RU2066198C1 - Способ получения легочного сурфактанта - Google Patents
Способ получения легочного сурфактанта Download PDFInfo
- Publication number
- RU2066198C1 RU2066198C1 RU95103260A RU95103260A RU2066198C1 RU 2066198 C1 RU2066198 C1 RU 2066198C1 RU 95103260 A RU95103260 A RU 95103260A RU 95103260 A RU95103260 A RU 95103260A RU 2066198 C1 RU2066198 C1 RU 2066198C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- surfactant
- extract
- water
- minutes
- phospholipids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 title claims description 25
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 46
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 abstract description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 14
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 10
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 7
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 206010006475 bronchopulmonary dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPNBCDPAKXQPHW-UHFFFAOYSA-N acetic acid chloroform methanol propan-2-one Chemical compound C(C)(=O)O.CO.C(Cl)(Cl)Cl.CC(=O)C CPNBCDPAKXQPHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229940066294 lung surfactant Drugs 0.000 description 1
- 238000005399 mechanical ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 1
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Использование: для получения лекарственных препаратов в промышленном производстве природных легочных суфактантов. Сущность изобретения: получение водно-солевого экстракта из измельченных легких крупного рогатого скота или путем смыва сурфактанта с помощью бронхоальвеолярного лаважа, центрифугирование его с последующим замораживанием и оттаиванием супернатанта. Для выделения суфактанта полученную суспензию подвергают низкоскоростному центрифугированию, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и экстрагируют органическими растворителями по Фолчу или Блайю и Дайеру и обрабатывают экстракт водно-солевыми растворами. Удаляя из экстракта водную фазу и органические растворители, остаток эмульгируют стерильной дистиллированной водой и лиофилизируют. Способ основан на использовании легко выполнимых операций, доступного сырья и материалов, обеспечивает высокое качество конечного продукта. Это делает способ высокотехнологичным и применимым в промышленном производстве. 2 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов из природного сырья, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов.
Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в эпителиальных клетках легкого (альвеолоциты II типа) и эксткретируется ими на внутреннюю поверхность легких, создавая таким образом высокоспецифическую легочную "смазку". Сурфактант покрывает поверхность альвеолярного эпителия и, обладая способностью резко снижать поверхностное натяжение, предотвращает коллапс альвеол в конце выдоха.
Известно, что основной причиной синдрома дыхательных расстройств новорожденных, в особенности недоношенных, является недостаточность системы легочного сурфактанта. По этой причине до начала 90-х годов в развитых странах Запада умирало, а в России и в настоящее время погибает около половины недоношенных детей или около 15 20 тысяч детей ежегодно. Кроме того, у тех новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, которые выживают, формируется бронхо-легочная дисплазия вследствие применения в их лечении искусственной вентиляции легких с использованием газовых смесей с высоким (более 60%) содержанием кислорода. Впоследствии эти дети страдают тяжелыми хроническими заболеваниями легких.
Легочный сурфактант является единственным и чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных детей.
Применение такого рода препаратов в последние годы в экономически развитых странах позволило резко (на 60 90%) снизить смертность недоношенных новорожденных. В нашей стране легочные сурфактанты не производятся и из-за их дороговизны не закупаются, а потому практически не используются.
В мировой медицинской практике применяют как синтетические и полусинтетические, так и природные легочные сурфактанты. Считают, что синтетические сурфактанты менее эффективны, хотя они безусловно более доступны. В то же время эти препараты в отличие от природных не содержат чрезвычайно важных для их свойств сурфактант-ассоциированных белков.
Предлагаемый нами способ относится к получению природных легочных сурфактантов, в частности сурфактантов из легких крупного рогатого скота.
Известен способ получения природного легочного сурфактанта из амниотической жидкости рожениц [1]
Способ заключается во взятии амниотической жидкости при проведении Кесарева сечения, ее центрифугировании при 150 g для удаления клеток, центрифугировании супернатанта при 7500 g для получения осадка, разделении ресуспендированного осадка в ступенсатом градиенте плотности сахарозы, трехкратного продавливания полученного из интерфазы материала через нейлоновую сетку с величиной пор 20 мкм с трехкратным переосаждением сурфактанта между этими продавливаниями и хранении полученного материала в замороженном состоянии.
