[go: up one dir, main page]

RS66412B1 - Anti-her2 antitelo-lek konjugat - Google Patents

Anti-her2 antitelo-lek konjugat

Info

Publication number
RS66412B1
RS66412B1 RS20241442A RSP20241442A RS66412B1 RS 66412 B1 RS66412 B1 RS 66412B1 RS 20241442 A RS20241442 A RS 20241442A RS P20241442 A RSP20241442 A RS P20241442A RS 66412 B1 RS66412 B1 RS 66412B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
ch2ch2
ggfg
cancer
drug
Prior art date
Application number
RS20241442A
Other languages
English (en)
Inventor
Hiroyuki Naito
Yusuke Ogitani
Takeshi Masuda
Takashi Nakada
Masao Yoshida
Shinji Ashida
Koji Morita
Hideki Miyazaki
Yuji Kasuya
Ichiro Hayakawa
Yuki Abe
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53756672&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66412(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of RS66412B1 publication Critical patent/RS66412B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo-lek konjugat koji ima lek protiv tumora konjugovan sa anti-HER2 antitelom putem segmenta strukture linkera, konjugat koji je koristan kao lek protiv tumora.
Stanje tehnike
[0002] Za antitelo-lek konjugat (Antibody-drug conjugate - ADC) koji ima lek sa citotoksičnošću konjugovan sa antitelom, čiji je antigen eksprimuje na površini ćelija kancera i koje se takođe vezuje za antigen sposoban za ćelijsku internalizaciju, i stoga može da isporuči lek selektivno ćelijama kancera, se stoga očekuje da izazove akumulaciju leka unutar ćelija kancera i da ubije ćelije kancera (videti, Ne-patentne literature 1 do 3). Kao ADC, Mylotarg (registrovani žig; Gemtuzumab ozogamicin) u kome je kaliheamicin konjugovan sa anti-CD33 antitelom je odobren kao terapijski agens za akutnu mijeloidnu leukemiju. Dodatno, Adcetris (registrovani žig; Brentuksimab vedotin), u kojem je auristatin E konjugovan sa anti-CD30 antitelom, je nedavno odobren kao terapijski agens za Hodgkin-ov limfom i anaplastični limfom velikih ćelija (videti, Ne-patentnu literaturu 4). Lekovi sadržani u ADC-ima (ADCs) koji su odobreni do sada ciljaju DNK ili tubulin.
[0003] Što se tiče antitumorskog agensa, derivati kamptotecina, jedinjenja niske-molekulskemase koja inhibiraju topoizomerazu I da bi ispoljila antitumorski efekat, su poznati. Među njima, antitumorsko jedinjenje predstavljeno pomoću formule ispod
[0004] (eksatekan, hemijski naziv: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion) je u vodi rastvoran derivat kamptotecina (Patentne Literature 1 i 2). Za razliku od irinotekana koji se trenutno primenjuje u kliničkim postavkama, ovo jedinjenje ne zahteva aktivaciju enzimom za ispoljavanje svog antitumorskog efekta. Dodatno, primećeno je da je njegova inhibitorna aktivnost na topoizomerazu I viša od SN-38 koja je glavna farmaceutski aktivna supstanca irinotekana i topotekana koja se takođe primenjuje u kliničkim postavkama, i viša in vitro citocidna aktivnost je potvrđena prema raznim ćelijama kancera. Posebno, potvrđeno je da ima efekat protiv ćelija kancera koje imaju rezistenciju na SN-38 ili slično usled eksprimujeja P-glikoproteina. Dodatno, u mišjem modelu sa subkutano transplantiranim humanim tumorom, potvrđeno je da ima moćan antitumorski efekat, i stoga je podvrgnut kliničkim studijama, ali još nije pušten na tržište (videti, Ne-patentne literature 5 do 10). Ostaje nejasno da li ili ne eksatekan deluje efikasno kao ADC.
[0005] DE-310 je kompleks u kome je eksatekan konjugovan sa biorazgradivim karboksimetildekstran polialkohol polimerom putem GGFG peptidnog razdelnika (Patentna Literatura 3). Konvertovanjem eksatekana u oblik polimernog proleka, izraženo svojstvo zadržavanja u krvi može biti održano i takođe izraženo svojstvo ciljanja tumorskih oblasti je pasivno povećano primenom povećane propustljivosti novoformiranih krvnih sudova unutar tumora i svojstva zadržavanja u tkivima tumora. Sa DE-310, putem cepanja peptidnog razdelnika pomoću enzima, eksatekan i eksatekan sa glicinom povezan sa amino grupom se kontinuirano oslobađaju kao glavna aktivna supstsanca, i kao rezultat, farmakokinetika je poboljšana. Pronađeno je da DE-310 ima veću efikasnost od eksatekana administriranog zasebno iako je ukupna doza eksatekana sadržanog u D310 niža nego u slučaju administracije eksatekana zasebno prema raznim modelima za procenu tumora u ne-kliničkim studijama. Klinička studija je sprovedena za DE-310, i efikasni slučajevi su takođe potvrđeni, uključujući izveštaj koji nagoveštava da se glavna aktivna supstanca akumulira u tumorima više nego u normalnim tkivima. Međutim, postoji takođe izveštaj koji ukazuje da akumulacija DE-310 i glavne aktivne supstance u tumorima nije mnogo različita od akumulacije u normalnim tkivima kod ljudi, i stoga nije primećeno pasivno ciljanje kod ljudi (videti, Ne-patentne literature 11 do 14). Kao rezultat, DE-310 takođe nije komercijalizovan, i ostaje nejasno da li ili ne eksatekan efikasno deluje kao lek usmeren na takvo ciljanje.
[0006] Kao jedinjenje koje se odnosi na DE-310, kompleks u kome je strukturni segment predstavljen pomoću -NH-(CH2)4-C(=O)- umetnut između -GGFG- razdelnika i eksatekana da bi se formirao -GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- primenjen kao razdelna struktura je takođe poznat (Patentna literatura 4). Međutim, antitumorski efekat pomenutog kompleksa nije uopšte poznat.
[0007] HER2 je jedan od proizvoda tipičnog onkogena tipa receptora za faktor rasta identifikovanog kao onkogen koji se odnosi na receptor 2 faktora rasta humanih epidermalnih ćelija, i to je transmembranski receptorski protein koji ima molekulsku masu od 185 kDa i koji ima tirozin kinazni domen (Ne-patentna literatura 15). DNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca od HER2 su stavljene na uvid u javnoj bazi podataka, i može se pozivati na njih, na primer, pod pristupnim brojem M11730 (GenBank), NP_004439.2 (NCBI), ili slično.
[0008] HER2 (neu, ErbB-2) je jedan od članova EGFR (epidermal growth factor receptor – receptor epidermalnog faktora rasta) familije i aktiviran je pomoću autofosforilacije na unutarćelijskim tirozinskim ostacima pomoću njegove homodimerne formacije ili heterodimerne formacije sa drugim EGFR receptorom HER1 (EGFR, ErbB-1), HER3 (ErbB-3), ili HER4 (ErbB-4) (Ne-patentne literature 16 do 18), time igrajući važnu ulogu u ćelijskom rastu, diferencijaciji, i preživljavanju u normalnim ćelijama i kancerskim ćelijama (Ne-patentne literature 19 i 20). HER2 je prekomerno eksprimuje u raznim tipovima kancera kao što su kancer dojke, kancer želuca, i kancer jajnika (Ne-patentne literature 21 do 26) i prijavljen je da je faktor negativne prognoze za kancer dojke (Ne-patentne literature 27 i 28) .
[0009] Trastuzumab je humanizovano antitelo mišjeg anti-HER2 antitela 4D5 (Ne-patentna literatura 29 i Patentna literatura 5), nazvan rekombinantno humanizovano anti-HER2 monoklonsko antitelo (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Herceptin(R)) (Patentna literatura 6). Trastuzumab se specifično vezuje za vanćelijski domen IV od HER2 i indukuje antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) ili vrši antikancerski efekat putem inhibicije transdukcije signala od HER2 (Ne-patentne literature 30 i 31). Trastuzumab je visoko efikasan za tumore koji prekomerno ispoljavaju HER2 (Ne-patentna literatura 32) i kao takav, je plasiran 1999. u Sjedinjenim Američkim Državama i 2001. u Japanu kao terapijski agens za pacijente sa metastatskim kancerom dojke koji prekomerno eksprimuje HER2.
[0010] Iako je terapijski efekat trastuzumaba na kancer dojke adekvatno dokazan (Ne-patentna literatura 33), navodno oko 15% pacijenata sa kancerom dojke koji prekomerno eksprimuje HER2 koji su primili širok spektar konvencionalnih antikancerskih terapija reaguje na trastuzumab. Oko 85% pacijenata ove populacije nema ili ima samo slab odgovor na tretman trastuzumabom.
[0011] Stoga, potreba za terapijskim agensom koji cilja bolesti povezane sa eksprimovanjem HER2 je prepoznata za pacijente koji pate od tumora koji prekomerno eksprimuje HER2 bez ili sa slabim odgovorom na trastuzumab ili poremećaja koji su povezani sa HER2. T-DM1 (trastuzumab emtansin, Kadcyla (R); Ne-patentna literatura 34) koji ima antitumorski lek konjugovan sa trastuzumabom preko strukture linkera, i pertuzumab (Perjeta(R); Ne-patentna literatura 35 i Patentna literatura 7) formulisan da cilja vanćelijski domen II od HER2 i inhibira formiranje heterodimera su razvijeni. Međutim, odgovor na njih, snaga aktivnosti, i prihvaćene indikacije su još uvek nedovoljni, i postoje nezadovoljene potrebe za ciljanje HER2.
[Lista navoda]
[Patentna literatura]
[0012]
[Patentna literatura 1] Japanski patent otkriven sa br. (Japanese Patent Laid-Open No.) 5-59061
[Patentna literatura 2] Japanski patent otkriven sa br.8-337584
[Patentna literatura 3] Međunarodna objava sa br. WO 1997/46260
[Patentna literatura 4] Međunarodna objava sa br. WO 2000/25825
[Patentna literatura 5] Američki patent br.5677171
[Patentna literatura 6] Američki patent br.5821337
[Patentna literatura 7] Međunarodna objava sa br. WO 01/00244
[Nepatentna literatura]
[0013]
[Ne-patentna literatura 1] Ducry, L., i ostali, Biokonjugat Chem. (2010) 21, 5-13.
[Ne-patentna literatura 2] Alley, S. C., i ostali, Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
[Ne-patentna literatura 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
[Ne-patentna literatura 4] Senter P. D., i ostali, Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
[Ne-patentna literatura 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
[Ne-patentna literatura 6] Mitsui, I., i ostali, Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782. [Ne-patentna literatura 7] Takiguchi, S., i ostali, Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.
[Ne-patentna literatura 8] Joto, N. i ostali Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
[Ne-patentna literatura 9] Kumazawa, E. i ostali, Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.
[Ne-patentna literatura 10] De Jager, R., i ostali, Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
[Ne-patentna literatura 11] Inoue, K. i ostali, Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda i ostali (2003) 145-153.
[Ne-patentna literatura 12] Kumazawa, E. i ostali, Cancer Sci (2004) 95, 168-175. [Ne-patentna literatura 13] Soepenberg, O. i ostali, Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
[Ne-patentna literatura 14] Wente M. N. i ostali, Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
[Ne-patentna literatura 15] Coussens L, i ostali, Science.1985;230(4730) :1132-1139.
[Ne-patentna literatura 16] Graus-Porta G, i ostali, EMBO J.1997;16;1647-1655.
[Ne-patentna literatura 17] Karnagaran D, i ostali, EMBO J.1996;15:254-264.
[Ne-patentna literatura 18] Sliwkowski MX, i ostali, J. Biol. Chem. 1994;269:14661-14665.
[Ne-patentna literatura 19] Di Fore PP, i ostali, Science.1987;237:178-182.
[Ne-patentna literatura 20] Hudziak RM, i ostali, Proc Natl Acad Sci USA.
1987;84:7159-7163.
[Ne-patentna literatura 21] Hardwick R, i ostali, Eur. J Surg Oncol.1997 (23):30-35. [Ne-patentna literatura 22] Korkaya H, i ostali, Oncogene.2008;27(47):6120-6130. [Ne-patentna literatura 23] Yano T, i ostali, Oncol Rep.2006;15(1):65-71.
[Ne-patentna literatura 24] Slamon DJ, i ostali, Science.1987;235:177-182.
[Ne-patentna literatura 25] Gravalos C, i ostali, Ann Oncol 19:1523-1529, 2008.
[Ne-patentna literatura 26] Fukushige S i ostali, Mol Cell Biol 6:955-958, 1986.
[Ne-patentna literatura 27] Slamon DJ, i ostali Science.1989;244:707-712.
[Ne-patentna literatura 28] Kaptain S i ostali, Diagn Mol Pathol 10:139-152, 2001.
[Ne-patentna literatura 29] Fendly. i ostali, Cancer Research 1990(50):1550-1558.
[Ne-patentna literatura 30] Sliwkowski MX, i ostali, Semin Oncol. 1999;26(4,Dodatak 12):60-70.
[Ne-patentna literatura 31] Hudis CA, i ostali, N Engl J Med.357: 39-51, 2007.
[Ne-patentna literatura 32] Vogel CL, i ostali, J Clin Oncol.2002;20(3):719-726.
[Ne-patentna literatura 33] Baselga i ostali, J. Clin. Oncol.14:737-744 (1996).
[Ne-patentna literatura 34] Howard A. i ostali, J Clin Oncol 2011;29:398-405.
[Ne-patentna literatura 35] Adams CW, i ostali, Cancer Immunol Immunother.
2006;6:717-727.
[Suština pronalaska]
[Tehnički problem]
[0014] U pogledu lečenja tumora pomoću antitela, može se primetiti nedovoljan antitumorski efekat čak iako antitelo prepoznaje antigen da bi se vezalo za ćelije tumora, i postoje slučajevi u kojima je efikasnije antitumorsko antitelo potrebno. Dodatno, mnoga antitumorska jedinjenja niske-molekulske-mase imaju probleme u vezi bezbednosti poput propratnih efekata i toksičnosti čak iako jedinjenja imaju odličan antitumorski efekat. Ostao je cilj da se postigne superiorni terapijski efekat dodatnim poboljšavanjem bezbednosti. Stoga, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi antitumorski lek koji ima odličan terapijski efekat, koji je odličan u smislu antitumorskog efekta i bezbednosti.
[Rešenje problema]
[0015] Pronalazači su zaključili da anti-HER2 antitelo je antitelo koje je sposobno da cilja ćelije tumora, to jest, koje ima svojstvo prepoznavanja ćelija tumora, svojstvo vezivanja za ćelije tumora, svojstvo internalizacije unutar ćelija tumora, citotoksičnu aktivnost prema ćelijama tumora, citocidnu aktivnost prema ćelijama tumora, ili slično; stoga, kada se antitumorsko jedinjenje eksatekan konvertuje u antitelo-lek konjugat, preko segmenta strukture linkera, konjugacijom za ovo antitelo, antitumorsko jedinjenje može sigurnije biti isporučeno ćelijama tumora da bi specifično ispoljilo antitumorski efekat jedinjenja u ćelijama tumora, i stoga se antitumorski efekat može sigurno ispoljiti i takođe se može očekivati poboljšan citocidni efekat anti-HER2 antitela, i doza antitumorskog jedinjenja može biti smanjena u poređenju sa slučajem administriranja jedinjenje zasebno, i tako uticaji antitumorskog jedinjenja na normalne ćelije mogu biti ublaženi tako da se može postići viša bezbednost.
[0016] U vezi sa tim, pronalazači su kreirali linker sa specifičnom strukturom i uspeli u dobijanju antitelo-lek konjugata u kojem su anti-HER2 antitelo i eksatekan konjugovani međusobno preko linkera, i potvrdili odličan antitumorski efekat koji se ispoljava konjugatom da bi time upotpunili predmetni pronalazak.
[0017] Specifično, predmetni pronalazak se odnosi na sledeće.
[1] Konjugat antitelo-lek u kome je antitumorsko jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
je konjugovano sa anti-HER2 antitelom preko linkera koji ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
preko tioetarske veze koja se formira na disulfidnoj vezi koja je prisuta u zglobnom delu anti-HER2 antitela.
[0018] Ovde je anti-HER2 antitelo povezano sa terminalom L1,
antitumorsko jedinjenje je povezano sa karbonil grupom - (CH2)n<2>-C(=O)- dela sa atomom azota amino grupe na poziciji 1 kao veznom pozicijom,
pri čemu
n1 predstavlja ceo broj od 0 do 6,
n2 predstavlja ceo broj od 0 do 5,
L1 predstavlja - (Sukcinimid-3-il-N) - (CH2)n3-C(=O)-,
pri čemu, n3 predstavlja ceo broj od 2 do 8,
L2 predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
pri čemu n4 predstavlja ceo broj od 1 do 6,
LP predstavlja peptidni ostatak koji se sastoji od 2 do 7 aminokiselina,
La predstavlja -O- ili jednostruku vezu, i
-(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
koje je povezano sa anti-HER2 antitelom na svom položaju 3 i povezano je sa metilenskom grupom u strukturi linkera koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1.
[0019] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na svako od sledećeg.
[2] Konjugat antitelo-lek prema [1], pri čemu je peptidni ostatak LP peptidni ostatak koji sadrži aminokiselinu izabranu od fenilalanina, glicina, valina, lizina, citrulina, serina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline.
[3] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [2], pri čemu L<P>je peptidni ostatak izabran iz sledeće grupe:
-GGF-,
-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,
-GGFG-,
-SGGF-,
-KGGF-,
-DGGFG-,
-GGFGG-,
-DDGGFG-,
-KDGGFG-, i
-GGFGGGF-;
pri čemu "(D-)D" predstavlja D-asparaginsku kiselinu.
[4] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [2], pri čemu LP je peptidni ostatak koji se sastoji od 4 aminokiseline.
[5] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [4], pri čemu LP je tetrapeptidni ostatak - GGFG-.
[6] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [5], pri čemu n3 je ceo broj od 2 do 5, i L2 je jednostruka veza.
[7] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [5], pri čemu n3 je ceo broj od 2 do 5, L2 je -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, i n4 je 2 ili 4.
[8] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [7], pri čemu -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je delimična struktura koja ima lanac dužine od 4 do 7 atoma.
[9] Konjugat antitelo-lek prema [1] ili [7], pri čemu -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je delimična struktura koja ima lanac dužine od 5 ili 6 atoma.
[10] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [9], pri čemu -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
ili
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-.
[11] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [9], pri čemu -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
ili
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[12] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [9], pri čemu deo strukture lek-linker koji ima lek povezan sa -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je jedna struktura leklinker izabrana iz sledeće grupe:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
pri čemu -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
koji je povezan sa anti-HER2 antitelom na svom položaju 3 i povezan je sa metilenskom grupom u strukturi linkera koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1, -(NH-DX) predstavlja grupu predstavljenu sledećom formulom:
pri čemu atom azota amino grupe na položaju 1 je vezujući položaj, i
-GGFG- predstavlja tetrapeptidni ostatak -Gly-Gly-Phe-Gly-.
[13] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [9], pri čemu deo strukture lek-linker koji ima lek povezan sa -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je jedna struktura leklinker izabrana iz sledeće grupe:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Ovde su -(Sukcinimid-3-il-N)-, -(NH-DX), i -GGFG- kao što je gore definisano.
[14] Konjugat antitelo-lek u kome je antitumorsko jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
je konjugovano sa anti-HER2 antitelom preko linkera koji ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
-L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-preko tioetarske veze koja se formira na disulfidnoj vezi prisutnoj u zglobnom delu anti-HER2 antitela,
pri čemu
anti-HER2 antitelo je povezano sa terminalom L1, antitumorsko jedinjenje je povezano sa karbonil grupom -(CH2)n2-C(=O)- dela,
pri čemu
n1 predstavlja ceo broj od 0 do 6,
n2 predstavlja ceo broj od 0 do 5,
L1 predstavlja -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-,
pri čemu n3 predstavlja ceo broj od 2 do 8,
L2 predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
pri čemu n4 predstavlja ceo broj od 1 do 6,
LP predstavlja tetrapeptidni ostatak -GGFG-,
La predstavlja -O- ili jednostruku vezu, i
-(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
koji je povezan sa anti-HER2 antitelom na svom položaju 3 i povezan je sa metilenskom grupom u strukturi linkera koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1.
[15] Konjugat antitelo-lek prema [14], pri čemu
n1 je 3, n2 je 0, n3 je 2, L2 je -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 je 2, i La je jesnostruka veza,
n1 je 1, n2 je 1, n3 je 5, L2 je jednostruka veza, i La je -O-, ili
n1 je 2, n2 je 1, n3 je 5, L2 je jednostruka veza, i La je -O-.
[16] Konjugat antitelo-lek prema [14] ili [15], pri čemu n3 je 2 ili 5, i L2 je jednostruka veza.
[17] Konjugat antitelo-lek prema [14] ili [15], pri čemu n3 je 2 ili 5, L2 je -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, i n4 je 2 ili 4.
[18] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [14] do [17], pri čemu -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
ili
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
[19] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [14] do [18], pri čemu deo strukture lek-linker koji ima lek povezan sa -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je jedna struktura leklinker izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
pri čemu, -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
koja je povezana sa anti-HER2 antitelom na svom položaju 3 i povezan je sa metilenskom grupom u strukturi linkera koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1, - (NH-DX) predstavlja grupu predstavljenu sledećom formulom:
pri čemu atom azota amino grupe na položaju 1 je vezujući položaj,
i
- GGFG- predstavlja tetrapeptidni ostatak -Gly-Gly-Phe-Gly-.
[20] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [14] do [18], pri čemu deo strukture lek-linker koji ima lek povezan sa -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je jedna struktura leklinker izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećeg:
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), i
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Ovde su -(Sukcinimid-3-il-N)-, -(NH-DX), i -GGFG- kao što je gore definisano.
[21] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [20], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 1 do 10.
[22] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [20], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 2 do 8.
[23] Konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [20], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u rasponu od 2 do 8.
[24] Lek koji sadrži konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [23], njegovu so ili njegov hidrat.
[25] Antitumorski lek i/ili lek protiv kancera koji sadrži konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [23], njegovu so ili njegov hidrat.
[26] Antitumorski lek i/ili lek protiv kancera prema [25], koji se koristi protiv kancera pluća, urotelnog karcinoma, kolorektalnog karcinoma, kancera prostate, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera dojke, kancera bešike, kancera želuca, gastrointestinalnog stromalnog tumora, kancera grlića materice, karcinoma jednjaka, karcinoma skvamoznih ćelija, peritonealnog karcinoma, kancera jetre, hepatocelularnog karcinoma, kancera debelog creva, karcinoma rektuma, kolorektalnog karcinoma, kancera endometrijuma, kancera materice, kancera pljuvačne žlezde, kancera bubrega, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera penisa, leukemije, malignog limfoma, plazmacitoma, mijeloma ili sarkoma.
[27] Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [23], njegovu so ili njegov hidrat kao aktivnu komponentu i farmaceutski prihvatljivu komponentu formulacije.
[28] Farmaceutska kompozicija prema [27], koja se koristi protiv kancera pluća, urotelnog karcinoma, kolorektalnog karcinoma, kancera prostate, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera dojke, kancera bešike, kancera želuca, gastrointestinalnog stromalnog tumora, kancera grlića materice, karcinoma jednjaka, karcinoma skvamoznih ćelija, peritonealnog karcinoma, kancera jetre, hepatocelularnog karcinoma, kancera debelog creva, karcinoma rektuma, kolorektalnog karcinoma, kancera endometrijuma, kancera materice, kancera pljuvačne žlezde, kancera bubrega, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera penisa, leukemije, malignog limfoma, plazmacitoma, mijeloma ili sarkoma.
[29] Postupak za lečenje tumora i/ili kancera koji obuhvata primenu konjugata antitelo-lek prema bilo kom od [1] do [23], njegove soli ili njegovog hidrata.
[30] Postupak za proizvodnju konjugata antitelo-lek koji se sastoji od reakcije jedinjenja predstavljenog sledećom formulom:
(maleimid-N-il)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<2>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) sa anti-HER2 antitelom ili njegovim reaktivnim derivatom i konjugacijom dela lek-linker sa antitelom postupkom za formiranje tioetarske veze na mestu disulfidne veze prisutnom u zglobnom delu antitela.
U formuli, n3 predstavlja ceo broj od 2 do 8, L2 predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
pri čemu n<4>predstavlja ceo broj od 1 do 6,
LP predstavlja peptidni ostatak koji se sastoji od 2 do 7 aminokiselina odabranih od fenilalanina, glicina, valina, lizina, citrulina, serina, glutaminske kiseline, i asparaginske kiseline,
n1 predstavlja ceo broj od 0 d 6,
n2 predstavlja ceo broj od 0 do 5,
La predstavlja -O- ili jednostruku vezu,
(maleimid-N-il) - je grupa predstavljena sledećom formulom:
pri čemu atom azota je vezujući položaj, i
-(NH-DX) je grupa predstavljena sledećom formulom:
pri čemu atom azota amino grupe na položaju 1 je vezujući položaj.
[31] Postupak proizvodnje prema [30], pri čemu je postupak za konjugovanje dela lek-linker sa anti-HER2 antitelom postupak redukcije antitela da bi se antitelo pretvorilo u reaktivni derivat.
[32] Postupak proizvodnje prema [30] ili [31], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 1 do 10.
[33] Postupak proizvodnje prema [30] ili [31], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 2 do 8.
[34] Postupak proizvodnje prema [30] ili [31], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 3 do 8.
[35] Konjugat antitelo-lek dobijen postupkom proizvodnje prema bilo kom od [30] do [34].
[36] Konjugat antitelo-lek dobijen formiranjem tioetarske veze na mestu sulfidne veze u zglobnom delu antitela, pri čemu se anti-HER2 antitelo tretira u redukcionom stanju i nakon toga reaguje sa jedinjenjem koje je odabrano iz prikazane grupe ispod:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), i
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
U gornjem tekstu, (maleimid-N-il)- je grupa predstavljena sledećom formulom:
pri čemu atom azota je vezni položaj, i
-(NH-DX) je grupa predstavljena sledećom formulom:
pri čemu atom azota amino grupe na poziciji 1 je vezni položaj, i
-GGFG- predstavlja tetrapeptidni ostatak -Gly-Gly-Phe-Gly-.
[37] Konjugat antitelo-lek dobijen formiranjem tioetarske veze na mestu sulfidne veze prisutnom u zglobnom delu antitela, pri čemu se anti-HER2 antitelo tretira u redukcionom stanju i nakon toga reaguje sa jedinjenjem odabranim iz grupe prikazano ispod:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), i
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
Ovde su (maleimid-N-il) -, - (NH-DX), i -GGFG- kao što je gore definisano.
[38] Konjugat antitelo-lek prema [36] ili [37], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 1 do 10.
[39] Konjugat antitelo-lek prema [36] ili [37], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 2 do 8.
[40] Konjugat antitelo-lek prema [36] ili [37], pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane jedne strukture lek-linker konjugovanih po molekulu antitela u opsegu od 3 do 8.
Prednosti pronalaska
[0020] Sa anti-HER2 antitelo-lek konjugatom koji ima antitumorsko jedinjenje eksatekan konjugovano preko linkera sa specifičnom strukturom, odličan antitumorski efekat i bezbednost mogu biti postignuti.
Kratak opis slika
[0021]
[Slika 1] Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca humanizovanog anti-HER2 monoklonskog antitela (SEQ ID NO: 1).
[Slika 2] Slika 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca humanizovanog anti-HER2 monoklonskog antitela (SEQ ID NO: 2).
[Slika 3] Slika 3 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (27) ili trastuzumaba na golog (nude) miša sa subkutano transplantiranim ćelijama linije KPL-4 humanog kancera dojke. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 4] Slika 4 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (8), (28) ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama linije NCI-N87 humanog kancera želuca. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 5] Slika 5 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (8), (29), (30), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama linije JIMT-1 humanog kancera dojke. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 6] Slika 6 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (31), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama linije Capan-1 humanog kancera pankreasa. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 7] Slika 7 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50) na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama linije NCI-N87 humanog kancera želuca. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 8] Slika 8 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ST225 ćelijama humanog kancera dojke. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 9] Slika 9 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ST910 ćelijama humanog kancera dojke. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 10] Slika 10 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama CTG-0401 linije humanog kolorektalnog kancera. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 11] Slika 11 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim CTG-0860 ćelijama humanog ne-sitnoćelijskog kancera pluća. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 12] Slika 12 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama CTG-0927 linije humanog kancera žučnih puteva. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 13] Slika 13 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama CTG-0137 linije humanog kancera jednjaka. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
[Slika 14] Slika 14 je dijagram koji prikazuje antitumorski efekat antitelo-lek konjugata (50), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina na golog miša sa subkutano transplantiranim ćelijama SK-OV-3 linije humanog kancera jajnika. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora.
Opis tehničkih rešenja
[0022] U daljem tekstu, poželjni načini za izvođenje predmetnog pronalaska su opisani sa pozivanjem na slike. Tehnička rešenja opisana ispod su data samo za ilustraciju jednog primera tipičnog tehničkog rešenja predmetnog pronalaska i nisu namenjeni da ograniče obim predmetnog pronalaska.
[0023] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska je antitumorski lek u kojem je anti-HER2 antitelo konjugovano sa antitumorskim jedinjenjem preko segmenta strukture linkera i objašnjen je detaljno u nastavku.
[Antitelo]
[0024] Anti-HER2 antitelo primenjeno u anti-HER2 antitelo-lek konjugatu predmetnog pronalaska može biti izvedeno iz bilo koje vrste, i poželjni primeri vrsta mogu da uključe ljude, pacove, miševe, i zečeve. U slučaju kada je antitelo izvedeno iz vrste koja nije ljudska, ono je poželjno himerizovano ili humanizovano primenom dobro poznate tehnike. Antitelo predmetnog pronalaska može biti poliklonsko antitelo ili monoklonsko antitelo i poželjno je monoklonsko antitelo.
[0025] Anti-HER2 antitelo je antitelo, koje je sposobno za ciljanje ćelija tumora, to jest, poseduje svojstvo prepoznavanja ćelije tumora, svojstvo vezivanja za ćeliju tumora, svojstvo internalizacije u ćeliju tumora, citocidnu aktivnost prema ćelijama tumora, ili slično, i može biti konjugovano sa lekom koji ima antitumorsku aktivnost preko linkera da bi se formirao antitelolek konjugat.
[0026] Vezujuća aktivnost antitela prema ćelijama tumora može biti potvrđena primenom protočne citometrije. Internalizacija antitela unutar ćelija tumora može biti potvrđena primenom (1) testa vizualizacije antitela inkorporisanog u ćelije pod fluorescentnim mikroskopom primenom vezivanja sekundarnog antitela (fluorescentno obeleženog) za terapijsko antitelo (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) testa merenja intenziteta fluorescencije inkorporisane u ćelije primenom vezivanja sekundarnog antitela (fluorescentno obeleženog) za terapijsko antitelo (Molecular Biology of the Cell, tom 15, 5268-5282, decembar 2004), ili (3) Mab-ZAP testa primenom vezivanja imunotoksina za terapijsko antitelo gde se toksin oslobađa nakon inkorporacije unutar ćelija da bi se inhibirao rast ćelija (Bio Techniques 28: 162-165, januar 2000). Kao imunotoksin, rekombinantni kompleksni protein katalitičkog domena toksina difterije i proteina G može biti primenjen.
[0027] Antitumorska aktivnost antitela može biti potvrđena in vitro određivanjem inhibitorne aktivnosti na rast ćelija. Na primer, ćelijska linija kancera koja prekomerno eksprimuje ciljni protein za antitelo je kultivisana, i antitelo je dodato u raznim koncentracijama u sistem kulture da bi se odredila inhibitorna aktivnost na formiranje fokusa, formiranje kolonije, i sferoidni rast.
Antitumorska aktivnost može biti potvrđena in vivo, na primer, administriranjem antitela golom mišu sa transplantiranom tumorskom ćelijskom linijom koja visoko eksprimuje ciljni protein, i određivanjem promene u ćeliji kancera.
[0028] S obzirom da jedinjenje konjugovano u antitelo-lek konjugatu vrši antitumorski efekat, poželjno je ali nije neophodno da samo antitelo treba da ima antitumorski efekat. Za svrhu specifičnog i selektivnog vršenja citotoksične aktivnosti antitumorskog jedinjenja na ćelije tumora, važno je i takođe je poželjno da antitelo treba da ima svojstvo internalizacije da bi migriralo u ćelije tumora.
[0029] Anti-HER2 antitelo može biti dobijeno pomoću procedure poznate u oblasti. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može biti dobijeno primenom postupka koja se obično izvodi u oblasti, koja uključuje imunizaciju životinja sa antigenim polipeptidom i prikupljanjem i prečišćavanjem antitela proizvedenih in vivo. Poreklo antigena nije ograničeno na ljudsko, i životinje mogu biti imunizovane sa antigenom izvedenim iz ne-humane životinje kao što je miš, pacov i slično. U ovom slučaju, ukrštena-reaktivnost antitela koja se vezuju za dobijeni heterologni antigen sa humanim antigenima može biti testirana da bi se ispitalo antitelo koje je primenljivo na humanu bolest.
[0030] Alternativno, antitelo-produkujuće ćelije koje proizvode antitela na antigen su fuzionisne sa ćelijama mijeloma u skladu sa postupkom poznatom u oblasti (npr., Kohler i Milstein, Nature (1975) 256, str. 495-497; i Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, str.365-367, Plenum Press, Njujork (1980)) da bi se formirali hibridomi, iz kojih se monoklonska antitela mogu zauzvrat dobiti.
[0031] Antigen može biti dobijen genetskim inženjeringom ćelija domaćina da bi se proizveo gen koji kodira antigeni protein. Specifično, vektori koji dozvoljavaju eksprimovanje gena antigena se pripremaju i prenose u ćelije domaćina tako da se gen eksprimuje. Tako eksprimuje antigen može biti prečišćen. Antitelo može takođe biti dobijeno pomoću postupka imunizovanja životinja sa iznad-opisanim antigen-eksprimujućim ćelijama obrađenim genetskim inženjeringom ili ćelijskom linijom koja eksprimuje antigen.
[0032] Anti-HER2 antitela koja mogu biti primenjena u predmetnom pronalasku nisu posebno ograničena i poželjno su, na primer, ona koja imaju svojstva kao što je ispod opisano.
(1) Anti-HER2 antitelo koje ima sledeća svojstva:
(a) specifično vezivanje za HER2, i
(b) koje ima aktivnost internalizacije u HER2-eksprimujuće ćelije vezivanjem za HER2.
(2) Antitelo u skladu sa (1) iznad, gde se antitelo vezuje za vanćelijski domen od HER2. (3) Antitelo u skladu sa (1) ili (2) iznad, gde je antitelo monoklonsko antitelo.
(4) Antitelo prema bilo kom od (1) do (3) gore, pri čemu antitelo ima aktivnost ćelijske citotoksičnosti (ADCC) zavisnu od antitela i/ili aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC)
(5) Antitelo u skladu sa bilo kojim od (1) do (4) iznad, gde antitelo je mišje monoklonsko antitelo, himerno monoklonsko antitelo, ili humanizovano monokonsko antitelo.
(6) Antitelo u skladu sa bilo kojim od (1) do (5) iznad, gde antitelo je humanizovano monokonsko antitelo koje sadrži težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEQ ID NO: 1 i lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEQ ID NO: 2.
(7) Antitelo u skladu sa bilo kojim od (1) do (6) iznad, gde antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca.
(8) Antitelo u skladu sa (7) iznad, gde antitelo sadrži težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 449 sa SEQ ID NO: 1 i lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 214 sa SEQ ID NO: 2.
(9) Antitelo dobijeno pomoću postupka za proizvodnju antitela u skladu sa bilo kojim od (1) do (8) iznad, postupka koja obuhvata korake: kultivacije ćelije domaćina transformisane sa ekspresionim vektorom koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo; i prikupljanja antitela od interesa iz kultura dobijenih u prethodnom koraku.
[0033] U daljem tekstu, anti-HER2 antitelo primenjeno u pronalasku je opisano.
[0034] Termini "kancer" i "tumor" kao što je ovde primenjeno se primenjuju sa istim značenjem.
[0035] Termin "gen" kao što je ovde primenjeno uključuje ne samo DNK, već takođe njenu mRNK, njenu cDNK i njenu cRNK.
[0036] Termin "polinukleotid" kao što je ovde primenjeno se koristi sa istim značenjem kao nukleinska kiselina i takođe uključuje DNK, RNK, probe, oligonukleotide, i prajmere.
[0037] Termini "polipeptid", "protein" i "protein" kao što je ovde primenjeno se primenjuju bez razlike.
[0038] Termin "ćelija" kao što je ovde primenjeno takođe uključuje ćelije u životinjskom pojedincu i kultivisane ćelije.
[0039] Termin "HER2" kao što je ovde primenjeno se koristi sa istim značenjem kao HER2 protein.
