[go: up one dir, main page]

RS61292B1 - Postupci i jedinjenja za selektivnu regulaciju ekspresije belančevina - Google Patents

Postupci i jedinjenja za selektivnu regulaciju ekspresije belančevina

Info

Publication number
RS61292B1
RS61292B1 RS20201573A RSP20201573A RS61292B1 RS 61292 B1 RS61292 B1 RS 61292B1 RS 20201573 A RS20201573 A RS 20201573A RS P20201573 A RSP20201573 A RS P20201573A RS 61292 B1 RS61292 B1 RS 61292B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mts
sirna
protein
seq
sequence
Prior art date
Application number
RS20201573A
Other languages
English (en)
Inventor
Jintai Huang
Sergey Ivashuta
Youlin Qi
Barbara E Wiggins
Yuanji Zhang
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology Llc filed Critical Monsanto Technology Llc
Publication of RS61292B1 publication Critical patent/RS61292B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak generalno se odnosi na tehničke oblasti agrikulture, oplemenjivanja biljka, i molekularne biologije. Još specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na postupke i jedinjenja za selektivno suprimiranje ekspresije rekombinantnih belančevina u muškom reproduktivnom tkivu transgeničnih biljaka i na pripadajuće primene.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Hibridno seme, odnosno, seme proizvedeno uz pomoć hibridizacije ili unakrsnefertilizacije blisko srodnih biljaka, može da proklija proizvodeći hibridne biljke koje poseduju željenu kombinaciju svojstava koje ne poseduje niti jedna od biljka iz kojih je dobiven hibrid. Hibridne biljke mogu da poseduju superiorne agronomske karakteristike, uključujući poboljšanje biljne veličine, prinos, nutritivni sastav, rezistenciju na bolesti, toleranciju na herbicide, toleranciju na stres, klimatsku adaptaciju, i druga željena svojstva. Efikasna proizvodnja hibridnog semena zahteva da polenu biljke ne treba biti omogućena samofertilizacija te iste biljke.
[0003] Kod proizvodnje hibridnog semena, proizvodnja i/ili ispuštanje polena može da se spreči u ženskoj roditeljskoj biljki sa ciljem da se olakša unakrsna-polinacija pomenute biljke umesto njene samo-polinacije. Takva prevencija može da se ostvari uz pomoć, na primer, ručnog odstranjivanja struktura koje sadrže polen (na primer, ručno ili mehaničko odstranjivanje nezrelih cvastova, upotrebe genetičkih sredstava za kontrolu polinacije (na primer, citoplazmatska muška sterilnost, jezgrina muška sterilnost), i/ili upotreba nekog hemijskog agensa.
[0004] Dokument WO 2007/047016 opisuje postupke za proizvodnju hibridnog semena uz pomoć rekombinantnih DNA-konstrukata koje podrazumeva prepoznavanje vezano uz nove zrele miRNA koja ima specifičan obrazac ekspresije u usevima. Međutim, dokument WO 2007/047016 ne opisuje mts-siRNA ili mts-siRNA-elemente.
SAŽETAK PRONALASKA
[0005] Ovaj pronalazak generalno se odnosi na rekombinante DNA-konstrukte koji obuhvataju sekvencu koja kodira neku belančevinu koja je operativno spojena na neku DNA-sekvencu koja sadrži siRNA-element specifičan za muško tkivo (mts-siRNA), pri čemu je pomenuti mtssiRNA-element heterologan u odnosu na pomenutu sekvencu koja kodira neku belančevinu, i pri čemu:
(a) pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem jednu mts-siRNA sekvencu koja je izabrana iz SEQ ID NO: 1-56 i 105-149; ili
(b) pomenut mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO: 57-94 i 96-104; ili
(c) pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO: 57-94 i 96-104, uz 1-3 ugrađene pogrešno-sparene baze; ili
(d) pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem 20 kontinuirana nukleotida mts-siRNA-elementa izabranog iz SEQ ID NO: 57-94 i 96-104;
pri čemu je ekspresija belančevine kodirane sa spomenutom sekvencom koja kodira neku belančevinu suprimirana u muškim reproduktivnim tkivima transgenične biljke koja eksprimira pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt.