Способ заключается во взятии амниотической жидкости при проведении Кесарева сечения, ее центрифугировании при 150 g для удаления клеток, центрифугировании супернатанта при 7500 g для получения осадка, разделении ресуспендированного осадка в ступенсатом градиенте плотности сахарозы, трехкратного продавливания полученного из интерфазы материала через нейлоновую сетку с величиной пор 20 мкм с трехкратным переосаждением сурфактанта между этими продавливаниями и хранении полученного материала в замороженном состоянии.
Полученный этим способом препарат содержит 80,7% фосфолипидов, 9,4% нейтральных липидов и 5,4% белка.
Такой состав характерен для природного легочного сурфактанта. Наличие указанного количества белка в препарате свидетельствует о присутствии в нем как гидрофобных, так и гидрофильных сурфактант-ассоциированных белков. Эти белки существенны для проявления функциональных свойств легочного сурфактанта.
Вместе с тем отмечаемая авторами высокая вязкость препарата, вынуждающая авторов для ее уменьшения проводить трехкратное продавливание суспензии через нейлоновую сетку с диаметром пор 20 мкм свидетельствуют, как нами показано, о присутствии в препарате значительного количества ДНК (0,06 0,2 мг/мг фосфолипидов), что в настоящее время считается абсолютно недопустимым.
Как свидетельствует описание способа выделения сурфактакта из амниотической жидкости он трудоемок, сложен и длителен, содержит 6 процедур центрифугирования, 5 из них длительные (90 120 мин); способ нетехнологичен, получаемый по нему продукт чрезвычайно дорог и поэтому способ безусловно не может лечь в основу промышленного производства сурфактанта.
Наиболее близким к заявляемому и взятому в качестве прототипа является способ получения "Сурфактантного состава и фармацевтических композиций для использования в лечении синдрома дыхательных расстройств" (European patent 0 119 056 B1) [2]
Способ предназначен для получения полусинтетического легочного сурфактанта, который содержит как основные компоненты 1,2-дипальмитоил-глицеро-(3)-фосфохолин (65,4% ) важнейший фосфолипид природного легочного сурфактанта, пальмитиновую кислоту (8,7%) и липопротеин (природный липопротеин, выделенный из легкого крупного рогатого скота) в количестве 1,3% В качестве дополнительных компонентов используются различные синтетические фосфолипиды.
Способ предназначен для получения полусинтетического легочного сурфактанта, который содержит как основные компоненты 1,2-дипальмитоил-глицеро-(3)-фосфохолин (65,4% ) важнейший фосфолипид природного легочного сурфактанта, пальмитиновую кислоту (8,7%) и липопротеин (природный липопротеин, выделенный из легкого крупного рогатого скота) в количестве 1,3% В качестве дополнительных компонентов используются различные синтетические фосфолипиды.
Способ состоит прежде всего в получении липопротеина из легкого крупного рогатого скота.
Для получения липопротеина легкое быка отмывают водой от крови и других загрязнений, разделяют на доли, удаляют сосуды, нарезают на тонкие куски и пропускают через мясорубку. К полученному гомогенату ткани добавляют физиологический раствор и перемешивают смесь при 4oС в течение 100 мин. Гомогенат фильтруют под давлением и получают грубый экстракт.
Этот экстракт центрифугируют при 10000 об/мин, супернатант выбрасывают, а осадок ресуспензируют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и осадок выбрасывают. Полученный супернатант центрифугируют снова при 10000 об/мин и собирают сырой осадок. Полученный таким образом неочищенный (грубый) осадок суспендируют в воде и к полученной суспензии добавляют хлорид натрия, таким образом чтобы достичь удельной плотности приблизительно 1,20, т.е. получают суспензию с концентрацией хлорида натрия около 30% Полученную суспензиют центрифугируют при 10000 об/мин при 0oС в течение 50 мин, что приводит к разделению ее на три слоя. Верхний слой, представляющий собой пенистую эмульсию, собирают и суспендируют в дистиллированной воде. Полученную суспензию диализуют через целофановую мембрану против дистиллированной воды. После этого диализованную суспензию лиофилизируют и получают неочищенный (грубый) сухой продукт. К этому неочищенному продукту добавляют холодный этилацетат при 5oС, полученную смесь перемешивают в течение 45 мин и фильтруют под остаточным давлением для отделения нерастворимого материала. Этот нерастворимый материал высушивают и добавляют к нему растворяющую смесь, состоящую из хлороформа и метанола (в объемном отношении 2:1). Полученную смесь встряхивают в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр для получения фильтрата. Отфильтрованный осадок экстрагируют еще раз той же смесью растворителей и тем же объемом и фильтруют для получения вторичного экстракта. Эту процедуру повторяют еще раз. Три полученных экстракта объединяют и высушивают досуха под остаточным давлением до получения твердого остатка.