[0040] Primeri anti-HER2 antitela kao što je ovde primenjeno mogu uključiti, ali nisu posebno ograničeni na, pertuzumab (Međunarodna patentna objava sa brojem WO 01/00245) i trastuzumab (Američki patent sa brojem 5821337). Trastuzumab je poželjan. Međutim, anti-HER2 antitelo predmetnog pronalaska nije ograničeno na njega sve dok je to anti-HER2 antitelo koje se specifično vezuje za HER2, i poželjnije koje ima aktivnost internalizacije u HER2-eksprimujuće ćelije pomoću vezivanja za HER2.
[0041] Termin "trastuzumab" kao što je ovde primenjeno se takođe naziva HERCEPTIN(R), huMAb4D5-8, ili rhuMAb4D5-8 i to je humanizovano antitelo koje sadrži težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 449 sa SEQ ID NO: 1 (Slika 1) i lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 214 sa SEQ ID NO: 2 (Slika 2).
[0042] Termin "specifično vezivanje" kao što je ovde primenjeno označava vezivanje koje je nespecifična adsorpcija. Primeri kriterijuma za određivanje da li je vezivanje specifično ili ne mogu uključiti konstantu disocijacije (u daljem tekstu naznačena kao "KD"). KD vrednost za antitelo za HER2 protein je poželjno 1 × 10-5 M ili manje, 5 × 10-6 M ili manje, 2 × 10-6 M ili manje, ili 1 × 10<-6>M ili manje, poželjnije 5 × 10<-7>M ili manje, 2 × 10<-7>M ili manje, ili 1 × 10<-7>M ili manje, dodatno poželjno 5 × 10-8 M ili manje, 2 × 10-8 M ili manje, ili 1 × 10-8 M ili manje, i najpoželjnije 5 × 10-9 M ili manje, 2 × 10-9 M ili manje, ili 1 × 10-9 M ili manje. Vezivanje između HER2 proteina i antitela može biti izmereno primenom postupka poznate u oblasti, kao što je površinska plazmonska rezonanca, ELISA, ili RIA.
[0043] Termin "CDR" kao što je ovde primenjeno se odnosi na region za određivanje komplementarnosti (complementarity determining region - CDR). Poznato je da svaki teški i laki lanac molekula antitela ima tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR). CDR se takođe naziva hipervarijabilni domen, i prisutan je u varijabilnom regionu svakog teškog i lakog lanca antitela. To je mesto koje ima neuobičajeno visoku varijabilnost u svojoj primarnoj strukturi, i postoje tri odvojena CDR u primarnoj strukturi svakog teškog i lakog polipeptidnog lanca. U ovoj specifikaciji, kao CDR antitela, CDR teškog lanca su predstavljeni sa CDRH1, CDRH2, i CDRH3 od amino-terminalne strane aminokiselinske sekvence teškog lanca, i CDR lakog lanca su predstavljeni sa CDRL1, CDRL2, i CDRL3 od amino-terminalne strane aminokiselinske sekvence lakog lanca. Ova mesta su blizu jedna drugima u tercijernoj strukturi i određuju specifičnost za antigen za koji se antitelo vezuje.
[0044] Fraza "hibridizacija je izvedena pod strogim uslovima" kao što je ovde primenjeno se odnosi na proces u kome se hibridizacija izvodi pod uslovima pod kojima se identifikacija može postići izvođenjem hibridizacije na 68°C u komercijalno dostupnom rastvoru za hibridizaciju ExpressHyb Hybridization Solution (proizvedenom od strane Clontech, Inc.) ili izvođenjem hibridizacije na 68°C u prisustvu 0.7 do 1.0 M NaCl primenom filtera koji ima DNK imobilisanu na njemu, praćeno pranjem na 68°C primenom 0.1 do 2 x SSC rastvora (1 x SSC rastvor je sačinjen od 150 mM NaCl i 15 mM natrijum citrata) ili pod uslovima koji su njima ekvivalentni.
1. HER2
[0045] HER2 je jedan od onkogenih proizvoda tipičnog onkogena receptora za faktor rasta koji je identifikovan kao onkogen koji se odnosi na humani receptor 2 za epidermalni ćelijski faktor rasta, i to je transmembranski receptorski protein koji ima molekulsku masu od 185 kDa i koji ima tirozin kinazni domen. HER2 je član EGFR familije koja se sastoji od HER1 (EGFR, ErbB-1), HER2 (neu, ErbB-2), HER3 (ErbB-3), i HER4 (ErbB-4) i poznato je da se autofosforiluje na unutarćelijskim tirozinskim ostacima pomoću njegove homodimerne formacije ili heterodimerne formacije sa drugim EGFR receptorom HER1, HER3, ili HER4 i samoaktivira se na takav način, time igrajući važnu ulogu u ćelijskom rastu, diferencijaciji, i preživljavanju u normalnim ćelijama i ćelijama tumora.
[0046] Kao HER2 protein koji će se koristiti u predmetnom pronalasku, HER2 protein može biti direktno prečišćen iz HER2-eksprimujućih ćelija humanog ili ne-humanog sisara (kao što je pacov ili miš) i primenjen, ili frakcija ćelijske membrane iznad-opisanih ćelija može biti pripremljena i primenjena. Dodatno, HER2 može biti dobijen pomoću in vitro njegove sinteze ili njegovom proizvodnjom u ćeliji domaćina kroz genetski inženjering. U genetskom inženjeringu, specifično, nakon što je HER2 cDNK integrisana u vektor sposoban za eksprimujeje HER2 cDNK, HER2 protein može biti dobijen njegovom sintezom u rastvoru koji sadrži enzim, supstrat i energetsku supstancu potrebnu za transkripciju i translaciju, ili eksprimovanjem HER2 u drugoj prokariotskoj ili eukariotskoj transformisanoj ćeliji domaćina. Alternativno, iznad-opisane genetskim inženjeringom modifikovane HER2-eksprimujuće ćelije, ili ćelijska linija koja eksprimuje HER2 mogu biti primenjene kao HER2 protein.
[0047] Sekvenca DNK i aminokiselinska sekvenca od HER2 su stavljene na uvid javnosti na javnoj bazi podataka, i može biti navedena, na primer, pod pristupnim brojem M11730 (GenBank), NP_004439.2 (NCBI), ili slično.
[0048] Dodatno, protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence gde su jedna ili nekoliko aminokiselina supstituisane, izbrisane i/ili dodate u bilo koju od iznad-opisanih aminokiselinskih sekvenci od HER2 i takođe ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od proteina je takođe uključen u HER2.
[0049] Humani HER2 protein je sastavljen od signalne sekvence koja se sastoji od 22 N-terminalna aminokiselinska ostatka, vanćelijskog domena koji se sastoji od 630 aminokiselinskih ostataka, transmembranskog domena koji se sastoji od 23 aminokiselinska ostatka, i unutarćelijskog domena koji se sastoji od 580 aminokiselinskih ostataka.
2. Proizvodnja anti-HER2 antitela
[0050] Antitelo na HER2 predmetnog pronalaska može biti dobijeno u skladu sa, na primer, postupkom koja se uobičajeno izvodi u oblasti, koja obuhvata imunizaciju životinja sa HER2 ili proizvoljnim polipeptidom odabranim od aminokiselinske sekvence od HER2 i prikupljanjem i prečišćavanjem antitela proizvedenih in vivo. Biološka vrsta za HER2 za primenu kao antigen nije ograničena da bude humana, i životinja može biti imunizovana sa HER2 izvedenim iz životinje koja nije čovek kao što je miš ili pacov ili sa pacovom p185neu. U ovom slučaju, ispitivanjem ukrštene-reaktivnosti između vezivanja antitela za dobijeni heterologni HER2 i humani HER2, antitelo primenljivo na bolest ljudi može biti odabrano.
[0051] Dodatno, monoklonsko antitelo može biti dobijeno iz hibridoma utvrđenog fuzionisanjem antitelo-produkujućih ćelija koje proizvode antitelo na HER2 sa ćelijama mijeloma u skladu sa poznatom postupkom (na primer, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, str.495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, str.365-367, Plenum Press, Njujork (1980)).
[0052] HER2 koje treba da se primeni kao antigen može biti dobijeno eksprimovanjem HER2 gena u ćeliji domaćina primenom genetskog inženjeringa.
[0053] Specifično, vektor sposoban za eksprimujeje HER2 gena je proizveden, i dobijeni vektor je transfektovan u ćeliju domaćina da bi se eksprimovao gen, i potom, eksprimuje HER2 je prečišćen.
[0054] Alternativno, iznad-opisane genetskim inženjeringom modifikovane HER2-eksprimujuće ćelije, ili ćelijska linija koja eksprimuje HER2 može biti primenjena kao HER2 protein. Anti-HER2 antitelo može biti dobijeno pomoću procedure poznate u oblasti. U daljem tekstu, postupak dobijanja antitela na HER2 je specifično opisana.
(1) Priprema antigena
[0055] Primeri antigena koji treba da se primeni za proizvodnju anti-HER2 antitela uključuju HER2, ili polipeptid koji se sastoji od delimične aminokiselinske sekvence koja sadrži barem 6 uzastopnih aminokiselina od HER2, ili derivat dobijen dodavanjem date aminokiselinske sekvence ili nosača tome.
[0056] HER2 može biti prečišćen direktno iz tkiva humanog tumora ili ćelija tumora i primenjen. Dodatno, HER2 može biti dobijen njegovim sintetisanjem in vitro ili njegovom proizvodnjom u ćeliji domaćina pomoću genetskog inženjeringa.
[0057] U pogledu genetskog inženjeringa, specifično, nakon što se HER2 cDNK integriše u vektor sposoban za eksprimujeje HER2 cDNK, HER2 može biti dobijen njegovim sintetisanjem u rastvoru koji sadrži enzim, supstrat i energetsku supstancu koja je potrebna za transkripciju i translaciju, ili eksprimovanjem HER2 u drugoj prokariotskoj ili eukariotskoj transformisanoj ćeliji domaćina.
[0058] Dodatno, antigen se može takođe dobiti kao sekretorni protein eksprimovanjem fuzionog proteina dobijenog ligacijom vanćelijskog domena od HER2, koji je membranski protein, za konstantni region antitela u odgovarajući domaćin-vektor sistem.
[0059] HER2 cDNK može se dobiti pomoću, na primer, takozvane PCR postupka u kojoj se polimerazna lančana reakcija izvodi primenom cDNK biblioteke eksprimovanjem HER2 cDNK kao šablona i prajmera koji specifično amplifikuju HER2 cDNK (PCR; Saiki, R. K., i ostali, Science, (1988) 239, str.487-489).
[0060] Kao in vitro sinteza polipeptida, na primer, Rapid Translation System (RTS) proizveden od strane Roche Diagnostics, Inc. može biti uzet za primer, ali nije ograničena na njega.
[0061] Primeri prokariotskih ćelija domaćina uključuju Escherichia coli i Bacillus subtilis. Da bi se transformisale ćelije domaćina sa ciljnim genom, ćelije domaćina se transformišu pomoću plazmidnog vektora koji sadrži replikon, tj., poreklo replikacije izvedeno iz vrste koja je kompatibilna sa domaćinom, i regulatorne sekvence. Dodatno, vektor poželjno ima sekvencu sposobnu za nametanje fenotipske selektivnosti na transformisanu ćeliju.
[0062] Primeri eukariotskih ćelija domaćina uključuju ćelije kičmenjaka, ćelije insekata, i ćelije kvasca. Kao ćelije kičmenjaka, na primer, COS ćelije simijana (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection – Američka kolekcija kultura sojeva), murinski fibroblasti NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), i sojevi deficijentni u dihidrofolat reduktazi (Urlaub, G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (1980) 77, str.4126-4220) ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61); i slično su često korišćeni, međutim, ćelije nisu ograničene na njih.
[0063] Tako dobijeni transformant može biti kultivisan u skladu sa postupkom koja se uobičajeno primenjuje u oblasti, i kultivisanjem transformanta, ciljni polipeptid se proizvodi unutarćelijski ili vanćelijski.
[0064] Pogodni medijum koji se koristi za kultivisanje može biti odabran od raznih medijuma za kulture koji se uobičajeno koriste zavisno od korišćenih ćelije domaćina. Ukoliko se Escherichia coli koristi, na primer, LB medijum dopunjen antibiotikom kao što je ampicilin ili IPMG ukoliko je potrebno može biti primenjen.
[0065] Rekombinantni protein proizveden unutarćelijski ili vanćelijski od transformanta kroz takvo kultivisanje može biti odvojen i prečišćen pomoću bilo koje od raznih poznatih separacionih postupak koje primenjuju fizičko ili hemijsko svojstvo proteina.
[0066] Specifični primeri postupak uključuju tretman sa zajedničkim proteinskim precipitantom, ultrafiltraciju, razne tipove tečne hromatografije kao što su hromatografija na molekularnim sitima (gel filtracija), adsorpciona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, i afinitetna hromatografija, dijaliza, i njihovu kombinaciju.
[0067] Dodatno, kačenjem oznake od šest histidinskih ostataka za rekombinantni protein koji treba da bude eksprimuje, protein može biti efikasno prečišćen sa nikal afinitetnom kolonom. Alternativno, kačenjem IgG Fc regiona za rekombinanti protein koji treba da bude eksprimuje, protein može biti efikasno prečišćen sa protein A kolonom.
[0068] Kombinovanjem iznad-opisanih postupak, velika količina ciljnog polipeptida može biti lako proizvedena u visokom prinosu i visoke čistoće.
[0069] Sam iznad-opisani transformant može biti primenjen kao antigen. Ćelijska linija koja eksprimuje HER2 može takođe biti primenjena kao antigen. Primeri ovakve ćelijske linije mogu uključiti SK-BR-3, BT-474, KPL-4, i JIMT-1 linije humanog kancera dojke, NCI-N87 liniju humanog kancera želuca, i SK-OV-3 liniju humanog kancera jajnika. Ćelijska linija predmetnog pronalaska nije ograničena na ove ćelijske linije sve dok eksprimuje HER2.
(2) Proizvodnja anti-HER2 monoklonskog antitela
[0070] Primeri antitela koja se specifično vezuju sa HER2 uključuju monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje sa HER2, i postupak dobijanja takvog antitela je kao što je opisano ispod.
[0071] Proizvodnja monoklonskog antitela uopšteno zahteva sledeće operativne korake:
(a) prečišćavanje biopolimera koji treba da se primeni kao antigen, ili pripremanje antigen-eksprimujućih ćelija;
(b) pripremanje antitelo-produkujućih ćelija pomoću imunizacije životinje injekcijom antigena, prikupljanje krvi, testiranje titra njegovog antitela da bi se odredilo kada je slezina uklonjena;
(c) pripremanje ćelija mijeloma (u daljem tekstu naznačene kao "mijelomske");
(d) fuzionisanje antitelo-produkujućih ćelija sa mijelomskim;
(e) proveravanje grupe hibridoma koji proizvode željeno antitelo;
(f) podela hibridoma u pojedinačne ćelijske klonove (kloniranje);
(g) po izboru, kultivisanje hibridoma ili uzgoj životinje kojoj je implantiran hibridom za proizvodnju velike količine monoklonskog antitela;
(h) ispitivanje tako proizvedenog monoklonskog antitela na biološku aktivnost i specifičnost vezivanja, ili testiranje istog na svojstva kao obeleženog reagensa; i slično.
[0072] U daljem tekstu, Proizvodni postupak monoklonskog antitela će biti opisana detaljno nakon koraka pomenutih iznad, međutim, postupak nije ograničena na to, i, na primer, drugačije antitelo-produkujuće ćelije od ćelija slezine i mijelomskih mogu biti primenjene.
(a) Prečišćavanje antigena
[0073] Kao antigen, HER2 pripremljen postupkom kao što je iznad opisano ili njegov delimičan peptid može biti primenjen.
[0074] Dodatno, frakcija membrane pripremljena iz rekombinantnih ćelija koje eksprimuju HER2 ili same rekombinantne ćelije koje eksprimuju HER2, i takođe delimičan peptid proteina pronalaska hemijski sintetisan pomoću postupka poznate onima koji su obučeni u oblasti mogu takođe biti primenjeni kao antigen.
[0075] Pored toga, HER2-eksprimujejuća ćelijska linija može takođe biti primenjena kao antigen.
(b) Priprema antitelo-produkujućih ćelija
[0076] Antigen dobijen u koraku (a) je pomešan sa adjuvansom kao što je Freund-ov potpuni ili nepotpuni adjuvans ili pomoćnim agensom kao što je aluminijum kalijum sulfat i dobijena smeša je korišćena kao imunogen da se imunizuje eksperimentalna životinja. Drugi postupak uključuje imunizaciju eksperimentalne životinje sa antigen-ekprimirajućim ćelijama kao imunogenom. Kao eksperimentalna životinja, bilo koja životinja koja se koristi u poznatom postupku proizvodnje hibridoma može biti primenjena bez smetnji. Specifično, na primer, miš, pacov, koza, ovca, govedo, konj, ili slično mogu biti primenjeni. Međutim, sa gledišta lakoće dostupnosti ćelija mijeloma koje treba da se fuzionišu sa ekstrahovanim antitelo-produkujućim ćelijama, miš ili pacov se poželjno primenjuju kao životinja koju treba imunizovati.
[0077] Dodatno, soj miševa ili pacova koji treba da se primeni nije posebno ograničen, i u slučaju miša, na primer, razni sojevi kao što su A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, i 129 i slično mogu biti primenjeni, i u slučaju pacova, na primer, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer i slično mogu biti primenjeni.
[0078] Ovi miševi i pacovi su komercijalno dostupni od uzgajivača/distributera eksperimentalnih životinja, na primer, CLEA Japan, Inc. i Charles River Laboratories Japan, Inc.
[0079] Kao životinja koja treba da se imunizuje, u razmatranju kompatibilnosti fuzionisanja sa ćelijama mijeloma opisanim dole, u slučaju miša, BALB/c soj, i u slučaju pacova, Wistar i Low sojevi su posebno poželjni.
[0080] Dodatno, u razmatranju antigene homologije između ljudi i miševa, takođe je poželjno da se primeni miš koji ima smanjenu biološku funkciju da ukloni auto-antitela, to jest, miš sa autoimunom bolešću.
[0081] Starost takvog miša ili pacova u vreme imunizacije je poželjno 5 do 12 nedelja starosti, poželjnije 6 do 8 nedelja starosti.
[0082] Da bi se imunizovala životinja sa HER2 ili njegovim rekombinantom, na primer, poznata postupak detaljno opisana u, na primer, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology tom I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oksford (1987); Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Ilinois (1964) ili slično može biti primenjena.
[0083] Među ovim postupakma imunizacije, poželjna specifična postupak u predmetnom pronalasku je, na primer, kao što sledi.
[0084] To jest, prvo, membranska proteinska frakcija koja služi kao antigen ili ćelije izazvane da eksprimujeju antigen je/su intradermalno ili intraperitonealno administrirane životinji. Međutim, kombinacija oba puta administracije je poželjna za povećanje efikasnosti imunizacije, i kada je intradermalna administracija izvedena u prvoj polovini i intraperitonealna administracija je izvedena u drugoj polovini ili samo pri poslednjem doziranju, efikasnost imunizacije može biti posebno povećana.
[0085] Raspored administracije antigena varira zavisno od tipa životinje koja treba da se imunizuje, individualne razlike ili slično. Međutim, uopšteno, raspored administracije u kojem je učestalost administracije antigena 3 do 6 puta i interval doziranja je 2 do 6 nedelja je poželjan, i raspored administracije u kojem je učestalost administracije antigena 3 do 4 puta i interval doziranja je 2 do 4 nedelje je poželjniji.
[0086] Dodatno, doza antigena varira zavisno od tipa životinje, individualnih razlika ili slično, međutim, doza je uopšteno podešena na 0.05 do 5 mg, poželjno oko 0.1 do 0.5 mg.
[0087] Buster imunizacija je izvedena 1 do 6 nedelja, poželjno 1 do 4 nedelje, poželjnije 1 do 3 nedelje nakon administracije antigena kao što je iznad opisano. Kada su imunogen ćelije, 1 × 10<6>do 1 × 107 ćelija je primenjeno.
[0088] Doza antigena u vreme izvođenja buster imunizacije varira zavisno od tipa ili veličine životinje ili slično, međutim, u slučaju, na primer, miša, doza je uopšteno podešena na 0.05 do 5 mg, poželjno 0.1 do 0.5 mg, poželjnije oko 0.1 do 0.2 mg. Kada su imunogen ćelije, 1 × 106 do 1 × 107 ćelija je primenjeno.
[0089] Ćelije slezine ili limfociti uključujući antitelo-produkujuće ćelije su aseptično uklonjene iz imunizovane ćelije nakon 1 do 10 dana, poželjno 2 do 5 dana, poželjnije 2 do 3 dana od buster imunizacije. U ovom trenutku, titar antitela se meri, i ako se životinja koja ima dovoljno povećani titar antitela koristi kao izvor snabdevanja antitelo-produkujućih ćelija, naknadna procedura može biti sprovedena efikasnije.
[0090] Primeri postupka merenja titra antitela koje treba da se ovde primeni uključuju RIA metodu i ELISA metodu, ali postupak nije ograničena na njih. Na primer, ukoliko se koristi ELISA metoda, merenje titra antitela u pronalasku može biti sprovedeno u skladu sa procedurama kao što je ispod opisano.
[0091] Prvo, prečišćen ili delimično prečišćen antigen se adsorbuje na površinu čvrste faze kao što je ploča sa 96-bunarića za ELISA, i površina čvrste faze koja nema adsobovan antigen na sebi je prekrivena sa proteinom nepovezanim sa antigenom kao što je albumin goveđeg seruma (bovine serum albumin - BSA). Nakon pranja površine, površina je dovedena u kontakt sa serijski-razblaženim uzorkom (na primer, mišijim serumom) kao primarnim antitelom da bi dozvolio da se antitelo u uzorku veže sa antigen.
[0092] Dodatno, kao sekundarno antitelo, antitelo obeleženo sa enzimom na mišje antitelo je dodato i dozvoljeno mu je da se veže za mišje antitelo. Nakon pranja, supstrat za enzim je dodat i promena u absorbanci koja se javlja usled razvijanja boje koje je indukovano razgradnjom supstrata ili slično je merena i titar antitela je računat na osnovu merenja.
[0093] Razdvajanje antitelo-produkujućih ćelija od ćelija slezine ili limfocita imunizovane životinje može biti sprovedeno u skladu sa poznatom postupkom (na primer, Kohler i ostali, Nature (1975), 256, str.495; Kohler i ostali, Eur. J. Immunol. (1977), 6, str.511; Milstein i ostali, Nature (1977), 266, str. 550; Walsh, Nature (1977), 266, str. 495). Na primer, u slučaju ćelija slezine, opšta postupak u kojoj su antitelo-produkujuće ćelije razdvojene homogenizovanjem slezine da bi se dobile ćelije kroz filtraciju sa mrežicom od nerđajućeg čelika i suspendovanjem ćelija u Eaglovom minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) može biti korišćena.
(c) Priprema ćelija mijeloma (u daljem tekstu naznačene kao "mijelomske")
[0094] Ćelije mijeloma koje treba primeniti za ćelijsku fuziju nisu posebno ograničene i odgovarajuće ćelije mogu biti odabrane iz poznatih ćelijskih linija. Međutim, s obzirom na pogodnost kada je hibridom odabran iz fuzionisanih ćelija, poželjno je primeniti HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibozil transferaza) deficijentni soj čiji je postupak odabira utvrđen.
[0095] Specifičnije, primeri HGPRT-deficijentnog soja uključuju X63-Ag8(X63), NS1-ANS11(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, i BU.1 izvedeni iz miševa; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) izvedeni iz pacova; i U266AR(SKO-007), GM1500·GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) i 8226AR/NIP4-1(NP41) izvedeni iz ljudi. Ovi HGPRT-deficijentni sojevi su dostupni od, na primer, ATCC ili slično.
[0096] Ovi ćelijski sojevi su subkultivisani u odgovarajućem medijumu kao što je 8-azaguanin medijum [medijum dobijen dodavanjem 8-azaguanina u RPMI 1640 medijum kome je dodat glutamin, 2-merkaptoetanol, gentamicin, i fetalni goveđi serum (u daljem tekstu naznačen kao "FCS")], Iscove-ov modifikovani Dulbecco-v medijum (u daljem tekstu naznačen kao "IMDM"), ili Dulbecco-v modifikovani Eagle-ov medijum (u daljem tekstu naznačen kao "DMEM"). U ovom slučaju, 3 do 4 dana pre izvođenja ćelijske fuzije, ćelije su subkultivisane u normalnom medijumu (na primer, ASF104 medijum (proizveden od strane Ajinomoto Co., Ltd.) koji sadrži 10% FCS) da se osigura ne manje od 2 x 107 ćelija na dan ćelijske fuzije.
(d) Ćelijska fuzija
[0097] Fuzija između antitelo-produkujućih ćelija i ćelija mijeloma može biti odgovarajuće izvršena u skladu sa poznatom postupkom (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology tom I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oksford (1987); Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfild, Ilinois (1964), itd.), pod uslovima takvim da stopa preživljavanja ćelija nije prekomerno smanjena.
[0098] Kao takva postupak, na primer, hemijska postupak u kojoj su antitelo-produkujuće ćelije i ćelije mijeloma pomešane u rastvoru koji sadrži polimer kao što je polietilen glikol u visokoj koncentraciji, fizička postupak koja primenjuje električnu stimulaciju, ili slično mogu biti primenjene. Među ovim postupakma, specifičan primer hemijske postupka je kao što je opisano ispod.
[0099] To jest, u slučaju gde je polietilen glikol primenjen u rastvoru koji sadrži polimer u visokoj koncentraciji, antitelo-produkujuće ćelije i ćelije mijeloma su pomešane u rastvoru polietilen glikola koji ima molekulsku masu 1500 do 6000, poželjnije 2000 do 4000 na temperaturi od 30 do 40°C, poželjno od 35 do 38°C tokom 1 do 10 minuta, poželjno 5 do 8 minuta.
(e) Odabir grupe hibridoma
[0100] Postupak odabira hibridoma dobijena iznad-opisanom ćelijskom fuzijom nije posebno ograničena. Obično, HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) postupak odabira (Kohler i ostali, Nature (1975), 256, str.495; Milstein i ostali, Nature (1977), 266, str.550) je primenjena.
[0101] Ova postupak je efikasna kada su hibridomi dobijeni primenom ćelija mijeloma HGPRT-deficijentnog soja koji ne može da preživi u prisustvu aminopterina. To jest, kultivacijom nefuzionisanih ćelija i hibridoma u HAT medijumu, samo hibridomima otpornim na aminopterin je dopušteno da prežive i proliferišu.
(f) Podela u pojedinačni ćelijski klon (kloniranje)
[0102] Kao postupak kloniranja za hibridome, poznata postupak kao što je postupak sa metilcelulozom, postupak sa mekom agarozom, ili postupak ograničenog rastvaranja može biti primenjena (videti, na primer, Barbara, B. M. i Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisko (1980)). Među ovim postupakma, posebno, postupak trodimenzionalne kulture kao što je postupak sa metilcelulozom je poželjna. Na primer, grupa hibridoma proizvedenih ćelijskom fuzijom je suspendovana u metilceluloznom medijumu kao što je ClonaCell-HY Selection Medium D (proizveden od strane StemCell Technologies, Inc., #03804) i kultivisana. Potom, formirane kolonije hibridoma su prikupljene, pri čemu monoklonski hibridomi mogu biti dobijeni. Prikupljene odgovarajuće hibridomske kolonije su kultivisane, i hibridom koji je potvrđen da ima stabilni titar antitela u dobijenom supernatantu hibridomske kulture je odabran kao HER2 monoklonsko antitelo-produkujući hibridomski soj.
(g) Priprema monoklonskog antitela kultivisanjem hibridoma
[0103] Kultivisanjem tako odabranog hibridoma, monoklonsko antitelo može biti efikasno dobijeno. Međutim, pre kultivisanja, poželjno je izvesti ispitivanje hibridoma koji proizvodi ciljno monoklonsko antitelo.
[0104] U takvom ispitivanju, poznata postupak može biti korišćena.
[0105] Merenje titra antitela u pronalasku može biti sprovedeno pomoću, na primer, ELISA postupka koja je objašnjena u stavci (b) koja je opisana iznad.
[0106] Hibridom dobijen pomoću postupka koja je opisana iznad može biti čuvan u zamrznutom stanju u tečnom azotu ili u zamrzivaču na -80°C ili niže.
[0107] Nakon završetka kloniraja, medijum se menja iz HT medijuma u normalni medijum, i hibridom se kultiviše.
[0108] Kultura velikih razmera se izvodi pomoću rotacione kulture primenom velike boce za kulturu ili pomoću “spiner” kulture. Iz supernatanta dobijenog pomoću kulture velikih razmera, monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za protein pronalaska može biti dobijeno prečišćavanjem primenom postupka koja je poznata onima koji su obučeni u oblasti kao što je gel filtracija.
[0109] Dodatno, hibridom je injektiran u abdominalnu šupljinu miša iste loze kao hibridom (na primer, iznad-opisanog BALB/c) ili Nu/Nu miša da proliferiše hibridom, pri čemu ascites koji sadrži veliku količinu monoklonskog antitela pronalaska može biti dobijen.
[0110] U slučaju kada se hibridom administrira u abdominalnu šupljinu, ako se mineralno ulje kao što je 2,6,10,14-tetrametil pentadekan (pristan) administrira 3 do 7 dana pre njega, veća količina ascitesa može biti dobijena.
[0111] Na primer, imunosupresiv je prethodno injektiran u abdominalnu šupljinu miša istog soja kao hibridom da inaktivira T ćelije.20 dana nakon toga, 106 do 107 ćelija hibridomskog klona je suspendovano u medijumu bez seruma (0.5 ml), i suspenzija je administrirana u abdominalnu šupljinu miša. Uopšteno, kada se abdomen proširi i ispuni sa ascitesom, ascites se prikuplja iz miša. Ovom postupkom, monoklonsko antitelo može biti dobijeno u koncentraciji koja je oko 100 puta ili mnogo viša nego ona u rastvoru kulture.
[0112] Monoklonsko antitelo dobijeno pomoću iznad-opisane postupka može biti prečišćeno pomoću postupka koja je opisana u, na primer, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology tom I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oksford (1978).
[0113] Tako dobijeno monoklonsko antitelo ima visoku antigenu specifičnost za HER2. Primeri monoklonskog antitela predmetnog pronalaska mogu uključiti, ali nisu posebno ograničeni na, mišje monoklonsko antitelo 4D5 (ATCC CRL 10463).
(h) Test monoklonskog antitela
[0114] Izotip i potklasa tako dobijenog monoklonskog antitela mogu biti određeni kao što sledi.
[0115] Prvo, primeri identifikacione postupka uključuju Ouchterlony metodu, ELISA metodu, i RIA metodu.
[0116] Ouchterlony postupak je jednostavna, ali kada je koncentracija monoklonskog antitela niska, operacija kondenzacije je neophodna.
[0117] Sa druge strane, kada se ELISA postupak ili RIA postupak primenjuje, direktnim reagovanjem supernatanta kulture sa čvrstom fazom sa adsorbovanim antigenom i primenom antitela koja odgovaraju raznim tipovima imunoglobulinskih izotipova i potklasa kao sekundarnih antitela, izotip i potklasa monoklonskog antitela mogu biti identifikovani.
[0118] Dodatno, kao jednostavnija postupak, komercijalno dostupan komplet za identifikaciju (na primer, Mouse Typer Kit proizveden od strane Bio-Rad Laboratories, Inc.) ili slično može biti primenjen.
[0119] Dodatno, kvantitativno određivanje proteina može biti izvedeno pomoću Folin Lowry postupka i postupka izračunavanja koja je zasnovana na apsorbanci na 280 nm (1.4 (OD 280) = Imunoglobulin 1 mg/ml).
[0120] Dodatno, čak i kada je monoklonsko antitelo odvojeno i nezavisno dobijeno ponovnim izvođenjem koraka (a) do (h) u (2), moguće je dobiti antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost ekvivalentnu onoj od HER2 antitela koje je dobijeno u koraku (g). Kao jedan primer takvog antitela, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao HER2 antitelo dobijeno u koraku (g) može biti predstavljeno. Ukoliko se novoproizvedeno monoklonsko antitelo vezuje za delimični peptid ili delimičnu tercijernu strukturu za koju se anti-HER2 antitelo vezuje, može biti određeno da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-HER2 antitelo. Dodatno, potvrđivanjem da se monoklonsko antitelo takmiči sa anti-HER2 antitelom za vezivanje za HER2 (to jest, monoklonsko antitelo inhibira vezivanje između anti-HER2 antitela i HER2), može biti određeno da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-HER2 antitelo čak iako specifična sekvenca epitopa ili struktura nije određena. Kada je potvrđeno da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-HER2 antitelo, za monoklonsko antitelo se posebno očekuje da ima afinitet za vezivanje antigena ili biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od anti-HER2 antitela.
(3) Druga antitela
[0121] Antitelo pronalaska uključuje ne samo iznad-opisano monoklonsko antitelo na HER2 već takođe rekombinantno antitelo dobijeno veštačkom modifikacijom u svrhu smanjenja heterologne antigeničnosti na ljude kao što su himerno antitelo, humanizovano antitelo i humano antitelo. Ova antitela mogu biti proizvedena primenom poznate postupka.
[0122] Kao himerno antitelo, antitelo u kome su varijabilni i konstantni regioni antitela izvedeni iz različitih vrsta, na primer, himerno antitelo u kojem je varijabilni region antitela izvedenog iz miša ili pacova povezan sa konstantnim regionom antitela izvedenog iz ljudi može biti prikazano kao primer (videti Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81, 6851-6855, (1984)). Primeri himernog antitela predmetnog pronalaska mogu uključiti, ali nisu posebno ograničeni na, himerno antitelo 4D5 koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG1 ili IgG2.
[0123] Kao humanizovano antitelo, antitelo dobijeno integrisanjem samo regiona za određivanje komplementarnosti (complementarity determining region - CDR) u antitelo izvedeno iz ljudi (videti Nature (1986) 321, str.522-525), i antitelo dobijeno graftovanjem dela aminokiselinskih ostataka okvirnog regiona kao i CDR sekvence za humano antitelo pomoću postupka CDR-graftovanja (WO 90/07861), i antitelo humanizovano primenom mutageneza strategije genske konverzije (američki patent sa brojem 5821337) mogu biti uzeti kao primer.
[0124] Termin "nekoliko" kao što je ovde primenjeno se odnosi na 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 ili 2.
[0125] Kao aminokiselinska supstitucija u ovoj specifikaciji, konzervativna aminokiselinska supstitucija je poželjna. Konzervativna aminokiselinska supstitucija se odnosi na supstituciju koja se javlja unutar grupe aminokiselina vezano za aminokiselinske bočne lance. Poželjne aminokiselinske grupe su kao što sledi: kisela grupa (asparaginska kiselina i glutaminska kiselina); bazna grupa (lizin, arginin, i histidin); nepolarna grupa (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, i triptofan); i nenaelaktrisana polarna familija (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, i tirozin). Poželjnije aminokiselinske grupe su kao što sledi: alifatična hidroksi grupa (serin i treonin); grupa koja sadrži amid (asparagin i glutamin); alifatična grupa (alanin, valin, leucin, i izoleucin); i aromatična grupa (fenilalanin, triptofan, i tirozin). Takva aminokiselinska supstitucija se poželjno izvodi unutar opsega koji ne umanjuje svojstva supstance koja ima originalnu aminokiselinsku sekvencu.
[0126] Kombinovanjem sekvence koja ima visoku homologiju sa iznad-opisanom aminokiselinskom sekvencom teškog lanca sa sekvencom koja ima visoku homologiju sa iznadopisanom aminokiselinskom sekvencom lakog lanca, moguće je da se odabere antitelo koje ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od svakog iznad-opisanog antitela. Takva homologija je uopšteno homologija od 80% ili više, poželjno homologija od 90% ili više, poželjnije homologija od 95% ili više, najpoželjnije homologija od 99% ili više. Dodatno, kombinovanjem aminokiselinske sekvence gde je jedan do nekoliko aminokiselinskih ostataka supstituisano, izbrisano ili dodato u aminokiselinsku sekvencu teškog lanca ili lakog lanca, takođe je moguće odabrati antitelo koje ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od svakog iznad-opisanog antitela. Termin "homologija" kao što je ovde primenjeno se primenjuje sa istim značenjem kao "identičnost".
[0127] Homologija između dve aminokiselinske sekvence može biti određena primenom uobičajenih parametara Blast algoritma verzija 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.25: 3389-3402) . Blast algoritam može biti primenjen takođe preko Interneta pristupanjem sajtu www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[0128] Dodatno, antitelo pronalaska uključuje humano antitelo koje se vezuje za HER2. Anti-HER2 humano antitelo se odnosi na humano antitelo koje ima samo sekvencu antitela izvedenog iz humanog hromozoma. Anti-HER2 humano antitelo može biti dobijeno pomoću postupka primenom miša koji proizvodi humano antitelo koji ima humani hromozomski fragment koji sadrži gene teškog i lakog lanca humanog antitela (videti Tomizuka, K. i ostali, Nature Genetics (1997) 16, str. 133-143; Kuroiwa, Y. i ostali, Nucl. Acids Res. (1998) 26, str. 3447-3448; Yoshida, H. i ostali, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects tom 10, str. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. i Iijima, S. urednici), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (2000) 97, str.722-727, itd.).
