RU2317089C2 - Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме и способ его получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Комплексный препарат-пробиотик включает носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованные на указанном носителе-энтеросорбенте. Клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла при следующем соотношении компонентов препарата в лиофилизированном виде, мас.%: клетки с питательной средой консорциума бифидо-, или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г 1,0-10,0; защитная среда 0,1-10,0; энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла, - остальное до 100%. Способ получения препарата включает обработку пористого энтеросорбента СУМС-1 раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1 и его отмывку от реагента 2-3-кратным объемом дистиллированной воды, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой, перед стерилизацией. В качестве бактерий используют концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г. Комплексный препарат-пробиотик обеспечивает более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом СУМС-1, определяющей его клиническую эффективность, и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 табл.

Description

Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве.

Для профилактики и лечения многих патологических состояний, обусловленных нарушением эндоэкологии, широкое распространение получили энтеросорбенты. Это различные типы активных углей, например карбактин, карболонг, микросорб, полифепан и т.д. (Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. - М.: Медицина, 1978, с.132-133; патент РФ N2029546, МПК⁶ А61К 9/16, опубл. 27.02.95 г.), природные материалы и их аналоги (кристаллическая микроцеллюлоза, цеолиты, хитозаны, пектины и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы, которые используются для очищения организма от шлаков, радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзо- и эндотоксикозов.

Однако энтеросорбенты не устраняют причин, вызывающих эффекты экзо- и эндотоксикозов, как правило, они не селективны, работают в основном на избыток субстрата, могут оказывать негативное действие из-за сорбции нужных для организма метаболитов (витаминов, гормонов) и не обеспечивают активно нормализацию микробиоценоза.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая. Для нормализации микробиоценоза широкое распространение получили препараты живых бактериальных клеток: бифидобактерий (межд. заявка (WO) № 85/03848), МКИ А23С 9/12, опубл. 12.09.85 г.), лактобактерий (заявка ЕПВ № 0154614, МКИ А23С 9/123, опубл. 11.09.85 г.), колибактерий и т.д.

Недостатками этих препаратов являются довольно короткие сроки их хранения, если они находятся в жидкой форме, или высокая стоимость, если они изготовлены в сухой форме, а также слабая устойчивость к инактивирующим факторам внешней среды и желудочно-кишечного тракта организма при применении.

Известен комплексный препарат, включающий пористый неорганический носитель и иммобилизованные на нем клетки микроорганизмов (заявка ФРГ №3410650, МКИ С12N 11/14, опубл. 03.10.85 г.). В качестве носителей применяют сталактитовые подложки с двойной структурой пор. Подложки имеют сквозные макропоры, которые делают возможным свободный обмен жидкости и газа из внутренней части носителя в окружающую среду. Размер макропор лежит в пределах величины клеток микроорганизмов.

Недостатком данного препарата является то, что он не предназначен для использования в качестве медицинского или ветеринарного препарата в связи с отсутствием данных о влиянии сталактитового носителя с нанесенными на нем микроорганизмами на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта организма человека или животного.

Известен комплексный фармацевтический препарат, включающий фармацевтически приемлемый носитель и иммобилизованные на нем микроорганизмы (межд. заявка (WO) №91/09608, МКИ А61К 35/74, опубл. 11.07.91 г.). Носитель не нарушает жизнеспособности микроорганизмов. В качестве микроорганизмов используют штамм L1a Streptococcus lactis. Препарат предназначен для борьбы с патогенной микрофлорой кишечника человека и животных, вызывающей диарею и другие желудочно-кишечные расстройства.

Недостатком препарата является то, что используемый в нем штамм L1a Streptococcus lactis влияет в основном на патогенную микрофлору кишечника человека и животных, т.е. проявляет антагонистические свойства, но слабо участвует в восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Кроме того, отсутствуют данные об антацидных свойствах носителя, что свидетельствует о слабой защите носителем иммобилизованных клеток Streptococcus lactis при действии внутренней среды организма с низкими значениями рН.

