RU2473698C1 - Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture - Google Patents
Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2473698C1 RU2473698C1 RU2011134107/10A RU2011134107A RU2473698C1 RU 2473698 C1 RU2473698 C1 RU 2473698C1 RU 2011134107/10 A RU2011134107/10 A RU 2011134107/10A RU 2011134107 A RU2011134107 A RU 2011134107A RU 2473698 C1 RU2473698 C1 RU 2473698C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- longum
- bifidobacterium longum
- bifidobacterium
- revealing
- oligonucleotide primers
- Prior art date
Links
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 title claims abstract description 28
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000007858 starting material Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 title abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum.The invention relates to biotechnology, namely to DNA technologies, and can be used in the milk processing industry for genotyping of strains and cultures of Bifidobacterium longum subspecies longum.
Одним из способов выявления Bifidobacterium, кроме микробиологического, является ПЦР-метод с использованием праймеров lm26 и lm3, позволяющий синтезировать сегмент 16S rRNA размером в 1,35 кb., позволяющий различать бифидобактерии от других бактерий (Р.Kaufman, A.Pfefferkorn, M.Teuber and L.Meile / Identification and Quantification of Bifidobacterium Species Isolated from Food with Genus-Specific 16S rRNA-Targeted Probes by Colony Hybridization and PCR // Appl. and Environ. Microbiol. - Apr. 1997. - Vol.63, No.4. - P.1268-1273One of the methods for detecting Bifidobacterium, in addition to the microbiological one, is the PCR method using lm26 and lm3 primers, which makes it possible to synthesize a 1.65 kb 16S rRNA segment, which makes it possible to distinguish bifidobacteria from other bacteria (P. Kaufman, A. Pfefferkorn, M. Teuber and L. Meile / Identification and Quantification of Bifidobacterium Species Isolated from Food with Genus-Specific 16S rRNA-Targeted Probes by Colony Hybridization and PCR // Appl. And Environ. Microbiol. - Apr. 1997. - Vol. 63, No. 4. - P.1268-1273
К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род - это Bifidobacterium, невозможна дифференциация на виды и подвиды.The disadvantages of this method include the fact that only the genus is detected - this is Bifidobacterium, differentiation into species and subspecies is impossible.
Другим решением данного способа является синтез с помощью ПЦР генов 16S rRNA при использовании праймеров, подобранных на основе последовательностей 16S rRNA пяти видов Bifidobacterium: bifidum, adolescentis, infantis, breve и longum. Можно выявлять не только род, но и вид данных бактерий (Dong X, Cheng G, Jian W. / Simultaneous identification of five Bifidobacterium species isolated from human beings using multiple PCR primers // Syst Appl Microbiol. - 2000. - Oct. - vol.23(3). - P.386-390) с учетом точечных мутаций характерных для рода и видов Bifidobacterium species (T. Matsuki, К. Watanabe, J. Fujimoto, Y. Kado, T. Takada / Quantitative PCR with 16S rRNA-Gene-Targeted Species-Specific Primers for Analysis of Human Intestinal Bifidobacteria // Appl. and Environ. Microbiol. - Jan. 2004. - vol.70. - No. 1. - P.167-173).Another solution of this method is the PCR synthesis of 16S rRNA genes using primers selected on the basis of 16S rRNA sequences of five species of Bifidobacterium: bifidum, adolescentis, infantis, breve and longum. Not only the genus, but also the species of these bacteria can be detected (Dong X, Cheng G, Jian W. / Simultaneous identification of five Bifidobacterium species isolated from human beings using multiple PCR primers // Syst Appl Microbiol. - 2000. - Oct. - vol .23 (3). - P.386-390) taking into account point mutations characteristic of the genus and species of Bifidobacterium species (T. Matsuki, K. Watanabe, J. Fujimoto, Y. Kado, T. Takada / Quantitative PCR with 16S rRNA -Gene-Targeted Species-Specific Primers for Analysis of Human Intestinal Bifidobacteria // Appl. And Environ. Microbiol. - Jan. 2004. - vol. 70 .-- No. 1. - P.167-173).
К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род и вид Bifidobacterium и невозможна дифференциация на подвиды.The disadvantages of this method include the fact that only the genus and species of Bifidobacterium is detected and differentiation into subspecies is impossible.
Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и способов выявления Bifidobacterium longum subspecies longum при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.The objective of the invention is to expand the arsenal of specific oligonucleotide primers and methods for detecting Bifidobacterium longum subspecies longum using specific synthetic oligonucleotide primers.
Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидные последовательности:The problem is solved in that synthetic oligonucleotide primers are synthesized to detect Bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures in the production of lactic acid products, according to the invention, the primers have the nucleotide sequences:
Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3'Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3 '
Bill 2R 5'-сccagcatggagtcggcgg-3'.Bill 2R 5'-cccagcatggagtcggcgg-3 '.
Задача решается тем, что в способе выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, включающем проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидную последовательностьThe problem is solved in that in the method for detecting Bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures in the production of lactic acid products, including PCR with oligonucleotide primers according to the invention, the primers have a nucleotide sequence
Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3'Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3 '
Bill 2R 5'-сccagcatggagtcggcgg-3',Bill 2R 5'-cccagcatggagtcggcgg-3 ',
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Bifidobacterium longum subspecies longum.and if a DNA fragment of 447 bp is detected conclude that Bifidobacterium longum subspecies longum is present in the test biological material.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктовExample 1. A method of obtaining synthetic oligonucleotide primers for the detection of Bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures in the production of lactic acid products
Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена BLLJ1840 glycosyi hydrolase, характерного для Bifidobacterium longum subspecies longum, при анализе полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).The search for new specific primers is carried out on the basis of the selected DNA fragment of the glycosyi hydrolase BLLJ1840 gene, which is characteristic of Bifidobacterium longum subspecies longum, when analyzing the complete genomes of the reference strains of Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN5, N15, BBHN68, 157, 770BN68, NFBN68, NFBN68, NFH5, BFN5, NF, N, N, N, N, N, N, N, T, N, N, N, N, N, N, 7, 7, 5, 7 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Selected DNA fragments are tested using the Blast program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства специфического фрагмента ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum с ДНК различных штаммов этой бактерии. Олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента с содержанием оснований GC не менее 50% и не образовывать димеры.The final selection of primers is based on the following criteria: a high level of similarity of a specific DNA fragment of Bifidobacterium longum subspecies longum with the DNA of various strains of this bacterium. Oligonucleotides must be complementary to the DNA sequence at the boundaries of a specific fragment with a GC base content of at least 50% and not form dimers.
Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.The chemical synthesis of primers is carried out by the amidophosphite method on an ASM-102U automatic synthesizer.
Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.The concentration of specific oligonucleotide primers in the mother liquor is determined by spectrometric method.
Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum.Thus, this method allows to obtain synthetic oligonucleotide primers complementary to the DNA of the glycosyl hydrolase gene fragment, characteristic only for Bifidobacterium longum subspecies longum.
Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктовExample 2. The method of application of synthetic oligonucleotide primers for the detection of Bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures in the production of lactic acid products
Способ осуществляется в несколько этапов.The method is carried out in several stages.
Этап 1. Выделение ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum.Step 1. Isolation of DNA of Bifidobacterium longum subspecies longum.
Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Bifidobacterium longum subspecies longum, выращенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.For DNA isolation, suspensions of strains and isolates of Bifidobacterium longum subspecies longum grown on nutrient broth from hydrolyzed milk (BHM), as well as biomaterial from fermented milk products, are taken.
При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 100 мкл культуры добавляют к 400 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (250-300 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.When isolated from a bacterial culture, cells are pelleted into the plaque by centrifugation for 1-2 minutes at 5000-7000 rpm. The supernatant is removed. 100 μl of the culture is added to 400 μl of 10% CTAB heated to + 80 ° C, mixed and incubated at + 80 ° C for 40 minutes. Then it is cooled to room temperature and 0.5 volumes (250-300 μl) of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture (25: 24: 1) are added, gently mixed 2-3 times for 1-2 minutes and centrifuged for 10 minutes at 13000 rpm The aqueous phase is transferred to another tube and 300 μl of a mixture of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) is added, stirred for 1 minute and centrifuged for 6 minutes at 13000 rpm. 50 μl (1/10 volume) of 3M sodium acetate pH 4.8 and 1000 μl of ethanol are added to the aqueous phase, stirred and placed for 1 hour at -20 ° C. The sample is centrifuged for 10 min at 13000 rpm, the precipitate is washed with 70% ethanol, dried at an inclined position of the tube at + 37 ° C for 25-30 min and dissolved in 30-50 μl of autoclaved bidistilled water.
Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции.Step 2. Carrying out a polymerase chain reaction.
