RU2339038C2 - Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores - Google Patents
Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores Download PDFInfo
- Publication number
- RU2339038C2 RU2339038C2 RU2006129445/15A RU2006129445A RU2339038C2 RU 2339038 C2 RU2339038 C2 RU 2339038C2 RU 2006129445/15 A RU2006129445/15 A RU 2006129445/15A RU 2006129445 A RU2006129445 A RU 2006129445A RU 2339038 C2 RU2339038 C2 RU 2339038C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- serum
- trichinosis
- conjugates
- antibodies
- conjugate
- Prior art date
Links
- 206010044608 Trichiniasis Diseases 0.000 title claims description 55
- 208000003982 trichinellosis Diseases 0.000 title claims description 55
- 201000007588 trichinosis Diseases 0.000 title claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 244000054334 omnivore Species 0.000 title claims description 11
- 235000020912 omnivore Nutrition 0.000 title claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 87
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 27
- 241000243777 Trichinella spiralis Species 0.000 claims abstract description 24
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 9
- -1 15M phosphate disubstituted potassium Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims abstract description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract 2
- 229940096911 trichinella spiralis Drugs 0.000 claims abstract 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 57
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 24
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 claims description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 5
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 abstract 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 abstract 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 241001439624 Trichina Species 0.000 abstract 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 53
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 43
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 29
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 21
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 16
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 16
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 15
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 15
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 12
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 11
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 6
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 6
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 5
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 108010022861 Trichinella excretory-secretory antigen Proteins 0.000 description 3
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 208000014837 parasitic helminthiasis infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 201000000077 Cysticercosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010014096 Echinococciasis Diseases 0.000 description 1
- 208000009366 Echinococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233756 Fabriciana elisa Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000009361 ascariasis Diseases 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical class [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000004441 taeniasis Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике опасного антропозооноза - трихинеллеза, и может быть использовано для прижизненной диагностики данного заболевания у плотоядных (кошек, собак) и всеядных животных (свиней).The invention relates to veterinary medicine, in particular to the immunodiagnosis of dangerous anthropozoonosis - trichinosis, and can be used for the intravital diagnosis of this disease in carnivores (cats, dogs) and omnivores (pigs).
Трихинеллез относится к числу распространенных и тяжело протекающих гельминтозов человека и животных. По характеру эпидемических вспышек, по массовости и внезапности трихинеллез напоминает многие инфекционные заболевания, а по злокачественности и смертности в случае интенсивного заражения не имеет себе равных [5].Trichinosis is one of the common and severely occurring helminthiases of humans and animals. By the nature of epidemic outbreaks, by mass and suddenness, trichinosis reminds many infectious diseases, and by malignancy and mortality in case of intensive infection it is unparalleled [5].
Трихинеллам свойственна высокая патогенность, хорошая выживаемость, большая плодовитость, широкий круг хозяев, прохождение цикла развития в одном организме в независимости от внешних факторов окружающей среды. Взаимная циркуляция возбудителя трихинеллеза между природными и синантропными очагами поддерживается определенными пищевыми связями: в результате поедания слабых зверей более сильными, а также через падаль. Из дикой природы через тушки отстрелянных на охоте хищников, а также грызунами, бродячими собаками, кошками, свиньями, трихинеллез переносится в населенные пункты, где и поддерживается среди домашних животных на протяжении многих лет [3, 6].Trichinella is characterized by high pathogenicity, good survival, great fertility, a wide range of hosts, the development cycle in one organism, regardless of external environmental factors. Mutual circulation of the causative agent of trichinosis between natural and synanthropic foci is supported by certain food connections: as a result of eating weak animals with stronger ones, as well as through carrion. From wildlife through the carcasses of hunted predators, as well as rodents, stray dogs, cats, pigs, trichinosis is transferred to settlements, where it has been supported among domestic animals for many years [3, 6].
Анализ эпизоотологической и эпидемической обстановки по трихинеллезу в Российской Федерации свидетельствует о все возрастающей роли диких промысловых животных в распространении этой инвазии и вспышках трихинеллеза среди населения [4, 7].An analysis of the epizootological and epidemic situation of trichinosis in the Russian Federation indicates the growing role of wild game animals in the spread of this invasion and outbreaks of trichinosis among the population [4, 7].
Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 случаев заболевания этим опасным гельминтозом людей, причем в 40% они носят групповой характер. В большинстве случаев данное заболевание было вызвано употреблением свинины. Способы кормления и содержания свиней в теплый период года на свободном выпасе, местные обычаи населения благоприятствуют очаговому распространению данной инвазии в синантропном очаге, в связи с чем в последние годы участились крупномасштабные вспышки трихинеллеза среди людей [5-7].Annually in the Russian Federation up to 700 cases of the disease with this dangerous helminthiasis of people are recorded, and in 40% they are of a group nature. In most cases, the disease was caused by eating pork. The methods of feeding and keeping pigs in the warm season on free pasture, local customs of the population favor the focal distribution of this invasion in the synanthropic focus, in connection with which, in recent years, large-scale outbreaks of trichinosis among people have become more frequent [5-7].
Своевременная диагностика, основанная только на клинической картине заболевания, не всегда объективна, хотя именно раннее обнаружение трихинеллеза позволяет назначить эффективное терапевтическое лечение. В связи с этим практическое здравоохранение и ветеринария остро нуждаются в иммунодиагностических тест-системах, позволяющих выявлять специфические антитела в крови инвазированных животных и людей. Разработка эффективной прижизненной диагностики трихинеллеза свиней является ведущим фактором обеспечения санитарного качества мясных продуктов, экономической рентабельности свиноводства, гарантией предупреждения вспышек трихинеллеза среди населения и, в конечном счете, способствует искоренению данного гельминтоза.Timely diagnosis, based only on the clinical picture of the disease, is not always objective, although it is the early detection of trichinosis that allows prescribing an effective therapeutic treatment. In this regard, practical health care and veterinary medicine are in urgent need of immunodiagnostic test systems that allow the detection of specific antibodies in the blood of invaded animals and humans. The development of an effective intravital diagnosis of pig trichinosis is a leading factor in ensuring the sanitary quality of meat products, the economic profitability of pig farming, guaranteeing the prevention of outbreaks of trichinosis among the population and, ultimately, contributes to the eradication of this helminthiasis.
Для прижизненной диагностики трихинеллеза домашних плотоядных животных (кошек, собак) коммерческие тест-системы не разработаны не только в РФ, но и в зарубежных странах. В связи с этим практическая ветеринарная медицина остро нуждается в эффективных иммунодиагностических тест-системах, позволяющих выявлять специфические антитела в сыворотке крови спонтанно инвазированных плотоядных и всеядных животных, особенно в синантропных очагах трихинеллеза. Прижизненная иммунологическая диагностика тканевого гельминтоза - трихинеллеза - позволит сохранить жизнь многим кошкам и собакам, обитающим при свиноводческих фермах, поскольку в случае вспышки трихинеллеза в первую очередь уничтожению подлежали все плотоядные животные данного хозяйства.For the intravital diagnosis of trichinosis of domestic carnivores (cats, dogs), commercial test systems have not been developed not only in the Russian Federation, but also in foreign countries. In this regard, practical veterinary medicine urgently needs effective immunodiagnostic test systems to detect specific antibodies in the blood serum of spontaneously infested carnivores and omnivores, especially in synanthropic foci of trichinosis. The intravital immunological diagnosis of tissue helminthiasis - trichinosis - will save the lives of many cats and dogs that live in pig farms, since in the event of an outbreak of trichinosis, all carnivores of this economy were primarily destroyed.
Цель изобретения состоит в создании технологии производства диагностически эффективной коммерческой тест-системы (ИФТС) на основе иммуноферментного метода для определения специфических антител в сыворотке крови у зараженных трихинеллезом плотоядных(кошек, собак) и всеядных (свиней) животных к антигенам Т.spiralis на всех стадиях развития инвазии, включая раннюю (острую фазу).The purpose of the invention is to create a technology for the production of a diagnostically effective commercial test system (IFTS) based on an enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of specific antibodies in the blood serum of carnivores (cats, dogs) and omnivores (pigs) infected with trichinosis against T.spiralis antigens at all stages the development of invasion, including early (acute phase).
Сущность изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективного способа прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных на основе коммерческой иммуноферментной тест-системы «ИФА-ВИГИС-БИОТЕХ- T.spiralis-стрип».The essence of the invention is the development and implementation in veterinary practice of an effective method for the intravital diagnosis of trichinosis of carnivores and omnivores based on the commercial ELISA test system "IFA-VIGIS-BIOTECH-T.spiralis-strip".
Наиболее близким прототипом предложенной инновации можно считать эффективные отечественные коммерческие тест-системы для иммунологической диагностики трихинеллеза у человека: иммуноферментная (производства ЗАО «Вектор-Бест, г. Новосибирск) и на основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), производства Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (5,8).The closest prototype of the proposed innovation can be considered effective domestic commercial test systems for the immunological diagnosis of trichinosis in humans: enzyme-linked immunosorbent (produced by Vector-Best CJSC, Novosibirsk) and based on the indirect hemagglutination reaction (RNGA), produced by the Rostov Scientific Research Institute of Microbiology and Parasitology ( 5.8).
Иммунологической диагностикой трихинеллеза свиней в РФ занимались Белозеров С.Н. (испытал реакцию непрямой иммунофлуоресценции РНИФ и ИФР, используя в качестве антигена лиофилизированных личинок трихинелл и некоторые фракции соматического экстракта); Написанова Л.А., Бережко В.К.. Шеховцов Н.В. (использовали в качестве антигена для dot-ELISA и ELISA фракционированный соматический экстракт и продукты метаболизма личинок трихинелл без определения молекулярной массы и степени иммуногенности используемых антигенов, подбирая экспериментальным путем удовлетворительные по специфичности и чувствительности фракции), Сапунов А.Я. (разработал внутрикожную аллергопробу на трихинеллез) (патент на изобретение №2210985 от 27.08.2003 г.) [1, 2, 4, 7, 8].The immunological diagnosis of pig trichinosis in the Russian Federation was carried out by SN Belozerov (tested the indirect immunofluorescence reaction of RNIF and IGF, using lyophilized larvae of Trichinella and some fractions of the somatic extract as antigen); Written by L.A., Berezhko V.K. Shekhovtsov N.V. (we used fractionated somatic extract and metabolic products of Trichinella larvae as the antigen for dot-ELISA and ELISA without determining the molecular weight and degree of immunogenicity of the antigens used, choosing experimentally satisfactory fractions for specificity and sensitivity), A.Ya. Sapunov. (developed an intradermal allergy test for trichinosis) (patent for invention No. 2210985 dated 08/27/2003) [1, 2, 4, 7, 8].
