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KR19980016013A - 적혈구 용혈 억제용 약제학적 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

적혈구 용혈 억제용 약제학적 조성물 및 그의 제조방법 Download PDF

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KR19980016013A
KR19980016013A KR1019960035511A KR19960035511A KR19980016013A KR 19980016013 A KR19980016013 A KR 19980016013A KR 1019960035511 A KR1019960035511 A KR 1019960035511A KR 19960035511 A KR19960035511 A KR 19960035511A KR 19980016013 A KR19980016013 A KR 19980016013A
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Abstract

본 발명은 하기 일반식(I)의 음전하를 지닌 술포리피드를 포함하는 항용혈제에 관한 것이다.
L-R-SO3X(I)
상기식에서 L은 지질부분이고(지질 부분은 두개의 히드로카본 사실이나 콜레스테롤과 같은 스테롤 구조를 가진다); R은 탄수화물 부분이며(글루코스, 갈락토스, 만노스, 리보스, 2-디옥시리보스, 그리고 이들 중 둘 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되어진다); X는 일반 혈액에 포함되어지는 수소 또는 양이온(Li, Na, K, 1/2 Mg, 1/2 Ca)이다.

Description

[발명의 명칭]
적혈구 용혈 억제용 약제학적 조성물 및 그의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 적혈구 용혈을 방지, 지연, 억제하는 것과 관련된 음전하를 가지는 당지질 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은 적혈구 용혈 치료에 대한 음전하를 가지는 당지질의 사용에 관한 것이며, 특히 포유동물에 있어서 보체 유도성 용혈 및 다른 병인에 의한 용혈의 치료에 적용된다. 또한 용혈 효과를 가지는 약물과 함께 항용혈 조성물로도 적용된다.
적혈구 용혈과 관련된 많은 질환과 질병이 알려져 있다. 그 예를들면, 신생아의 용혈질환, 발작성 야행 혈색 소뇨증, 수혈의 실수로 인한 질환등이다. 어떤 종류에 독소는 예를들면, 스타필로코코스 톡신, 뱀의 독소, 곤충의 독소등이 용혈의 원인이 되는 것으로 알려져 왔다. 또한 약물 유발 면역 용혈등도 알려져 왔으며, 용혈은 혈액의 저장 또는 혈액 성분을 보관시 야기 되기도 한다. 이러한 용혈 특성 때문에 많은 약제가 그 사용에 제한을 받게 된다.
에리스로사이트(Erythrocytes)는 용혈을 억제하는 특별한 시스템이다. 이 에리스로사이트 막에 특별한 글리코프로테인 MACIF가 함유되어 있고, 이 글리코프 로테인의 용혈을 억제 저해하는 기능을 가진 것으로 알려져 왔다. 유럽특허 A20 394 035호에서는 이러한 MACIF의 용해성 제형이 알려져 있다. 또 다른 용혈억제 글리코프로테인은 sCR1로 알려져 있고, 이러한 수용체 형의 보체는 혈구의 막에 존재한다. 이 글리코프로테인은 보체 화합물 C3b와 C4b가 결합되며, 이때 분자량은 250∼290 kDa이다. 글리코프로테인을 제조하는 방법이 PCT/US 93/07406호에 이미 개시되어 있다.
본 발명은 음전하를 가지는 술포리피드(SL)가 보체유도성 용혈과 다른 원인에 의해 용혈을 방지, 저해, 억제하는 새로운 생물학적 용도를 발명한 것이다. SL은 자연석 산물 및 인위적 합성에 의한 SL유도체를 모두 포함하기 위한 용어이며 다음 일반식(I)로 나타낸다.
L-R-SO3X(I)
일반식(I)에서 L은 지질부분이고, R은 탄수화물 부분이며 X는 일반 혈액에 포함되어지는 수소 또는 양이온(Li, Na, K, 1/2 Mg, 1/2 Ca)이다.
지질 부분은 두개 히드로카본 사슬이나 콜레스테롤과 같은 스테롤 구조를 가진다. 지질부분은 C12-C16의 아실과 알킬사슬을 가지는 1,2-디아실글리세롤 또는 1,2-디알킬글리세롤, 또는 1-알킬-2-아실글리세롤, 또는 1-아실-2-알킬글리세롤 또는 세라미드이다. 탄수화물 부분은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 리보스, 2-디옥시리보스, 그리고 이들 중 둘 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되어진다.
이러한 술포리피드는 자연적 산물 혹은 자연적 산물의 유도체, 혹은 인위적인 화학적 합성물이며 그예로 세레브로사이드-3-설페이트, 술포락토실세라미드, 술포갈락토실다아실글리세롤, 술포갈락토실알킬아실글리세롤이다. 바람직한 예의 술포리피드는 세레브로사이드 설페이트이며 자연적산물, 자연적산물의 유도체, 화학적 합성물이다.
