RU2236255C1

RU2236255C1 - Cultural virus-vaccine against newcastle disease

Info

Publication number: RU2236255C1
Application number: RU2003100756/13A
Authority: RU
Inventors: Н.А. Лагуткин (RU); Н.А. Лагуткин; В.Н. Смирнов (RU); В.Н. Смирнов; ров В.М. Котл (RU); В.М. Котляров; Т.Э. Южук (RU); Т.Э. Южук; А.А. Орлов (RU); А.А. Орлов; Е.В. Чуфарова (RU); Е.В. Чуфарова; А.В. Луницин (RU); А.В. Луницин; Н.В. Малоголовкина (RU); Н.В. Малоголовкина; В.И. Балышева (RU); В.И. Балышева; К.С. Чернов (RU); К.С. Чернов
Original assignee: ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2004-09-20

Abstract

FIELD: veterinary virology.

SUBSTANCE: vaccine comprises suspension of the mesogenic strain "M-VNIIVVIM" of Newcastle disease virus grown in transplanted culture of cell BHK-21/13 with titer 7.0-7.75 lg TCD₅₀/ml and protective medium in the ratio 1:1. Vaccine is harmless and exhibits high immunogenicity.

EFFECT: valuable properties of virus-vaccine.

1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к получению культуральной вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма "М - ВНИИВВиМ".The invention relates to the field of veterinary virology, in particular to the production of a culture virus vaccine against Newcastle disease from strain "M - VNIIVViM".

Профилактику ньюкаслской болезни (НБ) проводят путем вакцинации кур препаратами, изготовленными из лентогенных штаммов - Ла Сота, Бор-74 ВГНКИ (В.Н.Сюрин и др. Вирусные болезни животных, 1998 г. М.: ВНИИТИБП, с.214-232) и мезогенных штаммов парамиксовируса 1 - "Н", ГАМ-61 (В.И.Смоленский. "Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии". Док. дисс. 1999 г.). Эти штаммы при различных способах введения вызывают образование вирусспецифических антител (более 3 log 2) и защищают не менее 80% птицы от заболевания.Prevention of Newcastle disease (ND) is carried out by vaccinating chickens with drugs made from tapeogenic strains - La Sota, Bor-74 VGNKI (V.N.Syurin et al. Viral diseases of animals, 1998. M .: VNIITIBP, p.214-232 ) and mesogenic strains of paramyxovirus 1 - "N", GAM-61 (V.I. Smolensky. "Means and methods of specific prophylaxis of avian etiology of bird diseases. Doc. diss. 1999). These strains with various methods of administration cause the formation of virus-specific antibodies (more than 3 log 2) and protect at least 80% of the bird from the disease.

Вакцины из лентогенных штаммов обладают хорошей иммуногеностью, не реактогенны, вакцинацию можно проводить различными методами, но формируется иммунитет через 2-3 недели после иммунизации.Vaccines from lentogenic strains have good immunogenicity, are not reactogenic, vaccination can be carried out by various methods, but immunity is formed 2-3 weeks after immunization.

Отличительной особенностью вакцин из мезогенных штаммов является то, что они высокоиммуногенны, создают невосприимчивость через 48-220 часов и защищают птицу и течение года, но обладают реактогенностью.A distinctive feature of vaccines from mesogenic strains is that they are highly immunogenic, create immunity after 48-220 hours and protect the bird and throughout the year, but have reactogenicity.

Вирусным сырьем для изготовления вакцин из лентогенных и мезогенных штаммов является экстраэмбриональная жидкость зараженных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ). Для получения вакцин необходимо использовать только СПФ эмбрионы, которые в несколько раз дороже обычных, а их производство в России не налажено.The viral raw material for the manufacture of vaccines from streptogenic and mesogenic strains is extraembryonic fluid of infected developing chicken embryos (RCEs). To obtain vaccines, it is necessary to use only SPF embryos, which are several times more expensive than conventional ones, and their production in Russia has not been established.

Наиболее близким прототипом изобретения является эмбриональная вакцина против ньюкаслской болезни из мезогенного штамма Paramyxovirus "ГАМ-61 ВГНКИ", которую применяют для профилактики однократно интраназально, энтерально, внутримышечно или аэрозольно в эффективных дозах. Сохранность цыплят яичной породы после применения этой вакцины составила в среднем 99,3%, а для цыплят-бройлеров - 83,0%. Сделана попытка адаптации этого штамма на культурах клеток для изготовления культуральной вакцины. Установлено, что штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" не вызывает цитопатического действия в первичных и перевиваемых культурах клеток ПТ-80, ФЭК, ФЭУ и не пригоден для накопления с целью изготовления вакцины (П. №2055890 - прототип).The closest prototype of the invention is an embryonic vaccine against Newcastle disease from the mesogenic Paramyxovirus strain "GAM-61 VGNKI", which is used for prophylaxis once intranasally, enteral, intramuscularly or aerosol in effective doses. The safety of egg chickens after using this vaccine averaged 99.3%, and for broiler chickens - 83.0%. An attempt was made to adapt this strain to cell cultures for the manufacture of a culture vaccine. It was established that the strain "GAM-61 VGNKI" does not cause a cytopathic effect in primary and transplantable cultures of PT-80, FEK, PMT cells and is not suitable for accumulation for the purpose of manufacturing a vaccine (P. No. 2055890 - prototype).

