RU2066198C1 - Method of pulmonary surfactant preparing - Google Patents
Method of pulmonary surfactant preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2066198C1 RU2066198C1 RU95103260A RU95103260A RU2066198C1 RU 2066198 C1 RU2066198 C1 RU 2066198C1 RU 95103260 A RU95103260 A RU 95103260A RU 95103260 A RU95103260 A RU 95103260A RU 2066198 C1 RU2066198 C1 RU 2066198C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- surfactant
- extract
- water
- minutes
- phospholipids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 title claims description 25
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 46
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 abstract description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 14
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 10
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 7
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 206010006475 bronchopulmonary dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPNBCDPAKXQPHW-UHFFFAOYSA-N acetic acid chloroform methanol propan-2-one Chemical compound C(C)(=O)O.CO.C(Cl)(Cl)Cl.CC(=O)C CPNBCDPAKXQPHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229940066294 lung surfactant Drugs 0.000 description 1
- 238000005399 mechanical ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 1
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов из природного сырья, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов. The invention relates to medicine, namely to the production of drugs from natural raw materials, and may find application in the industrial production of natural pulmonary surfactants.
Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в эпителиальных клетках легкого (альвеолоциты II типа) и эксткретируется ими на внутреннюю поверхность легких, создавая таким образом высокоспецифическую легочную "смазку". Сурфактант покрывает поверхность альвеолярного эпителия и, обладая способностью резко снижать поверхностное натяжение, предотвращает коллапс альвеол в конце выдоха. Pulmonary surfactant is a natural complex of substances consisting of phospholipids, neutral lipids and surfactant-associated proteins. It is synthesized in the epithelial cells of the lung (type II alveolocytes) and is secreted by them on the inner surface of the lungs, thus creating a highly specific pulmonary "lubricant". Surfactant covers the surface of the alveolar epithelium and, having the ability to sharply reduce surface tension, prevents the collapse of the alveoli at the end of exhalation.
Известно, что основной причиной синдрома дыхательных расстройств новорожденных, в особенности недоношенных, является недостаточность системы легочного сурфактанта. По этой причине до начала 90-х годов в развитых странах Запада умирало, а в России и в настоящее время погибает около половины недоношенных детей или около 15 20 тысяч детей ежегодно. Кроме того, у тех новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, которые выживают, формируется бронхо-легочная дисплазия вследствие применения в их лечении искусственной вентиляции легких с использованием газовых смесей с высоким (более 60%) содержанием кислорода. Впоследствии эти дети страдают тяжелыми хроническими заболеваниями легких. It is known that the main cause of respiratory distress syndrome in newborns, especially premature infants, is the failure of the pulmonary surfactant system. For this reason, before the beginning of the 90s in the developed countries of the West, about half of premature babies or about 15 20 thousand children die every year in developed Western countries. In addition, those newborns with respiratory distress syndrome who survive have bronchopulmonary dysplasia due to the use of mechanical ventilation in their treatment using gas mixtures with a high (over 60%) oxygen content. Subsequently, these children suffer from severe chronic lung diseases.
Легочный сурфактант является единственным и чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных детей. Pulmonary surfactant is the only and extremely effective means of preventing and treating respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia in newborns.
Применение такого рода препаратов в последние годы в экономически развитых странах позволило резко (на 60 90%) снизить смертность недоношенных новорожденных. В нашей стране легочные сурфактанты не производятся и из-за их дороговизны не закупаются, а потому практически не используются. The use of such drugs in recent years in economically developed countries has dramatically (60 90%) reduce the mortality of premature infants. In our country, pulmonary surfactants are not produced and, because of their high cost, are not purchased, and therefore practically not used.
В мировой медицинской практике применяют как синтетические и полусинтетические, так и природные легочные сурфактанты. Считают, что синтетические сурфактанты менее эффективны, хотя они безусловно более доступны. В то же время эти препараты в отличие от природных не содержат чрезвычайно важных для их свойств сурфактант-ассоциированных белков. In world medical practice, both synthetic and semi-synthetic, as well as natural pulmonary surfactants are used. Synthetic surfactants are believed to be less effective, although they are certainly more affordable. At the same time, these drugs, unlike natural ones, do not contain surfactant-associated proteins that are extremely important for their properties.
Предлагаемый нами способ относится к получению природных легочных сурфактантов, в частности сурфактантов из легких крупного рогатого скота. Our proposed method relates to the production of natural pulmonary surfactants, in particular surfactants from cattle lungs.
Известен способ получения природного легочного сурфактанта из амниотической жидкости рожениц [1]
Способ заключается во взятии амниотической жидкости при проведении Кесарева сечения, ее центрифугировании при 150 g для удаления клеток, центрифугировании супернатанта при 7500 g для получения осадка, разделении ресуспендированного осадка в ступенсатом градиенте плотности сахарозы, трехкратного продавливания полученного из интерфазы материала через нейлоновую сетку с величиной пор 20 мкм с трехкратным переосаждением сурфактанта между этими продавливаниями и хранении полученного материала в замороженном состоянии.A known method of obtaining natural pulmonary surfactant from the amniotic fluid of women in labor [1]
The method consists in taking the amniotic fluid during Caesarean section, centrifuging it at 150 g to remove cells, centrifuging the supernatant at 7500 g to obtain a precipitate, separating the resuspended precipitate in a graduated sucrose density gradient, triple forcing the material obtained from the interphase through a nylon mesh with pore size 20 microns with three reprecipitation of surfactant between these bursts and storage of the obtained material in a frozen state.
Полученный этим способом препарат содержит 80,7% фосфолипидов, 9,4% нейтральных липидов и 5,4% белка. The preparation obtained by this method contains 80.7% phospholipids, 9.4% neutral lipids and 5.4% protein.
