RS61340B1 - Tečna neurotoksin formulacija stabilizovana sa triptofanom ili tirozinom - Google Patents

Description

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na neurotoksinske formulacije bez teþnih životinjskih proteina. Naroþito, predmetni pronalazak se odnosi na botulinum neurotoksinske formulacije bez teþnih životinjskih proteina stabilizovane se neproteinskim ekscipijentima. Neurotoksinske formulacije opisane ovde su pogodne za primenu u leþenju i naroþito za primenu kod pacijenata kako bi se postigao željeni terapeutski ili estetski efekat.

STANJE TEHNIKE

[0002] Klostridijski neurotoksini koje prirodno proizvode klostridijski sojevi su najotrovniji biološki agensi do danas poznati i istovremeno su moüni alati za leþenje niza neuromuskularnih i endokrinih poremeüaja, ukljuþujuüi cervikalnu distoniju, spastiþnost, blefarospazam, hiperhidrozu ili sialoreju. Takoÿe pronalaze upotrebu u estetskom polju za izravnavanje bora.

[0003] Da bi bio pogodan za upotrebu kao farmaceutski proizvod, kompozicija neurotoksina mora biti takav da se može þuvati bez znaþajnog gubitka aktivnosti neurotoksina.

[0004] U svim trenutno odobrenim formulacijama botulinskih neurotoksina, životinjski (ukljuþujuüi ljudski) protein, obiþno humani serumski albumin (HSA), koristi se kao stabilizator.

[0005] Prisustvo životinjskih proteina, kao što je HSA, u farmaceutskim kompozicijama je, meÿutim, nepoželjno zbog rizika, þak i ako je nizak, od nevoljnog prenošenja zaraženih agenasa životinjskog porekla poput priona na pacijenta.

[0006] Formulacije botulinum toksina bez životinjskih proteina su otkrivene u tehnici. Na primer, WO 0158472 opisuje liofilizovane smeše u kojima se polisaharid, kao što je 2-hidroksietil skrob koristi za stabilizaciju botulinum toksina. WO 2005007185 opisuje kompozicije u kojima se površinski aktivna supstanca i smeša najmanje dve amino kiseline odabrane izmeÿu Glu i Gln ili Asp i Asn koriste za stabilizaciju botulinskog toksina.

[0007] Veüina formulacija iz stanja tehnike nije stabilna u teþnom obliku i zato se þuva u liofilizovanom ili zamrznutom obliku. Takve formulacije lekar treba da rekonstituiše u sterilnom fiziološkom rastvoru pre davanja pacijentu. Ovaj korak rekonstitucije povezan je sa gubitkom vremena lekara, rizikom od greške razblaživanja i rizikom od kontaminacije tokom procesa rekonstitucije. Dobavljaþ botulinskog toksina takoÿe mora da obuþi lekare kako bi se osiguralo da se korak rekonstitucije izvede na adekvatan naþin.

[0008] Teþne formulacije su stoga korisne jer uklanjaju gubitak vremena za lekara, rizik od greške pri razblaživanju, rizik od kontaminacije i potrebu za pružanjem obuke za pružaoca usluga.

[0009] Teþne formulacije bez HSA opisane su, na primer, u WO 2006005910 koja otkriva teþne formulacije botulinum toksina koje sadrže površinski aktivnu supstancu, natrijum hlorid i disaharid. WO 2009008595 otkriva teþne formulacije botulinum toksina koje sadrže polisorbat 20 i metionin.

[0010] Cilj predmetnog pronalaska je da se obezbede povoljne formulacije botulinum neurotoksina bez teþnih životinjskih proteina, koje su pogodne za skladištenje i upotrebu u terapiji. Konkretno, stabilizujuüa formulacija treba da održi stabilnost proizvoda, da ne sadrži životinjske proteine, a takoÿe da bude pogodna za stabilizaciju neurotoksina koji ne sadrži kompleksne proteine.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0011] Prvi aspekt predmetnog pronalaska je teþna kompozicija koja sadrži ili se sastoji u osnovi od proteinskog neurotoksina, surfaktanta, amino kiseline odabrane izmeÿu triptofana i tirozina, pufer koji sadrži jone natrijuma, hlorida i fosfata, koji ima pH izmeÿu 5.5 i 8 , koja je stabilna tokom vremena i u kojoj nema proteina životinjskog porekla.

[0012] Drugi aspekt je upotreba teþnih kompozicija prema pronalasku u terapiji i / ili u kozmetici.

[0013] Sledeüi aspekt predmetnog pronalaska je upotreba amino kiseline odabrane izmeÿu triptofana i tirozina za zaštitu proteinskog neurotoksina od razgradnje u teþnoj kompoziciji bez proteina životinjskog porekla.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0014] Prvi aspekt predmetnog pronalaska je teþna kompozicija koja sadrži ili se sastoji u osnovi od proteinskog neurotoksina, surfaktanta, aminokiseline odabrane izmeÿu triptofana i tirozina, pufer koji sadrži jone natrijuma, hlorida i fosfata, koji ima pH izmeÿu 5.5 i 8 , koja je stabilna tokom vremena i u kojoj nema proteina životinjskog porekla.

[0015] Pod pojmom "bez životinjskih proteina" podrazumeva se da ne sadrži proteine životinjskog, ukljuþujuüi ljudskog porekla.

[0016] Neurotoksin je supstanca koja cilja nervnu üeliju i utiþe na neurološku funkciju.

Proteinski neurotoksini ukljuþuju botulinum toksine (BoNT) i tetanus toksin (TeNT). Poželjno je da je proteinski neurotoksin botulinum neurotoksin.

[0017] Botulinski neurotoksini su metaloproteaze od 150 kDa koje se sastoje u svom aktivnom obliku od 50 kDa lakog lanca (L) i od 100 kDa teškog lanca (H) povezani disulfidnim mostom. Lanac L je cink-proteaza koja intraüelijski cepa jedan od SNARE (rastvorljivi NSF Vezani protein REceptor) proteina koji su ukljuþeni u oslobaÿanje neurotransmitera posredovano vezikulom, þime narušavaju mehanizme posredovane neurotransmiterima. Teški lanac obuhvata dva domena: N-terminalni 50 kDa domen translokacije (HN) i C-terminalni 50 kDa receptor-vezujuüi domen (HC). HC domen botulinum neurotoksina sadrži dve razliþite strukturne karakteristike koje se nazivaju HCC i HCN domeni. Veruje se da su ostaci amino kiselina koji su ukljuþeni u vezivanje receptora primarno locirani u HCC domenu.

[0018] Neutrotoksini botulina klasifikovani su u 7 antigenski razliþitih serotipova (A do G). Primeri amino kiselinskih sekvenci za svaki serotip ovde su dati kao SEQ ID NO 1 do 7.

[0019] Za svaku od sekvenci, razliþiti domeni mogu, na primer, biti sledeüi.

[0020] Struþnjak üe shvatiti da mogu postojati neke varijacije u svakom od botulinskih neurotoksinskih domena.

[0021] BoNT deluju, na primer, na spojeve neuromuskularnih nerava spreþavajuüi oslobaÿanje acetilholina i na taj naþin spreþavajuüi mišiünu kontrakciju. Opijenost nervnog terminala je reverzibilna i njegovo trajanje varira za razliþite serotipove BoNT.

