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ES2911124T3 - Formulación líquida de neurotoxina estabilizada con triptófano o tirosina - Google Patents

Formulación líquida de neurotoxina estabilizada con triptófano o tirosina Download PDF

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ES2911124T3
ES2911124T3 ES20152386T ES20152386T ES2911124T3 ES 2911124 T3 ES2911124 T3 ES 2911124T3 ES 20152386 T ES20152386 T ES 20152386T ES 20152386 T ES20152386 T ES 20152386T ES 2911124 T3 ES2911124 T3 ES 2911124T3
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ES
Spain
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liquid composition
botulinum neurotoxin
tryptophan
neurotoxin
disorders
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Active
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ES20152386T
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English (en)
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Anders Jarstad
Anna Friis
Ulf Stahl
Ann Gurell
Barbro Agren
Emilia Edstrom
Andrew Pickett
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Galderma Holding SA
Ipsen Biopharm Ltd
Original Assignee
Galderma Holding SA
Ipsen Biopharm Ltd
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Abstract

Composición líquida que comprende una neurotoxina proteica, un tensioactivo, un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina, un tampón que comprende iones sodio, cloruro y fosfato, en la que dicha composición líquida tiene un pH entre 5,5 y 8, en la que dicha composición líquida está libre de proteínas de origen animal, y en la que dicha composición líquida es estable durante 2 meses a 2-8 ºC.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulación líquida de neurotoxina estabilizada con triptófano o tirosina
La presente invención se refiere a formulaciones líquidas de neurotoxinas libres de proteína animal. En particular, la presente invención se refiere a formulaciones líquidas de neurotoxina botulínica libres de proteína animal estabilizadas con excipientes no proteicos.
Las formulaciones de neurotoxinas descritas en el presente documento son adecuadas para su uso en terapia y, en particular, para la administración a un paciente para lograr un efecto terapéutico o estético deseado.
ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN
Las neurotoxinas clostridiales producidas de forma natural por cepas clostridiales son los agentes biológicos más tóxicos conocidos hasta la fecha y, al mismo tiempo, son herramientas poderosas para el tratamiento de una serie de trastornos neuromusculares y endocrinos, que incluyen distonía cervical, espasticidad, blefaroespasmo, hiperhidrosis o sialorrea. También son útiles en el campo estético para el suavizado de arrugas.
Con el fin de ser adecuados para su uso como un producto farmacéutico, una composición de neurotoxina debe ser tal que se pueda almacenar sin pérdida significativa de la actividad de la neurotoxina.
En todas las formulaciones actualmente aprobadas de neurotoxinas botulínicas, se utiliza una proteína animal (incluyendo humana), por lo general, albúmina de suero humano (HSA), como estabilizante.
La presencia de proteínas animales, tales como HSA, en composiciones farmacéuticas es, sin embargo, indeseable debido al riesgo, incluso si bajo, de transmitir involuntariamente agentes infecciosos transmitidos por animales, tales como priones, a un paciente.
Las formulaciones de toxina botulínica libres de proteína animal se han descrito en la técnica. Por ejemplo, el documento WO0158472 describe composiciones liofilizadas en las que se usa un polisacárido, tal como 2-hidroxietil almidón, para estabilizar una toxina botulínica. El documento WO2005007185 describe composiciones en las que se usa una sustancia tensioactiva y una mezcla de al menos dos aminoácidos seleccionados entre Glu y Gln o Asp y Asn para estabilizar una toxina botulínica.
La mayoría de las formulaciones de la técnica anterior, sin embargo, no son estables en forma líquida y, por tanto, se almacenan en forma liofilizada o secada por congelación. Estas formulaciones deben ser reconstituidas por el médico en una solución salina estéril antes de su administración a un paciente. Esta etapa de reconstitución está asociada con una pérdida de tiempo del médico, un riesgo de error de dilución y también un riesgo de contaminación durante el proceso de reconstitución. El proveedor de la toxina botulínica también debe entrenar a los médicos para asegurarse de que la etapa de reconstitución se realiza de manera adecuada.
Las formulaciones líquidas son, por lo tanto, ventajosas, ya que obvian la pérdida de tiempo para el médico, el riesgo de un error de dilución, el riesgo de contaminación y la necesidad de proporcionar formación por el proveedor.
Las formulaciones líquidas libres de HSA se describen por ejemplo en WO2006005910, que describe formulaciones líquidas de toxina botulínica que comprenden un tensioactivo, cloruro de sodio y un disacárido. El documento WO2009008595 describe formulaciones líquidas de toxina botulínica que comprenden polisorbato 20 y metionina. Un objetivo de la presente invención es proporcionar formulaciones líquidas ventajosas de neurotoxina botulínica libres de proteína animal, que sean adecuadas para el almacenamiento y para uso en terapia. En particular, la formulación estabilizadora debe mantener la estabilidad del producto, estar libre de proteínas animales y también ser adecuada para estabilizar una neurotoxina que esté libre de proteínas complejantes.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones. Un primer aspecto de la presente invención es una composición líquida que comprende o que consiste esencialmente en una neurotoxina proteica, un tensioactivo, un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina, un tampón que comprende iones sodio, cloruro y fosfato, que tiene un pH entre 5,5 y 8, que es estable durante 2 meses a 2-8 °C y que está libre de proteínas de origen animal.
Otro aspecto es el uso de las composiciones líquidas según la presente invención en terapia y/o en cosmética. Un aspecto adicional de la presente invención es el uso de un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina para proteger una neurotoxina proteica de la degradación en una composición líquida que está libre de proteínas de origen animal, en donde la composición líquida permanece estable durante 2 meses a 2-8°C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente divulgación es una composición líquida que comprende o que consiste esencialmente en una neurotoxina proteica, un tensioactivo, un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina, un tampón que comprende iones sodio, cloruro y fosfato, que tiene un pH entre 5,5 y 8, que es estable en el tiempo y que está libre de proteínas de origen animal.
Debe entenderse por "libre de proteína animal" que no comprende proteína de origen animal, incluido de origen humano.
Una neurotoxina es una sustancia que reconoce una célula nerviosa y afecta una función neurológica. Las neurotoxinas proteicas incluyen toxinas botulínicas (BoNT) y toxina tetánica (TeNT). Preferiblemente, la neurotoxina proteica es una neurotoxina botulínica.
Las neurotoxinas botulínicas son metaloproteasas de 150 kDa que consisten en su forma activa en una cadena ligera (L) de 50 kDa y una cadena pesada (H) de 100 kDa unidas por un puente disulfuro. La cadena L es una zinc-proteasa que escinde intracelularmente una de las proteínas SNARE (Soluble NSF Attachment Protein REceptor) involucradas en la liberación de neurotransmisores mediada por vesículas, interrumpiendo así los mecanismos mediados por neurotransmisores. La cadena pesada comprende dos dominios: un dominio de translocación de 50 kDa N-terminal (Hn) y un dominio de unión al receptor de 50 kDa C-terminal (Hc). El dominio Hc de una neurotoxina botulínica comprende dos características estructurales distintas que se conocen como los dominios Hcc y Hcn. Se cree que los residuos de aminoácidos implicados en la unión al receptor se localizan principalmente en el dominio Hcc.
