[go: up one dir, main page]

RU2473684C2 - Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток - Google Patents

Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2473684C2
RU2473684C2 RU2010126217/10A RU2010126217A RU2473684C2 RU 2473684 C2 RU2473684 C2 RU 2473684C2 RU 2010126217/10 A RU2010126217/10 A RU 2010126217/10A RU 2010126217 A RU2010126217 A RU 2010126217A RU 2473684 C2 RU2473684 C2 RU 2473684C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
fgf
factor
cells
markers characteristic
expressing markers
Prior art date
Application number
RU2010126217/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010126217A (ru
Inventor
Алиреза РЕЗАНИА
Original Assignee
Лайфскен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лайфскен, Инк. filed Critical Лайфскен, Инк.
Publication of RU2010126217A publication Critical patent/RU2010126217A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2473684C2 publication Critical patent/RU2473684C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии и клеточной инженерии. Предложен способ получения инсулинпродуцирующих клеток, полученных из полипотентных стволовых клеток и способных секретировать инсулин без использования слоя питающих клеток. Изобретение может быть использовано в фармакологической промышленности для получения инсулина. 71 з.п. ф-лы, 23 ил., 17 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагаются способы, способствующие осуществлению дифференцировки полипотентных стволовых клеток, и продукты, относящиеся к этим способам или возникающие в результате их использования. В частности, в настоящем изобретении предлагается усовершенствованный способ создания клеток, экспрессирующих гормоны поджелудочной железы, и клеток, секретирующих гормоны поджелудочной железы. Кроме того, в настоящем изобретении также предлагаются способы стимулирования дифференцировки полипотентных стволовых клеток без использования слоя питающих клеток, а также продукты, относящиеся к этим способам или возникающие в результате их использования. В настоящем изобретении также предлагаются способы, способствующие осуществлению стимулируемой глюкозой секреции инсулина в инсулинпродуцирующих клетках, полученных из полипотентных стволовых клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Достижения в области клеточной заместительной терапии сахарного диабета 1 типа и нехватка трансплантируемых островков Лангерганса заставили обратить внимание на разработку источников инсулинпродуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из полипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных, полипотентные стволовые клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Ткани, из которых состоят, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы, через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформировавшейся эндодермы. Клетки сформировавшейся эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF-3beta, GATA4, Mixl1, CXCR4 и Sox-17.
Полипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцировка полипотентных стволовых клеток in vitro приводит к утрате экспрессирования SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (если имеются) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные полипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые методом ОТ-ПЦР.
Полипотентные стволовые клетки, как правило, культивируются на слое питающих клеток, которые оказывают разностороннюю поддержку полипотентным клеткам. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Выращивание полипотентных стволовых клеток в культуре, не содержащей питающих клеток, без дифференцировки, осуществляется при помощи среды, кондиционированной путем предварительного культивирования в ней клеток другого типа. Как вариант, выращивание полипотентных стволовых клеток в культуре, не содержащей питающих клеток, без дифференцировки, осуществляется при помощи среды с определенным химическим составом.
Например, в публикациях Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science, 6 ноября 1998 года: Vol. 282, № 5391, pp. 1145-1147) описано культивирование линий полипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов.
В публикации Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) анализировался набор из 11 различных слоев питающих клеток, полученных от взрослых, новорожденных и эмбрионов людей, по их способности осуществлять поддержку культуры человеческих полипотентных стволовых клеток. Richards et al. сообщают: «линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемые на питающих слоях из фибробластов кожи взрослых людей, сохраняют морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток, и остаются полипотентными».
В заявке на патент US20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку полипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент US20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
В другом примере, Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих полипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере, Stojkovic et al. (Stem Cells 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанной дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В еще одном примере, Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают источник питающих клеток, получаемых из человеческой плаценты.
Amit et al. (Biol. Reprod. 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.
В другом примере, Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих постнатальных фибробластов крайней плоти.
В патенте US6642048 описывается среда, поддерживающая рост полипотентных стволовых клеток приматов (пПС) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В патенте US6642048 говорится: «Данное изобретение включает мезенхимо- и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способ получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды».
В другом примере, в заявке на патент WO2005014799, описывается кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В заявке на патент WO2005014799 говорится: «Культуральная среда, произведенная в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется при помощи секреторной активности клеток мыши, в частности, активности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов, именуемых MMH (Met Murine Hepatocyte)».
В другом примере, Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.
В другом примере, заявке на патент US20070010011, описывается культуральная среда определенного химического состава для поддержания полипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 октября 2005 года) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере, Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).
В другом примере, заявке на патент US20050148070, описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих клеток-фибробластов, где данный способ включает: культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, культуральную среду, в основном не включающую эмбриональную сыворотку млекопитающих и содержащую по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, причем фактор роста фибробластов происходит из источника, иного, чем просто слой питающих клеток-фибробластов, среду, поддерживающую пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без слоя питающих клеток или кондиционированной среды.
В другом примере, заявке на патент US20050233446, описывается среда с определенным составом, которая может использоваться при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе, среда, по существу, является изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенной дифференцировки.
В другом примере, патенте US6800480, говорится: «В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания клеток зародышевых стволовых клеток приматов, в значительной степени в недифференцированном состоянии, включающая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбранным из группы, состоящей из питающей клетки и экстраклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Среда также содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, состоящей из нуклеозидов и соль-пирувата».
В другом примере, заявке на патент US20050244962, говорится: «В одном аспекте, в изобретении предлагается способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно, также, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, иного, чем просто питающие клетки-фибробласты. В предпочтительной форме, слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов».
В другом примере, заявке на патент WO2005065354, описывается изотоническая культуральная среда определенного состава, в основном не содержащая питающих клеток и сыворотки, включающая: a) базовую среду; b) количество bFGF, достаточное для поддержания роста, в основном недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; c) количество инсулина, достаточное для поддержания роста, в основном недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d) количество аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста, в основном недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.
В другом примере, WO2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGFβ), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.
Полипотентные стволовые клетки могут культивироваться и дифференцироваться на субстрате тканевой культуры, покрытом экстраклеточным матриксом. Экстраклеточный матрикс может быть растворен перед покрытием им субстрата тканевой культуры. Примеры подходящих способов растворения экстраклеточного матрикса и покрытия субстрата тканевой культуры можно найти в публикации Kleinman, H.K., et al., Biochemistry 25: 312 (1986), и Hadley, M.A., et al., J. Cell. Biol. 101: 1511 (1985).
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировке сформировавшейся эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Следовательно, экспрессия Pdx1 является важным этапом онтогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, среди других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировке панкреатической эндодермы.
Клетки, обладающие свойствами островковых клеток, как сообщалось, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в публикации Lumelsky et al. (Science 292: 1389, 2001) сообщается о дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулинсекретирующие структуры, сходные с островками поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49: 157, 2000) сообщают, что инсулинсекретирующие клетки, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток, нормализовали гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.
В одном примере, в публикации Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид 3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, сходных с β-клетками.
В другом примере, Blyszczuk et al. (PNAS 100: 998, 2003) сообщается о получении инсулинпродуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
Micallef et al. сообщают, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54: 301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Эти результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, P48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Также эти авторы наблюдали, что на уровень экспрессии мРНК инсулина и Pdx1 не влияла ретиноевая кислота; однако обработка раствором FGF7 с концентрацией 3 нМ приводила к повышению уровня транскрипта Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически увеличивающих дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells, июнь 2005 г.; 10(6): 503-16).
В публикации Gordon et al. продемонстрирована индукция образования эндодермальных клеток brachyury+/HNF-3beta+ из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального пути Wnt (US 2006/0003446A1).
В публикации Gordon et al. (PNAS, Vol. 103, страница 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались, одновременно, сигнальные пути Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, как, например, у человека.
Thomson et al. выделяли эмбриональные стволовые клетки из человеческих бластоцист (Science 282: 114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии человеческих эмбриональных зародышевых клеток (чЭЗ) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцировке которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемиии (Leukemia Inhibitory Factor, LIF), человеческие эмбриональные стволовые клетки должны культивироваться в очень специфических условиях (США, патенты №№ 6200806; WO 99/20741; WO 01/51616).
D'Amour et al. описывают получение обогащенных культур сформировавшейся эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей приводит к их дифференцировке в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформировавшейся эндодермы, производные от человеческих эмбриональных стволовых клеток, могут подвергаться дальнейшей дифференцировке в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
В публикации D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭС) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы, инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование сформировавшейся эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».
В другом примере, Fisk et al. сообщают о системе для получения островковых клеток поджелудочной железы из человеческих эмбриональных стволовых клеток (заявка на патент US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцировки был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировались с антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бета-целлюлином с получением Pdx1-положительных клеток. Окончательная дифференцировка запускалась никотинамидом.
В одном примере, Benvenistry et al. сообщают: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия Pdx1 увеличивала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).
В другом примере, Odorico et al. сообщается о способах прямой дифференцировки in vitro полипотентных стволовых клеток млекопитающих в клетки панкреатической линии дифференцировки. Данные способы включают культивацию стволовых клеток в присутствии эффективного количества костного морфогенетического белка с индукцией дифференцировки в направлении мезэндодермы. Эти мезэндодермальные клетки далее культивируются до образования эмбриоидных телец (ЭТ), обогащенных клетками, коммитированными в сторону сформировавшейся эндодермы, которые при определенных условиях, в итоге, дифференцируются в клетки панкреатической линии дифференцировки (US20070259423).
В другом примере, Tulachan et al. (Developmental Biology, 305, 2007, страницы 508-521) утверждают: «Ингибирование сигнального пути TGF-B в эмбриональный период может, таким образом, позволить клеткам эпителия поджелудочной железы развиться до эндокринной линии дифференцировки».
Следовательно, острой потребностью по-прежнему остается разработка условий для создания стабильных линий полипотентных стволовых клеток, способных быть размноженными для решения текущих клинических задач и сохраняющих потенциал дифференцировки в эндокринные клетки поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие гормоны поджелудочной железы, или в клетки, секретирующие гормоны поджелудочной железы и обладающие способностью секретировать инсулин в ответ на изменение концентрации глюкозы. Мы использовали альтернативный подход к повышению эффективности дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток в сторону эндокринных клеток поджелудочной железы, способных секретировать инсулин в ответ на изменение концентрации глюкозы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения клеток, способных секретировать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой, из полипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:
культивирование полипотентных стволовых клеток,
дифференцировку полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы,
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ активизации стимулируемой глюкозой секреции инсулина в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из полипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:
культивирование полипотентных стволовых клеток,
дифференцировку полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы,
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном из вариантов осуществления экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дифференцируются из клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, любым из следующих способов:
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog; затем удаление среды, содержащей фактор роста фибробластов и ингибитор сигнального пути Hedgehog с последующей культивацией клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и ингибитор сигнального пути Hedgehog, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним из факторов роста фибробластов, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, ретиноевой кислотой, ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и по меньшей мере одним фактором, способным ингибировать костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein, BMP), или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, ретиноевой кислотой, ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и нетрином, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, ретиноевой кислотой, ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов, по меньшей мере одним фактором, способным ингибировать BMP и нетрином, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», затем удаление среды, содержащей по меньшей мере один фактор роста фибробластов и ингибитор фактора «Sonic Hedgehog», с последующей обработкой клеток ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и ретиноевой кислотой, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», затем удаление среды, содержащей по меньшей мере один фактор роста фибробластов и ингибитор фактора «Sonic Hedgehog», с последующей обработкой клеток ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, способным ингибировать BMP, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», затем удаление среды, содержащей по меньшей мере один фактор роста фибробластов и ингибитор фактора «Sonic Hedgehog», с последующей обработкой клеток ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов, ретиноевой кислотой и нетрином, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы по меньшей мере одним фактором роста фибробластов и ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», затем удаление среды, содержащей по меньшей мере один фактор роста фибробластов и ингибитор фактора «Sonic Hedgehog», с последующей обработкой клеток ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», по меньшей мере одним фактором роста фибробластов, ретиноевой кислотой, по меньшей мере одним фактором, способным ингибировать BMP, и нетрином.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, дифференцируются из клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым из следующих способов:
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей ингибитор γ-секретазы и агонист GLP-1, затем удаление среды, содержащей ингибитор γ-секретазы и агонист GLP-1, с последующей культивацией клеток в среде, содержащей агонист GLP-1, IGF-1 и HGF, или
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей агонист GLP-1, затем удаление среды, содержащей агонист GLP-1, с последующей культивацией клеток в среде, содержащей агонист GLP-1, IGF-1 и HGF, или
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей ингибитор γ-секретазы и агонист GLP-1, или
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей агонист GLP-1, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, или
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, или
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ глюкозы и агонист GLP-1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показана схема протокола дифференцировки, используемого в настоящем изобретении. Панель a) относится к способу, описанному в заявке на патент США № 11/736908, панели b) и c) представляют способы, являющиеся предметом настоящего изобретения.