Известен комплексный бактериальный препарат, включающий носитель и иммобилизованные на нем микробные клетки в концентрации на 1 мм² 2,1×10³-1,0×10⁵ (патент РФ №2017486, МПК⁶ А61К 31/00, опубл. 15.08.94 г.). В качестве носителя используют активированный уголь в виде порошка с размером частиц менее 30 мкм, а в качестве микроорганизмов используют лактобактерии и кишечные палочки.

Недостатком такого препарата является то, что активированный уголь, используемый в качестве носителя, является тонкопористым сорбентом с преобладанием микропор и высокой удельной поверхностью. Вследствие этого микробные клетки расположены на поверхности частиц сорбента и недостаточно защищены при неблагоприятном воздействии окружающей среды. Активированные угли активно поглощают низкомолекулярные биологически активные вещества, витамины и газы кишечника, что ухудшает работу перистальтики. Они быстро забиваются и работают преимущественно в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. Кроме того, угли не обладают антацидными свойствами, что не способствует выживаемости нанесенных на них клеток при действии сред с низкими значениями рН. Препарат не предусматривает использование одновременно нескольких штаммов микроорганизмов разных видов, например смеси бифидо- и лактобактерии, что значительно снижает эффективность действия препарата особенно при восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Известен препарат-пробиотик в иммобилизованной форме, включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки эубиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток при следующем количественном соотношении компонентов препарата, мас. %: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸-10⁸ КОЕ/мл - 1,0-50,0; носитель-сорбент - остальное до 100%.

В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ, модифицированный кремнийорганическим полимером. В качестве эубиотиков используют бифидо- или лактобактерии или их смесь (патент РФ №2118535, МПК⁶ А61К 35/74, опубл. 10.09.98 г.).

Однако используемые в указанном препарате сорбенты обладают недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков, а также имеет низкую колонизационную активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков.

Известен способ получения комплексного препарата бактерий-эубиотиков (патент РФ №2067114, МПК А61К 35/74, опубл. 27.09.96 г.), включающий выращивание в условиях глубинного культивирования культуры штаммов бифидобактерий и стрептококка, смешивание биомассы с защитной средой следующего состава (мас.%): сахароза 25-30; желатин 2-3; сухое молоко 3-5; глутамат натрия 0,5-1 и контактно-сорбционное обезвоживание целевого продукта, которое проводят охлажденным до минус 8-10°С сорбентом, например окисью алюминия, с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении 1:10-12, соответственно, а досушивание осуществляют в течение 18-20 часов при температуре 0-5°С в замкнутом объеме.

Однако используемый в указанном способе сорбент обладает недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков, а также имеет низкую колонизационную активность бактерий-эубиотиков.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме (патент РФ №2164801, МПК А61К 35/74, опубл. 10.04.01). Препарат включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток, согласно изобретению препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки пробиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г и содержанием аминокислот (мг/100 г сухой биомассы): глутаминовая кислота - 15,0-68,0; глутамин - 8,0-20,0; лейцин - 10,0-50,0; аргинин - 20,0-30,0; цистеин - 50,0-80,0 при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде мас.%: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г - 0,1-10,0; защитная среда - 0,1-10,0; носитель-сорбент - остальное до 100%. В качестве защитной среды используют желатин, сахарозу, аскорбиновую кислоту и хлористый натрий при следующем содержании компонентов, мас.%: желатин - 8,5-11,5; аскорбиновая кислота - 0,8-1,2; хлористый натрий - 1,7-3,0; сахароза - остальное до 100%. В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом. Препарат в качестве бактерий-пробиотиков дополнительно содержит сухую закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа АВ, соотношение которых с сухим концентратом бифидобактерий составляет 1:(8-9) соответственно. В качестве бифидобактерий в сухом концентрате используют бактерии Bifidum bifidum №1, или №791, или ЛВА-3, или Bifidobacterium longum 379, или Bifidobacterium adolescentis MC-42, или смесь бактериальных клеток указанных штаммов, взятых в равных весовых долях.

