RU2300384C2 - Substance possessing anti-inflammatory, immunomodulating and wound-healing activity - Google Patents
Substance possessing anti-inflammatory, immunomodulating and wound-healing activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2300384C2 RU2300384C2 RU2005102259/15A RU2005102259A RU2300384C2 RU 2300384 C2 RU2300384 C2 RU 2300384C2 RU 2005102259/15 A RU2005102259/15 A RU 2005102259/15A RU 2005102259 A RU2005102259 A RU 2005102259A RU 2300384 C2 RU2300384 C2 RU 2300384C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substance
- adp
- inflammatory
- wound
- supernatants
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 21
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 3
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 9
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000707 layer-by-layer assembly Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N nitrofural Chemical compound NC(=O)N\N=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к фармации и биотехнологии, и может быть использовано для получения лекарственных средств с противовоспалительным, иммуномодулирующим и ранозаживляющим свойствами на основе культур клеток.The invention relates to medicine, namely to pharmacy and biotechnology, and can be used to obtain drugs with anti-inflammatory, immunomodulating and wound healing properties based on cell cultures.
Известен способ получения аллотрансплантата для восстановления кожных покровов путем выращивания и последующего использования культуры аллогенных диплоидных эмбриональных фибробластов (RU 2023424). В данном методе используется культура аллогенных диплоидных фибробластов, получаемая из дермы в постнатальном периоде или из эмбрионов и плодов человека. Доказана высокая эффективность клинического применения указанного способа для лечения ожоговых ран в качестве самостоятельной терапии и для подготовки ран к аутодермопластике (А.А.Алексеев, А.Ю.Яшин. Комбинированная аутодермопластика с трансплантацией культивированных фибробластов при обширных глубоких ожогах: клинические результаты и перспективы // Междунар. симп. «Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи» (30-31 мая 1996 г., г.Тула). - Тула, 1996. - С.1-3; Алексеев, А.А. Современные методы лечения ожогов и ожоговой болезни / А.А.Алексеев // Комбустиология (электронный журнал). - 2000. - №1; 60. Туманов В.П. Морфологический анализ клеточного состава ожоговой раны при трансплантации культивированных аллофибробластов // II Междунар. симп. «Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи» (май 1998 г., г.Саратов). Саратов: Сарат. ун-т, 1998. - С.40-42).A known method of producing an allograft for restoration of the skin by growing and subsequent use of a culture of allogeneic diploid embryonic fibroblasts (RU 2023424). This method uses a culture of allogeneic diploid fibroblasts obtained from the dermis in the postnatal period or from human embryos and fetuses. The clinical application of this method for the treatment of burn wounds as an independent therapy and for preparing wounds for autodermoplasty has been proved to be highly effective (A.A. Alekseev, A.Yu. Yashin. Combined autodermoplasty with transplantation of cultured fibroblasts with extensive deep burns: clinical results and prospects / / International symposium “New methods of treating burns using cultured skin cells” (May 30-31, 1996, Tula). - Tula, 1996. - P.1-3; Alekseev, A.A. Modern methods burn and burn treatment diseases / A.A. Alekseev // Combustiology (electronic journal). - 2000. - No. 1; 60. Tumanov VP Morphological analysis of the cellular composition of a burn wound during transplantation of cultured allofibroblasts // II International Symptom “New Methods of Treatment burns using cultured skin cells "(May 1998, Saratov). Saratov: Sarat. un-t, 1998. - P.40-42).
Наиболее близким является решение по использованию в качестве действующего вещества лекарственного средства «Культура клеток диплоидных человека для заместительной терапии» (ФСП 42-0393252302, Регистрационное удостоверение Р №001402/01-2002 от 23.05.2002 г.), которое получают путем механической и ферментативной дезагрегации фрагментов эмбриона человека.The closest is the decision to use the drug "Culture of human diploid cells for substitution therapy" as the active substance (FSP 42-0393252302, Registration Certificate P No. 001402 / 01-2002 of 05.23.2002), which is obtained by mechanical and enzymatic disaggregation of fragments of a human embryo.