Такой состав характерен для природного легочного сурфактанта. Наличие указанного количества белка в препарате свидетельствует о присутствии в нем как гидрофобных, так и гидрофильных сурфактант-ассоциированных белков. Эти белки существенны для проявления функциональных свойств легочного сурфактанта. This composition is characteristic of natural pulmonary surfactant. The presence of the indicated amount of protein in the preparation indicates the presence of both hydrophobic and hydrophilic surfactant-associated proteins in it. These proteins are essential for the manifestation of the functional properties of pulmonary surfactant.
Вместе с тем отмечаемая авторами высокая вязкость препарата, вынуждающая авторов для ее уменьшения проводить трехкратное продавливание суспензии через нейлоновую сетку с диаметром пор 20 мкм свидетельствуют, как нами показано, о присутствии в препарате значительного количества ДНК (0,06 0,2 мг/мг фосфолипидов), что в настоящее время считается абсолютно недопустимым. At the same time, the high viscosity of the preparation, noted by the authors, forcing the authors to triple forcing the suspension through a nylon mesh with a pore diameter of 20 μm, indicates, as we have shown, the presence of a significant amount of DNA in the preparation (0.06 0.2 mg / mg phospholipids ), which is currently considered absolutely unacceptable.
Как свидетельствует описание способа выделения сурфактакта из амниотической жидкости он трудоемок, сложен и длителен, содержит 6 процедур центрифугирования, 5 из них длительные (90 120 мин); способ нетехнологичен, получаемый по нему продукт чрезвычайно дорог и поэтому способ безусловно не может лечь в основу промышленного производства сурфактанта. As evidenced by the description of the method for isolating surfactant from amniotic fluid, it is laborious, complex and time consuming, contains 6 centrifugation procedures, 5 of which are long (90 120 min); the method is non-technological, the product obtained through it is extremely expensive and therefore the method certainly cannot form the basis of the industrial production of surfactant.
Наиболее близким к заявляемому и взятому в качестве прототипа является способ получения "Сурфактантного состава и фармацевтических композиций для использования в лечении синдрома дыхательных расстройств" (European patent 0 119 056 B1) [2]
Способ предназначен для получения полусинтетического легочного сурфактанта, который содержит как основные компоненты 1,2-дипальмитоил-глицеро-(3)-фосфохолин (65,4% ) важнейший фосфолипид природного легочного сурфактанта, пальмитиновую кислоту (8,7%) и липопротеин (природный липопротеин, выделенный из легкого крупного рогатого скота) в количестве 1,3% В качестве дополнительных компонентов используются различные синтетические фосфолипиды.Closest to the claimed and taken as a prototype is a method of obtaining a "Surfactant composition and pharmaceutical compositions for use in the treatment of respiratory distress syndrome" (European patent 0 119 056 B1) [2]
The method is intended to produce a semisynthetic pulmonary surfactant, which contains the major components of 1,2-dipalmitoyl-glycero (3) -phosphocholine (65.4%), the most important phospholipid of natural pulmonary surfactant, palmitic acid (8.7%) and lipoprotein (natural 1.3% lipoprotein isolated from cattle lung) Various synthetic phospholipids are used as additional components.
Способ состоит прежде всего в получении липопротеина из легкого крупного рогатого скота. The method consists primarily in obtaining lipoprotein from cattle lung.
Для получения липопротеина легкое быка отмывают водой от крови и других загрязнений, разделяют на доли, удаляют сосуды, нарезают на тонкие куски и пропускают через мясорубку. К полученному гомогенату ткани добавляют физиологический раствор и перемешивают смесь при 4oС в течение 100 мин. Гомогенат фильтруют под давлением и получают грубый экстракт.To obtain lipoprotein, the bull’s lung is washed with water from blood and other contaminants, divided into lobes, blood vessels are removed, cut into thin pieces and passed through a meat grinder. Saline solution is added to the resulting tissue homogenate and the mixture is stirred at 4 ° C. for 100 minutes. The homogenate is filtered under pressure to obtain a coarse extract.
Этот экстракт центрифугируют при 10000 об/мин, супернатант выбрасывают, а осадок ресуспензируют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и осадок выбрасывают. Полученный супернатант центрифугируют снова при 10000 об/мин и собирают сырой осадок. Полученный таким образом неочищенный (грубый) осадок суспендируют в воде и к полученной суспензии добавляют хлорид натрия, таким образом чтобы достичь удельной плотности приблизительно 1,20, т.е. получают суспензию с концентрацией хлорида натрия около 30% Полученную суспензиют центрифугируют при 10000 об/мин при 0oС в течение 50 мин, что приводит к разделению ее на три слоя. Верхний слой, представляющий собой пенистую эмульсию, собирают и суспендируют в дистиллированной воде. Полученную суспензию диализуют через целофановую мембрану против дистиллированной воды. После этого диализованную суспензию лиофилизируют и получают неочищенный (грубый) сухой продукт. К этому неочищенному продукту добавляют холодный этилацетат при 5oС, полученную смесь перемешивают в течение 45 мин и фильтруют под остаточным давлением для отделения нерастворимого материала. Этот нерастворимый материал высушивают и добавляют к нему растворяющую смесь, состоящую из хлороформа и метанола (в объемном отношении 2:1). Полученную смесь встряхивают в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр для получения фильтрата. Отфильтрованный осадок экстрагируют еще раз той же смесью растворителей и тем же объемом и фильтруют для получения вторичного экстракта. Эту процедуру повторяют еще раз. Три полученных экстракта объединяют и высушивают досуха под остаточным давлением до получения твердого остатка.This extract is centrifuged at 10,000 rpm, the supernatant is discarded, and the pellet is resuspended in physiological saline and centrifuged again at 2000 rpm for 10 min, and the pellet is discarded. The resulting supernatant was centrifuged again at 10,000 rpm and a crude precipitate was collected. The crude (crude) precipitate thus obtained is suspended in water and sodium chloride is added to the resulting suspension, so as to achieve a specific gravity of about 1.20, i.e. get a suspension with a concentration of sodium chloride of about 30%. The resulting suspension is centrifuged at 10,000 rpm at 0 o C for 50 minutes, which leads to its separation into three layers. The top layer, which is a foamy emulsion, is collected and suspended in distilled water. The resulting suspension is dialyzed through a cellophane membrane against distilled water. After that, the dialyzed suspension is lyophilized and a crude (crude) dry product is obtained. Cold ethyl acetate was added to this crude product at 5 ° C, the resulting mixture was stirred for 45 minutes and filtered under residual pressure to separate insoluble material. This insoluble material is dried and a solvent mixture consisting of chloroform and methanol (in a volume ratio of 2: 1) is added to it. The resulting mixture was shaken for 30 minutes and filtered through a paper filter to obtain a filtrate. The filtered precipitate was extracted again with the same solvent mixture and the same volume and filtered to obtain a secondary extract. This procedure is repeated once more. The three extracts obtained are combined and dried to dryness under residual pressure until a solid residue is obtained.
