RS63500B1

RS63500B1 - Jedinjenja imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridina kao inhibitori janus kinaza

Info

Publication number: RS63500B1
Application number: RS20220753A
Authority: RS
Inventors: Tatiana Koudriakova; Kevin D Kreutter; Kristi Leonard; Michele C Rizzolio; Russell C Smith; Mark S Tichenor; Aihua Wang
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2022-09-30
Also published as: SMT202200326T1; KR20190086779A; CA3046965A1; UA125042C2; MY196260A; NZ755404A; PL3555097T3; IL267275A; AU2022204240B2; CO2019006200A2; BR112019011968A2; ECSP19042688A; EP4086256A1; US10294226B2; AU2017377069B2; WO2018112379A1; CN110088105A; MX2019007073A; ZA201904615B; MD3555097T2

Description

Opis pronalaska

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na određena jedinjenja imidazopirolopiridina i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Unutrašnji faktori, spoljašnji faktori ili kombinacija oba faktora mogu izazvati ili biti povezani sa razvojem abnormalnih imunih odgovora u telu. Kao posledica toga, razvijaju se patološka stanja u kojima su sastojci, kao što su supstance i tkiva, koji su normalno prisutni u telu, podložni takvom imunološkom odgovoru. Ova stanja se generalno nazivaju bolestima imunog sistema. Pošto je imuni sistem tela uključen i oštećenje utiče na tkivo tela, takve bolesti se nazivaju i autoimune bolesti. Pošto su takav sistem i tkivo deo istog tela, termini „autoimuna bolest“ i „bolest imunog sistema“ se ovde koriste naizmenično, bez obzira na to šta pokreće anomalni odgovor imunog sistema. Štaviše, identitet ili mehanizam osnovnog imunološkog problema nije uvek jasan. Videti, na primer, D.J. Marks, et al., Crohn’s disease: An immune deficiency state, Clinical Reviews in Allergy and Immunology 38(1), 20-30 (2010); J.D. Lalande, et al, Mycobacteria in Crohn’s disease: How innate immune deficiency may result in chronic inflammation, Expert Reviews of Clinical Immunology 6(4), 633-41 (2010); J.K. Yamamoto-Furusho, et al., Crohn’s disease: Innate immunodeficiency, World Journal of Gastroenterology, 12(42), 6751-55 (2006). Kako se ovde koristi, termin "autoimuna bolest" ne isključuje stanja čiji uzroci uključuju spoljne faktore ili agense, kao što su faktori okoline ili bakterije, i unutrašnje faktore kao što je genetska osetljivost. Shodno tome, stanje kao što je Kronova bolest (CD) se ovde naziva autoimunom bolešću, bez obzira da li je izazvano samim telom ili spoljnim faktorima. Videti, na primer, J. L. Casanova, et al., Revisiting Crohn’s disease as a primary immunodeficiency of macrophages, J. Exp. Med. 206(9), 1839-43 (2009).

[0003] Među različitim neželjenim efektima izazvanim autoimunim bolestima, obično se primećuje najmanje jedno od sledećeg: oštećenje, a ponekad i uništavanje tkiva, i promena organa koja može uticati na rast organa i funkciju organa. Primeri autoimunih bolesti pogađaju većinu glavnih organa, endokrinih i egzokrinih žlezda, krv i mišiće, i mnoštvo sistema, kao što su digestivni, vaskularni, vezivni i nervni sistemi. Imunosupresivni tretmani se često koriste za lečenje autoimunih bolesti.

[0004] Poznato je više teorija koje objašnjavaju kako nastaju autoimune bolesti, neke se fokusiraju na endogene faktore, a druge takođe uključuju egzogene faktore. Na molekularnom nivou, smatra se da signalni put Janus kinaze/pretvarača signala i aktivatora transkripcije (JAK/STAT) igra važnu ulogu u prenošenju informacija od ekstracelularnih hemijskih signala do ćelijskog jezgra, što rezultira regulacijom gena koji su uključeni u ćelijske aktivnosti kao što je imunitet. Citokini su primer ekstracelularnog molekula koji igra važnu ulogu u ćelijskoj signalizaciji. Leukocite, kao što su neutrofili, regrutuju citokini i hemokini da bi na kraju izazvali oštećenje tkiva kod hroničnih inflamatornih bolesti.

[0005] Familija proteina Janus kinaze (JAK) sastoji se od 4 tirozin kinaze, JAK1, JAK2, JAK3 i Tyk2, koje su centralne za intracelularnu signalizaciju tipa I i tipa II citokinskih receptora. Termin JAK se odnosi na JAK1, JAK2, JAK3 ili Tyk2, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Svaki JAK se selektivno povezuje sa podjedinicama receptora koje dimerišu (ili multimerišu) da bi formirale funkcionalne receptore. Prema J.D. Clark, et al., Discovery and Development of Janus Kinase (JAK) Inhibitors for Inflammatory Diseases, J. Med. Chem. 57(12), 5023-38 (2014), "korak aktivacije se dešava kada se citokin veže za svoj receptor, izazivajući multimerizaciju (dimerizaciju ili komplekse višeg reda) podjedinica receptora. Ovo dovodi JAK povezane sa svakom podjedinicom proksimalno jedne drugim, pokrećući seriju događaja fosforilacije koji na kraju rezultiraju fosforilacijom i aktivacijom signalnih pretvarača i aktivatora transkripcionih (STAT) proteina. Fosforilovani STAT dimer se zatim translocira u jezgro ćelije gde se vezuje za ciljne gene modulirajući njihovu ekspresiju." Jednom u jezgru, STAT regulišu transkripciju gena brojnih medijatora u inflamatornom procesu vezivanjem za specifična mesta prepoznavanja na DNK. Videti, na primer, J. Med. Chem.

57(12), 5023-38 (2014), citirano gore. Postoje značajni dokazi koji pokazuju važnost JAK/STAT puta kod inflamatornih, autoimunih bolesti i raka. Videti, na primer, M. Coskun, et al., Involvement of JAK/STAT signaling in the pathogenesis of inflammatory bowel disease, Pharmacological Research 76, 1-8 (2013); and J.J. O’Shea, et al. JAKs and STATs in immunity, immunodeficiency, and cancer, The New England Journal of Medicine 368, 161-70 (2013).

[0006] Inflamatorne bolesti creva, uključujući Kronovu bolest i ulcerozni kolitis (UC), karakterišu ponavljajuća crevna upala, poremećaj epitelne barijere i mikrobna disbioza. Prekomerni inflamatorni odgovor u gastrointestinalnom traktu je posredovan sa nekoliko proinflamatornih citokina uključujući TNFα, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-21 i IL-23 koji ispoljavaju svoje efekte na ćelije urođenog i adaptivnog imunog sistema uključujući T i B limfocite, epitelne ćelije, makrofage i dendritske ćelije (DC). Videti, na primer, Pharmacological Research 76, 1-8 (2013), cited above; S. Danese, et al., JAK inhibition using tofacitinib for inflammatory bowel disease treatment: A hub for multiple inflammatory cytokines, American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology 310, G155-62 (2016); and M.F. Neurath, Cytokines in inflammatory bowel disease, Nature Reviews Immunology 14, 329-42 (2014).

[0007] Prevencija i/ili kontrola takvog preteranog inflamatornog odgovora je poželjna. U svetlu mehanizma takvog odgovora kao što je prethodno sažeto, inhibicija JAK (pogledati ilustraciju na Slici 1 u obliku nazubljene strelice koja prikazuje pan-JAK inhibitor koji udara na JAK/STAT signalni put i upalu) je predviđena da spreči ili kontroliše prekomernu inflamatornu reakciju. JAK inhibitori koji inhibiraju veći broj takvih JAK proteina se ovde nazivaju pan-JAK inhibitori. Primeri terapijskih prednosti takve prevencije ili kontrole primećeni su kod tofacitiniba, oralnog bioraspoloživog pan-JAK inhibitora odobrenog u Sjedinjenim Državama za lečenje reumatoidnog artritisa i trenutno u kliničkom razvoju za ulcerozni kolitis. U kliničkom ispitivanju faze 2, 194 pacijenata sa umerenim do teškim ulceroznim kolitisom je navodno procenjeno na kliničku efikasnost. Videti, npr., W.J. Sandborn, et al., Tofacitinib, an oral Janus kinase inhibitor, in active ulcerative colitis, The New England Journal of Medicine 367, 616-24 (2012). Objavljene informacije o ovom ispitivanju pokazuju da su pacijenti koji su primali dva puta dnevno (BID) doze od 0,5, 3, 10 i 15 mg postigli stope kliničkog odgovora od 32, 48, 61 i 78%, redom, u poređenju sa 42% uočenih u placebu. Dalje je objavljeno da je sekundarna krajnja tačka kliničke remisije (Mayo skor ≤ 2) bila 13, 33, 48 i 41% u poređenju sa 10% uočenih u placebu. Videti, na primer, The New England Journal of Medicine 367, 616-24 (2012), citirano gore. U kliničkom ispitivanju faze 3 UC, 88 od 476 pacijenata je postiglo kliničku remisiju nakon 8 nedelja lečenja tofacitinibom (10 mg dva puta dnevno) u poređenju sa 10 od 122 pacijenata koji su primali placebo. Videti W.J. Sandborn, et al. Efficacy and safety of oral tofacitinib as induction therapy in patients with moderate-to-severe ulcerative colitis: results from 2 phase 3 randomised controlled trials, J. Crohns Colitis 10, S15-S (2016). Izveštaji o Kronovoj bolesti ukazuju da je tofacitinib takođe bio u razvoju za lečenje CD-a; međutim, navodno je prekinut zbog neuspeha da se postigne klinička efikasnost u kliničkom ispitivanju od 4 nedelje/faza 2 za umerenu do tešku CD. Videti W.J. Sandborn, et al., A phase 2 study of tofacitinib, an oral Janus kinase inhibitor, in patients with Crohn’s disease, Clinical gastroenterology and hepatology: The official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12, 1485-93 e2 (2014). Na osnovu konsultovane javno dostupne literature, trenutno je nejasno da li je neuspeh tofacitiniba kod CD povezan sa dizajnom kliničke studije, mehaničkim razlikama između UC i CD ili sistemskim neželjenim dejstvima koji ograničavaju dozu. Videti Pharmacological Research 76, 1-8 (2013), cited above; Clinical gastroenterology and hepatology: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12, 1485-93 e2 (2014), citirano gore; i C.J. Menet, et al., Triazolopyridines as selective JAK1 inhibitors: from hit identification to GLPG0634, J. Med. Chem. 57, 9323-42 (2014). U svetlu karakteristika ovog JAK inhibitora, poželjno je pronaći dodatne JAK inhibitore za prevenciju i/ili kontrolu preteranog inflamatornog odgovora.

[0008] Sistemska neželjena dejstva su prijavljena u pogledu kliničkih ispitivanja faze 2 i faze 3 inflamatorne bolesti creva (IBD) sa tofacitinibom. Videti The New England Journal of Medicine 367, 616-24 (2012), citirano gore; Clinical gastroenterology and hepatology: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12, 1485-93 e2 (2014), citirano gore; i J. Panes, et al. Efficacy and safety of oral tofacitinib for induction therapy in patients with moderate-to-severe Crohn’s disease: results of a Phase 2b randomised placebo-controlled trial, J. Crohns Colitis 10, S18-S19 (2016). Ova neželjena dejstva uključuju smanjen apsolutni broj neutrofila (ANC), povišen ukupni holesterol (lipid niske i visoke gustine), perforaciju creva i infekciju. Takva neželjena dejstva su u skladu sa onima uočenim nakon tretmana tofacitinibom kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom (RA) (videti, na primer, J.M. Kremer, et al. The safety and efficacy of a JAK inhibitor in patients with active rheumatoid arthritis: Results of a double-blind, placebo-controlled phase IIa trial of three dosage levels of CP-690,550 versus placebo, Arthritis and Rheumatism 60, 1895-905 (2009)), od kojih su neki verovatno rezultat bilo JAK2 zavisne inhibicije EPO, TPO i faktora stimulacije kolonija (csf-2 i GM-CSF (faktor stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga)) i/ili JAK1 zavisne inhibicije IL-6. Videti, Arthritis and Rheumatism 60, 1895-905 (2009), cited above; and O.H. Nielsen, et al., Will novel oral formulations change the management of inflammatory bowel disease? Expert Opinion on Investigational Drugs 25, 709-18 (2016).

[0009] Prema Slici 1, oralno primenjen lek može u principu da prati gastrointestinalni trakt od usta do jednjaka (1), do želuca (2) preko duodenuma (3) do jejunuma (4), zatim u ileum (5), a zatim u debelo crevo (6). Relativna područja apsorpcije za takve različite delove su približno 60% za jejunum (4), približno 26% za ileum (5) i približno 13% za debelo crevo (6). Apsorpcija kroz ove različite gastrointestinalne regione može dovesti do početka sistemske distribucije što zauzvrat može dovesti do neželjenih efekata. Gastrointestinalni trakt ima veoma veliku površinu. Videti, na primer, H.F. Helander, et al., Surface area of the digestive tract - revisited, Scandinavian Journal of Gastroenterology 49(6), 681-89 (2014); and K.J. Filipski, et al., Intestinal Targeting of Drugs: Rational Design Approaches and Challenges Current Topics in Medicinal Chemistry 13, 776-802 (2013). Ovako velika površina apsorpcije favorizuje sistemsku distribuciju supstanci koje mogu da prođu kroz zidove različitih delova crevnog trakta i u krvotok, a zauzvrat imaju potencijal da dovedu do neželjenih efekata sistemski distribuirane supstance. Sistemska distribucija je predstavljena isprekidanim linijama strelica na Slici 1 koje prožimaju zidove debelog creva za pojednostavljene ilustrativne svrhe, ali takva distribucija nije ograničena na zidove debelog creva, jer se može odvijati i kroz zidove drugih delova gastrointestinalnog trakta prikazanih na Slici 1, kao što su oni iz tankog creva. Takođe se podrazumeva da isprekidane linije strelica na Slici 1 predstavljaju sistemsku distribuciju izvan gastrointestinalnog trakta pošto je poznato da se takva sistemska distribucija odvija u odnosu na fiziologiju gastrointestinalnog trakta, i da takve isprekidane strelice jednostavno upućuju na šematski ilustrativan način na takvu sistemsku distribuciju. Videti, na primer, Current Topics in Medicinal Chemistry 13, 777-80 (2013), citirano gore, za opis crevnog tkiva, transporta preko istog i metabolizma.

[0010] Jedan od glavnih razloga za smanjenje broja kandidata za lek je bezbednost i podnošljivost. Videti, na primer, I. Kola, et al., Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery 3, 711-5 (2004); M.J. Waring, et al., An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery 14,475-86 (2015); M. Hay, et al., Clinical development success rates for investigational drugs, Nature Biotechnology 32, 40-51 (2014); i M.E. Bunnage, Getting pharmaceutical R&D back on target, Nature Chemical Biology 7, 335-9 (2011). Povećanje koncentracije jedinjenja u lokalnom tkivu do ciljanog tkiva, uz ograničavanje izlaganja drugom tkivu, može smanjiti neželjene efekte. Videti, na primer, V.P. Torchilin, Drug targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences11 Suppl 2, S81-91 (2000). Ovaj koncept je široko prihvaćen za određene bolesti i tkiva, kao što su oko (videti, na primer, R. Gaudana, et al., Ocular drug delivery, The AAPS Journal 12, 348-60 (2010)), koža (videti, na primer, R. Folster-Holst, et al., Topical hydrocortisone 17-butyrate 21-propionate in the treatment of inflammatory skin diseases: pharmacological data, clinical efficacy, safety and calculation of the therapeutic index, Die Pharmazie 71, 115-21 (2016)), i pluća (videti, na primer, J.S. Patil, et al., Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review, Lung India: official organ of Indian Chest Society 29, 44-9 (2012)). Slično ovim pristupima ciljanju na tkiva, povećanje koncentracije leka u crevima uz istovremeno ograničavanje neželjenih nivoa leka u drugom tkivu može povećati bezbednosne margine. Videti, na primer, I.R. Wilding, et al., Targeting of drugs and vaccines to the gut, Pharmacology & Therapeutics 62, 97-124 (1994); D. Charmot, Non-systemic drugs: a critical review, Current Pharmaceutical Design 18, 1434-45 (2012); and Current Topics in Medicinal Chemistry 13, at 780 (2013), citirano gore. Tkivno selektivna modulacija ciljeva u gastrointestinalnom tkivu sa jedinjenjima koja postižu ograničenu sistemsku izloženost može potencijalno poboljšati terapeutski indeks takvih jedinjenja za lečenje bolesti gastrointestinalnog trakta uključujući ulcerozni kolitis i Kronovu bolest. Videti, na primer, O. Wolk, et al., New targeting strategies in drug therapy of inflammatory bowel disease: mechanistic approaches and opportunities, Expert Opin. Drug Deliv. 10(9), 1275-86 (2013). Termin "sistemski efekti" se ovde koristi da ukaže na sistemsko izlaganje i efekte svake takve sistemske izloženosti, iako nisu uvek isti.

[0011] Pošto neki poznati JAK inhibitori imaju neželjene efekte koji su povezani sa njihovim sistemskim efektima, poželjno je pronaći nove JAK inhibitore kao aktivne supstance za prevenciju i/ili kontrolu preteranog inflamatornog odgovora i čiji se sistemski efekti eliminišu ili smanjuju. Štaviše, poželjno je pronaći JAK inhibitore sa lokalnim efektima na gastrointestinalna tkiva za lečenje stanja kao što su, ali ne ograničavajući se na, IBD sa smanjenim sistemskim efektima. Zbog uloge koju igraju različiti JAK proteini, dalje je poželjno pronaći pan-JAK inhibitore.

[0012] Ciljanje crevnog tkiva se u principu može sprovoditi u skladu sa više strategija. Videti, na primer, Current Topics in Medicinal Chemistry 13, at 780-95 (2013), citirano gore, koji se odnosi na pristupe koji uključuju pristupe fizičko-hemijskih svojstava, pristupe posredovane transportom, pristupe prolekovima i pristupe formulaciji i tehnologiji. Međutim, priznaje se da „postoji niz izazova i zamki koje su endemske za programe ciljanja tkiva“, a posebno za jedinjenja ciljana na creva, kao što je opisano u Current Topics in Medicinal Chemistry 13, at 795 (2013), citirano gore.

[0013] Stanja IBD se mogu proširiti na više delova gastrointestinalnog trakta. Iako je u pojednostavljene ilustrativne svrhe prikazano samo mesto bolesti debelog creva (10) u silaznom debelom crevu na Slici 1, inflamatorna bolest creva može zahvatiti bilo koji deo gastrointestinalnog trakta kao što je slučaj sa Kronovom bolešću, ili u rektumu i debelom crevu, kao kod ulceroznog kolitisa. Videti, na primer, NIDDK (National Institute of Diabetes, and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, US Department of Health and Human Services, <http://spotidoc.com/doc/71780/crohns-disease---national-digestive-diseases-information>, accessed Nov. 29, 2016. Mesta bolesti IBD-a mogu biti, na primer, ilealna (locirana u ileumu), ileokolična (zahvata delove ileuma i debelog creva) i debelo crevo (nalazi se u debelom crevu , kao što je ilustrativno prikazano u silaznom debelom crevu na Slici 1). Dakle, u određenim scenarijima bolesti, isporuka leka duž celog ili velikog dela crevnog trakta može biti poželjna. U drugim scenarijima bolesti, možda bi bilo poželjno povećati lokalnu koncentraciju u bilo kom delu gastrointestinalnog trakta. Ipak, u drugim scenarijima, kombinacija ova dva oblika isporuke na različitim mestima u crevnom traktu može biti poželjna.

[0014] Jedan od takvih scenarija bi se fokusirao na isporuku aktivne supstance koja ima ograničene sistemske efekte zbog ograničene apsorpcije prilikom prolaska kroz gastrointestinalni trakt, kao što je prikazano strelicama pune linije na Slici 1, dok je dostupna da deluje u velikim delovima gastrointestinalnog (GI) trakta, karakteristika koja se ovde naziva "lokalni GI efekti". Zbog smanjenih sistemskih efekata, za takvu supstancu se može proceniti širi opseg doza. Dalje bi bilo poželjno da takva aktivna supstanca ima nisku propustljivost, tako da samo mala količina prođe kroz crevni zid u krvotok kako bi se ograničili neželjeni efekti kada dospeju u neciljana područja.

[0015] Pored toga, JAK inhibitori su predviđeni kao kandidati za lečenje drugih bolesti. Predviđeno je da se koriste u lečenju očnih stanja uključujući suvo oko (B. Colligris, et al., Recent developments on dry eye disease treatment compounds, Saudi J. Ophthalmol. 28(1), 19-30 (2014)), mijeloproliferativnu neoplazmu, mijeloproliferativne bolesti (E.J. Baxter, et al., Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders, Lancet 365, 1054-1061 (2005); C. James, et al., A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera, Nature 434, 1144-1148 (2005); R. Kralovics, et al., A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders, N. Engl. J. Med. 352, 1779-1790 (2005); R.L. Levine, et al., Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis, Cancer Cell 7, 387-397 (2005); G. Wernig, et al., Efficacy of TG101348, a selective JAK2 inhibitor, in treatment of a murine model of JAK2V617F-induced polycythemia vera, Cancer Cell 13, 311-320 (2008)), mijeloproliferativni sindrom, akutnu mijeloidnu leukemiju, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora, sistemskog početka juvenilnog reumatoidnog artritisa, juvenilnog idiopatskog artritisa (H.W. Li, et al., Effect of miR-19a and miR-21 on the JAK/STAT signaling pathway in the peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic juvenile idiopathic arthritis, Exp. Ther. Med. 11(6), 2531-2536 (2016)), reakcije preosetljivosti tipa III, preosetljivosti tipa IV, zapaljenja aorte, iridociklitisa/uveitisa/optičkog neuritisa, juvenilne spinalne mišićne atrofije, dijabetičke retinopatije, dijabetičke bolesti bubrega uključujući dijabetičku nefropatiju (F.C. Brosius, et al., JAK inhibition in the treatment of diabetic kidney disease, Diabetologia 59(8), 1624-7, (2016); C.C. Berthier, et al., Enhanced expression of Janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathway members in human diabetic nephropathy, Diabetes 58(2), 469-77, (2009); E.N. Gurzov, et al., The JAK/STAT pathway in obesity and diabetes, FEBS J. 283(16), 3002-15 (2016)), mikroangiopatije, zapaljenja (M. Kopf, et al., Averting inflammation by targeting the cytokine environment, Nature Reviews Drug Discovery 9, 703-718 (2010); J.J. O’Shea, et al., A new modality for immunosuppression: targeting the JAK/STAT pathway, Nature Rev. Drug Discov. 3, 555-564 (2004)), hronične upale, inflamatorne bolesti creva uključujući ulcerozni kolitis (UC) i Kronovu bolest (R.H. Duerr, et al., A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene, Science 314, 1461-1463 (2006); M. Coskun, et al., Involvement of JAK/STAT signaling in the pathogenesis of inflammatory bowel disease, Pharmacol. Res. 76, 1-8 (2013); M.J. Waldner, et al., Master regulator of intestinal disease: IL-6 in chronic inflammation and cancer development, Semin. Immunol. 26(1), 75-9 (2014); S. Danese, et al., JAK inhibition using tofacitinib for inflammatory bowel disease treatment: a hub for multiple inflammatory cytokines, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 310(3), G155-62 (2016); W. Strober, et al., Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases, Gastroenterology 140, 1756-1767 (2011)), alergijske bolesti, vitiligo, atopijski dermatitis (R. Bissonnette, et al., Topical tofacitinib for atopic dermatitis: a phase IIa randomized trial, Br. J. Dermatol. 175(5), 902-911 (2016); W. Amano, et al., JAK inhibitor JTE-052 regulates contact hypersensitivity by downmodulating T cell activation and differentiation, J. Dermatol. Sci. 84, 258-265 (2016); T. Fukuyama, et al., Topically Administered Janus-Kinase Inhibitors Tofacitinib and Oclacitinib Display Impressive Antipruritic and Anti-Inflammatory Responses in a Model of Allergic Dermatitis, J. Pharmacol. Exp. Ther.

