPD：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，定容至500 mL，高压蒸汽灭菌。
PTM1：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5mL，定容至500 mL，过滤除菌。
BSM：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
甘油补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM1 80 mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
4.2、种子液制备：取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，挑取单菌落接种于500mL YPD液体培养基，于30℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到12时，作为上罐用种子液。
4.3、将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至6.0，121℃灭菌30 min，待冷却后校正溶氧0%，设置温度30℃，通气量20 L/min，罐压0.05 Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至6.0。
4.4、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500 mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧100%，设置转速300 rpm，发酵期间通过调整转数（300rpm-1000 rpm）和通气量维持溶氧20%以上。
4.5、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油，参数要求不变。
4.6、甘油补料流加10小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，温度降至25℃，其他参数要求不变。
4.7、混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数，按情况做具体调整。
4.8、发酵132 h后结束，放罐。发酵产物8000 rpm离心20分钟，收集上清。
对比例2
5.1、培养基配制
YPD：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，定容至500 mL，高压蒸汽灭菌。
PTM1：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5mL，定容至500 mL，过滤除菌。
BSM：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
甘油补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM1 80 mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
5.2、种子液制备：取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，挑取单菌落接种于500mL YPD液体培养基，于30℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到10时，作为上罐用种子液。
5.3、将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至6.0，121℃灭菌30 min，待冷却后校正溶氧0%，设置温度30℃，通气量20 L/min，罐压0.05 Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至6.0。
5.4、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500 mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧100%，设置转速300 rpm，发酵期间通过调整转数（300rpm-1000 rpm）和通气量维持溶氧20%以上。
5.5、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油，参数要求不变。
5.6、甘油补料流加10小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，温度降至25℃，其他参数要求不变。
5.7、混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数，按情况做具体调整。
5.8、发酵132 h后结束，放罐。发酵产物8000 rpm离心20分钟，收集上清。
对比例3
6.1、培养基配制：
YPD：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，定容至500 mL，高压蒸汽灭菌。
PTM1：五水硫酸铜3 g，碘化钾0.044 g，一水合硫酸锰1.5 g，二水合钼酸钠0.1 g，硼酸0.01 g，氯化钴0.25 g，氯化锌10 g，七水合硫酸亚铁32.5 g，生物素0.1 g，硫酸2.5mL，定容至500 mL，过滤除菌。
BSM：85%磷酸534 mL，二水合硫酸钙18.6 g，硫酸钾364 g，二水合硫酸镁298 g，氢氧化钾82.6 g，甘油800 g，定容至20 L。
甘油补料：甘油4200 g，纯化水2800 g，消泡剂0.2 mL/L，PTM1 80 mL，混合并装入10L储瓶中进行灭菌。
甲醇补料：甲醇20 L，过滤除菌；消泡剂0.2 mL/L，灭菌后溶入已除菌的甲醇中。
6.2、种子液制备：取保存菌种CBS7435-rHSA进行平板划线，挑取单菌落接种于500mL YPD液体培养基，于28℃、220rpm培养，待摇瓶种子OD600达到12时，作为上罐用种子液。