Этот материал растворяют в смеси хлороформа и метанола (2:1 об/об), хроматографируют на колонке Сефадекса LH-20 (колонка 15,5 см в диаметре и 90 см длиной), уравновешенной той же смесью растворителей, и элюируют той же смесью со скоростью 5 мл/мин. В процессе элюации собирают материал, выходящий в свободном объеме колонки. This material was dissolved in a mixture of chloroform and methanol (2: 1 v / v), chromatographed on a Sephadex LH-20 column (column 15.5 cm in diameter and 90 cm long), equilibrated with the same solvent mixture, and eluted with the same mixture with 5 ml / min. In the elution process, material is collected that leaves the free volume of the column.
Полученный фильтрат при микробиологическом контроле стерилен и дальнейшие процедуры с ним выполняли в стерильных условиях. Его высушивали досуха под остаточным давлением и суспендировали в стерильной воде. Суспензию лиофилизировали и получили липопротеин в виде светло-желтого с коричневым оттенком порошка. Under microbiological control, the obtained filtrate was sterile, and further procedures were performed with it under sterile conditions. It was dried to dryness under residual pressure and suspended in sterile water. The suspension was lyophilized to give the lipoprotein as a light yellow powder with a brown tint.
Всего из 128,3 кг ткани легкого было получено 8,3 г липопротеина. A total of 128.3 kg of lung tissue was obtained 8.3 g of lipoprotein.
Анализ показал, что он имеет м.м. 34.000 кДа и содержит 62,1% (в/в) фосфолипидов, 31,3 белка, 4,6% воды и 2,0% неидентифицированных компонентов. The analysis showed that it has m.m. 34,000 kDa and contains 62.1% (w / w) phospholipids, 31.3 proteins, 4.6% water and 2.0% unidentified components.
Для получения препарата сурфактанта брали 0,13 г липопротеина, полученного этим способом, и добавляли 6,58 г стерильного 1,2-дмпальмитоилглицеро-(3)-фосфохолина (ДППС), 2,19 г 1,2-диацил-sn-глицеро-(3)-фосфо-sn-глицерина (ДФГ) (с длиной жирнокислотных остатков от 14 до 24 углеродных атомов), 1,10 г пальмитиновой кислоты (ПК) и для растворения этих компонентов использовали 10,0 л смеси хлороформа и метанола (2:1, об/об) при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха при остаточном давлении и остаток ресуспендировали в водно-этанольной смеси (9: 1, об/об) при 45oС в течение 20 мин. Суспензию замораживали при -40oС и высушивали под вакуумом 75 90 мм Hg в течение 24 ч.To obtain a surfactant preparation, 0.13 g of lipoprotein obtained by this method was taken, and 6.58 g of sterile 1,2-dmpalmitoylglycero- (3) -phosphocholine (DPS), 2.19 g of 1,2-diacyl-sn-glycero were added - (3) -phospho-sn-glycerol (DGF) (with a fatty acid residue length of 14 to 24 carbon atoms), 1.10 g of palmitic acid (PC) and 10.0 L of a mixture of chloroform and methanol were used to dissolve these components ( 2: 1, v / v) at room temperature. The mixture was evaporated to dryness under residual pressure, and the residue was resuspended in a water-ethanol mixture (9: 1, v / v) at 45 ° C. for 20 minutes. The suspension was frozen at -40 o C and dried under vacuum of 75 to 90 mm Hg for 24 hours
Получено 10,33 г сурфактанта в виде белого порошка, содержащего 63,7% ДППС, 21,2% ДФГ, 10,6% ПК, 1,3% липопротеина и 3,2% воды (все величины выражены в соотношении в/в). Received 10.33 g of surfactant in the form of a white powder containing 63.7% DPS, 21.2% DPG, 10.6% PC, 1.3% lipoprotein and 3.2% water (all values are expressed in the ratio in / in )
Такой состав препарата имеет определенное сходство с природным легочным сурфактантом прежде всего по содержанию основного фосфолипида природных легочных сурфактантов ДППС. В отношении присутствующего в препарате белка следует отметить, что его всего около 0,4% (т.к. липопротеин содержит около 30% белка), тогда как в природном легочном сурфактанте только гидрофобных белков с м. м. 5 8 кДа более 1% Эти белки чрезвычайно важны для проявления функции этих препаратов. Большое значение для проявления функции сурфактанта имеют и другие имеющиеся в природном сурфактанте фосфолипиды (фосфатидилглицерины, фосфатидилсерины, дифофсфатидилглицерины, фосфатидилэтаноламины). В разных вариантах препарате по прототипу присутствует наряду с ДППС, как показано авторами, только какой-нибудь один из этих фосфолипидов. Малое содержание сурфактант-ассоциированных белков и неполный спектр фосфолипидов в этих препаратах не позволяет воспроизвести интегральную структуру сурфактанта полностью. This composition of the drug has a certain similarity with natural pulmonary surfactant primarily in the content of the main phospholipid of natural pulmonary surfactants DPS. Regarding the protein present in the preparation, it should be noted that it is only about 0.4% (since the lipoprotein contains about 30% protein), while in the natural pulmonary surfactant only hydrophobic proteins with a mass of 5-8 kDa are more than 1% These proteins are extremely important for the manifestation of the function of these drugs. Other phospholipids (phosphatidylglycerols, phosphatidylserines, diphosphatidylglycerols, phosphatidylethanolamines) that are present in the natural surfactant are of great importance for the manifestation of the surfactant's function. In different versions of the preparation according to the prototype, along with DPS, as shown by the authors, only one of these phospholipids is present. The low content of surfactant-associated proteins and the incomplete spectrum of phospholipids in these preparations do not allow reproducing the integral structure of the surfactant completely.
