RU2135205C1

RU2135205C1 - Инсулиновый препарат, способ получения препарата, способ лечения сахарного диабета

Info

Publication number: RU2135205C1
Application number: RU94028671A
Authority: RU
Inventors: Артур Хоффман Джеймс
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-09
Publication date: 1999-08-27
Also published as: CO4230235A1; ATE207761T1; DK0646379T3; HU9402287D0; JPH07149660A; HUT67853A; PT646379E; TW326394B; PE14495A1; ZA945939B; NZ264197A; UA27874C2; DE69428860D1; NO942959L; EP0646379B1; DE69428860T2; IL110581A0; EP0646379A1; BR9403204A; AU7024794A

Abstract

Изобретение относится к препарату инсулина, включающему суспензию кристаллов инсулина человека ультраленте и цинк в общей концентрации в препарате 0,5-20 мг на 100 единиц инсулина. Препарат имеет рН 6,0-7,4 и не содержит других белков, подобных протамину. Технический результат: модифицированный цинком препарат проявляет свойства очень долго сохраняющегося продукта инсулина человека. 3 с. и 6 з.п. ф-лы, 8 табл.

Description

Данное изобретение относится к области медицины, в частности к лечению диабета. Точнее, изобретение относится к препаратам, содержащим молекулу инсулина человека, который при назначении более близко имитирует базальный уровень инсулина, находящегося в нормальном организме человека.

Главный терапевтической целью лечения диабета является физиологический контроль за уровнем глюкозы в крови. Для этой цели доступно множество коммерческих препаратов. Для быстрого роста сахарной нагрузки, которая происходит во время еды, наиболее пригодными являются быстродействующие инсулиновые продукты, такие как Humulin Regular или так называемые мономерные аналоги инсулина.

Другим важным источником сахарной нагрузки у пациента является низкоуровневый, базальный выход глюкозы из печени. Этот выход прежде всего проистекает из начинающихся после приема пищи метаболических процессов, таких как глюконеогенез и глюкогенолиз. У диабетиков этот базальный выход глюкозы существенно возрастает ночью и приводит к продолжительным периодам гипергликемии, особенно в ранние утренние часы в случае, упоминаемом как явление дауна. Эти периоды гипергликемии, как показано, вносят важный вклад в высокие уровни гликированных белков, часто измеряемых клинически как гликозилированный гемоглобин. Скопление этих производных продуктов белков является одной из причин долговременных осложнений, связанных с диабетом, таких как заболевания нервной системы, почек и ретинопатия.

Идеальный инсулиновый препарат для воздействия на этот базальный выход глюкозы должен быть таким, чтобы давать в результате медленное, равномерное вливание инсулина в кровеносное русло, который соответствует низкому уровню выхода глюкозы из печени. Наилучшим продуктом для парэнтерального введения, который соответствует этому описанию, является коммерчески доступный бычий инсулин Ultralente. Вводимый только раз в день, он дает медленный, равномерный выход инсулина в кровеносное русло без какого-либо заметного пика инсулина.

Главная проблема с бычим Ultralente, однако, возникает из того факта, что бычий инсулин имеет другую последовательность аминокислот, чем инсулин человека. Организм человека может опознать бычий инсулин как посторонний белок. Постоянные инъекции этого иммуногенного вещества диабетикам могут дать в результате образование антител к инсулину. Это может привести к изменениям во временном действии инсулина и в эффективности, и к другим проблемам, возникающим из-за активированной иммунной системы пациента. По этим причинам бычий Ultralente остается неидеальным препаратом инсулина для парэнтерального введения.

Появление как рекомбинантной технологии ДНК, так и новых ферментативных методов для превращения свиного инсулина в инсулин человека способствовало поставкам инсулина человека, которые становятся доступными, начиная с 1980 г. Для преодоления проблем, связанных с бычим Ultralente, отмеченных выше, логичным шагом является получение кристаллов Ultralente человека и их приготовление в виде коммерчески доступных препаратов для парэнтерального введения. Виды, формы, размеры кристаллов, способы получения и приготовления составов продуктов бычьего Ultralente и Ultralente человека являются, в основном, идентичными.

