RS62295B1

RS62295B1 - Farmaceutskе kompozicijе kojе sadržе insulin

Info

Publication number: RS62295B1
Application number: RS20211060A
Authority: RS
Inventors: Mathias Norrman; Susanne Hostrup; Dorte Bjerre Steensgaard; Holger Martin Strauss; Rosa Rebecca Erritzøe Hansen; Svend Havelund; Morten Schlein; Jesper Søndergaard Pedersen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2021-09-30
Also published as: PE20191205A1; ZA201903425B; TW202003017A; WO2018109162A1; HUE055231T2; MA49116A; RS63773B1; CO2019006017A2; CA3046583A1; MX2021002083A; PH12019501363A1; DK3554534T3; TWI700091B; US10265385B2; US20240424064A1; HRP20221324T1; EP3821905B1; EP3554534A1; PL3821905T3; US20220202909A1

Description

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak je u oblasti farmaceutskih kompozicija za lečenje medicinskih stanja koja se odnose na dijabetes. Konkretnije, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže dugodelujući acilovani derivat analoga humanog insulina, i medicinsku upotrebu takvih kompozicija za terapiju davanjem bazalnog insulina.

STANJE TEHNIKE

Primarni cilј insulinske terapije u lečenju metaboličkih poremećaja je stvaranje održive skoro normalne glikemije zamenom ili dopunom endogene sekrecije insulina na što je moguće fiziološkiji način, posle obroka, kao i između obroka i preko noći. Odvajanje bazalnih potreba za insulinom i potreba povezanih sa obrokom (bolus) predstavlјa sistemski pristup supkutanoj insulinskoj terapiji.

Najvažnije farmakološke odlike bilo kog datog insulina - početak dejstva, profil maksimalnog dejstva, trajanje dejstva, itd. - u velikoj meri su određene njegovom kinetikom apsorpcije sa mesta supkutane injekcije u sistemsku cirkulaciju.

Nekovalentna oligomerizacija posredovana cinkom je dobro opisano svojstvo insulinskih proizvoda. Pod fiziološkim pH, humani insulin je rastvorlјiv, ali ima tendenciju da se samovezuje u dobro definisane heksamere (tj. jedinicu od šest molekula insulina), koordinacijom dva jona cinka (Zn<++>) na mesta vezivanja sa visokim afinitetom (B10His). Takođe, dobro je poznato da se fenolni ligandi, posebno fenol, specifično vezuju za heksamer insulina i promovišu formiranje heksamera u R-stanju. Nakon ubrizgavanja, fenolni ligandi brzo difunduju sa mesta ubrizgavanja. U nedostatku fenola na mestu ubrizgavanja, mogu se promeniti konformacija i veličina insulinskog oligomera, kao i viskoznost rastvora koji sadrži insulin, doprinoseći produženom profilu delovanja.

Jonassen et al, Pharm. Res. 201229 2104-2114 opisuje mehanizam produžavanja insulina degludeka, derivata insulina sa acilovanim lancem masnih dikiselina za davanje jednom dnevno, i opisuje korelaciju između visoke koncentracije cinka i produženja. WO 2009/115469 opisuje različite derivate insulina sa dugim dejstvom sa acilovanim lancima masnih dikiselina. WO 2013/153000 opisuje formulaciju tih derivata insulina dugog delovanja za supkutanu primenu, koja sadrži visok nivo cinka (ne manje od 3,5 Zn<++>/šest molova derivata insulina). Dizajniran je kako bi se produžilo vreme delovanja srazmerno profilu davanja jednom nedelјno. Visok sadržaj Zn<++>u formulacijama opisanim u WO 2009/115469 doveo je do produženog PK profila.

WO 2009/063072 stavlja na uvid javnosti farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu koje sadrže derivat bazalnog insulina (npr. degludek) i derivat GLP-1 (npr. liraglutid). Zato što se monomer liraglutida vezuje sa cinkom da bi se formirao diheptmer, nivo cinka veći od mono formulacije degludeka neophodan je u kombinovanoj formulaciji, da bi se postigao uporedni PK profil degludeka i postigla prihvatlјiva fizička stabilnost.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Prema predmetnom pronalasku, razvijena je nova formulacija derivata insulina sa dugim dejstvom, koja je sposobna da promoviše konformaciono stanje i obrazac oligomerizacije koji više liči na humani insulin, tj. heksamere, posebno R6 heksamere.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži izabrani derivat insulina dugog dejstva u jedinstvenoj kombinaciji pomoćnih supstanci pažlјivo formulisanih kako bi se smanjilo stvaranje oligomera na mestu ubrizgavanja, dok i dalјe pokazuje svojstva PK/PD prilagođena za davanje jednom nedeljno.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju sa smanjenim viskozitetom nakon ubrizgavanja i shodno tome smanjenom sklonošću da stvara bilo kakvu nelagodu nakon ubrizgavanja.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju sa pobolјšanom stabilnošću.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu kao lek za lečenje metaboličkog poremećaja.

Drugi cilјevi pronalaska će biti očigledni stručnjaku u tehnici iz sledećeg detalјnog opisa i primera.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

U svom prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži derivat insulina izabran iz grupe koja se sastoji iz

A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikosandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]acetilamino}etoksi) etoksi]acetil)), desB30 humani insulin; (Jedinjenje 1);

A14E, B16H, B25H, B29K(N<ε>-Heksadekandioil-γGlu), desB30 humani insulin (Jedinjenje 2);

A14E, B16H, B25H, B29K(N<ε>-Eicosanedioyl-γGlu), desB30 humani insulin (Jedinjenje 3); i

A14E, B25H, desB27, B29K(N<ε>-Oktadekandioil-γGlu), desB30 humani insulin (Jedinjenje 4); i dalјe sadrži od oko 1 do oko 2% (težina/težina) glicerola; od oko 45 do oko 75 mM fenola; od oko 0 do oko 19 mM m-Krezola; od oko 1,5 do oko 2,5 mola jona cinka na šest molova navedenog derivata insulina; od 5 do 50 mM natrijum hlorida; i imaju pH vrednost u rasponu od 7,2 do 8,0.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje dalјe sadrže insulinotropno GLP-1 jedinjenje, a posebno insulinotropno GLP-1 jedinjenje poznato kao semaglutid.

Semaglutid se može opisati strukturom Aib8,Lys26(OEG-OEG-gamma-Glu-C18-diacid),Arg34)GLP-1 H(7-37)-OH, koja se takođe može označiti i kao (N-epsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino) butirilamino]etoksi} etoksi)acetilamino] etoksi}etoksi)-acetil][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37), c.f. stavljeno na uvid javnosti u WO 2006/097537.

Predmetna objava se dalje može okarakterisati uz upućivanje na jednu ili više sledećih odlika ili realizacija:

1. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku koja sadrži derivat insulina, koji je A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

2. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku koja sadrži derivat insulina, koji je A14E, B16H, B25H, B29K(N<ε>-Heksadekandioil-γGlu), desB30 humani insulin (Jedinjenje 2).

3. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku koja sadrži derivat insulina, koji je A14E, B16H, B25H, B29K(N<ε>-Eikozandioil-γGlu), desB30 humani insulin (Jedinjenje 3).

4. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku koja sadrži derivat insulina, koji je A14E, B25H, desB27, B29K(N<ε>-Oktadekandioil-γGlu), desB30 humani insulin (Jedinjenje 4).

5. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, pri čemu je derivat insulina u rasponu od oko 3,5 do oko 5,0 mM.

6. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, pri čemu je derivat insulina u rasponu od oko 4,0 do oko 4,5 mM.

7. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, pri čemu je derivat insulina oko 4,2 mM.

8. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 1 do oko 2% (težina/težina) glicerola.

9. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 1,4 do oko 1,8% (težina/težina) glicerola.

10. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 1,5% ili 1,6% (težina/težina) glicerola.

11. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 45 do oko 75 mM fenola.

12. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 50 do oko 70 mM fenola.

13. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 55 do oko 65 mM fenola.

14. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ili 70 mM fenola.

15. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 0 do oko 19 mM m-Krezola.

16. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži 0 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM m-Krezola.

17. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 0 do oko 15 mM m-Krezola.

18. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM ili 19 mM od m-Krezola.

19. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 1,5 do oko 2,5 mola jona cinka na šest molova derivata insulina.

20. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 2,0 do oko 2,4 mola jona cinka na šest molova derivata insulina.

21. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 2,0 ili 2,1 mola jona cinka na šest molova derivata insulina.

22. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 2,2 ili 2,3 mola jona cinka na šest molova derivata insulina.

23. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 2,4 ili 2,5 mola jona cinka na šest molova derivata insulina.

24. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži manje od oko 75 mM natrijum hlorida.

25. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 5 do oko 50 mM natrijum hlorida.

26. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 10 do oko 25 mM natrijum hlorida.

27. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 15 do oko 25 mM natrijum hlorida.

28. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 20 mM, 50 mM ili 75 mM natrijum hlorida.

29. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja ima pH vrednost u rasponu od 7,2 do 8,0.

30. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja ima pH vrednost u rasponu od 7,2 do 7,6.

31. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja ima pH vrednost oko 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 ili 7,9.

32. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

od oko 4,0 do oko 4,5 mM derivata insulina;

od oko 1 do oko 2% (težina/težina) glicerola;

od oko 50 do oko 70 mM fenola;

od oko 0 do oko 15 mM od m-Krezola;

od oko 2,0 do oko 2,5 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

manje od oko 50 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost u rasponu od 7,2 do 7,6.

33. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

oko 4,2 mM derivata insulina;

oko 1,5% (težina /težina) glicerola;

oko 60 mM fenola;

od oko 0 mM od m-Krezola;

oko 2,0 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

oko 20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost od oko 7,4.

34. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

oko 4,2 mM derivata insulina;

oko 1,5% (težina/težina) glicerola;

oko 60 mM fenola;

oko 10 mM od m-Krezola;

oko 2,0 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

oko 20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost od oko 7,4.

35. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

oko 4,2 mM derivata insulina;

oko 1,5% (težina/težina) glicerola;

oko 60 mM fenola;

od oko 0 mM od m-Krezola;

oko 2,2 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

oko 20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost od oko 7,4.

36. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

oko 4,2 mM derivata insulina;

oko 1,5% (težina/težina) glicerola;

oko 60 mM fenola;

oko 10 mM od m-Krezola;

oko 2,2 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

oko 20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost od oko 7,4.

37. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

oko 4,2 mM derivata insulina;

oko 1,5% (težina/težina) glicerola;

oko 60 mM fenola;

od oko 0 mM od m-Krezola;

oko 2,4 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

oko 20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost od oko 7,4.

38. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži

oko 4,2 mM derivata insulina;

oko 1,5% (težina/težina) glicerola;

oko 60 mM fenola;

od oko 10 mM od m-Krezola;

oko 2,4 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

oko 20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost od oko 7,4.

39. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 4,2 mM derivata insulina; od oko 1 do oko 2% (težina/težina) glicerola; od oko 45 do oko 75 mM fenola; od oko 0 do oko 15 mM m-Krezola; od oko 1,5 do oko 2,5 mola jona cinka na šest molova navedenog derivata insulina; ne više od oko 50 mM natrijum hlorida; i imaju pH vrednost u opsegu od 7,2 do 8,0.

40. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 0 mM m-Krezola.

41. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži od oko 5 do oko 10 mM m-Krezola.

42. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja sadrži oko 10 mM m-Krezola.

43. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, koja dalјe sadrži semaglutid.

44. Farmaceutska kompozicija koja sadrži A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1); i semaglutid; i dalјe sadrži od oko 1 do oko 2% (težina/težina) glicerola; od oko 45 do oko 75 mM fenola; od 0-15 mM m-Krezola; od oko 1,5 do oko 2,5 mola jona cinka na šest molova datog derivata insulina; ne više od oko 25 mM natrijum hlorida; i ima pH vrednost u rasponu od 7,2 do 8.0

45. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži od oko 0,20 do oko 0,70 mM semaglutida.

46. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži od oko 0,30 do oko 0,70 mM semaglutida.

47. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži od oko 3,5 mM do oko 5,0 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

48. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži od oko 0,30 do oko 0,70 mM semaglutida i od oko 3,5 mM do oko 5,0 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikosandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}-etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

49. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži oko 0,30 mM semaglutida i od oko 3,5 mM do oko 5,0 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

50. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži oko 0,40 mM semaglutida i 4,2 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

51. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži oko 0,49 mM ili 0,50 mM semaglutida i 4,2 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-EikozandioilγGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

52. 35. Farmaceutska kompozicija prema prethodnim realizacijama, koja sadrži oko 0,60 mM semaglutida i 4,2 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1).

53. Farmaceutska (koformulacija) kompozicija koja sadrži A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)-etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1); i semaglutid; i dalјe sadrži oko 1,5% (težina/težina) glicerola; oko 60 mM fenola; oko 0 mM m-Krezola; oko 2,2 mola jona cinka na šest molova datog derivata insulina; oko 20 mM natrijum hlorida; i ima pH vrednost od oko 7,4.

54. Farmaceutska (koformulacija) kompozicija koja sadrži A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)-etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1); i semaglutid; i dalјe sadrži oko 1,5% (težina/težina) glicerola; oko 60 mM fenola; oko 10 mM m-Krezola; oko 2,2 mola jona cinka na šest molova datog derivata insulina; oko 20 mM natrijum hlorida; i ima pH vrednost od oko 7,4.

55. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je ovo potrebno u intervalima koji su ređi nego jednom dnevno (tj. u intervalima dužim od 24 sata), tokom vremenskog perioda od najmanje 3 meseca, najmanje 6 meseci, ili najmanje 1 godine.

56. Farmaceutska kompozicija iz prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je potrebno davanje subjektu sa frekvencijom u rasponu od svakog 2<.>dana do svakog 11<.>dana, u proseku.

57. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je potrebno davanje subjektu sa frekvencijom u rasponu od svakog 3<.>dana do svakog 10.<.>dana, u proseku.

58. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je potrebno davanje subjektu sa frekvencijom u rasponu od svakog 4<.>dana do svakog 9<.>dana, u proseku.

59. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je potrebno davanje subjektu sa frekvencijom u rasponu od svakog 5<.>dana do svakog 8<.>dana, u proseku.

60. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je potrebno davanje subjektu sa frekvencijom u rasponu od svakog 6<.>dana do svakog 7<.>dana, u proseku.

61. Farmaceutska kompozicija prethodnih realizacija, za davanje subjektu kome je potrebno davanje subjektu sa frekvencijom jednom nedelјno, tj. svakog 7<.>dana, u proseku, tokom vremenskog perioda od najmanje 3 meseca, najmanje 6 meseci ili najmanje 1 godine.