Недостатками прототипов ветеринарного направления являются: недостаточная чувствительность тестов в период острой фазы трихинеллеза, выявляющих иммунные комплексы только на 19-21 дни инвазии [1, 4], использование лиофилизированного дорогостоящего коммерческого антивидового конъюгата, содержащего иммуноглобулины только одного класса IgG. Отсутствие возможности сохранения контрольных сывороток и конъюгата ИФТС в активном состоянии без лиофильного высушивания на протяжении срока использования существенно увеличивало временные трудозатраты сотрудников на проведение анализа и удорожало стоимость каждой реакции. Разработчики иммуноферментной реакции ELISA для диагностики трихинеллеза свиней использовали в составе трехкомпонентной субстратной смеси вещество ортофенилендиамин (прототипы [1, 4]), что запрещено Министерством Здравоохранения РФ с 2004 г. ввиду канцерогенности данного реактива для персонала лабораторий.The disadvantages of prototypes of the veterinary direction are: insufficient sensitivity of the tests during the acute phase of trichinosis, detecting immune complexes only for 19-21 days of invasion [1, 4], the use of a lyophilized expensive commercial antispecies conjugate containing immunoglobulins of only one IgG class. The inability to maintain the control serum and IFTS conjugate in an active state without freeze drying over the period of use significantly increased the time required for employees to conduct the analysis and increased the cost of each reaction. For the diagnosis of pig trichinosis, the developers of the ELISA enzyme-linked immunosorbent assay used the substance orthophenylenediamine (prototypes [1, 4]) as part of a three-component substrate mixture, which has been prohibited by the Ministry of Health of the Russian Federation since 2004 due to the carcinogenicity of this reagent for laboratory personnel.
Известны зарубежные исследования по созданию эффективных диагностических тест-систем на основе иммуноферментного анализа как для научных работ, так и для коммерческих целей. Авторы использовали моноклональные антитела, очищенные антигены строго определенной молекулярной массы и конъюгат к иммуноглобулинам одного класса -IgG [9-14].Foreign studies are known to create effective diagnostic test systems based on enzyme-linked immunosorbent assay for both scientific research and commercial purposes. The authors used monoclonal antibodies, purified antigens of a strictly defined molecular weight and a conjugate to immunoglobulins of the same IgG class [9-14].
Ценность изобретения состоит в использовании антивидовых поликлональных конъюгатов собственного приготовления, состоящих из иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе организма зараженного трихинеллезом животного, в применении высокоактивных и специфичных антигенов T.spiralis молекулярной массой 29-63 кД (предыдущий патент авторов №2005105086/13), что в итоге позволяет выявлять специфические иммунные комплексы на всех стадиях болезни, в том числе и в период острой фазы трихинеллеза, на 7-10 дни инвазии. Все параметры ИФТС разработаны с учетом свойств используемых антигенов, сорбированных на твердой фазе (полистироловых микропанелях отечественного производства), что позволяет при исследованиях сывороток крови различных видов плотоядных и всеядных животных использовать стандартный набор реагентов, комплектуя наборы соответствующим антивидовым конъюгатом. Данная инновация существенно расширяет ассортимент выпускаемых ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза животных и понижает их себестоимость.The value of the invention lies in the use of self-made antispecies polyclonal conjugates consisting of immunoglobulins of various classes involved in the immune response of an animal infected with trichinosis, in the use of highly active and specific T.spiralis antigens with a molecular weight of 29-63 kD (previous authors patent No. 2005105086/13) that ultimately allows you to identify specific immune complexes at all stages of the disease, including during the acute phase of trichinosis, for 7-10 days of invasion. All IFTS parameters were developed taking into account the properties of the used antigens adsorbed on the solid phase (polystyrene micropanels of domestic production), which allows the use of a standard set of reagents when studying the blood serum of various species of carnivores and omnivores, completing the sets with the appropriate antivid conjugate. This innovation significantly expands the range of manufactured IFTS for the intravital diagnosis of trichinosis of animals and reduces their cost.
Наша работа отличается тем, что:Our work is characterized in that:
1. Впервые для нужд ветеринарии РФ разработана технология производства коммерческой ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных.1. For the first time for the needs of the Russian Federation veterinary medicine, a technology has been developed for the production of commercial IFTS for the intravital diagnosis of trichinosis of carnivores and omnivores.
2. В качестве антигенов для сенсибилизации твердой фазы (полистироловых микропанелей отечественного производства) применены высокоактивные и специфичные антигены T.spiralis молекулярной массой 29-63 кД (предыдущий патент авторов №2005105086/13),2. As antigens for sensitization of the solid phase (polystyrene micropanels of domestic production), highly active and specific T.spiralis antigens with a molecular weight of 29-63 kD were used (previous authors patent No. 2005105086/13),
3. В ИФТС используются поликлональные антивидовые конъюгаты собственного приготовления, состоящие из иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе организма зараженного трихинеллезом животного, что в итоге позволяет выявлять специфические иммунные комплексы на всех стадиях болезни, в том числе и в период острой фазы трихинеллеза, на 7-10 дни инвазии.3. IFTS uses home-made polyclonal antispecies conjugates consisting of immunoglobulins of various classes involved in the immune response of an animal infected with trichinosis, which ultimately allows the identification of specific immune complexes at all stages of the disease, including during the acute phase of trichinosis, 7-10 days of invasion.
4. В состав ИФТС введены оригинальные составы реагентов и буферных растворов, что позволило снимать неспецифическое ковалентное и ионное связывание отечественного полистирола с иммуноглобулинами испытуемых сывороток крови плотоядных и всеядных животных, а также существенно снизило стоимость наборов за счет отказа от использования полистироловых микропанелей фирмы Costar, США.4. The original compositions of reagents and buffer solutions were introduced into IFTS, which made it possible to remove nonspecific covalent and ionic binding of domestic polystyrene with immunoglobulins of the tested blood serum of carnivorous and omnivorous animals, and also significantly reduced the cost of sets due to the rejection of the use of Costar polystyrene micropanels, USA .
5. Все реагенты представленной тест-системы выпускаются в жидком виде, сохраняют активность в пределах гарантийного срока использования, некоторые компоненты (например, хромогенный субстрат, ТМБ и пероксид водорода), объединены в одном растворе. Это упрощает проведение и сокращает время, затрачиваемое на иммуноферментный анализ.5. All reagents of the presented test system are available in liquid form, remain active within the warranty period of use, some components (for example, chromogenic substrate, TMB and hydrogen peroxide) are combined in one solution. This simplifies the conduct and reduces the time spent on enzyme-linked immunosorbent assay.
6. Все параметры ИФТС разработаны с учетом свойств используемых антигенов, сорбированных на твердой фазе (полистироловых микропанелях - стрипах отечественного производства), что позволяет при исследованиях сывороток крови различных видов плотоядных и всеядных животных использовать стандартный набор реагентов, комплектуя наборы соответствующим антивидовым конъюгатом и контрольными сыворотками. Данная инновация существенно расширяет ассортимент выпускаемых ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза животных и понижает их себестоимость.6. All IFTS parameters are designed taking into account the properties of the used antigens adsorbed on the solid phase (polystyrene micropanels - domestic-made strips), which allows the use of a standard set of reagents in studies of blood serum of various species of carnivores and omnivores, completing the sets with the appropriate antivid conjugate and control sera . This innovation significantly expands the range of manufactured IFTS for the intravital diagnosis of trichinosis of animals and reduces their cost.
Способ прижизненной диагностики трихинеллеза у плотоядных (кошек, собак) и всеядных (свиней) животных включает следующие этапы:The method for the intravital diagnosis of trichinosis in carnivorous (cats, dogs) and omnivorous (pigs) animals includes the following steps:
1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.1. Taking blood from animals, obtaining and maintaining diagnostic sera.
2. Технологию производства компонентов ИФТС « ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип»2. The production technology of components IFTS "VIGIS-BIOTECH-T.spiralis-strip"
3. Рекомендации по применению ИФТС «ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип», примеры конкретного исполнения.3. Recommendations for the use of IFTS “VIGIS-BIOTECH-T.spiralis-strip”, examples of specific performance.
1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.1. Taking blood from animals, obtaining and maintaining diagnostic sera.
Пробы крови отбирают в стерильные сухие пробирки в объеме не менее 1,5-2 мл от каждого животного и помещают в термостат (37°С) на 1 час. Образовавшийся сгусток крови обводят стерильной металлической спицей или стеклянной палочкой и помещают в холодильник (+4°С) на 1-2 часа для отстаивания сыворотки. Пробы сывороток отбирают в пробирки типа «Эппендорф», маркируют и сохраняют в холодильнике при +4-8°С не более 3-х суток до проведения анализа. При наличии осадка эритроцитов сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут.Blood samples are taken in sterile dry tubes in a volume of at least 1.5-2 ml from each animal and placed in a thermostat (37 ° C) for 1 hour. The resulting blood clot is circled with a sterile metal needle or a glass rod and placed in a refrigerator (+ 4 ° C) for 1-2 hours to settle the serum. Serum samples are taken in test tubes of the Eppendorf type, labeled and stored in the refrigerator at + 4-8 ° C for no more than 3 days before analysis. In the presence of a erythrocyte sediment, the serum is centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes.
2. Технология производства компонентов ИФТС «ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип».2. Technology for the production of components IFTS "VIGIS-BIOTECH-T.spiralis-strip".