[0022] Prirodni BoNTs proizvode Clostridium botulinum i druge klostridijalne vrste kao što su C. butiricum, C. baratii i C. argentinense kao deo multi-proteinskih kompleksa koji štite neurotoksin od proteolitiþke degradacije. Pod „botulinum neurotoksinom u složenom obliku“ podrazumeva se botulinum neurotoksin i jedan ili više proteina koji su deo prirode takvih multi-proteinskih kompleksa (proteini povezani sa neurotoksinom ili „NAP“). NAP ukljuþuju netoksiþni protein nehemaglutinin (NTNH) i hemaglutinin proteine (HA-17, HA-33 i HA-70). Pod izrazom "botulinum neurotokin visoke þistoüe" podrazumeva se botulinum neurotokin koji u suštini nema NAPs.

[0023] Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin u složenom obliku. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin visoke þistoüe.

[0024] Postupak za proizvodnju BoNTs kroz kulturu prirodnih sojeva klostridija i njihovo preþišüavanje u složenom obliku ili obliku visoke þistoüe dobro je poznat u tehnici i opisani su na primer u Pickett, Andy. "Botulinum toxin as a clinical product: manufacture and pharmacology." Clinical Applications of Botulinum Neurotoxin. Springer New York, 2014.7-49.

[0025] Neutrotoksin botulinuma visoke þistoüe ili u osnovi þist može se dobiti iz proteinskog kompleksa koji sadrži botulinum toksin, na primer, prema postupku opisanom u Current topics in Microbiology and Immunology (1995), 195, p.151-154.

[0026] Alternativno, botulinum neurotoksin visoke þistoüe može se proizvesti rekombinantnom ekspresijom BoNT gena u heterolognom domaüinu kao što je E. coli i preþišüavati od njega.

[0027] Poželjno, proteinski neurotoksin je botulinum neurotoksin. Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin u složenom obliku. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin visoke þistoüe.

[0028] Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin preþišüen iz svog prirodnog klostridijalnog soja. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin proizveden rekombinantno u heterolognom domaüinu kao što je E. coli.

[0029] Prema predmetnom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti BoNT serotipa A, B, C, D, E, F ili G.

[0030] Prema predmetnom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti modifikovani botulinum neurotoksin. Prema predmetnom pronalasku, "modifikovani BoNT" je BoNT koji ima amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50% identiþnosti sekvence sa SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7. Poželjno, modifikovani BoNT ima amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiþnosti sekvence sa SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7. Poželjno, modifikovani BoNT je BoNT þija se amino kiselinska sekvenca razlikuje od SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 sa manje od 600, 400, 200, 150, 100, 50 ili 20 amino kiselinskih supstitucija, delecija ili dodavanja, na primer 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino kiselinskom supstitucijom, brisanja ili dodavanja.

[0031] Prema predmetnom pronalasku, rekombinantni botulinum neurotoksin može biti himerni botulinum neurotoksin. Prema predmetnom pronalasku, "himerni BoNT" se sastoji od L, HN, HCN i HCC domena koji ne pripadaju istom serotipu. Na primer, himerni BoNT može da se sastoji od L lanca iz jednog serotipa i punog H lanca (HN, HCN i HCC domeni) iz drugog serotipa. Himerni BoNT se takoÿe može sastojati od L lanca i HN domena („LHN“) iz jednog serotipa i HC domena (HCN i HCC) iz drugog serotipa. Himerni BoNT se takoÿe može sastojati od L lanca i HN i HCN domena („produženi LHN“) iz jednog serotipa i HCC domena iz drugog serotipa.

[0032] Prema pronalasku, domen lakog lanca (L) može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identiþnosti sekvence sa jednom od sledeüih amino kiselinskih sekvenci i koji zadržava sposobnost da cepa jedan od SNARE proteina koji su ukljuþeni u oslobaÿanje neurotransmitera posredovano vezikulom:

• Amino kiselina 1-448 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 1-440 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 1-441 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 1-445 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 1-422 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 1-439 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 1-441 SEQ ID NO:7

[0033] Prema pronalasku, HN domen može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identiþnosti sekvence sa jednom od sledeüih amino kiselinskih sekvenci i koja zadržava sposobnost translokacije:

• Amino kiselina 449-871 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 441-858 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 442-866 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 446-862 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 423-845 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 440-864 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 442-863 SEQ ID NO:7

[0034] Prema pronalasku, HC domen može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identiþnosti sekvence sa jednom od sledeüih amino kiselinskih sekvenci i koja zadržava sposobnost vezivanja za nervnomuskularnu üeliju:

• Amino kiselina 872-1296 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 859-1291 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 867-1291 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 863-1276 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 846-1252 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 865-1274 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 864-1297 SEQ ID NO:7

[0035] Prema pronalasku, HCC domen može imati amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identiþnosti sekvence sa jednom od sledeüih amino kiselinskih sekvenci i koja zadržava sposobnost vezivanja za nervnomuskularnu üeliju:

• Amino kiselina 1111-1296 SEQ ID NO:1

• Amino kiselina 1098-1291 SEQ ID NO:2

• Amino kiselina 1112-1291 SEQ ID NO:3

• Amino kiselina 1099-1276 SEQ ID NO:4

• Amino kiselina 1086-1252 SEQ ID NO:5

• Amino kiselina 1106-1274 SEQ ID NO:6

• Amino kiselina 1106-1297 SEQ ID NO:7

[0036] Gore identifikovane referentne sekvence treba smatrati kao vodiþem, jer se mogu pojaviti neznatne varijacije prema podserotipovima.

[0037] „Procentualni identitet sekvence“ izmeÿu dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina ili amino kiselina je funkcija broja identiþnih nukleotida / amino kiselina na identiþnim pozicijama koje dele poravnate sekvence. Dakle, % identiteta može se izraþunati kao broj identiþnih nukleotida / amino kiselina na svakom položaju u poravnanju podeljen ukupnim brojem nukleotida / amino kiselina u poravnatoj sekvenci, pomnožen sa 100. Izraþunavanje % identiteta sekvence takoÿe može uzeti uzeti u obzir broj praznina i dužinu svake praznine koju treba uvesti da bi se optimizovalo poravnanje dve ili više sekvenci. Poreÿenje sekvenci i odreÿivanje procentualnog identiteta izmeÿu dve ili više sekvenci može se izvršiti pomoüu specifiþnih matematiþkih algoritama, kao što je BLAST, koji üe biti poznati struþnjaku.

[0038] Surfaktanti (ili površinski aktivni agensi) su jedinjenja koja su u stanju da smanje površinski napon izmeÿu teþnosti i þvrste supstance ili izmeÿu dve teþnosti. Surfaktanti mogu biti nejonski, anjonski, katijonski ili amfoterni. U kompozicijama prema pronalasku, surfaktant je poželjno nejonski surfaktant. Nejonski površinski aktivni sastojci ukljuþuju polioksietilen glikol alkil etre, kao što je oktaetilen glikol monododecil etar ili pentaetilen glikol monododecil etar; Polioksipropilen glikol alkil etri; Glukozid alkil etri, kao što su Decil glukozid, Lauril glukozid ili Oktil glukozid; Estri polioksietilen glikol oktilfenola, kao što je Triton X-100; Estri polioksietilen glikol alkilfenola, kao što je nonoksinol-9; Glicerol alkil estri, kao što je gliceril laurat;

Polioksietilen glikol sorbitan alkil estri, kao što su polisorbati; Sorbitan alkil estri, kao što su Spans; Kokamid MEA, kokamid DEA; Dodecildimetilamin oksid; Blok kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola, kao što su poloksameri; Polietoksilirani loj amin (POEA).