Однако использование трансплантации АДФ в целом и вышеуказанного лекарственного средства, в частности, требует для своего применения определенных условий со стороны участка повреждения, а именно санации раны от бактериальной флоры, купирования активного воспалительного процесса (Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении кожных покровов / Д.С.Саркисов, В.Д.Федоров, Е.В.Глущенко и др. // Вести. Рос. АН. - 1994. - №6. - С.6-11). Кроме того, получение достаточного для закрытия обширного участка повреждения количества фибробластов связано со значительными финансовыми затратами, требует дополнительного использования подложек для выращивания клеток, соответствующих определенным требованиям, предъявляемым к биологическим покрытиям, и при этом нетоксичных для клеток и выдерживающих ферментативное воздействие среды в процессе культивирования. Еще одним фактором, ограничивающим возможность использования АДФ и «Культуры клеток диплоидных человека для заместительной терапии», является невозможность их длительного хранения и жесткие ограничения по условиям транспортировки.However, the use of ADP transplantation in general and the aforementioned medicinal product, in particular, requires for its application certain conditions on the part of the damage site, namely, debridement of the wound from the bacterial flora, relief of the active inflammatory process (Theoretical and practical aspects of the use of cultured fibroblasts for restoration of the skin / D.S. Sarkisov, V.D. Fedorov, E.V. Glushchenko and others // News. Ros. AN. - 1994. - No. 6. - P.6-11). In addition, obtaining sufficient fibroblasts to cover a large area of damage is associated with significant financial costs, requires the additional use of substrates for growing cells that meet certain requirements for biological coatings, and are non-toxic to cells and can withstand the enzymatic effect of the medium during cultivation. Another factor limiting the possibility of using ADP and “Culture of human diploid cells for replacement therapy” is the impossibility of their long-term storage and severe restrictions on the conditions of transportation.
В связи с этим задачей изобретения является получение нового биологически активного вещества, содержащего комплекс гуморальных факторов АДФ, для создания на его основе лекарственных средств, а также разработка способа его получения. Вещество должно обладать противовоспалительными, иммуномодулирующими и ранозаживляющими свойствами, иметь меньше ограничений в применении, в условиях хранения и транспортировки и быть дешевле в получении по сравнению с клеточной культурой.In this regard, the objective of the invention is to obtain a new biologically active substance containing a complex of humoral factors ADP, to create drugs based on it, as well as the development of a method for its production. The substance must have anti-inflammatory, immunomodulatory and wound healing properties, have fewer restrictions on use, in storage and transportation, and be cheaper to obtain in comparison with cell culture.
Поставленная задача достигается использованием в качестве указанного вещества супернатанта культуры АДФ, представляющего собой кондиционированную ими среду культивирования. Для получения культуры АДФ используется способ бесферментативной дезагрегации фрагментов донорских тканей.The problem is achieved by using as the specified substance the supernatant of the ADP culture, which is a culture medium conditioned by them. To obtain an ADP culture, a method of enzyme-free disaggregation of donor tissue fragments is used.