Наиболее близким способом (прототипом) является способ получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной и лиофилизированной форме, приведенный в описании к патенту РФ №2164801, МПК А61К 35/74, опубл. 10.04.01, включающий отмывку и стерилизацию пористого энтеросорбента СУМС-1, модифицированного углеродом, и его охлаждение до комнатной температуры, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси в течение не менее 1 часа при перемешивании и температуре +4°С до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент, отмывку полученного комплексного препарата в изотоническом солевом растворе с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой.

Однако используемые в указанном препарате и способе его получения сорбенты также обладают недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков. Кроме того, наблюдается низкая колонизационная активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков.

Техническим результатом заявляемых технических решений является создание такого комплексного препарата-пробиотика со способом его получения, который обеспечивал бы более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом СУМС-1, определяющей его клиническую эффективность, и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков.

Указанный технический результат достигается тем, что в комплексном препарате-пробиотике в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающем носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, модифицированный углеродом с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованными на указанном носителе-энтеросорбенте, согласно изобретению клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла в соответствии со способом по п.п.5 и 6 формулы изобретения при следующем соотношении компонентов препарата в лиофилизированном виде, мас.%:

клетки с питательной средой консорциума бифидо-,
или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь
с титром 108-1010 КОЕ/г	1,0-10,0
защитная среда	0,1-10,0
энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный
раствором соли металла	остальное до 100%.

Препарат с содержанием микробной биомассы менее 0,1 мас.% имеет низкий биотитр с преобладанием прочно связанных с сорбентом клеток, т.е. действует преимущественно как энтеросорбент. Количество микробных клеток, вводимых в препарат, не превышает 15 мас.%, вследствие чего вся биомасса бактерий препарата находится в защищенном состоянии. При этом энтеросорбент СУМС-1 в препарате сохраняет основные свои свойства, обеспечивающие связывание и выведение из кишечника токсинов, продуктов незавершенного метаболизма и патогенных микроорганизмов.

В качестве консорциума бифидобактерий он содержит штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13 и Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1.

В качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei С6 в соотношении 4:1,0:1,0.

Смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающем отмывку и стерилизацию пористого энтеросорбента СУМС-1, модифицированного углеродом, и его охлаждение до комнатной температуры, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси в течение не менее 1 часа при перемешивании и температуре не выше +4°С до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент, отмывку полученного комплексного препарата в изотоническом солевом растворе с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой, согласно изобретению перед стерилизацией энтеросорбент СУМС-1 обрабатывают раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1 и отмывают от реагента 2-3-кратным объемом дистиллированной воды, а в качестве бактерий-эубиотиков используют концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г.

В качестве раствора соли металла используют 3%-ный раствор сульфата магния.

В качестве консорциума бифидобактерий используют штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13, Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1, а в качестве консорциума лактобактерий используют штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75 и Lactobacillus casei С6 в соотношении 4:1,0:1,0. Смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.

Штамм бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5799. Штамм Bifidobacterium longum ДВА-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5894. Штамм Bifidobacterium adolescentis ГО-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 2944.

Штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863. Штамм Lactobacillus plantarum П-75 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962. Штамм Lactobacillus casei С6 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5724.

Введение в препарат сухой микробной биомассы с биотитром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г обеспечивает ему оптимальную биологическую активность. Если исходная микробная биомасса имеет титр меньше 10⁸ КОЕ/г, то препарат обладает недостаточной биологической активностью и при введении в желудочно-кишечный тракт проявляет слабый лечебно-профилактический эффект. Титр сухой микробной биомассы более 10¹⁰ КОЕ/мл значительно увеличивает стоимость препарата без значительного увеличения лечебно-профилактического эффекта.