[0039] Prema poželjnom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži nejonski surfaktant koji je polisorbat, poželjno polisorbat 20 (PS20), polisorbat 60 (PS60) ili polisorbat 80 (PS80). Najpoželjnije, nejonski surfaktant je PS80. Kada je surfaktant polisorbat, njegova koncentracija je poželjno od 0.001% do 15% v/v, još poželjnije od 0.005 do 2% v/v, još poželjnije od 0.01 do 1%, na primer 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ili 1% v/v. Prema jednom rešenju, surfaktant je PS80 u koncentraciji od 0,05 do 0,2% v / v, na primer oko 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19 ili 0.20 % v/v.

[0040] PS20 ima gustinu od približno 1.1 g/mL. PS60 ima gustinu od približno 1.044 g/mL. PS80 ima gustinu od približno od 1.06 do 1.09 g/mL.

[0041] Veruje se da polisorbati obrazuju micele i spreþavaju adsorpciju proteina na površini i agregaciju proteina. Bez želje da se bude vezano za teoriju, veruje se da nakon razgradnje / oksidacije polisorbati mogu formirati perokside i kiseline koji mogu imati uticaj na stabilnost proteina. Zbog toga se smatra poželjnim da koncentracija polisorbata bude što niža u formulaciji proizvoda. Zbog toga se smatra poželjnim da koncentracija polisorbata ne prelazi 200 puta veüu od kritiþne micelarne koncentracije (CMC), još poželjnije da ne prelazi 100, 50, 20, 10 ili 5 puta veüu od njegove CMC.

[0042] Za PS20 (Mw 1227.5 g/mol), CMC je približno 8x10<-5>M na 21°C, odn. približno 0.01 % w/v.

[0043] Za PS60 (Mw 1309 g/mol), CMC je približno 21x10<-6>M na 21°C, odn. približno 0.003 % w/v.

[0044] Za PS80 (Mw 1310 g/mol), CMC je približno 12x10<-6>M na 21°C, odn. približno 0.002 % w/v.

[0045] Prema poželjnom rešenju, koncentracija polisorbata je izmeÿu 1 i 200 puta veüa od njegove CMC na datoj temperaturi, na primer oko 21 °C, poželjno izmeÿu 2 i 100 puta veüa od njegove CMC, na primer oko 20 ili 50 puta veüa od njegove CMC.

[0046] Teþna kompozicija prema pronalasku sadrži amino kiselinu koja je triptofan ili tirozin. Bez želje da se bude vezano za teoriju, pretpostavlja se da triptofan ili tirozin mogu spreþiti oksidaciju aktivnog proteina zbog þega bi bio nefunkcionalan. Zapravo, smatra se da üe amino kiselina dodata u molarnom višku nad neurotoksinom biti prvo oksidovana, štedeüi neurotoksin. Takoÿe se pretpostavlja da triptofan ili tirozin mogu neutralisati reaktivne proizvode razgradnje površinski aktivnih supstanci kao što su polisorbati.

[0047] Poželjno je da je amino kiselina triptofan. Poželjnije, amino kiselina je L-triptofan.

[0048] Koncentracija amino kiselina je poželjno od oko 0.1 do 5 mg/ml, poželjnije izmeÿu 0.1 i 5 mg/ml, od 0.25 do 3 mg/ml, na primer oko 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2 ili 3 mg/ml.

[0049] Kompozicija prema pronalasku sadrži pufer koji sadrži natrijum, hlorid i fosfatne jone. Pronalazaþi su zaista iznenaÿujuüe otkrili da puferi bez natrijumovih, hloridnih i fosfatnih jona smanjuju stabilnost toksina. Poželjno je da pufer takoÿe sadrži jone kalijuma.

[0050] Pufer se na primer može dobiti kombinovanjem soli natrijum hlorida, kalijum hlorida i natrijum fosfata. Koncentracija natrijum hlorida je poželjno od 10 do 500 mM, poželjno od oko 25 do 300 mM, na primer oko 25, 50, 75, 100, 140, 150, 200, 250 ili 300 mM.

[0051] Koncentracija natrijum fosfata je poželjno od 1 do 100 mM, poželjno od 2 do 50 mM, na primer oko 2, 5, 10, 20, 30, 40 ili 50 mM.

[0052] Koncentracija kalijum hlorida je poželjno od 1 do 50 mM, poželjno od 1 do 10 mM, na primer oko 1, 2, 3, 4, 5 ili 10 mM.

[0053] Kompozicija prema pronalasku ima pH izmeÿu 5.5 i 8. Prema poželjnom ostvarenju, pH je izmeÿu 6.0 i 7.5, na primer oko 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75 , 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45 ili 7.5. Poželjno je da je pH unutar jedne jedinice od fiziološkog pH (koji je oko 7.4).

[0054] Kompozicija prema pronalasku je teþna. Kompozicija poželjno sadrži vodeni rastvaraþ, još poželjnije vodu, na primer sterilnu vodu, vodu za injekcije, preþišüenu vodu, sterilnu vodu za injekcije.

[0055] Poželjno je da je formulacija izotoniþna i pogodna za injekcije pacijentu, naroþito ljudskom pacijentu.

[0056] Koliþina botulinskog neurotoksina obiþno se izražava u mišjim LD50 (letalna doza 50) jedinica, definisana kao srednja letalna intraperitonealna doza kod miševa.

[0057] Mišja LD50 (MLD50) jedinica za botulinum toksine nije standardizovana jedinica. Zaista, testovi koje koriste razliþiti proizvoÿDþi toksina na tržištu posebno se razlikuju u izboru pufera za razblaživanje. Na primer, test koji se koristi za Dysport® koristi pufer želatin-fosfat, dok test koji se koristi za BOTOX® koristi fiziološki rastvor kao razblaživaþ. Veruje se da puferi želatina štite

1

toksin u visokim razblaženjima koja se koriste u testovima LD50. Nasuprot tome, smatra se da upotreba fiziološkog rastvora kao razblaživaþa dovodi do odreÿenog gubitka jaþine. Ovo bi moglo objasniti zašto je prilikom testiranja sa Dysport® testom jedna BOTOX® jedinica ekvivalentna približno tri jedinice Dysport® (Straughan, D. W. , 2006, ATLA 34(3), 305-313; Hambleton and Pickett, Hambleton, P., and A. M. Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87.11: 719).

[0058] Poželjno je da pufer za razblaživanje koji se koristi za odreÿivanje mišjeg LD50 je želatin-fosfatni pufer. Na primer, mišji LD50 se može odrediti kako je opisano u Hambleton, P. et al. Production, purification and toxoiding of Clostridium botulinum type A toxin. Eds. G. E. Jr Lewis, and P. S. Angel. Academic Press, Inc., New York, USA, 1981, p.248. Ukratko, uzorci botulinum toksina se serijski razblažuju u 0.2% (m/v) želatinskom 0.07M puferu Na2HPO4pri pH 6.5. Grupama miševa (npr.4 do 8 miševa u grupi) težine oko 20 g ubrizgava se intraperitonealno uzorak razblaženog toksina (na primer 0.5 ml po životinji). Grupe za razreÿivanje, na primer 5 grupa za razblaživanje, su odabrane da obuhvate 50% dozu letalnosti. Miševi su posmatrani do 96 sati i procenjena je letalna doza mišjeg 50 (MLD50).

