RU2339038C2 - Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных - Google Patents
Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2339038C2 RU2339038C2 RU2006129445/15A RU2006129445A RU2339038C2 RU 2339038 C2 RU2339038 C2 RU 2339038C2 RU 2006129445/15 A RU2006129445/15 A RU 2006129445/15A RU 2006129445 A RU2006129445 A RU 2006129445A RU 2339038 C2 RU2339038 C2 RU 2339038C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- serum
- trichinosis
- conjugates
- antibodies
- conjugate
- Prior art date
Links
- 206010044608 Trichiniasis Diseases 0.000 title claims description 55
- 208000003982 trichinellosis Diseases 0.000 title claims description 55
- 201000007588 trichinosis Diseases 0.000 title claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 244000054334 omnivore Species 0.000 title claims description 11
- 235000020912 omnivore Nutrition 0.000 title claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 87
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 27
- 241000243777 Trichinella spiralis Species 0.000 claims abstract description 24
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 9
- -1 15M phosphate disubstituted potassium Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims abstract description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract 2
- 229940096911 trichinella spiralis Drugs 0.000 claims abstract 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 57
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 24
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 claims description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 5
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 abstract 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 abstract 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 241001439624 Trichina Species 0.000 abstract 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 53
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 43
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 29
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 21
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 16
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 16
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 15
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 15
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 12
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 11
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 6
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 6
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 5
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 108010022861 Trichinella excretory-secretory antigen Proteins 0.000 description 3
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 208000014837 parasitic helminthiasis infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 201000000077 Cysticercosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010014096 Echinococciasis Diseases 0.000 description 1
- 208000009366 Echinococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233756 Fabriciana elisa Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000009361 ascariasis Diseases 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical class [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000004441 taeniasis Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике трихинеллеза. Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови зараженных животных в реакции иммуноферментного анализа и включает использование поликлональных антивидовых конъюгатов, иммуногенных пептидов Trichinella spiralis и контрольных сывороток исследуемого вида животных, при этом при сорбции на полистироле используют иммуногенные пептиды трихинелл молекулярной массой 63-29 кДа в концентрации 3,5-5 мкг/мл, в качестве поликлональных антивидовых конъюгатов используют антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, а также используют солевые буферные растворы, содержащие 0,005% тиомерсала натрия, 0,15М калия фосфорнокислого двухзамещеннго, 0,01М калия фосфорнокислого однозамещеннго, хлористого натрия 0,18М, 0,5% альбумина и 1,5% альбумина для конъюгатов, 1% твин-20 для нанесения сывороток и 1,5% твин-20 при использовании конъюгатов; хромогенный субстрат - 3,3′5,5′ тетраметилбензидин, для остановки реакции используют 0,5М серную кислоту, а полученный результат оценивают на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Изобретение позволяет диагностировать заболевание на ранних стадиях инвазии, начиная с 7-10 дня, и своевременно начинать лечение домашних плотоядных животных (кошек и охотничьих собак) и ликвидировать инвазированных трихинеллезом свиней, а также существенно снижает затраты и сокращает время при проведении ИФ анализа. 3 табл.
Description
Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике опасного антропозооноза - трихинеллеза, и может быть использовано для прижизненной диагностики данного заболевания у плотоядных (кошек, собак) и всеядных животных (свиней).
Трихинеллез относится к числу распространенных и тяжело протекающих гельминтозов человека и животных. По характеру эпидемических вспышек, по массовости и внезапности трихинеллез напоминает многие инфекционные заболевания, а по злокачественности и смертности в случае интенсивного заражения не имеет себе равных [5].
Трихинеллам свойственна высокая патогенность, хорошая выживаемость, большая плодовитость, широкий круг хозяев, прохождение цикла развития в одном организме в независимости от внешних факторов окружающей среды. Взаимная циркуляция возбудителя трихинеллеза между природными и синантропными очагами поддерживается определенными пищевыми связями: в результате поедания слабых зверей более сильными, а также через падаль. Из дикой природы через тушки отстрелянных на охоте хищников, а также грызунами, бродячими собаками, кошками, свиньями, трихинеллез переносится в населенные пункты, где и поддерживается среди домашних животных на протяжении многих лет [3, 6].
Анализ эпизоотологической и эпидемической обстановки по трихинеллезу в Российской Федерации свидетельствует о все возрастающей роли диких промысловых животных в распространении этой инвазии и вспышках трихинеллеза среди населения [4, 7].
Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 случаев заболевания этим опасным гельминтозом людей, причем в 40% они носят групповой характер. В большинстве случаев данное заболевание было вызвано употреблением свинины. Способы кормления и содержания свиней в теплый период года на свободном выпасе, местные обычаи населения благоприятствуют очаговому распространению данной инвазии в синантропном очаге, в связи с чем в последние годы участились крупномасштабные вспышки трихинеллеза среди людей [5-7].
Своевременная диагностика, основанная только на клинической картине заболевания, не всегда объективна, хотя именно раннее обнаружение трихинеллеза позволяет назначить эффективное терапевтическое лечение. В связи с этим практическое здравоохранение и ветеринария остро нуждаются в иммунодиагностических тест-системах, позволяющих выявлять специфические антитела в крови инвазированных животных и людей. Разработка эффективной прижизненной диагностики трихинеллеза свиней является ведущим фактором обеспечения санитарного качества мясных продуктов, экономической рентабельности свиноводства, гарантией предупреждения вспышек трихинеллеза среди населения и, в конечном счете, способствует искоренению данного гельминтоза.
Для прижизненной диагностики трихинеллеза домашних плотоядных животных (кошек, собак) коммерческие тест-системы не разработаны не только в РФ, но и в зарубежных странах. В связи с этим практическая ветеринарная медицина остро нуждается в эффективных иммунодиагностических тест-системах, позволяющих выявлять специфические антитела в сыворотке крови спонтанно инвазированных плотоядных и всеядных животных, особенно в синантропных очагах трихинеллеза. Прижизненная иммунологическая диагностика тканевого гельминтоза - трихинеллеза - позволит сохранить жизнь многим кошкам и собакам, обитающим при свиноводческих фермах, поскольку в случае вспышки трихинеллеза в первую очередь уничтожению подлежали все плотоядные животные данного хозяйства.
Цель изобретения состоит в создании технологии производства диагностически эффективной коммерческой тест-системы (ИФТС) на основе иммуноферментного метода для определения специфических антител в сыворотке крови у зараженных трихинеллезом плотоядных(кошек, собак) и всеядных (свиней) животных к антигенам Т.spiralis на всех стадиях развития инвазии, включая раннюю (острую фазу).
Сущность изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективного способа прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных на основе коммерческой иммуноферментной тест-системы «ИФА-ВИГИС-БИОТЕХ- T.spiralis-стрип».
Наиболее близким прототипом предложенной инновации можно считать эффективные отечественные коммерческие тест-системы для иммунологической диагностики трихинеллеза у человека: иммуноферментная (производства ЗАО «Вектор-Бест, г. Новосибирск) и на основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), производства Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (5,8).
Иммунологической диагностикой трихинеллеза свиней в РФ занимались Белозеров С.Н. (испытал реакцию непрямой иммунофлуоресценции РНИФ и ИФР, используя в качестве антигена лиофилизированных личинок трихинелл и некоторые фракции соматического экстракта); Написанова Л.А., Бережко В.К.. Шеховцов Н.В. (использовали в качестве антигена для dot-ELISA и ELISA фракционированный соматический экстракт и продукты метаболизма личинок трихинелл без определения молекулярной массы и степени иммуногенности используемых антигенов, подбирая экспериментальным путем удовлетворительные по специфичности и чувствительности фракции), Сапунов А.Я. (разработал внутрикожную аллергопробу на трихинеллез) (патент на изобретение №2210985 от 27.08.2003 г.) [1, 2, 4, 7, 8].
Недостатками прототипов ветеринарного направления являются: недостаточная чувствительность тестов в период острой фазы трихинеллеза, выявляющих иммунные комплексы только на 19-21 дни инвазии [1, 4], использование лиофилизированного дорогостоящего коммерческого антивидового конъюгата, содержащего иммуноглобулины только одного класса IgG. Отсутствие возможности сохранения контрольных сывороток и конъюгата ИФТС в активном состоянии без лиофильного высушивания на протяжении срока использования существенно увеличивало временные трудозатраты сотрудников на проведение анализа и удорожало стоимость каждой реакции. Разработчики иммуноферментной реакции ELISA для диагностики трихинеллеза свиней использовали в составе трехкомпонентной субстратной смеси вещество ортофенилендиамин (прототипы [1, 4]), что запрещено Министерством Здравоохранения РФ с 2004 г. ввиду канцерогенности данного реактива для персонала лабораторий.
Известны зарубежные исследования по созданию эффективных диагностических тест-систем на основе иммуноферментного анализа как для научных работ, так и для коммерческих целей. Авторы использовали моноклональные антитела, очищенные антигены строго определенной молекулярной массы и конъюгат к иммуноглобулинам одного класса -IgG [9-14].