Природные же препараты сурфактантов, помимо указанных компонентов, содержат также все гидрофобные (м.м. 5 8 кДа, 18 кДа) сурфактант-ассоциированные белки существенные для проявления их функции и отсутствующие в прототипе. Natural preparations of surfactants, in addition to these components, also contain all hydrophobic (m. 5 8 kDa, 18 kDa) surfactant-associated proteins that are essential for the manifestation of their function and are absent in the prototype.
Функциональную оценку сурфактанта, полученного по прототипу авторы проводили на зрелых кроликах, страдающих септицемией, вызванной внутрибрюшинным введением культуры клеток патогенного штамма Е.coli, осложняющейся в дальнейшем развитием синдрома дыхательных расстройств (СДР). Испытания показали, что такой тип СДР купируются в половине случаев и без применения сурфактанта только использованием канамицина (антибиотика широкого спектра действия). Сочетанное введение канамицина и сурфактанта купирует СДР у 85% больных животных, а применение одного сурфактанта без канамицина купирует СДР только у половины животных. The functional evaluation of the surfactant obtained by the prototype was carried out on mature rabbits suffering from septicemia caused by intraperitoneal administration of a cell culture of the pathogenic E. coli strain, which is complicated by the further development of respiratory distress syndrome (SDR). Tests have shown that this type of SDR is stopped in half the cases and without the use of surfactant only using kanamycin (a broad-spectrum antibiotic). The combined administration of kanamycin and a surfactant suppresses SDR in 85% of sick animals, and the use of one surfactant without kanamycin suppresses SDR in only half of the animals.
Во всех случаях сурфактант вводили от 1 до 6 раз в дозе 50 100 мг/кг массы животного на каждое введение, а канамицин вводили от 80 до 150 мг/кг в виде 2 8 раздельных доз. Канамицин вводили в течение 24 ч до и после развития СДР. In all cases, surfactant was administered from 1 to 6 times in a dose of 50 to 100 mg / kg of animal weight per administration, and kanamycin was administered from 80 to 150 mg / kg in the form of 2-8 separate doses. Kanamycin was administered 24 hours before and after the development of SDR.
Как свидетельствует описание способа выделения липопотеина, необходимого для получения сурфактанта по прототипу, он чрезвычайно трудоемок, чрезвычайно сложен, многостадиен и дает очень малый выход искомого липопротеина. Последний составляет в конечном препарате лишь 1,3% по массе, а остальная часть представляет собой синтетические фосфолипиды. Способ по прототипу включает 25 стадий, из которых 4 центрифугирования, одно из которых в градиенте плотности, длительный последующий после градиента диализ, обработку этилацетатом, длительную гель-фильтрацию с применением дорогостоящего носителя Сефадекса LH-20 для отделения липопротеина от основной массы сурфактантных фосфолипидов и белков. As evidenced by the description of the method for isolating lipoprotein necessary to obtain a surfactant according to the prototype, it is extremely laborious, extremely complex, multi-stage and gives a very small yield of the desired lipoprotein. The latter is only 1.3% by weight in the final preparation, and the rest is synthetic phospholipids. The prototype method includes 25 stages, of which 4 centrifuges, one of which in a density gradient, long dialysis following the gradient, ethyl acetate treatment, long-term gel filtration using an expensive Sephadex LH-20 carrier to separate lipoprotein from the bulk of surfactant phospholipids and proteins .
Технический результат изобретения состоит в упрощении способа получения сурфактанта и улучшении его качества. The technical result of the invention is to simplify the method of producing surfactant and improve its quality.
Этот результат достигается тем, что в известном способе получения легочного сурфактанта путем водно-солевой экстракции его из легкого крупного рогатого скота и последующего центрифугирования экстракта (или смыва сурфактанта легкого, полученного путем бронхо-альвеолярного лаважа) центрифугирование проводят при 150 g в течение 10 мин, полученный при центрифугировании супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше +10oС, после чего суспензию центрифугируют, полученный осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.This result is achieved in that in the known method for producing pulmonary surfactant by water-salt extraction from cattle lung and subsequent centrifugation of the extract (or flushing of lung surfactant obtained by broncho-alveolar lavage), centrifugation is carried out at 150 g for 10 minutes, obtained by centrifuging the supernatant was frozen, then thawed at a temperature not higher than +10 o C, then the suspension was centrifuged, the resulting precipitate was extracted with organic solvents, e strakt treated aqueous salt solutions, after which it was removed from the organic solvents to obtain the desired product.
Целесообразно центрифугирование суспензии, полученной после замораживания и оттаивания супернатанта, проводить при 3000 15000 g в течение 20 30 мин или проточно, экстракцию полученного осадка проводить смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 2:1 (об/об) по Фолчу [3] или 1:1 по Блайю и Дайеру [4] а в качестве водно-солевых растворов использовать 0,1% раствор хлоридов натрия или калия в соотношениях экстракт:водно-солевой раствор 10:2 (об/об) при экстракции липидов по Фолчу или 10:4,5 (об/об) при экстракции по Блайю и Дайеру. It is advisable to centrifuge the suspension obtained after freezing and thawing the supernatant, to carry out at 3000–15000 g for 20–30 min or flow, to extract the precipitate obtained with mixtures of chloroform and methyl alcohol in the ratios 2: 1 (v / v) according to Folch [3] or 1 : 1 according to Blyay and Dyer [4] and as water-salt solutions use a 0.1% solution of sodium or potassium chlorides in the ratios extract: water-salt solution of 10: 2 (v / v) during the extraction of lipids according to Folch or 10: 4.5 (v / v) during extraction according to Blyay and Dyer.