Изобретение поясняется следующими таблицами и фигурами:The invention is illustrated by the following tables and figures:
- на табл.1 - показатели функциональной активности нейтрофилов in vitro;- in table 1 - indicators of the functional activity of neutrophils in vitro;
- на табл.2 - показатели продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови здоровых доноров медиана, 1-й и 3-й квартили;- in table 2 - indicators of cytokine production by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors, median, 1st and 3rd quartiles;
- на фиг.1 - влияние супернатантов АДФ на адгезию нейтрофилов к пластику;- figure 1 - the effect of ADP supernatants on the adhesion of neutrophils to plastic;
- на фиг.2 - влияние супернатантов АДФ на активность миелопероксидазы нейтрофилов in vitro;- figure 2 - the influence of ADP supernatants on the activity of myeloperoxidase neutrophils in vitro;
- на фиг.3 - влияние супернатантов АДФ на активность кислой фосфатазы нейтрофилов in vitro;- figure 3 - the effect of ADP supernatants on the activity of acid phosphatase neutrophils in vitro;
- на фиг.4 - влияние супернатантов АДФ на показатели НСТ-теста нейтрофилов in vitro;- figure 4 - the effect of ADP supernatants on the performance of the HCT test of neutrophils in vitro;
- на фиг.5 - влияние супернатантов АДФ на спонтанную продукцию ФНО-α мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;- figure 5 - the effect of ADP supernatants on the spontaneous production of TNF-α by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors;
- на фиг.6 - влияние супернатантов АДФ на ЛПС-стимулированную продукцию ФНО-α мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;- Fig.6 - the effect of ADP supernatants on LPS-stimulated production of TNF-α by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors;
- на фиг.7 - влияние супернатантов АДФ на спонтанную продукцию ИЛ-1β мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;- Fig.7 - the effect of ADP supernatants on the spontaneous production of IL-1β by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors;
- на фиг.8 - влияние супернатантов АДФ на ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-1β мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;- Fig. 8 shows the effect of ADP supernatants on LPS-stimulated production of IL-1β by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors;
- на фиг.9 - влияние супернатантов АДФ на спонтанную продукцию раИЛ-1 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров;- figure 9 - the effect of ADP supernatants on the spontaneous production of RAIL-1 by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors;
- на фиг.10 - влияние супернатантов АДФ на ЛПС-стимулированную продукцию раИЛ-1 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров.- figure 10 - the effect of ADP supernatants on LPS-stimulated production of RAIL-1 by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors.
На всех фигурах и во всех таблицах: *1 - р<0,05 по сравнению с контролем. Для статобработки использовали дисперсионный анализ и критерий Ньюмена-Кейлса.In all figures and in all tables: * 1 - p <0.05 compared with the control. For statistical processing, analysis of variance and Newman-Cales test were used.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Перевиваемые линии АДФ получали оригинальным бесферментативным методом, отличающимся от общепринятого отказом от использования протеолитических ферментов (трипсин, коллагеназа, террилитин и др.). Кусочки тканей (абортный материал, кусочки дермы, костный мозг, легких) подвергали механической дезагрегации до фрагментов размером 0,1-0,2 мм3, добавляли питательную среду 199, дополненную 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, - для эмбриональных и фетальных тканей, или питательную среду RPMI 1640, дополненную 20% сыворотки эмбрионов коров, - для постнатального материала. Фрагменты тканей ресуспендировали в указанной среде, вносили в культуральные пластиковые флаконы и культивировали во влажной атмосфере с 5% СО2. В течение 1-3 суток происходила миграция фибробластов из тканевых фрагментов и прикрепление к дну культуральных флаконов. После этого фрагменты тканей со средой из флаконов удаляли, а к прикрепленным клетками добавляли свежую среду, соответствующую степени зрелости их источника. После формирования на дне культуральных флаконов монослоя АДФ отработанную питательную среду удаляли, к клеткам добавляли бессывороточную среду 199 и вновь культивировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Через сутки кондиционированную АДФ среду сливали и проверяли в последующих экспериментах на биологическую активность, а клеточный монослой пересевали на новые флаконы со сменой среды и контролем бактериологической чистоты и кариотипа клеток.The transferred ADP lines were obtained by the original non-enzymatic method, which differs from the generally accepted refusal to use proteolytic enzymes (trypsin, collagenase, terrilithin, etc.). Pieces of tissue (abortion material, pieces of dermis, bone marrow, lungs) were mechanically disaggregated to fragments of 0.1-0.2 mm 3 , culture medium 199 supplemented with 10% blood serum of cattle was added, for embryonic and fetal tissues , or RPMI 1640 growth medium supplemented with 20% serum of cow embryos, for postnatal material. Tissue fragments were resuspended in this medium, introduced into culture plastic bottles and cultured in a humid atmosphere with 5% CO 2 . Within 1-3 days, fibroblasts migrated from tissue fragments and culture bottles were attached to the bottom. After that, tissue fragments with medium from the vials were removed, and fresh medium corresponding to the degree of maturity of their source was added to the attached cells. After the formation of the ADP monolayer at the bottom of the culture flasks, the spent nutrient medium was removed, serum-free medium 199 was added to the cells and re-cultured for 24 hours under standard conditions. After a day, the conditioned ADP medium was poured and checked in subsequent experiments for biological activity, and the cell monolayer was subcultured into new vials with a change of medium and control of bacteriological purity and cell karyotype.