Однако, несколько лет клинической практики привели к определенным показаниям, что эти продукты не являются идентичными. Фактически, клинические сообщения показывают, что Ultralente человека действует быстрее, чем препарат бычьего Ultralente, в то время как свиной Ultralente является промежуточным по временному действию между другими видами. В клинической практике это привело многих врачей и диабетологов к тому, чтобы рекомендовать инъекции Ultralente человека дважды в день. Кроме того, значительный пик поглощения инсулина в кровеносном русле наблюдают через около 12 часов после подкожного введения. Это явление не только уменьшает способность этого продукта противостоять постоянному базальному выходу глюкозы из печени, это также дает в результате гиперинсулинемию, которая сама по себе может вести к макрососудистым осложнениям.

Причины различий во временном действии между бычьим Ultralente и Ultralente человека являются не вполне понятными. Присутствие антител к бычьему инсулину не является первичной причиной этого различия во временном действии. Некоторые исследования показывают, что инсулин из Ultralente человека поглощается быстрее из места инъекции, чем бычий Ultralente. Дальнейшее углубление в этот вопрос происходит из испытаний растворимости, описанных далее в подробном описании данного патента. Основанные на модификациях ранее описанных испытаний, эти тесты растворимости показывают, что кристалл бычьего Ultralente при растворении просто требует большего времени для растворения, чем кристалл Ultralente человека. Различия в последовательности аминокислот между бычьим инсулином и инсулином человека вызывают слабые различия в упаковке гексамеров инсулина в кристаллах, что приводит к различиям в скоростях растворения. После инъекции в подкожные ткани эта задержка в растворении бычьих кристаллов вероятно ведет к их более пролонгированному поглощению и временному биологическому действию.

Синтез аналогов инсулина человека является одним из путей, на которых исследуют пролонгирование временного действия. В частности, получены такие модификации как инсулин человека Gly^(A21)Arg^(B27)Thr-NН₂ ^(B30) (Jorgensen et al. , British Medical Journal 229, 415-419 (1989)) и модификации в положении Gly^(B13) (Hansen, Biophysical Chemistry 390 107-110 (1991)). Однако, в каждом из этих случаев введение новой последовательности аминокислот делает молекулу посторонней для организма человека и поэтому такой же или даже более иммуногенной, чем бычий инсулин. Конечно, применение молекулы природного инсулина человека было бы лучше, чем введение новой молекулы инсулина. Во всяком случае, не сообщалось ни о каких препаратах Ultralente человека, высоко обогащенных цинком, или о средствах получения таких препаратов для пролонгирования временного действия иммунологически предпочтительного препарата Ultralente человека до времени биологического действия фармакологически предпочтительного препарата бычьего Ultralente или до более длинного.

В течение многих лет известно, что инсулин может быть успешно кристаллизован с атомами цинка для получения многочисленных типов стабильных кристаллов, имеющих более долгие временные действия, чем растворимый или аморфный, некристаллизованный инсулин. Рыбий белок протамин также используют в качестве агента, образующего комплекс с инсулином для продления времени действия инсулина, но его гетерогенность и потенциальная иммуногенность делают его менее привлекательным для лекарства, регулярно вводимого подкожно.

В начале пятидесятых годов был разработан новый препарат кристаллов бычьего инсулина, который содержал только инсулин и цинк в ацетатном буфере при нейтральном pH (Hallas-Moeller et al., Sciense 116, 394-398 (1952)). Этот инсулин Lente снимает необходимость в фосфатном ионе, который сильно взаимодействует с ионами цинка, образуя нерастворимые фосфатные производные цинка. Препараты, содержащие только кристаллический инсулин в ацетатном буфере, называют Ultralente. Кристаллы, полученные таким образом, будут упоминаться здесь как кристаллы инсулина Ultralente.

