RS99304A - Postupci za lečenje hepatitisa - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje hepatitisa kod pacijenta, koji obuhvata primenu na pacijentu farmaceutskog preparata koji sadrži ugljen monoksid.

Description

POSTUPCI ZALEČENJEHEPATITISA

Referenca odnosne prijave

Ova prijava traži prioritet od US privremene prijave br. 60/381,527, podnete 17. maja 2002. godine, čiji je opis ovde u potpunosti uključen prema referenci.

Izjava o istraživanju sponzorisanom of strane federalne vlade

Ovaj pronalazak je ostvaren uz podršku Vlade SAD, prema odobrenjima nacionalnih instituta za zdravlje br. R01-GM-44100, HL58688, HL55330 i AI42365. Vlada polaže izvesna prava na predmetni pronalazak.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na lečenje hepatitisa.

Stanje tehnike

Gasoviti ugljen monoksid je otrovan u visokim koncentracijama. Međutim, sada je prepoznat kao važan signalni molekul (Verma et al., Science 259 : 381 - 384, 1993). Takođe je sugerisano da ugljen monoksid deluje kao neurotransmiterski molekul u mozgu (Id.) i kao neuro - endokrini modulator u hipotalamusu (Pozzoli et al., Endocrinologv 735 : 2314 - 2317, 1994). Kao i azot monoksid (NO), ugljen monoksid je relaksant glatke muskulature (Utz et al., Biochem. Pharmacol. 47 : 195 - 201. i 991; Christodoulides et al., Circulation 97 : 2306 - 9, 1995) i inhibira agregaciju trombocita (Mansouri et al., Thromb Haemost. 48 : 286 - 8, 1982). Pokazano je da inhalacija ugljen monoksida (CO) u niskim koncentracijama dovodi do ispoljavanja anti-inflamatornih dejstava u nekim modelima.

Hepatitis je oboljenje koje se karakteriše inflamacijom jetre. Inflamacija može biti okarakterisana kao difuzna ili trakasta nekroza zahvaćenih acinusa. Uzročni faktori hepatitisa obuhvataju. na primer, viruse, npr. specifične viruse hepatitisa, npr. viruse hepatitisa A. B, C, D, E i G; alkohol, kao i različite lekove (npr. izoniazid, metildopa, acetaminofen, amiodaron i nitrofurantoin) (videti The Merck Manual of Diagnosis and Therapv, 17. izdanje, Odeljak 4. Poglavlje 42).

Opispronalaska

Predmetni pronalazak se zasniva, delimično, na otkriću da primena CO može da zaštiti od razvoja hepatitisa.

Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja, sprečavanja nastanka ili smanjenja rizika od hepatitisa kod pacijenta. Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata identifikaciju pacijenta kod koga je dijagnostikovan hepatitis ili rizik za razvoj hepatitisa i primenu kod pacijenta farmaceutskog preparata koji sadrži količinu ugljen monoksida koja je efikasna u lečenju hepatitisa kod pacijenta.

Farmaceutski preparat može biti primenjen kod pacijenta na bilo koji način koji je poznat u struci za primenu gasova i/ili tečnosti kod pacijenta, npr. putem inhalacije, insuflacije, infuzije, injekcije i/ili ingestije. U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta inhalacijom. U drugom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta oralno. U još jednom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje direktno u abdominalnu duplju pacijenta. U još jednom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje putem uređaja za ekstrakorporalnu membransku razmenu gasova ili putem veštačkih pluća. U još jednom rešenju, pacijent je alkoholičar.

Pacijent može biti životinja, čovek ili organizam koji nije ljudski. Na primer, pacijent može biti sisar, npr. čovek, neki drugi primat, svinja, glodar, kao što su miševi i pacovi. zec, zamorac, hrčak, krava, konj, mačka, pas, ovca ili koza. Hepatitis može biti posiedica. ili može biti smatrano da pacijent poseduje rizik od hepatitisa zbog nekon od brojnih činilaca, npr. infekcija, npr. virusnih infekcija, npr, infekcija izazvanih virusom hepatitisa A, B, C, D, E i/ili G; upotrebe alkohola (npr. kod alkoholizma); upotrebe leka (npr. jednog ili više lekova koji su ovde opisani, npr. acetaminofena, anestetika, antituberkuiotika, antifungalnog sredstva, antidijabetika, neuroleptika, kao i lekova koji se koriste u lečenju HIV infekcije i AIDS); autoimunog stanja (npr. autoimunog hepatitisa); i/ili nekog hirurškog postupka. Farmaceutski preparat može biti formuiisan u bilo kom obliku, npr. gasovitom ili tečnom obliku.

U drugom rešenju, postupak prema predmetnom pronalasku dalje obuhvata primenu kod pacijenta barem jednog od sledećih tretmana: indukciju HO-1 ili feritina kod pacijenta; ekspresiju rekombinantne HO-1 ili feritina kod pacijenta; kao i primenu kod pacijenta farmaceutskog preparata koji sadrži HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin ili apoferitin, gvožđe, desferoksamin ili gvožđe dekstran. Takođe, predmetnim pronalaskom je obuhvaćena primena CO i nekog od gore nevedenih sredstava u toku dobijanja medikamenta za lečenje ili sprečavanje nastanka hepatitisa.

U drugom rešenju, hepatitis (ili rizik od nastanka hepatitisa) nije izazvan hirurškom intervencijom (npr. abdominalnom ili transplantacionom hirurškom intervencijom), bakterijskim endotoksinom, septičkim šokom i/ili sistemskom infiamacijom.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata postupak lečenja ili sprečavanja nastanka hepatitisa kod pacijenta koji obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje od ili koji poseduje rizik za razvoj hepatitisa (npr. pacijenta kod koga je dijagnostikovan hepatitis ili rizik za razvoj hepatitisa); sud koji sadrži gas pod pritiskom u kome se nalazi ugljen monoksid; otpuštanje gasa pod pritiskom iz suda, kako bi nastala atmosfera u kojoj se nalazi ugljen monoksid; kao i izlaganje pacijenta toj atmosferi, pri čemu je količina ugljen monoksida iz atmosfere dovoljna za lečenje hepatitisa kod pacijenta.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata postupak izvođenja abdominalne hirurške intervencije, npr. transplantacije jetre kod pacijenta, koji obuhvata identifikaciju pacijenta kome je potrebna abdominalna hirurška intervencija, pri čemu je hepatitis jedan od rizika intervencije; izvođenje abdominalne hirurške intervencije kod pacijenta, pri čemu pacijent pre. tokom ili nakon intervencije inhaiira količinu ugljen monoksida koja je dovoljna da umanji rizik od hepatitisa kod pacijenta. Takođe, predmetni pronalazak obuhvata upotrebu CO u dobijanju medikamenta, npr. gasovitog ili tečnog medikamenta, koji se koristi za lečenje ili sprečavanje nastanka hepatitisa.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata lečenje hepatitisa kod pacijenta koji boluje od ili koji poseduje rizik za razvoj hepatitisa koji nije izazvan hirurškom intervencijom i/ili endotoksinom, npr. hepatitisa koji je izazvan bilo kojim od činilaca koji su ovde opisani, a koji se razlikuju od hirurške intervencije i/ili endotoksina. Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje od hepatitisa ili koji poseduje rizik za razvoj hepatitisa koji nije izazvan hirurškom intervencijom i/ili endotoksinom, kao i primenu kod pacijenta farmaceutskog preparata koji sadrži količinu ugljen monoksida koja je efikasna u lečenju hepatitisa kod pacijenta.

Takođe, predmetnim pronalaskom je obuhvaćena primena kod pacijenta leka koji izaziva hepatitis (tj. hepatotoksičnog leka, npr. izonijazida, metildope, acetaminofena, amiodarona ili nitrofurantoina). Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata primenu takovog leka kod pacijenta, pri čemu se pre, tokom i/ili nakon njegove primene primenjuje kod pacijenta farmaceutski preparat koji sadrži ugljen monoksid u količini koja je efikasna za lečenje hepatitisa kod pacijenta.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje su koji sadrži komprimovani CO u gasovitom stanju za medicinsku upotrebu. Sud može da nosi oznaku koja ukazuje da se gas može koristiti za lečenje hepatitisa kod pacijenta. Alternativno iii kao dodatak, sud može da nosi oznaku koja ukazuje da se gas može primeniti kod pacijenta zajedno uz primenu leka koji indukuje hepatitis (tj. hepatotoksičnog leka), npr. acetaminofena. CO gas može da se naiazi u smeši sa gasovitim aztom, azot oksidom i azotom, ili gasom koji sadrži kiseonik. CO gas može-biti prisutan u smeši u koncentraciji od najmanje 0,025%, npr. najmanje oko 0.05%, 0.10%, 0,50%. 1,0%. 2,0%, 10%, 50% ili 90%.

Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje korišćenje CO u toku proizvodnje medikamenta za lečenje ili sprečavanje nastanka hepatitisa. Medikament može da se koristi tokom postupka za lečenje hepatitisa kod pacijenta koji pati iii koji poseduje rizik od razvoja hepatitisa, shodno postupcima koji su ovde opisani. Medikament može da se nalazi u bilo kom ovde opisanom obliku, npr. u obliku tečnog ili gasovitog CO preparata.

Osim ako nije drugačije defimsano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste poseduju isto značenje koje je uobičajeno među stručnjacima kojima je ovaj pronalazak namenjen. Iako su odgovarajući postupci i materijali opisani u tekstu koji sledi, mogu se koristiti postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska. Sve publikacije, patentne prijave, patenti i druge reference koje su ovde spomenute, u potpunosti su inkorporirane po referenci. U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, ima prednost. Materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativni i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Detalji jednog ili više rešenja predmetnog pronalaska su izneti u opisu koji sledi. Druge osobine, ciljevi i prednosti predmetnog pronalaska proizilaze iz opisa i patentnih zahteva.

Kratak opis crteža

Slika 1 je histogram koji pokazuje da indukcija HO-1 štiti hepatocite miša od ćelijske smrti indukovane sa TNF-a/D-gal. CoPP = kobalt protoporfitin; ALT = serumska alanin aminotransferaza; TNF = činilac nekroze tumora alfa. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti±SD vrednosti kod 6-8 miševa po grupi (<*>p<0,005).

Slika 2 je histogram koji pokazuje da egzogeni CO štiti hepatocite od ćelijske smrti indukovane TNF-a na način koji je nezavisan od cGMP/p38 puta i na način koji je zavisan od NF-kB aktivacije. CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = činilac nektoze tumora alfa; BAY = BAY 11-7082 (inhibira NF-kB aktivaciju); IkB = hcBa (sprečava NF-kB aktivaciju); ODQ = lH-[l,2,4]oksadiazolo[4.j-l]hinoksalin-l-on (selektivni inhibitor guanilil ciklaze); Lac-Z = pIPEP-Lac-Z (adenovirusna kontrola). Rezultati su prikazani kao srednjevrednosti ±SD vrednosti triplikata polja iz četiri nezavisna eksperimenta (<*>p<0,01).

Slika 3 je histogram koji pokazuje da egzogeni CO štiti humane hepatocite od ćelijske smrti indukovane sa TNF-a/Aktinomicinom D (ActD). CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/ActD. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD vrednosti triplikata polja iz tri nezavisna eksperimenta (<*>p<0.05).

Slika 4 je histogram koji pokazuje da egzogeni CO izaziva povećanje aktivacije NF-icB aktivacije u hepatocitima. CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; BAY = BAY 11-7082; SC = smeša citokina (TNF-a (500 U/ml), IL-lp (100 U/ml) i IFN-8 (100 U/ml)). Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti±SD triplikata polja iz tri nezavisna eksperimenta (<*>p<0,001 u odnosu na vazduh).

Slika 5 je slika poiiakrilamidnog gela koja pokazuje da egzogeni CO indukuje povećanje NF-kB nuklearne translokacije i vezivanje DNK, što je mereno testom pomaka elektroforetske pokretljivosti (EMSA - Electrophoretic Mobilitv Shift Assav). FP = slobodna proba (bez nukearnih proteina, pa zato i bez vezivanja DNK); TOTAL = NF-kB trake bez superpomaka antitelima.

Slike 6A-6C su tbtomikrografije primarnih hepatocita obojenih imunološkim bojenjem u cilju otkrivanja lokalizacije p65 u jedru, čime se pokazuje da egzogeni CO izazviva povećanje NF-kB aktivacije u hepatocitima. Slika 6A: hepatociti izloženi vazduhu. Slika 6B: hepatociti izloženi smeši citokina (TNF-a (500 U/mi), iL-lp (100 U/ml) i IFN-5 (100 U/ml)). Slika 6C: hepatociti izloženi CO. Slike predstavljaju prikaz 6 različitih polja. Stubovi označavaju 10 um.

Slika 7 je histogram koji pokazuje da zaštita hepatocita izazvana egzogenim CO obuhvata ekspresiju iNOS koja je zavisna od NF-kB. CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; BAY = BAY 11-7082; SC = smeša citokina. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD triplikata polja iz četiri nezavisna eksperimenta (<*>p<0.001 u odnosu ćelije tretirane na vazduhom i vazduhom/BAY).