우리는 보체 유도 용혈에서 술포리피드가 강한 항용혈 작용을 지님을 발견하였다. 리포솜 또는 유효 농도 50(IC50)가 3∼170 ㎍/ml인 술포리피드를 함유한 지방 에멀젼이 바람직하며, 이때 총 극성 지질중에 16∼90%의 술포리피드를 함유하는 것이 바람직하다. 만약 총 극성 지질중 술포리피드의 양이 16% 이하인 경우 충분한 항 용혈성을 지니지 못한다. 바람직한 지질은 술포리피드, 포스파티딜콜린, 세레브로사이드 및 콜레스테롤의 혼합물이다.
본 발명에 따른 항용혈 조성물의 제조방법은 다음과 같다.
전과정은 두가지 단계로 나누는데 첫번째 단계는 술포리피드(SL)를 포함하는 지질 혼합물을 얻는 것이며 두번째 단계는 등장액에서 지질 현탁액을 만드는 것이다. 본 발명의 조성물을 획득하는데 여러가지 방법이 있겠으나 최적의 SL양과 최적의 지질 환경을 가지는 천연물로 부터 지질을 분리해 내는 방법이 우선이다. 예를 들어 상용화된 술포리피드, 포스파티딜콜린, 세레브로사이드, 콜레스테롤을 가지고 그 구성비를 술포리피드 16∼90%, 포스파티딜콜린 10∼74%, 세레브로사이드 10∼40%, 콜레스테롤 0∼50%로 한다면 높은 활성을 나타낸다.
그러나 이러한 방법은 순수 지질의 높은 가격으로 적당하지 않다. 동물의 뇌나 척수로 부터 유기용매에서의 용해도 차이에 의한 술포리피드를 함유하는 지질 조성물을 획득하는 것이 보다 바람직하다. 그 방법을 기술하면 다음과 같다.
1. 신선한 소척수(cattle spinal cord)를 조직마쇄기로 잘개 분쇄하고 아세톤을 가한다. 교반후 여과하여 아세톤용액을 제거한다.
2. 잔사(residue)에 아세톤을 가하여 교반하고 아세톤 용해물질과 아세톤용액을 제거한다.
3. 잔사(residue)에 메탄올을 가하여 상온에서 교반한 다음 여과하여 추출된 메탄올 용액을 수거한다.
4. 잔사(residue)에 헥산을 가하여 상온에서 교반한 다음 여과하여 추출된 헥산용액을 수거한다.
5. 상기 3번 4번에서 수거한 추출액을 감압 증류한다.
6. 잔사(residue)에 염화메틸렌을 가하여 용해한 다음 아세톤을 가한다. 혼합물을 방치, 침전시킨다.
7. 침전물에 염화메티렌을 가하여 용해한 다음 아세톤을 가한다. 혼합물을 ⅓부피까지 감압 증류하고 방지, 침전시킨다.
8. 침전물을 염화메틸렌을 가하여 용해한 다음 생리식염수를 가하고 다시 메탄올을 가한다. 교반 후 염화메틸렌용액을 분리하고 수층은 제거한다.
9. 분리된 염화메틸렌용액을 탈수시키고 얻어진 지질혼합물을 저온에서 보관한다.
이러한 방법에 의해 획득된 지질 혼합물의 구성은 세레브로사이드 25∼30%, 포스파티딜에탄올아민 16∼25%, 세레브로사이드 설페이트 16∼24%, 포스파티딜콜린 8∼12%, 포스파티딜세린 11∼20% 그리고 스핑고미엘린 4∼6%이다. 이 조성물에 기초한 조성물의 IC50은 (50%의 항용혈성을 가지는 농도)4∼10 ㎍/ml이다.
항용혈 조성물은 정맥주사와 활성도를 높이기 위한 일환으로 전체 표면적을 넓히기 위해 1㎛보다 작은 리포좀의 형태로 제조한다.
이에 대한 방법을 기술하면 다음과 같다. 항용혈성 조성물은 질소 대기 상태에서 클로로포름, 메탄올, 에탄올 용매에서 SL을 포함한 지질 혼합물을 녹여 얻은 다음 용매를 감압 증류하고 생리식염수를 가한다. 초음파와 높은 압력하에서 입자의 크기를 고르게 분산시켜 미세한 입자를 제조한다. 무균조건에서 0.7에서 0.4㎛의 필터를 통과시켜 무균 현탁액을 제조한다.
본 발명은 다른 병인으로 인한 용혈과 특히 보체 유동성 용혈의 방지, 억제에 유용한 조성물을 제공한다.