Центрифугирование водно-солевого экстракта при 150 g в течение 10 мин позволяет убрать из него остатки обрывков тканей и клеток, оставив сурфактант в супернатанте. Это безусловно улучшает качество препарата, поскольку в него не попадает тканевой и клеточный материал. Centrifuging the water-salt extract at 150 g for 10 min allows you to remove the remnants of tissue and cell fragments from it, leaving the surfactant in the supernatant. This certainly improves the quality of the drug, since tissue and cellular material does not enter it.
Низкое содержание сурфактанта в получаемом супернатанте привело нас к необходимости работать с большими объемами жидкости и поставило перед нами задачу накопления и хранения ее в течение некоторого времени. В качестве способа хранения мы выбрали замораживание супернатанта, а при последующем оттаивании его мы обнаружили наличие в нем выраженного хлопьевидного осадка. Удалив его низкоскоростным центрифугированием, мы обнаружили практически полное отсутствие материала сурфактанта в полученном супернатанте. Анализ же самого осадка выявил, что он более чем на 90% представляет собой легочный сурфактант. The low surfactant content in the resulting supernatant led us to the need to work with large volumes of liquid and set us the task of accumulating and storing it for some time. As a storage method, we chose freezing of the supernatant, and upon subsequent thawing of it we found the presence of a pronounced flocculent precipitate in it. By removing it by low-speed centrifugation, we found an almost complete absence of surfactant material in the obtained supernatant. Analysis of the sediment itself revealed that it is more than 90% pulmonary surfactant.
Этот неожиданный для нас факт позволил нам избежать многочисленных трудоемких и длительных процедур выделения липопротеина, включающего многократное дифференциальное и плотностное центрифугирование, диализ, трудоемкую гель-фильтрацию на гидрофобном Сефадексе LH-20, ведущих к удалению основной массы фосфолипидов и белков легочного сурфактанта. This fact, which was unexpected for us, allowed us to avoid numerous laborious and lengthy lipoprotein isolation procedures, including multiple differential and density centrifugation, dialysis, labor-intensive gel filtration on hydrophobic Sephadex LH-20, leading to the removal of the bulk of phospholipids and pulmonary surfactant proteins.
Устранение этих процедур позволило значительно упростить способ получения конечного продукта. Такое упрощение способа сделало его высокотехнологичным и пригодным для использования в промышленном производстве. The elimination of these procedures has greatly simplified the method of obtaining the final product. This simplification of the method has made it high-tech and suitable for use in industrial production.
Кроме того, обнаруженные нами условия агрегации сурфактанта, а именно замораживание и последующее оттаивание супернатанта при температуре не выше +10oС, обеспечивают в таких мягких условиях выделения сохранность в конечном продукте полного набора фосфолипидов и нейтральных липидов сурфактанта, сохраняют значительное количество (около 2% по отношению к фосфолипидам) гидрофобных сурфактант-ассоциированных белков в их естественном липидном окружении. Это безусловно значительно повышает качество конечного продукта, выражающееся в значительно более высоком терапевтическом эффекте получаемого сурфактанта, и позволяет избежать добавления в конечные препараты дорогих синтетических фосфолипидов, составляющих основу полусинтетических известных сурфактантов.In addition, the conditions of surfactant aggregation that we found, namely, freezing and subsequent thawing of the supernatant at a temperature not exceeding + 10 o С, provide under such mild isolation conditions that a complete set of phospholipids and neutral surfactant lipids are preserved in the final product, retain a significant amount (about 2% in relation to phospholipids) of hydrophobic surfactant-associated proteins in their natural lipid environment. This certainly significantly improves the quality of the final product, which is expressed in a significantly higher therapeutic effect of the obtained surfactant, and avoids the addition of expensive synthetic phospholipids to the final preparations, which form the basis of semisynthetic known surfactants.
Экстрагирование органическими растворителями полученного центрифугированием осадка и последующая обработка экстракта водно-солевыми растворами создают условия перехода оставшихся в осадке балластных белков и ДНК в водную фазу, что освобождает экстракт с целевым продуктом от примесей и в еще большей степени повышает его качество. Причем предлагаемые нами смеси органических растворителей с экстракцей по Фолчу (хлороформ:метанол 2:1) (об/об) или по Блайю и Дайеру (хлороформ-метанол 1:1) (об/об), обеспечивая высокое качество искомого продукта, наиболее доступны, что является решающим для использования способа в промышленном производстве. The extraction of the precipitate obtained by centrifugation with organic solvents and the subsequent treatment of the extract with water-salt solutions create the conditions for the transfer of the remaining ballast proteins and DNA into the aqueous phase, which frees the extract with the target product from impurities and further improves its quality. Moreover, the mixtures of organic solvents we offer with extraction according to Folch (chloroform: methanol 2: 1) (V / V) or according to Blyay and Dyer (chloroform-methanol 1: 1) (V / V), ensuring the high quality of the desired product, are most available , which is crucial for using the method in industrial production.
Использование водно-солевых растворов в виде 0,1% растворов хлорида натрия или калия в указанных соотношениях, как нами показано, позволяет исключить потери фосфолипидов сурфактанта и удалять нелипидные примеси из искомого продукта, что обеспечивает его высокое качество. The use of water-salt solutions in the form of 0.1% sodium or potassium chloride solutions in the indicated proportions, as we have shown, allows us to exclude the loss of surfactant phospholipids and remove non-lipid impurities from the desired product, which ensures its high quality.
