RS62832B1 - Tečna neurotoksin formulacija stabilizovana sa triptofanom ili tirozinom - Google Patents

Description

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na neurotoksinske formulacije bez tečnih životinjskih proteina. Naročito, predmetni pronalazak se odnosi na botulinum neurotoksinske formulacije bez tečnih životinjskih proteina stabilizovane se neproteinskim ekscipijentima. Neurotoksinske formulacije opisane ovde su pogodne za primenu u lečenju i naročito za primenu kod pacijenata kako bi se postigao željeni terapeutski ili estetski efekat.

STANJE TEHNIKE

[0002] Klostridijski neurotoksini koje prirodno proizvode klostridijski sojevi su najotrovniji biološki agensi do danas poznati i istovremeno su moćni alati za lečenje niza neuromuskularnih i endokrinih poremećaja, uključujući cervikalnu distoniju, spastičnost, blefarospazam, hiperhidrozu ili sialoreju. Takođe pronalaze upotrebu u estetskom polju za izravnavanje bora.

[0003] Da bi bio pogodan za upotrebu kao farmaceutski proizvod, kompozicija neurotoksina mora biti takav da se može čuvati bez značajnog gubitka aktivnosti neurotoksina.

[0004] U svim trenutno odobrenim formulacijama botulinskih neurotoksina, životinjski (uključujući ljudski) protein, obično humani serumski albumin (HSA), koristi se kao stabilizator.

[0005] Prisustvo životinjskih proteina, kao što je HSA, u farmaceutskim kompozicijama je, međutim, nepoželjno zbog rizika, čak i ako je nizak, od nevoljnog prenošenja zaraženih agenasa životinjskog porekla poput priona na pacijenta.

[0006] Formulacije botulinum toksina bez životinjskih proteina su otkrivene u tehnici. Na primer, WO 0158472 opisuje liofilizovane smeše u kojima se polisaharid, kao što je 2-hidroksietil skrob koristi za stabilizaciju botulinum toksina. WO 2005007185 opisuje kompozicije u kojima se površinski aktivna supstanca i smeša najmanje dve amino kiseline odabrane između Glu i Gln ili Asp i Asn koriste za stabilizaciju botulinskog toksina.

[0007] Većina formulacija iz stanja tehnike nije stabilna u tečnom obliku i zato se čuva u liofilizovanom ili zamrznutom obliku. Takve formulacije lekar treba da rekonstituiše u sterilnom fiziološkom rastvoru pre davanja pacijentu. Ovaj korak rekonstitucije povezan je sa gubitkom vremena lekara, rizikom od greške razblaživanja i rizikom od kontaminacije tokom procesa rekonstitucije. Dobavljač botulinskog toksina takođe mora da obuči lekare kako bi se osiguralo da se korak rekonstitucije izvede na adekvatan način.

[0008] Tečne formulacije su stoga korisne jer uklanjaju gubitak vremena za lekara, rizik od greške pri razblaživanju, rizik od kontaminacije i potrebu za pružanjem obuke za pružaoca usluga.

[0009] Tečne formulacije bez HSA opisane su, na primer, u WO 2006005910 koja otkriva tečne formulacije botulinum toksina koje sadrže površinski aktivnu supstancu, natrijum hlorid i disaharid. WO 2009008595 otkriva tečne formulacije botulinum toksina koje sadrže polisorbat 20 i metionin.

[0010] Cilj predmetnog pronalaska je da se obezbede povoljne formulacije botulinum neurotoksina bez tečnih životinjskih proteina, koje su pogodne za skladištenje i upotrebu u terapiji. Konkretno, stabilizujuća formulacija treba da održi stabilnost proizvoda, da ne sadrži životinjske proteine, a takođe da bude pogodna za stabilizaciju neurotoksina koji ne sadrži kompleksne proteine.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0011] Predmetni pronalazak jed efinisan sa patentnim zahtevima. Prvi aspekt predmetnog pronalaska je tečna kompozicija koja sadrži ili se sastoji u osnovi od proteinskog neurotoksina, surfaktanta, amino kiseline odabrane između triptofana i tirozina, pufer koji sadrži jone natrijuma, hlorida i fosfata, koji ima pH između 5.5 i 8, koja je stabilna u periodu od 2 meseca na 2-8 °C i u kojoj nema proteine životinjskog porekla.

[0012] Drugi aspekt je upotreba tečnih kompozicija prema pronalasku u terapiji i / ili u kozmetici.

[0013] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je upotreba amino kiseline odabrane između triptofana i tirozina za zaštitu proteinskog neurotoksina od razgradnje u tečnoj kompoziciji u kojoj nema proteina životinjskog porekla, pri čemu tečna kompozicija ostaje stavilna u periodu od 2 meseca na 2-8 °C.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0014] Prvi aspekt predmetnog pronalaska je tečna kompozicija koja sadrži ili se sastoji u osnovi od proteinskog neurotoksina, surfaktanta, amino kiseline odabrane između triptofana i tirozina, pufer koji sadrži jone natrijuma, hlorida i fosfata, koji ima pH između 5.5 i 8, koja je stabilna tokom vremena i u kojoj nema proteina životinjskog porekla.

[0015] Pod pojmom "bez životinjskih proteina" podrazumeva se da ne sadrži proteine životinjskog, uključujući ljudskog porekla.

[0016] Neurotoksin je supstanca koja cilja nervnu ćeliju i utiče na neurološku funkciju.

Proteinski neurotoksini uključuju botulinum toksine (BoNT) i tetanus toksin (TeNT). Poželjno je da je proteinski neurotoksin botulinum neurotoksin.

[0017] Botulinski neurotoksini su metaloproteaze od 150 kDa koje se sastoje u svom aktivnom obliku od 50 kDa lakog lanca (L) i od 100 kDa teškog lanca (H) povezani disulfidnim mostom. Lanac L je cink-proteaza koja intraćelijski cepa jedan od SNARE (rastvorljivi NSF Vezani protein REceptor) proteina koji su uključeni u oslobađanje neurotransmitera posredovano vezikulom, čime narušavaju mehanizme posredovane neurotransmiterima. Teški lanac obuhvata dva domena: N-terminalni 50 kDa domen translokacije (HN) i C-terminalni 50 kDa receptor-vezujući domen (HC). HCdomen botulinum neurotoksina sadrži dve različite strukturne karakteristike koje se nazivaju HCCi HCNdomeni. Veruje se da su ostaci amino kiselina koji su uključeni u vezivanje receptora primarno locirani u HCCdomenu.

[0018] Neutrotoksini botulina klasifikovani su u 7 antigenski različitih serotipova (A do G). Primeri amino kiselinskih sekvenci za svaki serotip ovde su dati kao SEQ ID NO 1 do 7.

[0019] Za svaku od sekvenci, različiti domeni mogu, na primer, biti sledeći.

[0020] Stručnjak će shvatiti da mogu postojati neke varijacije u svakom od botulinskih neurotoksinskih domena.

