RU2195662C1

RU2195662C1 - Method of determining functional activity of human complement c1 inhibitor

Info

Publication number: RU2195662C1
Application number: RU2001114805A
Authority: RU
Inventors: Л.В. Козлов; С.С. Андина; В.А. Гузова; В.Л. Дьяков; Т.Н. Баталова
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2002-12-27

Abstract

FIELD: immunochemical assays. SUBSTANCE: invention relates to determining functional activity of complement C1 inhibitor in human serum for diagnostics of a series of diseases and in biological preparations. Sorption is performed in wells of micropanel with fibrinolysin (pharmacy preparation of plasmin), after which solution to be analyzed containing aforesaid C1 inhibitor with unknown activity is placed in wells and the total is incubated. During incubation, inhibitor is covalently bound to fibrinolysin. After drying and washing of micropanel, conjugate of enzyme with anti-C1-inhibitor antibodies and enzyme substrate are placed into wells. Amount of bound C1 inhibitor is found on the basis of enzymatic reaction product by the aid of anti-C1- inhibitor antibodies, in particular fraction of immunoglobulins F covalently bound to enzyme. Method is based on ability of functionally active C1 inhibitor of binding to fibrinolysin. EFFECT: simplified procedure and reduced expenses. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. The invention relates to medical immunology, and in particular to methods for determining the functional activity of complement components in human serum in the diagnosis of a number of diseases and in biological preparations.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. В патенте США [1] использован модифицированный метод определения активности Сl-ингибитора, основанный на тест-системе производства Cycotech (Сан Диего, Калифорния, США). Способ предусматривает следующие этапы: 1 - на микропанели сорбируют авидин, 2 - получают высокоочищенный ферментативно активный препарат субкомпонента Сls, 3 - синтезируют биотинилированный препарат Сls, 4 - образцы проб, содержащих определяемый функционально активный Сl-ингибитор, инкубируют с биотинилированным препаратом Сls, 5 - образующийся комплекс функционально активного Сl-ингибитора с Сls сорбируют в лунках микропанели, покрытых авидином, 6 - количество связавшегося в лунках Сl -ингибитора определяют с помощью конъюгата козьих антител против Сl-ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. The most promising of modern methods for the determination of blood serum proteins is the enzyme-linked immunosorbent assay due to its sensitivity, selectivity and the ability to automate the analytical process. The US patent [1] used a modified method for determining the activity of a Cl inhibitor based on a test system manufactured by Cycotech (San Diego, California, USA). The method involves the following steps: 1 - avidin is adsorbed on the micropanels, 2 - a highly purified enzymatically active preparation of the Сls subcomponent is obtained, 3 - the biotinylated preparation of Сls is synthesized, 4 - samples of samples containing a functionally determined Cl-inhibitor are incubated, incubated with the biotinylated preparation of Сls, 5 - the resulting complex of a functionally active Cl inhibitor with Cl is adsorbed in the wells of a micropanel coated with avidin, 6 - the amount of Cl inhibitor bound in the wells is determined using a goat antibody conjugate otiv Cl-inhibitor with horseradish peroxidase and a chromogenic peroxidase substrate.

К недостаткам метода можно отнести его многостадийность (использование дополнительной стадии взаимодействия биотин-авидин, а также необходимость получения биотинилированного Сls) и трудную доступность ферментативно активного Сls (присутствует в сыворотке крови в проферментной форме в количестве 30 мг/л, коммерчески недоступен). The disadvantages of the method include its multistage nature (the use of an additional stage of biotin-avidin interaction, as well as the need to obtain biotinylated Cls) and the difficult availability of enzymatically active Cls (present in serum in proenzyme form in an amount of 30 mg / l, not commercially available).

Задачей заявленного изобретения является снижение затрат на проведение определения функциональной активности Сl-ингибитора комплемента человека на основе иммуноферментного метода и упрощение способа путем уменьшения числа стадий и использования доступных препаратов. The objective of the claimed invention is to reduce the cost of determining the functional activity of the Cl-inhibitor of human complement based on the enzyme-linked immunosorbent assay and the simplification of the method by reducing the number of stages and the use of available drugs.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели фибринолизина (аптечный препарат плазмина), образцы проб, содержащих определяемый функционально активный Сl -ингибитор, вносят в лунки микропанели и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание Сl-ингибитора с фибринолизином, количество связавшегося в лунках Сl-ингибитора определяют с помощью конъюгата антител против Сl-ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. Способ основан на способности функционально активного Сl-ингибитора ковалентно связываться с фибринолизином. The task is achieved by developing a determination method that provides for: sorption of fibrinolysin micropanel in the wells (a pharmaceutical drug of plasmin), samples of samples containing a functionally determined CL inhibitor are introduced into the micropanel wells and incubation is performed, during which covalent binding of the Cl inhibitor occurs with fibrinolysin, the amount of Cl inhibitor bound in the wells is determined using the conjugate of antibodies against the Cl inhibitor with horseradish peroxidase and a chromogenic substrate for perks idazy. The method is based on the ability of a functionally active Cl inhibitor to covalently bind to fibrinolysin.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения функциональной активности Сl-ингибитора комплемента человека, использующего доступные препараты. The technical result of the claimed invention is the development of a simplified method for determining the functional activity of a human complement complement inhibitor using available drugs.

