RU2198221C2 - Способ секвенирования полинуклеотида и устройство для его осуществления - Google Patents
Способ секвенирования полинуклеотида и устройство для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2198221C2 RU2198221C2 RU2000104843/13A RU2000104843A RU2198221C2 RU 2198221 C2 RU2198221 C2 RU 2198221C2 RU 2000104843/13 A RU2000104843/13 A RU 2000104843/13A RU 2000104843 A RU2000104843 A RU 2000104843A RU 2198221 C2 RU2198221 C2 RU 2198221C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polymerase
- blocking group
- nucleotides
- polynucleotide
- preceding paragraphs
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 67
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 67
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010071146 DNA Polymerase III Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000007528 DNA Polymerase III Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract 4
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 229940123066 Polymerase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- XYORSKKUGAGNPC-UHFFFAOYSA-N phosphonocarbonylphosphonic acid Chemical group OP(O)(=O)C(=O)P(O)(O)=O XYORSKKUGAGNPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine hydrate Chemical compound O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZBNVNNVXWPVJLX-UHFFFAOYSA-N 1-[(1e)-1-diazoethyl]-2-nitrobenzene Chemical compound [N-]=[N+]=C(C)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O ZBNVNNVXWPVJLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BNWWLXBHLCDJPH-UHFFFAOYSA-N 1-[(e)-diazomethyl]-4,5-dimethoxy-2-nitrobenzene Chemical compound COC1=CC(C=[N+]=[N-])=C([N+]([O-])=O)C=C1OC BNWWLXBHLCDJPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012306 spectroscopic technique Methods 0.000 description 2
- 238000010897 surface acoustic wave method Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- LUJSSEKPLFAUNW-UHFFFAOYSA-N (2-nitro-1-phenylethylidene)hydrazine Chemical compound [O-][N+](=O)CC(=NN)C1=CC=CC=C1 LUJSSEKPLFAUNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUGXZLKUDLDTKX-UHFFFAOYSA-N 1-(2-nitrophenyl)ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SUGXZLKUDLDTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100037091 Exonuclease V Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000881977 Homo sapiens Exonuclease V Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000572 ellipsometry Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии. Проводят реагирование полинуклеотида-мишени с иммобилизованной на твердую подложку полимеразой и различными нуклеотидами в условиях, достаточных для прохождения полимеразной реакции. Выявляют инкорпорации конкретного нуклеотида, комплементарного полинуклеотиду-мишени, путем измерения излучения. Подложка представляет собой сенсорный чип. Оба этапа могут проводить с каждым из различных нуклеотидов по очереди до того момента, как происходит выявление инкорпорации, с последующим повтором этих этапов. Первый этап могут проводить в присутствии всех нуклеотидов. Нуклеотиды могут включать 3'-блокирующую группу, которую удаляют после прохождения реакции полимеризации. Блокирующая группа может быть удалена воздействием пульсирующего монохроматического света. Первый этап может включать дополнительно внесение конкурентного ингибитора полимеразы. Полимеразой может быть ДНК-полимераза III из Е. coli или Taq-полимераза, или обратная транскриптаза. Излучение может быть электромагнитным и относиться к инфракрасной области спектра или относиться к спектру радиочастот. Устройство состоит из оптического сенсорного чипа, несущего иммобилизованную на нем полимеразу. Чип используется в резонансе плазмонов на поверхности или в ядерно-магнитном резонансе источника света. Устройство включает устройство считывания изображения и светочувствительный элемент. Изобретение позволяет ускорить секвенирование полинуклеотида, сделать его менее трудоемким и более дешевым. 2 с. и 20 з.п. ф-лы, 3 ил.
Description
Изобретение касается способа определения последовательности полинуклеотида.
Предпосылки для изобретения
Возможность установления последовательности полинуклеотида имеет огромное научное значение. Например, проект "Геном человека" является амбициозным международным проектом, усилия которого направлены на картирование и секвенирование трех миллиардов пар нуклеотидов, составляющих кодирующие сегменты молекул ДНК в геноме человека. По завершении этого проекта полученная в результате база данных по нуклеотидным последовательностям станет не имеющим аналогов инструментом для биомедицинских исследований. Основной проблемой в успешном завершении данного проекта остается методология, применяемая для нуклеотидного секвенирования.
Возможность установления последовательности полинуклеотида имеет огромное научное значение. Например, проект "Геном человека" является амбициозным международным проектом, усилия которого направлены на картирование и секвенирование трех миллиардов пар нуклеотидов, составляющих кодирующие сегменты молекул ДНК в геноме человека. По завершении этого проекта полученная в результате база данных по нуклеотидным последовательностям станет не имеющим аналогов инструментом для биомедицинских исследований. Основной проблемой в успешном завершении данного проекта остается методология, применяемая для нуклеотидного секвенирования.
В целом, принципиальным подходом для решения задачи крупномасштабного секвенирования ДНК является метод "терминации цепи", известный как "метод Сэйнджера". Этот метод впервые был разработан Сэйнджером и Коулсоном (Sanger et al. , 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467): он направлен на использование дидезоксипроизводных четырех нуклеозидтрифосфатов, которые инкорпорируются в нарастающую полинуклеотидную цепочку в ходе полимеразной реакции. В результате такой инкорпорации дидезоксипроизводное останавливает ("терминирует") полимеразную реакцию, а полученные продукты затем разделяют методом гель-электрофореза и анализируют с целью определения позиции, по которой конкретное дидезоксипроизводное инкорпорировалось в данную полинуклеотидную цепь.
Хотя данный метод широко применяется и дает приемлемые результаты, ясно, что он является медленным, очень трудоемким и дорогостоящим.
Альтернативный способ секвенирования предложен в европейском патенте ЕР А-0-471732, который основан на использовании спектроскопического способа выявления инкорпорации нуклеотида в синтезируемую полинуклеотидную цепь, комплементарную мишени. Этот способ основан на формировании иммобилизованного комплекса матрицы и затравки, который подвергают воздействию потока, содержащего только один из различных нуклеотидов. Затем спектроскопические методики используются для измерения зависимого от времени сигнала, возникающего в ходе роста матрицы, катализируемом полимеразой. Спектроскопические методики, описанные к настоящему времени, - это спектроскопия резонанса плазмонов на поверхности (SPR), с помощью которой измеряют изменения в аналите (в анализируемой среде) в пределах быстро затухающих волновых полей, а также методики измерения флуоресценции. Однако данный способ характеризуется рядом ограничений: наиболее серьезным ограничением метода SPR является то, что по мере роста нуклеотидной цепи абсолютная величина сигнала также увеличивается вследствие перемещения цепи за пределы слабого волнового поля, что затрудняет определение величины прироста. Недостатки методик измерения флуоресценции связаны с увеличением уровня фоновых помех, обусловленных флуорофорами, инкорпорированными в состав растущей новосинтезируемой полинуклеотидной цепи. По мере роста цепи фоновый "шум" нарастает, соответственно должно увеличиваться и время, необходимое для выявления каждой инкорпорации нуклеотида. Это в существенной степени ограничивает применение данного способа для целей секвенирования крупных полинуклеотидов.
Таким образом, имеется необходимость в улучшенном способе установления последовательности полинуклеотида, который существенно увеличил бы скорость секвенирования полинуклеотида и который по преимуществу бил бы автоматизированным, что должно снизить сложность и затратность, характерные для методов, существующих в настоящее время.
Резюме изобретения
Настоящее изобретение базируется на реализации того факта, что измерение электромагнитного или какого-либо иного излучения может быть использовано для выявления изменения конформации и (или) массы полимеразы, происходящего тогда, когда в новосинтезируемую полинуклеотидную цепочку встраивается нуклеотид.
Настоящее изобретение базируется на реализации того факта, что измерение электромагнитного или какого-либо иного излучения может быть использовано для выявления изменения конформации и (или) массы полимеразы, происходящего тогда, когда в новосинтезируемую полинуклеотидную цепочку встраивается нуклеотид.
В соответствии с настоящим изобретением способ секвенирования полинуклеотида включает следующие этапы:
(1) реагирование полинуклеотида-мишени с иммобилизованной на твердую подложку полимеразой и различными нуклеотидами в условиях, достаточных для прохождения полимеразной реакции, и
(2) выявление инкорпорации конкретного нуклеотида, комплементарного полинуклеотиду-мишени, путем измерения излучения.
(1) реагирование полинуклеотида-мишени с иммобилизованной на твердую подложку полимеразой и различными нуклеотидами в условиях, достаточных для прохождения полимеразной реакции, и
(2) выявление инкорпорации конкретного нуклеотида, комплементарного полинуклеотиду-мишени, путем измерения излучения.