[0021] BoNT deluju, na primer, na spojeve neuromuskularnih nerava sprečavajući oslobađanje acetilholina i na taj način sprečavajući mišićnu kontrakciju. Opijenost nervnog terminala je reverzibilna i njegovo trajanje varira za različite serotipove BoNT.

[0022] Prirodni BoNTs proizvode Clostridium botulinum i druge klostridijalne vrste kao što su C. butiricum, C. baratii i C. argentinense kao deo multi-proteinskih kompleksa koji štite neurotoksin od proteolitičke degradacije. Pod „botulinum neurotoksinom u složenom obliku“ podrazumeva se botulinum neurotoksin i jedan ili više proteina koji su deo prirode takvih multi-proteinskih kompleksa (proteini povezani sa neurotoksinom ili „NAP“). NAP uključuju netoksični protein nehemaglutinin (NTNH) i hemaglutinin proteine (HA-17, HA-33 i HA-70). Pod izrazom "botulinum neurotokin visoke čistoće" podrazumeva se botulinum neurotokin koji u suštini nema NAPs.

[0023] Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin u složenom obliku. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin visoke čistoće.

[0024] Postupak za proizvodnju BoNTs kroz kulturu prirodnih sojeva klostridija i njihovo prečišćavanje u složenom obliku ili obliku visoke čistoće dobro je poznat u tehnici i opisani su na primer u Pickett, Andy. "Botulinum toxin as a clinical product: manufacture and pharmacology." Clinical Applications of Botulinum Neurotoxin. Springer New York, 2014.7-49.

[0025] Neutrotoksin botulinuma visoke čistoće ili u osnovi čist može se dobiti iz proteinskog kompleksa koji sadrži botulinum toksin, na primer, prema postupku opisanom u Current topics in Microbiology and Immunology (1995), 195, p.151-154.

[0026] Alternativno, botulinum neurotoksin visoke čistoće može se proizvesti rekombinantnom ekspresijom BoNT gena u heterolognom domaćinu kao što je E. coli i prečišćavati od njega.

[0027] Poželjno, proteinski neurotoksin je botulinum neurotoksin. Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin u složenom obliku. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin visoke čistoće.

[0028] Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin prečišćen iz svog prirodnog klostridijalnog soja. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin proizveden rekombinantno u heterolognom domaćinu kao što je E. coli.

[0029] Prema predmetnom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti BoNT serotipa A, B, C, D, E, F ili G.

[0030] Prema predmetnom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti modifikovani botulinum neurotoksin. Prema predmetnom pronalasku, "modifikovani BoNT" je BoNT koji ima amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7. Poželjno, modifikovani BoNT ima amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7. Poželjno, modifikovani BoNT je BoNT čija se amino kiselinska sekvenca razlikuje od SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 sa manje od 600, 400, 200, 150, 100, 50 ili 20 amino kiselinskih supstitucija, delecija ili dodavanja, na primer 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino kiselinskom supstitucijom, brisanja ili dodavanja.

[0031] Prema predmetnom pronalasku, rekombinantni botulinum neurotoksin može biti himerni botulinum neurotoksin. Prema predmetnom pronalasku, "himerni BoNT" se sastoji od L, HN, HCNi HCCdomena koji ne pripadaju istom serotipu. Na primer, himerni BoNT može da se sastoji od L lanca iz jednog serotipa i punog H lanca (HN, HCNi HCCdomeni) iz drugog serotipa. Himerni BoNT se takođe može sastojati od L lanca i HNdomena („LHN“) iz jednog serotipa i HCdomena (HCNi HCC) iz drugog serotipa. Himerni BoNT se takođe može sastojati od L lanca i HNi HCNdomena („produženi LHN“) iz jednog serotipa i HCCdomena iz drugog serotipa.

[0032] Prema pronalasku, domen lakog lanca (L) može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa jednom od sledećih amino kiselinskih sekvenci i koji zadržava sposobnost da cepa jedan od SNARE proteina koji su uključeni u oslobađanje neurotransmitera posredovano vezikulom:

• Amino kiselina 1-448 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 1-440 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 1-441 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 1-445 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 1-422 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 1-439 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 1-441 SEQ ID NO:7

[0033] Prema pronalasku, HNdomen može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa jednom od sledećih amino kiselinskih sekvenci i koja zadržava sposobnost translokacije:

• Amino kiselina 449-871 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 441-858 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 442-866 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 446-862 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 423-845 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 440-864 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 442-863 SEQ ID NO:7

[0034] Prema pronalasku, HCdomen može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa jednom od sledećih amino kiselinskih sekvenci i koja zadržava sposobnost vezivanja za nervnomuskularnu ćeliju:

• Amino kiselina 872-1296 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 859-1291 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 867-1291 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 863-1276 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 846-1252 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 865-1274 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 864-1297 SEQ ID NO:7

[0035] Prema pronalasku, HCCdomen može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa jednom od sledećih amino kiselinskih sekvenci i koja zadržava sposobnost vezivanja za nervnomuskularnu ćeliju:

• Amino kiselina 1111-1296 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 1098-1291 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 1112-1291 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 1099-1276 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 1086-1252 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 1106-1274 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 1106-1297 SEQ ID NO:7

[0036] Gore identifikovane referentne sekvence treba smatrati kao vodičem, jer se mogu pojaviti neznatne varijacije prema podserotipovima.

[0037] „Procentualni identitet sekvence“ između dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina ili amino kiselina je funkcija broja identičnih nukleotida / amino kiselina na identičnim pozicijama koje dele poravnate sekvence. Dakle, % identiteta može se izračunati kao broj identičnih nukleotida / amino kiselina na svakom položaju u poravnanju podeljen ukupnim brojem nukleotida / amino kiselina u poravnatoj sekvenci, pomnožen sa 100. Izračunavanje % identiteta sekvence takođe može uzeti uzeti u obzir broj praznina i dužinu svake praznine koju treba uvesti da bi se optimizovalo poravnanje dve ili više sekvenci. Poređenje sekvenci i određivanje procentualnog identiteta između dve ili više sekvenci može se izvršiti pomoću specifičnih matematičkih algoritama, kao što je BLAST, koji će biti poznati stručnjaku.

[0038] Surfaktanti (ili površinski aktivni agensi) su jedinjenja koja su u stanju da smanje površinski napon između tečnosti i čvrste supstance ili između dve tečnosti. Surfaktanti mogu biti nejonski, anjonski, katijonski ili amfoterni. U kompozicijama prema pronalasku, surfaktant je poželjno nejonski surfaktant. Nejonski površinski aktivni sastojci uključuju polioksietilen glikol alkil etre, kao što je oktaetilen glikol monododecil etar ili pentaetilen glikol monododecil etar; Polioksipropilen glikol alkil etri; Glukozid alkil etri, kao što su Decil glukozid, Lauril glukozid ili Oktil glukozid; Estri polioksietilen glikol oktilfenola, kao što je Triton X-100; Estri polioksietilen glikol alkilfenola, kao što je nonoksinol-9; Glicerol alkil estri, kao što je gliceril laurat;

Polioksietilen glikol sorbitan alkil estri, kao što su polisorbati; Sorbitan alkil estri, kao što su Spans; Kokamid MEA, kokamid DEA; Dodecildimetilamin oksid; Blok kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola, kao što su poloksameri; Polietoksilirani loj amin (POEA).