Состав реакционной смеси. Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-НСl рН 8,9; 160 мМ (NH)4SO4; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, по 0,25 мкМ каждого праймера; 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.The composition of the reaction mixture. For each test DNA sample, a PCR mixture is prepared: 650 mM Tris-Hcl pH 8.9; 160 mM (NH) 4 SO 4 ; 30 mM MgCl; 0.5% Tvin-20; 2.5 mM dNTP, 0.25 μM of each primer; 0.5 e.a. Taq DNA polymerase; 2 μl DNA sample and autoclaved bidistilled water up to 25 μl.
Температурный режим проведения ПЦР. Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 56°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.The temperature regime of PCR. The amplification program consists of the following temperature conditions: heating the reaction mixture at 95 ° С for 3 min - 1 cycle, then denaturation at 94 ° С 0.2 min, annealing at 56 ° С 0.2 min, elongation at 72 ° С 0 , 4 min - 35 cycles and dosynthesis at 72 ° C for 0.8 min.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.Stage 3. Sizing of PCR products.
Электрофорез ампликонов проводят в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).Amplicon electrophoresis is carried out in 0.5x Tris-borate buffer prepared from 5x TBE buffer (0.089 M Tris-borate; 0.089 M boric acid; 0.002 M EDTA).
Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 40 мА в течение 25-30 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 в/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».PCR products were visualized by electrophoresis in a 1% ethidium bromide agarose gel at a current of 40 mA for 25-30 minutes. 12.5 μl of amplicon is mixed with 3 μl of application buffer (0.25% bromophenol blue, 30% glycerin in double-distilled water) and added to the gel wells under electrophoresis buffer. Electrophoresis is carried out at a voltage of 10 V / cm of the length of the gel until the dye passes from the start of at least 2.0-2.5 cm of the gel (approximately 35 minutes). The results of electrophoresis are taken into account when viewing the gel in ultraviolet light with a wavelength of 254 nm on a Transilluminator instrument.
В качестве маркера используют ДНК pBLSK, гидролизованную MspI (на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п.).As a marker, pBLSK DNA hydrolyzed with MspI (into fragments 710, 489, 404, 328, 242, 190 np) was used.
Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 447 нуклеотидных пар.The PCR result is considered positive if the PCR product corresponds to the size of the DNA fragment in 447 nucleotide pairs.
Пример 3. Определение специфичности ПЦР.Example 3. Determination of the specificity of PCR.
Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами Bill 1F и Bill 2R представлены в таблице 1, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.The results of studies to determine the specificity of the reaction with the primers Bill 1F and Bill 2R are presented in Table 1, which show that positive analyzes of PCR products are obtained only when the DNA of the BLLJ1840 glycosyl hydrolase gene fragment specific only to Bifidobacterium longum subspecies longum is used as a matrix. Tests were negative when using DNA from other bacteria.
Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longums, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование.To confirm the specificity of the tested fragment of the BLLJ1840 glycosyl hydrolase gene, which is characteristic only for Bifidobacterium longum subspecies longums, a fragment was generated on the DNA matrix of the Bifidobacterium longum subspecies longum ST strain (GNU SibNIIS Collection, Barnaul) and sequenced.
Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью вышеназванных референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F.The analysis of the nucleotide sequences of the synthesized fragments was carried out by alignment methods with other published sequences of the complete genomes of the reference strains of Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 and 157F presented in the GenBank database (http: //www.ncbi .gov / GenBank Search.html). The nucleotide sequence of the Bifidobacterium longum subspecies longum ST strain (collection of GNU SibNIIS, Barnaul) was found to coincide with the nucleotide sequence of the above reference strains of Bifidobacterium longum subspecies longum JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN57, 15CC, NCC.
Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum, обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum, используемых в заквасочных культурах молокоперерабатывающей промышленности.Thus, the developed synthetic oligonucleotide primers for detecting the DNA of the BLLJ1840 glycosyl hydrolase gene, which is characteristic only of Bifidobacterium longum subspecies longum, are highly specific and allow the identification of strains and cultures of Bifidobacterium longum subspecies longum used in starter cultures of the dairy industry.
Claims (2)
Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'
Bill 2R 5'-с cca gca tgg agt cgg cgg-3'.1. Synthetic oligonucleotide primers for the detection of Bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used in the production of dairy products have the nucleotide sequence:
Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3 '
Bill 2R 5'-s cca gca tgg agt cgg cgg-3 '.
Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'18
Bill 2R 5'-с cca gca tgg agt cgg cgg-3'19,
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Bifidobacterium longum subspecies longum. 2. A method for detecting Bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used in the production of dairy products, including PCR with oligonucleotide primers, the primers have a nucleotide sequence
Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'18
Bill 2R 5'-s cca gca tgg agt cgg cgg-3'19,
and if a DNA fragment of 447 bp is detected conclude that Bifidobacterium longum subspecies longum is present in the test biological material.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011134107/10A RU2473698C1 (en) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011134107/10A RU2473698C1 (en) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2473698C1 true RU2473698C1 (en) | 2013-01-27 |
Family
ID=48806990
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011134107/10A RU2473698C1 (en) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2473698C1 (en) |
-
2011
- 2011-08-12 RU RU2011134107/10A patent/RU2473698C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LIESBETH MASCO, GEERT HUYS, DIRK GEVERS, LEEN VERBRUGGHEN, JEAN SWINGS. Identification of Bifidobacterium Species Using rep-PCR Fingerprinting. Systematic and Applied Microbiology. Volume 26, Issue 4, 2003, р.557-563. * |
| LIESBETH MASCO, GEERT HUYS, DIRK GEVERS, LEEN VERBRUGGHEN, JEAN SWINGS. Identification of Bifidobacterium Species Using rep-PCR Fingerprinting. Systematic and Applied Microbiology. Volume 26, Issue 4, 2003, р.557-563. MILOUD HADADJI ET AL. Identification of cultivable Bifidobacterium speciesisolated from breast-fed infants feces in West-Algeria. African Journal of Biotechnology Vol.4 (5), pp.422-430, May 2005. * |
| MILOUD HADADJI ET AL. Identification of cultivable Bifidobacterium speciesisolated from breast-fed infants feces in West-Algeria. African Journal of Biotechnology Vol.4 (5), pp.422-430, May 2005. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Garzetti et al. | A molecular scheme for Yersinia enterocolitica patho-serotyping derived from genome-wide analysis | |
| CN113249499B (en) | Salmonella typhi detection kit, and preparation method and application thereof | |
| Ward et al. | Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria | |
| Wang et al. | A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2 | |
| Zhang et al. | Detection of Yersinia enterocolitica in milk powders by cross-priming amplification combined with immunoblotting analysis | |
| CN103764850B (en) | The detection method of the generation clostridium difficile of toxin | |
| CN102168131B (en) | Primers for Amplifying Specific Regions of Common Pathogenic Legionella gyrB Genes and Their Applications | |
| Williams et al. | Verification of an Edwardsiella ictaluri‐specific diagnostic PCR | |
| RU2473698C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for revealing bifidobacterium longum subspecies longum in starter cultures used during cultured milk products manufacture | |
| JP3525259B2 (en) | Detection of Pectinatus spp. | |
| KR101752274B1 (en) | Primer set for high sensitive real-time multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for determining type of shiga toxin genes stx1 and stx2 of Enterohemorrhagic Escherichia coli, and method for determining type of shiga toxin genes of Enterohemorrhagic Escherichia coli using the same | |
| CN1771331B (en) | stn gene oligonucleotide primers for detecting salmonella species and detection process using the same | |
| JPWO1997020071A1 (en) | Detection of Pectinatus spp. | |
| RU2391409C1 (en) | METHOD OF DECTING PASTEURELLA AND/OR Pseudomonas Aeruginosa bacteria | |
| Drigo et al. | Development of PCR protocols for specific identification of Clostridium spiroforme and detection of sas and sbs genes | |
| RU2451751C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD OF DETECTING Lactococcus lactis subspecies lactis IN STARTER CULTURES WHEN PRODUCING FERMENTED MILK PRODUCTS | |
| RU2481400C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD TO DETECT Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus IN STARTER CULTURES USED IN PRODUCTION OF CULTURED MILK FOODS | |
| RU2469097C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detection of lactococcus lastis subspecies cremoris in starter cultures used in cheese industry and cultured milk production | |
| CN106929573B (en) | Nucleotide sequences specific to the wzm and wecA genes of Legionella pneumophila type O12 and their applications | |
| RU2455363C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting streptococcus thermophilus in starter cultures in hard cheese production | |
| JP7390736B2 (en) | Simultaneous detection method and primer kit for rot fungi | |
| JP7252606B2 (en) | Lactic acid bacteria detection primer set and detection method using the primer set | |
| JALALADDINI et al. | Isolation and identification of Mycoplasma gallisepticum in chickensbn from industrial farms in Kerman province | |
| JP2012187067A (en) | Method for quantifying bacterium of genus lactobacillus | |
| RU2481402C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD FOR DETECTION OF Lactobacillus acidophilus IN STARTER CULTURES USED IN PRODUCTION OF CULTURED MILK FOODS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130813 |