Воздействие излучения на какие-либо образцы используют в целом ряде методик, включая поверхностно-чувствительные методы детектирования, в которых изменение оптической реакции, отражения от оптически непрозрачной поверхности используется в качестве индикатора связеобразующих взаимодействий на этой поверхности. В предпочтительном варианте настоящего изобретения применяемой методикой является спектроскопия слабых волн, в частности спектроскопия резонанса плазмонов на поверхности (SPR).
В варианте настоящего изобретения нуклеотиды, используемые в данном способе, включают блокирующую группу по 3'-концу и необязательно по 5'-концу, которые предотвращают инкорпорацию нуклеотидов в состав полинуклеотидной цепи. Однако блокирующие группы могут быть избирательно удалены для того, чтобы открыть возможность инкорпорации. Путем использования заблокированных нуклеотидов возможным становится осуществление данного способа с использованием всех нуклеотидов, присутствующих в данной реакции в любой момент времени. Избирательное удаление блокирующих групп осуществляется таким образом, чтобы имелась возможность выявления каждого инкорпорированного нуклеотида. Следовательно, данный способ может осуществляться в режиме "реального времени", что обеспечит высокую скорость проведения секвенирования.
Описание чертежей
Настоящее изобретение будет описано примерами, в качестве которых выступают исключительно нижеследующие фигуры.
Настоящее изобретение будет описано примерами, в качестве которых выступают исключительно нижеследующие фигуры.
Фигура 1 схематически показывает процесс секвенирования полинуклеотидной последовательности с помощью SPR-спектроскопии.
Фигура 2 a,b,c показывает различные сигналы, выявляемые при полимеризации для каждого из различных нуклеотидов.
Фигура 3 показывает процедуру синтеза для дважды заблокированных нуклеотидов.
Описание изобретения
Представляемый способ секвенирования полинуклеотида включает анализ кинетического взаимодействия между полимеразой, полинуклеотидом-мишенью и комплементарным нуклеотидом. Измерение кинетического взаимодействия осуществляется путем мониторинга изменений параметров или поглощения электромагнитного или какого-либо иного излучения, которое имеет место тогда, когда проходит данная реакция.
Представляемый способ секвенирования полинуклеотида включает анализ кинетического взаимодействия между полимеразой, полинуклеотидом-мишенью и комплементарным нуклеотидом. Измерение кинетического взаимодействия осуществляется путем мониторинга изменений параметров или поглощения электромагнитного или какого-либо иного излучения, которое имеет место тогда, когда проходит данная реакция.
По использованию в данном тексте термин "полинуклеотид" призван пониматься в широком смысле: он включает ДНК и РНК, включая модифицированные ДНК и РНК, а также другие гибридизующие молекулы, сходные с нуклеиновыми кислотами, например нуклеопротеины.
Обычно данный способ осуществляется путем применения электромагнитного излучения с включением методик спектроскопии резонанса плазмонов на поверхности или ядерно-магнитного резонанса. Однако могут применяться и другие методики, которые используются для измерения изменений в уровне излучения, например спектроскопия по полной внутренней ответной флуоресценции (TIRF), по ослаблению полного отражения (ATR), по частотному изменению полного отражения (FTR), по рассеянию полного отражения (STIR), угловая рефлектометрия по Брюстеру или эллипсометрия слабых волн.
Также могут быть рассмотрены методики, отличные от тех, в которых используется электромагнитное излучение, такие как фотохимические методики, базирующиеся на хемолюминесценции; гравиметрические методики, включающие резонансные системы на основе использования поверхностных акустических волн (SAW), или методики с использованием частотного микробаланса кварцевых кристаллов (QCM).
Спектроскопия резонанса плазмонов на поверхности (SPR) является предпочтительным методом; с ее помощью определяют свойства раствора путем установления различий по индексу отражения между основной частью объема раствора и зоной слабого маломощного излучения. Падающий монохроматический свет отражается под конкретным углом от оптически непрозрачной поверхности (сенсорный чип) на противоположную сторону, где находится анализируемый образец. Свет проникает внутрь образца на очень короткое расстояние и сильно изменяется в результате взаимодействия на поверхности.
Подходящие сенсорные чипы (датчики) хорошо известны в данной области техники. Обычно они состоят из оптически прозрачного материала, например стекла, и тонкой отражающей пленки, например серебряной или золотой. Для получения обзорной информации по методу SPR-спектроскопии см. европейскую патентную публикацию 0-648328 (она полностью включена в данный текст для сведения в виде библиографической ссылки).
Спектроскопия по ядерно-магнитонму резонансу (ЯМР) является другим предпочтительным методом: в этом методе измеряются магнитные свойства исследуемых соединений. Ядра элементов, входящих в состав таких соединений, становятся энергетически ориентированными за счет совместного воздействия магнитного поля и радиочастотного излучения. Когда энергия, воздействующая на ядро, равна разнице энергий спиновых состояний (разница между ориентацией, параллельной или антипараллельной по отношению к направлению применямых полей), то достигается состояние резонанса. Процессы поглощения и последующей эмиссии энергии, связанные со сменой одного спинового состояния на другое, выявляются с помощью радиочастотного приемника.
Важным аспектом способа по настоящему изобретению является применение полимеразного фермента (полимеразы), иммобилизованного на твердой подложке. Иммобилизация полимеразы обеспечивает ряд важных преимуществ в достижении успеха применения данного способа. Во-первых, в значительной степени снижена проблема белого "шума", связанная с заметным поглощением энергии растворенными молекулами. Во-вторых, проблема "шума", обусловливаемого взаимодействием любого субстрата (например, нуклеотидов), не вовлекающим напрямую полимеразу, снижается, поскольку полимераза может быть поддержана в пределах участка, конкретно установленного относительно общего поля измерений. Это особенно важно тогда, когда методика, используемая для измерения изменений параметров излучения, основывается на измерении параметров флуоресценции, например, в методе TIRF, когда фоновая флуоресценция возрастает в процессе удлинения синтезируемой цепи. Кроме того, при использовании метода SPR-спектроскопии, полимеразные реакции происходят в пределах полей распространения слабых волн, вследствие чего точные измерения могут быть выполнены вне зависимости от размера полинуклеотида. Наконец, поскольку ни полинуклеотид-мишень, ни олигонуклеотидная затравка не являются необратимым образом присоединенными в твердой подложке, то эта поверхность может быть легко обновлена, что позволит проводить последующее секвенирование с использованием той же самой иммобилизованной полимеразы.
Иммобилизация может быть осуществлена с использованием стандартных процедур, хорошо известных в данной области техники. В частности, может быть осуществлена иммобилизация с использованием стандартной процедуры аминового сочетания, в соответствии с чем осуществляется присоединение ассоциированных с лигандом аминов, например, к активированной декстраном или N-гидроксисукцинимидоэфиром поверхности. В предпочтительном варианте настоящего изобретения полимеразу иммобилизуют на поверхность сенсорного SPR-чипа, который обеспечивает пространственную близость полимеразы с чувствительной поверхностью, на которой могут быть измерены коэффициенты отражения. Примеры процедур, применяемых для иммобилизации биологических молекул на оптические датчики, можно найти в европейском патенте ЕР А 0-589867 и в статье Lofas et al., 1995, Biosens. Bioelectron., 10, 813-822.
Полимеразой, используемой в настоящем изобретении, может быть полимераза любого из известных типов. Например, этой полимеразой может быть любая ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Если полинуклеотид-мишень является молекулой РНК, то такой полимеразой может быть РНК-зависимая ДНК-полимераза, т.е. обратная транскриптаза, или же РНК-зависимая РНК-полимераза, т.е. РНК-репликаза. В предпочтительном варианте настоящего изобретения полимеразой является полимераза Taq. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения полимеразой является голофермент полимеразы III E.coli (McHenry, 1988, Ann. Rev. Biochem. , 57, 519), полимераза Т7 (Schwager et al., 1989/1990, "Methods in Molecular & Cellular Biology", Vol. 1 [4], 155-159) или полимераза, кодируемая геном 5 фага Т7, в комплексе с тиоредоксином кишечной палочки (Tabor et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, 1612-1623). Каждая из этих полимераз обеспечивает связывание с полинуклеотидом-мишенью, сообщая ему высокую подвижность, что тем самым обеспечивает поддержание комплекса "полинуклеотид-полимераза" даже тогда, когда активная реакция полимеризации и не происходит.
Голофермент пслимеразы III составлен тремя компонентами, которые в сочетании формируют активный фермент: (I) полимеразный кор, включающий α-субъединицу полимеразы; (II) димер β-субъединицы, который выполняет роль своеобразного "браслета", образующегося вокруг ДНК; и (III) подкомплекс, образуемый двумя субъединицами - τ и γ, роль которых связана со связыванием и гидролиза АТФ, с образованием β-димера вокруг ДНК.