[0039] Prema poželjnom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži nejonski surfaktant koji je polisorbat, poželjno polisorbat 20 (PS20), polisorbat 60 (PS60) ili polisorbat 80 (PS80). Najpoželjnije, nejonski surfaktant je PS80. Kada je surfaktant polisorbat, njegova koncentracija je poželjno od 0.001% do 15% v/v, još poželjnije od 0.005 do 2% v/v, još poželjnije od 0.01 do 1%, na primer 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ili 1% v/v. Prema jednom rešenju, surfaktant je PS80 u koncentraciji od 0,05 do 0,2% v / v, na primer oko 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19 ili 0.20 % v/v.

[0040] PS20 ima gustinu od približno 1.1 g/mL. PS60 ima gustinu od približno 1.044 g/mL. PS80 ima gustinu od približno od 1.06 do 1.09 g/mL.

[0041] Veruje se da polisorbati obrazuju micele i sprečavaju adsorpciju proteina na površini i agregaciju proteina. Bez želje da se bude vezano za teoriju, veruje se da nakon razgradnje / oksidacije polisorbati mogu formirati perokside i kiseline koji mogu imati uticaj na stabilnost proteina. Zbog toga se smatra poželjnim da koncentracija polisorbata bude što niža u formulaciji proizvoda. Zbog toga se smatra poželjnim da koncentracija polisorbata ne prelazi 200 puta veću od kritične micelarne koncentracije (CMC), još poželjnije da ne prelazi 100, 50, 20, 10 ili 5 puta veću od njegove CMC.

[0042] Za PS20 (Mw 1227.5 g/mol), CMC je približno 8x10<-5>M na 21°C, odn. približno 0.01 % w/v.

[0043] Za PS60 (Mw 1309 g/mol), CMC je približno 21x10<-6>M na 21°C, odn. približno 0.003 % w/v.

[0044] Za PS80 (Mw 1310 g/mol), CMC je približno 12x10<-6>M na 21°C, odn. približno 0.002 % w/v.

[0045] Prema poželjnom rešenju, koncentracija polisorbata je između 1 i 200 puta veća od njegove CMC na datoj temperaturi, na primer oko 21 °C, poželjno između 2 i 100 puta veća od njegove CMC, na primer oko 20 ili 50 puta veća od njegove CMC.

[0046] Tečna kompozicija prema pronalasku sadrži amino kiselinu koja je triptofan ili tirozin. Bez želje da se bude vezano za teoriju, pretpostavlja se da triptofan ili tirozin mogu sprečiti oksidaciju aktivnog proteina zbog čega bi bio nefunkcionalan. Zapravo, smatra se da će amino kiselina dodata u molarnom višku nad neurotoksinom biti prvo oksidovana, štedeći neurotoksin. Takođe se pretpostavlja da triptofan ili tirozin mogu neutralisati reaktivne proizvode razgradnje površinski aktivnih supstanci kao što su polisorbati.

[0047] Poželjno je da je amino kiselina triptofan. Poželjnije, amino kiselina je L-triptofan.

[0048] Koncentracija amino kiselina je poželjno od oko 0.1 do 5 mg/ml, poželjnije između 0.1 i 5 mg/ml, od 0.25 do 3 mg/ml, na primer oko 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2 ili 3 mg/ml.

[0049] Kompozicija prema pronalasku sadrži pufer koji sadrži natrijum, hlorid i fosfatne jone. Pronalazači su zaista iznenađujuće otkrili da puferi bez natrijumovih, hloridnih i fosfatnih jona smanjuju stabilnost toksina. Poželjno je da pufer takođe sadrži jone kalijuma.

[0050] Pufer se na primer može dobiti kombinovanjem soli natrijum hlorida, kalijum hlorida i natrijum fosfata. Koncentracija natrijum hlorida je poželjno od 10 do 500 mM, poželjno od oko 25 do 300 mM, na primer oko 25, 50, 75, 100, 140, 150, 200, 250 ili 300 mM.

[0051] Koncentracija natrijum fosfata je poželjno od 1 do 100 mM, poželjno od 2 do 50 mM, na primer oko 2, 5, 10, 20, 30, 40 ili 50 mM.

[0052] Koncentracija kalijum hlorida je poželjno od 1 do 50 mM, poželjno od 1 do 10 mM, na primer oko 1, 2, 3, 4, 5 ili 10 mM.

[0053] Kompozicija prema pronalasku ima pH između 5.5 i 8. Prema poželjnom ostvarenju, pH je između 6.0 i 7.5, na primer oko 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75 , 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45 ili 7.5. Poželjno je da je pH unutar jedne jedinice od fiziološkog pH (koji je oko 7.4).

[0054] Kompozicija prema pronalasku je tečna. Kompozicija poželjno sadrži vodeni rastvarač, još poželjnije vodu, na primer sterilnu vodu, vodu za injekcije, prečišćenu vodu, sterilnu vodu za injekcije.

[0055] Poželjno je da je formulacija izotonična i pogodna za injekcije pacijentu, naročito ljudskom pacijentu.

[0056] Količina botulinskog neurotoksina obično se izražava u mišjim LD50 (letalna doza 50) jedinica, definisana kao srednja letalna intraperitonealna doza kod miševa.

[0057] Mišja LD50 (MLD50) jedinica za botulinum toksine nije standardizovana jedinica. Zaista, testovi koje koriste različiti proizvođDči toksina na tržištu posebno se razlikuju u izboru pufera za

1

razblaživanje. Na primer, test koji se koristi za Dysport® koristi pufer želatin-fosfat, dok test koji se koristi za BOTOX® koristi fiziološki rastvor kao razblaživač. Veruje se da puferi želatina štite toksin u visokim razblaženjima koja se koriste u testovima LD50. Nasuprot tome, smatra se da upotreba fiziološkog rastvora kao razblaživača dovodi do određenog gubitka jačine. Ovo bi moglo objasniti zašto je prilikom testiranja sa Dysport® testom jedna BOTOX® jedinica ekvivalentna približno tri jedinice Dysport® (Straughan, D. W. , 2006, ATLA 34(3), 305-313; Hambleton and Pickett, Hambleton, P., and A. M. Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87.11: 719).