Slika S je slika Western blot analize koja pokazuje da je ekspresija iNOS u hepatocitima značajno povećana nakon izlaganja TNF-a u prisustvu CO u poređenju sa izlaganjem samom TNF-a. iNOS = inducibilna sintaza azot monoksida; CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF-a = TNF-a/ActD; (3-aktin = kontrolni protein. Imunoblot predstavlja prikaz tri nezavisna eksperimenta.

Slika 9 je histogram koji pokazuje da hepatociti miševa kod kojih je iNOS aktivnost deficijentna( inos' 1')nisu zaštićeni od strane CO od ćelijske smrti indukovane sa TNF-a.CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/'ActD; iNOS"<1>" - iNOS onesposobljenih miševa; L-NIO = L-N5-(l-iminoetil)ornitin-2HCl. Rezuitati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD triplikata polja iz četiri nezavisna eksperimenta (<*>p<0.01 u odnosu na ćelije koje nisu tretirane sa TNF/ActD i koje su tretirane sa CO/TNF/ActD).

Slika 10 je histogram koji pokazuje da primena egzogenog CO sprečava ozledu jetre kod miševa koja je indukovana sa TNF/D-Gal. ALT = serumska alanin aminotransferaza; CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh. Rezuitati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD podataka od 18 - 20 miševa (<*>p<0,001 u donosu na tretman vazduhom).

Slike HA - 1 IH su fotomikrografije uzoraka jetre koje pokazuju da primena egzogenog CO sprečava ozledu jetre kod miševa koja je indukovana sa TNF-a/D-Gal. Slika 11A i 11B: uzorci jetre miševa koji su izloženi sobnom vazduhu i CO, respektivno, i koji su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E). Slike 11C i 11D: uzorci jetre miševa tretiranih sa TNF-a/D-Gal koji su izloženi sobnom vazduhu i CO, respektivno. i koji su obojeni sa H&E. Slike 11E i 11F: uzorci jetre miševa tretiranih sa TNF-a/D-Gal koji su izloženi sobnom vazduhu i CO, respektivno, i koji su obojeni tako da se detektuje aktivirana kapsaza-3. Slike 11G i 1 IH: uzorci jetre miševa tretiranih sa TNF-a/D-Gal koji su izloženi sobnom vazduhu i CO, respektivno, i koji su obojeni korišćenjem tehnike terminalnog dUTP obeležavanja krajnjeg useka koje je posredovano deoksinukleotidil transferazom (TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labeling). Slike predstavljaju izabrane preseke 15-20 preseka po jetri iz 3 - 4 individualna miša po grupi. Stubo vi označavaju 20 um.

Slika 12 je slika Western blot analize koja pokazuje da jetre miševa koji su izloženi dejstvu TNF-a/D-Gal i koji su tretirani inhalacijom CO poseduju povećane nivoe iNOS. Divlji tip = miševi divljeg tipa: iNOS"<7>" = iNOS deficijentni miševi; CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/D-Gal; (3-aktin = kontrolni protein.

Slike 13A - 13D su fotomikrografije uzoraka jetre koje pokazuju da jetre miševa koji su izloženi TNF-a/D-Gal i koji su tretirani inhalacijom CO poseduju povišene nivoe iNOS. Slika 13 A: uzorak jetre miša koji je iziagan sobnom vazduhu. Slika 13B: uzorak jetre miša koji je izlagan CO. Slika 13C: uzorak jetre miša koji je izlagan TNF-a/D-Gal i sobnom vazduhu. Slika 13D: uzorak jetre miša koji je izložen TNF-a/D-Gal i CO. Slike predstavljaju sest različitih životinja i 6-10 različitih preseka po uzorku jetre. Stubovi označavaju 20 um.

Slika 14 je histogram koji pokazuje da CO ne štiti od oštećenja jetre u odsustvu funkcije/ekspresije iNOS. L-NIL = L-N6-(l-iminoetil)lizin-dihidrohlorid (selektivni inhibitor iNOS); CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/D-Gal. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD 6 - 8 životinja po grupi (<*>p<0.01 u odnosu na CO/TNF-a/D-Gal i vazduh i CO kontrole).

Slika 15 je slika Western blot analize koja pokazuje da jetre miševa tretiranih sa CO pokazuju povećanu ekspresiju HO-1 u prisustvu i u odsustvu TNF-a/D-Gal. CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/D-Gal; (3-aktin = kontrolni protein. Blot predstavlja za 2 nezavisna eksperimenta.

Slika 16 je slika Western blot analize koja pokazuje da jetre miševa tretiranih sa CO ne pokazuju povećanu ekspresiju HO-1 u prisustvu ili odsustvu TNF-a/D-Gal, ukoliko je iNOS inhibirana korišćenjem L-NIL. CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/D-Gal; (3-aktin = kontrolni protein; L-NIL = L-N6-(l-iminoetil)lizin-dihidrohlorid

(selektivni inhibitor iNOS)

Slika 17 je histogram koji pokazuje da HO-1 koja je indukovana sa CO štiti od TNF-a indukovanog oštećenja jetre kod miševa. ALT = serumska alanin aminotransferaza; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/D-Gal; Sn = kalaj protoporfirin (inhibitor HO-1); VP = VPYRRO (dodonr azot oksida). Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD 8 - 10 miševa po grupi (<*>p<0,05 u odnosu na miševe tretirane sa CO/TNF/D-Gal).

Slika 18 je histogram koji pokazuje indukcija HO-1 štiti od oštećenja jetre izazvanog sa TNF-a nezavisno od aktivnosti iNOS. ALT = serumska alanin aminotransferaza; vazduh = sobni vazduh; TNF = TNF-a/D-Gal; L-NIL = L-N6-(l-iminoetil)lizin-dihidrohlorid (selektivni inhibitor iNOS); CoPP = kobalt protoporfirin (induktor HO-1); iNOS"<1>" = iNOS knock-out miševi. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD 6 - 8 miševa po grupi (<*>p<0,001 u odnosu na vazduh/TNF i L-NIL/TNF).

Slika 19 je histogram koji pokazuje daje ekspresija HO-1 potrebna za ispoljavanje sa CO indukovane zaštite hepatocita miša od ćelijske smrti indukovane sa TNF = TNF-a/ActD. Divlji tip (crni stubovi) = hepatociti koji su izolovani iz miševa divljeg tipa C57BL/6J;hmox-1" (beli stubovi) = hepatociti izolovani iz miševa koji ne poseduju HO-1 u genomu; CO = ugljen monoksid; vazduh = sobni vazduh; TNF-a = TNF-a/ActD (<*>p<0,01 u odnosu na ćelije koje nisu tretirane sa TNF-a/ActD i u odnosu na ćelije koje su tretirane sa TNF-a/ActD i sa

CO).

Slika 20 je histogram koji pokazuje daje ekspresija HO-1 potrebna za ispoljavanje sa NO indukovane zaštitehepatocita miša od ćelijske smrti indukovane sa TNF-a/ActD. Divlji tip (crni stubovi) = hepatociti koji su izolovani iz miševa divljeg tipa C57BL/6J;hmox- l''~

(beli stubovi) = hepatociti izolovani iz miševa koji ne poseduju HO-1 u genomu; CO = ugljen monoksid; SNAP = s-nitrozo-N-acetil-penicilamin (donor NO); vazduh = sobni vazduh; TNF-a = TNF-a/ActD (<*>p<0,01 u odnosu na ćelije koje nisu tretirane sa TNF-a/ActD i u odnosu na ćelije koje su tretirane sa TNF-a/ActD i sa NO).

Slika 21 je histogram koji pokazuje da su miševi koji su izloženi CO zaštićeni od ozlede jetre indukovane acetaminofenu. ALT = serumska alanin aminotransferaza; vazduh = sobni vazduh; APAP - acetaminofen. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SD 4 - 8 miševa po grupi.

Detaljan opis pronalaska

Pojam "ugljen monoksid" (ili "CO"), kao što se ovde koristi, označava molekulski oblik CO u gasovitom stanju, komprimovan u tečnost ili rastvoren u vodenom rastvoru. Pojmovi "preparat sa ugljen monoksidom" ili "farmaceutski preparat koji sadrži ugljen monoksid" se koriste u predmetnoj specifikaciji da opišu gasoviti ili tečni preparat koji sadrži CO, koji može biti primenjen kod pacijenta i/ili na neki organ, npr. na jetru. Iskusni stručnjak zna koji je oblik farmaceutskog preparata, npr. gasoviti, tečni ili gasoviti i tečni, poželjan u datom rešenju.

Pojmovi "efikasna količina" i "efikasan u lečenju". kao što se ovde koriste, označavaju primenu one količine iii koncentracije CO koja se koristi tokom određenog vremenskog perioda (uključujući akutnu ili hroničnu primenu, kao i periodičnu ili kontinuiranu primenu), koja je efikasna u kontekstu izazivanja željenog dejsrva ili fiziološkog ishoda. Efikasne količne ugljen monoksida koje se koriste u predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, količine koje sprečavaju pojavu hepatitisa, smanjuju rizik od razvoja hepatitisa, ublažavaju simptome hepatitisa ili poboljšavaju ishod drugih tretmana hepatitisa.

Za gasove, efikasne količine CO se generalno nalaze u opsegu od oko 0,0000001% do oko 0,3% (maseni procenti), npr. od 0.0001%) do oko 0,25% (maseni procenti), poželjno najmanje od oko 0,001%. na pnmer. najmanje 0.005%, 0.010%, 0.02%, 0,025%, 0,03%. 0,04%. 0.05%, 0.06%, 0.08%. 0,10%, 0.15%, 0,20%, 0,22% ili 0,24% (maseni procenti) CO. Poželjni su opsezi od. npr. 0,001% do oko 0,24%, oko 0.005% do oko 0,22%, oko 0,005%) do oko 0.05%, oko 0,010% do oko 0.20%. oko 0.02% do oko 0,15%, oko 0,025% do oko 0,10%, ili oko 0,03%) do oko 0,08%, ili oko 0,4% do oko 0,06%. Za tečne rastvore CO, efikasne količine se generalno nalaze u opsegu od oko 0,0001 do oko 0,0044 g CO/lOOg tečnosti, na pnmer, najmanje 0,0001, 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0.0037. 0,0040 ili 0,0042 g CO/100 g tečnog rastvora. Poželjne količine obuhvataju, na primer, od oko 0,0010 do oko 0.0030 g CO/100 g tečnosti, od oko 0,0015 do oko 0,0026 g CO/100 g tečnosti ili od oko 0,0018 do oko 0,0024 g CO/100 g tečnosti. Iskusni stručnjak shvata da se mogu primeniti i doze koje izlaze iz navedenih opsega, što zavisi od datog rešenja.

Pojam "pacijent" se koristi u predmetnoj specifikaciji da opiše životinju, čoveka ili organizam koji nije ljudski, za koga je obezbeđen tretman prema postupcima predmetnog pronalaska. Predmetnim pronalaskom su jasno obuhvaćene pnmene u veterinarskoj medicini. Navedeni pojam obuhvata, bez ograničenja, sisare, na primer, ljude, druge primate, svinje, glodare. kao što su miševi i pacovi. zečeve, zamorce, hrćke.Krave, konje, mačke, pse, ovce i koze. Pojam "tretman/tretirati" se ovde koristi da opiše odlaganje pojave, inhibiciju ili ublažavanje posledica stanja, npr. hepatitisa, kod pacijenta.