[0059] Kompozicija prema pronalasku poželjno sadrži od 4 do 10000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po ml, još poželjnije od 10 do 2000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po ml, na primer 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili 1500 LD50 jedinica botulinskog neurotoksina po ml.

[0060] Koliþina botulinskog neurotoksina takoÿe se može izraziti u ng. Kompozicija prema pronalasku poželjno sadrži od oko 0.01 do 75 ng botulinum neurotoksina po ml, još poželjnije od oko 0,03 do 20 ng botulinum neurotoksina po ml, još poželjnije od oko 0.1 do 15 ng botulinum neurotoksina po ml, na primer oko 0.15, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ng botulinskog neurotoksina po m.

[0061] Formulacija prema pronalasku ne sadrži životinjske proteine. Konkretno, kompozicije prema pronalasku ne sadrže albumin, a naroþito ne albumin humanog seruma. Poželjno je da je kompozicija prema pronalasku bez životinjskih proizvoda, što znaþi da ne sadrži sastojke životinjskog (ukljuþujuüi ljudsko) poreklo. Poželjno, kompozicija prema pronalasku ne sadrži nijedan protein osim proteinskog neurotoksina. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku ne sadrži nijedan protein osim proteinskog neurotoksina i jedan ili više NAP (proteini povezani sa neurotoksinom). Sumnje radi, primeüeno je da amino kiseline nisu proteini.

[0062] Prema rešenju pronalaska, kompozicija ne sadrži saharide, ukljuþujuüi monosaharide, disaharide i polisaharide.

[0063] Teþna kompozicija prema pronalasku je stabilan tokom vremena. Na primer, stabilan je 2 meseca na 2 do 8 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 3 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema poželjnom rešenju, stabilan je 6 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 12 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 18 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 24 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 6 meseci na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 2 meseca na 37°C.

[0064] Teþna kompozicicja prema pronalasku se poželjno þuva na temperaturi izmeÿu 0 ° i 30 °C. U poželjnom rešenju, þuva se na 2-8 °C, na primer na 5 °C. U još jednom rešenju, þuva se na sobnoj temperaturi. Poželjno je da nije smrznuto.

[0065] Stabilnost se može proceniti uporeÿivanjem aktivnosti botulinum neurotoksina tokom vremena. Aktivnost botulinskog neurotoksina može se odnositi na sposobnost aktivnosti botulinskog neurotoksina da se veže za svoj ciljni receptor u üeliji, da translocira laki lanac u üeliju i / ili da cepa svoj ciljni SNARE protein.

[0066] Postupci za merenje aktivnosti botulinum neurotoksina dobro su poznati u tehnici.

Aktivnost botulinskog neurotoksina može se proceniti, na primer, korišüenjem testa letalnosti miša (LD50), kao što je gore opisano, testa zasnovanog na mišiünom tkivu, kao što je test hemidiafragme mišiüa freniþnog nerva (na primer kao što je opisano u Bigalke, H. and Rummel A., Toxins 7.12 (2015):4895-4905), analizi zasnovanoj na üelijama (na primer kao što je opisano u WO 201349508 ili u WO 2012166943) ili analiza esktraüelijske proteolitiþke aktivnosti kao što je BoTest® (Botulinum Neurotoxin Detection Kit dostupan od BioSentinel Inc.).

[0067] Poželjno, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od datog procenta gubitka aktivnosti tokom datog vremenskog perioda i na datoj temperaturi.

[0068] Prema jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od 30% gubitka u ekstaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer ne više od 30% gubitka u ekstaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 6 meseci na 5 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 20% gubitka u esktaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 3 meseca na 5 °C, još poželjnije tokom 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 5 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od 40% gubitka u esktaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 30% gubitka u ekstaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 3 meseca na 25 °C, još poželjnije tokom 6 meseci na 25 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema preko 50% gubitka u ekstaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 2 meseca na 37 °C. Ekstraüelijska proteolitiþka aktivnost može se meriti pomoüu BoTest® testa.

[0069] Prema jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako na primer MLD50 nema gubitaka više od 30% tokom 2, 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer ne više od 30% gubitka u MLD50 jedinicama tokom 6 meseci na 5 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 20% gubitaka u MLD50 jedinicama tokom 2 meseca na 5 °C, još poželjnije tokom 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 5 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako nema više od 40% gubitka u MLD50 jedinicama tokom 2 ili 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Poželjno je da se kompozicija prema pronalasku smatra stabilnom ako nema više od 30% gubitka u MLD50 jedinicama tokom 3 meseca na 25 °C, poželjnije tokom 6 meseci na 25 °C. Prema još jednom rešenju, kompozicija prema pronalasku se smatra stabilnom ako ne postoji gubitak od više od 50% u jedinicama MLD50 tokom 2 meseca na 37 °C. MLD50 jedinice se mogu meriti kako je gore navedeno.

[0070] Teþne kompozicije prema pronalasku se mogu þuvati u zapeþDüenim boþicama ili špricevima, na primer u staklenim boþicama ili špricevima, poželjno staklenim boþicama tipa 1 (ili “telesno neutralnim“). Poželjno je da u boþici ili špricu nema ili ima vrlo malo kiseonika.

Boþice ili špricevi se mogu na primer napuniti u atmosferi sa kiseonikom ispod 100 ppm, poželjno ispod 50 ppm, a gas azota se može koristiti kao zaštitna atmosfera u boþicama. Kada se koriste staklene boþice, mogu se, na primer, zatvoriti hlorobutilnim ili brombutil gumenim þepovima, što mogu biti þepovi obloženi FluroTec®. Poželjno je da se teþne kompozicije prema pronalasku þuvaju u staklenim boþicama zatvorenim þepovima obloženim FluroTec®.

[0071] Prema jednom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

1

o 4 do 10000 LD50 jedinice botulinum neurotoksin per mL,

o 0.001 do 15% v/v polisorbat,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 10 do 500 mM NaCl,

o 1 do 50 mM KCl,

o 1 do 100 mM Natrijum fosfat,

ima pH izmeÿu 5.5 i 8, i stabilan je 6 meseci na 5°C.

[0072] Prema jednom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o 10 do 2000 LD50 jedinice botulinum neurotoksin po mL,

o 0.005 do 2% v/v polisorbat,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 25 do 300 mM NaCl,

o 1 do 10 mM KCl,

o 2 do 50 mM Natrijum fosfat,

ima pH izmeÿu 6.0 i 7.5, i stabilan je 12 meseci na 5°C.

[0073] Prema jednom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o 10 do 2000 LD50 jedinice botulinum neurotoksin po mL,

o 0.05 do 0.2% v/v polisorbat 80,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 25 do 300 mM NaCl,

o 1 do 10 mM KCl,

o 2 do 50 mM Natrijum fosfat,

ima pH izmeÿu 6.0 i 7.5, i stabilan je 12 meseci na 5°C.

[0074] Prema jednom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.2% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.6.

[0075] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.04% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.9.

