RS91004A - Postupci za lečenje ileusa - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje ileusa kod pacijenta, koji obuhvata primenu na pacijentu farmaceutskog preparata koji sadrži ugljen monoksid.

Description

POSTUPCI ZA LEČENJE ILEUSA

Referenca odnosne prijave

Ova prijava traži prioritet od US privremene prijave br. 60/372,652, podnete 15. aprila 2002. godine, čiji je opis ovde u potpunosti uključen prema referenci.

Izjava o istraživanju sponzorisanom of strane federalne vlade

Ovaj pronalazak je ostvaren uz podršku Vlade SAD, prema odobrenjima nacionalnih instituta za zdravlje br. HL55330, HL60234, GM58241, GM53789 i AI42365. Vlada polaže izvesna prava na predmetni pronalazak.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na lečenje gastrointestinalnih poremećaja.

Stanje tehnike

Ugljen monoksid (CO) je otrovan gas u visokim koncentracijama. Međutim, on je sada prepoznat kao važan signalni molekul (Verma et al., Science 259 : 381 - 384, 1993). Takođe, sugerisano je da ugljen monoksid služi kao neuronski signalni molekul u mozgu

(Id.), kao i neuro-endokrini modulator u hipotalamusu (Pozzoli et al., Endocrinologv 735 : 2314 - 2317, 1994). Kao i azot monoksid (NO), ugljen monoksid je relaksant glatkih mišićnih ćelija (Utz et al., Biochem Pharmacol. 47 : 195 -201, 1991; Christodoulides et al., Circulation 97 : 2306 - 9, 1995) i da inhibira agregaciju trombocita (Mansouri et al., Thromb. Haemost. 48 : 286 - 8, 1982). Pokazano je da inhalacija ugljen monoksida u malim koncentracijama ispoljava anti-infiamatorne efekte u nekim modelima.

Ileus je stanje koje se karakteriše odsustvom pokretljivosti creva i predstavlja jedan od najčešćih oblika ipstrukcije creva (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, Oxford Universitv Press (1994)). Često, ileus se javlja u čitavom intestinalnom traktu (npr. zahvata i tanko i debelo crevo), ali ponekad može da obuhvati samo jedan ili nekoliko njegovih segmenata. Intestinalna manipulacija u toku abdominalne hirurgije često vodi razvoju ileusa.

Predloženi su različiti farmaceutski pristupi lečenju ileusa (videt, na primer, U.S. patente br. 5,362,756 (fedotozin); 5,929,035 (neuropeptidi); 6,214,843 (pirazolopiridin); i 5,958,407 (npr. antagonizovanje proteinazom aktiviranog receptora 2)).

Suština pronalaska

Predmetni pronalazak se zasniva, jednim delom, na otkriću da primena CO može da ublaži ileus.

Prema tome, u jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja ileusa kod pacijenta, koji obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje od ili koji poseduje rizik za razvoj ileusa i primenu na pacijentu farmaceutskog preparata koji sadrži efikasnu količinu ili koncentraciju ugljen monoksida.

Ileus može biti ileus bilo kog dela gastrointestinalnog trakta, npr. želuca, tankog creva i/ili debelog creva. Ileus može da nastane kao posledica dejstva bilo kog činioca koji izaziva ileus, npr. hirurške intervencije, kao što je abdominalna hirurška intervencija, npr. transplantaciona hirurška intervencija (npr. transplantacija tankog creva (SITx - Small Intestinal Transplantation)) ili abdominalna hirurška intervencija koja nije transplantaciona (npr. abdominalna hirurška intervencija koja ibuhvata laparotomiju ili ona koja ne obuhvata laparotomiju, npr. laparoskopske procedure); ortopedska hirurška intervencija (npr. hirurška intervencija na kuku); porođaj; intestinalna ishemija; retroperitonealni hematom; intraabdominalna sepsa; intrapeirtonealna inflamacija, npr. akutni apendicitis, holecistitis, pankreatitis; frakture kičme; bubrešne kolike; torakalne lezije; bazalna pneumonija; frakture rebara; infarkt miokarda; metabolički poremećaji; ili bilo koja njihova kombinacija.

Farmaceutski preparat može biti primenjen kod pacijenta na bilo koji način koji je poznat u struci koji se koristi za primenu gasova, tečnosti i/ili čvrstih supstanci, npr. putem inhalacije, insuflacije, infuzije, injekcije i/ili ingestijom. Na primer, u jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta inhalacijom. U drugom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta oralno. U još jednom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje direktno u abdominalnu duplju pacijenta.

Dalje, postupak prema predmetnom pronalasku može da obuhvati primenu kod pacijenta barem jednog od tretmana kao dodatak tretmanu sa CO: indukciju HO-1 ili feritina; ekspresiju rekombinantne HO-1 ili feritina; kao i primenu farmaceutskih preparata koji sadrže HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin, desferoksamin, gvožđe dekstran ili apoferitin.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja ileusa nakon hirurške intervencije kod pacijenta. Postupak obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje od ileusa nakon hirurške intervencije i primenu farmaceutskog preparata koji sadrži količinu ugljen monoksida koja je efikasna u lečenju ileusa kod pacijenta. Ileus može biti ileus bilo kog dela gastrointestinalnog trakta, npr. želuca, tankog creva i/ili debelog creva. Farmaceutski preparat može da se primeni bilo kojim putem koji je ovde opisan, npr. inhalacijom (gasoviti preparati); oralno; i/ili direktnom primenom u abdominalnu duplju pacijenta.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenja ileusa kod pacijenta koji boluje ili koji poseduje rizik za razvoj ileusa koji nije izazvan abdominalnom hirurškom intervencijom, npr. ileusa koji je izazvan bilo kojim od činilaca koji su opisani ovde, a koji nisu hirurška abdominalna intervencija. Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje od ili koji poseduje rizik od razvoja ileusa koji nije izazvan abdominalnom hirurškom intervencijom i primenu farmaceutskog preparata koji sadrži količinu ugljen monoksida koja je efikasna u lečenju ileusa kod pacijenta.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ileusa kod pacijenta, koji obuhvata korake obezbeđivanja posude koja sarži gas pod pritiskom uključujući gasoviti ugljen monoksid; identifikaciju pacijenta koji boluje od ili koji poseduje rizik od razvoja ileusa; otpuštanje gasa pod pritiskom iz posude , kako bi se stvorila atmosfera u kojoj se nalazi ugljen monoksid; kao i izlaganje pacijenta navedenoj atmosferi, pri čemu je količina ugljen monoksida u atmosferi dovoljna za lečenje ileusa kod pacijenta.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak izvođenja hirurške intervencije kod pacijenta. Postupak obuhvata identifikaciju pacijenta kome je potrebna hirurška intervencija, pri čemu pacijent pre, tokom i/ili nakon intervencije udiše količinu gasovitog ugljen monoksida koja je dovoljna za lečenje ileusa kod pacijenta.

Hirurška intervencija može biti bilo koja hirurška intervencija koja izaziva i/ili izlaže pacijenta riziku za razvoj ileusa. Na primer, hirurška intervencija može da obuhvati manipulaciju (npr. dodirivanje (direktno ili indirektno)) gastrointestinalnog trakta, npr. želuca i/ili creva, npr. tankog ili debelog creva i može da obuhvati hiruršku intervenciju koja podrazumeva lapartomiju ili koja ne podrazumeva laparotomiju (npr. hirurške intervencije koje uključuju laparoskopiju). U određenim rešenjima, hirurgija može biti transplantaciona hirurška intervencija ili netransplantaciona hirurgija, npr. hirurgija na bilo kom organu (organima) ili tkivu (tkivima) u abdomenu, npr. hirurgija urogenitalnog sistema (npr. bubrega, uretera i/ili mokraćne bešike; kao i reproduktivnih organa (npr. materice, jajnika i/ili jajovoda)); dirurgija digestivnog sistema (npr. želuca, tankog creva, debelog creva, slepog creva, žučne beike, jetre, slezine i/ili pankreasa); hirurgija limfnog sistema; hirurgija respiratornog sistema (npr. pluća); hirurgija dijafragme; hirurgija u terapiji kancera ili bilo kog drugog organa ili tkiva u abdomenu; hirurgija endometrijuma; kao i ortopedska hirurgija, npr. hirurgija kuka.

U drugom rešenju, predmetni pronalzak obezbeđuje posudu koja sadrži medicinski komprimovani gasoviti CO. Posuda može da nosi oznaku koja označava da gas može da bude upotrebljen u lečenju ileusa, npr. ileusa koji nastaje kao posledica hirurške intervencije (npr. hirurške intervencije koja obuhvata intestinalnu manipulaciju) kod pacijenta (npr. kod čoveka). CO se može nalaziti u smeši sa gasom koji sadrži azot, azot monoksid i azot ili sa gasom koji sadrži kiseonik. CO se može nalaziti u smeši u koncentraciji od najmanje 0,025%, npr. od najmanje 0,05%, 0,10%, 0,50%, 1,0%, 2,0%, 10%, 50% ili 90%.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata postupak za lečenje ileusa kod pacijenta, koji obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje ili koji poseduje rizik od razvoja ileusa i primenu barem jednog od sledećih tretmana zajedno sa tretmanom sa CO: indukciju HO-1 ili feritina; ekspresiju rekombinantne HO-1 ili feritina; kao i primenu farmaceutskih preparata koji sadrže HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin, ili apoferitin. Takođe, obuhvaćena je i upotreba CO i bilo kog od gore nevedenih sredstava u dobijanju preparata za lečenje ili sprečavanje nastanka ileusa.

Takođe, predmetni pronalazak obuhvata korišćenje CO u proizvodnji preparata za lečenje ili sprečavanje nastanka stanja koja su ovde opisana, npr. ileusa. Preparat takođe može da se koristi u postupku za lečenje ileusa kod pacijenta i/ili za lečenje donatora, organa i/ili recipijenata u postupcima transplantacije. Preparat može biti u bilo kom ovde opisanom obliku, npr. u vidu tečnog ili gasovitog CO preparata.

Osim ako nije drugačije defmisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste poseduju isto značenje koje je uobičajeno među stručnjacima, kojima je ovaj pronalazak namenjen. Odgovarajući postupci i materijali su opisani u tekstu koji sledi, pri čemu se u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska mogu koristiti postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani. Sve publikacije, patentne prijave, patenti i druge reference koje su ovde spomenute, u potpunosti su inkorporirane po referenci. U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, ima prednost. Materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativni i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Detalji jednog ili više rešenja prema predmetnom pronalasku su prikazani na pridodatim crtežima i u opisu koji sledi. Druge karakteristike, ciljevi i prednosti pedmetnog pronalaska će biti jasni na osnovu opisa i crteža, kao i patentnih zahteva.

Kratak opis crteža

Slika 1 je linijski grafikon koji prikazuje efekat transplantacije tankog creva (SITx) i tretmana sa CO na spontanu i betaneholom stimulisanu kontraktilnost cirkularnih mišića tankog creva. ▲ = kontrola; 0 = kontrola + CO; X = SITx; ■ = SITx + CO.

Slika 2A je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat CO na crevni tranzit kod kontrolnih životinja (životinja kod kojih nije izvršena SITx). Crne prečke = kontrola; prugaste prečke = kontrola + CO (250 ppm); žel = želudac; tc = tanko crevo.

Slika 2B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat CO na crevni tranzit kod životinja kod kojih je izvršena SITx. Crne prečke = SITx; prugaste prečke = SITx + CO (250 ppm); žel = želudac; tc = tanko crevo i kol = debelo crevo.

Slika 2C je grafikon sa prečkama koji prikazuje da CO značajno poboljšava crevni tranzit kod pacova koji su podvrgnuti SITx. Grafikon sažeto prikazuje preračunata merenja tranzita kroz geometrijski centar. Kontrola = kontrolne životinje izlagane vazduhu; kontrola + CO = kontrolne životinje izlagane CO; SITx = životinje kod kojih je izvršena SITx koje su izlagane vazduhu; SITx + CO = životinje kod kojih je izvršena SITx koje su izlagane CO.

Slika 3 je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat CO na regrutaciju leukocita u muskularni sloj creva nakon SITx. Kontrola = kontrolne životinje izlagane vazduhu; kontrola + CO = kontrolne životinje izlagane CO; SbTx = životinje kod kojih je izvršena SITx koje su izlagane vazduhu; SbTx + CO = životinje kod kojih je izvršena SITx koje su izlagane CO.

Slika 4A je linijski grafikon koji prikazuje ekspresiju IL-6 iRNK u mukozi i mišićnom sloju u različitim vremenskim trenucima nakon SITx, što je mereno na osnov RNKaza zaštitnim testom. ■ = mišić; o = mukoza.

Slika 4B je linijski grafikon koji prikazuje ekspresiju IL-1(3 iRNK u mukozi i mišićnom sloju u različitim vremenskim trenucima nakon SITx, što je mereno na osnov RNKaza zaštitnim testom. ■ : mišić; o = mukoza.

Slika 5 je grupa grafikona sa prečkama koji prikazuju efekat CO na ekspresiju sintaze azot monoksida (iNOS), IL-6, IL-1B i IL-10 u spoljašnjem mišićnom sloju intestinalnih presadaka četiri časa nakon reperfuzije, što je mereno RT-PCR analizom u realnom vremenu. Normalno = kontrolne životinje izložene vazduhu; normalno + CO = kontrolne životinje izložene CO; SITx = životinje koje su podvrgnute SITx i izložene vazduhu; SITx + CO = životinje koje su podvrgnute SITx i izložene CO.

Slika 6 je grupa grafikona sa prečkama koja prikazuje efekat CO na serumske koncentracije IL-6 i nitrata/nitrita kod životinja koje su podvrgnute SITx, mereno nakon jednog časa (SITx + CO (lh)) i četiri časa (SITx + CO (4 h)) nakon reperfuzije. Normalno = kontrolne životinje izložene vazduhu; normalno + CO = kontrolne životinje izložene CO; SITx (1 h) i SITx (4 h) = životinje koje su podvrgnute SITx, mereno nakon jednog i nakon četiri časa nakon reperfuzije, respektivno.

Slika 7A je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat intestinalne manipulacije (IM) na ekspresiju HO-1 u ekstraktima mišićnog sloja, mereno korišćenjem RT-PCR analize u realnom vremenu u dve faze. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3 h), 6 (IM 6 h), 12 (IM 12 h) i 24 (IM 24 h) nakon laparotomije. Maksimalna vrednost ekspresije HO-1 se javlja tri do šest časova postoperativno. Podaci predstavljaju za koliko puta je srednja vrednost povećana u odnosu na kontrolu ± standardna greška merenja, n = 6.<*>P = 0,001;<**>P = 0,0001.

Slika 7B je fotografija preparata mišićnog sloja koja prikazuje HO-1 sličnu imunoreaktivnost u polimorfonuklearima koji infiltriraju mišićni sloj nakon IM.

Slika 7C je fotografija preparata mišićnog sloja koja prikazuje HO-1 sličnu imunoreaktivnost u makrofagima sličnim ćelijama koje infiltriraju mišićni sloj nakon IM.

Slika 7D je fotografija preparata mišićnog sloja koja prikazuje HO-1 sličnu imunoreaktivnost u ćelijama koje sadrže granule koji infiltriraju mišićni sloj nakon IM. Mesta nejasne imunofluorescencije u donjoj polovini slike su ćelije ispod ravni fokusa.

Slika 7E je fotografija preparata mišićnog sloja koja prikazuje nedostatak HO-1 slične imunoreaktivnosti u mišićnom sloju kod kontrolnih životinja.

Slika 8A je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekte udahnutog CO (24 časovno izlaganje) na crevni tranzit kod miševa koji nisu podvrgnuti IM. Žel = želudac; tc = tanko crevo; i kol = debelo crevo. Pune prečke = životinje koje nisu izložene CO; prečke sa prugama = životinje koje su izložene CO. Najveći deo fluorescentnog signala je lokalizovan u cekumu i proksimalnom kolonu.

Slika 8B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekte udahnutog CO (24 časovno izlaganje) na crevni tranzit kod miševa koji su podvrgnuti IM. Žel = želudac; tc = tanko crevo; i kol = debelo crevo. Pune prečke = životinje koje nisu izložene CO; prečke sa prugama = životinje koje su izložene CO. Nakon IM, crevni tražit je značajno usporen. Udisanje CO vodi distribuciji obečeženog dekstrana (IM-CO) više distalno.

Slika 8C je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezultat proračuna geomtrijskog centra (GC). Veći brojevi odgovarajudistribuciji obeleženog dekstrana više distalno. Kontrola = kontrolne životinje; Kontrola + CO = kontrolne životinje izlagane CO; IM = životinje koje su podvrgnute IM; IM + CO = životinje koje su podvrgnute IM i izlagane CO.<*>U IM grupi, GC je naglađeno narušen u odnosu na kontrole, P<0,0001; n = 6. f Udisanje CO (IM + CO) vodi značajnom povećanju GC u odnosu na IM, P = 0,001; n = 6. '

Slika 9A predstavlja tragove koji prikazuju efekat CO na spontanu kontraktilnu aktivnost. Kontrola: ritmičke kontrakcije koje su karakteristične za miševe koji nisu operisani. Kontrola + CO: udisanje ugljen monoksida (CO) tokom 24 časa od strane kontrolnih miševa nije dovelo do ispoljavanja efekta na spontanu kontraktilnost. IM: ritmična kontraktilnost je izgubljena nakon hirurške manipulacije na tankom crevu. IM + CO: ritmičnost je uspostavlj ena kod životinj a nad koj ima j e vršena manipulacij a i koj e su tretirane sa C 0.

Slika 9B predstavlja linijski grafikon (kriva doza - odgovor na dozu) koji prikazuje efekat CO na veličinu toničkih kontrakcija u uzorcima cirkularnog sloja glatkog mišića dobijenih od životinja koje nisu podvrgnute IM. Kontrakcije su indukovane izlaganjem uzoraka rastućim koncentracijama betanehola (0,1 do 300 umol/1). Udisanje CO od strane kontrolnih životinja nije imalo efekta na kontraktilnu aktivnost indukovanu betaneholom. ■ = kontrola; A. = kontrola + CO.

Slika 9C predstavlja linijski grafikon (kriva doza - odgovor na dozu) koji prikazuje efekat CO na veličinu toničkih kontrakcija u uzorcima cirkularnog sloja glatkog mišića dobijenih od životinja koje su podvrgnute IM. Kontrakcije su indukovane izlaganjem uzoraka rastućim koncentracijama betanehola (0,1 do 300 umol/1). Kapacitet kružnih mišića da se kontrahuju u odgovoru na betanehol je značajno umanjen nakon IM. Udisanje CO je uspostavilo kontraktilnu aktivnost do nivoa kontrolne (IM + CO). ■ = IM; ▲ = IM + CO.