A. 보체 유동성 용혈의 억제에 대한 조성
본 발명은 SL이 보체유도성 용혈을 억제함을 제시한다. 이러한 유형의 용혈은 신생아의 용혈성 질병과 발작성 야행 혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinur ia)과 같은 질병에서 발병하며 또한 보체 유동성 용혈은 약제의 작용과 미생물의 감염에 의해 발병한다[F.E. Bercovitz(1991) Rev. Infect. Dis V 13, pp 1151∼1162].
SL을 포함하는 조성물을 0.0005mg/ml 에서 20mg/ml의 농도까지 보체 유도성 용혈을 저해한다. 여기서 SL은 전체 극성 지질중 10% 이상을 차지한다. 극성 지질은 세레브로사이드, 콜레스테롤, 디포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린 등의 자연산물이며 상기 극성지질의 화학적 합성 유도체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 조성물은 술포리피드(10∼100%), 포스파티딜콜린(0∼90%), 세레브로사이드(0∼40%), 콜레스테롤(0∼60%)를 포함할때 이다.
다른 극성 지질도 본 조성물에 포함될 수 있으나 항용혈 활성을 낮출 수 있다. 수혈시에는 항상 바라지 않은 혈액 용혈이 따르므로 본 발명의 항용혈 조성물을 혈액에 첨가하여 사용할 수 있으며 이 경우 보체 유도성 용혈에 대한 처리와 같은 조성물로 적용한다. 이때 바람직한 SL을 포함하는 조성물의 농도는 0.005mg/ml∼20mg/ml 이다.
B. 비용혈 조성물(계면활성제 및 항생제와 같은 약제에 의한 용혈의 억제)
본 발명은 약리학적으로 활성이 있지만 혈액의 용혈을 유발하는 물질을 SL과 같이 병합하여 인간을 포함하는 포유동물의 정맥주사에 적합한 비용혈 조성물을 제공한다. 면역적 용혈뿐만아니라 비면역적 용혈에 대한 저해를 위해 적혈구의 파괴를 유발하는 물질과 강한 친화력이 있는 물질을 발견하는 것이 중요하다.
본 발명의 항용혈 조성물은 강한 음전하를 가지고 있기 때문에 지질 이중층에 용해되거나 강한 양전하를 가진 물질에 의한 용혈을 감소시킬 수 있다. 세파크로르는 세파로스포린계 항생제로써 용혈을 유발하는 약제로 알려져 있다. 본 발명의 항용혈 조성물은 이 약제에 의한 용혈을 억제한다. 이 경우에 있어서 효과적인 농도를 보체유도성 용혈의 경우 보다 높아 0.02mg/ml에서 20mg/ml 이다. 그리고 그 조성은 술포리피드(5∼100%), 포스파티딜콜린(0∼95%), 콜레스테롤(0∼60%), 세레브로사이드(0∼50%), 포스파티딜에탄올아민(0∼30%), 포스파티딜세린(0∼30%), 스핑고미엘린(0∼35%)이다. 로릴술피트류의 계면활성제의 경우도 용혈을 유발하며 위와같은 조성의 본 발명의 항용혈 조성물을 첨가하여 용혈을 억제할 수 있다.
C. 저장성 용혈의 억제에 대한 조성
동물세포는 세포내외의 삼투압의 차이에 의해 저장액에서 세포막의 파괴된다. 몇몇 감염에 의해서도 저장성 용혈은 유도된다(M.L. Bennish et al (1990) J.Infect. Dis. V. 161. pp 500∼506).
혈장은 적혈구 세포의 저장성용혈을 보호한다. 이러한 용혈에 대한 보호를 하는 혈장의 구성물이 저장액에 노출된 적혈구 세포의 세포막을 에워싸고 있으며 또한 강한 음전하를 가짐으로써 나트륨이온들과 결합하여 삼투압적으로 활성층을 형성하여 세포내의 과다한 물의 유입을 막는다(T.Butler, C.A. Bradley, J.E. Owensby (1992) Int. J. Exp. Pathol. V. 73. p 2733).
본 발명에서의 SL은 강한 산성 그룹으로 음전하를 가지고 있으며 이에 대해 본 발명의 항용혈 조성물은 저장성 용혈에 대한 보호기능을 가진다. 이 경우 효과적인 농도를 0.01mg/ml∼0.02mg/ml이며 최적 조성은 술포리피드(16∼100%), 포스파티딜콜린(0∼84%), 콜레스테롤(0∼60%), 세레브로사이드(0∼50%)이다.