Этот материал растворяют в смеси хлороформа и метанола (2:1 об/об), хроматографируют на колонке Сефадекса LH-20 (колонка 15,5 см в диаметре и 90 см длиной), уравновешенной той же смесью растворителей, и элюируют той же смесью со скоростью 5 мл/мин. В процессе элюации собирают материал, выходящий в свободном объеме колонки.
Полученный фильтрат при микробиологическом контроле стерилен и дальнейшие процедуры с ним выполняли в стерильных условиях. Его высушивали досуха под остаточным давлением и суспендировали в стерильной воде. Суспензию лиофилизировали и получили липопротеин в виде светло-желтого с коричневым оттенком порошка.
Всего из 128,3 кг ткани легкого было получено 8,3 г липопротеина.
Анализ показал, что он имеет м.м. 34.000 кДа и содержит 62,1% (в/в) фосфолипидов, 31,3 белка, 4,6% воды и 2,0% неидентифицированных компонентов.
Для получения препарата сурфактанта брали 0,13 г липопротеина, полученного этим способом, и добавляли 6,58 г стерильного 1,2-дмпальмитоилглицеро-(3)-фосфохолина (ДППС), 2,19 г 1,2-диацил-sn-глицеро-(3)-фосфо-sn-глицерина (ДФГ) (с длиной жирнокислотных остатков от 14 до 24 углеродных атомов), 1,10 г пальмитиновой кислоты (ПК) и для растворения этих компонентов использовали 10,0 л смеси хлороформа и метанола (2:1, об/об) при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха при остаточном давлении и остаток ресуспендировали в водно-этанольной смеси (9: 1, об/об) при 45oС в течение 20 мин. Суспензию замораживали при -40oС и высушивали под вакуумом 75 90 мм Hg в течение 24 ч.
Получено 10,33 г сурфактанта в виде белого порошка, содержащего 63,7% ДППС, 21,2% ДФГ, 10,6% ПК, 1,3% липопротеина и 3,2% воды (все величины выражены в соотношении в/в).
Такой состав препарата имеет определенное сходство с природным легочным сурфактантом прежде всего по содержанию основного фосфолипида природных легочных сурфактантов ДППС. В отношении присутствующего в препарате белка следует отметить, что его всего около 0,4% (т.к. липопротеин содержит около 30% белка), тогда как в природном легочном сурфактанте только гидрофобных белков с м. м. 5 8 кДа более 1% Эти белки чрезвычайно важны для проявления функции этих препаратов. Большое значение для проявления функции сурфактанта имеют и другие имеющиеся в природном сурфактанте фосфолипиды (фосфатидилглицерины, фосфатидилсерины, дифофсфатидилглицерины, фосфатидилэтаноламины). В разных вариантах препарате по прототипу присутствует наряду с ДППС, как показано авторами, только какой-нибудь один из этих фосфолипидов. Малое содержание сурфактант-ассоциированных белков и неполный спектр фосфолипидов в этих препаратах не позволяет воспроизвести интегральную структуру сурфактанта полностью.
Природные же препараты сурфактантов, помимо указанных компонентов, содержат также все гидрофобные (м.м. 5 8 кДа, 18 кДа) сурфактант-ассоциированные белки существенные для проявления их функции и отсутствующие в прототипе.
Функциональную оценку сурфактанта, полученного по прототипу авторы проводили на зрелых кроликах, страдающих септицемией, вызванной внутрибрюшинным введением культуры клеток патогенного штамма Е.coli, осложняющейся в дальнейшем развитием синдрома дыхательных расстройств (СДР). Испытания показали, что такой тип СДР купируются в половине случаев и без применения сурфактанта только использованием канамицина (антибиотика широкого спектра действия). Сочетанное введение канамицина и сурфактанта купирует СДР у 85% больных животных, а применение одного сурфактанта без канамицина купирует СДР только у половины животных.
Во всех случаях сурфактант вводили от 1 до 6 раз в дозе 50 100 мг/кг массы животного на каждое введение, а канамицин вводили от 80 до 150 мг/кг в виде 2 8 раздельных доз. Канамицин вводили в течение 24 ч до и после развития СДР.