[0129] Takav miš koji proizvodi humano antitelo može biti kreiran specifično kao što sledi. Genetički modifikovana životinja u kojoj su genski lokusi teškog i lakog lanca endogenog imunoglobulina poremećeni, i umesto toga, genski lokusi teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina uvedeni putem vektora veštačkog hromozoma kvasca (yeast artificial chromosome - YAC) ili slično je kreirana proizvodnjom “nokaut” životinje i transgene životinje i parenjem ovih životinja.
[0130] Dodatno, u skladu sa rekombinantnom DNK tehnikom, primenom cDNK kiselina koje kodiraju svaki od takvog teškog i lakog lanca humanog antitela, i poželjno vektora koji sadrži takve cDNK kiseline, eukariotske ćelije su transformisane, i transformant ćelija koja proizvodi rekombinanto humano monoklonsko antitelo je kultivisana, pri čemu se antitelo može takođe dobiti iz supernatanta kulture.
[0131] Ovde, kao domaćin, na primer, eukariotske ćelije, poželjno ćelije sisara kao što su CHO ćelije, limfociti, ili ćelije mijeloma mogu biti primenjene.
[0132] Dodatno, postupak dobijanja humanog antitela izvedenog iz fagnog displeja odabranog iz biblioteke humanog antitela (videti Wormstone, I. M. i ostali, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), str. 2301-2308; Carmen, S. i ostali, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), str. 189-203; Siriwardena, D. i ostali, Ophthalmology (2002) 109 (3), str.427-431, itd.) je takođe poznata.
[0133] Na primer, postupak fagnog displeja u kojoj je varijabilni region humanog antitela eksprimuje na površini faga kao jednolančano antitelo (scFv), i fag koji se vezuje za antigen je odabran (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), str.1105-1116) može biti primenjena.
[0134] Analiziranjem gena faga odabranog na osnovu vezivanja za antigen, DNK sekvenca koja kodira varijabilni region humanog antitela koje se vezuje za antigen može biti određena.
[0135] Ukoliko je DNK sekvenca od scFv koja se vezuje za antigen određena, humano antitelo može biti dobijeno pripremanjem ekspresionog vektora koji sadrži sekvencu i uvođenjem vektora u odgovarajućeg domaćina da je eksprimuje (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, str.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), str.1105-1116).
[0136] Kao jedan primer drugog indeksa za primenu u poređenju sa svojstvima antitela, stabilnost antitela može biti uzeta kao primer. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (differential scanning calorimetry - DSC) je uređaj koji je sposoban za brzo i tačno merenje srednje temperature termalne denaturacije (Tm) koje treba da se primeni kao povoljan indeks relativne konformacione stabilnosti proteina. Merenjem Tm vrednosti primenom DSC i poređenjem vrednosti, razlika u termalnoj stabilnosti može biti upoređena. Poznato je da stabilnost pri skladištenju antitela pokazuje izvesnu vezu sa termalnom stabilnošću antitela (Lori Burton, i ostali, Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, str. 265-273), i poželjno antitelo može biti odabrano primenom termalne stabilnosti kao indeksa. Primeri drugih indikacija za odabir antitela uključuju sledeće karakteristike: prinos u odgovarajućoj ćeliji je visok; i agregabilnost u vodenom rastvoru je niska. Na primer, antitelo koje prikazuje najviši prinos ne pokazuje uvek najvišu termalnu stabilnost, i stoga, neophodno je da se odabere antitelo najpogodnije za administraciju ljudima sveobuhvatnom procenom zasnovanom na iznadopisanim indikacijama.
[0137] U predmetnom pronalasku, modifikovana varijanta antitela je takođe uključena. Modifikovana varijanta se odnosi na varijantu dobijenu podvrgavanjem antitela predmetnog pronalaska hemijskoj ili biološkoj modifikaciji. Primeri hemijski modifikovane varijante uključuju varijante koje su hemijski modifikovane vezivanjem hemijskog segmenta za aminokiselinski skelet, varijante koje su hemijski modifikovane sa N-vezanim ili O-vezanim ugljovodoničnim lancem, itd. Primeri biološki modifikovane varijante uključuju varijante dobijene post-translacionom modifikacijom (kao što je N-vezana ili O-vezana glikozilacija, N-ili C-terminalna obrada, deamidacija, izomerizacija asparaginske kiseline, ili oksidacija metionina), i varijante u kojima je metioninski ostatak dodat N terminusu bivajući eksprimuje u prokariotskoj ćeliji domaćina. Dodatno, antitelo obeleženo tako da omogući detekciju ili izolaciju antitela ili antigena pronalaska, na primer, enzimom obeleženo antitelo, fluorescentno obeleženo antitelo, i afinitetno obeleženo antitelo su takođe uključena u značenje modifikovane varijante. Takva modifikovana varijanta antitela pronalaska je korisna za poboljšanje stabilnosti i zadržavanja antitela u krvi, smanjivanje njegove antigenosti, detekciju ili izolovanje antitela ili antigena, i tako dalje.
[0138] Dodatno, regulisanjem modifikacije glikana koji je vezan za antitelo pronalaska (glikozilacija, defukozilacija, itd.), moguće je poboljšati antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnu aktivnost. Kao tehnika za regulisanje modifikacije glikana antitela, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, itd. su poznati. Međutim, tehnika nije ograničena na njih. U antitelo predmetnog pronalaska, antitelo u kojem je modifikacija glikana regulisana je takođe uključeno.
[0139] U slučaju gde je antitelo proizvedeno prvo izolovanjem gena antitela i potom uvođenjem gena u odgovarajućeg domaćina, kombinacija odgovarajućeg domaćina i odgovarajućeg ekspresionog vektora može biti primenjena. Specifični primeri gena antitela uključuju kombinaciju gena koji kodira sekvencu teškog lanca antitela koje je opisano u ovoj specifikaciji i gena koji kodira sekvencu njegovog lakog lanca. Kada je ćelija domaćina transformisana, moguće je da se umetne gen sekvence teškog lanca i gen sekvence lakog lanca u isti ekspresioni vektor, i takođe u različite ekspresione vektore odvojeno.
[0140] U slučaju gde su eukariotske ćelije primenjene kao domaćin, životinjske ćelije, biljne ćelije, i eukariotski mikroorganizmi mogu biti primenjeni. Kao životinjske ćelije, ćelije sisara, na primer, COS ćelije simijana (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str.175-182, ATCC CRL-1650), murinski fibroblasti NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), i dihidrofolat reduktaza-deficijentni sojevi (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (1980) 77, str. 4126-4220) ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61) mogu biti uzete kao primer.
[0141] U slučaju gde su primenjene prokariotske ćelije, na primer, Escherichia coli i Bacillus subtilis mogu biti uzeti kao primer.
[0142] Uvođenjem željenog gena antitela u ove ćelije kroz transformaciju i kultivisanje tako transformisanih ćelija in vitro, antitelo može biti dobijeno. U gore opisanom postupku za kultivaciju, prinos može ponekad da varira u zavisnosti od sekvence antitela, i prema tome, moguće je izabrati antitelo koje se lako proizvodi kao farmaceutski preparat korišćenjem prinosa kao indikatora među antitelima koja imaju ekvivalentnu aktivnost vezivanja. Prema tome, u antitelo predmetnog pronalaska, antitelo dobijeno postupkom za proizvodnju antitela, okarakterisano uključivanjem koraka kultivisanja transformisane ćelije domaćina i koraka sakupljanja željenog antitela iz kultivisanog proizvoda dobijenog u koraku kultivacije je takođe uključeno.
[0143] Poznato je da je lizinski ostatak na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenog u kultivisanoj ćeliji sisara izbrisan (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), i takođe je poznato da su dva aminokiselinska ostatka (glicin i lizin) na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenog u kultivisanoj ćeliji sisara izbrisana i prolinski ostatak novo lociran na karboksil terminusu je amidovan (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Međutim, takva delecija i modifikacija sekvence teškog lanca ne utiču na afinitet za vezivanje antigena i efektorsku funkciju (aktivaciju komplementa, ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela, itd.) antitela. Stoga, u antitelu u skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo podvrgnuto takvoj modifikaciji i funkcionalni fragment antitela je takođe uključen, i deleciona varijanta u kojoj su jedna ili dve aminokiseline izbrisane na karboksil terminusu teškog lanca, varijanta dobijena amidacijom delecione varijante (na primer, teški lanac u kome je prolinski ostatak na karboksil terminusu amidovan), i slično su takođe uključeni. Tip delecione varijante koja ima deleciju na karboksil terminusu teškog lanca antitela u skladu sa pronalaskom nije ograničena na gorepomenute varijante sve dok su afinitet za vezivanje antigena i efektorska funkcija sačuvani. Dva teška lanca koja konstituišu antitelo u skladu sa pronalaskom mogu biti od jednog tipa odabranog iz grupe koja se sastoji od teškog lanca u punoj dužini i gore-opisane delecione varijante, ili mogu biti od dva tipa u kombinaciji odabranoj odatle. Na odnos količine svake varijante uklanjanja može uticati tip kultivisanih ćelija sisara koje proizvode antitelo u skladu sa pronalaskom i uslovima kultivisanja, međutim, slučaj kada je jedan aminokiselinski ostatak na karboksilnom kraju izbrisan u oba od dva teška lanca koji su sadržani kao glavne komponente u antitelu u skladu sa pronalaskom mogu služiti kao primer.
[0144] Kao izotip antitela pronalaska, na primer, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) može služiti kao primer, i IgG1 ili IgG2 mogu služiti kao primeri poželjno.
[0145] Kao biološka aktivnost antitela, generalno aktivnost vezivanja antigena, aktivnost internalizacije u ćelije koje eksprimujeju antigen vezivanjem za antigen, aktivnost neutralizacije aktivnosti antigena, aktivnost poboljšavanja aktivnosti antigena, aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), aktivost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), i ćelijski-posredovana fagocitoza zavisna od antitela (ADCP) mogu služiti kao primer. Biološka aktivnost antitela predmetnog pronalaska je aktivnost vezivanja za HER2, i poželjno aktivnost internalizacije u ćelije koje eksprimujeju HER2 vezivanjem za HER2. Dodatno, antitelo predmetnog pronalaska može imati ADCC aktivnost, CDC aktivnost, i/ili ADCP aktivnost dodatno na aktivnost internalizacije u ćelije.
[0146] Dobijeno antitelo može biti prečišćeno do homogenosti. Razdvajanje i prečišćavanje antitela mogu biti izvedeni korišćenjem konvencionalnog postupka razdvajanja proteina i prečišćavanja. Na primer, antitelo može biti razdvojeno i prečišćeno odgovarajućim odabiranjem i kombinovanjem kolonske hromatografije, filter filtracije, ultrafiltracije, preciptacije uz pomoć soli, dijalize, preparativne poliakrilamidne gel elektroforeze, izoelektrične fokusirajuće elektroforeze, i slično (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak i ostali eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), ali postupak nije ograničena na to.
[0147] Primeri takve hromatografije uključuju afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, gel filtracionu hromatografiju, hromatografiju na reverznoj fazi, i adsorpcionu hromatografiju.
[0148] Takva hromatografija može biti izvedena korišćenjem tečne hromatografije kao što su HPLC ili FPLC.
[0149] Kao kolona koja se koristi u afinitetnoj hromatografiji, Protein A kolona i Protein G kolona mogu služiti kao primer. Na primer, kao kolona korišćenje Protein A kolone, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia Corporation) i slično može služiti kao primer.
[0150] Dodatno, korišćenjem nosača koji ima antigen imobilisan na njemu, antitelo može biti prečišćeno korišćenjem svojstva vezivanja antitela za antigen.
[Antitumorsko jedinjenje]
[0151] Antitumorsko jedinjenje koje treba konjugovati sa anti-HER2 antitelo-lek konjugatom predmetnog pronalaska je objašnjeno. Antitumorsko jedinjenje korišćeno u predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno pod uslovom da je to jedinjenje koje ima antitumorski efekat i supstituent grupu ili delimičnu strukturu koja dozvoljava povezivanje sa strukturom linkera. Kada se deo ili ceo linker iscepa u tumorskim ćelijama, segment antitumorskog jedinjenja se oslobađa kako bi ispoljio antitumorski efekat antitumorskog jedinjenja. Kako se linker cepa na vezujućoj poziciji za lek, antitumorsko jedinjenje se oslobađa u nemodifikovanoj strukturi kako bi se ispoljio njegov unutrašnji antitumorski efekat.
[0152] Kao antitumorsko jedinjenje korišćeno u predmetnom pronalasku, eksatekan (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion; prikazan u formuli koja sledi), jedan od derivata kamptotecina, može biti poželjno korišćen.
[0153] Iako ima odličan antitumorski efekat, eksatekan nije bio komercijalizovan kao antitumorski lek. Jedinjenje može biti lako dobijeno pomoću poznatog postupka i amino grupa na poziciji 1 može biti poželjno korišćena kao vezujuća pozicija za strukturu linkera. Dodatno, iako eksatekan može biti takođe oslobođen u tumorskim ćelijama dok je deo linkera još uvek okačen za to, ono je odlično jedinjenje koje ispoljava odličan antitumorski efekat čak i u takvoj strukturi.
[0154] Pošto eksatekan ima strukturu kamptotecina, poznato je da se ravnoteža pomera u strukturu sa zatvorenim laktonskim prstenom (zatvoren prsten) u vodenom kiselom medijumu (na primer, pH 3 ili tako) ali se pomera u stukturu sa otvorenim laktonskim prstenom (otvoreni prsten) u vodenom baznom medijumu (na primer, pH 10 ili tako). Konjugat leka koji se uvodi sa eksatekanskim ostatkom koji odgovara strukturi zatvorenog prstena i očekuje se takođe da struktura otvorenog prstena ima isti antutumorski efekat i nepotrebno je reći da je bilo koja od ovih struktura unutar obima predmetnog pronalaska.
[0155] Dodatni primeri antitumorskog jedinjenja mogu uključiti doksorubicin, daunorubicin, mitomicin C, bleomicin, ciklocitidin, vinkristin, vinblastin, metotreksat, antitumorski agens zasnovan na platini (cisplatin ili njegovi derivati), taksol ili njegove derivati, i druge kampotecine ili njihove derivate (antitumorski agens opisan u japanskom patentu otkrivenom sa br. 6-87746).
[0156] Što se tiče antitelo-lek konjugata, broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela je ključni faktor koji ima uticaj na efikasnost i bezbednost. Proizvodnja antitelo-lek konjugata je izvedena definisanjem uslova reakcije koji uključuju količine sirovog materijala i reagenasa korišćenih za reakciju tako da se ima konstantan broj konjugovanih molekula leka. Smeša koja sadrži različite brojeve konjugovanih molekula leka je generalno dobijena različito od hemijske reakcije jedinjenja niske molekulske mase. Broj lekova konjugovanih u molekulu antitela je izražen ili određen pomoću prosečne vrednosti, to jest, prosečnim brojem konjugovanih molekula leka. Osim ako je specifično opisano drugačije kao princip, broj konjugovanih molekula leka označava prosečnu vrednost osim u slučaju u kom on predstavlja antitelo-lek konjugat koji ima specifičan broj konjugovanih molekula leka koji je uključen u smešu antitelolek konjugata koja ima različite brojeve konjugovanih molekula leka.
[0157] Broj molekula eksatekana konjugovanih za molekul antitela se može kontrolisati, i kao prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela, oko 1 do 10 eksatekana može biti povezano. Poželjno, to je 2 do 8, i poželjnije 3 do 8. U međuvremenu, prosečan poznavalac oblasti može dizajnirati reakciju za konjugaciju potrebnog broja molekula leka za molekul antitela na osnovu opisa iz Primera iz predmetne prijave i može dobiti antitelo-lek konjugat konjugovan sa kontrolisanim brojem molekula eksatekana.
[Struktura linkera]
[0158] Što se tiče anti-HER2 antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska, struktura linkera za konjugovanje antitumorskog jedinjenja za anti-HER2 antitelo je objašnjena. Linker ima strukturu sa sledećom formulom:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-.
Antitelo je povezano sa terminalnim L1 (kraj suprotan vezi sa L2), i antitumorsko jedinjenje je povezano sa karbonil grupom -La-(CH2)n2-C(=O)- segmenta.
[0159] n1 predstavlja ceo broj od 0 do 6 i poželjno je ceo broj od 1 do 5, i poželjnije 1 do 3.
1. L1
[0160] L<1>je predstavljen pomoću sledeće strukture:
-(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-.
U gorepomenutom, n3 je ceo broj od 2 do 8, "-(Sukcinimid-3-il-N)-" ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
[0161] Pozicija 3 gornje delimične strukture je vezujuća pozicija za anti-HER2 antitelo. Veza za antitelo na poziciji 3 je okarakterisana vezivanjem sa tioetarskom formacijom. Azotov atom na poziciji 1 strukturnog segmenta je povezan sa ugljenikovim atomom metilena koji je prisutan unutar linkera koji uključuje stukturu. Specifično, - (Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2- je struktura predstavljena sledećom formulom (ovde, "antitelo-S-" potiče od antitela).
[0162] U formuli, n3 je ceo broj od 2 do 8, i poželjno 2 do 5.
[0163] Specifični Primeri za L<1>mogu uključiti
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, i
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
2. L2
[0164] L2 je predstavljen pomoću sledeće strukture:
-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-,
L2 ne mora biti prisutan, i u takvom slučaju, L2 je jednostruka veza. n4 je ceo broj od 1 do 6, i poželjno 2 do 4. L2 je povezano sa L1 na njegovoj terminalnoj amino grupi i povezan je sa LP na njegovoj karbonil grupi na drugom kraju.
[0165] Specifični primeri za L<2>mogu uključiti
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-
C(=O)-.
3. LP
[0166] LP je peptidni ostatak koji se sastoji od 2 do 7 aminokiselina. Konkretno, sastoji se od oligopeptidnog ostatka u kome je 2 do 7 aminokiselina povezano peptidnom vezom. LP je vezan za L2 na svom N kraju i povezan je sa amino grupom - NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- dela linkera na njegovom C kraju. Ovde, izraz "peptidni ostatak" ili "oligopeptidni ostatak" je grupa izvedena iz peptida koji se sastoji od dva ili više aminokiselinskih ostataka i odnosi se na dvovalentnu grupu čiji su N i C krajevi veze.
[0167] Amino kiselina koja čini L<P>u linkeru nije posebno ograničena, međutim, njeni primeri uključuju L- ili D-amino kiselinu, poželjno L-amino kiselinu. I, to može biti amino kiselina koja ima strukturu kao što je β-alanin, ε-aminokaproična kiselina ili γ-aminobuterna kiselina pored αamino kiseline, dalje, može biti amino kiselina neprirodnog tipa kao što je N-metilovane aminokiseline.
[0168] Aminokiselinska sekvenca LP nije posebno ograničena, ali primeri sastavnih amino kiselina uključuju fenilalanin (Phe; F), tirozin (Tyr; Y), leucin (Leu; L), glicin (Gly; G), alanin (Ala; A), valin (Val; V), lizin (Lys; K), citrulin (Cit), serin (Ser; S), glutaminska kiselina (Glu; E) i asparaginska kiselina (Asp; D). Među njima, poželjni primeri uključuju fenilalanin, glicin, valin, lizin, citrulin, serin, glutaminsku kiselinu i asparaginsku kiselinu. Od ovih aminokiselina, može se konstruisati LP koji ima sekvencu aminokiselina po izboru izabranih sa ili bez preklapanja. U zavisnosti od vrste aminokiselina, obrazac oslobađanja leka se može kontrolisati. Broj aminokiselina može biti između 2 i 7.
[0169] Specifični primeri LP mogu da uključe
-GGF-,
-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,
-GGFG-,
-SGGF-,
-KGGF-,
-DGGFG-,
-GGFGG-,
-DDGGFG-,
-KDGGFG-, i
-GGFGGGF-.
U gornjem tekstu, "(D-)D" predstavlja D-asparaginsku kiselinu. Posebno poželjni primeri LP za konjugat antitelo-lek iz ovog pronalaska mogu uključiti tetrapeptidni ostatak -GGFG-.
4. La-(CH2)n2-C(=O)-
[0170] La u La-(CH2)n2-C(=O)- je -O- struktura ili jednostruka veza. n2 je ceo broj od 0 do 5, poželjno 0 do 3, i poželjnije 0 ili 1.
[0171] Primeri za L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- mogu uključiti sledeće strukture:
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-,
-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-C(=O)-.
[0172] Među ovima,
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-C(=O)-,
ili u slučaju u kome La je jednostruka veza, i n2 je 0 je poželjna.
[0173] Specifični primeri strukture predstavljeni pomoću -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-linkera mogu uključiti
-NH-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-O-C(=O)-.
[0174] Među ovima,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-
su poželjniji.
[0175] U linkeru, dužina lanca od -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je poželjno dužina lanca od 4 do 7 atoma, i poželjnije dužina lanca od 5 ili 6 atoma.
[0176] Što se tiče anti-HER2 antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska, kada je on prebačen u unutrašnjost tumorskih ćelija, predloženo je da se segment linkera iscepa i da derivat leka koji ima strukturu predstavljenu pomoću NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) se oslobodi da bi eksprimovao antitumorsko delovanje. Primeri antitumorskog derivata koji ispoljava antitumorski efekat oslobađanjem iz antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska uključuju antitumorski derivat koji ima segment strukture u kome kraj strukture predstavljene pomoću -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- linkera ima amino grupu, i one posebno poželjne uključujući sledeće.
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0177] U slučaju NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), potvrđeno je da, kako je aminalna struktura u molekulu nestabilna, ono ponovo prolazi kroz samo-degradaciju kako bi se oslobodilo sledeće HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Ta jedinjenja mogu takođe biti poželjno korišćena kao intermedijer u proizvodnji antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska.
[0178] Za antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska u kome eksatekan je korišćen kao lek, poželjno je da segment strukture lek-linker [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] koji ima sledeću strukturu je povezan sa antitelom. Prosečan konjugovan broj pomenutih segmenata strukture lek-linker po molekulu antitela može biti 1 do 10. Poželjno, to je 2 do 8, i poželjnije 3 do 8.
-(Sukcinimid-3-il-N) -CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0179] Među ovima, poželjniji su oni koji slede.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0180] Posebno su poželjni sledeći.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0181] Što se tiče strukture linkera za konjugovanje anti-HER2 antitela i leka u antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska, poželjni linker može biti konstruisan povezivanjem poželjnih struktura prikazanih za svaki deo linkera objašnjen iznad. Kao struktura linkera, oni sa sledećom strukturom mogu biti poželjno korišćeni. U međuvremenu, levi kraj ovih struktura je pozicija vezivanja sa antitelom i desni kraj je pozicija vezivanja sa lekom.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
- (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[0182] Među ovima, poželjniji su ovi koji slede.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[0183] Posebno poželjni uključuju ove koji slede.
-(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[Proizvodni postupak]
[0184] Zatim, objašnjenja su data za reprezentativni postupak za proizvodnju antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska ili proizvodnju njegovog intermedijera. U međuvremenu, jedinjenja su u daljem tekstu opisana sa brojem jedinjenja prikazanim u svakoj reakcionoj formuli. Specifično, oni su naznačeni kao "jedinjenje sa formulom (1)", "jedinjenje (1)", ili slično. Jedinjenja sa brojevima osim tih su takođe slično opisana.
1. Proizvodni postupak 1
[0185] Antitelo-lek konjugat predstavljen pomoću formule (1) u kome je antitelo povezano sa lek-linker strukturom preko tioetra može biti proizveden pomoću postupka koja sledi, na primer.
[0186] [U formuli, AB predstavlja antitelo koje ima sulfhidril grupu, i L1' predstavlja L1 strukturu linkera u kome je kraj linkera maleimidil grupa (formula prikazana ispod)
[0187] (u formuli, azotov atom je vezujuća pozicija), i specifično predstavlja grupu u kojoj -(Sukcinimid-3-il-N)- segment u -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)- od L<1>je maleimidil grupa. Dodatno, -(NH-DX) predstavlja strukturu predstavljenu sledećom formulom:
[0188] i predstavlja grupu koja je izvedena uklanjanjem jednog vodonikovog atoma amino grupe na poziciji 1 eksatekana.]
[0189] Dodatno, jedinjenje sa formulom (1) u gornjoj reakcionoj formuli može biti interpretirano kao struktura u kojoj se jedan segment strukture koji se proteže od leka do kraja linkera vezuje sa jednim antitelom. Međutim, to je samo opis koji je dat zbog praktičnosti, i zapravo postoji mnogo slučajeva u kojima je više segmenata strukture povezano sa jednim molekulom antitela. Isto se primenjuje i za objašnjenje Proizvodnog postupka koji je opisan ispod.
[0190] Antitelo-lek konjugat (1) može biti proizveden reagovanjem jedinjenja (2), koje se može dobiti postupkom opisanim ispod, sa antitelom (3a) koje ima sulfhidril grupu.
[0191] Antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu može biti dobijeno postupkom koja je dobro poznat u oblasti (Hermanson, G.T, Biokonjugat Techniques, str. 56-136, str.456-493, Academic Press (1996)). Primeri uključuju: Traut-ov reagens je reagovao sa amino grupom antitela; N-Sukcinimidil S-acetiltioalkanoati su reagovali sa amino grupom antitela praćeno reakcijom sa hidroksilaminom; nakon reagovanja sa N-Sukcinimidil 3-(piridilditio)propionatom, antitelo je reagovalo sa redukujućim agensom; antitelo je reagovalo sa redukujućim agensom kao što je ditiotreitol, 2-merkaptoetanol, i tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid (TCEP) za redukciju disulfidne veze u delu zgloba u antitelu kako bi se formirala sulfhidril grupa, ali nisu ograničeni na to.
[0192] Specifično, korišćenjem 0.3 do 3 molarnih ekvivalenata od TCEP kao redukujućeg agensa po disulfidu na zglobnom delu u antitelu i reagovanjem sa antitelom u puferskom rastvoru koji sadrži agens za helaciju, antitelo sa delimično ili kompletno redukovanim disulfidom na zglobnom delu u antitelu može biti dobijeno. Primeri agensa za helaciju uključuju etilendiamin tetrasirćetnu kiselinu (EDTA) i dietilentriamin pentasirćetnu kiselinu (DTPA). Može biti primenjen u koncentraciji od 1 mM do 20 mM. Primeri puferskog rastvora koji može biti korišćen uključuju rastvor natrijum fosfata, natrijum borata, ili natrijum acetata. Specifično, reagovanjem antitela sa TCEP na 4°C do 37°C tokom 1 do 4 sata, antitelo (3a) koje ima delimično ili kompletno redukovanu sulfhidril grupu može biti dobijeno.
[0193] U međuvremenu, sporovođenjem reakcije za dodavanje sulfhidril grupe za lek-linker segment, lek-linker segment može biti konjugovan pomoću tioetarske veze.
[0194] Korišćenjem 2 do 20 molarnih ekvivalenata jedinjenja (2) po antitelu (3a) koje ima sulfhidril grupu, antitelo-lek konjugat (1) u kome 2 do 8 molekula leka su konjugovani po molekulu antitela može biti proizveden. Specifično, dovoljno je da rastvor koji sadrži jedinjenje (2) rastvoreno u tome je dodato u puferski rastvor koji sadrži antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu za reakciju. Ovde, primeri za puferski rastvor koji može biti korišćen uključuju rastvor natrijum acetata, natrijum fosfata, i natrijum borata. pH za reakciju je 5 do 9, i poželjnije reakcija je izvedena blizu pH 7. Primeri rastvarača za rastvaranje jedinjenja (2) uključuju organski rastvarač kao dimetil sulfoksid (DMSO), dimetilformamid (DMF), dimetil acetamid (DMA), i N-metil-2-piridon (NMP).
[0195] Dovoljno je da se rastvor organskog rastvarača koji sadrži jedinjenje (2) ratvoreno u njemu doda pri 1 do 20% v/v u puferski rastvor koji sadrži antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu za reakciju. Temperatura reakcije je 0 do 37°C, poželjnije 10 do 25°C, i vreme reakcije je 0.5 do 2 sata. Reakcija može biti završena deaktiviranjem reaktivnosti neizreagovanog jedinjenja (2) sa reagensom koji sadrži tiol. Primeri reagensa koji sadrže tiol uključuju cistein i N-acetil-L-cistein (NAC). Specifičnije, 1 do 2 molarna ekvivalenta od NAC su dodati u korišćeno jedinjenje (2) i, inkubiranjem na sobnoj temperaturi tokom 10 do 30 minuta, reakcija može biti završena.
[0196] Proizvedeni antitelo-lek konjugat (1) može, nakon koncentracije, izmene pufera, prečišćavanja, i merenja koncentracije antitela i prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u skladu sa uobičajenim procedurama opisanim ispod, biti podvrgnut identifikaciji antitelo-lek konjugata (1) .
Uobičajena procedura A: Koncentracija vodenog rastvora antitela ili antitelo-lek konjugata
[0197] U Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Co.) kontejneru, rastvor antitela ili antitelolek konjugata je dodat i rastvor antitela ili antitelo-lek konjugata je koncentrovan centrifugiranjem (centrifuga tokom 5 do 20 minuta na 2000 G do 3800 G) korišćenjem centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).
Uobičajena procedura B: Merenje koncentracije antitela
[0198] Korišćenjem UV detektora (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), merenje koncentracije antitela je izvedeno u skladu sa postupkom definisanim od strane proizvođača. U to vreme, 280 nm apsorpcioni koeficijent različit za svako antitelo je korišćen (1.3 mLmg-1cm-1 do 1.8 mLmg-1cm-1).
Uobičajena procedura C-1: Izmena pufera za antitelo
[0199] NAP-25 kolona (Kat. br. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) korišćenjem Sephadex G-25 nosača je ekvilibrisana sa fosfatnim puferom (10 mM, pH 6.0; nazvan je kao PBS6.0/EDTA u specifikaciji) koji sadrži natrijum hlorid (137 mM) i etilen diamin tetrasirćetnu kiselinu (EDTA, 5 mM) u skladu sa postupkom definisanim od strane proizvođača. Vodeni rastvor antitela je primenjen u količini od 2.5 mL u jednoj NAP-25 koloni, i zatim frakcija (3.5 mL) je eluirana sa 3.5 mL PBS6.0/EDTA je sakupljena. Dobijena frakcija je koncentrovana pomoću Uobičajene procedure A. Nakon merenja koncentracije antitela korišćenjem Uobičajene procedure B, Koncentracija antitela je podešena do 10 mg/mL korišćenjem PBS6.0/EDTA.
Uobičajena procedura C-2: Izmena pufera za antitelo
[0200] NAP-25 kolona (Kat. br. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) korišćenjem Sephadex G-25 nosača je ekvilibrisana sa fosfatnim puferom (50 mM, pH 6.5; nazvan je kao PBS6.5/EDTA u specifikaciji) koji sadrži natrijum hlorid (50 mM) i EDTA (2 mM) u skladu sa postupkom definisanim od strane proizvođača. Vodeni rastvor antitela je nanet u količini od 2.5 mL na jednu NAP-25 kolonu, i zatim frakcija (3.5 mL) eluirana sa 3.5 mL PBS6.5/EDTA je sakupljena. Dobijena frakcija je koncentrovana pomoću Uobičajene procedure A. Nakon merenja koncentracije antitela korišćenjem Uobičajene procedure B, koncentracija antitela je podešena na 20 mg/mL korišćenjem PBS6.5/EDTA.
Uobičajena procedura D: Prečišćavanje antitelo-lek konjugata
[0201] NAP-25 kolona je ekvilibrisana sa bilo kojim puferom odabranim od komercijalno dostupnog fosfatnog pufera (PBS7.4, Kat. br.10010-023, Invitrogen), natrijum fosfatnog pufera (10 mM, pH 6.0; nazvan je kao PBS6.0) koji sadrži natrijum hlorid (137 mM), i acetatni pufer koji sadrži sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; nazvan je kao ABS u specifikaciji). Vodeni rastvor reakcije antitelo-lek konjugata je nanet u količini od oko 1.5 mL na NAP-25 kolonu, i zatim eluiran sa puferom u količini definisanoj od strane proizvođača kako bi se sakupila frakcija antitela. Sakupljena frakcija je ponovo naneta na NAP-25 kolonu i, ponavljanjem 2 do 3 puta ukupno proces prečišćavanja gel filtracijom za eluiranje sa puferom, antitelo-lek konjugat isključujući ne-konjugovani linker leka i jedinjenje niske molekulske mase (tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid (TCEP), N-acetil-L-cistein (NAC), i dimetil sulfoksid) je dobijeno.
[0202] Uobičajena procedura E: Merenje koncentracije antitela u antitelo-lek konjugatu i prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu (1) antitela.
[0203] Koncentracija konjugovanog leka u antitelo-lek konjugatu može biti izračunata merenjem UV apsorbance vodenog rastvora antitelo-lek konjugata na dve talasne dužine od 280 nm i 370 nm, praćeno izvođenjem izračunavanja prikazanog ispod.
[0204] Pošto je ukupna apsorbanca na bilo kojoj talasnoj dužini jednaka zbiru apsorbance svih hemijskih vrsta koje apsorbuju svetlost koje su prisutne u sistemu (aditivnost apsorbance), kada molarni apsorpcioni koeficijenti antitela i leka ostaju isti pre i posle konjugacije između antitela i leka, koncentracija antitela i koncentracija leka u antitelo-lek konjugatu izraženi su sledećim jednačinama.
[0205] U gorepomenutom, A280predstavlja apsorbancu vodenog rastvora antitelo-lek konjugata na 280 nm, A370predstavlja apsorbancu vodenog rastvora antitelo-lek konjugata na 370 nm, AA,280predstavlja apsorbancu antitela na 280 nm, AA,370predstavlja apsorbancu antitela na 370 nm, AD,280predstavlja apsorbancu prekursora konjugata na 280 nm, AD,370predstavlja apsorbancu prekursora konjugata na 370 nm, εA,280predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent antitela na 280 nm, εA,370predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent antitela na 370 nm, εD,280predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent prekursora konjugata na 280 nm, εD,370predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent prekursora konjugata na 370 nm, CApredstavlja koncentraciju antitela u antitelo-lek konjugatu, i CDpredstavlja koncentraciju leka u antitelo-lek konjugatu.
[0206] Kao εA,280, εA,370, εD,280, i εD,370u gorepomenutom, prethodno pripremljene vrednosti (procenjene vrednosti zasnovane na izračuvanju ili merenju vrednosti dobijenih pomoću UV merenja jedinjenja) su korišćene. Na primer, εA,280može biti procenjen iz aminokiselinske sekvence antitela korišćenjem poznate metode za izračunavanje (Protein Science, 1995, tom 4, 2411-2423). εA,370je generalno nula. U primerima, kao molarni apsorpcioni koeficijent trastuzumaba, εA,280= 215400 (procenjena vrednost na osnovu izračunavanja) i εA,370= 0 su korišćeni. εD,280i εD,370mogu biti dobijeni na osnovu Lambert-Beer-ovog zakona (Apsorbanca = molarna koncentracija × molarni apsorpcioni koeficijent × dužina ćelijske putanje) merenjem apsorbance rastvora u kome je prekursor konjugata koji će biti korišćen rastvoren u određenoj molarnoj koncentraciji. Kao molarni apsorpcioni koeficijent linkera leka u Primerima, εD,280= 5000 (izmerena prosečna vrednost) i εD,370= 19000 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni, ukoliko nije drugačije određeno. Merenjem A280i A370vodenog rastvora antitelo-lek konjugata i rešavanjem simultanih jednačina (I) i (II) korišćenjem vrednosti, CAi CDmogu biti dobijeni. Dodatno, deljenjem CDsa CA, prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela može biti dobijen.
[0207] Uobičajena procedura F: Merenje (2) prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u antitelo-lek konjugatu.
[0208] Prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u antitelo-lek konjugatu može takođe biti određen analizom tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) korišćenjem sledećeg postupka pored prethodno pomenute Uobičajene procedure E.
[F-1. Priprema uzorka za HPLC analizu (redukcija antitelo-lek konjugata)]
[0209] Rastvor antitelo-lek konjugata (oko 1 mg/mL, 60 µL) je izmešan sa vodenim rastvorom ditiotreitola (DTT) (100 mM, 15 µL). Uzorak u kome je disulfidna veza između L lanca i H lanca antitelo-lek konjugata je iscepana inkubiranjem smeše tokom 30 minuta na 37°C je korišćen u HPLC analizi.
[F-2. HPLC analiza]
[0210] HPLC analiza je izvedena u sledećim uslovima merenja:
HPLC sistem: Agilent 1290 HPLC sistem (Agilent Technologies, Inc.)