[0006] U jednom dodatnom aspekt ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu rekombinantnog DNA-konstrukta koji obuhvata identifikovanje mts-siRNA-elementa koji sadrži barem jednu mts-siRNA-sekvencu i operativno spajanje pomenutog mts-siRNA-elementa na sekvencu koja kodira belančevinu, pri čemu pomenuti mts-siRNA-element je heterologan u odnosu na pomenutu sekvencu koja kodira belančevinu, i pri čemu pomenuti: sadrži sekvencu koja kodira belančevinu operativno spojenu na DNA-sekvencu koja sadrži siRNA-element koji je specifičan za muško tkivo (mts-siRNA), pri čemu pomenuti mtssiRNA-element je heterologan u odnosu na pomenutu sekvencu koja kodira belančevinu, i pri čemu:
(a) pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem jednu mts-siRNA-sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 1-56 i 105-149; ili
(b) pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO: 57-94 i 96-104; ili
(c) pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO: 57-94 i 96-104, uz 1-3 ugrađene pogrešno-sparene baze; ili
(d) pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem 20 kontinuirana nukleotida iz mts-siRNA-elementa izabranog iz SEQ ID NO: 57-94 i 96-104;
pri čemu je ekspresija belančevine kodirane sa pomenutom sekvencom koja kodira belančevinu suprimirana u muškim reproduktivnim tkivima neke transgenične biljke koja eksprimira pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt.
[0007] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje transgeničnu biljku ili seme, potomka, ili neki biljni deo koji u svojem genomu sadrže rekombinantnu DNA koja je opisana iznad.
[0008] U jednoj sličnoj izvedbi ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za selektivno suprimiranje ekspresija neke rekombinante belančevine u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke koja eksprimira neki rekombinantni DNA-konstrukt opisan iznad.
[0009] U dodatnoj alternativi, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za indukovanje muškesterilnosti u nekoj transgeničnoj biljki koje podrazumeva primenu efektivne količine nekog herbicida nekoj transgeničnoj biljki koja sadrži neki rekombinantni DNA-konstrukt opisan iznad, pri čemu se pomenuta aplikacija herbicida provodi tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva pomenute transgenične biljke koje dovodi do indukovanja muškesterilnosti u pomenutoj transgeničnoj biljki.
KRATAK OPIS SLIKA
[0010]
Slika 1 prikazuje mapiranje mts-siRNA-sekvence u mts-siRNA-elementu (SEQ ID NO: 85), kao šta je opisano u Primeru 1. x-os od levo prema desno predstavlja orijentaciju mts-siRNA-elementa pri čemu je gornji lanac predstavljen u gornjoj polovini prikaza, a donji lanac je predstavljen u donjoj polovini prikaza; nukleotidna pozicija u 5'-3' orijentaciji je prikazana sa levo prema desno gore i sa desno prema levo dole. mts-siRNA-sekvence su prikazane u svojim relativnim pozicijama poravnanja. yos predstavlja relativnu zastupljenost mts-siRNA eksprimiranu u tkivu cvasta (skup cvetova na zajedničkoj osovini) biljke izraženu kao transkripti po četvrt miliona sekvenci (transcripts per quarter million sequences, tpq). mts-siRNA koje su visokozastupljene u biblioteci su zaokružene.
Slika 2 prikazuje Northern-blot analizu za merenje sRNA-ekspresije koja je specifična za cvast, kao šta je opisano u Primeru 2.
Slika 3 prikazuje mapiranje mts-siRNA sekvenca u mts-siRNA-elementu (SEQ ID NO: 87), kao šta je opisano u Primerima 2 i 8. x-os od levo prema desno predstavlja orijentaciju mts-siRNA-elementa pri čemu je gornji lanac predstavljen u gornjoj polovini prikaza, a donji lanac je predstavljen u donjoj polovini prikaza; nukleotidna pozicija u 5'-3' orijentaciji je prikazana od levo prema desno gore, a od desno prema levo dole. mts-siRNA-sekvence su prikazane u svojim relativnim pozicijama poravnanja. Označene su tri mts-siRNA-sekvence koje su korišćene da se dizajniraju tri specifične probe (sR648011 (SEQ ID NO: 8), sR1372590 (SEQ ID NO: 26), i sR410590 (SEQ ID NO: 33)).
Slika 4 prikazuje Northern-blot analizu temporalne ekspresije mts-siRNA-elementa (SEQ ID NO: 87) u zrelom cvastu uz korišćenje RNA iz različitih inbrid-germplazma (inbrid germplasm) tj. ukrštenih u srodstvu, kao šta je opisano u Primeru 2.