354(3), 394-405 (2015)), alopecia areata (A.K. Alves de Medeiros, et al., JAK3 as an Emerging Target for Topical Treatment of Inflammatory Skin Diseases, PLoS One 11(10) (2016); L. Xing, et al., Alopecia areata is driven by cytotoxic T lymphocytes and is reversed by JAK inhibition, Nat. Med. 20(9), 1043-9 (2014)), dermatitis skleroderma, akutne ili hronične imunološke bolesti povezane sa transplantacijom organa (P.S. Changelian, et al. Prevention of organ allograft rejection by a specific Janus kinase 3 inhibitor, Science 302, 875-878 (2003); F. Behbod, et al. Concomitant inhibition of Janus kinase 3 and calcineurin-dependent signaling pathways synergistically prolongs the survival of rat heart allografts, J. Immunol, 166, 3724-3732 (2001); S. Busque, et al,. Calcineurin-inhibitor-free immunosuppression based on the JAK inhibitor CP-690,550: a pilot study in de novo kidney allograft recipients, Am. J. Transplant, 9, 1936-1945 (2009)), psoriatičnu artropatiju, ulcerozne kolitis artropatije, autoimune bulozne bolesti, autoimunu hemolitičku anemiju, reumatoidni artritis (J.M. Kremer, et al., A randomized, double-blind placebocontrolled trial of 3 dose levels of CP-690,550 versus placebo in the treatment of active rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum. 54 (annual meeting abstract), L40 (2006); W. Williams, et al,. A randomized placebo-controlled study of INCB018424, a selective Janus kinase1&2 (JAK1&2) inhibitor in rheumatoid arthritis (RA), Arthritis Rheum. 58, S431 (2008); N. Nishimoto, et al., Study of active controlled monotherapy used for rheumatoid arthritis, an IL-6 inhibitor (SAMURAI): evidence of clinical and radiographic benefit from an x ray reader-blinded randomised controlled trial of tocilizumab, Ann. Rheum. Dis. 66(9), 1162-7 (2007)), intersticijalne bolesti pluća povezane sa reumatoidnim artritisom, sistemski eritematozni lupus (A. Goropevsek, et al., The Role of STAT Signaling Pathways in the Pathogenesis of Systemic Lupus Erythematosus, Clin. Rev. Allergy Immunol. (online pre-publication) < http://www.docguide.com/role-stat-signaling-pathways-pathogenesis-systemic-lupus-erythema-tosus?tsid=5 > May 23, 2016; M. Kawasaki, et al., Possible role of the JAK/STAT pathways in the regulation of T cell-interferon related genes in systemic lupus erythematosus, Lupus. 20(12), 1231-9 (2011); Y. Furumoto, et al., Tofacitinib ameliorates murine lupus and its associated vascular dysfunction, Arthritis Rheumatol., (on-line pre-publication) < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27429362> Jul 18, 2016)), sistemske bolesti pluća povezane sa eritematoznim lupusom, bolesti pluća povezane sa dermatomiozitisom/polimiozitisom, astmu (K. Vale, Targeting the JAK/STAT pathway in the treatment of’Th2-high’ severe asthma, Future Med. Chem. 8(4), 405-19 (2016)), ankilozantnog spondilitisa (AS) (C. Thompson, et al., Anti cytokine therapy in chronic inflammatory arthritis, Cytokine 86, 92-9 (2016)), plućne bolesti povezane sa AS, autoimuni hepatitis, autoimuni hepatitis tipa 1 (klasični autoimuni ili lupoidni hepatitis), autoimunog hepatitisa tipa 2 (hepatitis protiv LKM antitela), autoimuno posredovane hipoglikemije, psorijazu psoriasis (C.L. Leonardi, et al., Efficacy and safety of ustekinumab, a human interleukin-12/23 monoclonal antibody, in patients with psoriasis: 76-week results from a randomised, double-blind, placebocontrolled trial (PHOENIX 1), Lancet 371, 1665-1674 (2008); G. Chan, et al., Dose-dependent reduction in psoriasis severity as evidence of immunosuppressive activity of an oral Jak3 inhibitor in humans, Am. J. Transplant. 6, S87 (2006); K.A. Papp, et al., Efficacy and safety of tofacitinib, an oral Janus kinase inhibitor, in the treatment of psoriasis: a phase 2b randomized placebo-controlled dose-ranging study, Br. J. Dermatol. 167, 668-677 (2012); M. Cargill, et al. A large-scale genetic association study confirms IL12B and leads to the identification of IL23R as psoriasis-risk genes, Am. J. Hum. Genet. 80, 273-290 (2007)), psorijazu tipa 1, psorijazu tipa 2, psorijazu plaka, umerene do teške hronične plak psorijaze, autoimune neutropenije, autoimunosti sperme, multiple skleroze (all subtypes, B.M. Segal, et al., Repeated subcutaneous injections of IL,12/23 p40 neutralising antibody, ustekinumab, in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase II, double-blind, placebo-controlled, randomised, doseranging study, Lancet Neurol. 7, 796-804 (2008); Z. Yan, et al., Role of the JAK/STAT signaling pathway in regulation of innate immunity in neuroinflammatory diseases, Clin. Immunol. (online pre-publication) <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27713030>, accessed Oct 3, 2016; E.N. Benveniste, et al., Involvement of the janus kinase/signal transducer and activator of transcription signaling pathway in multiple sclerosis and the animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Interferon Cytokine Res. 34(8), 577-88 (2014).; Y. Liu, et al., Therapeutic efficacy of suppressing the Jak/STAT pathway in multiple models of experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Immunol. 192(1), 59-72 (2014)), akutnu reumatsku groznicu, Sjogrenov sindrom, Sjogrenov sindrom / plućnih bolesti povezanih sa bolešću (T. Fujimura, et al., Significance of Interleukin-6/STAT Pathway for the Gene Expression of REG Iα, a New Autoantigen in Sjögren’s Syndrome Patients, in Salivary Duct Epithelial Cells, Clin. Rev. Allergy Immunol. (online pre-publication) <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27339601 > Jun 24, 2016), autoimmune thrombocytopaenia, neuroinflammation including Parkinson’s disease (Z. Yan, et al., Oct. 3, 2016, cited above). JAK inhibitors have been reported as having therapeutic applications in cancer treatment in addition to inflammatory diseases. (S.J. Thomas, et al., The role of JAK/STAT signaling in the pathogenesis, prognosis and treatment of solid tumors, British J. Cancer 113, 365-71 (2015); A. Kontzias, et al., Jakinibs: A new class of kinase inhibitors in cancer and autoimmune disease, Current Opinion in Pharmacology, 12(4), 464-70 (Aug. 2012); M. Pesu, et al., Therapeutic targeting of JANUS kinases, Immunological Reviews, 223, 132-42 (Jun. 2008); P. Norman, Selective JAK inhibitors in development for rheumatoid arthritis, Expert Opinion on Investigational Drugs, 23(8), 1067-77 (Aug. 2014)). Pored toga, JAK inhibitori mogu biti korisni u prevenciji kolorektalnog raka jer smanjenje upale u debelom crevu može dovesti do prevencije raka u tom organu.

[0016] WO 2011/086053 A1 opisuje jedinjenja koja „mogu biti obezbeđena u farmaceutski prihvatljivim kompozicijama i korišćena za lečenje imunoloških ili hiperproliferativnih poremećaja“.

[0017] WO 2013/007765 A1 opisuje jedinjenja koja „mogu biti obezbeđena u farmaceutski prihvatljivim kompozicijama i korišćena za lečenje imunoloških ili hiperproliferativnih poremećaja“.

[0018] Mark Zak i dr. opisuju „strukturno zasnovano otkriće C-2 hidroksietil dela koji je obezbedio dosledno visoke nivoe selektivnosti za JAK1 u odnosu na JAK2 za imidazopirolopiridin seriju JAK1 inhibitora“ u „Identifikacija C-2 hidroksietil imidazopirolopiridina kao moćnih inhibitora JAK1 sa povoljnim fizičko-hemijskim svojstvima i visokom selektivnošću u odnosu na JAK2“, Journal of Medicinal Chemistry, vol. 56, no. 11, 31st May 2013, pages 4764-4785.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0019] Ovaj pronalazak se odnosi na sledeća jedinjenja:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piidin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid;

2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)cikloheksil) acetonitril;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-( ciklopropilmetil)acetamid;

N-(2-cijanoetil)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamid

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamid;

N-(2-cijano-2-metilpropil)-2-(1-((1r,4r)-4(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b ] piridin-2-il)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklobutil)metil)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1-metil-1H-pirazol-4-il)acetamid;

N-(4-(cijanometil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklopropil)metil)acetamid; i

farmaceutski prihvatljive soli takvih jedinjenja i njihove kombinacije.

[0020] Izrazi "jedinjenja pronalaska" i "jedinjenje pronalaska" imaju za cilj da obuhvate najmanje jedno jedinjenje odabrano iz gornje grupe jedinjenja, bilo u obliku bez rastvarača ili u bilo kom od hidratisanih i/ili rastvorenih oblika kao što je ovde ilustrovano.

[0021] Izvođenja ovog pronalaska se odnose na jedinjenja i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže. Ovde su otkriveni postupci njihovog pravljenja i prečišćavanja, postupci njihovog korišćenja kao JAK inhibitora i postupci za njihovo korišćenje u lečenju bolesnih stanja, poremećaja i stanja posredovanih JAK-om.

[0022] Izvođenja ovog pronalaska pokazuju efekte pan-JAK inhibicije sa lokalnim GI efektima i niskim ili zanemarljivim sistemskim efektima. Štaviše, izvođenja ovog pronalaska sa takvim karakteristikama mogu se davati oralno.

[0023] Ovde je otkrivena metoda lečenja subjekta koji pati ili ima dijagnozu bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja posredovanog JAK-om korišćenjem jedinjenja pronalaska ili aktivnih agenasa pronalaska.

[0024] Dodatna izvođenja, karakteristike i prednosti pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i kroz praksu pronalaska.

KRATAK OPIS SLIKA

[0025]

Slika 1.

Šematski dijagram dela ljudskog gastrointestinalnog trakta, prikazan kao rastegnuti prikaz koji nije u razmeri. Duodenum (3), jejunum (4) i ileum (5) (svi šematski prikazani) čine tanko crevo posle želuca (2) i jednjaka (1). Debelo crevo se sastoji od debelog creva (6), uključujući cekum (7) i slepo crevo (nije prikazano), uzlazno debelo crevo, poprečno debelo crevo, silazno debelo crevo, sigmoidni kolon (petlja u istom nije prikazana) i rektum (11). Poprečni kolon je deo koji se sastoji između desne (8) i leve (9) fleksure debelog creva, uzlazno debelo crevo se proteže od cekuma (7) do desne fleksure debelog creva (8), a silazno debelo crevo se proteže od leve fleksure debelog creva (9) do rektuma (11). Različiti obrasci distribucije su ilustrovani u odnosu na debelo crevo radi pogodnosti, ali se mogu odnositi i na druge delove gastrointestinalnog trakta. Sistemska distribucija je predstavljena isprekidanim linijama strelica na Slici 1 kako prožima zidove debelog creva za pojednostavljene ilustrativne svrhe, ali takva distribucija nije ograničena na zidove debelog creva, jer se može odvijati i kroz zidove drugih delova gastrointestinalnog trakta prikazanih na Slici 1, kao što su zidovi tankog creva. Distribucija sa određenim prodiranjem u tkivo je predstavljena punim strelicama na Slici 1 kao penetracija u tkivo debelog creva u pojednostavljene ilustrativne svrhe, ali takva penetracija nije ograničena na tkivo debelog creva, jer se može desiti I u tkivu drugih delova gastrointestinalnog trakta prikazanog na Slici 1, kao što je tkivo tankog creva. Efekat izvođenja JAK inhibitora prema ovom pronalasku je ilustrativno prikazan kao ometanje JAK/STAT signalnog puta koji bi inače doveo do upale povezane sa inflamatornom bolešću creva („IBD“), kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis. Kao primer, ali ne kao ograničenje, mesto bolesti je ilustrativno prikazano kao mesto bolesti debelog creva (10) u silaznom debelom crevu. Slika 2.

Šematski dijagram koji prikazuje pripremu/interkonverziju izvođenja jedinjenja Pr. 1.

Slika 3.

Preklapanje uzoraka prelamanja rendgenskih zraka na prahu velike propusnosti (HT-XRPD) za sledeća izvođenja jedinjenja Pr. 1, odozdo nagore: Is, 2 (dobijeno ekvilibracijom na sobnoj temperaturi u 1,4-dioksanu), 3b (dobijeno termocikliranjem u cikloheksanonu), 1b+4 (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u metanolu/vodi ( 50/50, v/v), 5 (dobijeno termocikliranjem u hloroformu), 6 (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u acetonitrilu), 7 (dobijeno od 1s+7, ekvilibracijom rastvarača u heptanu), 7 (dobijeno desolvatacijom 1s+7, zauzvrat dobijeno ekvilibracijom rastvarača u heptanu), 8 (dobijeno desolvatacijom ostvarenja 5 pomoću ciklusne diferencijalne skenirajuće kalorimetrije)) i 9 (dobijeno desolvatacijom ostvarenja 2 pomoću ciklusnog kalorimetrijskog diferencijalnog skeniranja).

Slika 4.

Preklapanje uzoraka prelamanja rendgenskih zraka na prahu velike propusnosti (HT-XRPD) za sledeća izvođenja jedinjenja Pr. 1, odozdo nagore: Is (početni materijal), 1a (dobijeno nakon izlaganja uslovima ubrzanog starenja (AAC) (40°C i 70% relativne vlažnosti) nekoliko oblika uzoraka izvođenja Is), 1b (dobijeno ekvilibracijom rastvarača na sobnoj temperaturi u toluenu), 1c (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u etil acetat/1,4-dioksanu (50/50, v/v)), Id (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u acetonitrilu/hloroformu ( 50/50, v/v)), 1e (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u etil acetat/1,4-dioksanu (50/50, v/v)), If (dobijeno ekvilibracijom rastvarača na sobnoj temperaturi u p-ksilenu), 1 g (dobijeno ekvilibracijom rastvarača na 50° C u anizolu), 1h (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u p-ksilenu).

Slika 5.

Preklapanje uzoraka premalanja rendgenskih zraka na prahu velike propusnosti (HT-XRPD) za sledeća izvođenja jedinjenja Pr. 1, odozdo nagore: Is, 3b (dobijeno termocikliranjem u cikloheksanonu), 3c (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL skali u 1,4-dioksanu), 3d (dobijeno hlađenjem kristalizacije na µL situ u tetrahidrofuranu) i 3e (dobijeno termocikliranjem u izobutanolu).

Slika 6.

HR-XRPD difraktogrami izvođenja Is u svom početnom obliku nakon četvorodnevnog izlaganja na 40°C i 70% relativnoj vlažnosti („Is 70 RH“), i nakon četvorodnevnog izlaganja na 25° C i 100% relativne vlažnosti ("10").

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0026] Kako se ovde koristi, termini "uključujući", "koji sadrži" i "koji obuhvata” se koriste u njihovom otvorenom, neograničavajućem smislu.

[0027] Bilo koja formula data ovde treba da predstavlja jedinjenja koja imaju strukture prikazane strukturnom formulom, kao i određene varijacije ili forme. Određene strukture mogu postojati kao tautomeri. Dodatno, amorfni oblik, hidrati, solvati, polimorfi i pseudopolimorfi takvih jedinjenja ovog pronalaska, i njihove smeše, takođe su predviđeni kao delovi ovog pronalaska. Izvođenja ovog pronalaska su u obliku bez rastvarača ili u bilo kom od hidratisanih i/ili rastvorenih oblika kao što je ovde ilustrovano.

[0028] Pozivanje na jedinjenje ovde označava upućivanje na bilo koji od: (a) stvarno navedenog oblika takvog jedinjenja, i (b) bilo kojeg od oblika takvog jedinjenja u medijumu u kome se jedinjenje razmatra kada se imenuje. Na primer, referenca na jedinjenje kao što je R-COOH, obuhvata referencu na bilo koji od, na primer, R-COOH(s), R-COOH(sol)i R-COO-(sol). U ovom primeru, R-COOH(s)se odnosi na čvrsto jedinjenje, kao što može biti na primer u tableti ili nekoj drugoj čvrstoj farmaceutskoj kompoziciji ili preparatu; R-COOH(sol)se odnosi na nedisocirani oblik jedinjenja u rastvaraču; i R-COO-(sol)se odnosi na disocirani oblik jedinjenja u rastvaraču, kao što je disocirani oblik jedinjenja u vodenoj sredini, bilo da takav disocirani oblik potiče od R-COOH, iz njegove soli ili iz bilo kog drugog entiteta koji daje R-COO- nakon disocijacije u medijumu koji se razmatra. U drugom primeru, izraz kao što je "izlaganje entiteta jedinjenju formule R-COOH" odnosi se na izlaganje takvog entiteta obliku ili oblicima jedinjenja R-COOH koji postoji ili postoje u medijumu u kome se takvo izlaganje dešava. U još jednom primeru, izraz kao što je "reagovanje entiteta sa jedinjenjem formule R-COOH" odnosi se na reakciju (a) takvog entiteta u hemijski relevantnom obliku, ili oblicima, takvog entiteta koji postoji, ili postoje u medijumu u kome se takva reakcija odvija, sa (b) hemijski relevantnim oblikom ili oblicima jedinjenja R-COOH koje postoji, ili postoje u medijumu u kome se takva reakcija odvija. S tim u vezi, ako je takav entitet na primer u vodenoj sredini, podrazumeva se da je jedinjenje R-COOH u takvom istom medijumu, i stoga je entitet izložen vrstama kao što su R-COOH(aq)i/ili R-COO-(aq), pri čemu indeks "(aq)" označava "vodeni" prema njegovom konvencionalnom značenju u hemiji i biohemiji. Funkcionalna grupa karboksilne kiseline je izabrana u ovim primerima nomenklature; ovaj izbor, međutim, nije zamišljen kao ograničenje, već je samo ilustracija. Podrazumeva se da se analogni primeri mogu obezbediti u smislu drugih funkcionalnih grupa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hidroksil, osnovne azotne članove, kao što su oni u aminima, i bilo koju drugu grupu koja interaguje ili se transformiše na poznate načine u medijumu koji sadrži jedinjenje. Takve interakcije i transformacije uključuju, ali nisu ograničene na, disocijaciju, asocijaciju, tautomeriju, solvolizu, uključujući hidrolizu, solvataciju, uključujući hidrataciju, protonaciju i deprotonaciju. Ovde nisu dati dalji primeri u ovom pogledu jer su ove interakcije i transformacije u datom medijumu poznate svakom prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0029] Bilo koja formula data ovde je takođe namenjena da predstavlja neobeležene oblike kao i izotopski obeležene oblike jedinjenja. Izotopski obeležena jedinjenja imaju strukture koje su prikazane ovde datim formulama osim što je jedan ili više atoma zamenjeno atomom koji ima odabranu atomsku masu ili maseni broj u obogaćenom obliku. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja pronalaska u obliku koji premašuje prirodnu količinu uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota i kiseonika kao što su<2>H,<3>H,<11>C,<13>C,<14>C,<15>N,<18>O i<17>O, redom. Takva izotopski obeležena jedinjenja su korisna u metaboličkim studijama (poželjno sa<14>C), studijama kinetike reakcija (sa, na primer, deuterijumom (tj. D ili<2>H); ili tricijumom (tj. T ili<3>H)), tehnikama detekcije ili snimanja [kao što je npr. pozitronska emisiona tomografija (PET) ili jednofotonska emisiona kompjuterska tomografija (SPECT)] uključujući testove distribucije leka ili supstrata u tkivu, ili u radioaktivnom lečenju pacijenata. Posebno,<18>F ili<11>C obeleženo jedinjenje može biti posebno poželjno za PET ili SPECT studije. Dalje, supstitucija sa težim izotopima kao što je deuterijum (tj.,<2>H) može da pruži određene terapeutske prednosti koje su rezultat veće metaboličke stabilnosti, na primer povećanje lokalnog poluživota in vivo ili smanjene potrebe za dozom. Izotopski obeležena jedinjenja ovog pronalaska se generalno mogu pripremiti sprovođenjem postupaka otkrivenih u šemama ili u primerima i pripremama opisanim u nastavku zamenom lako dostupnih izotopski obeleženih reagensa za ne-izotopski obeleženi reagens.

[0030] "Tautomeri" se odnose na jedinjenja koja su zamenljivi oblici određene strukture jedinjenja i koja variraju u pomeranju atoma vodonika i elektrona. Dakle, dve strukture koje imaju H član na različitim pozicijama mogu biti u ravnoteži dok zadovoljavaju pravila valentnosti. Na primer, enoli i ketoni su tautomeri jer se brzo interkonvertuju tretmanom kiselinom ili bazom.

[0031] Kada se poziva na bilo koju formulu datu ovde, izbor određenog dela sa liste mogućih vrsta za određenu varijablu nije namenjen da definiše isti izbor vrste za promenljivu koja se pojavljuje negde drugde. Drugim rečima, kada se promenljiva pojavljuje više puta, izbor vrste sa određene liste je nezavisan od izbora vrste za istu promenljivu negde drugde u formuli, osim ako nije drugačije navedeno.

[0032] Kao prvi primer terminologije supstituenata, ako je primer supstituenta S<1>jedan od S1i S2, a primer supstituenta S<2>je jedan od S3i S4, onda se ovi zadaci odnose na izvođenja ovog pronalaska data prema izboru S<1>primer je S1i S<2>primer je S3; Primer S<1>je S1, a S<2>primer je S4; S<1>primer je S2i S<2>primer je S3; S<1>primer je S2i S<2>primer je S4; i ekvivalenti svakog od takvih izbora. Kraća terminologija "S<1>primer je jedan od S1i S2, a S<2>primer je jedan od S3i S4" se shodno tome koristi ovde radi sažetosti, ali ne kao način ograničenja. Prethodni prvi primer terminologije supstituenata, koji je naveden u generičkim terminima, ima za cilj da ilustruje različite dodele supstituenata opisanih ovde.

[0033] Dalje, kada je za bilo koji član ili supstituent dato više od jednog dodeljivanja, izvođenja ovog pronalaska obuhvataju različite grupe koje se mogu napraviti iz navedenih dodela, uzetih nezavisno, i njihovih ekvivalenata. Kao drugi primer terminologije supstituenata, ako je ovde opisano da je supstituent Sexamplejedan od S1, S2i S3, ovaj spisak se odnosi na izvođenja ovog pronalaska za koje je SexampleS1; Sexampleje S2; Sexampleje S3; Sexampleje jedan od S1i S2; Sexampleje jedan od S1i S3; Sekample je jedan od S2i S3; Sexampleje jedan od S1, S2i S3; i Sexampleje bilo koji ekvivalent svakom od ovih izbora. Kraća terminologija „ Sexampleje jedan od S1, S2i S3“ se shodno tome koristi ovde radi sažetosti, ali ne kao način ograničenja. Prethodni drugi primer terminologije supstituenata, koji je naveden u generičkim terminima, ima za cilj da ilustruje različite dodele supstituenata opisanih ovde.