На первом этапе процесса секвенирования полинуклеотид-мишень может быть проконтактирован c подходящей затравкой в гибридизационно-полимеризационном буфере. Обычно буфер должен иметь температуру, достаточно высокую для того, чтобы разрушить (или расплавить) любые вторичные структуры, которые могут иметься в полинуклеотиде-мишени. После охлаждения затравка претерпит отжиг на свой комплемент в составе мишени. Полученный образец затем может быть проконтактирован с иммобилизованной полимеразой с образованием комплекса "полинуклеотид-мишень/полимераза".
В одном из вариантов настоящего изобретения добавление нуклеотидов контролируется таким образом, чтобы различные нуклеотиды добавлялись к комплексу "полимераза/мишень" последовательно. Например, может быть добавлен и оставлен для протекания через комплекс "полимераза/полинуклеотид" нуклеотид дГТФ: любая произошедшая инкорпорация затем выявляется. Несвязанный дГТФ выходит из реактивного сайта и тогда же вносится следующий нуклеотид. Таким образом, выявление кинетического взаимодействия может быть связано с конкретным, присутствующим в данный момент нуклеотидом, соответственно может быть определена последовательность полинуклеотида.
Данный способ также может быть осуществлен с использованием всех имеющихся нуклеотидов. Для успешного осуществления такого варианта необходимым является внесение в нуклеотиды блокирующих (защитных) групп, по крайней мере, по 3'-положению, а предпочтительно по 3' и по 5'-положениям. Блокирующие группы могут быть светочувствительными и могут быть удалены путем обработки светом определенной длины волны с выходом активной молекулы. Если нуклеотиды несут блокирующие группы по обоим 3'- и 5'-положениям, то блокирующие группы должны быть различимы по своим спектральным характеристикам, т.е. должна иметься возможность избирательного удаления одной из блокирующих групп путем применения света конкретной длины волны, которая бы не приводила к удалению другой блокирующей группы. Также является желательным, чтобы расположенная по 3'-положению блокирующая группа нуждалась для своего удаления в более продолжительной обработке светом по сравнению с таковой характеристикой 5'-блокирующей группы. Это обеспечивает различение блокирующих групп как по спектральным свойствам, так и по временной характеристике.
В целом, светочувствительные блокирующие группы претерпевают протеолиз при длинах волн в пределах от 200 до 450 нм. Блокирующие группы обычно являются производными соединения формулы R1[O-СО-]Х, где R1 представлен фотолабильной группой, а Х является отщепляемой группой. Например, R1 является о-нитробензилом. Конкретными предпочтительными блокирующими группами являются о-нитробензильные защитные группы, описанные в международных патентных заявках WO A-92/10092 и WO A-97/39151. Эти группы включают нитровератрилоксикарбонил (NVOC), нитропиперонилоксикарбонил (NPOC), α-метилнитровератрилоксикарбонил (MeNVOC), α-метилнитропиперонилоксикарбонил (MeNPOC) и 1-пиренилметилоксикарбонил (PYMOC).
Подходящей 3'-блокирующей группой является (4/5-диметокси-2-нитро-бензил)оксикарбонильная группа, которая может быть получена в реакции нуклеотида с соединением формулы I
где R является любой подходящей этерифицирующей группой, например метилом. Эта блокирующая группа может быть избирательным образом удалена с помощью пульсирующего освещения при длине волны 360 нм.
где R является любой подходящей этерифицирующей группой, например метилом. Эта блокирующая группа может быть избирательным образом удалена с помощью пульсирующего освещения при длине волны 360 нм.
Подходящей блокирующей группой по 5'-положению является 1-(2-нитрофенил)этиловая группа (II):
где R является любой подходящей функциональной группой, например галогеном. Эта блокирующая группа может быть избирательным образом удалена светом с длиной волны 260 нм.
где R является любой подходящей функциональной группой, например галогеном. Эта блокирующая группа может быть избирательным образом удалена светом с длиной волны 260 нм.
В качестве примера дважды заблокированные нуклеотиды были внесены в затравочный полинуклеотид-мишень (поддерживаемый в характеризующемся высокой степенью гибкости комплексе с полимеразой), а монохроматическое освещение было сфокусировано выше сайта полимеразы и имело длину волны, достаточную для удаления блокирующей группы от концевого фосфата каждого нуклеотида. Затем нуклеотиды имели возможность протечь мимо связанной полимеразы: соответственно могло иметь место встраивание нуклеотида в растущую полинуклеотидную цепь. Однако в тех случаях, когда блокирующая группа по 3'-положению оставалась связанной, инкорпорировался только один нуклеотид. Тогда измерение кинетических параметров взаимодействия позволит получить информацию по конкретному нуклеотиду, встроившемуся в растущую цепь. Используемой полимеразой может быть высоколабильная полимераза, которая не диссоциируется из комплекса сразу после того, как реакция полимеризации останавливается. С другой стороны, может быть использован конкурентный ингибитор, который бы предотвращал диссоциацию полимеразы из мишени.
После определения встроившегося нуклеотида пульс монохроматического света фокусируют на блокирующей группе каталитического полимеразного сайта с целью удаления блокирующей группы по 3'-положению. Пульсация монохроматического света может быть более продолжительной по сравнению с требуемой для удаления 5'-блокирующей группы, в результате только ассоциированная с нуклеотидом блокирующая группа в полимеразном комплексе будет удалена. Это снижает вероятность добавления нуклеотидов, не связанных с полимеразным комплексом.
Как только блокирующая группа по 3'-положению удалена, полимеразная реакция может быть продолжена по мере появления следующих нуклеотидов в сайте полимеразной реакции. Неконтролируемая полимеризация предотвращается путем чередования пульсов, необходимых для удаления блокирующих групп.
Хотя предпочтительным является использование дважды заблокированных нуклеотидов (в соответствии с описанным выше), тем не менее данная процедура также может быть осуществлена с использованием нуклеотидов, характеризующихся наличием только 3'-блокирующей группы. В этом случае желательным является использование конкурентного ингибитора полимеразы, который бы снижал вероятность встраивания нуклеотида, лишенного блокирующей группы по 3'-положению, в состав растущей нуклеотидной цепи. Подходящим конкурентным ингибитором полимеразы является карбонилдифосфонат (COMDP).
Нижеследующий пример илюстрирует настоящее изобретение вкупе с прилагаемыми чертежами.
Пример
Нижеследующий анализ был проведен с применением модифицированной системы BIAcore (BIAcore АВ, Uppsala, Швеция), включающей сенсорный чип СМ5 (экспериментальный тип: BIAcore АВ) в качестве оптической сенсорной поверхности. Аппаратура была оснащена интегрированным мкм-струйным картриджем (IFC), который позволял анализировать четыре камеры за одно внесение образца.
Нижеследующий анализ был проведен с применением модифицированной системы BIAcore (BIAcore АВ, Uppsala, Швеция), включающей сенсорный чип СМ5 (экспериментальный тип: BIAcore АВ) в качестве оптической сенсорной поверхности. Аппаратура была оснащена интегрированным мкм-струйным картриджем (IFC), который позволял анализировать четыре камеры за одно внесение образца.
Получение полимеразы
Голофермент полимеразы III E.coli был получен в соответствии с Millard et al. , 1995, Methods Enzymol., 262, 22) с использованием гидрофобной хроматографии взаимодействия на валил-сефарозных колонках с целью очистки голофермента при высоких солевых концентрациях. После очистки голофермент концентрировали с использованием метода ионной фильтрации, описанного Киркгаардом с соавт. (Kirkegaard et al., 1972, Anal. Biochem., 50, 122).
Голофермент полимеразы III E.coli был получен в соответствии с Millard et al. , 1995, Methods Enzymol., 262, 22) с использованием гидрофобной хроматографии взаимодействия на валил-сефарозных колонках с целью очистки голофермента при высоких солевых концентрациях. После очистки голофермент концентрировали с использованием метода ионной фильтрации, описанного Киркгаардом с соавт. (Kirkegaard et al., 1972, Anal. Biochem., 50, 122).
Иммобилизация полимеразы
Иммобилизацию полимеразы на поверхность сенсорного чипа осуществляли в соответствии с Jonsson et al., 1991, Biotechniques, 11, 620-627. Вкратце, среду сенсорного чипа уравновешивали буфером HEPES (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% сурфактанта Р20 [BIAcore AB, Uppsala, Швеция], рН=7,4). Равные объемы N-гидроксисукцинимида (0,1 М в воде) и N-этил-N'-(диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) (0,1 М в воде) смешивали друг с другом и наносили на поверхность чипа СМ5 с целью активации карбоксиметилированного декстрана. Частично собранный кор фрагмента полимеразы III (160 мкл, 500 ед.) смешивали с 10 мМ ацетата натрия (100 мкл, рН=5) и наносили на активированную поверхность. Наконец, остаточные N-гидроксисукцинимидоэфиры, имеющиеся на поверхности сенсорного чипа, реагировали с этаноламином (35 мкл, 1 М в воде; рН=8,5) и смывали с поверхности несвязавшуюся полимеразу. Процедуру иммобилизации осуществляли в непрерывном потоке буфера HEPES (5 мкл/мин) при температуре 25oС.