Целью изобретения является культуральная вирусвакцина из мезогенного штамма "М-ВНИИВВиМ" Paramyxovirus 1 серотипа (ньюкаслская болезнь), выращенного на культуре клеток ВНК-21/13, обладающая высокой иммуногенностью.The aim of the invention is a culture virus vaccine from the mesogenic strain "M-VNIIVViM" Paramyxovirus 1 serotype (Newcastle disease) grown on a cell culture of BHK-21/13, which has high immunogenicity.

Используемый штамм не патогенен для цыплят, но инокуляция 20% суспензии селезенки от павших цыплят в разведении 1/1000 вызывала гибель куриных эмбрионов через 60-84 часа. Штамм был идентифицирован как мезогенный. Инфекционный титр его составил 8,5-9,0 lg ЭЛД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:256-1:512 (8,0-9,0 log₂).The strain used is not pathogenic for chickens, but inoculation of a 20% suspension of spleen from dead chickens in 1/1000 dilutions caused the death of chicken embryos after 60-84 hours. The strain has been identified as mesogenic. Its infectious titer was 8.5-9.0 lg ELD ₅₀ / cm ³ and the hemagglutinating titer was 1: 256-1: 512 (8.0-9.0 log ₂ ).

После первых 4 пассажей вируса в клетках ВНК-21/13 наблюдалось четко выраженное цитопатическое действие. Вирус накапливается в титрах 7,0-7,75 lg ТЦД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр увеличился с 1:4 в первом пассаже до 1:32 в четвертом пасаже. Начиная с пятого пассажа, накопление вируса в клетках ВНК-21/13 стабилизировалось и составляло 7,0-7,75 lg ТЦД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:16-1:32. Культивирование штамма в КК ВНК-21/13 на протяжении 15 пассажей не привело к изменению его характеристик (Патент №2192464).After the first 4 passages of the virus, a clearly pronounced cytopathic effect was observed in BHK-21/13 cells. The virus accumulates in titers of 7.0-7.75 lg TCD ₅₀ / cm ³ , and the hemagglutinating titer increased from 1: 4 in the first passage to 1:32 in the fourth passage. Starting from the fifth passage, virus accumulation in BHK-21/13 cells stabilized and amounted to 7.0-7.75 lg TCD ₅₀ / cm ³ , and the hemagglutinating titer was 1: 16-1: 32. The cultivation of the strain in KK VNK-21/13 for 15 passages did not lead to a change in its characteristics (Patent No. 2192464).

Для получения вакцинного препарата подобрана питательная и поддерживающая среды и отработан режим роллерного культивирования вируса, определен состав защитной среды и режим лиофильной сушки, определены дозы, способы вакцинации птицы и иммуногенность вакцины.To obtain a vaccine preparation, a nutrient and support medium was selected and a roller culture mode of the virus was developed, the composition of the protective medium and the freeze-drying regime were determined, the doses, methods of vaccination of the bird, and immunogenicity of the vaccine were determined.

Пример 1. Для получения вакцины в качестве посевного вируса ньюкаслской болезни используют мезогенный штамм "М-ВНИИВВиМ", полученный на уровне 5-15 пассажей с инфекционным титром - 7,0-7,75 lg ТЦД₅₀/см³, гемагглютинирующим титром - 1:16-1:32.Example 1. To obtain the vaccine as a seed virus of the Newcastle disease using the mesogenic strain M-VNIIVViM obtained at the level of 5-15 passages with an infectious titer of 7.0-7.75 lg TCD ₅₀ / cm ³ , hemagglutinating titer - 1 : 16-1: 32.

Культуру клеток ВНК-21/13 выращивают в матрасах или роллерным методом культивирования с использованием ростовой среды Игла (MEM) при 36-38°С. Ростовая среда содержала 10% сыворотки КРС, а поддерживающая - 1%. Множественность заражения составляет 0,1-10 ТЦД₅₀/кл. При наступлении 80% ЦПД инфицированную культуру в матрасах замораживают и хранят при -40°С. Роллерное культивирование продолжается в течение 3-4 суток.The cell culture of BHK-21/13 is grown in mattresses or by roller culture method using Eagle's growth medium (MEM) at 36-38 ° C. The growth medium contained 10% of cattle serum, and the maintenance medium - 1%. The multiplicity of infection is 0.1-10 TCD ₅₀ / CL. At the onset of 80% CPD, the infected culture in the mattresses is frozen and stored at -40 ° C. Roller cultivation lasts for 3-4 days.