Хотя только 2 атома цинка являются необходимыми, чтобы быть комплексно связанными в каждом инсулиновом гексамере для образования правильного кристалла Ultralente, определенный молярный избыток цинка присутствует в каждом препарате Ultralente, и обнаружено, что для данного бычьего Ultralente временное действие соответствует одной инъекции в день (Schlichtkrull, in Insulin Crystalls, Ejnar Munksgaard Publishers, Copenhagen (1958)). Эта же работа сообщает (с. 92): "видимо, длительность действия несколько сокращается, когда свиной инсулин замещают бычьим инсулином в Ultralente. Таким образом, для обеспечения постоянного расчета времени для терапевтических суспензий необходимо строго придерживаться одних и тех же видов или находить фиксированную пропорцию между инсулинами от различных видов". Подобно этому, сообщается, что свиной инсулин Ultralente быстрее поглощается диабетиками, чем бычий инсулин Ultralente (Brange, in Galenics of Insulin, p.28, Springer-Verlag, Berlin (1987)). Однако, даже несмотря на то, что эти различия между видами были отмечены, и свиной инсулин является более близким по структуре к инсулину человека, и следовательно, менее иммуногенным, чем бычий инсулин, возможно изменения препаратов для пролонгации временного действия свиного Ultralente, для того, чтобы сделать его эквивалентным или более долгим, чем у бычьего Ultralente, но не было ни продемонстрировано, ни предложено. Фактически, в более раннем сообщении (Hallas-Moeller, Diabetes 5, 7-12 (1956)) предложено, что уровни цинка выше, чем 0,2 г на 100 единиц инсулина не смогут помочь в дальнейшей пролонгации временного действия инсулиновых препаратов Lente (или Ultralente) различных видов.

Примерно, 0,09 мг цинка на 100 единиц инсулина, по сообщению, является сильно связанным с нерастворимыми кристаллами бычьего Ultralente (14 атомов цинка на гексамер инсулина), в то время как относительно низкая концентрация свободного цинка, составляющая около 0,05 мг/мл, остается несвязанной в супернатанте. Предполагается, что оба этих уровня остаются неизменными, даже при увеличении активности препарата инсулина от 40 ед/мл до 100 ед/мл (Brange, in Galenics of Insulin, p. 37, Springer-Verlag, Berlin (1987)).

В патенте США (US 5070186) сообщается, что препараты инсулина, содержащие высокую концентрацию (0,02 - 0,5 М) другого двухвалентного катиона металла, магния, дают быстродействующие продукты инсулина. Однако, в настоящее время неожиданно обнаружено, что добавление ацетата или хлорида цинка в твердом виде или в виде концентрированных водных растворов непосредственно к препарату Ultralente человека до конечной общей концентрации цинка от около 0,5 до около 20 мг на 100 единиц инсулина замедляет растворение кристаллов и может пролонгировать их временное действие, сделав его таким же медленным или даже более медленным, чем у бычьего Ultralente. Обнаружено также, что эта модификация дает сопутствующее падение pH от pH около 7,4 до такого низкого, как pH 6,2. Далее, обнаружено, что эта модификация дает в результате большую часть добавленного цинка, остающуюся в супернатанте и несвязанную с нерастворимым кристаллическим инсулином. Видимая форма или размер кристаллов, или химическая стабильность инсулина в препаратах также не изменились значительно после определенных периодов хранения.

Данное изобретение относится к препарату инсулина, содержащему суспензию кристаллов инсулина Ultralente с общей концентрацией цинка в препарате между около 0,5 миллиграмм и около 20 миллиграмм на 100 единиц инсулина. Более, чем пятьдесят процентов цинка в препарате остаются скорее в растворимой фракции, чем в комплексе с инсулином. Этот препарат инсулина обычно имеет pH от около 6,0 до около 7,4. Этот модифицированный цинком препарат проявляет характеристики очень долго сохраняющегося продукта инсулина человека.

Для целей данного изобретения используют следующие термины и сокращения.

Общая концентрация цинка в препарате - полная концентрация цинка в препарате, является ли указанный цинк связанным в комплексе с инсулином или же находится в растворимой форме.

Инсулин Ultralente - препараты, содержащие кристаллы инсулина, полученные в ацетатном буфере, в основном, в соответствии с публикацией Hallas - Moеller, et al., Science 116, 394-398 (1952)). Кристаллы, полученные таким путем, будут упоминаться как кристаллы инсулина Ultralente.

ед. - стандартная международная единица активности инсулина.

Zn - цинк.

Все сокращения названий аминокислот, используемые в этом описании, являются принятыми Патентным ведомством США согласно 37 C.F.R. 1, 822 (b) (2) (1990).