Las neurotoxinas botulínicas se han clasificado en 7 serotipos antigénicamente distintos (A a G). Se proporcionan en el presente documento las secuencias de aminoácidos de ejemplo para cada serotipo como SEQ ID NO 1 a 7.
Para cada una de las secuencias, los diferentes dominios pueden ser por ejemplo de la siguiente manera.
Figure imgf000003_0001
El experto enenderá que puede haber alguna variación en cada uno de los dominios de la neurotoxina botulínica.
Las BoNT actúan, por ejemplo, sobre las uniones nerviosas neuromusculares impidiendo la liberación de acetilcolina y evitando así la contracción muscular. La intoxicación terminal del nervio es reversible y su duración varía para diferentes serotipos de NTBo.
Las BoNT naturales son producidas por Clostridium botulinum, y otras especies clostridiales, tales como C. butyricum, C. baratii y C. argentinense como parte de complejos de múltiples proteínas que protegen la neurotoxina de la degradación proteolítica. Por "neurotoxina botulínica en forma compleja" se entiende una neurotoxina botulínica y una o más de las proteínas que forman parte de la naturaleza de dichos complejos de múltiples proteínas (proteínas asociadas a neurotoxinas o "NAP"). Las NAP incluyen proteínas no tóxicas no de hemaglutinina (NTNH) y proteínas de hemaglutinina (HA-17, HA-33 y HA-70). Por "neurotoxina botulínica de alta pureza" se entiende una neurotoxina botulínica esencialmente libre de NAP.
Según una realización de la presente invención, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica en forma compleja. Según otra realización, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica de alta pureza.
Los procedimientos para producir BoNT a través del cultivo de cepas clostridiales naturales y purificarlas en forma compleja o en forma de alta pureza son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Pickett, Andy. "Botulinum toxin as a clinical product: manufacture and pharmacology”, Clinical applications of Botulinim Neurotoxin. Springer Nueva York, 2014. 7-49.
La neurotoxina botulínica de alta pureza o esencialmente pura se puede obtener a partir de un complejo de proteínas que comprende la toxina botulínica, por ejemplo, según el procedimiento descrito en Current topics in Microbiology and Immunology (1995), 195, pág. 151-154.
Alternativamente, la neurotoxina botulínica de alta pureza se puede producir mediante la expresión recombinante de un gen de BoNT en un huésped heterólogo, tal como E. coli, y se purifica a partir de la misma.
Preferiblemente, la neurotoxina proteica es una neurotoxina botulínica. Según una realización de la presente invención, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica en forma de complejo. Según otra realización, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica de alta pureza.
Según una realización de la presente invención, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica purificada a partir de su cepa clostridial natural. Según otra realización, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica producida de forma recombinante en un huésped heterólogo, tal como E. coli.
Según la presente invención, la neurotoxina botulínica puede ser una BoNT del serotipo A, B, C, D, E, F o G.
Según la presente invención, una neurotoxina botulínica puede ser una neurotoxina botulínica modificada. Según la presente invención, una "BoNT modificada" es una BoNT que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7. Preferiblemente, una BoNT tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO 1, 2, 3 , 4 , 5, 6 o 7. Preferiblemente, una BoNT modificada es una BoNT cuya secuencia de aminoácidos difiere de las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 en menos de 600, 400, 200, 150, 100, 50 o 20 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, por ejemplo mediante sustituciones, deleciones o adiciones de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos.
Según la presente invención, una neurotoxina botulínica recombinante puede ser una neurotoxina botulínica quimérica. Según la presente invención, una "BoNT quimérica" está constituida por un dominio L, Hn, Hcn y Hcc que no pertenecen todos al mismo serotipo. Por ejemplo, una BoNT quimérica puede consistir en una cadena L de un serotipo y una cadena H completa (dominios Hn, Hcn y Hcc) de un serotipo diferente. Una BoNT quimérica también puede consistir en una cadena L y un dominio Hn ("LHn") de un serotipo y un dominio He (Hcn y Hcc) de un serotipo diferente. Una BoNT quimérica también puede consistir en una cadena L y dominios Hn y Hcn ("LHn extendido") de un serotipo y un dominio Hee de un serotipo diferente.
Según la presente invención, un dominio de cadena ligera (L) puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una de las siguientes secuencias de aminoácidos y que conserva la capacidad de escindir una de las proteínas SNARE involucradas en la liberación de neurotransmisores mediada por vesículas:
- Aminoácido 1-448 de SEQ ID NO: 1
- Aminoácido 1-440 de SEQ ID NO: 2
- Aminoácido 1-441 de SEQ ID NO: 3
- Aminoácido 1-445 de SEQ ID NO: 4
- Aminoácido 1-422 de SEQ ID NO: 5
- Aminoácido 1-439 de SEQ ID NO: 6
- Aminoácido 1-441 de SEQ ID NO: 7
Según la presente invención, un dominio Hn puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una de las siguientes secuencias de aminoácidos y que conserva una capacidad de translocación:
- Aminoácido 449-871 de SEQ ID NO: 1
- Aminoácido 441-858 de SEQ ID NO: 2
- Aminoácido 442-866 de SEQ ID NO: 3
- Aminoácido 446-862 de SEQ ID NO: 4
- Aminoácido 423-845 de SEQ ID NO: 5
- Aminoácido 440-864 de SEQ ID NO: 6
- Aminoácido 442-863 de SEQ ID NO: 7
Según la presente invención, un dominio He puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una de las siguientes secuencias de aminoácidos y que conserva la capacidad de unirse a una célula neuromuscular:
- Aminoácido 872-1296 de SEQ ID NO: 1
- Aminoácido 859-1291 de SEQ ID NO: 2
- Aminoácido 867-1291 de SEQ ID NO: 3
- Aminoácido 863-1276 de SEQ ID NO: 4
- Aminoácido 846-1252 de SEQ ID NO: 5
- Aminoácido 865-1274 de SEQ ID NO: 6
- Aminoácido 864-1297 de SEQ ID NO: 7
Según la presente invención, un dominio Hee puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una de las siguientes secuencias de aminoácidos y que conserva la capacidad de unirse a una célula neuromuscular:
- Aminoácido 1111-1296 de SEQ ID NO: 1
- Aminoácido 1098-1291 de SEQ ID NO: 2
- Aminoácido 1112-1291 de SEQ ID NO: 3
- Aminoácido 1099-1276 de SEQ ID NO: 4
- Aminoácido 1086-1252 de SEQ ID NO: 5
-Aminoácido 1106-1274 de SEQ ID NO: 6
-Aminoácido 1106-1297 de SEQ ID NO: 7
Las secuencias de referencia identificadas anteriormente deben considerarse como una guía, ya que pueden producirse ligeras variaciones según los subserotipos.