Pojam "hepatitis" predstavlja u struci poznati pojam i ovde se odnosi na oboljenje kod pacijenta koje se jednim elom karakteriše inflamacijom jetre. Etiološki faktori za hepatitis obuhvataju, na primer. infekcije, npr. infekciju specifičnim virusima hepatitisa, npr. virusima hepatitisa A. B. C. D. £ i G; ili hepatotoksična sredstva, npr. hepatotoksične lekove (npr. izomjazid, metildopu. acetaminofen. amiodaron i nitrofurantoin), kao i toksine (npr. endotoksm ili toksine iz spoljašnje sredine). Hepatitis može da se javi postoperativno kod pacijenata podvrgnutih transplantaciji jetre. Dalji pnmeri lekova i toksina koji mogu da izazovu hepatitis (tj. hepatotoksičnih sredstava) su opisani u knjizi: Feldman: Sleisenger & Fordtran's Gastromtestinal and Liver Disease. 7. izdanje, poglavlje 17 (Liver Disease Caused by Drugs, Anesthetics and Toxms), čiji je sadržaj ovde jasno u ceiosti inkorporiran po referenci. Takvi primeri obuhvataju, bez ograničenja, metildopu i fenitoin. barbiturate. npr. tenobarbitai; sulfonamide (npr. u kombinovamm lekovima kao što je kotnmoksazol (sulfametoksazol i trimetopnm); sulfasalazin; saiicilati; disuifiram; blokaton (3-adrenergičkih receptora, npr. acebutolol, iabetalol i metoproloi); blokatore kalcijumovih kanala, npr. nifedipin, verapamil i diltiazem: sintetske retinoide, npr. etretinat: lekove za supresiju gastrične sekrecije. npr. oksmetidin, ebrotidin, cimetidin, ranitidin, omeprazol i famotidin: antagoniste leukotrienskih receptora. npr. zafirlukast; antituberkulotike, npr. rifampicin i pirazinamid; antifungalna sredstva, npr. ketokonazol, terbinafm. flukonazol i itrakonazol; antidijabetike, npr. tiazolidindione, npr. troglitazon i rosiglitazon; lekove koji se koriste za neurološke poremećaje, npr. neuroleptička sredstva, antidepresive (npr. fluoksetin, paroksetin. veniafaksin, trazodon. tolkapon i nefazodon), hipnotike (npr. aipidem, zolpidem i bentazepam), kao i druge lekove. npr. takrin, dantrolen, riluzol, tizanidin i alverin; nesteroidne anti-inflamatorne tekove, npr. bromfenak; COX-2 inhibitor; ciproteron acetat; lefiunomid; antivirusna sredstva, npr. fialuridin, didanozm. zacitabin, stavudin, lamivudin, zidovudin, abacavir; antineoplastične lekove, npr. tamoksifen i metotreksat; rekreacione droge, npr. kokain, fenciklidin i 5-metoksi-3,4-metilendioksimetamfetamin; L-asparginazu; amodiahin; hikanton; anestetička sredstva, npr. halotan, enfluran i izofluran; vitamine, npr. vitamin A; kao i toksine iz hrane i/ili iz spoljašnje sredine, npr. pirolizidin aikaloide. toksine izAmaniiaphalloidesili iz drugih otrovnih pečuraka, aflatoksin, arsenik, Bordeaux smeša (soli bakra i krečnjak), vinil hlorid monomcr, ugljen tetrahlorid, berilijum, dimetilformamid, dimetilnitrozamin, metilendianilin, fosfor, hlordekon (Kepon), 2,3,7,8-tetrahloro-dibenzop-dioksin (TCDD), tetrahloroetan, tetrahloroetilen, 2,4,5-trinitrotoluen, 1,1,1 -trihloroetan, toluen i ksilen; kao i poznate "biljne lekove", npr. efedrin i eugenol.

Simptomi hepatitisa mogu da obuhvataju umor, gubitak apetita, nelagodnost u želucu i/ili žuticu (žuta prebojenost kože i/ili beonjača). Detaljniji opis hepatitisa sc može naći u, na primer, The Merck Manual of Diagnosis and Therapv, 17. izdanje, Odeljak 4, Poglavlje 42; Odeljak 4, Poglavlje 44; i Odeljak 4, Poglavlje 40, čiji je sadržajjasno u celosti ovde uključen po referenci.

Iskusni stručnjaci zanju da kod pacijenta može da se postavi dijagnoza hepatitisa koriđenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci, npr. procenom funkcije jetre, npr. korišćenjem pretraga krvi za određivanje serumskih nivoa alanin aminotransferaze (ALT), alkalne fosfataze (AP) ili nivoa bilirubina.

Posebno pojedinci za koje se smatra da poseuju rizik od razvoja hepatitisa mogu da imaju korist od predmetnog pronalaska, primarno zato što profilaktički tretman može da započne pre pojave bilo kog znaka hepatitisa. U pojedince "sa rizikom" spadaju, npr. pacijenti koji su inficirani virusima hepatitisa ili pojedinci koji boluju od bilo kog stanja ili koji poseduju činioce rizika koji su opisani ovde (npr. pacijenti koji su izloženi dejstvu hepatotoksičnih sredstava). Iskusni stručnjak zna da se rizik od razvoja hepatitisa može odrediti dijagnostikovanjem od strane lekara.

Količine koje su efikasne za lečenje hepatitisa mogu da se primene kod pacijenta onog dana kada se kod pacijenta dijagnostiku)e hepatitis ili bilo koje drugo stanje koje je udruženo sa hepatitisom, ili postojanje bilo kog činioca rizika koji je udružen sa povećanom verovatnoćom da pacijent razvije hepatitis (npr. kada je pacijent u skorije vreme bio, upravo jeste ili će biti izložen hepatotoksičnom sredstvu, npr. hepatotoksičnom leku, kao što je acetaminofen). Pacijenti mogu da inhaliraju CO u koncentracijama u opsegu od 10 ppm do 1000 ppm, npr. od oko 100 ppm do oko 8oo ppm, od oko 150 ppm do oko 600 ppm, ili od oko 20 ppm do oko 500 ppm. Poželjne koncentracije obuhvataju, npr. oko 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm ili oko 1000 ppm. CO može da se primeni kod pacijenta intermitentno ili kontinuirano. CO može da se primeni tokom 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 ili 20 dana, ili tokom duže od 20 dana, npr. tokom 1, 2, 3, 5 ili 6 meseci, ili sve dotle dok pacijent pokazuje simptome hepatitisa, ili sve dok kod pacijenta

li

biva dijagnostikovan rizik od nastanka hepatitisa. Tokom datog dana, CO može da se primenjuje kontinuirano tokom čitavog dana ili intermitentno, npr. u vidu jednog udaha CO dnevno (kada se koriste velike koncentracije), ili sve do 23 časa dnevno, npr. tokom 20, 15, 12, 10, 6, 3 ili 2 časova dnevno, ili tokom 1 časa dnevno.

Kod pacijenata koji treba da se tretiraju hepatotoksičnimlekom (npr. zato što je tako prepisano od strane lekara), pacijent može da se tretira sa CO (npr. gasovitim CO preparatom) pre,'tokom i/ili nakon primene tog leka. Na primer, CO može da se primeni kod pacijenta, intermitentno ili kontinuirano, počevši od 0 do 20 dana pre primene leka (a ako se daju višestruke doze, pre svake pojedinačne doze), npr. počevši najmanje 30 minuta, npr. najmanje 1, 2, 3, 5, 7 ili 10 časova, ili pre 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 ili 20 dana, ili pre više od 20 dana, u odnosu na primenu leka. Alternativno ili kao dodatak, CO može da se primeni kod pacijenta nakon primene leka, npr. počevši neposredno nakon prmene, a zatim u nastavku intermitentno ili kontinuirano tokom oko 1, 2, 3, 5, 7 ili 10 časova, ili oko 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 ili 60 dana, neograničeno dugo ili sve dok lekar ne odluči da primena CO više nije potrebna (npr. sve dok se hepatotoksični lek ne eliminiše iz tela ili sve dotle dok može da izazove oštećenje jetre).

Pobijanje gasovitih preparata

CO preparat može biti gasoviti CO preparat. Komprimovani gas ili gas pod pritiskom koji se može koristiti u postupcima prema predmetnom pronalasku može da se pribavi posredstvom bilo kog komercijalnog izvora, kao i u bilo kom tipu suda koji služi za skladištenje komprimovanog gasa. Na primer, komprimovani gas ili gas pod pritiskom može da se pribavi od bilo kog proizvođača koji proizvodi komprimovane gasove, kao što je kiseonik, za medicinske primene. Pojam "gas za medicinske primene", koji se ovde koristi, označava gas koji je pogodan za primenu kod pacijenta, kako je to ovde definisano. Gas pod pritiskom, uključujući CO koji se koristi u postupcima prema predmetnom pronalasku, može da se pribavi u obliku u kome se svi gasovi (npr. CO, He, NO, CO2, O2, N2), koji su poželjni u konačnom obliku preparata, nalaze u istom sudu, s tim da NO i O2nemogu da se skladište zajedno. Opciono, postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se sprovedu korišćenjem više sudova koji sadrže pojedinačne gasove. Na primer, može biti obezbeđen jedan sud koji sadrži CO, sa ili bez drugih gasova, čiji sadržaj može opciono da se meša sa sobnim vazduhom ili sa sadržajem ti drugih sudova, na primer, sudova koji sadrže kiseonik, azot, ugljen dioksid, komprimovani vazduh ili bilo koji drugi pogodni gas ili smešu gasova.

Gasoviti preparati koji se primenjuju na pacijentu prema predmetnom pronalasku tipično sadrže od 0% do 79% azota (maseni procenti), od oko 21%> do oko 100% kiseonika (maseni procenti) i od oko 0,0000001%) do oko 0,3%> (maseni procenti) CO (što odgovara od oko 1 ppb ili 0,001 ppm do oko 3000 ppm). Poželjno, količina azota u gasovitom preparatu je oko 79% (maseni procenti), količina kiseonika je oko 21% (maseni procenti), a količina CO je od oko 0,0001% do oko 0,25% (maseni procenti), poželjno najmanje oko 0,001%, na primer, najmanje oko 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%), 0,20%o, 0,22% ili 0,24%o (maseni procenti). Poželjna količina se nalazi u opsegu od oko 0,005% do oko 0,24%, od oko 0,01% do oko 0,22%, od oko 0,015% do oko 0,20%, od oko 0,08%) do oko 0,20%o i od oko 0,025%o do oko 0,1% (maseni procenti). Primećeno je da gasoviti CO preparati koji poseduju koncentraciju CO veću od 0,3%> (kao što je konc. od 1% ili veća) mogu da se koriste tokom kratkog perioda (npr. jedan ili dva udaha), u zavisnosti od rešcnja.

Gasoviti CO preparat može da se koristi za stvaranje atmosfere koja sadrži CO gas. Atmosfera koja sadrži odgovarajuće nivoe CO gasa može da se formira, na primer, obezbeđivanjem suda koji sadrži gas pod pritiskom u kome se nalazi CO i otpuštanjem gasa pod pritiskom iz suda u komoru ili određeni prostor, kako bi nastala atmosfera koja sadrži CO gas unutar komore ili određenog prostora. Alternativno, gasovi mogu da se otpuštaju u aparat koji se završava maskom za disanje ili tubusom za disanje, čime se na taj način stvara atmosfera koja sadrži CO gas u maski ili tubusu za disanje, što obezbeđuje da pacijent bude jedina osoba u prostoriji koja je izložena značajnim nivoima CO.

Nivoi CO u atmosferi mogu da se mere ili prate korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci. Navedeni postupci obuhvataju elektrohemijsku detekciju, gasnu hromatografiju, određivanje radioaktivnosti izotopa, infracrvenu apsorpciju, kolorimetriju i elektrohemijske postupke koji se zasnivaju na selektivnim membranama (videti, na primer, Sunderman et al., Clin. Chem. 28 : 2026 - 2032, 1982; Ingi et al., Neuron 16 : 835 - 842, 1996). Sub-ppm nivoi CO mogu da se detektuju, na primer, gasnom hromatografijom i merenjem radioaktivnosti radioizotopa. Dalje, u struci je poznato da nivoi CO u sub-ppm opsegu mogu da se mere u biološkom tkivu senzorom za gas koji radi u srednjem infracrvenom delu spektra (videt, na primer, Morimoto et al, Am, J. Phvsiol. Heart Circ.

'f i

Physiol. 280 : H482 - H488, 2001). CO senzori i uređaji za detekciju gasa su široko dostupni kod brojnih komercijalnih izvora.

Pobijanje tečnih prep arata

CO preparat takođe može biti tečni CO preparat. Tečni CO preparat može da se dobije bilo kojim postupkom koji je poznat u struci kojim se gasovi čine rastvorljivim u tečnostima. Na primer, tečnost može da se postavi u takozvani "CO2inkubator" i da se izloži kontinuiranom protoku CO, poželjno onom koji je balansiran ugljen dioksidom, sve dok se ne postigne željena koncentracija CO u tečnosti. Prugi primer je propuštanje CO gasa u vidu mehurića direktno kroz tečnost sve do postizanja željene koncentracije CO. Količina CO koja može da se rastvori u datom vodenom rastvoru se povećava sa snižavanjem temperature. Još jedan primer je da odgovarajuća tečnost može da se propušta kroz cev koja dozvoljava gasnu difuziju, pri čemu se cev dovodi u atmosferu koja sadrži CO (na primer, korišćenjem uređaja kao što je membrana ekstrakorporalnog oksigenatora). CO difunduje u tečnost, kako bi nastao tečni CO preparat.

Verovatno je takav tečni preparat namenjen primeni na živoj životinju, tako da njegova temperatura treba da bude 37 5C u vreme primene na životinji.

Tečnost može biti bilo koja tečnost koja je poznata stručnjacima i koja je pogodna za primenu kod pacijenata (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgery, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Generalno, tečnost može biti vodeni rastvor. Primeri odgovarajućih rastvora obuhvataju fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS - Phosphate Buffered Saline), Celsior , Perfadex , Collins-ov rastvor, rastvor citrata i rastvor Univerziteta u Viskonsinu (University of Wisconsin solution - UWS) (Oxford Textbook of Surgery, Morris & Malt, urednici, Oxford University Press (1994)). U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, tečnost je Ringerov rastvor, npr. Ringerov rastvor sa laktatom, ili bilo koja druga tečnost koja se može primeniti kao infuzija kod pacijenta. U drugom rešenju, tečnost je krv, npr. puna krv.