신생아의 적혈구용혈병, 발작성 야간 혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemo globinuria)등을 포함하는 보체유도성 용혈을 수반하는 병의 치료에 있어서 본 발명의 항용혈 조성물의 농도는 등장액에서 14∼30mg/kg이고 정맥주사로 투여된다. 수혈의 경우 등장액으로 2∼5% 현탁하여 혈액에 0.005mg/ml∼5mg/ml 까지의 농도로 투여한다. 용혈을 유발하는 약제의 사용에 있어서 본 발명의 항용혈 조성물은 정맥주사로 14∼300mg/kg으로 투여한다.
[제조실시예]
이 제조실시예는 소의 척수로부터 본 발명의 항용혈 조성물을 제조하는 방법을 나타낸다. 본 발명은 다른 동물의 척수나 뇌 또는 조직세포에 함유되어 있는 술포리피드를 추출하는 데도 적합한다. 모든 조작은 질소기류하에서 수행된다.
스테이지 1. 술포리피드를 함유한 지질 혼합물의 제조
1kg의 냉동된 소 척수를 균일하게 분쇄하고 0.5∼1L의 아세톤을 가한다. 분쇄된 소 척수는 반응기에 투입하고 -10℃의 냉각된 아세톤을 가한다. 혼합물은 5분간 교반시키고, 너쉬(Nutsch) 필터로 여과시킨다. 아세톤 용액을 제거하고, 잔사를 반응기에 옮긴다. -10℃로 냉각된 아세톤을 가하고 경렬하게 2시간 동안 교반한다. 잔사를 필터로 여과한다(아세톤 추출물 2). 이 작업을 한번 더 반복한다(아세톤 추출물 3). 잔사를 너쉬 필터에서 0.2L 메탄올로 세척한다. 아세톤 추출물 2와 3을 콜레스테롤 분리를 위해 사용한다. 잔사를 반응기에 넣는다. 메탄올을 가한다. 혼합물을 20∼22℃에서 2시간 동안 교반한다. 잔사는 너쉬 필터에 여과한다.
메탄올 추출물(추출물 1)을 냉장고에 넣는다. 잔사를 반응기에 넣는다. 헥산을 가하고 2시간 동안 교반시킨다. 잔사는 너쉬 필터에 여과시킨다. 헥산 추출물(추출물 2)을 냉장고에 넣는다. 잔사를 반응기에 넣는다. 헥산을 가한다. 혼합물을 2시간 동안 격렬하게 교반하고 잔사는 너쉬 필터에 여과시킨다. 헥산 추출물(추출물 3)을 냉장고에 넣는다. 추출물 1, 2, 3을 35∼40℃의 진공에서 증발 건조시킨다.
잔사를 0.5 L 메틸클로라이드에 녹인다. 2.5 L 아세톤을 지질 수용액에 교반 하면서 가한다. 혼합물을 18시간 동안 냉장상자(0∼4℃)에 넣고 침전물을 원심분리 한 후 상등액을 제거한다. 침전물을 0.3 L 메틸클로라이드에 녹인다. 아세톤을 지질용액에 가하고 혼합물을 18시간 동안 냉장상자에 넣는다. 짐전물을 원심 분리하고 상등액을 제거한다. 침전물을 0.3 L 메틸클로라이드에 녹인다. 메탄올을 교반하면서 지질용액에 가하고 혼합물을 증발시킨다. 혼합물을 18시간 동안 냉장상자에 넣고 원심분리한 후 상징액을 제거한다. 침전물을 0.3 L 메틸클로라이드에 녹이고 1.5 L 메탄올을 지질용액에 가한다. 혼합물을 냉장상자에 18시간동안 넣고 침전물을 원심분리하고 상징액을 제거한다. 침전물을 0.3 L 메틸클로라이드에 녹인다. 0.3 L 생리식염수와 0.1 L 메탄올을 지질용액에 가하고 혼합물을 5분간 교반시킨다.
메틸클로라이드 용액을 분리기를 통해 분리하고 수층을 제거한다. 메틸클로라이드 용액을 0.1∼0.2kg Na2SO4에 의해 탈수시키고 냉장상자에 2시간 동안 넣는다. 메틸크로라이드 용액을 여과하여 분리하고 Na2SO4를 제거한다. 메틸클로라이드 지질용액을 -10N∼-20℃ 냉장고에 넣고 저장한다. 지질의 농축이 결정된다.
스테이지 2. 본 발명의 항용혈 조성물의 제조
메틸클로라이드 용액을 증발시키고 생리식염류에 분산시킨 후 지질의 농도를 2.6%까지 분산시킨다. 리포솜의 분산을 마이크로플루이다이저를 통해 3,4회 시키고(동일한 옵티컬 댄시티까지) 분산물을 멸균시킨다. 분산물을 0.4㎛ 필터를 통해 여과시키고 지질의 농도를 결정시킨다. 분산물을 2%의 멸균 등장용액에 희석시키고 제조된 지질을 멸균 병에 삽입시킨다.