[0034] Sledeći JAK inhibitori su ilustrativna izvođenja pronalaska:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanoetil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piidin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piidin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamid;

N-(2-cijano-2-metilpropil)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamid; i

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklopropil)metil)acetamid.

[0035] Dodatna izvođenja pronalaska su farmaceutski prihvatljive soli gore navedenih jedinjenja.

[0036] Dodatna izvođenja pronalaska su farmaceutske kompozicije od kojih svaka sadrži efikasnu količinu najmanje jednog od gore navedenih jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0037] "Farmaceutski prihvatljiva so" je so jedinjenja koje nije toksično, biološki podnošljivo ili na drugi način biološki pogodno za primenjivanje na subjektu. Videti, generalno, S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66, 1-19 (1977), and Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use, Stahl and Wermuth, Eds., Wiley-VCH and VHCA, Zurich, 2002. Jedinjenja pronalaska mogu posedovati dovoljno kiselu grupu, dovoljno baznu grupu ili obe vrste funkcionalnih grupa, i shodno tome reagovati sa određenim brojem neorganskih ili organskih baza, i neorganskih i organskih kiselina, da bi se formirala farmaceutski prihvatljiva so. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli obuhvataju sulfate, pirosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, fosfate, monohidrogenfosfate, dihidrogenfosfate, metafosfate, pirofosfate, hloride, bromide, jodide, acetate, propionate, dekanoate, kapilate, akrilate, formate, izobutirate, kaproate, heptanoate, propiolate, oksalate, malonate, sukcinate, suberate, sebakate, fumarate, maleate, butin-1,4-dioate, heksin-1,6-dioati benzoate, hlorobenzoate, metilbenzoate, dinitrobenzoate, hidroksibenzoate, metoksibenzoate, ftalate, sulfonate, ksilensulfonate, fenilacetate, fenilpropionate, fenilbutirate, citrate, laktate, γ-hidroksibutirate, glikolate, tartrate, metan-sulfonate, propansulfonate, naftalen-1-sulfonate, naftalen-2-sulfonate i mandelate.

[0038] Ako jedinjenje pronalaska sadrži najmanje jedan bazni azot, željena farmaceutski prihvatljiva so se može pripremiti bilo kojim pogodnim metodom dostupnim u struci, na primer, tretmanom slobodne baze sa neorganskom kiselinom, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, sulfaminska kiselina, azotna kiselina, borna kiselina i fosforna kiselina, ili sa organskom kiselinom, kao što su sirćetna kiselina, fenilsirćetna kiselina, propionska kiselina, stearinska kiselina, mlečna kiselina, askorbinska kiselina, maleinska kiselina, hidroksimaleinska kiselina, izetionska kiselina, jantarna kiselina, valerinska kiselina, fumarna kiselina, malonska kiselina, pirogrožđana kiselina, oksalna kiselina, glikolna kiselina, salicilna kiselina, oleinska kiselina, palmitinska kiselina, laurinska kiselina, piranozidil kiselina, kao što je glukuronska kiselina ili galakturonska kiselina, alfa-hidroksi kiselina, kao što je mandelna kiselina, limunska kiselina ili vinska kiselina, amino kiselina, kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina, aromatična kiselina, kao što je benzojeva kiselina, 2-acetoksibenzojeva kiselina, naftojeva kiselina ili cimetova kiselina, sulfon ledena kiselina, kao što je laurilsulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, bilo koja kompatibilna smeša kiselina kao što su one koje su ovde date kao primeri, i bilo koja druga kiselina i njihova smeša koje se smatraju ekvivalentima ili prihvatljivim zamenama u svetlu uobičajenog nivoa veštine u ovoj tehnologiji.

[0039] Ne mogu sva izvođenja farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja prema ovom pronalasku biti podjednako pogodna za njihov razvoj, jer jedinjenja koja su dovoljno slabo bazna (npr. pKa od oko 4) možda ne formiraju dovoljno stabilne soli za razvojne svrhe. Videti, npr., G.A. Stephenson, et al., J. Pharm. Sciences100(5), 1607-17 (2 011) "Physical stability of salts of weak bases in the solid state". Predviđeno je da neka izvođnja ovog pronalaska obuhvataju ko-kristalizovane oblike jedinjenja prema ovom pronalasku sa odgovarajućim ko-kristalnim oblikom. Dizajn i svojstva ko-kristala za farmaceutsku upotrebu i načini njihove izrade i karakterizacije date su u, na primer, N. Shan, et al., Drug Discovery Today, 13(9/10), 440-46 (2008) "The role of cocrystals in pharmaceutical science"; N. Qiao, et al., Intl. J. Pharmaceutics, 419, 1-11 (2011) "Pharmaceutical cocrystals: An overview"; R. Thakuria, et al., Intl. J. Pharmaceutics, 453, 101-25 (2013) "Pharmaceutical cocrystals and poorly soluble drugs".

[0040] Jedinjenja pronalaska, uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli, bilo sama ili u kombinaciji, (zajedno, "aktivno sredstvo" ili "aktivna sredstva") su korisna kao JAK inhibitori u postupcima pronalaska. Takve metode za modulaciju aktivnosti JAK obuhvataju izlaganje JAK efektivnoj količini najmanje jednog hemijskog jedinjenja pronalaska.

[0041] Inhibitor JAK može da se koristi kod subjekta sa dijagnozom ili bolovanjem od bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja posredovanog JAK aktivnošću, kao što su oni opisani ovde. Simptomi ili bolesna stanja treba da budu uključeni u okvire „bolesti, poremećaja ili zdravstvenih stanja“.

[0042] Shodno tome, aktivni agensi koji su ovde opisani mogu se koristiti za lečenje subjekata sa dijagnozom ili onih koji pate od bolesti, poremećaja ili zdravstvenog stanja posredovanih preko JAK-a. Termin "tretman" ili "lečenje", kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na davanje aktivnog agensa ili kompozicije pronalaska subjektu u cilju uticaja na terapeutsku ili profilaktičku korist kroz modulaciju JAK-a. Lečenje uključuje preokretanje, poboljšanje, ublažavanje, inhibiciju napretka, smanjenje ozbiljnosti, smanjenje ili prevenciju bolesti, poremećaja ili stanja, ili jednog ili više simptoma takve bolesti, poremećaja ili stanja posredovanih modulacijom JAK aktivnosti. Izraz "subjekat" se odnosi na pacijenta sisara kome je potreban takav tretman, kao što je čovek. Izraz "inhibitori" ili "inhibitor" se odnosi na jedinjenja koja smanjuju, sprečavaju, inaktiviraju, desenzibiliziraju ili smanjuju ekspresiju ili aktivnost JAK-a.

[0043] Izvođenja ovog pronalaska obezbeđuju JAK inhibitore za prevenciju i/ili kontrolu preteranog inflamatornog odgovora. Izvođenja JAK inhibitora prema ovom pronalasku su pan-JAK inhibitori.

[0044] Osim ako nije drugačije naznačeno, izraz "fizičko-hemijska svojstva inhibitora JAK" odnosi se na odgovarajuća imenovana svojstva kako sledi:

kao što je dato u opisu za jedinjenja Pr. 1-12, u slučaju molarne mase;

kako je određeno prema odgovarajućim definicijama, u slučaju broja donatora H veza, akceptora i rotirajućih veza; i

kao što je mereno u odnosu na Tabelu 1a, kolona 2, u slučaju koncentracija u plazmi, i Tabelu 7, kolone 3 i 4, u slučaju A-B koeficijenata permeabilnosti u prisustvu P-gp inhibitora i B-A koeficijenata permeabilnosti.

[0045] Ovde su otkrivene metode inhibicije JAK, koje obuhvataju izlaganje JAK receptora JAK inhibitoru koji se odlikuje sledećim fizičko-hemijskim svojstvima inhibitora JAK: koncentracija u plazmi u opsegu od oko 0,1 ng/mL do oko 60 ng/mL, cLog P u opsegu od oko 0,1 do oko 2,8, A-B koeficijenti permeabilnosti u prisustvu P-gp inhibitora u opsegu od oko 0,1 do oko 2,5, B-A koeficijenti propustljivosti u opsegu od oko 0,5 do oko 20, tPSA u rasponu od oko 85 do oko 120.

[0046] U metodama inhibicije JAK, koncentracija u plazmi je u opsegu od oko 10 ng/mL do oko 20 ng/mL.

[0047] U metodama inhibicije JAK, cLogP je u opsegu od oko 0,8 do oko 1,4.

[0048] U metodama inhibicije JAK, A-B koeficijent permeabilnosti u prisustvu P-gp inhibitora je u opsegu od oko 0,6 do oko 1,5.

[0049] U metodama inhibicije JAK, B-A koeficijent permeabilnosti je u opsegu od oko 0,5 do oko 5.

[0050] U metodama inhibicije JAK, tPSA je u opsegu od oko 100 do oko 120.

[0051] Ovde su otkrivene metode inhibicije JAK, koje obuhvataju izlaganje JAK receptora JAK inhibitoru koji se dalje karakteriše sledećim fizičko-hemijskim svojstvima inhibitora JAK: Molarna masa u opsegu od oko 300 g mol<-1>do oko 500 g mol<-1>, broj donatora vodonične veze u opsegu od oko 2 do oko 3, broj akceptora vodonične veze u opsegu od oko 4 do oko 5, i broj rotirajućih veza u opsegu od oko 3 do oko 6, pored koncentracija u plazmi, i vrednosti tPSA opisane gore za metodologije inhibicije JAK prema ovom pronalasku.

[0052] U metodama inhibicije JAK, molarna masa je u opsegu od oko 340 g mol<-1>do oko 430 g mol<-1>.

[0053] U metodama inhibicije JAK, broj rotirajućih veza je u opsegu od oko 5 do oko 6.

[0054] Izvođenja ovog pronalaska se mogu koristiti u metodama za lečenje upale u gastrointestinalnom traktu subjekta, koji obuhvataju davanje subjektu farmaceutski efikasne količine JAK inhibitora koji se odlikuje sledećim fizičko-hemijskim svojstvima inhibitora JAK: Koncentracija u plazmi u opsegu od oko 0,1 ng/mL do oko 60 ng/mL, cLog P u opsegu od oko 0,1 do oko 2,8, A-B koeficijenti permeabilnosti u prisustvu P-gp inhibitora u opsegu od oko 0,1 do oko 2,5, B-A koeficijenti propustljivosti u opsegu od oko 0,5 do oko 20, tPSA u opsegu od oko 85 do oko 120.

[0055] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, koncentracija u plazmi je u opsegu od oko 10 ng/mL do oko 20 ng/mL.

[0056] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, cLogP je u opsegu od oko 0,8 do oko 1,4.

[0057] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, koeficijent propustljivosti A-B je u prisustvu P-gp inhibitora u opsegu od oko 0,6 do oko 1,5.

[0058] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, B-A koeficijent propustljivosti je u opsegu od oko 0,5 do oko 5.

[0059] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, tPSA je u opsegu od oko 100 do oko 120.

[0060] Ovde su otkrivene metode za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu subjekta pri čemu se fizičkohemijska svojstva inhibitora JAK dalje karakterišu posedovanjem sledećih fizičko-hemijskih svojstava inhibitora JAK: molarna masa u opsegu od oko 300 g mol<-1>do oko 500 g mol<-1>, broj donatora vodonične veze u opsegu od oko 2 do oko 3, broj akceptora vodonične veze u opsegu od oko 4 do oko 5, i broj rotirajućih veza u opsegu od oko 3 do oko 6, pored koncentracija u plazmi, vrednosti cLogP, koeficijenata permeabilnosti i vrednosti tPSA opisanih gore za metodologije lečenja zapaljenja prema ovom pronalasku.

[0061] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, molarna masa je u opsegu od oko 350 g mol<-1>do oko 430 g mol<-1>.

[0062] U metodama za lečenje zapaljenja u gastrointestinalnom traktu, broj rotirajućih veza je u opsegu od oko 5 do oko 6.

[0063] Ovde su otkriveni JAK inhibitori koji imaju sledeća JAK fizičko-hemijska svojstva: koncentracija u plazmi u opsegu od oko 0,1 ng/mL do oko 60 ng/mL, cLogP u opsegu od 0,1 do oko 2,8, A-B permeabilnost koeficijent u prisustvu inhibitora P-gp u opsegu od oko 0,1 do oko 2,5, koeficijent permeabilnosti B-A u opsegu od oko 0,5 do oko 20, i tPSA u opsegu od oko 85 do oko 120.

[0064] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori čija je koncentracija u plazmi u opsegu od oko 10 ng/mL do oko 20 ng/mL.

[0065] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori koji imaju cLogP vrednosti u opsegu od oko 0,8 do oko 1,4.

[0066] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori koji imaju A-B koeficijent permeabilnosti u prisustvu P-gp inhibitora u opsegu od oko 0,6 do oko 1,5.

[0067] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori koji imaju B-A koeficijent permeabilnosti u opsegu od oko 0,5 do oko 5.

[0068] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori koji imaju vrednosti tPSA u opsegu od oko 100 do oko 120.

[0069] Ovde su otkriveni JAK inhibitori koji imaju sledeća fizičko-hemijska svojstva inhibitora JAK: molarna masa u opsegu od oko 300 g mol<-1>do oko 500 g mol<-1>, broj donatora vodonične veze u opsegu od oko 2 do oko 3, broj akceptora vodonične veze u opsegu od oko 4 do oko 5, i broj rotirajućih veza u opsegu od oko 3 do oko 6 pored koncentracija u plazmi, vrednosti cLogP, koeficijenata permeabilnosti i tPSA gore opisane vrednosti za JAK inhibitore prema ovom pronalasku.

[0070] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori čija je molarna masa u opsegu od oko 350 g mol<-1>do oko 430 g mol<-1.>

[0071] Ovde su dalje otkriveni JAK inhibitori koji imaju broj rotirajućih veza u opsegu od oko 5 do oko 6.

[0072] U metodama lečenja, efikasna količina najmanje jednog aktivnog agensa prema pronalasku može biti primenjena na subjektu koji pati ili ima dijagnozu takve bolesti, poremećaja ili zdravstvenog stanja. "Efektivna količina" označava količinu ili dozu dovoljnu da generalno dovede do željene terapeutske ili profilaktičke koristi kod pacijenata kojima je potreban takav tretman za naznačenu bolest, poremećaj ili zdravstveno stanje. Efikasne količine ili doze aktivnih agenasa ovog pronalaska mogu se utvrditi rutinskim metodama kao što su modelovanje, studije povećanja doze ili klinička ispitivanja, i uzimanjem u obzir rutinskih faktora, npr. farmakokinetika agensa, ozbiljnost i tok bolesti, poremećaja ili stanja, prethodna ili tekuća terapija subjekta, zdravstveno stanje subjekta i odgovor na lekove, i procena lekara koji leči. Za čoveka od 70 kg, ilustrativni opseg za odgovarajuću količinu doze je od oko 1 do 1000 mg/dan u pojedinačnim ili višestrukim doznim jedinicama.

[0073] Izvođenja ovog pronalaska su novi JAK inhibitori kao aktivne supstance za prevenciju i/ili kontrolu preteranog inflamatornog odgovora i čiji su sistemski efekti eliminisani ili smanjeni. Dalja izvođenja ovog pronalaska su JAK inhibitori sa lokalnim efektima na gastrointestinalna tkiva za lečenje stanja kao što je, ali bez ograničenja, IBD, bez izazivanja sistemskih efekata ili sa takvim prihvatljivo smanjenim sistemskim efektima.

[0074] Izvođenja ovog pronalaska su JAK inhibitori niske permeabilnosti. Dalja izvođenja ovog pronalaska su JAK inhibitori koji imaju rastvorljivost u vodi.

[0075] Kada dođe do poboljšanja pacijentove bolesti, poremećaja ili stanja, doza se može prilagoditi za preventivni tretman ili tretman održavanja. Na primer, doza ili učestalost primene, ili oboje, mogu se smanjiti u zavisnosti od simptoma, do nivoa na kome se održava željeni terapeutski ili profilaktički efekat. Naravno, ako su simptomi ublaženi na odgovarajući nivo, lečenje može prestati. Pacijenti mogu, međutim, zahtevati povremeni tretman na dugotrajnoj osnovi nakon bilo kakvog ponovnog pojavljivanja simptoma.

[0076] Pored toga, jedinjenja pronalaska su predviđena za upotrebu sama, u kombinaciji sa jednim ili više drugih jedinjenja ovog pronalaska, ili u kombinaciji sa dodatnim aktivnim sastojcima u lečenju stanja o kojima se govori u nastavku. Dodatni aktivni sastojci se mogu davati odvojeno sa najmanje jednim jedinjenjem pronalaska, sa aktivnim agensima pronalaska ili uključeni sa takvim agensom u farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku. U ilustrativnoj varijanti, dodatni aktivni sastojci su oni za koje se zna ili je otkriveno da su efikasni u lečenju stanja, poremećaja ili bolesti posredovanih JAK aktivnošću, kao što je drugi inhibitor JAK ili jedinjenje aktivno protiv drugog cilja povezanog sa određenim stanjem, poremećajem ili bolesti. Kombinacija može poslužiti za povećanje efikasnosti (npr. uključivanjem u kombinaciju jedinjenja koje potencira potenciju ili efektivnost agensa prema pronalasku), smanjenje jednog ili više neželjenih efekata ili smanjenje potrebne doze aktivnog agensa prema pronalasku.

[0077] Kada se govori o inhibiciji cilja, "efikasna količina" označava količinu dovoljnu da utiče na aktivnost najmanje jednog proteina JAK porodice. Merenje aktivnosti cilja može se vršiti rutinskim analitičkim metodama.

[0078] Aktivni agensi pronalaska su predviđeni za upotrebu, sami ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka, za formulisanje farmaceutskih kompozicija pronalaska. Farmaceutska kompozicija pronalaska sadrži efikasnu količinu najmanje jednog aktivnog sredstva u skladu sa pronalaskom.

[0079] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti koji se obično koriste u farmaceutskim kompozicijama su supstance koje su netoksične, biološki podnošljive i inače biološki pogodne za davanje subjektu, kao što je inertna supstanca, dodata farmakološkoj kompoziciji ili na drugi način korišćena kao sredstvo, nosač, ili razblaživač da bi se olakšalo davanje agensa i to kompatibilnog sa njim. Primeri takvih ekscipijenata uključuju kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, razne šećere i vrste skroba, derivate celuloze, želatin, biljna ulja i polietilen glikole.

[0080] Oblici za isporuku farmaceutskih kompozicija koji sadrže jednu ili više doznih jedinica aktivnih agenasa mogu se pripremiti korišćenjem farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata i poznatih tehnika mešanja ili onih koje postaju dostupne onima koji imaju uobičajene veštine u ovoj oblasti. Kompozicije se mogu primeniti prema inventivnim metodama odgovarajućim putem, npr. oralnim, parenteralnim, rektalnim, lokalnim ili okularnim putem, ili inhalacijom.

[0081] Preparat može biti u obliku tableta, kapsula, kesica, dražeja, praha, granula, pastila, praha za rekonstituciju, tečnih preparata ili supozitorija. Kompozicije mogu biti formulisane za bilo koji od mnoštva puteva primene, kao što su intravenozna infuzija, subkutana injekcija, lokalna primena ili oralna primena. Poželjno, kompozicije mogu biti formulisane za oralnu primenu.

[0082] Za oralnu primenu, aktivni agensi pronalaska mogu biti obezbeđeni u obliku tableta, kapsula ili perli, ili kao rastvor, emulzija ili suspenzija. Za pripremu oralnih kompozicija, aktivni agensi mogu biti formulisani tako da daju dozu od, na primer, za čoveka od 70 kg, od oko 1 do 1000 mg/dan u pojedinačnim ili višestrukim doznim jedinicama kao ilustrativni opseg.

[0083] Oralne tablete mogu da sadrže aktivni sastojak/ sastojke pomešane sa kompatibilnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima kao što su razblaživači, agensi za dezintegraciju, vezivni agensi, agensi za podmazivanje, zaslađivači, agensi za ukus, agensi za bojenje i konzervansi. Pogodni inertni punioci uključuju natrijum i kalcijum karbonat, natrijum i kalcijum fosfat, laktozu, skrob, šećer, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri tečnih oralnih ekscipijenata uključuju etanol, glicerol, vodu i slično. Skrob, polivinil-pirolidon (PVP), natrijum skrob glikolat, mikrokristalna celuloza i alginska kiselina su primeri dezintegracionih agenasa. Vezivni agensi mogu uključivati skrob i želatin. Sredstvo za podmazivanje, ako postoji, može biti magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Po želji, tablete mogu biti obložene materijalom kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat da bi se odložila apsorpcija u gastrointestinalnom traktu, ili mogu biti obložene enteričkom prevlakom. Dodatni premaz koji se može koristiti uključuje obloge koje su dizajnirane da oslobađaju jedinjenje ili aktivni agens u zavisnosti od vremena, pH ili sadržaja bakterija.

[0084] Kapsule za oralnu primenu uključuju tvrde i meke želatinske ili (hidroksipropil) metil celulozne kapsule. Za pripremu tvrdih želatinskih kapsula, aktivni sastojak/sastojci se mogu pomešati sa čvrstim, polučvrstim ili tečnim razblaživačem. Meke želatinske kapsule se mogu pripremiti mešanjem aktivnog sastojka sa uljem kao što je ulje od kikirikija ili maslinovo ulje, tečni parafin, mešavina mono i diglicerida kratkolančanih masnih kiselina, polietilen glikol 400 ili propilen glikol. Tečnosti za oralnu primenu mogu biti u obliku suspenzija, rastvora, emulzija ili sirupa ili mogu biti liofilizovane ili predstavljene kao suvi proizvod za rekonstituciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takve tečne kompozicije mogu opciono da sadrže: farmaceutski prihvatljive ekscipijente kao što su agensi za suspendovanje (na primer, sorbitol, metil celuloza, natrijum alginat, želatin, hidroksietilceluloza, karboksimetilceluloza, aluminijum stearat gel i slično); nevodeni nosači, npr. ulje (na primer, bademovo ulje ili frakcionisano kokosovo ulje), propilen glikol, etil alkohol ili voda; konzervansi (na primer, metil ili propil phidroksibenzoat ili sorbinska kiselina); sredstva za vlaženje kao što je lecitin; i, po želji, arome ili boje.

[0085] Aktivni agensi ovog pronalaska se takođe mogu davati neoralnim putevima. Na primer, kompozicije se mogu formulisati za rektalnu primenu kao supozitorije, klistir ili pena. Za parenteralnu upotrebu, uključujući intravenske, intramuskularne, intraperitonealne ili subkutane puteve, agensi pronalaska mogu biti obezbeđeni u sterilnim vodenim rastvorima ili suspenzijama, puferovanim do odgovarajućeg pH i izotoničnosti ili u parenteralno prihvatljivom ulju. Pogodni vodeni nosači uključuju Ringerov rastvor i izotonični natrijum hlorid. Takvi oblici mogu biti predstavljeni u obliku jedinične doze kao što su ampule ili uređaji za injekcije za jednokratnu upotrebu, u oblicima sa više doza kao što su bočice iz kojih se može povući odgovarajuća doza, ili u čvrstom obliku ili pretkoncentratu koji se može koristiti za pripremu formulacija za injekcije. Ilustrativne doze infuzije se kreću od oko 1 do 1000 µg/kg/minutu agensa pomešanog sa farmaceutskim nosačem tokom perioda u rasponu od nekoliko minuta do nekoliko dana.