62. Postupak za dobijanje farmaceutske kompozicije za injekcije obuhvata:

(i) Priprema rastvora rastvaranjem A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-EikosandioilγGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humanog insulina u vodi

(ii) Priprema rastvora rastvaranjem konzervanasa i izotoničnih sredstava u vodi (iii) Priprema rastvora rastvaranjem jona cinka u vodi

(iv) Mešanje rastvora a) i rastvora b)

(v) Dodavanje rastvora c) u rastvor a+b

(vi) Rastvaranje semaglutida u kombinovanom rastvoru a+b+c

(vii) Podešavanje pH smeše f) na želјeni pH, nakon čega sledi sterilna filtracija.

Predmetni zahtevi definišu obuhvat predmetnog pronalaska.

Biološka aktivnost

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje su korisne kao lekovi za lečenje metaboličkih bolesti, poremećaja ili stanja, a posebno bolesti, poremećaja ili stanja koja se odnose na dijabetes.

U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju ili ublažavanju bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, dijabetesom tipa 1, dijabetesom tipa 2, poremećenom tolerancijom glukoze, hiperglikemijom, dislipidemijom, gojaznošću ili metaboličkim sindromom (metabolički sindrom X, sindrom insulinske rezistencije).

U drugoj realizaciji, farmaceutska kompozicija prema pronalasku je za upotrebu u lečenju ili ublažavanju bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, a posebno dijabetesom tipa 1 ili dijabetesom tipa 2.

Stvarna doza zavisi od prirode i težine bolesti koja se leči, i o tome odlučuje lekar, a može se varirati titracijom doze prema posebnim okolnostima predmetnog pronalaska kako bi se postigao želјeni terapeutski efekat.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Predmetni pronalazak je dalјe prikazan uz upućivanje na prateće crteže, na kojima:

Slika 1 prikazuje oligomerizaciju mono formulacija A, B i C jedinjenja 1, u simuliranim uslovima na mestu injekcije:

Sl. 1A: Prividni prosečni hidrodinamički radijus (rH) [nm] meren DLS-om;

Sl. 1B: Prividna prosečna molekulska težina merena CG-MALS-om;

Sl. 1C: Prividni prosečni koeficijent sedimentacije (S) izmeren AUC;

Beli stubovi: Jedinjenje 1, Formulacija C sa 2,2 Zn + na šest insulina (mol:mol); Sivi stubovi: Jedinjenje 1, Formulacija B sa 2,4 Zn + na šest insulina (mol:mol); Crni stubovi: Jedinjenje 1, Formulacija A koja sadrži 4,5 Zn + na šest insulina (mol:mol);

Sl. 2 prikazuje oligomerizaciju mono formulacija 01-06 jedinjenja 1, u simuliranim uslovima na mestu ubrizgavanja:

Sl. 2A: Prividni prosečni hidrodinamički radijus (Rh, avg) [nm] meren DLS-om; Sl. 2B: Prividni prosečni koeficijent sedimentacije (S*) meren AUC-om

1

Sl. 3 prikazuje prividnu dinamičku viskoznost [cP] (slika 3A i slika 3C) i specifičnu viskoznost [ηspec] (slika 3B, slika 3D) različitih formulacija jedinjenja sa izmenjenim puferom Jedinjenja 1 i intersticijalnog pufera za fluid (ISF), u zavisnosti od temperature [°C];

Sl. 3A i Sl. 3B: Formulacija A; Formulacija B; Formulacija C; ISF pufer;

Sl. 3C i Sl. 3D: Formulacija 02; Formulacija 03; Formulacija 04; ISF pufer;

Sl. 4 prikazuje konformaciono stanje Jedinjenja 1 u formulacijama:

Sl. 4A: skoro UV-CD [Δε251nm (M-1 cm-1)] koji prikazuje konformacione promene (T-stanje; mešovito TR stanje; R-stanje) u funkciji Zn++ po šest insulina (mol:mol) za formulacije 01-06;

Sl. 4B: skoro UV CD [Δε251nm(M-1 cm-1)] koje prikazuje konformacione promene (T-stanje; mešovito stanje TR; R-stanje) u funkciji Zn++ po šest insulina (mol:mol) za formulacije B1-B6, D1-D7 i formulacije humanog insulina sa različitim nivoom cinka:

Otvoreni krugovi: Humani insulin (600 nmol/ml humanog insulina, 30 mM fenola, 150 mM NaCl, pH 7,4);

Crni kvadrati: Jedinjenje 1 formulisano sa 25 mM fenola, 25 mM m-Krezola i 20 mM NaCl;

Sivi krugovi: Jedinjenje 1 formulisano sa 60 mM fenola, 10 mM m-Krezola i 20 mM NaCl;

Sl. 5 prikazuje distribuciju oligomera Jedinjenja 1 u formulacijama prema SEC-u: Sl. 5A prikazuje nativni SEC hromatogram Formulacija 01, 02, 03, 04, 05 i 06; Sl. 5B prikazuje nativni SEC hromatogram formulacija A i B1-B6;

Sl. 6 prikazuje SAXS podatke rasipanja [Intenzitet (a.u.) vs. s (Å-1)] Jedinjenja 1 i humanog insulina u formulisanom stanju:

Sl. 6A: Krive raspršenja Formulacije A Jedinjenja 1 prikazane crnom bojom i humanog insulina prikazane sivom bojom (Jedinjenje 1, 4,2 mM, 4,5 Zn/heksamer; Humani insulin 0,6 mM, 2,2 Zn/heksamer);

Sl. 6B: Krive raspršenja Formulacije C Jedinjenja 1 prikazane crnom bojom i humanog insulina prikazane sivom bojom (Jedinjenje 1, 4,2 mM, 2,2 Zn/heksamer; Humani insulin 0,6 mM, 2,2 Zn/heksamer (R6-heksamer));

Sl. 7 prikazuje čistoću Jedinjenja 1 u formulacijama:

Slika 7A prikazuje čistoću (% ukupnog peptida) pri skladištenju na 30°C [Vremenska tačka (mesec)] za Formulaciju A Jedinjenja 1 (crna linija), Formulaciju B (siva linija) i Formulaciju C (isprekidana linija);

Sl. 7B prikazuje čistoću (% ukupnog peptida) pri skladištenju na 37°C [Vremenska tačka (nedelјe)] za za formulacije 01, 04, 05 i 06 Jedinjenja 1;

Beli krugovi: Formulacija 01, Crni krugovi: Formulacija 04, Beli kvadrati: Formulacija 05, Crni kvadrati: Formulacija 06;

Sl. 8 prikazuje čistoću Jedinjenja 1 (% ukupnog Jedinjenja 1) pri skladištenju na 37°C [Vremenska tačka (nedelјe)] u kombinovanim formulacijama sa semaglutidom:

Beli krugovi: kombinovana-Formulacija I, Crni krugovi: kombinovana-Formulacija II, Beli trouglovi: kombinovana-Formulacija III, Crni trouglovi: kombinovana-Formulacija IV, Beli kvadrati: kombinovana Formulacija V, Crni kvadrati: kombinovana Formulacija VI;

Sl. 9 prikazuje oligomerizaciju kombinovanih formulacija u simuliranim uslovima mesta ubrizgavanja:

Sl. 9A: Prividni prosečni hidrodinamički radijus (rH) [nm] meren DLS -om;

Sl. 9B: prikazuje veličinu oligomera kombinovanih formulacija nakon izmene pufera prema AUC-u (S*).