Предлагаемый способ бесферментативного получения культур клеток позволяет обеспечить минимальное повреждение клеток и снизить экономические затраты на начальном этапе.The proposed method of non-enzymatic production of cell cultures allows for minimal damage to cells and reduce economic costs at the initial stage.
Биологическая активность вещества иллюстрирована в нижеприведенных экспериментах.The biological activity of the substance is illustrated in the experiments below.
Пример 1. Влияние супернатантов АДФ на функциональную активность Нф периферической крови здоровых доноров in vitro.Example 1. The effect of ADP supernatants on the functional activity of Nf peripheral blood of healthy donors in vitro.
В качестве супернатантов использовали кондиционированную в течение 24 ч эмбриональными (СЭФ) или зрелыми легочными (СЗФЛ) фибробластами среду 199. МНК и нейтрофилы (Нф) получали из венозной крови здоровых добровольцев общепринятым методом выделения на двойном градиенте плотности фиколл-гипак 1,077 и 1,114. После отмывки Нф ресуспендировали в бессывороточной среде 199 и вносили в лунки 96-луночного планшета в конечной концентрации 2×105/лунку. К МНК добавляли суточный СЭФ и СЗФЛ в конечной концентрации 25%, в контрольные лунки добавляли аналогичный объем бессывороточной среды 199. Клетки инкубировали в течение 2 ч в термостате при +37°С, по окончании инкубации трижды отмывали от неприкрепившихся клеток подогретым до +37°С фосфатно-солевым буфером. Дальнейшие эксперименты проводили по методикам, описанным Р.М.Хаитовым и соавт. (Экологическая иммунология / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов. - М.: ВНИРО, 1995. - 219 с.).Medium 199, conditioned for 24 hours, was used as supernatants for embryonic (SEF) or mature pulmonary (NPL) fibroblasts for 24 h. MNCs and neutrophils (NFs) were obtained from the venous blood of healthy volunteers by the conventional method of isolating ficoll-hypak 1.077 and 1.114 on a double density gradient. After washing, Nf was resuspended in 199 serum-free medium and added to the wells of a 96-well plate at a final concentration of 2 × 10 5 / well. The daily SEF and NWFL at a final concentration of 25% were added to the MNCs, a similar volume of serum-free medium 199 was added to the control wells. Cells were incubated for 2 hours in an incubator at + 37 ° C; after incubation, they were washed three times from non-adherent cells heated to + 37 ° With phosphate buffered saline. Further experiments were carried out according to the methods described by R.M.Khaitov et al. (Ecological immunology / R.M. Khaitov, B.V. Pinegin, H.I. Istamov. - M.: VNIRO, 1995. - 219 p.).
Показатели активности нейтрофилов представлены в табл. 1 и на фиг.1-4.Indicators of neutrophil activity are presented in table. 1 and 1 to 4.
Пример 2. Влияние супернатантов АДФ на продукцию ФНО-α и ИЛ-1β мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови здоровых доноров in vitro.Example 2. The effect of ADP supernatants on the production of TNF-α and IL-1β by mononuclear cells (MNCs) of peripheral blood of healthy donors in vitro.