El "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos es función del número de nucleótidos/aminoácidos idénticos en posiciones idénticas compartidas por las secuencias alineadas. Por lo tanto, el % de identidad se puede calcular como el número de nucleótidos/aminoácidos idénticos en cada posición en una alineación dividido por el número total de nucleótidos/aminoácidos en la secuencia alineada, multiplicado por 100. Los cálculos del % de identidad de secuencia también pueden tener en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que debe introducirse para optimizar la alineación de dos o más secuencias. Las comparaciones de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias se pueden llevar a cabo usando algoritmos matemáticos específicos, tales como BLAST, que resultarán familiares para un experto.
Los tensioactivos (o agentes tensioactivos) son compuestos que son capaces de reducir la tensión superficial entre un líquido y un sólido o entre dos líquidos. Los tensioactivos pueden ser no iónicos, aniónicos, catiónicos o anfóteros. En las composiciones según la presente invención, el tensioactivo es preferiblemente un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos incluyen éteres alquílicos de polioxietilenglicol, tales como éter monododecílico de octaetilenglicol o éter monododecílico de pentaetilenglicol; éteres alquílicos de polioxipropilenglicol; éteres alquílicos de glucósido, tales como decilglucósido, laurilglucósido o octilglucósido; éteres de octilfenol de polioxietilenglicol, tales como Triton X-100; éteres de alquilfenol de polioxietilenglicol, tales como Nonoxinol-9; Ésteres alquílicos de glicerol, tales como laurato de glicerilo; ésteres alquílicos de polioxietilenglicol sorbitán, tales como polisorbatos; ésteres alquílicos de sorbitán, tales como Spans; Cocamida MEA, cocamida DEA; óxido de dodecildimetilamina; copolímeros de bloque de polietilenglicol y polipropilenglicol, tales como poloxámeros; amina de sebo polietoxilada (POEA).
Según una realización preferida, la composición líquida según la presente invención comprende un tensioactivo no iónico que es un polisorbato, preferiblemente polisorbato 20 (PS20), polisorbato 60 (PS60) o polisorbato 80 (PS80). Lo más preferiblemente, el tensioactivo no iónico es PS80. Cuando el tensioactivo es un polisorbato, su concentración es preferiblemente de 0,001 % a 15 % v/v, más preferiblemente de 0,005 a 2 % v/v, más preferiblemente aún de 0,01 a 1 %, por ejemplo, 0,01,0,05, 0,1,0,2, 0,5 o 1 % v/v. Según una realización, el tensioactivo es PS80 a una concentración de 0,05 a 0,2 % v/v, por ejemplo, aproximadamente 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19 o 0,20 % v/v.
El PS20 tiene una densidad de aproximadamente 1,1 g/ml. PS60 tiene una densidad de aproximadamente 1,044 g/ml. PS80 tiene una densidad de aproximadamente 1,06 a 1,09 g/ml.
Los polisorbatos se cree que forman micelas y evitan la adsorción de proteínas a las superficies y la agregación de proteínas. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que tras la degradación/oxidación, los polisorbatos pueden formar peróxidos y ácidos que pueden tener un efecto sobre la estabilidad de las proteínas. Por tanto, se considera preferible que la concentración de polisorbato sea lo más baja posible en la formulación del producto. Por lo tanto, se considera preferible que la concentración de polisorbato no exceda 200 veces su concentración micelar crítica (CMC), más preferiblemente no debe exceder 100, 50, 20, 10 o 5 veces su CMC.
Para PS20 (PM 1227,5 g/mol), la CMC es de aproximadamente 8 x 10'5 M a 21 °C, es decir, aproximadamente 0,01 % p/v.
Para PS60 (PM 1309 g/mol), la CMC es de aproximadamente 21 x 10'6 M a 21 °C, es decir, aproximadamente 0,003 % p/v.
Para PS80 (PM 1310 g/mol), la CMC es de aproximadamente 12 x 10'6 M a 21 °C, es decir, aproximadamente 0,002% p/v.
Según una realización preferida, la concentración de polisorbato es de entre 1 y 200 veces su CMC a una temperatura determinada, por ejemplo aproximadamente 21 °C, preferiblemente entre 2 y 100 veces su CMC, por ejemplo aproximadamente 20 o 50 veces su CMC .
La composición líquida según la presente invención comprende un aminoácido que es triptófano o tirosina. Sin querer estar ligado a la teoría, se plantea la hipótesis de que el triptófano o la tirosina pueden prevenir la oxidación de la proteína activa, lo que la haría no funcional. De hecho, se cree que el aminoácido agregado en exceso molar sobre la neurotoxina se oxidará en primer lugar, salvando la neurotoxina. También se plantea la hipótesis de que el triptófano o la tirosina pueden neutralizar los productos reactivos de degradación de los tensioactivos, tales como los polisorbatos.
Preferiblemente, el aminoácido es triptófano. Más preferiblemente, el aminoácido es L-triptófano.
La concentración de aminoácido es preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 5 mg/ml, más preferiblemente entre 0,1 y 5 mg/ml, de 0,25 y 3 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 o 3 mg/ml.
La composición según la presente invención comprende un tampón que comprende iones de sodio, cloruro y fosfato. De hecho, los inventores descubrieron sorprendentemente que los tampones sin iones sodio, cloruro y fosfato reducían la estabilidad de la toxina. Preferiblemente, el tampón también comprende iones potasio.
El tampón puede, por ejemplo, obtenerse mediante la combinación de sales de cloruro de sodio, cloruro de potasio y fosfato de sodio. La concentración de cloruro de sodio es preferiblemente de 10 a 500 mM, preferiblemente de aproximadamente 25 a 300 mM, por ejemplo, aproximadamente 25, 50, 75, 100, 140, 150, 200, 250 o 300 mM.
La concentración de fosfato de sodio es preferiblemente de 1 a 100 mM, preferiblemente de 2 a 50 mm, por ejemplo aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 mM.
La concentración de cloruro de potasio es preferiblemente de 1 a 50 mM, preferiblemente de 1 a 10 mm, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 10 mM.
La composición según la presente invención tiene un pH entre 5,5 y 8. Según una realización preferida, el pH está entre 6,0 y 7,5, por ejemplo aproximadamente 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45 o 7,5. Preferiblemente, el pH está dentro de una unidad del pH fisiológico (que es alrededor de 7,4).
La composición según la presente invención es líquida. La composición comprende preferiblemente un diluyente acuoso, más preferiblemente agua, por ejemplo, agua estéril, agua para inyección, agua purificada, agua estéril para inyección.
Preferiblemente, la formulación es isotónica y es adecuada para la inyección a un paciente, en particular un paciente humano.
La cantidad de neurotoxina botulínica se expresa habitualmente en unidades de LD50 (dosis letal 50) en ratón, que se define como la dosis intraperitoneal letal media en ratones.
La unidad de LD50 (MLD50) en ratón para toxinas botulínicas no es una unidad estandarizada. De hecho, los ensayos utilizados por diferentes fabricantes de toxinas comercializadas difieren en particular en la elección del tampón de dilución. Por ejemplo, la prueba usada para Dysport® usa tampón de fosfato de gelatina, mientras que la prueba usada para BOTOX® usa solución salina como diluyente. Se cree que los tampones de gelatina protegen la toxina a las altas diluciones utilizadas en los ensayos de LD50. Por el contrario, se cree que el uso de solución salina como diluyente conduce a una cierta pérdida de potencia. Esto podría explicar por qué cuando se prueba con el ensayo de Dysport®, una unidad BOTOX® equivale aproximadamente a tres unidades de Dysport (Straughan, DW, 2006, ATLA 34 (3), 305­ 313; Hambleton y Pickett, Hambleton, P., y AM Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87.11: 719).