2.1. Изготовление специфических реагентов набора: антигена, антивидовых поликлональных конъюгатов, положительных и отрицательных контрольных сывороток плотоядных и всеядных животных.2.1. Production of specific kit reagents: antigen, antispecific polyclonal conjugates, positive and negative control sera of carnivores and omnivores.
2.1.1. Получение специфического антигена - иммуногенных петидов трихинелл молекулярной массой 63-29 - кД подробно изложено в предыдущем патенте авторов «Способ получения иммуногенного антигена Trishinella spiralis» (установлен приоритет от 25.02.2005).2.1.1. Obtaining a specific antigen - immunogenic trichinella petids with a molecular weight of 63-29 - KD is described in detail in the previous patent of the authors "Method for the production of Trishinella spiralis immunogenic antigen" (priority established on February 25, 2005).
Для наработки биомассы трихинелл проводили заражение лабораторных животных (белых крыс и кроликов) инвазионными личинками в дозе 10 лич./грамм живого веса. Через 50-60 дней проводили убой, отделяли мышечную ткань и переваривали ее в искусственном желудочном соке при температуре 38,5-39°С. Выделенных личинок многократно отмывали в физиологическом растворе с антибиотиками и помещали в ИПС ДМЕМ с глутамином. Инкубацию личинок проводили до 5 суток в термостате при температуре 38,5°С с ежедневным отбором экскреторно-секреторных продуктов. Оставшуюся биомассу личинок гомогенизировали, проводили 18-часовую экстракцию и использовали для получения второй белковой фракции при хроматографическом разделении на сефадексе G-100. Белковые продукты очищали центрифугированием при 20000 g, подвергали диализу и концентрировали ПЭГ 6000. Концентрацию белка измеряли по Лоури при длине волны 280 нм. Конечная концентрация белка в антигене T.spiralis составляла от 750 до 800 мкг/мл. Проведенные исследования показали, что полное насыщение твердой фазы (микропанелей из полистирола, производства ГОСНИИПОЛИМЕР, г.Москва) происходит при концентрации антигена трихинелл от 3,5 до 5 мкг/мл. Дальнейшее увеличение дозы антигена к существенному повышению оптической плотности продукта ИФР не приводит.To produce Trichinella biomass, laboratory animals (white rats and rabbits) were infected with invasive larvae at a dose of 10 individuals / gram live weight. After 50-60 days, slaughter was performed, muscle tissue was separated and digested in artificial gastric juice at a temperature of 38.5-39 ° C. The isolated larvae were repeatedly washed in physiological saline with antibiotics and placed in IPA DMEM with glutamine. Larvae were incubated for up to 5 days in an incubator at a temperature of 38.5 ° С with daily selection of excretory-secretory products. The remaining biomass of larvae was homogenized, an 18-hour extraction was performed and used to obtain a second protein fraction by chromatographic separation on Sephadex G-100. Protein products were purified by centrifugation at 20,000 g, dialyzed and concentrated with PEG 6000. The protein concentration was measured by Lowry at a wavelength of 280 nm. The final protein concentration in T.spiralis antigen ranged from 750 to 800 μg / ml. Studies have shown that complete saturation of the solid phase (polystyrene micropanels manufactured by GOSNIIPOLIMER, Moscow) occurs at a Trichinella antigen concentration of 3.5 to 5 μg / ml. A further increase in the dose of antigen does not significantly increase the optical density of the IGF product.
Для получения активной твердой фазы проводили сенсибилизацию в течение 18 часов при 4°С, по окончании удаляли содержимое лунок, после чего 3-5 раз промывали их 250 мкл ФСБ-Т.To obtain an active solid phase, sensitization was carried out for 18 hours at 4 ° C, at the end the contents of the wells were removed, and then they were washed 3-5 times with 250 μl of FSB-T.
2.1.2. Получение контрольных положительных и отрицательных сывороток крови плотоядных и всеядных животных.2.1.2. Obtaining control positive and negative sera of carnivores and omnivores.
Положительные контрольные сыворотки крови получали от иммунизированных полным соматическим экстрактом и экспериментально зараженных трихинеллезом животных. Динамику титров специфических антител определяли ИФМ, сыворотки отбирали по п.1, для увеличения срока хранения в них добавляли тиомерсал до 0,001% по объему. При комплектовании наборов ИФТС контрольную положительную сыворотку определенного вида животного разводили в соотношении 1:100 реагентом «Иммуностаб» производства ЗАО НВО «Иммунотех», г.Москва, при этом титр специфических антител в ИФА поддерживался на уровне не менее 1:800.Positive control blood serum was obtained from animals immunized with a complete somatic extract and experimentally infected with trichinosis. The dynamics of titers of specific antibodies was determined by IFM, sera were selected according to claim 1, to increase the shelf life, thiomersal was added to them up to 0.001% by volume. When completing IFTS kits, the control positive serum of a certain type of animal was bred in a ratio of 1: 100 with Immunostab reagent manufactured by NVO Immunoteh CJSC, Moscow, while the titer of specific antibodies in ELISA was maintained at a level of at least 1: 800.
Отрицательные контрольные сыворотки получали от клинически здоровых животных, проверяли в ИФА, далее по п.1, 2.1.2. При отработке параметров ИФА отрицательную сыворотку исследовали в тех же разведениях, что и положительную, для сопоставления показателей оптической плотности, причем все сыворотки начинали титровать с разведения 1:100.Negative control sera were obtained from clinically healthy animals, tested in ELISA, then according to claim 1, 2.1.2. When testing the ELISA parameters, negative serum was examined in the same dilutions as positive to compare the optical density, and all serums began to titrate with a dilution of 1: 100.
2.1.3. Получение поликлональных антивидовых конъюгатов.2.1.3. Obtaining polyclonal antispecific conjugates.
Для получения общеглобулиновой фракции собирали сыворотки крови в количестве не менее 20-25 проб от животных одного вида различных половозрастных групп, свободных от гельминтов и инфекционных болезней. Аликвоты всех проб помещали в общую пробирку, смешивали на вортексе и постепенно добавляли пересыщенный раствор сульфата аммония до 50% концентрации. После инкубации при 4-6°С в течение 12 часов иммуноглобулины осаждали центрифугированием при 15 тыс./об/мин (40 минут). Антитела конъюгировали с модифицированным перийодатом натрия ферментом (пероксидазой хрена) по методу Wilson M.P., NakaneR.K., 1978.To obtain a common globulin fraction, blood serum was collected in an amount of at least 20-25 samples from animals of the same species of various sex and age groups, free from helminths and infectious diseases. Aliquots of all samples were placed in a common tube, mixed on a vortex and a supersaturated solution of ammonium sulfate was gradually added to a concentration of 50%. After incubation at 4-6 ° C for 12 hours, immunoglobulins were precipitated by centrifugation at 15 thousand / rpm (40 minutes). Antibodies were conjugated to a modified sodium periodate enzyme (horseradish peroxidase) according to the method of Wilson M.P., NakaneR.K., 1978.
Контроль активности и специфичности антивидового конъюгата определяли прямым твердофазным ИФА путем титрования на полистироловых микропанелях. Иммуноглобулины в предварительно подобранной концентрации (в 0,01М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5) сорбировали на твердой фазе в течение 18 часов при +4°С. Свободные участки пластика блокировали, внося по 200 мкл 0,05% инертного белка. Для титрования антивидового конъюгата готовили двукратные разведения на ФСБ начиная от 1:100 и до 1:25600, ИФА осуществляли по стандартной схеме. По изменению окраски проводили визуальный учет реакции, принимая за титр конъюгата его наибольшее разведение, дающее темно-желтое окрашивание в лунках. Специфичность полученного антивидового конъюгата определяли при испытании гетерологичных сывороток крови (т.е. принадлежавшим животным других видов) тем же способом. Каждая партия синтезированного антивидового конъюгата тестировалась на специфичность и активность, после чего определялось рабочее разведение этого реагента (для плотоядных - 1:6000, для свиней - 1:4000).Control of the activity and specificity of the antispecific conjugate was determined by direct solid-phase ELISA by titration on polystyrene micropanels. Immunoglobulins in a pre-selected concentration (in 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.5) were sorbed on the solid phase for 18 hours at + 4 ° C. Free areas of the plastic were blocked, introducing 200 μl of 0.05% inert protein. For titration of the antispecific conjugate, double dilutions were prepared on FSB from 1: 100 to 1: 25600, ELISA was carried out according to the standard scheme. A color change was used to visually record the reaction, taking the highest dilution as the conjugate titer, giving a dark yellow color in the wells. The specificity of the obtained anti-species conjugate was determined by testing heterologous blood sera (i.e. belonging to animals of other species) in the same way. Each batch of synthesized anti-species conjugate was tested for specificity and activity, after which the working dilution of this reagent was determined (for carnivores - 1: 6000, for pigs - 1: 4000).
2.2. Приготовление неспецифических реагентов набора: фосфатно-солевого буфера, разводящих буферных растворов для сывороток и конъюгата., субстратного раствора на основе ТМБ, стоп-реагента.2.2. Preparation of nonspecific kit reagents: phosphate-saline buffer, diluting buffer solutions for serum and conjugate., TMB-based substrate solution, stop reagent.
2.2.1. Фосфатно-солевой буферный раствор (0,01М ФСБ-Т, рН 7,4) используется для приготовления отмывающей жидкости, а также как компонент разводящих растворов для сывороток и конъюгата. Состоит из калия фосфорнокислого однозамещенного (0,01 М), хлористого калия (0,01 М), калия фосфорнокислого двухзамещенного (0,15 М), хлористого натрия (0,18 М) и твин-20 (0,5%).2.2.1. Phosphate-saline buffer solution (0.01 M FSB-T, pH 7.4) is used to prepare washing liquid, as well as a component of diluting solutions for serum and conjugate. It consists of potassium phosphate monosubstituted (0.01 M), potassium chloride (0.01 M), potassium phosphate disubstituted (0.15 M), sodium chloride (0.18 M) and tween-20 (0.5%).