Ценность изобретения состоит в использовании антивидовых поликлональных конъюгатов собственного приготовления, состоящих из иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе организма зараженного трихинеллезом животного, в применении высокоактивных и специфичных антигенов T.spiralis молекулярной массой 29-63 кД (предыдущий патент авторов №2005105086/13), что в итоге позволяет выявлять специфические иммунные комплексы на всех стадиях болезни, в том числе и в период острой фазы трихинеллеза, на 7-10 дни инвазии. Все параметры ИФТС разработаны с учетом свойств используемых антигенов, сорбированных на твердой фазе (полистироловых микропанелях отечественного производства), что позволяет при исследованиях сывороток крови различных видов плотоядных и всеядных животных использовать стандартный набор реагентов, комплектуя наборы соответствующим антивидовым конъюгатом. Данная инновация существенно расширяет ассортимент выпускаемых ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза животных и понижает их себестоимость.
Наша работа отличается тем, что:
1. Впервые для нужд ветеринарии РФ разработана технология производства коммерческой ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных.
2. В качестве антигенов для сенсибилизации твердой фазы (полистироловых микропанелей отечественного производства) применены высокоактивные и специфичные антигены T.spiralis молекулярной массой 29-63 кД (предыдущий патент авторов №2005105086/13),
3. В ИФТС используются поликлональные антивидовые конъюгаты собственного приготовления, состоящие из иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе организма зараженного трихинеллезом животного, что в итоге позволяет выявлять специфические иммунные комплексы на всех стадиях болезни, в том числе и в период острой фазы трихинеллеза, на 7-10 дни инвазии.
4. В состав ИФТС введены оригинальные составы реагентов и буферных растворов, что позволило снимать неспецифическое ковалентное и ионное связывание отечественного полистирола с иммуноглобулинами испытуемых сывороток крови плотоядных и всеядных животных, а также существенно снизило стоимость наборов за счет отказа от использования полистироловых микропанелей фирмы Costar, США.
5. Все реагенты представленной тест-системы выпускаются в жидком виде, сохраняют активность в пределах гарантийного срока использования, некоторые компоненты (например, хромогенный субстрат, ТМБ и пероксид водорода), объединены в одном растворе. Это упрощает проведение и сокращает время, затрачиваемое на иммуноферментный анализ.
6. Все параметры ИФТС разработаны с учетом свойств используемых антигенов, сорбированных на твердой фазе (полистироловых микропанелях - стрипах отечественного производства), что позволяет при исследованиях сывороток крови различных видов плотоядных и всеядных животных использовать стандартный набор реагентов, комплектуя наборы соответствующим антивидовым конъюгатом и контрольными сыворотками. Данная инновация существенно расширяет ассортимент выпускаемых ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза животных и понижает их себестоимость.
Способ прижизненной диагностики трихинеллеза у плотоядных (кошек, собак) и всеядных (свиней) животных включает следующие этапы:
1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.
2. Технологию производства компонентов ИФТС « ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип»
3. Рекомендации по применению ИФТС «ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип», примеры конкретного исполнения.
1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.
Пробы крови отбирают в стерильные сухие пробирки в объеме не менее 1,5-2 мл от каждого животного и помещают в термостат (37°С) на 1 час. Образовавшийся сгусток крови обводят стерильной металлической спицей или стеклянной палочкой и помещают в холодильник (+4°С) на 1-2 часа для отстаивания сыворотки. Пробы сывороток отбирают в пробирки типа «Эппендорф», маркируют и сохраняют в холодильнике при +4-8°С не более 3-х суток до проведения анализа. При наличии осадка эритроцитов сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут.
2. Технология производства компонентов ИФТС «ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип».
2.1. Изготовление специфических реагентов набора: антигена, антивидовых поликлональных конъюгатов, положительных и отрицательных контрольных сывороток плотоядных и всеядных животных.
2.1.1. Получение специфического антигена - иммуногенных петидов трихинелл молекулярной массой 63-29 - кД подробно изложено в предыдущем патенте авторов «Способ получения иммуногенного антигена Trishinella spiralis» (установлен приоритет от 25.02.2005).