[0058] Poželjno je da pufer za razblaživanje koji se koristi za određivanje mišjeg LD50 je želatin-fosfatni pufer. Na primer, mišji LD50 se može odrediti kako je opisano u Hambleton, P. et al. Production, purification and toxoiding of Clostridium botulinum type A toxin. Eds. G. E. Jr Lewis, and P. S. Angel. Academic Press, Inc., New York, USA, 1981, p.248. Ukratko, uzorci botulinum toksina se serijski razblažuju u 0.2% (m/v) želatinskom 0.07M puferu Na2HPO4pri pH 6.5. Grupama miševa (npr.4 do 8 miševa u grupi) težine oko 20 g ubrizgava se intraperitonealno uzorak razblaženog toksina (na primer 0.5 ml po životinji). Grupe za razređivanje, na primer 5 grupa za razblaživanje, su odabrane da obuhvate 50% dozu letalnosti. Miševi su posmatrani do 96 sati i procenjena je letalna doza mišjeg 50 (MLD50).

[0059] Kompozicija prema pronalasku poželjno sadrži od 4 do 10000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po ml, još poželjnije od 10 do 2000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po ml, na primer 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili 1500 LD50 jedinica botulinskog neurotoksina po ml.

[0060] Količina botulinskog neurotoksina takođe se može izraziti u ng. Kompozicija prema pronalasku poželjno sadrži od oko 0.01 do 75 ng botulinum neurotoksina po ml, još poželjnije od oko 0,03 do 20 ng botulinum neurotoksina po ml, još poželjnije od oko 0.1 do 15 ng botulinum neurotoksina po ml, na primer oko 0.15, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ng botulinskog neurotoksina po ml.

[0061] Formulacija prema pronalasku ne sadrži životinjske proteine. Konkretno, kompozicije prema pronalasku ne sadrže albumin, a naročito ne albumin humanog seruma. Poželjno je da je kompozicija prema pronalasku bez životinjskih proizvoda, što znači da ne sadrži sastojke životinjskog (uključujući ljudsko) poreklo. Poželjno, kompozicija prema pronalasku ne sadrži nijedan protein osim proteinskog neurotoksina. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku ne sadrži nijedan protein osim proteinskog neurotoksina i jedan ili više NAP (proteini povezani sa neurotoksinom). Sumnje radi, primećeno je da amino kiseline nisu proteini.

[0062] Prema rešenju pronalaska, kompozicija ne sadrži saharide, uključujući monosaharide, disaharide i polisaharide.

[0063] Tečna kompozicija prema pronalasku je stabilan tokom vremena. Na primer, stabilan je 2 meseca na 2 do 8 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 3 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema poželjnom rešenju, stabilan je 6 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 12 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 18 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 24 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 6 meseci na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 2 meseca na 37°C.

[0064] Tečna kompozicicja prema pronalasku se poželjno čuva na temperaturi između 0 ° i 30 °C. U poželjnom rešenju, čuva se na 2-8 °C, na primer na 5 °C. U još jednom rešenju, čuva se na sobnoj temperaturi. Poželjno je da nije smrznuto.

[0065] Stabilnost se može proceniti upoređivanjem aktivnosti botulinum neurotoksina tokom vremena. Aktivnost botulinskog neurotoksina može se odnositi na sposobnost aktivnosti botulinskog neurotoksina da se veže za svoj ciljni receptor u ćeliji, da translocira laki lanac u ćeliju i / ili da cepa svoj ciljni SNARE protein.

[0066] Postupci za merenje aktivnosti botulinum neurotoksina dobro su poznati u tehnici.

Aktivnost botulinskog neurotoksina može se proceniti, na primer, korišćenjem testa letalnosti miša (LD50), kao što je gore opisano, testa zasnovanog na mišićnom tkivu, kao što je test hemidiafragme mišića freničnog nerva (na primer kao što je opisano u Bigalke, H. and Rummel A., Toxins 7.12 (2015):4895-4905), analizi zasnovanoj na ćelijama (na primer kao što je opisano u WO 201349508 ili u WO 2012166943) ili analiza esktraćelijske proteolitičke aktivnosti kao što je BoTest® (Botulinum Neurotoxin Detection Kit dostupan od BioSentinel Inc.).

[0067] Poželjno, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od datog procenta gubitka aktivnosti tokom datog vremenskog perioda i na datoj temperaturi.

[0068] Prema jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od 30% gubitka u ekstaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer ne više od 30% gubitka u ekstaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 6 meseci na 5 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 20% gubitka u esktaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 3 meseca na 5 °C, još poželjnije tokom 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 5 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od 40% gubitka u esktaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 30% gubitka u ekstaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 3 meseca na 25 °C, još poželjnije tokom 6 meseci na 25 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema preko 50% gubitka u ekstaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 2 meseca na 37 °C. Ekstraćelijska proteolitička aktivnost može se meriti pomoću BoTest® testa.

[0069] Prema jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako na primer MLD50 nema gubitaka više od 30% tokom 2, 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer ne više od 30% gubitka u MLD50 jedinicama tokom 6 meseci na 5 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 20% gubitaka u MLD50 jedinicama tokom 2 meseca na 5 °C, još poželjnije tokom 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 5 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od 40% gubitka u MLD50 jedinicama tokom 2 ili 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 30% gubitka u MLD50 jedinicama tokom 3 meseca na 25 °C, poželjnije tokom 6 meseci na 25 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako ne postoji gubitak od više od 50% u jedinicama MLD50 tokom 2 meseca na 37 °C. MLD50 jedinice se mogu meriti kako je gore navedeno.

[0070] Tečne kompozicije prema pronalasku se mogu čuvati u zapečDćenim bočicama ili špricevima, na primer u staklenim bočicama ili špricevima, poželjno staklenim bočicama tipa 1 (ili “telesno neutralnim“). Poželjno je da u bočici ili špricu nema ili ima vrlo malo kiseonika. Bočice ili špricevi se mogu na primer napuniti u atmosferi sa kiseonikom ispod 100 ppm, poželjno ispod 50 ppm, a gas azota se može koristiti kao zaštitna atmosfera u bočicama. Kada se koriste staklene bočice, mogu se, na primer, zatvoriti hlorobutilnim ili brombutil gumenim čepovima, što mogu biti čepovi obloženi FluroTec®. Poželjno je da se tečne kompozicije prema pronalasku čuvaju u staklenim bočicama zatvorenim čepovima obloženim FluroTec®.

1

[0071] Prema jednom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o 4 do 10000 LD50 jedinice botulinum neurotoksin per mL,

o 0.001 do 15% v/v polisorbat,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 10 do 500 mM NaCl,

o 1 do 50 mM KCl,

o 1 do 100 mM Natrijum fosfat,

ima pH između 5.5 i 8, i stabilan je 6 meseci na 5°C.

[0072] Prema jednom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o 10 do 2000 LD50 jedinice botulinum neurotoksin po mL,

o 0.005 do 2% v/v polisorbat,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 25 do 300 mM NaCl,

o 1 do 10 mM KCl,

o 2 do 50 mM Natrijum fosfat,

ima pH između 6.0 i 7.5, i stabilan je 12 meseci na 5°C.