2.2.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБРС) представляет собой ФСБ, в котором увеличено содержание хлористого натрия до 0,36 М, и добавлены БСА (бычий сывороточный альбумин - 0,5%), твин-20 (до 1%) и тиомерсал натрия (0,005%).2.2.2. The dilution buffer solution for serum titration (RBS) is an FSB in which the sodium chloride content is increased to 0.36 M, and BSA (bovine serum albumin - 0.5%), tween-20 (up to 1%) and sodium thiomersal are added. (0.005%).
2.2.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) имеет тот же состав, что и РБРС, (п.2.2.2.), но количество БСА увеличено до 1,5% и твин-20 до 1,5%. Повышенное содержание хлористого натрия, инертного белка (альбумина) и твин-20 блокирует неспецифическое связывание полистирола твердой фазы с антителами испытуемых сывороток.2.2.3. The conjugate dilution solution (RRB) has the same composition as the RBS, (clause 2.2.2.), But the amount of BSA is increased to 1.5% and tween-20 to 1.5%. The increased content of sodium chloride, inert protein (albumin) and tween-20 blocks the non-specific binding of solid phase polystyrene to the antibodies of the test sera.
2.2.4. Однокомпонентный готовый к использованию субстратный раствор на основе ТМБ (ТУ 9398-01/в-11361534-2004) представляет собой стабилизирующий буфер, содержащий 3,3'5,5'-тетраметилбензидин и пероксид водорода. Коммерческий препарат, выпускается ЗАО НВО «Иммунотех», г.Москва, предназначен для ИФА. В процессе реакции, катализируемой пероксидазой, происходит окисление ТМБ пероксидом водорода в продукт, имеющий синюю окраску, которая переходит в желтую при остановке ферментативной реакции добавлением стоп-реагента.2.2.4. The one-component ready-to-use substrate solution based on TMB (TU 9398-01 / B-11361534-2004) is a stabilizing buffer containing 3.3'5.5'-tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide. Commercial preparation, manufactured by CJSC NVO "Immunotech", Moscow, is intended for ELISA. In the reaction catalyzed by peroxidase, TMB is oxidized by hydrogen peroxide to a product with a blue color, which turns yellow when the enzymatic reaction is stopped by the addition of a stop reagent.
2.2.4. Останавливающий ферментативную реакцию раствор (стоп-реагент) - 0,5 М серная кислота, вносится в количестве 100 мкл в лунку. После добавления стоп-реагента в течение 15 минут проводили учет результатов реакции.2.2.4. The solution stopping the enzymatic reaction (stop reagent) - 0.5 M sulfuric acid, is added in an amount of 100 μl per well. After adding a stop reagent for 15 minutes, the results of the reaction were recorded.
Результаты ИФА оценивали на спектрофотометре 340/АТС фирмы STL-Labsistems (Австрия) с автоматическим ридером и вертикальным лучом света при длине волны 450 нм (ОП 450).ELISA results were evaluated on a 340 / ATS spectrophotometer (STL-Labsistems, Austria) with an automatic reader and a vertical light beam at a wavelength of 450 nm (OD 450).
В приложениях (№1, 2, 3,) «Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза (собак, кошек или свиней) в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта» подробно описана методика проведения исследования сывороток крови вышеуказанных видов животных для выявления специфических антител к T.spiralis.In the appendices (No. 1, 2, 3,) “Temporary instruction on the use of a set of components for the diagnosis of trichinosis (dogs, cats or pigs) in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the order of production experience” describes in detail the methodology for the study of blood serum of the above species to detect specific antibodies to T.spiralis.
Примеры конкретного исполнения:Examples of specific performance:
Пример 1Example 1
В этом эксперименте проводили исследование диагностической эффективности ИФТС с сыворотками крови 96 свиней, включая положительный и отрицательный контроли.In this experiment, a study was made of the diagnostic effectiveness of IFTS with blood serum of 96 pigs, including positive and negative controls.
Результаты представлены в таблице 1.The results are presented in table 1.
Пример 2.Example 2
В данном эксперименте определяли диагностическую эффективность ИФТС с сыворотками крови 48 домашних кошек различных половозрастных групп, собранных в ветеринарных клиниках г.Москвы. В ветеринарные клиники владельцы этих кошек обращались по поводу различных заболеваний внутренних органов неинфекционной природы. В качестве положительных проб использовались сыворотки крови 6 кошек, содержащихся в виварии ВИГИС и иммунизированных антигеном трихинелл с последующим экспериментальным заражением трихинеллезом.In this experiment, the diagnostic efficacy of IFTS with blood serums of 48 domestic cats of various age and sex groups collected in veterinary clinics in Moscow was determined. The owners of these cats have applied to veterinary clinics for various diseases of internal organs of non-infectious nature. As a positive test, we used the blood serum of 6 cats contained in the VIGIS vivarium and immunized with Trichinella antigen, followed by experimental infection with Trichinosis.
Пример 3.Example 3
Диагностическую эффективность ИФТС определяли с 48 сыворотками крови собак, собранных в ветеринарных клиниках г.Москвы. Согласно анамнезу животные были клинически здоровы, дегельминтизированы или же страдали неинфекционными заболеваниями. В качестве положительных проб использовались сыворотки крови 2-х иммунизированных экскреторно-секреторными антигенами трихинелл собак и 3-х экспериментально зараженных T.spiralis собак, содержащихся в виварии Государственного Университета Республики Ингушетия, г.Назрань.The diagnostic efficacy of IFTS was determined with 48 blood serum of dogs collected in veterinary clinics in Moscow. According to the anamnesis, the animals were clinically healthy, deworming, or suffered from noncommunicable diseases. Blood samples of 2 dogs Trichinella immunized with excretory-secretory antigens and 3 experimentally infected T.spiralis dogs contained in the vivarium of the State University of the Republic of Ingushetia, Nazran were used as positive samples.
Источники информацииInformation sources
1. Белозеров С.Н., Гуданавичюс Т.И. Реакция энзим-меченых антител для диагностики трихинеллеза // Ветеринария. - 1982. - 11. - С.41-44.1. Belozerov S.N., Gudanavichyus T.I. The reaction of enzyme-labeled antibodies for the diagnosis of trichinosis // Veterinary medicine. - 1982. - 11. - P.41-44.
2. Васерин Ю.И. Иммунодиагностика трихинеллеза человека// Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл. - М. - 2000. - С.16-22.2. Vaserin Yu.I. Immunodiagnostics of human trichinosis // Eighth All-Russian. conf. on trichinosis. Thes. Doc. - M. - 2000. - P.16-22.
3. Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И., Попов М.А. Особенности эпизоотологии и эпидемиологии трихинеллеза на Северном Кавказе, роль диких животных в поддержании синантропных очагов заболевания // Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл. - М. - 2000. - С.122-124.3. Nagorny S. A., Tverdokhlebova T. I., Popov M. A. Features of the epizootology and epidemiology of trichinosis in the North Caucasus, the role of wild animals in maintaining synanthropic foci of the disease // Eighth All-Russia. conf. on trichinosis. Thes. Doc. - M. - 2000. - P.122-124.
4. Написанова Л.А. ELISA и dot-ELISA в динамике экспериментального трихинеллеза свиней // Материалы докладов к 7-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. - М. - 1996. - С.48-49.4. Written by L. A. ELISA and dot-ELISA in the dynamics of experimental pig trichinosis // Materials of reports to the 7th scientific conference on the problem of trichinosis of humans and animals. - M. - 1996. - P.48-49.
5. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл // Мед. паразитология и паразитарные болезни. - 1986. - 3. - С.51-56.5. Poletaeva OG, Krasovskaya NN, Glagoleva V.A. Characterization of an enzyme immunoassay system with Trichinella antigens // Honey. parasitology and parasitic diseases. - 1986. - 3. - P.51-56.
6. Попов М.А., Васерин Ю.И., Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И Диагностика трихинеллеза на Северном Кавказе // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М. - 2002. - С.246-247.6. Popov MA, Vaserin Yu.I., Nagorny SA, Tverdokhlebova T.I. Diagnosis of trichinosis in the North Caucasus // Theory and practice of controlling parasitic diseases. - M. - 2002. - P.246-247.
7. Пшеничный А.А., Сапунов В.А. Новый и необычный источник заражения людей трихинеллезом в Краснодарском крае. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М. - 2002. - С.287-290.7. Pshenichny A.A., Sapunov V.A. A new and unusual source of human infection with trichinosis in the Krasnodar Territory. // Theory and practice of controlling parasitic diseases. - M. - 2002. - P.287-290.
8. Твердохлебова Т.И., Васерин Ю.И. Получение диагностикума трихинеллезного антигенного эритроцитарного сухого для РНГА и оценка его эффективности. // Мед. Паразитология и паразитарные болезни. - М. - 2005. - №2. - С.29-32.8. Tverdokhlebova TI, Vaserin Yu.I. Obtaining a diagnosticum of trichinosis antigenic erythrocyte dry for RNGA and evaluating its effectiveness. // Honey. Parasitology and parasitic diseases. - M. - 2005. - No. 2. - S. 29-32.
9. Gamble H.R., Andersom W.R., Graham., Murrel K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using excretory-secretory antigen // Veterinary Parasitology. - 1983. - 13. - 349-361.9. Gamble H.R., Andersom W.R., Graham., Murrel K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using excretory-secretory antigen // Veterinary Parasitology. - 1983. - 13. - 349-361.
10. Gamble H.R., Murrell K.D., Marti Ph. Inoculation of pigs against T.spiralis using excretory-secretory antigens // Amer. J. Vet. Res. - 1986. - 47. - 11. - P.2396-23989.10. Gamble H.R., Murrell K.D., Marti Ph. Inoculation of pigs against T. spiralis using excretory-secretory antigens // Amer. J. Vet. Res. - 1986. - 47. - 11. - P.2396-23989.
11. Gamble H.R. Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay // J. of Food Protection. - 1995. - 58(3). - P.295-298.11. Gamble H.R. Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay // J. of Food Protection. - 1995 .-- 58 (3). - P.295-298.
12. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis // Veterinary Parasitoligy. - 1988. - 30. - P.131-134.12. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis // Veterinary Parasitoligy. - 1988. - 30. - P.131-134.
13. Gamble H.R., Wisnewski N., Wassom D. Detection of trichinellosis enzyme immunoassay using a synthetic glycan antigen // American Journal of Veterinary. - 1997. - 58. - P.417-421.13. Gamble H.R., Wisnewski N., Wassom D. Detection of trichinellosis enzyme immunoassay using a synthetic glycan antigen // American Journal of Veterinary. - 1997. - 58. - P.417-421.
14. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Factors influencing the excretory-secretory antigens in the serodiagnosis of swine trichinellosis // Consejo Superior de Investigaciones Press Madrid Spain. - 1989. - P.202-209.14. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Factors influencing the excretory-secretory antigens in the serodiagnosis of swine trichinellosis // Consejo Superior de Investigaciones Press Madrid Spain. - 1989. - P.202-209.
Приложение 1.Annex 1.
Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза свиней в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опытаInstructions for use of a set of components for the diagnosis of pig trichinosis in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the order of production experience
Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови к антигенам трихинелл.The test system "VIGIS - Biotech - T.spiralis-strip" is a set of reagents for the detection of serum antibodies to Trichinella antigens.
Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов свиньи с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.The active components of the test system are Trichinella antigens immobilized in the wells of strips; polyclonal conjugate of antibodies against pig immunoglobulins with the enzyme peroxidase, control positive and negative samples.
Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления не связавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов свиньи с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащем хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.A method for detecting antibodies to trichinella antigens is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), during which the interaction of the studied blood serum samples with helminth antigens immobilized in the wells leads to the binding of specific antibodies and the formation of an antigen-antibody complex on the surface of the wells. After removal of unbound serum components and adding to the wells of strips of a conjugate against pig immunoglobulins with peroxidase, the enzyme tag is included in the immune complex. As a result of an enzymatic reaction in the wells with a substrate solution containing chromogen (TMB) and a hydrogen peroxide catalyst, a colored product is formed. The color intensity of this product is proportional to the concentration of antibodies to Trichinella antigens in the analyzed serum sample.
Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови свиней иммуноферментным методом.The components included in the kit for the diagnosis of trichinosis are designed to detect antibodies to T.spiralis antigens in serum of pigs by enzyme immunoassay.
- 2. Набор с увеличенным объемом компонентов расчитан на исследование 192 (96×2) проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы, и содержит следующие реагенты:- 2. The kit with an increased volume of components is designed for the study of 192 (96 × 2) samples, including positive and negative control samples, and contains the following reagents:
- 2.1. Иммуносорбент - 2 полистироловых 96-луночных разборных планшета с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.- 2.1. Immunosorbent - 2 polystyrene 96-well collapsible plates with sorbed Trichinella excretory-secretory antigen, strip wells are transparent, colorless.
- 2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови свиней, содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.- 2.2. A positive control sample (K +) - pig serum containing antibodies to T.spiralis, inactivated, liquid, light straw color.
- 2.3. Отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови свиней, не содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.- 2.3. Negative control sample (K-) - serum of pigs, not containing antibodies to T.spiralis, inactivated, liquid, light straw color.
- 2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов свиньи, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.- 2.4. Anti-species conjugate - 10-fold concentrate of diagnostic antibodies against pig immunoglobulins covalently linked to the horseradish peroxidase enzyme in a stabilizing solution, liquid, transparent, yellowish.
- 2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.- 2.5. Phosphate-saline buffer with tween - 20 (FSB-T, 25-fold concentrate), liquid, transparent, colorless.
- 2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.- 2.6. Conjugate Dilution Solution (PPK) is a clear, slightly opalescent liquid.
- 2.7. Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.- 2.7. The diluting buffer solution for serum dilution (RBS) is a clear straw-colored liquid.
- 2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.- 2.8. One-component substrate buffer solution with TMB chromogen (tetramethylbenzidine) and hydrogen peroxide, ready to use, colorless transparent liquid.
- 2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.- 2.8. Stop reagent - sulfuric acid to a concentration of 0.5 M to stop the enzymatic reaction, a clear, colorless liquid.
Иммунобиологические свойства.Immunobiological properties.
Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам Т.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови свиней.The test system detects specific antibodies to all major immunogenic T.spiralis antigens with a molecular weight of 63-29 kD in pig serum.
Назначение.Destination.
Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе для сероэпизоотлогического моноторинга регионов РФ на свиноводческих комплексах, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.The test system is intended for the intravital diagnosis of pig trichinosis by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on a solid-phase carrier for seroepizootological monotoring of regions of the Russian Federation on pig breeding complexes, as well as for scientific research in experimental trichinosis.
Меры безопасности.Security measures.
Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.Despite the fact that this test system is completely biologically safe, the following rules must be observed: do not pipet the solutions with your mouth, work with rubber gloves. Solid waste (used tablets, dispenser tips, reagent vials) is disinfected by immersion in 6% hydrogen peroxide solution with 0.5% CMC or 3% chloramine B. Decontamination time of at least 1 hour. Liquid waste (wash water) is neutralized in a container for infected material by adding dry chloramine at a rate of 200 g / l (decontamination duration of 1 hour) or by boiling for 30 minutes. Tools and equipment are wiped 2 times with 70% ethyl alcohol before and after work.
Способ применения:Mode of application:
1. Приготовление реагентов для ИФА.1. Preparation of reagents for ELISA.
Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.Before starting work, it is necessary to withstand all reagents for 30 minutes at a temperature of from 20 to 24 ° C.
Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.All solutions must be taken with new tips or sterile pipettes.
Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.To conduct an ELISA, the following materials will additionally be required: distilled water, ethyl alcohol, hydrogen peroxide, rubber gloves, glass or polypropylene tubes, automatic pipettes and tips for them.
1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.1.1. Preparation of working solution FSB-T.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.If there is a visually detectable precipitate of salts in the vial with FSB-T, the vial with concentrate should be kept at a temperature of 37 ° C until the salts are completely dissolved.
Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.Transfer the contents of the FSB-T vial to a 1 liter volumetric cylinder and bring the solution volume to 650 ml with distilled water.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.Storage: unused FSB-T concentrate during the shelf life of the kit, prepared working solution - no more than 3 days at a temperature of 2 to 8 ° C.
1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.1.2. Diluting Serum Titration Buffer (RBS) - Ready To Use.
1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т1.3. The solution for dilution of the conjugate (RRK) is a 2-fold concentrate, before the reaction, depending on the number of strips used, dilute 1: 1 with a working solution of FSB-T
Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.For 12 strips (full plate), add 6 ml of FSB-T to 6 ml of PPK, mix. Store the resulting solution at 4 ° C for no more than 1 day.
1.4. Подготовка контрольных сывороток.1.4. Preparation of control sera.
Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.Positive and negative control sera (K + and K-) before use, dilute 1:10 with a solution for serum titration (for example, add 10 μl K + in 90 μl of RBS in one well of a tablet with a control sample), which will correspond to diagnostic titer 1: one hundred. Diluted samples are not subject to storage.
1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.1.5. Preparation of working dilution of the conjugate.
В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствующее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.Add the conjugate concentrate to the working solution of the PPK in a ratio of 1: 100, mix gently (without foaming). In 12 ml of PPK, add 120 μl of conjugate (if the entire tablet is used). In the case of using one or more strips of the tablet in a clean bottle, select the required amount of RRP and add the appropriate amount of conjugate. Prepare a working solution of the conjugate at a temperature of 20-25 ° C not earlier than 15-20 minutes before application to the tablet at. Store the remainder of the conjugate concentrate during the shelf life of the kit at a temperature of 2-4 ° C.
1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.1.6. A one-component substrate buffer solution with TMB chromogen and hydrogen peroxide is ready for use. The solution is stored in a dark place at a temperature of 2-4 ° C during the shelf life of the kit.
1.7. Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.1.7. Stop reagent - (0.5 M sulfuric acid) - ready to use. The term of use is not limited.
Подготовка исследуемых сывороток.Preparation of test sera.
Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови свиней как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше - 20°С, но подвергать замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.To identify specific antibodies to T.spiralis, use pig blood serum both freshly prepared and stored for 48 hours at a temperature of 2 to 8 ° C in a volume of at least 50 μl. Samples containing aggregates or sediment must be clarified by centrifugation. It is preferable to keep the selected samples in a frozen state at a temperature of no higher than -20 ° C, but they can be frozen and thawed no more than 1 time.
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.To exclude false-positive results, test sera should be prepared and stored under conditions excluding bacterial growth. Each serum or solution sample should be taken with a new tip. For sampling and components, use automatic pipettes with an error in measuring volume of not more than 5%.
Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0,9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.Dilute samples of test sera in tubes in serum dilution buffer (BRS) to a concentration of 1: 100, for which 10 μl of serum is added to 990 μl (0.9 ml) of the buffer. For analysis, withdraw 100 μl (0.1 ml) from each tube and add to the well a strictly individual tip or pipette. The remains of diluted sera can be saved for titration of doubtful samples if necessary, re-analysis for 2-3 days at a temperature of + 4 ° C.
3. Проведение ИФА.3. Conducting ELISA.
Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.The set before analysis to withstand 30 minutes at a temperature of from 20 to 26 ° C.
3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончанию промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.3.1. Rinse the tablet once with FSB-T, and add at least 200 μl of solution to each well. At the end of the wash, remove the remaining liquid by vigorous shaking, tapping the tablet on filter paper folded several times.
3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.3.2. Pipette 200 μl of K + into the well of tablet A1, add 100 μl of BRS to wells B1, C1 and D1 for multiple titration of the control sample (up to a titer of at least 1: 800). 100 μl of K- serum is added to one of the wells, one more a well is used to control the quality of the reagents by placing 100 μl of BRS in it. Pipette 100 µl of the test sera into the remaining wells in a diagnostic titer of 1: 100. Mix each sample during titration by pipetting at least 5 times.