Основу жидкой бактериальной суспензии для сушки составляют клетки-эубиотики в молочной питательной среде с повышенным титром клеток (10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл) - жидкий концентрат бифидобактерий. Молочная питательная среда с клетками-эубиотиками содержит повышенное количество белка (не менее 12% СОМ - сухого остатка молока). Это позволяет увеличить антибиотические свойства бактерий-пробиотиков в препарате. Кроме того, повышенное количество белка увеличивает антацидные свойства препарата. Высокая концентрация клеток в жидкой бактериальной суспензии позволяет их использовать в препарате в сухом виде в концентрации 1,0-10,0% с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/мл.

Носитель-сорбент представляет собой механически прочные частицы порошка, или гранулы, или таблетки, выполненные из оксида алюминия, поверхность которых модифицирована углеродом при получении сорбента типа СУМС-1 черного цвета. Сорбенты имеют удельную поверхность до 300 м²/г и развитую структуру мезо- и макропор. Размеры макропор сорбента соизмеримы с размерами микробных клеток, что позволяет заполнять макропоры указанными клетками. Регулированием процентного содержания углерода в сорбенте с последующими окислительно-восстановительными его обработками обеспечивается получение носителя с заданными гидрофильно-гидрофобными и другими топохимическими характеристиками. Сорбенты типа СУМС-1 в меньшей степени, чем другие аналогичные материалы, извлекают витамины и гормоны из организма и не нарушают перистальтику, что делает возможным их применение длительными курсами. Наличие в сорбенте оксида алюминия придает его поверхности определенные буферные антацидные свойства, что способствует лучшему сохранению активности и выживанию иммобилизованных на нем микробных клеток, например, при прохождении препарата через желудок (устраняет отрицательное влияние желудочного сока на микробные клетки) или при других неблагоприятных условиях (низких рН).

Макропористая структура носителя-сорбента, ячейки которого заполнены микробными клетками, также способствует защите этих иммобилизованных клеток от инактивирующих факторов внешней среды. Причем микробные клетки, находящиеся в порах, и клетки, находящиеся близко к внешней поверхности носителя-сорбента, отличаются по своим десорбционным способностям, и такая неоднородность свойств клеток обеспечивает пролонгированное действие препарата и способствует колонизации не только верхних, но и нижних отделов кишечника. Пористый носитель, являясь энтеросорбентом, снимает эффекты местного (а через него и общего) токсикоза, что способствует выживаемости бактерий препарата и микрофлоры кишечника, а также снижает нагрузку на органы детоксикации человека или животного. Кроме того, при использовании в препарате в качестве микробных клеток консорциума бифидобактерий, или консорциума лактобактерий, или смеси консорциумов бифидо- и лактобактерий обеспечивается не только вытеснение из желудочно-кишечного тракта патогенных микроорганизмов (за счет антагонистических свойств указанных бактерий), но и восстановление сильно сокращенной микрофлоры кишечника при дисбактериозе и других заболеваниях.

Ниже приведены примеры составов предлагаемого комплексного препарата бактерий-эубиотиков в иммобилизованной и лиофилизированной форме.

Пример 1. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):

клетки с питательной средой консорциума лактобактерий
с титром 1010 КОЕ/г	1,0
защитная среда, в том числе:
желатин	0,085
аскорбиновая кислота	0,008
хлористый натрий	0,017
сахароза	0,89
энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный
3%-ным раствором сульфата магния	остальное до 100%.

Пример 2. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):

клетки с питательной средой консорциума бифидобактерий
с титром 109 КОЕ/г	7,0
защитная среда, в том числе:
желатин	0,85
аскорбиновая кислота	0,08
хлористый натрий	0,17
сахароза	8,9
энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный
3%-ным раствором сульфата магния	остальное до 100%.

Пример 3. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):

клетки с питательной средой и
титром 108 КОЕ/г смеси консорциумов
бифидо- и лактобактерий в
соотношении 1:1	10,0
защитная среда, в том числе:
желатин	0,575
аскорбиновая кислота	0,06
хлористый натрий	0,15
сахароза	4,215
энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный
3%-ным раствором сульфата магния	остальное до 100%.