На фиг.2 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 2. Экспрессия маркеров панкреатической эндодермы (PDX-1, ISL-1) и эндокринных маркеров (NeuroD, инсулин и глюкагон) показана на стадиях с 3 по 5 (S3-S5). На стадиях с 4 по 5 наблюдалось достоверное увеличение экспрессии инсулина и глюкагона.
На фиг.3 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 3. Панкреатические эндокринные маркеры a) инсулин, b) NKX2, c) глюкагон, d) NeuroD и маркер панкреатической эндодермы e) PDX-1 на стадиях с 3 по 5. Влияние ингибиторов различных киназ оценивалось на стадии 3 или 4, либо на стадиях 3 и 4 (+/+ обозначает присутствие данного соединения как на стадии 3, так и на стадии 4, +/- обозначает присутствие данного соединения на стадии 3 и его отсутствие на стадии 4, -/+ обозначает присутствие данного соединения на стадии 4 и его отсутствие на стадии 3).
На фиг.4 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 4. Панкреатические маркеры a) глюкагон и инсулин, b) HAND1 и NeuroD, c) HNF4a и PDX-1, d) NKX2.2 и Sox17 показаны для стадий с 3 по 5. Эффект ингибитора ALK5 II оценивался на стадии 4 или 5, либо на стадиях 4 и 5 (+/+ обозначает присутствие ингибитора на обеих стадиях 4 и 5, +/- обозначает присутствие ингибитора на стадии 4 и его отсутствие на стадии 5, -/+ обозначает присутствие ингибитора на стадии 5 и его отсутствие на стадии 4).
На фиг.5 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 5. Эффект 1-10 мкМ ингибиторов I и II ALK5 на экспрессию: a) глюкагона, b) инсулина, c) PDX-1, d) NeuroD, показан для стадий с 4 по 5. При контрольной обработке ни один из ингибиторов ALK5 в ходе процесса дифференцировки не использовался.
На фиг.6 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 6. Эффект сочетания 1 мкМ ингибитора ALK5 и 0-500 нг/мл рекомбинантного человеческого фактора Noggin на экспрессию a) альбумина, b) CDX2, c) инсулина, d) глюкагона, e) PDX-1, f) NeuroD и g) NKX2.2, показан для стадий с 3 по 5. Ингибитор ALK5 добавлялся на стадиях 4 и 5, а белок Noggin добавлялся на стадии 3.
На фиг.7 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 7. Эффект сочетания 1 мкМ ингибитора ALK5 и 100 нг/мл рекомбинантного человеческого белка Noggin на экспрессию a) инсулина, b) глюкагона, c) ngn3, d) NeuroD, e) CDX-2, f) PDX-1, показан для стадий 4 и 5. Ингибитор ALK5 добавлялся на стадиях 4 и 5, а белок Noggin добавлялся на стадиях 3, 4 или 3 и 4.
На фиг.8 показана морфология клеток, дифференцированных в соответствии со способами, описанными в примере 7: a) 4-кратное фазово-контрастное изображение клеток стадии 5 на 6 день, b) 10-кратное фазово-контрастное изображение клеток стадии 5 на 6 день, c) 4-кратное фазово-контрастное изображение клеток стадии 5 на 12 день, d) 10-кратное фазово-контрастное изображение клеток стадии 5 на 12 день.
На фиг.9 показаны иммунофлуоресцентные изображения клеток, дифференцированных в соответствии со способами, описанными в примере 7. Клетки находятся на стадии 5, день 12. a) Инсулиновое окрашивание единичного кластера, а также в сочетании с b) ядерным красителем DAPI.
На фиг.10 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 7.
На фиг.11 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 8. Демонстрируется эффект сочетания белка Noggin, добавляемого на стадиях 3 и 4, с белком нетрин-4 и/или ингибитором ALK 5, добавляемым на стадии 4, на экспрессию a) ngn3, b) PDX-1, c) NeuroD, d) Pax4, e) инсулина и f) глюкагона.
На фиг.12 показан анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 8. Панель a) инсулин, b) глюкагон, c) ngn3, d) NKX2.2, e) NeuroD и f) PDX-1.
На фиг.13 показана стимулированная глюкозой секреция инсулина (Glucose Stimulated Insulin Secretion, GSIS) in vitro в длительно культивируемых культурах стадии 5. Клетки стадии 5, подготовленные в соответствии со способами, описанными в примере 9, стимулировались глюкозой в день a) 6, b) 12 и c) 8-20 дней в культуре стадии 5.
На фиг.14 показан эффект белка нетрин-1 или нетрин-2 на экспрессию эндокринных маркеров. Анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 10.
На фиг.15 показана индукция появления эндокринных маркеров с использованием альтернативного метода индукции образования сформировавшейся эндодермы. Анализ методом ПЦР в реальном времени линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцируемых в соответствии со способами, описываемыми в примере 11. Панель a) инсулин, b) глюкагон, c) NKX2.2, d) Pax4, e) PDX-1 и f) NeuroD.
На фиг.16 показана экспрессия различных маркеров на разных стадиях протокола дифференцировки, приведенного на фиг.1, с. Панель a) показана экспрессия CXCR4, определенная методом FACS (сортировкой флуоресцентно-активированных клеток) в клетках H1 на третий день стадии 1. Панель b) Показана экспрессия маркеров, характерных для линии сформировавшейся эндодермы и внеэмбриональной линии, в клетках на третий день стадии 1, измеренная методом ПЦР в реальном времени. Панели c)-n) демонстрируют экспрессию различных генов в клетках, собранных в конце стадий 2-6, измеренную методом ПЦР в реальном времени.
На фиг.17 показано количество клеток на разных стадиях протокола дифференцировки, приведенного на фиг.1, с.
На фиг.18 показана секреция C-пептида клетками в конце стадии 6 протокола дифференцировки, приведенного на фиг.1, c, в ответ на различные стимулы.
На фиг.19 показано содержание в клетках C-пептида и проинсулина в конце стадии 6 протокола дифференцировки, приведенного на фиг.1, c, в сравнении с панкреатическими островками взрослых людей.
На фиг.20 показана экспрессия инсулина (панель a), синаптофизина (панель b) и ко-экспрессия синаптофизина (ось X) и инсулина (ось Y) (панель c) в клетках в конце стадии 6 протокола дифференцировки, приведенного на фиг.1, c.
На фиг.21 показана экспрессия синаптофизина (панели a и c) и инсулина (панели b и d) в конце стадии 6 протокола дифференцировки, приведенного на фиг.1, c, в клетках, обработанных 100 нг/мл белка Chordin вместо белка Noggin на стадиях 3-4.
На фиг.22 показана экспрессия различных маркеров в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H9, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, c. Приведенные данные представляют собой экспрессию a) HNF4a, b) HNF6, c) CDX2, d) PDX-1, e) NKX6.1, f) Pax4, g) NKX2.2, h) NeuroD, i) NGN3, j) PECAM, k) глюкагона и l) инсулина, измеренную методом ПЦР в реальном времени в клетках, собранных в конце стадий 3-6.
На фиг.23 показана экспрессия различных маркеров в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, c, где клетки были обработаны с помощью B27 или N2. Приведенные данные представляют собой экспрессию a) CDX2, b) глюкагона, c) инсулина и d) PDX-1, измеренную методом ПЦР в реальном времени в клетках, собранных в конце стадий 3-6.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяющиеся по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся предшественники, необновляющиеся предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий, происходящих из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисту.
По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (2) полипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные давать начало группе клеточных линий, в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут давать таких потомков, как ГСК (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (таких как тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, т.е. способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные давать начало единственной клеточной линии (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или малоспециализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированной дифференцировкой представляет собой клетку, занявшую более специализированную («коммитированную») позицию в пределах клеточной линии дифференцировки. Термин «коммитированная», применительно к процессу дифференцировки, обозначает клетку, дошедшую в ходе дифференцировки до стадии, от которой, в нормальных условиях, она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет, в нормальных условиях, дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированной (или коммитированной) позиции в линии дифференцировки. В настоящем документе линией дифференцировки клеток называется наследственность клетки, т.е. от каких клеток она происходит и каким клеткам может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в данную линию дифференцировки.
«b-клеточной линией дифференцировки» называются клетки, положительные по экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для b клеточной линии дифференцировки, относятся b клетки.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX-17, GATA-4, HNF-3 бета, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix homeobox-подобный белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформировавшейся эндодермы.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX-1, HNF-1beta, PTF-1 альфа, HNF-6 или HB9. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 или PTF-1 альфа. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, относятся панкреатические эндокринные клетки, клетки, экспрессирующие гормоны поджелудочной железы, клетки, секретирующие гормоны поджелудочной железы и клетки b-клеточной линии дифференцировки.
«Сформировавшейся эндодермой» в настоящем документе называются клетки, обладающие характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта и формирующих желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформировавшейся эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и Mixl1.
«Внеэмбриональной эндодермой» в настоящем документе называется популяция клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX-7, AFP и SPARC.
«Маркерами» в настоящем документе называются молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов, дифференциально экспрессируемые в конкретной клетке. В данном контексте, под дифференциальной экспрессией подразумевается повышенный уровень положительного маркера и пониженный уровень отрицательного маркера. Определяемый уровень маркерной аминокислоты или полипептида в интересующих клетках значительно выше или ниже, в сравнении с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из разнообразных способов, известных в данной области.
«Мезэндодермальной клеткой» в настоящем документе называется клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из следующих маркеров: CD48, эомезодермин (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.
«Панкреатической эндокринной клеткой» или «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
«Панкреатической эндодермальной клеткой» в настоящем документе называется клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, PAX-4, NKX2.2.
«Клеткой, продуцирующей гормон поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная производить по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
«Клеткой, секретирующей гормон поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная секретировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
«Поздней клеткой передней кишки» в настоящем документе называется клетка, способная секретировать по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX-1, HNF-1, PTF-1A, HNF-6, HB-9, PROX-1.
«Клеткой предпервичной полоски» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal или FGF8.
«Клеткой первичной кишечной трубки» в настоящем документе называется клетка, способная секретировать по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF-1, HNF-4A.
«Клеткой первичной полоски» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, Mix homeobox-подобный белок или FGF4.
ВЫДЕЛЕНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПОЛИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Характеристика полипотентных стволовых клеток
Полипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282: 1145, 1998). Дифференцировка полипотентных стволовых клеток in vitro приводит к утрате экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (если имеются) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Недифференцированные полипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые методом ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных полипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. Как вариант, полипотентность можно определить путем создания эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии полипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного метода окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, причем все человеческие хромосомы должны присутствовать и не иметь видимых изменений.
Источники полипотентных стволовых клеток
К типам полипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии полипотентных клеток, получаемых из ткани, образующейся после беременности, в том числе, из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе беременности, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также предусмотрено использование описываемых здесь составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, и в этом случае исходными клетками могут быть первичные полипотентные клетки, взятые напрямую из тканей, служащих источником. Также подходящими являются клетки, взятые из популяции полипотентных стволовых клеток, уже культивируемых в отсутствие питающих клеток. Также подходящими являются мутантные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, например, BG01v (BresaGen, Athens, GA).
В одном из вариантов осуществления, человеческие эмбриональные стволовые клетки подготавливаются, как описано в публикации Thomson et al. (США патент № 5843780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 7844, 1995).
Культивирование полипотентных стволовых клеток
В одном из вариантов осуществления полипотентные стволовые клетки, как правило, культивируются на слое питающих клеток, которые оказывают разностороннюю поддержку полипотентным клеткам. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Выращивание полипотентных стволовых клеток в культуре, не содержащей питающих клеток, без дифференцировки, осуществляется при помощи среды, кондиционированной путем предварительного культивирования в ней клеток другого типа. Как вариант, выращивание полипотентных стволовых клеток в культуре, не содержащей питающих клеток, без дифференцировки, осуществляется при помощи среды с определенным химическим составом.
Полипотентные стволовые клетки могут быть нанесены на подходящий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является компонент экстраклеточного матрикса, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в образовании связи между рецептором молекул адгезии и лигандом. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® - это растворимый препарат из клеток опухоли Engelbreth-Holm-Swarm, который при комнатной температуре представляет собой гель, образующий восстановленную базальную мембрану.