[실시예]
항용혈의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
시약 1(Reagent 1) : 생리식염수 9ml에 적혈구 1ml를 가한다. 30초간 잘 섞은 다음 원심분리하여 상징액을 버린다. 이 과정을 2∼3회 반복한다. 이렇게하여 얻어진 적혈구 0.3ml와 9.7ml의 생리식염수를 섞는다.
시약 2(Reagent 2) : 용혈성혈청 0.1ml를 생리식염수 30ml에 희석시킨다(섭씨 35도에서 20∼45분 동안 적혈구의 용혈이 일어나는 농도이며 희석된 혈청과 적혈구의 부피비는 1:1로 한다.)
시약 3(Reagent 3) : 보체 8mg을 생리식염수 1ml에 녹이고 다시 생리식염수 9ml로 희석하였다.
반 응
1. 주요 대조군 : 시약은 다음과 같은 순서로 혼합하였다.
시약 1(Reagent 1) 0.5ml + 시약 2(Reagent 2) 0.5ml +
시약 3(Reagent 3) 0.5ml + 생리식염수 1ml
2. 적혈구 대조군 : 시약은 다음과 같은 순서로 혼합하였다.
시약 1(Reagent 1) 0.5ml + 생리식염수 2ml
3. 리포좀 분산 대조군 : 시약은 다음과 같은 순서로 혼합하였다.
항용혈조성물 0.5ml + 생리식염수 2ml
4. 주실혐 : 시약은 다음과 같은 순서로 혼합하였다.
시약 1(Reagent 1) 0.5ml + 항용혈조성물 0.5ml + 시약 2(Reagent 2)
0.5ml + 시약 3(Reagent 3) 0.5ml + 생리식염수 0.5ml
이들 샘플들은 섭씨 30도에서 주요대조군이 완전한 용혈이 일어 날때까지 배양하고 원심분리하였다. 상징액을 8배 희석하여 418nm에서 그 흡광치를 측정하였다. 항용혈 활성도는 다음과 같은 식에 따라 계산하였다.
AA = [(ODcont - (ODex - ODls))/ODcont] * 100%일반식 (4)
여기서 ODex는 418nm에서의 실험의 흡광치이고, ODcont은 418nm에서의 주요 대조군의 흡광치이며, ODls는 주실험에서와 같은 농도의 지질현탁액에 대한 흡광치를 나타낸다. 이와같이 항용혈 활성도를 측정한 후 IC50즉 50%의 활성을 나타내는 농도를 계산하였다.
[실시예 1∼16]
다음의 실시예 SL과 SL을 포함되는 복합체의 항용혈 활성을 나타낸다.
실시예 1과 실시예 2는 소의 뇌와 척수에서 정제한 각각의 세레브로사이드 술피트(CS)가 실질적으로 같은 항용혈 활성을 나타냄을 보여준다. 실시예 3∼6은 두가지 조성물에 있어서 에그(egg) 포스파티딜콜린(PC)은 항용혈 활성을 증가시키는 반면, 스핑고미에린(SM)은 항용혈 활성을 감소시킨다. 실시예 7과 실시예 8은 술포락토실세라미드(SLC)와 술포갈락토실디아실그리세롤(SGDAG)의 항용혈 활성을 나타낸것이다. 실시예 9∼13은 세가지 조성물에 대한 항용혈 활성도를 나타낸 것인데 이러한 조성에 있어서 세레브로사이드(Cer)와 콜레스테롤(Chol)의 첨가의 경우 활성이 증가하였다. 실시예 14에서는 세레브로사이드와 콜레스테롤을 같이 혼합한 네가지 조성물이 세레브로사이드 슐피트의 항용혈 활성을 증가시킴을 알 수 있다. 실시에 15는 제조실시예에서 조제한 소의 척수에서 분리한 조성물의 강한 항용혈 활성을 나타낸다. 실시예 16은 리포좀과 지질현탁액에서의 항용혈 활성도의 차이를 나타낸다.
[실시예 17∼20]
본 실시예 17∼20은 신생아의 용혈병에 있어서 본 발명의 항용혈 조성물에 의한 면역용혈의 억제를 실시하였다. 실험과정은 다음과 같다.