Пример 4. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):

клетки с питательной средой и титром 109 КОЕ/г
смеси консорциумов бифидо- и лактобактерий в
соотношении 3:1	5,0
защитная среда, в том числе:
желатин	0,85
аскорбиновая кислота	0,08
хлористый натрий	0,17
сахароза	8,9
энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный
3%-ным раствором сульфата магния	остальное до 100%.

Пример 5. Технология получения готовых форм препарата "Экофлор".

По специальной технологии готовят исходные сорбенты типа СУМС-1 (патент РФ №2026733), в котором оксид алюминия модифицирован углеродом, с требуемой пористой структурой, химической природой поверхности и размером частиц или гранул. Далее мерное количество энтеросорбента СУМС-1 засыпают в цилиндрическую емкость, заливают дистиллированной водой в объемном соотношении 1:1 и тщательно перемешивают. Отмывают не менее 3-х раз дистиллированной водой до полного исчезновения угольной пленки и взвеси. Далее энтеросорбент СУМС-1 обрабатывают раствором соли металла, а именно 3%-ным раствором сульфата магния в объемном соотношении 1:1. Отмывают от сульфат-ионов 2-3-кратным объемом дистиллированной воды. После обработки энтеросорбента СУМС-1 3%-ным раствором сульфата магния эффективность его биосорбции увеличивается в 1,4 раза, а эффективность биодесорбции, определяющая клинический эффект от действия препарата, равна 1.

Стерилизацию СУМС-1 ведут сухим жаром в сушильном шкафу россыпью слоем не более 1,5-2,0 см при температуре (160±2)°С в течение 2 часов. Контроль стерильности СУМС-1 определяют микробиологически. Контроль процесса стерилизации СУМС-1 осуществляют с помощью химических тестов.

Процесс иммобилизации СУМС-1 проводят в асептических условиях. Для иммобилизации берут равные по объему (1:1) количества энтеросорбента СУМС-1 и культуры консорциумов микроорганизмов. Для иммобилизации используют консорциум бифидобактерий (с титром не менее 10¹⁰ КОЕ/мл), или консорциум лактобактерий (с титром не менее 10⁸ КОЕ/мл), или их смесь в объемном соотношении 9:1 соответственно в соответствии с примерами 1-3. Биомассу бактерий приготавливают на молочной питательной среде, содержащей повышенное количество белка (не менее 12% СОМ - сухого остатка молока) по стандартной технологии.

Смесь энтеросорбента СУМС-1 с клетками бактерий-эубиотиков тщательно перемешивают в течение 5 мин и помещают на шейкер на 1 час при интенсивности 100 колебаний в минуту при температуре 6±2°С. Процесс иммобилизации возможно вести в стеклянной посуде на роллерной установке. Для определения качества иммобилизации из исходного титра бифидобактерий и лактобактерий в концентрате бифидо- и лактобактерий вычитают полученный результат биотитрования. Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.

Далее продукт однократно промывают в изотоническом растворе NaCl. Мутный раствор стерильно сливают, отбирают пробы и проводят контроль полноты процесса иммобилизации по МУК 4.2.577-96 (Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", п.7.1 и п.7.10). Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.

Отмытый продукт замораживают в низкотемпературном холодильнике типа "Кельвинатор" при температуре минус (40-45)°С в течение (24-48) часов. Кассеты с предварительно замороженным препаратом перегружают в сушильную камеру при достижении температуры плит минус (20-30)°С и камеру вакуумируют. Готовый препарат "Экофлор" в сухой иммобилизованной форме фасуют во флаконы и герметично закрывают пробками. Массовая доля влаги составляет не более 3,0 мас.%.

В таблице 1 приведены адсорбционные емкости СУМС-1 после модификации поверхности (измерялась по адсорбции метиленового синего согласно ФС 42-3283-96).