Данное изобретение направлено на препарат инсулина, содержащий суспензию кристаллов Ultralente в препарате с общей концентрацией цинка между около 0,5 миллиграмм и около 20 миллиграмм на 100 единиц инсулина. Более, чем пятьдесят процентов всего цинка в препарате скорее являются в растворимой фракции, чем в комплексе с инсулином. Этот препарат инсулина обычно имеет pH между около 6,0 и около 7,4. В дополнение, препарат инсулина данного изобретения не содержит других белков, подобных протамину. Препарат может содержать консервирующие или сохраняющие изотоничность агенты, и он может также содержать буфер, который не взаимодействует сильно с цинком. Этот модифицированный цинком препарат проявляет характеристики очень долго сохраняющегося продукта инсулина человека.

Препараты данного изобретения могут быть получены добавлением цинка к предварительно полученным суспензиям кристаллов инсулина Ultralente или путем добавления дополнительного цинка после стадии кристаллизации в способе производства Ultralente. Цинк может быть добавлен в твердом виде или он может быть добавлен в виде раствора. Альтернативно, суспензия кристаллов Ultralente может быть добавлена к твердому цинку или к раствору цинка. Несколько различных солей цинка могут быть использованы в данном изобретении. Представительные примеры солей цинка включают ацетат цинка, бромид цинка, хлорид цинка, фторид цинка, иодид цинка и сульфат цинка. Специалисту известно, что существуют много других солей цинка, которые тоже могут быть использованы в производстве модифицированных цинком препаратов инсулина Ultralente данного изобретения. Предпочтительно, ацетат цинка или хлорид цинка используют для создания модифицированных инсулиновых препаратов Ultralente, поскольку эти соли не добавляют новых химических ионов в коммерчески доступные препараты Ultralente.

Следовательно, изобретение, описываемое здесь, направлено на существенное повышение концентрации цинка в супернатанте препаратов Ultralente человека без значительной модификации самих кристаллов Ultralente. Неожиданно было обнаружено, что обогащенный цинком препарат Ultralente может замедлять скорость растворения нерастворимых кристаллов инсулина и пролонгировать временное биологическое действие по сравнению с немодифицированными препаратами Ultralente человека.

Избегать чрезмерно резкой модификации кристалла Ultralente может быть важным по нескольким причинам. Во-первых препараты Ultralente используются для регулярного введения диабетикам уже в течение 40 лет, и сам Ultralente человека около 10 лет. Следовательно, рекорд надежности может быть получен в наследство этими новыми модифицированными цинком препаратами. Во-вторых, существенное увеличение уровня цинка при комплексообразовании с кристаллами инсулина могло бы привести к аггрегированию кристаллов. Через некоторое время это привело бы к образованию коллоидных частиц в препарате, что сделает его непригодным. Исследования модифицированных цинком препаратов Ultralente инсулина человека, описываемые в данном изобретении, не обнаруживают никаких существенно модифицированных или аггрегированных кристаллов инсулина. Наконец, модификация цинк-инсулиновых кристаллов может привести к изменениям в структуре самого инсулина, что может изменить его биологические свойства или даже его иммуногенность.

Сопутствующее падение pH, которое происходит в этих модифицированных препаратах Ultralente может также оказаться важным. Увеличение уровня растворимых ионов цинка, как известно, ведет к росту химического расщепления инсулина между остатками A8 (треонин) и A9 (серин), даже если инсулин представлен в виде нерастворимых кристаллов. (Brange et al., Pharmaceutical Research 9, 715-726 (1992)). Некоторое уменьшение pH препаратов инсулина ниже pH 7 уменьшает эту реакцию расщепления и, следовательно, улучшается долговременная стабильность. Возможно также, что это падение pH может быть частично ответственным за минимальное взаимодействие избытка цинка с кристаллом инсулина, поскольку известно, что взаимодействие белков с цинком ослабляется при более кислотных значениях pH. (Schlichtkrull, in Insulin Crystalls, Ejnar Munksgaard Publichers, Copenhagen (1958)).

Новые модифицированные цинком препараты Ultralente человека, описываемые в данном изобретении, имеют несколько дополнительных свойств. Приготовления препарата может иметь место долгое время спустя после того, как получен исходный препарат Ultralente человека. Различные уровни цинка могли бы быть даже добавлены таким образом в аптеке или в клинике и приспособлены, в зависимости от желаемого временного действия, к потребностям индивидуальных пациентов. Также не требуется никаких новых наполнителей, комплексообразующих агентов, химикалиев или органических растворителей для этих препаратов, так что необходимость принимать во внимание неизвестную токсичность новых химических объектов при регулярном введении в течение многих лет отпадает. Наконец, пределы изменения pH целевого раствора, pH от 6,0 до 7,4, достаточно близки к pH подкожной ткани (pH 7,4), это не должно вызывать раздражения.