Detektor: ultravioletni apsorpcioni spektrometar (talasna dužina merenja: 280 nm) Kolona: PLRP-S (2.1 × 50 mm, 8 µm, 1000 angstroma; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)
Temperatura kolone: 80°C
Mobilna faza A: vodeni rastvor koji sadrži 0.04% trifluorosirćetnu kiselinu (TFA) Mobilna faza B: acetonitrilni rastvor koji sadrži 0.04% TFA
Program gradijenta: 29%-36% (0-12.5 min), 36%-42% (12.5-15 min), 42%-29% (15-15.1 min), i 29%-29% (15.1-25 min)
Zapremina ubrizgavanja uzorka: 15 µL
[F-3. Analiza podataka]
[F-3-1] U poređenju sa L (L0) i H (H0) lancima ne-konjugovanog antitela, L (L lanac vezan za jedan molekul leka: L1) i H (H lanac vezan za jedan molekul leka: H1, H lanac vezan za dva molekula leka: H2, H lanac vezan za tri molekula leka: H3) lanci konjugovani za lek ispoljavaju višu hidrofobnost u proporciji sa brojem konjugovanih molekula leka i prema tome imaju veće vreme retencije. Ovi lanci su stoga eluirani po redosledu od L0i L1ili H0, H1, H2, i H3. Pikovi detekcije mogu biti dodeljeni bilo kom od L0, L1, H0, H1, H2, i H3poređenjem vremena retencije sa L0i H0.
[F-3-2] Pošto linker leka ima UV apsorpciju, vrednosti u oblasti pika su korigovane u odgovoru na broj konjugovanih molekula linkera leka u skladu sa sledećim izrazom korišćenjem molarnih apsorpcionih koeficijenata L ili H lanca i linkera leka.
[0212] Ovde, za molarni apsorpcioni koeficijent (280 nm) L ili H lanca svakog antitela, vrednost procenjena iz aminokiselinske sekvence L ili H lanca svakog antitela pomoću poznate postupka izračunavanja (Protein Science, 1995, tom. 4, 2411-2423) može biti korišćena. U slučaju trastuzumaba, molarni apsorpcioni koeficijent od 26150 i molarni apsorpcioni koeficijent od 81290 su korišćeni kao procenjene vrednosti za L i H lance, redom, u skladu sa njegovom aminokiselinskom sekvencom. Kao molarni apsorpcioni koeficijent (280 nm) linkera leka, izmereni molarni apsorpcioni koeficijent (280 nm) jedinjenja u kome je maleimid grupa konvertovana u sukcinimid tioetar reakcijom svakog linkera leka sa merkaptoetanolom ili N-acetilcisteinom je korišćen.
[F-3-3] Odnos oblasti pika (%) svakog lanca je izračunata za ukupne korigovane vrednosti oblasti pikova u skladu sa sledećim izrazom.
[0213] [F-3-4] Prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u antitelo-lek konjugatu je izračunata u skladu sa sledećim izrazom.
Prosečan broj konjugovanih molekula leka = (L0odnos oblasti pika x 0 L0odnos oblasti pika x 1 H0odnos oblasti pika x 0 H1odnos oblasti pika x 1 H2odnos oblasti pika x 2 H3odnos oblasti pika x 3) / 100 x 2
[0214] Intermedijerno jedinjenje proizvodnje u Proizvodnom postupku 1 je opisano ispod. Jedinjenje predstavljeno formulom (2) u Proizvodnom postupku 1 je jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
(maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX).
[0215] U formuli,
n<3>predstavlja ceo broj od 2 do 8,
L2 predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
gde n4 predstavlja ceo broj od 1 do 6,
LP predstavlja peptidni ostatak od koji se sastoji od 2 do 7 aminokiseline izabrane od fenilalanina, glicina, valina, lizina, citrulina, serina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline,
n1 predstavlja ceo broj od 0 do 6,
n2 predstavlja ceo broj od 0 do 5,
L3 predstavlja -O- ili jednostruku vezu,
(maleimid-N-il)- je maleimidil grupa (2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il grupa) predstavljena sledećom formulom:
[0216] gde azotov atom je vezujuća pozicija, i
-(NH-DX) je grupa predstavljena sledećom formulom:
gde atom azota amino grupe na poziciji 1 je vezujuća pozicija.
[0217] Kada je L<2>jednostruka veza ili -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)-, poželjno je za intermedijer u proizvodnji da n4 bude ceo broj od 2 do 4.
[0218] Što se tiče peptidnog ostatka LP, jedinjenje koje ima peptidni ostatak koji se sastoji od aminokiseline izabrane od fenilalanina, glicina, valina, lizina, citrulina, serina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline je poželjno kao proizvodni intermedijer. Među tim peptidnim ostacima, jedinjenje u kome je LP peptidni ostatak koji se sastoji od 4 aminokiseline je poželjno kao proizvodni intermedijer. Tačnije, jedinjenje u kome je LP tetrapeptidni ostatak -GGFG- je poželjno kao proizvodni intermedijer.
[0219] Dodatno, kao -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-, jedinjenje koje ima -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili - NHCH2CH2-O-CH2- je poželjno kao intermedijer u proizvodnji. Jedinjenje koje ima -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2je poželjnije.
[0220] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) u kome n3 je ceo broj od 2 do 5, L2 je jednostruka veza, i - NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjno kao intermedijer u proizvodnji. Jedinjenje u kome -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjnije. Jedinjenje u kome n3 je ceo broj od 2 ili 5 je dodatno poželjno.
[0221] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) u kome n3 je ceo broj od 2 do 5, L2 je -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 je ceo broj od 2 do 4, i -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili - NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjno kao intermedijer u proizvodnji. Jedinjenje u kome n<4>je ceo broj od 2 ili 4 je poželjnije. Jedinjenje u kome -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je dodatno poželjno.
[0222] Poželjni primeri intermedijera korisnog u proizvodnji takvog jedinjenja predmetnog pronalaska mogu uključiti ono što sledi.
(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=O) - (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=O) - (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O) - (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C (=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O) - (NH-DX).
[0223] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti proizveden reagovanjem lek-linker jedinjenja odabranog od gore-pomenute grupe intermedijernih jedinjenja u proizvodnji sa anti-HER2 antitelom ili njegovim reaktivnim derivatom kako bi se time formirala tioetarska veza na mestu disulfidne veze prisutne u zglobnom delu anti-HER2 antitela. U ovom slučaju, reaktivni derivat anti-HER2 antitela je poželjno korišćen, i reaktivni derivat dobijen pomoću redukujućeg anti-HER2 antitela je posebno poželjan.
[0224] Slede jedinjenja poželjnija kao intermedijer u proizvodnji.
(maleimid-N-il) -CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O) - (NH-DX), (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=O) -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O)- (NH-DX).
[0225] Među gore-pomenutom grupom internedijernih jedinjenja, jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ili (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
je dodatno poželjno jedinjenje.
[0226] Da bi se osigurala količina konjugata, može se mešati više konjugata dobijenih u sličnim uslovima proizvodnje da bi se dobio ekvivalentni broj lekova (npr., oko ± 1) da bi se pripremile nove količine. U ovom slučaju, prosečan broj lekova je između prosečnih brojeva lekova u konjugatima pre mešanja.
2. Proizvodni postupak 2
[0227] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) kao intermedijer korišćeno u prethodnom proizvodnom postupku i njegova farmakološki prihvatljiva so mogu biti proizvedeni pomoću sledećeg postupka, na primer.
[0228] U formuli, L1' predstavlja terminalnu maleimidil grupu, i P1, P2, i P3 svaki predstavlja zaštitnu grupu.
[0229] Jedinjenje (6) može biti proizvedeno derivatizacijom karboksilne kiseline (5) u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, kiseli halid, ili slično i reagovanjem toga sa NH2-DX(4) ili njegovom farmakološki prihvatljivom soli. NH2-DX (4) označava eksatekan (hemijski naziv: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion).
[0230] Reakcioni reagensi i uslovi koji su uobičajeno korišćeni za sintezu peptida mogu biti korišćeni za reakciju. Postoje razne vrste aktivnog estra. Na primer, može biti proizveden reagovanjem fenola kao što je p-nitrofenol, N-hidroksi benzotriazol, N-hidroksi sukcinimid, ili slično, sa karboksilnom kiselinom (5) korišćenjem agensa za kondenzovanje kao što je N,N'-dicikloheksilkarbodiimid ili 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid. Dodatno, aktivni estar može takođe biti proizveden pomoću reakcije karboksilne kiseline (5) sa pentafluorofenil trifluoroacetatom ili slično; reakcije karboksilne kiseline (5) sa 1-benzotriazolil oksitripirolidinofosfonijum heksafluorofosfitom; reakcije karboksilne kiseline (5) sa dietil cijanofosfonatom (postupak usoljavanja); reakcije karboksilne kiseline (5) sa trifenilfosfinom i 2,2'-dipiridil disulfidom (Mukaiyama-ovaj postupak); reakcije karboksilne kiseline (5) sa triazin derivatom kao što je 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid (DMTMM); ili slično. Dodatno, reakcija može takođe biti izvedena pomoću, npr., postupci sa kiselim halidom pomoću koje je karboksilna kiselina (5) tretirana sa kiselim halidom kao što je tionil hlorid i oksalil hlorid u prisustvu baze.
[0231] Reagovanjem sa aktivnim estrom, mešovitim kiselim halidom, ili kiselim halidom karboksilne kiseline (5) dobijenim kao iznad sa jedinjenjem (4) u prisustvu pogodne baze u inertnom rastvaraču na -78°C do 150°C, jedinjenje (6) može biti proizvedeno. (U međuvremenu, "inertni rastvarač" označava rastvarač koji ne inhibira reakciju za koju je rastvarač korišćen.)
[0232] Specifični primeri baze za svaki korak opisan iznad uključuju karbonat, alkoksid, hidroksid ili hidrid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala kao što je natrijum karbonat, kalijum karbonat, natrijum etoksid, kalijum butoksid, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, natrijum hidrid, i kalijum hidrid; organometalnu bazu predstavljenu alkil litijumom kao što je nbutil litijum, ili dialkilamino litijum kao što je litijum diizopropilamid; organometalnu bazu bisililamina kao što je litijum bis(trimetilsilil)amid; i organsku bazu koja uključuje tercijarni amin ili heterociklično jedinjenje koje sadrži azot kao što je piridin, 2,6-lutidin, kolidin, 4-dimetilaminopiridin, trietilamin, N-metil morfolin, diizopropiletilamin, i diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU).
[0233] Primeri intertnog rastvarača koji je korišćen za reakciju predmetnog pronalaska uključuju halogenovani ugljovodonični rastvarač kao što je dihlorometan, hloroform, i ugljenik tetrahlorid; etarski rastvarač kao što je tetrahidrofuran, 1,2-dimetoksietan, i dioksan; aromatični ugljovodonični rastvarač kao što su benzen i toluen; i amidni rastvarač kao što su N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, i N-metilpirolidin-2-on. Dodatno ovima, sulfoksid rastvarač kao što je dimetil sulfoksid i sulfolan; i ketonski rastvarač kao što je aceton i metil etil keton i alkoholni rastvarač kao što je metanol i etanol može biti korišćen u nekim slučajevima. Dodatno, mešoviti rastvarač može biti primenjen od njih.
[0234] Kao zaštitna grupa P1 za terminalnu amino grupu jedinjenja (6), zaštitna grupa za aminu grupu koja je generalno korišćena za sintezu peptida, na primer, terc-butiloksi karbonil grupa, 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, ili benziloksi karbonil grupa, može biti primenjena. Primeri drugih zaštitnih grupa za amino grupu uključuju alkanoil grupu kao što je acetil grupa; alkoksikarbonil grupu kao što je metoksikarbonil grupa i etoksikarbonil grupa; arilmetoksi karbonil grupu kao što je parametoksibenziloksi karbonil grupa, i para (ili orto)nitrobenziloksi karbonil grupa; arilmetil grupu kao što je benzil grupa i trifenil metil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i aril sulfonil grupu kao što je 2,4-dinitrobenzen sulfonil grupa i ortonitrobenzen sulfonil grupa. Zaštitna grupa P1 može biti odabrana u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu koju treba zaštiti.
[0235] Uklanjanjem zaštitne grupe P1 za terminalnu amino grupu dobijenog jedinjenja (6), jedinjenje (7) može biti proizvedeno. U deprotekciji, reagensi i uslovi mogu biti odabrani zavisno od zaštitne grupe.
[0236] Jedinjenje (9) može biti proizvedeno derivatizovanjem peptidne karboksilne kiseline (8), koja ima N kraj zaštićen sa P2, u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, ili slično i reagovanjem toga sa jedinjenjem (7) koje je dobijeno. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje petidne veze između peptidne karboksilne kiseline (8) i jedinjenja (7) bi mogli pogodno biti odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P2 može biti pogodno odabrana od onih opisanih za zaštitnu grupu jedinjenja (6), i selekcija može biti načinjena na osnovu, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu koju treba zaštiti. Kao što je generalno korišćeno za peptidnu sintezu, ponavljanjem sekvencijalno reakcije i deprotekcije amino kiseline ili peptida koji konstituišu peptidnu karboksilnu kiselinu (8) za elongaciju, jedinjenje (9) takođe može biti proizvedeno.
[0237] Uklanjanjem zaštitne grupe P<2>za amino grupu jedinjenja (9) koje je dobijeno, jedinjenje (10) može biti proizvedeno. U deprotekciji, reagensi i uslovi mogu biti odabrni zavisno od zaštitne grupe.
[0238] Moguće je da se proizvede jedinjenje (2) derivatizacijom karboksilne kiseline (11) u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, kiseli halid, ili slično i reagovanjem toga sa dobijenim jedinjenjem (10). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između karboksilne kiseline (11) i jedinjenja (10) mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6).
[0239] Jedinjenje (9) može takođe biti proizvedeno pomoću postupka koja sledi, na primer.
[0240] Jedinjenje (13) može biti proizvedeno derivatizacijom peptidne karboksilne kiseline (8) koja ima N kraj zaštićen sa P2 u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, ili slično i reagovanjem toga u prisustvu baze sa aminskim jedinjenjem (12) koje ima karboksi grupu zaštićenu sa P3. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (8) i jedinjenja (12) mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<2>za amino grupu jedinjenja (13) nije posebno ograničena sve dok je to zaštitna grupa generalno korišćena.
[0241] Specifično, primeri zaštitne grupe za hidroksil grupu mogu uključiti alkoksimetil grupu kao što je metoksimetil grupa; arilmetil grupu kao što je benzil grupa, 4-metoksibenzil grupa, i trifenilmetil grupa; alkanoil grupu kao što je acetil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i silil grupu kao što je terc-butil difenilsilil grupa. Karboksi grupa može biti zaštićena, npr., kao estar sa alkil grupom kao što je metil grupa, etil grupa, i terc-butil grupa, alil grupa, ili arilmetil grupa kao što je benzil grupa. Primeri zaštitne grupe za amino grupu mogu uključiti: alkiloksi karbonil grupu kao što je terc-butiloksi karbonil grupa, metoksikarbonil grupa, i etoksikarbonil grupa; aliloksikarbonil grupu, ili arilmetoksi karbonil grupu kao što je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, benziloksi karbonil grupa, parametoksibenziloksi karbonil grupa, i para (ili orto)nitrobenziloksi karbonil grupa; alkanoil grupu kao što je acetil grupa; arilmetil grupu kao što je benzil grupa i trifenil metil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i aril sulfonil grupu kao što je 2,4-dinitrobenzen sulfonil grupa ili ortonitrobenzen sulfonil grupa.
[0242] Što se tiče zaštitne grupe P3 za karboksi grupu, zaštitna grupa obično korišćena kao zaštitna grupa za karboksi grupu u organskoj sintetičkoj hemiji, posebno, sintezi peptida može biti primenjena. Specifično, ona može biti pogodno odabrana od zaštitnih grupa opisanih iznad, na primer, estara sa alkil grupom kao što je metil grupa, etil grupa, ili terc-butil, alil estara, i benzil estara.
[0243] U takvim slučajevima, zaštitna grupa za amino grupu i zaštitna grupa za karboksi grupu mogu biti one poželjno uklonjene pomoću drugačijih postupaka ili drugačijih uslova. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P2 je terc-butiloksi karbonil grupa i P3 je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti odabrane od onih pomenutih ranije u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koja imaju amino grupu i karboksi grupu koje treba zaštiti. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0244] Uklanjanjem zaštitne grupe P3 za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (13), jedinjenje (14) može biti proizvedeno. U deprotekciji, reagensi i uslovi su odabrani zavisno od zaštitne grupe.
[0245] Jedinjenje (9) može biti proizvedeno derivatizovanjem dobijenog jedinjenja (14) u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, kiseli halid, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6) .
[0246] Jedinjenje (2) može biti takođe proizvedeno pomoću postupka koja sledi, na primer.
[0247] Uklanjanjem zaštitne grupe P2 za amino grupu jedinjenja (13), jedinjenje (15) može biti proizvedeno. U deprotekciji, reagensi i uslovi mogu biti odabrani zavisno od zaštitne grupe.
[0248] Jedinjenje (16) može biti proizvedeno derivatizovanjem derivata (11) karboksilne kiseline u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, kiseli halid, ili slično i reagovanjem toga u prisustvu baze sa jedinjenjem (15) koje je dobijeno. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između peptidne karboksilne kiseline (11) i jedinjenja (15) mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6).
[0249] Uklanjanjem zaštitne grupe za karboksi grupu jedinjenja (16) koje je dobijeno, jedinjenje (17) može biti proizvedeno. Deprotekcija može biti izvedena slično deprotekciji na karboksi grupi za proizvodnju jedinjenja (14).
[0250] Jedinjenje (2) može biti proizvedeno derivatizovanjem jedinjenja (17) u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, kiseli halid, ili slično i reagovanjem toga sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6) .
3. Proizvodni postupak 3
[0251] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) intermedijera može biti takođe proizvedeno pomoću postupka koja sledi.
[0252] U formuli, L1' odgovara L1 koji ima strukturu u kojoj je kraj konvertovan u maleimidil grupu, i P<4>predstavlja zaštitnu grupu.
[0253] Jedinjenje (19) može biti proizvedeno derivatizovanjem jedinjenja (11) u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, ili slično i reagovanjem toga u prisustvu baze sa peptidnom karboksilnom kiselinom (18) koja ima C kraj zaštićen sa P<4>. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeno za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (18) i jedinjenja (11) mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P4 za karboksi grupu jedinjenja (18) može biti pogodno odabrana od zaštitnih grupa opisanih iznad.
[0254] Uklanjanjem zaštitne grupe za karboksi grupu jedinjenja (19) koje je dobijeno, jedinjenje (20) može biti proizvedeno. Deprotekcija može biti izvedena slično deprotekciji karboksi grupe za proizvodnju jedinjenja (14).
[0255] Jedinjenje (2) može biti proizvedeno derivatizovanjem jedinjenja (20) koje je dobijeno u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, ili slično i reagovanjem toga sa jedinjenjem (7). Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6).
4. Proizvodni postupak 4
[0256] U nastavku, postupak za proizvodnju jedinjenja (10b) koje ima n1 = 1, La = O u intermedijeru (10) proizvodnje opisanom u Proizvodnom postupku 2 je opisan detaljno. Jedinjenje predstavljeno formulom (10b), njegova so ili solvat može biti proizvedeno u skladu sa postupkom koja sledi, na primer.
[0257] U formuli, LP je definisan iznad, L predstavlja acil grupu koja je alkanoil grupa kao što je acetil grupa ili aroil grupa kao što je benzoil grupa, ili vodonikov atom, X i Y svaki predstavlja oligopeptid koji se sastoji od 1 do 3 aminokiseline, P5 i P7 svaki predstavlja zaštitnu grupu za amino grupu, i P6 predstavlja zaštitnu grupu za karboksi grupu.
[0258] Jedinjenje predstavljeno formulom (21) može biti proizvedeno korišćenjem ili primenjivanjem postupka opisanim u Japanskom patentu otkrivenom sa br. 2002-60351 ili literaturi (J. Org. Chem., tom 51, strana 3196, 1986), i sprovođenjem uklanjanja zaštitnih grupa ili modifikacije funkcionalnih grupa, ako je potrebno. Dalje, ono može biti takođe dobijeno tretiranjem aminokiseline sa zaštićenom terminalnom amino grupom ili kiselim amidom oligopeptida sa zaštićenom amino grupom sa aldehidom ili ketonom.
[0259] Reagovanjem jedinjenja (21) sa jedinjenjem (22) koje ima hidroksil grupu na temperaturi koja je u rasponu od temperaturnih uslova hlađenja do sobne temperature u inertnom rastvaraču u prisustvu kiseline ili baze, jedinjenje (23) može biti proizvedeno.
[0260] Ovde, primeri kiseline koja može biti korišćena uključuju neorgansku kiselinu kao što je fluorovodonična kiselina, hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, i borna kiselina; organsku kiselinu kao što je sirćetna kiselina, limunska kiselina, paratoluen sulfonska kiselina, i metansulfonska kiselina; i Luisovu kiselinu kao što je tetrafluoroborat, cink hlorid, kalaj hlorid, aluminijum hlorid, i gvožđe hlorid. Među ovima sulfonska kiselina, posebno, paratoluen sulfonska kiselina je poželjna. Što se tiče baze, bilo koja od već spomenutih baza može biti pogodno odabrana i korišćena. Poželjni primeri istih uključuju alkoksid alkalnog metala kao što je kalijum terc-butoksid, hidroksid alkalnog metala kao što su natrijum hidroksid i kalijum hidroksid; hidrid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala kao što su natrijum hidrid i kalijum hidrid; organometalnu bazu predstavljenu dialkilamino litijumom kao što je litijum diizopropilamid; i organometalnu bazu bisililamina kao što je litijum bis(trimetilsilil)amid.
[0261] Primeri rastvarača koji će se koristiti za reakciju uključuju etarski rastvarač kao što je tetrahidrofuran i 1,4-dioksan; i aromatični ugljovodonični rastvarač kao što je benzen i toluen. Ti rastvarači mogu biti pripremljeni kao smeša sa vodom.
[0262] Dodatno, zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljeno pomoću P5 nije posebno ograničena pod uslovom da je grupa uobičajeno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni Primeri uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u Proizvodnom postupku 2. Međutim, u trenutnoj reakciji, mogu postojati slučajevi u kojima je zaštitna grupa za amino grupu koja je predstavljena pomoću P5 iscepana. U takvim slučajevima, zaštitna grupa može biti uvedena ponovo odgovarajućim izvođenjem reakcije sa pogodnim reagensom za zaštitu amino grupe kao što može biti potrebno.
[0263] Jedinjenje (24) može biti proizvedeno uklanjanjem zaštitne grupe P6 jedinjenja (23). Ovde, reprezentativni primeri zaštitne grupe za karboksi grupu predstavljene pomoću P6 su opisani u Proizvodnom postupku 2, i ona može biti odgovarajuće odabrana od njih. U jedinjenju (23), poželjno je u ovom slučaju da zaštitna grupa P5 za amino grupu i zaštitna grupa P6 za karboksi grupu su zaštitne grupe koje mogu biti uklonjene pomoću drugačijeg postupka ili drugačijih uslova. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<5>je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa i P6 je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti odabrane u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu i karboksi grupu koje treba zaštititi. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi su odabrani zavisno od zaštitne grupe.
[0264] Jedinjenje (26) može biti proizvedeno derivatizovanjem karboksilne kiseline (24) u aktivni estar, mešoviti kiseli anhidrid, kiseli halid, ili slično i reagovanjem toga sa jedinjenjem (4) ili njegovom farmakološki prihvatljivom soli kako bi se proizvelo jedinjenje (25) praćeno uklanjanjem zaštitne grupe P5 jedinjenja (25) koje je dobijeno. Za reakciju između jedinjenja (4) i karboksilne kiseline (24) i reakciju za uklanjanje zaštitine grupe P<6>, isti reagensi i reakcioni uslovi kao oni opisani za Proizvodni postupak 2 mogu biti primenjeni.
[0265] Jedinjenje (10b) može biti proizvedeno reagovanjem jedinjenja (26) sa aminokiselinom sa zaštićenom terminalnom amino grupom ili oligopeptidom (27) sa zaštićenom amino grupom kako bi se proizvelo jedinjenje (9b) i uklanjanjem zaštitne grupe P7 jedinjenja (9b) koje je dobijeno. Zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljena pomoću P7 nije posebno ograničena pod uslovom da je generalno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni primeri navedenog uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u Proizvodnom postupku 2. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi su odabrani zavisno od zaštitne grupe. Za reakciju između jedinjenja (26) i jedinjenja (27), reakcioni reagensi i uslovi koji su uobičajeno korišćeni za sintezu peptida mogu biti upotrebljeni. Jedinjenje (10b) proizvedeno pomoću ranijeg pomenutog postupka može biti derivatizovano u jedinjenje (1) predmetnog pronalaska u skladu sa postupkom opisanim iznad.
5. Proizvodni postupak 5
[0266] U daljem tekstu, postupak za proizvodnju jedinjenja (2) koje ima n<1>= 1, n<2>= 1, L<a>= O u intermedijeru (2) proizvodnje opisanom u Proizvodnom postupku 2 je opisana detaljno. Jedinjenje predstavljeno formulom (2), njegova so ili solvat može biti proizvedeno u skladu sa postupkom koja sledi, na primer.
[0267] U formuli, L1' , L2, LP su kao što je definisano iznad, Z predstavlja oligopeptid koji se sastoji od 1 do 3 aminokiseline, P<8>predstavlja zaštitnu grupu za amino grupu, i P<9>predstavlja zaštitnu grupu za karboksi grupu.
[0268] Jedinjenje (30) može biti proizvedeno uklanjanjem zaštitne grupe P8 aminokiseline ili oligopeptida (28) sa zaštićenom terninalnom amino grupom i karboksi grupom kako bi se proizvelo jedinjenje (29) i reagovanjem dobijenog aminskog oblika (29) sa jedinjenjem (11). Zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljeno pomoću P8 nije posebno ograničena pod uslovom da je to grupa uobičajeno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni primeri uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u Proizvodnom postupku 2. Dodatno, za uklanjanje zaštitne grupe P8, reagensi i uslovi mogu biti odabrani zavisno od zaštitne grupe. Za reakciju između jedinjenja (29) i karboksilne kiseline (11), isti reagensi i reakcioni uslovi kao oni opisani za Proizvodni postupak 2 mogu biti primenjeni.
[0269] Intermedijer (2b) proizvodnje može biti proizveden uklanjanjem zaštitne grupe P9 jedinjenja (30) kako bi se proizvelo jedinjenje (31) i reagovanjem dobijene karboksilne kiseline (31) sa jedinjenjem (26). Reprezentativni primeri zaštitne grupe za karboksi grupu predstavljene pomoću P8 su opisani u Proizvodnom postupku 2. Za njihovu reakciju deprotekcije, isti reagensi i reakcioni uslovi kao oni opisani za Proizvodni postupak 2 mogu biti primenjeni. Za reakciju između jedinjenja (26) i karboksilne kiseline (31), reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni. Jedinjenje (2b) proizvedeno pomoću prethodno pomenutog postupka može biti derivatizovano u jedinjenje (1) predmetnog pronalaska u skladu sa postupkom opisanim iznad.
6. Proizvodni postupak 6
[0270] U daljem tekstu, postupak za proizvodnju jedinjenja (17b) koje ima n<1>= 1, n<2>= 1, L<a>= O u intermedijeru (17) proizvodnje opisanom u Proizvodnom postupku 2 je opisana detaljno. Jedinjenje predstavljeno formulom (17b), njegova so ili solvat može takođe biti proizvedeno u skladu sa postupkom koja sledi, na primer.
[0271] U formuli, L1' , L2, LP, X, Y, P5, P6, i P7 su kao što je definisano iznad.
[0272] Jedinjenje (33) može biti proizvedeno uklanjanjem zaštitne grupe P5 za amino grupu jedinjenja (23) koje ima zaštićenu terminalnu amino grupu i karboksi grupu kako bi se proizvelo jedinjenje (32) i reagovanjem dobijenog aminskog derivata (32) sa oligopeptidom (27) koji ima zaštićenu terminalnu amino grupu ili zaštićenu amino grupu. Zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljena pomoću P5 nije posebno ograničena pod uslovom da je to grupa uobičajeno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni primeri uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u Proizvodnom postupku 2. Dodatno, za uklanjanje zaštitne grupe P<5>, reagensi i uslovi mogu biti odabrani zavisno od zaštitne grupe. Ovde, iako reprezentativni primeri zaštitne grupe za karboksi grupu kao što je predstavljena pomoću P6 i zaštitne grupe za amino grupu kao što je predstavljeno pomoću P7 uključuju zaštitne grupe za karboksi grupu i amino grupu koje su opisane u Proizvodnom postupku 2. Poželjno je da u jedinjenju (33), zaštitna grupa P6 za karboksi grupu i zaštitna grupa P7 za amino grupu su zaštitne grupe koje mogu biti uklonjene pomoću istog postupka ili istih uslova. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P6 je benzil estar grupa i P7 je benziloksi karbonil grupa.
[0273] Jedinjenje (34) može biti proizvedeno uklanjanjem zaštitne grupe P6 za karboksi grupu jedinjenja (33) i zaštitne grupe P<7>za amino grupu jedinjenja (33). Jedinjenje (37) može takođe biti proizvedeno sekvencijalnim uklanjanjem zaštitne grupe P6 za karboksi grupu i zaštitne grupe P7 za amino grupu, i osim toga, jedinjenje (34) može biti proizvedeno jednostavno uklanjanjem odmah obe zaštitne grupe P6 i P7 koje mogu biti uklonjene istim postupkom ili istim uslovima.
[0274] Jedinjenje (17b) može biti proizvedeno reagovanjem dobijenog jedinjenja (34) sa jedinjenjem (11). Za reakciju između jedinjenja (34) i jedinjenja (11), isti reagensi i reakcioni uslovi kao oni opisani za Proizvodni postupak 2 mogu biti primenjeni.
[0275] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska, kada je ostavljen na vazduhu ili je ponovo kristalisao ili je prečišćen, može apsorbovati vlagu ili imati adsorpcionu vodu ili se pretvoriti u hidrat, i takva jedinjenja ili soli koji sadrže vodu su takođe uključeni u predmetni pronalazak.
[0276] Jedinjenja obeležena sa raznim radioaktivnim ili neradioaktivnim izotopima su takođe uključena u predmetni pronalazak. Jedan ili više atoma koji formiraju antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska mogu da sadrže atomski izotop u ne-prirodnom odnosu. Primeri atomskih izotopa uključuju deuterijum (<2>H), tricijum (<3>H), jod-125 (<125>I), i ugljenik-14 (<14>C). Dodatno, jedinjenje predmetnog pronalaska može biti radioaktivno-obeleženo sa radioaktivnim izotopom kao što je tricijum (3H), jod-125 (125I), ugljenik-14 (14C), bakar-64 (64Cu), cirkonijum-89 (89Zr), jod-124 (124I), fluor-18 (18F), indijum-111 (111I), ugljenik-11 (11C) i jod-131 (131I). Jedinjenje obeleženo sa radioaktivnim izotopom je korisno kao terapijski ili profilaktički agens, reagens za istraživanje kao što je reagens za testiranje i agens za dijagnozu kao što je in vivo dijagnostički imidžing agens. Bez povezanosti sa radioaktivnošću, bilo koji izotopski tip antitelolek konjugata predmetnog pronalaska je unutar obima predmetnog pronalaska.
[Lekovi]
[0277] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska ispoljava citotoksičnu aktivnost za kancerske ćelije, i prema tome, on može biti primenjen kao lek, posebno kao terapijski agens i/ili profilaktički agens za kancer.
[0278] Naime, anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti selektivno korišćen kao lek za hemoterapiju, što je glavni postupak za lečenje kancera, i kao rezultat, može da odloži razvoj kancerskih ćelija, inhibira njihov rast, i dodatno ubije kancerske ćelije. Ovo može da dozvoliti da pacijenti sa kancerom budu oslobođeni simptoma uzrokovanih kancerom ili da se postigne poboljšanje u QOL (quality of life - kvalitetu života) pacijenata sa kancerom i ostvari terapijski efekat održavajući živote pacijenata sa kancerom. Čak i ako anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska ne postigne ubijanje kancerskih ćelija, može postići veći QOL kod pacijenata sa kancerom postižući dugoročno preživljavanje, inhibiranjem ili kontrolisanjem rasta kancerskih ćelija.
[0279] U takvoj terapiji lekom, on može biti primenjen kao lek sam i dodatno, on može biti primenjen kao lek u kombinaciji sa dodatnom terapijom u adjuvantnoj terapiji i može biti kombinovan sa hirurškom operacijom, radioterapijom, hormonskom terapijom, ili slično. Osim toga, može biti primenjen kao lek za terapiju lekom u neoadjuvantnoj terapiji.
[0280] Pored terapijske primene kao što je opisano iznad, efekat supresije rasta malih metastatskih kancerskih ćelija i dodatno ubijanje njih može takođe biti očekivano. Posebno, kada je ekspresija HER2 potvrđena u primarnim kancerskim ćelijama, inhibicija kancerske metastaze ili profilaktičkog efekta se može očekivati administriranjem anti-HER2 antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska. Na primer, efekat inhibiranja i ubijanja kancerskih ćelija u telesnoj tečnosti u toku metastaze ili efekat, na primer, inhibiranja i ubijanja malih kancerskih ćelija odmah nakon implantacije u bilo koje tkivo se može očekivati. Shodno tome, može se očekivati inhibicija kancerske metastaze ili profilaktički efekat, posebno, posle hirurškog uklanjanja kancera.
[0281] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska se može očekivati da ispolji terapijski efekat administracijom kao sistemska terapija pacijentima, i dodatno, lokalnom administracijom kancerskim tkivima.
[0282] Primeri tipa kancera na koji anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti primenjen mogu uključiti kancer pluća, urotelijalni kancer, kolorektalni kancer, kancer prostate, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, gastrointestinalni stromalni tumor, kancer grlića materice, kancer jednjaka, karcinom skvamoznih ćelija, peritonealni kancer, kancer jetre, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer rektuma, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer materice, kancer pljuvačnih žlezda, kancer bubrega, kancer vulve, kancer tiroidee, ili kancer penisa. Subjekat za tretman anti-HER2 antitelo-lek konjugatom predmetnog pronalaska je kancerska ćelija koja eksprimuje, u kancerskoj ćeliji kao subjektu za tretman, HER2 protein koji antitelo unutar antitelo-lek konjugata može prepoznati. Termin "kancer koji eksprimuje HER2 protein" kao što je korišćeno u predmetnoj specifikaciji je kancer koji sadrži ćelije koje imaju HER2 protein na njihovoj ćelijskoj površini. HER2 protein je prekomerno eksprimuje u raznim humanim tumorima i može biti procenjen korišćenjem postupka generalno izvedenim u oblasti, kao što je postupak imunohistohemijskog bojenja (IHC) za procenu prekomerne ekspresije HER2 proteina, ili postupkom fluorescentne in situ hibridizacije (FISH) za procenu amplifikacije HER2 gena.
[0283] Dodatno, anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska ispoljava antitumorski efekat prepoznavanjem, kroz njegovo anti-HER2 antitelo, HER2 proteina eksprimujeog na površini kancerskih ćelija i internalizovanjem u kancerske ćelije. Prema tome, subjekat za tretman anti-HER2 antitelo-lek konjugatom predmetnog pronalaska nije ograničen na "kancer koji eksprimuje HER2 protein" i može takođe biti, na primer, leukemija, maligni limfom, plazmacitom, mijelom, ili sarkom.
[0284] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti poželjno administriran sisaru, ali je poželjnije administriran čoveku.
[0285] Supstance korišćene u farmaceutskoj kompoziciji koje sadrže anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska mogu biti pogodno odabrane i primenjene iz formulacionih aditiva ili slično koji su generalno korišćeni u oblasti, u pogledu doze ili koncentracije koja se administrira.
[0286] Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti administriran kao farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv sastojak. Na primer, farmaceutska kompozicija iznad tipično sadrži najmanje jedan farmaceutski nosač (na primer, sterilisana tečnost). Ovde, tečnost uključuje, na primer, vodu i ulje (petrolej ulje i ulje životinjskog porekla, biljnog porekla, ili sintetičkog porekla. Ulje može biti, na primer, ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, ili susamovo ulje. Voda je tipičniji nosač kada se farmaceutska kompozicija iznad intravenski administrira. Fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze, i vodeni rastvor glicerola mogu biti takođe korišćeni kao tečni nosač, posebno, za rastvor za ubrizgavanje. Pogodni farmaceutski nosač može biti odabran od onih poznatih u oblasti. Ako je poželjno, kompozicija iznad može takođe da sadrži količinu u tragovima agensa za vlaženje, agensa za emulzifikaciju, ili agensa za puferovanje za pH. Primeri pogodnog farmaceutskog nosača su stavljeni na uvid javnosti u "Remington's Pharmaceutical Sciences" od strane E. W. Martin. Formulacije odgovaraju načinu administracije.
[0287] Razni sistemi isporuke su poznati i oni mogu biti primenjeni za administriranje anti-HER2 antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska. Primeri puta za administraciju mogu uključiti intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, i subkutane puteve, ali nisu ograničeni na to. Administracija može biti učinjena injekcijom ili bolus injekcijom, na primer. U skladu sa specifičnim poželjnim tehničkim rešenjem, administracija antitelo-lek konjugata je izvedena ubrizgavanjem. Parenteralna administracija je poželjan put administracije.