Для наработки биомассы трихинелл проводили заражение лабораторных животных (белых крыс и кроликов) инвазионными личинками в дозе 10 лич./грамм живого веса. Через 50-60 дней проводили убой, отделяли мышечную ткань и переваривали ее в искусственном желудочном соке при температуре 38,5-39°С. Выделенных личинок многократно отмывали в физиологическом растворе с антибиотиками и помещали в ИПС ДМЕМ с глутамином. Инкубацию личинок проводили до 5 суток в термостате при температуре 38,5°С с ежедневным отбором экскреторно-секреторных продуктов. Оставшуюся биомассу личинок гомогенизировали, проводили 18-часовую экстракцию и использовали для получения второй белковой фракции при хроматографическом разделении на сефадексе G-100. Белковые продукты очищали центрифугированием при 20000 g, подвергали диализу и концентрировали ПЭГ 6000. Концентрацию белка измеряли по Лоури при длине волны 280 нм. Конечная концентрация белка в антигене T.spiralis составляла от 750 до 800 мкг/мл. Проведенные исследования показали, что полное насыщение твердой фазы (микропанелей из полистирола, производства ГОСНИИПОЛИМЕР, г.Москва) происходит при концентрации антигена трихинелл от 3,5 до 5 мкг/мл. Дальнейшее увеличение дозы антигена к существенному повышению оптической плотности продукта ИФР не приводит.
Для получения активной твердой фазы проводили сенсибилизацию в течение 18 часов при 4°С, по окончании удаляли содержимое лунок, после чего 3-5 раз промывали их 250 мкл ФСБ-Т.
2.1.2. Получение контрольных положительных и отрицательных сывороток крови плотоядных и всеядных животных.
Положительные контрольные сыворотки крови получали от иммунизированных полным соматическим экстрактом и экспериментально зараженных трихинеллезом животных. Динамику титров специфических антител определяли ИФМ, сыворотки отбирали по п.1, для увеличения срока хранения в них добавляли тиомерсал до 0,001% по объему. При комплектовании наборов ИФТС контрольную положительную сыворотку определенного вида животного разводили в соотношении 1:100 реагентом «Иммуностаб» производства ЗАО НВО «Иммунотех», г.Москва, при этом титр специфических антител в ИФА поддерживался на уровне не менее 1:800.
Отрицательные контрольные сыворотки получали от клинически здоровых животных, проверяли в ИФА, далее по п.1, 2.1.2. При отработке параметров ИФА отрицательную сыворотку исследовали в тех же разведениях, что и положительную, для сопоставления показателей оптической плотности, причем все сыворотки начинали титровать с разведения 1:100.
2.1.3. Получение поликлональных антивидовых конъюгатов.
Для получения общеглобулиновой фракции собирали сыворотки крови в количестве не менее 20-25 проб от животных одного вида различных половозрастных групп, свободных от гельминтов и инфекционных болезней. Аликвоты всех проб помещали в общую пробирку, смешивали на вортексе и постепенно добавляли пересыщенный раствор сульфата аммония до 50% концентрации. После инкубации при 4-6°С в течение 12 часов иммуноглобулины осаждали центрифугированием при 15 тыс./об/мин (40 минут). Антитела конъюгировали с модифицированным перийодатом натрия ферментом (пероксидазой хрена) по методу Wilson M.P., NakaneR.K., 1978.
Контроль активности и специфичности антивидового конъюгата определяли прямым твердофазным ИФА путем титрования на полистироловых микропанелях. Иммуноглобулины в предварительно подобранной концентрации (в 0,01М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5) сорбировали на твердой фазе в течение 18 часов при +4°С. Свободные участки пластика блокировали, внося по 200 мкл 0,05% инертного белка. Для титрования антивидового конъюгата готовили двукратные разведения на ФСБ начиная от 1:100 и до 1:25600, ИФА осуществляли по стандартной схеме. По изменению окраски проводили визуальный учет реакции, принимая за титр конъюгата его наибольшее разведение, дающее темно-желтое окрашивание в лунках. Специфичность полученного антивидового конъюгата определяли при испытании гетерологичных сывороток крови (т.е. принадлежавшим животным других видов) тем же способом. Каждая партия синтезированного антивидового конъюгата тестировалась на специфичность и активность, после чего определялось рабочее разведение этого реагента (для плотоядных - 1:6000, для свиней - 1:4000).
2.2. Приготовление неспецифических реагентов набора: фосфатно-солевого буфера, разводящих буферных растворов для сывороток и конъюгата., субстратного раствора на основе ТМБ, стоп-реагента.
2.2.1. Фосфатно-солевой буферный раствор (0,01М ФСБ-Т, рН 7,4) используется для приготовления отмывающей жидкости, а также как компонент разводящих растворов для сывороток и конъюгата. Состоит из калия фосфорнокислого однозамещенного (0,01 М), хлористого калия (0,01 М), калия фосфорнокислого двухзамещенного (0,15 М), хлористого натрия (0,18 М) и твин-20 (0,5%).