[0073] Prema jednom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o 10 do 2000 LD50 jedinice botulinum neurotoksin po mL,

o 0.05 do 0.2% v/v polisorbat 80,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 25 do 300 mM NaCl,

o 1 do 10 mM KCl,

o 2 do 50 mM Natrijum fosfat,

ima pH između 6.0 i 7.5, i stabilan je 12 meseci na 5°C.

[0074] Prema jednom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.2% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.6.

[0075] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.04% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.9.

[0076] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 0.25% v/v polisorbat 20,

o 4 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0077] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.01% v/v polisorbat 80,

o 0.25 mg/mL triptofan

1

o 255 mM NaCl,

o 2 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 7.2.

[0078] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.01% v/v polisorbat 80,

o 0.25 mg/mL triptofan

o 255 mM NaCl,

o 10 mM KCl,

o 50 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.3.

[0079] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 1% v/v polisorbat 80,

o 0.25 mg/mL triptofan

o 255 mM NaCl,

o 50 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.3.

[0080] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 1% v/v polisorbat 80,

o 3 mg/mL triptofan,

o 255 mM NaCl,

o 10 mM KCl,

o 50 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 7.2.

1

[0081] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.1% v/v polisorbat 80,

o 1.625 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0082] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.01% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0083] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.1% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0084] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

1

o Botulinum neurotoksin A,

o 1% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0085] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 15% v/v polisorbat 20,

o 1 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0086] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 15% v/v polisorbat 20,

o 4 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0087] Prema drugom rešenju, tečna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 0.25% v/v polisorbat 20,

o 4 mg/mL triptofan

1

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri čemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0088] Sledeći aspekt je upotreba tečnih kompozicija prema pronalasku u terapiji.

[0089] Tečne kompozicije prema pronalasku se mogu koristiti u terapiji za lečenje ili prevenciju mišićnih poremećaja, neuromišićnih poremećaja, neuroloških poremećaja, oftalmoloških poremećaja, poremećaja bola, psiholoških poremećaja, zglobnih poremećaja, zapaljenskih poremećaja, endokrinih poremećaja ili uroloških poremećaja.

[0090] Na primer, tečne kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju bolesti, stanja ili sindroma odabranih između sledećih:

• oftalmološki poremećaji izabrani iz grupe koju čine blefarospazam, strabizam (uključujući restriktivni ili miogeni strabizam), ambliopija, oscilopsija, zaštitna ptoza, terapijska ptoza za zaštitu rožnjače, nistagmus, estropija, diplopija, entropion, uvlačenje kapaka, orbitalna miopatija, heterophoria, misiopatija , nekontrolisana neusklađenost, primarna ili sekundarna ezotropija ili egzotropija, internuklearna oftalmoplegija, koso odstupanje, Duaneov sindrom i povlačenje gornjeg kapka;

• poremećaji pokreta, uključujući hemifacijalni spazam, tortikolis, spastičnost deteta ili odrasle osobe (npr. kod cerebralne paralize, post-moždanog udara, multiple skleroze, traumatičnih povreda mozga ili pacijenata sa povredom kičmene moždine), idiopatske fokalne distonije, ukočenost mišića, grč pisca, šaka distonija, VI paraliza nerva, oromandibularna distonija, tremor glave, tardivna diskinezija, tardivna distonija, profesionalni grčevi (uključujući grčeve muzičara), paraliza facijalnog nerva, grč zatvaranja vilice, grč lica, sinkinezija, tremor, primarni tremor pisanja, mioklonus, ukočenost sindrom osobe, distonija stopala, paraliza lica, sindrom bolne ruke i pokreta prstiju, tički poremećaji, distonični tikovi, Tourette-ov sindrom, neuromiotonija, drhtava brada, bočna paraliza rektusa, inverzija distoničnog stopala, distonija vilice, zečji sindrom, cerebelarni tremor, paraliza nerva III, nepčani mioklonus, akastezija, grčevi mišića, paraliza IV nerva, smrzavanje hoda, ekstenzorska trunkalna distonija, sinkeza paralize facijalnog nerva, sekundarna distonija, Par kinsonova bolest, Huntingtonova horeja, epilepsija, distonija van perioda, cefalični tetanus, miokimija i sindrom benignih grčeva-fascikulacije;

• otorinolaringološki poremećaji uključujući spazmodičnu disfoniju, poremećaje otisa, oštećenje sluha, klik u uhu, tinitus, vrtoglavicu, Meniere-ovu bolest, disfunkcija kohlearnog nerva,

1

mucanje, krifofaringealna disfagija, bruksizam, zatvaranje grkljana u hroničnoj aspiraciji, granulom vokalne šupljine, ventrikularna distonija, ventrikularna distonija mutacijska disfonija, trizmus, hrkanje, glasovni tremor, aspiracija, distonija izbočenja jezika, nepčani tremor, duboki ugriz usne i larinksne distonije; Sindrom prvog ugriza;

• gastrointestinalni poremećaji, uključujući ahalaziju, analnu fisuru, zatvor, disfunkciju temperomandibularnog zgloba, sfinkter Odijeve disfunkcije, trajni sfinkter Odijeve hipertenzije, poremećaji crevnih mišića, puborectalis sindrom, anismus, spazm pilora, disfunkcija žučne kese, poremećaj pokretljivosti gastrointestinalnog ili ezofagealnog spazma i gastropareza; • urogenitalni poremećaji, uključujući detruzor sfinktera disinergija, detruzor hiperrefleksija, neurogena disfunkcija bešike (npr. kod Parkinsonove bolesti, povreda kičmene moždine, moždani udar ili multipla skleroza), prekomerna aktivnost bešike, prekomerna aktivnost neurogenog detruzora, grčevi bešike, urinarna inkontinencija, zadržavanje mokraće, hipertrofirani vrat bešike disfunkcija voidinga, intersticijski cistitis, vaginizam, endometrioza, bol u karlici, povećanje prostate (benigna hiperplazija prostate), prostatodinija, rak prostate i priapizam;

• dermatološki poremećaji, uključujući proliferativne poremećaje kožnih ćelija, kožne rane, psorijazu, rozaceju, akne; retki nasledni poremećaji kože poput Fok-Fordice sindroma ili Hailei-Haileijeve bolesti; smanjenje keloidnih i hipertrofičnih ožiljaka; smanjenje veličine pora; inflamatorna stanja kože; bolna upalna stanja kože;

• poremećaji bola, uključujući bol u leđima (bol u gornjem delu leđa, bol u donjem delu leđa), miofascijalni bol, tenzijska glavobolja, fibromialgija, bolni sindromi, mijalgija, migrena, bič, zglobovi, postoperativni bol, bol koji nije povezan sa grčem mišića i bolom povezanim sa poremećajima glatkih mišića;

• inflamatorni poremećaji uključujući pankreatitis, neurogeni inflamatorni poremećaji (uključujući giht, tendonitis, bursitis, dermatomiozitis i ankilozirajući spondilitis);