Как свидетельствует описание способа выделения липопотеина, необходимого для получения сурфактанта по прототипу, он чрезвычайно трудоемок, чрезвычайно сложен, многостадиен и дает очень малый выход искомого липопротеина. Последний составляет в конечном препарате лишь 1,3% по массе, а остальная часть представляет собой синтетические фосфолипиды. Способ по прототипу включает 25 стадий, из которых 4 центрифугирования, одно из которых в градиенте плотности, длительный последующий после градиента диализ, обработку этилацетатом, длительную гель-фильтрацию с применением дорогостоящего носителя Сефадекса LH-20 для отделения липопротеина от основной массы сурфактантных фосфолипидов и белков.
Технический результат изобретения состоит в упрощении способа получения сурфактанта и улучшении его качества.
Этот результат достигается тем, что в известном способе получения легочного сурфактанта путем водно-солевой экстракции его из легкого крупного рогатого скота и последующего центрифугирования экстракта (или смыва сурфактанта легкого, полученного путем бронхо-альвеолярного лаважа) центрифугирование проводят при 150 g в течение 10 мин, полученный при центрифугировании супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше +10oС, после чего суспензию центрифугируют, полученный осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.
Целесообразно центрифугирование суспензии, полученной после замораживания и оттаивания супернатанта, проводить при 3000 15000 g в течение 20 30 мин или проточно, экстракцию полученного осадка проводить смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 2:1 (об/об) по Фолчу [3] или 1:1 по Блайю и Дайеру [4] а в качестве водно-солевых растворов использовать 0,1% раствор хлоридов натрия или калия в соотношениях экстракт:водно-солевой раствор 10:2 (об/об) при экстракции липидов по Фолчу или 10:4,5 (об/об) при экстракции по Блайю и Дайеру.
Центрифугирование водно-солевого экстракта при 150 g в течение 10 мин позволяет убрать из него остатки обрывков тканей и клеток, оставив сурфактант в супернатанте. Это безусловно улучшает качество препарата, поскольку в него не попадает тканевой и клеточный материал.
Низкое содержание сурфактанта в получаемом супернатанте привело нас к необходимости работать с большими объемами жидкости и поставило перед нами задачу накопления и хранения ее в течение некоторого времени. В качестве способа хранения мы выбрали замораживание супернатанта, а при последующем оттаивании его мы обнаружили наличие в нем выраженного хлопьевидного осадка. Удалив его низкоскоростным центрифугированием, мы обнаружили практически полное отсутствие материала сурфактанта в полученном супернатанте. Анализ же самого осадка выявил, что он более чем на 90% представляет собой легочный сурфактант.
Этот неожиданный для нас факт позволил нам избежать многочисленных трудоемких и длительных процедур выделения липопротеина, включающего многократное дифференциальное и плотностное центрифугирование, диализ, трудоемкую гель-фильтрацию на гидрофобном Сефадексе LH-20, ведущих к удалению основной массы фосфолипидов и белков легочного сурфактанта.
Устранение этих процедур позволило значительно упростить способ получения конечного продукта. Такое упрощение способа сделало его высокотехнологичным и пригодным для использования в промышленном производстве.
Кроме того, обнаруженные нами условия агрегации сурфактанта, а именно замораживание и последующее оттаивание супернатанта при температуре не выше +10oС, обеспечивают в таких мягких условиях выделения сохранность в конечном продукте полного набора фосфолипидов и нейтральных липидов сурфактанта, сохраняют значительное количество (около 2% по отношению к фосфолипидам) гидрофобных сурфактант-ассоциированных белков в их естественном липидном окружении. Это безусловно значительно повышает качество конечного продукта, выражающееся в значительно более высоком терапевтическом эффекте получаемого сурфактанта, и позволяет избежать добавления в конечные препараты дорогих синтетических фосфолипидов, составляющих основу полусинтетических известных сурфактантов.
Экстрагирование органическими растворителями полученного центрифугированием осадка и последующая обработка экстракта водно-солевыми растворами создают условия перехода оставшихся в осадке балластных белков и ДНК в водную фазу, что освобождает экстракт с целевым продуктом от примесей и в еще большей степени повышает его качество. Причем предлагаемые нами смеси органических растворителей с экстракцей по Фолчу (хлороформ:метанол 2:1) (об/об) или по Блайю и Дайеру (хлороформ-метанол 1:1) (об/об), обеспечивая высокое качество искомого продукта, наиболее доступны, что является решающим для использования способа в промышленном производстве.