[0086] Za lokalnu primenu, agensi se mogu mešati sa farmaceutskim nosačem u koncentraciji od oko 0,01% do oko 20% leka u nosaču, poželjno 0,1% do 10%. Drugi način primene agenasa pronalaska može da koristi formulaciju flastera da bi se izvršilo transdermalno oslobađanje.

[0087] Aktivni agensi se mogu alternativno davati u postupcima ovog pronalaska inhalacijom, nazalnim ili oralnim putem, npr. u sprej formulaciji koja takođe sadrži odgovarajući nosač.

[0088] Izvođenja pronalaska mogu se koristiti u postupku lečenja subjekta koji pati ili ima dijagnozu bolesti, poremećaja ili medicinskog stanja posredovanog JAK-om, koji obuhvata davanje subjektu kome je potreban takav tretman efikasne količine aktivnog sredstva.

[0089] U određenim metodama, bolest, poremećaj ili zdravstveno stanje je inflamatorna bolest creva, kao što je Kronova bolest i ulcerozni kolitis.

[0090] Izvođenja ovog pronalaska mogu da se koriste u postupku za modulaciju aktivnosti JAK-a, uključujući i kada je takva kinaza u subjektu, koji obuhvata izlaganje JAK efektivnoj količini najmanje jednog jedinjenja odabranog među jedinjenjima pronalaska.

[0091] Jedinjenja pronalaska su korisna kao JAK inhibitori koji se mogu dozirati oralno i specifično distribuirati u crevno tkivo uz održavanje niske sistemske izloženosti. Ovo je u suprotnosti sa većinom poznatih JAK inhibitora koji se doziraju oralno i distribuiraju u mnoga tkiva zbog činjenice da imaju veliku sistemsku izloženost.

[0092] Tabela 1a i Tabela 1b pokazuju rezultate in vivo eksperimenata. Ovi rezultati obuhvataju koncentracije u plazmi i tkivu debelog creva za petnaest jedinjenja koja su davana miševima kako je opisano u Protokolima 1, 2 ili 3. Rezultati koncentracije u plazmi i debelom crevu su dobijeni praćenjem Protokola 1 korišćenjem venepunkcije krvarenja dorzalne metatarzalne vene za jedinjenja (B), (C) i Primere 6 i 11. Rezultati koncentracije u plazmi i debelom crevu su dobijeni praćenjem Protokola 2 korišćenjem retroorbitalnog krvarenja za jedinjenja (A), i Primera 1, i 3 do 5 i Protokola 2 korišćenjem venepunkcije dorzalne metatarzalne kosti vena za Primere 2, 7 do 10 i 12. Rezultati Protokola 1 i 2 su prikazani u Tabeli 1a. Rezultati koncentracije u plazmi i debelom crevu su dobijeni praćenjem Protokola 3 za Primere 1 do 3 i 4. Rezultati Protokola 3 su prikazani u Tabeli 1b. Ovi protokoli su opisani ispod pod naslovom In vivo studije.

Tabela 1a. Rezultati In vivo eksperimenata nakon p.o. doziranja – Srednja koncentracija ispitivanih jedinjenja

Tabela 1b. Rezultati In vivo eksperimenata nakon i.c. doziranja – Srednja koncentracija ispitivanih jedinjenja

[0093] Jedinjenja (A) - (C) su sledeća referentna jedinjenja koja su otkrivena u WO2013/007765 ili WO2011/086053 za njihovu upotrebu kao inhibitora Janus kinaza:

[0094] Jedinjenja Pr. 1-12 u tabelama 1a i 1b su izvođenja ovog pronalaska data u odgovarajućim Primerima.

[0095] Kao što je prikazano u Tabeli 1a, koncentracije u debelom crevu za jedinjenja Pr. 1-12 mnogo su veće od odgovarajućih koncentracija u plazmi, sa odnosom koncentracija [debelo crevo (4 h)] : [plazma (0,5 h)] u rasponu od oko 52 do oko 3.000. Nasuprot tome, takvi odnosi za jedinjenja (A) - (C) su se kretali od oko 3 do oko 17. Tabela 1b takođe pruža potkrepljujuće podatke da Primeri 1, 3 i 4 imaju nisku sistemsku izloženost nakon i.c. doziranja. Kontrast između svojstava ostvarenja ovog pronalaska u odnosu na referentna jedinjenja je mnogo naglašeniji kada se poređenje odnosi na vrednosti koncentracije u plazmi od 4 h. U tom pogledu, odnosi koncentracije [debelo crevo (4 h)] : [plazma (4 h)] za jedinjenja Pr. 1-12 se kreću od oko 888 do oko 6886. Nasuprot tome, takvi odnosi za jedinjenja (A) - (C) kreću se od oko 11 do oko 538. Ovi odnosi koncentracija u debelom crevu i plazmi ukazuju da jedinjenja Pr. 1-12 imaju niske sistemske efekte u bilo kom trenutku nakon oralne doze, dok jedinjenja (A) - (C) imaju relativno visoke sistemske efekte. Ovo je neočekivani nalaz lokalnih GI efekata za jedinjenja Pr. 1-12.

[0096] Kao što je prikazano u Tabeli 4, enzimska aktivnost jedinjenja Pr. 1-12 je izmerena da bi se odredila aktivnost za svaki pojedinačni enzim. Za sva testirana jedinjenja izmerena je inhibicija enzimske aktivnosti, pokazujući da su ova jedinjenja pan-JAK inhibitori. Podaci dati u ovoj tabeli za jedinjenja (A) - (C) takođe pokazuju inhibiciju enzimske aktivnosti, ovim jedinjenjima, za sve JAK proteine.

[0097] Kao što je prikazano u Tabeli 5, ćelijske aktivnosti jedinjenja Pr. 1-12 su procenjene u mononuklearnoj ćeliji periferne krvi (PBMC) korišćenjem stimulusa IL-2, IFN-α i GM-CSF i merenjem inhibicije fosforilacije STAT5, STAT4 i STAT5, redom. Za sva testirana jedinjenja merena je inhibicija STAT fosforilacije sa sva tri stimulusa.

[0098] Kao što je prikazano u Tabeli 6, rastvorljivosti jedinjenja Pr. 1-12 izmerene su u simuliranoj gastričnoj tečnosti ("SGF") i simuliranoj crevnoj tečnosti ("SIF"). Sva testirana jedinjenja su pokazala merljivu rastvorljivost iznad 400 µM u SGF-u i u opsegu od 81 µM do iznad 400 µM sa SIF. Kao što je prikazano u istoj tabeli, ovi podaci o rastvorljivosti su bili uporedivi sa rastvorljivostima jedinjenja (A) - (C).

[0099] Kao što je prikazano u Tabeli 7, permeabilnost jedinjenja (A) - (C) i Pr. 1-12 merena je korišćenjem MDCK-MDR1 ćelijske linije sa i bez elakridara, inhibitora P-gp. Sva jedinjenja su pokazala nisku permeabilnost za merenja apikalnog-bazolateralnog transporta, sa i bez inhibitora P-gp (elakridar). Vrednosti koeficijenta propustljivosti za jedinjenja (A) - (C) i Pr. 1-12 bile su niske i uporedive za apikalni-bazolateralni transport bez elakridara (za sva takva jedinjenja) i sa elakridarom (za jedinjenja (B) - (C) i jedinjenja 1-12) (kolone 2 i 3 u takvim tabelama), ali koeficijenti bazolateralne-apikalne permeabilnosti za jedinjenja (A) - (C) su bili veći od onih za većinu jedinjenja Pr. 1 - 12, kao što je prikazano u koloni 4 iste tabele. U odnosu na kolone 3 i 4 u Tabeli 7, većina jedinjenja Pr. 1-12 ima niske koeficijente apikalne-bazolateralne permeabilnosti merene u prisustvu elakridara (kolona 3), kao i niske koeficijente bazolateralne-apikalne permeabilnosti (kolona 4). Ove dve karakteristike karakterišu takva jedinjenja kao jedinjenja niske permeabilnosti. Ista karakterizacija se ne može napraviti za jedinjenja (A) - (C), čiji su koeficijenti bazolateralneapikalne permeabilnosti (kolona 4) veći od onih za većinu jedinjenja Pr. 1 - 12. Odnosi efluksa dati u istoj tabeli za jedinjenja (A) - (C) i Pr. 1-12 pokazuju da su sva ova jedinjenja P-gp supstrati.

[0100] Ne postoji poznato referentno učenje ili sugestija koja ukazuje na to da se izraženi nedostatak sistemskih efekata za izvođenja ovog pronalaska u poređenju sa onima referentnih jedinjenja (A) - (C) može zaključiti i/ili predvideti na osnovu strukturnih poređenja ili drugih karakteristika jedinjenja (A) - (C) kao što su one o kojima se govori u vezi sa tabelama 4, 6 i 7. Ovo je tako iako referentna jedinjenja (A) - (C) predstavljaju strukturne sličnosti određenih grupa sa sličnim delovima izvođenja ovog pronalaska.

[0101] Pored toga, ne postoji poznato referentno učenje ili sugestija koja ukazuje da se karakteristika niske permeabilnosti za izvođenja ovog pronalaska u poređenju sa karakteristikama referentnih jedinjenja (A) - (C) može zaključiti i/ili predvideti na osnovu strukturnih poređenja.

[0102] Sledeći specifični primeri su dati da dalje ilustruju pronalazak i različita izvođenja.

[0103] U dobijanju jedinjenja opisanih u primerima ispod i odgovarajućim analitičkim podacima, poštovani su sledeći eksperimentalni i analitički protokoli osim ako nije drugačije naznačeno.

[0104] Osim ako nije drugačije navedeno, reakcione smeše su magnetno mešane na sobnoj temperaturi (rt). Tamo gde su rastvori „sušeni“, oni se generalno suše preko sredstva za sušenje kao što je Na2SO4ili MgSO4. Tamo gde su smeše, rastvori i ekstrakti bili "koncentrisani", oni su tipično koncentrovani na rotacionom isparivaču pod sniženim pritiskom.

[0105] Tankoslojna hromatografija je izvedena korišćenjem Merck silika gela 60 F2542,5 cm x 7,5 cm, 250 µm ili 5,0 cm x 10,0 cm, 250 µm prethodno obloženih ploča od silika gela.

[0106] Fleš hromatografija na koloni normalne faze (FCC) je izvedena na silika gelu (SiO2) eluiranjem sa 2 M NH3u MeOH/DCM, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0107] Maseni spektri (MS) su dobijeni na Agilent seriji 1100 MSD korišćenjem jonizacije elektrosprejom (ESI) u pozitivnom režimu osim ako nije drugačije naznačeno. Izračunata (calcd.) masa odgovara tačnoj masi.

[0108] Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) su dobijeni na spektrometrima Bruker modela DRX. Format<1>H NMR podataka u nastavku je: hemijski pomak u ppm niže od referentnog tetrametilsilana (višestrukost, konstanta kuplovanja J u Hz, integracija).

[0109] Hemijska imena su generisana ili od strane ChemDraw (CambridgeSoft, Cambridge, MA) ili ACD/Name Version 9 (Advanced Chemistry Development, Toronto, Ontario, Canada). Kao primer, oznaka (1r,4r) se odnosi na trans orijentaciju oko cikloheksilnog prstena kao što je generisano korišćenjem funkcije imenovanja Chemdraw Ultra Pro 14.0.

[0110] Da bismo pružili sažetiji opis, neki od kvantitativnih izraza koji su ovde dati nisu kvalifikovani terminom "otprilike". Podrazumeva se da, bez obzira da li se termin „otprilike“ koristi eksplicitno ili ne, svaka količina koja je ovde data ima za cilj da se odnosi na stvarnu datu vrednost, a takođe znači da se odnosi na aproksimaciju takvoj datoj vrednosti koja bi se razumno mogla zaključiti na osnovu uobičajene veštine u ovoj oblasti, uključujući ekvivalente i aproksimacije zbog eksperimentalnih i/ili uslova merenja za takvu datu vrednost.

[0111] Kad god je prinos dat u procentima, takav prinos se odnosi na masu entiteta za koji je prinos dat u odnosu na maksimalnu količinu istog entiteta koja bi se mogla dobiti pod određenim stehiometrijskim uslovima. Koncentracije reagensa koje su date u procentima odnose se na masene odnose, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0112] Skraćenice i akronimi korišćeni ovde uključuju sledeće, kao što je prikazano u nastavku:

Definisane skraćenice i akronimi

Intermedijer 1 sinteza i karakterizacija:

2-((1r,4r)-4-((5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)cikloheksil)acetonitril

[0113]

[0114] Korak A: terc-butil N-[(1r,4r)-4-(Hidroksimetil)cikloheksil]karbamat. U bocu sa okruglim dnom od 20 litara sa 4 grla, pročišćenu i održavanu inertnom atmosferom azota, stavljen je (1r,4r)-4-[[(tercbutoksi)karbonil]amino]cikloheksan-1-karboksilna kiselina (1066 g, 4,38 mol, 1,00 ekviv.) i THF (10 L). Nakon toga je u kapima dodavan BH3-Me2S (10 M, 660 mL) na -10 °C tokom 1 h. Dobijeni rastvor je mešan 3 h na 15°C. Ova reakcija je izvedena tri puta paralelno i reakcione smeše su kombinovane. Reakcija je zatim ugašena dodatkom metanola (2 L). Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ovo je rezultiralo terc-butil N-[(1r,4r)-4-(hidroksimetil)cikloheksil]karbamat (3000 g, 99,6%) kao bela čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C12H23NO3, 229.32; m/z pronađeno, 215,2 [M-tBu+MeCN+H]<+>;<1>H NMR: (300 MHz, CDCl3): δ 4,40 (s, 1H), 3,45 (d, J= 6,3 Hz, 2H), 3,38 (s, 1H), 2,05-2,02 (m, 2H), 1,84-1,81 ( m, 2H), 1,44 (s, 11 H), 1,17-1,01 (m, 4H).

[0115] Korak B: terc-butil N-[(1r,4r)-4-[(Metansulfoniloksi)metil]cikloheksil]karbamat. U bocu sa okruglim dnom od 20 L sa 4 grla, pročišćenu i održavanu inertnom atmosferom azota, stavljen je terc-butil N-[(1r,4r)-4-(hidroksimetil)cikloheksil]karbamat (1000 g, 4,36 mol, 1,00 ekv.), dihlorometan (10 L), piridin (1380 g, 17,5 mol, 4,00 ekv.). Ovo je praćeno dodavanjem kapi po kapi MsCl (1000 g, 8,73 mol, 2,00 ekviv.) na -15°C. Dobijeni rastvor je mešan preko noći na 25°C. Ova reakcija je izvedena paralelno 3 puta i reakcione smeše su kombinovane. Reakcija je zatim ugašena dodavanjem 2 L vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom (1 x 9 L). Organski sloj je odvojen i ispran sa 1 M HCl (3 x 10 L), NaHC03(zasićeni vodeni) (2 x 10 L), vodom (1 x 10 L) i slanim rastvorom (1 x 10 L). Smeša je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana pod vakuumom. Ovo je rezultiralo terc-butil N-[(1r,4r)-4-[(metansulfoniloksi)metil]cikloheksil]karbamatom (3300 g, 82%) u vidu bele čvrste supstance. LC-MS: MS (ESI): masa izrač. za C13H25NO5S, 307.15; m/z pronađeno 292,1, [M-tBu+MeCN+H]<+>;<1>H NMR: (300 MHz, CDCl3): δ 4,03 (d, J= 6,6 Hz, 2H), 3,38 (s, 1H), 3,00 (s, 3H), 2,07-2,05 (m, 2H), 1,87-1,84 ( m, 2H), 1,72-1,69 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,19-1,04 (m, 4H).

[0116] Korak C: terc-butil N-[(1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil]karbamat. U bocu sa okruglim dnom od 10 L sa 4 grla stavljen je terc-butil N-[(1r,4r)-4-[(metansulfoniloksi)metil]cikloheksil]karbamat (1100 g, 3,58 mol, 1,00 ekviv.), DMSO (5500 mL) i NaCN (406 g, 8,29 mol, 2,30 ekviv.). Dobijena smeša je mešana 5 h na 90 °C. Ova reakcija je izvedena paralelno 3 puta i reakcione smeše su kombinovane. Reakcija je zatim ugašena dodavanjem 15 L vode/leda. Čvrste materije su sakupljene filtracijom. Čvrste materije su isprane vodom (3 x 10 L). Ovo je rezultiralo terc-butil N-[(1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil]karbamatom (2480 g, 97%) u vidu bele čvrste supstance. MS (ESI): masa izrač. za C13H22N2O2, 238.17; m/z pronađeno 224 [M-tBu+MeCN+H]<+>;<1>H NMR: (300 MHz, CDC13: δ 4,39 (s, 1H), 3,38 (s, 1H), 2,26 (d, J= 6,9 Hz, 2H), 2,08-2,04 (m, 2H), 1,92-1,88 (m , 2H), 1,67-1,61 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,26-1,06 (m, 4H).

[0117] Korak D: 2-[(1r,4r)-4-aminocikloheksil]acetonitril hidrohlorid. U posudu sa okruglim dnom od 10 L stavljen je terc-butil N-[(1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil]karbamat (620 g, 2,60 mol, 1,00 ekviv.) i 1,4-dioksan ( 2 L). Nakon toga je u kapima dodavan rastvor HCl u 1,4-dioksanu (5 L, 4 M) uz mešanje na 10°C. Dobijeni rastvor je mešan preko noći na 25 °C. Ova reakcija je izvedena 4 puta i reakcione smeše su kombinovane. Čvrste materije su sakupljene filtracijom. Čvrste materije su isprane sa 1,4-dioksanom (3 3x L), etil acetatom (3 x 3 L) i heksanom (3 x 3 L). Ovo je rezultiralo 2-[(1r,4r)-4-aminocikloheksil]acetonitril hidrohloridom (1753 g, 96%) u vidu bele čvrste supstance. MS (ESI): masa izrač. za C8H14N2, 138.12; m/z pronađeno 139,25, [M+H]<+>;<1>H NMR: (300 MHz, DMSO-d6): δ 8,14 (s, 3H), 2,96-2,84 (m, 1H), 2,46 (d, J= 6,3 Hz, 2H), 1,98 (d, J= 11,1 Hz, 2H), 1,79 (d, J= 12,0 Hz, 2H), 1,64-1,49 (m, 1H), 1,42-1,29 (m, 2H), 1,18-1,04 (m, 2H).

[0118] Korak E: 2-((1r,4r)-4-((5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)cikloheksil)acetonitril. U bocu sa okruglim dnom od 1000 mL koji sadrži 2-[(1r,4r)-4-aminocikloheksil]acetonitril hidrohlorid (29,10 g, 166,6 mmol) dodat je DMA (400 mL). Dobijena suspenzija je tretirana sa 4-hloro-5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridinom (51,53 g, 152,6 mmol), a zatim sa DIPEA (63,0 mL, 366 mmol). Reakciona smeša je stavljena pod N2i zagrevana na 80 °C tokom 4 h. Sirova reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i polako sipana u energićno promešanu bocu od 2 L koji sadrži 1,6 L vode. Dobijena suspenzija je mešana 15 minuta na sobnoj temperaturi, zatim filtrirana i sušena 16 h u vakuum pećnici uz zagrevanje na 70 °C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (63,37 g, 95%) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C21H21N5O4S, 439.1; m/z pronađeno, 440,1 [M+H]<+>.<1>H NMR (500 MHz, CDC13: δ 9.10 (s, 1H), 8.99 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 8.23 - 8.15 (m, 2H), 7.66 - 7.59 (m, 2H), 7.56 - 7 m, 2H), 6,67 (d, J= 4,2 Hz, 1H), 3,95 - 3,79 (m, 1H), 2,38 (d, J= 6,2 Hz, 2H), 2,32 - 2,21 (m, 2H), 2,08 - 1,98 (m, 2H), 1,88-1,76 (m, IH), 1,60-1,32 (m, 4H).

Intermedijer 2 sinteza i karakterizacija:

2-((1r,4r)-4-((5-Amino-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)cikloheksil)acetonitril

[0119]

[0120] 2-((1r,4r)-4-((5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)cikloheksil)acetonitril (Intermedijer 1, 58,60 g, 133,3 mmol) je rastvoreno u THF/MeOH (1:1, 4800 mL). Smeša je propuštena kroz reaktor za hidrogenaciju kontinualnog protoka (10% Pd/C), kao što je Thales Nano H-Cube®, pri 10 mL/min sa 100% vodonika (atmosferski pritisak, 80 °C), zatim je rastvor koncentrovan da bi se dobio proizvod kao ljubičasta čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je triturisana sa EtOAc (400 mL), a zatim ponovo triturisana sa MeOH (200 mL), zatim filtrirana i osušena pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (50,2 g, 91,9% prinos). MS (ESI): masa izrač. za C21H23N5O2S, 409.2; m/z pronađeno, 410,2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDC13) δ 8,10 - 8,03 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.51 - 7.43 (m, 1H), 7.43 - 7.34 (m, 3H), 6.44 (d, J= 4.2 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.65 - 3.51 (m, 1H), 2.74 (s, 2H), 2.26 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 2.19 - 2.05 (m, 2H), 1.97 - 1.86 (m, 2H), 1.76 - 1.59 (m, 1H), 1.33 - 1.12 (m, 4H).

Intermedijer 3 sinteza i karakterizacija:

Etil 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2 -il)acetat

[0122] U bocu sa okruglim dnom od 1L koja sadrži šipku za mešanje i 2-((1r,4r)-4-((5-amino-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridin-4 -il)amino)cikloheksil)acetonitril (Intermedijer 2, 58,31 g, 142,4 mmol) je dodat etil 3-etoksi-3-imino-propanoat (60,51 g, 309,3 mmol), a zatim EtOH (600 mL, sušeno preko 3A molekularnih sita tokom 48 h). Refluks kondenzator je vezan za reakcionu bocu, reakcija je pročišćena sa N2, i zagrevana na 90 °C tokom 9 h. Reakciona smeša je ohlađena na sobnoj temperaturi i ostavljena da stoji 30 h gde se proizvod kristalizovao u vidu braon iglica. Čvrste materije su razbijene lopaticom i reakciona smeša je prebačena u bocu od 2 L. Voda (1.4 L) je dodavana polako preko levka za odvajanje uz snažno mešanje. Nakon što je dodavanje vode završeno, suspenzija je mešana tokom 30 minuta. Smeđe iglice su izolovane filtracijom, a zatim osušene provlačenjem vazduha kroz filter tokom 1 h. Proizvod je prebačen u bocu od 500 mL i tretiran sa EtOAc (200 mL). Dodata je mala količina kristala za seme, što je izazvalo formiranje belog čvrstog taloga. Suspenzija je mešana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, filtrirana, isprana sa EtOAc (25 mL) i osušena pod vakuumom da bi se dobio proizvod kao bela čvrsta supstanca (48,65 g, 68% prinos). MS (ESI): masa izrač. za C26H27N5O4S, 505.2; m/z pronađeno, 506.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.85 (s, 1H), 8.28 - 8.19 (m, 2H), 7.84 (d, J= 4.0 Hz, 1H), 7.61 - 7.53 (m, 1H), 7.52 - 7.43 (m, 2H), 6.84 (d, J= 4.1 Hz, 1H), 4.32 (s, 1H), 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.09 (s, 2H), 2.44 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.40 - 2.27 (m, 2H), 2.16 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 2.12 - 1.96 (m, 3H), 1.54 - 1.38 (m, 2H), 1.27 (t, J= 7.1 Hz, 3H).