Svaka pogodna tečnost može biti zasićena do odgovarajuće koncentracije CO putem uređaja za difuziju gasova. Alternativno, mogu se koristiti prethodno napravljeni rastvori koji su prošli kontrolu kvaliteta0posedovanju odgovarajućih nivoa CO. Precizna kontrola doze može da se postigne merenjima membranom koja je propusna za gas, a koja je nepropusna za tečnost i koja je povezana sa analizatorom za CO. Rastvori mogu biti zasićeni do željenih efikasnih koncentracija koje se održavaju na ovim nivoima.

Tretman pacijenata preparatima ugljen monoksida

Pacijent može biti tretiran CO preparatom primenom bilo kog postupka koji je poznat u struci za primenu gasova i/ili tečnosti kod pacijenata. CO preparati mogu da se primenjuju kod pacijenta kod koga je dijagnostikovan ili za koga je procenjeno da postoji rizik od razvoja hepatitisa. Predmetni pronalazak obuhvata sistemsku primenu tečnih ili gasovitih CO preparata kod pacijenata (na primer, inhalacijom i/ili ingestijom), kao i topijsku primenu preparata na jetri pacijenta (npr. uvođenjem u abdominalnu duplju).

Sistemska primena ugljen monoksida

Gasoviti CO preparati mogu da se sistemski primene kod pacijenta, npr. kod pacijenta kod koga je dijagnostikovan ili kod koga je procenjeno da poseduje rizik od razvoja hepatitisa. Gasoviti CO preparati se tipično primenjuju inhalacijom kroz usta ili nosne hodnike do pluća, gde se CO brzo apsorbuje u cirkulaciju pacijenta. Koncentracija aktivnog jedinjenja (CO) koja se koristi u terapijskom gasovitom preparatu zavisi od brzine apsorpcije, distribucije, inaktivacije i ekskrecije (generalno, putem respiracije) CO, kao i od drugih činilaca koji su poznati stručnjacima. Treba dalje primetiti da kod svakog subjekta, tokom vremena, specifični dozni režimi treba da budu podešeni shodno individualnim potrebama i profesionalnoj proceni osobe koja primenjuje ili koja nadgleda primenu preparata, a takođe treba primetiti da su ovde navedeni opsezi koncentracija isključivo ilustrativne prirode i da ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite ili primenu preparata prema predmetnom pronalasku. Tretman može da bude praćen, a doze CO mogu da budu podešene tako da se osigura optimalni tretman pacijenta. Obimom zaštite predmetnog pronalaska su obuhvaćene akutna, subakutna i hronična primena CO, što zavisi, na primer, od ozbiljnosti ili trajanja hepatitisa kod pacijenta. CO može da se primeni kod pacijenta tokom vremena (uključujući i neograničeno dugu primenu) koje je dovoljno za lečenje stanja i za ispoljavanje željenog farmakološkog ili biološkog dejstva.

Slede primeri nekih od postupaka i uređaja koji se mogu koristiti za primenu gasovitih preparata CO kod pacijenata.

Respiratori

CO za medicinske primene (koncentracije mogu da variraju) može da se naruči pomešan sa vazduhom ili drugim gasom koji sadrži kiseonik u standardnom rezervoaru za komprimovani gas (npr. smeša 21% O2i 79% N2). Gas je nereaktivan, a koncentracije koje su potrebne za postupke prema predmetnom pronalasku se nalaze dosta ispod granice zapaljivosti (10% u vazduhu). U bolničkom okruženju, gas se obično primenjuje uz krevet pacijenta, gde se meša sa kiseonikom ili sobnim vazduhom, u posudi za mešanje, do postizanja željene koncentracije izražene u ppm (delovi na milion). Pacijent inhalira gasnu smešu putem respiratora, kod koga je brzina protoka podešena u odnosu na komfor i potrebe pacijenta. Ovo se određuje na osnovu grafikona plućnih funkcija (tj. frekfence disanja, zapremine udaha i izdaha itd.). Na sistemu za primenu se mogu dizajnirati sigurnosni mehanizmi koji bi sprečili da pacijent nepotrebno primi veću količinu CO od željene. Nivo CO koji pacijent prima može se pratiti posmatranjem: (1) karboksihemoglobina (COHb), koji se određuje u venskoj krvi i (2) izdahnutog CO koji se prikuplja na sporednom portu respiratora. Izlaganje CO može da se podesi na osnovu zdravstvenog stanja pacijenta i na osnovu drugih pokazatelja. Ukoliko je potrebno, CO može biti istisnut iz organizma pacijenta primenom inhalacije sa 100% O2. CO se ne metaboliše; stoga, količina koja se udahne će na kraju biti potpuno izdahnuta, izuzev veoma malog procenta koji se prevede u CO2. CO može da se meša u bilo kom odnosu sa O2, kako bi se obezbedila terapijska primena CO bez posledičnih hipoksičnih stanja.

Maska za lice i šator za inhalaciju

Gasovita smeša koja sadrži CO može da se pripremi kao što je gore navedeno kako bi se omogućila pasivna inhalacija od strane pacijenta koji koristi masku za lice ili šator za inhalaciju. Koncentracija koja se inhalira može da se menja i može biti istisnuta iz organizma pacijenta prostim prebacivanjem na 100% O2. Praćenje nivoa CO može da se izvede na ili blizu maske ili šatora uz sigurnosni mehanizam koji sprečava da suviše velika koncentracija CO bude inhalirana.

I,

Prenosivi inhalator

Komprimovani CO može da se upakuje u prenosivi uređaj za inhalaciju i da bude inhaliran u odmerenoj dozi, na primer, kako bi se obezbedio intermitentni tretman kod recipijenta koji se ne nalazi u bolničkim uslovima. U kontejnere mogu biti uskladištene različite koncentracije CO. Uređaj može biti jednostavan, u obliku malog rezervoara (npr. nosivosti ispod 5 kg) sa odgovarajuće razblaženim CO, sa ventilom za otvaranje/zatvaranje i sa cevkom iz koje pacijent uzima udah CO prema standardnom režimu ili po potrebi.

Intravenska veslačka pluća

Veštačka pluća (uređaj u vidu katetera za izmenu gasova u krvi) koji je dizajniran za dopremanje O2i uklanjanje CO2, može biti upotrebljen za dopremanje CO. Kada je implantiran, kateter se nalazi u jednoj od većih vena i sposoban je za dopremanje CO u datim koncentracijama sistemski ili lokalno. Dopremanje može biti lokalno dopremanje visokih koncentracija CO tokom kratkog perioda na mestu izvođenja intervencije, npr. u blizini jetre (ova visoka koncentracija brzo biva razblažena u cirkulaciji) ili tokom dužeg perioda u nižoj koncentraciji (videti, na primer, Hattler et al., Artif. Organs 18 (11) : 806 - 812 (1994); i Golob et al., ASAIO I, 47 (5) : 432 - 437 (2001)).

Komora sa normalnim pritiskom

U određenim slučajevima, poželjno je da se čitav pacijent izloži dejstvu CO. Pacijent treba da se nalazi unutar hermetički zatvorene komore u koju je ubačen CO (u koncentraciji koja ne ugrožava pacijenta, ili u koncentraciji koja nosi prihvatljiv rizik, bez rizika da posmatrači budu izloženi dejstvu gasa). Nakon okončanja izloženosti, komora može biti isprana vazduhom (npr. 21% O2, 79%o N2), a uzorci mogu biti analizirani primenom CO analizatora, kako bi se osiguralo da CO nije ostao u komori pre nego se pacijent izvede iz sistema za izlaganje.

Sistemska primena tečnih CO preparata

Predmetni pronalazak dalje obuhvata stvaranje tečnih CO preparata za sistemsku primenu kod pacijenta, npr. oralno i/ili infuzijom kod pacijenta, npr. intravenski, intraarterijski, intraperitonealno i/ili subkutano. Na primer, tečni CO preparati, kao što je Ringerov rastvor koji je zasićen sa CO, može da se primeni u vidu infuzije kod pacijenta koji boluje od ili koji poseduje rizik od razvoja hepatitisa. Alternativno ili kao dodatak, kod pacijenta može da se primeni u vidu transfuzije delimično ili potpuno sa CO zasićena puna krvi (ili njene frakcije).

Predmetni pronalazak takođe obuhvata upotrebu sredstava kojima je moguće dopremiti odgovarajuće doze gasovitih ili tečnih CO preparata (npr. gume, kremovi, masti, bombone ili flastere koji otpuštaju CO).

Topijski tretman organa ugljen monoksidom

Alternativno, ili kao dodatak, CO preparati mogu da se primene direktno na jetru, npr. na celu jetru ili na bilo koji njen deo. Gasoviti preparati mogu da se primene direktno na jetru pacijenta primenom bilo kog postupka koji je poznat u struci za insuflaciju gasova u telo pacijenta. Na primer, gasovi, kao ugljen dioksid, se često insufliraju u abdominalnu duplju pacijenta, kako bi olakšali pregled tokom laparoskopskih procedura (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Iskusni stručnjak zna da se slične procedure mogu primeniti za dopremanje CO preparata direktno do jetre pacijenta.

Vodeni CO preparati takođe mogu da se primene topijski na jetru pacijenta. Vodeni oblici preparata mogu da se primene korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci za primenu tečnosti kod pacijenta. Kao i u slučaju gasovitih preparata, vodeni preparati mogu da se primene direktno na jetru pacijenta. Na primer, tečnosti, npr. fiziološki rastvor koji sadrži rastvoreni CO, može da se injektira u u abdominalnu duplju pacijenta tokom laparoskopskih procedura. Iskusni stručnjak zna da se slične procedure mogu iskoristiti za primenu tečnih CO preparata direktno do jetre pacijenta. Dalje,in situizlaganje može da se izvede ispiranjem jetre ili nekog njenog dela tečnim preparatom ugljen monoksida (videti Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)).

Primena hemoksigenaze- 1, drugih jedinjenja i drugih tretmana za hepatitis

Predmetni pronalazak takođe obuhvata indukciju ekspresije hemoksigenaze-1 (HO-1) zajedno sa primenom CO. Na primer, HO-1 može biti indukovana kod pacijenta koji boluje ili koji poseduje rizik za razvoj hepatitisa. Kao što se ovde koristi, pojam "indukovati (indukovan)" označava povećanje proizvodnje proteina, na primer, HO-1, u izolovanim ćelijama ili u ćelijama tkiva, organa ili organizma životinje, korišćenjem ćelijskog endogenog (npr. ne-rekombinantnog) gena koji kodira određeni protein.

Ekspresija HO-1 može biti indukovana kod pacijenta bilo kojim postupkom poznatim u struci. Na primer, proizvodnja HO-1 može biti indukovana heminom, gvožđe protoporfirinom ili kobalt protoporfirinom. Takođe, različita sredstva koja se razlikuju od hema, u koja spadaju teški metali, citokini, hormoni, NO, COCL, endotoksin i toplotni udar, predstavljaju snažne induktore ekspresije HO-1 (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15 : 9 - 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 : 517 - 554, 1997; i Tenhunen et al., J. Lab. Clin. Med. 75 : 410 - 421, 1970). Ekspresija HO-1 je takođe snažno indukovana raznim sredstvima koja izazivaju oksidativni stres, uključujući vodonik peroksid, supstance koje smanjuju količinu glutationa, UV radijaciju, endotoksin i hiperoksiju (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15 : 9 - 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 : 517 - 554, 1997; i Keyse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 99 - 103, 1989). Pojam "farmaceutski preparat koji sadrži induktor HO-1" označava farmaceutski preparat koji sadrži neko od sredstava koje je sposobno da indukuje ekspresiju HO-1 kod pacijenta, na primer, neko od sredstava koja su opisana gore, npr. hemin, gvožđe protoporfirin i/ili kobalt protoporfirin.

Ekspresija HO-1 u ćeliji može biti povećana transferom gena. Kao što se ovde koristi, pojam "ekspresija (eksprimiran)" označava izazivanje povećanja proizvodnje proteina, npr. HO-1 ili feritina, u izolovanim ćelijama ili u ćelijama tkiva, organa ili organizma životinje, korišćenjem egzogeno primenjenog gena (npr. rekombinantnog gena). Poželjno je da HO-1 ili feritin budu poreklom iz iste vrste (npr. od čoveka, miša, pacova itd.) kao i recipijent, kako bi se verovatnoća imune reakcije svela na minimum. Ekspresija može da se pokrene konstitutivni promoterom (npr. citomegalovirusnim promoterima) ili tkivno specifičnim promoterom (npr. promoterom gena tečne komponente mleka iz ćelija mlečne žlezde ili albuminskim promoterom ćelija jetre). Odgovarajući vektor za gensku terapiju (npr. retrovirus, adenovirus, virus udružen sa adeno virusom (AAV - Adeno Associated Virus),

I

poks virus (npr. virus vakcinije), virus humane imunodeficijencije (HIV), minutni virus miša, virus hepatitisa B, virus influence, herpes simpleks virus 1 i lentivirus) koji kodira HO-1 ili feritin, može da se primeni kod pacijenta koji boluje od ili za koga je procenjeno da poseduje rizik od razvoja hepatitisa, i to oralno, inhalacijom ili injekcijom u jetru. Slično tome, plazmidni vektori koji kodiraju HO-1 ili apoferitin mogu da se primene, na primer, u vidu gole DNK, u lipozomima ili u mikročesticama.