[0076] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 0.25% v/v polisorbat 20,

o 4 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0077] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.01% v/v polisorbat 80,

o 0.25 mg/mL triptofan

o 255 mM NaCl,

o 2 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 7.2.

1

[0078] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.01% v/v polisorbat 80,

o 0.25 mg/mL triptofan

o 255 mM NaCl,

o 10 mM KCl,

o 50 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.3.

[0079] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 1% v/v polisorbat 80,

o 0.25 mg/mL triptofan

o 255 mM NaCl,

o 50 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.3.

[0080] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 1% v/v polisorbat 80,

o 3 mg/mL triptofan,

o 255 mM NaCl,

o 10 mM KCl,

o 50 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 7.2.

[0081] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

1

o 0.1% v/v polisorbat 80,

o 1.625 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0082] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.01% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0083] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 0.1% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0084] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin A,

o 1% v/v polisorbat 80,

o 1 mg/mL triptofan,

o 140 mM NaCl,

1

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 6.75.

[0085] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 15% v/v polisorbat 20,

o 1 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0086] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 15% v/v polisorbat 20,

o 4 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

[0087] Prema drugom rešenju, teþna kompozicija prema pronalasku sadrži ili se sastoji u osnovi od:

o Botulinum neurotoksin B,

o 0.25% v/v polisorbat 20,

o 4 mg/mL triptofan

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM Natrijum fosfat,

pri þemu je pH navedene kompozicije približno 7.4.

1

[0088] Sledeüi aspekt je upotreba teþnih kompozicija prema pronalasku u terapiji.

[0089] Teþne kompozicije prema pronalasku se mogu koristiti u terapiji za leþenje ili prevenciju mišiünih poremeüaja, neuromišiünih poremeüaja, neuroloških poremeüaja, oftalmoloških poremeüaja, poremeüaja bola, psiholoških poremeüaja, zglobnih poremeüaja, zapaljenskih poremeüaja, endokrinih poremeüaja ili uroloških poremeüaja.

[0090] Na primer, teþne kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti za leþenje ili prevenciju bolesti, stanja ili sindroma odabranih izmeÿu sledeüih:

• oftalmološki poremeüaji izabrani iz grupe koju þine blefarospazam, strabizam (ukljuþujuüi restriktivni ili miogeni strabizam), ambliopija, oscilopsija, zaštitna ptoza, terapijska ptoza za zaštitu rožnjaþe, nistagmus, estropija, diplopija, entropion, uvlaþenje kapaka, orbitalna miopatija, heterophoria, misiopatija , nekontrolisana neusklaÿenost, primarna ili sekundarna ezotropija ili egzotropija, internuklearna oftalmoplegija, koso odstupanje, Duaneov sindrom i povlaþenje gornjeg kapka;

• poremeüaji pokreta, ukljuþujuüi hemifacijalni spazam, tortikolis, spastiþnost deteta ili odrasle osobe (npr. kod cerebralne paralize, post-moždanog udara, multiple skleroze, traumatiþnih povreda mozga ili pacijenata sa povredom kiþmene moždine), idiopatske fokalne distonije, ukoþenost mišiüa, grþ pisca, šaka distonija, VI paraliza nerva, oromandibularna distonija, tremor glave, tardivna diskinezija, tardivna distonija, profesionalni grþevi (ukljuþujuüi grþeve muziþara), paraliza facijalnog nerva, grþ zatvaranja vilice, grþ lica, sinkinezija, tremor, primarni tremor pisanja, mioklonus, ukoþenost sindrom osobe, distonija stopala, paraliza lica, sindrom bolne ruke i pokreta prstiju, tiþki poremeüaji, distoniþni tikovi, Tourette-ov sindrom, neuromiotonija, drhtava brada, boþna paraliza rektusa, inverzija distoniþnog stopala, distonija vilice, zeþji sindrom, cerebelarni tremor, paraliza nerva III, nepþani mioklonus, akastezija, grþevi mišiüa, paraliza IV nerva, smrzavanje hoda, ekstenzorska trunkalna distonija, sinkeza paralize facijalnog nerva, sekundarna distonija, Par kinsonova bolest, Huntingtonova horeja, epilepsija, distonija van perioda, cefaliþni tetanus, miokimija i sindrom benignih grþeva-fascikulacije;

• otorinolaringološki poremeüaji ukljuþujuüi spazmodiþnu disfoniju, poremeüaje otisa, ošteüenje sluha, klik u uhu, tinitus, vrtoglavicu, Meniere-ovu bolest, disfunkcija kohlearnog nerva, mucanje, krifofaringealna disfagija, bruksizam, zatvaranje grkljana u hroniþnoj aspiraciji, granulom vokalne šupljine, ventrikularna distonija, ventrikularna distonija mutacijska disfonija, trizmus, hrkanje, glasovni tremor, aspiracija, distonija izboþenja jezika, nepþani tremor, duboki ugriz usne i larinksne distonije; Sindrom prvog ugriza;

1

• gastrointestinalni poremeüaji, ukljuþujuüi ahalaziju, analnu fisuru, zatvor, disfunkciju temperomandibularnog zgloba, sfinkter Odijeve disfunkcije, trajni sfinkter Odijeve hipertenzije, poremeüaji crevnih mišiüa, puborectalis sindrom, anismus, spazm pilora, disfunkcija žuþne kese, poremeüaj pokretljivosti gastrointestinalnog ili ezofagealnog spazma i gastropareza; • urogenitalni poremeüaji, ukljuþujuüi detruzor sfinktera disinergija, detruzor hiperrefleksija, neurogena disfunkcija bešike (npr. kod Parkinsonove bolesti, povreda kiþmene moždine, moždani udar ili multipla skleroza), prekomerna aktivnost bešike, prekomerna aktivnost neurogenog detruzora, grþevi bešike, urinarna inkontinencija, zadržavanje mokraüe, hipertrofirani vrat bešike disfunkcija voidinga, intersticijski cistitis, vaginizam, endometrioza, bol u karlici, poveüanje prostate (benigna hiperplazija prostate), prostatodinija, rak prostate i priapizam;

• dermatološki poremeüaji, ukljuþujuüi proliferativne poremeüaje kožnih üelija, kožne rane, psorijazu, rozaceju, akne; retki nasledni poremeüaji kože poput Fok-Fordice sindroma ili Hailei-Haileijeve bolesti; smanjenje keloidnih i hipertrofiþnih ožiljaka; smanjenje veliþine pora; inflamatorna stanja kože; bolna upalna stanja kože;

• poremeüaji bola, ukljuþujuüi bol u leÿima (bol u gornjem delu leÿa, bol u donjem delu leÿa), miofascijalni bol, tenzijska glavobolja, fibromialgija, bolni sindromi, mijalgija, migrena, biþ, zglobovi, postoperativni bol, bol koji nije povezan sa grþem mišiüa i bolom povezanim sa poremeüajima glatkih mišiüa;

• inflamatorni poremeüaji ukljuþujuüi pankreatitis, neurogeni inflamatorni poremeüaji (ukljuþujuüi giht, tendonitis, bursitis, dermatomiozitis i ankilozirajuüi spondilitis);

• sekretorni poremeüaji kao što su prekomerno luþenje žlezda, hiperhidroza (ukljuþujuüi aksilarnu hiperhidrozu, palmarnu hiperhidrozu i Frei-ov sindrom), hipersalivacija, sialorrhoea, bromhidroza, hipersekrecija sluzi, hiperakrimacija, disfunkcija holokrinih žlezda; višak luþenja sebuma;

