RU2455363C1 - Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production - Google Patents
Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2455363C1 RU2455363C1 RU2011110985/10A RU2011110985A RU2455363C1 RU 2455363 C1 RU2455363 C1 RU 2455363C1 RU 2011110985/10 A RU2011110985/10 A RU 2011110985/10A RU 2011110985 A RU2011110985 A RU 2011110985A RU 2455363 C1 RU2455363 C1 RU 2455363C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- streptococcus thermophilus
- oligonucleotide primers
- synthetic oligonucleotide
- starter cultures
- primers
- Prior art date
Links
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 235000011617 hard cheese Nutrition 0.000 title claims abstract description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710096750 Penicillin-binding protein 2B Proteins 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 101150038610 penA gene Proteins 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Streptococcus thermophilus.The invention relates to biotechnology, namely to DNA technology, and can be used in the milk processing industry for genotyping of strains and cultures of Streptococcus thermophilus.
До настоящего времени основным способом типирования штаммов и изолятов Streptococcus thermophilus является способ, основанный на накоплении данных бактерий в питательной среде. Для выделения молочнокислых стрептококков 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1:10 на физиологическом растворе. Полученную суспензию засевают в стерильное молоко (0,25-0,5 см3 инокулята на 10 см3 среды). Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. Посевы термостатируют при 40°С до свертывания молока. Изучение биологических и биохимических свойств и сопоставление полученных данных с данными дифференциальной таблицы (табл.17.16.) определителя микроорганизмов Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. - Т.2. - Под ред. Дж.Хоулта, П.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльмса. - М.: Мир. - 1997. - С.560-566) позволяет провести типирование исследуемых бактерий.To date, the main method for typing strains and isolates of Streptococcus thermophilus is a method based on the accumulation of these bacteria in a nutrient medium. To isolate lactic streptococci, 1 g of the sample is triturated in a sterile mortar and a 1:10 dilution in physiological saline is prepared. The resulting suspension is seeded in sterile milk (0.25-0.5 cm 3 inoculum per 10 cm 3 medium). If the culture is isolated from fermented milk products, then one drop of the product is introduced into the sterile milk with a bacteriological loop. Crops are thermostated at 40 ° C until coagulation of milk. The study of biological and biochemical properties and comparison of the obtained data with the data of the differential table (Table 17.16.) Of the determinant of microorganisms of Bergey (Detergent of bacteria of Bergey. In 2 volumes - T.2. - Edited by J. Hoult, P. Krieg, P. Snita, J. Steyli, S.Willms. - M .: Mir. - 1997. - S.560-566) allows the typing of the studied bacteria.
К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения большого числа биохимических дифференцирующих тестов, длительность процесса тестирования и высокую стоимость.The disadvantages of this method include the need for a large number of biochemical differentiating tests, the duration of the testing process and the high cost.
Наиболее близким решением данного изобретения являются праймеры и способ генотипирования Streptococcus thermophilus, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров на 16S rRNA (С.Г.Ботина. Штаммы S. thermophilus, ферментирующие галактозу//Молочная промышленность. - 2008. - №4. - С.59). Осуществляется синтез и секвенирование последовательности гена 16S rRNA. Затем проводится сравнение последовательности данного гена с последовательностями, характерными для Streptococcus thermophilus из базы данных GenBank.The closest solution to this invention are primers and a method for genotyping Streptococcus thermophilus, including the synthesis of oligonucleotide primers for 16S rRNA (S. G. Botina. S. thermophilus strains fermenting galactose // Dairy industry. - 2008. - No. 4. - S. 59 ) The synthesis and sequencing of the 16S rRNA gene sequence is carried out. Then, the sequence of this gene is compared with the sequences characteristic of Streptococcus thermophilus from the GenBank database.
К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения секвенирования ампликонов, сравнение каждого с базой данных GenBank, длительность процесса тестирования и высокую стоимость.The disadvantages of this method include the need for amplicon sequencing, comparing each with the GenBank database, the duration of the testing process and the high cost.
Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и способов выявления Streptococcus thermophilus при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.The objective of the invention is to expand the arsenal of specific oligonucleotide primers and methods for identifying Streptococcus thermophilus using specific synthetic oligonucleotide primers.
Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыров, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидные последовательности:The problem is solved in that synthetic oligonucleotide primers are synthesized to identify Streptococcus thermophilus in starter cultures in the production of hard cheeses, according to the invention, the primers have the nucleotide sequences:
Stt1F 5' - GGGCAACAGTATGTTCCAGG - 3' иStt1F 5 '- GGGCAACAGTATGTTCCAGG - 3' and
Stt2R 5' - CCATGATAGCTTTAACGGC - 3'.Stt2R 5 '- CCATGATAGCTTTAACGGC - 3'.