Preferiblemente, el tampón de dilución utilizado para determinar la LD50 en ratón es un tampón de fosfato de gelatina. Por ejemplo, la LD50 en ratón se puede determinar tal como se describe en Hambleton, P. et al. Production, purification and toxoiding of Clostridium botulinum type Atoxin. Eds. G.E. Jr Lewis y P.S. Angel. Academic Press, Inc., Nueva York, EE.UU., 1981, pág. 248. Brevemente, las muestras de toxina botulínica se diluyen en serie en tampón de Na2HPO40,07 M en gelatina al 0,2 % (p/v) a pH 6,5. A grupos de ratones (por ejemplo, 4 a 8 ratones por grupo) que pesan aproximadamente 20 g se les inyecta por vía intraperitoneal una muestra de toxina diluida (por ejemplo, 0,5 ml por animal). Los grupos de dilución, por ejemplo 5 grupos de dilución, se seleccionan para abarcar la dosis de letalidad del 50 %. Los ratones se observan durante hasta 96 horas y se estima la dosis letal 50 en ratón (MLD50).
La composición según la presente invención comprende preferiblemente de 4 a 10000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml, más preferiblemente de 10 a 2000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml, por ejemplo 20, 30, 40, 50, 75, 100 , 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o 1500 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml.
La cantidad de neurotoxina botulínica también se puede expresar en ng. La composición según la presente invención comprende preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 75 ng de neurotoxina botulínica por ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,03 a 20 ng de neurotoxina botulínica por ml, más preferiblemente aún de aproximadamente 0,1 a 15 ng de neurotoxina botulínica por ml, por ejemplo aproximadamente 0,15, 0,3, 0,5, 0,75, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ng de neurotoxina botulínica por ml.
La formulación según la presente invención está libres de proteínas animales. En particular, las composiciones según la presente invención no comprenden albúmina y, en particular, no comprenden albúmina de suero humano. Preferiblemente, la composición según la presente invención está libre de productos animales, lo que significa que no comprende ningún componente de origen animal (incluido humano). Preferiblemente, la composición según la presente invención no comprende otra proteína que no sea la neurotoxina proteica. Según otra realización, la composición según la presente invención no comprende otra proteína que no sea la neurotoxina proteica y una o más NAP (proteínas asociadas a neurotoxinas). Por si hay dudas, cabe indicar que los aminoácidos no son proteínas.
Según una realización de la presente invención, la composición no comprende sacáridos, incluyendo monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
La composición líquida según la presente invención es estable en el tiempo. Por ejemplo, es estable durante 2 meses entre 2 y 8 °C. Según una realización, es estable durante 3 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo, a 5 °C. Según una realización preferida, es estable durante 6 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo, a 5 °C. Según una realización, es estable durante 12 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo, a 5 °C. Según una realización, es estable durante 18 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo, a 5 °C. Según una realización, es estable durante 24 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo, a 5 °C. Según una realización, es estable durante 36 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización, es estable durante 3 meses a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C. Según una realización, es estable durante 6 meses a temperatura ambiente, por ejemplo a 25 °C. Según una realización, es estable durante 2 meses a 37 °C.
La composición líquida según la presente invención se almacena preferiblemente a una temperatura entre 0 °C y 30 °C. En una realización preferida, se almacena a 2-8 °C, por ejemplo, a 5 °C. En otra realización, se almacena a temperatura ambiente. Preferiblemente no está congelada.
La estabilidad se puede evaluar mediante la comparación de la actividad de la neurotoxina botulínica a lo largo del tiempo. La actividad de la neurotoxina botulínica puede referirse a la capacidad de la actividad de la neurotoxina botulínica de unirse a su receptor diana en una célula, translocar la cadena ligera en una célula y/o escindir su proteína SNARE diana.
Los procedimientos para medir la actividad de la neurotoxina botulínica son bien conocidos en la técnica. La actividad de la neurotoxina botulínica se puede evaluar, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo de letalidad en ratón (LD50), tal como se describe anteriormente, un ensayo basado en tejido muscular, tal como el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico del ratón (por ejemplo, tal como se describe en Bigalke, H. y Rummel A., Toxins 7.12 (2015): 4895­ 4905), un ensayo basado en células (por ejemplo, tal como se describe en el documento WO201349508 o en el documento WO2012166943) o un ensayo de actividad proteolítica extracelular, tal como BoTest® (Botulinum Neurotoxin Detection Kit disponible de BioSentinel Inc.).
Preferiblemente, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más que un determinado porcentaje de pérdida de actividad durante un período determinado de tiempo y a una temperatura determinada.
Según una realización, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 30% de pérdida de actividad proteolítica extracelular durante 3, 6, 12, 18, 24 o 36 meses de 2 a 8 °C, por ejemplo no más del 30% de pérdida de actividad proteolítica extracelular durante 6 meses a 5 °C. Preferiblemente, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 20% de pérdida de actividad proteolítica extracelular durante 3 meses a 5 °C, más preferiblemente durante 6, 12, 18, 24 o 36 meses a 5 °C. Según otra realización, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 40% de pérdida de actividad proteolítica extracelular durante 3 meses a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25 °C. Preferiblemente, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 30 % de pérdida de actividad proteolítica extracelular durante 3 meses a 25 °C, más preferiblemente durante 6 meses a 25 °C. Según otra realización, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 50% de pérdida de actividad proteolítica extracelular durante 2 meses a 37 °C. La actividad proteolítica extracelular se puede medir con el ensayo BoTest®.
Según una realización, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 30% de pérdida en unidades MLD50 durante 2, 3, 6, 12, 18, 24 o 36 meses a 2 a 8 °C, por ejemplo, no más del 30% de pérdida en unidades MLD50 durante 6 meses a 5 °C. Preferiblemente, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 20% de pérdida en unidades MLD50 durante 2 meses a 5 °C, más preferiblemente durante 3, 6, 12, 18, 24 o 36 meses a 5 °C. Según otra realización, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 40% de pérdida en unidades MLD50 durante 2 o 3 meses a temperatura ambiente, por ejemplo, a 25°C. Preferiblemente, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 30% de pérdida en unidades MLD50 durante 3 meses a 25°C, más preferiblemente, durante 6 meses a 25°C. Según otra realización, una composición según la presente invención se considera estable si no hay más del 50% de pérdida en unidades MLD50 durante 2 meses a 37 °C. Las unidades MLD50 se pueden medir como se indicó anteriormente.