• respiratorni poremeüaji, ukljuþujuüi rinitis (ukljuþujuüi alergijski rinitis), HOBP, astmu i tuberkulozu;

• hipertrofiþni poremeüaji, ukljuþujuüi poveüanje mišiüa, maseteriþnu hipertrofiju, akromegaliju i neurogenu prednju hipertrofiju tibialisa sa mijalgijom;

• zglobni poremeüaji ukljuþujuüi teniski lakat (ili epikondilitis lakta), upale zglobova, koksartroza, osteoartritis, patologija rotatorne mišiüne kape ramena, reumatoidni artritis i sindrom karpalnog tunel;

• endokrini poremeüaji poput dijabetesa tipa 2, hiperglukagonizam, hiperinsulinizam, hipoinzulinizam, hiperkalcemija, hipokalcemija, poremeüaji štitne žlezde (ukljuþujuüi Graveovu bolest, tiroiditis, Hashimotov tiroiditis, hipertireoza i hipotiroidizam), paratireoidni poremeüaji (ukljuþujuüi hiperparatiroidizam i hipoparatireoidizam), Gushingov sindrom i gojaznost;

2

• autoimune bolesti poput sistemskog eritemskog lupusa;

• proliferativne bolesti, ukljuþujuüi tumore paraganglioma, rak prostate i tumore kostiju;

• traumatiþne povrede, ukljuþujuüi sportske povrede, povrede mišiüa, rane tetiva i frakture kostiju; i

• veterinarska upotreba (npr. imobilizacija sisara, konjske kolike, ahalazija životinja ili grþevi mišiüa životinja).

[0091] Teþna kompozicija prema pronalasku mogu se takoÿe koristiti u estetskoj medicini (to jest za poboljšanje kozmetiþkog izgleda), posebno za leþenje ili spreþavanje bora na koži, posebno bora na licu, kao što su mrštene linije lica, bore konture oka, linije namrgoÿenih glabelara, oborena usta, bore na vratu (platismalne trake), bore na bradi (mentalis, peau d'orange, udubljena brada), linije þela, bore „ogrebane kože“, tretman za podizanje nosa ili linije spavanja. Prema ovom aspektu pronalaska, subjekat koji se leþi ili spreþava za poboljšanje kozmetiþkog izgleda poželjno ne pati od bilo kog od gore opisanih poremeüaja, stanja ili sindroma. Još poželjnije, pomenuti subjekt je zdrav subjekt (tj. ne pati od bilo koje bolesti, stanja ili sindroma).

[0092] Teþne kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapijskim jedinjenjem. U jednom rešenju teþne kompozicije prema pronalasku se daju u kombinaciji sa analgetiþkim jedinjenjem za leþenje bola, naroþito u kombinaciji sa opioidnim derivatom kao što je morfijum kako je opisano u WO 2007/144493 þiji je sadržaj ovde ukljuþen referencom. U još jednom rešenju, teþne kompozicije prema pronalasku se daju u kombinaciji sa hijaluronskom kiselinom, na primer za leþenje karcinoma prostate kako je opisano u WO 2015/0444416 þiji je sadržaj ovde ukljuþen referencom.

[0093] Sledeüi aspekt ovog pronalaska je upotreba amino kiseline odabrane izmeÿu triptofana i tirozina za zaštitu proteinskog neurotoksina od razgradnje u teþnoj kompoziciji koji nema proteine životinjskog porekla.

[0094] Prema poželjnom rešenju, amino kiselina je triptofan, još poželjnije L-triptofan.

[0095] Poželjno je da je proteinski neurotoksin botulinum neurotoksin. Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin u složenom obliku. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin visoke þistoüe. Prema rešenju pronalaska, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin preþišüen iz svog prirodnog soja klostridija. Prema još jednom rešenju, botulinum neurotoksin je botulinum neurotoksin proizveden rekombinantno u heterolognom domaüinu kao što je E. coli. Prema ovom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti BoNT serotipa A, B, C, D, E, F ili G. Prema ovom pronalasku, botulinum neurotoksin može biti modifikovani botulinum neurotoksin kako je gore opisano. Prema ovom pronalasku, rekombinantni botulinum neurotoksin može biti himerni botulinum neurotoksin kako je gore opisano.

[0096] Prema poželjnom rešenju, amino kiselina se koristi u kombinaciji sa površinski aktivnom supstancom i puferom koji sadrži natrijum, hlorid i fosfat jone, a teþna kompozicija ima pH izmeÿu 5.5 i 8. Poželjno je da je površinski aktivna supstanca nejonsko površinski aktivna susptanca još poželjnije polisorbat, na primer PS20, PS60 ili PS80. Najpoželjnije, nejonska površinski aktivna supstanca je PS80. Poželjno je da pufer takoÿe sadrži jone kalijuma. Pufer se može dobiti, na primer, kombinovanjem soli natrijum hlorida, kalijum hlorida i natrijum fosfat. Prema poželjnom rešenju, pH je izmeÿu 6.0 i 7.5, na primer 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75, 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45 ili 7.5. Poželjno je da je pH unutar jedne jedinice od fiziološkog pH (koji je oko 7.4).

[0097] Prema poželjnom rešenju upotrebe prema pronalasku, teþna kompozicija je stabilna 2 meseca. Na primer, stabilna je 2 meseca na 2 do 8 ° C. Prema jednom rešenju, stabilna je 3 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema poželjnom rešenju, stabilna je 6 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilna je 12 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 18 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 24 meseca na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 36 meseci na 2 do 8 °C, na primer na 5 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 3 meseca na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C. Prema jednom rešenju, stabilan je 6 meseci na sobnoj temperaturi, na primer na 25 °C.

PRIMERI

1. Priprema stabilnih teþnih botulinum toksin A formulacija

[0098] Teþni preparati botulinum toksina koji sadrže 15 ng/mL visoko preþišüenog BoNT/A, 15% v/v polisorbat 20, amino kiselinu izabranu izmeÿu tirozina (Tyr), triptofana (Trp) i cisteina (Cys) ili smeše metionina (Met), tirozina (Tyr), triptofana (Trp) i cisteina (Cys) (Sigma Aldrich), i Slani Rastvor Fosfatnog Pufera (PBS iz Calbiochem) (140 mM NaCl, 10 mM natrijum fosfat i 3 mM KCl pri pH 7.4 na 25°C) su pripremljeni, filtrirani korišüenjem 0.22 mm PVDF (poliviniliden flourid) filtera i þuvani u silikonizovanim 2 mL staklenim špricevima na 6 dana na 40°C, nakon þega je izvršen test potencije za svaki preparat.

[0099] Za test potencije, špricevi koji su sadržali preparate ispraznili su se u staklene boþice od 2 ml (Chromacol, Gold) sa poklopcima koji sadrže PTFE tretirane gumene pregrade (Chromacol) ili u 1.7 ml plastiþne epruvete za mikro centrifugu (Axygen, Maximum Recovery), gde obe imaju niska svojstva adsorpcije proteina. Preparati su zatim razblaženi korišüenjem 0.9% rastvora NaCl sa 3% humanim serumskom albumina (HSA). Za svaki preparat, istog dana kada je izvedeno i razblaživanje, ubrizgano je 50 ml uzorka u mišiü Gastrocnemius miševa. Miševi su praüeni 3 dana i zabeležen je stepen paralize.