Задача решается тем, что в способе выявления Streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыров, включающем проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидную последовательностьThe problem is solved in that in the method for the detection of Streptococcus thermophilus in starter cultures in the production of hard cheeses, including PCR with synthetic oligonucleotide primers, according to the invention, the primers have a nucleotide sequence
Stt1F 5' - GGGCAACAGTATGTTCCAGG - 3' иStt1F 5 '- GGGCAACAGTATGTTCCAGG - 3' and
Stt2R 5' - CCATGATAGCTTTAACGGC - 3',Stt2R 5 '- CCATGATAGCTTTAACGGC - 3',
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 655 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Streptococcus thermophilus.and if a DNA fragment of 655 bp is detected conclude that Streptococcus thermophilus is present in the test biological material.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеровExample 1. A method of obtaining synthetic oligonucleotide primers
Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена пенициллин-связывающего протеина 2 В (pbp2b gene), характерного только для Streptococcus thermophilus, при анализе полных геномов референтных штаммов Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066 и LMD9, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).The search for new specific primers is carried out on the basis of the selected DNA fragment of the penicillin binding protein 2B gene (pbp2b gene), which is characteristic only of Streptococcus thermophilus, when analyzing the complete genomes of the reference strains of Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066, and LMD9 (available in the GenB database http: // : //www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Selected DNA fragments are tested using the Blast program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства фрагментов ДНК с ДНК различных штаммов Streptococcus thermophilus, содержание оснований GC не менее 50%, не образуют димеры, комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента.The final selection of primers is based on the following criteria: a high level of similarity of DNA fragments with DNA of various Streptococcus thermophilus strains, a content of GC bases of at least 50%, do not form dimers, are complementary to the DNA sequence at the borders of a specific fragment.
Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.The chemical synthesis of primers is carried out by the amidophosphite method on an ASM-102U automatic synthesizer.
Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.The concentration of specific oligonucleotide primers in the mother liquor is determined by spectrometric method.
Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена пенициллин-связывающего протеина 2 В (pbp2b gene), характерного только для Streptococcus thermophilus.Thus, this method allows to obtain synthetic oligonucleotide primers complementary to the DNA of a fragment of the penicillin-binding protein 2B gene (pbp2b gene), which is characteristic only of Streptococcus thermophilus.
Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыровExample 2. The method of application of synthetic oligonucleotide primers for the detection of Streptococcus thermophilus in starter cultures in the production of hard cheeses
Способ осуществляется в несколько этапов.The method is carried out in several stages.
Этап 1. Выделение ДНК Streptococcus thermophilus.Step 1. Isolation of Streptococcus thermophilus DNA.
Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Streptococcus thennophilus, выделенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.For DNA isolation, suspensions of Streptococcus thennophilus strains and isolates isolated on nutrient broth from hydrolyzed milk (BHM), as well as biomaterial from fermented milk products, are taken.
При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют 50 мкл культуры добавляют к 300 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (300-400 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.When isolated from a bacterial culture, cells are plated onto the plaque by centrifugation for 1-2 minutes at 5000-7000 rpm The supernatant is removed. 50 μl of the culture is added to 300 μl of 10% CTAB heated to + 80 ° C, stirred and incubated at + 80 ° C for 40 minutes. Then it is cooled to room temperature and 0.5 volumes (300-400 μl) of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture (25: 24: 1) are added, gently mixed 2-3 times for 1-2 minutes and centrifuged for 10 minutes at 13000 rpm The aqueous phase is transferred to another tube and 300 μl of a mixture of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) is added, stirred for 1 minute and centrifuged for 6 minutes at 13000 rpm. 50 μl (1/10 volume) of 3M sodium acetate pH 4.8 and 1000 μl of ethanol are added to the aqueous phase, stirred and placed for 1 hour at -20 ° C. The sample is centrifuged for 10 min at 13000 rpm, the precipitate is washed with 70% ethanol, dried at an inclined position of the tube at + 37 ° C for 25-30 min and dissolved in 30-50 μl of autoclaved bidistilled water.
Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции.Step 2. Carrying out a polymerase chain reaction.
Состав реакционной смеси: Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-НСl рН 8,9; 160 мМ (NH)4SO4; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, no 0,15 мкг каждого праймера; 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.The composition of the reaction mixture: For each test DNA sample, a PCR mixture is prepared: 650 mm Tris-Hcl pH 8.9; 160 mM (NH) 4 SO 4 ; 30 mM MgCl; 0.5% Tvin-20; 2.5 mM dNTP, no 0.15 μg of each primer; 0.5 e.a. Taq DNA polymerase; 2 μl DNA sample and autoclaved bidistilled water up to 25 μl.