Slika 10 je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat izlaganja CO na broj mijeloperoksidaza (MPO) pozitivnih leukocita koji infiltriraju mišićni sloj mukoze kod kontrolnih miševa pre i nakon manipulacije (IM). Kontrola = kontrolne životinje; kontrola + CO = kontrolne životinje izlagane CO; IM = životinje podvrgnute IM; IM + CO = životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su dati kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.<*>P<0,0001; n = 4.

Slika 11A je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezuktate dvostepene RT-PCR analize u realnom vremenu efekata hirurške anestezije i IM na ekspresiju iRNK IL-6 u vremenu. Uzorci su analizovani u nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM12h) i 24 (IM 24h) časova. Maksimalna vrednost ekpsresije je primećena nakon 3 i nakon 6 časova od hirurške intervencije. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.

<*>P<0,0001 u odnosu na kontrolu.

Slika 11B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat inhalacije CO na ekspresiju iRNK IL-6 nakon 3 i (IM + CO 3h) i 6 (IM + CO 6 h) nakon hirurške intervencije. IM 3h i IM 6h = IM kontrolnih životinja nakon 3 časa i nakon 6 časova, respektivno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.

Slika 11C je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat inhalacije CO na prouvodnju IL-6 proteina u ekstraktima mišićnog sloja koji su prikupljeni 24 časova nakon hirurške intervencije. Proizvodnja IL-6 je značajno umanjena inhalacijom CO. Kontrola = kontrolne životinje; kontrola + CO = kontrolne životinje izložene CO; IM = životinje podvrgnute IM; IM + CO = životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti±standardna greška merenja.<*>P<0,0001 u odnosu na kontrolu; i t P = 0,001 u odnosu na IM; n = 6.

Slika 12A je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezultate dvostepene RT-PCR analize u realnom vremenu efekata hirurške anestezije na i IM na ekpsresiju iRNK IL-1(3 u vremenu. Ekspresija iRNK nakon hirurške manipulacije (IM). Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h) i 24 (IM 24h) časova. Maksimalna ekspresija se javlja 6 časova postoperativno. Podaci su izraženi kao srednjevrednosti ±standardna greška merenja.

<*>P = 0,001 i P<0,0001 u odnosu na kontrolu, n = 6.

Slika 12B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat inhalacije CO na ekspresiju iRNK IL-ip nakon 3 (IM + CO 3h) i 6 (IM + CO 6 h) časova nakon hirurške intervencije. CO značajno inhibira maksimalne vrednosti ekspresije iRNK IL-1B. IM 3h i IM 6 h = IM kontrolnih životinja nakon 3 i nakon 6 časova, respektivno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.<*>P = 0,0001 u odnosu na IM 6 h, n = 6.

Slika 12C je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat inhalacije CO na proizvodnju proteina IL-1B u ekstraktima mišićnog sloja creva koji su prikupljeni 24 časova nakon hirurške intervencije. Proizvodnja proteina IL-1 (3 je značajno umanjena inhalacijom CO. Kontrola = kontrolne životinje; kontrola + CO = kontrolne životinje izložene CO; IM = životinje podvrgnute IM; IM + CO = životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja. ND = nedetektovano.<*>P = 0,001 u odnosu na kontrolu; i t P = 0,001 u odnosu na IM; n = 6.

Slika 13A je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezultate dvostepene RT-PCR analize u realnom vremenu efekata hirurške anestezije i IM na ekspresiju iRNK iNOS u vremenu. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h) i 24 (IM 24h) časa. Maksimalna ekspresija se javlja 6 časova postoperativno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.<*>P = 0,001; **P<0,0001 u odnosu na kontrolu, n = 6.

Slika 13B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekte inhalacije CO na ekspresiju iRNK iNOS nakon 3 (IM + CO 3h) i 6 (IM + CO 6h) časova od hifurške intervencije. IM 3h i IM 6h = IM kontrolne životinje nakon 3h i nakon 6h, respektivno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja. f P = 0,001 u odnosu na IM 6h; n = 6.

Slika 13C je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat inhalacije CO na proizvodnju ukupnih nitrita u ekstraktima mišićnog sloja creva koji su prikupljeni 24 časova nakon hirurške intervencije. Ukupna proizvodnja nitrita je određena kao indeks iNOS aktivnosti. Inhalacija CO značajno inhibira hirurški indukovano povećanje proizvodnje nitrita u mišićnom sloju creva kojim je manipulisano u toku intervencije. Slično smanjenje nivoa nitrita je postignuto inkubacijom ekstrakata mišićnog sloja u prisustvu selektivnog iNOS inhibitora L-Nil (30 uM; IM + L-Nil). Kontrola = kontrolne životinje; kontrola + CO = kontrolne životinje izložene CO; IM = životinje podvrgnute IM; IM + CO = životinje podvrgnute IM i izložene CO.<*>P = 0,001 u odnosu na kontrolu; t P = 0,001 u odnosu na IM; n = 6. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.

Slika 14A je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezultate dvostepene RT-PCR analize u realnom vremenu efekata hirurške anestezije i IM na ekspresiju iRNK COX-2 u vremenu. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h) i 24 (IM 24h) časa. Maksimalna ekspresija se javlja 3-12 časova postoperativno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.<*>P = 0,001;<**>P = 0,0001 u odnosu na kontrolu, n = 6.

Slika 14B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekte inhalacije CO na ekspresiju iRNK COX-2 nakon 3 (IM + CO 3h) i 6 (IM + CO 6h) časova od hirurške intervencije. IM 3h i IM 6h = IM kontrolne životinje nakon 3h i nakon 6h, respektivno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.

Slika 14C je grafikon sa prečkama koji prikazuje da inhalacija CO značajno povećava ekspresiju iRNK COX-2 3 časa (CO 3h) nakon intervencije. CO 6h = ekspresija nakon 6 časova od intervencije. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.

*P = 0,01.

Slika 14D je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekat inhalacije CO na proizvodnju PGE2 u ekstraktima mišićnog sloja creva prikupljenih nakon 24 časa od hirurške intervencije. Proizvodnja PGE2 je određena kao indeks COX-2 aktivnosti. Inhalacija CO značajno povećava proizvodnju supstance iz kontrolnih uzoraka mišićnog sloja, ali ne ispoljava efekat na hirurški indukovano povećanje PGE2 proizvodnje u ekstraktima mišićnog sloja kojim je manipulisano tokom intervencije. Kontrola = kontrolne životinje; kontrola + CO = kontrolne životinje izložene CO; IM = životinje podvrgnute IM; IM + CO = životinje podvrgnute IM i izložene CO. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.<*>P = 0,01 i<**>P = 0,0001 u odnosu na kontrolu; n = 6.

Slika 15A je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezultate dvostepene RT-PCR analize u realnom vremenu efekata hirurške anestezije i IM na ekspresiju iRNK IL-10 u vremenu. Uzorci su analizirani nakon 3 (IM 3h), 6 (IM 6h), 12 (IM 12h) i 24 (IM 24h) časa. Maksimalna ekspresija se javlja 3 do6 časova postoperativno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.<*>P < 0,001 u odnosu na kontrolu; n = 6.

Slika 15B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekte inhalacije CO na ekspresiju iRNK IL-10 nakon 3 (IM + CO 3h) i 6 (IM + CO 6h) časova od hirurške intervencije. Inhalacija CO povećava nivo iRNK IL-10 nakon 3, ali ne i nakon 6 časova od hirurške intervencije. IM 3h i IM 6h = IM kontrolne životinje nakon 3h i nakon 6h, respektivno. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja. fp = 0,001 u odnosu na IM 3h; n = 6.

Slika 15C je grafikon sa prečkama koji prikazuje- da inhalacija CO od strane kontrolnih životinja značajno povećava ekspresiju iRNK IL-10 3 časa (CO 3h) i 6 časova (Co 6h) nakon intervencije. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja.

*P < 0,001 u odnosu na kontrolu; n = 6.

Slika 16A je grafikon sa prečkama koji prikazuje rezultate dvostepene RT-PCR analize u realnom vremenu efekata hirurške anestezije i IM na ekspresiju iRNK HO-1 u vremenu, nakon 3 i 6 časova od intervencije (IM). Inhalacija CO značajno povećava ekspresiju iRNK HO-1 nakon 3 časa (IM + CO 3h), ali ne i nakon 6 časova (IM + CO 6h) postoperativno. IM 3h i IM 6h = IM kontrolne životinje nakon 3 i nakon 6 časova, respektivno. f P < 0,001 u odnosu na IM 3h, n = 6.

Slika 16B je grafikon sa prečkama koji prikazuje efekte inhalacije CO na ekspresiju iRNK HO-1 nakon 3 (CO 3h) i 6 (CO 6h) časova od tretmana. Inhalacija CO od strane kontrolnih životinja povećava ekspresiju iRNK HO-1 6 časova nakon tretmana.<*>P <0,05 u odnosu na kontrolu; n = 6.

Detaljan opis pronalaska

Pojam "ugljen monoksid" (ili "CO"), kao što se ovde koristi, označava molekulski oblik CO u gasovitom stanju, komprimovan u tečnost ili rastvoren u vodenom rastvoru. Pojmovi "preparat sa ugljen monoksidom" ili "farmaceutski preparat koji sadrži ugljen monoksid" se koriste u predmetnoj specifikaciji da opišu gasoviti ili tečni preparat koji sadrži CO i koji može biti primenjen kod pacijenta i/ili na organ, npr. na tanko crevo. Iskusni stručnjak će znati koji je oblik farmaceutskog preparata, npr. gasoviti, tečni ili gasoviti i tečni, poželjan u datoj primeni.

Pojmovi "efikasna količina" i "efikasan u lečenju", kao što se ovde koriste, označavaju količinu ili koncentraciju CO koja se koristi tokom određenog vremenskog perioda, uključujući akutnu ili hroničnu primenu, kao i periodičnu ili kontinuiranu primenu, koja je efikasna u kontekstu izazivanja željenog dejstva ili fiziološkog ishoda. Efikasne količine CO koje se primenjuju u predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, količine koje sprečavaju nastanak ili umanjuju simptome ileusa kod pacijenta nakon hirurške intervencije, npr. transplantacije tankog creva.

Za gasove, efikasne količine CO se generalno nalaze u opsegu od oko 0,0000001% do oko 0,3% (maseni procenti), npr. od 0,0001%) do oko 0,25% (maseni procenti), poželjno najmanje od oko 0,001%, na primer, najmanje 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% ili 0,24% (maseni procenti) CO. Za tečne rastvore CO, efikasne količine se generalno nalaze u opsegu od oko 0,0001 do oko 0,0044 g CO/lOOg tečnosti, na primer, najmanje 0,0001, 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040 ili 0,0042 g CO/100 g tečnog rastvora. Poželjne količine obuhvataju, na primer, od oko 0,0010 do oko 0,0030 g CO/100 g tečnosti, od oko 0,0015 do oko 0,0026 g CO/100 g tečnosti ili od oko 0,0018 do oko 0,0024 g CO/100 g tečnosti. Iskusni stručnjak shvata da se mogu primeniti i doze koje izlaze iz navedenih opsega, što zavisi od datog rešenja.

Pojam "pacijent" se koristi u predmetnoj specifikaciji da opiše životinju, čoveka ili organizam koji nije ljudski, za koga je obezbeđen tretman prema postupcima predmetnog pronalaska. Predmetnim pronalaskom su jasno obuhvaćene primene u veterinarskoj medicini. Navedeni pojam obuhvata, bez ograničenja, sisare, na primer, ljude, druge primate, svinje, glodare, kao što su miševi i pacovi, zečeve, zamorce, hrčke, krave, konje, mačke, pse, ovce i koze. Pojam "tretirati/tretman" se ovde koristi da opiše odlaganje pojave, inhibiciju ili ublažavanje efekata stanja, na primer, ileusa.

Pojam "donor" ili "pacijent - donor ", kao što se ovde koristi, označava pacijenta (čoveka ili ne-humani organizam) od koga se može pribaviti organ ili tkivo radi transplantacije pacijentu - recipijentu. Pojam "recipijent" ili"" pacijent - recipijent se odnosi na pacijenta (čoveka ili ne-humani organizam) u koga se prenosi organ ili tkivo.

Pojam "ileus" generalno označava parcijalnu ili kompletnu paralizu ili dismotilitet gastrointestinalnog trakta. Ileus može nastati u čitavom gastrointestinalnom traktu, ili može da zahvati samo jedan ili nekoliko njegovih delova, npr. želudac, tanko crevo ili debelo crevo. Iskusni stručnjak zshvata da ileus može da nastane kao posledica dejstva velikog broja činioca, npr. hirurške intervencije (bilo koje hirurške intervencije koja podrazumeva laparotomiju, npr. transplantacija tankog creva (SITx - Small Intestinal Transplantation); ili bilo koje hirurške intervencije koja podrazumeva laparoskopiju); intestinalne ishemije; retroperitonealnog hematoma; intraabdominalne sepse; intraperitonealne inflamacije; akutnog apendicitisa; holecistitisa; pankreatitisa; ureteralne kolike; torakalne lezije; bazalne pneumonije; infarkta miokarda; metaboličkih poremećaja, npr onih koji dovode do povećanja nivoa kalijuma; lekova, npr. produženog dejstva opijata; kao i trauma, npr. fraktura kičme i rebara (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Pojam takođe obuhvata post-porođajni ileus, koji je čest problem kod žena u periodu nakon porođaja, npr. nakon vaginalnog porođaja ("prirodnog porođaja") ili hirurški potpomognutog porođaja. Kao što se ovd ekoristi, pojam !post-hirurški ileus! se odnosi na ileus koji se javlja kod pacijenta nakon bilo koje hirurške intervencije, npr. nakon abdominalne hirurške intervencije. Pojam "ne-hirurške intervencije" se odnosi na medicinske tretmane koji ne obuhvataju hirurgiju. Pojam "ileus koji je posledica stanja koja ne obuhvataju hiruršku intervenciju" se odnosi na ileus koji je izazvan faktorima koji nisu hirurška intervencija, npr. faktorima koji su ode opisani.

Pacijenti za koje se smatra da poseduju rizik od razvoja ileusa mogu da imaju posebnu korist od predmetnog pronalaska, primarno zbog toga što profilaktički tretman može da otpočne pre pojave bilo kog znaka ileusa. Pojedinci koji "poseduju rizik za razvoj ileusa" obuhvataju, npr. pacijente kojima je neophodna abdominalna hirurška intervencija, bilo daje medicinski indikovana ili je elektivna, i/ili su to oni pojedinci koji boluju od bilo kojih stanja ili povreda koje su opisane u prethodnom pasusu. Iskusni stručnjak zna da rizik od nastanka ileusa može biti određen bilo kojim postupkom koji je poznat u struci, npr. lekar može postaviti dijagnozu.

Pojam "transplantacija" se koristi u predmetnoj specifikaciji kao opšti pojam za opisivanje postupka prenosa organa ili tkiva (npr. tankog creva) u pacijenta. Pojam "transplantacija" je u struci definisan kao prenos živih tkiva ili ćelija iz donora u recipijenta, pri čemu se održava funkcionalni integritet transaplantiranog tkiva ili ćelija u organizmu recipijenta (videti, na primer, The Merck Manual, Berkow, Fletcher & Beers, urednici, Merck Research Laboratories, Rahway, NJ, 1992). Pojam obuhvata sve kategorije transplantacije koje su poznate u struci. Transplantati su kategorizovani po mestu i genetskoj vezi između donora i recipijenta. Pojam obuhvata, na primer, autotransplantaciju (uklanjanje i prenos ćelija ili tkiva sa jednog mesta na telu pacijenta na isto ili drugo mesto na istom pacijentu), alotransplantaciju (transaplantaciju između članova iste vrste) i ksenotransplantaciju (transplantacije između članova različitih vrsta).

Dobij an jegasovitihpreparata

CO preparat može biti gasoviti CO preparat. Komprimovani gas ili gas pod pritiskom koji se može koristiti u postupcima prema predmetnom pronalasku može da se pribavi posredstvom bilo kog komercijalnog izvora, kao i u bilo kom tipu suda koji služi za skladištenje komprimovanog gasa. Na primer, komprimovani gas ili gas pod pritiskom može da se pribavi od bilo kog izvora koji proizvodi komprimovane gasove, kao što je kiseonik, za medicinske primene. Pojam "gas za medicinsku primenu", kao što se ovde koristi, označava gas koji je pogodan za primenu kod pacijenata, kao što je ovde definisano. Gas pod pritiskom, uključujući CO koji se koristi u postupcima prema predmetnom pronalasku, može da se pribavi u obliku u kome se svi gasovi (npr. CO, He, NO, CO2, O2, N2), koji su poželjni u konačnom obliku preparata, nalaze u istom sudu, s tim da NO i O2ne mogu da se skladište zajedno. Opciono, postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se sprovedu korišćenjem više sudova koji sadrže pojedinačne gasove. Na primer, može biti obezbeđen jedan sud koji sadrži CO, sa ili bez drugih gasova, čiji sadržaj može opciono da se meša sa sobnim vazduhom ili sa sadržajem drugih sudova, na primer, sudova koji sadrže kiseonik, azot, ugljen dioksid, komprimovani vazduh ili bilo koji drugi pogodni gas ili smešu gasova.

Gasoviti preparati koji se primenjuju na pacijentu prema predmetnom pronalasku tipično sadrže od 0% do 79% azota (maseni procenti), od oko 21% do oko 100% kiseonika (maseni procenti) i od oko 0,0000001%) do oko 0,3% (maseni procenti) CO (što odgovara od oko 1 ppb ili 0,001 ppm do oko 3000 ppm). Poželjno, količina azota u gasovitom preparatu je oko 79% (maseni procenti), količina kiseonika je oko 21% (maseni procenti), a količina CO je od oko 0,0001%) do oko 0, 25% (maseni procenti). Količina CO.je poželjno najmanje oko 0,001%, na primer, najmanje oko 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% ili 0,24% (maseni procenti). Poželjna količina se nalazi u opsegu od oko 0,005% do oko 0,24%, od oko 0,01% do oko 0,22%, od oko 0,015% do oko 0,20%, od oko 0,08% do oko 0,20%, od oko 0,025% do oko 0,1% (maseni procenti). Primećeno je da gasoviti CO preparati koji poseduju koncentraciju CO veću od 3% (kao što je konc. od 1% ili veća) mogu da se koriste tokom kratkog perioda (npr. jedan ili dva udana), u zavisnosti od primene.