PRIMERI

Pronalazak je dalјe prikazan uz upućivanje na sledeće primere, koji nemaju nameru da na bilo koji način ograniče obim pronalaska čija se zaštita traži.

Primer 1

Pobolјšana biofizička svojstva u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja

Protokol

API od formulacija je A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humani insulin (Jedinjenje 1) dobijen kao što je opisano u npr. WO 2009/115469, videti Primer 33.

Oligomerizacija Jedinjenja 1 je određena pri uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja. Uslovi simuliranog mesta ubrizgavanja postignuti su iscrpljivanjem fenola i/ili metakrezola, odnosno, izmenom pufera u simulirani intersticijski pufer fluida. Ova procedura je praktično uklonila sve fenolne ligande, ali je zadržala odnos cink/insulin iz osnovne formulacije.

Formulacijama se izmenjuju puferi u pufer za intersticijalni fluid (ISF-) preko kolone PD-MidiTrap G-25 prema protokolu proizvođača.

Kolone su uravnotežene sa cilјnim puferom ispiranjem kolone dovolјnom zapreminom cilјnog pufera, a formulacija se nanosi u odgovarajućoj zapremini i eluira cilјnim puferom. ISF pufer se sastoji od 140 mM NaCl, 4 mM KCI, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepesa, pH 7,4.

Ukoliko nije drugačije navedeno, postupak je bio sledeći:

Izmena pufera na 22°C;

Naknadna inkubacija na 37°C tokom 14-18 sati; i

Naknadno merenje na 22°C (osim ako nije drugačije navedeno).

Obično su merenja vršena oko 1 sat nakon završetka inkubacije na 37°C. Ako to nije moguće, uzorci se čuvaju na 22°C do merenja.

Osim ako nije drugačije naznačeno, uzorci se mere nerazblaženi. Treba napomenuti da veličina oligomera koja proizlazi iz opisanog postupka iscrplјivanja fenola zavisi od procesa, a za datu formulaciju može varirati u zavisnosti od faktora kao što su vreme, temperatura i količina kolone. Zbog toga je poželјno da se merenja za dati skup formulacija uporede u okviru istog eksperimenta, a ne u različitim eksperimentima.

Zbog toga je za istu referencu, formulacija testirana zajedno sa različitim formulacijama pronalaska u različitim eksperimentima. Na primer, Formulacija A naspram Formulacije B i C; Formulacija 01 naspram formulacija 02-06.

Prividni prosečni hidrodinamički radijus (rH) je meren pomoću rinamičkog rasipanja svetlosti (DLS), korišćenjem DynaPro PR™ (Wyatt technology, Santa Barbara, CA, SAD). Pre analize uzorci su centrifugirani 5 minuta na 1200 rpm (o/min) da bi se uklonile sve čestice prašine u rastvoru. Merenja su sprovedena na 25°C koristeći 40 akvizicija i 2 sekunde vremena akvizicije.

Prividna prosečna molekulska težina (kDa) merena kompozitnim gradijentom, višeslojno statičko raspršivanje svetlosti (CG-MALS) korišćenjem sistema koji se sastoji od titratorske jedinice Wyatt Technology Corporation (WTC) Calypso II spojene na WTC DAWN8+ detektor rasipanja svetlosti (radi na 664 nm) i WTC Optilab T-rEX refraktometar (radi na 660 nm) na 25°C. Uzorci su pre merenja filtrirani kroz filter od 0,45 µm, nakon čega sledi filter od 0,22 µm.

Eksperimenti sa brzinom taloženja (SV) izvedeni su sa XL-I analitičkom ultracentrifugom (BeckmanCoulter, Brea, CA) u 12-mm ili 3-mm središnjim delovima sa dvostrukim sektorom prekrivenim safirnim prozorima. Uzorci su se centrifugirani na 40000 rpm i 20°C dok se sedimentacija nije završila i nadgledali optikom interferencije instrumenta. Distribucije koeficijenta sedimentacije (SCD) izračunate su pomoću SedFita, verzija 11.8 (www.analyticalultracentrifugation.com) korišćenjem c(s) modela sa rešetkom od 100 s-vrednosti u rasponu dovolјnom za opisivanje svih materijala koji se talože, prema rmsd i rezidualnom šablonu. Odnos trenja f/fo tretiran je kao promenlјiva koja se optimizuje tokom postavljanja (P Schuck, MA Perugini, NR Gonzales, GJ Howlett and D Schubert: Size-distribution analysis of proteins by analytical ultracentrifugation: strategies

1

and application to model systems; (Biophys. J. 2002 82:1096). Prosečne vrednosti koeficijenta sedimentacije dobijene su integracijom dobijenih c(s)-distribucija.

Dinamički viskoziteti zavisni od temperature mereni su viskozimetrom tipa Lovis2000 sa kotrlјajućim kuglicama (Anton Paar, Grac, Austrija). Temperatura je smanjena sa 40°C na 4°C u koracima od 2°C, omogućavajući 5 minuta ravnoteže temperature između koraka. Gustina pufera je istovremeno merena denzitometrom DMA5000, takođe od Antona Paara.

Tri mono formulacije, tj. Formulacija A predstavnik stanja tehnike (vidi npr. WO 2013/153000), i Formulacije B, C reprezentativne za pronalazak (60 mM fenola/10 mM m-Krezola) su pripremljene.

Tabela 1A: Uporedne mono formulacije A, B i C

Napravlјeno je još šest mono formulacija, tj. Formulacija 01 (ista kao formulacija A) i Formulacije 02, 03, 04, 05 i 06 reprezentativne za pronalazak (Tabela 1B). Sadržaj cinka je varirao od 4,5 Zn<++>/šest insulina do 2,4, 2,2 i 2,0 Zn<++>/šest insulina. Pored toga, testirani su i konzervativni sistemi od ili 25/25 mM fenola/m-Krezola ili 60/0 mM fenola/m-Krezola.

Tabela 1B: Uporedne formulacije

* Isto kao formulacija A

Pobolјšana veličina oligomera mono-formulacija sa izmenjenim puferom koja ima 60 mM fenola i 10 m-Krezola (Tabela 2A; Sl., 1A, 1B i 1C)

Tabela 2A: Veličina oligomera na simuliranom mestu ubrizgavanja

Pobolјšana veličina oligomera mono-formulacija sa izmenjenim puferom koje sadrže 60 mM fenola i 0 m-Krezola (Tabela 2B; Sl. 2A i 2B)

Tabela 2B Veličina oligomera na simuliranom mestu ubrizgavanja

1

Zaključak

Sadržaj cinka je smanjen sa 4,5 Zn<++>/šest insulina u formulaciji A do 2,4 i 2.2 Zn<++>/šest insulina u formulacijama B i C (sa povećanim fenolom i smanjenim metakrezolom) respektivno. Ovo smanjenje cinka bilo je praćeno smanjenjem veličine oligomera (videti slike 1A, 1B i 1C) kako je određeno u uslovima simuliranja mesta ubrizgavanja gore opisanim postupkom.

Rezultati formulacije 01-06 dalјe potvrđuju da se veličina oligomera smanjuje kada se Zn smanji sa 4,5 Zn<++>/šest insulina do 2,2 ± 0,2 Zn<++>/šest insulina. Za 2,2 ± 0,2 Zn<++>/šest insulina, veličina oligomera se dodatno smanjuje kada se fenol/krezol smanji sa 25 mM/25 mM na 60 mM/0 mM. Pogledajte slike 2A i 2B.