Температурный режим проведения ПНР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 60°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.Temperature regime of the NDP: The amplification program consists of the following temperature regimes: heating the reaction mixture at 95 ° C for 3 min - 1 cycle, then denaturing at 94 ° C 0.2 min, annealing at 60 ° C 0.2 min, elongation at 72 ° С 0.4 min - 35 cycles and dosynthesis at 72 ° С for 0.8 min.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.Stage 3. Sizing of PCR products.
Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).PCR products are analyzed by electrophoresis in 0.5x Tris-borate buffer prepared from 5x TBE buffer (0.089 M Tris-borate; 0.089 M boric acid; 0.002 M EDTA).
Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 25-40 мА в течение 30-40 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 в/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35-40 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».PCR products were visualized by electrophoresis in a 1% ethidium bromide agarose gel at a current strength of 25-40 mA for 30-40 minutes. 12.5 μl of amplicon was mixed with 3 μl of application buffer (0.25% bromophenol blue, 30% glycerol in double-distilled water) and added to the gel wells under electrophoresis buffer. Electrophoresis is carried out at a voltage of 10 V / cm of the gel length until the dye passes from the start of at least 2.0-2.5 cm of the gel (about 35-40 minutes). The results of electrophoresis are taken into account when viewing the gel in ultraviolet light with a wavelength of 254 nm on a Transilluminator instrument.
В качестве маркера используют ДНК pSKII(+), гидролизованную Mspl на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п. или 100bр.PSKII (+) DNA hydrolyzed by Mspl into fragments 710, 489, 404, 328, 242, 190 n.p. is used as a marker. or 100br.
Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 655 н.п.The PCR result is considered positive if the PCR product corresponds to the size of the DNA fragment in 655 N. p.
Пример 3. Определение специфичности ПЦР.Example 3. Determination of the specificity of PCR.
Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами Stt1F и Stt2R представлены в таблице 1, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена пенициллин-связывающего протеина 2 В (pbp2b gene), характерного только для Streptococcus thermophilus. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.The results of studies to determine the specificity of the reaction with the Stt1F and Stt2R primers are presented in Table 1, which show that positive analyzes of PCR products are obtained only when the DNA fragment of the penicillin-binding protein 2 B gene (pbp2b gene), which is characteristic only of Streptococcus thermophilus. Tests were negative when using DNA from other bacteria.
Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента гена пенициллин-связывающего протеина 2В (pbp2b gene), характерного только для Streptococcus thermophilus, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Streptococcus thermophilus 1244 (Коллекция ВНИИМС, Углич) и провели секвенирование. Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066 и LMD9, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Streptococcus thermophilus 1244 (Коллекция ВНИИМС, Углич) совпадала с нуклеотидной последовательностью, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена GenBank вышеназванных референтных штаммов Streptococcus thermophilus.To confirm the specificity of the test fragment of the penicillin-binding protein 2B gene (pbp2b gene), which is characteristic only of Streptococcus thermophilus, a fragment was generated on the DNA matrix of the strain Streptococcus thermophilus 1244 (VNIIMS collection, Uglich) and sequenced. The analysis of the nucleotide sequences of the synthesized fragments was carried out by alignment methods with other published sequences of the complete genomes of the reference strains of Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066 and LMD9, presented in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Search.html). It was found that the nucleotide sequence of the Streptococcus thermophilus 1244 strain (VNIIMS collection, Uglich) coincided with the nucleotide sequence when the DNA of the GenBank gene fragment of the abovementioned Streptococcus thermophilus reference strains was used as a template.
Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления Streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыров обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Streptococcus thermophilus, используемых в молокоперерабатывающей промышленности.Thus, the developed synthetic oligonucleotide primers and the method for detecting Streptococcus thermophilus in starter cultures in the production of hard cheeses are highly specific and allow the identification of strains and cultures of Streptococcus thermophilus used in the milk processing industry.