Gasoviti CO preparat može da se koristi za stvaranje atmosfere koja sadrži CO gas. Atmosfera koja sadrži odgovarajuće nivoe CO gasa može da se formira, na primer, obezbeđivanjem suda koji sadrži gas pod pritiskom u kome se nalazi CO i otpuštanjem gasa pod pritiskom iz suda u komoru ili određeni prostor, kako bi nastala atmosfera koja sadrži CO gas unutar komore ili određenog prostora. Alternativno, gasovi mogu da se otpuštaju u aparat koji se završava maskom za disanje ili tubusom za disanje, čime se na taj način stvara atmosfera koja sadrži CO gas u maski ili tubusu za disanje, što obezbeđuje da pacijent bude jedina osoba u prostoriji koja je izložena značajnim nivoima CO.

Nivoi CO u atmosferi mogu da se mere ili prate korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci. Navedeni postupci obuhvataju elektrohemijsku detekciju, gasnu hromatografiju, određivanje radioaktivnosti izotopa, infracrvenu apsorpciju, kolorimetriju i elektrohemijske postupke koji se zasnivaju na selektivnim membranama (videti, na primer, Sunderman et al, Clin. Chem. 28 : 2026 - 2032, 1982; Ingi et al., Neuron 16 : 835 - 842, 1996). Sub-ppm nivoi CO mogu da se detektuju, na primer, gasnom hromato grafijom i merenjem radioaktivnosti radioizotopa. Dalje, u struci je poznato da nivoi CO u sub-ppm opsegu mogu da se mere u biološkom tkivu senzorom za gas koji radi u srednjem infracrvenom delu spektra (videt, na primer, Morimoto et al., Am, J. Phvsiol. Heart Circ. Phvsiol. 280 : H482 - H488, 2001). CO senzori i uređaji za detekciju gasa su široko dostupni kod brojnih komercijalnih izvora.

Dobijanje tečnih preparata

CO preparat takođe može biti tečni CO preparat. Tečni CO preparat može da se dobije bilo kojim postupkom koji je poznat u struci kojim se gasovi čine rastvorljivim u tečnostima. Na primer, tečnost može da se postavi u takozvani "CO2inkubator" i da se izloži kontinuiranom protoku CO, poželjno onom koji je balansiran ugljen dioksidom, sve dok se ne postigne željena koncentracija CO u tečnosti. Drugi primer je propuštanje CO gasa u vidu mehurića direktno kroz tečnost sve do postizanja željene koncentracije CO. Količina CO koja može da se rastvori u datom vodenom rastvoru se povećava sa snižavanjem temperature. Još jedan primer je da odgovarajuća tečnost može da se propušta kroz cev koja dozvoljava gasnu difuziju, pri čemu se cev dovodi u atmosferu koja sadrži CO (na primer, korišćenjem uređaja kao što je membrana ekstrakorporalnog oksigenatora). CO difunduje u tečnost, kako bi nastao tečni CO preparat.

Verovatno je daje takav tečni preparat namenjen korišćenju na živoj životinji i da će njegova temperatura iznositi oko 37 °C u vreme njegove primene.

Tečnost može biti bilo koja tečnost koja je poznata stručnjacima i koja je pogodna za primenu kod pacijenata ili za čuvanje i/ili ispiranje i/ili perfundovanje organa od interesa (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Generalno, tečnost može biti vodeni rastvor. Primeri odgovarajućih rastvora obuhvataju fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS - Phosphate Buffered Saline), Celsior™, Perfadex™, Collins-ov rastvor, rastvor citrata i rastvor Univerziteta u Viskonsinu (Universitv of Wisconsin solution - UWS) (Oxford Textbook of Surgery, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, tečnost je Ringerov rastvor, na primer, Ringer - laktatni rastvor, ili bilo koja druga tečnost koja može da bude primenjena u vidu infuzije kod pacijenta. U drugom rešenju, tečnost obuhvata krv, na primer, punu krv.

Svaka pogodna tečnost može biti zasićena do odgovarajuće koncentracije CO putem uređaja za difuziju gasova. Alternativno, mogu se koristiti prethodno napravljeni rastvori koji su prošli kontrolu kvaliteta o posedovanju odgovarajućih nivoa CO. Precizna kontrola doze može da se postigne merenjima membranom koja je propusna za gas, a koja je nepropusna za tečnost i koja je povezana sa analizatorom za CO. Rastvori mogu biti zasićeni do željenih efikasnih koncentracija koje se održavaju na ovim nivoima.

Tretman pacijenata preparatima ugljen monoksida

Pacijent može biti tretiran sa CO preparatom primenom bilo kog postupka koji je poznat u struci za primenu gasova i/ili tečnosti kod pacijenata. "CO preparati mogu da se primenjuju kod pacijenta kod koga je dijagnostikovan ili za koga je procenjeno da postoji rizik od razvoja ileusa, na primer, kod hirurških pacijenata, uključujući pacijente koji su podvrgnuti SITx. Predmetni pronalazak obuhvata sistemsku primenu tečnih ili gasovitih CO preparata kod pacijenata (na primer, inhalacijom i/ili ingestijom), kao i topijsku primenu preparata na gastrointestinalnom traktu pacijenta (npr. ingestijom, insuflacijom i/ili unošenjem u abdominalnu duplju).

Sistemskaprimena ugljen monoksida

Gasoviti CO preparati mogu da se sistemski primene kod pacijenta, na primer, kod hirurškog pacijenta ili donora i/ili recipijenta pri transplantaciji tankog creva. Gasoviti CO preparati se tipično primenjuju inhalacijom kroz usta ili nosne hodnike do pluća, gde CO može da ispolji svoje dejstvo diretno ili da se brzo apsorbuje u cirkulaciju pacijenta. Koncentracija aktivnog jedinjenja (CO) koja se koristi u terapijskom gasovitom preparatu zavisi od brzine apsorpcije, distribucije, inaktivacije i ekskrecije (generalno, putem respiracije) CO, kao i od drugih činilaca koji su poznati stručnjacima. Treba dalje primetiti da kod svakog subjekta, tokom vremena, specifični dozni režimi treba da budu podešeni shodno individualnim potrebama i profesionalnoj proceni osobe koja primenjuje ili koja nadgleda primenu preparata, a takođe treba primetiti da su ovde navedeni opsezi koncentracija isključivo ilustrativne prirode i da ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite ili primenu preparata prema predmetnom pronalasku. Obimom zaštite predmetnog pronalaska su obuhvaćene akutna, subakutna i hronična primena CO, što zavisi, na primer, od ozbiljnosti ili trajanja ileusa kod pacijenta. CO može da se primeni kod pacijenta tokom vremena (uključujući i neograničeno dugu primenu) koje je dovoljno za lečenje stanja i za ispoljavanje željenog farmakološkog ili biološkog dejstva.

Slede primeri nekih od postupaka i uređaja koji se mogu koristiti za primenu gasovitih preparata CO kod pacijenata.

Respiratori

CO za medicinske primene (koncentracije mogu da variraju) može da se naruči pomešan sa vazduhom ili drugim gasom koji sadrži kiseonik u standardnom rezervoaru za komprimovani gas (npr. smeša 21% O2i 79% N2). Gas je nereaktivan, a koncentracije koje su potrebne za postupke prema predmetnom pronalasku se nalaze dosta ispod granice zapaljivosti ( 10% u vazduhu). U bolničkom okruženju, gas se verovatno primenjuje uz krevet pacijenta, gde se meša sa kiseonikom ili sobnim vazduhom, u posudi za mešanje, do postizanja željene koncentracije izražene u ppm (delovi na milion). Pacijent inhalira gasnu smešu putem respiratora, kod koga je brzina protoka podešena u odnosu na komfor i potrebe pacijenta. Ovo se određuje na osnovu grafikona plućnih funkcija (tj. frekfence disanja, zapremine udana i izdana itd.). Na sistemu za primenu se mogu dizajnirati sigurnosni mehanizmi koji bi sprečili da pacijent nepotrebno primi veću količinu CO od željene. Nivo CO koji pacijent prima može se pratiti posmatranjem: (1) karboksihemoglobina (COHb), koji se određuje u venskoj krvi i (2) izdahnutog CO koji se prikuplja na sporednom portu respiratora. Izlaganje CO može da se podesi na osnovu zdravstvenog stanja pacijenta i na osnovu drugih pokazatelja. Ukoliko je potrebno, CO može biti istisnut iz organizma pacijenta primenom inhalacije sa 100% O2. CO se ne metaboliše; stoga, količina koja se udahne će na kraju biti potpuno izdahnuta, izuzev veoma malog procenta koji se prevede u CO2. CO može da se meša u bilo kom odnosu sa O2, kako bi se obezbedila terapijska primena CO bez posledičnih hipoksičnih stanja.

Maska za lice i šator za inhalaciju

Gasovita smeša koja sadrži CO može da se pripremi kao što je gore navedeno kako bi se omogućila pasivna inhalacija od strane pacijenta koji koristi masku za lice ili šator za inhalaciju. Koncentracija koja se inhalira može da se menja i može biti istisnuta iz organizma pacijenta prostim prebacivanjem na 100%) O2. Praćenje nivoa CO može da se izvede na ili blizu maske ili šatora uz sigurnosni mehanizam koji sprečava da suviše velika koncentracija CO bude inhalirana.

Prenosivi inhalator

Komprimovani CO može da se upakuje u prenosivi uređaj za inhalaciju i da bude inhaliran u odmerenoj dozi, na primer, kako bi se obezbedio intermitentni tretman kod recipijenta koji se ne nalazi u bolničkim uslovima. U kontejnere mogu biti uskladištene različite koncentracije CO. Uređaj može biti jednostavan, u obliku malog rezervoara (npr. nosivosti ispod 5 kg) sa odgovarajuće razblaženim CO, sa ventilom za otvaranje/zatvaranje i sa cevkom iz koje pacijent uzima udah CO prema standardnom režimu ili po potrebi.

Intravenska veštačka pluća

Veštačka pluća (uređaj u vidu katetera za izmenu gasova u krvi) koji je dizajriiran za dopremanje O2i uklanjanje CO2, može biti upotrebljen za dopremanje CO. Kada je implantiran, kateter se nalazi u jednoj od većih vena i sposoban je za dopremanje CO u datim koncentracijama sistemski ili lokalno. Dopremanje može biti lokalno dopremanje visokih koncentracija CO tokom kratkog perioda na mestu izvođenja intervencije, npr. u blizini tankog creva (ova visoka koncentracija brzo biva razblažena u cirkulaciji) ili tokom dužeg perioda u niskoj koncentraciji (videti, na primer, Hattler et al., Artif. Organs 18 (11) : 806 - 812 (1994); i Golob et al., ASAIO J., 47 (5): 432 - 437 (2001)).

Komora sa normalnim pritiskom

U određenim slučajevima, poželjno je da se čitav pacijent izloži dejstvu CO. Pacijent treba da se nalazi unutar hermetički zatvorene komore u koju je ubačen CO (u koncentraciji koja ne ugrožava pacijenta, ili u koncentraciji koja nosi prihvatljiv rizik, bez rizika da posmatrači budu izloženi dejstvu gasa). Nakon okončanja izloženosti, komora može biti isprana vazduhom (npr. 21% O2, 79% N2), a uzorci mogu biti analizirani primenom CO analizatora, kako bi se osiguralo da CO nije ostao u komori pre nego se pacijent izvede iz sistema za izlaganje.

Sistemska primena tečnih CO preparata

Predmetni pronalazak dalje obuhvata stvaranje tečnih CO preparata za sistemsku primenu kod pacijenta, npr. infuzijom. Na primer, tečni CO preparati, kao što je Ringerov rastvor zasićen sa CO, mogu da se primene infuzijom kod pacijenta pre, tokom i/ili nakon hirurške intervencije. Alternativno, ili kao dodatak, kod pacijenta može da se primeni i puna krv (ili njene frakcije) koja je delimično ili potpuno zasićena sa CO. Predmetni pronalazak takođe obuhvata primenu sredstava koja su sposobna za dopremanje doza CO gasa ili tečnosti (npr. gume, kremovi, masti ili flasteri koji otpuštaju CO).

Topijski tretman gastrointestinalnog trakta ugljen monoksidom

Alternativno, ili kao dodatak, CO preparati mogu da se primene direktno u gastrointestinalnom traktu, npr. unutar i/ili izvan celog gastrointestinalnog trakta, ili na nekom njegovom delu. Gasoviti preparat može da se primeni direktno na gastrointestinalni trakt pacijenta, na primer, kod Mrurškog pacijenta ili donora ili recipijenta kod transplantacije tankog creva, primenom bilo kog postupka u struci koji se koristi za insuflaciju gasova kod pacijenta. Na primer, gasovi, kao ugljen dioksid, se često insufliraju u gastrointestinalni trakt i u abdominalnu duplju pacijenta, kako bi olakšali pregled tokom endoskopskih i laparoskopskih procedura, respektivno (videti, na primer, 6xford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Iskusni stručnjak zna da se slične procedure mogu primeniti za dopremanje CO preparata direktno u gastrointestinalni trakt pacijenta. Predmetni pronalazak takođe može da se primeni radi sprečavanja nastanka ileusa koji nastaje kao posledica laparoskopije ili endoskopije, npr. kolonoskopije i ezofagogastroduodenoskopij e.

Vodeni CO preparati takođe mogu da se primene topijski u gastrointestinalnom traktu pacijenta. Vodeni oblici preparata mogu da se primene korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci za primenu tečnosti kod pacijenta Kao i u slučaju gasovitih preparata, vodeni preparati mogu da se primene direktno u unutrašnjosti i/ili spolja na gastrointestinalni trakt. Na primer, vodeni oblik preparata može da se primeni oralno, na primer, tako što pacijent proguta enkapsuliranu ili ne-enkapsuliranu dozu vodenog CO preparata. U drugom primeru, tečnosti, na primer, fiziološki rastvor koji sadrži rastvoreni CO, može da se injektira u gastrointestinalni trakt i u abdominalnu duplju pacijenta tokom endoskopskih i laparoskopskih procedura, respektivno. U kontekstu SITx, izlaganjeinsitu može da se izvede primenom bilo kog postupka koji je poznat u struci, npr. puteminsitu ispiranja organa tečnim CO preparatom, pre uklanjanja iz donora (videti Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)).

Ex vivo čuvanje organa pri transplantaciji tankog creva

Preparati sa CO mogu da se koriste za lečenja pacijenata koji se podvrgavaju transplantaciji bilo kog dela gastrointestinalnog trakta, npr. transplantaciji tankog creva (SITx

- Small intestine transplantation). U kontekstu transplantacionih procedura, preparati sa CO se mogu koristiti za lečenje donora, recipijenata i/ili samog organa tokom bilo kog od koraka preuzimanja, skladištenja organa i same transplantacije. Organ gastrointestinalnog trakta može biti preuzet iz donora, tretiran preparatom sa COex vivoshodno postupku, prema predmetnom pronalasku, i transplantiran u recipijenta. Alternativno, ili kao dodatak, organ može biti tretiranin situ,dok j još u donora. Opciono, preparat sa CO može biti primenjen na recipijentu pre, tokom i/ili nakon liirurške intervencije, npr. nakon reperfundovanja organa sa

krvlju recipijenta. Preparat sa CO može biti primenjen na dodnru pre ili tokom procesa prikupljanja organa.

Ex vivoizlaganje tankog creva (ili njegovog dela) ugljen monoklsidu može da se ostvari izlaganjem tankog creva atmosferi koja sadrži CO gas, izlaganjem tečnom preparatu CO, npr. tečnom perfuzatu, rastvoru za skladištenje ili rastvoru za ispiranje koji sadrži rastvoreni CO, ili na oba načina.

Izlaganje tankog creva gasovitim preparatima CO može se izvesti u bilo kojoj komori ili u području koje je pogodno za stvaranje atmosfere koja sadrži odgovarajuće nivoe CO gasa. Takve komroe obuhvataju, na primer, inkubatore i komore koje su izgrađene za skladištenje organa u rastvoru za prezervaciju. Odgovarajuća komora može biti komora u kojoj su gasovi koji se u njoj nalaze prisutni isključivo u unutrašnjoj atmosferi, tako da koncentracija CO može da se uspostavi i održava na datoj vrednosti i sa datim stepenom čistoće, npr. to je komora koja je hermetički zatvorena. Na primer, za izlaganje organa preparatu sa CO može da se koristi CO2inkubator, pri čemu se CO gas dovodi kontinuiranim tokom iz suda koji sadrži gas.

Izlaganje organa tečnim preparatima CO može da se izedeex vivokorišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci. Na primer, izlaganje može da se izvedeex vivou bilo kojoj komori ili prostoru koji poseduje zapreminu dovoljnu za potapanje organa, kompletno ili delimilno, u preparat sa CO. Drugi primer izlaganja organa preparatu sa CO jeste postavljanje organa u odgovarajući kontejner i omogućavanjem da preparat sa CO ispira organ, tako da se organ izlaže kontinuiranom toku preparata sa CO.

Drugi primer je perfundovanje organa preparatom sa CO. Pojam "perfuzija" je poznat u struci i odnosi se na propuštanje tečnosti, npr. preparata sa ugljen monoksidom, kroz krvne sudove organa U kontekstu gastrointestinalnog trakta, pojam obuhvata ispiranje lumena creva preparatom sa ugljen monoksidom. Postupci za perfuziju organaex vivoiin situsu dobro poznati u struci. Organ može biti perfundovan preparatom sa COex vivo,na primer, putem kontinuirane hipotermijske mašinske perfuzije (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, Oxford Universitv Press (1994)). Opciono, kodin situperfuzije, organ može biti perfundovan rastvorom za ispiranje, npr. UW rastvorom bez ugljen monoksida, pre perfuzije preparatom sa CO, kako bi se uklonila krv donora iz organa. Takav postupak treba da se izvodi u cilju izbegavanja kompeticije za CO od strane hemoglobina donora. Kao druga mogućnost, rastvor za ispiranje može biti preparat sa CO.

Sledeći primer je postavljanje organa, npr. potapanje, u podlogu ili u rastvor koji ne sadrži ugljen monoksid i postavljanje u komoru u kojoj podloga ili rastvor mogu da se transformišu u preparat sa CO putem izlaganja atmosferi koja sadrži ugljen monoksid, kao što je ovde opisano. Jod jedan primer je potapanje organa u tečnost koja ne sadrži ugljen monoksid, a potom se ovaj gas može propustiti u vidu megurića kroz tečnost.

Tanko crevo može da se dobije iz donora i da se transplantira bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjacima (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, Oxford Universitv Press (1994)). Vešti stručnjak shvata da postupci transplantacije i/ili prikupljanja organa za transplantaciju mogu da budu različiti u zavisnosti od mnogih okolnosti, kao što su starostna dob donora/recipijenta.

Predmetni pronalazak obuhvata izlaganje putem bilo kog ili putem svih gore navedenih postupaka izlaganja organa tečnom preparatu sa CO, npr. putem ispiranja, potapanja ili perfundovanja, tokom date SITx procedure.