2.2.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБРС) представляет собой ФСБ, в котором увеличено содержание хлористого натрия до 0,36 М, и добавлены БСА (бычий сывороточный альбумин - 0,5%), твин-20 (до 1%) и тиомерсал натрия (0,005%).
2.2.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) имеет тот же состав, что и РБРС, (п.2.2.2.), но количество БСА увеличено до 1,5% и твин-20 до 1,5%. Повышенное содержание хлористого натрия, инертного белка (альбумина) и твин-20 блокирует неспецифическое связывание полистирола твердой фазы с антителами испытуемых сывороток.
2.2.4. Однокомпонентный готовый к использованию субстратный раствор на основе ТМБ (ТУ 9398-01/в-11361534-2004) представляет собой стабилизирующий буфер, содержащий 3,3'5,5'-тетраметилбензидин и пероксид водорода. Коммерческий препарат, выпускается ЗАО НВО «Иммунотех», г.Москва, предназначен для ИФА. В процессе реакции, катализируемой пероксидазой, происходит окисление ТМБ пероксидом водорода в продукт, имеющий синюю окраску, которая переходит в желтую при остановке ферментативной реакции добавлением стоп-реагента.
2.2.4. Останавливающий ферментативную реакцию раствор (стоп-реагент) - 0,5 М серная кислота, вносится в количестве 100 мкл в лунку. После добавления стоп-реагента в течение 15 минут проводили учет результатов реакции.
Результаты ИФА оценивали на спектрофотометре 340/АТС фирмы STL-Labsistems (Австрия) с автоматическим ридером и вертикальным лучом света при длине волны 450 нм (ОП 450).
В приложениях (№1, 2, 3,) «Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза (собак, кошек или свиней) в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта» подробно описана методика проведения исследования сывороток крови вышеуказанных видов животных для выявления специфических антител к T.spiralis.
Примеры конкретного исполнения:
Пример 1
В этом эксперименте проводили исследование диагностической эффективности ИФТС с сыворотками крови 96 свиней, включая положительный и отрицательный контроли.
Результаты представлены в таблице 1.
| № п/п | Сыворотки крови свиней: | Кол-во проб | Результаты ИФА | |||
| Положит. реакция | Отрицат. реакция | Чувствительность | Специфичность | |||
| 1. | Иммунизированных экстрактом и зараженных личинками трихинелл, в том числе положительный контроль. | 9 | 8 | 1 | 88,9,% | |
| 3. | Зараженных гетерологичными гельминтозами: | 12 | 6 | 9 | 81,6% | |
| эхинококкозом | 16 | 9 | 11 | |||
| аскариозом | 3 | - | 3 | |||
| цистицеркозом тениукольным эзофагостомозом | 2 | - | 2 | |||
| 4. | Клинически здоровых, агельминтозных (в том числе 2 отриц. контроля) | 52 | 1 | 46 | ||
Пример 2.
В данном эксперименте определяли диагностическую эффективность ИФТС с сыворотками крови 48 домашних кошек различных половозрастных групп, собранных в ветеринарных клиниках г.Москвы. В ветеринарные клиники владельцы этих кошек обращались по поводу различных заболеваний внутренних органов неинфекционной природы. В качестве положительных проб использовались сыворотки крови 6 кошек, содержащихся в виварии ВИГИС и иммунизированных антигеном трихинелл с последующим экспериментальным заражением трихинеллезом.
| Таблица 2 | ||||||
| № п/п | Сыворотки кошек | Кол-во проб | Результаты ИФА | |||
| Положит. реакция | Отрицат. реакция | Чувствительность | Специфичность | |||
| 1. | Иммунизированных антигеном или зараженных трихинеллезом | 6 | 6 | - | 100% | |
| 2. | Больных внутренними незаразными болезнями | 42 | 7 | 35 | 83,3% | |
Пример 3.
Диагностическую эффективность ИФТС определяли с 48 сыворотками крови собак, собранных в ветеринарных клиниках г.Москвы. Согласно анамнезу животные были клинически здоровы, дегельминтизированы или же страдали неинфекционными заболеваниями. В качестве положительных проб использовались сыворотки крови 2-х иммунизированных экскреторно-секреторными антигенами трихинелл собак и 3-х экспериментально зараженных T.spiralis собак, содержащихся в виварии Государственного Университета Республики Ингушетия, г.Назрань.
| № п/п | Сыворотки крови собак | Результаты ИФА | ||||
| Положит. реакция | Отрицат. реакция | Чувствительность | Специфичность | |||
| 1. | Иммунизированных антигенами или зараженных Т.spiralis | 5 | 5 | - | 100% | |
| 2. | Клинически здоровых или больных незаразными болезнями (в том числе 2 отриц. контроля) | 43 | 4 | 39 | 90,6% | |
Источники информации
1. Белозеров С.Н., Гуданавичюс Т.И. Реакция энзим-меченых антител для диагностики трихинеллеза // Ветеринария. - 1982. - 11. - С.41-44.