[0100] Rezultati su prikazani u tabeli 1.

Tabela 1 - ubrzani test skladištenja (6 dana na 40 °C) amino kiselinskih dodataka na BoNT/A stabilnost. Rezultati paralize kod miševa: - = nisu analizirani, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

[0101] Utvrÿeno je da tirozin i triptofan imaju zaštitni efekat protiv razgradnje BoNT/A. Utvrÿeno je da Triptofan ima najjaþi zaštitni efekat. Cistein, kao i smeša koja sadrži sve 4 amino kiseline, nisu imale zaštitni efekat.

2

2. Priprema stabilne teþne botulinum toksin B formulacije

[0102] Teþni preparati botulinum toksina koji sadrže 350 ng/mL visoko preþišüenog BoNT / B, 15% v/v polisorbata 20, amino kiselinu odabranu izmeÿu tirozina (Tir), triptofana (Trp) i cisteina (Cis) ili smeše metionina (Met ), tirozin (Tir), triptofan (Trp) i cistein (Cis) i slani rastvor fosfatnog pufera (PBS) pri pH 7.4 su pripremljeni, filtrirani uz pomoü filtera 0.22 mm i þuvani u silikonizovanim 2 ml staklenim špricevima dve nedelje na 40 °C , nakon þega je izvršen test potencije za svaki preparat kako je gore opisano.

[0103] Rezultati su prikazani u tabeli 2.

Tabela 2 - ubrzani test skladištenja (dve nedelje na 40 °C) amino kiselinskih dodataka na BoNT/B stabilnost. Rezultati paralize kod miševa: - = nisu analizirani, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

[0104] Utvrÿeno je da tirozin i triptofan imaju zaštitni efekat protiv razgradnje BoNT/B. Cistein, kao i smeša koja sadrži sve 4 amino kiseline, takoÿe je imao zaštitni efekat, ali u slabijoj meri.

3. Procena razliþitih koncentracija triptofana i polisorbata 20

[0105] Pripremljeni su teþni botulinum toksin preparati koji sadrže visoko preþišüeni BoNT/A ili BoNT / B i razliþite koncentracije polisorbata 20 (PS 20) i triptofana i slani rastvor fosfatnog pufera (PBS) na pH 7.4, filtrirani uz pomoü 0.22 mm filtera i þuvani u silikonizovanim 2 ml staklene špricevima. Ispitivanja potencije paralize zadnjih udova izvedena su za svaki preparat, kao što je gore opisano.

[0106] Rezultati su prikazani u tabeli 3.

Tabela 3 - procena koncentracija Trp i polisorbat 20 (PS20) na BoNT/A ili BoNT/B stabilnost. Rezultati paralize kod miševa: - = nije analizirana, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

2

4. Procena razliþitih koncentracija soli u BoNT/B preparatima

[0107] Teþni preparati botulinum toksina koji sadrže 100 ng/ml visoko preþišüenog BoNT/B, polisorbat 20, triptofan razliþitih dobavljaþa amino kiselina i pufer odabran od PBS pH 7.4 (Calbiochem), 12 nM fosfat pufera pH 7 (Apoteket) i 20 mM natrijuma acetat (NaAc) pH 5.5 (NaAc iz Fluka i sirüetna kiselina iz Merck) pripremljeni su, filtrirani uz pomoü filtera od 0.22 mm i þuvani u silikonizovanim staklenim špricevima od 2 ml. Ispitivanja potencije paralize zadnjih udova izvedena su za svaki preparat, kao što je gore opisano.

[0108] Rezultati su prikazani u tabeli 4.

Tabela 4 - procena razliþitih koncentracija soli na stabilnost BoNT/B. Rezultati paralize kod miševa: - = nis analizirani, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

[0109] Rezultati pokazuju da preparati koji sadrže PBS pufer (koji sadrže natrijum, hlorid, fosfat i kalijumove jone) imaju ulogu u stabilnosti botulinum toksina.

5. Procena razliþitih stabilizatora

2

[0110] Pripremljeni su teþni preparati botulinum toksina koji sadrže 15 ng/ml visoko preþišüenog BoNT/A, polisorbat 20 (PS20) ili polisorbat 80 (PS80) ili HSA, triptofan i PBS, filtrirani uz pomoü filtera 0.22 mm i þuvani u silikonizovanim staklenim špricevima od 2 ml. Ispitivanja potencije paralize zadnjih udova izvedena su za svaki preparat, kao što je gore opisano.

[0111] Rezultati su prikazani u tabeli 5.

Tabela 5 - procena razliþitih površinski aktivnih supstanci na stabilnost BoNT/A. Rezultati paralize kod miševa: - = nije analiziran, WN = bez zabeleške, PA = paraliza i † = smrt.

2

6. Procena razliþitih formulacija

[0112] Teþni preparati botulinum toksina koji sadrže 10 ng/ml visoko preþišüenog BoNT/A, 0.25% PS80, 1 mg/ml triptofana i PBS su pripremljeni kako je gore opisano. pH se podesi na 6.6 i 7.0 dodavanjem HCl. Svaki preparat je þuvan 5 nedelja na 40 °C.

[0113] Svaki preparat je zatim razblažen 10 puta i izvedeni su testovi potencije paralize zadnjih udova kako je gore opisano (0.05 ng po injekciji). U oba sluþaja, paraliza zadnjih udova primeüena je na dan 3. Paraliza je bila jaþa sa preparatom pH 6.6.

7. Procena razliþitih formulacija

[0114] Teþni preparati botulinum toksina koji sadrže 0,3 ng/ml visoko preþišüenog BoNT/A, polisorbat odabran izmeÿu PS20 i PS80, 1 mg/ml triptofana i 12 mM PBS pri pH 7.4 pripremljeni su kako je gore opisano. Dodavanjem 1.2 M HCl se pH svakog preparata podesi na pH 6.6 ili 6.9.

[0115] Polisorbat 20 je testiran u jednoj koncentraciji, 0.2% v/v, što odgovara oko 20 puta veüoj od njegove CMC (kritiþna micelarna koncentracija, oko 0.01% v/v na 21 °C). Polisorbat 80 je testiran na 0.04% i 0.2% m/v, što odgovara oko 20 i 100 puta više od njega CMC (oko 0.002% w/v na 21°C).

Tabela 6 - Izbor polisorbata i pH

[0116] Za svaki preparat, zapremina od 0.5 ml je punjena u staklene špriceve dužine 1 ml (BD) i zapeþDüena klipom obloženim fluorokarbonom.

[0117] Potencija je izmerena testom paralize zadnjih udova kod miševa, kao što je gore opisano.

2

[0118] Nije opaženo smanjenje potencije ni u jednoj formulaciji nakon 6 meseci þuvanja na 5 °C i posle 25 °C.