Korištenje hemoksigenaze- 1 i drugih jedinjenja

Predmetni pronalazak takođe obuhvata indukciju ekspresije hemoksigenaze-1 (HO-1) zajedno sa primenom CO. U kontekstu SITx, HO-1 može biti opciono indukovana u organu, donoru organa, recipijentu ili u sva tri slučaja, zajedno sa primenom CO. Na primer, HO-1 može biti indukovana u donoru, npr. pre ili tokom uklanjanja organa, u samom organuex vivoi/ili u recipijentu pre, tokom ili nakon transplantacije. U kontekstu drugih intervencija (tj. onih koje nisu u vezi sa transplantacijom) kod kojih je verovatnoća razvoja ileusa velika, HO-1 treba da bude indukovana u crevima kratko vrme pre, tokom ili ubrzo nakon intervencije. Kao što se ovde koristi, pojam "indukovati (indukovan)" označava povećanje proizvodnje proteina, na primer, HO-1, u izolovanim ćelijama ili u ćelijama tkiva, organa ili organizma životinje, korišćenjem ćelijskog endogenog (npr. ne-rekombinantnog) gena koji kodira dati protein.

Ekspresija HO-1 može biti indukovana kod pacijenta bilo kojim postupkom poznatim u struci. Na primer, ekspresija HO-1 može biti indukovana heminom, gvožđe protoporfirinom ili kobalt protoporfirinom. Takođe, različita sredstva koja se razlikuju od hema, u koja spadaju teški metali, citokini, hormoni, NO, COCI2, endotoksin i toplotni udar, predstavljaju snažne induktore ekspresije HO-1 (Otterbein et al., Am. J. Phvsiol. Lung Cell Mol. Phvsiol. 279 : L1029 - L1037, 2000; Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15 : 9 - 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 : 517 - 554, 1997; i Tenhunen et al., J. Lab,. Clin. Med. 75 : 410 - 421, 1970). Ekspresija HO-1 je takođe snažno indukovana raznim sredstvima i stanjima koja izazivaju oksidativni stres, uključujući vodonik peroksid, supstance koje smanjuju količinu glutationa, UV radijaciju i hiperoksiju (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9- 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 : 517 - 554, 1997; i Keyse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 99 - 103, 1989). Pojam "farmaceutski preparat koji sadrži induktor HO-1" označava farmaceutski preparat koji sadrži neko od sredstava koje je sposobno da indukuje ekspresiju HO-1 kod pacijenta, na primer, neko od sredstava koja su opisana gore, npr. hemin, gvožđe protoporfirin i/ili kobalt protoporfirin.

Ekspresija HO-1 u ćeliji može biti povećana transferom gena. Kao što se ovde koristi, pojam "ekspresija (eksprimiran)" označava povećanje proizvodnje proteina, npr. HO-1 ili feritina, u izolovanim ćelijama ili u ćelijama tkiva, organa ili organizma životinje, korišćenjem egzogeno primenjenog gena (npr. rekombinantnog gena). Poželjno je da HO-1 ili feritin budu poreklom iz iste vrste (npr. od čoveka, miša, pacova itd.) kojoj pripada recipijent, kako bi se verovatnoća imune reakcije svela na minimum. Ekspresija može da se pokrene konstitutivni promoterom (npr. citomegalovirusnim promoterima) ili tkivno specifičnim promoterom (npr. promoterom proteina tečne komponente mleka koji proizvode ćelije mlečne žlezde ili albuminskim promoterom ćelija jetre). Odgovarajući vektor za gensku terapiju (npr. retrovirus, adenovirus, virus udružen sa adeno virusom (AAV - Adeno Associated Virus), poks virus (npr. virus vakcinije), HIV, minutni virus miša, virus hepatitisa B, virus influence, herpes simpleks virus 1 i lentivirus) koji kodira HO-1 ili feritin, može da se primeni kod pacijenta oralno, inhalacijom ili injekcijom u crevni zid, lumen creva ili u abdominalnu duplju bilo kada pre, tokom i/ili nakon intervencije koja izaziva ileus, nprr 24 časa pre ili neposredno pre intervencije koja izaziva ileus. Slično tome, plazmidni vektori koji kodiraju HO-1 ili apoferitin mogu da se primene, na primer, u vidu gole DNK, ili lipozomima ili u mikročesticama.

Dalje, egzogeni HO-1 protein može direktno da se primeni kod pacijenta bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Egzogeni HO-1 može da bude direktno primenjen kao dodatak, ili kao alternativa, uz indukciju ekspresije HO-1 kod pacijenta kao što je opisano gore. HO-1 protein može da se primeni kod pacijenta, na primer, u vidu lipozoma i/ili fuzionog proteina, npr. u vidu TAT-fuzionog proteina (videti, na primer, Becker-Hapak et al., Methods 24:247-256, 2001).

Alternativno, ili kao dodatak, bilo koji od metabolita HO-1, na primer, bilirubin, biliverdin, gvožđe i/ili feritin, može da se primeni kod pacijenta zajedno sa CO kako bi se sprečio nastanak ili da bi se lečio ileus. Dalje, predmetni pronalazak obuhvata molekule koji vezuju gvožđe, a koji se razlikuju od feritina, npr. desferoksamin (DFO), gvožđe dekstran i/ili apoferitin, koji se mogu primeniti kod pacijenta. Dalje, predmetni pronalazak podrazumeva da enzimi (npr. biliverdin reduktaza) koji katalizuju razgradnju do bilo kog od ovih proizvoda mogu biti inhibirani u cilju stvaranja/pospešivanja željenog dejstva. Sva gore navedena sredstva mogu biti primenjena, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno ili direktno unutar ili van creva.

Predmetni pronalazak podrazumeva da jedinjenja koja otpuštaju CO u telu nakon primene (npr. jedinjenja koja otpuštaju CO, npr. fotoaktivirajuća jedinjenja koja otpuštaju CO), na primer, dimangan dekakarbonil, trikarbonildihlororutenijum (II) dimer i metilen hlorid (npr. u dozi između 400 i 600 mg/kg, npr. oko 500 mg/kg), mogu takođe biti upotrebljena u postupcima prema predmetnom pronalasku, kao što je to slučaj sa karboksihemoglobinom i supstituentima hemoglobina koji vezuju CO.

Gore navedena sredstva mogu da budu primenjena na bilo koji način, na primer, oralno, intraperitonealno, intravenski ili intraarterijski. Svako od gore nevdenih jedinjenja može da se primeni kod pacijenta lokalno i/ili sistemski, kao i u bilo kojoj kombinaciji.

Predmetni pronalazak dalje obuhvata lečenje ileusa primenom CO kod pacijenta u kombinaciji sa funkcionalnom stimulacijom intestinalnog trakta pacijenta, npr. sa primenom omekšivača stolice, laksativa i/ili lubriklanata; i/ili sa primenom intravenske hidracije i/ili nazogastrične dekompresije. CO može biti primenjen u kombinaciji sa bilo kojim drugim poznatim postupcima ili preparatima za lečenje ileusa.

Predmetni pronalazak je delimično ilustrovan primerima koji slede i koji ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Primeri

Primer 1: Zaštitni efekat CO kod ileusa koji je indukovan transplantacijom

Životinje

Od Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapoiis, IN) su naručeni mužijaci LEW (RT1) pacova koji su dobijeni međusobnim ukrštanjem, čija je masa 200 - 300 g, držani su u kavezima sa laminarnim tokom vazduha na Univerzitetu Pittsburgh. Životinje su hranjene standardnom dijetomad libitum.

Transplantacija tankog creva

Da bi se utvrdilo protektivno dejstvo CO protiv ileusa koji je udružen sa transplantacijom tankog creva, kod singenih Levvis pacova je izvedena ortopična SITx. SITx sa kavalnom drenažom je izvedena korišćenjem prethodno opisane procedure. Čitavo tanko crevo donora od Treitzovog ligamenta do ileoceklanog zalistka je izolovano na vaskularnoj peteljci zajedno a segmentom aorte. Presadak je perfundovan putem aortnog segmenta sa 5 ml Ringer - laktata, a lumen creva je ispran sa 20 ml hladnog fiziološkog rastvora koji sadrži 0,5% neomicin sulfat (Sigma, St. Louis, MO). Uspostavljene su terminalno - postranične anastomoze između presatka aorte i infrarenalne aorte recipijenta, kao i između vene porte presatka i vene kave ecipijenta, korišćenjem 10-0 Novafil™ šavova. Vreme hladne ishemije je 1 čas. Čitavo crevo recipijenta je uklonjeno, a kontinuitet creva je uspostavljen proksimalnim i distalnim termino-terminalnim intestinalnim anastomozama. Životinje - recipijenti su primile profilaktičku dozu cefamandol nafata od 20 mg/dan tokom 3 postoperativna dana. Recipijenti su dobili vodu 3 časa nakon hirurške intervencije, a hranu su 24 časa nakon intervencije.

Eksperimentalne grupe

U ovoj studiji su ispitivane četiri grupe životinja, od kojih je kod dve primenjena SITx. Grupu jedan čine neoperisane životinje. Grupu 2 čine životinje koje su izložene dejstvu CO i koje nisu operisane. Grupa 3 je podvrgnuta singenoj SITx, a recipijenti su držani na sobnom vazduhu. Grupu 4 čine recipijenti SITx, koji su postavljeni u komoru sa CO tokom 1 časa pre intervencije, a zatim su ponovo izloženi dejstvu CO neposredno nakon intervencije, sve do vremena kada su žrtvovani. U grupama 3 i 4 kao donori su poslužili normalni LEW pacovi.

Izlaganje dejstvu CO

Životinje su izložene dejstvu CO u koncentraciji od 250 ppm. Ukratko, 1% CO u vazduhu je pomešan sa vazduhom (21% O2) u cilindru za mešanje od nerđajućeg čelika, a zatim je smeša prebačena u staklenu komoru za izlaganje zapremine 3,70 ft<3>, pri brzini protoka od 12 l/min. Za konstantno određivanje nivoa CO u komori je korišćen CO analizator (Interscan, Chatsvvorth, CA). Koncentracija CO je održavana na 250 ppm čitavo vreme. Životinjama je obezbeđena hrana i voda za vreme izlaganja.

Funkcionalne studije

Dejstvo tretmana sa CO na crevni dismotilitet kod transplantiranih presadaka je procenjivano iin vitroiin vivo.Tkiva su prikupljena nakon 24 i 48 časova pole operacije, jer je pokazano da su ovo vremenski trenuci u kojima je transplantacijom izazvani dismotilitet najizraženiji. Mehanička mišićna aktivnost kružnog mišićnog slojain vitroje merena kao što je ranije opisano (Eskandari et al, Am. J. Phvsiol. 273 (3 Pt 1) : G727 - 34 (1997)). Pacovi su anestezirani i žrtvovani eksangvinacijom nakon 24 časova posle operacije. Segment srednjeg jejunuma je postavljen u graduisani Svlgaard™ disekcioni sud koji sadrži prethodno oksigenisani Krebs - Ringer - bikarbonatni pufer (KRB; koncentracije u mM: 137,4 Na<+>, 5,9 K<+>, 2,5 Ca<2+>, 1,2 Mg<2+>, 134 Cl", 15,5 HC03", 1,2 H2P04" i 11,5 glukoza) koji je ekvilibrisan smešom 97% O2i 3% CO2. Cevo je otvoreno duž mezenerijalne ivice, a mukoza je uklonjena preparacijom finom pincetom. Delovi mišićnog sloja pune debljine (1x6 mm) su isečeni paralelno sa kružnim mišićnim slojem. Isečci mišićnog sloja su postavljeni u standardne horizontalne mehaničke komore za organe koje su kontinuirano spajane sa preoksigeniranim KRB na 37 °C. Jedan kraj svakog isečka je ligaturom prikačen za fiksirano postolje, a drugi za prevodilac izometrijske sile (WPI, Sarasota, FL). Isečci su ostavljeni da se ekvilibriraju tokom 1 časa, nakon čega su inkrementno rastezani do dužine pri kojoj se javlja maksimalna spontana kontrakcija (Lo). Nakon drugog perioda ekvilibracije od 30 minuta, napravljene su krive kontraktilnosti izlaganjem tkiva rastućim koncentracijama muskarinskog antagoniste betanehola (0,3 do 300 uM) tokom 10 minuta, nakon čega je usledio period ispiranja od 10 minuta. Kontraktilna aktivnost je izračunata kao integral površine ispod krive, normalizovano prevođenjem telesne mase i dužine isečka na kvadratne milimetre tkiva (1,03 mg/mm<2>) i što je izraženo kao g/s/mm .

Crevni tranzit je meren kod kontrolnih +životinja i kod životinja kojima je manipulisano nakon 48 časova od operacije procenjivanjem crevne distribucije fluoresceinom obeleženog dekstrana (Molecular Probes). Životinje su blago sedirane inhaliranjem izoflurana i peroralno su hranjene obeleženim dekstranom (200 ul rastvora konc. 6 mg/ml u fiziološkom rastvoru). Dva časa nakon primene, životinje su žrtvovane, a čitav gastrointestinalni trakt, od želuca do distalnog kolona, je izvađen. Ispitan je sadržaj želuca, tankog creva (podeljeno u 10 segmenata jednake dužine), cekuma i kolona (tri segmenta: proksimalni, srednji i distalni), postavljen je u 2 ml fiziološkog rastvora, energično je promešan kako bi se oslobodio dekstran koji je prisutan u svakom segmentu. Nakon usitnjavanja crevnog tkiva i crevnog sadržaja, jednake količine supernatanta su ošitavane u duplikatu na čitaču za ploče (CvtoFluor II; talasna dužina ekscitacije 530 nm, a emisije 590 nm) radi kvantifikacije fluorescentnog signala u svakom segmentu creva. Histogram medijane fluorescentnog signala je zatim iscrtan, kako bi se pokazale promene u distribuciji obeleženog dekstrana u različitim eksperimentalnim grupama. Crevni tranzit je određen radi statističke analize izračunavanjem geometrijskog centra (GC).

Morfološke studije

Histološke studije

Tkivo presađenih tankih creva je fiksirano u 10% puferovanom formalinu i ubačeno u parafin. ISečeni su preseci debljine 4 um, koji su obojeni hematoksilinom i eozinom.

Histohemijski postupci sa mijeloperoksidazom

Delovi mišićnog sloja pune debljine dobijeni iz srednjeg dela tankog creva su prikupljeni nakon 24 časa od operacije. Segmenti creva su potopljeni u KRB u graduisanoj Sylgaard™ staklenu posudu i prikačeni su bez istezanja duž mezenterijalne ivice. Dužina i širina segmenata je merena lenjirom. Zatim je otovoren kolon duž mezenterijalne ivice i istegnut je 150% po dužini i 250% po širini. Mukoza i submukoza su uklonjene koriđćenjem fine pincete, a ostatak tkiva je fiksiran u 100% denaturisanom etanolu tokom 30 minuta. Nakon ispiranja nekoliko puta sa PBS, tkivo je tretirano Hanker - Yates reagensom radi detekcije polimorfonuklearnih neutrofila (PMN) koji pokazuju mijeloperoksidaznu (MPO) aktivnost (Sheibani et al., Am. J. Clin. Pathol. 75 (3) : 367 - 70 (1981)). Tkiva su postavljena na staklene pločice korišćenjem Gel/MountTM (Biomedia Corp., Foster City, CA), prekrivena su pokrovnim staklom i posmatrana su pod svetlosnim mikroskopom (Nikon FXA, Fryer, Huntlev, IL) pri uveličanju od 200x. Broj MPO-pozitivnih PMN koji infiltriraju spoljašnji deo mišićnog sloja je određen na osnovu srednje vrednosti sa 5 do 6 optičkih polja koja se nalaze između mezenteričke i anti-mezenteričke ivice.

Molekularno- biološke studije

RNKaza zaštitni test ( RZT)

Da bi se izvela sekvencijalna analiza ekspresije iRNK citokina u mukozi i mišićnom sloju, izvodi se RNKaza zaštitni test sa Riboquant™ setom (Pharmingen) prema protokolu proizvođača. Radioaktivno obeležene višestruke antisens RNK probe su sintetisane korišćenjemin vitroseta za transkripciju i seta za osnovu većeg broja pacovskih citokina (rCK-1), koji obuhvata probe za citokine ( IL-1 a, IL-1 (3, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-a, TNF-p i IFN-y) i esencijalne (housekeeping) gene (L32 i GAPDH). Probe koje su obeležene sa j2P (8,0 x IO<3>cpm) i RNK uzorka (5 u.g) su hibridizovani korišćenjem RPA seta (Pharmingen). Zaštićeni segmenti su postavljeni na 40%> poliakrilamidni gel. Urađena je autoradiografija korišćenjem Phosphorlmager™ sistema (Molecular Dynamics, Krefeld, Nemačka). Kvantifikacija radioaktivnosti traka iRNK je urađena sa NIH Image, normalizovana je za GAPDH i izražena kao odnos citokin/GAPDH (N = 3-4).

SYBR green RT- PCR u realnom vremenu

Efekti inhalacije CO na transplantacijom indukovanu ekspresiju pro-inflamatornih i anti-inflamatornih gena su određivani u ekstraktima mišićnog sloja pomoću RT-PCR. Spoljašnji deo mišićnog sloja je prikupljen iz normalnih creva i iz transplantiranih presadaka četiri časa nakon operacije i brzo zaleđen u tečnom azotu. Ovaj trenutak nalazi se u opsegu maksimalne ekspresije medijatora inflamacije koja se javlja izmežu 3 i 6 časova nakon abdominalne hirurške intervencije. Ekstrakcija ukupne RNK je izvedena korišćenjem guanidium-tiocijanat fenol-hloroform postupka ekstrakcije, kao što je ranije opisano (Eskandari et al, Am. J. Clin. Pathol. 75 (3) : 367 - 370 (1997)). RNK sačma je resuspendovana u resuspenzionom rastvoru u kome je RNK zaštićena (Ambion Inc., Austin, TX), a zatim je uklonjena potencijalno kontaminirajuća DNK tretiranjem sa DNKazom I (DNA-Free Kit, Ambion Inc., Austin, TX). Jednaki delovi (5 u.g) ukupne RNK iz svakog uzorka su kvantifikovani spektrofotometrijom (talasna dužina 250 nm) i podeljeni na jednake delove sa koncentracijom od 40 ng/ul. Maksimalna vrednost ekspresije iRNK je određivana u duplikatu pomoću dvostepene SYBR Green RT-PCR u realnom vremenu. GAPDH je korišćen kao endogena referenca. Jednake količine RNK su izložene sintezi prvog lanca komplementarne DNK (cDNK) korišćenjem slučajno izabranih heksamera (PE Applied Biosvstems, Foster City, CA) i Super Script II™ (Life Technologies, Rockville, MD). Prajmer sekvence su dobijene iz literature ili su dizajnirane prema objavljenim sekvencama (Tabela 1). PCR reakciona smeša je pripremljena korišćenjem SYBR Green PCR Ćore Reagents (PE Applied Biosvstems). Svaki od uzoraka je procenjivan u duplikatu korišćenjem uslova koji su preporučeni od strane proizvođača. Reakciona smeša je inkubirana na 50 °C tokom 2 minuta, kako bi se aktivirala uracil N'-glikozilaza, a zatim tokom 12 minuta na 95 °C, kako bi se aktivirala Amplitaq Gold™ polimeraza,nakon čega sledi 40 cilusa na 95 °C tokom 15 sekundi i na 60 °C tokom 1 minuta na ABI PRISM 7700™ sistemu za detekciju .sekvence (PE Applied Biosvstems, Foster City, CA). Podaci dobijeni putem PCR tehnike u realnom vremenu su ucrtani kao ARnfluorescentnog signala u funkciji broja ciklusa. Dogovoreni prag je podešen na srednji linearni deo ARngrafa ciklusa u logaritamskoj razmeri. Ciklus praga (C-r) je definisan kao broj ciklusa pri kome ARnprelazi prag. Kvantifikacija ekspresije iRNK je normalizovana za GAPDH i izračunata u odnosu na kontrolu korišćenjem komparativnog Ctpostupka (Schmittgen et al, J. Biochem. Biophvs. Methods 46 (1 - 2): 69 - 8 (20000)).