Pobolјšan viskozitet mono-formulacija sa izmenjenim puferom koje imaju 60 mM fenola i 10 mM m-Krezola (videti Tabelu 3A; Slike 3A i 3B)

Tabela 3A: Viskoznost Formulacija A, B, C sa izmenjenim puferom

Pobolјšan viskozitet mono-formulacija sa izmenjenim puferom koje imaju 60 mM fenola i 0 m-Krezola (videti Tabelu 3B; Sl. 3C i 3D)

Tabela 3B: Viskoznost Formulacija 02, 03 i 04 sa izmenjenim puferom

1

Zaključak

Ovi eksperimenti pokazuju da viskoznost formulacije u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja prema ovoj metodi u velikoj meri zavisi od sadržaja cinka, tako da smanjenje odnosa cinka dovodi do manjeg viskoziteta.

Primer 2

tmaksi eliminacija t1/2

tmakspredstavlјa vreme do maksimalne koncentracije (maksimalna izloženost plazmi), i t1⁄2predstavlјa poluvreme eliminacije u kome polovina jedinjenja nestaje iz plazme nakon primene.

Izmenjene biofizičke osobine opisane u Primeru 1 konzistentne su sa PK profilom ranije iskazanog tmakskod svinja (videti Tabelu 3). Ovo ukazuje na to da se vreme zadržavanja jedinjenja 1 u potkožju smanjuje kada se formuliše prema pronalasku, a za razliku od istog jedinjenja koje se daje u formulaciji prema prethodnom stanju tehnike.

Iznenađujuće, smanjeni nivo cinka gotovo nema uticaja na trajanje delovanja (tj. ne utiče na t1/2eliminacije), što čini formulaciju prema pronalasku i formulaciju iz stanja tehnike podjednako pogodnom za davanje jednom nedelјno.

Tabela 4

1

Zaključak

Ovi eksperimenti pokazuju da je vreme boravka u potkožju (tmaks) Jedinjenja 1 značajno smanjeno kao rezultat smanjenja Zn<++>/heksamer. Zapažanje je u skladu sa podacima predstavlјenim u Primeru 1, koji pokazuje smanjenje veličine oligomera nastalih u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja.

Stoga, kada je formulisano prema pronalasku, Jedinjenje 1 formira manje oligomere na mestu ubrizgavanja što daje PK/PD profil sa kraćim vremenom zadržavanja u potkožju (smanjeno tmaks).

Ali iznenađujuće, iako je vreme boravka u potkožju (tmax) Jedinjenja 1 značajno smanjeno, formacije pronalaska su zadržale isto poluvreme eliminacije (ne utiče na t1/2eliminacije). To znači da bi formulacije pronalaska mogle da omoguće da derivati insulina sa dugim dejstvom brže dostignu maksimalnu koncentraciju u cirkulaciji, dok i dalje zadržavaju maksimalnu koncentraciju sa dužim trajanjem.

Ovo neočekivano otkriće, takođe, omogućava ograničavanje stvaranja velikih oligomera na mestu ubrizgavanja, uz očuvanje dugotrajnog delovanja srazmerno profilu davanja jednom nedelјno. Formiranje velikih oligomera visokog viskoziteta na mestu ubrizgavanja može izazvati nelagodu nakon ubrizgavanja.

Primer 3

Poboljšano konformaciono stanje u formulaciji

Uz prisustvo cinka, humani insulin postoji u obliku heksamera u formulaciji. Heksameri humanog insulina mogu usvojiti dva različita konformaciona stanja u zavisnosti od konformacije monomera. Osam N-terminalnih amino-kiselinskih ostataka B-lanca insulinskog monomera može biti ili u izduženoj konformaciji (T-stanje) ili u αspiralnoj konformaciji (R-stanje). U prisustvu fenola i NaCl, humani insulin usvaja R konformaciju, što je povolјna konformacija s obzirom na fizičku i hemijsku stabilnost (Dunn MF. Zinc-ligand interactions modulate assembly and stability of the insulin hexamer: A review. Biometals 2005; 18; 295-303).

Protokol

1

Konformacione promene insulinskog heksamera praćene su CD potpisom od 251 nm (Krüger P, Gilge G, Cabuk Y and Wollmer A; Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1990371 669-673). Uzorci su mereni pomoću instrumenta Jasco 815 i dužine puta 0,02 cm. Prazne titracije su oduzete i dobijeni Δε 251nm je iscrtan u odnosu na Zn/6Ins (mol/mol).

Konformaciono stanje mono formulacija koje imaju 60 mM fenola/0 m-Krezola

Konformaciono stanje Formulacija 01-06 prikazano je u Tabeli 5A i na slici 4A.

Tabela 5A: Sklonost konformacionom stanju u formulaciji 01-06 sa 60 mM fenola/0 m-Krezola

Sl. 4A prikazuje konformacione promene (T-stanje; mešovito TR stanje; R-stanje) u zavisnosti od Zn<++>po šest insulina (mol: mol) za formulacije 01-06.

Konformaciono stanje mono-formulacija koje imaju 60 mM fenola i 10 mM m-Krezola

Pripremlјene su dve serije formulacija. Sve formulacije su sadržale 4,2 mM Jedinjenja 1, 16 mg/ml (1,6%) glicerola, 20 mM NaCl, sa pH 7,4. Formulacije serije B sadržale su 60 mM fenola i 10 mM m-Krezola, pri čemu je nivo cinka varirao kao 1,5(B1), 2,0(B2), 2,3(B3), 2,5(B4), 3,0(B5) i 4,0(B6) po 6 insulina. Serija D je sadržala 25 mM fenola i 25 mM m-Krezola, pri čemu je nivo cinka varirao kao 1,5, 2,0, 2,3, 2,5, 3,0, 4,0 i 4,5 na 6 insulina. Takođe je pripremlјen niz formulacija humanog insulina, sa različitim nivoima cinka. Konformaciono stanje prikazano je u Tabeli 5B i na Slici 4B.

Tabela 5B Sklonost konformacionom stanju u formulacijama B1-B6 sa 60 mM fenola i 10 m-krezola, i formulacijama D1-D7 sa 25 mM fenola i 25 m-krezola

1

* Nije uključeno u Sl. 4B

Sl. 4B prikazuje konformacione promene (T-stanje; mešovito TR stanje; R-stanje) u funkciji Zn++ po šest insulina (mol:mol) za formulacije serije B i serije D, i formulacije humanog insulina.

Zaključak

Podaci sa skoro UV CD-a pokazuju da je T/R konformacija Jedinjenja 1 zavisila od koncentracije cinka. Smanjenje cinka bilo je praćeno promenom konformacionog stanja Jedinjenja 1 u formulaciji iz mešovitog T/R stanja u R-stanje, koje je takođe bilo praćeno višim nivoom heksamera formiranog u formulacijama (videti Primer 4 u daljem tekstu). R-stanje i nivo heksmera je dodatno pojačan promenom odnosa fenola/metakrezola sa 25/25 mM na 60/10 mM (Sl. 4B).

Podaci formulacija 01-06 pokazuju da je R-stanje Jedinjenja 1 u formulacijama dodatno obogaćeno smanjenjem Zn sa 4,5 na 2,2 Zn ± 0,2 Zn /6 Jedinjenja 1 i izostavlјanjem m-Krezola (slika 4A).