Пример. Определение функциональной активности препарата Сl-ингибитора. Растворяют фармакопейный препарат фибринолизина в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной активностью 1-10 ед./мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), по 200 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл VBS². В лунки планшета каждого ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый Сl-ингибитор в VBS²⁺ в виде прогрессивных двукратных разведений. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М МаСl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против Сl -ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3%-ной перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14%-ной серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата Сl-ингибитора рассчитывают по стандартной кривой, полученной в результате проведения такого же эксперимента со стандартным раствором с известной активностью Сl-ингибитора.Example. Determination of the functional activity of the drug Cl inhibitor. Dissolve the pharmacopoeial preparation of fibrinolisin in 0.05 M sodium carbonate buffer, pH 9.5, with a final activity of 1-10 units / ml and add 100 μl of solution to each well of a flat-bottomed polystyrene 96-well plate. Close the lid and leave overnight at 4 ^o C. Three times the tablet is washed with Veronal buffer solution, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, 0.15 mm Ca ²⁺ and 0.5 mm Mg ²⁺ (VBS ²⁺ ), 200 μl to each well, then the plate is dried by shaking out the remaining liquid. 100 μl of VBS ^{2 was} added to each well of the plate. 100 μl of a solution containing a detectable Cl inhibitor in VBS ²⁺ in the form of progressive two-fold dilutions is added to the wells of each row of tablets. After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ^° C, washing three times with phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.15 M MaCl and 0.05% Tween-20, and draining the plate, 100 μl of peroxidase conjugate are added to each well with antibodies against human Cl inhibitor in the same buffer in a selected dilution. After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ^° C, five times washing with detergent and draining the plate, 100 μl of substrate buffer (10 mg of orthophenylenediamine in 25 ml of citrate-phosphate buffer, pH 5.0, and 50 μl 3 % hydrogen peroxide). After 30 minutes of incubation in the dark, the reaction is stopped by adding 50 μl of 14% sulfuric acid to each well. The results of the reaction are taken into account using a spectrophotometer with a vertical beam by measuring light absorption at 492 nm. The functional activity of the Cl inhibitor preparation is calculated from the standard curve obtained from the same experiment with the standard solution with the known activity of the Cl inhibitor.

Этим методом проведено определение активности Сl-ингибитора в 10 образцах сыворотки крови человека и сравнение с количественным определением его в тех же сыворотках стандартным методом радиальной иммунодиффузии (РИД). Полученные результаты приведены в таблице. This method determined the activity of the Cl inhibitor in 10 samples of human serum and compared with its quantitative determination in the same sera by the standard method of radial immunodiffusion (RID). The results are shown in the table.

Из данных таблицы следует, что результаты, полученные двумя методами, согласуются между собой, т.е. заявленным способом действительно определяется функциональная активность Сl-ингибитора комплемента. Небольшие расхождения, наблюдаемые в отдельных результатах, объясняются тем, что метод РИД является менее точным из-за трудностей измерения диаметров колец преципитации (определяемая концентрация пропорциональна квадрату диаметра), что является причиной возрастания ошибок. From the table it follows that the results obtained by the two methods are consistent with each other, i.e. the claimed method really determines the functional activity of the complement inhibitor Cl. The small discrepancies observed in individual results are explained by the fact that the RID method is less accurate due to difficulties in measuring the diameters of the precipitation rings (the determined concentration is proportional to the square of the diameter), which causes an increase in errors.

ЛИТЕРАТУРА
1. Pilatte Y. M. , Hammer C.H., Frank M.M., Fries L.F. Process for the purification of Сl-inhibitor. Patent US 5030578. July 9, 1991.LITERATURE
1. Pilatte YM, Hammer CH, Frank MM, Fries LF Process for the purification of Cl-inhibitor. Patent US 5030578. July 9, 1991.

Claims

A method for determining the functional activity of a human complement C1-inhibitor, characterized in that fibrinolysin is adsorbed in the micropanel wells for enzyme-linked immunosorbent assay, then a sample of the test sample containing human complement C1-inhibitor with unknown activity is added to the micropanel wells, incubated and, after the plate is dried and washed the conjugate of the enzyme with antibodies against the C1-inhibitor and the substrate of this enzyme are added to the wells, after which the content of the active C1-inhibitor is calculated by the number of razovavshegosya product of the enzymatic reaction.