После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.After that, glue the tablet with adhesive tape or place in a plastic bag and incubate for 30 minutes at a temperature of 37 ° C.
3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.3.3 After incubation, rinse the plate with FSB-T five times, as described in section 3.1.
3.4. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.3.4. After washing and removing moisture, add 100 μl of conjugate to each well of the plate (see preparation 1.4.). Close the plate and incubate at 37 ° C for 30 minutes.
3.5. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.3.5. At the end of the incubation, rinse the plate with FSB-T 5 times, as described in section 3.1.
3.6. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.3.6. Pipette 100 μl of a one-component substrate solution with TMB chromogen into each well and place for 10-15 minutes in a dark place under observation. With the development of intense blue staining of the positive control sample, the reaction is stopped by the addition of a stop reagent in an amount of 50 μl and after 2-5 minutes ELISA results are recorded.
Учет результатов.Accounting for results.
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.ELISA results are recorded on a spectrophotometer, optical density (OD) is measured at a wavelength of 450 nm. The instrument is tuned “over the air”. The reaction is taken into account if the optical density in wells with a negative control is less than 0.2, in a well with a control of reagents (conjugate) does not exceed 0.15, and with a positive (K +) it is equal to or more than 0.6 p.p.
В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.If it is not possible to carry out instrumental accounting of the reaction results, a visual assessment of the intensity of the staining of the solution in the wells is used, comparing the test sera with samples K + and K-. The test serum is considered to be positively reacting with the antigen if the color of the substrate mixture caused by it is more intense than in wells with a diagnostic control sample on strips with the same antigen. When determining the titer of antibodies in the test serum, the highest serum dilution at which the color of the substrate mixture is more intense than in the wells with a diagnostic control sample is taken as the ELISA titer for the antigen used.
Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.Highly sensitive ELISA methods can sometimes give false positive results, which are due to various reasons: contamination of samples, poor-quality washing of the immunosorbent, the content in some samples of substances that can bind non-specifically to immunosorbents, the interaction of antibodies with heterologous parasitic antigens due to immunological crossings.
Шкала визуальной оценки реакции:Reaction Visual Assessment Scale:
«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый."+++" - strongly positive, the color is dark yellow.
«++» - положительная, цвет интесивно желтый.“++” is positive, the color is intense yellow.
«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.“+” - doubtful (or false positive), straw-yellow color, this test should be repeated in ELISA.
«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.“-” is negative, there is no staining or a weak background.
Приложение 2.Appendix 2
Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза кошек в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опытаInstructions for the use of a kit of components for the diagnosis of feline trichinosis in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the order of production experience
Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови к антигенам трихинелл.The test system "VIGIS - Biotech - T.spiralis-strip" is a set of reagents for the detection of serum antibodies to Trichinella antigens.
Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов кошек с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.The active components of the test system are Trichinella antigens immobilized in the wells of strips; polyclonal conjugate of antibodies against feline immunoglobulins with peroxidase enzyme, control positive and negative samples.
Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления несвязавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов кошки с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащим хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.A method for detecting antibodies to trichinella antigens is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), during which the interaction of the studied blood serum samples with helminth antigens immobilized in the wells leads to the binding of specific antibodies and the formation of an antigen-antibody complex on the surface of the wells. After removal of unbound serum components and addition of a cat-peroxidase conjugate conjugate against immunoglobulins to the wells, the enzyme tag is included in the immune complex. As a result of an enzymatic reaction in the wells with a substrate solution containing chromogen (TMB) and a hydrogen peroxide catalyst, a colored product is formed. The color intensity of this product is proportional to the concentration of antibodies to Trichinella antigens in the analyzed serum sample.
Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови кошек иммуноферментным методом.The components included in the kit for the diagnosis of trichinosis are designed to detect antibodies to T.spiralis antigens in serum of cats by enzyme immunoassay.
2. Набор компонентов рассчитан на исследование 96 проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы, и содержит следующие реагенты:2. The set of components is designed to study 96 samples, including positive and negative control samples, and contains the following reagents:
2.1. Иммуносорбент - полистироловый 96-луночный разборный планшет с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.2.1. Immunosorbent is a polystyrene 96-well collapsible plate with sorbed Trichinella excretory-secretory antigen, the strip wells are transparent, colorless.
2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови кошки, содержащая антитела к T.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.2.2. A positive control sample (K +) - cat serum containing antibodies to T.spiralis, inactivated, liquid, light straw color.
2.3. Отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови кошки, не содержащая антитела к T.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.2.3. Negative control sample (K-) - serum of a cat, not containing antibodies to T.spiralis, inactivated, liquid, light straw color.
2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов кошки, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.2.4. Anti-species conjugate - 10-fold concentrate of diagnostic antibodies against cat immunoglobulins covalently linked to the horseradish peroxidase enzyme in a stabilizing solution, liquid, transparent, yellowish.
2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.2.5. Phosphate-saline buffer with tween - 20 (FSB-T, 25-fold concentrate), liquid, transparent, colorless.
2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.2.6. Conjugate Dilution Solution (PPK) is a clear, slightly opalescent liquid.
2.7 Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.2.7 Reconstituting buffer solution for serum dilution (RBS) - a clear liquid of light straw color.
2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.2.8. One-component substrate buffer solution with TMB chromogen (tetramethylbenzidine) and hydrogen peroxide, ready to use, colorless transparent liquid.
2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.2.8. Stop reagent - sulfuric acid to a concentration of 0.5 M to stop the enzymatic reaction, a clear, colorless liquid.
Иммунобиологические свойства.Immunobiological properties.
Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам T.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови кошек.The test system identifies specific antibodies to all major immunogenic T.spiralis antigens with a molecular weight of 63-29 kDa in feline serum.
Назначение.Destination
Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза кошек в ветеринарных клиниках методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.The test system is intended for intravital diagnosis of trichinosis in cats in veterinary clinics by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on a solid-phase carrier, as well as for scientific research in experimental trichinosis.
Меры безопасности.Security measures.
Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.Despite the fact that this test system is completely biologically safe, the following rules must be observed: do not pipet the solutions with your mouth, work with rubber gloves. Solid waste (used tablets, dispenser tips, reagent vials) is disinfected by immersion in 6% hydrogen peroxide solution with 0.5% CMC or 3% chloramine B. Decontamination time of at least 1 hour. Liquid waste (wash water) is neutralized in a container for infected material by adding dry chloramine at a rate of 200 g / l (decontamination duration of 1 hour) or by boiling for 30 minutes. Tools and equipment are wiped 2 times with 70% ethyl alcohol before and after work.
Способ применения:Mode of application:
1. Приготовление реагентов для ИФА.1. Preparation of reagents for ELISA.
Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.Before starting work, it is necessary to withstand all reagents for 30 minutes at a temperature of from 20 to 24 ° C.
Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.All solutions must be taken with new tips or sterile pipettes.
Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.To conduct an ELISA, the following materials will additionally be required: distilled water, ethyl alcohol, hydrogen peroxide, rubber gloves, glass or polypropylene tubes, automatic pipettes and tips for them.
1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.1.1. Preparation of working solution FSB-T.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.If there is a visually detectable precipitate of salts in the vial with FSB-T, the vial with concentrate should be kept at a temperature of 37 ° C until the salts are completely dissolved.
Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.Transfer the contents of the FSB-T vial to a 1 liter volumetric cylinder and bring the solution volume to 650 ml with distilled water.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.Storage: unused FSB-T concentrate during the shelf life of the kit, prepared working solution - no more than 3 days at a temperature of 2 to 8 ° C.
1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.1.2. Diluting Serum Titration Buffer (RBS) - Ready To Use.
1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т.1.3. The solution for dilution of the conjugate (RRK) is a 2-fold concentrate, before the reaction, dilute 1: 1 with a working solution of FSB-T, depending on the number of strips used.
Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.For 12 strips (full plate), add 6 ml of FSB-T to 6 ml of PPK, mix. Store the resulting solution at 4 ° C for no more than 1 day.
1.4. Подготовка контрольных сывороток.1.4. Preparation of control sera.
Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.Positive and negative control sera (K + and K-) before use, dilute 1:10 with a solution for serum titration (for example, add 10 μl K + in 90 μl of RBS in one well of a tablet with a control sample), which will correspond to diagnostic titer 1: one hundred. Diluted samples are not subject to storage.
1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.1.5. Preparation of working dilution of the conjugate.
В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствующее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.Add the conjugate concentrate to the working solution of the PPK in a ratio of 1: 100, mix gently (without foaming). In 12 ml of PPK, add 120 μl of conjugate (if the entire tablet is used). In the case of using one or more strips of the tablet in a clean bottle, select the required amount of RRP and add the appropriate amount of conjugate. Prepare a working solution of the conjugate at a temperature of 20-25 ° C not earlier than 15-20 minutes before application to the tablet at. Store the remainder of the conjugate concentrate during the shelf life of the kit at a temperature of 2-4 ° C. 1.6. A one-component substrate buffer solution with TMB chromogen and hydrogen peroxide is ready for use. The solution is stored in a dark place at a temperature of 2-4 ° C during the shelf life of the kit.
1.7 Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.1.7 Stop reagent - (0.5 M sulfuric acid) - ready to use. The term of use is not limited.
Подготовка исследуемых сывороток.Preparation of test sera.
Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови кошек как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше - 20°С, но подвергаться замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.To identify specific antibodies to T.spiralis, use feline blood serum, either freshly prepared or stored for 48 hours at a temperature of 2 to 8 ° C in a volume of at least 50 μl. Samples containing aggregates or sediment must be clarified by centrifugation. It is preferable to keep the selected samples in a frozen state at a temperature of no higher than -20 ° C, but they can be frozen and thawed no more than 1 time.
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.To exclude false-positive results, test sera should be prepared and stored under conditions excluding bacterial growth. Each serum or solution sample should be taken with a new tip. For sampling and components, use automatic pipettes with an error in measuring volume of not more than 5%.
Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0.9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.Dilute test sera in tubes in serum dilution buffer (BRS) to a concentration of 1: 100, for which 10 μl of serum is added to 990 μl (0.9 ml) of the buffer. For analysis, withdraw 100 μl (0.1 ml) from each tube and add to the well a strictly individual tip or pipette. The remains of diluted sera can be saved for titration of doubtful samples if necessary, re-analysis for 2-3 days at a temperature of + 4 ° C.
3. Проведение ИФА.3. Conducting ELISA.
Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.The set before analysis to withstand 30 minutes at a temperature of from 20 to 26 ° C.
3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончании промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.3.1. Rinse the tablet once with FSB-T, and add at least 200 μl of solution to each well. At the end of the wash, remove the remaining liquid by vigorous shaking, tapping the tablet on filter paper folded several times.
3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.3.2. Pipette 200 μl of K + into the well of tablet A1, add 100 μl of BRS to wells B1, C1 and D1 for multiple titration of the control sample (up to a titer of at least 1: 800). 100 μl of K- serum is added to one of the wells, one more a well is used to control the quality of the reagents by placing 100 μl of BRS in it. Pipette 100 µl of the test sera into the remaining wells in a diagnostic titer of 1: 100. Mix each sample during titration by pipetting at least 5 times.
После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.After that, glue the tablet with adhesive tape or place in a plastic bag and incubate for 30 minutes at a temperature of 37 ° C.
3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.3.3 After incubation, rinse the plate with FSB-T five times, as described in section 3.1.
3.7. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.3.7. After washing and removing moisture, add 100 μl of conjugate to each well of the plate (see preparation 1.4.). Close the plate and incubate at 37 ° C for 30 minutes.
3.8. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.3.8. At the end of the incubation, rinse the plate with FSB-T 5 times, as described in section 3.1.
3.9. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.3.9. Pipette 100 μl of a one-component substrate solution with TMB chromogen into each well and place for 10-15 minutes in a dark place under observation. With the development of intense blue staining of the positive control sample, the reaction is stopped by the addition of a stop reagent in an amount of 50 μl and after 2-5 minutes ELISA results are recorded.
Учет результатов.Accounting for results.
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.ELISA results are recorded on a spectrophotometer, optical density (OD) is measured at a wavelength of 450 nm. The instrument is tuned “over the air”. The reaction is taken into account if the optical density in wells with a negative control is less than 0.2, in a well with a control of reagents (conjugate) does not exceed 0.15, and with a positive (K +) it is equal to or more than 0.6 p.p.
В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.If it is not possible to carry out instrumental accounting of the reaction results, a visual assessment of the intensity of the staining of the solution in the wells is used, comparing the test sera with samples K + and K-. The test serum is considered to be positively reacting with the antigen if the color of the substrate mixture caused by it is more intense than in wells with a diagnostic control sample on strips with the same antigen. When determining the titer of antibodies in the test serum, the highest serum dilution at which the color of the substrate mixture is more intense than in the wells with a diagnostic control sample is taken as the ELISA titer for the antigen used.
Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.Highly sensitive ELISA methods can sometimes give false positive results, which are due to various reasons: contamination of samples, poor-quality washing of the immunosorbent, the content in some samples of substances that can bind non-specifically to immunosorbents, the interaction of antibodies with heterologous parasitic antigens due to immunological crossings.
Шкала визуальной оценки реакции:Reaction Visual Assessment Scale:
«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый."+++" - strongly positive, the color is dark yellow.
«++» - положительная, цвет интесивно желтый.“++” is positive, the color is intense yellow.
«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.“+” - doubtful (or false positive), straw-yellow color, this test should be repeated in ELISA.
«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.“-” is negative, there is no staining or a weak background.
Приложение 3.Appendix 3
Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза собак в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опытаInstructions for the use of a kit of components for the diagnosis of dog trichinosis in an enzyme immunoassay (ELISA) in the order of production experience
Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови у собак к антигенам трихинелл.The test system "VIGIS - Biotech - T.spiralis-strip" is a set of reagents for detecting blood serum antibodies in dogs to Trichinella antigens.
Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов собак с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.The active components of the test system are Trichinella antigens immobilized in the wells of strips; polyclonal conjugate of antibodies against dog immunoglobulins with the enzyme peroxidase, control positive and negative samples.
Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген-антитело» на поверхности лунок. После удаления не связавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов собаки с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащим хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.A method for detecting antibodies to Trichinella antigens is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), during which the interaction of the studied blood serum samples with helminth antigens immobilized in the wells leads to the binding of specific antibodies and the formation of an antigen-antibody complex on the surface of the wells. After removal of unbound serum components and adding to the wells of the strips of the conjugate against dog immunoglobulins with peroxidase, the enzyme label is included in the immune complex. As a result of an enzymatic reaction in the wells with a substrate solution containing chromogen (TMB) and a hydrogen peroxide catalyst, a colored product is formed. The color intensity of this product is proportional to the concentration of antibodies to Trichinella antigens in the analyzed serum sample.
Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови собак иммуноферментным методом.The components included in the kit for the diagnosis of trichinosis are designed to detect antibodies to T.spiralis antigens in the blood serum of dogs by enzyme immunoassay.
2. Набор компонентов рассчитан на исследование 96 проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы и содержит следующие реагенты:2. The set of components is designed to study 96 samples, including positive and negative control samples and contains the following reagents:
2.1. Иммуносорбент - полистироловый 96-луночный разборные планшет с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.2.1. Immunosorbent is a polystyrene 96-well collapsible plate with sorbed Trichinella excretory-secretory antigen, the strip wells are transparent, colorless.
2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови собаки, содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.2.2. A positive control sample (K +) is the blood serum of the dog containing antibodies to T.spiralis, inactivated, liquid, light straw in color.
2.3. Отрицательный контрольный образец (К-)- сыворотка крови собаки, не содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.2.3. Negative control sample (K -) - dog blood serum that does not contain antibodies to T. spiralis, inactivated, liquid, light straw color.
2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов собаки, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.2.4. Anti-species conjugate - 10-fold concentrate of diagnostic antibodies against dog immunoglobulins covalently linked to the horseradish peroxidase enzyme in a stabilizing solution, liquid, transparent, yellowish.
2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.2.5. Phosphate-saline buffer with tween - 20 (FSB-T, 25-fold concentrate), liquid, transparent, colorless.
2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.2.6. Conjugate Dilution Solution (PPK) is a clear, slightly opalescent liquid.
2.7. Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.2.7. The diluting buffer solution for serum dilution (RBS) is a clear straw-colored liquid.
2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.2.8. One-component substrate buffer solution with TMB chromogen (tetramethylbenzidine) and hydrogen peroxide, ready to use, colorless transparent liquid.
2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.2.8. Stop reagent - sulfuric acid to a concentration of 0.5 M to stop the enzymatic reaction, a clear, colorless liquid.
Иммунобиологические свойства.Immunobiological properties.
Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам Т.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови собак.The test system detects specific antibodies to all the main immunogenic T.spiralis antigens with a molecular weight of 63-29 kD in the blood serum of dogs.
Назначение.Destination
Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза собак в ветеринарных клиниках методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.The test system is intended for intravital diagnosis of dog trichinosis in veterinary clinics by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on a solid-phase carrier, as well as for scientific research in experimental trichinosis.
Меры безопасности.Security measures.
Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.Despite the fact that this test system is completely biologically safe, the following rules must be observed: do not pipet the solutions with your mouth, work with rubber gloves. Solid waste (used tablets, dispenser tips, reagent vials) is disinfected by immersion in 6% hydrogen peroxide solution with 0.5% CMC or 3% chloramine B. Decontamination time of at least 1 hour. Liquid waste (wash water) is neutralized in a container for infected material by adding dry chloramine at a rate of 200 g / l (decontamination duration of 1 hour) or by boiling for 30 minutes. Tools and equipment are wiped 2 times with 70% ethyl alcohol before and after work.
Способ применения:Mode of application:
1. Приготовление реагентов для ИФА.1. Preparation of reagents for ELISA.
Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.Before starting work, it is necessary to withstand all reagents for 30 minutes at a temperature of from 20 to 24 ° C.
Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.All solutions must be taken with new tips or sterile pipettes.
Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.To conduct an ELISA, the following materials will additionally be required: distilled water, ethyl alcohol, hydrogen peroxide, rubber gloves, glass or polypropylene tubes, automatic pipettes and tips for them.
1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.1.1. Preparation of working solution FSB-T.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.If there is a visually detectable precipitate of salts in the vial with FSB-T, the vial with concentrate should be kept at a temperature of 37 ° C until the salts are completely dissolved.
Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.Transfer the contents of the FSB-T vial to a 1 liter volumetric cylinder and bring the solution volume to 650 ml with distilled water.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.Storage: unused FSB-T concentrate during the shelf life of the kit, prepared working solution - no more than 3 days at a temperature of 2 to 8 ° C.
1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.1.2. Diluting Serum Titration Buffer (RBS) - Ready To Use.
1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т1.3. The solution for dilution of the conjugate (RRK) is a 2-fold concentrate, before the reaction, depending on the number of strips used, dilute 1: 1 with a working solution of FSB-T
Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.For 12 strips (full plate), add 6 ml of FSB-T to 6 ml of PPK, mix. Store the resulting solution at 4 ° C for no more than 1 day.
1.4. Подготовка контрольных сывороток.1.4. Preparation of control sera.
Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.Positive and negative control sera (K + and K-) before use, dilute 1:10 with a solution for serum titration (for example, add 10 μl K + in 90 μl of RBS in one well of a tablet with a control sample), which will correspond to diagnostic titer 1: one hundred. Diluted samples are not subject to storage.
1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.1.5. Preparation of working dilution of the conjugate.
В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствуюшее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.Add the conjugate concentrate to the working solution of the PPK in a ratio of 1: 100, mix gently (without foaming). In 12 ml of PPK, add 120 μl of conjugate (if the entire tablet is used). In the case of using one or more strips of the tablet in a clean bottle, select the required amount of RRP and add the appropriate amount of conjugate. Prepare a working solution of the conjugate at a temperature of 20-25 ° C not earlier than 15-20 minutes before application to the tablet at. Store the remainder of the conjugate concentrate during the shelf life of the kit at a temperature of 2-4 ° C.