용혈병이 있는 신생아의 적혈구와 그 어머니의 혈청을 사용하였다. 신생아 전두(forehead)의 세정맥에서 뽑은 혈액속의 섬유소를 제거하고 얻어진 적혈구 1ml에 생리식염수 9ml를 가하여 30초간 잘 섞은 다음 원심분리하여 상징액을 버린다. 이 과정을 두번 반복한 적혈구 0.3ml에 생리식염수 9.7ml를 가한다. 신생아의 어머니에서 뽑은 혈액은 섭씨 20도에서 2시간 방치한 다음 원심분리한다. 얻어진 혈청은 생리식염수로 10배 희석하였다. 주실험에서 0.5ml의 적혈구에 본 발명의 항용혈 조성물 0.5ml, 혈청, 0.5ml, 생리식염수 0.5ml를 가한다. 공백(blank)실험에서 0.5ml의 적혈구에 혈청0.5ml, 생리식염수 1ml를 가한다. 광산란 대조군에서 본 발명의 항용혈 조성물 0.5ml에 혈청 0.5ml, 생리식염수 1ml를 가한다. 모든 샘플은 418nm에서 측정되었고 용혈의 정도는 다음과 같은 공식에 의해 계산하였다.
H = (ODex - ODlS - ODbl) * 100/OD100일반식(5)
여기서 ODex는 주실험에서의 흡광치, ODbl은 공백(blank)실험에서의 흡광치, OD은 100% 용혈ㄹ하에서의 흡광치 OD100는 주실험에서와 같은 농도의 지질현탁액에 대한 흡광치이다. 이 실험은 본 발명의 항용혈 조성물의 최종농도를 0.04, 0.2, 1mg/ml로 정하여 행하였다. 그 결과를 표2에 나타내었다.
표에서 보는 바와 같이 본 발명이 항용혈 조성물이 없을 시 용혈은 병의 정도에 따라 21∼48%로 나타났고 모든 경우에 있어 0.2mg/ml의 농도 이상에서 현저한 용혈의 지연이 일어났다.
[실시예 21]
본 실시예는 발작성 야간 혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)의 경우에 본 발명의 항용혈 조성물에 의한 보체 유동성 용혈의 억제를 보여준다.
그 실험과정은 다음과 같다.
발작성 야간 혈색소뇨증 환자의 혈액과 정상인의 혈액을 대조군으로 수집하여 항응고제로 소듐 옥살레이트나 소듐 시트레이트를 첨가하였다. 용혈시스템의 구성은 표3에 따라 혼합하였고 본 발명의 항용혈 조성물은 2번 시험관에 첨가하였다. 이 시험관은 섭씨 37도에서 1시간 배향하였다. 0.04% 수산화암모늄 4.7ml에 상징액을 섞는다. 공백(blank)실험으로 0.04% 수산화암모늄 4.7ml를 0.3ml 혈청에 섞는다. 0.04% 수산화암모늄 4.7ml에 환자로 부터의 적혈구 0.025ml를 가하고 생리식염수 0.275ml를 가하여 100% 용혈반응을 실시하였다. 모든샘플은 418nm에서 흡광치를 측정하였고 용혈 정도는 다음과 같은 공식에 따라 계산하였다.
H = (ODex - ODls - ODbl) * 100/OD100일반식(5)
여기서 ODex는 주실험에서의 흡광치, ODbl은 공백(blank)실험에서의 흡광치, OD100은 100% 용혈하에서의 흡광치, ODls는 주실험에서와 같은 농도의 지질 현탁액에 대한 흡광치이다.
[실시예 22∼29]
본 실시예는 포유동물 중 양과 토끼에 대한 면역 용혈의 경우 본 발명의 항용혈 조성물에 의한 항용혈성과 보체 유도성 용혈과 수반된 장애와 병들의 치료법에 관해 기술하였다.
[실시예 30∼41]
본 실시예는 스타필로코커스 독소, 독액 독소, 곤충의 독소로 인한 용혈의 경우 본 발명의 항용혈 조성물의 항용혈성을 예시한다. 뱀과 곤층의 독소는 용혈 효과를 가진다는 것을 이미 잘 알려져있는 사실이다. 이러한 독소의 구성성분 중 용혈의 반응을 일으키는 중요한 인자는 포스포리파제이다.
포스포리파제는 포스포리피드의 에스테르 결합을 절단하여 리소-포스포리피드를 만드는데 이것은 세포막의 지질 이중층을 파괴한다. 포스포리파제C는 미생물에서 생산되어 융혈 효과를 가진다. 이 경우 디아실디글리세리드가 형성되고 이렇게 종류의 리피드는 매우 작은 폴라 헤드를 가진다. 그래서 지질 이중층을 형성하지 못하고 세포막을 파괴시킨다. 이러한 세포막을 불안정화하는 물질에 대해 강한 음전하를 가지는 SL을 포함하는 리포좀은 포스포리파제와 같은 세포막 의존성 단백질의 좋은 표적물이 된다. 따라서 리포좀은 용혈을 방지, 저해, 억제시킨다.