В качестве стабилизирующей среды используют защитную среду на основе пептона, которую готовили согласно технологическому регламенту "Среда защитная (СПЛФ - жидкая)", утв. ГУВ Госагропрома СССР 10.11.88 г и контролируют согласно ТУ 10-19.45-88 "Среда защитная для вирусных вакцин (СПЛФ - жидкая)".As a stabilizing medium, a peptone-based protective medium is used, which was prepared according to the technological regulations "Protective medium (SPLF - liquid)", approved. GUV Gosagroprom of the USSR 10.11.88 g and control according to TU 10-19.45-88 "The protective environment for viral vaccines (SPLF - liquid)."

Вируссодержащий препарат смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают в ампулы по 1 см³ и проводят сушку на сублимационном аппарате ТГ-50,5, предварительно заморозив смесь до температуры минус 50°С. Температурный режим сушки изменяется во времени, а вакуум остается в пределах 80-100 мм рт. столба. Общее время сушки составляет 34-37 часов, а влажность готового продукта 2-3%.The virus-containing preparation is mixed with a protective medium in a ratio of 1: 1, poured into ampoules of 1 cm ³ and dried on a TG-50.5 freeze-dryer, after freezing the mixture to a temperature of minus 50 ° С. The temperature regime of drying varies over time, and the vacuum remains in the range of 80-100 mm RT. pillar. The total drying time is 34-37 hours, and the humidity of the finished product is 2-3%.

Контроль стерильности культуральной вакцины проводили на бактериальных средах: МПА, МПБ, Сабуро и тиогликолевом агаре. Рост бактериальной и грибковой микрофлоры в течение 10 дней не выявлен.The sterility of the culture vaccine was controlled on bacterial media: MPA, MPB, Saburo and thioglycol agar. The growth of bacterial and fungal microflora within 10 days was not detected.

Проверку безвредности культуральной вакцины против ньюкаслской болезни проводили путем вакцинации 10 цыплят интраназально в обьеме 0,1 см исходной вируссодержащей жидкости. Клинических признаков заболевания в течение 10 дней наблюдения не отмечено.The safety of the culture vaccine against Newcastle disease was verified by vaccinating 10 chickens intranasally in a volume of 0.1 cm of the original virus-containing liquid. There were no clinical signs of the disease within 10 days of observation.

Лиофилизированый препарат применяют для вакцинации цыплят. Способы вакцинации - внутримышечный - однократно в объеме 0,5 см³ в разведении 1:500 или интраназальный - однократно в объеме 0,1 см³ в разведении 1:100 по общепринятой методике. Прирост титра антигемагглютининов составляет не менее 3,0 log₂ на 7 день после вакцинации.A lyophilized preparation is used to vaccinate chickens. Methods of vaccination - intramuscular - once in a volume of 0.5 cm ³ at a dilution of 1: 500 or intranasal - once in a volume of 0.1 cm ³ at a dilution of 1: 100 according to the standard method. The increase in titer of antihemagglutinins is at least 3.0 log ₂ on the 7th day after vaccination.

Иммуногенные свойства культуральной вакцины против НБ из штамма “М-ВНИИВВ и М” приведены в таблице.The immunogenic properties of the culture vaccine against NB from the strain “M-VNIIVV and M” are shown in the table.

В опытах использованы цыплята яичного и мясного направления.In the experiments, chickens of egg and meat direction were used.

Из представленных результатов видно, что вакцина из штамма М-ВНИИВВиМ обеспечивает защиту цыплят к заражению вирулентным штаммом "Т-53" вируса ньюкаслской болезни в 93,3-100% случаев, а эмбриональная вакцина из мезогенного штамма ГАМ-61 ВГНКИ при аналогичных иммунизирующих дозах обеспечивает защиту цыплят - в 83,3-100% случаев.From the presented results it is seen that the vaccine from strain M-VNIIVViM protects chickens from being infected with the virulent strain "T-53" of the Newcastle disease virus in 93.3-100% of cases, and the embryonic vaccine from the mesogenic strain GAM-61 of VGNKI with similar immunizing doses provides protection of chickens - in 83.3-100% of cases.

Проверена сохранность лиофилизированной культуральной вакцины против ньюкаслской болезни. Хранение вакцины в течение 18 месяцев практически не снизило ее активность. Внутримышечная вакцинация цыплят дала положительный результат.The safety of the lyophilized culture vaccine against Newcastle disease has been verified. Storage of the vaccine for 18 months practically did not reduce its activity. Intramuscular vaccination of chickens gave a positive result.

Claims

Cultural virus vaccine against Newcastle disease, including virus-containing material and a protective environment, characterized in that as a virus-containing material contains a suspension of the mesogenic strain M-VNIIVViM of the Newcastle disease virus grown on the cell culture of BHC-21/13, and a protective environment at a ratio of 1 :1.