Slika 5 prikazuje in situ lokalizaciju siRNA-ekspresije u zrelom prašniku primenom antisense- (levi panel) ili sense- (desni panel) proba za mts-siRNA-sekvencu (sR648011, SEQ ID NO: 8), kao šta je opisano u Primeru 2
Slika 6 prikazuje lokalizaciju CP4-EPSPS-belančevine u prašnicima ne-poprskanih biljaka koje su transgenične za konstrukt 3 (Slika 6A) ili konstrukt 4 (Slika 6B), kao šta je opisano u Primeru 4. Kukuruzne biljke transgenične za konstrukt 3 sadrže ekspresionu kasetu CP4-EPSPS/mts-siRNA-element. Biljke sa konstruktom 4 su kontrola.
Slika 7 prikazuje transgenične kukuruzne biljke izvedene iz konstrukata koji sadrže ekspresionu kasetu CP4-EPSPS/mts-siRNA-element, koje su bile vegetativno tolerantne na glifosat i imale indukovanu mušku-sterilnost uz pomoć kasne aplikacije glifosata, kao šta je opisano u Primeru 7. Slika 7A prikazuje glifosat-poprskane i nepoprskane transgenične kukuruzne biljke. Slika 7B prikazuje cvastove iz ne-poprskanih transgeničnih biljaka, a Slika 7C prikazuje polenska zrna iz ne-poprskanih transgeničnih biljaka. Slika 7D prikazuje cvastove iz poprskanih transgeničnih biljaka, a Slika 7E prikazuje polenska zrna iz poprskanih transgeničnih biljaka.
Slika 8 prikazuje podatke jednogodišnjih terenskih bodovanja muške fertilnosti (male fertility rating, MFR) nakon kasnog prskanja sa glifosatom. Slika 8A prikazuje prosečni MFR dobiven u tri različita režima tretmana sa glifosatom (Trt 1, Trt 2, i Trt 3) za NK603 (CP4-EPSPS transgenični kukuruz), MON 87427 (CP4-EPSPS transgenični kukuruz sa glifosat-inducibilnom muškom-sterilnosti), i dva događaja iz konstrukta 3, kao šta je opisano u Primeru 5; isprekidana linija pokazuje industrijski standard za mušku-sterilnost, MFR 2. Slika 8B prikazuje cvast iz biljaka tretiranih sa tretmanom prskanja protiv korova. Slika 8C prikazuje cvast iz biljaka tretiranih kasnim prskanjem sa glifosatom za indukovanje muške-sterilnosti.
Slika 9 prikazuje rezultate terenskih merenja broja biljaka po parceli sa muškomsterilnosti izmerenom preko ekstruzije (istiskivanje) prašnika u S90, S90+3, i S90+6 tokom tretmana sa dva različita režima prskanja sa glifosatom (Trt 2 i Trt 3) za NK603 (CP4-EPSPS transgenični kukuruz), MON 87427 (CP4-EPSPS transgenični kukuruz sa glifosat-inducibilnom muškom-sterilnosti), i za četiri događaja iz konstrukta 3, kao šta je opisano u Primeru 5.
Slika 10 prikazuje rezultate studija vijabilnosti polena kao šta je opisano u Primeru 5. Slike 10A i 10B pokazuju primer kasne ekstruzije prašnika u cvastu iz konstrukta 3 koji je prskan za sterilnost. Kutija na Slici 10A je onaj deo koji je povećan u Slici 10B. Primer kasne ekstruzije prašnika je zaokružen u Slici 10B. Bojanje polena po Alexander-u u prskanjem izazvanoj sterilnosti, kasno-ekstrudiranog prašnika iz prskanog konstrukta 3 prikazuje samo ne-vijabilan polen (prozirno svetlo-plavo, polenska zrna nepravilne forme) (Slika 10C). Polen iz prašnika ne-prskanog konstrukta 3 je potpuno vijabilan i izgleda neprozirno, tamno-ljubičasto i sferično kada je obojen po Alexander-u (Slika 10D).
Slika 11 prikazuje rezultate terenskog testiranja NK603-biljaka i konstrukta 3 za prinos blisko ukrštenih zrna i mušku fertilnost, kao šta je opisano u Primeru 6. Prinos iz srodnog parenja je izmeren u bušelima/akru (Bu/akr), a indukovana muška-sterilnost je izmerena preke rangiranja muške fertilnosti (MFR). Horizontalni stupac pokazuje industrijski standard muške-sterilnosti, MFR 2. Trt 1, Trt 2, i Trt 3 se odnose na režime tretmana 1, 2, i 3.