[0288] U skladu sa reprezentativnim tehničkim rešenjem, farmaceutska kompozicija je propisana, kao farmaceutska kompozicija pogodna za intravensku administraciju čoveku, u skladu sa konvencionalnim procedurama. Kompozicija za intravensku administraciju je tipično rastvor u sterilnom i izotoničnom vodenom puferskom rastvoru. Ako je neophodno, lek može da sadrži agens za solubilizaciju i lokalne anestetike za ublažavanje bola na mestu ubrizgavanja (na primer, lignokain). Generalno, sastojak gorenaveden je obezbeđen pojedinačno kao bilo koji od liofilizovanog praha ili anhidrovanog koncentrata koji je sadržan u kontejneru koji je dobijen zaptivanjem u ampulu ili kesicu koja ima količinu aktivnog agensa ili kao smeša u jediničnom doznom obliku. Kada lek treba da se administrira ubrizgavanjem, može se administrirati iz boce za ubrizgavanje koja sadrži vodu ili fiziološki rastvor sterilnog farmaceutskog kvaliteta. Kada se lek administrira ubrizgavanjem, može se obezbediti ampula sterilne vode ili fiziološkog rastvora za ubrizgavanje, tako da se gore pomenuti sastojci mešaju jedan sa drugim pre administracije.
[0289] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti farmaceutska kompozicija koja sadrži samo anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska ili farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-HER2 antitelo-lek konjugat i najmanje jedan agens za lečenje kancera pored konjugata. Anti-HER2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti administriran sa drugim agensima za lečenje kancera. Anti-kancerski efekat može biti poboljšan u skladu sa tim. Drugi anti-kancerski agensi korišćeni za takvu svrhu mogu biti administrirani pojedincu simultano sa, odvojeno od, ili nakon antitelo-lek konjugata, i mogu biti administrirani dok se menja interval administracije za svaki. Primeri agenasa sa lečenje kancera uključuju 5-FU, pertuzumab, paklitaksel, karboplatin, cisplatin, gemcitabin, kapecitabin, irinotekan (CPT-11), paklitaksel, docetaksel, pemetreksed, sorafenib, vinblastin, vinorelbin, everolims, tanespimicin, bevacizumab, oksaliplatin, lapatinib, ado-trastuzumab emtansin(T-DM1), ili lekove opisane u Međunarodnoj objavi br. WO 2003/038043, LH-RH analoge (leuprorelin, goserelin, ili slično), estramustin fosfat, estrogen antagoniste (tamoksifen, raloksifen, ili slično), i inhibitore aromataze (anastrozol, letrozol, eksemestan, ili slično), ali nisu ograničeni sve dok su oni lekovi koji imaju antitumorsku aktivnost.
[0290] Farmaceutska kompozicija može biti formulisana u formulaciji liofilizacije ili tečnu formulaciju kao formulaciju koja ima željeni sastav i potrebnu čistoću. Kada je formulisana kao formulacija liofilizacije, to može biti formulacija koja sadrži pogodne formulacione aditive koji su korišćeni u oblasti. Takođe za tečnu formulaciju, ona može biti formulisana kao tečna formulacija koja sadrži razne formulacione aditive koji su korišćeni u oblasti.
[0291] Kompozicija i koncentracija farmaceutske kompozicije može varirati u zavisnosti od postupka administracije. Međutim, anti-HER2 antitelo-lek konjugat sadržan u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska može da ispolji farmaceutski efekat čak i pri maloj dozi kada antitelo-lek konjugat ima viši afinitet za antigen, to jest, viši afinitet (= niža Kd vrednost) u pogledu konstante disocijacije (to jest, Kd vrednost) za antigen. Prema tome, za određivanje doze antitelo-lek konjugata, doza može biti određena s obzirom na situaciju koja se odnosi na afinitet između antitelo-lek konjugata i antigena. Kada je antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska administriran čoveku, na primer, oko 0.001 do 100 mg/kg može biti administrirano jednom ili administriran nekoliko puta sa intervalom od tokom 1 do 180 dana.
u jednom trenutku sa intervalom od 1 do 180 dana Primeri
[0292] Predmetni pronalazak je specifično opisan u pogledu primera opisanih ispod. Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na njih. Dodatno, to se nikako ne tumači na ograničen način. Dodatno, ukoliko nije specifično opisano drugačije, reagens, rastvarač, i polazni materijal opisan u specifikaciji može se lako dobiti od komercijalnog dobavljača.
Referentni Primer 1 Priprema trastuzumaba
[0293] Četrnaest bočica sa 440 mg/bočici Herceptina (Genentech, Inc.) su rastvorene u 2 L pufera A za katjon-izmenjivačku hromatografiju (25 mM citratni pufer, 30 mM NaCl, pH 5.0) i filtrirano je kroz 0.2 µm filter (Millipore Corp.: Stericup 0.22 µm, GVPVDF Membrane). Uzorci su primenjeni na kolonu za katjon-izmenjivačku hromatografiju (SP Sepharose HP 240 ml, XK50 kolona), praćeno eluiranjem sa linearnom gradijentom koncentracije NaCl od 30 mM do 500 mM korišćenjem pufera B za katjon-izmenjivačku hromatografiju (25 mM citratni pufer, 500 mM NaCl, pH 5.0) kako bi se odvojile IgG monomerne frakcije. Monomerni uzorci koji imaju višu čistoću preko 98% pomoću analize ekskluzionom hromatografijom po veličini su kombinovani i koncentrovani sa UF30K (Millipore Corp.: PELLICON XL Filter, BIOMAX 30K, PXB030A50), i pufer je zamenjen sa CBS puferom (10 mM citrat/140 mM NaCl, pH 6.0). Uzorci sa zamenjenim CBS puferom su filtrirani kroz 0.2 µm filter (Sartorius AG: Minisart-Plus 0.2 µm, 17823K).
Referentni Primer 2 Proizvodnja trastuzumab emtansina T-DM1
[0294] SMCC derivatizacija antitela: Korišćenjem Uobičajene procedure C-2 (PBS6.5/EDTA je korišćen kao puferski rastvor), Uobičajene procedure A, i Uobičajene procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.37 mLmg-1cm-1 je korišćen) opisane u Proizvodnom postupku 1, zamena pufera sa PBS6.5/EDTA je izvedena na trastuzumabu proizvedenom u Referentnom Primeru kako bi se pripremio rastvor koji sadrži trastuzumab (160.0 mg) rastvoren u PBS6.5/EDTA (7.60 mL) u polipropilenskoj epruveti od 15 mL. Zatim, SMCC (1.84 mg) DMSO rastvor (0.40 mL; koji odgovara sa oko 5.1 ekvivalenata po molekulu antitela) je dodat na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je podešena da ima koncentraciju antitela od 20mg/mL, i reakcija je izvedena na sobnoj temperaturi korišćenjem rotatora za epruvete (MTR-103, proizveden od strane AS ONE Corporation) tokom 2 sata. Ova reakcija je podvrgnuta prečišćavanju u skladu sa Uobičajenom procedurom D-2 (PBS6.5/EDTA je korišćen kao puferski rastvor) kako bi se dobilo 12 mL rastvora koji sadrži 154.9 mg SMCC-derivatizovanog antitela. Konjugacija između antitela i linkera leka: Dodavanje PBS6.5/EDTA (2.56 mL) i N2-deacetil-N2-(3-merkapto-1-oksopropil)-maitansin (4.67 mg; DM1, Journal of Medicinal Chemistry, 2006, tom 49, br. 14, str. 4392) DMA (dimetilacetamid) rastvora (0.93 mL; koji odgovara na oko 5.8 ekvivalenata po SMCC-derivatizovanom molekulu antitela) u rastvor dobijen iznad u polipropilenskoj epruveti od 50 mL na sobnoj temperaturi, reakcioni rastvor je podešen do koncentracije antitela od 10 mg/mL, i reakcija je izvedena na sobnoj temparetauri korišćenjem rotatora za epruvete tokom 16.5 sati.
[0295] Procedura prečišćavanja: Gornji rastvor je podvrgnut pečišćavanju korišćenjem Uobičajene procedure D-1 korišćenjem natrijum fosfatnog puferskog rastvora (10 mM, pH 6.5) koji sadrži natrijum hlorid (137 mM) kako bi se dobilo 35 mL rastvora koji sadrži ciljno jedinjenje iz Referentnog Primera.
[0296] Fizičko-hemijska karakterizacija: Korišćenjem Uobičajene procedure E korišćenjem UV apsorbance na dve talasne dužine od 252 nm i 280 nm, sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0297] Koncentracija antitela: 4.14 mg/mL, prinos antitela: 144.9 mg (91%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.0.
Primer 1 Intermedijer (1)
[0298]
Proces 1: terc-Butil (4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)karbamat
[0299] 4-(terc-Butoksikarbonilamino)butanska kiselina (0.237 g, 1.13 mmol) je rastvorena u dihlorometanu (10 mL), N-hidroksisukcinimid (0.130 g, 1.13 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (0.216 g, 1.13 mmol) su dodati i mešano je tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat ukapima u N,N-dimetilformamidni rastvor (10 mL) napunjen sa soli metansulfonske kiseline eksatekana (0.500 g, 0.94 mmol) i trietilaminom (0.157 mL, 1.13 mmol), i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel hromatografijom na koloni [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0.595 g, kvantitativna).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J=7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J=7.2 Hz), 1.82-1.89 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2.39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J=6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.40 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+
Proces 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]butanamid
[0300] Jedinjenje (0.388 g, 0.61 mmol) dobijeno u Procesu 1 iznad je rastvoreno u dihlorometanu (9 mL). Trifluorosirćetna kiselina (9 mL) je dodata i mešano je tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel hromtografijom na koloni [hloroform – podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] kako bi se dobio trifluoroacetat jedinjenja iz naslova (0.343 g, kvantitativna).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2.17 (2H, m), 2.27 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.80-2.86 (2H, m), 3.15-3.20 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.72 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+
Primer 2 antitelo-lek konjugat (2)
Proces 1: N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0302] N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicin (0.081 g, 0.19 mmol) je rastvoren u dihlorometanu (3 mL), N-hidroksisukcinimid (0.021 g, 0.19 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodimid hidrohlorid (0.036 g, 0.19 mmol) su dodati i zatim mešani tokom 3.5 sata. Reakcioni rastvor je dodat u kapima rastvoru N,N-dimetilformamida (1.5 mL) koji je napunjen sa jedinjenjem (0.080 g, 0.15 mmol) dobijenim u procesu 2 iz primera 1, i mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform – hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.106 g, 73%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J=12.7, 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3.16-3.19 (2H, m), 3.54 (2H, d, J=5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J=5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.2 Hz).
MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+
Proces 2: glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0303] Jedinjenje (1.97 g, 2.10 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad je rastvoreno u dihlorometanu (7 mL). Nakon dodavanja trifluorosirćetne kiseline (7 mL), mešano je tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i ostaci su napunjeni sa toluenom za azeotropnu destilaciju. Dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform – podeljen organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije trifluoroacetat jedinjenja iz naslova (1.97 g, 99%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 (2H, m), 2.12-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.03-3.09 (3H, m), 3.18-3.19 (2H, m), 3.58-3.60 (2H, m), 3.64 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.69 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J=16.8, 5.9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 7.17-7.27 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.78-7.81 (2H, m), 7.95-7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+
Proces 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10, 13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0304] N,N-dimetilformamidnom (1.2 mL) rastvoru jedinjenja (337 mg, 0.353 mmol) koje je dobijeno u procesu 2 iznad, trietilamin (44.3 mL, 0.318 mmol) i N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (119.7 mg, 0.388 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 5 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (278.0 mg, 76%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.66-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.05-2.21 (6H, m), 2.39 (3H, s), 2.79 (1H, dd, J=14.0, 9.8 Hz), 2.98-3.21 (5H, m), 3.55-3.77 (8H, m), 4.41-4.48 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.40 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.54-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.20-7.27 (5H, m), 7.30 (1H, s), 7.70 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.14 (1H, d, J=7.9 Hz), 8.25 (1H, t, J=6.1 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.5 Hz). MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+
Proces 4: antitelo-lek konjugat (2)
[0305] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg<-1>cm-1) opisane u Proizvodnom postupku 1. Rastvor (3.0 mL) je stavljen u polipropilensku epruvetu od 15 mL i napunjen je sa vodenim rastvorom 10 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorida (TCEP, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0934 mL; 4.6 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.150 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0306] Konjugacija između antitela i linkera leka: posle inkubiranja rastvora iznad na 22°C tokom 10 minuta, DMSO rastvor (0.187 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje koje je dobijeno u procesu 3 je dodat tome i inkubiran je za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0374 mL; 18.4 ekvivalenata po molekulu antitela) N-acetilcisteina (NAC, Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i inkubiran je na 22°C da prekine reakciju linkera leka tokom još 20 minuta.
[0307] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS6.0 korišćen je kao pufer rastvor) koja je opisana u Proizvodnom postupku 1 da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova. Nakon toga, rastvor je koncentrovan uobičajenom procedurom A.
[0308] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E koja je opisana u Proizvodnom postupku 1, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0309] Koncentracija antitela: 3.21 mg/mL, prinos antitela: 22.5 mg (75%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 2.6.
Primer 3 antitelo-lek konjugat (3)
[0310]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (3)
[0311] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.487 mLmg-1cm-1) . Rastvor (1.25 mL) je stavljen u polipropilensku epruvetu od 1.5 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.039 mL; 4.6 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.0625 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon dodavanja DMSO (0.072 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 3 iz primera 2 (0.078 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, to je mešano korišćenjem rotatora za epruvete radi konjugovanja linkera leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0155 mL; 18.4 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i mešan na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (ABS je korišćen kao pufer rastvor) koja je opisana u Proizvodnom postupku 1 da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa. Rastvor je dodatno koncentrovan korišćenjem uobičajene procedure A. Nakon toga, korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0312] Koncentracija antitela: 9.85 mg/mL, prinos antitela: 6.9 mg (55%), i prosečan broj konjugovanih molekula antitela (n) po molekulu antitela: 7.3.
Primer 4 antitelo-lek konjugat (4)
[0313]
Proces 1: N-[3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0314] Jedinjenje (80 mg, 0.084 mmol) iz primera 1 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem N-sukcinimidil 3-maleimid propioata (24.6 mg, 0.0924 mmol) umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (60.0 mg, 73%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.89 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.70-1.78 (2H, m), 1.81-1.94 (2H, m), 2.12-2.23 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.81 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.01-3.15 (3H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 3.30-3.35 (1H, m), 3.58-3.71 (6H, m), 3.71-3.79 (1H, m), 4.44-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.0 Hz), 5.27 (1H, d, J=19.0 Hz), 5.43 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.47 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.57-5.63 (1H, m), 6.56 (1H, s), 7.02 (2H, s), 7.17-7.22 (1H, m), 7.22-7.30 (5H, m), 7.34 (1H, s), 7.73 (1H, t, J=5.6 Hz), 7.83 (1H, d, J=10.7 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.6 Hz), 8.15 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.30 (2H, dt, J=18.7, 5.7 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.8 Hz).
MS (APCI) m/z: 990 (M+H)+
Proces 2: antitelo-lek konjugat (4)
[0315] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1). Rastvor (1 mL) je stavljen u polipropilensku epruvetu od 1.5 mL i napunjen je sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.0155 mL; 2.3 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.050 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon dodavanja DMSO (0.072 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 3 iz primera 2 (0.031 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, mešano je korišćenjem rotatora za epruvete za konjugovanje linkera leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0078 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i mešan je na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanjem korišćenjem uobičajene procedure D (ABS je korišćen kao pufer rastvor) da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa. Korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0316] Koncentracija antitela: 1.32 mg/mL, prinos antitela: 7.9 mg (79%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.1.
Primer 5 antitelo-lek konjugat (5)
Proces 1: antitelo-lek konjugat (5)
[0318] Količina vodenog rastvora od 10 mM TCEP je prilagođena tako da je molarni odnos TCEP u odnosu na antitelo pri redukciji antitela 4.6. I dodata količina od 10 mM rastvora linkera leka je prilagođena tako da je molarni odnos jedinjenja iz procesa 1 iz primera 4 u odnosu na antitelo pri konjugaciji linkera leka 9.2. Zatim je dodata količina vodenog rastvora 100 mM NAC prilagođena tako da je molarni odnos NAC prema antitelu pri završetku reakcije 18.4. Istim procedurama kao u procesu 2 iz primera 4, 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijeno, i dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0319] Koncentracija antitela: 1.23 mg/mL, prinos antitela: 7.4 mg (74%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.1.
Primer 6: antitelo-lek konjugat (6)
[0320]
Proces 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]amino}etoksi)etoksi]propanoil}glicilglicil -L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0321] Jedinjenje (100 mg, 0.119 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 2 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem diizopropiletilamina (20.8 µL, 0.119 mmol) umesto trietilamina i N-sukcinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidpropanamid)etoksi)etoksi)propanoata (50.7 mg, 0.119 mmol) umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (66.5 mg, 48%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 (2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J=8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m), 7.18-7.25 (4H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J=11.3 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.44 (1H, d, J=9.0 Hz).
MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+
Proces 2: antitelo-lek konjugat (6)
[0322] Redukcija antitela: trastuzumab dobijen u referentnom primeru 1 pripremljen je da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, je korišćen 1.48 mLmg-1cm-1). Rastvor (1.25 mL) je stavljen u polipropilensku epruvetu od 1.5 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.019 mL; 2.3 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.0625 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon dodavanja DMSO (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 1 (0.039 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, mešano je korišćenjem rotatora za epruvete za konjugovanje linkera leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.008 mL) 100 mM NAC je dodat tome i mešan na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta.
[0323] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (korišćen je ABS kao pufer rastvor) koja je opisana u Proizvodnom postupku 1 da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0324] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0325] Koncentracija antitela: 1.76 mg/mL, prinos antitela: 10.6 mg (85%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.6.
Primer 7 antitelo-lek konjugat (7)
[0326]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (7)
[0327] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u Referentnom primeru 1 je pripremljen da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1). Rastvor (1.25 mL) je smešten u polipropilensku epruvetu od 1.5 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.039 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.0625 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon dodavanja DMSO (0.072 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 1 iz primera 6 (0.078 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, mešano je korišćenjem rotatora za epruvete za konjugovanje linkera leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0155 mL) 100 mM NAC je dodat tome i mešan na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (ABS je korišćen kao pufer rastvor) da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0328] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0329] Koncentracija antitela: 1.93 mg/mL, prinos antitela: 11.6 mg (93%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.9.
Primer 8 antitelo-lek konjugat (8)
[0330]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (8)
[0331] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u Referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1). Rastvor (1.25 mL) je smešten u polipropilensku epruvetu od 1.5 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.039 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.0625 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon dodavanja DMSO (0.072 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 1 iz primera 6 (0.078 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, mešano je korišćenjem rotatora za epruvete za konjugovanje linkera leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0155 mL) 100 mM NAC je dodat tome i mešan na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta.
Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanjem korišćenjem uobičajene procedure D-1 (ABS je korišćen kao pufer rastvor) da se dobije 5.7 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0332] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0333] Koncentracija antitela: 1.50 mg/mL, prinos antitela: 8.55 mg (86%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.2.
Primer 9 antitelo-lek konjugat (9)
[0334]
Proces 1: N-[19-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-17-okso-4,7,10,13-tetraokso-16-azanonadekan-1-oil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid
[0335] Jedinjenje (90 mg, 0.107 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 2 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem diizopropiletilamina (18.7 µL, 0.107 mmol) umesto trietilamina i N-sukcinimidil 1-maleinimid-3-okso-7,10,13,16-tetraoksa-4-azanonadekan-19oata (55.1 mg, 0.107 mmol) umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (50 mg, 37%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.64-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 (2H, m), 2.06-2.19 (4H, m), 2.27-2.32 (2H, m), 2.33-2.37 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.72-2.80 (3H, m), 2.96-3.19 (6H, m), 3.39-3.48 (10H, m), 3.52-3.75 (10H, m), 4.39-4.48 (1H, m), 5.14 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (1H, s), 7.13-7.24 (5H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.10 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.44 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)<+>
Proces 2: antitelo-lek konjugat (9)
[0336] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 2 iz primera 6. Koncentracija antitela: 1.75 mg/mL, prinos antitela: 10.5 mg (84%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.4.
Primer 10 antitelo-lek konjugat (10)
[0337]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (10)
[0338] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja koje je dobijeno u procesu 1 iz primera 9, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.79 mg/mL, prinos antitela: 10.7 mg (86%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.0.
Primer 11 intermedijer (11)
[0339]
Proces 1: terc-butil [2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]karbamat
[0340] So metansulfonske kiseline eksatekana (3.10 g, 5.47 mol) reagovala je na isti način kao proces 1 iz primera 1 korišćenjem {2-[(terc-butoksikarbonil)amino]etoksi}sirćetne kiseline (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 292; 1.55 g, 6.01 mmol) umesto 4-(tercbutoksikarbonilamino)butanoinske kiseline da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (2.56 g, 73%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.26 (9H, s), 1.81-1.91 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 3.08-3.26 (4H, m), 3.43-3.53 (2H, m), 4.00 (1H, d, J=15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J=15.1 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.22 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.59-5.66 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.86 (1H, t, J=5.4 Hz), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 637 (M+H)<+>
Proces 2: 2-(2-aminoetoksi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]acetamid
[0341] Jedinjenje (1.50 g, 2.36 mol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 1 da se dobije so trifluorosirćetne kiseline jedinjenja iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (1.50 g, kvantitativno).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.5 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.15-2.23 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.05 (2H, t, J=5.1 Hz), 3.15-3.23 (2H, m), 3.71 (2H, t, J=5.1 Hz), 4.10 (2H, s), 5.19 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.43 (2H, s), 5.58-5.66 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.33 (1H, s), 7.73-7.84 (4H, m), 8.55 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+
Primer 12 antitelo-lek konjugat (12)
[0342]
Proces 1: N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12Hbenzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]glicinamid
[0343] Jedinjenje (554 mg, 0.85 mmol) iz procesa 2 iz primera 11 reagovao je na isti način kao proces 1 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova (775 mg, 95%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 9.8 Hz), 2.95 (1H, dd, J=13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.23-3.32 (2H, m),3.40-3.62 (8H, m),3.73 (1H, dd, J=16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m),5.17 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.45 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.54 (1H, s), 6.99 (1H, t, J=5.8 Hz), 7.13-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.76-7.82 (2H, m), 7.90 (1H, t, J=5.2 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+
Proces 2: glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]glicinamid
[0344] Jedinjenje (630 mg, 0.659 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 2 da se dobije so trifluorosirćetne kiseline jedinjenja iz naslova (588 mg, 92%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J=13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.24-3.32 (3H, m),3.41-3.71 (7H, m), 3.86 (1H, dd, J=16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J=9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.5 Hz), 5.45 (1H, d, J=16.5 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.13-7.26 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.87-8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.46-8.55 (2H, m). MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+
Proces 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]glicinamid
[0345] Jedinjenje (240 mg, 0.247 mmol) dobijeno u procesu 2 iznad reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova (162 mg, 62%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.6 Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.78-1.90 (2H, m), 2.09 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J=13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J=13.6, 4.5 Hz), 3.08-3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m),3.33-3.40 (4H, m),3.47-3.68 (7H, m), 3.72 (1H, dd, J=16.6, 5.7 Hz), 4.03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J=8.6, 4.2 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.25 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.81 (2H, m), 7.99 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03-8.11 (2H, m), 8.22 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+
Proces 4: antitelo-lek konjugat (12)
[0346] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 3, antitelo-lek konjugat iz naslova dobijen je na isti način kao proces 2 iz primera 6. Rastvor je dodatno koncentrovan uobičajenom procedurom A. Nakon toga, korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
Koncentracija antitela: 10.77 mg/mL, prinos antitela: 7.5 mg (60%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.7.
Primer 13 antitelo-lek konjugat (13)
[0347]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (13)
[0348] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 3 iz primera 12, antitelo-lek konjugat iz naslova dobijen je na isti način kao proces 1 iz primera 7. Rastvor je dodatno koncentrovan uobičajenom procedurom A. Nakon toga, korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti. Koncentracija antitela: 10.69 mg/mL, prinos antitela: 7.5 mg (60%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.9.
Primer 14 intermedijer (14)
[0349]
Proces 1: terc-butil (3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-3-oksopropil)karbamat
[0350] So metansulfonske kiseline eksatekana (500 mg, 0.941 mmol) reagovala je na isti način kao proces 1 iz primera 1 korišćenjem N-(terc-butoksikarbonil)-β-alanina umesto 4-(tercbutoksikarbonilamino)butanske kiseline da se dobije jedinjenje iz naslova kao žuto braon čvrsta supstanca (616 mg, kvantitativno).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.29 (9H, s), 1.86 (2H, dt, J=15.1, 7.3 Hz), 2.04-2.22 (2H, m),2.31 (2H, t, J=6.8 Hz), 2.40 (3H, s), 3.10-3.26 (4H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, dd, J=18.8, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.5, 4.2 Hz), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.30 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 607 (M+H)<+>
Proces 2: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0351] Jedinjenje dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 1 da se dobije so trifluorosirćetne kiseline jedinjenja iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (499 mg, 86%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.86 (2H, dquin, J=14.6, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2 Hz), 2.06-2.27 (1H, m), 2.41 (3H, s), 2.46-2.57 (2H, m), 3.08 (2H, t, J=6.8 Hz), 3.14-3.24 (2H, m), 5.22 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.29 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.58 (1H, dt, J=8.5, 4.5 Hz), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.74 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+
Primer 15 antitelo-lek konjugat (15)
[0352]
Proces 1: N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0353] Jedinjenje (484 mg, 0.780 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 14 reagovalo je na isti način kao proces 1 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (626 mg, 87%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27-1.42 (9H, m), 1.77-1.93 (2H, m), 2.06-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.40 (3H, d, J=1.6 Hz), 2.44-2.54 (2H, m), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.52 (6H, d, J=6.3 Hz), 4.42-4.54 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.42 (1H, dd, J=18.4, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.7, 4.4 Hz), 6.53 (1H, s), 6.98 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.14-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.77-7.84 (1H, m), 7.91 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.16 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.1 Hz), 8.52 (1H, d, J=9.0 Hz).
Proces 2: glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid trifluoroacetat
[0354] Jedinjenje (624 mg, 0.675 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (626 mg, 92%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.86 (2H, tt, J=14.5, 7.2 Hz), 2.07-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.40 (3H, s), 2.44-2.54 (2H, m), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 4.3 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=4.7 Hz), 3.69 (3H, td, J=11.2, 5.7 Hz), 3.87 (1H, dd, J=17.0, 5.7 Hz), 4.54 (1H, m, J=17.8, 4.5 Hz), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.51-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.14-7.29 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.88 (1H, t, J=5.7 Hz), 7.97 (3H, brs), 8.29-8.38 (2H, m), 8.50 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.55 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+
Proces 3: N-[6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0355] Jedinjenje (60.0 mg, 0.0646 mmol) dobijeno u procesu 2 iznad reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca (14.0 mg, 21%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.39-1.51 (4H, m), 1.79-1.91 (2H, m), 2.02-2.20 (2H, m), 2.07 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.30-2.42 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J=14.1, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.7, 4.9 Hz), 3.12-3.21 (2H, m), 3.26-3.42 (2H, m), 3.50-3.80 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.6 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.51-5.62 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.84 (2H, m), 8.01 (1H, t, J=5.3 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.14 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.25 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.53 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+
Proces 4: Antitelo-lek konjugat (15)
[0356] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg-1cm-1). Rastvor (1.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 2 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.0155 mL; 2.3 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.050 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0357] Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon inkubiranja rastvora na 22°C tokom 10 minuta, DMSO rastvor (0.0311 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje dobijeno u procesu 3 je dodat tome i inkubiran za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.00622 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i inkubiran na 22°C da se završi reakcija linkera leka za sledećih 20 minuta.
[0358] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS6.0 korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0359] Fizičko-hemijska karakterizacija: Korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0360] Koncentracija antitela: 1.18 mg/mL, prinos antitela: 7.08 mg (71%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 2.0.
Primer 16 Antitelo-lek konjugat (16)
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (16)
[0362] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg<-1>cm-1). Rastvor (1.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 2 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.0311 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.050 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0363] Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon inkubiranja rastvora na 22°C tokom 10 minuta, DMSO rastvor (0.0622 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje dobijeno u procesu 3 iz primera 15 je dodato tome i inkubirano za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0124 mL; 18.4 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i inkubiran na 22°C da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS6.0 korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova. Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0364] Koncentracija antitela: 1.03 mg/mL, prinos antitela: 6.18 mg (62%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.8.
Primer 17 antitelo-lek konjugat (17)
[0365]
Proces 1: N-[3-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0366] Jedinjenje (60.0 mg, 0.0646 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 15 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem N-sukcinimidil 3-maleimid propionata umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (36.0 mg, 57%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.85 (2H, dt, J=14.4, 7.5 Hz), 2.05-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.30-2.44 (5H, m), 2.73-2.84 (1H, m), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.17 (3H, d, J=5.1 Hz), 3.26-3.40 (2H, m), 3.41-3.81 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.52-5.61 (1H, m),6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m),7.31 (1H, s), 7.80 (2H, d, J=10.2 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.12 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.20-8.31 (2H, m), 8.52 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+
Proces 2: antitelo-lek konjugat (17)
[0367] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 2 iz primera 6.
Koncentracija antitela: 1.74 mg/mL, prinos antitela: 10.4 mg (83%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.7.
Primer 18 antitelo-lek konjugat (18)
[0368]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (18)
[0369] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iz primera 17, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.98 mg/mL, prinos antitela: 11.9 mg (95%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.6.
Primer 19 Antitelo-lek konjugat (19)
Proces 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]amino})etoksi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0371] Jedinjenje (60.0 mg, 0.0646 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 15 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem N-sukcinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidpropanamid)etoksi)etoksi)propanoata umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca (23.0 mg, 31%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.77-1.92 (2H, m), 2.07-2.21 (2H, m), 2.27-2.42 (6H, m), 2.40 (3H, s), 2.74-2.84 (1H, m), 2.97-3.06 (1H, m), 3.09-3.21 (4H, m), 3.25-3.39 (6H, m), 3.45 (4H, s), 3.50-3.80 (8H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.26 (1H, m, J=18.4 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.51-5.61 (1H, m),6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.87 (2H, m), 7.93-8.07 (2H, m), 8.09-8.21 (2H, m), 8.26 (1H, brs), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+
Proces 2: antitelo-lek konjugat (19)
[0372] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iznad, konjugat antitelo-lek iz naslova je dobijen na isti način kao proces 2 iz primera 6.
Koncentracija antitela: 1.60 mg/mL, prinos antitela: 9.6 mg (77%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 1.9.
Primer 20 antitelo-lek konjugat (20)
[0373]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (20)
[0374] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iz primera 19, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.69 mg/mL, prinos antitela: 10.1 mg (81%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.0.
Primer 21 antitelo-lek konjugat (21)
[0375]
Proces 1: N-[19-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-17-okso-4,7,10,13-tetraoksa-16-azanonadekan-1-oil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0376] Jedinjenje (60.0 mg, 0.0646 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 15 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem N-sukcinimidil 1-maleinimid-3-okso-7,10,13,16-tetraoksa-4-azanonadekanoata umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca (23.0 mg, 29%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.85 (2H, tt, J=14.6, 7.1 Hz), 2.06-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.28-2.43 (6H, m), 2.78 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 3.9 Hz), 3.09-3.22 (4H, m), 3.27-3.41 (4H, m), 3.47 (12H, d, J=8.6 Hz), 3.53-3.81 (10H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.53-5.61 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.12-7.29 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.85 (2H, m), 8.03 (2H, d, J=6.6 Hz), 8.11-8.21 (2H, m), 8.27 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+
Proces 2: antitelo-lek konjugat (21)
[0377] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 2 iz primera 6. Koncentracija antitela: 1.77 mg/mL, prinos antitela: 10.6 mg (85%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.2.
Primer 22 antitelo-lek konjugat (22)
[0378]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (22)
[0379] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iz primera 21, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.89 mg/mL, prinos antitela: 11.3 mg (90%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.2.
Primer 23 intermedijer (23)
[0380]
[0381] Proces 1: terc-butil (6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-6-oksoheksil)karbamat
[0382] So metansulfonske kiseline eksatekana (0.500 g, 0.882 mmol) reagovala je na isti način kao proces 1 iz primera 1 korišćenjem 6-(terc-butoksikarbonilamino)heksanoične kiseline umesto 4-(terc-butoksikarbonilamino)buterne kiseline da se dobije jedinjenje iz naslova (0.620 g, kvantitativno).
<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.83 (3H, t, J=7.8 Hz), 1.14-1.28 (2H, m), 1.31 (9H, s), 1.47-1.61 (2H, m), 1.75-1.89 (2H, m), 2.04-2.17 (4H, m), 2.35 (3H, s), 2.81-2.88 (2H, m), 3.09-3.16 (2H, m), 5.10 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.16 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.39 (2H, s), 5.48-5.55 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.73-6.78 (1H, m), 7.26 (1H, s), 7.74 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.39 (1H, d, J=9.0 Hz).
Proces 2: 6-amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]heksanamida
[0383] Jedinjenje (0.397 g, 0.611 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 1 da se dobije so trifluorosirćetne kiseline jedinjenja iz naslova (0.342 g, 84%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.88 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31-1.41 (2H, m), 1.52-1.70 (4H, m), 1.80-1.94 (2H, m), 2.05-2.18 (2H, m), 2.21 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.40 (3H, s), 2.81 (2H, t, J=7.4 Hz), 3.10-3.25 (2H, m), 3.33 (2H, brs), 5.18 (1H, d, J=19.8 Hz), 5.22 (1H, d, J=19.8 Hz), 5.41 (2H, d, J=16.6 Hz), 5.45 (2H, d, J=16.6 Hz), 5.53-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J=9.2 Hz).
Primer 24 Antitelo-lek konjugat (24)
Proces 1: N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-6-oksoheksil)glicinamid
[0385] Jedinjenje (0.170 g, 0.516 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 23 reagovalo je na isti način kao proces 1 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova (0.225 g, 91%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.88 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.43-1.70 (6H, m), 1.87 (2H, td, J=15.0, 7.4 Hz), 2.10-2.22 (3H, m), 2.28-2.37 (1H, m), 2.42 (3H, s), 2.78-2.85 (1H, m), 3.01-3.10 (3H, m), 3.15-3.22 (2H, m), 3.54-3.61 (5H, m), 3.62-3.69 (1H, m), 4.44-4.53 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.45 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.02 (1H, t, J=6.1 Hz), 7.11-7.28 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.63-7.69 (1H, m), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.90-7.96 (1H, m), 8.17 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.28 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=9.0 Hz).
Proces 2: glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-6-oksoheksil)glicinamid
[0386] Jedinjenje (0.105 g, 0.108 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova (0.068 mg, 65%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.89 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.15-1.67 (6H, m), 1.79-1.97 (2H, m), 2.08-2.24 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.76-2.82 (1H, m), 3.00-3.10 (5H, m), 3.19 (1H, s), 3.50-3.63 (2H, m), 3.64-3.76 (3H, m), 3.84-3.92 (1H, m), 4.51-4.59 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.24 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.44 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, brs), 7.15-7.29 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.72-7.78 (1H, m), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.96-8.08 (2H, m), 8.30-8.38 (2H, m), 8.46-8.56 (2H, m).
Proces 3: N-[6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-6-oksoheksil)glicinamid
[0387] Jedinjenje (58 mg, 0.060 mmol) dobijeno u procesu 2 iznad reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova (39 mg, 62%).
1H-NMR (CD3OD) δ: 0.99 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27 (2H, td, J=11.6, 6.1 Hz), 1.38-1.44 (2H, m), 1.50-1.63 (6H, m), 1.65-1.80 (2H, m), 1.89-1.98 (2H, m), 2.17-2.25 (3H, m), 2.26-2.36 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.95 (1H, dd, J=14.3, 9.2 Hz), 3.12 (1H, dd, J=13.7, 5.7 Hz), 3.15-3.25 (4H, m), 3.44 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.65 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.76 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.79-3.86 (4H, m), 4.43 (1H, dd, J=8.9, 6.0 Hz), 5.10 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.35 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.56 (1H, d, J=16.0 Hz), 5.60-5.64 (1H, m), 6.76 (2H, s), 7.12-7.24 (6H, m), 7.58 (1H, s), 7.60 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.68 (1H, t, J=5.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+
Proces 4: antitelo-lek konjugat (24)
[0388] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA primenom uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg1cm-1). Rastvor (9.0 mL) je sakupljen u epruveti od 50 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.140 mL; 2.3 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.450 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0389] Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon inkubiranja rastvora na 22°C tokom 10 minuta, DMSO rastvor (0.280 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje u procesu 3 je dodat tome i inkubirano je za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta.