Intermedijer 4 sinteza i karakterizacija:

Natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetat

[0123]

[0124] U rastvor etil 2-(1-((1r,4r)-4(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3 -b]piridin-2-il)acetat (intermedijer 3,9.50 g, 18,8 mmol) u MeOH (30 mL) i THF (30 mL) je dodat vodeni natrijum hidroksid (56,4 mL, 56,4 mmol, 1 M) i mešan na sobnoj temperaturi tokom 14 sati. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom na sobnoj temperaturi da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (7 g) kao braon čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS (ESI): masa izrač. za C18H18N5NaO2, 359.1; m/z pronađeno, 337.9 [M+H-Na]<+>.<1>H NMR (400MHz, CD3OD) δ 8.52 - 8.47 (m, 1H), 7.85 - 7.81 (m, 2H), 7.46 - 7.41 (m, 4H), 6.85 - 6.81 (m, 1H), 4.60 - 4.46 (m, 1H), 3.96 (s, 2H), 2.59 - 2.49 (m, 4H), 2.19 - 2.05 (m, 6H), 1.56 - 1.43 (m, 2H) (1:1 smeša jedinjenja iz naslova i benzensulfonske kiseline).

Primer 1 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piidin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid

[0125]

(Pr.1)

[0126] Korak A: 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3- b]piidin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid. Da bi se obezbedio suv polazni materijal, etil 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 3) je zagrevan pod vakuumom na 50 °C tokom 18 h pre reakcije. U posudi od 1 L, etil 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 3, 52,585 g, 104,01 mmol) je suspendovan u DMA (50 mL). Dodat je 1-amino-2-metilpropan-2-ol (50 mL) i reakcija je zagrevana na 110 °C tokom 45 minuta, zatim na 125 °C tokom 5 sati. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i razblažena sa EtOAc (800 mL). Organski sloj je ekstrahovan tri puta sa rastvorom voda/fiziološki rastvor pri čemu je rastvor sastavljen od 1L vode plus 50 mL slanog rastvora. Vodeni slojevi su ponovo ekstrahovani sa EtOAc (2 x 600 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko anhidrovanog MgS04, koncentrovani do suvog, a zatim sušeni 3 dana pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (65,9 g, 98% prinos) u vidu žute pene. Proizvod je odveden u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja. MS (ESI): masa izrač. za C28H32N6O4S, 548.22; m/z pronađeno, 549.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3: δ 8.76 (s, 1H), 8.26 - 8.19 (m, 2H), 7.84 (d, J= 4.1 Hz, 1H), 7.60 - 7.53 (m, 1H), 7.50 -7.44 (m, 2H), 6.84 (d, J= 4.2 Hz, 1H), 4.76 - 4.61 (m, 1H), 3.97 (s, 2H), 3.45 (s, 1H), 3.27 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 2.41 (d, J= 6.5 Hz, 2H), 2.38 - 2.25 (m, 2H), 2.23 - 2.12 (m, 2H), 2.09 - 1.94 (m, 4H), 1.48 (qd, J= 13.6, 4.0 Hz, 2H), 1.21 (s, 6H).

[0127] Korak B: 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid. 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2- il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid (65,90 g, 102,1 mmol) je dodat u bocu od 1 L koja sadrži šipku za mešanje. Dodat je 1,4-dioksan (300 mL), a zatim vodeni KOH (3 M, 150 mL). Reakcija je zagrevana na 80 °C tokom 2 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i zapremina rastvarača je smanjena na oko 200 mL na rotacionom isparivaču. Ostatak je tretiran rastvorom voda/fiziološki rastvor (100 mL/100 mL), zatim ekstrahovan sa 10% MeOH u CH2Cl2(2 x 1 L). Organski slojevi su kombinovani, osušeni preko anhidrovanog MgS04i koncentrovani do suvog da bi se dobila žuta čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je suspendovana u CH2Cl2(200 mL), snažno mešana 30 minuta, a zatim sakupljena filtracijom. Čvrsta supstanca je isprana sa CH2Cl2(100 mL), osušena provlačenjem vazduha kroz filter, a zatim dalje sušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi tokom 16 h da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (41,59 g, 89% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C22H28N6O2, 408.23; m/z pronađeno, 409.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ 11.85 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.21 - 8.10 (m, 1H), 7.49 - 7.43 (m, 1H), 6.74 - 6.65 (m, 1H), 4.53 - 4.42 (m, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.08 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 2.58 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 2.41 - 2.28 (m, 2H), 2.09 - 1.92 (m, 5H), 1.42 - 1.31 (m, 2H), 1.09 (s, 6H). Sinteza i karakterizacija aktivnog jedinjenja svakog od izvođenja ovog pronalaska su ovde date u obliku primera. Zbog kristalne strukture nekih izvođenja ovog pronalaska, polimorfni skrining se može sprovesti da bi se dalje karakterisali specifični oblici bilo kog takvog jedinjenja. Ovo je ilustrovano na neograničavajući način za jedinjenje Pr. 1 na primeru pod naslovom skrining polimorfa.

Primer 2 sinteza i karakterizacija:

2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)cikloheksil) acetonitril

[0128]

[0129] Korak A: 2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)-6-(fenilsulfonil)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)cikloheksil)acetonitril. 2-((1r,4r)-4-((5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1H-pirolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)cikloheksil)acetonitril (Intermedijer 1, 23,3 g , 53,0 mmol) je dodat u bocu sa okruglim dnom od 1 L koji sadrži magnetnu mešalicu, a zatim je dodat DMSO (200 mL) i metanol (200 mL). 1H-imidazol-4-karbaldehid (8,56 g, 89,1 mmol) je dodat kao čvrsta supstanca, a zatim je dodat natrijum hidrosulfit (32,7 g, 188 mmol) kao rastvor u vodi (100 mL). Reakcioni sud je opremljen refluks kondenzatorom i zagrevan na 90 °C u grejnom bloku tokom 15 h. Reakciona smeša je zatim ohlađena na sobnoj temperaturi i dodata u bocu koji sadrži vodu (2000 mL) uz mešanje, što je rezultiralo formiranjem belog taloga. Smeša je mešana tokom 30 minuta i čvrste materije su sakupljene filtracijom. Čvrste materije su sušene provlačenjem vazduha kroz filter tokom 6 h, a zatim dalje sušene u vakuumskoj pećnici zagrejanoj na 60 °C tokom 3 dana da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (22,7 g, 88% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C25H23N7O2S,485.16; m/z pronađeno, 486.1 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3: δ 8.74 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.20 - 8.11 (m, 2H), 8.04 - 7.96 (m, 2H), 7.76 - 7.68 (m, 1H), 7.68 - 7.60 (m, 2H), 7.19 (d, J= 4.2 Hz, 1H), 5.56 (s, 1H), 2.58 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 2.38 - 2.24 (m, 2H), 2.07 (s, 1H), 1.98 (d, J = 10.8 Hz, 5H), 1.35 (q, J = 12.3 Hz, 2H).

[0130] Korak B: 2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H))-il)cikloheksil)acetonitril. Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno korišćenjem uslova analognih onima opisanim u Primeru 1, Korak B korišćenjem 2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)-6-(fenilsulfonil)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)cikloheksil)acetonitril (222 mg, 0,46 mmol) umesto 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil) )cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (0-15% 2 N NH3-MeOH/EA) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (97 mg, 69% prinos). MS (ESI): masa izrač. za C19H19N7,345.17; m/z pronađeno, 346.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.61 (s, 1H), 11.86 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.92 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.48 (t, J= 3.0 Hz, 1H), 6.76 (dd, J= 3.5, 1.8 Hz, 1H), 5.85 (s, 1H), 2.60 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.57 - 2.41 (m, 2H), 2.14 - 1.88 (m, 5H), 1.45 - 1.27 (m, 2H).

Primer 3 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piidin-2-il)-N-(ciklopropilmetil)acetamid

[0131]

[0132] Korak A: 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3- b]piidin-2-il)-N-(ciklopropilmetil)acetamid. Smeša etil 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenil-sulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3- b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 3, 555 mg, 1,06 mmol) i ciklopropilmetilamin (1,87 mL, 21,1 mmol) su zagrevani na 125 °C tokom 1 h u mikrotalasnom reaktoru. Ostatak je tretiran vodom, a zatim ekstrahovan etil acetatom. Organski slojevi su kombinovani, osušeni preko natrijum sulfata, propušteni kroz čep od silicijum dioksida i koncentrovani do suvog korišćenjem rotacionog isparivača da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (642 mg). MS (ESI): masa izrač. za C28H30N6O3S, 530.21; m/z pronađeno, 531.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.64 (s, 1H), 8.19-8.11 (m, 2H), 7.95 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.66-7.57 (m, 1H), 7.57-7.48 (m, 2H), 7.11 (d, J= 4.1 Hz, 1H), 4.53 (s, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.07 (d, J= 7.1 Hz, 2H), 2.53 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 2.45-2.30 (m, 2H), 2.14-2.03 (m, 5H), 1.55 - 1.42 (m, 2H), 1.02-0.94 (m, 1H), 0.54-0.47 (m, 2H), 0.24-0.18 (m, 2H).

[0133] Korak B: 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2- il)-N-(ciklopropilmetil)acetamid. U smešu 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciklopropilmetil)acetamid (560 mg, 1,05 mmol) u 1,4-dioksanu (4,22 mL) je dodat 3N KOH (2,81 mL). Smeša je zagrevana na 80 °C tokom 1 sata, zatim prečišćena baznom HPLC: Xbridge Prep OBD C1850 mm k100 mm, 5 µm kolona (eluent 0-100% ak NH4OH/ACN (10 min)) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (187 mg, 46% prinos). MS (ESI): masa izrač. za C22H26N6O, 390.22; m/z pronađeno, 391.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.57 (s, 1H), 7.50 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.13 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.67-2.52 (m, 4H), 2.20-2.03 (m, 5H), 1.58- 1.44 (m, 2H), 1.12-0.97 (m, 1H), 0.60-0.48 (m, 2H), 0.31 -0.22 (m, 2H).

Primer 4 sinteza i karakterizacija:

N-(2-cijanoetil)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin- 2-il)acetamid

[0135] U rastvor natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 4, 400 mg, 1,11 mmol) i 3-aminopropannitril (320 mg, 2,24 mmol) u DMF (5 mL) je dodat PyBOP (870 mg, 1,67 mmol) i DIPEA (0,60 mL, 3,5 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 40 h. Posle uklanjanja DMF-a u vakuumu, ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni korišćenjem 50-100% etil acetata u heptanu. Sakupljene frakcije su koncentrovane in vacuo do male zapremine i bela čvrsta supstanca koja je istaložena je filtrirana, isprana sa 10% MeOH u CH2Cl2i osušena da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (75 mg, 17% prinos). Filtrat je koncentrovan do suvog i prečišćen pomoću HPLC reverzne faze koristeći Varian Pursuit XRs5 Diphenyl 100 mm x 30 mm kolona (eluent 10 - 90% CH3CN u vodi, 0,1% TFA) da bi se dobilo bistro ulje. Ovaj materijal je rastvoren u 10% MeOH u CH2Cl2, propušten kroz tri kolone od 500 mg SILICYCLE SPE-R66030B-03P Carbonate (SiliaBond acid cavenger kartridž za ekstrakciju čvrste faze) da bi se uklonio TFA i eluiran sa 10% MeOH da bi se obezbedila dodatna CH2Cl2frakcija jedinjenja iz naslova (88 mg, 20% prinos). Dve frakcije su kombinovane da bi se dobio konačni proizvod (163 mg, 37% prinos) u vidu bele čvrste supstance. MS (ESI): masa izrač. za C21H23N7O, 389.20; m/z pronađeno, 390.3 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.53 (s, 1H), 7.48 (d, J= 3.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.51 (br s, 1H), 4.12 (s, 2H), 3.50 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.71 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.45 -2.63 (m, 4H), 2.03 - 2.19 (m, 5H), 1.44 - 1.57 (m, 2H).

Primer 5 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piidin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamid

[0136]

[0137] Smeša etil 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3 -b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 3,309 mg, 0,61 mmol) i 4-aminotetrahidropiran (195 mg, 1,93 mmol) u 1,4-dioksanu (0,5 mL) zagrevani su u mikrotalasnom reaktoru na 180 °C tokom 1 H. Reakciona smeša je zatim razblažena sa 1,4-dioksanom (1,5 mL), tretirana sa vodenim 3N KOH (2 mL) i zagrevana na 80 °C tokom 1,5 h. Ostatak je zatim tretiran vodom (10 mL) i ekstrahovan sa CH2Cl2(3 x 50 mL). Organski slojevi su kombinovani, sušeni preko MgS04i koncentrovani u vakuumu. Sirovi materijal je prečišćen korišćenjem fleš hromatografije na koloni (5-10% MeOH/CH2Cl2) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (146 mg, 57% prinos). MS (ESI): masa izrač. za C23H28N6O2, 420.23; m/z pronađeno, 421.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ 11.84 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.36 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 6.73 - 6.67 (m, 1H), 4.54 - 4.41 (m, 1H), 3.98 (s, 2H), 3.86-3.81 (m, 2H), 3.81 -3.74 (m, 1H), 3.40 - 3.34 (m, 2H), 2.60 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.41 - 2.29 (m, 2H), 2.10 - 2.01 (m, 1H), 2.00 - 1.93 (m, 4H), 1.77 - 1.70 (m, 2H), 1.49 - 1.33 (m, 4H).

Primer 6 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamid

[0138]

[0139] U mikrotalasnu bočicu dodat je etil 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[ 2,3-b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 3, 300 mg, 0,593 mmol) i 4-aminometiltetrahidropiran (683 mg, 5,93 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na 125 °C tokom 1 h. Zatim su dodati dioksan (2,37 mL) i KOH (3 M u vodi, 1,58 mL, 4,75 mmol) i reakcija je mešana u mikrotalasnoj pećnici na 80 °C tokom 1 h. Reakcija je prečišćena preko bazne HPLC korišćenjem Waters Xbridge Prep OBD C18150 mm x 30 mm, 5 µm kolone (eluent 0-100% voda (0,05% NH4OH)/ACN (10 min)) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (97 mg, 38% prinosa). MS (ESI): masa izrač. za C24H30N6O2, 434.24; m/z pronađeno, 435.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (500 MHz, CD3OD): δ 8.43 (s, 1H), 7.38 (d, J= 3.5 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.43 (s, 1H), 4.03 - 3.96 (m, 2H), 3.89 - 3.79 (m, 2H), 3.34 - 3.25 (m, 2H), 3.04 (d, J= 6.8 Hz, 2H), 2.54 - 2.38 (m, 4H), 2.08 - 1.96 (m, 5H), 1.74 - 1.63 (m, 1H), 1.59 - 1.54 (m, 2H), 1.46 - 1.33 (m, 2H), 1.25 - 1.14 (m, 2H).

Primer 7 sinteza i karakterizacija:

N-(2-cijano-2-metilpropil)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid

[0141] Rastvor natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2 -il)acetat (Intermedijer 4,300 mg, 0,835 mmol), 3-amino-2,2-dimetilpropannitril (82,0 mg, 0,835 mmol), DIPEA (216 mg, 1,67 mmol) i DMF (5 mL) su mešani na 0° C tokom 1 h. Zatim je dodat PyBrOP (467 mg, 1,00 mmol) i reakciona smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Smeša je ugašena sa 10 mL vode i prečišćena je preparativnom HPLC korišćenjem Waters Xbridge Prep OBD C18150 mm x 30 mm 5 µm kolone (eluent: 28% voda (0,05% amonijak hidroksid v/v)-ACN da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (58 mg, 16% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C23H27N7O, 417.23; m/z pronađeno, 418.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 11.86 (br s, 1H), 8.71 - 8.66 (m, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.48 - 7.45 (m, 1H), 6.73 - 6.69 (m, 1H), 4.53 - 4.42 (m, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.33 -3.31 (m, 1H), 2.57 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 2.41 - 2.27 (m, 2H), 2.05 - 1.93 (m, 5H), 1.45 - 1.26 (m, 9H).

Primer 8 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklobutil)metil)acetamid

[0142]

[0143] Rastvor natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2 -il)acetat (Intermedijer 4,300 mg, 0,835 mmol), 1-(aminometil)ciklobutanol (84,4 mg, 0,835 mmol), DIPEA (216 mg, 1,67 mmol) i DMF (5 mL) je mešan na 0 °C tokom 1 h. Zatim je dodat PyBrOP (467 mg, 1,00 mmol) i mešan na sobnoj temperaturi preko noći, a zatim ugašen sa 10 mL vode. Reakcija je prečišćena preparativnom baznom HPLC korišćenjem Kromasil 150 mm x 25 mm, 10 µm kolone (eluent: voda (0,05% amonijak hidroksid v/v)-ACN od 9% do 39%, v/v) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (90 mg, 26% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C23H28N6O2, 420.23; m/z pronađeno, 421.2 [M+H]+. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 11.58 (br s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.94 - 7.85 (m, 1H), 7.46 - 7.40 (m, 1H), 6.75 - 6.70 (m, 1H), 4.89 (br s, 1H), 4.57 - 4.47 (m, 1H), 4.04 (s, 2H), 3.27 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 2.55 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.45 - 2.31 (m, 2H), 2.10 - 1.88 (m, 9H), 1.71 - 1.60 (m, 1H), 1.54 - 1.35 (m, 3H).

Primer 9 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1-metil-1H-pirazol-4-il)acetamid

[0144]

[0145] U rastvor natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetat (Intermedijer 4, 100 mg, 0,278 mmol) i 1-metil-1H-pirazol-4-amin (54,0 mg, 0,557 mmol) u DMF (0,8 mL) su dodati PyBrOP (217 mg, 0,417 mmol) i DIPEA (0,144 mL, 0,835 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. DMF je uklonjen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (50-100% EtOAc/heptani, zatim 10% MeOH / DCM) i zatim pomoću HPLC reverzne faze koristeći Varian Pursuit XRs5 Diphenyl 100 mm x 30 mm kolona (eluent 10 - 90% CH3CN u vodi, 0,1% TFA) da bi se dobio proizvod kao TFA so. Ovaj materijal je rastvoren u 10% MeOH u CH2Cl2i propušten kroz kolonu od 500 mg SILICYCLE SPE-R66030B-03P Carbonate (SiliaBond uložak za ekstrakciju kiseline u čvrstoj fazi) da se ukloni TFA kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (34 mg, 29% prinos) u obliku bele čvrste supstance. MS (ESI): masa izrač. za C22H24N8O, 416.21; m/z pronađeno, 417.3 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 12.77 (br s, 1H), 11.24 (br s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.89 (br s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.29 - 7.20 (m, 1H), 6.74 (br s, 1H), 4.85 - 4.65 (m, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.80 - 2.55 (m, 1H), 2.45 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.32 - 1.98 (m, 6H), 1.62 - 1.44 (m, 2H).

Primer 10 sinteza i karakterizacija:

N-(4-(cijanometil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid

(Pr.10)

[0147] Korak A: Dimetil ciklopentan-1,3-dikarboksilat. Rastvor ciklopentan-1,3-dikarboksilne kiseline (70,0 g, 443 mmol) i anhidrovanog metanola (300 mL) je ohlađen na 0 °C u kupatilu sa ledenom vodom. Ukapavanjem je dodata koncentrovana sumporna kiselina (14 mL), održavajući temperaturu na < 15 °C. Nakon dodavanja, reakcija je zagrejana do 90 °C i mešana preko noći. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana do suvog. Ostatak je tretiran sa MTBE (500 mL) i H2O (100 mL). Vodeni sloj je odvojen i ekstrahovan sa MTBE (2 x 100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani zasićenim natrijum bikarbonatom (2 x 100 mL), slanim rastvorom (100 mL), osušeni preko anhidrovanog MgS04, filtrirani i koncentrovani do suvog da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (72,5 g, 88%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.65 (s, 6H), 2.84 - 2.72 (m, 2H), 2.26 - 2.17 (m, 1H), 2.11 -2.02 (m, 1H), 1.96 - 1.88 (m, 4H).

[0148] Korak B: Dimetil biciklo[2.2.1]heptan-1,4-dikarboksilat. n-Butillitijum (2,5 M u heksanu, 419,0 mL, 1048 mmol) je polako dodat u rastvor diizopropilamina (152 mL, 1090 mmol) i anhidrovanog THF (1000 mL) na -78 °C (suvi led)/aceton pod N2. Reakcija je zatim mešana 0,5 sati na 0 °C pre hlađenja na -78 °C. DMPU (404 mL, 3350 mmol) je dodat preko levka za dodavanje. Zatim je polako dodat rastvor dimetil ciklopentan-1,3-dikarboksilata (78,0 g, 419 mmol) i anhidrovanog THF (300 mL) preko levka za dodavanje. Reakcija je zagrejana do 0 °C i mešana 30 minuta, zatim ohlađena na -78 °C i tretirana rastvorom 1-bromo-2-hloroetana (59,0 mL, 712 mmol) i anhidrovanog THF (200 mL). Reakcija je ostavljena da se polako zagreje do sobne temperature i mešana je 12 sati na sobnoj temperaturi. Reakcija je ugašena zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (400 mL). Reakcija je razblažena etil acetatom (500 mL), organski sloj je odvojen, a vodeni sloj je dalje ekstrahovan etil acetatom (2 x 500 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (2 x 300 mL), osušeni preko anhidrovanog MgS04, filtrirani i koncentrovani do suvog. Ostatak je filtriran kroz jastučić od silika gela i ispran etil acetatom (2000 mL). Filtrat je koncentrovan do suvog, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (petroleum etar/etil acetat, 30:1 do 20:1, gradijent eluiranja) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (48,5 g, 54%) u obliku bele čvrste supstance.

<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 3.69 (s, 6H), 2.08 - 1.99 (m, 4H), 1.91 (s, 2H), 1.73 - 1.63 (m, 4H).

[0149] Korak C: 4-(Metoksikarbonil)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilna kiselina. U rastvor dimetil biciklo[2.2.1]heptan-1,4-dikarboksilata (27,3 g, 129 mmol) i THF (700 mL) polako je dodat metanolni (80 mL) rastvor natrijum hidroksida (5,145 g, 128,6 mmol) na 0 °C i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je koncentrovana do suvog, a ostatak je triturisan sa MTBE (15 mL). Talog je sakupljen filtracijom, ispran sa MTBE (5 mL) i rastvoren u 100 mL H20. Rastvor je zakiseljen do pH = 4 sa 2 M HCl. Talog je sakupljen filtracijom i osušen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (13.0 g, 51.0%) u vidu bele čvrste supstance. Filtrat je ekstrahovan etil acetatom (3 x 75 mL) i kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni preko anhidrovanog MgS04, filtrirani i koncentrovani do suvog da bi se dobila druga frakcija jedinjenja iz naslova (8,0 g, 31%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,21 (br s, 1H), 3,59 (s, 3H), 1,94 -1,86 (m, 4H), 1,74 (s, 2H), 1,61-1,54 (m, 4H).