실험과정 : 생리식염수 9ml에 적혈구 1ml를 가한다. 30초간 잘 섞은 다음 원심분리하여 상징액을 버린다. 이 과정을 2∼3회 반복한다. 이렇게하여 얻어진 적혈구 0.3ml와 9.7ml의 생리식염수를 섞는다. 곤충의 독액은 생리식염수에 희석하여 0.15mg/ml로 하였고, 포스포리파제 C의 농도는 생리식염수의 희석하여 10mg/ml로 하였으며, 알파-헤모리신은 희석하지 않고 상용으로 준비된 그래도 사용하였다. 0.25ml 적혈구에 본 발명의 항용혈 조성물(20mg/ml) 0.25ml를 가한 다음 독소물 0.05ml를 가하였다. 대조군 실험으로 본 발명의 항용혈 조성물 대신에 생리 식염수를 동일 부피 가하였다.
이들 샘플들은 섭씨 30도에서 주요대조군의 완전한 용혈이 일어 날 때까지 배양하고 원심분리하였다. 상징액을 8배 희석하여 418nm에서 그 흡광치를 측정하였다. 항용혈 활성도는 다음과 같은 식에 따라 계산하였다.
AA = [(ODcont - (ODex - ODls))/ODcont] * 100%일반식(4)
여기서 ODex는 418nm에서의 주실험의 흡광치이고, ODcont은 418nm에서의 주요대조군의 흡광치이며, ODls는 주실험에서와 같은 농도의 지질현탁액에 대한 흡광치를 나타낸다.
실시예 31, 34, 37, 40에서 음전하를 감소시키는 스테아릴아민을 함유한 본 발명의 항용혈 조성물은 항용혈 활성도를 감소시킨다. 이는 전하를 가지는 본 발명의 하용혈 조성물의 구성성분에 대한 중요성을 확인시켜 준다.
[실시예 42∼45]
본 실시예는 용혈 효과를 수반하는 세파로스포린계 항생제인 세파크로르에 대한 본 발명의 항용혈 조성물의 항용혈성을 시험하였다.
실험과정
1) 세파크로르의 포화농도 결정 : 5mg/ml 실사용농도는 2.5mg/ml
2) 용혈을 야기하는 세파크로르의 농도 결정
1. 0.25ml 적혈구 + 0.9ml 생리식염수 + 0.1ml 세파크로르
2. 0.25ml 적혈구 + 0.8ml 생리식염수 + 0.2ml 세파크로르
3. 0.25ml 적혈구 + 0.7ml 생리식염수 + 0.3ml 세파크로르
4. 0.25ml 적혈구 + 0.5ml 생리식염수 + 0.5ml 세파크로르
섭씨 37도에서 1시간 30분간 배양한 뒤 용혈을 측정하였으며 샘플 4에서만 약15%의 용혈을 관찰할 수 있었으며 샘플 4를 주실험에 적용하였다.
3) 주실험
1. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 1.0% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.5ml 세파크로르 + 0.25ml 생리식염수
2. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 0.1% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.5ml 세파크로르 + 0.25ml 생리식염수
3. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 0.1% 본 발명의 항용 조성물 + 0.5ml 세파크로르 + 0.25ml 생리식염수
동시에 주요 대조군으로 본 발명의 항용혈 조성물 대신 동일 부피의 생리식염수를 가하였으며 섭씨 37도에서 1시간 30분 배양하고 원심분리하여 상징액을 8배 희석한 후 418nm 에서 흡광치를 측정하였다.
[실시예 46∼50]
본 실시예는 로릴 슬피트를 포함한 계면활성제에 의한 용혈의 경우 본 발명의 항용혈 조성물에 의한 항용혈 활성도를 나타내다. 0.041mg/ml 농도의 로릴슐피트를 사용하였으며 이 농도는 10분안에 완전한 용혈을 야기한다.
실험과정
1) 용혈을 야기하는 로릴술피트의 농도 결정
1. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 생리식염수 + 0.25ml 0.5% 로릴술피트
2. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 생리식염수 + 0.25ml 0.05% 로릴술피트
3. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 생리식염수 + 0.25ml 0.025% 로릴술피트
4. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 생리식염수 + 0.25ml 0.0125% 로릴술피트
5. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 생리식염수 + 0.25ml 0.00625% 로릴술피트
섭씨 20도에서 5분간 배양하고 용혈정도를 계산하였다. 샘플 4에서 용혈이 완전히 일어났고 샘플 5에서는 20% 용혈이 일어났다. 따라서 샘플 4를 선택하였다.