Таблица 1 Данные по адсорбционной емкости энтеросорбента СУМС-1 после обработки солями металлов
№ п/п	Наименование солей	Адсорбционная емкость	рН сорбента
1	СУМС-1 чистый	0,017±0.002 г	8,2
2	СУМС-1+AlCl3 (0,36%)	0,018±0.002 г	6,1
3	СУМС-1+AlCl3 (0,75%)	0,018±0.002 г	5,8
4	СУМС-1+AlCl3 (3%)	0,012±0.001 г	3,26
5	СУМС-1+MgSO4 (1%)	0,017±0.001 г	6,7
6	СУМС-1+MgSO4·6Н2O (3%)	0,024±0.002 г	6,5
7	СУМС-1+MgSO4·6Н2О (5%)	0,027±0.003 г	6,3
8	СУМС-1+MgCl2 (1%)	0,015±0.002 г	6,5
9	СУМС-1+MgCl2 (3%)	0,018±0.002 г	6,6
10	СУМС-1+NiCl2 (3%)	0,016±0.002 г	5,9
11	СУМС-1+ZnCl2 (3%)	0,019±0.001 г	5,5

Обработанная поверхность СУМС-1 оценивалась в биологических тестах по:

1) эффективности биосорбции (отношение количества сорбированных клеток к общему количеству бактерий в исходной суспензии),

2) эффекивности биодесорбции (отношение количества бактерий, десорбированных с поверхности СУМС-1, к количеству сорбированных бактерий).

Эффективность биодесорбции является важным показателем, во многом определяющим клиническую эффективность ИКЭ. Результаты биологических тестов приведены в табл. 2.

Таблица 2 Данные биологического тестирования энтеросорбента СУМС после обработки солями металлов
Модификация поверхности	Эффектив. десорбции LgT4/LgT3	Эффектив. сорбции LgT1/LgT3	Исходный титр Т1 (КОЕ/мл)	Сорбция Т3=(Т1-Т2)			Десорбция Т4
				T3	Т2
Иммобилизация консорциума бифидобактерий
AlCl3 - 0,01%	0,8714	1,001	1·1010	4·108		9,6·109	5·108
AlCl3 - 0,36%	0,8781	1,0004	1·1010	7·107		9,93·109	6·108
AlCl3 - 0,75%	0,9009	1,000	1·1010	1·108		9,99·109	1·109
MgSO4·6Н2O - 3%	1,0000	1,015	1·1010	3·109		7·109	7·109
MgSO4·6Н2О - 3%	0,9344	1,004	1·1010	1·109		9·109	2·109
Иммобилизация смеси консорциумом бифидо- и лактобактерий
MgSO4·6Н2O - 3%	0,9068	1,007	1·1010	1,6·109		8,4·109	1·109
Иммобилизация консорциума лактобактерий
MgSO4·6Н2O - 3%	0,7839	1,005	6·108	6·107		5,4·108	7·106
Примечание: Т1 (КОЕ/мл) - исходный титр биомассы бактерий; Т2 (КОЕ/мл) - титр биомассы бактерий, оставшейся после иммобилизации на энтеросорбент;

Т3=Т1-T2 - титр (КОЕ/мл) бактериальных клеток, иммобилизованных на сорбенте; Т4 - титр (КОЕ/мл) бактериальных клеток после десорбции, определяющий клинический эффект от действия препарата

Таким образом, по результатам исследований обработанной поверхности СУМС-1 солями металлов вариант №6 (табл.1) обработки MgSO₄·6H₂О (3%) является наиболее оптимальным. После обработки энтеросорбента СУМС-1 3%-ным раствором сульфата магния эффективность его биосорбции увеличивается в 1,4 раза (отношение сорбированных клеток к общему количеству бактерий в исходной суспензии), а эффективность биодесорбции, определяющая клинический эффект от действия комплексного препарата (отношение количества бактерий, десорбированных с поверхности СУМС-1 к количеству сорбированных на нем бактерий), равна 1, что показывает о том, что практически все бактерии могут десорбироваться в желудочно-кишечном тракте.