Las composiciones líquidas según la presente invención pueden almacenarse en viales o jeringas selladas, por ejemplo, viales o jeringuillas de vidrio, preferiblemente viales de vidrio o jeringuillas de tipo 1 (o "neutrales de cuerpo"). Preferiblemente, hay muy poco o nada de oxígeno en el vial o la jeringa. Los viales o jeringas se pueden llenar, por ejemplo, en una atmósfera con oxígeno por debajo de 100 ppm, preferiblemente por debajo de 50 ppm, y se puede usar gas nitrógeno como atmósfera protectora en los viales. Cuando se utilizan viales de vidrio, se pueden tapar, por ejemplo, con tapones de goma de clorobutilo o bromobutilo, que pueden ser tapones recubiertos con FluroTec®. Preferiblemente, las composiciones líquidas según la presente invención se almacenan en viales de vidrio tapados con tapones recubiertos con FluroTec®.
Según una realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: -de 4 a 10000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml,
-de 0,001 a 15% v/vde polisorbato,
-de 0,1 a 5 mg/ml de triptófano,
- de 10 a 500 mM de NaCl,
- de 1 a 50 mM de KCl,
-de 1 a 100 mM de fosfato de sodio,
tiene un pH entre 5,5 y 8, y es estable durante 6 meses a 5 °C.
Según una realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: -de 10 a 2000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml,
- de 0,005 a 2% v/v de polisorbato,
-de 0,1 a 5 mg/ml de triptófano,
-de 25 a 300 mM de NaCl,
-de 1 a 10 mM de KCl,
-de 2 a 50 mM de fosfato de sodio,
tiene un pH entre 6,0 y 7,5, y es estable durante 12 meses a 5 °C.
Según una realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: -de 10 a 2000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml,
- de 0,05 a 0,2 % v/v de polisorbato 80,
- de 0,1 a 5 mg/ml de triptófano,
- de 25 a 300 mM de NaCl,
- de 1 a 10 mM de KCl,
- de 2 a 50 mM de fosfato de sodio,
tiene un pH entre 6,0 y 7,5, y es estable durante 12 meses a 5 °C.
Según una realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,2 % v/v de polisorbato 80,
- 1 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
- 3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,6.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,04 % v/v de polisorbato 80,
- 1 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
- 3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,9.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica B,
- 0,25 % v/v de polisorbato 20,
- 4 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
- 3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 7,4.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,01 % v/v de polisorbato 80,
- 0,25 mg/ml de triptófano,
- 255 mM de NaCI,
- 2 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 7,2.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,01 % v/v de polisorbato 80,
- 0,25 mg/ml de triptófano,
- 255 mM de NaCl,
- 10 mM de KCl,
- 50 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,3.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 1 % v/v de polisorbato 80,
- 0,25 mg/ml de triptófano,
- 255 mM de NaCl,
- 50 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,3.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 1 % v/v de polisorbato 80,
- 3 mg/ml de triptófano,
- 255 mM de NaCl,
-10 mM de KCl,
- 50 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 7,2.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,1 % v/v de polisorbato 80,
- 1,625 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
-3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,75.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,01 % v/v de polisorbato 80,
- 1 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
-3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,75.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 0,1 % v/v de polisorbato 80,
- 1 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
-3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,75.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica A,
- 1 % v/v de polisorbato 80,
- 1 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
- 3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 6,75.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica B,
- 15 % v/v de polisorbato 20,
- 1 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
-3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 7,4.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica B,
- 15 % v/v de polisorbato 20,
- 4 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
-3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 7,4.
Según otra realización, una composición líquida según la presente invención comprende o consiste esencialmente en: - neurotoxina botulínica B,
- 0,25 % v/v de polisorbato 80,
- 4 mg/ml de triptófano,
- 140 mM de NaCl,
-3 mM de KCl,
- 10 mM de fosfato de sodio,
en la que el pH de dicha composición es aproximadamente 7,4.
Otro aspecto es el uso de las composiciones líquidas según la presente invención en terapia.
Las composiciones líquidas según la presente invención se pueden usar en terapia para tratar o prevenir trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos neurológicos, trastornos oftalmológicos, trastornos del dolor, trastornos psicológicos, trastornos articulares, trastornos inflamatorios, trastornos endocrinos o trastornos urológicos.
Por ejemplo, las composiciones líquidas según la presente invención se pueden usar para tratar o prevenir una enfermedad, afección o síndrome seleccionado entre los siguientes:
- trastornos oftalmológicos seleccionados del grupo que consiste en blefaroespasmo, estrabismo (incluido el estrabismo restrictivo o miogénico), ambliopía, oscilopsia, ptosis protectora, ptosis terapéutica para la protección corneal, nistagmo, estropía, diplopía, entropión, retracción palpebral, miopatía orbitaria, heteroforia, desalineación concomitante, desalineación no concomitante, esotropía o exotropía primaria o secundaria, oftalmoplejía internuclear, desviación oblicua, síndrome de Duane y retracción del párpado superior;
- trastornos del movimiento que incluyen espasmo hemifacial, tortícolis, espasticidad del niño o del adulto (por ejemplo, en pacientes con parálisis cerebral, pacientes que han sufrido un accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, lesión cerebral traumática o lesión de la médula espinal), distonías focales idiopáticas, rigidez muscular, calambres del escritor, distonía de la mano, parálisis del nervio VI, distonía oromandibular, temblor de cabeza, discinesia tardía, distonía tardía, calambres ocupacionales (incluidos calambres de músicos), parálisis del nervio facial, espasmo de cierre de la mandíbula, espasmo facial, sincinesia, temblor, temblor primario de escritura, mioclonías, síndrome de persona rígida, distonía del pie, parálisis facial, síndrome de brazo doloroso y dedos en movimiento, trastornos de tic, tics distónicos, síndrome de Tourette, neuromiotonía, mentón tembloroso, parálisis del recto lateral, inversión distónica del pie, distonía de la mandíbula, síndrome del conejo, temblor cerebeloso, parálisis del nervio III, mioclonía palatina, acastesia, calambres musculares, parálisis del nervio IV, congelación de la marcha, distonía del tronco extensor, sinquinesia de post-parálisis del nervio facial, distonía secundaria, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, epilepsia, distonía del período “off” , tétanos cefálico, mioquimia y síndrome benigno de fasciculación de calambres; - trastornos otorrinolaringológicos que incluyen disfonía espasmódica, trastornos óticos, deficiencia auditiva, clic del oído, tinnitus, vértigo, enfermedad de Meniere, disfunción del nervio coclear, tartamudeo, disfagia cricofaríngea, bruxismo, cierre de laringe en aspiración crónica, granuloma de cuerdas vocales, distonía ventricular, disfonia ventricular, disfonía mutacional, trismo, ronquidos, temblor de voz, aspiración, distonía de protrusión de lengua, temblor palatino, mordida profunda de labio y distonía laríngea; síndrome del primer mordisco;