Как вариант, можно использовать другие компоненты экстраклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., отдельно или в различных сочетаниях.
Полипотентные стволовые клетки могут наноситься на субстрат с применением подходящего распределения и в присутствии среды, способствующей выживанию, размножению клеток и сохранению ими желательных особенностей. На все эти характеристики оказывает влияние аккуратность распределения клеток при посеве, которая легко может достигаться специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может состоять из следующих компонентов, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco #11965-092; модифицированная по способу Дульбекко среда Игла Knockout (KO DMEM), Gibco #10829-018; базальная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глутамина, Gibco #15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco #11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma #M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco #13256-029.
Создание клеток, способных секретировать инсулин при стимуляции глюкозой, из полипотентных стволовых клеток
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения клеток, способных секретировать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой, из полипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:
культивирование полипотентных стволовых клеток,
дифференцировку полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы,
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ активизации стимулируемой глюкозой секреции инсулина в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из полипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:
культивирование полипотентных стволовых клеток,
дифференцировку полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы,
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
К полипотентным стволовым клеткам, подходящим для использования в настоящем изобретении, относятся, например, линия человеческих эмбриональных стволовых клеток H9 (код NIH: WA09), линия человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (код NIH: WA01), линия человеческих эмбриональных стволовых клеток H7 (код NIH: WA07) и линия человеческих эмбриональных стволовых клеток SA002 (Cellartis, Sweden). Также подходят для использования в рамках настоящего изобретения клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для полипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
Маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, выбираются из группы, включающей SOX-17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix homeobox-подобный белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформировавшейся эндодермы. В одном аспекте настоящего изобретения, клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, представляет собой клетку-предшественницу первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения, клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения, клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, представляет собой клетку сформировавшейся эндодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбираются из группы, включающей Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном аспекте настоящего изобретения, клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, выбираются из группы, включающей NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. В одном из вариантов осуществления, панкреатической эндокринной клеткой является клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы. В одном аспекте настоящего изобретения, клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой клетку, экспрессирующую гормоны поджелудочной железы. Как вариант, панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой клетку, секретирующую гормоны поджелудочной железы.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для β-клеточной линии. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии, экспрессирует Pdx1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. В одном аспекте настоящего изобретения, клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии, представляет собой β-клетку.
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы
Полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой, а затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2005.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и лиганд Wnt в отсутствие сыворотки, затем удаления лиганда Wnt и культивирования клеток с активином A и сывороткой. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США серийный № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США серийный № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США серийный № 61/076889.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США серийный № 61/076900.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США серийный № 61/076908.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США серийный № 61/076915.
Выявление клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Полипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют данных маркеров. Таким образом, дифференцировка полипотентных клеток обнаруживается, когда клетки начинают экспрессировать эти маркеры.
Эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы.
Методы анализа экспрессии маркерных белков и нуклеиновых кислот в культивированных или изолированных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические методы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блот, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (смотрите, например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характерные особенности полипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам, и дополнительные характеристики еще продолжают выявляться. К маркерам полипотентных стволовых клеток относятся, например, экспрессия одного или нескольких следующих факторов: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
После обработки полипотентных стволовых клеток с применением методов, составляющих предмет изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы.
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog KAAD-циклопамином, затем удаления среды, содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин с последующим культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, соответствующего способам, описанным в заявке на патент США серийный № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, соответствующего способам, описанным в заявке на патент США серийный № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, включающий следующие стадии:
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, и
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина.
В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина, в течение периода от приблизительно одного до приблизительно шести дней. В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина, в течение приблизительно шести дней.
При использовании этого способа любая клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, может дифференцироваться в клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, включающий следующие стадии:
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы,
обработка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты и фактора роста фибробластов, и
удаление по меньшей мере одного фактора, выбранного из группы, состоящей из ретиноевой кислоты и фактора роста фибробластов с последующей обработкой клеток по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислоты, фактора роста фибробластов, фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина.
В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты и фактора роста фибробластов, в течение периода от приблизительно одного до приблизительно трех дней. В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты и фактора роста фибробластов, в течение приблизительно трех дней. В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислоты, фактора роста фибробластов, фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина, в течение периода от приблизительно одного до приблизительно четырех дней. В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислоты, фактора роста фибробластов, фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина, в течение приблизительно четырех дней.
При использовании этого способа любая клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, может дифференцироваться в клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.
В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, произведенные при помощи способов, составляющих предмет изобретения, демонстрируют пониженный уровень экспрессии маркеров, ассоциированных с тканями печени и кишечника. В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, произведенные при помощи способов, составляющих предмет изобретения, демонстрируют пониженный уровень экспрессии альбумина и CDX-2.
По меньшей мере один фактор роста фибробластов выбран из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10.
В одном из вариантов осуществления, BMP представляет собой BMP4. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один фактор, способный ингибировать BMP4, представляет собой Noggin.
Нетрин выбран из группы, состоящей из нетрина 1, нетрина 2 и нетрина 4.
Ретиноевая кислота может использоваться в концентрациях от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 мМ. В одном из вариантов осуществления, ретиноевую кислоту используют в концентрации 1 мкМ.
FGF-2 может использоваться в концентрациях от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, FGF-2 используют в концентрации 50 нг/мл.
FGF-4 может использоваться в концентрациях от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, FGF-4 используют в концентрации 50 нг/мл.
FGF-7 может использоваться в концентрациях от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, FGF-7 используют в концентрации 50 нг/мл.
FGF-10 может использоваться в концентрациях от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, FGF-10 используют в концентрации 50 нг/мл.
Noggin может использоваться в концентрациях от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, Noggin используют в концентрации 100 нг/мл.
Нетрин 1 может использоваться в концентрациях от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, нетрин 1 используют в концентрации 100 нг/мл.
Нетрин 2 может использоваться в концентрациях от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, нетрин 2 используют в концентрации 100 нг/мл.
Нетрин 4 может использоваться в концентрациях от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления, нетрин 4 используют в концентрации 100 нг/мл.
В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним из следующих факторов: ретиноевая кислота, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, циклопамин, Noggin, нетрин 1, нетрин 2 или нетрин 4.
В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-2, циклопамином и Noggin. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-4, циклопамином и Noggin. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-7, циклопамином и Noggin. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-10, циклопамином и Noggin.
В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-2, циклопамином и нетрином. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-4, циклопамином и нетрином. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-7, циклопамином и нетрином. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-10, циклопамином и нетрином.
Нетрин выбирается из группы, включающей нетрин 1, нетрин 2 и нетрин 4.
В одном из вариантов осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-2, циклопамином, Noggin и нетрином. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-4, циклопамином, Noggin и нетрином. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-7, циклопамином, Noggin и нетрином. В альтернативном варианте осуществления, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой, FGF-10, циклопамином, Noggin и нетрином.
Нетрин выбран из группы, состоящей из нетрина 1, нетрина 2 и нетрина 4.
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, могут быть обработаны по меньшей мере одним дополнительным фактором, который может улучшать образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы. Как вариант, как минимум еще один дополнительный фактор может улучшить пролиферацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные с помощью способов, составляющих предмет изобретения. Далее по меньшей мере еще один дополнительный фактор может улучшить способность клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученных с помощью способов, которые составляют предмет изобретения, образовывать другие типы клеток или повышать эффективность дополнительных стадий дифференцировки.
По меньшей мере одним дополнительным фактором могут быть, например, никотинамид, члены семейства TGF-β, включая TGF-β1, 2 и 3, сывороточный альбумин, члены семейства факторов роста фибробластов, тромбоцитарные факторы роста -AA, и -BB, плазма, богатая тромбоцитами, инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -8, -10, 11), глюкагонподобный пептид-I и II (GLP-I и II), миметические антитела GLP-1 и GLP-2, экзендин-4, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, инсулин, прогестерон, апротинин, гидрокортизон, этаноламин, бета-меркаптоэтанол, эпидермальный фактор роста (EGF), гастрин I и II, хелатирующие агенты на основе меди, например, триэтиленпентамин, форсколин, Na-Butyrate, активин, бета-целлюлин, ITS, Noggin, фактор роста нейритов, Nodal, вальпроевая кислота, трихостатин A, натрий бутират, фактор роста гепатоцитов (HGF), сфингозин-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), добавки N2 и B27 (Gibco, CA), стероидные алкалоиды, например, циклопамин (EMD, CA), фактор роста кератиноцитов (KGF), белки семейства Dickkopf, экстракт бычьего гипофиза, белок, ассоциированный с неогенезом островков (islet neogenesis-associated protein, INGAP), Indian Hedgehog, Sonic Hedgehog, протеосомальные ингибиторы, ингибиторы сигнального пути Notch, ингибиторы Sonic Hedgehog и их сочетания.
По меньшей мере один дополнительный фактор может поступать из кондиционированной среды, полученной от линий панкреатических клеток, таких как PANC-1 (ATCC № CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC № HTB-79), BxPC-3 (ATCC № CRL-1687), HPAF-II (ATCC № CRL-1997), линий клеток печени, таких как HepG2 (ATCC № HTB-8065), линий клеток кишечника, таких как FHs 74 (ATCC № CCL-241).
Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, хорошо известны специалистам в данной сфере, и дополнительные маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, продолжают выявляться. Данные маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатической эндодермы. К маркерам, специфическим для линии панкреатической эндодермы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.
Эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.
Способы анализа экспрессии маркерных белков и нуклеиновых кислот в культивированных или изолированных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические методы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блот, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (смотрите, например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, описанного в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей DAPT и экзендин-4, затем удаления среды, содержащей DAPT и экзендин-4 с последующим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин-1, IGF-1 и HGF. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей экзендин-4, затем удаления среды, содержащей экзендин-4 с последующим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин-1, IGF-1 и HGF. Пример данного способа описан в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей DAPT и экзендин-4. Пример данного способа описан в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей экзендин-4. Пример данного способа описан в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
В одном аспекте настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии с способами, описанными в заявке на патент США серийный № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном аспекте настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США серийный № 11/77311, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном аспекте настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии с способами, описанными в заявке на патент США серийный № 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном аспекте настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1. Фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, может быть антагонист рецептора-1 TGF-β на поверхности клеток. Как вариант, этот фактор может ингибировать биологическую активность рецептора TGF-βR-1. Как вариант, этот фактор может ингибировать или являться антагонистом элемента пути сигнальной трансдукции TGF-βR-1 в клетке.
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1 в течение периода от приблизительно одного до приблизительно двенадцати дней. Как вариант, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1 в течение периода от приблизительно пяти до приблизительно двенадцати дней. Как вариант, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1 в течение приблизительно двенадцати дней.
При использовании этого способа любая клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, может дифференцироваться в клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, включающий следующие стадии:
культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
обработка клеток фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1.
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение периода от приблизительно одного до приблизительно двенадцати дней. Как вариант, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение периода от приблизительно пяти до приблизительно двенадцати дней. Как вариант, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение приблизительно двенадцати дней.
При использовании этого способа любая клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, может дифференцироваться в клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток.
В одном из вариантов осуществления, фактор, ингибирующий сигнальный путь Notch, представляет собой ингибитор γ-секретазы. В одном из вариантов осуществления, ингибитор γ-секретазы представляет собой 1S-бензил-4R-[1-(1S-карбамоил-2-фенэтилкарбамоил)-1S-3-метилбутилкарбамоил]-2R-гидрози-5-фенилпентил] карбаминовой кислоты трет-бутиловый эфир, также называемый L-685458.
L-685458 может использоваться в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 100 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 90 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 80 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 70 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 60 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 50 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 40 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 30 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 20 мкМ. В одном из вариантов осуществления L-685458 используют в концентрации 10 мкМ.
В одном из вариантов осуществления фактор, ингибирующий сигнальный путь TGF-βR-1, представляет собой ингибитор TGF-βR-1-киназы. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы представляет собой (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин). В другой реализации ингибитор TGF-βR-1-киназы представляет собой [3-(пиридин-2-ил)-4-(4-хинонил)]-1H-пиразол.
Ингибитор TGF-βR-1-киназы может использоваться в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 100 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 90 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 80 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 70 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 60 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 50 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 40 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 30 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 20 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 10 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 1 мкМ. В одном из вариантов осуществления, ингибитор TGF-βR-1-киназы используют в концентрации приблизительно 0,1 мкМ.