[0150] Korak D: Metil 4-(((benziloksi)karbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilat. Difenilfosforil azid (17,1 mL, 78,6 mmol) je dodat u rastvor 4-(metoksikarbonil)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilne kiseline (13,0 g, 65,6 mmol), DIPEA (22,8 mmol), i 131 anhidrovanog toluena (200 mL) i reakciona smeša je mešana na 110 °C tokom 2 sata. Reakcija je ohlađena na 50 °C i dodat je benzil alkohol (13,6 mL, 131 mmol) i reakciona smeša je mešana na 110 °C preko noći. Reakcija je koncentrovana do suvog, rastvorena u MTBE (250 mL) i isprana sa H20 (150 mL). Organski sloj je odvojen, a vodeni sloj je ekstrahovan sa MTBE (2 x 100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (100 mL), osušeni preko anhidrovanog MgS04, filtrirani i koncentrovani do suvog. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (petroleum etar/etil acetat, 10:1 do 5:1, gradijent eluiranja) da bi se dobio nečist proizvod (28,5 g) kao bledo žuto ulje. Proizvod je dalje prečišćen preparativnom kiselom HPLC korišćenjem Phenomenex Synergi Max-RP 250 x 50 mm x 10 µm kolone (eluent: 38% do 68% (v/v) CH3CN i H20 sa 0,1% TFA). Čiste frakcije su kombinovane i isparljive supstance su uklonjene pod vakuumom. Ostatak je razblažen sa H2O (80 mL), pH rastvor je podešen na pH = 8 zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, a dobijeni rastvor je ekstrahovan sa CH2Cl2(3 x 100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (75 mL), osušeni preko anhidrovanog MgS04, filtrirani i koncentrovani do suvog da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (17,3 g, 85%) kao bezbojno ulje. MS (ESI): masa izrač. za C17H21NO4, 303.2; m/z pronađeno, 303.9 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.56 (br s, 1H), 7.37 - 7.30 (m, 5H), 4.97 (s, 2H), 3.58 (s, 3H), 1.90 - 1.80 (m, 6H), 1.65 - 1.59 (m, 4H).

[0151] Korak E: Metil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilat. Smeša metil 4-(((benziloksi)karbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilata (17 g, 56 mmol), di-terc-butil dikarbonata (18,35 g, 84,06 mmol), MeOH (200 mL) i vlažni Pd/C (4 g, 10 tež.%, 50% H2O) dodata je u bocu sa okruglim dnom od 500 mL sa balonom vodonika (13 psi) i mešana je na sobnoj temperaturi tokom 72 sata. Katalizator je filtriran i filtrat je koncentrovan do suvog. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na koloni (petroleum etar/etil acetat, 20:1 do 1:1, gradijent eluiranja) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (12,0 g, 79,5%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,04 (br s, 1H), 3,57 (s, 3H), 1,93 - 1,78 (m, 4H), 1,77 (s, 2H), 1,63 - 1,53 (m, 4H) , 1,35 (s, 9H).

[0152] Korak F: 4-((terc-butoksikarbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilna kiselina. U rastvor metil 4-((tercbutoksikarbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilata (5,0 g, 19 mmol), THF (40 mL) i MeOH (20 mL) dodat je vodeni rastvor natrijum hidroksida. (1,0 M, 46,4 mL, 46,4 mmol) na sobnoj temperaturi i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Reakcija je koncentrovana do suvog, a ostatak je razblažen sa H20 (20 mL), zakiseljen do pH = 4 - 5 sa 2 M HCl da bi se dobio talog. Precipitat je rastvoren u 150 mL etil acetata, ispran slanim rastvorom (45 mL), osušen preko anhidrovanog Na2S04, filtriran i koncentrovan do suvog da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4,74 g, 100% prinos) u obliku bele čvrste supstance, koje je korišćeno direktno u sledećem koraku.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,06 (br s, 1H), 7,00 (br s, 1H), 1,87 - 1,73 (m, 6H), 1,58 - 1,50 (m, 4H), 1,35 (s, 9H), 1,87 - 1,73 (m, 6H), 1,58 - 1,50 (m, 4H), 1,35 (s, 9H). ).

[0153] Korak G: terc-butil (4-(hidroksimetil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)karbamat. Rastvor boran-tetrahidrofuran kompleksa (1,0 M, 37,1 mL, 37,1 mmol) je polako dodat u rastvor 4-((tercbutoksikarbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-karboksilne kiseline (4,74 g, 18,6 mmol) i anhidrovanog THF (50 mL) na 0 °C u atmosferi azota. Nakon što je dodavanje završeno, reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. U smešu je polako dodavana voda (30 mL) i mešana je dodatnih 30 minuta. Reakcija je koncentrovana do suvog, a ostatak je razblažen etil acetatom (50 mL), ispran sa H20 (15 mL) i slanim rastvorom (10 mL), osušen preko anhidrovanog Na2S04, filtriran i koncentrovan do suvog. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na koloni (petroleum etar/etil acetat, 2:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4,0 g, 89% prinos) u obliku bele čvrste supstance. TLC (petrol etar/etil acetat, 2:1), Rf = 0,5.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6,88 (br s, 1H), 4,38 (t, J= 5,4 Hz, 1H), 3,36 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 1,73 (br s, 2H) , 1,64-1,49 (m, 4H), 1,42 (s, 2H), 1,39-1,33 (m, 9H), 1,25-1,16 (m, 2H).

[0154] Korak H: (4-((terc-butoksikarbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)metil metansulfonat. Piridin (2,7 mL, 33 mmol) je dodat u rastvor terc-butil (4-(hidroksimetil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)karbamata (2,0 g, 8,3 mmol) i anhidrovanog CH2Cl2(30 mL). Reakcija je ohlađena na 0 °C i dodat je metansulfonil hlorid (2.0 mL, 25.0 mmol) , a smeša je mešana tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena sa CH2Cl2(50 mL) i vodom (30 mL). Organski sloj je odvojen, ispran slanim rastvorom (15 mL), osušen preko anhidrovanog MgS04, filtriran i koncentrovan do suvog. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na koloni (petroleum etar/etil acetat, 5:1 do 1:1, gradijent eluiranja) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2,58 g, 97%) u obliku bele čvrste supstance. TLC (petrol etar/etil acetat, 1:1), Rf = 0,85.<1>H NMR (400M Hz, CDCl3) 4,73 (br s, 1H), 4,21 (s, 2H), 2,98 (s, 3H), 1,93 - 1,90 (m, 2H), 1,78 - 1,62 (m, 6H), 1,53-1,34 (m, 11 H).

[0155] Korak I: terc-butil (4-(cijanometil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)karbamat. U rastvor (4-((tercbutoksikarbonil)amino)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)metil metansulfonata (2,58 g, 8,07 mmol) i DMSO (25 mL) dodat je natrijum cijanid (1,20 g, 24,5 mmol). Reakcija je zagrejana do 100 °C i mešana tokom 24 sata. Reakcija je razblažena sa 50 mL vode i ekstrahovana etil acetatom (3 x 40 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko anhidrovanog Na2S04, filtrirani i koncentrovani do suvog. Ostatak je prečišćen pomoću fleš hromatografije na koloni (petrol etar/etil acetat, 5:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,8 g, 89% prinos) u obliku bele čvrste supstance.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 7,00 (br s, 1H), 2,67 (s, 2H), 1,82 (br s, 2H), 1,69 - 1,52 (m, 6H), 1,47 - 1,40 (m, 2H ), 1,37 (s, 9H).

[0156] Korak J: 2-(4-Aminobiciklo[2.2.1]heptan-1-il)acetonitril hidrohlorid. U suspenziju terc-butil (4-(cijanometil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)karbamata (850 mg, 3,40 mmol) i etil acetata (2 mL) na 0 °C dodat je rastvor HCl u etil acetatu (4.0 M, 10 mL, 40 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom do suvog. Ostatak je trituriran sa MTBE (5 mL) i suspenzija je izolovana filtracijom. Filterski kolač je ispran sa MTBE (1 mL) i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (450 mg, 71%) kao bela čvrsta supstanca. MS (ESI): masa izrač. za C9H14N2150,12 m/z, nađeno 151,1 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,59 (br.s., 3H), 2,78 (s, 2H), 1,90 - 1,77 (m, 2H), 1,74 - 1,62 (m, 4H), 1,60 (s, 2H), 1,56-1,46 (m, 2H).

[0157] Korak K: N-(4-(cijanometil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6 -dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid. U rastvor natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il )acetat (Intermedijer 4, 300 mg, 0,835 mmol), 2-(4-aminobiciklo[2.2.1]heptan-1-il)acetonitril hidrohlorid (138 mg, 0,918 mmol) i DIPEA (0,291 mL, 1,67 mmol) u suvi DMF (6 mL) je dodat PyBrOP (428 mg, 0,918 mmol) na 0 °C. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 12 h. Smeša je ugašena sa 10 mL vode i ekstrahovana sa EtOAc (3 x 20 mL). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom, osušene iznad anhidrovanog Na2S04, filtrirane i koncentrovane do suvog. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (koristeći Xtimate C18150 x 25 mm x 5 mm column (eluent: 23% do 33% (v/v) CH3CN i H2O sa 10 mM NH4HCO3) i preparativnom TLC (dihlorometan=metanol 15:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (36,6 mg, 9% prinos) u obliku bele čvrste supstance. MS (ESI): masa izrač. za C27H31N7O, 469.3; m/z pronađeno, 470.2 [M+H]<+>.

<1>H NMR (400MHz, CD3OD): δ 8.53 (s, 1H), 7.48 (d, J= 4.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J= 4.0 Hz, 1H), 4.47 (br s, 1H), 4.07 -4.02 (m, 2H), 2.63 (s, 2H), 2.61 - 2.50 (m, 4H), 2.18 - 1.98 (m, 7H), 1.94 - 1.84 (m, 2H), 1.82 (s, 2H), 1.79 - 1.68 (m, 2H), 1.62 - 1.43 (m, 4H).

Primer 11 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamid

[0158]

(Pr. 11)

[0159] Korak A: 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamid. Jedinjenje iz naslova (383 mg, 70%) je pripremljeno na način analogan onome opisanom u Primeru 1, Korak A korišćenjem 1H-pirazol-3-amina (465 mg, 5,48 mmol) umesto 1-amino-2-metilpropan- 2-ol. MS (ESI): masa izrač. za C27H26N8O3S, 542.2; m/z pronađeno, 543.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.36 (s, 1H), 11.36 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.14 - 8.10 (m, 2H), 7.96 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.72 - 7.68 (m, 1H), 7.63 - 7.60 (m, 2H), 7.30 (s, 1H), 7.13 (d, J= 4.2 Hz, 1H), 6.44 - 6.41 (m, 1H), 5.41 (s, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 2.56 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 2.23 - 2.13 (m, 2H), 2.02 - 1.95 (m, 1H), 1.41 - 1.32 (m, 2H).

[0160] Korak B: 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-yl)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamid. Jedinjenje iz naslova je pripremljeno na način analogan Primeru 1, Korak B korišćenjem 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4, 5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamid (270 mg, 0,500 mmol) umesto 2-(1-((1r,4r))-4-(cijanometil)cikloheksil)-6-(fenil-sulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2- hidroksi-2-metilpropil)acetamid i prečišćen baznom HPLC korišćenjem Xbridge Prep OBD C18150 mm x 30 mm, 5µm, eluent 5% ACN/NH4OH (aq) (10 min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (15 mg, 7% ). MS (ESI): masa izrač. za C21H22N8O, 402.5; m/z pronađeno, 403.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 12.35 (s, 1H), 11.85 (s, 1H), 10.84 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.58 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 6.47 - 6.39 (m, 1H), 4.64 - 4.46 (m, 1H), 4.21 (s, 2H), 2.57 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 2.45 - 2.26 (m, 2H), 2.08 - 1.88 (m, 5H), 1.39 (q, J = 11.7 Hz, 2H).

Primer 12 sinteza i karakterizacija:

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklopropil)metil)acetamid

[0161]

(Pr.12)

[0162] Rastvor natrijum 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2 -il)acetat (Intermedijer 4, 300 mg, 0,835 mmol), 1-(aminometil)ciklopropanol (72,7 mg, 0,835 mmol), DIPEA (216 mg, 1,67 mmol) i DMF (5 mL) su mešani na 0 °C za 1 h. Zatim je dodat PyBrOP (467 mg, 1,00 mmol) i mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je ugašena sa 10 mL vode i prečišćena preparativnom baznom HPLC korišćenjem Kromasil 150 mm x 25 mm, 10 µm kolone (eluent: voda (0,05% amonijak hidroksida v/v)-ACN od 5% do 35%, v /v) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (84 mg, 25% prinos) u obliku bele čvrste supstance. MS (ESI): masa izrač. zaC22H26N6O2, 406.21; m/z pronađeno, 407.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 11.53 (br s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.03 - 7.93 (m, 1H), 7.44 - 7.40 (m, 1H), 6.74 - 6.71 (m, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.58 - 4.49 (m, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.29 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.55 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.45 - 2.31 (m, 2H), 2.10 - 1.97 (m, 5H), 1.50 - 1.37 (m, 2H), 0.62 - 0.55 (m, 2H), 0.55 - 0.48 (m, 2H).

Primer skrininga polimorfa

[0163] Neka izvođenja jedinjenja prema ovom pronalasku kao slobodne baze predstavljaju višestruke kristalne konfiguracije koje imaju složeno ponašanje u čvrstom stanju, od kojih neke zauzvrat mogu predstavljati međusobne karakteristike zbog različitih količina ugrađenog rastvarača. Neka izvođenja jedinjenja prema ovom pronalasku su u obliku pseudopolimorfa, koji su izvođenja istog jedinjenja koja predstavljaju kompozicione razlike kristalne rešetke usled različitih količina rastvarača u samoj kristalnoj rešetki. Pored toga, solvatacija kanala takođe može biti prisutna u nekim kristalnim izvođenjima jedinjenja prema ovom pronalasku, u kojima je rastvarač ugrađen u kanale ili šupljine koje su prisutne u kristalnoj rešetki. Na primer, različite kristalne konfiguracije date u Tabeli 2 su pronađene za jedinjenje Pr. 1. Zbog ovih karakteristika, često su primećeni nestehiometrijski solvati, kao što je ilustrovano u Tabeli 2. Štaviše, prisustvo takvih kanala ili šupljina u kristalnoj strukturi nekih izvođenja prema ovom pronalasku omogućava prisustvo molekula vode i/ili rastvarača koji se drže unutar kristalne strukture sa različitim stepenom čvrstoće vezivanja. Shodno tome, promene u specifičnim uslovima okoline mogu lako dovesti do nekog gubitka ili dobijanja molekula vode i/ili molekula rastvarača u nekim izvođenjima prema ovom pronalasku. Podrazumeva se da je "solvatacija" (treća kolona u Tabeli 2) za svako od izvođenja navedenog u Tabeli 2 formula solvatacija, i da stvarno određivanje istog kao stehiometrijskog broja (četvrta kolona u Tabeli 2) može neznatno da varira iz formule solvatacije u zavisnosti od stvarnih uslova okoline kada se eksperimentalno odredi. Na primer, ako oko polovine molekula vode u jednom izvođenju može biti prisutno kao vodonično vezano za aktivno jedinjenje u kristalnoj rešetki, dok okvirno druga polovina molekula vode može biti u kanalima ili šupljinama u kristalnoj rešetki, tada promene u ambijentalnim uslovima mogu promeniti količinu tako labavo sadržanih molekula vode u šupljinama ili kanalima, i stoga dovesti do male razlike između solvatacije formule koja je dodeljena prema, na primer, difrakciji jednog kristala, i stehiometrije koja je određena pomoću, na primer, termogravimetrijske analize u kombinaciji sa masenom spektroskopijom.

Tabela 2. Ostvarenja kristalnih oblika jedinjenja Pr. 1

[0164] Jedinjenje koje je dobijeno kao što je opisano u Primeru 1 dalje je kristalizovano pripremanjem suspenzije u DCM (1:3, na primer 10 g jedinjenja u 30 ml DCM) koja je mešana na 40°C tokom 4 sata, i dalje mešano tokom 14 sati na 25°C, zatim je polako dodat heptan (1:2, na primer 20 ml heptana u jedinjenje/DCM suspenzija/rastvor) na 25°C, mešan na 40°C tokom 4 sata, hlađen na 25°C i mešan još 14 sati na 25°C. Naknadna filtracija dovodi do jedinjenja iz Pr. 1 u obliku prljavo-bele čvrste supstance, koja je identifikovana kao monohidrat, Is izvođenje.

[0165] Izvođenja 1 - 10 u Tabeli 2 i Slici 2 su kristalne. Izvođenja 1s i 1a kroz 1h su izostrukturna. Izvođenje Is kristališe u centro-simetričnoj triklinskoj prostornoj grupi P-1. Termin "izvođenje 1" zajedno se odnosi na izostrukturna ostvarenja 1s i 1a kroz 1h. Bilo koje od ovakvih izvođenja od 1s i 1a kroz 1h se ponekad pominje kao izostrukturni član izvođenja 1 ili samo kao član izvođenja 1. Izvođenja 3b, 3c, 3d i 3e su izostrukturna i kristališu se u monoklinskom sistemu, prostorna grupa C, 2/c. Termin "izvođenje 3" zajedno se odnosi na izostrukturna izvođenja 3b, 3c, 3d i 3e. Bilo koje od ovakvih 3b, 3c, 3d i 3e izvođenja se ponekad naziva izostrukturnim članom izvođenja 3 ili samo kao članom izvođenja 3. Izostrukturna izvođenja su takva da poseduju slična svojstva kristalne strukture (iste simetrije i slične parametre jedinične ćelije i kristalno pakovanje) dok imaju različite hemijske sastave (tj. različite molekule rastvarača i/ili vode ugrađene u kristalnu rešetku). Parametri jedinične ćelije u izostrukturnim izvođenjima mogu se neznatno razlikovati zbog različitog sastava (rastvarač ili voda ugrađeni u kristalnu strukturu). Izvođenja pomenuta u Tabeli 2 su pripremljena i/ili međusobno konvertovana kao što je šematski prikazano na Slici 2 i kako je detaljnije opisano u sledećim tehnikama skrininga.

[0166] Skrining je uključivao protokole kristalizacije kao što su ekvilibracija rastvarača u čistim rastvaračima, kristalizacija isparavanjem, kristalizacija hlađenja sa vrućom filtracijom, crash-kristalizacija sa anti-rastvaračem i kristalizacija termociklizacijom. Čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD. Kada je to bilo primenljivo, matične tečnosti su u potpunosti isparene, a preostale čvrste materije su takođe analizirane pomoću HT-XRPD. Preovlađujuća čvrsta forma koja je identifikovana bila je varijanta početnog materijala Is kao monohidrat.

Uravnotežavanje rastvarača na 25°C i 50°C

[0167] Dugoročni eksperimenti sa suspenzijom su izvedeni suspendovanjem jedinjenja izvođenja Is u dvadeset čistih rastvarača i mešanjem na sobnoj temperaturi dve nedelje i na 50°C jednu nedelju. Po završetku vremena ekvilibracije, zaostale čvrste materije su odvojene od matične tečnosti. Čvrste materije su osušene pod uslovima okoline i osušene pod vakuumom (5 mBar) pre nego što su analizirane pomoću HT-XRPD. Nakon toga, čvrste materije su bile izložene uslovima ubrzanog starenja (40°C / 70% relativne vlažnosti) tokom dva dana i ponovo analizirane pomoću HT-XRPD.

[0168] Od većine rastvarača za kristalizaciju, dobijen je početni materijal kao izvođenje Is. Od nekoliko rastvarača za kristalizaciju, HT-XRPD uzorci su bili slični onima u početnom rešenju Is. U većini ovih difrakcionih obrazaca identifikovani su pomaci pikova i/ili dodatni pikovi. Svaki od ovih obrazaca je odgovarao izvođenju koje je označeno kao jedno od 1a do 1h, i na osnovu sličnosti u HT-XRPD difrakcijskim obrascima za takva izvođenja, oni su predstavljeni kao izvođenja koje su izostrukturni članovi izvođenja 1. Svi izostrukturni članovi izvođenja 1 su konvertovani u varijantu 1a nakon izlaganja na 40°C i 75% RH tokom dva dana.

[0169] Izvođenje se konvertuje u hidratizovano rešenje 10 kada je izloženo 100% RH na 25°C. Ipak, izvođenje 10 nije bilo fizički stabilno u uslovima okoline. Dok je izvođenje 1s kristalizovano u triklinskom sistemu, prostorna grupa P-1, nađeno je da je izvođenje 10 kristalizovano u monoklinskom sistemu, prostorna grupa C 2/c. -izvođenje 10 je imalo ograničenu fizičku stabilnost u uslovima okoline i konvertovano je u drugo izvođenje kao što je Is ili 1a. Ovo ponašanje se može pripisati nejednako jakom vezivanju svih molekula hidratacije/solvatacije. U ovom slučaju, izvođenje 10 bi imalo manje snažno vezan drugi molekul vode koji bi se izgubio u uslovima okoline. Preciznije, fizička stabilnost izvođenja Is je ispitivana u klimatskim komorama izlaganjem uzorka od 20 mg takvog izvođenja na 40°C i 70% relativnoj vlažnosti tokom četiri dana, a drugi uzorak od 20 mg istog izvođenja je takođe izložen tokom četiri dana na 25°C i 100% relativne vlažnosti. Posle četiri dana, različiti čvrsti uzorci su analizirani pomoću HR-XRPD, parametri kristalnih ćelija su određeni i difraktogrami su indeksirani. Difraktogrami su prikazani na slici 6. Odozdo prema gore, prvi difraktogram na slici 6 odgovara rešenju Is kao početni materijal, a drugi odgovara istom obliku nakon 4-dnevnog izlaganja na 40°C i 70% relativne vlažnosti, označene kao "Is 70 RH" na istoj slici. Ova analiza je otkrila da je početno oličenje Is pronađeno iako sa malom količinom drugog kristalnog oblika koji je verovatno bio još jedno hidratizovano oličenje sa većim sadržajem vode. Indeksiranje za takav oblik nije bilo moguće zbog male količine u kojoj je bio prisutan. Treći difraktogram odgovara rešenju Is nakon 4-dnevnog izlaganja temperaturi od 25°C i 100% relativnoj vlažnosti, označenom kao "10" na istoj slici. Ovi uslovi dovode do konverzije izvođenja Is u izvođenje 10, sa malom kontaminacijom inicijalne varijante Is, i solvatacije kao što je opisano u tabeli 2. Nakon dehidracije, obe realizacije Is i 10 su rekristalizovane u anhidrovani oblik sa tačkom topljenja od 148° C.

[0170] Uravnotežavanje rastvarača na sobnoj temperaturi dalo je oličenje 1b iz toluena kao rastvarača za kristalizaciju, i izvođenje If iz p-ksilena kao rastvarača za kristalizaciju.

[0171] Tri dodatna čvrsta izvođenja su identifikovana i označena kao izvođenja 2, 3 i 7. Izvođenje 2 je identifikovano iz eksperimenta ekvilibracije rastvarača izvedenog na sobnoj temperaturi u 1,4-dioksanu, dok je izvođenje 7 pronađeno kao smeša sa oličenjem Is u eksperimentu ekvilibracije jednog rastvarača na 50°C iz heptana. Identifikovano je nekoliko sličnih, ali ne identičnih difraktograma koji su grupisani kao izvođenja 3b, 3c, 3d i 3e koji su izostrukturni članovi izvođenja 3. Izostrukturni članovi izvođenja 3 su pronađeni pomešani sa članovima izvođenja 1. Smeše koje sadrže članove izvođenja 3 transformisane su u nekim slučajevima u oličenje 1a ili u mešavine izvođenja 1a i 3e. Izvođenje 7 je izgledalo kao fizički stabilno, ali je izvođenje 2 konvertovano u izvođenje 3e nakon dva dana izlaganja AAC.