Иммобилизацию полимеразы на поверхность сенсорного чипа осуществляли в соответствии с Jonsson et al., 1991, Biotechniques, 11, 620-627. Вкратце, среду сенсорного чипа уравновешивали буфером HEPES (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% сурфактанта Р20 [BIAcore AB, Uppsala, Швеция], рН=7,4). Равные объемы N-гидроксисукцинимида (0,1 М в воде) и N-этил-N'-(диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) (0,1 М в воде) смешивали друг с другом и наносили на поверхность чипа СМ5 с целью активации карбоксиметилированного декстрана. Частично собранный кор фрагмента полимеразы III (160 мкл, 500 ед.) смешивали с 10 мМ ацетата натрия (100 мкл, рН=5) и наносили на активированную поверхность. Наконец, остаточные N-гидроксисукцинимидоэфиры, имеющиеся на поверхности сенсорного чипа, реагировали с этаноламином (35 мкл, 1 М в воде; рН=8,5) и смывали с поверхности несвязавшуюся полимеразу. Процедуру иммобилизации осуществляли в непрерывном потоке буфера HEPES (5 мкл/мин) при температуре 25oС.
Олигонуклеотиды
Два олигонуклеотида были синтезированы с применением стандартных методов фосфорамидитного синтеза. Олигонуклеотид, обозначенный как SEQ ID NО 1, был использован в качестве полинуклеотида-мишени, а олигонуклеотид, обозначенный как SEQ ID NO 2, был использован в качестве затравки.
Два олигонуклеотида были синтезированы с применением стандартных методов фосфорамидитного синтеза. Олигонуклеотид, обозначенный как SEQ ID NО 1, был использован в качестве полинуклеотида-мишени, а олигонуклеотид, обозначенный как SEQ ID NO 2, был использован в качестве затравки.
CAАGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG
(SEQ ID NO 1)
CTCTCCCTTCTCTCGTC
(SEQ ID NO 2)
Два олигонуклеотида реагировали в необходимых для гибридизации условиях с образованием комплекса "мишень-затравка".
(SEQ ID NO 1)
CTCTCCCTTCTCTCGTC
(SEQ ID NO 2)
Два олигонуклеотида реагировали в необходимых для гибридизации условиях с образованием комплекса "мишень-затравка".
Затем подвергнутую праймингу ДНК суспендировали в буфере (20 мМ Трис-HCl, рН=7,5; 8 мМ МgСl2, 4% [объемные проценты] глицерина, 5 мМ дитиотреитола [DDT], 40 мкг бычьего сывороточного альбумина), содержащем 21 мкг связывающегося с одноцепочечной ДНК белка и частично собранную ДНК-полимеразу III, необходимые для образования структуры типа "браслета" (1,6 пкМ β-димера и 195 фМ γ-субъединицы). Также присутствовали 0,5 мМ АТФ наряду с 60 мкМ карбонилдифосфоната (COMDP). В этой реакции γ-субъединица действует как молекулярный "бикфордов шнур", гидролизуя АТФ, что обеспечивает размещение субъединиц β-димера вокруг ДНК с образованием частично собранной полимеразы (Studwell et al., 1990, UCLA Symp. Mol, Cell. Biol., New Series, 127, 153).
Комплекс, образованный подвергнутой праймингу ДНК и частично собранной полимеразой, затем наносили поверх полимеразы III на поверхности сенсорного чипа при скорости потока 5 мкм/мин и оставляли для обеспечения связывания полимеразы, опосредуемое через действие γ-субъединиц.
В этом эксперименте необходимыми для связывания полимеразы III с праймированной ДНК являются ионы магния и АТФ. Однако ионы магния также ускоряют удаление затравки за счет корректировки активности экзонуклеазы 5'-->3'. Эта проблема может быть решена путем включения карбонилдифосфоната, который является конкурентным ингибитором полимеразной активности (полимераза III, не имеющая активности экзонуклеазы 5'-->3', может быть использована для решения данной конкретной проблемы).
На поверхности чипа поддерживается непрерывный поток 60 мМ карбонилдифосфоната, целью чего является предотвращение экзонуклеазной активности по удалению в ее результате затравки от ДНК-мишени.
Инкорпорация нуклеотидов с двумя блокирующими группами.
Каждый нуклеотид (дЦТФ, дТТФ, дГТФ и дАТФ) включал 1-(2-нитрофенил)этиловую блокирующую группу по 5' положению и (4,5-диметокси-2-нитробензил) оксикарбонильную блокирующую группу по 3'-положению, что показано на фиг.3. Синтез дважды заблокированных нуклеотидов проводился следующим образом.
Стадия 1. Синтез (4,5-диметоксинитробензил)-оксикарбонилнуклеозидтрифосфата.
Один и тот же подход был применен в отношении нуклеотидов дЦТФ, дТТФ, дГТФ и дАТФ. Смесь дАТФ-дигидрата (0,4 ммоль) и приблизительно 3 ммоль 4,5-диметокси-2-нитрофенилдиазометана, свежеприготовленного из 900 мг (4 ммоль) 4,5-диметокси-2-нитрофенилгидразона (синтезированного путем обработки 6-нитроверальдегида гидразинмоногидратом в хлороформе в соответствии с процедурой Wootton & Trentham, 1989, "Photochemical Probes in Biochem.", ed. P.E.Nielsen, NATO ASI Ser. C, Vol., 272, 277-296), перемешивали в 15 мл ДМСО при комнатной температуре в темноте в течение 40 часов. Контроль за ходом реакции с помощью тонкослойной хроматографии в смеси хлороформа и метанола (5: 1 - объемное соотношение) подтвердил появление пятна с Rf=0,54, что соответствует данному нуклеотиду. ДМСО, непрореагировавшее диазосоединение и продукты реакции с низким показателем полярности были удалены путем повторной экстракции в 60 мл эфира. Оставшийся материал, который помимо других соединений включал непрореагировавший нуклеотид и желаемый продукт, был растворен в минимальном количестве хлороформа и разделен методом тонкослойной хроматографии на силикагеле (3х30 см). С помощью элюции 100%-ным хлороформом и смесью метанола и хлороформа (95:5 - объемное соотношение) удаляли с колонки гидрофобные побочные продукты 4,5-диметокси-2-нитрофенилдиазометана. Фракции высушивали с использованием роторного испарителя. Лиофилизации подвергали 78 мг собранного продукта. Общий выход составил 45%. дАТФ с 4,5-диметилокси-2-нитробензилоксикарбонильной 3'-блокирующей группой выделяли напрямую из неочищенного продукта с высокой степенью чистоты с помощью препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой.
Стадия 2. Добавление 5'-1-(2-нитрофенил)этиловой группы к 3'-4,5-диметокси-2-нитробензилоксикарбонила блокированного дАТФ.
Смесь 4,5-диметокси-2-нитробензилоксикарбонил-5'-дАТФ (0,4 ммоль) и приблизительно 3 ммоль 1-(2-нитрофенил)диазоэтана, свежеприготовленного из 716,7 мг (4 ммоль) гидразона 2-нитроацетофенона (синтезированного путем обработки 2-нитроацетофенона гидразинмоногидратом в этаноле) и 2,9 г (30 ммоль) МnО2 (90%) в 20 мл хлороформа в соответствии с процедурой, описанной ранее (Walker et al., 1989, Methods Enzymol., 172, 288-301), перемешивали в 15 мл ДМСО при комнатной температуре в темноте в течение 40 часов. Контроль за реакцией, осуществлявшийся с помощью ТСХ в системе хлороформ/ метанол (объемное соотношение 5:1), показал появление пары зон с величинами Rf=0,68 и Rf=0,58, соответствующих двух диастереоизомерам аксиальной и двум диастереоизомерам экваториальной форм 1-(2-нитрофенил)этилового эфира 4,5-диметокси-2-нитробензилоксикарбонил-5'- дАТФ соответственно. ДМСО, непрореагировавшее диазосоединение и продукты реакции с низким показателем полярности были удалены путем повторной экстракции в 50 мл эфира.