• sekretorni poremećaji kao što su prekomerno lučenje žlezda, hiperhidroza (uključujući aksilarnu hiperhidrozu, palmarnu hiperhidrozu i Frei-ov sindrom), hipersalivacija, sialorrhoea, bromhidroza, hipersekrecija sluzi, hiperakrimacija, disfunkcija holokrinih žlezda; višak lučenja sebuma;

• respiratorni poremećaji, uključujući rinitis (uključujući alergijski rinitis), HOBP, astmu i tuberkulozu;

• hipertrofični poremećaji, uključujući povećanje mišića, maseteričnu hipertrofiju, akromegaliju i neurogenu prednju hipertrofiju tibialisa sa mijalgijom;

• zglobni poremećaji uključujući teniski lakat (ili epikondilitis lakta), upale zglobova, koksartroza, osteoartritis, patologija rotatorne mišićne kape ramena, reumatoidni artritis i sindrom karpalnog tunel;

2

• endokrini poremećaji poput dijabetesa tipa 2, hiperglukagonizam, hiperinsulinizam, hipoinzulinizam, hiperkalcemija, hipokalcemija, poremećaji štitne žlezde (uključujući Graveovu bolest, tiroiditis, Hashimotov tiroiditis, hipertireoza i hipotiroidizam), paratireoidni poremećaji (uključujući hiperparatiroidizam i hipoparatireoidizam), Gushingov sindrom i gojaznost;

• autoimune bolesti poput sistemskog eritemskog lupusa;

• proliferativne bolesti, uključujući tumore paraganglioma, rak prostate i tumore kostiju;

• traumatične povrede, uključujući sportske povrede, povrede mišića, rane tetiva i frakture kostiju; i

• veterinarska upotreba (npr. imobilizacija sisara, konjske kolike, ahalazija životinja ili grčevi mišića životinja).

[0091] Tečna kompozicija prema pronalasku mogu se takođe koristiti u estetskoj medicini (to jest za poboljšanje kozmetičkog izgleda), posebno za lečenje ili sprečavanje bora na koži, posebno bora na licu, kao što su mrštene linije lica, bore konture oka, linije namrgođenih glabelara, oborena usta, bore na vratu (platismalne trake), bore na bradi (mentalis, peau d'orange, udubljena brada), linije čela, bore „ogrebane kože“, tretman za podizanje nosa ili linije spavanja. Prema ovom aspektu pronalaska, subjekat koji se leči ili sprečava za poboljšanje kozmetičkog izgleda poželjno ne pati od bilo kog od gore opisanih poremećaja, stanja ili sindroma. Još poželjnije, pomenuti subjekt je zdrav subjekt (tj. ne pati od bilo koje bolesti, stanja ili sindroma).

[0092] Tečne kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapijskim jedinjenjem. U jednom rešenju tečne kompozicije prema pronalasku se daju u kombinaciji sa analgetičkim jedinjenjem za lečenje bola, naročito u kombinaciji sa opioidnim derivatom kao što je morfijum kako je opisano u WO 2007/144493 čiji je sadržaj ovde uključen referencom. U još jednom rešenju, tečne kompozicije prema pronalasku se daju u kombinaciji sa hijaluronskom kiselinom, na primer za lečenje karcinoma prostate kako je opisano u WO 2015/0444416 čiji je sadržaj ovde uključen referencom.

[0093] Sledeći aspekt ovog pronalaska je upotreba amino kiseline odabrane između triptofana i tirozina za zaštitu proteinskog neurotoksina od razgradnje u tečnoj kompoziciji koji nema proteine životinjskog porekla.

[0094] Prema poželjnom rešenju, amino kiselina je triptofan, još poželjnije L-triptofan.

[0095] Poželjno je da je proteinski neurotoksin botulinum neurotoksin. Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin u složenom obliku. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin visoke čistoće. Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin prečišćen iz svog prirodnog soja klostridija. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin proizveden rekombinantno u heterolognom domaćinu kao što je E. coli. Prema ovom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti BoNT serotipa A, B, C, D, E, F ili G. Prema ovom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti modifikovani botulinum neurotoksin kako je gore opisano. Prema ovom pronalasku, rekombinantni botulinum neurotoksin može biti himerni botulinum neurotoksin kako je gore opisano.

[0096] Prema poželjnom rešenju, amino kiselina se koristi u kombinaciji sa površinski aktivnom supstancom i puferom koji sadrži natrijum, hlorid i fosfat jone, a tečna kompozicija ima pH između 5.5 i 8. Poželjno je da je površinski aktivna supstanca nejonsko površinski aktivna susptanca još poželjnije polisorbat, na primer PS20, PS60 ili PS80. Najpoželjnije, nejonska površinski aktivna supstanca je PS80. Poželjno je da pufer takođe sadrži jone kalijuma. Pufer se može dobiti, na primer, kombinovanjem soli natrijum hlorida, kalijum hlorida i natrijum fosfat. Prema poželjnom rešenju, pH je između 6.0 i 7.5, na primer 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75, 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45 ili 7.5. Poželjno je da je pH unutar jedne jedinice od fiziološkog pH (koji je oko 7.4).

[0097] Prema poželjnom rešenju upotrebe prema pronalasku, tečna kompozicija je stabilna 2 meseca. Na primer, stabilna je 2 meseca na 2 do 8 ° C. Prema jednom rešenju, stabilna je 3 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema poželjnom rešenju, stabilna je 6 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilna je 12 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 18 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 24 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 6 meseci na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C.

PRIMERI

1. Priprema stabilnih tečnih botulinum toksin A formulacija

[0098] Tečni preparati botulinum toksina koji sadrže 15 ng/mL visoko prečišćenog BoNT/A, 15% v/v polisorbat 20, amino kiselinu izabranu između tirozina (Tyr), triptofana (Trp) i cisteina (Cys) ili smeše metionina (Met), tirozina (Tyr), triptofana (Trp) i cisteina (Cys) (Sigma Aldrich), i Slani Rastvor Fosfatnog Pufera (PBS iz Calbiochem) (140 mM NaCl, 10 mM natrijum fosfat i 3 mM KCl pri pH 7.4 na 25°C) su pripremljeni, filtrirani korišćenjem 0.22 mm PVDF (poliviniliden flourid) filtera i čuvani u silikonizovanim 2 mL staklenim špricevima na 6 dana na 40°C, nakon čega je izvršen test potencije za svaki preparat.

[0099] Za test potencije, špricevi koji su sadržali preparate ispraznili su se u staklene bočice od 2 ml (Chromacol, Gold) sa poklopcima koji sadrže PTFE tretirane gumene pregrade (Chromacol) ili u 1.7 ml plastične epruvete za mikro centrifugu (Axygen, Maximum Recovery), gde obe imaju niska svojstva adsorpcije proteina. Preparati su zatim razblaženi korišćenjem 0.9% rastvora NaCl sa 3% humanim serumskom albumina (HSA). Za svaki preparat, istog dana kada je izvedeno i razblaživanje, ubrizgano je 50 ml uzorka u mišić Gastrocnemius miševa. Miševi su praćeni 3 dana i zabeležen je stepen paralize.