Использование водно-солевых растворов в виде 0,1% растворов хлорида натрия или калия в указанных соотношениях, как нами показано, позволяет исключить потери фосфолипидов сурфактанта и удалять нелипидные примеси из искомого продукта, что обеспечивает его высокое качество.
Пример 1. 10 кг легкого быка отмывают холодной водой от крови, освобождают от крупных бронхов и сосудов, разрезают на куски около 0,5 кг и пропускают через ножевую мясорубку, добавляют к измельченным легким 50 л холодного +4oC физиологического раствора (ФР, 0,9% раствора хлорида натрия) и перемешивают при +4oС в течение 15 мин. Гомогенат фильтруют через марлю, осадок выбрасывают, а фильтрат центрифугируют при 150 g в течение 10 мин для удаления остатков ткани и клеток. Полученный супернатат (51 л) замораживают при -20oС в течение 60 мин, после чего оттаивают при температуре +4oС. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 g на проточной центрифуге в течение 30 мин при +4oС.
Полученный осадок (12 г) экстрагируют по Блайю и Дайеру. Для этого его ресуспендируют в 240 мл дистиллированной воды, добавляют 900 мл смеси из 300 мл хлороформа и 600 мл метанола и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. После этого добавляют 300 мл хлороформа и 300 мл 0,18% раствора хлорида калия (т.е. соблюдаются соотношения хлороформа и метанола 1:1, экстракция по Блайю и Дайеру, и соотношение объема экстракта и 0,1% водно-солевого раствора 10:4,5). Суспензию перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре в атмосфере аргона и центрифугируют при 600 g в течение 20 мин. Из образовавшейся двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю отбирают и удаляют из нее органические растворители при остаточном давлении на ротационном испарителе RVO-64 при температуре 37oС. Сухой остаток ресуспендируют в 200 мл дистиллированной воды и лиофилизируют.
Получено 10 г белого с кремоватым оттенком цвета аморфного порошка.
Результаты анализа,г:
фосфолипиды 8,9
нейтральные липиды 0,9
белок 0,2
Анализ продукта на содержание липидного фосфора проводился по Васьковскому [4] содержание белка определяли по методу Лоури после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Анализ спектра белков с помощью электрофореза в ПАГ в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия [5] выявил группы белков с м.м. 18 кДа и 5 8 кДа (рис.1). Эти гидрофобные белки специфичны для природного легочного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК по Бартону [6] отрицательный.
фосфолипиды 8,9
нейтральные липиды 0,9
белок 0,2
Анализ продукта на содержание липидного фосфора проводился по Васьковскому [4] содержание белка определяли по методу Лоури после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Анализ спектра белков с помощью электрофореза в ПАГ в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия [5] выявил группы белков с м.м. 18 кДа и 5 8 кДа (рис.1). Эти гидрофобные белки специфичны для природного легочного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК по Бартону [6] отрицательный.
Подлинность препарата подтверждена
положительным пенным тестом;
исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ-метанол-7N NH3 (65:25:5) и хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота вода (30:40:10:10:5) (рис.2). На хроматограмме видно, что в препарате все основные классы фосфолипидов, свойственные природному сурфактанту. В то время как, в прототипе, как описывают авторы, присутствуют только фосфатидилхолин и один из других фосфолипидов сурфактанта в зависимости от варианта препарата.
положительным пенным тестом;
исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ-метанол-7N NH3 (65:25:5) и хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота вода (30:40:10:10:5) (рис.2). На хроматограмме видно, что в препарате все основные классы фосфолипидов, свойственные природному сурфактанту. В то время как, в прототипе, как описывают авторы, присутствуют только фосфатидилхолин и один из других фосфолипидов сурфактанта в зависимости от варианта препарата.
исследованием терапевтической активности.
После однократного интратрахеального введения собакам с моделью сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств полученного препарата в дозе 50 100 мг/кг массы уже через 15 мин обнаружено увеличение парциального напряжения кислорода в артериальной крови и насыщения гемоглобина кислородом, а также снижение парциального напряжения углекислого газа в артериальной крови. Через сутки после введения препарата у собак не было одышки, были нормальные параметры газов крови и отсутствовали патологические изменения на рентгенограммах грудной клетки (нормальная воздушность легких без ателектазов), а их поведение и состояние не отличалось от здоровых. Собачки с той же моделью синдрома дыхательных расстройств, не получавшие препарата, характеризовались одышкой при нагрузке в течение 3 суток, наличием сливных ателектазов в легких на рентгенограммах грудной клетки и восстановлением всех параметров только к 7 8 суткам после развития синдрома дыхательных расстройств. Ни в одном случае при лечении 10 собак не было гибели животных.