Slika 12 prikazuje rezultate terenskog testiranja srodnog ukrštanja ne-transgenične ženske linije (Null), linije MON87427, i tri događaja iz konstrukta 3, svi u istoj genetičkoj pozadini, a koje su bile unakrsno-oprašene sa muškim MON810/MON88017-testerom kako bi se generisalo seme F1-hibrida. Prinos hibridnog zrno je izmeren u bušelima/akru (Bu/akr). Trt 1, Trt 2, i Trt 3 se odnosi na režime tretmana 1, 2, i 3.
Slika 13 prikazuje analizu polenskog zrna iz F1-hibridnih biljaka, kao šta je opisano u Primeru 7. Paneli pokazuju rezultate bojanja polena po Alexander-u iz tri različita F1-hibridna ukrštanja: ne-transgenična ženska biljka x MON88017 muška biljka; MON87427 ženska biljka x MON88017 muška biljka; i ženska biljka sa događajem iz konstrukta 3 x MON88017 muška biljka. Fertilnost cvasta je funkcionalno obnovljena u F1-hibridima dobivenim iz biljaka sa događajima sa konstruktom 3 uz korišćenje MON88017-polena.
Slika 14 prikazuje shematske crteže izvedaba rekombinantnih DNA-konstrukata (prikazanih u 5'-3'smeru od levo prema desno) uključujući (gore) sekvencu koja kodira belančevinu (na primer, DNA koja kodira glifosat-rezistentan EPSPS) operativno spojen na DNA-sekvencu koja sadrži mts-siRNA-element (na primer, jedan ili više izabranih iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 57-94 i 96-104) (gore). U neograničavajućoj specifičnoj izvedbi (dole), pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt sadrži neki promotor koji je operativno spojen na, ili uravnan sa, nekim intronom, tranzitnim peptidom, CP4-EPSPS-kodiranom sa SEQ ID NO: 95, mts-siRNA-elementom (SEQ ID NO: 81), i 3'UTR.
DETALJAN OPIS
REKOMBINANTNI DNA-KONSTRUKTI
[0011] Ova specifikacija obezbeđuje jedinjenja i postupke za selektivno suprimiranje ekspresije rekombinante belančevine u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke i njihovu primenu. U ovde obezbeđenom aspektu, konstrukt rekombinantne DNA koji uključuje sekvencu koja kodira belančevinu koja je operativno spojena na DNA-sekvencu uključujući mts-siRNA-element, tj. neki himerni transgen uključujući sekvencu koja kodira belančevinu koja kodira pomenutu rekombinantnu belančevinu i barem jedan mts-siRNA-element operativno spojen na pomenutu sekvencu koja kodira belančevinu. U jednom aspektu, takvi konstrukti rekombinantne DNA su korisni za selektivno suprimiranje ekspresije neke rekombinantne belančevine u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke. Jedan ovde obezbeđen aspekt obuhvata molekul rekombinantne DNA koji sadrži konstrukt rekombinantne DNA i postupke za njegovu primenu. Sekvence nukleinske kiseline mogu da se obezbede u formi DNA ili RNA, kao šta je specifikovano; opis jednog molekula neizbežno definiše drugi, kao šta je poznato stručnjacima. Nadalje, opis sekvenca neke nukleinske kiseline neizbežno definiše tačan komplement pomenute sekvence, kao šta je poznato stručnjacima.