- trastornos gastrointestinales que incluyen acalasia, fisura anal, estreñimiento, disfunción de la articulación temperomandibular, disfunción del esfínter de Oddi, hipertensión sostenida del esfínter de Oddi, trastornos de los músculos intestinales, síndrome puborrectal, anismo, espasmo pilórico, disfunción de la vesícula biliar, disfunción de la motilidad esofágica gastrointestinal o esofágica, espasmo esofágico difuso y gastroparesia;
-trastornos urogenitales que incluyen disinergia del esfínter detrusor, hiperreflexia del detrusor, disfunción de la vejiga neurógena (por ejemplo, en pacientes con enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular o esclerosis múltiple), vejiga hiperactiva, hiperactividad neurogénica del detrusor, espasmos de vejiga, incontinencia urinaria, retención urinaria, hipertrofia del cuello de la vejiga, disfunción miccional, cistitis intersticial, vaginismo, endometriosis, dolor pélvico, agrandamiento de la glándula prostética (hiperplasia prostética benigna), prostatodinia, cáncer de próstata y priapismo;
- trastornos dermatológicos que incluyen trastornos proliferativos de células cutáneas, heridas en la piel, psoriasis, rosácea, acné; trastornos cutáneos hereditarios raros, tales como el síndrome de Fox-Fordyce o la enfermedad de Hailey-Hailey; reducción de cicatrices queloides e hipertróficas; reducción del tamaño de los poros; afecciones inflamatorias de la piel; afecciones inflamatorias dolorosas de la piel;
- trastornos del dolor que incluyen dolor de espalda (dolor de espalda superior, dolor de espalda baja), dolor miofascial, dolor de cabeza tensional, fibromialgia, síndromes dolorosos, mialgia, migraña, latigazo cervical, dolor en las articulaciones, dolor posoperatorio, dolor no asociado con un espasmo muscular y dolor asociado con trastornos del músculo liso;
-trastornos inflamatorios que incluyen pancreatitis, trastornos inflamatorios neurogénicos (que incluyen gota, tendinitis, bursitis, dermatomiositis y espondilitis anquilosante);
- trastornos secretores, tales como secreciones excesivas de las glándulas, hiperhidrosis (incluyendo hiperhidrosis axilar, hiperhidrosis palmar y síndrome de Frey), hipersalivación, sialorrea, bromhidrosis, hipersecreción de moco, hiperlagrimeo, disfunción de la glándula holocrina; exceso de secreción de sebo;
- trastornos respiratorios que incluyen rinitis (incluida rinitis alérgica), EPOC, asma y tuberculosis; - trastornos hipertróficos que incluyen agrandamiento muscular, hipertrofia maseterica, acromegalia e hipertrofia neurogénica del tibial anterior con mialgia;
- trastornos articulares que incluyen codo de tenista (o epicondilitis del codo), inflamación de las articulaciones, coxartrosis, osteoartritis, patología del manguito de los músculos rotadores del hombro, artritis reumatoide y síndrome del túnel carpiano;
- trastornos endocrinos como diabetes tipo 2, hiperglucagonismo, hiperinsulinismo, hipoinsulinismo, hipercalcemia, hipocalcemia, trastornos de la tiroides (incluida la enfermedad de Grave, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, hipertiroidismo e hipotiroidismo), trastornos paratiroideos (incluidos hiperparatiroidismo e hipoparatiroidismo), síndrome de Gushing;
- enfermedades autoinmunes como el lupus eritemotoso sistémico;
- enfermedades proliferativas que incluyen tumores de paraganglioma, cáncer de próstata y tumores óseos;
- lesiones traumáticas que incluyen lesiones deportivas, lesiones musculares, heridas de tendones y fracturas de huesos; y
- usos veterinarios (por ejemplo, inmovilización de mamíferos, cólico equino, acalasia animal o espasmos musculares de animales).
Las composiciones líquidas según la presente invención también se pueden utilizar en medicina estética (es decir, para mejorar el aspecto cosmético), en particular para tratar o prevenir las arrugas de la piel, en particular las arrugas faciales, tales como las arrugas del entrecejo, las arrugas del contorno de los ojos, líneas glabelares del entrecejo, boca caída, arrugas del cuello (bandas platismales), arrugas del mentón (mentalis, piel de naranja, barbilla con hoyuelos), líneas de la frente, arrugas de "piel rayada", tratamiento de estiramiento nasal o líneas de sueño. Según este aspecto de la presente invención, el sujeto que se va a tratar o prevenir para mejorar la apariencia cosmética preferiblemente no padece ninguno de los trastornos, afecciones o síndromes que se describen anteriormente. Más preferiblemente, dicho sujeto es un sujeto sano (es decir, que no padece ninguna enfermedad, afección o síndrome).
Las composiciones líquidas según la presente invención se pueden usar en combinación con otro compuesto terapéutico. En una realización, las composiciones líquidas según la presente invención se administran en combinación con un compuesto analgésico para tratar el dolor, en particular en combinación con un derivado opioide, tal como morfina, tal como se describe en el documento WO 2007/144493, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. En otra realización, las composiciones líquidas según la presente invención se administran en combinación con ácido hialurónico, por ejemplo, para tratar el cáncer de próstata, tal como se describe en el documento WO 2015/0444416, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia.
Un aspecto adicional de la presente divulgación es el uso de un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina para proteger una neurotoxina proteica de la degradación en una composición líquida que está libre de proteínas de origen animal.
Según una realización preferida, el aminoácido es triptófano, más preferiblemente L-triptófano.
Preferiblemente, la neurotoxina proteica es una neurotoxina botulínica. Según una realización de la presente invención, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica en forma compleja. Según otra realización, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica de alta pureza. Según una realización de la presente invención, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica purificada a partir de su cepa clostridial natural. Según otra realización, la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica producida de forma recombinante en un huésped heterólogo, tal como E. coli. Según la presente invención, la neurotoxina botulínica puede ser una BoNT de serotipo A, B, C, D, E, F o G. Según la presente invención, una neurotoxina botulínica puede ser una neurotoxina botulínica modificada, tal como se ha descrito anteriormente. Según la presente invención, una neurotoxina botulínica recombinante puede ser una neurotoxina botulínica quimérica, tal como se ha descrito anteriormente.
Según una realización preferida, el aminoácido se usa en combinación con un tensioactivo y un tampón que comprende iones sodio, cloruro y fosfato, y la composición líquida tiene un pH entre 5,5 y 8. Preferiblemente, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico, más preferiblemente un polisorbato, por ejemplo PS20, PS60 o PS80. Lo más preferiblemente, el tensioactivo no iónico es PS80. Preferiblemente, el tampón también comprende iones potasio. El tampón se puede obtener, por ejemplo, combinando sales de cloruro de sodio, cloruro de potasio y fosfato de sodio. Según una realización preferida, el pH está entre 6,0 y 7,5, por ejemplo 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45 o 7,5. Preferiblemente, el pH está dentro de una unidad del pH fisiológico (que es alrededor de 7,4).
Según una realización preferida del uso según la presente invención, la composición líquida es estable durante 2 meses. Por ejemplo, es estable durante 2 meses entre 2 y 8 °C. Según una realización, es estable durante 3 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización preferida, es estable durante 6 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización, es estable durante 12 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización, es estable durante 18 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización, es estable durante 24 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización, es estable durante 36 meses entre 2 y 8 °C, por ejemplo a 5 °C. Según una realización, es estable durante 3 meses a temperatura ambiente, por ejemplo a 25 °C. Según una realización, es estable durante 6 meses a temperatura ambiente, por ejemplo a 25 °C.