2. Васерин Ю.И. Иммунодиагностика трихинеллеза человека// Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл. - М. - 2000. - С.16-22.
3. Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И., Попов М.А. Особенности эпизоотологии и эпидемиологии трихинеллеза на Северном Кавказе, роль диких животных в поддержании синантропных очагов заболевания // Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл. - М. - 2000. - С.122-124.
4. Написанова Л.А. ELISA и dot-ELISA в динамике экспериментального трихинеллеза свиней // Материалы докладов к 7-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. - М. - 1996. - С.48-49.
5. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл // Мед. паразитология и паразитарные болезни. - 1986. - 3. - С.51-56.
6. Попов М.А., Васерин Ю.И., Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И Диагностика трихинеллеза на Северном Кавказе // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М. - 2002. - С.246-247.
7. Пшеничный А.А., Сапунов В.А. Новый и необычный источник заражения людей трихинеллезом в Краснодарском крае. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М. - 2002. - С.287-290.
8. Твердохлебова Т.И., Васерин Ю.И. Получение диагностикума трихинеллезного антигенного эритроцитарного сухого для РНГА и оценка его эффективности. // Мед. Паразитология и паразитарные болезни. - М. - 2005. - №2. - С.29-32.
9. Gamble H.R., Andersom W.R., Graham., Murrel K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using excretory-secretory antigen // Veterinary Parasitology. - 1983. - 13. - 349-361.
10. Gamble H.R., Murrell K.D., Marti Ph. Inoculation of pigs against T.spiralis using excretory-secretory antigens // Amer. J. Vet. Res. - 1986. - 47. - 11. - P.2396-23989.
11. Gamble H.R. Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay // J. of Food Protection. - 1995. - 58(3). - P.295-298.
12. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis // Veterinary Parasitoligy. - 1988. - 30. - P.131-134.
13. Gamble H.R., Wisnewski N., Wassom D. Detection of trichinellosis enzyme immunoassay using a synthetic glycan antigen // American Journal of Veterinary. - 1997. - 58. - P.417-421.
14. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Factors influencing the excretory-secretory antigens in the serodiagnosis of swine trichinellosis // Consejo Superior de Investigaciones Press Madrid Spain. - 1989. - P.202-209.
Приложение 1.
Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза свиней в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта
Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови к антигенам трихинелл.
Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов свиньи с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.
Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления не связавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов свиньи с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащем хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.
Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови свиней иммуноферментным методом.
- 2. Набор с увеличенным объемом компонентов расчитан на исследование 192 (96×2) проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы, и содержит следующие реагенты:
- 2.1. Иммуносорбент - 2 полистироловых 96-луночных разборных планшета с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.
- 2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови свиней, содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.
- 2.3. Отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови свиней, не содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.
- 2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов свиньи, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.
- 2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.
- 2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.
- 2.7. Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.
- 2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.
- 2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.
Иммунобиологические свойства.
Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам Т.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови свиней.
Назначение.
Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе для сероэпизоотлогического моноторинга регионов РФ на свиноводческих комплексах, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.
Меры безопасности.
Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.
Способ применения:
1. Приготовление реагентов для ИФА.
Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.
Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.
Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.
1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.
Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.
1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.
1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т
Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.
1.4. Подготовка контрольных сывороток.
Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.
1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.
В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствующее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.
1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.
1.7. Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.
Подготовка исследуемых сывороток.
Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови свиней как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше - 20°С, но подвергать замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.
Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0,9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.
3. Проведение ИФА.
Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.
3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончанию промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.
3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.
После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.
3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.
3.4. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.
3.5. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.
3.6. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.
Учет результатов.
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.
В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.
Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.
Шкала визуальной оценки реакции:
«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый.
«++» - положительная, цвет интесивно желтый.
«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.
«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.
Приложение 2.
Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза кошек в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта
Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови к антигенам трихинелл.
Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов кошек с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.
Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления несвязавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов кошки с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащим хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.
Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови кошек иммуноферментным методом.
2. Набор компонентов рассчитан на исследование 96 проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы, и содержит следующие реагенты:
2.1. Иммуносорбент - полистироловый 96-луночный разборный планшет с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.