Dalje, egzogeni HO-1 protein može direktno da se primeni kod pacijenta bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Egzogeni HO-1 može da bude direktno primenjen kao dodatak, ili kao alternativa, uz indukciju ekspresije HO-1 kod pacijenta kao što je opisano gore. HO-1 protein može da se primeni kod pacijenta, na primer, u vidu lipozoma i/ili fuzionog proteina, npr. u vidu TAT-fuzionog proteina (videt, na primer, Becker-Hapak et al., Methods 24:247 -256,2001).

Alternativno, ili kao dodatak, bilo koji od metabolita HO-1, na primer, bilirubin, biliverdin, gvožđe i/ili feritin, može da se primeni kod pacijenta zajedno sa CO kako bi se sprečio nastanak ili da bi se lečio hepatitis. Dalje, predmetni pronalzak obuhvata molekule koji vezuju gvožđe, a koji se razlikuju od feritina, npr. desferoksamin (DFO), gvožđe dekstran i/ili apoferitin, koji se mogu primeniti kod pacijenta. Dalje, predmetni pronalazak podrazumeva da enzimi koji katalizuju razgradnju do bilo kog od ovih proizvoda (npr. biliverdin reduktaza) mogu biti inhibirani u cilju stvaranja/pospešivanja željenog dejstva. Sva gore navedena sredstva mogu biti primenjena, na primer, oralno, intravcnski, mtraperitonealno ili direktno na jetru.

Predmetni pronalazak podrazumeva da jedinjenja koja otpuštaju CO u telu nakon primene (npr. jedinjenja koja otpuštaju CO, npr. fotoaktivirajuća jedinjenja koja otpuštaju CO), na primer, dimangan dekakarbonil, trikarbonildihlororutenijum (II) dimer i metilen hlorid (npr. u dozi između 400 do 600 mg/kg, npr. oko 500 mg/kg), mogu takođe biti upotrebi]ena u postupcima prema predmetnom pronalasku, kao što je to slučaj sa karboksihemoglobinom i supstituentima hemoglobina koji vezuju CO.

Gore navedena sredstva mogu da budu primenjena kod pacijenta na bilo koji način, na primer, oralno, intraperitonealno, intravenski ili intraarterijski. Svako od gore nevdenih jedinjenja može da se primeni kod pacijenta lokalno i/ili sistemski, kao i u bilo kojoj kombinaciji.

Predmetni pronalazak dalje obuhvata tretiranje/sprečavanje nastanka hepatitisa primenom CO kod pacijenta u kombinaciji sa bilo kojim drugim poznatim postupcima ili jedinjenjima za lečenje hepatitisa, npr. sa prekidom ili smanjenjem učestalosti primene lekova koji izazivaju hepatitis; primenom kortikosteroida i/ili a-interferona ili drugih antivirusnih sredstava kod pacijenta; i/ili sa izvođenjem hirurške intervencije na pacijentu, npr. sa transplantacijom jetre.

Predmetni pronalazak je delimično ilustrovan primerima koji slede i koji ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Primeri

Primer 1: Ugljen monoksid ublažava oštećenje jetre

Životinje

Zain vivoeksperimente su korišćeni mužjaci C57BK/6J (Charles Rivers Laboratories, Bar Harbor ME)inos' 1'miševa stari 8-12 nedelja i po starosnoj dobi odgovarajući miševi divljeg tipa (uzgajani / čuvani na Pitsburg Univerzitetu).

Modeli akutnog oštećenja jetre

Grupama miševa je davan TNF-a/D-Gal (0,3 ug/8 mg/mišu, i.p., respektivno). U zavisnosti od eksperimentalnih uslova, neki miševi su primali CO (250 ppm), selektivni donor NO, 02-vinil l-(pirolidin-l-il) diazen-l-ium-l,2-dioalt (V-PYRO; 10 mg/kg s.c, Alexis Biochem., San Diego, CA) ili kobalt protoporfirin (CoPP, 5 mg/kg, i.p., Frontier Scientific, Logan, UT). Dodatno, onda kada je to bilo naznačeno, primenjivani su selektivni inhibitor iNOS, L-N6-(l-iminoetil)-lizin-dihidrohlorid (L-NIL; 5 mg/kg, i.p., Alexis Biochemicals) ili HO-1 inhibitor, kalaj protoporfirin (SnPP, 50 umol/kg, i.p.; Frontier Scientific). Onda kada je naznačeno, prirnenjivan je acetaminofen (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) (500 mg/kg, i.p.).

Ćelijskakulturahepatocita

.<<>

Primarni hepatociti miša su prikupljeni iz C57BK/6J,mkk3~'~, inos' 1'miševa (kolonija koja se međusobno ukršta) ilihmox'~miševa, kao što je opisano u: Kim et al., J. Biol. Chem. 272: 1402 - 1411 (1997). Hepatociti su korišćeni tokom dana 1 - 3 nakon prikupljanja.

Indukcija ćelijske smrti/apoptoze hepatocita

Ćelije su tretirane sa TNF-a (10 ng/ml) i aktinomicinom-D (Act-D, 200 ng/ml, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) u cilju indukcije ćelijske smrti. Pokazano je da tretman sa TNF-a/Act-D indukuje ćelijsku smrt, posebno apoptozu, kod primarnih hepatocita (videti, npr. Kim et al., J. Biol. Chem. 272: 1402 - 1411 (1997)). Hepatociti su tretirani sa CO, donorom NO, s-nitrozo-N-acetil-penicilaminom (SNAP, 250 - 270 uM) i/ili dodatnim farmakološkim sredstvima, onda kada je to naznačeno. Dvanaest časova nakon TNF-a/Act-D tretmana, ćelije su isprane i obojene kristal-vio let bojom, kako bi se odredila vijabilnost, na način koji je ranije opisan (Id.). Kada je naznačeno, primenjen je selektivniin vitroinhibitor iNOS, L-N5-(l-iminoetil)-ornitin-2HCl (LNIO, 1 - 2 mM, Calbiochem, San Diego, CA).

Transfer gena/plazmiđa

U nekim eksperimentima, 12 časova pre tretmana sa TNF-a/Act-D, izveden je transfer gena iKBa super-represora (Hellebrand et al., Hepatologv 27 : 1285 - 1295 (1998)) ili - galaktozidaze, korišćenjem adenovirusnih vektora (10 pfu/ćeliji). NF-kB aktivacija je proćenjivana korišćenjem luciferaza reporter testa, kao što je opisano u: Chovv et al., J. Biol. Chem. 274 : 10689 - 10692 (1999). Ukratko, hepatociti su ko-transficirani saNF-KB reporter konstruktima (pGL3-K|3 luciferaza, 100 ng/polju; i pIEP-Lac-z 0,5 ug/polju) korišćenjem Lipofectin™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), po uputstvima proizvođača. Procena ekspresije iNOS je izvedena korišćenjem luciferaza reporter testa, kao što je opisano u: Lovvenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 : 9730 - 9734 (1993). Ukratko, hepatociti su kotransficirani reporterskim konstruktima iNOS promotera (pXP2, 1 ug/polju) i pIEP-LacZ (0,5 ug/polju), kao što je opisano ranije.

Luciferaza reporter testovi

Hepatociti su transficirani plazmidima, kao št je opisano ranije, i tretirani su različitim stimulusima 24 časa nakon transfekcije. Aktivnost luciferaze (iskazana u arbitrarnim jedinicama, AU) je ispitivana nakon 6 časova od početka tretmana, korišćenjem seta za ispitivanje luciferaze (Promega, Madison, WI) i Berthold-ovog luminometra. Rezultati su korigovani u odnosu na efikasnost transfekcije i koncentraciju proteina.

Test pomaka elektroforetske pokretljivosti

Iz hepatocita su ekstrahovana jedra nakon tretmana. Dvostruke DNK NF-kB konsenzus sekvenca (GGGGACTTTCCC (sekvenca čiji je ID broj 1); Santa Cruz Biotechnologv, Santa Cruz, CA) je obeležena sa [8- P]-ATP i inkubirana sa 5 mg ukupnih proteina jedra. Neke inkubacije su izvedene u prisustvu antitela protiv p65/RelA ili p50 (Santa Cruz Biotech.) u cilju pricene super-pomaka. Test pomaka elektroforetske pokretljivosti (EMSA - Electrophoretic Mobilitv Shift Assay) je izveden kao što je opisano u: Taylor et al., J. Biol. Chem. 273 : 15148 - 15156 (1998).

Imunoblot analiza

Western blot analiza je izvedena na primarnim hepatocitima u kulturi homogenata jetre sa antitelima protiv iNOS (Transduction Laboratories, Lexington, Kentaki; 1 : 1000), protiv HO-1 (Calbiochem; 1 : 2000) ili protiv p-aktina (Sigma Chemical; 1 : 5000). Po polju za SDS-PAGE je naneto po 30 proteina u eksperimentima na ćelijskim kulturama ili po 100 ug homogenata jetre.

Histologija/Imunohistohemija

Radi histoloških i imunohistohemisjjkih analiza, jetre su fiksirane u 2% paraformaldehidu, a zatim su brzim postupkom zamrznute u tečnom azotu. Uzorci su potom isečeni (debljina uzorka 7) i obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E). Preseci jetre su takođe obojeni TUNEL bojenjem i aktiviranom kapsazom-3, korišćenjem setova prema uputstvima proizvođača (Promega). Isečci za imunohistohemijsko ispitivanje iNOS su blokirani sa 5% kozjim serumom koji sadrži 0,2% goveđeg serumskog albumina. Nakon toga, isečci su inkubirani tokom 1 časa na sobnoj temp. sa anti-iNOS antitelima (Transduction Laboratories; 1 : 300), a zatim su isprani i ispitivani sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Jedra su obojena Hoechst bojom. Slike su dobijene korišćenjem Oh/mpus Provus mikroskopa. Hepatociti iz kulture su nanešeni na gelatinizirana pokrovna stakla, stimulisani su kao što je naznačeno, a zatim su fiksirani u 2% paraformaldehidu koji sadrži 0,1%> Triton X-100. Blokiranje i bojenje je slično prethodnom, s tim da su korišćena anti-p65/RelA antitela (Santa Cruz Biotechnologv; 1 : 350).

Izlaganje CO

Životinje su izlagane CO u koncentraciji od 250 ppm. Ukratko, 1% CO u vazduhu je pomešan sa vazduhom (21% kiseonika) u cilindru za mešanje od nerđajućeg čelika, a zatim je usmeren u komoru za izlaganje gasu zapremine 3,70 ft<3>, pri brzini protoka od 12 l/min. Za kontinuirano merenje nivoa CO u komori je korišćen CO analizator (Interscan, Chatsvvorth, CA). Koncentracije CO su održavane na 250 ppm sve vreme. Miševi su postavljani u komoru za izlaganje gasu po potrebi.

HO-1 štiti od oštećenja jetre

Ispitivano je da li HO-1 štiti od akutne insuficijencije jetre. Rezultati su predstavljeni na Slici 1. Kod mužijaka C57BL/6J miševa je primenjivan kobalt protoporfirin (5 mg/kg, i.p.). Nakon 24 časova, miševima je dat TNF-a/D-Gal (0,3 u.g/8 mg/mišu, i.p., respektivno). Nakon 8 časova od primene TNF-a/D-Gal, kod miševa su mereni serumski nivoi alanin aminotransferaze (ALT). Indukcija HO-1 sprečava nastanak oštećenja jetre, mereno na osnovu nivoa ALT.

Egzogeni CO štiti hepatocite

Ispitivano je da li egzogeni CO štiti hepatocite od ćelisjke smrtiin vitro.Rezultati su predstavljeni na Slikama 2 i 3. Da bi se dobili podaci koji su predstavljeni na Slici 2, hepatociti miša su prethodno inkubirani sa CO (250 ppm) tokom 1 časa (standardno vreme prethodnog tretmana u svim eksperimentima), pre dodavanja TNF-a/Act-D (10 ng/200 ng/ml, respektivno). Ćelije su održavane u atmosferi CO tokom trajanja eksperimenta. Nakon 12 časova, merena je ćelijska vijabilnost, kao što je opisano u: Kim et al., J. Biol. Chem. 272 : 1402 - 1411 (1997). Adenovirusni eksperimenti obuhvataju inkubaciju hepatocita tokom noći sa 10 pfu/ćeliji adenovirusa, pre dodavanja TNF-a/Act-D, a zatim ispitivanje vijabilnosti korišćenjem kristal-violet bojenja. Takođe, u ovom modelu je ispitivana uloga molekula guanilil ciklaze i p38 MAPK. Da bi se procenila uloga cGMP i da bi se potvrdila uloga NF-kB, hepatociti su odvojeno tretirani sa rastvorljivim inhibitorom guanilat ciklaze (sGC), 1H-[l,2,4]oksadiazolo[4,3-a]hinoksalin-l-onom (ODQ; Calbiochem; 2 - 10 uM) ili sa inhibitorom NF-kB, BAY 11-7082 (10 uM). Ćelije su tretirane sa inhibitorima tokom 1 časa pre jednočasovnog tretmana sa CO. Zatim je dodat TNF-a/Act-D, pa je ispitivana ćelijska vijabilnost nakon 12 časova. Aktivacija NF-kB je kritična za ispoljavanje zaštite koju izaziva CO, dok cGMP nije uključen u ovaj proces. Izlaganje CO vodi značajno manjoj smrti ćelija (<*>p<0,01) u poređenju sa tretmanom bez CO.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 3, primarni humani hepatociti, dobijeni resekcijom iz jetre donora, tretirani su sa CO i TNF-a/Act-D, kao što je gore opisano.