Результаты доклинических исследований

Проведенные исследования подтвердили, что комплексный препарат «Экофлор» нетоксичен для лабораторных животных, восстанавливает нормобиоценоз кишечника, элиминирует условно-патогенную и патогенную микрофлору, не вызывает побочных и непредвиденных нежелательных реакций, стимулирует процессы адаптации организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Основные результаты исследования:

1) морфометрические показатели животных в экспериментальных группах нарастали в соответствии с популяционным стандартом;

2) лабораторные анализы крови оставались в пределах физиологической нормы;

3) гистологические исследования органов показали отсутствие токсического воздействия;

4) подтверждено отсутствие повреждающего действия на структуру кишечного эпителия со стороны препарата;

5) патолого-анатомическое вскрытие подтвердило состояние органов в норме. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комплексный препарат «Экофлор» успешно прошел доклинические испытания.

Результаты клинических исследований комплексного препарата «ЭКОФЛОР»

Все пациенты (45 человек - экспериментальная группа и 25 человек - группа сравнения) имели хроническую патологию: атопический дерматит - в 44,4% случаев; острый аллергоз - в 11,1% случаев; вторичный хронический пиелонефрит - в 22,2% случаев; сахарный диабет - в 11,1% случаев; бронхиальная астма - в 11,1% случаев.

После проведенного экспериментального курса лечения комплексным препаратом «Экофлор» были получены следующие результаты:

1) препарат «Экофлор» способствует уменьшению абдоминального болевого синдрома, проявлений диспепсического синдрома, нормализации моторной функции кишечника, регрессу кожных высыпаний;

2) применение «Экофлора» способствует уменьшению субъективных клинических (недомогание, слабость, нарушение аппетита) и объективных лабораторных критериев (нормализация лейкоцитарного индекса интоксикации и гематологического показателя интоксикации, купирование синдрома цитолиза и нормализация общего белка сыворотки крови, а также уменьшение выраженности мочевого синдрома), отражающих синдром эндогенной интоксикации;

3) при использовании препарата «Экофлор» в 62,2% наблюдается полное восстановление функций переваривания и всасывания в кишечнике, у остальных больных - тенденция к нормализации показателей;

4) препарат «Эклофлор» способствует восстановлению кишечной микрофлоры: кишечной палочки, бифидофлоры; снижению кокковых форм, кишечной палочки со слабо выраженными ферментными свойствами, лактозонегативных энтеробактерий;

5) при приеме препарата не выявлены побочные эффекты и осложнения.

Таким образом, препарат успешно прошел клинические испытания, является безвредным и высокоэффективным средством в отношении восстановления нормобиоценоза кишечника и купирования синдрома эндогенной интоксикации.

Claims (9)

1. Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающий носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, модифицированный углеродом с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованные на указанном энтеросорбенте, отличающийся тем, что клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%:

клетки с питательной средой консорциума бифидо-,   или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь   с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г 1,0-10,0 защитная среда 0,1-10,0 энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный   раствором соли металла остальное

2. Комплексный препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве консорциума бифидобактерий он содержит штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13 и Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1.

3. Комплексный препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei Сб в соотношении 4:1,0:1,0.

4. Комплексный препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.

5. Способ получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающий отмывку и стерилизацию пористого энтеросорбента СУМС-1, модифицированного углеродом, и его охлаждение до комнатной температуры, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси в течение не менее 1 часа при перемешивании и температуре не выше +4°С до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент, отмывку полученного комплексного препарата в изотоническом солевом растворе с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой, отличающийся тем, что перед стерилизацией энтеросорбент СУМС-1 обрабатывают раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1 и отмывают от реагента 2-3 кратным объемом дистиллированной воды, а в качестве бактерий-эубиотиков используют концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве раствора соли металла используют 3%-ный раствор сульфата магния.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве консорциума бифидобактерий используют штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13, Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве консорциума лактобактерий используют штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75 и Lactobacillus casei Сб в соотношении 4:1,0:1,0.

9. Способ по п.5, отличающийся тем, что смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.