Пример 1. 10 кг легкого быка отмывают холодной водой от крови, освобождают от крупных бронхов и сосудов, разрезают на куски около 0,5 кг и пропускают через ножевую мясорубку, добавляют к измельченным легким 50 л холодного +4oC физиологического раствора (ФР, 0,9% раствора хлорида натрия) и перемешивают при +4oС в течение 15 мин. Гомогенат фильтруют через марлю, осадок выбрасывают, а фильтрат центрифугируют при 150 g в течение 10 мин для удаления остатков ткани и клеток. Полученный супернатат (51 л) замораживают при -20oС в течение 60 мин, после чего оттаивают при температуре +4oС. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 g на проточной центрифуге в течение 30 мин при +4oС.Example 1. 10 kg of a lung of a bull is washed with cold water from blood, freed from large bronchi and blood vessels, cut into pieces about 0.5 kg and passed through a meat grinder, 50 l of cold +4 o C saline solution are added to the crushed lungs (FR, 0.9% sodium chloride solution) and stirred at +4 o C for 15 minutes The homogenate is filtered through cheesecloth, the pellet is discarded, and the filtrate is centrifuged at 150 g for 10 min to remove tissue and cell debris. The resulting supernatate (51 L) was frozen at -20 o C for 60 minutes, and then thawed at a temperature of + 4 o C. The resulting suspension was centrifuged at 3000 g in a flow centrifuge for 30 minutes at + 4 o C.
Полученный осадок (12 г) экстрагируют по Блайю и Дайеру. Для этого его ресуспендируют в 240 мл дистиллированной воды, добавляют 900 мл смеси из 300 мл хлороформа и 600 мл метанола и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. После этого добавляют 300 мл хлороформа и 300 мл 0,18% раствора хлорида калия (т.е. соблюдаются соотношения хлороформа и метанола 1:1, экстракция по Блайю и Дайеру, и соотношение объема экстракта и 0,1% водно-солевого раствора 10:4,5). Суспензию перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре в атмосфере аргона и центрифугируют при 600 g в течение 20 мин. Из образовавшейся двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю отбирают и удаляют из нее органические растворители при остаточном давлении на ротационном испарителе RVO-64 при температуре 37oС. Сухой остаток ресуспендируют в 200 мл дистиллированной воды и лиофилизируют.The resulting precipitate (12 g) was extracted according to Blyay and Dyer. To do this, it is resuspended in 240 ml of distilled water, 900 ml of a mixture of 300 ml of chloroform and 600 ml of methanol are added and stirred for 1 h at room temperature in argon atmosphere. After this, 300 ml of chloroform and 300 ml of a 0.18% solution of potassium chloride are added (i.e., the ratios of chloroform and methanol are 1: 1, extraction according to Blyay and Dyer, and the ratio of the volume of extract to 0.1% water-salt solution 10 : 4,5). The suspension is stirred for 30 minutes at room temperature in an argon atmosphere and centrifuged at 600 g for 20 minutes. From the resulting two-phase system, the upper phase is discarded, and the lower phase is removed and organic solvents are removed from it at a residual pressure on a RVO-64 rotary evaporator at a temperature of 37 ° C. The dry residue is resuspended in 200 ml of distilled water and lyophilized.
Получено 10 г белого с кремоватым оттенком цвета аморфного порошка. Received 10 g of a white with a creamy tint amorphous powder.
Результаты анализа,г:
фосфолипиды 8,9
нейтральные липиды 0,9
белок 0,2
Анализ продукта на содержание липидного фосфора проводился по Васьковскому [4] содержание белка определяли по методу Лоури после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Анализ спектра белков с помощью электрофореза в ПАГ в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия [5] выявил группы белков с м.м. 18 кДа и 5 8 кДа (рис.1). Эти гидрофобные белки специфичны для природного легочного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК по Бартону [6] отрицательный.The results of the analysis, g:
phospholipids 8.9
neutral lipids 0.9
protein 0.2
The analysis of the product for the content of lipid phosphorus was carried out according to Vaskovsky [4] the protein content was determined by the Lowry method after delipidization of the material by chromatography in a thin layer of silica gel. Analysis of the protein spectrum by electrophoresis in PAG in the presence of urea and sodium dodecyl sulfate [5] revealed groups of proteins with m.m. 18 kDa and 5 8 kDa (Fig. 1). These hydrophobic proteins are specific for natural pulmonary surfactant. No other proteins were found. The analysis for DNA content according to Barton [6] is negative.
Подлинность препарата подтверждена
положительным пенным тестом;
исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ-метанол-7N NH3 (65:25:5) и хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота вода (30:40:10:10:5) (рис.2). На хроматограмме видно, что в препарате все основные классы фосфолипидов, свойственные природному сурфактанту. В то время как, в прототипе, как описывают авторы, присутствуют только фосфатидилхолин и один из других фосфолипидов сурфактанта в зависимости от варианта препарата.The authenticity of the drug is confirmed.
positive foam test;
by studying the phospholipid composition using two-dimensional thin-layer chromatography on silica gel in the systems: chloroform-methanol-7N NH 3 (65: 25: 5) and chloroform-acetone-methanol-acetic acid water (30: 40: 10: 10: 5) (Fig. .2). The chromatogram shows that in the preparation all the main classes of phospholipids characteristic of the natural surfactant are present. While, in the prototype, as the authors describe, only phosphatidylcholine and one of the other surfactant phospholipids are present, depending on the variant of the drug.
исследованием терапевтической активности. research of therapeutic activity.