Kako bi se tokom PCR amplifikacije isključila kontaminacija genomskom DNK, u svakoj PCR reakciji su korišćene RT-negativne kontrole (uzorci koji sadrže RNK koja nije reverzno transkribovana). Analize krivih topljenja su izvedene za svaku od reakcija, kako bi se osigurala amplifikacija specifičnog proizvoda. Dodatno, prajmeri su podvrgnuti elektroforezi na gelu, da bi se povrdilo odsustvo nespecifičnih traka i da bi se potvrdilo da su amplifikovani segmenti odgovarajuće dužine. Efikasnost PCR-amplifikacije ciljane cDNK je ispitivana kako bi se izmerila kolinearnost razblaženja. Napravljena su serijska trostruka razblaženja u triplikatu. Generisane su standardne krive ucrtavanjem CTvrednosti u funkciji relativnog ulaznog broja kopija. Nagibi standardnih krivih od -3,2 ± 0,3 sa koeficijentima korelacije od 0,99 su smatrani prihvatljivim, sa odgovarajućim stopama efikasnosti od 100 ± 10%.

Norther Blott analiza HO- 1

Northern Blott analiza je izvedena kao što je prethodno opisano (Camhi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 13 : 387 - 398 (1995)). Ukratko, 10 ug ukupne RNK, ekstrahovane iz tkiva na način koji je opisan gore, podvrgnuto je elektroforezi u 1% agaroza gelu, a zatim je prebačeno na najlonske membrane kapilarnim dejstvom. Najlonske membrane su zatim prehibridizovane u puferu za hibridizaciju (1% goveđi serumski albumin (BSA), 7% SDS, 0,5 M P04pufer, pH 7,0 i 1 mM EDTA) na 65 °C tokom 2 časa, a zatim je usledila hibridizacijasaHO-1 cDNK pacova koja je obeležena sa<32>P, sa oligonukleotidnom probom na L-feritin pacova koja je obeležena sa<32>P ili oligonukleotidnom probom za pacovski H-feritin koja je obeležena sa<32>P, na 65 °C tokom 24 časa. Najlonske membrane su potom dva puta isprane u puferu A (0,5% BSA, 5% SDS, 40 mM P04pufer, pH 7,0 i 1 mM EDTA) tokom 15 minuta na 65 °C, a potom tri puta u puferu B (1% SDS, 40 mM P04pufer, pH 7,0 i 1 mM EDTA) tokom 15 minuta na 65 °C.

Proba za cDNK HO- 1

Pacovska cDNK (pHOl) pune dužine je velikoduđno obezbeđena od dr S. Shibahara sa Tohoku Univerziteta (Sendai, Japan). pHOl je subklonirana u pBluescript vektor, pa je izvedena Hindlll/EcoRI digestija, kako bi se izolovao HO-1 cDNK insert od 0,9 kb iz Bluescript vektora. Kako bi se kontrolisale varijacije u količini RNK u različitim uzorcima ili greške u nanošenju, blotovi su hibridizovani sa oligonukleotidnom probom koja odgovara 18S rRNK. Sintetisan je oligonukleotid od 24 baznih parova (5'-ACGGTATCTGATCGTCTTCGAACC-3'; sekvenca čiji je ID broj 17) koja je komplementarna sa 18S RNK, korišćenjem DNK aparata za sintezu (Applied Biosvstems, Foster City, CA). HO-1 cDNK je obeležena sa [<j2>P] CTP korišćenjem slučajno izabranog seta prajmera nabavljenog od Boehringer Mannheim (Mannheim, Nemačka). Sve oligonukleotidne probe su obeležene sa [<32>P] ATP na 3' kraju sa terminalnom deoksinukleotidiltransferazom (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Autoradiografski signali su upoređeni sa 18S rRNK dobijenom iz istog blota.

Određivanje nivoa citokina u serumu

Uzorci seruma su sekvencijalno uzeti nakon 1, 4 i 24 časa od reperfuzije i uskladišteni su na -80 °C radi evaluacije. Serumske koncentracije citokina, uključujući IL-6, IL-10 i TNFa, su određene korišćenjem setova pacovskih sa enzimom povezanih imuno-testova (ELISA), po uputstvu proizvođača (R&D, Cambridge, MA).

Merenje serumskih nivoa nitrita/ nitrata

Kako bi se pratili stabilni krajnji proizvodi metabolizma NO, mereni su serumski nivoi nitrita/nitrata nakon 1, 4 i 24 časa, korišćenjem komercijalno dostupnih setova za testiranje (Cayman, Ann Arbor, MI), a kvantifikacija je rađena prema uputstvu proizvođača. U ovom sistemu testiranja, nitrat se redukuje do nitrita korišćenjem nitrat reduktaze, a koncentracija nitrita u uzorku se nakon toga meri korišćenjem Griess-ove reakcije.

Kultura mišićnih ćelija

Tanko crevo kontrolnih pacova i pacova koj su podvrgnuti transplantaciji je uklonjeno (u sterilnim uslovima) nakon 24 časa od operacije. Kolon je ostavljenin situ.Crevo je prebačeno u sterilnu posudu koja sadrži Hank-ov balansirani soni rastvor (Sigma, St. Louis, MO) sa 200 j/ml penicilina G i 200 u.g/ml streptomicina (HBSS). Mišićni sloj je izolovan kao što je opisano gore i prebačen je na sterilnu gazu. Određena je masa mokrih uzoraka, pa su napravljene jednake količine tkiva od po 150 - 200 mg. Tkiva su dva puta isprana u HBSS. Jednake količine su prebačene u polja ploče za kulturu od 35 mm koja sadrži po 3 ml od seruma slobodnog DMEM koji sadrži penicilin/streptomicin, kao što je naznačeno gore, pa je sve inkubirano tokom 24 časa u 5% CO2inkubatoru na 37 °C. Nakon perioda inkubacije, jednake količine od po 1 ml supernatanta su zamrznute u tečnom azotu i uskladištene na -80 °C. Nivoi citokina su mereni. korišćenjem ELISA, a vrednosti su normalizovane na masu mokrog tkiva. Korišćeni su komercijalno dostupni ELISA setovi, prema uputstvima proizvođača.

Analiza podataka

Rezultati su izraženi kao srednje vrednosti ± standardna devijacija srednje vrednosti (SEM). Statistička analiza je izvedena korišćenjem Studentovog t testa ili analizom varijanse (ANOVA), kada je to bilo potrebno. Nivo verovatnoće od p < 0,05 je smatran statistički značajnim.

CO suprimira razvoj intestinalne disfunkcije udruđene sa SITx

Efekti SITx i tretman sa CO na spontanu i betanehofom stimulisanu kontraktilnost cirkularnih mičića tankog creva je ispitivana u kupatilu za eksperimente na organimain vitro.Tkiva su prikupljena 24 časova nakon reperfuzije transplantiranog intestinalnog presatka. Uzorci mišića creva kontrolnih životinja generišu pravilne kontrakcije (podaci nisu prikazani). Tretman sa CO tokom 24 časova nije ispoljio efekat na spontanu kontraktilnu aktivnost kod neoperisanih kontrolnih pacova (podaci nisu prikazani). Nakon SITx, spontana kontraktilna aktivnost je izgubljena (podaci nisu prikazani). Tretman sa CO je uspostavio spontanu kontraktilnu aktivnost kod pacova podvrgnutih transplantaciji (podaci nisu prikazani).

Dodavanje betanehola (0,3 do 300 uM) u superfuzat kupatila izaziva toničke kontrakcije čija jačina zavisi od koncentracije. Integrisani kontraktilni odgovori normalizovani na površinu tkiva dobijeni su kao odgovor na povećanje doza betanehola prikazani su na Slici 1. Kod kontrolnih životinja, kontraktilna sila je zavisna od koncentracije u opsegu od 10 do 300 uM betanehola, a maksimalna vrednost sile od 3,5 ± 0,7 g/mm<2>/s je generisana kao odgovor na koncentraciju od 100 uM betanehola. Tretman sa CO nije imao efekta na kontraktilnost kod neoperisanih životinja (maksimalna vrednost kontraktilne sile 3,2 ± 0,5 g/mm2/s). SITx izaziva smanjenje generisane kontraktilne sile što se primećuje na čitavoj krivi doza - odgovor, u poređenju sa kontrolama, koja dostiže statističku značajnost pri koncentraciji betanehola koja je veća od 10 uM. Pri koncentraciji od 100 uM betanehola, maksimalna vrednost kontraktilne sile je smanjena za 49% do 1,7 ± 0,4 g/mm<2>/s. Tretman sa CO sprečava nastanak inhibitornog efekta SITx na čitavoj krivi doza - odgovor, ponovo uspostavljejuči maksimalnu vrednost kontraktilne sile na kontrolnim nivoima (3,6 ± 0,7 g/mm<2>/s).

Intestinalni tranzit je meren kod kontrolnih životinja i onih koje su podvrgnute transplantaciji nakon 48 časova od operacije, procenjivanjem intestinalne distribucije dekstrana obeleženog fluoresceinom kod oralno hranjenih životinja. Slike 2A i 2B su histogrami tranzita koji prikazuju distribuciju neapsorbilnog FITC-om obeleženog dekstrana duž gastrointestinalnog trakta (od želuca do kolona), 2 časa nakon oralne primene. Histogram medijane fluorescencije u svakom segmentu creva, nakon 2 časa od oralnog hranjenja, kod neoperisanih kontrolnih životinja i kod konrolnih životinja tretiranih sa CO, prikazan je na Slici 2A. U obe grupe, najveći deo fluorescento obeležene supstance se nalazi u segmentima 9 i 10 tankog creva i u cekumu. Ovo čini kontrast u odnosu na obrazac distribucije koji se šrimećuje kod pacova podvrgnutih transplantaciji (Slika 2B), gde se fluorescentna oznaka primarno nalazi u želucu, dok mala količina označene supstance ulazi u proksimalni deo tankog creva. Kod životinja podvrgnutih transplantaciji i tretmanu sa CO, obrazac distribucije oznake je distalniji, sa akumulacijom primarno u segmentima 6, 7 i 8 tankog creva. Statističke ananalize rezultata na osnovu proračuna geometrijskog centra, koje su prikazane na Slici 2C, pokazuju da inhalacija CO značajno poboljšava intestinalni tranzit kod pacova koji su podvrgnuti transplantaciji tankog creva.

Migracija leukocita

Ćelijski infiamatorni procesi u mišićnom sloju tankog creva su procenjivani nakon 24 časa od SITx. Aktivnost mijeloperoksidaze (MPO), koja je određena Hanker - Yates histohemijskim postupkom, korišćena je za kvantifikaciju leukocitnog infiltrata u tkivima kontrolnih životinja i onih kod kojih je izvršena transplantacija, sa ili bez tretmana sa CO. Kod neoperisanih kontrolnih životinja koje su tretirane sa CO MPO pozitivne ćelije su retke (poodaci nisu prikazani). SITx izaziva značajnu migraciju leukocita u mišićni sloj tankog creva (podaci nisu prikazani). Broj ćelija po 200xpolju je sažeto naveden na Slici 3, koja prikazuje da tretman sa CO smanjuje srednji broj MPO pozitivnih ćelija; međutim, ovo smanjenje nije statistički značajno (p = 0,08, n = 6).

Analiza sekvence citokina u mukozi i mišićnom sloju

RNKaza zaštitni test je pokazao da SITx izaziva značajno povećanje ekspresije iRNK IL-6 i IL-1 (3, sa maksimalnom vrednošću nakon 3 - 6 časova u transplantiranom presatku (Slike 4A i 4B). Shodno tome, nivoi iRNK medijatora inflamacije su analizirani nakon 4 časa od reperfuzije.

Infiamatorni odgovor na molekulskom nivou

Slika 5 predstavlja set grafikona sa prečkama koji prikazuju efekat CO na ekspresiju sintaze azot oksida (iNOS), IL-6, IL-ip i IL-10 u spoljašnjem delu mišićnog sloja intestinalnih presadaka nakon četiri časa od reperfuzije. PCR analizom u realnom vremenu je pokazala značajano povećanje ekspresije iRNK proinflamatornih citokina (IL-6 (za 3400 *) i IL-ip (za 38 x)) u spoljašnjem delu mišićnog sloja intestinalnih presadaka. Ekspresija TNF-a je takođe značajno povećana, ali u manjen stepenu (za 3 x); Ekspresija gena za ICAM-1, adhezioni molekul koji ima značajnu ulogu u migraciji cirkulišućih inflamatornih ćelija, poviđena je za 14 *. Kod recipijentnih pacova tretiranih sa CO, srednja relativna ekspresija IL-6 i IL-1 B je smanjena (za 40% i 50%, respektivno), dok je ekspresija TNF-a i ICAM-1 ostala nepromenjena. Usled velike standardne devijacije između transplantiranih grupa, smanjenje ekspresije iRNK IL-6 kod pacova tretiranih sa CO nije bilo statistički značajno (p = 0,084, n = 6), dok je ekspresija IL-1 P značajno smanjena (p = 0,046, n = 6). Genska ekspresija inducibilnih oblika ciklo-oksigenaze (COX-2) i sintaze azot oksida (iNOS) je značajno povišena u mišićnom sloju transplantiranih presadaka (za 5 *i za 48x, respektivno). Srednja relativna ekspresija iRNK oba enzima je smanjena za oko 50% kod pacova tretiranih sa CO. Jod jednom, smanjenje ekspresije iNOS nije bilo sasvim značajno (p = 0,060, n = 6), dok je smanjenje ekspresije COX-2 veoma značajno (p = 0,26, n = 6). Sama inhalacija CO nije imala značajnog eekta na ekspresiju bilo kog od poasmatranih medijatora.

Slika 6 predstavlja set grafikona sa prečkama koji prikazuju efekat CO na serumske koncentracije IL-6 i nitrata/nitrita kod životinja koje su recipijenti intestinalnih presadaka, nakon jednog i nakon četiri časa od reperfuzije. Da bi se generisali ovi podaci, uzorci seruma su uzeti u razlilito vreme nakon transplantacije i uskladišteni su na -80 °C do momenta merenja. Serumske koncentracije IL-6 su određene korišćenjem seta pacovskog imuno-testa povezanog sa enzimom (ELISA) (R&D, Cambridge, MA). Serumski nivoi nitrata/nitrita, stabilnih krajnjih proizvoda metabolizma NO, mereni su korišćenjem komercijalno dostupnog seta za testiranje (Cavman, Ann Arbor, MI). U ovom sistemu za testiranje, nitrat se redukuje do nitrita korišćenjem nitrat reduktaze, a koncentracija nitrita u uzorku se nakon toga meri korišćenjem Griess-ove reakcije. Serumski nivoi IL-6 i nitrata/nitrita kod životinja koje su podvrgnute SITx i koje su tretirane vazduhom se povećava tokom vremena. Životinje koje su podvrgnute SITx i tretirane sa CO (SITx + CO) pokazuju značajno smanjenje serumskih nivoa IL-6 i nitrata/nitrita.

Podaci koji pokazuju da CO štiti od transplantacijom izazvane intestinalne disfunkcije prikazani su u Tabeli I, ispod. Rano (<48 časova) nakon SITx, intestinalni presadak trpi od značajnog zastoja intestinalnog tranzita, smanjenja mišićne kontraktilnosti i masivnih inflamatornih infiltrata. Ove promene su smanjene kod recipijenata tretiranih sa CO. Serumske koncentracije IL-6 (4 časa nakon reperfuzije) su značajno manje kod SITx /CO grupe, u poređenju sa SITx/bez CO grupe. CO sprečava nastanak inflamacije u intestinalnom presatku i I/R ozledu udruženu sa SITx, tako što smanjuje ekspresiju proinflamatornih citokina IL-6 i IL-1.

Primer 2: CO suprimira razvoj ileusa udruženog sa hirurškom manipulacijom na tankom crevu

Životinje

Mužijaci C57B16 miševa divljeg tipa (20 - 25 g) su obezbeđeni od kompanije Harlan (Indianapolis, IN). Miđevi su držani u kavezima bez prisustva patogena, pod ciklusom svetio/tama od 12 časova i hranjeni su komercijalno dostupnom hranom za glodare i vodom iz vodovodaad libitum.

Eksperimentalne grupe i operativni postupci

Miševi koji odgovaraju po starosnoj dobi su podeljeni u četiri eksperimentalne grupe: kontrole bez ikakvog tretmana (Kontrola); kontrole tretirane sa CO (Kontrola + CO); miševi podvrgnuti hirurškoj intervenciji na tankom crevu (IM); i miševi podvrgnuti hirurškoj intervenciji na tankom crevu i tretmanu sa CO (IM + CO).

Hirurška manipulacija

Miševi su anestezirani inhalacijom izoflurana, a abdomen im je otvoren medijalnom laparotomijom. Tanko crevo je eventrirano i nešno komprimovano čitavom dužinom korišćenjem sterilnih pamučnih kompresa. Ovaj postupak je dizajniran da bi se simuliralo garniranje creva koje se uobičajeno izvodi tokom abdominalnih hirurških intervencija u kliničkoj praksi. Creva su repozicionirana u abdominalnu duplju, a incizija je zatvorena produžnim šavovima u dva sloja. Trajanje postupka je oko 15 minuta, a životinje su puštene da se slobodno kreću po svojim kavezima nakon 20 minuta od prestanka dejstva anestetika.