[0100] Rezultati su prikazani u tabeli 1.

Tabela 1 - ubrzani test skladištenja (6 dana na 40 °C) amino kiselinskih dodataka na BoNT/A stabilnost. Rezultati paralize kod miševa: - = nisu analizirani, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

2

[0101] Utvrđeno je da tirozin i triptofan imaju zaštitni efekat protiv razgradnje BoNT/A. Utvrđeno je da Triptofan ima najjači zaštitni efekat. Cistein, kao i smeša koja sadrži sve 4 amino kiseline, nisu imale zaštitni efekat.

2. Priprema stabilne tečne botulinum toksin B formulacije

[0102] Tečni preparati botulinum toksina koji sadrže 350 ng/mL visoko prečišćenog BoNT / B, 15% v/v polisorbata 20, amino kiselinu odabranu između tirozina (Tir), triptofana (Trp) i cisteina (Cis) ili smeše metionina (Met ), tirozin (Tir), triptofan (Trp) i cistein (Cis) i slani rastvor fosfatnog pufera (PBS) pri pH 7.4 su pripremljeni, filtrirani uz pomoć filtera 0.22 mm i čuvani u silikonizovanim 2 ml staklenim špricevima dve nedelje na 40 °C , nakon čega je izvršen test potencije za svaki preparat kako je gore opisano.

[0103] Rezultati su prikazani u tabeli 2.

Tabela 2 - ubrzani test skladištenja (dve nedelje na 40 °C) amino kiselinskih dodataka na BoNT/B stabilnost. Rezultati paralize kod miševa: - = nisu analizirani, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

[0104] Utvrđeno je da tirozin i triptofan imaju zaštitni efekat protiv razgradnje BoNT/B. Cistein, kao i smeša koja sadrži sve 4 amino kiseline, takođe je imao zaštitni efekat, ali u slabijoj meri.

3. Procena različitih koncentracija triptofana i polisorbata 20

[0105] Pripremljeni su tečni botulinum toksin preparati koji sadrže visoko prečišćeni BoNT/A ili BoNT / B i različite koncentracije polisorbata 20 (PS 20) i triptofana i slani rastvor fosfatnog pufera (PBS) na pH 7.4, filtrirani uz pomoć 0.22 µm filtera i čuvani u silikonizovanim 2 ml staklene špricevima. Ispitivanja potencije paralize zadnjih udova izvedena su za svaki preparat, kao što je gore opisano.

[0106] Rezultati su prikazani u tabeli 3.

Tabela 3 - procena koncentracija Trp i polisorbat 20 (PS20) na BoNT/A ili BoNT/B stabilnost. Rezultati paralize kod miševa: - = nije analizirana, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

2

4. Procena različitih koncentracija soli u BoNT/B preparatima

[0107] Tečni preparati botulinum toksina koji sadrže 100 ng/ml visoko prečišćenog BoNT/B, polisorbat 20, triptofan različitih dobavljača amino kiselina i pufer odabran od PBS pH 7.4

2

(Calbiochem), 12 nM fosfat pufera pH 7 (Apoteket) i 20 mM natrijuma acetat (NaAc) pH 5.5 (NaAc iz Fluka i sirćetna kiselina iz Merck) pripremljeni su, filtrirani uz pomoć filtera od 0.22 mm i čuvani u silikonizovanim staklenim špricevima od 2 ml. Ispitivanja potencije paralize zadnjih udova izvedena su za svaki preparat, kao što je gore opisano.

[0108] Rezultati su prikazani u tabeli 4.

Tabela 4 - procena različitih koncentracija soli na stabilnost BoNT/B. Rezultati paralize kod miševa: - = nis analizirani, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

[0109] Rezultati pokazuju da preparati koji sadrže PBS pufer (koji sadrže natrijum, hlorid, fosfat i kalijumove jone) imaju ulogu u stabilnosti botulinum toksina.

5. Procena različitih stabilizatora

[0110] Pripremljeni su tečni preparati botulinum toksina koji sadrže 15 ng/ml visoko prečišćenog BoNT/A, polisorbat 20 (PS20) ili polisorbat 80 (PS80) ili HSA, triptofan i PBS, filtrirani uz pomoć filtera 0.22 mm i čuvani u silikonizovanim staklenim špricevima od 2 ml. Ispitivanja potencije paralize zadnjih udova izvedena su za svaki preparat, kao što je gore opisano.

2

[0111] Rezultati su prikazani u tabeli 5.

Tabela 5 - procena različitih površinski aktivnih supstanci na stabilnost BoNT/A. Rezultati paralize kod miševa: - = nije analiziran, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

6. Procena različitih formulacija

2

[0112] Tečni preparati botulinum toksina koji sadrže 10 ng/ml visoko prečišćenog BoNT/A, 0.25% PS80, 1 mg/ml triptofana i PBS su pripremljeni kako je gore opisano. pH se podesi na 6.6 i 7.0 dodavanjem HCl. Svaki preparat je čuvan 5 nedelja na 40 °C.

[0113] Svaki preparat je zatim razblažen 10 puta i izvedeni su testovi potencije paralize zadnjih udova kako je gore opisano (0.05 ng po injekciji). U oba slučaja, paraliza zadnjih udova primećena je na dan 3. Paraliza je bila jača sa preparatom pH 6.6.

7. Procena različitih formulacija

[0114] Tečni preparati botulinum toksina koji sadrže 0.3 ng/ml visoko prečišćenog BoNT/A, polisorbat odabran između PS20 i PS80, 1 mg/ml triptofana i 12 mM PBS pri pH 7.4 pripremljeni su kako je gore opisano. Dodavanjem 1.2 M HCl se pH svakog preparata podesi na pH 6.6 ili 6.9.

[0115] Polisorbat 20 je testiran u jednoj koncentraciji, 0.2% v/v, što odgovara oko 20 puta većoj od njegove CMC (kritična micelarna koncentracija, oko 0.01% v/v na 21 °C). Polisorbat 80 je testiran na 0.04% i 0.2% m/v, što odgovara oko 20 i 100 puta više od njega CMC (oko 0.002% w/v na 21°C).

Tabela 6 - Izbor polisorbata i pH

[0116] Za svaki preparat, zapremina od 0.5 ml je punjena u staklene špriceve dužine 1 ml (BD) i zapečDćena klipom obloženim fluorokarbonom.

[0117] Potencija je izmerena testom paralize zadnjih udova kod miševa, kao što je gore opisano.

[0118] Nije opaženo smanjenje potencije ni u jednoj formulaciji nakon 6 meseci čuvanja na 5 °C i posle 25 °C.