Primer 4

Poboljšana distribucija oligomera u formulaciji

Protokol

Hromatografija isključenja po veličini je osetlјiva metoda za kvantifikovanje nekovalentne oligomerne distribucije formulacija insulina. SEC je sproveden korišćenjem kolone BEH200, 1.7 µm 4,6x150 mm sa tekućim puferom koji se sastojao od 8,0 mM fenola, 140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4. Hromatografija je sprovedena na 22°C pomoću 2 µL zapremine injekcije i protokom od 0,3 ml/min. Kao standardi molekularne težine korišćeni su albumin, kovalentni insulinski heksamer i monomerni insulin. Hromatogrami su analizirani integracijom da predstavlјaju vrste veće od heksamera (3,0-3,8 min), heksamera (3,8-4,3 min) i vrste manje od heksamera (4,3-5,5 min). Imajte na umu da će se tačna ograničenja integracije za svaki skup podataka neznatno razlikovati zbog varijacija u performansama kolona.

Podaci o rasipanju rendgenskih zraka pod malim uglom (SAXS) prikuplјeni su pomoću instrumenta BioSAXS-2000 opremlјenog protočnom ćelijom i Dectris 100K

2

detektorom koji pokriva q-raspon od 0,008-0,661 Å<-1>. Merenja pufera su oduzeta od merenja uzoraka da bi se dobili profili rasipanja proteina. Podaci iz referentnog uzorka humanog insulina u heksamernom stanju sa R konformacijom prikuplјeni su prema istom postupku, iz uzorka od 0,6 mM humanog insulina, 3 Zn<++>/šest insulina, 16 mM fenola, 20 mM NaCl i 7 mM fosfatnog pufera pH 7,4.

Distribucija oligomera za formulacije koje sadrže 60 mM fenola i 0 m-Krezola Nativni SEC hromatogram za upoređivanje formulacija 01, 02, 03, 04, 05 i 06 je generisan (videti Tabelu 6 i Sl. 5A).

Tabela 6: Distribucija vrsta kako je dobijeno nativnim SEC-om po integraciji

hromatograma

Distribucija oligomera za formulacije koje sadrže 60 mM fenola i 10 mM m-Krezola

Nativni SEC hromatogram koji upoređuje formulacije B1-B6 i formulaciju A je generisan (videti Tabelu 6 i Sl. 5B). Površina ispod krive je slična za sve hromatograme. Hromatogrami su analizirani integracijom da predstavlјaju vrste veće od heksamera (3,0-3,8 min), heksamera (3,8-4,3 min) i vrste manje od heksamera (4,3-5,5 min). Napominjemo da će se tačna ograničenja integracije za svaki skup podataka neznatno razlikovati zbog varijacija u performansama kolona.

Tabela 7: Distribucija oligomera po SEC-u

Zaključak

SEC podaci Formulacija 01-06 (Tabela 6, Sl. 5A) pokazuju da distribuciju oligomera Jedinjenja 1 Formulacije 01 karakterišu široke trake bez jasnih dominantnih vrsta oligomera. Distribucija oligomera Jedinjenja 1 u Formulacijama 03-06 je uža u poređenju sa Formulacijama 01 i 02. Vreme zadržavanja glavnih pikova Formulacija 03-06 je u skladu sa heksamerom, a mali vrh sa vremenom zadržavanja od 5 minuta je u skladu sa monomerom ili dimerom.

SEC podaci Formulacija B1-B6 i A (Tabela 7, Sl. 5B), takođe, pokazuju da je sa 2,0-2,5 insulina cinka/6, heksamerni vrh obogaćen, u poređenju sa 4,0 ili 4,5 Zn.

Zbog toga je heksamerni vrh obogaćen niskim cinkom (npr. 2,0Zn do 2,5Zn) u poređenju sa visokim cinkom (npr. 4,0 ili 4,5Zn). I za 4.5Zn i za 2.2Zn heksamer je obogaćen na 60 mM/0 ili 10 mM fenola/m-Krezola u odnosu na 25/25 mM fenola/m-Krezola. Kada se formuliše prema pronalasku, sadržaj heksamera se povećava i oligomerizacija postaje bolјe definisana.

SAXS podaci, takođe, potvrđuju da obrazac oligomerizacije Formulacije A Jedinjenja 1 sa 4,5 Zn<++>/heksamer ne liči na klasični heksamer humanog insulina, dok je struktura Jedinjenja 1 na bazi heksamera dominantna u Formulaciji C (Sl. 6). Kada se formuliše prema pronalasku (Formulacija C), obrazac oligomerizacije postaje bolјe definisan i konzistentan sa strukturom zasnovanom na heksameru, sličnoj lјudskom insulinu.

Primer 5

Unapređena hemijska stabilnost i fizička stabilnost

Eksperimentalni rezultati u ovom primeru pokazali su da su hemijska stabilnost i fizička stabilnost Jedinjenja 1 pobolјšane su u novim formulacijama u poređenju sa referentnom Formulacijom A. Posebno, sa visokim nivoom fenola i niskim nivoom m-Krezola, kako hemijska stabilnost, tako i fizička stabilnost Jedinjenja 1 se povećava kada se koncentracija cinka smanji.

Protokol

Čistoća je određena reverznofaznom tečnom hromatografijom ultra visokih performansi (RP-UHPLC) gde su uzorci analizirani pomoću Acquity CSH Fluoro Phenyl, 130Å, 1,7 µm, 2,1x150mm kolona, gradijentno eluiranje acetonitrilom u mobilnoj fazi acetonitrila i fosfora pufer u vodi sa naknadnom UV detekcijom (215 nm) pod protokom od 0,30 ml/min sa zapreminom ubrizgavanja uzorka od 2-3 µl. Čistoća je procenjena kao površina glavnog vrha podelјena sa površinom svih vrhova x 100%.

Hemijska stabilnost formulacije Jedinjenja 1 sa 60 mM fenola i 10 mM m-Krezola

Stabilnost merena kao % čistoće ukupnog peptida sa RP-UHPLC pokazuje značajno povećanu stabilnost Jedinjenja 1 u Formulaciji B i Formulaciji C, koja je sadržavala60 mM fenola i 10 mM m-Krezola, u poređenju sa Formulacijom A Jedinjenja 1, koja sadrži 25 mM fenola i 25 mM m-Krezola. Vidi Tabelu 8 i Sl. 7A.

Tabela 8: %Čistoće Jedinjenja 1

Hemijska stabilnost formulacija Jedinjenja 1 sa 60 mM fenola i 0 m-krezola

Stabilnost formulacija predstavlјenih u tabeli 9 merena kao % čistoće ukupnog peptida sa RP-UHPLC dalјe potvrđuje da se hemijska stabilnost Jedinjenja 1 povećava kao funkcija koncentracije cinka u formulacijama sa relativno visokim nivoom fenola i niskim nivoom m-Krezola. Rezultati pokazuju povećanu stabilnost Jedinjenja 1 kada je cink smanjen sa 4,5 Zn<++>/šest insulina do 2,4, 2,2 i 2,0 Zn<++>/šest insulina u formulacijama sa promenom sistema konzervansa sa 25/25 mM fenola/m-Krezola na 60 mM fenola i 0 m-Krezola. Vidi Tabelu 9 i Sl. 7B.

Tabela 9: %Čistoće Jedinjenja 1

2

Zaključak

Kada se formuliše prema pronalasku (vidi Formulacije B, C, 04, 05 i 06; Tabele 8 i 9, i Sl. 7A i Sl. 7B), hemijska stabilnost se povećava u poređenju sa stanjem tehnike (Formulacije A i Formula 01).