Isparavajuća kristalizacija

[0172] Matične tečnosti sačuvane iz eksperimenata ekvilibracije rastvarača izvedenih na sobnoj temperaturi korišćene su za eksperimente sa sporom kristalizacijom u isparavanju. Matične tečnosti su filtrirane da bi se uklonile sve čestice i bile ostavljene da polako ispare pod uslovima okoline. Dobijene čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD i ponovo nakon dva dana izlaganja AAC.

[0173] Zbog slabe rastvorljivosti jedinjenja Pr. 1 u nekim od rastvarača, nisu pronađene čvrste materije kada su korišćeni takvi rastvarači. U eksperimentima gde su čvrste materije bile taložene, amorfni ostatak ili izostrukturni članovi izvođenja 1 ili 3 su dobijeni. Tokom studije stabilnosti, različiti članovi izvođenja 1 su konvertovani u oličenje 1a, dok se činilo da je uzorak iz izvođenja 3 fizički stabilan. Amorfne čvrste materije koje su u nekim slučajevima ostale amorfne nakon studije stabilnosti, postale su tečne ili su pokazivale neke znake kristalnosti.

Kristalizacija hlađenja

[0174] Matične tečnosti eksperimenata za ravnotežu rastvarača izvedenih na 50°C su filtrirane na 50°C da bi se uklonile sve čestice. Suspenzije na 50°C su filtrirane korišćenjem 0,2 µm PTFE filtera, a rastvori su stavljeni na 5°C i ostavljeni da odleže tokom 72 sata. Kada su se čvrste materije taložile tokom starenja, ove čvrste materije su odvojene od tečnosti, osušene pod uslovima okoline i pod vakuumom i analizirane pomoću HT-XRPD. Preostale matične tečnosti su ostavljene da polako ispare, a preostale čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD. Uzorci u kojima nije došlo do precipitacije su stavljeni pod vakuum, a osušene čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD. Sve čvrste materije su zatim izložene AAC (2 dana na 40°C/70% RH) i ponovo analizirane pomoću HT-XRPD.

[0175] Čvrste materije se nisu taložile pri hlađenju u nekim rastvorima, u kojim slučajevima su rastvori upareni pod uslovima okoline. Zbog niske rastvorljivosti jedinjenja Pr. 1 u nekim rastvaračima, iz nekih rastvora nisu dobijene čvrste materije.

[0176] Iz četiri rastvarača (2-propanol, 2-butanon, acetonitril i metanol) došlo je do taloženja. Izvođenje 6 je identifikovano nakon isparavanja jednog eksperimenta kristalizacije sa hlađenjem na skali od mL u 800 µL acetonitrila, koncentracije od 25 mg/mL. Izvođenje 6 je izgledalo kao stabilna čvrsta forma nakon 2 dana AAC, i pojavilo se kao nesolvatovana varijanta.

Hlađenje/isparavanje kristalizacije na µL skali

[0177] Eksperimenti hlađenja/isparavanja kristalizacije u µL skali su izvedeni na ploči sa 96 bunarića, korišćenjem 12 čistih rastvarača i 12 smeša rastvarača i primenom četiri temperaturna profila. U svaki bunarić je dozirano približno 4 mg izvođenja Is. Nakon toga, dodaju se rastvarači za kristalizaciju (80 µL) i mešavine rastvarača da bi se postigla koncentracija od 50 mg/mL, a ploča, sa svakim pojedinačno zapečaćenim bunarićem, naknadno je podvrgnuta jednom od četiri temperaturna profila. Po završetku temperaturnog profila rastvarači su ostavljeni da ispare na niskom ambijentalnom pritisku (24 sata), a preostale čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD pre i posle izlaganja AAC tokom 2 dana (40°C/70% RH).

[0178] Članovi izvođenja 1 i 3 su pronađeni iz većine sistema rastvarača i temperaturnih profila. Međutim, primećena je određena tendencija čvrstog oblika u odnosu na temperaturni profil. Izvođenje 1b je uglavnom identifikovano na osnovu kratkih temperaturnih profila (starenje od 3 sata). Ipak, isti sistemi rastvarača sa dugim vremenima starenja doveli su do identifikacije oblika If, članova izvođenja 3 ili mešavine članova izvođenja 1 i 3. Izvođenje 3c je dobijeno sa 1,4-dioksanom kao rastvaračem za kristalizaciju i temperaturnim profilom od 50°C kao početnom temperaturom, održavanom tokom 60 min, nakon čega je usledilo hlađenje brzinom od 1°C/h do konačne temperature od 20°C, držano tokom 48 h; izvođenje 3d je dobijeno sa tetrahidrofuranom kao rastvaračem za kristalizaciju i istim temperaturnim profilom kao za izvođenje 3c.

[0179] Izvođenje 4 je identifikovano u eksperimentima izvedenim u metanolu/vodi (50/50, v/v), THF i DCM/IPA (50/50, v/v) kada su primenjeni uslovi kratkog starenja. Izvođenje 4 je dobijeno tretiranjem rešenja Is sa mešavinom (50/50) vode i metanola i temperaturnim profilom od 50°C kao početne temperature, održanom tokom 60 min, nakon čega je usledilo hlađenje brzinom od 20°C/h do konačne temperature od 5°C, održane tokom 3 h, što je dalo izvođenje 4 zajedno sa izvođenjem 1b. Izvođenje 4 zajedno sa izvođenjem 1b je takođe dobijeno tretiranjem Is sa mešavinom (50/50) vode i metanola i temperaturnim profilom od 50°C kao početne temperature, održane tokom 60 minuta, nakon čega je usledilo hlađenje brzinom od 20° C/h do krajnje temperature od 20°C, držano tokom 3 h. Izvođenje 4 nije izgledalo kao fizički stabilno u uslovima okoline. Eksperimenti kristalizacije hlađenja dali su izvođenje 1c od etil acetata/1,4-dioksana (50/50, v/v) kao rastvarača za kristalizaciju i temperaturnog profila od 50°C kao početne temperature, održanog tokom 60 min, nakon čega je usledilo hlađenje na brzini od 1°C/h do konačne temperature od 5°C, održavane tokom 48 h; varijanta 1d iz acetonitrila/hloroforma (50/50, v/v) kao rastvarača za kristalizaciju i temperaturnog profila od 50°C kao početne temperature, držane tokom 60 min, nakon čega sledi hlađenje brzinom od 1°C/h do konačne temperature od 5°C, održavane tokom 48 h; i varijanta 1e od etil acetata/1,4-dioksana (50/50, v/v) kao rastvarača za kristalizaciju i temperaturnog profila od 50°C kao početne temperature, držane tokom 60 min, nakon čega sledi hlađenje brzinom od 1°C/h do krajnje temperature od 20°C, održano tokom 48 h.

[0180] Izvođenje 5 je identifikovano u eksperimentima izvedenim u hloroformu kao rastvaraču za kristalizaciju i temperaturnom profilu od 50°C kao početnoj temperaturi, održanoj tokom 60 min, nakon čega je usledilo hlađenje brzinom od 1°C/h do krajnje temperature od 20°C, održano tokom 48 h.

[0181] Slične konverzije su uočene tokom studije stabilnosti kao što je prethodno uočeno u drugim metodama kristalizacije. U većini slučajeva svi čvrsti oblici su pretvoreni u izvođenje 1a ili u smeše koje sadrže izvođenje 1a.

Isparavajuća kristalizacija iz čvrstih smeša

[0182] U evaporativnoj kristalizaciji korišćenjem smeša rastvarač/anti-rastvarač, pripremaju se bistri rastvori jedinjenja iz kojih rastvarač prvo isparava (visok parni pritisak) izazivajući taloženje jedinjenja u određenoj meri u obliku kristala. Ovi kristali tada deluju kao seme kada antirastvarač (niži pritisak pare) ispari.

[0183] Jedinjenje Pr. 1 se nije potpuno rastvorilo u svakom od sistema rastvarača. Iz tog razloga, svi eksperimenti su uključivali filtraciju pre isparavanja.

[0184] Rezultati HT-XRPD analize su pokazali da jedinjenje Pr. 1 kristališe uglavnom kao izvođenje Is nakon isparavanja smeše rastvarača. Ovo je primećeno za sledeće sisteme rastvarač/anti-rastvarač: tetrahidrofuran/voda, acetonitril/voda, hloroform/etanol, metanol/etil acetat, 2-butanon/izopropanol i heptan/aceton. Iz dva sistema, aceton/kumen i 1,4-dioksan/etil format, identifikovana su izostrukturna izvođenja 3b i 3e, koja su nakon AAC konvertovane u različite smeše izvođenja 1a i 3d, odnosno Is i 3e.

Kristalizacija protiv rastvarača

[0185] Zasićeni rastvori jedinjenja Pr. 1 su pripremljeni u čistim rastvaračima. Dodavanja antirastvarača su izvedena u naprednom i obrnutom dodavanju. U prethodnom dodavanju, antirastvarač je dodat u tri alikvota u rastvor jedinjenja. Obrnuto dodavanje je izvedeno dodavanjem zapremine rastvora jedinjenja u veliki višak antirastvarača (20 mL).

[0186] Posle taloženja, čvrste materije su odvojene od tečnosti, osušene pod uslovima okoline i osušene pod vakuumom (5 mbar) pre nego što su analizirane pomoću HT-XRPD. Eksperimenti u kojima nije došlo do precipitacije nakon dodavanja antirastvarača su čuvani na 5°C tokom 48 sati da bi se izazvalo taloženje. Precipitirane čvrste materije su zatim odvojene i analizirane pomoću HT-XRPD. Kada nisu dobijene čvrste materije, rastvori su upareni pod blagim uslovima, a zaostale čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD. Sve čvrste materije su izložene AAC (2 dana na 40°C/70% relativne vlažnosti) i ponovo su analizirane pomoću HT-XRPD.

[0187] Prednja kristalizacija protiv rastvarača je pokazala precipitaciju u svim slučajevima. Sve čvrste materije bi se mogle klasifikovati kao izostrukturni članovi (1s, 1b, 1j, 1f) izvođenja 1 ili izvođenja 3 (3b, 3d, 3f). Nakon izlaganja AAC-u, svi čvrsti uzorci su konvertovani u izvođenje 1a, osim jednog koji je konvertovan u mešavinu izvođenja 1a i 3e.

[0188] Eksperimenti reverzne kristalizacije protiv rastvarača izvedeni u DMSO kao rastvaraču dali su različite čvrste oblike u zavisnosti od korišćenog antirastvarača. Sa dihlorometanom ili p-ksilenom identifikovani su izostrukturni članovi (1s i 1b) izvođenja 1, dok je sa MTBE dobijen amorfni ostatak. Uparavanje dva rastvora sa heptanom i vodom kao antirastvaračima koji nisu precipitirali nakon dodavanja antirastvarača dovelo je do ulja. Konverzije u izvođenje 1a su primećene posle AAC, a amorfni ostaci su postali delikvescentni.

Eksperimenti vruće filtracije

[0189] Eksperimenti kristalizacije hlađenja sa vrućom filtracijom izvedeni su iz prezasićenih rastvora jedinjenja Pr. 1 pripremljenog na 50°C u različitim smešama rastvarača. Vrući filtrirani rastvori su prošli 48-časovni profil hlađenja. Bočice u kojima su se čvrste materije istaložile nakon temperaturnog profila su centrifugirane i čvrste materije su odvojene od tečnosti i analizirane pomoću HT-XRPD (nakon sušenja pod vakuumom). Ukoliko se nije istaložila čvrsta supstanca, rastvori su upareni pod vakuumom i čvrste materije su analizirane pomoću HT-XRPD. Sve čvrste materije su izložene AAC (2 dana na 40°C/70% RH) i ponovo analizirane pomoću HT-XRPD. U polovini eksperimenata sa toplom filtracijom nije došlo do precipitacije i nakon isparavanja rastvarača nije prikupljeno dovoljno čvrstih materija zbog slabe rastvorljivosti jedinjenja Pr. 1 u tim sistemima rastvarača. U tri eksperimenta, dobijen je amorfni ostatak koji se nakon AAC kristalizovao u mešavinu članova izvođenja 1 (1s ili 1a) i 3 (3e) ili je postao delikvescentan. Izvođenje 5 je identifikovano iz eksperimenta u aceton/hloroformu (50/50, v/v). Činilo se da je ovo izvođenje fizički nestabilno pošto je konverzija u izvođenje 1a primećena nakon AAC.

Eksperimenti termocikliranja

[0190] Suspenzije od oko 6 mg izvođenja Is su pripremljene u 10 rastvarača na sobnoj temperaturi. Suspenzije su bile smenjivane između 5°C i 50°C. Po završetku termocikliranja, čvrste materije su odvojene centrifugiranjem i osušene u uslovima ambijenta i pod vakuumom (5 mbar) pre nego što su analizirane pomoću HT-XRPD. Nakon toga, sve čvrste materije su bile izložene AAC tokom dva dana i ponovo analizirane pomoću HT-XRPD. Eksperimenti termocikliranja obično promovišu formiranje stabilnijeg polimorfnog oblika. Sa izuzetkom eksperimenta izvedenog u cikloheksanonu, sve bočice su sadržale čvrste materije nakon termo profila. Rastvor cikloheksanona je polako uparen pod blagim vakuumom. Članovi izvođenja 1, 3 ili njihove mešavine identifikovani su uglavnom u vlažnim čvrstim materijama. Nakon sušenja ovih čvrstih materija, primećena je konverzija u izvođenju Is. Izvođenja 3b i 3e su dobijena termocikliranjem u 300 µL cikloheksanona u koncentraciji od 51 mg/mL (3b) i u 400 µL izobutanola u koncentraciji od 37,3 mg/mL (3e). Izvođenje 5 je dobijeno termocikliranjem u 800 µL hloroforma u koncentraciji od 18,6 mg/mL.

[0191] Slike 3, 4 i 5 prikazuju preklapanje HT-XRPD obrazaca za izvođenja navedena u Tabeli 2, koja se takođe pominju u pregledima opisanim iznad.

[0192] Izvođenje Is je dobijeno iz većine eksperimenata kristalizacije. To je kanalni hidrat koji ima promenljiv broj molekula vode i/ili drugih rastvarača ugrađenih u zavisnosti od uslova okoline. Uočena je konverzija u izvođenju 1a. Ovaj oblik je sadržao nešto više vode (1,3 molekula vode). Svi izostrukturni članovi izvođenja 1 su konvertovani u izvođenje 1a nakon izlaganja 40°C i 75% RH tokom dva dana. Pomeranja nekih difrakcionih pikova u XRPD obrascima za članove izvođenja 1 mogu se pripisati različitim molekulima rastvarača ili vode koji su ugrađeni u kristalnu rešetku. Slika 4 prikazuje preklapanje HT-XRPD šablona za članove izvođenja 1. Difraktogram Is odgovara jedinjenju Pr. 1 kao početni materijal u obliku izvođenja Is. Difraktogram 1a odgovara izvođenju 1a koje je dobijeno nakon izlaganja AAC nekoliko uzoraka iz izvođenja Is. Difraktogram 1b odgovara izvođenju 1b koje je dobijeno eksperimentom ekvilibracije rastvarača na sobnoj temperaturi u toluenu. Difraktogram 1c odgovara izvođenju 1c koje je dobijeno iz eksperimenta kristalizacije hlađenja u mL skali u etil acetat/1,4-dioksanu (50/50, v/v). Difraktogram 1c odgovara izvođenju 1d koje je dobijeno iz eksperimenta kristalizacije hlađenja u mL skali u acetonitrilu/hloroformu (50/50, v/v). Difraktogram 1e odgovara izvođenju 1e koje je dobijeno eksperimentom kristalizacije hlađenja na skali od mL u etil acetat/1,4-dioksanu (50/50, v/v). Difraktogram If odgovara izvođenju If koje je dobijeno iz eksperimenta ekvilibracije rastvarača na sobnoj temperaturi u p-ksilenu. Difraktogram 1g odgovara izvođenju 1g koje je dobijeno eksperimentom ekvilibracije rastvarača na 50°C u anizolu. Difraktogram 1h odgovara izvođenju 1h koje je dobijeno eksperimentom kristalizacije hlađenja u mL skali u p-ksilenu.

[0193] Difraktogrami za članove izvođenja 3 su prikazani na slici 5. Pomeranja primećena u različitim HT-XRPD obrascima se najverovatnije pripisuju različitim molekulima rastvarača koji su ugrađeni u kristalnu rešetku. Izvođenje 3 je dobijeno zagrevanjem varijante 2 na 40 °C na 70% RH tokom 4 dana. Izvođenja 3b do 3e su bili rastvoreni oblici koji sadrže nestehiometrijsku količinu rastvarača koja je varirala u zavisnosti od rastvarača ugrađenog u kristalnu strukturu (0,3-0,7 molekula). Mešavine koje sadrže članove iz izvođenja 3 bile su nestabilne nakon izlaganja AAC-u i transformisale su se u nekim slučajevima u izvođenje 1a ili u mešavine izvođenja 1a i 3e. Konverzija u izvođenje 1a se pripisuje razmeni molekula rastvarača molekulima vode nakon izlaganja visokoj relativnoj vlažnosti i rekristalizaciji u hidratizovanom izvođenju 1a.

[0194] Izvođenje 9 je dobijeno zagrevanjem izvođenja 2 do temperature od oko 200 °C praćeno hlađenjem na 25 °C i takođe cikličnim DSC 25-200-25-300 °C.

[0195] Izvođenje 8 je dobijeno zagrevanjem izvođenja 5 na temperaturi od oko 175 °C.

[0196] Izvođenja ovog pronalaska uključuju jedinjenje Pr. 1 u najmanje jednom od oblika Is, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g, 1h, 2, 3b, 3c, 3d, 3e, 5, 6, 7, 8, 9 i 10. Izvođenja ovog pronalaska obuhvataju jedinjenja prema ovom pronalasku u obliku farmaceutski prihvatljivih ko-kristala.

[0197] Primeri 1-12 su JAK inhibitori i testirani su u enzimskim i ćelijskim testovima. Rezultati enzimskog testa su predstavljeni u Tabeli 4 koja nosi naslov ”Rezultati testova enzimske inhibicije”. Primeri 1-12 su takođe testirani u tri ćelijska testa: IL-2 pSTAT5 (JAK1/JAK3), IFNα pSTAT4 (JAK1/TIK2) i GM-CSF pSTAT5 (JAK2/JAK2) sa rezultatima predstavljenim u Tabeli 5 pod nazivom “Podaci o testu zasnovani na ćelijama”. Ispod je opis načina na koji je enzimski test izveden uključujući materijale koji su korišćeni u testu (pod naslovom “Materijali”), kako je test postavljen (pod naslovom “Protokol analize”) i metoda koji se koristi za analizu podataka (pod naslovom “Metoda masene spektrometrije visoke propusnosti (HTMS)”).

Enzimski test inhibicije

Materijali

[0198] Supstrat (NH2-KGGEEEEYFELVKK-CO2), interni standardni peptid (NH2-SWGAIETDKEYYTVKD-CO2) i peptid proizvoda (samo za standardnu krivu) (NH2-KGGEEEEY-Pi-FELVKK-CO2),, kupljeni su od AnaSpec (Fremont, CA, USA). JAK1-JH1JH2 (574-1154 with a His-GST Tag and a C-terminal tev (ENLYFQ-G) cleavage site), JAK3-JH1JH2 (512-1124 with a GST Tag and a C-terminal tev (ENLYFQ-G) cleavage site), and Tyk2-JH1JH2 (8H_tev_580-1182-C936A-C1142A with a C-terminal tev (ENLYFQ-G) cleavage site) prečišćeni su iznutra. JAK2-JH1JH2 (532-1132 with a GST tag and C-terminal tev (ENLYFQ-G) cleavage site), kupljeni su od Invitrogen-a. LC/MS voda i acetonitril (ACN), kupljeni su od HoneyWell, Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA). Dimetilsulfoksid 99,8% (DMSO) i trifluorosirćetna kiselina 99,5% (TFA) kupljeni su od from EMD Chemical (Gibbstown, NJ, USA). Adenozin trifosfat (ATP), 4-morfolinpropansulfonska kiselina (MOPS), magnezijum hlorid (MgCl2), etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), ditiotreitol (DTT), mravlja kiselina >95% (FA) i Tween-20 kupljeni su od Sigma (St Louis, MO, USA). Polipropilenske ploče sa 384 bunara, Cat#781280 kupljene su od Greinera (Monroe, NC), RapidFireTM kertridž A C4 Column (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

[0199] HTMS eksperimenti su izvedeni u režimu pozitivne jonizacije na RapidFire 300 instrumentu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), u kombinaciji sa ABSiex QTrap 4000 sistemom sa elektrosprej jonizacionim izvorom (RF-MS) (Concord, ON, Canada). RapidFire sistem je radio sa 3 izokratične pumpe Agilent 1200 serije Agilent Technologies (Santa Clara, CA) i jednom peristaltičkom pumpom modela ISM832C iz Ismatec-a (Wertheim, Germany). Ceo sistem je funkcionisao korišćenjem softvera RapidFire koji je bio povezan sa softverom Analyst za maseni spektrometar.

Protokol analize

[0200] Serija doziranja od 11 tačaka je napravljena za svako jedinjenje serijskim razblaživanjem 1:3 ili 1:4 u DMSO, pri čemu je tačka 12 DMSO kontrola. Sa ploča za serijsko razblaživanje, uzorak je prebačen na ploču za analizu sa 384 bunarića (#781280, Greiner, Monroe, NC) korišćenjem Labcyte Echo (Sunnyvale, CA) ili Biosero ATS (San Diego, CA). Jedinjenja su testirana u duplikatu. Kolona 12 je korišćena za pozitivne kontrole, a kolona 24 je sadržala negativne kontrole bez dodavanja enzima. Jedinjenje iz naše interne kolekcije, sa inhibitornom aktivnošću za JAK izoforme, korišćeno je kao referentno jedinjenje. Konačna koncentracija DMSO je bila ≤0,25% u reakciji od 20 µL. Uslovi ispitivanja za svaki od proteina su rezimirani u Tabeli 3. Enzimska reakcija je započeta dodavanjem 10 mL mešavine enzima i ATP u 10 µL rastvora supstrata pripremljenog u reakcionom puferu (50 mM MOPS pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,002% Tveen-20). Enzim Tyk2 je prethodno inkubiran sa 2 mM ATP-a tokom 30 minuta pre početka reakcije. Odmah nakon dodavanja enzima u reakcionu smešu, ploča je centrifugirana na 1000 rpm tokom 1 minuta i inkubirana na 25 °C tokom 45 minuta za JAK3 i 90 minuta za JAK1, JAK2 i Tyk2. Reakcija je ugašena dodavanjem 20 µL 0,5 % TFA koji sadrži 0,15 µM internog standardnog peptida korišćenjem Multidrop Combi dozatora reagensa (Thermo Scientific, Waltham, MA). Nekoliko bunarića u koloni 24 je tipično korišćeno za standardnu krivu proizvoda. Nakon gašenja, ploča za analizu je centrifugirana na 3000 rpm tokom 3 minuta i zapečaćena aluminijumskom folijom koja se može probiti (Cat# 06644-001, Agilent) korišćenjem PlateLoc (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Ploče su zatim prebačene u RapidFire za MS analizu. Inhibicija jedinjenja je procenjena smanjenjem nivoa fosforilisanog proizvoda u bunarićima za uzorke u poređenju sa neinhibiranom enzimskom reakcijom. Uslovi testa za gornje testove su prikazani u Tabeli 3, a rezultati Pr. 1 – 12, kako je testirano u ovim testovima, prikazani su u Tabeli 4.