2

8. Procena različitih formulacija

[0119] Izrađeno je devetnaest različitih formulacija koje sadrže visoko prečišćeni botulinum neurotoksin tipa A sa različitim koncentracijama polisorbata 80, triptofana, natrijum fosfat, natrijum hlorida, kalijum hlorida i promenljive pH. Svaka formulacija je imala ciljanu nominalnu snagu od 500 U/mL. Svaka formulacija je degasirana, filtrirana kroz filter od 0.2 µm i napunjena u bočice. Kao zaštitna atmosfera u bočicama korišćen je azotni gas. Punjenje je izvršeno u anaerobnoj komori. Svaka formulacija je punjena u 1 ml alikvota u atmosferi azota u staklene bočice od 2 ml, zatvorene zatvaračima FluroTec®, zapečDćene aluminijumskim zatvaračima i odložene uspravno.

[0120] Stabilnost 19 formulacija procenjena je na 5 °C, 25 °C i 37 °C upotrebom BoTest® za merenje potencije.

Tabela 7 – Kompozicije ekscipijensa

Tabela 8 – Komponente pakovanja

[0121] Za sve formulacije rešenje je ostalo bistro i za većinu delova bezbojno.

[0122] Koncentracije ekscipijenasa testirane u ovoj studiji izgleda da ne utiču na pH formulacije tokom ispitivanog vremenskog intervala. Rezultati potencije su predstavljeni u tabeli 9.

Tabela 9 - Rezultati najbolje potencije

1

[0123] Za nekoliko kompozicija nije bilo više od 30% gubitka u potenciji tokom 6 meseci na 5 °C i / ili ne više od oko 40% gubitka u potenciji tokom 3 meseca na 25 °C i / ili ne više od oko 50% gubitka u potencija tokom 2 meseca na 37 °C .

9. Procena PS 60

[0124] Formulacija koja sadrži visoko prečišćeni botulinum neurotoksin tipa A je pripremljena sa 0.1% (v/v) PS60, 1 mg/mL L-Triptofana, 10 mM natrijum fosfatom, 140 mM natrijum hlorida, 3 mM kalijum hlorida i vodom za injekcije. pH se podesi na 6.75 sa HCl. Formulacija je imala ciljnu nominalnu snagu od 100 U/mL. Formulacija je degasirana, filtrirana kroz filtere od 0.2 mm i aseptično punjena u bočice od 2 ml u anaerobnoj komori sa atmosferom azota sa zapreminom punjenja od 1 ml. Azotni gas je korišćen kao zaštitna atmosfera u bočicama. Bočice su zatvorene zatvaračima FluroTec®, zaptivenim aluminijumskim zatvaračima.

Tabela 10 – Komponente pakovanja

[0125] Potencija tokom vremena na 37 °C i 25 °C izmerena je pomoću MLD50 testa kako je ovde opisano.

[0126] Na 37 °C, preostala potencija nakon 9 nedelja bila je oko 50-55% od početne potencije.

[0127] Na 25 °C, preostala potencija nakon 3 meseca bila je oko 80% od početne potencije.

2

�

�

�

�

4

�

�

�

�

2

�

�

�

4

1

�

�

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Tečna kompozicija koja sadrži proteinski neurotoksin, površinski aktivnu susptancu, amino kiselinu izabranu između triptofana i tirozina, pufer koji sadrži natrijum, hlorid i fosfat jone, pri čemu navedena tečna kompozicija ima pH između 5.5 i 8,

pri čemu navedena kompozicija ne sadrži proteine životinjskog porekla i

pri čemu navedena tečna kompozicija je stabilna tokom perioda od 2 meseca na 2-8 °C.

2. Tečna kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu navedena površinski aktivna supstanca je ne jonska površinski aktivna supstanca.

3. Tečna kompozicija prema zahtevu 2, pri čemu navedena ne jonska površinski aktivna supstanca je polisorbat, poželjno Polisorbat 20, Polisorbat 60 ili Polisorbat 80.

4. Tečna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu navedena amino kiselina je triptofan, poželjno L-triptofan.

5. Tečna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu navedeni pufer dalje sadrži jone kalijuma; i/ili

pri čemu navedena kompozicija ima pH između 6.0 i 7.5; i/ili

pri čemu se ne dogodi više od 30% gubitka u ekstaćelijskoj proteolitičkoj aktivnosti tokom 2, 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 5°C.

6. Tečna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu navedeni proteinski neurotoksin je botulinum neurotoksin, odabran od prirodnog botulinum neurotoksina u složenom obliku, prirodnog botulinum neurotoksina visoke čistoće i rekombinantnog botulinum neurotoksina, poželjno

pri čemu navedeni botulinum neurotoksin je rekombinantni botulinum neurotoksin odabran između botulinum neurotoksina A, B, C, D, E, F ili G, modifikovanog botulinum neurotoksina i himernog botulinum neurotoksina.

7. Tečna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu navedena tečna kompozicija sadrži:

o 4 do 10000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po mL,

o 0.001 do 15% v/v polisorbat,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 10 do 500 mM NaCl,

o 1 do 50 mM KCl,

o 1 do 100 mM Natrijum fosfat,

ima pH između 5.5 i 8, i stabilna je 12 meseci na 5°C.

8. Tečna kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu navedena tečna kompozicija sadrži:

o 10 do 2000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po mL,

o 0.05 do 0.2% v/v polisorbat 80,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 25 do 300 mM NaCl,

o 1 do 10 mM KCl,

o 2 do 50 mM Natrijum fosfata,

ima pH između 6.0 i 7.5, i stabilna je 18 meseci na 5°C.

9. Tečna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 8 za primenu u terapiji.

10. Tečna kompozicija prema zahtevu 9 za primenu u lečenju ili prevenciji mišićnih poremećaja, neuromišićnih poremećaja, neuroloških poremećaja, oftalmoloških poremećaja, poremećaja bola, psiholoških poremećaja, zglobnih poremećaja, inflamatornih poremećaja, endokrinih poremećaja ili uroloških poremećaja.

11. Primena tečne kompozicije prema bilo kom od zahteva 1 do 8 u estetskoj medicini, na primer za lečenje ili prevenciju bora na koži, posebno bora na licu kao što su mrštene linije lica, bore na konturi oka, glabelarne linije mrštenja, oborena usta, bore na vratu (platismalne trake), bore na koži brada (mentalis, peau d'orange, udubljena brada), linije čela, bore "ogrebane kože", tretman podizanja nosa ili linije spavanja.

12. Primena amino kiseline odabrane između triptofana i tirozina za zaštitu proteinskog neurotoksina od razgradnje u tečnoj kompoziciji koja je bez proteina životinjskog porekla, pri čemu tečna kompozicija ostaje stabilna tokom perioda od 2 meseca na 2-8 °C.

13. Primena prema zahtevu 12, pri čemu navedena amino kiselina je triptofan.

14. Primena prema zahtevu 12 ili 13, pri čemu navedeni proteinski neurotoksin je botulinum neurotoksin.

15. Primena prema zahtevu 12, pri čemu se navedena amino kiselina koristi u kombinaciji sa površinski aktivnom supstancom i puferom koji sadrži jone natrijuma, hlorida i fosfata, a navedena tečna kompozicija ima pH između 5.5 i 8.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5