2) 주실험
1. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 1.0% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.25ml 0.125mg/ml 로릴슐피트
2. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 1.0% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.25ml 0.125mg/ml 로릴슐피트
3. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 1.0% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.25ml 0.125mg/ml 로릴슐피트
4. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 1.0% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.25ml 0.125mg/ml 로릴슐피트
5. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 1.0% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.25ml 0.125mg/ml 로릴슐피트
동시에 주요 대조군으로 본 발명의 항용혈 조성물 대신 동일 부피의 생리식염수를 가하였으며 섭씨 20도에서 20분 배양하고 원심분리하여 상징액을 8배 희석한후 418nm에서 흡광치를 측정하였다.
[실시예 51∼56]
본 실시예에서는 저장액으로 인한 용혈의 억제에 관한 것이다.
실험과정
1) 용혈에 대한 염화나트륨에 농도결정
1. 0.25 적혈구 + 0.75ml 0.81% 염화나트륨
2. 0.25 적혈구 + 0.75ml 0.76% 염화나트륨
3. 0.25 적혈구 + 0.75ml 0.63% 염화나트륨
4. 0.25 적혈구 + 0.75ml 0.54% 염화나트륨
5. 0.25 적혈구 + 0.75ml 0.45% 염화나트륨
6. 0.25 적혈구 + 0.75ml 0.36% 염화나트륨
샘플 5와 6에서 염화나트륨 용액을 가한 후 즉시 용혈이 일어났으며 섭씨 20도에서 15분간 배양한 후 샘플 2에서의 용액은 45%이며 샘플 3에서의 용혈은 85% 이었다.
2) 주실험
1. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 0.01% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.75ml 0.63% 염화나트륨
2. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 0.02% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.75ml 0.63% 염화나트륨
3. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 0.01% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.75ml 0.76% 염화나트륨
4. 0.25ml 적혈구 + 0.25ml 0.02% 본 발명의 항용혈 조성물 + 0.75ml 0.76% 염화나트륨
동시에 주요 대조군으로 본 발명의 항용혈 조성물 대신 동일 부피의 생리식염수를 가하였으며 섭씨 20도에서 20분 배향하고 원심분리하여 상징액을 8배 희석한후 418nm에서 흡광치를 측정하였다.

Claims (6)

  1. 신선한 소척수 또는 포유동물의 뇌나 척수를 분쇄, 아세톤을 가하고 아세톤 용해물질과 아세톤용액을 제거한 후, 메탄올을 가하여 여과하여 추출된 메탄올 용액을 수거하고, 헥산을 가하여 추출된 헥산용액을 수거한 후, 상기 수거한 추출액을 감압 증류하고, 염화메틸렌을 가하여 용해한 다음 아세톤을 가하고, 침전물에 염화메틸렌을 가하여 용해한 다음 메탄올을 가하고, 혼합물을 1/3 부피까지 감압 증류하고 방치, 침전시킨 후, 염화메틸렌을 가하여 용해한 다음 생리 식염수를 가하고 다시 메탄올을 가한 후, 염화메틸렌용액을 분리하고 수층은 제거한 뒤, 분리된 염화메틸렌용액을 탈수시킴을 특징으로 하는 술포리피드를 함유하는 항용혈 지질 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 항용혈 지질 조성물의 구성은 세레브로사이드 25∼20%, 포스파티딜에탄올아민 16∼25%, 세레브로사이드 설페이트 16∼24%, 포스파티딜콜린 8∼12%, 포스파티딜세린 11∼20% 및 스핑고미엘린 4∼6%를 함유함을 특징으로 하는 항용혈 지질 조성물의 제조방법.
  3. 하기 일반식(I)의 음전하를 지닌 술포리피드를 포함하는 지질 혼합물로 구성된 항용혈제
    L-R-SO3X(I)
    상기식에서, L은 지질부분이고(지질 부분은 두개의 히드로카본 사슬이나 콜레스테롤과 같은 스테롤 구조를 가진다);
    R은 탄수화물 부분이며(글루코스, 갈락토스, 만노스, 리보스, 2-디옥시리보스, 그리고 이들 중 둘 이상의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되어진다);
    X는 일반 혈액에 포함되어지는 수소 또는 양이온(Li, Na, K, 1/2 Mg, 1/2 Ca)이다.
  4. 제3항에 있어서, 음전하를 지니는 술포리피드는 세레브라사이드-3-설페이트, 술포락토실세라미드, 술포갈락토실디아실글리세롤 또는 술포갈락토실알킬아실 글리세롤임을 특징으로 하는 항용혈제.
  5. 제3항에 있어서, 지질 혼합물중 일반식(I)의 술포리피드의 함량이 총 극성지질 함량중 16∼90% 포함함을 특징으로 하는 항용혈제.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 혼합물의 구성이 술포리피드 16∼90%, 포스파티딜콜린 10∼74%, 세레블사이드 10∼40%, 콜레스테롤 0∼50%임을 특징으로 하는 항용혈제.
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