EJEMPLOS
1. Preparación de formulaciones líquidas estables de toxina botulínica A
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían 15 ng/ml de BoNT/A altamente purificada, 15 % v/v de polisorbato 20, un aminoácido seleccionado entre tirosina (Tyr), triptófano (Trp) y cisteína (Cys) o una mezcla de metionina (Met), tirosina (Tyr), triptófano (Trp) y cisteína (Cys) (Sigma Aldrich) y solución salina tamponada con fosfato (PBS de Calbiochem) (NaCl 140 mM, fosfato de sodio 10 mM y KCl 3 mM a pH 7,4 a 25 °C), se filtraron usando filtros de PVDF (polivinilidenfluoruro) de 0,22 |jm y se almacenaron en jeringas de vidrio de 2 ml siliconizadas durante 6 días a 40 °C, tras lo cual se realizó una prueba de potencia para cada preparación.
Para la prueba de potencia, las jeringas que contienen las preparaciones se vaciaron en viales de vidrio de 2 ml (Chromacol, Gold) con tapas que contienen septos de caucho tratados con PTFE (Chromacol) o en tubos de microcentrífuga de plástico de 1,7 ml (Axygen, Maximum Recovery) que ambos tienen propiedades de baja adsorción de proteínas. Las preparaciones se diluyeron posteriormente utilizando una solución de NaCl al 0,9% con albúmina de suero humano (HSA) al 3%. Para cada preparación, se inyectaron 50 j l de muestra en el músculo gastrocnemio de ratones el mismo día en que se realizó la dilución. Los ratones se controlaron durante 3 días y se registró el grado de parálisis.
Los resultados se muestran en la tabla 1.
Tabla 1 - una prueba de almacenamiento acelerado (6 días a 40 °C) de adiciones de aminoácidos sobre la estabilidad de BoNT/A. Resultados de parálisis en ratones: - = no analizados, WN = sin nota, PA = parálisis y t =
Figure imgf000012_0001
Se descubrió que la tirosina y el triptófano tenían un efecto protector contra la degradación de BoNT/A. Se descubrió que el triptófano tenía el efecto protector más fuerte. La cisteína, así como la mezcla que contiene los 4 aminoácidos, no tuvo un efecto protector.
2. Preparación de una formulación líquida estable de toxina botulínica B
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían 350 ng/ml de BoNT/B altamente purificads, polisorbato 20 15 % v/v, un aminoácido seleccionado entre tirosina (Tyr), triptófano (Trp) y cisteína (Cys) o una mezcla de metionina (Met), tirosina (Tyr), triptófano (Trp) y cisteína (Cys), y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, se filtraron con filtros de 0,22 |jm y se almacenaron en jeringas de vidrio de 2 ml siliconizadas durante dos semanas a 40 °C, después de lo cual se realizó una prueba de potencia para cada preparación, tal como se ha descrito anteriormente.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2 - una prueba de almacenamiento acelerado (dos semanas a 40 °C) de adiciones de aminoácidos sobre la estabilidad de BoNT/B. Resultados de parálisis en ratones: - = no analizado, WN = sin nota, PA = parálisis y t = m r .
Figure imgf000013_0001
Se descubrió que la tirosina y el triptófano tenían un efecto protector contra la degradación de BoNT/B. La cisteína, así como la mezcla que contiene los 4 aminoácidos, también tuvieron un efecto protector, pero en menor medida. 3. Evaluación de diferentes concentraciones de triptófano y polisorbato 20
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían BoNT/A o BoNT/B altamente purificada y diversas concentraciones de polisorbato 20 (PS 20) y triptófano y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, se filtraron usando filtros de 0,22 jm y se almacenaron en jeringas de vidrio de 2 ml siliconizadas. Se realizaron pruebas de potencia de parálisis de las patas traseras para cada preparación, tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Figure imgf000014_0001
4. Evaluación de diferentes concentraciones de sal en preparaciones de BoNT/B
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían 100 ng/ml de BoNT/B altamente purificada, polisorbato 20, triptófano de diversos proveedores de aminoácidos y un tampón seleccionado de PBS pH 7,4 (Calbiochem), tampón fosfato 12 nM pH 7 (Apoteket) y acetato de sodio (NaAc) 20 mM pH 5,5 (NaAc de Fluka y ácido acético de Merck), se filtraron usando filtros de 0,22 |im y se almacenó en jeringas de vidrio de 2 ml siliconizadas. Se realizaron pruebas de potencia de parálisis de las patas traseras para cada preparación, tal como se ha descrito anteriormente.
Los resultados se muestran en la tabla 4.
Tabla 4 - evaluación de diferentes concentraciones de sal sobre la estabilidad de BoNT/B. Resultados de parálisis en ratones: - = no analizados, WN = sin nota, PA = parálisis y t = muerte.
Figure imgf000015_0001
Los resultados muestran que las preparaciones que contienen el tampón de PBS (que contiene iones sodio, cloruro, fosfato y potasio) parecen jugar un papel en la estabilidad de la toxina botulínica.
5. Evaluación de diferentes estabilizadores
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían 15 ng/mL de BoNT/A altamente purificada, un polisorbato 20 (PS20) o polisorbato 80 (PS80) o HSA, triptófano y PBS, se filtraron usando filtros de 0,22 |jm y se almacenaron en jeringas de vidrio de 2 ml siliconizadas. Se realizaron pruebas de potencia de parálisis de las patas traseras para cada preparación, tal como se ha descrito anteriormente.
Los resultados se muestran en la tabla 5.
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
6. Evaluación de diferentes formulaciones
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían 10 ng/ml de BoNT/A altamente purificada, PS80 al 0,25 %, triptófano 1 mg/ml y PBS, tal como se ha descrito anteriormente. El pH se ajustó a 6,6 y 7,0 añadiendo HCl. Cada preparación se almacenó durante 5 semanas a 40 °C.
Cada preparación se diluyó, a continuación, 10 veces y se realizaron pruebas de potencia de parálisis de las patas traseras, tal como se ha descrito anteriormente (0,05 ng por inyección). En ambos casos, se observó parálisis de las patas traseras el día 3. La parálisis fue más fuerte con la preparación de pH 6,6.
7. Evaluación de diferentes formulaciones
Se prepararon preparaciones líquidas de toxina botulínica que contenían 0,3 ng/ml de BoNT/A altamente purificada, un polisorbato seleccionado de PS20 y PS80, triptófano 1 mg/ml y PBS 12 mM a pH 7,4, tal como se ha descrito anteriormente. El pH de cada preparación se ajustó a pH 6,6 o 6,9 añadiendo HCl 1,2 M.
El polisorbato 20 se ensayó a una concentración, 0,2 % p/v, correspondiente a aproximadamente 20 veces su CMC (concentración micelar crítica, aproximadamente 0,01 % p/v a 21°C). El polisorbato 80 se ensayó al 0,04 % y al 0,2 % p/v, correspondientes, respectivamente, a aproximadamente 20 y 100 veces su CMC (aproximadamente 0,002 % p/v a 21 °C).