Izlaganje primarnih hepatocita miša, pacova i čoveka dejstvu CO inhibira sa TNF-a indukovanu apoptozu. Inhibicija apoptoze hepatocita je nezavisna od stvaranja cGMP, pošto selektivni inhibitor guanilil ciklaze, ODQ, ne sprečava zaštitu koju obezbeđuje CO (Slika 2). Dodatno, tretman sa CO inhibira ćelijsku smrt i u prisustvu SB203580 (3 -30 uM, Calbiochem), selektivnog inhibitora p38 MAPK aktivacije, i kod hepatocitamkk3~'~miševa (dominantna kinaza koja pethodi p38 u lancu aktivacije) (podaci nisu prikazani). Stoga, efekti CO su nezavisni od cGMP/p38 MAPK puta. U ovim eksperimentima, hepatociti su prethodno tretirani sa CO tokom 1 časa pre dodavanja TNF-a/Act-D u podlogu. Ukoliko je tretman sa CO započet nakon dodavanja TNF-a, primećena je manja zaštita (podaci nisu prikazani).

Uloga NF-kB u zaštiti sa CO

Ispitivano je da li zaštita hepatocita posredovana sa CO zavisi od NF-kB. Slike 4, 5 i 6A-6C prikazuju podatke koji pokazuju da CO indukuje povećanje NF-kB jedarne translokacije i DNK vezivanje kod hepatocita miša, mereno aktivnošću NF-kB luciferaza reporter testom, EMSA i imuno-bojenjem na RelA/p65 jedarnu translokaciju, respektivno.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 4, procenjena je aktivacija NF-kB, korišćenjem luciferaza reporter testa, kao što je opisano u: Chow et al., J. Biol. Chem. 274 : 10689 - 10692 (1999). Ukratko, hepatociti su kotransficirani sa NF-kB reporterskim konstruktima i sa pIEP-Lac-z, 24 časova pre dodavanja BAY 11-7082 (10 uM) ili vehikuluma. Ćelije su inkubirane tokom 1 časa pre izlaganja CO (250 ppm). Aktivnost luciferaze (izražena u arbitrarnim jedinicama, AU) je ispitivana 6 časova nakon izlaganja CO ili smeši citokina (SC), koja je sastavljena od TNF-a (500 U/ml), IL-lp (100 U/ml) i IFN-5 (100 U/ml), koja je korišćena kao pozitivna kontrola za NF-kB aktivaciju. Rezultati su korigovani prema efikasnosti transfekcije i koncentraciji proteina.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 5, procenjeno je vezivanje NF-kB za DNK korišćenjemEMSA u hepatocitima koji su tretirani sa CO (250 ppm). Treba primetiti povećanje tokom vremena u vezivanju (ukupnom) NF-kB, sa ekspresijom čiji je maskimum nakon 1 časa (Trake 1, 4, 7). Ekstrakti su zatim super-pomereni kako bi se identifikovali različiti NF-kB dimeri korišćenjem antitela protiv p50 (Trake 2, 5, 8) i protiv p65 (Trake 3, 6, 9).

Da bi se dobili podaci prikazani na Slikama 6A-6C, primarni hepatociti su bojeni imuno-bojama radi lokalizacije p65 nakon izlaganja dejstvu CO tokom 1 časa (250 ppm). Slike predstavljaju jedarnu translokaciju NF-kB (strelice su usmerene ka zelenim jedrima i pokazuju translokaciju NF-kB) kod ćelija koje su tretirane sa SC (pozitivna kontrola) i kod ćelija koje su tretirane sa CO, u poređenju sa ćelijama koje su tretirane vazduhom kod kojih nema lokalizacije (strelice usmerene ka plavim jedrima).

Aktivnost NF-kB luciferaza reporter testa pokazuje maksimalnu vrednost nako 1 časa od postavljanja ćelija u atmosferu CO. Smeša citokina (SC) je uključena u tretman grupa kao pozitivni signal i kao standard maksimalne reporterske aktivnosti putem koje se procenjuju efekti CO. Efikasnost transfekcije kod primarnih hepatocita se teško postiže, ali je reporterska aktivnost vrlo značajna (<*>p<0,001 u poređenju sa kontrolom). Ovi podaci u kombinaciji sa pozitivnim imunološkim bojenjem i rezultatima EMSA podržavaju pretpostavku da CO indukuje skromni porast ekspresije NF-kB, koji sam po sebi može delimično dovesti do selektivne ekspresije gena. Da bi se procenilo da li je aktivnost NF-kB potreba za ispoljavanje zaštite posredovane sa CO, korišćen je adenovirusni transfer gena IkBu da bi se sprečila translokacija NF-kB, a BAY 11-7082 (1 - 10 mM, Calbiochem) je korišćen da inhibira aktivaciju NF-tcB.Zaštitni efekti CO su bili poništeni inhibicijom NF-kB aktivacije.

UlogaNF-kB - zavisne ekspresije iNOS kod zaštite sa CO

Ispitivano je da li zaštita hepatocita posredovana sa CO zahteva ekspresiju iNOS i stvaranje NO. Rezultati su predstavljeni na Slikama 7, 8 i 9.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 7, procenjena je ekspresija iNOS korišćenjem luciferaza reporter testa, kao što je opsiano u: Lovvenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 9730 - 9734 (1993). Ukratko, hepatociti su ko-transficirani sa reporterskim konstruktom iNOS promotera i sa pIEP-LacZ, 24 časa pre izlaganja BAY 11-7082 (10 uM) ili vehikulumu. Ćelije su inkubirane sa BAY 1 čas pre izlaganja CO (250 ppm). Ispitivana je aktivnost luciferaze (izražena u arbitrarnim jedinicama; AU), kao što je ranije opisano. Kao pozitivna kontrola je korišćena smeša citokina (SC) da bi se indukovala ekspresija iNOS, a rezultati su korigovani za efikasnost transfekcije i koncentraciju proteina.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 8, procenjena je ekspresija iNOS proteina korišćenjem imunoblot tehnika. Ukreatko, ćelijski ekstrakti hepatocita su tretirani sa TNF-a/ActD tokom 6 - 8 časova u prisustvu ili odsustvu CO (250 ppm). Kontrolne ćelije su dobijale vazduh ili sam CO. Treba primetiti na Slici 8 da TNF-a indukuje ekspresiju iNOS minimalno, dok se kod ovih ćelija kada se tretiraju sa TNF-a u prisustvu CO javlja značajno veća indukcija ekspresije iNOS.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 9, izinos' 1'ili iz C57BL/6J miševa divljeg tipa su izolovani hepatociti, koji su potom prethodno tretirani tokom 1 časa sa L-NIO (1 mM), da bi se inhibirala iNOS pre dodavanja CO. Ove grupe životinja koje su izlagane CO su primile jednočasovni prethodni tretman pre dodavanja TNF-a/ActD, a potom su ponovo izložene CO. CO nije obezbedio zaštitu od ćelijske smrti, što je procenjeno korišćenjem izbacivanja kristal-violet boje nakon 12 časova kod ćelija kod kojih je ekspresija iNOS bila odsutna ili inhibirana.

Izlaganje hepatocita CO dovodi do visoko značajnog porasta u aktivnosti iNOS luciferaza reporter testa (Slika 7). Ponovo, smeša citokina je korišćena i kao pozitivan kontrola kod ovih transfekcija niske efikasnosti i kao standard u odnosu na koji su procenjivani efekti CO. Konzistentno sa zapažanjem daje ekspresija iNOS zavisna od NF-kB, primećena je smanjena reporterska aktivnost kod hepatocita koji su tretirani sa BAY 11-7082 (Slika 7). Dodatno, ekspresija iNOS proteina je značajno povećana u odgovoru na TNF-a u prisustvu CO, u poređenju sa dejstvom samog TNF-a (Slika 8). Korišćenjem hepatocita iz iNOS knock-out miševa( inos' 1')i hepatocita divljeg tipa tretiranih selektivnim iNOS inhibitorom, L-NIO (1 mM Calbiochem), podnosioci patentne prijave su ispitivali da li CO može da zaštiti od ćelijske smrti indukovane sa TNF-a u odsustvu aktivnosti iNOS. Hepatociti koji ne poseduju iNOS aktivnost nisu zaštićeni pomoću CO od ćelijske smrti indukovane TNF-a, dok su hepatociti divljeg tipa bili zaštićeni (Slika 9). Sve zajedno, ovi podaci pokazuju da CO zahteva NF-kB aktivaciju i iNOS ekspresiju da bi se ispoljila zaštita hepatocita od ćelijske smrtiin viiro.

Inhalirani CO štiti od insuficijencije jetre

Ispitivano je da li inhalirani CO štiti miševe od oštećenja jetre kod TNF-a/D-Gal modela fulminantne insuficijencije jetre. Rezultati su prikazani na Slikama 10 i 11A-1 IH.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 10, miševi su tretirani sa CO (250 ppm) tokom 1 časa pre dobijanja TNF-a/D-Gal (0,3 u.g/8 mg/mišu; i.p., respktivno). Nakon primene TNF-a/D-Gal, miševi su ponovo izlagani CO u komori, a u njihovom serumu je analiziran nivo ALT nakon 6-8 časova. Bez izlaganja CO, insuficijencija jetre se javlja nakon 6-8 časova, primarno usled apoptoze hepatocita. kao što je ranije opisano zain vitromodel. Srumski nivo ALT kod miševa koji su tretirani sa CO je bio za 74% niži od nivoa kod miševa izlaganih vazduhu.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 11A - 11H, uzorci jetre miševa tretiranih sa TNF-a/D-Gal u prisustvu i odsustvu tretmana sa CO (250 ppm) tokom 8 časova su isečeni i obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E), bojenjem na aktiviranu kapsazu 3 (povećanje intenziteta crvene boje) i bojenjem TUNEL tehnikom (pojačano zeleno bojenje ćelija; marker ćelijske smrti). Jedra su obojena plavo. Na osnovu bojenja H&E, Izlaganje CO značajno smanjuje TNF-a/D-Gal indukovano oštećenje jetre. Uzorci jetre miševa koji su izlagani CO takođe pokazuju manje TUNEL pozitivnih ćelija, manji intenzitet bojenja na aktiviranu kapsazu 3 i poseduju normalnu tkivnu arhitektoniku. Kontrolni miševi koji su tretirani vazduhom i koji su primali TNF-a/D-Gal pokazuju izraženu inflamaciju jetre, eem, hemoragiju i gubitak tkivne arhitektonike.

Gore diskutovani rezultati su potvrđeni korišćenjem lipopolisaharida (LPS, takođe označen kao endotoksin) umesto TNF. U ovim studijama za potvrđivanje, primena LPS/D-Gal je dovela do povećanja serumskih nivoa ALT sve do >1000 IU/ml (u odnosu na kontrolni nivo od 20±5 IU/ml), mereno nakon 8 časova od primene LPS/D-Gal. Kod mišeav koji su prethodno tretirani sa 250 ppm CO, povećanje nivoa ALT je smanjeno za >75%, do vrednosti od 250 ± 75 IU/ml. Da bi se dalje karakterisali efekti primećeni usled primene CO u ovom modelu, meren je serumski nivo interleukina-6, za koji je nađeno daje smanjen za 65% kod životinja koje su udisale CO u poređenju sa kontrolama koje su udisale vazduh (podaci nisu prikazani). Histopataloški pregled tkiva jetre kod ovih miševa je sličan onome kada se koristi TNF-a/D-Gal. Netretirani miševi i miševi tretirani sa CO (bez tretmana sa LPS/D-Gal) ne pokazuju znake oštećenja, dok oni koji su tretirani vazduhom i LPS/D-Gal pokazuju izraženo oštećenje, uključujući edem, hemoragiju, infiltraciju neutrofilima i ukupnu destrukciju normalne morfologije i arhitektonike tkiva. Nasuprot tome, jetre miševa koji su tretirani sa CO i LPS/D-Gal su zaštićene u istoj meri kao i jetre miševa tretiranih sa CO i TNF-a/D-Gal. Primećeno je malo promena u markerima inflamacije (edem, hemoragija, infiltracija neutrofila). Arhitektonika tkiva je održana i umnogome je slična onoj kod netretiranih miševa (bez tretmana sa LPS/D-Gal) koji su izlagani CO. Konačno, upotreba LPS/D-Gal za indukciju akutnog hepatitisa je analogna upotrebi TNF-a/D-Gal tretmana i potvrdila je podatke dobijene tim tretmanom.