Оставшийся материал, который помимо прочего включал непрореагировавший 4,5-диметокси-2-нитробензилоксикарбонил-5'- дATФ и искомый дважды заблокированный дАТФ, растворяли в минимальном количестве хлороформа и разделяли методом тонкослойной хроматографии на силикагелевой колонке размером 3х30 см. С помощью элюции 100%-ным хлороформом удаляли с этой колонки гидрофобные побочные продукты 1-(2-нитрофенил)диазоэтана. Полученный продукт высушивали в роторном испарителе. Лиофилизация позволила получить 74 мг итогового соединения. Общий выход составил 57%.
В полимеризационном буфере (1 мМ Трис-HC1 - рН=8,8; 5 мМ KCI, 0,15 мМ MgCl2, 0,01% желатина (весовые проценты)) присутствовало по 0,2 мМ каждого из нуклеотидов.
Секвенирование ДНК
На фиг. 1 показана SPR-система и проточная камера [7], оснащенная приспособлением для применения электромагнитного излучения [1] в сторону сенсорного чипа [2] с иммобилизованной на его поверхности полимеразой [3], имеющим входное отверстие [4] для внесения нуклеотидов в камеру и два фокусирующих узла [5 и 6], предназначенные для подачи пульсов монохроматического света в камеру.
На фиг. 1 показана SPR-система и проточная камера [7], оснащенная приспособлением для применения электромагнитного излучения [1] в сторону сенсорного чипа [2] с иммобилизованной на его поверхности полимеразой [3], имеющим входное отверстие [4] для внесения нуклеотидов в камеру и два фокусирующих узла [5 и 6], предназначенные для подачи пульсов монохроматического света в камеру.
Различные нуклеотиды вносили через проточную камеру при скорости протока в ней 30 мкл/мин при температуре 25oС и интенсивности сбора данных 10 Гц. По мере прохождения нуклеотидов мимо фокусирующего узла [5] осуществляется пульсация монохроматического света с длиной волны 260 нм, что имеет целью удаление блокирующей группы по 5'-положению. Затем нуклеотиды протекают по сенсорным чипам [2] и контактируют с комплексом, образованным полинуклеотидом-мишенью и полимеразой [3], который удерживается на месте за счет неполной сборки β-димера. Поскольку 3'-положение в затравочной последовательности свободно для реагирования, полимеризация может иметь место тогда, когда нуклеотид встраивается в свой комплемент на целевом полинуклеотиде. Это встраивание затем выявляется с помощью монохроматического р-поляризованного света SPR-устройства. Дальнейшая полимеризация уже невозможна, поскольку инкорпорировавшийся нуклеотид защищен по своему 3'-положению блокирующей группой. Затем через фокусирующий узел [6] осуществляют воздействие пульсами монохроматаческого света с длиной волны 360 нм по сайту реакции полимеризации. Высокая скорость потока в проточной камере обеспечивает удаление несвязавшихся полимеразой нуклеотидов из камеры до того, как будет накоплена достаточная энергия, которой бы хватило для удаления у них 3'-блокирующих групп.
Как только 3'-блокирующая группа удаляется из полимеризовавшегося нуклеотида, может происходить дальнейшая реакция полимеризации.
На фиг.2 показаны результаты экспериментального секвенирования, в котором каждый из встраивающихся в растущую полинуклеотидную цепь нуклеотидов был определен. Полученные результаты подтвердили, что полученная последовательность комплементарна той, которая показана в SEQ ID NO 1.
Список последовательностей приведен в конце описания.
Claims (22)
1. Способ секвенирования полинуклеотида, включающий этапы: (а) реагирование полинуклеотида-мишени с полимеразой, иммобилизованной на твердой подложке, и различными нуклеотидами в условиях, обеспечивающих полимеразную реакцию; и (b) детекцию проявления последствий инкорпорации конкретного нуклеотида, комплементарного полинуклеотиду - мишени, которая осуществляется путем измерения излучения.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная твердая подложка представляет собой сенсорный чип.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что этапы (а) и (b) осуществляются с каждым из различных нуклеотидов по очереди до того момента, как происходит выявление инкорпорации, с последующим повтором этих этапов.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что этап (а) осуществляется в присутствии всех нуклеотидов.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что нуклеотиды включают 3'-блокирующую группу, которую удаляют после прохождения реакции полимеризации.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что блокирующая группа может быть избирательно удалена воздействием пульсирующего монохроматического света.
7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что нуклеотиды включают дополнительную блокирующую группу по концевому фосфатному остатку в трифосфатной цепочке, а дополнительная блокирующая группа удаляется до удаления 3'-блокирующей группы.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что дополнительная блокирующая группа может быть избирательно удалена действием пульсирующего монохроматического света в условиях, отличающихся от тех, которые необходимы для удаления 3'-блокирующей группы.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что дополнительная блокирующая группа удаляется действием пульсирующего монохроматического света в течение времени отличного от требуемого для удаления 3'-блокирующей группы.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что этап (а) дополнительно включает внесение конкурентного ингибитора полимеразы.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полинуклеотид-мишень на этапе (а) связан с полимеразой за счет β2-димерного комплекса.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полимеразой является ДНК-полимераза III E. coli или полимераза Т7.
13. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что полимеразой является Таq-полимераза.
14. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что полимеразой является обратная транскриптаза.
15. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что этап (b) включает выявление изменений резонансного сигнала во времени.
16. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что излучение является электромагнитным.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что электромагнитное излучение относится к инфракрасной области спектра.
18. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что этап (b) включает применение резонанса плазмонов на поверхности.
19. Способ по п.16, отличающийся тем, что электромагнитное излучение относится к спектру радиочастот.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что инкорпорация нуклеотида определяется с применением ядерно-магнитного резонанса.
21. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полинуклеотидом является ДНК.
22. Устройство для секвенирования полинуклеотида, состоящее из оптического сенсорного чипа, несущего иммобилизованную на нем полимеразу, используемого в резонансе плазмонов на поверхности или в ядерно-магнитном резонансе источника света, устройства считывания изображения и светочувствительного элемента.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9715942.0A GB9715942D0 (ru) | 1997-07-28 | 1997-07-28 | |
| GB9715942.0 | 1997-12-22 | ||
| GBGB9727103.5A GB9727103D0 (ru) | 1997-12-22 | 1997-12-22 | |
| GB9727103.5 | 1997-12-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000104843A RU2000104843A (ru) | 2002-03-10 |
| RU2198221C2 true RU2198221C2 (ru) | 2003-02-10 |
Family
ID=26311958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000104843/13A RU2198221C2 (ru) | 1997-07-28 | 1998-07-24 | Способ секвенирования полинуклеотида и устройство для его осуществления |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7008766B1 (ru) |
| EP (4) | EP1229133B1 (ru) |
| JP (1) | JP2001511358A (ru) |
| KR (1) | KR100664331B1 (ru) |
| CN (1) | CN1152140C (ru) |
| AT (1) | ATE225858T1 (ru) |
| AU (1) | AU735898B2 (ru) |
| BR (1) | BR9812270A (ru) |
| CA (1) | CA2294962C (ru) |
| DE (1) | DE69808661T3 (ru) |
| DK (1) | DK1017848T3 (ru) |
| ES (1) | ES2183394T5 (ru) |
| IL (1) | IL133411A (ru) |
| IS (1) | IS5360A (ru) |
| NZ (1) | NZ502557A (ru) |
| PT (1) | PT1017848E (ru) |
| RU (1) | RU2198221C2 (ru) |
| WO (1) | WO1999005315A2 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2432205C2 (ru) * | 2005-06-23 | 2011-10-27 | Биокартис С.А. | Картридж, система и способ автоматизированной медицинской диагностики |
| RU2478710C2 (ru) * | 2005-09-16 | 2013-04-10 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способы генетического контроля поражения растений насекомыми и применяемые для этого композиции |
| US8946510B2 (en) | 2004-04-09 | 2015-02-03 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| RU2772924C1 (ru) * | 2018-12-21 | 2022-05-27 | Иллумина, Инк. | Сенсорные системы |
| US11782006B2 (en) | 2018-12-21 | 2023-10-10 | Illumina, Inc. | Sensing systems |
Families Citing this family (148)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9620209D0 (en) * | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| WO1998035012A2 (en) | 1997-02-12 | 1998-08-13 | Chan Eugene Y | Methods and products for analyzing polymers |
| RU2198221C2 (ru) * | 1997-07-28 | 2003-02-10 | Медикал Биосистемз Лтд. | Способ секвенирования полинуклеотида и устройство для его осуществления |
| US6780591B2 (en) | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US7875440B2 (en) | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US6787308B2 (en) | 1998-07-30 | 2004-09-07 | Solexa Ltd. | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
| WO2002061127A2 (en) * | 2001-01-30 | 2002-08-08 | Solexa Ltd. | Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis |
| AU2180200A (en) * | 1998-12-14 | 2000-07-03 | Li-Cor Inc. | A heterogeneous assay for pyrophosphate detection |
| PT1159453E (pt) | 1999-03-10 | 2008-08-29 | Asm Scient Inc | Processo para sequenciação directa de ácidos nucleicos |
| AU2005201777B2 (en) * | 1999-03-10 | 2007-08-02 | Asm Scientific, Inc. | A Method for Direct Nucleic Acid Sequencing |
| GB9907813D0 (en) | 1999-04-06 | 1999-06-02 | Medical Biosystems Ltd | Synthesis |
| GB9907812D0 (en) * | 1999-04-06 | 1999-06-02 | Medical Biosystems Ltd | Sequencing |
| AU5059800A (en) * | 1999-04-08 | 2000-11-14 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Nucleoside derivatives with photo-unstable protective groups |
| EP1681356B1 (en) * | 1999-05-19 | 2011-10-19 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
| US7056661B2 (en) | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
| US7501245B2 (en) | 1999-06-28 | 2009-03-10 | Helicos Biosciences Corp. | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| US6818395B1 (en) | 1999-06-28 | 2004-11-16 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences |
| US6927065B2 (en) | 1999-08-13 | 2005-08-09 | U.S. Genomics, Inc. | Methods and apparatus for characterization of single polymers |
| US6982146B1 (en) | 1999-08-30 | 2006-01-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | High speed parallel molecular nucleic acid sequencing |
| WO2001016375A2 (en) * | 1999-08-30 | 2001-03-08 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | High speed parallel molecular nucleic acid sequencing |
| US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US7211390B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-05-01 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US6908736B1 (en) | 1999-10-06 | 2005-06-21 | Medical Biosystems, Ltd. | DNA sequencing method |
| GB9923644D0 (en) * | 1999-10-06 | 1999-12-08 | Medical Biosystems Ltd | DNA sequencing |
| AU2170901A (en) * | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Lion Bioscience Ag | Branched compound for use in nucleic acid detection and analysis reactions |
| GB0002389D0 (en) * | 2000-02-02 | 2000-03-22 | Solexa Ltd | Molecular arrays |
| GB0016473D0 (en) | 2000-07-05 | 2000-08-23 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Sequencing method |
| CN101525660A (zh) | 2000-07-07 | 2009-09-09 | 维西根生物技术公司 | 实时序列测定 |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| EP3034627B1 (en) | 2000-10-06 | 2019-01-30 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| EP1354064A2 (en) | 2000-12-01 | 2003-10-22 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| JP2004523243A (ja) | 2001-03-12 | 2004-08-05 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置 |
| GB0112238D0 (en) * | 2001-05-18 | 2001-07-11 | Medical Biosystems Ltd | Sequencing method |
| US7118907B2 (en) | 2001-06-06 | 2006-10-10 | Li-Cor, Inc. | Single molecule detection systems and methods |
| US6613523B2 (en) * | 2001-06-29 | 2003-09-02 | Agilent Technologies, Inc. | Method of DNA sequencing using cleavable tags |
| US7668697B2 (en) * | 2006-02-06 | 2010-02-23 | Andrei Volkov | Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level |
| US6852492B2 (en) * | 2001-09-24 | 2005-02-08 | Intel Corporation | Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication |
| US6902921B2 (en) | 2001-10-30 | 2005-06-07 | 454 Corporation | Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase |
| US6956114B2 (en) | 2001-10-30 | 2005-10-18 | '454 Corporation | Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase |
| GB0129012D0 (en) | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Solexa Ltd | Labelled nucleotides |
| US7057026B2 (en) | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
| US7414116B2 (en) | 2002-08-23 | 2008-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| US11008359B2 (en) | 2002-08-23 | 2021-05-18 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| EP3795577A1 (en) | 2002-08-23 | 2021-03-24 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotides |
| ATE546525T1 (de) | 2003-01-29 | 2012-03-15 | 454 Life Sciences Corp | Nukleinsäureamplifikation auf basis von kügelchenemulsion |
| US7575865B2 (en) | 2003-01-29 | 2009-08-18 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
| US7151598B2 (en) * | 2003-04-04 | 2006-12-19 | Vladimir Poponin | Method and apparatus for enhanced nano-spectroscopic scanning |
| EP1616157B1 (en) * | 2003-04-04 | 2012-05-09 | VP Holding, LLC | Method and apparatus for enhanced nano-spectroscopic scanning |
| JP2004347621A (ja) * | 2003-04-24 | 2004-12-09 | Dainippon Printing Co Ltd | 透過型スクリーン |
| GB0316553D0 (en) * | 2003-07-15 | 2003-08-20 | Densham Daniel | Method |
| US20070122808A1 (en) * | 2003-07-15 | 2007-05-31 | Densham Daniel H | Measurement of a polynuleotide amplification reaction |
| GB0317343D0 (en) * | 2003-07-24 | 2003-08-27 | Medical Biosystems Ltd | Polynucleotide sequencing |
| US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
| JP2007518107A (ja) | 2004-01-13 | 2007-07-05 | ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド | ポリマーを使用する溶液中の分析物の検出および定量化 |
| US7595160B2 (en) | 2004-01-13 | 2009-09-29 | U.S. Genomics, Inc. | Analyte detection using barcoded polymers |
| CA2557177A1 (en) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Stephen Quake | Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences |
| JP2008512084A (ja) | 2004-05-25 | 2008-04-24 | ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション | 核酸の配列決定のための方法およびデバイス |
| US7476734B2 (en) | 2005-12-06 | 2009-01-13 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
| GB0413082D0 (en) | 2004-06-11 | 2004-07-14 | Medical Biosystems Ltd | Method |
| US7170050B2 (en) | 2004-09-17 | 2007-01-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Apparatus and methods for optical analysis of molecules |
| US7315019B2 (en) | 2004-09-17 | 2008-01-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Arrays of optical confinements and uses thereof |
| US7220549B2 (en) | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
| US7482120B2 (en) | 2005-01-28 | 2009-01-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7274458B2 (en) | 2005-03-07 | 2007-09-25 | 3M Innovative Properties Company | Thermoplastic film having metallic nanoparticle coating |
| US7666494B2 (en) | 2005-05-04 | 2010-02-23 | 3M Innovative Properties Company | Microporous article having metallic nanoparticle coating |
| EP1901057A1 (en) * | 2005-07-07 | 2008-03-19 | Sony Corporation | Substance information acquisition method and substance information measurement device using evanescent light, and base arrangement decision method and device |
| JP2009501095A (ja) | 2005-07-14 | 2009-01-15 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 金属性ナノ粒子コーティングを有する水溶性ポリマー基材 |
| US7805081B2 (en) * | 2005-08-11 | 2010-09-28 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source |
| GB0517097D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Solexa Ltd | Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof |
| US7666593B2 (en) | 2005-08-26 | 2010-02-23 | Helicos Biosciences Corporation | Single molecule sequencing of captured nucleic acids |
| US7405281B2 (en) | 2005-09-29 | 2008-07-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor |
| US7763423B2 (en) | 2005-09-30 | 2010-07-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Substrates having low density reactive groups for monitoring enzyme activity |
| US7998717B2 (en) | 2005-12-02 | 2011-08-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Mitigation of photodamage in analytical reactions |
| US8703734B2 (en) | 2005-12-12 | 2014-04-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Nanoprobes for detection or modification of molecules |
| EP1960550B1 (en) | 2005-12-12 | 2010-09-15 | The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services | Probe for nucleic acid sequencing and methods of use |
| US7995202B2 (en) | 2006-02-13 | 2011-08-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources |
| US7692783B2 (en) | 2006-02-13 | 2010-04-06 | Pacific Biosciences Of California | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources |
| US7715001B2 (en) | 2006-02-13 | 2010-05-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources |
| US7397546B2 (en) | 2006-03-08 | 2008-07-08 | Helicos Biosciences Corporation | Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam |
| US8975216B2 (en) | 2006-03-30 | 2015-03-10 | Pacific Biosciences Of California | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same |
| US7563574B2 (en) | 2006-03-31 | 2009-07-21 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods, systems and compositions for monitoring enzyme activity and applications thereof |
| US8207509B2 (en) | 2006-09-01 | 2012-06-26 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Substrates, systems and methods for analyzing materials |
| CA2662521C (en) * | 2006-09-01 | 2016-08-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Substrates, systems and methods for analyzing materials |
| US20080076123A1 (en) * | 2006-09-27 | 2008-03-27 | Helicos Biosciences Corporation | Polymerase variants for DNA sequencing |
| US20080080059A1 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modular optical components and systems incorporating same |
| WO2008042067A2 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
| US7883869B2 (en) | 2006-12-01 | 2011-02-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| US8551704B2 (en) | 2007-02-16 | 2013-10-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Controllable strand scission of mini circle DNA |