После отмывки МНК ресуспендировали в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и вносили в лунки 24-луночного планшета в конечной концентрации 1×106/лунку. К МНК добавляли суточный СЭФ и СЗФЛ в конечной концентрации 25%, в контрольные лунки добавляли аналогичный объем бессывороточной среды 199. В часть лунок вносили ЛПС в концентрации 10 мкг/лунку. Клетки инкубировали в течение суток в СО2-инкубаторе и по окончании инкубации оценивали концентрацию ФНОα и ИЛ-1β в твердофазном ИФА с использованием тест-систем фирмы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Россия). Полученные результаты представлены в табл.1 и на фиг.1-4. Как видно из фиг.5 и 6 и табл.2, СЭФ и СЗФЛ статистически значимо стимулируют спонтанную продукцию ФНО-α, однако данный эффект не имеет клинического значения, поскольку концентрации ФНО-α сопоставимы с нормальным содержанием данного цитокина в сыворотке крови здорового человека. Аналогичный, статистически значимый эффект СЭФ и СЗФЛ оказывают и на спонтанную продукцию ИЛ-1β (табл.2 и фиг.7 и 8). При стимуляции МНК с помощью ЛПС отмечено значительное статистически значимое ингибирующее влияние обоих супернатантов на продукции провоспалительных цитокинов ФНО-α и ИЛ-1β.After washing, MNCs were resuspended in complete RPMI-1640 nutrient medium supplemented with 5% fetal calf serum and added to the wells of a 24-well plate at a final concentration of 1 × 10 6 / well. The daily SEF and NWFL were added to the MNCs at a final concentration of 25%, a similar volume of serum-free medium 199 was added to the control wells. LPS was added to the wells at a concentration of 10 μg / well. Cells were incubated for 24 hours in a CO 2 incubator, and at the end of the incubation, the concentration of TNFα and IL-1β in the solid-phase ELISA was evaluated using Protein Loop test systems (St. Petersburg, Russia). The results are presented in table 1 and figure 1-4. As can be seen from FIGS. 5 and 6 and Table 2, SEF and NWFP statistically significantly stimulate the spontaneous production of TNF-α, however, this effect has no clinical significance, since the concentration of TNF-α is comparable to the normal content of this cytokine in the blood serum of a healthy person. A similar, statistically significant effect of SEF and NWFP has on the spontaneous production of IL-1β (table 2 and 7 and 8). When stimulating MNCs using LPS, a significant statistically significant inhibitory effect of both supernatants on the production of proinflammatory cytokines TNF-α and IL-1β was noted.
Пример 3. Влияние супернатантов АДФ на продукцию рецепторного антагониста ИЛ-1 (раИЛ-1) МНК периферической крови здоровых доноров in vitro.Example 3. The effect of ADP supernatants on the production of the receptor antagonist IL-1 (RAIL-1) MNCs of peripheral blood of healthy donors in vitro.
Общая схема опытов идентична описанной для исследования продукции ФНО-α и ИЛ-1β, за исключением тест-систем для определения концентрации раИЛ-1 («Цитокин», Санкт-Петербург, Россия). Полученные результаты представлены в табл. 2 и на фиг.9 и 10. Видно, что супернатанты АДФ статистически значимо усиливали как спонтанную, так и ЛПС-стимулированную продукцию МНК доноров этого важного противовоспалительного цитокина.The general experimental design is identical to that described for studies of the production of TNF-α and IL-1β, with the exception of test systems for determining the concentration of RaIL-1 (Cytokine, St. Petersburg, Russia). The results are presented in table. 2 and Figs. 9 and 10. It is seen that ADP supernatants statistically significantly enhanced both spontaneous and LPS-stimulated production of MNC donors of this important anti-inflammatory cytokine.
Таким образом, супернатанты АДФ in vitro оказывали противовоспалительное влияние, выражавшееся в подавлении продукции провоспалительных цитокинов аллогенными мононуклеарными клетками в условиях стимуляции липополисахаридом, подавление адгезионной способности аллогенных нейтрофилов. При этом отмечается стимуляция продукции раИЛ-1 мононуклеарами, особенно в условиях индукции липополисахаридом, и повышение активности факторов бактерицидности нейтрофилов.Thus, in vitro ADP supernatants exerted an anti-inflammatory effect, expressed in the suppression of the production of proinflammatory cytokines by allogeneic mononuclear cells under conditions of stimulation with a lipopolysaccharide, and suppression of the adhesion ability of allogeneic neutrophils. At the same time, stimulation of the production of RAIL-1 by mononuclear cells is noted, especially under conditions of induction by lipopolysaccharide, and an increase in the activity of neutrophil bactericidal factors.