Claims (2)
Stt1F 5'-GGGCAACAGTATGTTCCAGG-3' и
Stt2R 5'-CCATGATAGCTTTAACGGC-3'1. Synthetic oligonucleotide primers for the detection of Streptococcus thermophilus in starter cultures in the production of hard cheeses, according to the invention, the primers have nucleotide sequences
Stt1F 5'-GGGCAACAGTATGTTCCAGG-3 'and
Stt2R 5'-CCATGATAGCTTTAACGGC-3 '
Stt1F 5'-GGGCAACAGTATGTTCCAGG-3' и
Stt2R 5'-CCATGATAGCTTTAACGGC-3',
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 655 н.п.делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Streptococcus thermophilus. 2. A method for detecting Streptococcus thermophilus in starter cultures in the production of hard cheeses, including PCR with synthetic oligonucleotide primers according to the invention, the primers have a nucleotide sequence
Stt1F 5'-GGGCAACAGTATGTTCCAGG-3 'and
Stt2R 5'-CCATGATAGCTTTAACGGC-3 ',
and if a 655 bp DNA fragment is detected, they conclude that Streptococcus thermophilus is present in the biological material under study.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011110985/10A RU2455363C1 (en) | 2011-03-23 | 2011-03-23 | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011110985/10A RU2455363C1 (en) | 2011-03-23 | 2011-03-23 | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2455363C1 true RU2455363C1 (en) | 2012-07-10 |
Family
ID=46848557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011110985/10A RU2455363C1 (en) | 2011-03-23 | 2011-03-23 | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2455363C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2376367C2 (en) * | 2003-03-17 | 2009-12-20 | Даниско А/С | Structuring fermenting milk bacteria |
-
2011
- 2011-03-23 RU RU2011110985/10A patent/RU2455363C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2376367C2 (en) * | 2003-03-17 | 2009-12-20 | Даниско А/С | Structuring fermenting milk bacteria |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/U58210. БОТИНА С.Г. Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии. DisCollection.ru. 14.03.2011. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113249499A (en) | Salmonella typhi detection kit, and preparation method and application thereof | |
| CN115029459A (en) | Kit for visually detecting Pasteurella multocida based on CRISPR-Cas12a and application | |
| CN102947467A (en) | Assays and kits for serotyping pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits | |
| WO2010062897A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| CN101469326B (en) | Nucleotide specific to ITS of Balcillus proteus mirabilis and use thereof | |
| CN112176080B (en) | Nested PCR primer set, kit and detection method for specific detection of sisal purple leaf curl phytoplasma | |
| RU2455363C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production | |
| CN104611441A (en) | Primers, probes and kit for quantitative PCR (polymerase chain reaction) for detecting 11 types of chlamydiae | |
| JP2015213439A (en) | S. aureus having enterotoxin B, C, D or E gene or LAMP primer for detection of said gene, and S. aureus having enterotoxin B, C, D or E gene using the same | |
| KR101752274B1 (en) | Primer set for high sensitive real-time multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for determining type of shiga toxin genes stx1 and stx2 of Enterohemorrhagic Escherichia coli, and method for determining type of shiga toxin genes of Enterohemorrhagic Escherichia coli using the same | |
| CN104975077A (en) | Pig-sourced eperythrozoon fluorogenic quantitative PCR detection kit and application thereof | |
| Othman et al. | Conventional and molecular detection of Pasteurella multocida in outbreak of respiratory tract infection of sheep and goats in Basrah Province | |
| RU2481400C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD TO DETECT Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus IN STARTER CULTURES USED IN PRODUCTION OF CULTURED MILK FOODS | |
| RU2451751C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD OF DETECTING Lactococcus lactis subspecies lactis IN STARTER CULTURES WHEN PRODUCING FERMENTED MILK PRODUCTS | |
| KR20090122554A (en) | Primer sets and probes for Salmonella typhimurium detection | |
| CN1771331B (en) | stn gene oligonucleotide primers for detecting salmonella species and detection process using the same | |
| RU2481402C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD FOR DETECTION OF Lactobacillus acidophilus IN STARTER CULTURES USED IN PRODUCTION OF CULTURED MILK FOODS | |
| RU2822737C1 (en) | Method for identification of significant for agriculture representatives of genus bacillus-bacillus subtilis, bacillus megaterium and bacillus thuringiensis based on restriction analysis of gene 165s rrna | |
| RU2822737C9 (en) | Method for identification of significant for agriculture representatives of genus bacillus - bacillus subtilis, bacillus megaterium and bacillus thuringiensis based on restriction analysis of gene 16s rrna | |
| RU2469097C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detection of lactococcus lastis subspecies cremoris in starter cultures used in cheese industry and cultured milk production | |
| RU2473698C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture | |
| CN116179570B (en) | A pathogen-specific nucleic acid gene and detection method for Proteus mirabilis | |
| CN114196768B (en) | Specific molecular targets for identification of Pseudomonas aeruginosa serogroups and their rapid detection methods | |
| CN113897417B (en) | Group of probes, detection kit and detection method for detecting bovine tuberculosis bacillus | |
| RU2435852C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD OF DETECTING DNA OF Mycobacterium paratuberculosis THAT IS PARATUBERCULOSIS AGENT BY METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140324 |