6.3、将20L BSM培养基投入发酵罐，用氨水调节pH至6.0，121℃灭菌30 min，待冷却后校正溶氧0%，设置温度28℃，通气量20 L/min，罐压0.05 Mpa。向培养基中加入已除菌的PTM1溶液87mL，并再次调节培养基pH至6.0。
6.4、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉500 mL左右，使接种前罐内体积约19.5L。将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧100%，设置转速300 rpm，发酵期间通过调整转数（300rpm-1000 rpm）和通气量维持溶氧20%以上。
6.5、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油，参数要求不变。
6.6、甘油补料流加10小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，温度降至25℃，其他参数要求不变。
6.7、混合补料流加2小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数，按情况做具体调整。
6.8、发酵132 h后结束，放罐。发酵产物8000 rpm离心20分钟，收集上清。
实施例4
在实施例1-3和对比例1-3发酵期间，每12 h间隔取样，测量OD600值和湿重。
结果分别如图1和图2所示。实验结果表明，实例1和实例3生长速度最快，按生长速度从大到小排列依次为：实例3>实例1>实例2>对比例2>对比例3>对比例1。
综上所述，通过改变菌种接种量、种子液菌体浓度、温度、pH发酵条件，可以促进发酵前期菌体的生长速率。
实施例5
将实施例1-3和对比例1-3得到的发酵液纯化后采用硫酸苯酚法进行糖蛋白定量。以减压干燥至恒重的甘露糖作为对照品，配制不同浓度对照溶液，与适当稀释的供试品按照硫酸苯酚法显色并测定吸光度，以吸光度和对照品浓度拟合标准曲线并求得样品甘露糖的含量，样品的总蛋白含量按照凯氏定氮法测定，最后计算样品中甘露糖含量在总蛋白中的比例［W/W，甘露糖mg•g (Pro)-1］，结果如表1所示。
表1硫酸苯酚法测定重组蛋白中甘露糖含量
由表1结果验证了本发明的方法即在发酵过程中改变菌种接种量、种子液菌体浓度、温度、pH发酵条件，可以提高菌株的生长速率，可以降低毕赤酵母重组蛋白的甘露糖基化，且在一定条件下，表达产物的O-糖基化修饰水平与菌株生长速率成反比。
申请人声明，在上述说明书的描述过程中：
术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
最后应说明的是：
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵过程中至少采取一种措施提高菌株的生长速率，降低蛋白质O-糖基化水平；
方法包括以下步骤：
S1、种子液制备：取保存菌种进行平板划线，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中培养，待摇瓶种子OD600达到10-12时，作为上罐用种子液；
S2、将BSM培养基投入发酵罐，调节pH至5.0-5.8、灭菌，待冷却后校正溶氧，设置温度和通气量，向培养基中加入已除菌的PTM1溶液，并再次调节培养基pH至5.0-5.8；
S3、通过取样口将发酵罐内培养基弃掉部分，将摇瓶种子接入发酵罐，校正溶氧、设置转速，发酵期间通过调整转数和通气量维持溶氧20%以上；
S4、当溶氧突增时进入甘油补料阶段，匀速流加甘油补料；
S5、甘油补料流加10-12小时后进入混合补料阶段，甘油补料和甲醇补料同时流加，pH调至6.0-6.5，降温；
S6、补料流加2-3小时后进入甲醇补料期，流加甲醇补料，实时监测各发酵参数；
S7、发酵结束后，放罐，发酵产物离心，收集上清；
步骤S1的菌种为CBS7435-rHSA，CBS7435-rHSA菌株采用以下方法制备：
R1、设计并合成重组人白蛋白DNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示；
R2、将序列连接到pPICZα A载体上，酶切位点为PmII和XbaI，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有zeocin的LB平板上，挑取单克隆转入含有zeocin的LB液体培养基中，重提质粒，经酶切鉴定和测序验证，表达质粒构建正确，命名为pPICZα A-rHSA；
R3、将质粒载体经Sac I酶切线性化后电转化入CBS7435感受态细胞中，将转化好的菌株涂布于含有zeocin的YPD抗性平板上，挑取阳性单克隆，获得重组人白蛋白表达菌株CBS7435-rHSA；
步骤S1中，菌种在YPD液体培养基的培养温度为28-30℃；
步骤S1中，摇瓶种子OD600为10；
步骤S2中，2次调整PH值均为5。
2.如权利要求1述的一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S1中，每1L的YPD液体培养基包括以下组分：酵母提取物5-10g，蛋白胨10-20g，葡萄糖10-20 g。
3. 如权利要求1所述的一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S2中，每20L的BSM培养基包括以下组分：85%磷酸534 -600mL，二水合硫酸钙18.6 -20g，硫酸钾364 -400g，二水合硫酸镁298-320 g，氢氧化钾82.6-100 g，甘油800 -850g。
4. 如权利要求1所述的一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，步骤S2中，每500mL的PTM1溶液包括以下组分：五水硫酸铜3-5 g，碘化钾0.044-0.1 g，一水合硫酸锰1.5 -2g，二水合钼酸钠0.1-0.2 g，硼酸0.01 -0.03g，氯化钴0.25-0.35 g，氯化锌10-12 g，七水合硫酸亚铁32.5 -35g，生物素0.1 -0.2g，硫酸2.5-3.0 mL。
5.如权利要求4所述的一种制备低O-糖基化水平的重组人白蛋白的方法，其特征在于，甘油补料包括：甘油、纯化水、消泡剂和PTM1；甲醇补料包括：甲醇、消泡剂。
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