Данное изобретение предполагает препараты кристаллов Ultralente человека, для лечения диабета путем подкожных инъекций, такие инъекции дают медленное поглощение инсулина, такое, что если желательно, требуется назначать не более одной инъекции в день. Препараты могут также содержать консервирующий агент, такой как метилпарабен; агент, сохраняющий изотоничность, такой как хлорид натрия, и общее содержание цинка от около 0,5 до около 20 мг на 100 единиц инсулина, и значения pH в пределах от около 6,0 до около 7,4. Специалисту известно, что многие другие консерванты и агенты, сохраняющие изотоничность, являются доступными для использования в данном изобретении. В преимущественном осуществлении общая концентрация цинка находится в пределах от около 0,5 до около 7 мг на 100 единиц инсулина, и pH находится в пределах от около 6,2 до около 7,2. Другим предпочтительным осуществлением является значение pH для всех уровней цинка, которое получается тогда, когда соответствующее количество твердого хлорида цинка, твердого ацетата цинка или концентрированного водного раствора этих реагентов добавляют к предварительно приготовленному раствору Ultralente человека, т.е. не производят дальнейшей установки pH.

Для сравнения концентраций цинка и инсулина, отмеченных в научных публикациях и в патентных документах других авторов, таблица I представляет эквивалентность цинка и инсулина в соединении, в то время как таблица II представляет эквивалентность цинка в растворе.

Последующие примеры приводятся для иллюстрации данного изобретения, но не ограничивают его.

Пример 1.

Получение модифицированных цинком препаратов Ultralente человека.

Используют Humulin Ultralente (Lilly, Indianapolis, IN, DSA) и Ultralente (Beef) Insulin Extended Insulin Zinc Suspension USP (Novo Nordisk, Bagvaerd, Denmark), оба с активностью 100 единиц инсулина на мл (100 ед.). Эти препараты, содержащие общую концентрацию цинка около 0,15 мг/мл, либо используют непосредственно, либо разбавляют до активности инсулина 40 ед., используя Sterile Diluent Sor Ultralente Insulin (Lilly),
который содержит 0,05 мг/мл цинка. К предварительно взвешенным образцам твердого хлорида цинка (EM Science, Cherry Hill, NJ, USA) непосредственно добавляют растворы инсулинов Ultralente с активностью 100 ед. или 40 ед. Альтернативно, к препаратам Humulin Ultralente с активностью 100 ед. добавляют различные количества концентрированных растворов хлорида цинка (100 мг/мл в воде) или ацетата цинка (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, USA, 200 мг/мл в воде) с произвольным значением pH. Общие уровни цинка либо устанавливаются путем объединения вычисленных уровней цинка в инсулине, растворителе и реагентах, либо определяют экспериментально с помощью атомной абсорбционной спектроскопии.

Пример 2.

Значения pH модифицированных цинком препаратов Ultralente человека.

Значения pH находящихся в употреблении фармацевтических препаратов все составляют около pH 7,4. Модифицированные цинком препараты Ultralente получают по примеру 1 и определяют их значения pH. Данные представлены ниже на таблице III.

Разумеется, значение pH этих препаратов немного падают, когда добавляют реагент, содержащий цинк. Образцы, полученные с ацетатом цинка, показывают меньшее падение pH по сравнению с хлоридом цинка. В последующих примерах, описанных здесь, за исключением примера 3B, не производилось установление pH в растворах, полученных таким образом.

Также обнаружено, что добавление незначительных количеств растворов гидроксида натрия к этим обогащенным цинком препаратам после добавления реагентов, содержащих цинк, может вызвать рост pH в малой степени. Увеличение pH препаратов до значения 7,4 путем добавления больших значений гидроксида натрия вызывает, однако, немедленное образование массивного осадка, предположительно, соединений типа гидроксида цинка, что делает препараты непригодными для дополнительных целей. С другой стороны, добавление кислотных растворов, подобных соляной кислоте или уксусной кислоте, для уменьшения pH после приготовления обогащенных цинком Ultralente не вызывает никаких проблем с выпадением осадка, но анализы супернатантов с помощью ВЭЖХ показывают малое, дополнительное процентное содержание кристаллов Ultralente, которые вероятно, солюбилизируются во время этого процесса подкисления. Подкисление с использованием разбавленной уксусной кислоты служит наилучшим образом для минимизирования или исключения солюбилизации инсулина, как по примеру 3B. Следовательно, поскольку установление меньших pH этих обогащенных цинком суспензий Ultralente может быть проведено удовлетворительно, этот патент не должен быть ограничен только теми значениями pH, которые устанавливаются, когда добавляют конкретный реагент, содержащий цинк.