Tabla 6 - Elección de polisorbato y pH
Figure imgf000017_0001
Para cada preparación, se llenó un volumen de 0,5 ml en jeringas de 1 ml de vidrio largo (BD) y se sellaron con un émbolo recubierto de fluorocarbono.
La potencia se midió mediante la prueba de parálisis de las patas traseras en ratones, tal como se ha descrito anteriormente.
No se observó disminución de potencia en ninguna formulación después de 6 meses de almacenamiento a 5 °C y después de 25 °C.
8. Evaluación de diferentes formulaciones
Se prepararon diecinueve formulaciones diferentes que contienen neurotoxina botulínica de tipo A altamente purificada con concentraciones variables de polisorbato 80, triptófano, fosfato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio y pH variable. Cada formulación tenía una potencia nominal objetivo de 500 U/ml. Cada formulación se desgasificó, se filtró a través de un filtro de 0,2 pm y se llenó en viales. Se utilizó gas nitrógeno como atmósfera protectora en los viales. El llenado se realizó en una cámara anaeróbica. Cada formulación se llenó en alícuotas de 1 ml en una atmósfera de nitrógeno en viales de vidrio de 2 ml tapados con tapones FluroTec® sellados con juntas “flip off” de aluminio y almacenados en posición vertical.
Se evaluó la estabilidad de las 19 formulaciones a 5 °C, 25 °C y 37 °C usando BoTest® para medir la potencia.
Tabla 7 - Composiciones de excipientes
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000018_0001
Tabla 8 - Componentes del envasado
Figure imgf000018_0002
Para todas las formulaciones, la solución permaneció transparente y para la mayoría de las partes incolora.
Las concentraciones de excipientes ensayadas en este estudio parecen no afectar el pH de las formulaciones durante el intervalo de tiempo probado. Los resultados de potencia se presentan en la tabla 9.
Tabla 9 - Resultados de potencia Botest
Figure imgf000018_0003
Para varias composiciones, no hubo más del 30 % de pérdida en la potencia durante 6 meses a 5 °C y/o no más de aproximadamente 40 % de pérdida en la potencia durante 3 meses a 25 °C y/o no más de aproximadamente 50 % de pérdida de potencia durante 2 meses a 37 °C.
9. Evaluación de PS 60
Se preparó una formulación que contenía neurotoxina botulínica de tipo A altamente purificada con PS60 al 0,1 % (v/v), 1 mg/ml de L-triptófano, fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, cloruro de potasio 3 mM y agua para inyección. El pH se ajustó a 6,75 con HCl. La formulación tenía una potencia nominal objetivo de 100 U/mL. La formulación se desgasificó, se filtró a través de filtros de 0,2 |jm y se cargó en viales de 2 ml asépticamente en una cámara anaeróbica con atmósfera de nitrógeno con un volumen de llenado de 1 ml. Se utilizó gas nitrógeno como atmósfera protectora en los viales. Los viales se taparon con tapones de FluroTec® sellados con juntas de aluminio “flip off”.
Tabla 10 - Componentes del envasado
Figure imgf000018_0004

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Composición líquida que comprende una neurotoxina proteica, un tensioactivo, un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina, un tampón que comprende iones sodio, cloruro y fosfato,
en la que dicha composición líquida tiene un pH entre 5,5 y 8,
en la que dicha composición líquida está libre de proteínas de origen animal, y
en la que dicha composición líquida es estable durante 2 meses a 2-8 °C.
2. Composición líquida, según la reivindicación 1, en la que dicho tensioactivo es un tensioactivo no iónico.
3. Composición líquida, según la reivindicación 2, en la que dicho tensioactivo no iónico es un polisorbato, preferiblemente Polisorbato 20, Polisorbato 60 o Polisorbato 80.
4. Composición líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho aminoácido es triptófano, preferiblemente L-triptófano.
5. Composición líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho tampón comprende además iones potasio; y/o
en la que dicha composición tiene un pH entre 6,0 y 7,5; y/o
en la que no se produce más del 30 % de pérdida de la actividad proteolítica extracelular durante 2, 3, 6, 12, 18, 24 o 36 meses a 5 °C.
6. Composición líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha neurotoxina proteica es una neurotoxina botulínica, seleccionada entre una neurotoxina botulínica natural en forma compleja, una neurotoxina botulínica natural de alta pureza y una neurotoxina botulínica recombinante; preferiblemente
en la que dicha neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica recombinante seleccionada entre una neurotoxina botulínica A, B, C, D, E, F o G, una neurotoxina botulínica modificada y una neurotoxina botulínica quimérica.
7. Composición líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha composición líquida comprende: -de 4 a 10000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml,
- de 0,001 a 15 % v/v de polisorbato,
-de 0,1 a 5 mg/ml de triptófano,
-de 10 a 500 mM de NaCl,
-de 1 a 50 mM de KCl,
-de 1 a 100 mM de fosfato de sodio,
tiene un pH entre 5,5 y 8, y es estable durante 12 meses a 5 °C.
8. Composición líquida, según la reivindicación 7, en la que dicha composición líquida comprende:
-de 10 a 2000 unidades LD50 de neurotoxina botulínica por ml,
- de 0,05 a 0,2% v/v de polisorbato 80,
-de 0,1 a 5 mg/ml de triptófano,
-de 25 a 300 mM de NaCl,
-de 1 a 10 mM de KCl,
-de 2 a 50 mM de fosfato de sodio,
tiene un pH entre 6,0 y 7,5, y es estable durante 18 meses a 5 °C.
9. Composición líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en terapia.
10. Composición líquida, según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o prevención de trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos neurológicos, trastornos oftalmológicos, trastornos de dolor, trastornos psicológicos, trastornos articulares, trastornos inflamatorios, trastornos endocrinos o trastornos urológicos.
11. Uso de la composición líquida, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en medicina estética, por ejemplo, para tratar o prevenir arrugas de la piel, en particular, arrugas faciales, tales como arrugas del entrecejo, arrugas del contorno de los ojos, líneas glabelares del entrecejo, boca caída, arrugas del cuello (bandas platismales), arrugas del mentón (mentalis, piel de naranja, barbilla con hoyuelos), líneas de la frente, arrugas de "piel rayada", tratamiento de estiramiento nasal o líneas de sueño.
12. Uso de un aminoácido seleccionado entre triptófano y tirosina para proteger una neurotoxina proteica de la degradación en una composición líquida que está libre de proteínas de origen animal, en la que la composición líquida permanece estable durante 2 meses a 2-8 °C.
13. Uso, según la reivindicación 12, en el que dicho aminoácido es triptófano.
14. Uso, según la reivindicación 12 ó 13, en el que dicha neurotoxina proteica es una neurotoxina botulínica.
15. Uso, según la reivindicación 12, en el que dicho aminoácido se usa en combinación con un tensioactivo y un tampón que comprende iones sodio, cloruro y fosfato, y dicha composición líquida tiene un pH entre 5,5 y 8.
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