Как свидетельствуют выше приведенные характеристики полученного препарата сурфактанта, он значительно лучшего качества в сравнении с прототипом, поскольку соответствует составу природного легочного сурфактанта и обладает более высоким терапевтическим эффектом.
Пример 2. 10 легких (20 кг) двухгодовалых бычков выделяли из грудной клетки, избегая их повреждения, отмывали от крови и заполняли через трахею 10 л физиологического раствора каждое легкое. Трахею закрывали пробкой и легкие медленно встряхивали на станине в одной плоскости в течение 15 мин. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа сливали и отжимали легкие снаружи механически для более полного выдавливания жидкости из легких. Всего получено 82 л суспензии. Ее центрифугировали при 150 g в течение 10 мин и осадок клеток выбрасывали. Полученный супернатат (81 л) замораживали при -20oС в течение 60 мин, после чего оттаивали при +10oС. Полученную суспензию центрифугировали при 15000 g на проточной центрифуге ОТР 102К-01 в течение 45 мин при +4oC.
Полученный осадок (18 г) экстрагировали по Фолчу. Для этого его ресуспендировали в 1,0 л дистиллированной воды, добавляли 20 л смеси из 13,3 л хлороформа и 6,7 л метанола (соотношение хлороформа и метанола 2:1), суспензию перемешивали в течение 1 ч в атмосфере аргона и добавляли 3,0 л стерильного 0,13% водного раствора хлорида натрия (соотношение объема экстракта и водного раствора хлорида натрия 10:2). Суспензию перемешивали в течение 30 мин в атмосфере аргона и центрифугировали при 600 g в течение 30 мин. Из полученной двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывали, а нижнюю забирали и фильтровали через капроновый фильтр с величиной пор 0,2 мкм (стерилизующее фильтрование). Полученный фильтрат упаривали досуха на ротационном испарителе под остаточным давлением при +35oС. Остаток ресуспендировали в 800 мл стерильной дистиллированной воды, эмульсию разливали в стерильные флаконы по 5 мл и лиофилизировали. Флаконы укупоривали резиновыми пробками в атмосфере аргона и завальцовывали алюминиевыми колпачками.
Получено 160 флаконов по 100 мг белого с кремоватым оттенком аморфного порошка в каждом (всего 16 г сурфактанта)
Результаты анализа (одного флакона),мг:
фосфолипиды 89,0
нейтральные липиды 9,0
белок 2,0
Подлинность и специфические свойства на модели сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств подтверждены как и в примере 1.
Результаты анализа (одного флакона),мг:
фосфолипиды 89,0
нейтральные липиды 9,0
белок 2,0
Подлинность и специфические свойства на модели сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств подтверждены как и в примере 1.
Предлагаемый способ получения легочного сурфактанта по сравнению с известным имеет ряд существенных преимуществ.
1. Способ значительно проще прототипа, поскольку включает всего 5 достаточно простых операций против 25 трудоемких и длительных процедур в прототипе.
2. Способ обеспечивает получение высокоочищенного препарата, содержащего все присущие сурфактанту фосфолипиды и существенное количество (около 2%) сурфактант-ассоциированных гидрофобных белков в их собственном липидном окружении, в то время как в прототипе присутствуют только два основных фосфолипида и около 0,4% белка из-за многостадийной обработкой исходного сырья, которая приводит к получению липопротеина, что вынуждает для получения препаратов сурфактанта добавлять к нему синтетические фосфолипиды.
3. Небольшое количество стадий получения сурфактанта делает заявляемый способ высокотехнологичным и применимым в промышленном производстве.
Способ разработан в лаборатории биотехнологии препаратов для лучевой диагностики и терапии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института Минздравмедпрома РФ совместно с ТОО "Контраст, ЛТД".
Препарат в настоящее время проходит доклинические испытания и планируется представить материалы по этому препарату в Фармкомитет Минздравмедпрома в 1996 году.
Предлагаемый способ положен в основу создаваемого в настоящее время промышленного производства природного легочного сурфактанта в ЦНИРРИ Минздравмедпрома.