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть обработаны по меньшей мере одним дополнительным фактором, который может улучшать образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы. Как вариант, по меньшей мере еще один дополнительный фактор может улучшить пролиферацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных с помощью способов, составляющих предмет настоящего изобретения. Далее по меньшей мере еще один дополнительный фактор может улучшить способность клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных с помощью способов, которые составляют предмет настоящего изобретения, образовывать другие типы клеток или повышать эффективность дополнительных стадий дифференцировки.
По меньшей мере одним дополнительным фактором могут быть, например, никотинамид, члены семейства TGF-β, включая TGF-β1, 2 и 3, сывороточный альбумин, члены семейства факторов роста фибробластов, тромбоцитарные факторы роста -AA, и -BB, плазма, богатая тромбоцитами, инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -8, -10, 11), глюкагонподобный пептид-I и II (GLP-I и II), миметические антитела GLP-1 и GLP-2, экзендин-4, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, инсулин, прогестерон, апротинин, гидрокортизон, этаноламин, бета-меркаптоэтанол, эпидермальный фактор роста (EGF), гастрин I и II, хелатирующие агенты на основе меди, например, триэтиленпентамин, форсколин, бутират натрия, активин, бетацеллюлин, ITS, Noggin, фактор роста нейритов, Nodal, вальпроевая кислота, трихостатин A, натрий бутират, фактор роста гепатоцитов (HGF), сфингозин-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), добавки N2 и B27 (Gibco, CA), стероидные алкалоиды, например, циклопамин (EMD, CA), фактор роста кератиноцитов (KGF), белки семейства Dickkopf, экстракт бычьего гипофиза, белок, ассоциированный с неогенезом островков (islet neogenesis-associated protein, INGAP), Indian Hedgehog, Sonic Hedgehog, протеосомальные ингибиторы, ингибиторы сигнального пути Notch, ингибиторы Sonic Hedgehog и их сочетания.
По меньшей мере один дополнительный фактор может поступать из кондиционированной среды, полученной от линий панкреатических клеток, таких как PANC-1 (ATCC № CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC № HTB-79), BxPC-3 (ATCC № CRL-1687), HPAF-II (ATCC № CRL-1997), линий клеток печени, таких как HepG2 (ATCC № HTB-8065), линий клеток кишечника, таких как FHs 74 (ATCC № CCL-241).
Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы
Маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, хорошо известны специалистам в данной сфере, и дополнительные маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, продолжают выявляться. Данные маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии эндокринных клеток поджелудочной железы. К маркерам, специфическим для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, NGN-3, NeuroD, Islet-1.
Маркеры, характерные для линии β-клеток, хорошо известны специалистам в данной сфере, и дополнительные маркеры, характерные для линии β-клеток, продолжают выявляться. Эти маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные для линии β-клеток. К специфическим особенностям линии β-клеток относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, в том числе, таких как Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox gene-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3beta и MafA. Эти транскрипционные факторы хорошо известны в данной сфере в плане идентификации эндокринных клеток. Смотрите, например, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).
Эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы. Как вариант, эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии β-клеток.
Способы анализа экспрессии маркерных белков и нуклеиновых кислот в культивированных или изолированных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блот, а для маркеров, доступных в интактных клетках, способ проточной цитометрии (FACS) (смотрите, например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
В одном аспекте настоящего изобретения эффективность дифференцировки определялась путем измерения процентной доли инсулин-положительных клеток в данной клеточной культуре после обработки. В одном из вариантов осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 100% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 90% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 80% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 70% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 60% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 50% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 40% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 30% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 20% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 10% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления, способы настоящего изобретения давали приблизительно 5% инсулин-положительных клеток в данной культуре.
В одном аспекте настоящего изобретения эффективность дифференцировки определялась путем измерения стимулированной глюкозой секреции инсулина, определявшейся по количеству С-пептида, секретируемого клетками. В одном из вариантов осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 1000 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 900 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 800 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 700 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 600 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 500 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 400 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 500 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 400 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 300 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 200 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 100 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 90 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 80 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 70 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 60 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 50 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 40 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 30 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 20 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления, клетки, полученные способами настоящего изобретения, производили приблизительно 10 нг C-пептида/пг ДНК.
Способы лечения
В одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения пациентов, страдающих от диабета 1 типа или подвергающихся риску развития этого заболевания. Данный способ включает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку полипотентных стволовых клеток in vitro в линию β-клеток и имплантирование клеток β-линии пациенту
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения пациентов, страдающих от диабета 2 типа или подвергающихся риску развития этого заболевания. Данный способ включает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку полипотентных культивированных стволовых клеток in vitro в линию β-клеток и имплантирование клеток β-линии пациенту.
При необходимости пациент далее может получать лечение фармакологическими агентами или биологически активными веществами, улучшающими выживаемость и функционирование трансплантированных клеток. К этим агентам могут относиться, например, в том числе, инсулин, члены семейства TGF-β, включая TGF-β1, 2 и 3, костные морфогенетические белки (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 и -13), факторы роста фибробластов-1 и -2, тромбоцитарный фактор роста -AA и -BB, плазма, богатая тромбоцитами, инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), фактор роста из клеток эндотелия сосудов (VEGF), плейотропин, эндотелин. К другим фармакологическим веществам могут относиться, например, никотинамид, глюкагонподобный пептид-I (GLP-1) и II, миметические антитела GLP-1 и 2, экзендин-4, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, ингибиторы MAPK, такие, например, как описаны в опубликованной патентной заявке США 2004/0209901 и опубликованной патентной заявке США 2004/0132729.
Полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в инсулин-продуцирующие клетки до трансплантации реципиенту. В специфической реализации полипотентные стволовые клетки являются полностью дифференцированными в β-клетки до трансплантации реципиенту. Как вариант, полипотентные стволовые клетки могут быть трансплантированы реципиенту в недифференцированном или частично дифференцированном состоянии. Дальнейшая дифференцировка может происходить в организме реципиента.
Клетки сформировавшейся эндодермы, или, как вариант, клетки панкреатической эндодермы, или, как вариант, β-клетки могут имплантироваться в форме дисперсных клеток или клеток, образовавших кластеры, которые способом инфузии могут вводиться в воротную вену печени. Как вариант, клетки могут вводиться в биологически-совместимых разрушающихся полимерных вспомогательных материалах, в пористых неразрушающихся приспособлениях или в инкапсулированном виде для защиты от иммунного ответа организма-хозяина. Клетки могут имплантироваться в подходящее место организма реципиента. К местам для имплантации относятся, например, печень, естественная поджелудочная железа, пространство под почечной капсулой, сальник, брюшная полость, субсерозное пространство, кишечник, желудок или подкожный карман.
Для облегчения дальнейшей дифференцировки, выживания и активности имплантированных клеток, предварительно, одновременно или после имплантации клеток могут вводиться дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты или противовоспалительные агенты. В некоторых вариантах осуществления, факторы роста применяются для дифференцировки введенных клеток in vivo. Данные факторы могут секретироваться эндогенными клетками и воздействовать на внедренные клетки in situ. Дифференцировку имплантированных клеток можно индуцировать любым сочетанием эндогенных или введенных экзогенно факторов роста, известных специалистам.
Количество клеток, используемое при имплантации, зависит от ряда различных факторов, в том числе, от состояния пациента и его реакции на лечение, и оно может быть определено специалистом в данной сфере.
В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения пациентов, страдающих от диабета или подвергающихся риску развития этого заболевания. Данный способ включает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку культивированных стволовых клеток in vitro в линию β-клеток и заключение клеток в опорный материал с трехмерной структурой. Клетки могут поддерживаться in vitro на этом опорном материале до имплантации пациенту. Как вариант, опорный материал, содержащий клетки, может напрямую имплантироваться в организм пациента без дополнительного культивирования in vitro. В опорный материал может быть заключен по меньшей мере один фармакологический агент, улучшающий выживание и функционирование трансплантированных клеток.
К опорным материалам, подходящим для применения для целей настоящего изобретения, относятся тканевые шаблоны, каналы, перегородки и резервуары, применяемые для лечения тканей. В частности, для практического применения способов настоящего изобретения подходят синтетические и природные материалы в форме пеноматериалов, губок, гелей, гидрогелей, тканных и нетканных структур, применяемых in vitro и in vivo для реконструкции и регенерации биологической ткани, а также для доставки хемотаксических агентов, индуцирующих рост ткани. Смотрите, например, материалы, описанные в патенте США 5770417, патенте США 6022743, патенте США 5567612, патенте США 5759830, патенте США 6626950, патенте США 6534084, патенте США 6306424, патенте США 6365149, патенте США 6599323, патенте США 6656488, патентной заявке США 2004/0062753 A1, патенте США 4557264 и патенте США 6333029.
Чтобы создать опорный материал с включенным фармакологическим агентом, фармакологический агент можно смешать с раствором полимера до изготовления опорной структуры. Как вариант, фармакологический агент можно нанести в виде покрытия на изготовленную опорную структуру, предпочтительно, в присутствии фармакологического носителя. Фармакологический агент может иметь форму жидкости, мелкодисперсного твердого вещества или любую другую подходящую физическую форму. Как вариант, в опорный материал могут быть добавлены инертные наполнители для изменения скорости высвобождения фармакологического агента. В альтернативном варианте осуществления, в опорный материал включается по меньшей мере одно фармакологическое соединение, являющееся противовоспалительным средством, как например, описанные в патенте США 6509369.
В опорный материал может включаться по меньшей мере одно фармакологическое соединение, являющееся антиапоптозным средством, как например, соединения, описанные в патенте США 6793945.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармакологическое соединение, являющееся ингибитором фиброза, как например, соединения, описанные в патенте США 6331298.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармакологическое соединение, являющееся стимулятором ангиогенеза, как например, соединения, описанные в Опубликованной патентной заявке США 2004/0220393 и в Опубликованной патентной заявке США 2004/0209901.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармакологическое соединение, являющееся иммуносупрессором, как например, соединения, описанные в Опубликованной патентной заявке США 2004/0171623.
В опорный материал также может включаться по меньшей мере одно фармакологическое вещество, представляющее собой фактор роста, например, члены семейства TGF-β, включая TGF-β1, 2 и 3, костные морфогенетические белки (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 и -13), факторы роста фибробластов-1 и -2, тромбоцитарный фактор роста -AA и -BB, плазма, богатая тромбоцитами, инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -8, -10, -15), фактор роста из клеток эндотелия сосудов (VEGF), плейотропин, эндотелин. К другим фармакологическим соединениям могут относиться, например, никотинамид, индуцированный гипоксией фактор 1-альфа, глюкагонподобный пептид-I (GLP-1), миметические антитела GLP-1 и GLP-2, и II, экзендин-4, Nodal, Noggin, NGF, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, тенасцин-C, тропоэластин, пептиды тромбинового происхождения, кателицидины, дефензины, ламинин, биологические пептиды, содержащие связывающие клетки и гепарин домены протеинов адгезивного экстраклеточного матрикса, таких как фибронектин и витронектин, ингибиторы MAPK, такие как соединения, описанные в Опубликованной патентной заявке США 2004/0209901 и Опубликованной патентной заявке США 2004/0132729.
Включение клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, в опорный каркас может осуществляться путем простого нанесения клеток на опорный каркас. Клетки могут входить внутрь каркаса путем простой диффузии (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Было разработано несколько других подходов для повышения эффективности рассевания клеток. Например, для нанесения хондроцитов на каркас из полигликолевой кислоты используются центрифужные пробирки (Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). Другой подход к нанесению клеток представляет собой использование центрифугирования, создающего минимальный стресс для рассеваемых клеток и повышающий эффективность нанесения. Например, в публикации Yang et al. разработан способ нанесения клеток (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)), названный центрифужной иммобилизацией клеток (Centrifugational Cell Immobilization, CCI).
Настоящее изобретение иллюстрируют, но не ограничивают, следующие примеры.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Культура человеческих эмбриональных стволовых клеток
Линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 были получены в WiCell Research Institute, Inc., (Madison, WI) и культивировались в соответствии с инструкциями, предоставленными указанным выше институтом. Вкратце, клетки культивировались на питающих клетках, представляющих собой мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ) в среде для эмбриональных стволовых клеток, содержащей DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO), с добавкой 20% заменителя сыворотки Knockout, 100 нМ раствора заменимых аминокислот MEM, 0,5 мМ бетамеркаптоэтанола, 2 нМ L-глутамина с 4 нг/мл человеческого основного фактора роста фибробластов (bFGF) (все производства Invitrogen/GIBCO). МЭФ-клетки из мышиных эмбрионов E13 -13.5, были приобретены в Charles River. МЭФ-клетки выращивались в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hyclone), 2 мМ глутамина и 100 мМ заменимых аминокислот MEM. Субконфлюэнтные культуры МЭФ-клеток были обработаны раствором 10 мкг/мл митомицина C (Sigma, St. Louis, MO) в течение 3 ч для остановки деления клеток, затем обработаны трипсином и рассеяны по 2×104/см2 на покрытые 0,1% бычьим желатином чашки. В качестве слоя питающих клеток использовались МЭФ-клетки пассажей со второго по четвертый. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, нанесенные на слой питающих МЭФ-клеток, культивировались при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2 в инкубаторе с увлажнением для тканевых культур. По достижении конфлюэнтного роста (приблизительно, через 5-7 дней после нанесения), человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатывались раствором коллагенозы типа IV с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen/GIBCO) в течение 5-10 мин, а затем мягко счищались с поверхности при помощи пипетки на 5 мл. Клетки осаждались центрифугированием при 900 об/мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировался и снова высевался с соотношением клеток от 1:3 до 1:4 в свежую культуральную среду.