Uloga iNOS u CO posredovanoj zaštiti od oštećenja jetre

Korišćenjem imunoblot i imunohistohemijskih tehnika je ispitivano da li su hepatični nivoi iNOS proteina povišeni u jetri miševa izloženih dejstvu CO, nakon tretmana sa TNF-a/D-Gal. Dalje, ispitivano je da li CO štitiinos' 1'miševe ili miševe divljeg tipa koji su tretirani selektivnim inhibitorom iNOS, L-NIL (10 mg/kg, i.p., dozirano svaka 2 časa), da bi se utvrdilo da li ekspresija iNOS ima neku funkcionalnu ulogu u ovome. Rezultati su navedeni na Slikama 12, 13A-DD i 14.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 12, mužijaci C57BL/6J miševa su tretirani vazduhom ili CO (250 ppm), tokom 1 časa pre primene TNF-a/D-Gal (0,3 ug/8 mg/mišu, i.p., respektivno). Nakon 6 časova, prikupljene su jetre, kako bi se imunoblot tehnikom procenila ekspresija iNOS. Rezultati pokazuju da je ekspresija iNOS skromno povećana kod miševa tretiranih vazduhom i TNF-a/D-Gal, a daje značajno povećana kod miševa tretiranih sa CO i TNF-a/D-Gal. Kao što je i očekivano,inos' 1'miševi nisu pokazali ekspresiju iNOS proteina.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slikama 13A-13D, isečci jetri miševa su obojeni na prisustvo iNOS. Isečci jetre su dobijeni od miševa koji su tretirani sa TNF-a/D-Gal u prisustvu ili odsustvu CO, kao i od kontrolnih životinja koje su izlagane vazduhu i CO i koje su primili TNF-a/D-Gal. Jetre miševa koji su izloženi CO, ali koji nisu primili TNF-a/D-Gal pokazuju skromno povećanje ekspresije iNOS. Međutim, primećeno je značajno izraženije povećanje ekspresije (označeno povećanjem broja zeleno obojenih ćelija) u jetrama miševa koji su izloženi CO i koji su primili TNF-a/D-Gal. Povećana ekspresija je lokalizovana oko krvnih sudova.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 14, ispitivana je efikasnost CO posredovane zaštite u odsustvu iNOS aktivnosti korišćenjeminos' 1'miševa i miševa divljeg tipa koji su tretirani sa L-NIL, selektivnim inhibitorom iNOS (L-NIL; 5 mg/kg, i.p., dozirano svaka dva časa). L-NIL je primenjen 2 časa pre primene CO. Životinje tretirane sa CO su zatim prethodno tretirane (250 ppm) tokom 1 časa pre primene TNF-a/D-Gal. U odsustvu funkcije/ekspresije iNOS, CO nije mogao da zaštiti od oštećenja jetre, što je procenjeno na osnovu merenja serumskih nivoa ALT i histopatološkog pregleda (podaci nisu prikazani).

Stoga, izgleda da je zaštitni efekat inhaliranog CO kod insuficijencije jetre indukovanog sa TNF-a zavisno od aktivnosti iNOS:

Uloga HO-1 u CO posredovanoj zaštiti od akutne insuficijencije jetre

Ispitivano je da li CO i NO obezbeđuju zaštitu od akutnog ošteđenja jetre putem mehanizma zavisnog od HO-1. Podaci su prikazani na Slikama 15, 16, 17 i 18.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 14, primenjena je imunoblot tehnika kako bi se posmatrala ekspresija HO-1 u jetri miševa koji primaju TNF-a/D-Gal u prisustvu i u odsustvu CO (250 ppm). Miševi tretirani sa CO pokazuju značajno povećanje ekspresije HO-1 i u prisustvu i u odsustvu TNF-a/D-Gal.

Da bi se procenila uloga iNOS na ekspresiju HO-1 indukovanu sa TNF-a/D-Gal u jetri (podaci prikazani na SLici 16), miševima je dat L-NIL (5 mg/kg, i.p.) 2 časa pre prethodnog tretmana sa CO (250 ppm), što je ponavljano na svaka 2 čas nakon toga. Kontrolni miševi su primali L-NIL i držani su na sobnom vazduhu. Treba primetiti na SLici 16 da CO povećava ekspresiju HO-1 kod miševa tretiranih vehikulumom, ali da ne može da indukuje ekspresiju kada je blokirana iNOS. Sam tretman sa L-NIL ima minimalni efekat na ekspresiju HO-1.

Da bi se ispitala uloga indukcije ekspresije HO-1 sa CO (podaci prikazani na Slici 17), miševima je davan SnPP (50 umol/kg, s.c), selektivni inhibitor HO-1, 5 časova pre tretmana sa CO. Alternativno, miševima je davan VPYRRO (VP), donor NO (10 mg/kg, s.c). VP je selektivno dizajniran da dopremi NO direktno do jetre. Jedan čas nakon inicijalne doze VP, životinje su izložene dejstvu CO tokom 1 časa pre primene TNF-a/D-Gal (videti ranije). Serumski nivoi ALT su određivani nakon 6-8 časova. Treba primetiti da CO nije mogao da obezbedi zaštitu kod životinja kod kojih'je aktivnost HO-1 bila blokirana. VP je, kada je primenjen 2 časa pre, a potom na svakih 2 časa ponovo, obezbedio zaštitu od oštećenja, što je određeno nakon 8 časova na osnovu merenja serumskih nivoa ALT.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 18, C57BL/6J miševi divlčjeg tipa su prethodno tretirani tokom 24 časa sa rastvorom L-NIL u pijaćoj vodi (4,5 mM), kao što je opisano u: Stenger et al., J. Exp. Med. 183 : 1501 - 1514 (1996). Ovim miševima iinos' 1'miševima je potom dat CoPP. Koncentracija L-NIL je održavana na istom nivou u vodi tokom čitavog eksperimenta. Kontrolni iinos1'miševi su dobijali normalnu pijaću vodu. Nakon 24 časa od primene CoPP, primenjen je TNF-a/D-Gal, a 6 - 8 časova kasnije je određivan serumski nivo ALT. Treba primetiti na SLici 18 da indukcija ekspresije HO-1 obezbeđuje zaštitu bez obzira na prisustvo iNOS.

Imunoblot analiza ekstrakata jetre miševa tretiranih sa CO u prisustvu ili u odsustvu TNF-a/D-Gal je pokazala povećanje ekspresije HO-1 (Slika 15). Dodavanje inhibitora iNOS, L-NIL, ovim grupama, koji poništava zaštitu (Slika 17), takođe sprečava povećanje ekspresije HO-1 (Slika 16). Da bi se odredilo da li HO-1 ima centralnu ulogu u zaštiti jetre izazvanoj sa CO, korišćen je kalaj protoporfirin - IX (SnPP, 50 umol/kg, s.c, Frontier Scientific), kao selektivni inhibitor aktivnosti HO-1. SnPP značajno umanjuje zaštitne efekte CO u ovom modelu (Slika 17). Primena SnPP u odsustvu TNF-a/D-Gal ne pokazuje štetne ili zaštitne efekte (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati sugerišu daje povećanje ekspresije HO-1 važno za ispoljavanje zaštitnih dejstava CO.

Da bi se odredilo da li je povećana ekspresija HO-1 takođe potrebna ukoliko je zaštita inicirana sa NO, miševi su tretirani sa farmakološkim donorom NO, V-PYRRO/NO. Ovo sredstvo se metaboliše u jetri, što vodi oslobađanju NO dejstvom hepatocita. V-PYR.RO/NO takođe obezbeđuje zaštitu nakon primene LPS/D-gal ili TNF-a/D-gal. Miševi su randomizovani i tretirani sa TNF-a/D-gal sa ili bez primene SnPP, kako bi se procenila uloga HO-1. V-PYRUO/NO poseduje zaštitno dejstvo, što je procenjeno na osnovu serumske ALT. Međutim, SnPP poništava sposobnost ovog donora NO da štiti od oštećenja jetre (Slika 17). Stoga, izgleda daje zaštita jetre sa CO ili sa NO barem delimično zavisna od HO-1.

Pošto ovi podaci sugerišu da CO i NO zahtevaju aktivnost HO-1 da bi štitili od smrti hepatocita indukovane sa TNF-a, ispitivano je da li zaštita koja je posredovana sa HO-1 zahteva aktivnost iNOS. Korišćenjeminos' 1'miševa, HO-1 je indukovana primenom CoPP. Nakon 24 časa je ubrizgana TNF-a/D-gal, u toku maksimalne ekspresije HO-1, a nakon 6 - 8 časova je procenjivano oštećenje jetre. Rezultati pokazuju daje indukcija HO-1 sposobna da značajno spreči nastanak oštećenja jetre nezavisno od aktivnosti iNOS, uz smanjenje nivoa serumske ALT od >50% (Slika 18). Ovi rezultati su potvrđeni korišćenjem L-NIL. Miševi su prethodno tretirani pijaćom vodom koja sadrži L-NIL (4,5 mM) tokom 24 časa. Ovim postupkom se efikasno inhibira aktivnost iNOS. Kontrolni miševi su primali normalnu vodu. Nakon toga, CoPP je primenjen da bi se indukovala ekspresija HO-1, a 24 časova nakon toga miševima je dat TNF-a/D-gal. Sam tretman sa L-NIL ne menja ozbiljnost oštećenja u ovom modelu. Sve životinje koje primaju CoPP (sa ili bez L-NIL) su zaštićene od oštećenja jetre (Slika 18).

Ispitivano je da li je potrebna ekspresija HO-1 za CO i NO indukovanu zaštitu od ćelijske smrti hepatocita koja je indukovana sa TNF-a/D-gal. Podaci su prikazani na Slikama 19 i 20.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 19, hepatociti su izolovani iz HO-1 deficijentnih miševa( hmox- l' 1')i miševa divljeg tipa (C57BL/6J miševi), potom su prethodno tretirani sa CO (250 ppm), a onda sa TNF-a/Act-D. Vijabilnost je procenjena kao što je opisano ranije. CO značajno štiti hepatocite divljeg tipa, ali nije sposoban da zaštiti hepatocite izolovane izhmox- l' 1'miševa.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 20, hepatociti su izolovani iz HO-1 deficijentnih miševa( hmox- l''')i miševa divljeg tipa (C57BL/6J miševi), potom su prethodno tretirani sa donorom NO, SNAP (500 uM), a nakon 1 časa su tretirani sa TNF-a/Act-D. Pokazano je da SNAP štiti hepatocite u ovom modelu. SNAP značajno štiti hepatocite divljeg tipa od ćelijske smrti, ali ne obezbeđuje značajnu zaštitu od ćelijske smrti kod hepatocita izolovanih izhmox- i~ 1~miševa.

Kao što je ranije diskutovano, ćelije miševa divljeg tipa ihmox- l' 1'miševa koje su tretirane vazduhom podležu ćelijskoj smrti kao što je očekivano, dok su ćelije divljeg tipa koje su tretirane sa CO ili NO bile zaštićene u prisustvu TNF-a/Act-D (Slike 19 i 20). Zaštita koja je obezbeđena sa CO i NO ne postoji kod ćelija kod kojih nedostaje funkcionalna HO-1( hmox- r!'miševi). Stoga, izgleda da HO-1 obezbeđuje zaštitu u ovom modelu, bez uključivanja iNOS, što sugeriše da HO-1 ili jedan ili više njenih katalitičkih proizvoda mogu, delimično, da ispolje citoprotektivne efekte u ovom momdelu.

InhaliraniCO štiti od hepatitisa indukovanog acetaminofenom

?

Ispitivano je da li inhalirani CO štiti od hepatitisa indukovanog acetaminiofenom (APAP). Podaci su prikazani na Slici 21.

Da bi se dobili podaci prikazani na Slici 21, mužijaci C57BL/6J miševa su izlagani CO (250 ppm) ili 1 čas pre ili 4 časa posle primene APAP (500 mg/kg, i.p.). Miševi su zatim držani u atmosferi sa CO za vreme odvijanja eksperimenta. Nakon 20 časova od primene APAP, određivani su serumski nivoi ALT. Kontrolni miševi su dobijali APAP i držani su na vazduhu. Ovaj protokol je dizajniran da bi se dozvolilo da se hepatitis razvije tokom 4 časa pre primene CO. CO značajno smanjuje oštećenje jetre, što se procenjuje na osnovu serumske ALT (622 ± 44 u poređenju sa 175 ± 137, p<0,01 u poređenju sa kontrolom).

Ovakva zaštita je slična onoj koja se primećuje u različitoj grupi životinja koje su prethodno tretirane sa CO pre dodavanja APAP. Navedeni podaci podržavaju terapeutsku upotrebu CO u klinički značajnoj situaciji, kada tretman treba da se započne nakon inicijacije hepatitisa.