Пример 3.

Уровни цинка в модифицированных цинком препаратах Ultralente человека.

A. Три обогащенных цинком препарата Ultralente человека получают подобно образцу 8 по примеру 2. Один мл каждой из этих трех суспензий с установленными общими уровнями цинка от 0,7 до 2,5 мг на 100 единиц инсулина и неизмененный инсулиновый препарат Humulin Ultralente перемешивают вручную при 25^oC, а затем хранят при 5^oC в течение 20 часов. Затем каждую суспензию прокачивают сквозь 0,2 мк фильтр Acrodisc^R (Gelman Sciences, Ann Arbcr, MI, USA). Фильтрат разбавляют 9 мл 0,1 н. HCl. Нерастворимые кристаллы, которые остаются на фильтре, повторно растворяют с помощью медленного пропускания 10 мл 0,1 н. HCl через каждый фильтр. Уровни цинка в этих растворах определяют с помощью атомной абсорбции и по ним вычисляются уровни цинка в исходных супернатантах или кристаллах инсулина препаратов. Данные этих экспериментов представлены в таблице IV.

Этот эксперимент показывает, что большая часть дополнительно добавленного цинка остается в супернатанте и не связывается с кристаллами инсулина ни в комплексах, ни ковалентно.

B. 20 мл препарата, содержащего около 2,5 мг/мл цинка получают подобно образцу 8 по примеру 2. Половину этой суспензии (pH 6,81) оставляют с произвольным pH, в то время как в другой половине устанавливают pH 6,15 путем добавления малого объема разбавленной уксусной кислоты. Суспензии хранят при 5^oC. В различные моменты времени уровни цинка в супернатантах и нерастворимых кристаллах определяют как описано выше. Данные этих экспериментов представлены ниже в таблице V.

Этот эксперимент показывает, что установление pH с помощью разбавленной уксусной кислоты не изменяет распределения цинка между супернатантом и нерастворимыми кристаллами инсулина. Он показывает, что распределение цинка не изменяется значительно во время хранения. Большая часть цинка остается в супернатантной фракции в обоих этих препаратах.

Пример 4.

Стабильность модифицированных цинком препаратов Ultralente человека.

A. Несколько модифицированных цинком препаратов Ultralente человека, полученных по примеру 2, исследуют под микроскопом при увеличении x 43. Все суспензии показывают типичную ромбоэдрическую форму кристаллов Ultralente находящихся в неизменных препаратах. Размеры, формы и степень аггрегации кристаллов в суспензиях, модифицированных цинком являются в сущности неотличимыми от немодифицированной суспензии. Присутствие значительных количеств посторонних, нерастворимых некристаллических частиц в этих препаратах не наблюдается.

Препараты также проявляют те же свойства по отношению к перемешиванию, что и неизмененные препараты Ultralente. После перемешивания кристаллические суспензии также показывают те же свойства по отношению к осаждению, что и неизмененный Ultralente, как в терминах времени, необходимого для полного осаждения кристаллов, так и в примерном объеме осевших кристаллов.

B. Получают обогащенный цинком препарат инсулина Ultralente человека, содержащий около 7,5 мг/мл цинка (подобно образцу 9 по примеру 2). Немодифицированный Ultralente (образец 7 по примеру 2) используют в качестве контроля. Оба образца хранят при 5^oC в течение одного года. В это время кристаллы инсулина повторно растворяют в разбавленной соляной кислоте и оценивают их чистоту на установке для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой. Используют колонку 4,6 x 250 мм Zorbax C-8, содержащую частицы с 150 ангстремными порами при 40^oC. Инсулин элюируют при объемной скорости потока 0,7 мл/мин в градиенте ацетонитрила, содержащего 0,225 М сульфата аммония при pH около 2.