2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови кошки, содержащая антитела к T.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.
2.3. Отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови кошки, не содержащая антитела к T.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.
2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов кошки, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.
2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.
2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.
2.7 Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.
2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.
2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.
Иммунобиологические свойства.
Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам T.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови кошек.
Назначение.
Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза кошек в ветеринарных клиниках методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.
Меры безопасности.
Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.
Способ применения:
1. Приготовление реагентов для ИФА.
Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.
Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.
Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.
1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.
Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.
1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.
1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т.
Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.
1.4. Подготовка контрольных сывороток.
Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.
1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.
В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствующее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.
1.7 Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.
Подготовка исследуемых сывороток.
Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови кошек как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше - 20°С, но подвергаться замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.
Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0.9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.
3. Проведение ИФА.
Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.
3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончании промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.
3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.
После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.
3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.
3.7. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.
3.8. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.
3.9. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.
Учет результатов.
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.
В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.
Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.
Шкала визуальной оценки реакции:
«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый.
«++» - положительная, цвет интесивно желтый.
«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.
«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.
Приложение 3.
Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза собак в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта
Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови у собак к антигенам трихинелл.
Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов собак с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.
Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген-антитело» на поверхности лунок. После удаления не связавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов собаки с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащим хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.
Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови собак иммуноферментным методом.
2. Набор компонентов рассчитан на исследование 96 проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы и содержит следующие реагенты:
2.1. Иммуносорбент - полистироловый 96-луночный разборные планшет с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.
2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови собаки, содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.
2.3. Отрицательный контрольный образец (К-)- сыворотка крови собаки, не содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.
2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов собаки, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.
2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.
2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.
2.7. Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.
2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.
2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.
Иммунобиологические свойства.
Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам Т.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови собак.
Назначение.
Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза собак в ветеринарных клиниках методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.
Меры безопасности.
Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.
Способ применения:
1. Приготовление реагентов для ИФА.
Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.
Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.
Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.
1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.
Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.
1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.
1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т
Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.
1.4. Подготовка контрольных сывороток.
Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.
1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.
В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствуюшее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.
1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.
1.7 Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.
Подготовка исследуемых сывороток
Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови кошек как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше -20°С, но подвергать замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.
Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0.9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.
3. Проведение ИФА.
Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.
3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончании промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.
3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.
После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.
3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.
3.10. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.
3.11. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.
3.12. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.
Учет результатов.
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.
В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.
Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.