Пример 2
Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток до эндокринных клеток поджелудочной железы на субстрате тканевой культуры, покрытом MATRIGEL TM
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 45, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще трех дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA) в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN). Общая схема процедуры изображена на фиг.1, a. Образцы РНК отбирались из культуры на различных стадиях дифференцировки. На фиг.2 показаны данные анализа методом ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных на стадиях с 3 по 5. Видно достоверное увеличение экспрессии эндокринных маркеров, таких как инсулин и глюкагон, наблюдаемое в клетках стадий 4 и 5, в сочетании с увеличением экспрессии NeuroD.
Пример 3
Влияние различных соединений на экспрессию маркеров, характерных для линии панкреатических клеток, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, a
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA) в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN). Некоторые из культур были обработаны приведенными ниже соединениями в концентрации 1 мкм на стадии 3, стадии 4, или на стадиях 3+4: ингибитор MEK/MAPK (2′-амино-3′-метоксифлавон) (PD98059, Calbiochem, CA), ингибитор RAF-киназы (5-йодо-3-[(3,5-дибромо-4-гидроксифенил)метилен]-2-индолинон) (№553008, Calbiochem, CA), ингибитор SMAD3 (6,7-диметил-2-((2E)-3-(1-метил-2-фенил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил-проп-2-еноил))-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин) (№ 566405, Calbiochem, CA), ингибитор AKT (1L6-гидроксиметил-хироинозитол-2-(R)-2-O-метил-3-O-октадецил-sn-глицерокарбонат) (№124005, Calbiochem, CA), ингибитор MEK (№444937 Calbiochem, CA), и ингибитор рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) (ингибирует активиновый рецептор-подобную киназу 5, № 616452, Calbiochem, CA).
На фиг.3, a-e показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных в конце стадий с 3 по 5, обработанных в соответствии с указанными условиями. Следует обратить внимание, что добавление ингибитора киназы рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) к клеткам на стадии 4 или на стадии 3 и 4 существенно увеличивало экспрессию инсулина, глюкагона, NeuroD и NKX2.2 и, при этом, незначительно влияло на экспрессию PDX-1 в конце стадии 5. Добавление ингибитора киназы рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) к клеткам только на стадии 3 незначительно увеличивало экспрессию эндокринных маркеров в клетках в конце стадии 5.
Пример 4
Влияние добавления ингибитора киназы рецептора TGF-b I на экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, a
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 44 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA) в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN). Некоторые культуры были обработаны ингибитором киназы рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) в концентрации 1 мкм (ингибитор активиновый рецепторподобной киназы 5, № 616452, Calbiochem, CA) на стадии 4, на стадии 5 или на стадиях 4 и 5.
На фиг.4, a-e показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных в конце стадий с 3 по 5, при наличии/отсутствии ингибитора киназы на стадиях 4-5. Следует обратить внимание, что добавление ингибитора киназы рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) к клеткам на стадии 4 или на стадии 4 и 5 существенно увеличивало экспрессию инсулина, глюкагона, NeuroD и NKX2.2 и, при этом, незначительно влияло на экспрессию PDX-1 в конце стадии 5. Добавление ингибитора киназы рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) к клеткам только на стадии 5 незначительно увеличивало экспрессию эндокринных маркеров в клетках в конце стадии 5.
Пример 5
Влияние различных ингибиторов киназы рецептора TGF-b I на экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, a
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 41 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA) в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN). Некоторые культуры были обработаны ингибитором киназы рецептора TGF-B I (2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин) в концентрации 1-10 мкм (ингибитор II ALK5) (ингибитор активиновый рецепторподобной киназы 5, № 616452, Calbiochem, CA) или ингибитором I TGF-B рецептора I (ингибитор I ALK5) ([3-(пиридин-2-ил)-4-(4-хинонил)]- 1H-пиразол) (№ 616451, Calbiochem, CA) на стадиях 4 и 5.
На фиг.5, a-e показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных в конце стадий с 4-5, при наличии/отсутствии ингибитора ALK5 I или II. Следует обратить внимание, что добавление ингибитора ALK5 I или II в концентрации 1-10 мкм на стадиях 4 и 5 существенно увеличивало экспрессию инсулина, глюкагона, PDX-1 и NeuroD в конце стадий 4-5 в сравнении с контролем (стандартной обработкой). Все образцы анализировались трехкратно.
Пример 6
Влияние ингибиторов Noggin и ALK5 на экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, a
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 41 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO)+0-500 нг/мл Noggin (R&D Systems, MN).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, Ca)+1 мкм ингибитора II ALK5 (Calbiochem, Ca) в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN)+1 мкм ингибитора II ALK5.
На фиг. 6,a-g показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных в конце стадий 3-5, при наличии/отсутствии 0-100 нг/мл Noggin. Добавление Noggin в концентрации 100 нг/мл на стадии 3 незначительно увеличивало экспрессию инсулина и глюкагона в конце стадии 4 и, при этом, существенно подавляло экспрессию альбумина и CDX2 в сравнении с необработанными образцами. Добавление Noggin в концентрации 500 нг/мл не влияло на экспрессию PDX-1, но существенно снижало экспрессию эндокринных маркеров, а также альбумина и CDX2. Альбумин является маркером клеток-предшественников печеночных клеток, тогда как CDX2 является маркером клеток кишечника.
Пример 7
Влияние добавления Noggin на стадии 3 и ингибиторов ALK5 на стадиях 4 и 5 на экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 44 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO)+100 нг/мл Noggin (R&D Systems, MN).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, Ca)+1 мкм ингибитора II ALK5 (Calbiochem, Ca)+/-100 нг/мл Noggin в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN)+1 мкм ингибитора II ALK5.
На фиг.7, a-f показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных в конце стадий 4-5, при наличии/отсутствии 100 нг/мл Noggin. Добавление 100 нг/мл Noggin на стадиях 3+4, в сочетании с добавлением ингибитора II ALK5, значительно повышало экспрессию инсулина и глюкагонов на стадиях 4-5. В частности, добавление Noggin на обеих стадиях 3 и 4 значительно повышало экспрессию NGN3, маркера предшественников эндокринных клеток и, при этом, существенно подавляло экспрессию альбумина и CDX2 по сравнению с необработанными образцами.
На фиг.8, a-d показано фазово-контрастное изображение культур, соответствующих приведенному выше протоколу. В некоторых культурах стадия 5 продлялась на срок от 3 до 21 дня. К 10-12 дню культивирования в среде стадии 5 по всей культуральной чашке наблюдались отдельные кластеры клеток, напоминающие островки у человека. На панелях a и b показаны изображения культур стадии 5 на 6 день, а на панелях показаны изображения культур стадии 5 на 12 день. Некоторые кластеры были вручную сняты, рассеяны на планшеты, покрытые 1:30 MATRIGEL, со средой, соответствующей стадии 5. После 2 дней инкубации кластеры окрашивались для определения инсулина и глюкагона. Большинство клеток в кластерах, как показано на фиг.9, a-b, являлись положительными в отношении продукции человеческого инсулина. Для дальнейшей оптимизации дозы ингибитора BMP, Noggin, культуры на стадиях 2-4 проходили обработку Noggin в концентрации 0, 10, 50 или 100 нг/мл. На фиг.10 показана экспрессия NGN3 на стадии 4 в культурах, которые были обработаны различными дозами Noggin на стадиях 2-4. Представляется, что концентрация 50-100 нг/мл Noggin приводит к максимальной экспрессии NGN3 на стадии 4.
Пример 8
Влияние добавления Noggin на стадиях 3-4, нетрина на стадии 4 и ингибиторов ALK5 на стадии 4 на экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 2% БСА с жирными кислотами и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO)+100 нг/мл Noggin (R&D Systems, MN).
Далее клетки культивировались в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA)+1 мкм ингибитора II ALK5 (Calbiochem, Ca)+/-100 нг/мл Noggin+100 нг/мл нетрина-4 в течение трех дней.
На фиг.11, a-f показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных в конце стадии 4, при наличии/отсутствии 100 нг/мл нетрина-4 на стадии 4. Добавление 100 нг/мл Noggin на стадии 3 и 4, в сочетании с добавлением ингибитора II ALK5 и 100 нг/мл нетрина-4 на стадии 4, существенно увеличивало экспрессию NGN3, NeuroD и Pax4 в клетках, собранных в конце стадии 5.
В некоторых культурах стадии 4 Noggin не использовался, тогда как добавлялся нетрин-4 в сочетании с ингибитором Alk5. На фиг.12, a-d показано, что отсутствие Noggin на стадии 4 существенно уменьшало экспрессию NGN3, NKX2.2 и NeuroD, и оказывало умеренное влияние на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, собранных в конце стадии 5.
Пример 9
Стимулируемая глюкозой секреция инсулина (GSIS) in vitro полипотентными стволовыми клетками, обработанными в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенном на фиг.1, b
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 2% БСА с жирными кислотами и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO)+100 нг/мл Noggin (R&D Systems, MN).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, Ca)+1 мкм ингибитора II ALK5 (Calbiochem, Ca)+/-100 нг/мл Noggin+100 нг/мл нетрин-4 в течение шести дней с последующей дополнительной инкубацией в течение 3-21 дней в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN)+1 мкм ингибитора II ALK5.
Клетки культуры стадии 5 в день 6, 8, 12 и 20 тестировались на GSIS путем отмывки в течение 1 ч в буфере Кребса (раствор Кребса-Рингера: 0,1% БСА, 10 мМ HEPES, 5 мМ NaHCO3, 129 мМ NaCl, 4,8 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl2, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgSO4, 5 мМ NaHCO3) при 37°C, с последующей инкубацией в течение 1 часа в буфере Кребса с добавлением 2 мМ D-глюкозы, и дополнительной инкубацией в течение 1 часа в буфере Кребса с добавлением 20 мМ D-глюкозы. После каждой инкубации супернатант отбирался и замораживался при -20°C для последующего анализа. Концентрации секретированного С-пептида анализировались с помощью сверхчувствительного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на С-пептид (Alpco Diagnostics, Sweden). На фиг.13, a-c показаны уровни секретированного человеческого С-пептида в ответ на стимуляцию глюкозой in vitro. Начальный и промежуточный период инкубации на стадии 5 не характеризовался высоким коэффициентом стимуляции (отношением количества секретированного C-пептида при высокой концентрации глюкозы к количеству секретированного С-пептида при низкой концентрации глюкозы), тогда как образцы, инкубированные в среде стадии 5 в течение 20 дней, демонстрировали высокую стимуляцию в ответ на глюкозу. Это показывает, что длительное воздействие среды стадии 5 приводит к созреванию кластеров, которые демонстрируют признаки GSIS.
Пример 10
Влияние добавления нетрина-1 или нетрина-2 на экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, b
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 44, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 44 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO).
Далее клетки культивировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA) в течение шести дней с последующей дополнительной трехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+50 нг/мл IGF (Peprotech, NJ)+50 нг/мл HGF (R&D Systems, MN). К некоторым культурам на стадиях 2-5 добавлялось 50 нг/мл нетрина-1 или нетрина-2 (R&D Systems, MN). На фиг.14 показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных на стадии 5, при наличии/отсутствии 50 нг/мл нетрина-1 нетрина-2 на стадиях со 2 по 5. Добавление и нетрина-1, и нетрина-2 значительно увеличивает экспрессию глюкагона и инсулина в клетках, собранных в конце стадии 5.
Пример 11
Альтернативный способ индукции экспрессии маркеров, характерных для линии сформировавшейся эндодермы
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 48, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировались в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, либо следующим путем:
культивирование в среде RPMI с добавлением 1% B27 (Invitrogen, Ca) и 50 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN), плюс 1 мМ Na Butyrate (Sigma, MO) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 1% B27 (Invitrogen, Ca) и 50 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN), плюс 0,5 мМ Na Butyrate (Sigma, MO) в течение дополнительных трех дней, либо
в среде DMEM/F12 с добавлением 0,5% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (R&D Systems, MN) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), в течение двух дней, с последующей обработкой средой DMEM/F12, с добавлением 2% ЭТС и 100 нг/мл Activin-A (AA) в течение еще двух дней.
Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% ЭТС+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение трех дней, с последующей четырехдневной инкубацией в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+20 нг/мл FGF7+0,25 мкм Cyclopamine-KAAD+2 мкм ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO). Далее клетки инкубировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл Exendin-4 (Sigma, MO)+1 мкм DAPT (Calbiochem, CA)+1 мкм ингибитора II ALK5 (Calbiochem, Ca) в течение трех дней.
Индуцирование дифференцировки культур в сформировавшуяся эндодерму с использованием альтернативного способа а), приведенного выше, приводила к 78% экспрессии CXCR4, измеренной методом FACS, в сравнении с 56% экспрессией CXCR4 при использовании альтернативного способа b), приведенного выше. CXCR4 рассматривается как маркер клеток сформировавшейся эндодермы.
На фиг.15, a-f показаны данные ПЦР в реальном времени, полученные на клетках, собранных на стадии 5, при использовании альтернативного способа a) или b). Представляется, что альтернативный способ a) также может применяться для индуцирования экспрессии маркеров панкреатической эндодермы и линии эндокринных клеток.
Пример 12
Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемых в отсутствие сыворотки, на субстрате для тканевой культуры с покрытием MATRIGEL TM , в панкреатические эндокринные клетки
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 52, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и подвергались воздействию среды RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Ohio) и 100 нг/мл Activin A (R&D Systems, MN), плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, MN), плюс 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, NJ), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл Activin A, плюс 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней. Далее культуры обрабатывались DMEM/F12+2% БСА+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ Cyclopamine-KAAD (№ 239804, Calbiochem, CA) в течение двух дней, с последующей четырехдневной инкубацией в DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ Cyclopamine-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, MO)+100 нг/мл Noggin (R&D Systems, MN). Далее клетки инкубировались в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+100 нг/мл Noggin+1 мкМ DAPT (№ по каталогу 565784, Calbiochem, CA)+1 мкМ ингибитора II ALK5 (№ по каталогу 616452, Calbiochem, Ca)+100 нг/мл нетрина-4 (R&D Systems, MN) в течение трех дней, с последующей дополнительной инкубацией в течение семи дней в среде DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA)+1 мкМ ингибитора II ALK5 (Calbiochem, Ca). Для дальнейшего созревания эндокринных культур была добавлена последняя стадия, состоящая в семидневной обработке средой DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen, CA). За исключением последней стадии, все прочие стадии были связаны с ежедневной сменой среды. Общая схема процедуры изображена на фиг.1, с. На каждой стадии количество клеток подсчитывалось с помощью гемоцитометра, и для ПЦР-анализа отбирались образцы РНК. Все образцы отбирались трехкратно.
На фиг.16, a-b показана экспрессия CXCR4, измеренная методом FACS, и данные ПЦР в реальном времени для стадии 1 день 3. Виден многократный рост экспрессии относительно недифференцированных эмбриональных стволовых клеток H1. На фиг.16, c-n показаны данные ПЦР в реальном времени для основных панкреатических и эндокринных маркеров в клетках, собранных на стадиях 2-6. На фиг.17 показано количество клеток в конце стадий 1-6.
Пример 13
Содержание C-пептида и проинсулина в полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, c
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 42, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировались в соответствии с протоколом, приведенным на фиг.1, с, как описано в приведенном выше примере 12.
Клетки отмывались в буфере Кребса-Рингера (129 мМ NaCl, 4,8 мМ KCl, 1,2 мМ NaH2PO4, 1,2 мМ MgSO4, 2,5 мМ CaCl2, 5 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 0,3% (масса/объем) БСА) и инкубировались в буфере Кребса в течение 15 минут с последующей инкубацией в буфере Кребса с добавлением 2 мМ D-глюкозы при 37°C, 5% CO2, 95% воздуха. Отбирался объем 0,5 мл супернатанта, оставшаяся среда удалялась и заменялась буфером Кребса с добавлением одного из следующих стимуляторов: 20 мМ D-глюкозы (HG), 30 мМ KCl, 100 мкМ толбутамида (tol), 100 мМ IBMX, 2 мкМ BAY K8644, или 10 мМ кетоизокапроновой кислоты (KIC) в течение 45 минут при 37°C, 5% CO2, 95% воздуха. Отбирался объем 0,5 мл супернатанта, а оставшаяся среда отбрасывалась. Супернатанты анализировались на содержание человеческого С-пептида с использованием комплекта для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA на С-пептид (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, NH). Образцы стандартно разводились в 5-10 раз, чтобы обеспечить соответствие линейному диапазону стандартов, входящих в комплект.
На фиг.18 показана секреция С-пептида после стимуляции различными стимулами. На диаграмме для каждого агента также показан коэффициент стимуляции (частное от деления концентрации C-пептида в супернатанте после стимуляции на концентрацию С-пептида в основном супернатанте, содержащем 2 мМ глюкозы).
Для измерения содержания C-пептида, проинсулина и ДНК в культурах шестой стадии, 6-луночные планшеты, содержащие культуры стадии 6, обрабатывались 500 мкл лизирующего клетки буфера (10 мМ Tris-HCL+1 мМ EDTA, pH 7,5) с последующей ультразвуковой обработкой в течение 30 секунд. Содержание C-пептида и проинсулина измерялись с использованием комплектов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на С-пептид (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, NH) и проинсулин (№ по каталогу 11-1118-01, Alpco Diagnostics, NH), соответственно. Количественный анализ содержания ДНК в лизатах проводился с помощью комплекта Quant-IT™ для ДНК (№ по каталогу P7589, Invitrogen, Ca). Образцы стандартно разводились в 500-1000 раз, чтобы обеспечить соответствие линейному диапазону стандартов, входящих в комплект. На фиг.19 показано содержание C-пептида и проинсулина, нормализованное к ДНК, для трех разных лунок 6-луночного планшета, содержащей культуры стадии 6. Для сравнения, также было измерено содержание C-пептида и проинсулина в трех образцах человеческих трупных островков поджелудочной железы. Следует учитывать, что данные отражают содержание инсулина во всей культуре, а не только в кластерах, присутствующих в культуре.
Пример 14
Анализ методом FASC полипотентных стволовых клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцировки, приведенным на фиг.1, c
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировались в соответствии с протоколом, приведенным на фиг.1, с, как описано в приведенном выше примере 12. Клетки подвергались диссоциации из монослойных культур на одиночные клетки с использованием TrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, CA) и отмывались в холодном PBS. Для фиксации клетки ресуспендировались в 200-300 мкл буфера Cytofix/Cytoperm (BD 554722, BD, Ca) и инкубировались в течение 30 мин при 4°C. Клетки дважды отмывались в 1 мл буферного раствора Perm/Wash (BD 554723) и ресуспендировались в 100 мкл раствора для окраски/блокировки, содержащем 2% нормальной козьей сыворотки в буфере Perm/Wash. Для анализа методом проточной цитометрии клетки окрашивались следующими первичными антителами: антиинсулиновые (кроличьи мАт, Cell Signaling № C27C9; разведение 1:100), антиглюкагоновые (мышиные мАт, Sigma № G2654, 1:100); антисинаптофизиновые (кроличьи поликлональные антитела, DakoCytomation № A0010, 1:50); Клетки инкубировались в течение 30 мин при 4°C с последующей двукратной отмывкой в буфере Perm/Wash и дальнейшей инкубацией в течение 30 мин в следующих подходящих вторичных антителах: козьи антикроличьи Alexa 647 (Invitrogen № A21246) или козьи антимышиные 647 (Invitrogen № A21235); козьи антикроличьи R-PE (BioSource № ALI4407). Все вторичные антитела применялись в разведении 1:200. Клетки отмывались по меньшей мере один раз в буфере Perm/Wash и анализировались с применением BD FACSArray. Для анализа фиксировалось не менее 10000 событий. В качестве контроля использовались недифференцированные клетки H1 и клеточная линия b-TC (ATCC, VA). На фиг.20, a-c показана процентная доля инсулин-положительных и синаптофизин-положительных клеток в культурах стадии 6.
Пример 15
Добавление хордина на стадиях 3 и 4 протокола дифференцировки, указанного на фиг.1, c, повышает экспрессию маркеров, характерных для линии эндокринных клеток поджелудочной железы
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 52, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировались в соответствии с протоколом, приведенным на фиг.1, с, за исключением того, что вместо Noggin на стадиях 3-4 добавлялось 50-100 нг/мл хордина (R&D Systems, MN). Как и Noggin, также является известным ингибитором сигнального пути BMP. Анализ культур стадии 6 методом FACS (фиг.21, a-b) выявил экспрессию инсулина и синаптофизина, очень сходную с экспрессией, наблюдавшейся при добавлении Noggin на стадиях 3-4.
Пример 16
Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемых в отсутствие сыворотки, на субстрате для тканевой культуры с покрытием MATRIGEL TM , в панкреатические эндокринные клетки
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H9, пассаж 39, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировались в соответствии с протоколом, приведенным на фиг.1, с, как описано в приведенном выше примере 12. РНК отбиралась в конце стадий 1-6. На фиг.22, a-l показаны данные ПЦР в реальном времени для основных панкреатических и эндокринных маркеров в клетках, собранных в конце стадий 3-6. По аналогии с результатами, полученными на линии H1, клетки H9 были способны экспрессировать маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
Пример 17
Влияние добавок для культуральной среды на способность полипотентных стволовых клеток дифференцироваться в панкреатические эндокринные клетки
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 39, культивировались на чашках с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировались в соответствии с протоколом, приведенным на фиг.1, с, за исключением того, что в некоторых культурах в базовую среду DMEM/F12 добавлялись 0,25-1% B27 или 1% N2 (Invitrogen, Ca)+2% БСА. Все прочие компоненты протокола дифференцировки сохранялись такими же, как описано в примере 12. Образцы отбирались трехкратно в конце стадий 3, 5 и 6, и анализировались методом ПЦР в реальном времени. На фиг.23, a-d показаны данные ПЦР в реальном времени для основных панкреатических и эндокринных маркеров в клетках, собранных в конце стадий 3, 5 и 6. Использование N2/БСА вместо B27 давало очень сходную экспрессию ключевых маркеров эндокринных клеток поджелудочной железы. Более того, концентрацию B27 можно было снизить до 0,25% без существенного влияния на экспрессию ключевых маркеров эндокринных клеток поджелудочной железы.
Публикации, цитируемые в данном документе, полностью включаются в настоящий документ в форме ссылок. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Claims (72)

1. Способ получения клеток, способных секретировать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой, из полипотентных стволовых клеток человека, включающий следующие стадии:
a. культивирование полипотентных стволовых клеток человека,
b. дифференцировку полипотентных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы,
c. дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
d. дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, способные секретировать инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1.
2. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии клеток панкреатической эндодермы, обрабатывают фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение периода от одного до двенадцати дней.
3. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии клеток панкреатической эндодермы, обрабатывают фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение периода от пяти до двенадцати дней.
4. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии клеток панкреатической эндодермы, обрабатывают фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение двенадцати дней.
5. Способ по п.1, где фактор, ингибирующий путь TGF-βR-1, представляет собой ингибитор киназы TGF-βR-1.
6. Способ по п.5, где фактор, ингибирующий сигнальный путь TGF-βR-1, представляет собой ингибитор киназы TGF-βR-1.
7. Способ по п.6, где киназу TGF-βR-1 используют в концентрации от 0,1 мкМ до 100 мкМ.
8. Способ по п.6, где ингибитор киназы TGF-βR-1 представляет собой 2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1Н-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин.
9. Способ по п.6, где ингибитор киназы TGF-βR-1 представляет собой [3-(пиридин-2-ил)-4-(4-хинонил)]-1Н-пиразол.
10. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, также обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина.
11. Способ по п.1, где стадию дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, проводят путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1.
12. Способ по п.11, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатывают фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение периода от одного до двенадцати дней.
13. Способ по п.11, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатывают фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение периода от пяти до двенадцати дней.
14. Способ по п.11, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатывают фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, и фактором, ингибирующим сигнальный путь TGF-βR-1, в течение двенадцати дней.
15. Способ по п.11, где фактор, ингибирующий сигнальный путь Notch, представляет собой ингибитор γ-секретазы.
16. Способ по п.15, где ингибитор γ-секретазы представляет собой L-685458.