Через один год степень чистоты немодифицированного инсулина Ultralente равна 96,4% при нескольких неидентифицированных пиках в пределах 0,2% каждый и при пике A²¹-дезамидоинсулина около 1%. Препарат Ultralente, содержащий 7,5 мг/мл цинка через один год показывает общую степень чистоты инсулина, равную 96,8% при нескольких неидентифицированных пиках в пределах 0,1 - 0,2% и при пике A²¹-дезамидоинсулина около 1%. Новый, неизвестный пик, элюирующий перед инсулином, но не наблюдаемый в образце немодифицированного Ultralente представлен на уровне 0,3%.

Эти эксперименты показывают, что модифицированные цинком препараты сохраняют стабильность кристаллов Ultralente в терминах их размера и формы. Также, имея высокие уровни цинка в препарате Ultralente они не изменяют значительно химическую чистоту молекулы инсулина после хранения в течение года при 5^oC.

Пример 5.

Испытание растворения состава
Это испытание является модификацией ранее опубликованного испытания, которое находится в Graham and Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36, 427 - 430 (1983), доктрина которых включена сюда путем упоминания. Оно использует скорость растворения кристалла инсулина после значительного разбавления буфером, в котором цинк не связывается, в качестве способа предсказания скорости, с которой кристаллические препараты будут растворяться после подкожной инъекции животным. Это возможно потому, что для суспензий инсулина лимитирующей стадией в вызове биологического ответа является, главным образом, скорость растворения нерастворимого инсулина после инъекции. Таким образом, можно предсказать, что препарат инсулина, который растворяется более медленно при этом испытании по сравнению с Ultralente человека, будет, вероятно, действовать более медленно в биологических моделях.

Готовят три модифицированных цинком препарата Ultralente человека, которые содержат 0,35, 0,7 и 2,5 мг/мл цинка способом, подобным образцу 8 по примеру 2, 0,5 мл порции этих суспензий и 0,5 мл порции неизменных 100 ед. препаратов Ultralente человека и бычьего, каждую, добавляют к 50 мл 0,1 М трис (трис гидроксиметиламинометан, Mallinokrodt, Paris, KY, USA) буфер при pH 7,5, перемешивая при 25^oC в 80 мл стеклянном химическом стакане. Через 3 и 8 часов аликвоты перемешиваемых суспензий удаляют и пропускают через 0,2-микронный фильтр Acrodisc^R.

Количество инсулина в фильтрате определяют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Максимальное содержание инсулина, которое определяют с помощью ВЭЖХ, находится в нефильтрованной подкисленной аликвоте. Таким образом, в начале испытания растворимости нет существенно солюбилизированного инсулина. Данные этих экспериментов представлены в таблице VI.

Этот эксперимент демонстрирует, что неизмененный Ultralente человека повторно растворяется немного быстрее, чем неизмененный бычий Ultralente. Он показывает также, что добавление цинка к Ultralente человека до уровня около 0,7 мг на 100 единиц инсулина делает кристаллы инсулина растворяющимися примерно с той же скоростью как неизменный бычий инсулин Ultralente.

Пример 6.

Испытание растворимости в непрерывном потоке
Это испытание является модификацией проточных тестов, опубликованных ранее Brange, Galenics of Insulin, p. 46, Springer-Verlag, Berlin (1987) и Graham and Pomeroy, J. Pharm. Pharmacol. 36, 427 - 430 (1983), доктрина которых включена сюда путем упоминания, 2 мл аликвоты неизмененного инсулина Ultralente человека и бычьего Ultralente и образец Ultralente человека, содержащего около 0,7 мг цинка на 100 единиц инсулина (по примеру 5), каждый растворяют в 48 мл 0,1 М трис-буфера при pH 7,5. По 50 мл каждой суспензии непосредственно пропускают через 0,2 микронный фильтр Acrodisc^R, и промывают 5 мл воды. Затем каждый фильтр помещают in-line в систему прокачки элюента установки FPL C (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Через каждый фильтр прокачивают свежий 0,1 М трис-буфер с pH 7,5 с объемной скоростью потока 2 мл в минуту. Поглощение элюента после фильтра непрерывно регистрируют спектроскопически по элюированию инсулина в течение более чем двух часов на длине волны 214 нанометров. Различные порции элюента также исследуются с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой для подтверждения присутствия инсулина человека или бычьего инсулина.