Tretman inhalacijom CO

Miševi koji su čuvani u kavezima su postavljeni u komore od pleksiglasa koje su kontinuirano ventilirane vazduhom ili vazduhom koji sadrži CO (250 ppm). Obezbeđen je port za uzimanje uzoraka da bi se kontinuirano pratila koncenracija ugljen monoksida u komori. Životinje su imale slobodan pristup hrani i vodi u svakom trenutku. Miševi su izloženi CO ili vazduhu 1 čas pre laparotomije, zatim su uklonjene iz komore radi hirurške intervencije, pa su ponovo vraćene u komoru gde su ostavljene tokom 24 časa. Miševi koji se ne podvrgavaju hirurškoj intervenciji se uklanjaju iz komore tokom sličnog vremena, pa se zatim vraćaju u komoru gde ostaju tokom 24 časa.

Morfološke studije

MPO histohemijski postupak

Mišićni sloj pune debljine je uzet iz srednjeg dela jejunuma 24 časa nakon operacije. Segmenti creva su potopljeni u KRB u Sylgaard graduisanoj staklenoj posudi (Midland, MI) i pričvršćeni su bez rastezanja duž mezenterijalne ivice. Dužina i širina segmenata su izmereni lenjirom. Segment jejunuma je otvoren duž mezenterijalne ivice i rastegnut je do 150% dužine i 250%) širine. Mukoza je uklonjena korišćenjem fme pincete, a ostataka tkiva je fiksiran u 100% denaturisanom etanolu tokom 30 minuta. Nakon ispiranja nekoliko puta sa PBS, tkivo je tretirano sa Hanker - Yates reagensom (Polvsciences, VVarrington, PA), radi detekcije polimorfonuklearnih neutrofila (PMN) koji poseduju mijeloperoksidaznu aktivnost

(MPO). Tkiva su naneta na staklene pločice korišćenjem Gel/Mount™ ( Biomedia Corp., Foster City, CA), prekrivene su pokrovnim staklom i ispitivane su pod svetlosnim mikroskopom (Nikon Microphot - FXA, Fryer, Huntlev, IL) pri uveličanju od 200 x. PMN su brojani na pet do čest susednih optičkih polja centriranih između mezenterijalne i antimezenterijalne ivice.

HO- 1 imunohistohemijski postupak

Mišićni sloj pune debljine je pripremljen kao što je navedeno gore, pa je fiksiran u Zambonijevom fiksativu tokom 1 časa, pa je ispran sa DMSO. Nakon ispiranja tokom nekoliko puta sa PBS, tkiva su tretirana sa PBS koji sadrži 10% normalni serum magarca i 0,1%) Triton-X. Preparati su zatim inkubirani tokom noći zajedno sa zečijim anti-pacovskim HO-1 antitelima (1 : 500, Stressgen, Vancouver, Kanada), isprani su i inkubirani tokom 2 časa sa magarećim anti-zečijim IgG-Cy3 konjugatom (Jackson ImmunoResearch laboratories, Inc., West Grove, PA). Tkiva su naneta na staklene pločice sa Gel/Mount™ na gore opisani način, pa su ispitana pod fluorescentnim mikroskopom (Nikon Microphot-FXA, Huntley, IL).

Funkcionalne studije

Miševi su anestezirani i žrtvovani eksangvinacijom na kraju dvadesetčetvoročasovnog tretmana sa CO ili običnim vazduhom u komorama.In vitromehanička aktivnost cirkularnih mišića je merena na način opisan u Eskandari et al. (Am. J. Physiol. 273 : G727 - G734

(1997)). Ukratko, segment središnjeg dela tankog creva je prikačen u Sylgard™ graduisanoj posudi (Midland, MI), koja sadrži prethodno oksigenisani Krebs - Ringer - bikarbonatni pufer (KRB; koncentracije u mM: 137,4 Na<+>, 5,9 K<+>, 2,5 Ca<2+>, 1,2 Mg<2+>, 134 Cl", 15,5 HC03", 1,2 H2PO4' i 11,5 glukoza), koji je izložen smeši 97% O2i 3% CO2, kako bi se uspostavila pH vrednost od 7,4. Crevo je otvoreno duž mezenerijalne ivice, a mukoza je uklonjena preparacijom finom pincetom. Delovi mišićnog sloja pune debljine (1><6 mm) su isečeni paralelno sa kružnim mišićnim slojem i postavljeni su u standardne horizontalne mehaničke komore za organe, koje su kontinuirano prelivane sa preoksigeniranim KRB na 37 °C. Jedan kraj svakog isečka je ligaturom prikačen za fiksirano postolje, a drugi za prevodilac izometrijske sile (WPI, Sarasota, FL). Isečci su ostavljeni radi ekvilibriracije tokom 1 časa, nakon čega su inkrementno rastezani do L0 (dužine pri kojoj se javlja maksimalna spontana kontrakcija). Nakon perioda snimanja osnovnih vrednosti od 30 minuta, napravljene su krive kontraktilnosti izlaganjem tkiva rastućim koncentracijama muskarinskog antagoniste betanehola (0,3 do 300 pM) tokom 10 minuta, nakon čega slede periodi ispiranja od 10 minuta. Kontraktilna aktivnost je izračunata kao integral površine ispod krive. Odgovor je normalizovan na količinu tkiva prevođenjem telesne mase i dužine isečka na kvadratne milimetre tkiva (1,03 mg/mm ), što je izraženo u g/s/mm . Crevni tranzit je meren kod kontrolnih životinja i kod životinja kojima je manipulisano nakon 24 časa od operacije procenjivanjem crevne distribucije neapsorbilnog fluoresceinom obeleženog dekstrana (molekilska masa 70000). Životinje su blago sedirane inhaliranjem izoflurana (100 ul rastvora konentracije 25 mg/ml). Devedeset minuta nakon primene, životinje su žrtvovane, a čitav gastrointestinalni trakt, od želuca do distalnog kolona, je izvađen. Ispitan je sadržaj želuca, tankog creva (podeljeno u 10 segmenata jednake dužine), cekuma i kolona (tri segmenta jednake dužine), postavljenje u 2 ml fiziološkog rastvora, energično je promešan kako bi se oslobodio dekstran koji je prisutan u svakom segmentu. Nakon usitnjavanja crevnog tkiva i crevnog sadržaja, jednake količine supernatanta su očitavane u duplikatu na čitaču za ploče (CvtoFluor II; talasna dužina ekscitacije 530 nm, a emisije 590 nm) radi kvantifikacije fluorescentnog signala u svakom segmentu creva. Distribucija signala duž gastrointestinalnog trakta je određena izračunavanjem geometrijsog centra (GC = £ (procenat ukupnog fluorescentnog signala u svakom segmenti x broj segmenata)) radi kvantitaivnog statističkog poređenja eksperimentalnih grupa.

SYBR green RT- PCR u realnom vremenu

Ekspresija pro-inflamatornih i anti-inflamatornih gena je određivana pomoću RT-PCR. Spoljašnji deo mišićnog sloja creva je prikupljen u četiri vremenska trenutka (3, 6, 12 i 24 časa) od operacije i brzo zaleđen u tečnom azotu. Ekstrakcija ukupne RNK je izvedena korišćenjem guanidium-tiocijanat fenol-hloroform postupka ekstrakcije, kao što je opisano u Eskandari et al. (Id.). RNK sačma je resuspendovana u resuspenzionom rastvoru u kome je RNK zaštićena (Ambion Inc., Austin, TX), a zatim je uklonjena potencijalno kontaminirajuća DNK tretiranjem sa DNKazom I (DNA-Free Kit, Ambion Inc., Austin, TX). Jednaki delovi (po 5 u.g) ukupne RNK iz svakog uzorka su kvantifikovani spektrofotometrijom (talasna dužina 250 nm). Maksimalna vrednost ekspresije iRNK je određivana u duplikatu pomoću dvostepene SYBR Green RT-PCR u realnom vremenu. P-aktin je korišćen kao endogena referenca. Jednake količine RNK (40 ng) su izložene sintezi prvog lanca komplementarne DNK (cDNK) korišćenjem slučajno izabranih heksamera (PE Applied Biosvstems, Foster City, CA) i Super Script II™ (Life Technologies, Rockville, MD). Prajmer sekvence su dobijene iz literature ili su dizajnirane prema objavljenim sekvencama (Tabela 3). PCR reakciona smeša je pripremljena korišćenjem SYBR Green PCR Ćore Reagents seta (PE Applied Biosvstems). Svaki od uzoraka je procenjivan u duplikatu korišćenjem uslova koji su preporučeni od strane proizvođača. Podaci dobijeni putem PCR tehnike u realnom vremenu su ucrtani kao ARnfluorescentnog signala u funkciji broja ciklusa. Dogovoreni prag je podešen na srednji linearni deo ARngrafa ciklusa u logaritmaskoj razmeri. Ciklus praga (Ct) je definisan kao broj ciklusa pri kome ARnprelazi prag. Kvantifikacija ekspresije iRNK je normalizovana za P-aktin i izračunata u odnosu na kontrolu korišćenjem komparativnog Ctpostupka.

Kako bi se tokom PCR amplifikacije isključila kontaminacija genomskom DNK, u svakoj PCR reakciji su korišćene RT-negativne kontrole (uzorci koji sadrže RNK koja nije reverzno transkribovana). Analize krivih topljenja su izvedene za svaku od reakcija, kako bi se osigurala amplifikacija specifičnog proizvoda. Dodatno, prajmeri su podvrgnuti elektroforezi na gelu, da bi se povrdilo odsustvo nespecifičnih traka i da bi se potvrdilo da su amplifikovani segmenti odgovarajuće dužine. Efikasnost PCR-amplifikacije svake od ciljnih cDNK je merena određivanjem kolinearnosti serijskih razblaženja. Napravljena su trostruka serijska razblaženja u triplikatu za sve prajmere. Generisane su standardne krive ucrtavanjem Ctvrednosti u funkciji relativnog ulaznog broja kopija, kako bi se procenili prajmeri. Nagibi standardnih krivih od -3,2 ± 0,3 sa koeficijentima korelacije od 0,99 su smatrani prihvatljivim, sa odgovarajućim stopama efikasnosti od 100 ± 10%.

Analiza otpuštanja medijatora iz mišićnog sloja creva

Određivanje proteina i azot oksida

Tanko crevo kontrolnih pacova i pacova koj su podvrgnuti manipulaciji je uklonjeno u sterilnim uslovima, nakon 4 ili 24 časa od operacije, pri čemu je kolon ostavljenin situ.Tanko crevo je prebačeno u sterilnu posudu koja sadrži Hank-ov balansirani soni rastvor (Sigma, St. Louis, MO) sa 200 j/ml penicilina G i 200 ug/ml streptomicina (HBSS), lumen je ispran, a tkivo je prebačeno u drugu posudu sa HBSS. Mišićni sloj je prikupljen kao što je gore opisano za RT-PCR u realnom vremenu. Tkivo je držano pod sterilnim uslovima na 3 do 5 °C tokom čitavog postupka prikupljanja. Izolovani mišićni sloj je prebačen na sterilnu gazu, pa je određena masa sa tečnošću, kako bi se napravili jednaki uzorci od po 40 do 60 mg. Jednake količine tkiva su dva puta isprane u HBSS, prebačene su na polja ploče za kulturu od 35 mm koja sadrži po 3 ml DMEM bez seruma koji sadrži penicilin/streptomicin, pa je sve inkubirano tokom 24 časa u inkubatoru sa 5% CO2i odgovarajućom vlažnošću na 37 °C. Farmakološka sredstva koja su dodata u podlogu kuture su sterilizovana propuštanjem kroz filtere pre upotrebe.

Nakon perioda inkubacije, tkivo mišića je usitnjeno, pa su jednake količine podloge za kulturu zamrznute u tečnom azotu i uskladištene na -80 °C. Nivoi IL-6, IL-1 p, PGE2 i IL-10, koji su sekretovani u podlogu kulture su određeni korišćenjem komercijalnih setova za ELISA (R&D Svstems, Minneapolis, MN), prema uputstvima proizvođača. Nivo azot oksida (NO) koji je otpušten u podlogu kulture je određen merenjem stabilnih krajnjih proizvoda metabolizma NO. Nivoi nitrata/nitrita su mereni nakon 24 časa od operacije korišćenjem komercijalno dostupnog seta za testiranje (Oxford Biomedical Research, Oxford, MI) i izračunati su prema uputstvima proizvođača. U ovom sistemu testiranja, nitrat se redukuje do nitrita korišćenjem granuliranog kadmijuma, a ukupna koncentracija nitrita se nakon toga određuje korišćenjem Griess-ove reakcije. Sva merenja su normalizovana na masu vlažnog tkiva.

Inhalirani CO suprimira razvoj postoperativnog ileusa

Opšta zapažanja

Sve životinje su se brzo oporavile od operacije. Nije bilo slučajeva mortaliteta niti morbiditeta povezanih sa hirurškim postupkom, ili sa režimom izlaganja CO. Iako su miševi razvili ileus, postoperativno doterivanje i svakodnevno ponašanje bilo je normalno, sa ponovnim početkom oralnog unošenja hrane i vode u okviru nekoliko časova nakon oporavka od anestezije.

Ekspresija HO- 1

Slike 7A - 7E su grafikoni i slike koje prikazuju ekspresiju hemoksigenaze-1 (HO-1) u mišićnom sloju creva posle hirurške manipulacije tankim crevom miša. Da bi se ispitala potencijalna antiinflamatorna zaštitna uloga endogenih HO-1 proizvoda, promene u ekspresiji iRNK HO-1 su utvrđene pomoću SYBR green RT-PCR u realnom vremenu. Slika 7A prikazuje obrasce ekspresije iRNK HO-1 u mišićnom sloju creva kod neoperisanih kontrolnih miševa, kao i kod miševa koji su bili podvrgnuti hirurškoj iintervenciji, pri čemu su uzorci prikupljeni nakon 3, 6, 12 i 24 časova od laparatomije. Ekspresija iRNK HO-1 je značajno uvećana (za 35 *) u poređenju sa kontrolom nakon 3 časa od laparatomije, sa maksimalnom vredošću ekspresije 6 časova nakon operacije (uvećanje od 45x). Iako su nivoi ekspresije opali nakon 6 časova, ekspresija je ostala povišena (za 22*) sve do poslednjeg merenja nakon 24 časa od operacije.

Takođe, ispitano je da li povećanje ekspresije iRNK HO-1 dovodi do eskpresije proteina u mišićnom sloju creva nakon hirurške manipulacije. Urađen je HO-1 imunohistohemijski test na mišićnom sloju pune debljine srednjeg dela jeunuma prikupljenog od neoperisanih miševa i od miševa koji su bili podvrgnuti hirurškoj manipulaciji na tankom crevu 24 časa postoperativno. Kod životinja podvrgnutih hirurškoj intervenciji, HO-1 imunoreaktivnost je primećena kod velikog broja infiltrirajućih polimorfonukleara (slika 7B) i kod ćelija morfološki sličnih makrofagima (slika 87C). Ponekad, primećeno je da ćelije koje sadrže brojne citoplazmatske granule (granulociti) takođe ispoljavaju intenzivnu HO-1 imunoreaktivnost (slika 7D). Slaba HO-1 imunoreaktivnost je takođe primećena kod nekarakteristične populacije ćelija koje su razbacane u mišićnom sloju. HO-1 imunoreaktivnost nije utvrđena u kod neoperisanih miševa pri pregledu crevnog zida pune debljine (slika 7E). Specifičnost imunoloških bojenja na HO-1 je potvrđena testom bez primarnih antitela (nije prikazano).

Funkcionale studije

Crevna pasaža je merena kod kontrolnih životinja i kod životinja podvrgnutih hirurškoj intervenciji 24 časa nakon operaticije tako što je procenjivana gastrointestinalna distribucija fluorosceinom označenog dekstrana koji je unet oralno. Slike 8A - 8C su grafikoni sa prečkama koji prikazuju rezultate studija tranzita koji je određen distribucijom neapsorbilnog fluoresceinom označenog dekstrana, 1,5 časova nakon njegove oralne primene. Histogram medijane fluoroscencije prisutne u svakom segmentu creva kontrolnih miševa koji nisu podvrgnuti nikakvom tretmanu i miševa tretiranih sa CO je prikazan na Slici 8A. Kod životinja koje nisu podvrgnute nikakvom tretmanu, obeleženi dekstran je primarno raspoređen u terminalnom delu tankog creva, u cekumu i proksimalnom kolonu, 90 minuta nakon unošenja dekstrana. Sam inhalacioni tretman sa CO (250 ppm) je izazvao mali pomak u prolasku koji nije od značaja, sa oznakom koja je rapoređena predominantno u cekumu i kolonu. Slika 8B predstavlja poređenje distribucije fluorescentnog signala kod miševa koji su podvrgnuti manipulaciji i koji su bili bez ili su primili tretman sa CO. Nakon manipulacije crevima, fluoroscentni signal je ograničen na želudac i 3 proksimalna segmenta tankog creva. Kada su životinje tretirane sa CO, oznaka je distribuitana distalnije duž gastrointestinalnog trakta. Rezultati proračunavanja geometrijskog centra (GC) su prikazani na Slici 8C, radi statističkog poređenja. Više vrednosti GC nagoveštavaju distalniju distribuciju fluorescentnog signala i odgovaraju bržoj pasaži. Vrednosti prikazane na ovoj slici pokazuju da CO ubrzava prolazak kroz creva kod neoperisanih miševa, ali vrednosti GC nisu dostigle statistički značajnu vrednost. Dodatno, kao što je ranije pokazano, vrednosti GC pokazuju daje prolazak primetno sporiji posle intestinalne manipulacije, ali da je produženje prolaska značajno umanjeno u miševa koji su bili tretirani inhalacijom CO.