[0390] Sledeće, vodeni rastvor (0.0559 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodato tome i inkubirano je na 22°C da se završi reakcija linkera leka za dodatnih 20 minuta.
[0391] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS7.4 korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije rastvor koji sadrži antitelolek konjugat iz naslova.
[0392] Fizičko-hemijska karakterizacija: Korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0393] Koncentracija antitela: 3.30 mg/mL, prinos antitela: 53.5 mg (59%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 1.7.
Primer 25 antitelo-lek konjugat (25)
[0394]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (25)
[0395] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg-1cm-1). Rastvor (9.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 50 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.280 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.450 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0396] Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon inkubiranja rastvora na 22°C tokom 10 minuta, DMSO rastvor (0.559 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje u procesu 3 iz primera 24 je dodat tome i inkubiran za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.112 mL; 18.4 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i inkubiran na 22°C da se završi reakcija linkera leka za sledećih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS6.0 korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije rastvor koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0397] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0398] Koncentracija antitela: 10.65 mg/mL, prinos antitela: 55.1 mg (61%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 2.5.
Primer 26 antitelo-lek konjugat (26)
[0399]
Proces 1: ({N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metil acetat
[0400] Smeši koja sadrži N-9-fluorenilmetoksikarbonilglicilglicin (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahidrofuran (THF; 120 ml), i toluen (40.0 ml), piridin (1.16 ml, 14.7 mmol) i olovo tetraacetat (6.84 g, 14.7 mmol) dodati su i zagrevani pod refluksom tokom 5 sati. Nakon što je reakcioni rastvor ohlađen do sobne temperature, nerastvorljive supstance su uklonjene filtracijom kroz Celite, i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostaci su rastvoreni u etil acetatu i isprani sa vodom i zasićenim slanim rastvorom, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom, dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [heksan : etil acetat = 9 : 1 (v/v) - etil acetat] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (3.00 g, 67%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J=5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J=7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J=7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 (1H, brs), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J=7.3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.3 Hz).
Proces 2: Benzil [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi]acetat
[0401] THF (40.0 mL) rastvoru jedinjenja (3.68 g, 10.0 mmol) dobijenog u procesu 1 iznad i benzil glikolatu (4.99 g, 30.0 mmol), kalijum terc-butoksid (2.24 g, 20.0 mmol) je dodat na 0°C i mešan na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Reakcioni rastvor je napunjen sa etil acetatom i vodom na 0°C i ekstrahovan sa etil acetatom i hloroformom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostaci su rastvoreni u dioksanu (40.0 mL) i vodi (10.0 mL), napunjeni sa natrijum hidrogen karbonatom (1.01 g, 12.0 mmol) i 9-fluorenilmetil hloroformatom (2.59 g, 10.0 mmol), i mešani su na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa vodom i ekstrahovan sa etil acetatom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [heksan : etil acetat = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna uljana supstanca (1.88 g, 40%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.84 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J=6.5 Hz), 4.49 (2H, d, J=6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 (1H, brs), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.79 (2H, d, J=7.4 Hz).
Proces 3: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi]sirćetna kiselina
[0402] Jedinjenje (1.88 g, 3.96 mmol) dobijeno u procesu 2 iznad je rastvoreno u etanolu (40.0 mL) i etil acetatu (20.0 ml). Nakon dodavanja paladijum ugljenik katalizatora (376 mg), mešano je pod atmosferom vodonika na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nerastvorljive supstance uklonjene su filtracijom kroz Celite, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (1.52 g, kvantitativno).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.62 (2H, d, J=6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.72 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J=6.5 Hz).
Proces 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]amino}-2-oksoetil)karbamat
[0403] Pri hlađenju ledom, N,N-dimetilformamidnom rastvoru (10.0 mL) soli metansulfonske kiseline eksatekana (0.283 g, 0.533 mmol), N-hidroksisukcinimida (61.4 mg, 0.533 mmol), i jedinjenja (0.205 g, 0.533 mmol) dobijenog u procesu 3 iznad, N,N-diizopropiletilamin (92.9 µL, 0.533 mmol) i N,N'-dicikloheksilkarbodimid (0.143 g, 0.693 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroforma : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo braon čvrsta supstanca (0.352 g, 82%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.81 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2.20 (2H, m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.98 (2H, s), 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32-5.42 (2H, m), 5.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J=6.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+
Proces 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0404] N,N-dimetilformamidnom rastvoru (11.0 mL) jedinjenja (0.881 g, 1.10 mmol) dobijenog u procesu 4 iznad, piperidin (1.1 mL) je dodat i mešan je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da se dobije smeša koja sadrži jedinjenje iz naslova. Smeša je korišćena za sledeću reakciju bez dodatnog prečišćavanja.
Proces 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil] glicinamid
[0405] Pri hlađenju ledom, N,N-dimetilformamidnom rastvoru (50.0 mL) smeše (0.439 mmol) dobijene u procesu 5 iznad, N-hidroksisukcinimidu (0.101 g, 0.878 mmol), i N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalaninu (jedinjenje opisano u Japanskom patentu otkrivenom sa br. 2002-60351; 0.440 g, 0.878 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodimid (0.181 g, 0.878 mmol) je dodat i mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo narandžasta čvrsta supstanca (0.269 g, 58%).
MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+
Proces 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0406] N,N-dimetilformamidnom rastvoru (4.00 mL) jedinjenja (0.269 g, 0.253 mmol) dobijenog u procesu 6 iznad, piperidin (0.251 mL, 2.53 mmol) je dodat i mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da se dobije smeša koja sadrži jedinjenje iz naslova. Smeša je korišćena za sledeću reakciju bez dodatnog prečišćavanja.
Proces 8: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10, 13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0407] N,N-dimetilformamidnom rastvoru (10.0 mL) jedinjenja (0.253 mmol) dobijenog u procesu 7 iznad, N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (0.156 g, 0.506 mmol) je dodat i mešan na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.100 g, 38%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.83 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1.47 (4H, m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (6H, m), 3.98 (2H, s), 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11-7.24 (5H, m), 7.28 (1H, s), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.09 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J=9.0 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.5 Hz). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+
Proces 9: antitelo-lek konjugat (26)
[0408] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 8 iznad, konjugat antitelo-lek iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 2 iz primera 6.
Koncentracija antitela: 1.61 mg/mL, prinos antitela: 9.7 mg (77%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 2.9.
Primer 27 antitelo-lek konjugat (27)
[0409]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (27)
[0410] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijeno u procesu 8 iz primera 26, konjugat antitelo-lek iz naslova je dobijen na isti način kao Proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.58 mg/mL, prinos antitela: 9.5 mg (76%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 5.6.
Primer 28 antitelo-lek konjugat (28)
Proces 1: antitelo-lek konjugat (28)
[0412] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, je korišćen 1.48 mLmg-1cm-1) . Rastvor (1.25 mL) je smešten u dve polipropilenske epruvete od 1.5 mL i napunjen je sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.039 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.0625 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon dodavanja DMSO (0.072 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (0.078 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, mešano je korišćenjem rotatora za epruvete za konjugovanje linkera leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor 100 mM NAC (0.0155 mL) je dodat tome i mešano je na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (ABS je korišćen kao pufer rastvor) da se dobije 11.7 mL ukupno rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0413] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0414] Koncentracija antitela: 1.60 mg/mL, prinos antitela: 18.7 mg (94%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 5.2.
Primer 29 antitelo-lek konjugat (29)
[0415]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (29)
[0416] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg<-1>cm<-1>) . Rastvor (6 mL) je smešten u polipropilenskoj epruveti i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.108 mL; 2.5 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.091 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon dodavanja DMSO (0.146 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (0.193 mL; 4.5 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, inkubiran je za konjugovanje linkera leka za antitelo na 15°C tokom 1 sata. Sledeće, vodeni rastvor (0.029 mL) 100 mM NAC je dodat tome i mešan je na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta.
[0417] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju primenom uobičajene procedure D (ABS korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije 24 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0418] Fizičko-hemijska karakterizacija: Korišćenjem uobičajenih procedura E i F (εD,280= 5178 (izmerena vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena vrednost) su korišćene), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0419] Koncentracija antitela: 1.77 mg/mL, prinos antitela: 42 mg (85%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren je uobičajenom procedurom E: 3.0, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću uobičajene procedure F: 3.4.
Primer 30 antitelo-lek konjugat (30)
[0420]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (30)
[0421] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1). Rastvor (6 mL) je smešten u polipropilensku epruvetu i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.215 mL; 5 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.094 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0422] Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon dodavanja DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (0.370 mL; 8.6 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, inkubiran je za konjugovanje linkera leka za antitelo na 15°C tokom 1 sata. Sledeće, vodeni rastvor (0.056 mL) 100 mM NAC je dodat tome i mešano na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za sledećih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (ABS korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije 24 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0423] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajenih procedura E i F (εD,280= 5178 (izmerena vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena vrednost) su korišćene), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0424] Koncentracija antitela: 1.92 mg/mL, prinos antitela: 46 mg (92%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću uobičajene procedure E: 6.2, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću uobičajene procedure F: 7.1.
Primer 31 antitelo-lek konjugat (31)
[0425]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (31)
[0426] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela od 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1) . Rastvor (50.00 mL) je smešten u polipropilenski kontejner i napunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.745 mL) na sobnoj temperaturi sa mešanjem i zatim sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (1.868 mL; 5.4 ekvivalenta po molekulu antitela). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.0 ± 0.1, mešanje je završeno, i disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0427] Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon hlađenja gornjeg rastvora do 15°C, DMSO rastvor koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (2.958 mL; 8.6 ekvivalenta po molekulu antitela) je postepeno dodat u kapima tome uz mešanje. Dok je temperatura održavana na 15°C, reakcioni rastvor je mešan tokom prvih 30 minuta i inkubiran bez mešanja za konjugovanje linkera leka za antitelo tokom sledećeg sata. Sledeće, vodeni rastvor (0.444 mL) 100 mM NAC je dodat tome sa mešanjem i mešano je na sobnoj temperaturi da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta.
[0428] Prečišćavanje: postepenim dodavanjem 20% vodenog rastvora sirćetne kiseline (oko 0.25 mL) i ABS (50 mL) gornjem rastvoru uz mešanje, pH rastvora je prilagođena do 5.5 ± 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (Millipore Corp., Millex-HV filter, 0.45 µm, PVDF membrana) da se ukloni beličasta materija. Ovaj rastvor je podvrgnut ultrafiltracijskom prečišćavanju korišćenjem aparata za ultrafiltraciju koji se sastoji od ultrafiltracijske membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), pumpe za epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00), i epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifično, dok je ABS dodavan u kapima (ukupno 800 mL) kao pufer rastvor za prečišćavanje reakcionom rastvoru, ultrafiltracijsko prečišćavanje je izvedeno za uklanjanje nekonjugovanih linkera lekova i drugih reagenasa male molekularne težine, takođe zamenjivanje pufer rastvora sa ABS-om, i dodatno koncentrovanje rastvora. Dobijeni prečišćeni rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.22 µm (Millipore Corp., Millex-GV filter, PVDF membrane) i 0.10 µm (Millipore Corp., Millex-VV filter, PVDF membrane)) da se dobije rastvor koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova. Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajenih procedura E i F (εD,280= 5178 (izmerena vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena vrednost) su korišćene), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0429] Koncentracija antitela: 11.28 mg/mL, prinos antitela: 451 mg (90%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću uobičajene procedure E: 6.6, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela measured by the uobičajene procedure F: 7.7.
Primer 32 (Alternativni postupak za sintezu jedinjenja iz procesa 8 iz primera 26)
[0430]
Proces 1: terc-butil N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenil alaninat
[0431] Pri hlađenju ledom, THF-skom (12.0 ml) rastvoru terc-butil N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenil alaninata (J. Pept. Res., 1999, tom 53, str. 393; 0.400 g, 0.717 mmol), 1,8-diazabiciklo [5.4.0]-7-undecen (0.400 ml) je dodat i mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 dana, i zatim je N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (0.221 g, 0.717 mmol) dodatno dodat i mešano je tokom 3 sata. Reakcioni rastvor je razblažen sa etil acetatom i ispran sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline, zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata, i zasićenim slanim rastvorom, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom, dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.295 g, 78%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.28-1.36 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.57-1.71 (4H, m), 2.23 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.09 (2H, d, J=6.0 Hz), 3.51 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.85-4.02 (4H, m), 4.69-4.78 (1H, m), 6.15 (1H, t, J=4.6 Hz), 6.33 (1H, d, J=7.3 Hz), 6.60 (1H, t, J=5.0 Hz), 6.68 (2H, s), 7.10-7.16 (2H, m), 7.22-7.31 (3H, m).
MS (ESI) m/z: 529 (M+H)<+>
Proces 2: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanin
[0432] Dihlorometanskom rastvoru (8.00 ml) jedinjenja (0.295 g, 0.558 mmol) dobijenog u procesu 1 iznad, trifluorosirćetna kiselina (4.00 mL) je dodata i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.240 g, 91%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1.15-1.23 (2H, m), 1.40-1.53 (4H, m), 2.10 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.88 (1H, dd, J=13.7, 8.9 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 5.0 Hz), 3.35-3.43 (2H, m), 3.58-3.77 (4H, m), 4.41 (1H, td, J=7.8, 5.0 Hz), 7.00 (2H, s), 7.16-7.31 (5H, m), 8.00 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz).
Proces 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0433] Jedinjenje (0.572 g, 1.21 mmol) dobijeno u procesu 2 iznad je rastvoreno u dihlorometanu (12.0 mL), napunjeno sa N-hidroksisukcinimidom (0.152 g, 1.32 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodimid hidrohloridom (0.253 g, 1.32 mmol), i mešano je tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat N,N-dimetilformamidnom rastvoru (22.0 mL) smeše (1.10 mmol) dobijene u procesu 5 iz primera 26, i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline i ekstrahovan sa hloroformom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.351 g, 31%). Instrumentalni podaci jedinjenja isti su kao kod jedinjenja iz procesa 8 iz primera 26.
Primer 33 (Alternativni postupak za sintezu jedinjenja iz procesa 8 iz primera 26)
[0434]
Proces 1: Benzil [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi] acetat
[0435] THF-skom (200 ml) rastvoru jedinjenja (7.37 g, 20.0 mmol) koje je dobijeno u procesu 1 iz primera 26, benzil glikolat (6.65 g, 40.0 mmol) i monohidrat p-toluen sulfonske kiseline (0.381 g, 2.00 mmol) dodati su na 0°C i mešani na sobnoj temperaturi tokom 2 sata i 30 minuta. Reakcioni rastvor je napunjen sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata i ekstrahovan sa etil acetatom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [heksan : etil acetat = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (6.75 g, 71%). Instrumentalni podaci jedinjenja isti su kao kod jedinjenja iz procesa 2 iz primera 26.
Proces 2: N-[(Benziloksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanin-N-{[(2-(benziloksi)-2-oksoetoksi]metil}glicinamid
[0436] N,N-dimetilformamidnom rastvoru (140 mL) jedinjenja (6.60 g, 13.9 mmol) dobijenog u procesu 1 iznad, 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (2.22 g, 14.6 mmol) je dodat na 0°C i mešan na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Reakcioni rastvor je napunjen sa N,N-dimetilformamidnim rastvorom (140 mL) N-[(benziloksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6.33 g, 15.3 mmol), N-hidroksisukcinimida (1.92 g, 16.7 mmol), i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodimid hidrohlorida (3.20 g, 16.7 mmol) mešano unapred na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i mešano na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa 0.1 N hlorovodoničnom kiselinom i ekstrahovan sa hloroformom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (7.10 g, 79%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 2.78 (1H, dd, J=13.9, 9.6 Hz), 3.05 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.56-3.80 (6H, m), 4.15 (2H, s), 4.47-4.55 (1H, m), 4.63 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.03 (2H, s), 5.15 (2H, s), 7.16-7.38 (15H, m), 7.52 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.17 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.36 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.61 (1H, t, J=6.6 Hz).
Proces 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(karboksimetoksi)metil]glicinamid
[0437] N,N-dimetilformamidnom (216 mL) rastvoru jedinjenja (7.00 g, 10.8 mmol) dobijenog u procesu 2 iznad, paladijum ugljenik katalizator (7.00 g) je dodat i to je mešano pod atmosferom vodonika na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Nerastvorljive supstance su uklonjene filtracijom kroz Celite, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostaci su rastvoreni u vodi, nerastvorljiv materijal je uklonjen filtracijom kroz Celite, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ova procedura je ponovljena dva puta da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (3.77 g, 82%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 2.84 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.08 (1H, dd, J=13.7, 4.7 Hz), 3.50-3.72 (4H, m), 3.77-3.86 (2H, m), 3.87 (2H, s), 4.52-4.43 (1H, m), 4.61 (2H, d, J=6.6 Hz), 7.12-7.30 (5H, m), 8.43 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.54 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.70 (1H, t, J=6.3 Hz), 8.79 (1H, t, J=5.5 Hz).
Proces 4: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(karboksimetoksi)metil]glicinamid
[0438] N,N-dimetilformamidnom (85.0 mL) rastvoru jedinjenja (3.59 g, 8.48 mmol) dobijenog u procesu 3 iznad, N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (2.88 g, 9.33 mmol) i trietilamin (0.858 g, 8.48 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa 0.1 N hlorovodoničnom kiselinom i ekstrahovan sa hloroformom i mešanim rastvorom hloroforma i metanola [hloroform : metanol = 4 : 1 (v/v)]. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroforma : metanol : voda = 7 : 3: 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (3.70 g, 71%). 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.13-1.24 (2H, m), 1.42-1.53 (4H, m), 2.11 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.80 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.37 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.56-3.78 (6H, m), 3.97 (2H, s), 4.46-4.53 (1H, m), 4.61 (2H, d, J=6.3 Hz), 7.00 (2H, s), 7.15-7.29 (5H, m), 8.03-8.20 (3H, m), 8.32 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.7 Hz).
Proces 5: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0439] N,N-dimetilformamidnom rastvoru (40.0 mL) soli metansulfonske kiseline eksatekana (1.14 g, 2.00 mmol), trietilamin (0.202 g, 2.00 mmol), jedinjenje (1.48 g, 2.40 mmol) dobijeno u procesu 4 iznad, i 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid (0.993 g, 3.00 mmol) koji sadrži 16.4% vode dodati su na 0°C i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (1.69 g, 82%). Spektralni podaci jedinjenja isti su kao kod jedinjenja iz procesa 8 iz primera 26.
Primer 34 intermedijer (34)
[0440]
[0441] Proces 1: 2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetilacetat
[0442] Pri hlađenju ledom, N,N-dimetilformamidnoj suspenziji (20.0 mL) soli metansulfonske kiseline eksatekana (0.500 g, 0.941 mmol), N,N-diizopropiletilamin (0.492 mL, 2.82 mmol) i acetoksiacetil hlorid (0.121 ml, 1.13 mmol) dodati su i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3: 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.505 g, kvantitativno).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.08 (3H, s), 2.08-2.22 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.14-3.21 (2H, m), 4.51 (2H, dd, J=19.4, 14.7 Hz), 5.22 (2H, dd, J=40.1, 19.0 Hz), 5.43 (2H, s), 5.56-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+
[0443] Proces 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-2-hidroksiacetamid
[0444] Metanolnoj suspenziji (50.0 mL) jedinjenja (0.504 g, 0.941 mmol) dobijenoj u procesu 1 iznad, THF (20.0 ml) i vodeni rastvor 1 N natrijum hidroksida (4.00 ml, 4.00 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcija je završena dodavanjem 1 N hlorovodonične kiseline (5.00 ml, 5.00 mmol), i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3: 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.412 g, 89%). Ovo jedinjenje je potvrđeno kod mišjeg tumora koji je primio antitelo-lek konjugat (45) ili (46).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.78-1.95 (2H, m), 2.09-2.28 (2H, m), 2.39 (3H, s), 3.07-3.27 (2H, m), 3.96 (2H, d, J=6.0 Hz), 5.11-5.26 (2H, m), 5.42 (2H, s), 5.46-5.54 (1H, m), 5.55-5.63 (1H, m), 6.52 (1H, s), 7.30 (1H, s), 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.41 (1H, d, J=9.1 Hz). MS (ESI) m/z: 494 (M+H)+
Primer 35 (Alternativni postupak za sintezu jedinjenja iz primera 34)
[0445]
Proces 1: N-[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-2-hidroksiacetamid
[0446] Glikolna kiselina (0.0201 g, 0.27 mmol) je rastvorena u N,N-dimetilformamidu (1.0 mL), napunjena sa N-hidroksisukcinimidom (0.0302 g, 0.27 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohloridom (0.0508 g, 0.27 mmol), i mešana je tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat N,N-dimetilformamidnoj suspenziji (1.0 mL) napunjenoj sa solju metansulfonske kiseline eksatekana (0.1 g, 0.176 mmol) i trietilaminom (0.025 mL, 0.18 mmol) i mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 10 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.080 g, 92%) . Spektralni podaci jedinjenja isti su kao kod jedinjenja dobijenog u procesu 2 iz primera 34.
Primer 36 antitelo-lek konjugat (36)
[0447]
Proces 1: N-[4-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)butanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]-β-alaninamid
[0448] Jedinjenje (60.0 mg, 0.0646 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 15 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 korišćenjem N-sukcinimidil 4-maleimid butirata umesto N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo bela čvrsta supstanca (24.0 mg, 38%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.68 (2H, quin, J = 7.4 Hz), 1.78-1.92 (2H, m), 2.06-2.22 (2H, m), 2.10 (2H, t, J = 7.8 Hz), 2.31-2.43 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J = 13.7, 9.4 Hz), 3.01 (1H, dd, J = 13.7, 4.7 Hz), 3.17 (4H, d, J = 5.1 Hz), 3.29-3.40 (2H, m), 3.52-3.80 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J = 18.4 Hz), 5.26 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.42 (2H, s) , 5.52-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.12-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.84 (2H, m), 8.02 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.08-8.16 (2H, m), 8.25 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.52 (1H, d, J = 8.2 Hz).
MS (ESI) m/z: 990 (M+H)+
Proces 2: Antitelo-lek konjugat (33)
[0449] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 2 iz primera 6.
Koncentracija antitela: 1.75 mg/mL, prinos antitela: 10.5 mg (84%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 4.7.
Primer 37 antitelo-lek konjugat (37)
[0450]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (37)
[0451] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1 iz primera 36, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijeno na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.89 mg/mL, prinos antitela: 11.3 mg (90%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 8.5.
Primer 38 intermedijer (38)
[0452]
Proces 1: terc-butil (5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-5-oksopentil)karbamat
[0453] So metansulfonske kiseline eksatekana (500 mg, 0.941 mmol) reagovala je na isti način kao proces 1 iz primera 1 korišćenjem 5-(terc-butoksikarbonilamino)valerinske kiseline umesto 4-(terc-butoksikarbonilamino)buterne kiseline da se dobije jedinjenje iz naslova kao žuto-braon čvrsta supstanca (571 mg, 96%). Jedinjenje je korišćeno za sledeću reakciju bez bez izvođenja dodatnog prečišćavanja.
MS(ESI)m/z:635(M+H)+
Proces 2: 5-amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]pentanamid
[0454] Jedinjenje (558 mg, 0.879 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 1 da se dobije trifluoroacetat jedinjenja iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (363 mg, 64%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.88 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.52-1.71 (4H, m), 1.87 (2H, tt, J = 14.4, 6.9 Hz), 2.07-2.18 (2H, m), 2.22 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.76-2.88 (2H, m), 3.13-3.22 (2H, m), 5.18 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.33 (1H, s), 7.65 (3H, br.s.), 7.81 (1H, d, J = 11.3 Hz), 8.49 (1H, d, J = 8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 535 (M+H)+
Primer 39 antitelo-lek konjugat (39)
Proces 1: N-(terc-butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-5-oksopentil)glicinamid
[0456] Jedinjenje (348 mg, 0.537 mmol) dobijeno u procesu 2 iz primera 38 reagovalo je na isti način kao proces 1 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (429 mg, 84%). Jedinjenje je korišćeno za sledeću reakciju bez izvođenja dodatnog prečišćavanja.
Proces 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-5-oksopentil)glicinamid
[0457] Jedinjenje (427 mg, 0.448 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 2 da se dobije trifluoroacetat jedinjenja iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (430 mg, 99%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.38-1.49 (2H, m), 1.54-1.66 (2H, m), 1.86 (2H, tt, J = 14.5, 7.0 Hz), 2.08-2.16 (2H, m), 2.19 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.40 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J = 13.9, 10.0 Hz), 3.00-3.12 (3H, m), 3.14-3.21 (2H, m), 3.57 (2H, d, J = 4.7 Hz), 3.60-3.75 (3H, m), 3.87 (1H, dd, J = 16.8, 5.9 Hz), 4.55 (1H, td, J = 9.0, 4.7 Hz), 5.16 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 18.4 Hz), 5.44 (2H, s), 5.53-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.14-7.29 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.74 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.81 (1H, d, J = 10.9 Hz), 7.96 (3H, br.s.), 8.30-8.37 (1H, m), 8.44-8.53 (2H, m).
MS (ESI) m/z: 853 (M+H)+
Proces 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-5-oksopentil)glicinamid
[0458] Jedinjenje (60.0 mg, 0.0621 mmol) dobijeno u procesu 2 iznad reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca (16.0 mg, 25%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.13-1.21 (2H, m), 1.36-1.52 (6H, m), 1.53-1.65 (2H, m), 1.79-1.92 (2H, m), 2.05-2.15 (4H, m), 2.19 (2H, s), 2.40 (3H, s), 2.79 (1H, dd, J = 13.7, 10.2 Hz), 2.98-3.10 (3H, m), 3.12-3.21 (2H, m), 3.29-3.37 (2H, m), 3.53-3.79 (6H, m), 4.41-4.50 (1H, m), 5.16 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.52-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.12-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.63 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J = 10.6 Hz), 8.02 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.08 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.12 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.24 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.45 (1H, d, J = 8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1046 (M+H)+
Proces 4: antitelo-lek konjugat (39)
[0459] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg-1cm-1). Rastvor (1.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 2 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.0155 mL; 2.3 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.050 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0460] Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon inkubiranja rastvora tokom 10 minuta na 22°C, DMSO rastvor (0.0311 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje dobijeno u procesu 3 je dodato tome i inkubirano za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.00622 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i inkubiran na 22°C da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta.
[0461] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS6.0 korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0462] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0463] Koncentracija antitela: 1.12 mg/mL, prinos antitela: 6.72 mg (67%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 1.8.
Primer 40 antitelo-lek konjugat (40)
[0464]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (40)
[0465] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.37 mLmg-1cm-1). Rastvor (1.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 2 mL i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.0311 mL; 4.6 ekvivalenta po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.050 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0466] Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon inkubiranja rastvora na 22°C tokom 10 minuta, DMSO rastvor (0.0622 mL; 9.2 ekvivalenta po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenje dobijeno u procesu 3 iz primera 39 je dodato tome i inkubirano za konjugovanje linkera leka za antitelo na 22°C tokom 40 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.0124 mL; 18.4 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i inkubiran na 22°C da se završi reakcija linkera leka za narednih 20 minuta. Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D-1 (PBS6.0 korišćen je kao pufer rastvor) da se dobije 6 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0467] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E, dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0468] Koncentracija antitela: 0.98 mg/mL, prinos antitela: 5.88 mg (59%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.4.
Primer 41 antitelo-lek konjugat (41)
[0469]
Proces 1: terc-butil {2-[(2-hidroksietil)amino]-2-oksoetil}karbamat
[0470] N-(terc-butoksikarbonil)glicin (4.2 g, 24 mmol) je rastvoren u dimetilformamidu (40 mL). Nakon dodavanja aminoetanola (2.9 g, 48 mmol) i 1-hidroksibenzotriazola (3.7 g, 24 mmol) i dodavanja 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (6.9 g, 36 mmol), to je mešano na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i ostatak je napunjen sa toluenom za azeotropnu destilaciju. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [etil acetat - etil acetat : metanol = 10 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna uljana supstanca (3.8 g, 72%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.44 (9H, s), 1.69 (1H, brs), 3.43 (2H, td, J = 5.9, 5.1 Hz), 3.71 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.79 (2H, d, J = 5.9 Hz), 5.22 (1H, brs), 6.62 (1H, brs).
Proces 2: 2-{[N-(terc-butoksikarbonil)glicil]amino}etil4-nitrofenilkarbonat
[0471] THF (23 mL) rastvoru jedinjenja (1.0 g, 4.59 mmol) dobijenom u procesu 1 iznad, diizopropiletilamin (0.80 mL, 4.59 mmol) i bis(4-nitrofenil) karbonat (1.32 g, 6.88 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [heksan -heksan : etil acetat = 1 : 3 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (1.13 g, 64%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.44 (1H, s), 3.66 (2H, td, J = 5.1, 5.9 Hz), 3.81 (2H, d, J = 5.9 Hz), 4.36 (2H, t, J = 5.1 Hz), 5.07 (1H, s), 6.48-6.53 (1H, m), 7.38 (2H, dt, J = 9.9, 2.7 Hz), 8.27 (2H, dt, J = 9.9, 2.7 Hz).
Proces 3: 2-({[(terc-butoksikarbonil)amino]acetil}amino)etil[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]karbamat
[0472] Soli metansulfonske kiseline eksatekana (0.70 g, 1.2 mmol), jedinjenju (0.57 g, 1.5 mmol) dobijenom u procesu 2, i 1-hidroksibenzotriazolu (3.7 g, 24 mmol), dimetilformamid (23 mL) je dodat, i diizopropiletilamin (0.43 mL, 2.5 mmol) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i ostatak je napunjen sa toluenom za azeotropnu destilaciju. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 10 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.86 g, kvantitativno) kao bledo žuta čvrsta supstanca.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.35 (9H, s), 1.78-1.94 (1H, m), 2.07-2.17 (1H, m), 2.17-2.27 (1H, m), 2.37 (3H, s), 3.05-3.16 (1H, m), 3.19-3.26 (1H, m), 3.34-3.39 (2H, m), 3.50-3.56 (2H, m), 4.00-4.07 (1H, m), 4.13-4.21 (1H, m), 5.15-5.34 (3H, m), 5.44 (2H, s), 6.54 (1H, s), 6.90-6.96 (1H, m), 7.32 (1H, s), 7.78 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.93-8.07 (2H, m).
Proces 4: 2-(glicilamino)etil[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]karbamat
[0473] Jedinjenje (0.86 g, 2.1 mmol) dobijeno u procesu 3 iznad je rastvoreno u dihlorometanu (15 mL). Nakon dodavanja trifluorosirćetne kiseline (15 mL), mešano je tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i ostatak je napunjen sa toluenom za azeotropnu destilaciju. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroform : metanol: voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.86 g, 99%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.79-1.95 (2H, m), 2.06-2.18 (1H, m), 2.18-2.29 (1H, m), 2.38 (3H, s), 3.07-3.17 (1H, m), 3.20-3.29 (1H, m), 3.36-3.50 (2H, m), 3.51-3.62 (2H, m), 3.99-4.08 (1H, m), 4.22-4.31 (1H, m), 5.16-5.35 (3H, m), 5.42 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.46 (1H, d, J = 18.8 Hz), 6.56 (1H, s), 7.34 (1H, s), 7.65 (2H, brs), 7.79 (1H, d, J = 10.6 Hz), 7.99-8.06 (1H, m), 8.51 (1H, t, J = 5.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+
Proces 5: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]karbamoil}oksi)etil]glicinamid
[0474] N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanin (Japanski Patent otkriven sa br. 2002-60351; 0.21 g, 0.41 mmol) je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (3 mL). Nakon dodavanja N-hidroksisukcinimida (0.052 g, 0.45 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (0.086 g, 0.45 mmol), to je mešano tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat u kapima N,N-dimetilformamid rastvoru (2 mL) koji je napunjen sa jedinjenjem (0.24 g, 0.35 mmol) dobijenim u procesu 4 i trietilaminom (0.078 mL, 0.45 mmol), i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.24 g, 65%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.05-2.27 (2H, m), 2.36 (3H, s), 2.73-2.81 (1H, m), 2.98-3.12 (2H, m), 3.17-3.26 (1H, m), 3.35-3.42 (2H, m), 3.55-3.79 (6H, m), 4.00-4.10 (1H, m), 4.12-4.23 (2H, m), 4.23-4.29 (2H, m), 4.45-4.55 (1H, m), 5.13-5.33 (3H, m), 5.40 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.44 (1H, d, J = 17.2 Hz), 6.53 (1H, s), 7.11-7.26 (5H, m), 7.26-7.33 (3H, m), 7.38 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.57 (1H, t, J = 5.9 Hz), 7.68 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.77 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.85 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.91-7.97 (1H, m), 7.98-8.05 (2H, m), 8.14 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.31-8.26 (1H, m).
MS (APCI) m/z: 1063 (M+H)+
Proces 6: glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]karbamoil}oksi)etil]glicinamid
[0475] Jedinjenje (0.24 g, 0.35 mmol) dobijeno u procesu 5 iznad reagovalo je na isti način kao proces 7 iz primera 26 da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.12 g, 65%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.78-1.94 (2H, m), 2.06-2.27 (2H, m), 2.37 (3H, s), 2.72-2.81 (1H, m), 2.98-3.07 (1H, m), 3.12-3.17 (2H, m), 3.57-3.81 (6H, m), 4.00-4.21 (3H, m), 4.45-4.54 (1H, m), 5.15-5.35 (3H, m), 5.41 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.45 (1H, d, J = 17.2 Hz), 6.54 (1H, s), 7.11-7.26 (6H, m), 7.32 (1H, s), 7.78 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.93-8.00 (1H, m), 8.03 (1H, d, J = 9.4 Hz), 8.06-8.13 (1H, m), 8.21-8.27 (2H, m), 8.30-8.36 (1H, m).
MS (APCI) m/z: 841 (M+H)+
Proces 7: N-[6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]karbamoil}oksi)etil]glicinamid
[0476] Jedinjenje (42.0 mg, 0.0499 mmol) dobijeno u procesu 6 reagovalo je na isti način kao proces 3 iz primera 2 da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (38.3 mg, 74%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.12-1.23 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.80-1.95 (2H, m), 2.05-2.27 (4H, m), 2.38 (3H, s), 3.43-2.40 (8H, m), 3.53-3.78 (6H, m), 4.00-4.21 (2H, m), 4.44-4.55 (1H, m), 5.17-5.36 (3H, m), 5.43 (2H, s), 6.54 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.19 (5H, d, J = 23.9 Hz), 7.33 (1H, s), 7.78 (1H, d, J = 10.6 Hz), 7.91-8.16 (5H, m), 8.24-8.31 (1H, m). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+
Proces 8: antitelo-lek konjugat (41)
[0477] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 7 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 2 iz primera 6.
Koncentracija antitela: 1.54 mg/mL, prinos antitela: 9.2 mg (74%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 3.7.
Primer 42 antitelo-lek konjugat (42)
[0478]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (42)
[0479] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijeno u procesu 7 iz primera 41, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.47 mg/mL, prinos antitela: 8.8 mg (71%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 7.0.
Primer 43 antitelo-lek konjugat (43)
[0480]
Proces 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]amino}etoksi)etoksi]propanoil}glicilglicil -L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0481] Jedinjenje (53.7 mg, 50.5 µmol) dobijeno u procesu 6 iz primera 26 je rastvoreno u N,N-dimetilformamidu (1.50 mL). Nakon dodavanja 1,8-diazabiciklo (5.4.0)-7-undecena (7.5 µL, 50.5 µmol), mešano je na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Reakcioni rastvor je napunjen sa piridinijum p-toluensulfonatom (14.0 mg, 5.56 µmol), zatim je napunjen sa N-sukcinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidopropanamido)etoksi)etoksi)propanoatom (32.3 mg, 75.8 µmol), i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2.25 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [[hloroform-podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (27.1 mg, 47%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.79-1.91 (2H, m), 2.18 (2H, t, J = 15.1 Hz), 2.29-2.33 (4H, m), 2.39 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J = 13.9, 9.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J = 13.7, 3.9 Hz), 3.13-3.15 (2H, m), 3.44-3.46 (6H, m), 3.57-3.59 (6H, m), 3.69-3.75 (6H, m), 4.01 (2H, s), 4.46-4.48 (1H, m), 4.63 (2H, d, J = 6.3 Hz), 5.21 (2H, s), 5.42 (2H, s), 5.60 (1H, dd, J = 13.5, 5.7 Hz), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.17-7.24 (6H, m), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.00-8.02 (2H, m), 8.13 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.17 (1H, t, J = 6.3 Hz), 8.52 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.65 (1H, t, J = 6.5 Hz).
MS (ESI) m/z = 1151 (M+H)+
Proces 2: antitelo-lek konjugat (43)
[0482] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 1, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7. Koncentracija antitela: 1.96 mg/mL, prinos antitela: 17.6 mg (88%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 5.6.