Шкала визуальной оценки реакции:
«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый.
«++» - положительная, цвет интесивно желтый.
«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.
«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.
Claims (1)
- Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных путем выявления специфических антител в сыворотке крови зараженных животных в реакции иммуноферментного анализа, характеризующийся тем, что включает использование поликлональных антивидовых конъюгатов, иммуногенных пептидов Trichinella spiralis и контрольных сывороток исследуемого вида животных, при этом при сорбции на полистироле используют иммуногенные пептиды трихинелл молекулярной массой 63-29 кДа в концентрации 3,5-5 мкг/мл, в качестве поликлональных антивидовых конъюгатов используют антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, а также используют солевые буферные растворы, содержащие 0,005% тиомерсала натрия, 0,15М калия фосфорно-кислого двухзамещеннго, 0,01М калия фосфорно-кислого однозамещеннго, хлористого натрия 0,18М, 0,5% альбумина и 1,5% альбумина для конъюгатов, 1% твин-20 для нанесения сывороток и 1,5% твин-20 при использовании конъюгатов; хромогенный субстрат - 3,3′5,5′ тетраметилбензидин, для остановки реакции используют 0,5М серную кислоту, а полученный результат оценивают на спектрофотометре при длине волны 450 нм.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006129445/15A RU2339038C2 (ru) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006129445/15A RU2339038C2 (ru) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006129445A RU2006129445A (ru) | 2008-02-20 |
| RU2339038C2 true RU2339038C2 (ru) | 2008-11-20 |
Family
ID=39266926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006129445/15A RU2339038C2 (ru) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2339038C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2423700C2 (ru) * | 2009-04-10 | 2011-07-10 | Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза свиней |
| RU2589656C2 (ru) * | 2014-11-25 | 2016-07-10 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Способ математического прогнозирования тяжести течения трихиниллёза |
| RU2746448C2 (ru) * | 2017-12-20 | 2021-04-14 | Евроиммун Медицинише Лабордиагностика Аг | Способ обнаружения Trichinella |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2201591C2 (ru) * | 2001-02-20 | 2003-03-27 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина | Устройство для трихинеллоскопии в полевых условиях |
| RU2210985C2 (ru) * | 2000-04-10 | 2003-08-27 | Попов Михаил Алексеевич | Аллерген для прижизненной диагностики трихинеллеза у свиней |
| RU2005105086A (ru) * | 2005-02-25 | 2006-08-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скр бина (ВИГИС) (RU) | Способ получения иммуногенного антигена trichinella spiralis |
-
2006
- 2006-08-15 RU RU2006129445/15A patent/RU2339038C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2210985C2 (ru) * | 2000-04-10 | 2003-08-27 | Попов Михаил Алексеевич | Аллерген для прижизненной диагностики трихинеллеза у свиней |
| RU2201591C2 (ru) * | 2001-02-20 | 2003-03-27 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина | Устройство для трихинеллоскопии в полевых условиях |
| RU2005105086A (ru) * | 2005-02-25 | 2006-08-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скр бина (ВИГИС) (RU) | Способ получения иммуногенного антигена trichinella spiralis |
| RU2287342C1 (ru) * | 2005-02-25 | 2006-11-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОГО АНТИГЕНА Trichinella spiralis |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2423700C2 (ru) * | 2009-04-10 | 2011-07-10 | Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза свиней |
| RU2589656C2 (ru) * | 2014-11-25 | 2016-07-10 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Способ математического прогнозирования тяжести течения трихиниллёза |
| RU2746448C2 (ru) * | 2017-12-20 | 2021-04-14 | Евроиммун Медицинише Лабордиагностика Аг | Способ обнаружения Trichinella |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006129445A (ru) | 2008-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marrie et al. | Seroepidemiology of Q fever among domestic animals in Nova Scotia. | |
| Deplazes et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay for diagnostic detection of Taenia saginata copro-antigens in humans | |
| Sroka | Seroepidemiology of toxoplasmosis in the Lublin region | |
| Lightowlers et al. | Serological diagnosis of Echinococcus granulosus infection in sheep using cyst fluid antigen processed by antibody affinity chromatography | |
| CN101581726B (zh) | 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 | |
| BRPI0813681B1 (pt) | dispositivo e método para detectar a presença ou ausência de coproantígeno de nematelminto toxocara em uma amostra fecal de um mamífero, método para diagnosticar uma infecção intestinal por nematelminto toxocara em um mamífero, e kit para detecção de um ou mais coproantígenos de nematelmintos toxocara em uma amostra de um mamífero. | |
| Abuseir et al. | Evaluation of a serological method for the detection of Taenia saginata cysticercosis using serum and meat juice samples | |
| Chand et al. | Comparison of milk-ELISA and serum-ELISA for the diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep | |
| KR101510376B1 (ko) | 새우 알레르겐, 항새우 알레르겐 항체 및 그의 이용 | |
| Edrissian et al. | Application of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to identification of Anopheles mosquito bloodmeals | |
| US8048637B2 (en) | Diagnostic composition and method for the detection of a Trichinella infection | |
| RU2339038C2 (ru) | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных | |
| Niilo | Enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolated from intestinal contents of cattle, sheep and chickens | |
| Cooke et al. | The latest FAD–Faecal antibody detection in cattle. Protocol and results from three UK beef farms naturally infected with gastrointestinal nematodes | |
| EP3608672B1 (en) | Crude native hapten-based indirect elisa assay kit and lyophilised controls for the confirmatory diagnosis of bovine brucellosis in blood serum and milk by animal and tank | |
| CN102944682A (zh) | 蟹类抗体谱检测试剂盒 | |
| García-Vazquez et al. | A serological survey of Trypanosoma cruzi infection in dogs of two urban areas of Mexico | |
| JP5830771B2 (ja) | 寄生虫の検出方法、及び、キット | |
| RU2167673C1 (ru) | Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 кур | |
| RU2769578C1 (ru) | Способ получения флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума для выявления возбудителей риккетсиозов и коксиеллезов, флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум и его применение | |
| RU2287154C2 (ru) | Способ диагностики токсоплазмоза у собак и кошек | |
| KR20180006516A (ko) | Igm 반정량적 렙토스피라증 진단 키트 | |
| Williamson | Serological Characterisation of Spiroplasmas and Other Mycoplasmas | |
| Pathak et al. | In vitro Cultivation of Toxocara canis Larva for Extraction of Excretory-Secretory (TcES) Antigen | |
| RU2782463C1 (ru) | Способы, устройства, наборы и композиции для обнаружения ленточных червей |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080829 |