Rezultati koji su diskutovani u ovom Primeru pokazuju da mala koncentracija CO može da zaštiti od fulminantnog hepatitisa indukovanog sa TNF-a/D-gal i prikazuje jedinstvenu u ranije neprepoznatu zavisnost i od HO-1 i od iNOS kod zaštite jetre indukovane sa CO od oštećenja izazvanog sa TNF-a/D-gal.

Bez namere vezivanja za bilo koju teoriju, moguće je da sa CO posredovana zaštita deluje putem aktivacije NF-kB, koji u prisustvu ingžflamatornog stimulusa vodi povećanju ekspresije iNOS sa posledičnom proizvodnjom NO. Kao dodatak indukciji iNOS, mogu biti indukovani drugi NF-kB zavisni antiapoptotični/zaštitni geni. Tokom jednočasovnog prethodnog tretmana sa CO i pre tretmana ćelija sa TNF-a, prisutna je značajna aktivacija NF-kB, koja može biti deo pripremanja ćelijskog aparata, kao što je diskutovano ranije. Aktivacija NF-kB od strane CO može delimično da dovede do blagog povećanja stvaranja reaktivnih jedinjenja kiseonika koja nastaju u mitohondrijama (preliminarna posmatranja). Vreme od 1 časa takođe može da omogući vreme koje je potrebno za ekspresiju anti-apoptotskih gena koji su zavisni od NF-kB. Sledeći korak u ovom hipotetičkom modelu može da vodi stvaranju NO koja sledi povećanje ekspesije iNOS. NO dovodi do povećanja ekspresije HO-1, čija aktivnost obezbeđuje zaštitne efekte. Zaštitni efekat HO-1 može biti posledica uklanjanja hema ili bilo kog drugog (jednog ili više) od njegova tri proizvoda: CO, biliverdina/bilirubina ili gvožđa/feritina. S obzirom da je egzogeni CO primenjivan tokom čitavog eksperimenta, deluje malo verovatno da samo endogeno nastali CO posreduje u zaštiti sa HO-1. Međutim, moguće je daje uključena kombinacija CO sa drugim proizvodima HO-1 ili ovim drugim proizvodima koji deluju samostalno.

U studiji koja je opisana gore, CO je primenjivan u klinički značajnom modelu hepatitisa indukovanog acetaminofenom (APAP), koji poseduje klinički tok koji je sličan razvoju akutnog hepatitisa kod ljudi. Podaci pokazuju da izlaganje CO tokom 4 časa nakon primene APAP (500 mg/kg, i.p.) dovodi do smanjenja oštećenja jetre za 62% (Slika 21). U ovom modelu oštećenja jetre indukovanog sa APAP, miševi pokazuju znake hepatitisa čak 2 - 4 časa nakon primene APAP, a letalni ishod nastaje za 24 - 48 časova. Stoga, CO je primenjen nakon otpočinjanja oštećenja jetre. Konzistentni sa podacima iz APAP modela su rezultati iz mišijeg modela hemoragijskog šoka, gde je početak terapijske primene inhaliranog CO tokom resuscitacije. a posle 2,5 časova faze šoka, rezultovalo ispoljavanjem zaštitnog efekta u odnosu na oštećenje jetre (smanjenje nivoa serumske ALT nakon 24 časa za >65%, p<0,01, n = 6-10 životinja/grupi).

Ukratko, upotrebom modela oštećenja jetre izazvanog primarno apoptozom indukovanom sa TNF-a, pokazano je sledeće: prvo, inhalirani CO može da spreči nastanak hepatitisa u ovom modelu; drugo, zaštita upotrebom CO zahteva stvaranje drugog gasovitog molekula, NO; treće, NO ispoljava svoja poželja dejstva, barem delimično, putem povećanja ekspresije HO-1; i četvrto, povećanje ekspresije HO-1 obezbeđuje zaštitu bez potrebe za aktivnošću iNOS/NO, tj. bez obaveznog održavanja ovog ciklusa.

Primer 2: Protokol tretmana hepatitisa

Sledeći primer prikazuje protokole koji se koriste u lečenju pacijenta kod koga je dijagnostikovan hepatitis. Primer takođe prikazuje protokole za lečenje pacijenata pre, tokom i/ili nakon hirurških intervencija, npr. hirurške intervencije za transplantaciju jetre. Iskusni stručnjak zna da svaki od protokola koji je ovde opisan može biti prilagođen individualnim potrebama pacijenta, a takođe može biti prilagođen upotrebi zajedno sa nekim drugim tretmanom hepatitisa.

Tretman pacijenata

Tretman pacijenata sa CO može početi onog dana kada je kod pacijenta dijagnostikovan hepatitis, na primer, hepatitis koji je izazvan virusnom infekcijom i/ili zloupotrebom alkohola. Pacijentu dijagnoza može biti postavljena od strane lekara korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci. Na primer, lekar može dijagnostikovati poremećaj korišćenjem podataka dobijenih na osnovu ispitivanja krvi, npr. testova za određivanje nivoa serumske ALT, kao i testova za određivanje infekcije određenim virusom (npr. nekim od poznatih virusa hepatitisa). Dalje, lekar može uzeti u obzir podatke iz anamneze pri postavljanju dijagnoze (npr. uzimanjem u obzir podatka da je pacijent alkoholičar ili hronični korisnik droge). Pacijent može inhalirati CO u koncentraciji od 250 do 500 ppm tokom 1 časa dnevno. Ovakav tretman može da se nastavi tokom oko 30 dana ili sve dotle dok se ne postavi dijagnoza da pacijent ne poseduje samu bolest ili rizik od njenog nastanka.

Postupci za transplantaciju jetre

Tretman donora jetre

Pre preuzimanja jetre ili njenog dela, donor može biti tretiran inhalacijom ugljen monoksida (250 ppm) tokom 1 časa. Tretman može biti primenjen u dozama koje variraju od 10 ppm do 1000 ppm tokom vremena koje varira od 1 do 6 časova, ili tokom čitavog perioda od trenutka kada je moguće započeti tretman donora u stanju moždane smrti (leš) do trenutka uklanjanja organa. Za ljude - donore, tretman treba da počne što je pre moguće nakon uspostavljanja moždane smrti. U nekim rešenjima, poželjno je započeti tretman pre nastanka moždane smrti.

Za životinje (npr. svinje) koje se koriste kao donori pri ksenotransplantaciji, živa životinja - donor može biti tretirana relativno visokim nivoima gasovitog ugljen monoksida, a ako je potrebno sve dok tako nastali karboksihemoglobin ne kompromituje vijabilnost i funkciju organa koji treba da se transplantira. Na primer, moguće je koristiti koncentracije veće od 500 ppm (npr. 1000 ppm ili veće, sve do 10000 ppm, posebno tokom kratkih perioda).

Tretman jetre in situ

Pre preuzimanja jetre iz donora, organ može biti ispran ili perfundovan nekim rastvorom, npr. puferom ili podlogom, dok je još uvek u organizmu donora. Namera je da se jetra ispere rastvorom koji je zasićen ugljen monoksidom i da se organ održava u atmosferi ugljen monoksida, tako da koncentracija ugljen monoksida ostane na nivou zasićenja. Ispiranje može da traje tokom najmanje 10 minuta, npr. tokom 1 časa, nekoliko časova, ili duže. Idealno, rastvor treba da dopremi najveću moguću koncentraciju ugljen monoksida do ćelija jetre (ili nekog njenog dela).

Teretman jetre ex vivo

Jetra može da se čuva u podlozi koja sadrži ugljen monoksid od trenutka uklanjanja iz donora do trenutka transplantacije u recipijenta. Ovo se može postići čuvanjem jetre u podlozi koja sadrži CO ili perfundovanjem jetre takvom podlogom. S obzirom da se ovo odvija preex vivo,nego u životinji, mogu se upotrebiti veoma visoke koncentracije CO (npr. 10000 ppm), kako bi se u podlozi održala zasićena koncentracija CO.

Tretman recipijenta jetre

Tretman recipijenta sa CO može da počne na dan transplantacije, barem 30 minuta pre početka hirurške intervencije. Alternativno, tratman može početi najmanje 30 minuta pre reperfuzije organa u recipijentu. Tretman može da se nastavi tokom najmanje 30 minuta, npr. tokom 1 časa. Doze ugljen monoksida od oko 10 ppm do oko 3000 ppm mogu da se dopreme tokom različitog vremena, npr. tokom minuta ili časova i mogu da se primene na sam dan transplantacije ili u danima koji slede. Na primer, pacijent može da inhalira ugljen monoksid u koncentraciji od npr. 3000 ppm, tokom tri udaha između kojih su periodi od po 10 sekundi zadržavanja daha. Alternativno, manje koncentracije gasa mogu da se dopreme intermitentno ili konstantno, tokom dužeg perioda vremena, uz pravilno disanje, radije nego uz zadržavanje daha. Kao smernica za pravilnu upotrebu CO kod pacijenta mogu da se koriste koncentracije karboksihemoglobina. Obično, tretman recipijenta ne bi trebalo da povisi nivo karboksihemoglobina iznad nivoa koji predstavlja prihvatljivi rizik za pacijenta kome je potrebna transaplantacija.

Opisana su brojna rešenja predmetnog pronalaska. Bez obzira na to, treba shvatiti da je moguće napraviti različite modifikacije bez odstupanja od duha i od obima zaštite predmetnog pronalaska. Shodno tome, druga rešenja su obuhvaćena obimom zaštite koji je definisan patentnim zahtevima koji slede.

Claims (18)

1. Upotreba ugljen monoksida za dobijanje farmaceutskog preparata za lečenje hepatitisa kod pacijenta.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je farmaceutski preparat u obliku gasa.

3. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što se farmaceutski preparat primenjuje na pacijentu oralnim putem, inhalacijom ili direktnom primenom u abdominalnu duplju pacijenta.

4. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je pacijent zaražen virusom koji je izabran iz grupe koju čine: virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, virus hepatitisa D, virus hepatitisa E i virus hepatitsa G.

5. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je pacijent alkoholičar.

6. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što lečenje hepatitisa dodatno obuhvata primenu na pacijentu tretmana koji je izabran iz grupe koju čine: prekid ili smanjenje učestanosti primene lekova koji izazivaju hepatitis; i primena kortikosteroida ili antivirusnih sredstava kod pacijenta.

7. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što se farmaceutski preparat primenjuje na pacijentu putem veštačkih pluća ili putem uređaja za ekstrakorporalnu membransku razmenu gasova.

8. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je hepatitis izazvan izlaganjem pacijenta hepatotoksičkom sredstvu.

9. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što hepatitis nije izazvan hirurškom intervencijom ili endotoksinom.

10. Upotreba ugljen monoksida za dobijanje farmaceutskog preparata za lečenje hepatitisa kod pacijenta, naznačena time što obuhvata: (a) obezbeđivanje suda u kome je smešten farmaceutski preparat u vidu komprimovanog gasa koji sadrži ugljen monoksid; (b) oslobađanje farmaceutskog preparata iz suda, kako bi se formirala atmosfera koja sadrži ugljen monoksid u gasnom stanju; i (c) izlaganje pacijenta ovoj atmosferi.

11. Upotreba ugljen monoksida za dobijanje farmaceutskog preparata za primenu hepatotoksičkog leka na pacijentu, naznačena time što obuhvata: (a) primenu hepatotoksičkog leka na pacijentu; i (b) primenu farmaceutskog sredstva na pacijentu, pre, tokom ili nakon koraka (a),.

12. Upotreba prema zahtevu 11, naznačena time što je hepatotoksički lek izabran iz grupe koju čine: izonijazid, metildopa, acetaminofen, amiodaron i nitrofurantoin.

13. Sud koji sadrži komprimovan gas ugljen monoksida, medicinske čistoće, naznačen time što sud nosi oznaku koja ukazuje da se gas može koristiti za lečenje hepatitisa kod pacijenta.

14. Sud prema zahtevu 13, naznačen time što oznaka dodatno ukazuje da se gas može primenjivati na pacijentu zajedno uz primenu hepatotoksičkog leka.

15. Sud koji sadrži komprimovan gas ugljen monoksida, medicinske čistoće, naznačen time što sud nosi oznaku koja ukazuje da se gas može primenjivati na pacijentu zajedno uz primenu hepatotoksičkog leka.

16. Sud prema zahtevu 13, 14 ili 15, naznačen time što je ugljen monoksid u smeši sa gasom koji sadrži kiseonik.

17. Sud prema zahtevu 13, 14 ili 15, naznačen time što je ugljen monoksid prisutan u smeši, u koncentraciji od najmanje oko 0,025%, u koncentraciji od najmanje oko 0, 05%, u koncentraciji od najmanje oko 0,10%, u koncentraciji od najmanje oko 1,0%, ili u koncentraciji od najmanje oko 2,0%.

18. Upotreba ugljen monoksida za dobijanje farmaceutskog preparata za lečenje hepatitisa kod pacijenta, naznačena time što obuhvata: (a) identifikaciju pacijenta koji boluje od hepatitisa ili je izložen riziku od nastanka hepatitisa koji nije izazvan hirurškom intervencijom ili endotoksinom; i (b) primenu na pacijentu farmaceutskog preparata.