17. Способ по п.15, где L-685458 используют в концентрации от 0,1 мкМ до 100 мкМ.
18. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, также обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина.
19. Способ по п.1, где стадию дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, проводят путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина.
20. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина, в течение от одного до шести дней.
21. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина, в течение шести дней.
22. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до трех дней, а затем клетки обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до четырех дней.
23. Способ по п.22, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение трех дней.
24. Способ по п.22, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение четырех дней.
25. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до трех дней, а затем клетки обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение от одного до четырех дней.
26. Способ по п.25, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение трех дней.
27. Способ по п.25, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10 в течение четырех дней.
28. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до трех дней, а затем клетки обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, нетрином, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до четырех дней.
29. Способ по п.28, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение трех дней.
30. Способ по п.28, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, нетрином, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, в течение четырех дней.
31. Способ по п.19, где фактор, который выбран из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, представляет собой FGF-7.
32. Способ по п.31, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают FGF-7 в концентрации от 50 пг/мл до 50 мкг/мл.
33. Способ по п.31, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают FGF-7 в концентрации 20 нг/мл.
34. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой в концентрации от 1 нМ до 1 мМ.
35. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой в концентрации 1 мкМ.
36. Способ по п.19, где ингибитор фактора «Sonic Hedgehog» представляет собой циклопамин.
37. Способ по п.36, где циклопамин используют в концентрации от 0,1 мкМ до 10 мкМ.
38. Способ по п.36, где циклопамин используют в концентрации, равной 0,25 мкМ.
39. Способ по п.19, где фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой ингибитор ВМР4.
40. Способ по п.39, где ингибитор ВМР4 представляет собой Noggin.
41. Способ по п.39, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают Noggin в концентрации от 500 нг/мл до 100 мкг/мл.
42. Способ по п.39, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают Noggin в концентрации 100 нг/мл.
43. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают нетрином в концентрации от 500 нг/мл до 100 мкг/мл.
44. Способ по п.19, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают нетрином в концентрации 100 нг/мл.
45. Способ по п.19, где нетрин выбран из группы, состоящей из нетрина 1, нетрина 2 и нетрина 4.
46. Способ по п.1, где стадию дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, проводят путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина.
47. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина в течение периода от одного до шести дней.
48. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, ингибитора фактора «Sonic Hedgehog», фактора, способного ингибировать BMP, и нетрина в течение шести дней.
49. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до трех дней, а затем клетки обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до четырех дней.
50. Способ по п.49, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение трех дней.
51. Способ по п.49, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение четырех дней.
52. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором по меньшей мере фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до трех дней, а затем клетки обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до четырех дней.
53. Способ по п.52, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение трех дней.
54. Способ по п.52, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, в течение четырех дней.
55. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение периода от одного до трех дней, а затем клетки обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, нетрином, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF- 7 и FGF-10, в течение периода от одного до четырех дней.
56. Способ по п.55, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog» и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, в течение трех дней.
57. Способ по п.55, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ингибитором фактора «Sonic Hedgehog», фактором, способным ингибировать BMP, нетрином, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, в течение четырех дней.
58. Способ по п.46, где фактор, который выбран из группы, состоящей из FGF-2, FGF-4, FGF-7 и FGF-10, представляет собой FGF-7.
59. Способ по п.58, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают FGF-7 в концентрации от 50 пг/мл до 50 мкг/мл.
60. Способ по п.58, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают FGF-7 в концентрации 20 нг/мл.
61. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой в концентрации от 1 нМ до 1 мМ.
62. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают ретиноевой кислотой в концентрации 1 мкМ.
63. Способ по п.46, где ингибитор фактора «Sonic Hedgehog» представляет собой циклопамин.
64. Способ по п.63, где циклопамин используют в концентрации от 0,1 мкМ до 10 мкМ.
65. Способ по п.63, где циклопамин используют в концентрации, равной 0,25 мкМ.
66. Способ по п.46, где фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой ингибитор ВМР4.
67. Способ по п.66, где ингибитор ВМР4 представляет собой Noggin.
68. Способ по п.66, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают Noggin в концентрации от 500 нг/мл до 100 мкг/мл.
69. Способ по п.66, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают Noggin в концентрации 100 нг/мл.
70. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают нетрином в концентрации от 500 нг/мл до 100 мкг/мл.
71. Способ по п.46, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформировавшейся эндодермы, обрабатывают нетрином в концентрации 100 нг/мл.
72. Способ по п.46, где нетрин выбран из группы, состоящей из нетрина 1, нетрина 2 и нетрина 4.
RU2010126217/10A 2007-11-27 2008-11-25 Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток RU2473684C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US99052907P 2007-11-27 2007-11-27
US60/990,529 2007-11-27
PCT/US2008/084705 WO2009070592A2 (en) 2007-11-27 2008-11-25 Differentiation of human embryonic stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010126217A RU2010126217A (ru) 2012-01-10
RU2473684C2 true RU2473684C2 (ru) 2013-01-27

Family

ID=40350230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010126217/10A RU2473684C2 (ru) 2007-11-27 2008-11-25 Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

Country Status (12)

Country Link
US (5) US9062290B2 (ru)
EP (1) EP2229434B1 (ru)
JP (2) JP5710264B2 (ru)
KR (2) KR101706928B1 (ru)
CN (2) CN101878298B (ru)
AT (1) ATE523585T1 (ru)
BR (1) BRPI0819609A2 (ru)
CA (3) CA2706560C (ru)
ES (1) ES2372463T3 (ru)
MX (1) MX2010005805A (ru)
RU (1) RU2473684C2 (ru)
WO (1) WO2009070592A2 (ru)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
US8012751B2 (en) * 2005-03-31 2011-09-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of pluripotent embryonic stem cells
ES2400916T3 (es) 2005-06-08 2013-04-15 Janssen Biotech, Inc. Una terapia celular para degeneración ocular
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
EP2610336A1 (en) 2007-07-31 2013-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
MX2010009251A (es) 2008-02-21 2010-11-25 Centocor Ortho Biotech Inc Metodos, placas de superficie modificada y composiciones para la fijacion, el cultivo y el desprendimiento celular.
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
ES2697798T3 (es) 2008-06-30 2019-01-28 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre pluripotentes
US20120021519A1 (en) * 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
RU2522001C2 (ru) 2008-10-31 2014-07-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
KR102025158B1 (ko) 2008-10-31 2019-09-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화
CA2744227C (en) 2008-11-20 2018-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
WO2010065679A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 International Stem Cell Corporation Methods of deriving differentiated cells from stem cells
EP2456862A4 (en) 2009-07-20 2013-02-27 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
KR101893021B1 (ko) 2009-07-20 2018-08-29 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
GB2485113B (en) * 2009-07-20 2016-12-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage
DK2516625T3 (da) * 2009-12-23 2024-09-09 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller
KR101841271B1 (ko) 2009-12-23 2018-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
US8932853B2 (en) 2009-12-29 2015-01-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
AU2011223900A1 (en) * 2010-03-01 2012-09-13 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
WO2011143299A2 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
NZ607608A (en) * 2010-08-09 2014-03-28 Takeda Pharmaceuticals Co Method of producing pancreatic hormone-producing cells
AU2015213422A1 (en) * 2010-08-12 2015-09-10 Janssen Biotech, Inc. Treatment of diabetes with pancreatic endocrine precursor cells
EP3981415A1 (en) * 2010-08-12 2022-04-13 Janssen Biotech, Inc. Treatment of diabetes with pancreatic endocrine precursor cells
SG187946A1 (en) 2010-08-31 2013-03-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
US9181528B2 (en) * 2010-08-31 2015-11-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
ES2659393T3 (es) 2010-08-31 2018-03-15 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas
KR102090751B1 (ko) 2011-12-22 2020-03-19 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
EP2823037A4 (en) 2012-03-07 2015-09-16 Janssen Biotech Inc DEFINED MEDIA FOR THE EXPANSION AND CARE OF PLURIPOTENTAL STEM CELLS
CN108034633B (zh) 2012-06-08 2022-08-02 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
GB201216796D0 (en) * 2012-09-20 2012-11-07 Cambridge Entpr Ltd In vitro pancreatic differentiation
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
RU2018116647A (ru) * 2012-12-31 2018-10-24 Янссен Байотек, Инк. Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
CN105705634A (zh) 2012-12-31 2016-06-22 詹森生物科技公司 用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能细胞的悬浮和群集
US20150368616A1 (en) * 2013-02-14 2015-12-24 The Cleveland Clinic Foundation Methods for induction of cell fates from pluripotent cells
CN103194424A (zh) * 2013-03-28 2013-07-10 于涛 一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法
CA2910394A1 (en) * 2013-04-26 2014-10-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
KR102580225B1 (ko) 2013-06-11 2023-09-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
US10114008B2 (en) 2014-01-21 2018-10-30 Empire Technology Development Llc Methods and devices for high throughput screening of conditions affecting stem cell differentiation
CN117821369A (zh) 2014-05-16 2024-04-05 詹森生物科技公司 小分子增强胰腺内分泌细胞中的mafa表达的用途
EP3147356B1 (en) * 2014-05-20 2024-03-13 Tokyo Institute of Technology Method for inducing differentiation of insulin-producing cells
WO2016100909A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
CN113234661A (zh) 2014-12-18 2021-08-10 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
AU2016228894B2 (en) 2015-03-11 2021-03-04 Ccs Ventures Limited Pancreatic endocrine progenitor cell therapies for the treatment of obesity and Type 2 diabetes (T2D)
US20180327719A1 (en) * 2015-09-18 2018-11-15 Kyoto University Method for producing pancreatic bud cells
WO2017072580A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Biolamina Ab Methods for producing hepatocytes
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
MA45502A (fr) 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
EP4595951A3 (en) 2016-11-10 2025-08-27 ViaCyte, Inc. Pdx1 pancreatic endoderm cells in cell delivery devices
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
AU2018370029B2 (en) 2017-11-15 2024-11-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Islet cell manufacturing compositions and methods of use
KR20250048481A (ko) * 2018-02-09 2025-04-08 세라시스, 인코포레이티드 당뇨병을 치료하기 위한 췌장 세포 및 이를 생성하는 방법
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
US12378572B2 (en) 2018-09-07 2025-08-05 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
WO2020077204A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Salk Institute For Biological Studies Cells, islets, and organoids that evade immune detection and autoimmunity, methods of production and use thereof
CA3257300A1 (en) 2019-05-31 2025-06-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
US20220233298A1 (en) 2019-05-31 2022-07-28 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
AU2020283056B2 (en) 2019-05-31 2023-06-08 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
WO2020243663A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
JP7753197B2 (ja) 2019-09-05 2025-10-14 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ユニバーサルドナー細胞
EP4025224A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 CRISPR Therapeutics AG Universal donor cells
WO2021119382A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 The Regents Of The University Of California Endoderm differentiation from pluripotent stem cell lines
CN113106054B (zh) * 2020-01-13 2022-10-14 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂
CN111394311B (zh) * 2020-04-20 2022-07-01 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种诱导间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的无血清完全培养基
EP4647080A2 (en) 2020-07-31 2025-11-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Differentiation of pancreatic endocrine cells
KR20230146007A (ko) 2020-12-31 2023-10-18 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 범용 공여자 세포
EP4426814A2 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived pancreatic islet differentiation
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
WO2024243236A2 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of delivery of islet cells and related methods

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0149109A2 (de) * 1984-01-18 1985-07-24 Siemens Aktiengesellschaft Integrierte Halbleiterschaltung mit einem Ringoszillator
SU1602536A1 (ru) * 1988-11-28 1990-10-30 Украинский научно-исследовательский ветеринарный институт Способ определени целесообразности вакцинации против парвовирусной болезни свиней
US20030138948A1 (en) * 2001-12-07 2003-07-24 Fisk Gregory J. Islet cells from human embryonic stem cells