Fizička stabilnost

Protokol:

Formulacije Jedinjenja 1 su testirane u mikrotitarskoj ploči sa 96 ležišta sa 4 replike od 200 µl. U 1,0 ml iz svake formulacije, ThT (tioflavin T) dodato je do 1 µM. Test tioflavina T (ThT) za sklonost stvaranju amiloidnih vlakana izvedena je na Thermo Fluoroskanu, 960 rpm centrifuge, na 37 ºC, tokom 45 sati. Emisija ThT je skenirana pre i posle testa. Vreme kašnjenja do početka emisije ThT fluorescencije je mera fizičke stabilnosti. Vremena kašnjenja su određena iz kriva fluorescencije prosečno za 4 replike. Duže vreme kašnjenja ukazuje na veću fizičku stabilnost.

Treba napomenuti da rezultati ThT-a dobijeni iz opisanog protokola mogu varirati između eksperimenata. Zbog toga je poželјno da se merenja za dati skup formulacija uporede u okviru istog eksperimenta, a ne u različitim eksperimentima. U ovom primeru, ista referentna formulacija je testirana zajedno sa različitim formulacijama pronalaska u različitim eksperimentima. Na primer, Formulacija A protiv Formulacije C; Formulacija 01 protiv Formulacija 04-06.

Vremena kašnjenja prikazana su u donjoj Tabeli 10. Formulacija A ili Formula 01 kao referentna formula za poređenje.

Rezultati su prikazani u Tabeli 10A i Tabeli 10B.

Fizička stabilnost Jedinjenja 1 u formulacijama sa 60 mM fenola i 10 m-Krezola

Tabela 10A: Tht vreme kašnjenja (1)

Tabela 10B: Tht vreme kašnjenja (2)

Zaključak

Vremena kašnjenja dobijena u ThT testu ukazuju na to da je fizička stabilnost Jedinjenja 1 pobolјšana u formulacijama sa niskim nivoom cinka, visokim nivoom fenola i niskim nivoom m-Krezola. Podaci su pokazali da pri smanjenju cinka sa 4,5Zn/6Ins na 2,2 ± 0,2Zn/6Ins i istovremenom povećanju fenola sa 25 mM na 60 mM i smanjenju m-Krezola sa 25 mM na 10 mM dolazi do dužeg vremena kašnjenja i time pobolјšane fizičke stabilnosti. Sa uklanjanjem m-Krezola, fizička stabilnost Jedinjenja 1 je dodatno pobolјšana u formulacijama sa niskim nivoom cinka (videti Tabelu 10B).

Primer 6

Kombinovane formulacije i njihova hemijska i fizička stabilnost

Jedinjenje 1 može biti koformulisano zajedno sa jednom nedelјno GLP-1 analognim semaglutidom za kombinaciju sa fiksnim odnosom.

Sledeće kombinovane formulacije 1 do 6 Jedinjenja 1 i semaglutida su pripremlјene. Mono-formulacija Jedinjenja 1 je, takođe, pripremlјena kao referenca 1 mono-formulacije. Predviđene cilјne vrednosti su prikazane u Tabeli 11, ispod.

Tabela 11: Kombinovane formulacije Jedinjenja 1 i semaglutida

2

Koncentracije jedinjenja 1 i semaglutida u proizvedenim formulacijama merene su pomoću RP-HPLC i referentnih materijala. Ove koncentracije su navedene u Tabelama 12A i 12B, ispod.

Tabela 12A: Izmerene koncentracije Jedinjenja 1 i semaglutida

Tabela 12B: Izmerene koncentracija Jedinjenja 1 i semaglutida (odvojena serija iz Tabele 12A)

2

Izmerene koncentracije su stoga odstupile manje od 3% od predviđenih cilјnih vrednosti.

Sledeće kombinovane formulacije I-VI Jedinjenja 1 i semaglutida su, takođe, pripremlјene kasnije. Mono-formulacija jedinjenja 1 je pripremlјena kao referenca 2 mono-formulacije. Predviđene cilјne vrednosti su prikazane u Tabeli 13, ispod.

Tabela 13

Fizička stabilnost

Protokol:

Formulacije su testirane na mikrotitarskoj ploči sa 96 ležišta sa 8 replika od 200 µl. U 1,0 ml iz svake formulacije, ThT (tioflavin T) je dodat do 1 µM. Test tioflavina T (ThT) za sklonost stvaranju amiloidnih vlakana izvedena je na Thermo Fluoroskanu, 960 rpm centrifuge, na 37 ºC, tokom 45 sati. Emisija ThT je skenirana pre i posle testa. Vreme kašnjenja do početka ThT fluorescentne emisije (formiranje amiloidnih vlakana) je mera fizičke stabilnosti. Vremena kašnjenja su određena iz krivi fluorescencije u proseku za 8 replika. Vremena kašnjenja su dva puta testirana za kombinovane formulacije 1-4 i kombinovane formulacije 5 i 6, respektivno; i svaka sa

2

mono formulacijom testirana kao referenca, kako bi rezultati bili uporedivi. Duže vreme kašnjenja ukazuje na veću fizičku stabilnost.

Referentna vrednost mono-formulacije Jedinjenja 1 i kombinovane formulacije su testirane u testu tioflavina T (ThT) sa mikrotitarskom pločom sa 96 ležišta na sklonost stvaranju amiloidnih vlakana.

Vremena kašnjenja prikazana su u donjim tabelama 14A, 14B, 14C.

Tabela 14A: Vreme kašnjenja kombinovanih formulacija

Tabela 14B: Vreme kašnjenja kombinovane formulacije

Tabela 14C: Vreme kašnjenja kombinovane formulacije

Zaključak:

THT test je pokazao da bez povećanja nivoa cinka, kombinovane formulacije Jedinjenja 1 i semaglutida nisu ugrozile fizičku stabilnost Jedinjenja 1 u poređenju sa stabilnošću mono formulacije Jedinjenja 1. U stvari, vreme kašnjenja kombinovanih formulacija bilo je mnogo duže od onih mono-formulacija Jedinjenja 1, pokazujući da koformulisanje Jedinjenja 1 sa semaglutidom u stvari stabilizuje formulaciju u odnosu na

2

neželјeno stvaranje amiloidnih vlakana. U poređenju sa kombinovanom formulacijom drugih derivata insulina dugog delovanja i derivata GLP-1 (npr. degludek i liraglutid), ovaj nalaz je neočekivan i iznenađujući.

Rezultati Tabele 14C pokazuju da snižavanje nivoa m-Krezola može dodatno pobolјšati fizičku stabilnost kombinovane formulacije Jedinjenja 1 i semaglutida; a povećanje nivoa fenola takođe pobolјšava fizičku stabilnost kombinovane formulacije Jedinjenja 1 i semaglutida.

Rezultati Tabele 14C, takođe, pokazuju da kada se ko-formuliše Jedinjenje 1 sa semaglutidom u formulaciji prema pronalasku, fizička stabilnost Jedinjenja 1 se povećava, u poređenju sa upotrebom formulacije iz stanja tehnike (Formulacija I) za kombinovanu formulaciju Jedinjenja 1 i semaglutida.