Primer 44 antitelo-lek konjugat (44)
[0483]
Proces 1: terc-butil N-[(benziloksi)karbonil]glicilglicil-D-fenilalaninat
[0484] N-[(benziloksi)karbonil]glicilglicin (3.00 g, 11.3 mmol) je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (20.0 mL). Nakon dodavanja N-hidroksisukcinimida (1.43 g, 12.4 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (2.37 g, 12.4 mmol), to je mešano tokom 1 sata. N,N-dimetilformamidni rastvor (10 mL) napunjen je sa D-fenilalanin terc-butilom (2.74 g, 12.38 mmol) i trietilamin (1.73 mL, 12.4 mmol) je dodat u kapima reakcionom rastvoru i mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa dihlorometanom i ispran sa vodom, 1 N hlorovodoničnom kiselinom, i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (4.21 g, 80%).
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.41 (9H, s), 3.03-3.14 (2H, m), 3.86-3.97 (4H, m), 4.70-4.77 (1H, m), 5.13 (2H, s), 5.43 (1H, brs), 6.42 (1H, d, J = 10.0 Hz), 6.64-6.71 (1H, m), 7.11-7.15 (2H, m), 7.20-7.31 (4H, m), 7.31-7.38 (4H, m).
MS (APCI) m/z: 470 (M+H)+
Proces 2: N-[(benziloksi)karbonil]glicilglicil-D-fenilalanin
[0485] Jedinjenje (4.21 g, 8.97 mmol) dobijeno u procesu 1 je rastvoreno u etil acetatu (20 mL). Nakon dodavanja etil acetatnog rastvora (20.0 mL) 4 N vodonik hlorida, ostavljen je preko noći na sobnoj temperaturi. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, zatim je dodat toluen, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (1.66 g, 45%).
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.92-3.01 (1H, m), 3.10-3.18 (1H, m), 3.65-3.81 (3H, m), 3.88-3.98 (1H, m), 4.64-4.73 (1H, m), 5.06 (2H, s), 5.87 (1H, brs), 7.10-7.37 (13H, m).
MS (APCI) m/z: 412 (M+H)-
Proces 3: N-[(benziloksi)karbonil]glicilglicil-D-fenilalanil-N-{[2-(benziloksi)-2-oksoetoksi]metil}glicinamid
[0486] Dioksan (25.0 mL) rastvoru jedinjenja (1.25 g, 2.63 mmol) dobijenog u procesu 1 iz primera 32, piperidin (5.00 mL) i N,N-dimetilformamid (5.00 mL) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (20.0 mL). Nakon dodavanja jedinjenja (1.20 g, 2.90 mmol) iz procesa 2 iznad i 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorida (1.03 g, 3.16 mmol) koji sadrži 16.4% vode, mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata.
Reakcioni rastvor je napunjen sa hloroformom i ispran sa vodom, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (270 mg, 16%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 2.78 (1H, dd, J = 13.6, 10.0 Hz), 3.05 (1H, dd, J = 13.9, 4.2 Hz), 3.56-3.79 (6H, m), 4.15 (2H, s), 4.47-4.54 (1H, m), 4.63 (2H, d, J = 6.7 Hz), 5.03 (2H, s), 5.15 (2H, s), 7.14-7.39 (15H, m), 7.50 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.02 (1H, t, J = 5.4 Hz), 8.16 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.34 (1H, t, J = 6.0 Hz), 8.60 (1H, t, J = 7.0 Hz).
MS (APCI) m/z: 648 (M+H)+
Proces 4: Glicilglicil-D-fenilalanil-N-[(karboksimetoksi)metil]glicinamid
[0487] Jedinjenje (200 mg, 0.31 mmol) dobijeno u procesu 3 iznad je rastvoreno u N,N-dimetilformamidu (5.0 mL). Nakon dodavanja 5% paladijum ugljenik katalizatora (0.12 g), to je mešano pod atmosferom vodonika na sobnoj temperaturi tokom 9 sati. Reakcioni rastvor je filtriran kroz Celite, i ostatak je ispran sa mešanim rastvaračem vode i N,N-dimetilformamida. Filtrat i isprane supstance su kombinovani, i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (0.15 g, kvantitativno).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 2.85 (1H, dd, J = 13.3, 9.7 Hz), 3.08 (1H, dd, J = 13.9, 5.4 Hz), 3.43-3.52 (4H, m), 3.62-3.89 (7H, m), 4.36-4.44 (1H, m), 4.58-4.67 (2H, m), 7.12-7.29 (5H, m), 8.44 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.67 (1H, d, J = 7.3 Hz), 8.78 (1H, t, J = 5.4 Hz), 8.91 (1H, brs). MS (APCI) m/z: 424 (M+H)+
Proces 5: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-D-fenilalanil-N-[(karboksimetoksi)metil]glicinamid
[0488] Jedinjenje (0.15 g, 0.35 mmol) dobijeno u procesu 4 iznad je rastvoreno u N,N-dimetilformamidu (10 mL). Nakon dodavanja N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata (0.11 g, 0.35 mmol), mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je napunjen sa hloroformom i ispran sa vodom, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (41 mg, 26%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.13-1.24 (2H, m), 1.42-1.53 (4H, m), 2.12 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.82 (1H, dd, J = 13.9, 10.0 Hz), 3.09 (1H, dd, J = 13.9, 4.8 Hz), 3.17 (2H, d, J = 4.2 Hz), 3.47-3.89 (8H, m), 4.08-4.14 (1H, m), 4.41-4.49 (1H, m), 4.58-4.69 (2H, m), 7.00 (2H, s), 7.14-7.27 (5H, m), 8.31 (1H, t, J = 6.0 Hz), 8.39 (1H, brs), 8.55 (2H, brs), 8.93 (1H, brs).
MS (APCI) m/z: 615 (M-H) -Proces 6: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-D-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0489] N,N-dimetilformamid (10 mL) rastvoru soli metansulfonske kiseline eksatekana (22 mg, 0.388 mmol), trietilamin (5.42 µL, 0.388 mmol), jedinjenje (29 mg, 0.466 mmol) dobijeno u procesu 5 iznad, i 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid (19 mg, 0.686 mmol) koji sadrži 16.4% vode su dodati na 0°C i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač u reakcionom rastvoru je uklonjen pod sniženim pritiskom, i zatim je dobijeni ostatak prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - podeljeni organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (26 mg, 65%).
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.79-1.92 (2H, m), 2.09 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.13-2.23 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J = 13.6, 9.4 Hz), 2.98-3.05 (1H, m), 3.13-3.23 (2H, m), 3.54-3.78 (8H, m), 4.02 (2H, s), 4.41-4.50 (1H, m), 4.61-4.66 (2H, m), 5.21 (2H, s), 5.42 (2H, s), 5.56-5.64 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.14-7.27 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.01 (1H, t, J = 5.4 Hz), 8.07 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.14 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.31 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.53 (1H, d, J = 9.1 Hz), 8.63 (1H, t, J = 6.3 Hz).
MS (APCI) m/z: 1034 (M+H)+
Proces 7: antitelo-lek konjugat (44)
[0490] Korišćenjem trastuzumaba proizvedenog u referentnom primeru 1 i jedinjenja dobijenog u procesu 6 iznad, antitelo-lek konjugat iz naslova je dobijen na isti način kao proces 1 iz primera 7.
Koncentracija antitela: 1.87 mg/mL, prinos antitela: 16.8 mg (84%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.1.
Primer 45 intermedijer (45)
[0491]
Proces 1: terc-butil (2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetil)karbamat
[0492] Dihlorometan (3.00 mL) rastvoru N-(terc-butoksikarbonil)-glicina (0.395 g, 2.26 mmol), N-hidroksisukcinimid (0.260 g, 2.26 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (0.433 mg, 2.26 mmol) su dodati i mešani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ovaj rastvor je dodat rastvoru koji se sastoji od soli metansulfonske kiseline eksatekana (1.00 g, 1.88 mmol), trietilamina (0.315 mL, 2.26 mmol), i N,N-dimetilformamida (3.00 mL) i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 16.5 sati. Reakcioni rastvor je razblažen sa hloroformom i ispran sa 10% rastvorom limunske kiseline, i zatim je organski sloj osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (1.16 g, 99%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.30 (9H, s), 1.81-1.89 (2H, m), 2.09-2.21 (2H, m), 2.38 (3H, s), 3.15-3.17 (2H, m), 3.55-3.56 (2H, m), 5.15 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 19.2 Hz), 5.41 (2H, s), 5.55-5.56 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.95 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.28 (1H, s), 7.77 (1H, d, J = 11.0 Hz), 8.39 (1H, d, J = 8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 593 (M+H)+
Proces 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]glicinamid
[0493] Jedinjenje (0.513 g, 1.01 mmol) dobijeno u procesu 1 iznad reagovalo je na isti način kao proces 2 iz primera 1 da se dobije jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (0.463 g, 93%).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 0.96 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.89-1.91 (2H, m), 2.14-2.16 (1H, m), 2.30 (3H, s), 2.40-2.42 (1H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.79-3.86 (2H, m), 4.63-4.67 (1H, m), 5.00-5.05 (1H, m), 5.23 (1H, d, J = 16.0 Hz), 5.48 (1H, d, J = 16.0 Hz), 5.62-5.64 (1H, m), 7.40-7.45 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 493 (M+H)+
Primer 46 antitelo-lek konjugat (46)
[0494]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (46)
[0495] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1) . Rastvor (50 mL) je smešten u polikarbonatnu erlenmajer posudu od 125 mL, napunjenu sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata na sobnoj temperaturi (0.750 mL) uz mešanje korišćenjem magnetne mešalice, i zatim je napunjena sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (1.857 mL; 5.4 ekvivalenta po molekulu antitela). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.0 ± 0.1, mešanje je završeno, i disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0496] Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon hlađenja gornjeg rastvora do 15°C, DMSO rastvor koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (2.958 mL; 8.6 ekvivalenta po molekulu antitela) je postepeno dodavano u kapima tome uz mešanje. Na 15°C, reakcioni rastvor je mešan prvih 30 minuta i inkubiran bez mešanja za konjugovanje linkera leka za antitelo tokom sledećeg sata. Sledeće, vodeni rastvor (0.444 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i mešano je na sobnoj temperaturi da se završi reaktivnost nereagovanih linkera lekova za narednih 20 minuta.
[0497] Prečišćavanje: postepenim dodavanjem 20% vodenog rastvora sirćetne kiseline (oko 0.25 mL) i ABS-a (50 mL) rastvoru iznad uz mešanje, pH rastvora je prilagođena do 5.5 ± 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (Millipore Corp., Millex-HV filter, 0.45 µm, PVDF membrana) da se ukloni beličasta materija. Ovaj rastvor je podvrgnut ultrafiltracijskom prečišćavanju korišćenjem ultrafiltracijskog aparata sastavljenog od membrane za ultrafiltraciju (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), pumpe za epruvetu (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00), i epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifično, dok je ABS dodavan u kapima (ukupno 800 mL) kao pufer rastvor za prečišćavanje reakcionom rastvoru, ultrafiltracijsko prečišćavanje je izvršeno za uklanjanje nekonjugovanih linkera lekova i drugih reagenasa male molekularne težine, takođe zamenjivanje pufer rastvora sa ABS, i dodatno koncentrovanje rastvora. Dobijeni prečišćen rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.22 µm (Millipore Corp., Millex-GV filter, PVDF membrane) i 0.10 µm (Millipore Corp., Millex-VV filter, PVDF membrana)) da se dobije 42.5 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova. Fizičkohemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajenih procedura E i F (εD, 280= 5178 (izmerena vrednost), i εD, 370= 20217 (izmerena vrednost) su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0498] Koncentracija antitela: 10.4 mg/mL, prinos antitela: 442 mg (88.5%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom E: 6.0, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereno uobičajenom procedurom F: 7.5.
Primer 47 antitelo-lek konjugat (47)
[0499]
Proces 1: antitelo-lek konjugat (47)
[0500] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1) . Rastvor (15 mL) je smešten u polipropilensku epruvetu i napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (0.567 mL; 5.5 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (0.225 mL). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 2 sata. Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon dodavanja DMSO (0.146 mL) i DMSO rastvora koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (0.928 mL; 9.0 ekvivalenta po molekulu antitela) rastvoru iznad na sobnoj temperaturi, inkubiran je za konjugovanje linkera leka za antitelo na 15°C tokom 30 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (0.133 mL; 12.9 ekvivalenta po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome i mešan na sobnoj temperaturi da se završi reaktivnost nereagovanih linkera lekova za drugih 20 minuta.
[0501] Prečišćavanje: rastvor iznad je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem uobičajene procedure D (ABS je korišćen kao pufer rastvor) da se dobije 49 mL rastvora koji sadrži jedinjenje od interesa.
[0502] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E (εD, 280= 5178 i εD, 370= 20217 su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti. Koncentracija antitela: 2.91 mg/mL, prinos antitela: 143 mg (95%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.2.
Primer 48 antitelo-lek konjugat (48)
[0503]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (48)
[0504] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg-1cm-1) . Rastvor (280 mL) je smešten u polikarbonatnu erlenmajer posudu od 1000 mL, napunjenu sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata na sobnoj temperaturi (4.200 mL) uz mešanje korišćenjem magnetne mešalice, i zatim je napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (10.594 mL; 5.5 ekvivalenata po molekulu antitela). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.4 ± 0.1, mešanje je završeno, i disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 2 sata.
[0505] Konjugacija između antitela i linkera leka: nakon hlađenja rastvora iznad do 15°C, DMSO rastvor koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (17.335 mL; 9.0 ekvivalenata po molekulu antitela) je postepeno dodat u kapima tome uz mešanje. Reakcioni rastvor je mešan na 15°C za konjugovanje linkera leka za antitelo tokom 30 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (2.485 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i mešan je na sobnoj temperaturi da se završi reaktivnost nereagovanih linkera lekova tokom drugih 20 minuta.
[0506] Prečišćavanje: postepenim dodavanjem 20% vodenog rastvora sirćetne kiseline (oko 1.4 mL) i ABS (280 mL) rastvoru iznad uz mešanje, pH rastvora je prilagođena do 5.5 ± 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.45 µm, PVDF membrana) da se ukloni beličasta materija dok se dobija oko 600 mL filtrata. Ovaj rastvor je podvrgnut ultrafiltacijskom prečišćavanju korišćenjem aparata za ultrafiltraciju koji je sastavljen od ultrafiltracijske membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), pumpe za epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00), i epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifično, dok je ABS dodavan u kapima (ukupno 4800 mL) kao pufer rastvor za prečišćavanje reakcionom rastvoru, ultrafiltracijsko prečišćavanje je izvedeno za uklanjanje nekonjugovanih linkera lekova i drugih reagenasa male molekularne težine, takođe za zamenjivanje pufer rastvora sa ABS, i dodatno koncentrovanje rastvora. Dobijeni prečišćeni rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (dva puta sa 0.22 µm i 0.10 µm, PVDF membrana) da se dobije 70 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0507] Fizičko-hemijska karakterizacija: korišćenjem uobičajene procedure E (εD, 280= 5178 i εD, 370= 20217 su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti. Koncentracija antitela: 35.96 mg/mL, prinos antitela: 2517 mg (90%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.2.
Primer 49 antitelo-lek konjugat (49)
[0508]
Proces 1: Antitelo-lek konjugat (49)
[0509] Redukcija antitela: trastuzumab proizveden u referentnom primeru 1 je pripremljen tako da ima koncentraciju antitela 10 mg/mL zamenom medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem uobičajene procedure C-1 i uobičajene procedure B (kao koeficijent apsorpcije na 280 nm, korišćen je 1.48 mLmg<-1>cm<-1>). Rastvor (280 mL) je smešten u polikarbonatnu erlenmajer posudu od 1000 mL, napunjenu sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata na sobnoj temperaturi (4.200 mL) uz mešanje korišćenjem magnetne mešalice, i zatim je napunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (10.594 mL; 5.5 ekvivalenata po molekulu antitela). Nakon utvrđivanja da je rastvor imao pH od 7.0 ± 0.1, mešanje je završeno, i disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 2 sata.
[0510] Konjugacija između antitela i linkera leka: Nakon hlađenja gornjeg rastvora do 15°C, DMSO rastvor koji sadrži 10 mM jedinjenje iz procesa 8 iz primera 26 (17.335 mL; 9.0 ekvivalenata po molekulu antitela) je postepeno dodat u kapima tome uz mešanje. Reakcioni rastvor je mešan na 15°C za konjugovanje linkera leka za antitelo tokom 30 minuta. Sledeće, vodeni rastvor (2.485 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i mešano je na sobnoj temperaturi da se završi reaktivnost nereagovanih linkera lekova za drugih 20 minuta.
[0511] Prečišćavanje: postepenim dodavanjem 20% vodenog rastvora sirćetne kiseline (oko 1.4 mL) i ABS-a (280 mL) rastvoru iznad uz mešanje, pH rastvora je prilagođena na 5.5 ± 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.45 µm, PVDF membrana) da se ukloni beličasta materija dok se dobija oko 600 mL filtrata. Ovaj rastvor je podvrgnut ultrafiltracijskom prečišćavanju korišćenjem aparata za ultrafiltraciju koji je sastavljen od ultrafiltracijske membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Ultracell 30 KDa), pumpe za epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00), i epruvete (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifično, dok je ABS dodavan u kapima (ukupno 4800 mL) kao pufer rastvor za prečišćavanje reakcionom rastvoru, ultrafiltracijsko prečišćavanje je izvedeno za uklanjanje nekonjugovanih linkera lekova i drugih reagenasa male molekularne težine, takođe zamenjivanje pufer rastvora sa ABS-om, i dodatno koncentrovanje rastvora. Dobijeni prečišćeni rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (dva puta sa 0.22 µm i 0.10 µm, PVDF membrana) da se dobije 130 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
[0512] Fizičko-hemijska karakterizacija: Korišćenjem uobičajene procedure E (εD, 280= 5178 i εD, 370= 20217 su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
[0513] Koncentracija antitela: 21.00 mg/mL, prinos antitela: 2730 mg (97.5%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 6.3.
Primer 50 antitelo-lek konjugat (50)
Proces 1: antitelo-lek konjugat (50)
[0514] Antitelo-lek konjugati (47), (48), i (49) proizvedeni u primerima 47, 48, i 49 su pomešani (243 mL) i dodatno napunjeni sa ABS-om (39.75 mL) da se dobije 283 mL rastvora koji sadrži antitelo-lek konjugat iz naslova.
Fizičko-hemijska karakterizacija: Korišćenjem uobičajenih procedura E i F (εD, 280= 5178, i εD, 370= 20217 su korišćeni), dobijene su sledeće karakteristične vrednosti.
Koncentracija antitela: 20.0 mg/mL, prinos antitela: 5655 mg, prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću uobičajene procedure E: 6.3, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću uobičajene procedure F: 7.8.
Evaluacioni Primer 1 Inhibitorni efekat antitelo-lek konjugata na ćelijski rast (1)
[0515] KPL-4 linija HER2 antigen-pozitivnih ćelija humanog kancera dojke (Dr. Junichi Kurebayashi, Kawasaki Medical School, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6).707-717) ili MCF7 linija antigen-negativnih ćelija humanog kancera dojke (European Collection of Cell Cultures; ECACC) je kultivisana u RPMI1640 (GIBCO) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (MOREGATE) (u daljem tekstu, naznačen kao medijum). KPL-4 ili MCF7 je pripremljena tako da ima koncentraciju od 2.5 × 104 ćelija/mL korišćenjem medijuma, dodata u koncentraciji od 100 µL/bunariću u mikroploču od 96-bunarića za ćelijsku kulturu, i kultivisana tokom noći.
[0516] Sledećeg dana, trastuzumab ili antitelo-lek konjugat razblažen u 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, i 0.064 nM korišćenjem medijuma je dodat u koncentraciji od 10 µL/bunariću u mikroploču. Medijum je dodat u koncentraciji od 10 µL/bunariću u bunariće u koje nije dodato antitelo. Ćelije su kultivisane pod 5% CO2na 37°C tokom 5 do 7 dana. Nakon kultivacije, mikroploča je izvađena iz inkubatora i ostavljena na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Rastvor kulture je napunjen sa jednakom količinom CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) i promešan. Nakon što je mikroploča odstajala na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, intenzitet luminescencije svakog bunarića je izmeren korišćenjema čitača ploče (PerkinElmer). IC50vrednost je izračunata u skladu sa sledećom jednačinom:
a: Koncentracija uzorka a
b: Koncentracija uzorka b
c: Vijabilnost ćelija uzorka a
d: Vijabilnost ćelija uzorka b
[0517] Vijabilnost ćelija pri svakoj koncentraciji je izračunata u skladu sa sledećom jednačinom:
a: Prosečan intenzitet luminescencije bunarića sa uzorkom (n = 2)
b: Prosečan intenzitet luminescencije bunarića u koje nije dodato antitelo (n = 10)
[0518] Antitelo-lek konjugati (2), (3), (5), (7), (10), (12), (13), (16), (18), (40), i (42) su ispoljili inhibitorni efekat na ćelijski rast od IC50< 0.1 (nM) na KPL-4 ćelije.
[0519] Antitelo-lek konjugati (4), (6), (9), (15), (17), (21), (22), (25), (36), (37), (39), (41), i (43) su ispoljili inhibitorni efekat na ćelijski rast od 0.1 < IC50< 1 (nM) na ćelije.
[0520] Antitelo-lek konjugati (20), (24), i (27) su ispoljili inhibitorni efekat na ćelijski rast od 1 < IC50< 100 (nM) na ćelije. Nijedan od antitelo-lek konjugata (19) ili (26) nije ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast na ćelije (> 100 (nM)).
[0521] S druge strane, antitelo-lek konjugati (5), (13), i (43) su ispoljili inhibitorni efekat na ćelijski rast od 1 < IC50< 100 (nM) na MCF7 ćelije, dok nijedan od antitelo-lek konjugata (2), (3), (4), (6), (7), (9), (10), (12), (15), (16), (17), (18), (25), (26), (27), (39), (40), (41), (42), i (44) nije ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast na ćelije (> 100 (nM)).
[0522] Trastuzumab nije ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast niti na KPL-4 ćelije niti MCF7 ćelije (> 100 (nM)).
Evaluacioni Primer 2 Antitumorski test (1)
[0523] Miš: 5- do 6-nedelja-stare ženke golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) su aklimatizovane tokom 4 do 7 dana pod SPF uslovima pre primene u eksperimentu. Miševi su nahranjeni sa sterilisanom čvrstom hranom (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) i data im je sterilisana voda iz česme (pripremljena dodatkom 5 do 15 ppm rastvora natrijum hipohlorita).
[0524] Test i izraz za izračunavanje: U svim studijama, glavna osa i sporedna osa tumora su merene dva puta nedeljno korišćenjem elektronskog digitalnog kalipera (CD-15CX, Mitutoyo Corp.), i zapremina tumora (mm3) je izračunata. Izraz za izračunavanje je kao što je prikazano ispod.
[0525] Svi antitelo-lek konjugati i antitelo su razblaženi sa fiziološkim rastvorom (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) i korišćeni u zapremini od 10 mL/kg za intravensku administraciju u repnu venu svakog miša.
[0526] KPL-4 ćelije su suspendovane u fiziološkom rastvoru, i 1.5 × 107 ćelija je subkutano transplantirano u desnu stranu tela svake ženke golog miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 15. Antitelo-lek konjugat (27) ili anti-HER2 antitelo trastuzumab (Referentni primer 1) za kontrolnu grupu je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dane 15 i 22. Netretirana grupa je utvrđena kao kontrolna grupa.
[0527] Rezultati su prikazani na Slici 3. Administracija trastuzumaba je inhibirala rast tumora, dok je administracija antitelo-lek konjugata (27) proizvela značajniji inhibitorni efekat na rast tumora. Na slici, apscisa prikazuje dane nakon inokulacije tumora, i ordinata prikazuje zapreminu tumora. Dodatno, miševi koji su primili trastuzumab ili antitelo-lek konjugat (27) su bili bez primetnih znaka kao što su gubitak mase, nagoveštavajući da je antitelo-lek konjugat (27) visoko bezbedan. U Evaluacionim Primerima ispod vezano za antitumorski test, test je sproveden pomoću procedure koja je primenjena u ovom Evaluacionom Primeru , sem ako nije naznačeno drugačije.
Evaluacioni Primer 3 Antitumorski test (2)
[0528] Ćelije NCI-N87 linije humanog kancera želuca kupljene od ATCC (American Type Culture Collection) su suspendovane u fiziološkom rastvoru, i 1 × 107 ćelija je subkutano transplantirano u desnu stranu tela svake ženke golog miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 7. Antitelo-lek konjugat (8) ili (28), ili trastuzumab emtansin (Referentni primer 2) je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 7. Netretirana grupa je utvrđena kao kontrolna grupa.
[0529] Rezultati su prikazani na Slici 4. Potvrđeno je da antitelo-lek konjugati (8) i (28) imaju snažan antitumorski efekat sa tumorskom regresijom ekvivalentnom onoj od trastuzumab emtansina. Dodatno, pronađeno je da je administracija antitelo-lek konjugata (8) ili (28), ili trastuzumab emtansina bez gubitka mase miševa.
Evaluacioni Primer 4 Antitumorski test (3)
[0530] Ćelije JIMT-1 linije humanog kancera dojke kupljene od DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) su suspendovane u fiziološkom rastvoru, i 3 × 106 ćelija je subkutano transplantirano u desnu stranu tela svake ženke golog miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 12. Antitelo-lek konjugat (8), (29), ili (30), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dane 12 i 19. Grupa kojoj je administriran fiziološki rastvor je utvrđena kao kontrolna grupa.
[0531] Rezultati su prikazani na Slici 5. Administracija trastuzumaba ili trastuzumab emtansina nije inhibirala rast JIMT-1 tumora. S druge strane, administracija antitelo-lek konjugata (8), (29), ili (30) je inhibirala rast tumora. Dodatno, pronađeno je da je administracija antitelo-lek konjugata (8), (29), ili (30), trastuzumaba, ili trastuzumab emtansina bez gubitka mase miševa.
Evaluacioni Primer 5 Inhibitorni efekat antitelo-lek konjugata na ćelijski rast (2)
[0532] Calu-3 linija humanog nesitnoćelijskog kancera pluća (ATCC) je kultivisana u Eagleovom minimalnom esencijalnom medijumu (GIBCO) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (MOREGATE) (u daljem tekstu, naznačen kao MEM medijum).
[0533] NCI-N87 linija humanog kancera želuca (ATCC) ili MKN-45 linija humanog kancera želuca (Health Science Research Resources Bank) je kultivisana u RPMI1640 Medijumu (GIBCO) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (u daljem tekstu, naznačen kao RPMI medijum).
[0534] MDA-MB-453 linija humanog kancera dojke (ATCC) ili MDA-MB-468 linija humanog kancera dojke (ATCC) je kultivisana u Leibovitz-ovom L-15 Medijumu (GIBCO) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (u daljem tekstu, naznačen kao Leibovitz-ov medijum).
[0535] Među ovih 5 tipova ćelijskih linija, Calu-3, NCI-N87, i MDA-MB-453 su HER2-pozitivne ćelije, i MKN-45 i MDA-MB-468 su HER2-negativne ćelije.
[0536] Calu-3, NCI-N87, ili MKN-45 je pripremljena tako da ima koncentraciju od 4 × 104 ćelija/mL korišćenjem MEM medijuma ili RPMI medijuma, dodata u koncentraciji od 25 µL/bunariću u mikroploču sa 96-bunarića za ćelijsku kulturu dopunjena sa 65 µL/bunariću medijuma, i kultivisana preko noći pod 5% CO2na 37°C. Takođe, MDA-MB-453 ili MDA-MB-468 je pripremljena tako da ima koncentraciju od 4 × 104 ćelija/mL korišćenjem Leibovitz-ovog medijuma, dodata u koncentraciji od 25 µL/bunariću u mikroploču sa 96-bunarića za ćelijsku kulturu dopunjena sa 65 µL/bunariću medijuma, i kultivisana preko noći na 37°C bez podešavanje CO2koncentracije.
[0537] Sledećeg dana, test supstanca razblažena u 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, i 0.064 nM korišćenjem RPMI medijuma ili Leibovitz-ovog medijuma, ili RPMI medijum ili Leibovitz-ov medijum je dodat u koncentraciji od 10 µL/bunariću u mikroploču. Ćelije su kultivisane pod 5% CO2na 37°C ili na 37°C bez podešavanja CO2koncentracije tokom 6 dana.
[0538] Za Calu-3, NCI-N87, i MDA-MB-468, antitelo-lek konjugat (46) je dodat kao test supstanca. Za ostale ćelije, antitelo-lek konjugat (50) je dodat kao test supstanca. Nakon kultivacije, mikroploča je izvađena iz inkubatora i ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Rastvor kulture je napunjen sa jednakom količinom CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) i promešan sa mešalicom ploče da bi se potpuno lizirale ćelije. Nakon što je mikroploča odstajala na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, intenzitet luminescencije je meren korišćenjem čitača ploče.
[0539] Ćelijska vijabilnost je izračunata u skladu sa sledećom jednačinom:
a: Prosečan intenzitet luminescencije bunarića u koje je dodata test supstanca b: Prosečan intenzitet luminescencije bunarića u koje je dodat medijum
[0540] IC50vrednost je izračunata u skladu sa sledećom jednačinom:
a: Koncentracija a test supstance
b: Koncentracija b test supstance
c: Ćelijska vijabilnost pojačana sa test supstancom koja ima koncentraciju a
d: Ćelijska vijabilnost pojačana sa test supstancom koja ima koncentraciju b [0541] Koncentracije a i b uspostavljaju odnos a > b koji prelazi 50% ćelijske vijabilnosti.
[0542] Antitelo-lek konjugat (46) je ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast od IC50< 1 (nM) na HER2-pozitivne ćelije Calu-3 i NCI-N87. S druge strane, antitelo-lek konjugat (46) nije ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast na HER2-negativne ćelije MDA-MB-468 (> 100 (nM)).
[0543] Antitelo-lek konjugat (50) je ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast od IC50< 1 (nM) na HER2-pozitivne ćelije MDA-MB-453. S druge strane, antitelo-lek konjugat (50) nije ispoljio inhibitorni efekat na ćelijski rast na HER2-negativne ćelije MKN-45 (> 100 (nM)).
Evaluacioni Primer 6 Antitumorski test (4)
[0544] Ćelije Capan-1 linije humanog kancera pankreasa (ATCC) koje slabo eksprimujeju HER2 su suspendovane u fiziološkom rastvoru, i 4 × 107 ćelija je subkutano transplantirano u desnu stranu tela svake ženke golog miša da bi se generisao Capan-1 solidni tumor. Nakon toga, ovaj solidni tumor je održavan u nekoliko pasaža transplantacijom ženkama golih miševa i primenjen u ovom testu. Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantiran u desnu stranu tela svake ženke golog miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 20.
[0545] Antitelo-lek konjugat (31), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 20. Grupa kojoj je administriran fiziološki rastvor je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0546] Rezultati su prikazani na Slici 6. Administracija trastuzumaba ili trastuzumab emtansina nije inhibirala rast Capan-1 tumora. Nasuprot tome, administracija antitelo-lek konjugata (31) je inhibirala rast tumora, ukazujući da je antitelo-lek konjugat (31) efikasan za čak tumor sa niskim HER2 eksprimovanjem. Antitelo-lek konjugat (31) nije inhibirao rast tumora sa GCIY linijom kancera želuca koja ne eksprimuje HER2.
[0547] Što se tiče eksprimujeja HER2 u tumoru, na osnovu rezultata merenja imunohistohemijskog bojenja opisanog u 3. izdanju smernica za HER2 testiranje (razvijenih od strane Japanskog odbora za patologiju za optimalnu primenu trastuzumaba, Japanskog društva za patologiju), klasifikacija je izvedena tako da skor od 3+: visoko eksprimujeje, 2+: umereno eksprimujeje, i 1+: slabo eksprimujeje. Čak iako je skor bio 0 u ovoj metodi merenja, tumor nađen kao HER2-pozitivan pomoću drugih metoda merenja kao što je metoda merenja korišćenjem protočnog citometra je klasifikovan kao tumor sa slabim eksprimovanjem.
Evaluacioni Primer 7 Antitumorski test (5)
[0548] Ćelije NCI-N87 linije humanog kancera želuca kupljene od ATCC su suspendovane u fiziološkom rastvoru, i 1 × 107 ćelija je subkutano transplantovano na desnu stranu tela svake ženke golog miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 6. Antitelo-lek konjugat (50) je intravenski administriran u svakoj dozi od 0.3, 1, 3, ili 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 6. Grupa kojoj se administrira rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0549] Rezultati su prikazani na Slici 7. Antitelo-lek konjugat (50) je ispoljio dozno-zavistan antitumorski efekat. Dodatno, pronađeno je da je administracija antitelo-lek konjugata (50) bila bez gubitka mase miševa.
Evaluacioni Primer 8 Antitumorski test (6)
[0550] Ovaj test je izveden pomoću sledeće metode.
[0551] Miš: 6- do 12-nedelja-stare ženke golih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) su podvrgnute eksperimentu.
[0552] Test i izraz za izračunavanje: Glavna osa i sporedna osa tumora su izmerene dva puta nedeljno korišćenjem elektronskog digitalnog kalipera, i zapremina tumora (mm3) je izračunata. Izraz za izračunavanje je kao što je prikazano ispod.
[0553] Antitelo-lek konjugat, trastuzumab, i trastuzumab emtansin su razblaženi sa rastvorom acetatnog pufera i korišćeni u zapremini od 10 mL/kg za intravensku administraciju u repnu venu svakog miša.
[0554] Tumor (ST225; South Texas Accelerated Research Therapeutics (START)) odstranjen iz pacijenta sa kancerom dojke i održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa je korišćen u ovom testu. Ovaj tumor je umereno eksprimovao HER2 (koji je dobio skor od 2+ u imunohistohemijskom bojenju).
[0555] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantovan na stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm3. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0556] Rezultati su prikazani na Slici 8. Administracija trastuzumaba nije inhibirala rast tumora ST225 kancera dojke koji umereno eksprimuje HER2. Nasuprot tome, administracija trastuzumab emtansina ili antitelo-lek konjugata (50) značajno je inhibirala rast tumora.
Evaluacioni Primer 9 Antitumorski test (7)
[0557] Tumor (ST910; START) odstranjen iz pacijenta sa kancerom dojke i održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa je korišćen u ovom testu. Ovaj tumor je slabo eksprimovan HER2 (koji je dobio skor od 1+ u imunohistohemijskom bojenju).
[0558] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantovan na stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm<3>. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0559] Rezultati su prikazani na Slici 9. Administracija trastuzumaba ili trastuzumab emtansina nije inhibirala rast tumora ST910 kancera dojke koji slabo eksprimuje HER2. Nasuprot tome, administracija antitelo-lek konjugata (50) je značajno inhibirala rast tumora, pokazujući da je antitelo-lek konjugat (50) efikasan za tumor kancera dojke koji slabo eksprimuje HER2. Ovaj Evaluacioni Primer 9 je izveden pomoću iste procedure kao Evaluacioni Primer 8.
Evaluacioni Primer 10 Antitumorski test (8)
[0560] Ovaj test je izveden pomoću procedure koja sledi. Evaluacioni Primeri 11 do 13 su takođe izvedeni pomoću ove procedure.
[0561] Miš: 5- do 8-nedelja-stare ženke golih miševa (Harlan Laboratories Ltd.) su podvrgnute eksperimentu.
[0562] Test i izraz za izračunavanje: Glavna osa i sporedna osa tumora su izmerene dva puta nedeljno korišćenjem elektronskog digitalnog kalipera, i zapremina tumora (mm3) je izračunata. Izraz za izračunavanje je kao što je prikazano ispod.
[0563] Antitelo-lek konjugat, trastuzumab, i trastuzumab emtansin su razblaženi sa rastvorom acetatnog pufera i korišćeni u zapremini od 10 mL/kg za intravensku administraciju u repnu venu svakog miša.
[0564] Tumor (CTG-0401; Champions Oncology Inc.) odstranjen iz pacijenta sa kolorektalnim kancerom i održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa je korišćen u ovom testu. Ovaj tumor je umereno eksprimovan HER2 (koji je dobio skor od 1+ ili 2+ u imunohistohemijskom bojenju).
[0565] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantovan na levu stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm3. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0566] Rezultati su prikazani na Slici 10. Administracija trastuzumaba ili trastuzumab emtansina nije inhibirala rast tumora CTG-0401 kolorektalnog kancera koji slabo ili umereno eksprimovan HER2. Nasuprot tome, administracija antitelo-lek konjugata (50) značajno je inhibirala rast tumora.
Evaluacioni Primer 11 Antitumorski test (9)
[0567] Tumor (CTG-0860; Champions Oncology Inc.) odstranjen iz pacijenta sa nesitnoćelijskim kancerom pluća i održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa je korišćen u ovom testu. Ovaj tumor je umereno eksprimovao HER2 (koji je dobio skor od 2+ u imunohistohemijskom bojenju).
[0568] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantiran na levu stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm3. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0569] Rezultati su prikazani na Slici 11. Administracija trastuzumaba ili trastuzumab emtansina nije inhibirala rast tumora CTG-0860 ne-sitnoćelijskog kancera pluća koji umereno eksprimuje HER2. Nasuprot tome, administracija antitelo-lek konjugata (50) značajno je inhibirala rast tumora.