Пример 4. Влияние супернатантов АДФ на сроки эпителизации экспериментальной ожоговой раны (ЭОР) у крыс.Example 4. The effect of ADP supernatants on the timing of epithelization of an experimental burn wound (ESM) in rats.
Под эфирным наркозом 10 крысам линии Вистар раскаленным до 200°С электродом площадью 1 см2 путем контактного воздействия в течение 2 с наносили 3 экспериментальных ожоговых раны (ЭОР) на область спины. На каждую из ран накладывали стерильную салфетку, пропитанную раствором 0,05% фурацилина (контроль), СЭФ или СЗФЛ, которые фиксировали лейкопластырем. На шею крысы фиксировали пластиковый воротник и каждую крысу помещали в отдельную клетку для исключения самостоятельного и взаимного повреждения наклеек. Под эфирным наркозом ежедневно в течение 21 дня производили перевязку со сменой салфеток с супернатантами АДФ и раствором антисептика. При формировании струпа на ране во время перевязки его тангенциально иссекали. За указанный период отмечена полная эпителизация ЭОР, леченных СЭФ, - у 8 крыс, леченных СЗФЛ - у 7 крыс, леченных раствором фурацилина - у 2 крыс.Under ether anesthesia, 10 Wistar rats heated to 200 ° C with an electrode of 1 cm 2 area were contacted for 3 seconds with 3 experimental burn wounds (ESAs) on the back. A sterile napkin impregnated with a solution of 0.05% furatsilina (control), SEF or NWFL, which was fixed with adhesive tape, was applied to each of the wounds. A plastic collar was fixed on the rat’s neck and each rat was placed in a separate cage to exclude independent and mutual damage to the stickers. Under ether anesthesia, daily for 21 days, a dressing was performed with a change of napkins with ADP supernatants and an antiseptic solution. When a scab was formed on a wound during dressing, it was tangentially excised. Over the indicated period, complete epithelization of ESM was observed in treated rats in 8 rats, in treated rats in North-West Florida in 7 rats, in rats treated with furatsilin solution in 2 rats.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005102259/15A RU2300384C2 (en) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | Substance possessing anti-inflammatory, immunomodulating and wound-healing activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005102259/15A RU2300384C2 (en) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | Substance possessing anti-inflammatory, immunomodulating and wound-healing activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005102259A RU2005102259A (en) | 2006-07-10 |
| RU2300384C2 true RU2300384C2 (en) | 2007-06-10 |
Family
ID=36830393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005102259/15A RU2300384C2 (en) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | Substance possessing anti-inflammatory, immunomodulating and wound-healing activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2300384C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2369398C2 (en) * | 2007-09-10 | 2009-10-10 | Юрий Евгеньевич Бурда | Human fibroblast-based supernatant medicine with wound healing activity |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2023424C1 (en) * | 1993-01-13 | 1994-11-30 | Научно-производственный центр трансплантации и культивирования тканей | Methof for curing wound |
| RU2160112C1 (en) * | 2000-04-10 | 2000-12-10 | Сухих Геннадий Тихонович | Method for producing cellular transplant from fetus tissues |
| RU2205010C2 (en) * | 1997-06-03 | 2003-05-27 | Матаеси Девелопмент Ко., Лтд. | Natural antitumor or antiviral substances and their application |
| RU2231986C1 (en) * | 2002-12-15 | 2004-07-10 | Вольхина Валентина Николаевна | Method for surgical treating inflammatory-destructive parodontium diseases |
| JP2004339107A (en) * | 2003-05-14 | 2004-12-02 | Applied Cell Biotechnologies Inc | Therapeutic agent for dermatosis and covering material for treating dermatosis using concentrated solution of extracellular matrix |
-
2005
- 2005-01-31 RU RU2005102259/15A patent/RU2300384C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2023424C1 (en) * | 1993-01-13 | 1994-11-30 | Научно-производственный центр трансплантации и культивирования тканей | Methof for curing wound |