8. Procena razliþitih formulacija

[0119] Izraÿeno je devetnaest razliþitih formulacija koje sadrže visoko preþišüeni botulinum neurotoksin tipa A sa razliþitim koncentracijama polisorbata 80, triptofana, natrijum fosfat, natrijum hlorida, kalijum hlorida i promenljive pH. Svaka formulacija je imala ciljanu nominalnu snagu od 500 U/mL. Svaka formulacija je degasirana, filtrirana kroz filter od 0.2 mm i napunjena u boþice. Kao zaštitna atmosfera u boþicama korišüen je azotni gas. Punjenje je izvršeno u anaerobnoj komori. Svaka formulacija je punjena u 1 ml alikvota u atmosferi azota u staklene boþice od 2 ml, zatvorene zatvaraþima FluroTec®, zapeþDüene aluminijumskim zatvaraþima i odložene uspravno.

[0120] Stabilnost 19 formulacija procenjena je na 5 °C, 25 °C i 37 °C upotrebom BoTest® za merenje potencije.

Tabela 7 – Kompozicije ekscipijensa

2

Tabela 8 – Komponente pakovanja

[0121] Za sve formulacije rešenje je ostalo bistro i za veüinu delova bezbojno.

[0122] Koncentracije ekscipijenasa testirane u ovoj studiji izgleda da ne utiþu na pH formulacije tokom ispitivanog vremenskog intervala. Rezultati potencije su predstavljeni u tabeli 9.

Tabela 9 - Rezultati najbolje potencije

[0123] Za nekoliko kompozicija nije bilo više od 30% gubitka u potenciji tokom 6 meseci na 5 °C i / ili ne više od oko 40% gubitka u potenciji tokom 3 meseca na 25 °C i / ili ne više od oko 50% gubitka u potencija tokom 2 meseca na 37 °C .

9. Procena PS 60

[0124] Formulacija koja sadrži visoko preþišüeni botulinum neurotoksin tipa A je pripremljena sa 0.1% (v/v) PS60, 1 mg/mL L-Triptofana, 10 mM natrijum fosfatom, 140 mM natrijum hlorida, 3 mM kalijum hlorida i vodom za injekcije. pH se podesi na 6.75 sa HCl. Formulacija je imala ciljnu nominalnu snagu od 100 U/mL. Formulacija je degasirana, filtrirana kroz filtere od 0.2 mm i aseptiþno punjena u boþice od 2 ml u anaerobnoj komori sa atmosferom azota sa zapreminom punjenja od 1 ml. Azotni gas je korišüen kao zaštitna atmosfera u boþicama. Boþice su zatvorene zatvaraþima FluroTec®, zaptivenim aluminijumskim zatvaraþima.

Tabela 10 – Komponente pakovanja

[0125] Potencija tokom vremena na 37 °C i 25 °C izmerena je pomoüu MLD50 testa kako je ovde opisano.

[0126] Na 37 °C, preostala potencija nakon 9 nedelja bila je oko 50-55% od poþetne potencije.

[0127] Na 25 °C, preostala potencija nakon 3 meseca bila je oko 80% od poþetne potencije.

LISTA SEKVENCI

[0128]

<110> IPSEN BIOPHARM Ltd

NESTLE SKIN HEALTH SA

<120> Neurotoksin formulacija

1

2

�

�

�

4

�

�

�

�

1

�

�

�

�

4

�

�

�

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Teþna kompozicija koja sadrži proteinski neurotoksin, površinski aktivnu susptancu, amino kiselinu izabranu izmeÿu triptofana i tirozina, pufer koji sadrži natrijum, hlorid i fosfat jone, pri þemu navedena teþna kompozicija ima pH izmeÿu 5.5 i 8,

pri þemu navedena kompozicija ne sadrži proteine životinjskog porekla i

pri þemu navedena teþna kompozicija je stabilna tokom vremena.

2. Teþna kompozicija prema zahtevu 1, pri þemu navedena površinski aktivna supstanca je ne jonska površinski aktivna supstanca.

3. Teþna kompozicija prema zahtevu 2, pri þemu navedena ne jonska površinski aktivna supstanca je polisorbat, poželjno Polisorbat 20, Polisorbat 60 ili Polisorbat 80.

4. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri þemu navedena amino kiselina je triptofan, poželjno L-triptofan.

5. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri þemu navedeni pufer dalje sadrži jone kalijuma.

6. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri þemu navedena kompozicija ima pH izmeÿu 6.0 i 7.5.

7. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri þemu se ne dogodi više od 30% gubitka u ekstaüelijskoj proteolitiþkoj aktivnosti tokom 2, 3, 6, 12, 18, 24 ili 36 meseci na 5°C.

8. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri þemu navedeni proteinski neurotoksin je botulinum neurotoksin, odabran od prirodnog botulinum neurotoksina u složenom obliku, prirodnog botulinum neurotoksina visoke þistoüe i rekombinantnog botulinum neurotoksina.

9. Teþna kompozicija prema zahtevu 8, pri þemu navedeni botulinum neurotoksin je rekombinantni botulinum neurotoksin odabran izmeÿu botulinum neurotoksina A, B, C, D, E, F ili G, modifikovanog botulinum neurotoksina i himernog botulinum neurotoksina.

10. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri þemu navedena teþna kompozicija sadrži:

o 4 do 10000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po mL,

o 0.001 do 15% v/v polisorbat,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 10 do 500 mM NaCl,

o 1 do 50 mM KCl,

o 1 do 100 mM Natrijum fosfat,

ima pH izmeÿu 5.5 i 8, i stabilna je 6 meseci na 5°C.

11. Teþna kompozicija prema zahtevu 10, pri þemu navedena teþna kompozicija sadrži:

o 10 do 2000 LD50 jedinica botulinum neurotoksina po mL,

o 0.05 do 0.2% v/v polisorbat 80,

o 0.1 do 5 mg/mL triptofan,

o 25 do 300 mM NaCl,

o 1 do 10 mM KCl,

o 2 to 50 mM Natrijum fosfat,

ima pH izmeÿu 6.0 i 7.5, i stabilna je 12 meseci na 5°C.

12. Teþna kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 11 za primenu u terapiji.

13. Teþna kompozicija prema zahtevu 12 za primenu u leþenju ili prevenciji mišiünih poremeüaja, neuromišiünih poremeüaja, neuroloških poremeüaja, oftalmoloških poremeüaja, poremeüaja bola, psiholoških poremeüaja, zglobnih poremeüaja, inflamatornih poremeüaja, endokrinih poremeüaja ili uroloških poremeüaja.

14. Primena teþne kompozicije prema bilo kom od zahteva 1 do 11 u estetskoj medicini, na primer za leþenje ili prevenciju bora na koži, posebno bora na licu kao što su mrštene linije lica, bore na konturi oka, glabelarne linije mrštenja, oborena usta, bore na vratu (platismalne trake), bore na koži brada (mentalis, peau d'orange, udubljena brada), linije þela, bore "ogrebane kože", tretman podizanja nosa ili linije spavanja.

15. Primena amino kiseline odabrane izmeÿu triptofana i tirozina za zaštitu proteinskog neurotoksina od razgradnje u teþnoj kompoziciji koja je bez proteina životinjskog porekla.

16. Primena prema zahtevu 15, pri þemu navedena amino kiselina je triptofan.

17. Primena prema zahtevu 15 ili 16, pri þemu navedeni proteinski neurotoksin je botulinum neurotoksin.

18. Primena prema zahtevu 15, pri þemu se navedena amino kiselina koristi u kombinaciji sa površinski aktivnom supstancom i puferom koji sadrži jone natrijuma, hlorida i fosfata, a navedena teþna kompozicija ima pH izmeÿu 5.5 i 8.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5