In vitrosu ispitivani efekti CO na spontanu i betaneholom stimulisanu kontraktilnost cirkularnih mišića tankog creva u kupatilu za eksperimente na organima, 24 časa nakon hirurške manipulacije crevima, u vreme kada se ileus jasno razvio. Slike 9A - 9C prikazuju mehaničku aktivnost segmenata cirkularnih glatkih mišića tankog creva. Slika 9A predstavlja set reprezentativnih zapisa spontane kontraktilnosti crevnih cirkularnih mišića. Mišićne trake uzete iz tankog creva miševa bez ikakvog tretmana proizvele su uobičajene kontrakcije (Slika 9A; kontrola), a tretman sa CO nije imao efekta na njih (Slika 9A; kontrola + CO). Posle IM, spontana kontraktilna aktivnost je značajno umanjena (Slika 9A; IM). Ipak, u IM miševa tretiranih sa CO, ritmičnost je značajno povećana (Slika 9A; IM + CO). Dodavanjem muskarinskog agoniste betanehola (0,3 do 300 uM) u superfuzat izaziva od koncentracije zavisnu toničku kontrakciju. Površina ispod krive kontrakcije je integrisana i normalizovana na površinu mišićnog segmenta, kako bi se dobila mera kontraktilnosti cirkularnih mišića. Slika 9B i 9C su linijski grafikoni koji prikazuju normalizovanu kontraktilnost. Kod kontrolnih miševa maksimum kontraktilne snage (3,5 ± 0,7 g/s/mm<2>) je generisan kao odgovor na 100 uM betanehola (slika 9B). CO samostalno nije imao efekta na kontrolne kontrakcije (3,2 ± 0,5 g/s/mm<2>). Hirurška manipulacija dovela je do smanjenja kontraktilne snage od početka do kraja krive reakcije na dozu u poređenju sa kontrolama, postižući statističku značajnost sa koncentracijama betanehola višim od 10 uM (slika 9C). Maksimum kontraktilne snage dobijen sa 100uMbetanehola je smanjen za 49% (1,7 ± 0,4 g/s/mm<2>) kod ovih miševa. Inhalacija CO (250 ppm) je potpuno sprečila inhibitorni efekat hirurške manipulacije (3,6 ± 0,7 g/s/mm ).

MPO histohemijski postupak

Hirurška manipulacija tankim crevom obično izaziva jak ćelijski infiamatorni odgovor u mišiću. Hanker - Yates histohemijski test na prisustvo mijeloperoksidaze (MPO<+>) upotrebljen je da bi se kvantifikovao leukocitni infiltrat u tkivima uzetim iz kontrolnih životinja i onih podvrgnutih intervenciji, koje su primile ili koje nisu primile tretman sa CO. Slika 10 je histogram koji prikazuje podatke o MPO<+>ćelijama koje infiltriraju mišićni sloj kod četiri eksperimentalne grupe koje su upotrebljene u ovoj studiji. Leukociti su brojani pri uvećanju od 200x. Kod kontrolnih životninja koje nisu podvrgnute operaciji, MPO<+>ćelije su bile retke. Hirurška anestezija i manipulacija crevima dovele su do uvećanja broja MPO<+>ćelija od 250x, koje su infiltrirale mišićni sloj u toku 24 časa. Zanimljivo je da tretman inhalacijom CO nije imao efekta na veličinu leukocitnog infiltrata ni kod jedne grupe.

Ekspresija pro- inflamatornih citokina

Slike 11A - 11C su grafikoni koji prikazuju efekte inhaliranog CO na ekspresiju IL-6. Brojevi pokazuju vremenski tok ekspresije gena za IL-6 posle manipulacije tankim crevima i efekte inhaliranog CO na ekspresiju gena za IL-6 i na ekspresiju proteina. Analiza vremenskog toka upotrebom RT-PCR u realnom vremenu pokazuje daje ekspresija iRNK IL-6 povećana za 300 x u poređenju sa kontrolnim miševima koji nisu primili nikakav tretman, 3 i 6 časova nakon operacije (Slika 11 A). Ekspresija se-naglo smanjuje nakon 12 časova, smanjujući se na uvećanje od 50 x u odnosu na kontrolu, nakon 24 časa. Inhalacija CO nije imala efekta na manipulacijom indukovanu gensku ekspresiju nakon 3 i 6 časova (Slika 11B). Oslobađanje IL-6 iz izolovanog mišićnog sloja je meren nakon inkubacije u podlozi ćelijske kulture (Slika 11C). Nivo IL-6 je jako povišen 24 časa nakon crevne manipulacije, što je u suprotnosti sa podacima o oslobađanju dobijenim PCR analizom, koje je značajno smanjeno za 70% kod miševa koji su tretirani sa CO.

Takođe je ispitivan proinflamatorni citokin IL-1 (3. Vremenski obrazac ekspresije gena za IL-ip je prikazan na Slici 12A - 12B. Merenje nivoa IL-ip je otežano time što je primećeno da su nivoi iRNK u mišićnom ekstraktu dobijenom od kontrolnih miševa bez ikakvog tretmana i od kontrolnih miševa tretiranih sa CO ispod granice detekcije aparata za analizu sekvence. Prema tome, uzorci sakupljeni od miševa podvrgnutih intervenciji, 6 časova posle operacije, redom su razblaživani i vrednosti ciklusa praga (Ct) su normalizovane u odnosu na (3-aktin, čiji je nivo određen u nerazblaženirn uzorcima. Vrednosti kontrolnog ACtsu potom izračunate upotrebom najniže koncentracije IL-1 (3 za koju se Ctsmanjuje u linearnom opsegu. Potom su izračunate promene ekspresije gena kod ostalih eksperimentalnih grupa prema ovoj kontroli, pa su stoga konzervativne u svojoj proceni stvarnog stepena povećanja. Na osnovu ovih proračuna, utvrđeno je da ekspresija iRNK IL-1 (3, koja se javlja kao odgovor na hiruršku anesteziju i manipulaciju crevima, dovodi do povećanja od 38 * u odnosu na kontrolu, 3 časa nakon operacije. Maksimalna ekspresija se pojavljuje nešto kasnije nego što je ranije primećeno za ekspresiju IL-6, pri čemu se javlja povećanje od 170 x i 150*, nakon 6 i 12 časova od operacije, pa ponovo opada na 40 * veću vrednost od osnovne nakon 24 časa (slika 12A). Kod životinja koje su tretirane sa CO, ekspresija IL-1 B nakon 6 časova je bila manja za 60% (Slika 12B). Oslobađanje IL-1 (3 iz ekstrakta mišićnog sloja prikupljenog 24 časa nakon operacije izmereno je posle dodatnih 24 časova inkubacije u podlozi ćelijske kulture (Slika 12C). Saglasno sa podacima dobijenim RT-PCR analizom, IL-1 p nije pronađen u kontrolnoj grupi, pošto je koncentracija proteina dobijena iz 100 mg ekstrakta tkiva povećana tek nakon manipulacije crevima. Ovaj odgovor je značajno umanjen za 60%> kod miševa koji su podvrgnuti tretmanu inhalacije CO.

Ekspresija ciklooksigenaze- 2 i inducibilne azot oksid sintaze

Aktivirani makrofagiin situi leukociti u inflitratu sintetišu i oslobađaju prostaglandine koji nastaju dejstvom inducibilne izoforme ciklooksigenaze, COX-2, i azot oksida (NO) koji nastaje dejstvom inducibilne forme azot oksid sintaze (iNOS), koja ima direktan i snažan efekat na kontraktilnimaparat glatkih mišića creva: Vremenski obrazac ekspresije iNOS nakon manipulacije predstavljen je na Slikama 13A - 13C. Analiza vemenskog obrasca pokazuje da se genska ekspresija značajno povećava nakon 3 i 6 časova od manipulacije tankim crevom (Slika 13B). Maksimalna vrednost ekspresije koja se dostiže nakon 6 časova je smanjena za 60% kod životinja koje su tretirane sa CO (Slika 14B). Izlaganje netretiranih miševa CO nema efekta na ekspresiju iNOS (višestruko povećanje: kontrola, 1,06 ± 0,18; CO 3 časa, 1,04 ± 0,19; CO 6 časova, 1,26±0,19). Ukupna koncentracija nitrita u podlozi za uzgajanje poreklom iz ekstrakta mišićnog sloja sakupljenog 24 časova nakon operacije, merena procenom proizvodnje NO (Slika 13C). Kao što je i bilo predviđeno podacima dobijenim PCR analizom, određivanje nitrita je značajno povećano posle crevne manipulacije i ovo povećanje je bilo umanjeno za 75% tretiranjem miševa sa CO. Slično umanjenje odgovora dobijeno je inkubacijom ekstrakta mišićnog sloja sa selektivnim inhibitorom iNOS, L-Nil (50 pM), što pokazuje da je iNOS izvor hirurški indukovanog povećanja proizvodnje NO.

Slike 14A - 14D su grafikoni sa prečkama koji prikazuju efekat inhalacije CO na ekspresiju COX-2. Slike prikazuju vremenski obrazac ekspresije COX-2 indukovane IM. Analiza vremenskog obrasca ekspresije pokazuje da je ekspresija gena za COX-2 bila uvećana za 8 do 10 x, 3 do 6 časova od operacije, i da je ostala povišena sve do 24 časa nakon operacije (Slika 14A). Tretman sa CO nije imao efekta na ekspresiju gena nakon 3 i 6 časova (Slika 14B). Sama inhalacija CO kod neoperisanih kontrolnih miševa je prouzrokovala relativno malo povećanje ekspresije iRNK COX-2 od 2,5x, 3 časa nakon operacije (Slika 14C). Oslobađanje PGE2iz ekstrakta mišićnog sloja sakupljenog 24 časa nakon operacije mereno i korišćeno kao pokazatelj aktivnosti COX-2 (Slika 14D). U skladu sa podacima dobijenim PCR analizom, sama inhalacija CO, kao i manipulacija crevima, doveli su do značajnog povećanja oslobađanja PGE2. Specifično za PGE2, tretman miševa podvrgnutih intervenciji sa CO nema efekta na oslobađanje prostanoida koje je indukovano sa IM.

Ekspresija anti- inflamatornih gena

IL-10 je citokin sa više funkcija koji ispoljava značajana zaštitna i anti-inflamatorna dejstva u gastrointestinalnom traktu. Slike 15A - 15C prikazuju efekte inhalacije CO na ekspresiju IL-10. Slike pokazuju vremenski obrazac ekspresije IL-10. Ekspresija gena je povećana za 12 x u odnosu na kontrolu kao odgovor na manipulaciju crevima, nakon 3 i 6 časova od operacije. Ekspresija je nakon toga opadala, ali je ostala povišena tokom 24 časa od operacije za oko 4 x u odnosu na ekspresiju kod kontrolnih životinja (Slika 15A). Kod životinja podvrgnutih intervenciji, a koje su tretirane sa CO, nakon 3 časa od intervencije, ekspresija gena za IL-10 je povišena za 43 x u odnosu na kontrolu, što predstavlja odgovor koji je 300% jači nego sama manipulacija (slika 15B). Kod kontrolnih miševa, sama inhalacija CO bila je dovoljna da proizvede značajno povećanje ekspresije IL-10 (slika 15C).

Takože je ispitivan efekat inhaliranog CO na ekspresiju gena za HO-1. Slike 16A - 16B prikazuju efekat inhalacije CO na ekspresiju HO-1. Slika 16A upoređuje ekspresiju gena nastalu zbog IM nakon 3 i 6 časova od intervencije (Slika 7D) sa ekspresijom kod miševa podvrgnutih intervenciji koji su tretirani sa CO. Takođe, inhalacija CO je povećala ekspresiju gena za HO-1 nakon 3 časa od operacije na nivo koji je 300%) viši nego onaj koji je izazvan samo manipulacijom (Slika 16B). U ovom slučaju, samo inhalacija sa CO kod neoperisanih kontrolnih miševa dovela je do malog, ipak značajnog, povećanja u ekspresiji gena za HO-1, ali samo nakon 6 časova.

Navedeni primer obezbeđujein vivoiin vitrodokaze da inhalacija niskih koncentracija CO (250 ppm) značajno ublažava crevni dismotilitet koji je karakteristika postoperativnog ileusa. Podaci pokazuju da CO može da deluje na nivo genske i proteinske ekspresije i da može da selektivno menja određene elemente proinflamotornih i anti-inflamatornih puteva, što vodi do značajnom poboljšanju crevne funkcije.

Postoperativni ileus je trenutno praktično neizbežna posledica abdominalnih hirurških intervencija i prisutan je u opsegu od kratkotrajne atonije do teškog paralitičnog ileusa koji može da traje danima. Paralitični ileus se karakteriše crevnom stazom, bakterijskim bujanjem i disbalansom tečnosti i elektrolita, što vodi značajnom morbiditetu i često smrtnom ishodu. Izlaganje miševa CO inhalacijom poboljšava manipulacijom izazvanu supresiju spontane kontraktilnosti cirkularnih glatkih mišića, vraća sposobnost kontrakcije kao odgovor na holinergične agoniste i značajno ublažava smanjenje crevnog tranzita. Ovo opšte poboljšanje kontraktilne funkcije se postiže bez značajnog smanjenja u količini inflamatornog crevnog infiltrata, što sugeriše da CO deluje na elemente kaskadne inflamatorne reakcije koji nisu povezani sa migracijom leukocita. Kako bi se odredilo dejstvo CO na kaskadu inflamatorne reakcije, određivana je ekspresija gena pro- i anti-inflamatornih medijatora pomoću RT-PCR u realnom vremenu.

Povećani nivoi pro-infiamatornih citokina IL-6 i IL-1 se uvek javljaju u akutnoj i hroničnoj inflamaciji creva kod ljudi i životinja, uključujući stanje kao što je postoperativni ileus. IL-6 aktivira različite ćelijske tipove da bi izazvao sintezu hemoatraktanata i adhezivnih molekula, pa stoga ima centralnu ulogu u započinjanju regrutacije leukocita i ekstravazaciji u mišićni sloj creva. U ovom primeru, inhalacija CO nije promenila rano povećanje ekspresije gena IL-6 izazvano hirurškom intervencijom merenom posle 3 i 6 časova od operacije, što je u skladu sa nedostatkom njegovog efekta na stepen inflamatornog ćelijskog infiltrata. Ipak, oslobađanje proteina IL-6 iz izolovanog crevnog mišićnog sloja koje je utvrđivano 24 časa nakon operacije bilo je umanjeno za 60% od 5000 pg/ml do 2000 pg/ml kod miševa koji su tretirani sa CO, što sugeriše da CO ispoljava posttranskripcioni efekat na ekspresiju IL-6. Ovaj ustaljeni nivo oslobađanja proteina je bio još primetno uvećan u poređenju sa kontrolnim miševima koji uopšte nisu tretirani (150 pg/ml), čineći teškim procenu koji efekat ovo može imati na pro-inflamatonu signalizaciju posredovanu sa IL-6. Skorašnje studije, ipak, pokazuju da IL-6 takođe ima i značajane anti-inflamatorne osobine, sugerišući da je neophodna kontinuirana ekspresija IL-6 da bi se indukovali određeni zaštitni mehanizmi. Ovo potencijalno obuhvata sposobnost inhibicije proizvodnje TNF-a, IL-ip i makrofagnog inflamatornog proteina-2 i sposobnost povećanja nivoa antagonista IL-1 receptora i rastvorljivog TNF receptorain vitro.Stoga, supresija IL-6 posredovanih pro-inflamatornih mehanizama i kasnijih stadijuma inflamatorne kaskade, može da doprinese poboljšanju crevne kontraktilnosti koja je primećena 24 časa nakon operacije.

Uloga koju ima IL-1P u postoperativnom ileusu slabije je karakterizovana; ipak, zna se da endogeni IL-1 (3 zaustavlja kontraktilni odgovor crevne glatke muskulature pacova na holinergične agoniste i na električne stimuluse, sugerišući da on ispoljava svoje inhibitorno dejstvo uticajem na neuronske mehanizme. Dodatno, imunološka neutralizacija aktivnosti IL-1 značajno smanjuje težinu bolesti u modelu mišijeg kolitisa, što ukazuje da ovaj citokin takođe ima značajnu inicijalnu ulogu kod inflamacije creva. Kod miševa podvrgnutih intervenciji, koji su tretirani sa CO, ekspresija gena za IL-1 (3 je značajno smanjena, sa smanjenjem od 75% u ekspresiji gena izazvanoj hirurškom intervencijom, nakon 6 časova od operacije, a smanjena je i ekspresija odgovarajućeg proteina nakon 24 časa. Stoga, očekivano je da pro-inflamatorna aktivnost IL-13, kao i njegovi potencijalni inhibitorni efekti na neuromuskularni aparat, budu značajno oslabljeni. Sve zajedno, ovi nalazi sugerišu da se zaštitni efekti CO ostvaruju, berem delimično, mehanizmom koji je usmeren na određene elemente u okviru IL-6 i IL-1 p posredovanih pro-inflamatornih kaskadnih reakcija i koji je nezavisan od regrutacije leukocita ili koji se odvija tek pošto je regrutacija leukocita u potpunosti započeta.

Iako se broj leukocita u infiltratu ne menja kod miševa tretiranih sa CO, podaci o citokinima ukazuju da postoji CO zavisna funkcionalna inhibicija citokina koji se klasično stvaraju od strane leukocita. Stoga, ispitana je modulacija kinetički aktivnih medijatora glatkih mišića NO i PGE2poreklom iz leukocita, koji su potencijalne dodatne mete inhibicije putem CO. Pokazano je da prostanoidi proizvedeni od strane COX-2 i azot oksid koji je proizveden od iNOS imaju snažana inhibitorna dejstva na kontraktilnost crevne muskulature i da inhibicija COX-2 enzima ili selektivno "izbacivanje" gena za iNOS koji potiče iz leukocita, značajno povećavaju otpornost prema razvoju postoperativnog ileusa. U ovom primeru, ispitivanje genske ekspresije iNOS i C0X-2 je pokazalo da se ekspresija oba navedena gena značajno uvećava nakon manipulacije crevima. Hirurški izazvano povećanje genske ekspresije iNOS i proizvodnje NO bili su smanjeni za 75% kod životinja koje su tretirane sa CO, sugerišući da bi CO mogao da deluje na nivou transkripcije da bi izmenio ekspresiju iNOS. Takođe je pokazano dain vitroaktivnost iNOS, kao i endotelijalne i neuralne forme NOS, mogu biti direktno inhibirane pomoću CO, verovatno putem vezivanja CO za hem podjedinicu koja je prisutna u proteinu NOS. Sve zajedno, očekivano je da smanjenje oslobađanja NO, usled smanjene genske ekspresije i/ili enzimske aktivnosti zbog inhalacije CO, značajno doprinese poboljšanju crevne fuinkcije. Nasuprot iNOS, inhalacija CO nije imala nikakvog efekta na hirurški izazvanu ekspresiju iRNK COX-2 ili oslobađanje PGE2, što je mereno u podlozi kulture ili inkubatu mišićnog sloja prikupljenog nakon 24 časa od operacije. Zanimljivo je daje inhalacija CO kod miševa koji nisu bili tretirani dovela do povećanjem ekspresije iRNK COX-2od 2,5 x nakon 3 časa od operacije, uz odgovarajuće povećanje oslobađanja PGE2nakon 24 časa. Indukcija COX-2 pomoću CO nije ranije bila saopštena, a funkcionalna posledica ovog povećanja aktivnosti je nepoznata. Kontrolni miševi koji su tretirani sa CO nisu pokazali funkcionalno slabljenje ili povišenje pro-inflamatornih medijatora, što sugeriše da se u ovom slučaju indukcija COX-2 ne deluje na pro-inflamatorni kapacitet.