| RU2205010C2 (en) * | 1997-06-03 | 2003-05-27 | Матаеси Девелопмент Ко., Лтд. | Natural antitumor or antiviral substances and their application |
| RU2160112C1 (en) * | 2000-04-10 | 2000-12-10 | Сухих Геннадий Тихонович | Method for producing cellular transplant from fetus tissues |
| RU2231986C1 (en) * | 2002-12-15 | 2004-07-10 | Вольхина Валентина Николаевна | Method for surgical treating inflammatory-destructive parodontium diseases |
| JP2004339107A (en) * | 2003-05-14 | 2004-12-02 | Applied Cell Biotechnologies Inc | Therapeutic agent for dermatosis and covering material for treating dermatosis using concentrated solution of extracellular matrix |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2369398C2 (en) * | 2007-09-10 | 2009-10-10 | Юрий Евгеньевич Бурда | Human fibroblast-based supernatant medicine with wound healing activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005102259A (en) | 2006-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9078903B2 (en) | Compositions for the treatment of skin conditions, disorders or diseases and methods of making and using the same | |
| KR101495281B1 (en) | Composition for skin regeneration or wound healing comprising Mesenchymal Stem cells-Hydrogel-Biodegradable scaffold or Mesenchymal Stem cells-Hydrogel-Nondegradable scaffold | |
| JPH07501214A (en) | A novel keratinocyte culture, its preparation method and its use as a wound treatment agent | |
| Abdel-Sayed et al. | Cell therapies for skin regeneration: An overview of 40 years of experience in burn units | |
| CN116555175A (en) | Cell repair protein extract, preparation method and application thereof | |
| KR101293762B1 (en) | Culture media having enhanced wound healing activity and a method for preparing the same | |
| CN113876611A (en) | Application of sialic acid in preparation of preparation for promoting collagen production | |
| US20200078492A1 (en) | Process for obtaining a functional dermal substitute of decellurized amniotic membrane from the placenta combination with keratinocytes and its use as an agent for tissue regeneration of the skin | |
| WO1999001034A1 (en) | Method for producing new hair growth | |
| US20220218868A1 (en) | Novel polysaccharide-based hydrogel scaffolds for wound care | |
| US20010006813A1 (en) | Methods and compositions for the preparation of cell transplants | |
| KR20170089924A (en) | Stem cell material and method of manufacturing | |
| NZ336619A (en) | A method of biological control with a spirulina compound useful for treating skin defects | |
| KR20150142287A (en) | Culture media compostion for promoting stem cell proliferation comprising plant extracts | |
| NZ202259A (en) | Wound healing composition,preparation and uses | |
| CN104971382A (en) | Adhesive bandage type artificial active tissue constructed by using culture solution without serum or bovine pituitary extracts and construction method of adhesive bandage type artificial active tissue | |
| RU2300384C2 (en) | Substance possessing anti-inflammatory, immunomodulating and wound-healing activity | |
| Liu et al. | Bioreactor microcarrier cell culture system (Bio-MCCS) for large-scale production of autologous melanocytes | |
| US20210220518A1 (en) | Producing method of the collagen-laminin matrix for healing ulcers, burns and wounds of a human skin | |
| Villeneuve et al. | A novel culturing and grafting system for the treatment of leg ulcers | |
| DE102006038252A1 (en) | Preparation with marine collagen for proteinase inhibition | |
| RU2646793C1 (en) | Dog remedy regenerative activity | |
| Pramono et al. | Immense addition of royal jelly apis mellifera (ceiba pentandra) insufficient to increase fibroblast preputium proliferation | |
| RU2250108C2 (en) | Method for local treatment of erosive-ulcerous defects of skin and mucosa | |
| RU2197953C1 (en) | Agent normalizing skin tissue cell function |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070201 |