Evaluacioni Primer 12 Antitumorski test (10)
[0570] Tumor (CTG-0927; Champions Oncology Inc.) ekscizovan iz pacijenta sa kancerom žučnog kanala i održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa je korišćen u ovom testu. Ovaj tumor je visoko eksprimovao HER2 (koji je dobio skor od 3+ u imunohistohemijskom bojenju).
[0571] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantiran na levu stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm3. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0572] Rezultati su prikazani na Slici 12. Administracija trastuzumab nije inhibirala rast tumora CTG-0927 kancera žučnog kanala koji je visoko eksprimovao HER2. Nasuprot tome, administracija trastuzumab emtansina je inhibirala rast tumora. Pored toga, administracija antitelo-lek konjugata (50) indukovala je regresiju tumora.
Evaluacioni Primer 13 Antitumorski test (11)
[0573] Tumor (CTG-0137; Champions Oncology Inc.) odstranjen iz pacijenta sa kancerom jednjaka i održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa je korišćen u ovom testu. Ovaj tumor je visoko eksprimovao HER2 (koji je dobio skor od 3+ u imunohistohemijskom bojenju).
[0574] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantiran na levu stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm<3>. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran rastvor acetatnog pufera je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0575] Rezultati su prikazani na Slici 13. Administracija trastuzumaba nije inhirala rast tumora CTG-0137 kancera jednjaka koji je visoko eksprimovao HER2. Nasuprot tome, administracija trastuzumab emtansina ili antitelo-lek konjugata (50) značajno je inhibirala rast tumora.
Evaluacioni Primer 14 Antitumorski test (12)
[0576] Ćelije SK-OV-3 linije humanog kancera jajnika koje su visoko ekspimirale HER2 kupljene od ATCC su suspendovane u fiziološkom rastvoru, i 4 × 107 ćelija je subkutano transplantirano u desnu stranu tela svake ženke golog miša kako bi se pripremio SK-OV-3 solidni tumor. Posle toga, ovaj solidni tumor je održavan u nekoliko pasaža transplantacijom u ženke golih miševa i korišćen u ovom testu.
[0577] Tumorski deo solidnog tumora je subkutano transplantiran u desnu stranu tela svake ženke golog miša, i miševi su nasumično grupisani kada je zapremina tumora dostigla 100 do 300 mm3. Datum grupisanja je definisan kao Dan 0. Antitelo-lek konjugat (50), trastuzumab, ili trastuzumab emtansin je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u repnu venu svakog miša na Dan 0. Grupa kojoj je administriran fiziološki rastvor je uspostavljena kao kontrolna grupa.
[0578] Rezultati su prikazani na Slici 14. Administracija trastuzumaba nije inhibirala rast SK-OV-3 tumora. Nasuprot tome, administracija trastuzumab emtansina ili antitelo-lek konjugata (50) značajno je inhibirala rast tumora.
Slobodan tekst liste sekvenci
SEQ ID NO: 1 - Aminokiselinska sekvenca teškog lanca humanizovanog anti-HER2 monoklonskog antitela
SEQ ID NO: 2 - Aminokiselinska sekvenca lakog lanca humanizovanog anti-HER2 monoklonskog antitela

Claims (11)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitelo-lek ili njegovu so kao aktivnu komponentu, i farmaceutski prihvatljivu komponentu formulacije, pri čemu konjugat antitelo-lek je konjugat antitelo-lek, gde antitumorsko jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
    je konjugovano sa anti-HER2 antitelom preko linkera koji ima strukturu predstavljenu sledećom formulom: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- preko tioetarske veze koja se formira na disulfidnoj vezi koja je prisutna u zglobnom delu anti-HER2 antitela, pri čemu anti-HER2 antitelo je povezano sa terminalom L1, antitumorsko jedinjenje je povezano sa karbonil grupom - (CH2)n2-C(=O)- dela sa atomom azota amino grupe na poziciji 1 kao veznom pozicijom, pri čemu n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6, n2 predstavlja ceo broj od 0 do 5, L1 predstavlja -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-, pri čemu n3 predstavlja ceo broj od 2 do 8, L2 predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu, pri čemu n4 predstavlja ceo broj od 1 do 6, LP predstavlja tetrapeptidni ostatak -GGFG-, La predstavlja -O- ili jednostruku vezu, i -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu sledećom formulom:
    koji je povezan sa anti-HER2 antitelom na svom položaju 3 i povezan je sa metilenskom grupom u strukturi linkera koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1, za primenu u lečenju karcinoma sa niskom ekspresijom HER2.
  2. 2. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu deo strukture lek-linker koji ima lek povezan sa -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- je jedna struktura lek-linker izabrana iz sledeće grupe: (Sukcinimid-3-il-N) -CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) pri čemu -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu prikazanu sledećom formulom:
    koji je povezan sa anti-HER2 antitelom na svom položaju 3 i povezan je sa metilenskom grupom u strukturi linkera koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1, -(NH-DX) predstavlja grupu predstavljenu sledećom formulom:
    pri čemu je atom azota amino grupe na poziciji 1 vezni položaj, i -GGFG- predstavlja tetrapeptidni ostatak -Gly-Gly-Phe-Gly-.
  3. 3. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu deo strukture lek-linker je jedna struktura lek-linker izabrana iz sledeće grupe: -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  4. 4. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu deo strukture lek-linker je -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
  5. 5. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu deo strukture lek-linker je -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
  6. 6. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu deo strukture lek-linker je -(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  7. 7. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu anti-HER2 antitelo sadrži težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 449 sa SEQ ID NO: 1 i lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 2.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu anti-HER2 antitelo sadrži težak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 1 i lak lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 2.
  9. 9. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane lek-linker strukture konjugovane po antitelu u opsegu od 2 do 8.
  10. 10. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je prosečan broj jedinica odabrane lek-linker strukture konjugovane po antitelu u opsegu od 3 do 8.
  11. 11. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu HER2-nisko ekspresioni kancer je kancer pluća, urotelni kancer, kolorektalni kancer, kancer prostate, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer mokraćne bešike, kancer želuca, gastrointestinalni stromalni tumor, kancer grlića materice, kancer jednjaka, karcinom skvamoznih ćelija, kancer peritoneuma, kancer jetre, hepatocelularni kancer, kancer debelog creva, kancer rektuma, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer materice, kancer pljuvačne žlezde, kancer bubrega, kancer vulve, kancer štitne žlezde, kancer penisa, leukemija, maligni limfom, plazmacitom, mijelom ili sarkom.
RS20241442A 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antitelo-lek konjugat RS66412B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014017777 2014-01-31
JP2014168944 2014-08-22
JP2014227886 2014-11-10
EP22198821.5A EP4212552B1 (en) 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antibody-drug conjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66412B1 true RS66412B1 (sr) 2025-02-28

Family

ID=53756672

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211465A RS62618B1 (sr) 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antitelo-lek konjugat
RS20190280A RS58415B1 (sr) 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antitelo-lek konjugat
RS20241442A RS66412B1 (sr) 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antitelo-lek konjugat

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211465A RS62618B1 (sr) 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antitelo-lek konjugat
RS20190280A RS58415B1 (sr) 2014-01-31 2015-01-28 Anti-her2 antitelo-lek konjugat

Country Status (31)

Country Link
US (4) US10155821B2 (sr)
EP (5) EP3973995A1 (sr)
JP (10) JP5998289B2 (sr)
KR (13) KR102314913B1 (sr)
CN (2) CN105829346B (sr)
AU (3) AU2015212265B2 (sr)
BR (1) BR112016013482B1 (sr)
CA (1) CA2928794C (sr)
CY (3) CY1121573T1 (sr)
DK (3) DK3101032T3 (sr)
ES (3) ES3005311T3 (sr)
FI (1) FI4212552T3 (sr)
FR (1) FR21C1030I2 (sr)
HR (3) HRP20241783T1 (sr)
HU (4) HUE044389T2 (sr)
IL (5) IL278891B2 (sr)
LT (4) LT3101032T (sr)
MX (2) MX375930B (sr)
NL (1) NL301117I2 (sr)
NO (1) NO2021027I1 (sr)
NZ (1) NZ719202A (sr)
PH (2) PH12020552271A1 (sr)
PL (3) PL3466976T3 (sr)
PT (3) PT3466976T (sr)
RS (3) RS62618B1 (sr)
SG (2) SG10201800210TA (sr)
SI (3) SI4212552T1 (sr)
SM (3) SMT201900211T1 (sr)
TW (10) TWI789700B (sr)
WO (1) WO2015115091A1 (sr)
ZA (1) ZA201602802B (sr)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX364484B (es) * 2012-10-11 2019-04-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo-fármaco.
HRP20250673T1 (hr) * 2013-12-25 2025-08-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Postupak za proizvodnju konjugata anti-trop2 antitijelo-lijek
KR102314913B1 (ko) * 2014-01-31 2021-10-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항-her2 항체-약물 접합체
ES2754348T3 (es) * 2014-04-10 2020-04-17 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de (anticuerpo anti-HER2)-fármaco
US9808528B2 (en) 2014-06-18 2017-11-07 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates and methods of using same
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
AU2016286898B2 (en) 2015-06-29 2022-12-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for selectively manufacturing antibody-drug conjugate
SG10201912173RA (en) 2016-10-07 2020-02-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
KR20250040100A (ko) * 2016-12-12 2025-03-21 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트와 면역 체크 포인트 저해제의 조합
CN117982673A (zh) * 2017-02-28 2024-05-07 第一三共株式会社 抗her3抗体-药物偶联物的应用
CN108653746B (zh) * 2017-03-29 2021-04-27 北京键凯科技股份有限公司 一种多载药点、高载药配基药物偶联物
TWI880888B (zh) 2017-08-23 2025-04-21 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物之製劑及其冷凍乾燥方法
JP7248578B2 (ja) * 2017-08-31 2023-03-29 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの新規製造方法
KR102816741B1 (ko) 2017-08-31 2025-06-04 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 개량 제조 방법
HUE067382T2 (hu) 2018-05-18 2024-10-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-MUC1-exatecan antitest-hatóanyag konjugátum
CN120501882A (zh) 2018-05-28 2025-08-19 第一三共株式会社 通过施用抗her2抗体-药物缀合物治疗her2突变的癌
US20210283269A1 (en) 2018-07-25 2021-09-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
WO2020022475A1 (ja) 2018-07-27 2020-01-30 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質
CN112805036A (zh) 2018-07-31 2021-05-14 第一三共株式会社 通过施用抗体-药物缀合物对转移性脑肿瘤的治疗
CN110790840A (zh) 2018-08-01 2020-02-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人her2的抗体、其制备方法和用途
CN112512587A (zh) 2018-08-06 2021-03-16 第一三共株式会社 抗体药物缀合物和微管蛋白抑制剂的组合
TW202016317A (zh) 2018-08-23 2020-05-01 日商第一三共股份有限公司 抗體藥物結合物之感受性標記
WO2020063676A1 (zh) 2018-09-26 2020-04-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 依喜替康类似物的配体-药物偶联物及其制备方法和应用
US12377163B2 (en) 2018-09-30 2025-08-05 Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co., Ltd Anti-B7H3 antibody-exatecan analog conjugate and medicinal use thereof
SG11202106248XA (en) * 2018-12-11 2021-07-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Combination of antibody-drug conjugate with parp inhibitor
CN113195000A (zh) * 2018-12-21 2021-07-30 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物和激酶抑制剂的组合
CN109824759A (zh) * 2019-03-08 2019-05-31 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体
PH12021552363A1 (en) 2019-03-29 2022-09-05 Medimmune Ltd Compounds and conjugates thereof
CN111686259B (zh) * 2019-05-26 2023-08-08 成都百利多特生物药业有限责任公司 一种含sn38的抗体药物偶联物
AU2020301289B2 (en) * 2019-06-28 2024-11-07 Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate, intermediate thereof, preparation method therefor and application thereof
BR112022004913A2 (pt) * 2019-09-18 2022-06-07 Baili Bio Chengdu Pharmaceutical Co Ltd Derivado de camptotecina e conjugado do mesmo
US20220387618A1 (en) 2019-11-15 2022-12-08 Seagen Inc. Methods of treating her2 positive breast cancer with tucatinib in combination with an anti-her2 antibody-drug conjugate
KR20220113728A (ko) 2019-12-12 2022-08-16 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도
BR112022011632A2 (pt) 2019-12-16 2022-10-04 Jiangsu Hengrui Medicine Co Conjugado análogo de anticorpo exatecano anti-cea e uso farmacêutico do mesmo
US20230101735A1 (en) 2020-01-22 2023-03-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-trop-2 antidody-exatecan analog conjugate and medical use thereof
EP4129345A4 (en) * 2020-03-25 2023-11-29 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING AN ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND USE THEREOF
JP2023519261A (ja) 2020-03-25 2023-05-10 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｐｓｍａ抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途
MX2022011769A (es) * 2020-03-25 2022-10-18 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Metodo de preparacion de medicamento de conjugado de anticuerpo.
CN115835860A (zh) * 2020-06-12 2023-03-21 树顶分子生技股份有限公司 用于治疗非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的带有碳酸酯的紫檀芪氨基酸的新型类似物
WO2021260583A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
TW202216208A (zh) 2020-06-24 2022-05-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atr抑制劑之組合
WO2021260582A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
JP2023539715A (ja) * 2020-06-24 2023-09-19 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲートとａｔｍ阻害剤との組合わせ
EP4171654A1 (en) * 2020-06-24 2023-05-03 AstraZeneca UK Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
WO2022001864A1 (zh) * 2020-06-28 2022-01-06 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
BR112023000489A2 (pt) * 2020-07-13 2023-03-28 Regeneron Pharma Análogos de camptotecina conjugados a um resíduo de glutamina em uma proteína, e seu uso
KR102349925B1 (ko) * 2020-07-16 2022-01-12 주식회사 피노바이오 Fl118 약물을 포함하는 화합물 및 이를 이용한 면역접합체
CA3186675A1 (en) * 2020-07-20 2022-01-27 Yasuki KAMAI Combination of anti-her2 antibody-drug conjugate with her dimerization inhibitor
CN119792568A (zh) * 2020-08-13 2025-04-11 正大天晴药业集团股份有限公司 抗体药物偶联物
JP2023545359A (ja) 2020-09-12 2023-10-30 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド 抗ｈｅｒ２抗体－薬物複合体治療のためのスコアリング方法
WO2022056696A1 (zh) * 2020-09-15 2022-03-24 四川百利药业有限责任公司 一种喜树碱类药物及其抗体偶联物
CN116199739B (zh) 2020-09-30 2024-12-17 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用
CA3195117A1 (en) 2020-10-09 2022-04-14 Jerome Thomas Mettetal Ii Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
JP2023545581A (ja) * 2020-10-12 2023-10-30 シーチュアン バイリ ファーム シーオー． エルティーディー カンプトテシン系誘導体及びそのリガンド－薬物複合体
US20230381332A1 (en) * 2020-10-12 2023-11-30 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. Deuterated Camptothecin Derivative And Antibody-drug Conjugate Thereof
TW202227140A (zh) 2020-11-11 2022-07-16 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物及抗SIRPα抗體之組合
CN116615250A (zh) 2020-11-12 2023-08-18 第一三共株式会社 通过施用抗b7-h3抗体-药物缀合物的间皮瘤治疗
CN112535738B (zh) * 2020-12-04 2022-09-09 中国科学技术大学 奥沙利铂偶联物及其制备方法和应用
MX2023006751A (es) * 2020-12-11 2023-06-19 Wigen Biomedicine Tech Shanghai Co Ltd Nuevo derivado de camptotecina, composicion que comprende el mismo y su uso.
AU2022208361A1 (en) * 2021-01-13 2023-07-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-dll3 antibody-drug conjugate
WO2022171115A1 (zh) * 2021-02-09 2022-08-18 微境生物医药科技(上海)有限公司 用于adc制备的喜树碱衍生物
CN117015549A (zh) * 2021-03-17 2023-11-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种喜树碱衍生物的制备方法
US12036286B2 (en) 2021-03-18 2024-07-16 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds
WO2022205111A1 (zh) * 2021-03-31 2022-10-06 上海复旦张江生物医药股份有限公司 一种伊喜替康衍生物的制备方法及其中间体
CA3213079A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Kristin Lynne ANDREWS Amino-substituted heterocycles for treating cancers with egfr mutations
KR20240036506A (ko) * 2021-05-07 2024-03-20 알렉소 온콜로지 인크. 엑사테칸 유도체 및 그의 항체-약물 접합체
CN113402584A (zh) * 2021-07-06 2021-09-17 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种抗体偶联药物连接子的中间体lnd1067-l1的合成方法
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
US11814394B2 (en) 2021-11-16 2023-11-14 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Exatecan derivatives, linker-payloads, and conjugates and thereof
AU2022392822A1 (en) 2021-11-18 2024-05-02 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
KR20240120744A (ko) 2021-12-16 2024-08-07 맵웰 (상하이) 바이오사이언스 컴퍼니, 리미티드 캄프토테신 화합물 및 이의 접합체
EP4456899A1 (en) * 2021-12-28 2024-11-06 AstraZeneca UK Limited Combination of antibody-drug conjugate and rasg12c inhibitor
IL313929A (en) 2021-12-28 2024-08-01 Astrazeneca Uk Ltd Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
CA3255700A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited RATING METHOD FOR ANTI-TROP2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE THERAPY
EP4514391A1 (en) 2022-04-27 2025-03-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
JP2025517656A (ja) * 2022-05-11 2025-06-10 第一三共株式会社 腫瘍抗原に特異的である抗体と、ｃｄ４７阻害剤との組合せ
IL318313A (en) 2022-07-12 2025-03-01 Cytomx Therapeutics Inc EPCAM antibody conjugates and their uses
MA71616A (fr) 2022-07-28 2025-05-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Association d'un conjugué anticorps-médicament et d'un inhibiteur de point de contrôle bispécifique
CN117024438A (zh) * 2022-07-29 2023-11-10 杭州爱科瑞思生物医药有限公司 依沙替康衍生物及其应用
TW202415409A (zh) 2022-08-02 2024-04-16 中國商諾納生物（蘇州）有限公司 Msln抗體藥物複合體
JP2025511436A (ja) * 2022-09-02 2025-04-16 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー エキサテカン由来トポイソメラーゼ－１阻害薬医薬組成物及びその使用
CN116712561A (zh) * 2022-12-29 2023-09-08 杭州爱科瑞思生物医药有限公司 含n-亚甲基酰胺连接子的抗体-药物偶联物
CN120569220A (zh) 2023-01-18 2025-08-29 苏州宜联生物医药有限公司 一种抗体药物偶联物、制备方法及其应用
WO2024158996A2 (en) 2023-01-25 2024-08-02 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
WO2024175069A1 (zh) * 2023-02-23 2024-08-29 一线医药（杭州）有限公司 喜树碱衍生物及其偶联物以及其制备方法和医药用途
TW202444423A (zh) 2023-03-14 2024-11-16 日商第一三共股份有限公司 抗cdh6抗體-藥物結合物與vegf抑制劑之組合
CN118666946A (zh) * 2023-03-15 2024-09-20 上海亲合力生物医药科技股份有限公司 连接子及使用其的偶联药物、抗体偶联药物及其应用
CN120917143A (zh) 2023-03-29 2025-11-07 第一三共株式会社 抗cd25抗体及抗cd25抗体-药物偶联物
KR20250173601A (ko) 2023-03-31 2025-12-10 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트와 HIF-2α 저해제의 조합
TW202506190A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 日商第一三共股份有限公司 利用抗ｍｕｃ１抗體－藥物結合物投予的藥劑低敏感性癌之治療方法
CN121038817A (zh) 2023-04-10 2025-11-28 第一三共株式会社 抗-b7-h3抗体-药物缀合物和atr抑制剂或atm抑制剂的组合
CN121175072A (zh) 2023-04-11 2025-12-19 浙江博锐生物制药有限公司 抗ror1抗体及其药物偶联物
WO2025019254A1 (en) 2023-07-14 2025-01-23 Guardant Health, Inc. Classification of breast tumors using dna methylation from liquid biopsy
TW202506196A (zh) * 2023-07-28 2025-02-16 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 含有糖皮質激素的抗體藥物偶聯物的藥物組合物
WO2025036480A1 (zh) * 2023-08-16 2025-02-20 中山康方生物医药有限公司 化合物以及含有该化合物的抗体偶联药物
WO2025054707A1 (en) * 2023-09-11 2025-03-20 Theratechnologies Inc. Peptide conjugates of camptothecin analogs and uses thereof
WO2025054996A1 (en) * 2023-09-15 2025-03-20 Duality Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Antibody-drug conjugate
CN117417347A (zh) * 2023-09-28 2024-01-19 杭州爱科瑞思生物医药有限公司 卤素取代的依沙替康的酰胺衍生物及其制备方法和应用
WO2025078841A2 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Antikor Biopharma Limited Antibodies, conjugates, and uses thereof
WO2025088496A1 (en) 2023-10-24 2025-05-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and anti-pd-1/tim-3 bispecific binding protein
TW202535479A (zh) 2023-12-05 2025-09-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體藥物結合物與血腦屏障穿透性ｐａｒｐ１選擇性抑制劑之組合
WO2025176180A1 (zh) * 2024-02-23 2025-08-28 江苏恒瑞医药股份有限公司 艾日布林衍生物药物偶联物用于治疗肿瘤的用途
WO2025209545A1 (zh) * 2024-04-03 2025-10-09 上海药明合联生物技术有限公司 用于抗体药物偶联物的连接子、其用途和由其制备的抗体药物偶联物
WO2025238587A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate and androgen receptor signaling inhibitor
WO2025242090A1 (zh) * 2024-05-21 2025-11-27 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 喜树碱衍生物及其中间体的制备方法
WO2025252189A1 (zh) * 2024-06-06 2025-12-11 海思科医药集团股份有限公司 喜树碱类衍生物及其用途

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
JP3008226B2 (ja) 1991-01-16 2000-02-14 第一製薬株式会社 六環性化合物
US5637770A (en) 1991-01-16 1997-06-10 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Hexa-cyclic compound
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
DE69333823T2 (de) 1992-03-24 2006-05-04 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Verfahren zur herstellung von gliedern von spezifischen bindungspaaren
JP3359955B2 (ja) 1992-07-16 2002-12-24 第一製薬株式会社 抗腫瘍剤
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
JPH09506508A (ja) 1993-12-03 1997-06-30 メディカル リサーチ カウンシル 組換え結合タンパク質およびペプチド
US6504029B1 (en) 1995-04-10 2003-01-07 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Condensed-hexacyclic compounds and a process therefor
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
SG50747A1 (en) 1995-08-02 1998-07-20 Tanabe Seiyaku Co Comptothecin derivatives
JPH1095802A (ja) 1995-12-28 1998-04-14 Tanabe Seiyaku Co Ltd カンプトテシン誘導体
CA2192725C (en) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Camptothecin derivatives
TW527183B (en) 1996-06-06 2003-04-11 Daiichi Seiyaku Co Drug complex
TW409058B (en) 1996-06-06 2000-10-21 Daiichi Seiyaku Co Method for preparation of a drug complex
JPH1171280A (ja) 1997-06-26 1999-03-16 Tanabe Seiyaku Co Ltd 医薬組成物
JPH1192405A (ja) 1997-09-19 1999-04-06 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 薬物複合体
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
AU3733399A (en) * 1998-05-22 1999-12-13 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Drug composites
CN1191093C (zh) 1998-10-30 2005-03-02 第一制药株式会社 Dds化合物及其测定方法
AU3672800A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
BR0012196A (pt) 1999-06-25 2002-03-19 Genentech Inc Método de tratamento de um tumor em mamìferos através do uso de conjugados de maitansinóide e anticorpo receptor anti-erbb e artigo industrializado
KR100850389B1 (ko) 1999-06-25 2008-08-04 제넨테크, 인크. 인간화 항-ＥｒｂＢ2 항체 및 항-ＥｒｂＢ2 항체를 사용한치료 방법
JP2002060351A (ja) 2000-03-22 2002-02-26 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 水酸基を有する薬物を含むｄｄｓ化合物
KR20030031502A (ko) 2000-06-29 2003-04-21 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤 디디에스 화합물 및 그의 제조방법
US6815435B2 (en) 2000-07-13 2004-11-09 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions containing DDS compounds
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
TWI313609B (en) 2001-08-21 2009-08-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Pharmaceutical composition for inhibiting the metastasis or preventing the recurrence of malignant tumor
KR100573565B1 (ko) 2001-08-29 2006-04-25 주식회사 포스코 요철부가 형성된 실린더 링과 이 실린더 링이 결합된 맨드릴
IL161686A0 (en) 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
AU2002363939A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US7585491B2 (en) * 2002-12-13 2009-09-08 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
AU2005218642B2 (en) 2004-03-02 2011-04-28 Seagen Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
MXPA06013413A (es) 2004-05-19 2007-01-23 Medarex Inc Enlazadores quimicos y conjugados de los mismos.
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
KR20110050567A (ko) * 2004-07-22 2011-05-13 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP1817341A2 (en) 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
TWI441646B (zh) 2005-01-21 2014-06-21 Genentech Inc 帕妥珠單抗(pertuzumab)用於製備治療人類病患癌症之藥物的用途
DE102005009084A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Anthrazyklin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
DE102005009099A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
JP2006316040A (ja) * 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）補助療法
US20090226465A1 (en) 2005-10-31 2009-09-10 Jackson David Y Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
US20080131428A1 (en) 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
CN101490087B (zh) 2006-05-30 2013-11-06 健泰科生物技术公司 抗体和免疫偶联物及其用途
HRP20140172T1 (hr) 2006-05-30 2014-03-28 Genentech, Inc. Protutijela i imunokonjugati kao i njihove uporabe
ITMI20061473A1 (it) 2006-07-26 2008-01-27 Indena Spa Derivati della camptotecina ad attivita antitumorale
MY166445A (en) 2008-03-18 2018-06-27 Genentech Inc Combinations of an anti-her2 antibody-drug conjugate and chemotherapeutic agents,and methods of use
CN104524590B (zh) * 2008-04-30 2019-06-21 伊缪诺金公司 交联剂和它们的用途
EP2277044B1 (en) 2008-05-13 2015-06-17 Genentech, Inc. Analysis of antibody drug conjugates by bead-based affinity capture and mass spectrometry
US8927694B2 (en) 2008-11-18 2015-01-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
PL3939617T3 (pl) 2009-02-13 2025-03-17 Immunomedics, Inc. Związki pośrednie do wytwarzania koniugatów z wiązaniem rozszczepialnym wewnątrzkomórkowo
EP2435071A1 (en) 2009-05-29 2012-04-04 F. Hoffmann-La Roche AG Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
CA2768494A1 (en) * 2009-07-22 2011-01-27 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating her2 positive cancer with her2 receptor antagonist in combination with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin
WO2011022474A2 (en) 2009-08-18 2011-02-24 Baker Hughes Incorporated Method of forming polystalline diamond elements, polycrystalline diamond elements, and earth boring tools carrying such polycrystalline diamond elements
JP2013505944A (ja) 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
CA2782194C (en) 2009-12-02 2018-01-16 Immunomedics, Inc. Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer
EP2569000B1 (en) 2010-05-13 2017-09-27 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
MX350781B (es) 2010-05-17 2017-09-18 Livtech Inc * Anticuerpo anti-humano trop-2 que tiene actividad anti-tumoral in vivo.
CA2799202C (en) 2010-05-18 2016-07-05 Cerulean Pharma Inc. Compositions and methods for treatment of autoimmune and other diseases
EP2594589A1 (en) 2010-06-10 2013-05-22 Sapporo Medical University ANTI-Trop-2 ANTIBODY
PH12013500070A1 (en) 2010-07-12 2017-08-23 Covx Tech Ireland Ltd Multifunctional antibody conjugates
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
JP6014596B2 (ja) 2010-11-09 2016-10-25 メディミューン，エルエルシー 均一コンジュゲーションのための抗体足場
CN103313990B (zh) 2010-11-17 2016-07-20 基因泰克公司 丙氨酰美登醇抗体偶联物
US8871908B2 (en) 2011-11-11 2014-10-28 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies specific for Trop-2 and their uses
US9427464B2 (en) * 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
MX2014007121A (es) * 2011-12-14 2014-09-04 Seattle Genetics Inc Nuevos conjugados de principio activo-ligante (adc) y su uso.
US20130280282A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
EP2861259A1 (en) 2012-06-14 2015-04-22 Ambrx, Inc. Anti-psma antibodies conjugated to nuclear receptor ligand polypeptides
MX364484B (es) 2012-10-11 2019-04-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo-fármaco.
ES2782248T3 (es) 2012-10-19 2020-09-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo y fármaco producido por la unión a través de un enlazador que tiene estructura hidrófila
JP6262768B2 (ja) * 2013-01-03 2018-01-17 セルトリオン， インク． 抗体−リンカー−薬物結合体、その製造方法およびそれを含む抗癌剤組成物
HRP20250673T1 (hr) 2013-12-25 2025-08-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Postupak za proizvodnju konjugata anti-trop2 antitijelo-lijek
KR102314913B1 (ko) * 2014-01-31 2021-10-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항-her2 항체-약물 접합체
KR102186027B1 (ko) 2014-04-10 2020-12-03 다이이치 산쿄 유럽 게엠베하 항her3 항체-약물 콘주게이트

Also Published As

Publication number Publication date
HUS2100025I1 (hu) 2021-07-28
CN110464847B (zh) 2024-02-09
JP7703727B2 (ja) 2025-07-07
CA2928794A1 (en) 2015-08-06
LTC3101032I2 (sr) 2022-10-25
MX2016006498A (es) 2016-08-04
JP6665325B2 (ja) 2020-03-13
KR102314913B1 (ko) 2021-10-19
RU2683780C2 (ru) 2019-04-02
US20240026030A1 (en) 2024-01-25
SMT202100659T1 (it) 2022-01-10
KR20230042126A (ko) 2023-03-27
MX2020010682A (es) 2020-11-06
US11795236B2 (en) 2023-10-24
FR21C1030I2 (fr) 2022-04-08
SG11201603960XA (en) 2016-07-28
KR102465042B1 (ko) 2022-11-09
JP6914380B2 (ja) 2021-08-04
TW202525347A (zh) 2025-07-01
KR102510128B1 (ko) 2023-03-14
KR102362920B1 (ko) 2022-02-14
PL3101032T3 (pl) 2019-07-31
EP3101032A4 (en) 2017-09-06
KR102275925B1 (ko) 2021-07-12
JP7467557B2 (ja) 2024-04-15
KR102238848B1 (ko) 2021-04-09
AU2022203818A1 (en) 2022-06-23
KR20220100994A (ko) 2022-07-18
JP5998289B2 (ja) 2016-09-28
FR21C1030I1 (sr) 2021-08-27
RU2016123597A3 (sr) 2018-10-12
ZA201602802B (en) 2017-09-27
KR20210127803A (ko) 2021-10-22
KR20180122038A (ko) 2018-11-09
US11584800B2 (en) 2023-02-21
TWI796243B (zh) 2023-03-11
PH12016500904B1 (en) 2016-07-11
JP2021169493A (ja) 2021-10-28
TW202237114A (zh) 2022-10-01
LT4212552T (lt) 2025-01-10
NL301117I2 (nl) 2021-07-29
HRP20190431T1 (hr) 2019-04-19
JP2025138756A (ja) 2025-09-25
EP3101032A1 (en) 2016-12-07
PL3466976T3 (pl) 2021-12-20
KR102190548B1 (ko) 2020-12-14
SI4212552T1 (sl) 2025-03-31
JP6105183B1 (ja) 2017-03-29
IL266790A (en) 2019-07-31
BR112016013482B1 (pt) 2022-04-19
JP2019112403A (ja) 2019-07-11
JP2020097617A (ja) 2020-06-25
TWI661839B (zh) 2019-06-11
NL301117I1 (nl) 2021-07-19
US20160333112A1 (en) 2016-11-17
CN110464847A (zh) 2019-11-19
HUE044389T2 (hu) 2019-10-28
KR102881140B1 (ko) 2025-11-04
JP7146031B2 (ja) 2022-10-03
TWI796246B (zh) 2023-03-11
KR102557062B1 (ko) 2023-07-18
KR20220154251A (ko) 2022-11-21
SMT202500030T1 (it) 2025-03-12
US20190077880A1 (en) 2019-03-14
KR20230162159A (ko) 2023-11-28
DK3101032T3 (en) 2019-04-29
LT3466976T (lt) 2021-11-10
IL278891A (en) 2021-01-31
TWI789700B (zh) 2023-01-11
DK4212552T3 (da) 2025-02-10
IL278891B1 (en) 2024-02-01
TW201613649A (en) 2016-04-16
EP3101032B1 (en) 2019-01-16
CN105829346A (zh) 2016-08-03
DK3466976T3 (da) 2021-12-13
WO2015115091A1 (ja) 2015-08-06
SI3101032T1 (sl) 2019-02-28
TW202322817A (zh) 2023-06-16
PH12016500904A1 (en) 2016-07-11
TWI870307B (zh) 2025-01-11
MX375930B (es) 2025-03-04
TWI722422B (zh) 2021-03-21
KR20250162923A (ko) 2025-11-19
EP4212552B1 (en) 2024-11-13
US10155821B2 (en) 2018-12-18
AU2020200596A1 (en) 2020-02-20
CY2021018I1 (el) 2021-10-15
IL245252A0 (en) 2016-06-30
TW201834692A (zh) 2018-10-01
PT3466976T (pt) 2021-10-27
RU2019107788A (ru) 2019-05-17
JP2017105789A (ja) 2017-06-15
PT4212552T (pt) 2025-01-20
KR20220025176A (ko) 2022-03-03
KR102417312B1 (ko) 2022-07-05
PH12020552271A1 (en) 2022-05-02
TW202237115A (zh) 2022-10-01
KR102606930B1 (ko) 2023-11-29
SG10201800210TA (en) 2018-02-27
US20200385486A1 (en) 2020-12-10
TW201934145A (zh) 2019-09-01
IL324322A (en) 2025-12-01
PL4212552T3 (pl) 2025-03-17
EP4464707A2 (en) 2024-11-20
CY1121573T1 (el) 2020-05-29
TWI627967B (zh) 2018-07-01
RS62618B1 (sr) 2021-12-31
LT3101032T (lt) 2019-03-25
ES2727351T3 (es) 2019-10-15
KR20210040181A (ko) 2021-04-12
KR20200140932A (ko) 2020-12-16
TW202237191A (zh) 2022-10-01
AU2015212265B2 (en) 2020-01-02
LTPA2021515I1 (sr) 2021-08-10
EP3466976A1 (en) 2019-04-10
SMT201900211T1 (it) 2019-05-10
CY1124774T1 (el) 2022-11-25
JP2024081770A (ja) 2024-06-18
PT3101032T (pt) 2019-04-03
TW202237113A (zh) 2022-10-01
EP4464707A3 (en) 2025-04-02
IL245252B (en) 2019-06-30
TWI848560B (zh) 2024-07-11
FI4212552T3 (fi) 2025-01-31
SI3466976T1 (sl) 2021-12-31
HRP20241783T1 (hr) 2025-02-28
JP2017036285A (ja) 2017-02-16
CN105829346B (zh) 2019-08-23
ES3005311T3 (en) 2025-03-14
KR20210088745A (ko) 2021-07-14
HRP20211848T1 (hr) 2022-03-04
HUE070620T2 (hu) 2025-06-28
JP2022180504A (ja) 2022-12-06
JPWO2015115091A1 (ja) 2017-03-23
ES2895254T3 (es) 2022-02-18
KR101916553B1 (ko) 2018-11-07
KR20160113099A (ko) 2016-09-28
EP3973995A1 (en) 2022-03-30
HUE057464T2 (hu) 2022-05-28
BR112016013482A2 (sr) 2017-10-03
RS58415B1 (sr) 2019-04-30
IL310627A (en) 2024-04-01
IL310627B1 (en) 2025-12-01
NO2021027I1 (no) 2021-07-06
TWI796245B (zh) 2023-03-11
TW202120088A (zh) 2021-06-01
RU2016123597A (ru) 2018-03-02
JP2017095457A (ja) 2017-06-01
TWI796244B (zh) 2023-03-11
JP6466895B2 (ja) 2019-02-06
EP4212552A1 (en) 2023-07-19
EP3466976B1 (en) 2021-09-08
AU2020200596B2 (en) 2022-03-03
CY2021018I2 (el) 2021-10-15
IL278891B2 (en) 2024-06-01
CA2928794C (en) 2019-08-13
KR20230113822A (ko) 2023-08-01
TW202500196A (zh) 2025-01-01
NZ719202A (en) 2022-02-25
JP6046301B1 (ja) 2016-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240026030A1 (en) Method of treating cancer comprising administration of anti-her2 antibody-drug conjugate
HK40112172A (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
HK40064483A (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
HK40086489A (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
HK40086489B (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
RU2794183C2 (ru) Анти-her2 конъюгат антитела с лекарственным средством
HK40005802A (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
HK40005802B (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
HK1231102A1 (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate
HK1231102B (en) Anti-her2 antibody-drug conjugate