Jedan od dramatičnih efekata inhalacije CO je ekspresija gena povezanih sa anti-inflamatornim putevima: IL-10 i HO-1. Kada su oba gena indukovana nakon manipulacije crevima, ekspresija je povećana za 300% kod životinja podvrgnutih manipulaciji koje su tretirane sa CO. Ovo povećanje je primećeno u nakon 3 časa od operacije, ali ne i nakon 6 časova, što sugeriše da izlaganje dejstvu CO vodi ranoj indukciji ovih gena, što je koncept koji je podržan rezultatima koji pokazuju da sama inhalacija CO kod životinja koje nisu bile tretirane vodi značajnoj indukciji IL-10 i HO-1. Uloga koju imaju ovi medijatori u postoperativnom ileusu ranije nije bila opisana. Ipak, IL-10 je citokin koji deluje na više nivoa i koji poseduje širok sprkatr bioloških dejstava na mijeloidne i limfoidne ćelije. Jedna od njegovih funkcija koja je poznata jeste sposobnost da inhibira proizvodnju pro-inflamatornih medijatora; uključujući proizvodnju faktora nekroze tumora a (TNFa), IL-6, IL-1, sposobnost da stimuliše faktor stimulacije kolonije granulocita - makrofaga i sposobnost pokretanja proizvodnje azot oksida od strane aktiviranih monocita/makrofaga. U skorije vreme, utvrđeno je da IL-10 inhibira proizvodnju NO od strane makrofaga miša stimulisanih sa LPS, i to putem antagonizma sa ćelijskim preuzimanjem L-arginina i putem katalitičke aktivnosti same iNOS, tako da potencijalno doprinosi umanjenju inhibitornog efekta NO na glatke mišiće creva. Dodatno, postaje sve očiglednije da indukcija puteva posredovanih sa HO-1 ima značaj ano anti-inflamatomo i citoprotektivno dejstvo u različitim akutnim i hroničnim zapaljenskim procesima. Nema dokaza koji bi sugerisali da je ekspresija ova dva medijatora međusobno povezana. Objavljeni nalazi pokazuju da izlaganje CO uvećava gensku ekspresiju IL-10 i oslobađanje proteina iz LPS stimulisanih makrofaga. U skorije vreme, otkriveno je da endogeni IL-10 indukuje HO-1 u makrofagima miša i da je indukcija HO-1 neophodna za ispoljavanje inhibitornog efekta IL-10 na proizvodnju TNF-a izazvanu lipopolisaharidom. Rana indukcija HO-1 može da dovede do povećanja proizvodnje endogenog CO, za koji se očekuje da doprinese dejstvu egzogeno primenjenog gasa. Dodatno, HO-1 aktivost ima citoprotektivna i antioksidantna svojstva koja dodprinose neutralizaciji slobodnih radikala u toku redoks ciklusa biliverdina i bilirubina. Zbog toga, povećana proizvodnja IL-10 i pojačana aktivnost HO-1 bi delovali zajedno u slabljenju zapaljenske reakcije ranoj fazi njenog razvoja i to putem smanjenja ekspresije pro-inflamatornih medijatora, povećavajući tkivnu raspoloživost CO i obezbeđujući zaštitu od stresa izazvanog slobodnim radikalima.

Sažeto, podaci koji su ovde prikazani sugerišu da se zaštitni efekat inhalacije CO ispoljava njegovim dejstvom na odabrane elemente u okviru pro- i anti-inflamatornih puteva. Izgleda da CO deluje i na nivou ekspresije gena i na nivou proteinske ekspresije, što vodi indukciji IL-10 i HO-1, smanjenoj ekspesiji IL-1 P i inhibiciji iNOS. Zajedno, ovi efekti dovode do modulacije hirurški izazvanih zapaljenskih odgovora u okviru mišićnog sloja creva, što vodi do poboljšanja funkcije creva nakon opercaije.

Primer 3. CO suprimira razvoj ileusa koji je povezan sa hirurškom manipulacijom tankog creva kod miševa i svinja

Ileus je kod miševa izazvan nežnom manipulacijom taknkog creva. Incizija je napravljena kako bi se abdominalna duplja miša učinila dostupnom, a manipulacija crevima je izvedena nežnim bockanjem i udaranjem po tankom crevu (videti, npr. Schvvartz et al., Gastroenterologv 121 (6) : 1354 - 1357 (2001)). Incizija je potom zatvorena, a analize su urađene 24 časa kasnije. Miševi su bili izloženi CO inhalaciji (200 i 500 ppm) tokom 1 časa pre početka manipulacije crevima i tokom celog perioda oporavka. Crevna kontraktilnost je procenjenain vitrokvantifikacijom kontrakcije snopova cirkularnih mišića u odgovoru na betanehol (0,3 - 300 |JM), kao iin vivoodređivanjem crevnog tranzita na osnovu distribucije oralno unetog dekstrana obeleženog fluorosceinom i izračunavanjem geometrijskog centra, kao što je gore opisano u Primeru 1. Ekspresija iRNK HO-1 i IL-10 je utvrđena pomoću SYBR green RT-PCR u realnom vremenu u ekstraktima spoljašnjeg dela mišićnog sloja creva, kao što je gore opisano u Primeru 1. Oslobađanje azot oksida (NO), snažnog inhibitora kontraktilnosti glatkih mišića, procenjeno je merenjem ukupnog serumskog nitrita, što je takođe opisano ranije u Primeru 1.

Maksimalna vrednost sile kontrakcije koja je generisana kao odgovor na betanehol (100 |JM) značajno je umanjena nakon IM (1,1 ± 0,2 g/s/mm ), u poređenju sa kontrolom (2,2 ± 0,5 g/s/mm<2>). Supresija kontraktilnosti prouzrokovana sa IM bila je sprečena kod IM + CO miševa (1,9 ± 0,5 g/s/mm<2>). Crevni tranzit je takođe poboljšan kod miševa koji su bili tretirani sa CO (geometrijski centar: kotrola = 11,0 ± 0,5, IM = 2,7 ± 0,2; IM + CO = 6,3 ± 0,8). RT-PCR podaci pokazuju da IM prouzrokuje značajno povećanje maksimalne vrednosti ekspresije HO-1 (45x) posle 6 časova, kao i ekspresije IL-6 (300 x) i IL-10 (13 x) posle 3 časa od IM u poređenju sa kontrolom. Kod IM - CO miševa, ekspresija HO-1 je dosegla vrhunac ranije, 3 časa posle IM, i to na višem nivou (150x) u poređenju sa kontrolom. Ekspresija IL-10 posle 3 časa je takođe bila viša kod IM - CO miševa (35 x). Nivo serumskog nitrita je povećan posle IM (18,3 ± 3,6 pM) u poređenju sa kontrolom (2,4 ± 1,9 pM), a smanjenje kod IM - CO životinja (6,0 ± 1,6 |JM).

Stoga, CO ublažava crevni dismotilitet izazvan hirurškom intervencijom,in vitroiin vivo,preko mehanizama koji mogu da obuhvate indukciju anti-inflamatornog citokina IL-10 i samnjenjem proizvodnje NO. Rana indukcija HO-1 (povećanje ekspresije od 300% u odnosu na samu IM) bi povećala raspoloživost CO, pojačavajući njegova anti-inflamatorna dejstva.

Slični eksperimenti su izvedeni i na modelu svinje. Ileus je proizveden blagom manipulacijom tankog creva (IM). Svinje su bile izložene dejstvu CO (250 ppm) ili vazduhu (kontrola) tokom perioda od 3 časa pre IM. Gastrointestinalna funkcija je procenjivanain vivopraćenjem tranzita čeličnih kuglica kroz tanko crevo. Utvrđeno je da CO poboljšava crevni tranzit nakon manipulacije crevima.

Primer 4. Prethodni tretman sa niskom koncentracijom CO (250 do 75 ppm) tokom tri

sata pre početka laparatomije štiti od razvoja postoperativnog ileusa

Ovaj primer pokazuje da niske koncentracije CO koje se koriste u kratkom vremenskom periodu deluju zaštitno u odnosu na razvoj postoperativnog ileusa.

Ileus je prouzrokovan blagom manipulacijom tankim crevpm (IM). Pacovi su izloženi opadajućim koncentracijama CO (250, 125, 75, 30 ppm) u vazduhu tom 1 časa ili 3 časa pre laparatomije (n=6). Rezultati su upoređeni sa onima koji su dobijeni korišćenjem ranije ustanovljenih protokola izlaganja CO u koncentraciji od 250 ppm tokom 1 časa pre i 24 časa posle laparatomije.

Gastrointestinalna funkcija je procenjenain vivoutvrđivanjem crevnog tranzita na osnovu distrbucije oralno unetog dekstrana koji je obeležen fiuorosceinom kroz gastrointestinalni trakt. Medijana distribucije obeleženog dekstrana je utvrđena radi statističke analize proračunanjem geometrijskog centra (GC).

Geometrijski centar je bio značajno umanjen kod pacova koji su prošli hiruršku manipulaciju, u poređenju sa neoperisanim kontrolama (GC: kontrola = 9,8 ± 0,2, IM = 5,8 ± 0,4), što ukazuje na značajno smanjenje crevnog tranzita. Iako je izlaganje neoperisanih pacova koncentraciji od 250 ppm tokom 24 časa dovela do blagog kašnjenja u crevnom tranzitu (GC: 8,8 ± 0,4), prethodni tretman tokom 1 časa i 24 časovni tretman nakon intervencije sa 250 ppm CO je doveo do značajnog poboljšanju crevnog tranzita kod pacova koji su prošli kroz hiruršku manipulaciju (GC: 8,2 ± 0,4). Prethodni tretman pacova podvrgnutih intervenciji koncentracijom od 250 ppm CO tokom 1 časa samo pre operacije bio je manje efikasan u sprečavanju hirurški indukovane inhibicije tranzita (GC: 7,2 ± 0,3), dok je prethodni tretman tokom 3 časa proizveo efekat koji je jednak onom dobijenom korišćenjem tratmana tokom 24 časova (GC: 8,6 ± 0,3). Slično poboljšanje je dobijeno prethodnim tretmanom sa niskoim koncentracijama od 125 i 75 ppm CO (GC: 8,6 ± 0,4 i 8,8 ± 0,1, respektivno). Ovaj zaštitni efekat je umanjen kada je koncentracija CO dalje smanjena na 30 ppm (GC: 7,0 ± 0,2).

Ovaj primer pokazuje da produženo izlaganje CO nije neophodno da bi se dobila maksimalna korist zaštite od razvoja postoperativnog ileusa. Uključivanje niskih koncentracija CO u anestetičke gasove tokom preoperativnog perioda može da predstavlja minimalno invazivnu tehniku koja doprinosi smanjenju razvoja ileusa kod pacijenata koji su u riziku, tako ubrzavajući postoperativni oporavak i smanjujući dužinu boravka u bolnici.

Primer 5. Protokoli za tretman ileusa

Sledeći primer prikazuje protokole koji se koriste u tretmanu pacijenata pre, za vreme i/ili posle hirurškog postupka, npr. transplantacije (npr. SITx) ili hirurškog postupka koji nije transplantacija (npr. postupka nakon koga može nastati ileus). Primer obuhvata protokole za tretman ileusa, npr. ileusa koji nastaje nakon transplantacije ili hirurškog postupka koji nije transplantacija, kao i dodatne protokole tretiranja donora, gastrointestinalnog trakta ili nekog njegovog dela, npr. tankog creva, kao i recipijenta, sa CO, u toku transplantacionog postupka. Jedan ili više sledećih postupaka mogu biti upotrebljeni u toku date hirurške intervencije.

Tretman pacijenata

CO može biti unet sistemski ili lokalno kod pacijenta, pre, za vreme, i/ili nakon izvođenja hirurške intervencije na pacijentu, ili nakon dijagnostikovanja ileus kod pacijenta (npr. ileusa koji nastaje nakon operacije ili koji nastaje u uslovima koji ne podrazumevaju operaciju). Pacijenti mogu da inhaliraju CO u koncentracijama koje su u opsegu od 10 ppm do 1000 ppm, npr. oko 100 ppm da oko 800 ppm, oko 150 ppm do oko 600 ppm, ili oko 200 ppm do oko 500 ppm. Poželjne koncentracije obuhvataju, npr. koncentracije od oko 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, ili oko 1000 ppm. CO može biti primenjen kod pacijenta intermitentno ili kontinuirano, počevši od 0. do 20. dana pre hirurške intervencije, npr. počevši najmanje oko 30 minutapre intervencije, npr. oko 1, 2, 3, 5, 7 ili 10 časova pre intervencije, ili 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 18, ili 20 dana pre intervencije, ili više od 20 dana pre intervencije. Alternativno, ili kao dodatak, CO može biti primenjen kod pacijenta tokom intervencije, npr. inhalacijom i/ili topijskom primenom. Alternativno, ili kao dodatak, CO može biti primenjen kod pacijenta nakon intervencije, npr. počevši odmah posle intervencije i nastavljajući tokom oko 1, 2, 3, 5, 7, ili 10 časova, ili oko 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50, ili 60 dana od intervencije, ili neograničeno dugo, ili dok se normalni motilitet creva ne uspostavi posle završetka intervencije.

Postupak transplantacije

Tretman donatora

Pre uzimanja organa ili njegovog dela, donor može biti tretiran inhalacijom ugljen monoksida (250 ppm) tokom jednog časa. Tretman može biti primenjen u dozama koje se kreću od 10 ppm do 1000 ppm za vreme koje iznosi od jednog do šest časova, ili tokom celog perioda od kada je moguće tretirati, donora kod koga je ustanovljena moždana smrt (leš) do vremena kada je organ uklonjen. Za humane donore, tretman treba da započne što je pre moguće nakon ustanovljavanja moždane smrti. U nekim rešenjima, poželjno je da se otpočne sa tretmanom pre moždane smrti.

Za životinje koje nisu ljudi (npr. svinje) koje se upotrebljavaju kao donori kod ksenotransplantacije, živa životinja donor treba da bude tretirana relativno visokim nivoima ugljen monoksida inhalacijom, koliko je poželjno, sve dok karbohemoglobin koji na taj način nastaje ne ugrozi vijabilnost i funkciju organa koji treba da se transplantira. Na primer, moguće je upotrebiti koncentracije koje su više od 500 ppm (npr. 1000 ppm ili više, čak i do 10000 ppm, naročito u kratkim vremenskim periodima).

Tretman organa in situ

Pre nego što se organ uzme od donora, može biti ispran ili preliven rastvorom, npr. puferom ili podlogom, još dok je u donoru. Namera je da se organ ispere rastvorom koji je zasićen ugljen monoksidom i da se održava u atmosferi sa ugljen monoksidom, tako da se sadržaj ugljen monoksioda ostane zasićen. Ispiranje može da se obavlja tokom najmanje 10 minuta, npr. tokom 1 časa, nekoliko časova, ili duže. Idealno, rastvor bi trebalo da dopremi najviše moguće koncentracije ugljen monoksida do ćelija organa.

Tretman organa ex vivo

Organ, kao što je tanko crevo, može se čuvati u podlozi koja sadrži ugljen monoksid, od momenta kada je uklonjen iz donora, do vremena kda je transplantiran u recipijenta. Ovo može biti izvedeno održavanjem organa u podlozi koja sadrži CO, ili prelivanjem organa takvom podlogom. S obzirom da se ovo dešavaex vivo,a ne u životinji, mogu biti upotrebljene veoma visoke koncentracije CO (npr. 10000 ppm), kako bi se u podlozi održala zasićena koncentracija CO.

Tretman recipijenta

Tretman recipijenta sa CO može početi na dan transplantacije, najmanje 30 minuta pre nego što započne operacija. Alternativno, tretman može početi najmanje 30 minuta pre reperfuzije organa u recipijentu. Tretman treba da bude nastavljen tokom najmanje najmanje 30 minuta, npr. tokom 1 časa. Doze ugljen monoksida između 10 ppm i 3000 ppm mogu biti primenjene različito dugo, npr. tokom nekoliko minuta ili nekoliko časova, a mogu biti primenjene na dan transplantacije, kao i danima posle transplantacije. Na primer, pacijent može da inhalira koncentraciju ugljen monoksida od, npr. 3000 ppm, tokom tri uzastopna udaha od kojih se svaki zadrži po 10 sekundi. Alternativno, niža koncentracija gasa može biti primenjena intermitentno ili koninuirano, u toku dužeg vremenskog perioda, bolje uz normalno disanje, nego sa zadržavanjem vazduha. Koncentracija karboksihemoglobina može biti korišćena kao vodič za ispravnu primenu ugljen monoksida kod pacijenata. Uobičajeno, tretman recipijenata ne bi trebalo da poveća nivo karboksihemoglobina iznad vrednosti koje se uzimaju kao granica prihvatljivog rizika za pacijente kojima je neophodna transplantacija.

Treba da se shvati da, iako je predmetni pronalazak opisan u vezi sa njegovim detaljnim opisom, prethodno izneti opis je namenjen ilustraciji predmetnog pronalaska i ni na koji način ne ograničava obim zaštite predmetnog pronalaska, koji je definisan pridodatim patentnim zahtevima. Drugi aspekti, prednosti i modifikacije predmetnog pronalaska, nalaze se u okviru patentnih zahteva koji slede.

Claims (1)

1. Upotreba ugljen monoksida za pripremanje farmaceutskog preparata za lečenje ili prevenciju ileusa kod pacijenta.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što ileus je ileus tankog creva, debelog creva ili želudca.

3. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što ileus je ileus nakon hirurške intervencije ili nakon porođaja. u obliku gasa.

8. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1 do 6, naznačena time što je farmaceutski preparat u obliku tečnosti.

9. Upotreba ugljen monoksida za pripremanje farmaceutskog preparata za lečenje ileusa kod pacijenta, naznačena time što: (a) obezbeđen je sud u kome je smešten farmaceutski preparat u obliku komprimovanog gasa koji sadrži ugljen monoksid; (b) farmaceutski preparat se oslobađa iz suda, kako bi se formirala atmosfera koja sadrži ugljen monoksid u gasnom stanju; i (c) pacijent se izlaže ovoj atmosferi.

10. Upotreba prama bilo kome od zahteva 1 do 9, naznačena time što je pacijent čovek.

11. Sud koji sadrži komprimovan gas ugljen monoksida, medicinske čistoće, naznačen time što sud nosi oznaku koja ukazuje da se gas može koristiti za lečenje ili prevenciju ileusa kod pacijenta.

12. Sud prema zahtevu 11, naznačen time što je ugljen monoksid u smeši sa gasom koji sadrži kiseonik.

13. Sud prema zahtevu 12, naznačen time što je ugljen monoksid prisutan u smeši, u koncentraciji od najmanje oko 0,025%, najmanje oko 0,05%), najmanje oko 0,10%), najmanje oko 1,0%) ili najmanje oko 2, 0%.