После однократного интратрахеального введения собакам с моделью сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств полученного препарата в дозе 50 100 мг/кг массы уже через 15 мин обнаружено увеличение парциального напряжения кислорода в артериальной крови и насыщения гемоглобина кислородом, а также снижение парциального напряжения углекислого газа в артериальной крови. Через сутки после введения препарата у собак не было одышки, были нормальные параметры газов крови и отсутствовали патологические изменения на рентгенограммах грудной клетки (нормальная воздушность легких без ателектазов), а их поведение и состояние не отличалось от здоровых. Собачки с той же моделью синдрома дыхательных расстройств, не получавшие препарата, характеризовались одышкой при нагрузке в течение 3 суток, наличием сливных ателектазов в легких на рентгенограммах грудной клетки и восстановлением всех параметров только к 7 8 суткам после развития синдрома дыхательных расстройств. Ни в одном случае при лечении 10 собак не было гибели животных. After a single intratracheal administration to dogs with a model of a surfactant-deficient respiratory syndrome, the resulting drug at a dose of 50 to 100 mg / kg of body weight showed an increase in the partial pressure of oxygen in arterial blood and saturation of hemoglobin with oxygen, as well as a decrease in the partial pressure of carbon dioxide in arterial blood after 15 minutes . A day after the administration of the drug, the dogs did not have shortness of breath, there were normal parameters of blood gases and there were no pathological changes in chest radiographs (normal airiness of the lungs without atelectasis), and their behavior and condition did not differ from healthy ones. Dogs with the same model of respiratory distress syndrome who did not receive the drug were characterized by shortness of breath with a load of 3 days, the presence of confluent atelectasis in the lungs on chest radiographs, and restoration of all parameters only to 7 8 days after the development of respiratory distress syndrome. In no case, in the treatment of 10 dogs there was no death of animals.
Как свидетельствуют выше приведенные характеристики полученного препарата сурфактанта, он значительно лучшего качества в сравнении с прототипом, поскольку соответствует составу природного легочного сурфактанта и обладает более высоким терапевтическим эффектом. As indicated by the above characteristics of the obtained surfactant preparation, it is of significantly better quality in comparison with the prototype, since it corresponds to the composition of natural pulmonary surfactant and has a higher therapeutic effect.
Пример 2. 10 легких (20 кг) двухгодовалых бычков выделяли из грудной клетки, избегая их повреждения, отмывали от крови и заполняли через трахею 10 л физиологического раствора каждое легкое. Трахею закрывали пробкой и легкие медленно встряхивали на станине в одной плоскости в течение 15 мин. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа сливали и отжимали легкие снаружи механически для более полного выдавливания жидкости из легких. Всего получено 82 л суспензии. Ее центрифугировали при 150 g в течение 10 мин и осадок клеток выбрасывали. Полученный супернатат (81 л) замораживали при -20oС в течение 60 мин, после чего оттаивали при +10oС. Полученную суспензию центрифугировали при 15000 g на проточной центрифуге ОТР 102К-01 в течение 45 мин при +4oC.Example 2. 10 lungs (20 kg) of two-year-old calves were isolated from the chest, avoiding damage, washed from the blood and 10 l of physiological saline was filled through the trachea each lung. The trachea was closed with a stopper and the lungs were slowly shaken on the bed in the same plane for 15 minutes. The bronchoalveolar lavage fluid was drained and squeezed out of the lungs from the outside mechanically to more fully squeeze out the fluid from the lungs. A total of 82 l of suspension was obtained. It was centrifuged at 150 g for 10 min and the cell pellet was discarded. The resulting supernatate (81 L) was frozen at -20 ° C for 60 minutes, and then thawed at + 10 ° C. The resulting suspension was centrifuged at 15,000 g in an OTP 102K-01 flow centrifuge for 45 minutes at + 4 ° C.
Полученный осадок (18 г) экстрагировали по Фолчу. Для этого его ресуспендировали в 1,0 л дистиллированной воды, добавляли 20 л смеси из 13,3 л хлороформа и 6,7 л метанола (соотношение хлороформа и метанола 2:1), суспензию перемешивали в течение 1 ч в атмосфере аргона и добавляли 3,0 л стерильного 0,13% водного раствора хлорида натрия (соотношение объема экстракта и водного раствора хлорида натрия 10:2). Суспензию перемешивали в течение 30 мин в атмосфере аргона и центрифугировали при 600 g в течение 30 мин. Из полученной двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывали, а нижнюю забирали и фильтровали через капроновый фильтр с величиной пор 0,2 мкм (стерилизующее фильтрование). Полученный фильтрат упаривали досуха на ротационном испарителе под остаточным давлением при +35oС. Остаток ресуспендировали в 800 мл стерильной дистиллированной воды, эмульсию разливали в стерильные флаконы по 5 мл и лиофилизировали. Флаконы укупоривали резиновыми пробками в атмосфере аргона и завальцовывали алюминиевыми колпачками.The resulting precipitate (18 g) was extracted according to Folch. To do this, it was resuspended in 1.0 L of distilled water, 20 L of a mixture of 13.3 L of chloroform and 6.7 L of methanol was added (the ratio of chloroform and methanol was 2: 1), the suspension was stirred for 1 h in an argon atmosphere, and 3 , 0 l of a sterile 0.13% aqueous solution of sodium chloride (the ratio of the volume of the extract and the aqueous solution of sodium chloride 10: 2). The suspension was stirred for 30 minutes under argon and centrifuged at 600 g for 30 minutes. From the obtained two-phase system, the upper phase was discarded, and the lower phase was taken and filtered through a nylon filter with a pore size of 0.2 μm (sterilizing filtration). The resulting filtrate was evaporated to dryness on a rotary evaporator under residual pressure at +35 o C. The residue was resuspended in 800 ml of sterile distilled water, the emulsion was poured into sterile 5 ml vials and lyophilized. The bottles were corked with rubber stoppers in an argon atmosphere and rolled up with aluminum caps.
Получено 160 флаконов по 100 мг белого с кремоватым оттенком аморфного порошка в каждом (всего 16 г сурфактанта)
Результаты анализа (одного флакона),мг:
фосфолипиды 89,0
нейтральные липиды 9,0
белок 2,0
Подлинность и специфические свойства на модели сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств подтверждены как и в примере 1.Received 160 bottles of 100 mg of a white with a creamy tint of amorphous powder in each (a total of 16 g of surfactant)
The results of the analysis (one bottle), mg:
phospholipids 89.0
neutral lipids 9.0
protein 2.0
The authenticity and specific properties of the model surfactant-deficient syndrome of respiratory disorders are confirmed as in example 1.