US20060194321A1 (en) * 2005-01-31 2006-08-31 Alan Colman Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US20070020242A1 (en) * 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway

Family Cites Families (232)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5759830A (en) 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JP2813467B2 (ja) 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
ATE214602T1 (de) 1994-12-29 2002-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verstärker eines anti-tumoragens beinhaltend einen il-6 antagonisten
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
PT1028954E (pt) 1997-04-24 2003-11-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Imidazoles substituidos uteis no tratamento de doencas inflamatorias
DE69837491T2 (de) 1997-07-03 2008-01-17 Osiris Therapeutics, Inc. Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ATE294860T1 (de) 1997-09-16 2005-05-15 Egea Biosciences Llc Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
AR014195A1 (es) 1997-12-29 2001-02-07 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles para el tratamiento de procesos inflamatorios, composiciones anti-inflamatorias que los comprenden, ymetodos para prepararlos
EP1066052B1 (en) 1998-03-18 2006-02-01 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
IL144359A0 (en) 1999-01-21 2002-05-23 Vitro Diagnostics Inc Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
AU7719300A (en) 1999-09-27 2001-04-30 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
JP2003517592A (ja) 1999-12-13 2003-05-27 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 膵島αおよびβ前駆体の同定ならびに単離のためのマーカー
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
KR100947577B1 (ko) 2000-06-26 2010-03-15 엔씨 메디컬 리서치 가부시키가이샤 신경계 세포로 분화할 수 있는 세포를 포함하는 세포분획
KR100850812B1 (ko) 2000-10-23 2008-08-06 스미스클라인 비참 코포레이션 신규 화합물
EP1345946B1 (en) 2000-12-08 2005-08-10 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
EP1362047B1 (en) 2000-12-08 2006-05-17 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
WO2002059278A2 (en) 2001-01-24 2002-08-01 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Department Of Health & Human Services Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
ES2571219T3 (es) 2001-01-25 2024-09-23 The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services Formulación de compuestos de ácido borónico
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
US20050054102A1 (en) 2001-04-19 2005-03-10 Anna Wobus Method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
EP1391505B1 (en) 2001-04-24 2009-01-28 Ajinomoto Co., Inc. Stem cells and method of separating the same
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
WO2003014313A2 (en) 2001-08-06 2003-02-20 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
AU2002363659B2 (en) 2001-11-15 2008-09-25 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
US20030161816A1 (en) 2001-12-07 2003-08-28 Fraser John K. Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CA2471540A1 (en) 2001-12-28 2003-07-10 Cellartis Ab A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
CA2482716A1 (en) 2002-04-17 2003-10-23 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of forming pancreatic .beta. cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
EP1506192B1 (en) 2002-05-08 2008-02-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) * 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
EP1507848A4 (en) 2002-05-28 2005-11-23 Becton Dickinson Co EXPANSION AND TRANSDIFFERENCING OF HUMAN AZINUS CELLS
KR20050008787A (ko) 2002-06-05 2005-01-21 얀센 파마슈티카 엔.브이. 키나제 저해제로서의 비스인돌릴-말레이미드 유도체
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
JP2005534345A (ja) 2002-07-29 2005-11-17 エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド インスリン陽性、グルコース応答性細胞の分化のための多段階方法
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
WO2004044158A2 (en) 2002-11-08 2004-05-27 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
AU2003302702B2 (en) 2002-12-05 2008-08-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
PT1572984E (pt) 2002-12-16 2016-06-03 Technion Res & Dev Foundation Sistema de cultura para células estaminais embrionárias humanas sem células alimentadoras e sem xeno
PL377403A1 (pl) 2003-01-29 2006-02-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sposób wytwarzania preparatu powlekanego
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
AU2004252571C1 (en) 2003-06-27 2012-03-01 Ethicon, Incorporated Postpartum-derived cells for use in treatment of disease of the heart and circulatory system
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
CA2536067A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
WO2005063971A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Cythera, Inc Definitive endoderm
US20050266554A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CN112813019A (zh) 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
WO2005080598A1 (ja) 2004-02-19 2005-09-01 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
EP1737944A4 (en) 2004-03-09 2010-03-24 Lifescan Inc METHOD FOR GENERATING INSULIN-PRODUCING CELLS
WO2005086845A2 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Regents Of The University Of California Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
WO2005097977A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
EP1740612B1 (en) 2004-04-27 2019-08-07 Viacyte, Inc. Pdx1 expressing endoderm
CA2573283C (en) * 2004-07-09 2023-03-14 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
WO2006020919A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
GB2432835B (en) 2004-09-08 2009-04-08 Wisconsin Alumni Res Found Culturing human embryonic stem cells
WO2006029197A1 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Medium and culture of embryonic stem cells
AU2006218359A1 (en) 2005-03-04 2006-09-08 John O'neil Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN103361301A (zh) 2005-03-31 2013-10-23 斯丹姆涅恩有限公司 高度纯化来自羊膜的细胞群
EP1876893B1 (en) 2005-04-15 2012-04-11 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
EP1874367B1 (en) 2005-04-26 2011-07-06 Arhus Universitet Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces
US20100234400A1 (en) 2005-06-10 2010-09-16 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
US20080199959A1 (en) 2005-06-21 2008-08-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method For Cell Culture
KR20160116024A (ko) 2005-06-22 2016-10-06 아스테리아스 바이오세라퓨틱스, 인크. 인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양
EA017545B1 (ru) 2005-06-30 2013-01-30 Янссен Фармацевтика Н.В. Циклические анилино-пиридинотриазины в качестве ингибиторов gsk-3
WO2007016485A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Athersys, Inc. Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells
US20090087907A1 (en) 2005-07-29 2009-04-02 Alice Pebay Compositions and Methods for Growth of Pluripotent Cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
WO2007027156A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving mesenchymal stem cells
AU2006292021B2 (en) 2005-09-12 2012-05-31 Es Cell International Pte Ltd. Cardiomyocyte production
WO2008048671A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
NZ567082A (en) 2005-10-14 2012-08-31 Univ Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
DK1957636T3 (en) * 2005-10-27 2018-10-01 Viacyte Inc PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FORTARM ENDODERM
ZA200804673B (en) 2005-12-13 2009-11-25 Univ Kyoto Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
AU2007220759A1 (en) 2006-02-23 2007-09-07 Viacyte, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
DK2650360T3 (da) 2006-03-02 2019-10-07 Viacyte Inc Endokrine prekursorceller, pancreatiske hormon udtrykkende celler og fremgangsmåder til fremstilling
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
EP4438720A3 (en) 2006-04-28 2025-02-26 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2650561C (en) 2006-05-02 2014-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
US20090298169A1 (en) 2006-06-02 2009-12-03 The University Of Georgia Research Foundation Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2656175C (en) 2006-06-26 2018-08-28 Lifescan, Inc. Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
US20100323442A1 (en) 2006-10-17 2010-12-23 Emmanuel Edward Baetge Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CN101611016B (zh) 2006-10-17 2012-01-25 斯蒂菲尔实验室公司 他拉罗唑代谢物
US20110151554A1 (en) 2006-11-09 2011-06-23 Akira Yuo Method for culturing and subculturing primate embryonic stem cell, as well as method for inducing differentiation thereof
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP2126045A4 (en) 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
EP2562248B1 (en) 2007-07-18 2021-06-09 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2009048675A1 (en) 2007-07-31 2009-04-16 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
EP2610336A1 (en) 2007-07-31 2013-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
AU2008291930B2 (en) 2007-08-24 2014-04-17 Slotervaart Participaties Bv Compositions for the treatment of neoplastic diseases
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
MX2010009251A (es) 2008-02-21 2010-11-25 Centocor Ortho Biotech Inc Metodos, placas de superficie modificada y composiciones para la fijacion, el cultivo y el desprendimiento celular.
JPWO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2011-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
WO2009116951A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
AU2008355123B2 (en) 2008-04-21 2014-12-04 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
DK2993226T3 (da) 2008-06-03 2021-02-22 Viacyte Inc Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
ES2697798T3 (es) 2008-06-30 2019-01-28 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre pluripotentes
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
KR102025158B1 (ko) 2008-10-31 2019-09-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화
RU2522001C2 (ru) 2008-10-31 2014-07-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
ES2743204T3 (es) 2008-11-04 2020-02-18 Viacyte Inc Composiciones de suspensión de agregados de células madre y métodos para su diferenciación
ES2667493T3 (es) 2008-11-14 2018-05-11 Viacyte, Inc. Encapsulación de células pancreáticas derivadas de células madre humanas pluripotentes
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
US20110229441A1 (en) 2008-12-05 2011-09-22 Association Francaise Contre Les Myopathies Method and Medium for Neural Differentiation of Pluripotent Cells
EP2456862A4 (en) 2009-07-20 2013-02-27 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
GB2485113B (en) 2009-07-20 2016-12-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
DK2516625T3 (da) 2009-12-23 2024-09-09 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller
EP2542666A4 (en) 2010-03-02 2014-05-07 Univ Singapore CULTURE ADDITIVES FOR PROMOTING A STEM CELL PROGRAMMING AND DIFFERENTIATION REACTION
EP3199623B1 (en) 2010-03-31 2021-07-28 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
CN103068970A (zh) 2010-04-25 2013-04-24 西奈山医学院 来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成
WO2011143299A2 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
AU2011285531B2 (en) 2010-08-05 2015-04-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
NZ607608A (en) 2010-08-09 2014-03-28 Takeda Pharmaceuticals Co Method of producing pancreatic hormone-producing cells
US9181528B2 (en) 2010-08-31 2015-11-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
US20130274184A1 (en) 2011-10-11 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Er stress relievers in beta cell protection
KR102090751B1 (ko) 2011-12-22 2020-03-19 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
CN108034633B (zh) 2012-06-08 2022-08-02 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
RU2018116647A (ru) 2012-12-31 2018-10-24 Янссен Байотек, Инк. Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
EP2970892A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
KR102580225B1 (ko) 2013-06-11 2023-09-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0149109A2 (de) * 1984-01-18 1985-07-24 Siemens Aktiengesellschaft Integrierte Halbleiterschaltung mit einem Ringoszillator
SU1602536A1 (ru) * 1988-11-28 1990-10-30 Украинский научно-исследовательский ветеринарный институт Способ определени целесообразности вакцинации против парвовирусной болезни свиней
US20030138948A1 (en) * 2001-12-07 2003-07-24 Fisk Gregory J. Islet cells from human embryonic stem cells
US20070020242A1 (en) * 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194321A1 (en) * 2005-01-31 2006-08-31 Alan Colman Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D′AMOUR KA, et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2006 Nov; 24(11):1392-401. Epub 2006 Oct 19. SKOUDY A, et al. Transforming growth factor (TGF)beta, fibroblast growth factor (FGF) and retinoid signalling pathways promote pancreatic exocrine gene expression in mouse embryonic stem cells. Biochem J. 2004 May 1; 379 (Pt 3):749-56. *
D'AMOUR KA, et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2006 Nov; 24(11):1392-401. Epub 2006 Oct 19. *
SKOUDY A, et al. Transforming growth factor (TGF)beta, fibroblast growth factor (FGF) and retinoid signalling pathways promote pancreatic exocrine gene expression in mouse embryonic stem cells. Biochem J. 2004 May 1; 379 (Pt 3):749-56. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2229434A2 (en) 2010-09-22
CN101878298B (zh) 2017-08-15
CA2706560C (en) 2017-02-28
CN107574142A (zh) 2018-01-12
BRPI0819609A2 (pt) 2014-10-14
US20230287353A1 (en) 2023-09-14
JP5710264B2 (ja) 2015-04-30
US20090170198A1 (en) 2009-07-02
US20200024578A1 (en) 2020-01-23
US11505783B2 (en) 2022-11-22
US9062290B2 (en) 2015-06-23
KR20100101111A (ko) 2010-09-16
HK1147521A1 (en) 2011-08-12
CA2954431C (en) 2021-08-24
US20150252327A1 (en) 2015-09-10
JP2011504753A (ja) 2011-02-17
US20180258402A1 (en) 2018-09-13
US9969982B2 (en) 2018-05-15
CN107574142B (zh) 2021-07-06
ES2372463T3 (es) 2012-01-20
ATE523585T1 (de) 2011-09-15
JP2015062437A (ja) 2015-04-09
CA2706560A1 (en) 2009-06-04
MX2010005805A (es) 2010-06-09
KR101592182B1 (ko) 2016-02-05
CA3123528A1 (en) 2009-06-04
EP2229434B1 (en) 2011-09-07
KR101706928B1 (ko) 2017-02-27
WO2009070592A3 (en) 2009-10-15
WO2009070592A2 (en) 2009-06-04
JP6145117B2 (ja) 2017-06-07
KR20150088338A (ko) 2015-07-31
CN101878298A (zh) 2010-11-03
CA2954431A1 (en) 2009-06-04
US10494609B2 (en) 2019-12-03
RU2010126217A (ru) 2012-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230287353A1 (en) Differentiation of human embryonic stem cells
RU2528861C2 (ru) Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
RU2579278C2 (ru) Популяция панкреатических эндокринных клеток-предшественников для снижения концентрации глюкозы в крови и способ дифференцировки панкреатических эндодермальных клеток
RU2473685C2 (ru) Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
RU2540016C2 (ru) Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
RU2610176C2 (ru) Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
RU2465323C2 (ru) Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
HK1147521B (en) Differentiation of human embryonic stem cells