| US20100167413A1 (en) * | 2007-05-10 | 2010-07-01 | Paul Lundquist | Methods and systems for analyzing fluorescent materials with reduced autofluorescence |
| US20080277595A1 (en) * | 2007-05-10 | 2008-11-13 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Highly multiplexed confocal detection systems and methods of using same |
| DE102007022915A1 (de) * | 2007-05-14 | 2008-11-20 | Stiftung Caesar Center Of Advanced European Studies And Research | Polymerisationssensor |
| US7901889B2 (en) | 2007-07-26 | 2011-03-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Molecular redundant sequencing |
| US7960116B2 (en) | 2007-09-28 | 2011-06-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
| WO2009045344A2 (en) | 2007-09-28 | 2009-04-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Error-free amplification of dna for clonal sequencing |
| EP2725107B1 (en) | 2007-10-19 | 2018-08-29 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | DNA sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified ddNTPs and nucleic acid comprising inosine with reversible terminators |
| US20110014611A1 (en) | 2007-10-19 | 2011-01-20 | Jingyue Ju | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequences by synthesis |
| CA2711560A1 (en) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and systems for analysis of fluorescent reactions with modulated excitation |
| CA2715385A1 (en) | 2008-02-12 | 2009-08-20 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for use in analytical reactions |
| US8236499B2 (en) | 2008-03-28 | 2012-08-07 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sample preparation |
| US8628940B2 (en) | 2008-09-24 | 2014-01-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Intermittent detection during analytical reactions |
| EP4230747A3 (en) | 2008-03-28 | 2023-11-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| US8198023B2 (en) | 2008-08-05 | 2012-06-12 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Prevention and alleviation of steric hindrance during single molecule nucleic acid synthesis by a polymerase |
| WO2010027497A2 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc | Preparations, compositions, and methods for nucleic acid sequencing |
| DK3629011T3 (da) | 2008-09-16 | 2024-01-29 | Pacific Biosciences California Inc | Integreret optisk indretning |
| US8921046B2 (en) | 2008-09-19 | 2014-12-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nucleic acid sequence analysis |
| US8481264B2 (en) | 2008-09-19 | 2013-07-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis |
| WO2010036287A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Intermittent detection during analytical reactions |
| US8383369B2 (en) | 2008-09-24 | 2013-02-26 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Intermittent detection during analytical reactions |
| WO2010059206A2 (en) | 2008-11-19 | 2010-05-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modular nucleotide compositions and uses therefor |
| US8370079B2 (en) | 2008-11-20 | 2013-02-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Algorithms for sequence determination |
| US8993230B2 (en) | 2008-12-04 | 2015-03-31 | Pacific Biosciences of Californ, Inc. | Asynchronous sequencing of biological polymers |
| US20230148447A9 (en) | 2008-12-11 | 2023-05-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Classification of nucleic acid templates |
| AU2009325069B2 (en) | 2008-12-11 | 2015-03-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Classification of nucleic acid templates |
| US9175338B2 (en) | 2008-12-11 | 2015-11-03 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods for identifying nucleic acid modifications |
| AU2010245304B2 (en) | 2009-04-27 | 2015-06-04 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Real-time sequencing methods and systems |
| US8501406B1 (en) | 2009-07-14 | 2013-08-06 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Selectively functionalized arrays |
| US8518643B2 (en) | 2010-02-04 | 2013-08-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Method to improve single molecule analyses |
| CA2790393C (en) | 2010-02-19 | 2019-03-12 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Integrated analytical system and method |
| US20110311963A1 (en) * | 2010-03-16 | 2011-12-22 | Life Technologies Corporation | Method and Apparatus for Addressable Flow Cells in Single Molecule Sequencing |
| US8318094B1 (en) | 2010-06-18 | 2012-11-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Substrate analysis systems |
| WO2012021733A2 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Photodamage mitigation compounds and systems |
| US8465922B2 (en) | 2010-08-26 | 2013-06-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and systems for monitoring reactions |
| WO2012129242A2 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Isolation of polymerase-nucleic acid complexes and loading onto substrates |
| WO2012138973A2 (en) | 2011-04-06 | 2012-10-11 | The University Of Chicago | COMPOSITION AND METHODS RELATED TO MODIFICATION OF 5-METHYLCYTOSINE (5mC) |
| US20150031024A1 (en) * | 2011-07-30 | 2015-01-29 | The Regents Of The University Of California | Enzymatic preparation of 10 base to 50 kb double-strand dna reagent for sequencing with a nanopore-polymerase sequencing device |
| US9347900B2 (en) | 2011-10-14 | 2016-05-24 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Real-time redox sequencing |
| US9267917B2 (en) | 2011-11-04 | 2016-02-23 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nanopores in zero mode waveguides |
| US9238836B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-01-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for sequencing modified nucleic acids |
| WO2013163207A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Identification of 5-methyl-c in nucleic acid templates |
| BR112015022448B1 (pt) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Illumina Cambridge Limited | molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado, métodos para preparar o crescimento de polinucleotídeo complementar a polinucleotídeo alvo de fita simples em reação de sequenciação e para determinar a sequência de polinucleotídeo alvo de fita simples e kit |
| US9416414B2 (en) | 2013-10-24 | 2016-08-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Delaying real-time sequencing |
| US10302972B2 (en) | 2015-01-23 | 2019-05-28 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Waveguide transmission |
| WO2016179437A1 (en) | 2015-05-07 | 2016-11-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Multiprocessor pipeline architecture |
| US10077470B2 (en) | 2015-07-21 | 2018-09-18 | Omniome, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
| US10731211B2 (en) | 2015-11-18 | 2020-08-04 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for loading of polymerase complexes |
| AU2017258619B2 (en) | 2016-04-29 | 2020-05-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing method employing ternary complex destabilization to identify cognate nucleotides |
| WO2018034780A1 (en) | 2016-08-15 | 2018-02-22 | Omniome, Inc. | Sequencing method for rapid identification and processing of cognate nucleotide pairs |
| KR102230444B1 (ko) | 2016-08-15 | 2021-03-23 | 옴니옴 인코포레이티드 | 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법 및 시스템 |
| CA3048415C (en) | 2016-12-30 | 2023-02-28 | Omniome, Inc. | Method and system employing distinguishable polymerases for detecting ternary complexes and identifying cognate nucleotides |
| US9932631B1 (en) | 2017-09-11 | 2018-04-03 | Omniome, Inc. | Genotyping by polymerase binding |
| WO2018136117A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Omniome, Inc. | Allele-specific capture of nucleic acids |
| EP3571319A1 (en) | 2017-01-20 | 2019-11-27 | Omniome, Inc. | Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow |
| US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| US9951385B1 (en) | 2017-04-25 | 2018-04-24 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| EP3697932A1 (en) | 2017-10-19 | 2020-08-26 | Omniome, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
| US11078534B2 (en) * | 2017-11-27 | 2021-08-03 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photocleavable nucleotide reagents with high stability |
| KR20230108222A (ko) * | 2020-11-16 | 2023-07-18 | 일루미나, 인코포레이티드 | 혼입 및 이미징 혼합물 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4629747A (en) * | 1984-07-09 | 1986-12-16 | Phillips Petroleum Company | Microbiocidal anionic sequesterants with polyvalent metal cations for permeability correction process |
| US5372937A (en) * | 1989-08-18 | 1994-12-13 | Procur Aktiebolag | Process for producing an oligosaccharide compound by using glycosidases from a mollusc |
| RU2041262C1 (ru) * | 1993-08-11 | 1995-08-09 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | Способ иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3728032A (en) * | 1971-10-13 | 1973-04-17 | H Noll | Flow cell for spectroscopic analysis of density gradients |
| GB2102005B (en) * | 1981-07-23 | 1984-11-21 | Mta Koezponti Kemiai Kutato In | Process for synthesis of polydeoxynucleotides |
| US5064754A (en) * | 1984-12-14 | 1991-11-12 | Mills Randell L | Genomic sequencing method |
| US4863849A (en) * | 1985-07-18 | 1989-09-05 | New York Medical College | Automatable process for sequencing nucleotide |