Инсулин в кристаллах бычьего Ultralente только очень медленно растворяется в свежем трис-буфере. Элюирование бычьего инсулина подтверждают путем анализа с помощью ВЭЖХ порции элюента. Инсулин в кристаллах неизменного Ultralente человека проявляет быструю скорость растворения, достигающую пика примерно через 35 минут и остающуюся относительно высокой в течение всего эксперимента. Препарат Ultralente человека, содержащий 0,7 мг/мл цинка, проявляет отклик, очень похожий на образец неизмененного Ultralente человека, но не на бычий препарат. Это заставляет считать, что ранняя фильтрационная стадия испытания удаляет весь несвязанный цинк из этого препарата и остающиеся кристаллы ведут себя точно также как кристаллы неизмененного Ultralente человека. Эти данные также демонстрируют изначальную разницу скоростей растворения кристаллов бычьего инсулина и инсулина человека. Данные этих экспериментов представлены ниже в таблице VII.

Таблица VII. Относительное поглощение
Пример 7
Испытания препаратов Ultralente на кроликах
Препараты бычьего Ultralente (40 ед.) и Ultralente человека активностью 40 ед., полученные как показано в образцах 1 - 6 по примеру 2, тестируют на модели нормального кролика. Кролики, которых используют в этом примере, являются New Zealand Whites,
в большинстве своем самки, все весом 2,7 - 4 кг, в возрасте 0,5 - 4 года и голодавшие 16 часов перед введением образца. Суспензии инсулина вводят каждую 10 кроликам подкожно в заднюю часть шеи в дозе 0,2 единицы на килограмм. В различные моменты времени получают 100 ul volumes крови из крайних вен уха, смешивают с 900 ul volumes антикоагулянта (ЭДТА-фторид натрия) и анализируют на содержание глюкозы. Величины содержания глюкозы стандартизируют для отражения процента природной глюкозы в крови, измеренной перед инъекцией образца. Данные этих экспериментов представлены в таблице VIII.

Профиль временного действия в модели кролика является более коротким, чем в человеческой. Это сокращение времени действия ведет к непригодности этой модели для показа существенного различия между неизмененными препаратами бычьего Ultralente и Ultralente человека (сравните образцы 1 и 7). Несмотря на это ограничение этот эксперимент показывает, что биологическое действие инсулина Ultralente человека резко изменяется, когда достаточное количество цинка добавляют к препарату. Как показывают образцы 4 - 6, начало сильного биологического отклика задерживается более, чем на один час, достигая высшей точки между 2 и 4 часами. Максимальное падение глюкозы в крови также уменьшается от около 40% в образцах 1 - 3 (высшая точка через 2 - 4 часа). Таким образом, препараты с достаточным содержанием цинка четко проявляют пролонгированное временное действие, более медленное, чем неизмененные препараты бычьего Ultralente либо Ultralente человека.

Claims

1. Препарат инсулина человека, представляющий собой суспензию соединения цинка с кристаллическим инсулином, отличающийся тем, что использует суспензию кристаллов инсулина человека ультраленте с общим содержанием цинка в препарате 0,5-20 мг на 100 единиц инсулина.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит консерванты.

3. Препарат по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит агенты изотоничности.

4. Препарат по п.3, отличающийся тем, что дополнительно содержит буфер.

5. Препарат по п. 4, отличающийся тем, что общая концентрация цинка в препарате 0,5-7,0 мг на 100 единиц инсулина.

6. Способ получения препарата инсулина путем добавления солей цинка к препарату ультраленте, отличающийся тем, что добавляют соли цинка до конечной концентрации 0,5-20 мг на 100 единиц инсулина.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что соли цинка выбирают из группы, включающей ацетат цинка, бромид цинка, хлорид цинка, иодид цинка, фторид цинка и сульфат цинка.

8. Способ лечения сахарного диабета путем подкожного введения препарата инсулина человека, представляющего собой суспензию соединения цинка с кристаллическим инсулином, отличающийся тем, что используют терапевтически приемлемое количество препарата инсулина человека, содержащего суспензию кристаллов инсулина ультраленте с общим содержанием цинка в препарате 0,5 -20 мг на 100 единиц инсулина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанную подкожную инъекцию назначают один раз в день.