Tabela 3. Uslovi ispitivanja za testove enzima porodice JAK<∗>

Metoda masene spektrometrije velike propusnosti (HTMS)

[0201] Analiza uzorka na RapidFire-u je izvedena korišćenjem mobilne faze A1 koja se sastoji od Voda/TFA/FA (100:0,01:0,1, v/v/v), mobilne faze B1 koja se sastoji od ACN/Voda/TFA/FA (80:20:0,01:0,1, v/v/v). Korišćeni su sledeći parametri rada: stanje 1 (aspiracija), 250 ms; stanje 2 (učitavanje/pranje), 3000 ms; stanje 3 (eluiranje), 4000 ms; stanje 4 (reekvilibracija), 1000 ms sa brzinom protoka od 1,25 mL/min. Uzorci su aspirirani direktno sa ploče za ispitivanje sa 384 bunarića i isporučeni na RF-MS mikroskalni kartridž za ekstrakciju C4 čvrste faze (Tip A). Neželjena komponenta kao što su so, kofaktor, deterdžent i veliki protein su isprani, a zadržani analiti (supstrat, proizvod i IS) su koeluirani direktno na ABSiex Qtrap 4000 sistem. Kvantifikacija peptida (supstrata), fosfopeptida (proizvoda) i internog standardnog peptida (IS) izvršena je pomoću MRM koristeći prelaze 562→ 136,0, 589,2 → 215,7 i 953,2→ 158,8 (ili 974,2 → 158,8) redom.

Tabela 4. Rezultati testova enzimske inhibicije

Ćelijski testovi

IL-2 pSTAT5 (JAK1/JAK3) ćelijski test

[0202] AlphaLISA test (zasnovan na Alpha Tehnologiji kompanije PerkinElmer) je izveden tako što je prvo nanošenje sveže odmrznutih PBMCs (Biological Specialty Corporation) u ploče sa 384 bunarića na 30.000 ćelija po 4 µL po bunariću u HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) koji sadrži 0,1% BSA bez IgG (imunoglobulina G), bez proteaze (bovine serum albumin) (Jackson ImmunoResearch Cat. No. 001-000-161). Ćelije su zatim tretirane sa 2 µL/bunariću jedinjenja razblaženih u DMSO na half-log titirisanoj koncentraciji, sa najvišom test koncentracijom od 10 µM i 0,5% konačne koncentracije DMSO, tokom trideset minuta na 37 °C. Zatim su ćelije stimulisane sa 2 µL/bunariću IL-2 (R&D Sistems Cat. No. 202-IL-050) pri 5 ng/mL tokom trideset minuta na 37 °C. Ćelijske reakcije su prekinute dodavanjem 2 µL/bunariću pufera za lizu (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST5-A10K) nakon čega je usledila inkubacija od pet minuta na sobnoj temperaturi. 5 µL/bunariću mešavine akceptora (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST5-A10K) je dodato ćelijama i inkubirano u mraku jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je ćelijama dodato 5 µL/bunariću mešavine donora (PerkinElmer Cat. No. ALSU~PST5~A10K) i inkubirano u mraku preko noći na sobnoj temperaturi. Konačno, ploče su očitane na PerkinElmer EnVision za detekciju fluorescentnog signala koji je vremenski razrešen. Procenat inhibicije pSTAT5 zavisne od IL-2 određen je na test koncentracijama jedinjenja; i za svako jedinjenje je generisana kriva doze i izračunat je IC50. IC50jedinjenja je izračunat nelinearnom regresijom, sigmoidnom analizom odgovora na dozu half-log titracione krive razblažene koncentracije jedinjenja u odnosu na Alfa signal. Skraćenica "Alpha" je skraćenica za homogeni test pojačane luminescentne blizine; Alfa signal je luminescentni/fluorescentni signal.

IFNα pSTAT4 (JAK1/TYK2) ćelijski test

[0203] AlphaLISA test (zasnovan na Alpha Tehnologiji kompanije PerkinElmer) je izveden tako što je prvo nanošenje sveže odmrznutih PBMC (Biological Specialty Corporation) u ploče sa 384 bunarića na 100.000 ćelija po 6 µL po bunarčiću u DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) koji sadrži 10% FBS (fetal bovine serum) i 1.000 I.U./mL penicilina i 1.000 mg/µL streptomicina. Ćelije su zatim tretirane sa 2 µL/bunariću jedinjenja razblaženih u DMSO na half-log titirisanoj koncentraciji, sa najvišom test koncentracijom od 10 µM i 0,5% konačne koncentracije DMSO, tokom trideset minuta na 37 °C. Zatim su ćelije stimulisane sa 2 µL/bunariću IFNα (PBL Assay Science Cat. No.

11101-2) pri 4 ng/mL tokom trideset minuta na 37 °C. Ćelijske reakcije su prekinute dodavanjem 2 µL/bunariću pufera za lizu (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST4- A10K) nakon čega je usledila inkubacija od pet minuta na sobnoj temperaturi. 4 µL/bunariću mešavine akceptora (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST4-A10K) je dodato ćelijama i inkubirano u mraku jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je ćelijama dodato 4 µL/bunariću mešavine donatora (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST4-A10K) i inkubirano u mraku preko noći na sobnoj temperaturi. Konačno, ploče su očitane na PerkinElmer EnVision za detekciju vremenski razrešenog fluorescentnog signala. Procenat inhibicije pSTAT4 zavisne od IFNα određen je na testnim koncentracijama jedinjenja; i za svako jedinjenje je generisana kriva doze i izračunat je IC50. IC50jedinjenja je izračunat nelinearnom regresijom, sigmoidnom analizom odgovora na dozu half-log titracione krive razblažene koncentracije jedinjenja u odnosu na Alfa signal. Termin "Alfa" je definisan u opisu ćelijskog testa koji je neposredno prethodio.

GM-CSF pSTAT5 (JAK2/JAK2) ćelijski test

[0204] AlphaLISA test (zasnovan na Alpha Tehnologiji kompanije PerkinElmer) je izveden tako što je prvo nanošenje sveže odmrznutih PBMC (Biological Specialty Corporation) u ploče sa 384 bunarića na 30.000 ćelija po 4 µL po bunariću u HBSS koji sadrži 0,1% IgG-free, BSA bez proteaze (Jackson ImmunoResearch Cat. No. 001-000-161). Ćelije su zatim tretirane sa 2 µL/bunariću jedinjenja razblaženih u DMSO na half-log titirisanom koncentracijom, sa najvišom test koncentracijom od 10 µM i 0,5% konačne koncentracije DMSO, tokom trideset minuta na 37 °C. Zatim su ćelije stimulisane sa 2 µL/bunariću GM-CSF (R&D Systems Cat. No. 215-GM-050) pri 11 pg/mL tokom 15 minuta na 37 °C. Ćelijske reakcije su prekinute dodavanjem 2 µL/bunariću pufera za lizu (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST5-A10K) nakon čega je usledila inkubacija od pet minuta na sobnoj temperaturi. 5 µL/bunariću mešavine akceptora (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST5-A10K) je dodato ćelijama i inkubirano u mraku jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je ćelijama dodato 5 µL/bunariću mešavine donora (PerkinElmer Cat. No. ALSU-PST5-A10K) i inkubirano u mraku preko noći na sobnoj temperaturi. Konačno, ploče su očitane na PerkinElmer EnVision za detekciju vremenski razrešenog fluorescentnog signala. Procenat inhibicije pSTAT5 zavisne od GM-CSF je određen na test koncentracijama jedinjenja; i za svako jedinjenje je generisana kriva doze i izračunat je ICso. ICso jedinjenja je izračunaa nelinearnom regresijom, sigmoidnom analizom odgovora na dozu half-log titracione krive razblažene koncentracije jedinjenja u odnosu na Alfa signal. Termin "Alfa" je definisan u opisu ćelijskog testa IL-2 pSTAT5 (JAK1/JAK3).

Tabela 5. Podaci o testu na osnovu ćelija

[0205] Primeri 1-12 su testirani u testovima rastvorljivosti i permeabilnosti. Rezultati testa rastvorljivosti su predstavljeni u Tabeli 6 koja nosi naziv “Podaci o ispitivanju rastvorljivosti”, a rezultati testa permeabilnosti su predstavljeni u Tabeli 7 pod nazivom “MDCK-MDR1 Podaci o permeabilnosti”. Ovi testovi rastvorljivosti i permeabilnosti su opisani u nastavku pod naslovima “Testovi rastvorljivosti” i “Testovi propustljivosti”, redom.

Testovi rastvorljivosti

[0206] Merenja rastvorljivosti su sprovedena u sledećim medijima rastvorljivosti: Simulirani želudac (34,2 mM natrijum hlorida i 100 mM hlorovodonične kiseline) ili simulirane crevne tečnosti (natašteno stanje [pH 6,5]: 3 mM natrijum tauroholata, 0,75 mM lecitina, 28,4 mM monobaznog natrijum fosfata, 8,7 mM natrijum hidroksida i 105,9 mM natrijum hlorida). Test jedinjenja su rastvorena u DMSO u koncentraciji od 10 mM. Ispitivana jedinjenja su raspoređena (20 mL) u Nunc 1-mL-96-Deep-Well-PP ploče, a DMSO je uparen duvanjem azotom iz TurboVap 96 tokom 6 sati ili dok se nije proizveo suv ostatak. Zatim je 400 µL medijuma za rastvorljivost dodato u bunarić koji sadrži suvu čvrstu supstancu. Pre-Slit Poklopac bunarića je bezbedno postavljen preko bloka ploče bunarića, a uzorci su snažno mešani 2-5 dana na temperaturi okoline. Nakon perioda inkubacije, uzorci su filtrirani kroz AcroPrep 1-mL-96-Filter ploču u novu 2-mL-96-Deep-Well-PP ploču, a supernatanti su kvantifikovani pomoću UV-HPLC koristeći kalibraciju u 3 tačke u rasponu od 0,004-0,55 mM. Rastvorljivost za svako jedinjenje je izračunata iz sledeće jednačine:

[0207] Vrednosti rastvorljivosti su bile u opsegu od 4 - 400 µM. Vrednosti izvan ovog opsega prijavljene su kao < 4 µM ili > 400 µM. Rastvorljivosti su prijavljene sve dok je jedinjenje koje se proučava bilo dovoljno stabilno da završi odgovarajuće određivanje rastvorljivosti.

Tabela 6. Podaci o testu rastvorljivosti

Ispitivanja permeabilnosti

[0208] Merenje permeabilnosti je sprovedeno prema Cyprotex protokolu korišćenjem ćelijske linije MDCK-MDR1 dobijene od NIH (Rockville, MD, USA). Ćelije između prolaznih brojeva 6-30 zasejane su na Multiscreen plate<TM>(Millipore) pri gustini ćelija od 3,4 x 10<5>ćelija/cm<2>i kultivisane tri dana pre nego što su studije permeabilnosti sprovedene. Ćelije u ovom testu formiraju kohezivni sloj od jednog ćelijskog sloja koji ispunjava površinu posude za kulturu, takođe poznat kao konfluentni monosloj, a četvrtog dana test jedinjenje je dodato na apikalnu stranu membrane, a transport jedinjenja preko monosloja je praćen tokom vremenskog perioda od 60 min.

[0209] Na jednostavan i osnovni način uvođenja termina "A" i "B" koji se često koriste u ovim testovima, apikalna ("A") strana ili odeljak entiteta je strana takvog entiteta koja je izložena lumenu ili spoljašnjem okruženju, dok je bazolateralna („B“) strana ili odeljak strana ili odeljak takvog entiteta koji je izložen tipično unutrašnjem okruženju, obuhvatajući suprotnu stranu. Na primer, kada je takav entitet ilustrativno ćelija crevnog epitela, apikalna strana takve crevne ćelije bi bila strana ćelije koja je izložena lumenu creva, dok bi bazolateralna strana bila strana koja je izložena krvi.

[0210] Test jedinjenja su rastvorena u DMSO u koncentraciji od 10 mM. Rastvori za doziranje su pripremljeni razblaživanjem test jedinjenja sa puferom za ispitivanje (Hanks Balanced Salt Solution), pH 7,4, u konačnoj koncentraciji od 5 µM. Za procenu apikalne prema bazolateralnoj ("A-B") permeabilnosti, pufer je uklonjen iz apikalnog odeljka i zamenjen rastvorom za doziranje test jedinjenja sa ili bez glikoproteina permeabilnosti ("PgP", "P-gP", "Pgp" ili "P-gp") inhibitora elakridar (2 µM). Za procenu bazolateralne i apikalne ("B-A") permeabilnosti, pufer je uklonjen sa prateće ploče i zamenjen rastvorom za doziranje test jedinjenja. Inkubacije su izvedene u duplikatu na 37 °C u atmosferi od 5% CO2sa relativnom vlažnošću od 95%. Svaka analiza je uključivala referentne markere propranolola (visoka permeabilnost) i prazosina (PgP supstrat). Posle inkubacije od 60 minuta, apikalni i bazolateralni uzorci su korišćeni. Nakon inkubacije od 60 minuta, apikalni i bazolateralni uzorci su razblaženi i test jedinjenja su kvantifikovana pomoću LC/MS/MS koristeći kalibraciju u 8 tačaka u opsegu od 0,0039 do 3 µM sa odgovarajućim razblaženjem uzoraka (faktor razblaženja primaoca = 1; donator i C0faktor razblaženja = 10). Koeficijent permeabilnosti (Papp) za svako jedinjenje je izračunat iz sledeće jednačine: Papp= (dQ/dt) / (C0 x S), pri čemu je dQ/dt brzina prodiranja leka kroz ćelije, C0je donator koncentracija odeljka u nultom vremenu, a S je površina monosloja ćelije.

[0211] Procenat oporavka je meren za sve uslove inkubacije. Ova merenja nisu otkrila neprihvatljivo vezivanje jedinjenja/ploče ili akumulaciju jedinjenja u ćelijskom monosloju.

[0212] Druga i treća kolona u Tabeli 7 pokazuju vrednosti Papp(A-B)za apikalni-bazolateralni transport jedinjenja bez (druga kolona) i sa P-gp inhibitorom (treća kolona, označena kao<Pe>

app(A-B)) koji je bio elakridar. Papp(A-B)daje indikaciju obima permeacije kroz ćelije u ovom testu, koji je predviđen za modeliranje transcelularnog transporta kroz ćelije koje eksprimiraju Pgp, kao što su ćelije gastrointestinalnog trakta koje eksprimiraju Pgp. Vrednosti P<e>app(A-B)(Papp(A-B)u prisustvu inhibitora P-gp) date u koloni 3 su određene da bi se potvrdila uloga P-gp u efluksu jedinjenja. Četvrta kolona u Tabeli 7 prikazuje vrednosti Papp(B-A)za bazolateralno-apikalni transport jedinjenja. Odnosi efluksa ispitivanog jedinjenja su dati u petoj koloni Tabele 7 kao Papp(B-A)/ Papp(A-B)korišćenjem odgovarajućih vrednosti koeficijenta permeabilnosti iz četvrte i druge kolone u istoj tabeli. Odnosi efluksa (peta kolona, Tabela 7) su konstantno veći od 2 za jedinjenja (A) - (C) kao i za jedinjenja Pr. 1-12, što ukazuje da se efluks jedinjenja javlja za sva takva jedinjenja.

[0213] Papp(A-B)vrednosti u koloni 2 su generalno niske i uporedive za referentna jedinjenja (A) - (C) i takođe za jedinjenja Pr. 1-12. Ove niske vrednosti ukazuju na nisku permeabilnost za sva takva jedinjenja, što je posledica efekata P-gp pošto su sva takva jedinjenja supstrati P-gp, kao što je naznačeno vrednostima datim u koloni 5 koje su sve veće od 2. Da se okarakteriše kao da imaju nizak nivo permeabilnost, vrednosti date u trećoj i četvrtoj koloni za P<e>app(A-B)i Papp(B-A), redom, treba da budu niske. Međutim, ovi podaci pokazuju da su vrednosti Papp(B-A)za jedinjenja (A) -(C) veće od odgovarajućih vrednosti jedinjenja Pr. 1-12.

[0214] Integritet svakog monosloja je praćen ispitivanjem permeacije lucifer žute fluorimetrijskom analizom. Ovo ispitivanje je otkrilo da ćelije u ovom testu održavaju zadovoljavajući konfluentni monosloj.

Tabela 7. Podaci o permeabilnosti MDCK-MDR1

In vivo studije

Oralno doziranje - Protokol 1

[0215] Tri neizgladnjivane ženke C57BL/6 miševa dobile su oralno test jedinjenje u dozi od 25 mg/kg p.o. kao rastvor u 20% hidroksipropil-beta-ciklodekstrinu (HPβCD) u zapremini doze od 5 mL/kg. Uzorci krvi su sakupljeni 0,5, 2 i 4 h nakon doze putem retroorbitalnog krvarenja ili venepunkcije dorzalne metatarzalne vene. Uzorci krvi su sakupljeni u epruvete koje sadrže antikoagulans (Heparin-Na) i stavljene na vlažni led. Frakcija plazme je odvojena centrifugiranjem i zamrznuta na -20 °C do 4 h i -80 °C nakon 4 h osim ako nije analizirana ubrzo nakon uzimanja uzorka. Uzorci debelog creva su sakupljeni 4 h nakon doze. Od početka cekuma seciran je uzorak debelog creva od 4 - 6 cm, presečen po uzdužnoj osi, a čvrsti sadržaj uklonjen ispiranjem sa 2 mL fiziološkog rastvora. Debelo crevo je dalje isprano stavljanjem u 5 mL fiziološkog rastvora i mućkano tokom 5 sekundi. Uzorak debelog creva je zatim osušen tapkanjem, izmeren i homogenizovan kao 1 deo tkiva (g) do 4 dela HPLC vode (mL). Koncentracije jedinjenja u plazmi i homogenatu debelog creva su određene korišćenjem metode kvalifikovane tečne hromatografije-trostruke kvadrupolne masene spektrometrije (LC-MS/MS). Ovaj protokol je korišćen za procenu sledećih test jedinjenja: Jedinjenja (B) i (C) i Primera 6 i 11.

Oralno doziranje - Protokol 2

[0216] Tri neizgladnjivane ženke C57BL/6 miševa dobile su oralno test jedinjenje u dozi od 25 mg/kg p.o. kao rastvor u 20% HPbCD u zapremini doze od 5 mL/kg. Uzorci krvi su sakupljeni 0,5, 2 i 4 h nakon doze putem retroorbitalnog krvarenja ili dorzalne metatarzalne vene. Uzorci krvi su sakupljeni u epruvete koje sadrže antikoagulans (Heparin-Na) i stavljene na vlažni led. Frakcija plazme je odvojena centrifugiranjem i zamrznuta na -20 °C do 4 h i -80 °C nakon 4 h osim ako nije analizirana ubrzo nakon uzimanja uzorka. Uzorci debelog creva su sakupljeni 4 h nakon doze. Od 2 cm ispod cekuma, uzorak debelog creva od 4 cm je seciran, presečen po uzdužnoj osi, a čvrsti sadržaj uklonjen ispiranjem sa 2 mL fiziološkog rastvora. Debelo crevo je dalje isprano stavljanjem u 5 mL fiziološkog rastvora i mućkano tokom 5 sekundi. Uzorak debelog creva je zatim osušen, izmeren i homogenizovan kao 1 deo tkiva (g) do 4 dela HPLC vode (mL). Koncentracije jedinjenja u plazmi i homogenatu debelog creva su određene korišćenjem metode kvalifikovane tečne hromatografije-trostruke kvadrupolne masene spektrometrije (LC-MS/MS). Ovaj protokol je korišćen za procenu sledećih test jedinjenja: Jedinjenje (A) i Primere 1 do 5, 7 do 10 i 12.

IC doziranje-Protokol 3

[0217] Grupa za intrakolonsku (IC) dozu: Nakon anestezije sa izofluranom inhalacijom, tri neizgladnjivane ženke C57BL/6 miševa dobile su jedinjenje intrakolonski kroz mali rez na abdominalnom zidu pomoću šprica i igle u dozi od 5 mg /kg kao rastvor u 20% HPbCD pri zapremini doze od 1 mL/kg. Uzorci krvi su sakupljeni 0,5, 2 i 4 h nakon doze putem retroorbitalnog krvarenja. Uzorci krvi su sakupljeni u epruvete koje sadrže antikoagulans (Heparin-Na) i stavljene na vlažni led. Frakcija plazme je odvojena centrifugiranjem i zamrznuta na -20 °C do 4 h i -80 °C nakon 4 h osim ako nije analizirana ubrzo nakon uzimanja uzorka. Uzorci debelog creva su sakupljeni 4 h nakon doze. Od 2 cm ispod cekuma, uzorak debelog creva od 4 cm je seciran, presečen po uzdužnoj osi, a čvrsti sadržaj uklonjen ispiranjem sa 2 mL fiziološkog rastvora. Debelo crevo je dalje isprano stavljanjem u 5 mL fiziološkog rastvora i mućkano tokom 5 sekundi. Uzorak debelog creva je zatim osušen, izmeren i homogenizovan kao 1 deo tkiva (g) do 4 dela HPLC vode (mL). Koncentracije jedinjenja u plazmi i homogenatu debelog creva su određene korišćenjem metode kvalifikovane tečne hromatografije-trostruke kvadrupolne masene spektrometrije (LC-MS/MS). Ovaj protokol je korišćen za procenu IC doziranja sledećih test jedinjenja: Primera 1, 3 i 4.

[0218] Jedinjenja Pr. 1 - 12 su dalje okarakterisana fizičko-hemijskim osobinama datim u Tabeli 8. Vrednosti cLogP i tPSA su izračunate korišćenjem ChemBioDraw Ultra 14.0, gde je P koeficijent raspodele noktanol - voda. Ukupna polarna površina (tPSA) se izračunava kao površinski zbir svih polarnih atoma, prvenstveno kiseonika i azota, uključujući i njihove vezane vodonike.

Tabela 8. Neka fizičko-hemijska svojstva jedinjenja Pr. 1 - 12

Claims

Patentni zahtevi:

1. Jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciklopropil metil)acetamid;

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamid;

N-(4-(cijanometil)biciklo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5 -d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamid;

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciklopropilmetil)acetamid;

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamid; i

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklobutil)metil)acetamid i

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije,

opciono pri čemu je pomenuto jedinjenje:

(a) 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)- N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamido; ili

(b)2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il ) cikloheksil)acetonitril; ili

(c) 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)- N-((1-hidroksiciklobutil)metil)acetamid.

5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroksiciklobutil)metil)acetamid; i

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije,

Opciono pri čemu se pomenuto jedinjenje bira između:

(a) grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-( 2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid;

2-((1r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)cikloheksil) acetonitril; i

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije; ili

(b) grupe koju čine

2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-( (1-hidroksiciklopropil)metil)acetamid; i

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije; ili

(c) grupe koju čine

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije.

10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

njihovi farmaceutski prihvatljivi ko-kristali.

11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 10, izabrano iz grupe koju čine

njihovi farmaceutski prihvatljivi ko-kristali.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog jedinjenja prema patentnom zahtevu 1.

13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

farmaceutski prihvatljive soli i njihove kombinacije,

opciono pri čemu je pomenuto jedinjenje:

(a) 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)- N-(2-hidroksi-2-metilpropil)acetamid; ili

(c) 2-(1-((1r,4r)-4-(cijanometil)cikloheksil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirolo[2,3-b]piridin-2-il)- N-((1-hidroksiciklopropil)metil)acetamid.