1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.1.6. A one-component substrate buffer solution with TMB chromogen and hydrogen peroxide is ready for use. The solution is stored in a dark place at a temperature of 2-4 ° C during the shelf life of the kit.
1.7 Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.1.7 Stop reagent - (0.5 M sulfuric acid) - ready to use. The term of use is not limited.
Подготовка исследуемых сыворотокPreparation of test sera
Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови кошек как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше -20°С, но подвергать замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.To identify specific antibodies to T.spiralis, use feline blood serum, either freshly prepared or stored for 48 hours at a temperature of 2 to 8 ° C in a volume of at least 50 μl. Samples containing aggregates or sediment must be clarified by centrifugation. The selected samples are preferably stored in a frozen state at a temperature not exceeding -20 ° C, but they can be frozen and thawed no more than 1 time.
Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.To exclude false-positive results, test sera should be prepared and stored under conditions excluding bacterial growth. Each serum or solution sample should be taken with a new tip. For sampling and components, use automatic pipettes with an error in measuring volume of not more than 5%.
Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0.9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.Dilute test sera in tubes in serum dilution buffer (BRS) to a concentration of 1: 100, for which 10 μl of serum is added to 990 μl (0.9 ml) of the buffer. For analysis, withdraw 100 μl (0.1 ml) from each tube and add to the well a strictly individual tip or pipette. The remains of diluted sera can be saved for titration of doubtful samples if necessary, re-analysis for 2-3 days at a temperature of + 4 ° C.
3. Проведение ИФА.3. Conducting ELISA.
Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.The set before analysis to withstand 30 minutes at a temperature of from 20 to 26 ° C.
3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончании промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.3.1. Rinse the tablet once with FSB-T, and add at least 200 μl of solution to each well. At the end of the wash, remove the remaining liquid by vigorous shaking, tapping the tablet on filter paper folded several times.
3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.3.2. Pipette 200 μl of K + into the well of tablet A1, add 100 μl of BRS to wells B1, C1 and D1 for multiple titration of the control sample (up to a titer of at least 1: 800). 100 μl of K- serum is added to one of the wells, one more a well is used to control the quality of the reagents by placing 100 μl of BRS in it. Pipette 100 µl of the test sera into the remaining wells in a diagnostic titer of 1: 100. Mix each sample during titration by pipetting at least 5 times.
После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.After that, glue the tablet with adhesive tape or place in a plastic bag and incubate for 30 minutes at a temperature of 37 ° C.
3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.3.3 After incubation, rinse the plate with FSB-T five times, as described in section 3.1.
3.10. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.3.10. After washing and removing moisture, add 100 μl of conjugate to each well of the plate (see preparation 1.4.). Close the plate and incubate at 37 ° C for 30 minutes.
3.11. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.3.11. At the end of the incubation, rinse the plate with FSB-T 5 times, as described in section 3.1.
3.12. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.3.12. Pipette 100 μl of a one-component substrate solution with TMB chromogen into each well and place for 10-15 minutes in a dark place under observation. With the development of intense blue staining of the positive control sample, the reaction is stopped by the addition of a stop reagent in an amount of 50 μl and after 2-5 minutes ELISA results are recorded.
Учет результатов.Accounting for results.
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.ELISA results are recorded on a spectrophotometer, optical density (OD) is measured at a wavelength of 450 nm. The instrument is tuned “over the air”. The reaction is taken into account if the optical density in wells with a negative control is less than 0.2, in a well with a control of reagents (conjugate) does not exceed 0.15, and with a positive (K +) it is equal to or more than 0.6 p.p.
В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.If it is not possible to carry out instrumental accounting of the reaction results, a visual assessment of the intensity of the staining of the solution in the wells is used, comparing the test sera with samples K + and K-. The test serum is considered to be positively reacting with the antigen if the color of the substrate mixture caused by it is more intense than in wells with a diagnostic control sample on strips with the same antigen. When determining the titer of antibodies in the test serum, the highest serum dilution at which the color of the substrate mixture is more intense than in the wells with a diagnostic control sample is taken as the ELISA titer for the antigen used.
Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.Highly sensitive ELISA methods can sometimes give false positive results, which are due to various reasons: contamination of samples, poor-quality washing of the immunosorbent, the content in some samples of substances that can bind non-specifically to immunosorbents, the interaction of antibodies with heterologous parasitic antigens due to immunological crossings.
Шкала визуальной оценки реакции:Reaction Visual Assessment Scale:
«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый."+++" - strongly positive, the color is dark yellow.
«++» - положительная, цвет интесивно желтый.“++” is positive, the color is intense yellow.
«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.“+” - doubtful (or false positive), straw-yellow color, this test should be repeated in ELISA.
«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.“-” is negative, there is no staining or a weak background.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006129445/15A RU2339038C2 (en) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006129445/15A RU2339038C2 (en) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006129445A RU2006129445A (en) | 2008-02-20 |
| RU2339038C2 true RU2339038C2 (en) | 2008-11-20 |
Family
ID=39266926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006129445/15A RU2339038C2 (en) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2339038C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2423700C2 (en) * | 2009-04-10 | 2011-07-10 | Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) | Method for life-time diagnostics of swine trichinosis |
| RU2589656C2 (en) * | 2014-11-25 | 2016-07-10 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Method of mathematical prediction of trichinosis severity |
| RU2746448C2 (en) * | 2017-12-20 | 2021-04-14 | Евроиммун Медицинише Лабордиагностика Аг | Trichinella detection method |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2201591C2 (en) * | 2001-02-20 | 2003-03-27 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина | Equipment for trichinelloscopy under field conditions |
| RU2210985C2 (en) * | 2000-04-10 | 2003-08-27 | Попов Михаил Алексеевич | Allergen for diagnostics of trichinosis in swine |
| RU2005105086A (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скр бина (ВИГИС) (RU) | METHOD FOR PRODUCING AN IMMUNOGENOUS ANTIGEN TRICHINELLA SPIRALIS |
-
2006
- 2006-08-15 RU RU2006129445/15A patent/RU2339038C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2210985C2 (en) * | 2000-04-10 | 2003-08-27 | Попов Михаил Алексеевич | Allergen for diagnostics of trichinosis in swine |
| RU2201591C2 (en) * | 2001-02-20 | 2003-03-27 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина | Equipment for trichinelloscopy under field conditions |
| RU2005105086A (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скр бина (ВИГИС) (RU) | METHOD FOR PRODUCING AN IMMUNOGENOUS ANTIGEN TRICHINELLA SPIRALIS |
| RU2287342C1 (en) * | 2005-02-25 | 2006-11-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC Trichinella spiralis ANTIGEN |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2423700C2 (en) * | 2009-04-10 | 2011-07-10 | Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) | Method for life-time diagnostics of swine trichinosis |
| RU2589656C2 (en) * | 2014-11-25 | 2016-07-10 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Method of mathematical prediction of trichinosis severity |
| RU2746448C2 (en) * | 2017-12-20 | 2021-04-14 | Евроиммун Медицинише Лабордиагностика Аг | Trichinella detection method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006129445A (en) | 2008-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marrie et al. | Seroepidemiology of Q fever among domestic animals in Nova Scotia. | |
| Deplazes et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay for diagnostic detection of Taenia saginata copro-antigens in humans | |
| Sroka | Seroepidemiology of toxoplasmosis in the Lublin region | |
| Lightowlers et al. | Serological diagnosis of Echinococcus granulosus infection in sheep using cyst fluid antigen processed by antibody affinity chromatography | |
| CN101581726B (en) | New-generation brucellosis antibody competition enzyme-linked immunosorbent adsorption test detection kit | |
| BRPI0813681B1 (en) | device and method for detecting the presence or absence of toxocara nematelminth coproantigen in a fecal sample from a mammal, method for diagnosing intestinal toxocara nematelmin infection in a mammal, and kit for detecting one or more toxocara nematelminth coproantigens in a sample of a mammal. | |
| Abuseir et al. | Evaluation of a serological method for the detection of Taenia saginata cysticercosis using serum and meat juice samples | |
| Chand et al. | Comparison of milk-ELISA and serum-ELISA for the diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep | |
| KR101510376B1 (en) | Shrimp allergens, anti-shrimp allergens and their use | |
| Edrissian et al. | Application of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to identification of Anopheles mosquito bloodmeals | |
| US8048637B2 (en) | Diagnostic composition and method for the detection of a Trichinella infection | |
| RU2339038C2 (en) | Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores | |
| Niilo | Enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolated from intestinal contents of cattle, sheep and chickens | |
| Cooke et al. | The latest FAD–Faecal antibody detection in cattle. Protocol and results from three UK beef farms naturally infected with gastrointestinal nematodes | |
| EP3608672B1 (en) | Crude native hapten-based indirect elisa assay kit and lyophilised controls for the confirmatory diagnosis of bovine brucellosis in blood serum and milk by animal and tank | |
| CN102944682A (en) | Crab type antibody repertoire detection kit | |
| García-Vazquez et al. | A serological survey of Trypanosoma cruzi infection in dogs of two urban areas of Mexico | |
| JP5830771B2 (en) | Parasite detection method and kit | |
| RU2167673C1 (en) | Set for determining antibodies to egg yield drop syndrome-76 hen virus | |
| RU2769578C1 (en) | Method for producing a fluorescent immunoglobulin diagnostic agent for detecting pathogens of rickettsioses and coxielloses, fluorescent immunoglobulin diagnostic agent and application thereof | |
| RU2287154C2 (en) | Method for predicting toxoplasmosis in dogs and cats | |
| KR20180006516A (en) | Igm semiquantitative diagnostic kit for leptospirosis | |
| Williamson | Serological Characterisation of Spiroplasmas and Other Mycoplasmas | |
| Pathak et al. | In vitro Cultivation of Toxocara canis Larva for Extraction of Excretory-Secretory (TcES) Antigen | |
| RU2782463C1 (en) | Methods, devices, kits, and compositions for detection of tapeworms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080829 |