| US4971903A (en) † | 1988-03-25 | 1990-11-20 | Edward Hyman | Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids |
| JP2955759B2 (ja) | 1988-07-20 | 1999-10-04 | セゲブ・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 核酸配列を増幅及び検出する方法 |
| SE462454B (sv) * | 1988-11-10 | 1990-06-25 | Pharmacia Ab | Maetyta foer anvaendning i biosensorer |
| GB2225339A (en) * | 1988-11-15 | 1990-05-30 | Aligena Ag | Separating electrically charged macromolecular compounds by forced-flow membrane electrophoresis |
| GB8910880D0 (en) * | 1989-05-11 | 1989-06-28 | Amersham Int Plc | Sequencing method |
| US5302509A (en) * | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
| EP0450060A1 (en) * | 1989-10-26 | 1991-10-09 | Sri International | Dna sequencing |
| ATE199054T1 (de) | 1990-12-06 | 2001-02-15 | Affymetrix Inc A Delaware Corp | Verbindungen und ihre verwendung in einer binären synthesestrategie |
| DE4104076C2 (de) * | 1991-02-11 | 1994-03-31 | Bruker Analytische Messtechnik | Vorrichtung zur kernresonanzspektrometrischen Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen |
| US6004744A (en) † | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| GB9119735D0 (en) * | 1991-09-16 | 1991-10-30 | Secr Defence | Gene probe biosensor method |
| US5583026A (en) * | 1994-08-31 | 1996-12-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | Process for reconstituting the polymerase III* and other subassemblies of E. coli DNA polymerase III holoenzyme from peptide subunits |
| GB9208733D0 (en) | 1992-04-22 | 1992-06-10 | Medical Res Council | Dna sequencing method |
| SE9201984D0 (sv) | 1992-06-29 | 1992-06-29 | Pharmacia Biosensor Ab | Improvement in optical assays |
| US5360714A (en) * | 1992-08-28 | 1994-11-01 | Fox Chase Cancer Center | Hepadnavirus polymerase gene product having RNA-dependent DNA priming and reverse transcriptase activities and methods of measuring the activities thereof |
| WO1994010128A1 (en) * | 1992-11-02 | 1994-05-11 | Affymax Technologies N.V. | Novel photoreactive protecting groups |
| EP0689610B1 (en) * | 1993-03-19 | 2002-07-03 | Sequenom, Inc. | Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| WO1995006138A1 (en) | 1993-08-25 | 1995-03-02 | The Regents Of The University Of California | Microscopic method for detecting micromotions |
| US5485277A (en) * | 1994-07-26 | 1996-01-16 | Physical Optics Corporation | Surface plasmon resonance sensor and methods for the utilization thereof |
| US5801042A (en) * | 1994-08-18 | 1998-09-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Unique associated Kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof |
| US5635608A (en) * | 1994-11-08 | 1997-06-03 | Molecular Probes, Inc. | α-carboxy caged compounds |
| US5959098A (en) | 1996-04-17 | 1999-09-28 | Affymetrix, Inc. | Substrate preparation process |
| US5753439A (en) * | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
| US6331692B1 (en) * | 1996-10-12 | 2001-12-18 | Volker Krause | Diode laser, laser optics, device for laser treatment of a workpiece, process for a laser treatment of workpiece |
| CA2282418A1 (en) | 1997-03-05 | 1998-09-11 | Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. | Screen employing fluorescence anisotropy to identify compounds with affinity for nucleic acids |
| US6159687A (en) * | 1997-03-18 | 2000-12-12 | Novo Nordisk A/S | Methods for generating recombined polynucleotides |
| RU2198221C2 (ru) * | 1997-07-28 | 2003-02-10 | Медикал Биосистемз Лтд. | Способ секвенирования полинуклеотида и устройство для его осуществления |
| US7875440B2 (en) * | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US6780591B2 (en) * | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| GB9907813D0 (en) * | 1999-04-06 | 1999-06-02 | Medical Biosystems Ltd | Synthesis |
| US7056661B2 (en) * | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
| GB9923644D0 (en) * | 1999-10-06 | 1999-12-08 | Medical Biosystems Ltd | DNA sequencing |
| US6908736B1 (en) * | 1999-10-06 | 2005-06-21 | Medical Biosystems, Ltd. | DNA sequencing method |
| GB0112238D0 (en) * | 2001-05-18 | 2001-07-11 | Medical Biosystems Ltd | Sequencing method |
| GB0317343D0 (en) * | 2003-07-24 | 2003-08-27 | Medical Biosystems Ltd | Polynucleotide sequencing |
| GB0413082D0 (en) * | 2004-06-11 | 2004-07-14 | Medical Biosystems Ltd | Method |
| WO2013113402A1 (en) * | 2012-02-03 | 2013-08-08 | Agilent Technologies, Inc. | Micromachined flow cell with freestanding fluidic tube |
-
1998
- 1998-07-24 RU RU2000104843/13A patent/RU2198221C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-24 DE DE69808661T patent/DE69808661T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 KR KR1020007000971A patent/KR100664331B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-24 JP JP2000504282A patent/JP2001511358A/ja active Pending
- 1998-07-24 ES ES98935212T patent/ES2183394T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 EP EP02005331.0A patent/EP1229133B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 EP EP98935212A patent/EP1017848B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 BR BR9812270-3A patent/BR9812270A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-07-24 AU AU84559/98A patent/AU735898B2/en not_active Expired
- 1998-07-24 WO PCT/GB1998/002214 patent/WO1999005315A2/en not_active Ceased
- 1998-07-24 DK DK98935212T patent/DK1017848T3/da active
- 1998-07-24 CN CNB988076233A patent/CN1152140C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 PT PT98935212T patent/PT1017848E/pt unknown
- 1998-07-24 IL IL13341198A patent/IL133411A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-24 CA CA2294962A patent/CA2294962C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 EP EP10181931.6A patent/EP2267164B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 NZ NZ502557A patent/NZ502557A/en unknown
- 1998-07-24 EP EP10182026.4A patent/EP2267165B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 AT AT98935212T patent/ATE225858T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-24 US US09/463,549 patent/US7008766B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-25 IS IS5360A patent/IS5360A/is unknown
-
2004
- 2004-02-24 US US10/786,951 patent/US20040241719A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-08-03 US US11/833,673 patent/US20080014592A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-01-04 US US12/651,824 patent/US20100316999A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4629747A (en) * | 1984-07-09 | 1986-12-16 | Phillips Petroleum Company | Microbiocidal anionic sequesterants with polyvalent metal cations for permeability correction process |
| US5372937A (en) * | 1989-08-18 | 1994-12-13 | Procur Aktiebolag | Process for producing an oligosaccharide compound by using glycosidases from a mollusc |
| RU2041262C1 (ru) * | 1993-08-11 | 1995-08-09 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | Способ иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11492638B2 (en) | 2004-04-09 | 2022-11-08 | Monsanto Technology, Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US10787680B2 (en) | 2004-04-09 | 2020-09-29 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US12077770B2 (en) | 2004-04-09 | 2024-09-03 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US8946510B2 (en) | 2004-04-09 | 2015-02-03 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US9238822B2 (en) | 2004-04-09 | 2016-01-19 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US9340797B2 (en) | 2004-04-09 | 2016-05-17 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US11685930B2 (en) | 2004-04-09 | 2023-06-27 | Monsanto Technology, Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| US10167484B2 (en) | 2004-04-09 | 2019-01-01 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| RU2432205C2 (ru) * | 2005-06-23 | 2011-10-27 | Биокартис С.А. | Картридж, система и способ автоматизированной медицинской диагностики |
| RU2478710C2 (ru) * | 2005-09-16 | 2013-04-10 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способы генетического контроля поражения растений насекомыми и применяемые для этого композиции |
| US11312975B2 (en) | 2005-09-16 | 2022-04-26 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
| US10538783B2 (en) | 2005-09-16 | 2020-01-21 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
| US9695439B2 (en) | 2005-09-16 | 2017-07-04 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
| US11939589B2 (en) | 2005-09-16 | 2024-03-26 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
| US8759611B2 (en) | 2005-09-16 | 2014-06-24 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of insect infestation in plants and compositions thereof |
| RU2772924C1 (ru) * | 2018-12-21 | 2022-05-27 | Иллумина, Инк. | Сенсорные системы |
| US11782006B2 (en) | 2018-12-21 | 2023-10-10 | Illumina, Inc. | Sensing systems |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2198221C2 (ru) | Способ секвенирования полинуклеотида и устройство для его осуществления | |
| AU769102B2 (en) | DNA sequencing method | |
| US6908736B1 (en) | DNA sequencing method | |
| AU751766B2 (en) | Nucleic acid sequence analysis | |
| HK1031130B (en) | Nucleic acid sequence analysis | |
| MXPA00000715A (es) | Analisis de secuencia de acido nucleico | |
| US20110091887A1 (en) | Method for detection of methylcytosine using photoresponsive probe | |
| HK1045857B (en) | Dna sequencing method | |
| NO880010L (no) | Analytisk metode for detektering og maaling av spesifikke nuklein syresekvenser. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090725 |