Предлагаемый способ получения легочного сурфактанта по сравнению с известным имеет ряд существенных преимуществ. The proposed method for producing pulmonary surfactant in comparison with the known has several significant advantages.
1. Способ значительно проще прототипа, поскольку включает всего 5 достаточно простых операций против 25 трудоемких и длительных процедур в прототипе. 1. The method is much simpler than the prototype, since it includes only 5 fairly simple operations against 25 laborious and lengthy procedures in the prototype.
2. Способ обеспечивает получение высокоочищенного препарата, содержащего все присущие сурфактанту фосфолипиды и существенное количество (около 2%) сурфактант-ассоциированных гидрофобных белков в их собственном липидном окружении, в то время как в прототипе присутствуют только два основных фосфолипида и около 0,4% белка из-за многостадийной обработкой исходного сырья, которая приводит к получению липопротеина, что вынуждает для получения препаратов сурфактанта добавлять к нему синтетические фосфолипиды. 2. The method provides a highly purified preparation containing all inherent surfactant phospholipids and a significant amount (about 2%) of surfactant-associated hydrophobic proteins in their own lipid environment, while in the prototype there are only two main phospholipids and about 0.4% protein due to the multi-stage processing of the feedstock, which leads to the production of lipoprotein, which forces to add synthetic phospholipids to it to obtain surfactant preparations.
3. Небольшое количество стадий получения сурфактанта делает заявляемый способ высокотехнологичным и применимым в промышленном производстве. 3. A small number of stages for producing surfactant makes the inventive method high-tech and applicable in industrial production.
Способ разработан в лаборатории биотехнологии препаратов для лучевой диагностики и терапии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института Минздравмедпрома РФ совместно с ТОО "Контраст, ЛТД". The method was developed in the biotechnology laboratory of drugs for radiation diagnostics and therapy at the Central Research X-ray and Radiological Institute of the Ministry of Health of the Russian Federation together with Kontrast, LTD LLP.
Препарат в настоящее время проходит доклинические испытания и планируется представить материалы по этому препарату в Фармкомитет Минздравмедпрома в 1996 году. The drug is currently undergoing preclinical trials and it is planned to submit materials on this drug to the Pharmaceutical Committee of the Ministry of Healthcare in 1996.
Предлагаемый способ положен в основу создаваемого в настоящее время промышленного производства природного легочного сурфактанта в ЦНИРРИ Минздравмедпрома. The proposed method is the basis of the currently created industrial production of natural pulmonary surfactant in Central Research Institute of Health of the Ministry of Health.
Claims (4)
15000 g в течение 20-30 мин или проточно.2. The method according to p. 1, characterized in that the centrifugation of the suspension obtained after freezing and thawing of the supernatant is carried out at 3000
15000 g for 20-30 minutes or flow.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95103260A RU2066198C1 (en) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Method of pulmonary surfactant preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95103260A RU2066198C1 (en) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Method of pulmonary surfactant preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2066198C1 true RU2066198C1 (en) | 1996-09-10 |
| RU95103260A RU95103260A (en) | 1996-11-27 |
Family
ID=20165417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95103260A RU2066198C1 (en) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Method of pulmonary surfactant preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2066198C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198670C1 (en) * | 2002-02-19 | 2003-02-20 | ООО "Биосурф" | Method for obtaining pulmonary surfactant in cattle |
-
1995
- 1995-03-17 RU RU95103260A patent/RU2066198C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Pediatrics, 1983, v.71, p.473-481. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198670C1 (en) * | 2002-02-19 | 2003-02-20 | ООО "Биосурф" | Method for obtaining pulmonary surfactant in cattle |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU95103260A (en) | 1996-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5024995A (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharamceutical compositions | |
| HK1007103B (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharmaceutical compositions | |
| US4338301A (en) | Lung tissue extract useful for treating hyaline-membrane disease and method for producing the extract | |
| IE840553L (en) | Surfactant and pharmaceutical composition | |
| US4397839A (en) | Surface active material and process for preparing same | |
| EP0145005B1 (en) | Pulmonary surfactant, process for its preparation and its pharmaceutical use | |
| JP3012259B2 (en) | Method for separating glycolipids from lipid mixtures | |
| RU2066198C1 (en) | Method of pulmonary surfactant preparing | |
| RU2152219C1 (en) | Peptides showing immunostimulating activity, method of their synthesis, drug based on thereof, splenopid and its using | |
| RU2066197C1 (en) | Method of pulmonary surfactant preparing | |
| RU2033796C1 (en) | Peptide-containing fraction from mammalian spleen showing immunostimulating activity, and a method of its preparing | |
| SU624562A3 (en) | Method of producing substance exhibiting hormonal action | |
| CN117683149A (en) | Polysaccharide extracted from Pu' er tea and application thereof in relieving side effects of chemotherapy | |
| RU2198670C1 (en) | Method for obtaining pulmonary surfactant in cattle | |
| US4226884A (en) | L-gamma-glutamyl-taurine as extracted from parathyroid gland and method of treatment using same | |
| JPH0378372B2 (en) | ||
| JP2024524512A (en) | Method for preparing pulmonary surfactant | |
| KR19980016013A (en) | Pharmaceutical composition for inhibiting red blood cell hemolysis and method for producing the same | |
| CA1329123C (en) | Inhibitor of angiogenesis | |
| US20200353377A1 (en) | Extraction of animal-derived pulmonary surfactants | |
| KR960013436B1 (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharmaceutical compositions | |
| EP0673653A1 (en) | Biologically active agent having immunomodulating properties, method for its obtaining and pharmaceutical preparation based on it | |
| CN120771102A (en) | A bletilla striata polysaccharide hydrogel and its preparation method and application, a bletilla striata polysaccharide hydrogel loaded with drugs and its preparation method | |
| JPS6361000A (en) | Lipoprotein and production thereof | |
| JPH07238091A (en) | Glycoprotein and appetite inhibitor comprising the same as active ingredient |