Hemijska stabilnost

Protokol

Čistoća je određena reverzno-faznom tečnom hromatografijom ultra visokih performansi (RP-UHPLC) gde su uzorci analizirani pomoću Acquity CSH Fluoro Phenyl, 130Å, 1,7 um, 2,1x150mm kolona, gradijentno eluiranje acetonitrilom u mobilnoj fazi acetonitrila i fosforim puferom u vodi sa naknadnom UV detekcijom (215 nm) pod protokom od 0,30 ml/min sa zapreminom ubrizgavanja uzorka od 2-3 µl. Čistoća je procenjena kao površina glavnog vrha podelјena sa površinom svih vrhova x 100%.

Stabilnost formulacija predstavlјenih u tabeli 15 merena je kao % čistoće ukupnog Jedinjenja 1 sa RP-UHPLC.

Rezultati potvrđuju povećanu hemijsku stabilnost Jedinjenja 1 u kombinovanim formulacijama kada se cink smanji sa 4,5 Zn++/šest insulina na 2,4, 2,2 i 2,0 Zn++/šest insulina (Tabela 15, Slika 8). Promena sistema konzervansa sa 25/25 mM fenola/m-Krezola na 60 mM fenola i 0 m-Krezola ima za rezutat dodatno pobolјšanje hemijske stabilnosti Jedinjenja 1 u kombinovanoj formulaciji.

Tabela 15: Čistoća Jedinjenja 1 u kombinovanoj formulaciji

2

Zaključak

Kada se ko-formuliše Jedinjenje 1 sa semaglutidom u formulaciji prema pronalasku, hemijska stabilnost Jedinjenja 1 se povećava, u poređenju sa upotrebom formulacije iz stanja tehnike (Formulacija I) za kombinovanu formulaciju Jedinjenja 1 i semaglutida.

Primer 7

PK svojstva ko-formulacija sa semaglutidom u LYD svinjskom PK modelu

Od Formulacija proizvedenih u Primeru 6, referentna mono Formulacija Jedinjenja 1 i Kombinacija 1 i Kombinacija 2 su okarakterisani u životinjskom LYD svinjskom PK modelu. Važno je da parametri PK tmaksand t1⁄2Jedinjenja 1, kao ni srednje vreme zadržavanja (MRT) Jedinjenja 1 nisu značajno promenjeni nakon ko-formulacije sa semaglutidom.

Sprovedena je unakrsna studija sa 16 životinja (n = 8 za svaku formulaciju).

Tabela 16: PK parametri Jedinjenja 1

Prosečne vrednosti ± standardne devijacije su prikazane.

PK parametri za Jedinjenje 1, kada su zajedno formulisani sa semaglutidom u Kombinaciji 1 i Kombinaciji 2, nisu značajno promenjeni u poređenju sa Jedinjenjem 1 koje se daje kao mono-formulacija. tmaksvrednosti su bile nešto niže za ko-formulacije, ali sa standardnom devijacijom za referencu Jedinjenja 1 vrednosti se preklapaju. t1⁄2i MRT su bili veoma slični za Jedinjenje 1 u ko-formulacijama u poređenju sa referentnom mono-formulacijom. U zaklјučku, ko-formulacija sa semaglutidom nije značajno uticala na svojstva PK Jedinjenja 1.

Primer 8

Pobolјšana veličina oligomera ko-formulacija sa izmenjenim puferom 60/0

Oligomerizacija kombinovanih Formulacija I-VI nastalih u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja Jedinjenja 1 određena je prema protokolu opisanom u Primeru 1. Rezultati su prikazani u Tabeli 17 i na Sl. 9A i Sl. 9B.

Tabela 17: Veličina oligomera kombinovanih formulacija

Zaključak

Ovi eksperimenti pokazuju da veličina oligomera nastalih u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja u velikoj meri zavisi od sadržaja cinka.

Prosečna veličina oligomera formiranih iz kombinovanih formulacija u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja značajno je smanjena u formulacijama sa niskim nivoom cinka (npr. 2,4 i 2,2 Zn++/šest insulina) u poređenju sa formulacijama sa visokim nivoom cinka (npr. 4,5 Zn++/šest insulina). Povećanje nivoa fenola i smanjenje nivoa m-Krezola dodatno smanjuju prosečnu veličinu oligomera nastalih iz kombinovanih formulacija u uslovima simuliranog mesta ubrizgavanja.

1

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži derivat insulina izabran iz grupe koja se sastoji iz

A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikosandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humanog insulina (Jedinjenje1);

A14E, B16H, B25H, B29K(N<ε>-Heksadekandioil-γGlu), desB30 humanog insulina (Jedinjenje 2);

A14E, B16H, B25H, B29K(N<ε>-Eikozandioil-γGlu), desB30 humanog insulina (Jedinjenje 3); i

A14E, B25H, desB27, B29K(N<ε>-Oktadekandioil-γGlu), desB30 humanog insulina (Jedinjenje 4); i dalje sadrži

od 1 do 2% (težina/težina) glicerola; od 45 do 75 mM fenola; od 0 do 19 mM m-Krezola; od 1,5 do 2,5 mola jona cinka na šest molova datog derivata insulina; od 5 do 50 mM natrijum hlorida; i ima pH vrednost u rasponu od 7,2 do 8,0.

2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, naznačena time što je derivat insulina A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humanog insulina (Jedinjenje1).

3. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, naznačena time što je količina derivata insulina u rasponu od 3,5 do 5,0 mM.

4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, koja sadrži od 45 do 75 mM fenola, kao što je od 55 mM do 65 mM fenola; ili sadrži 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM, 56 mM, 57 mM, 58 mM, 59 mM, 60 mM, 61 mM, 62 mM, 63 mM, 64 mM, 65 mM , 66 mM, 67 mM, 68 mM, 69 mM ili 70 mM fenola.

5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, naznačena time što sadrži od 0 do 19 mM m-Krezola, kao što je od 0 mM do 15 mM m-Krezola; ili sadrži 0 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM ili 15 mM m-Krezola.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, koja sadrži manje od 25 mM natrijum hlorida.

7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, koja sadrži

2

od 4,0 do 4,5 mM derivata insulina;

od 1 do 2% (težina/težina) glicerola;

od 50 do 70 mM fenola;

od 0 do 15 mM od m-krezola; od 2,0 do 2,5 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

ne više od 25 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost u rasponu od 7,2 do 7,6.

8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, koja sadrži 4,2 mM derivata insulina;

1,5% (težina/težina) glicerola;

60 mM fenola;

0 mM od m-Krezola;

2,2 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost 7,4.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, koja sadrži 4,2 mM derivata insulina;

1,5% (težina/težina) glicerola;

60 mM fenola;

od 10 mM od m-Krezola;

2,2 mola jona cinka na šest molova derivata insulina;

20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost 7,4.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-2, koja sadrži 4.2 mM A14E, B16H, B25H, B29K((N<ε>-Eikozandioil-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)etoksi]acetilamino}etoksi)etoksi]acetil)), desB30 humanog insulina (Jedinjenja 1);

1,5% (težina/težina) glicerola;

60 mM fenola;

10 mM od m-Krezola;

2,2 mola jona cinka na šest mola derivata insulina;

20 mM natrijum hlorida; i

ima pH vrednost 7,4.

11. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 10, za upotrebu kao lek za lečenje metaboličkog poremećaja.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 10, za upotrebu kao lek za lečenje ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa dijabetesom, dijabetesom tipa 1, dijabetesom tipa 2, poremećenom tolerancijom glukoze, hiperglikemijom, dislipidemijom, gojaznošću ili metaboličkim sindromom (metabolički sindrom X, sindrom insulinske rezistencije).

4