Claims (4)
1. Способ получения легочного сурфактанта путем водно-солевой экстракции его из легкого крупного рогатого скота и последующего центрифугирования экстракта, отличающийся тем, что центрифугирование экстракта проводят при 150 g в течение 10 мин, полученный супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше 10oC, полученную суспензию центрифугируют, осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что центрифугирование суспензии, полученной после замораживания и оттаивания супернатанта, проводят при 3000
15000 g в течение 20-30 мин или проточно.
15000 g в течение 20-30 мин или проточно.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что экстракцию полученного осадка проводят смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 1 1 по Блайю и Дайеру или 2 1 по Фолчу.
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве водно-солевых растворов для обработки упомянутого экстракта используют 0,1%-ный раствор хлоридов натрия или калия в соотношении экстракт водно-солевой раствор 10 2 (об/об) по Фолчу или 10 4,5 (об/об) по Блайю или Дайеру.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95103260A RU2066198C1 (ru) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Способ получения легочного сурфактанта |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95103260A RU2066198C1 (ru) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Способ получения легочного сурфактанта |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2066198C1 true RU2066198C1 (ru) | 1996-09-10 |
| RU95103260A RU95103260A (ru) | 1996-11-27 |
Family
ID=20165417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95103260A RU2066198C1 (ru) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Способ получения легочного сурфактанта |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2066198C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198670C1 (ru) * | 2002-02-19 | 2003-02-20 | ООО "Биосурф" | Способ получения сурфактанта из легких крупного рогатого скота |
-
1995
- 1995-03-17 RU RU95103260A patent/RU2066198C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Pediatrics, 1983, v.71, p.473-481. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198670C1 (ru) * | 2002-02-19 | 2003-02-20 | ООО "Биосурф" | Способ получения сурфактанта из легких крупного рогатого скота |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU95103260A (ru) | 1996-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5024995A (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharamceutical compositions | |
| HK1007103B (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharmaceutical compositions | |
| US4338301A (en) | Lung tissue extract useful for treating hyaline-membrane disease and method for producing the extract | |
| IE840553L (en) | Surfactant and pharmaceutical composition | |
| US4397839A (en) | Surface active material and process for preparing same | |
| EP0145005B1 (de) | Lungen-Surfactant, Verfahren zu seiner Herstellung und seine pharmazeutische Verwendung | |
| JP3012259B2 (ja) | 脂質混合物から糖脂質を分離する方法 | |
| RU2066198C1 (ru) | Способ получения легочного сурфактанта | |
| RU2152219C1 (ru) | Пептиды, обладающие иммуностимулирующей активностью, способ их получения, лекарственный препарат на их основе спленопид и его применение | |
| RU2066197C1 (ru) | Способ получения легочного сурфактанта | |
| RU2033796C1 (ru) | Пептидсодержащая фракция из селезенки млекопитающих, обладающая иммуностимулирующей активностью и способ ее получения | |
| SU624562A3 (ru) | Способ получени вещества, обладающего гормональным действием | |
| CN117683149A (zh) | 一种从普洱茶提取的多糖及其缓解化疗副作用的应用 | |
| RU2198670C1 (ru) | Способ получения сурфактанта из легких крупного рогатого скота | |
| US4226884A (en) | L-gamma-glutamyl-taurine as extracted from parathyroid gland and method of treatment using same | |
| JPH0378372B2 (ru) | ||
| JP2024524512A (ja) | 肺サーファクタントを調製する方法 | |
| KR19980016013A (ko) | 적혈구 용혈 억제용 약제학적 조성물 및 그의 제조방법 | |
| CA1329123C (en) | Inhibitor of angiogenesis | |
| US20200353377A1 (en) | Extraction of animal-derived pulmonary surfactants | |
| KR960013436B1 (ko) | 천연 폐 계면활성제, 그의 제조방법 및 이것을 함유하는 제약 조성물 | |
| EP0673653A1 (en) | Biologically active agent having immunomodulating properties, method for its obtaining and pharmaceutical preparation based on it | |
| CN120771102A (zh) | 一种白及多糖水凝胶及其制备方法和应用、一种负载药物的白及多糖水凝胶及其制备方法 | |
| JPS6361000A (ja) | リポ蛋白質及びその製造法 | |
| JPH07238091A (ja) | 糖タンパク質及びこれを有効成分とする食欲抑制剤 |