[0012] "siRNA specifična za muško tkivo" ili "mts-siRNA" definišu malu RNA (sRNA) od oko 18 do oko 26 nukleotida (na primer, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili 26 nukleotida) obogaćena ili specifično eksprimirana u muškom reproduktivnom tkivu(tkivima) (na primer, muški cvast) neke biljke, tj., koja poseduje ekspresioni obrazac koji je specifičan za muško tkivo. siRNA specifične za muško tkivo se prirodno pojavljuju u biljkama i mogu da se detektuju primenom tehnika koje su poznate stanju tehnike, poput Northern-analize niske molekulske mase. DNA sekvenca koja je komplementarna sa mts-siRNA ovde se naziva "mtssiRNA-sekvenca". Primeri za mts-siRNA sekvence za endogene biljne mts-siRNA su obezbeđeni u SEQ ID NO: 1-56 i 105-149. U jednoj izvedbi, mts-siRNA-sekvenca je tačan DNA-komplement (bez pogrešno-sparenih baza) nekoj mts-siRNA. U drugim izvedbama, mtssiRNA-sekvenca varira za 1-3 nukleotida (pogrešno-sparene baze) upoređeno sa nekom mtssiRNA mada svejedno poseduje dovoljnu komplementarnost da se spoji ili da hibridizuje, na primer, u tipično fiziološkim uslovima, sa pomenutom mts-siRNA. "Komplementarnost" se odnosi na sposobnost nukleotida iz jednog polinukleotidnog lanca da se spare sa nukleotidima iz drugog polinukleotidnog lanca u skladu sa standardnim pravilima Watson-Crick komplementarnosti (tj., gvanin se sparuje sa citozinom (G:C), a adenin se sparuje sa timinom (A:T) ili uracilom (A:U); moguća je pojava intra-lančane hibridizacije između dva ili više komplementarnih regiona u jednom polinukleotidu. Kada je uključena u nekom konstruktu rekombinantne DNA kao šta je ovde opisano, mts-siRNA je sposobna za RNAi-posredovanu supresiju ili prekidanja ekspresije nekog gena i/ili belančevine.
[0013] Barem jedna, barem dve, barem tri, ili više od tri mts-siRNA-sekvenca mogu da klasterišu zajedno ili da se preklope u jednom DNA molekulu. Takav DNA molekul ovde se naziva "siRNA-element specifičan za muško tkivo" ili "mts-siRNA-element", a definisan je tako da uključuje barem jednu, barem dve, barem tri, ili više od tri mts-siRNA-sekvenca unutar sekvencinog prozora od oko 500 nukleotida. mts-siRNA-element može da bude bilo koje dužine, poput oko 20 nukleotida (nt), oko 25 nt, oko 30 nt, oko 40 nt, oko 50 nt, oko 60 nt, oko 70 nt, oko 80 nt, oko 100 nt, oko 150 nt, oko 200 nt, oko 250 nt, oko 300 nt, oko 350 nt, oko 400 nt, oko 450 nt, oko 500 nt, oko 550 nt, ili oko 600 nt.
[0014] Rekombinantni DNA-konstrukt iz ove specifikacije je neki DNA-molekul koji uključuje barem jednu sekvencu koja kodira belančevinu operativno spojenu na DNA sekvenca uključujući mts-siRNA-element. Termin "rekombinantno" se odnosi na molekul ili na ćelija ili organizam koji je proizveden ljudskom tehnologijom primenom genetičkog inženjeringa zbog čega nije prirodan. Kao šta se ovde koristi, rekombinantni DNA-konstrukt je neki rekombinantni DNA-molekul koji uključuje dve ili više heterologane DNA sekvence. Termin "heterologan" se odnosi na odnos između dve ili više sekvenca nukleinskih kiselina ili belančevina koje su izvedene iz različitih izvora (na primer, iz različitih lokacija u genomu, ili iz različitih vrsta). U jednom primeru, promotor i DNA sekvenca koja kodira belančevinu su međusobno heterologni ako pomenuti promotor nije neki nativan promotor pomenute DNA sekvence koja kodira belančevinu. U drugom primeru, sekvenca koja kodira belančevinu je heterologna u odnosu na mts-siRNA-element ako takva kombinacija nije prirodna, poput nekog biljnog mts-siRNA-elementa operativno spojenog na neki gen za toleranciju na herbicid, poput CP4-EPSPS. Osim toga, neka naročita sekvenca može da bude "heterologna" u odnosu na ćeliju ili organizam u kojeg je unesena (tj., sekvenca koja nije prirodno prisutna u toj naročitoj ćeliji ili organizmu).
[0015] Termin "operativno spojena" se odnosi na dva polinukleotidna molekula spojena na način da jedan može da deluje na ekspresiju drugog. Na primer, prvi polinukleotidni molekul je operativno spojen na drugi polinukleotidni molekul pri čemu su polinukleotidni molekuli aranžirani tako da prvi polinukleotidni molekul može da utiče na ekspresiju drugog polinukleotidnog molekula. Pomenuta dva polinukleotidna molekula mogu da budu deo jednog kontinuiranog polinukleotidnog molekula, a mogu da budu susedni ili razdvojeni. Na primer, neki mts-siRNA-element je operativno spojen na sekvencu koja kodira belančevinu ako, nakon transkripcije u ćelijama muškog reproduktivnog tkiva, prisutnost pomenutog mts-siRNA-elementa rezultuje supresijom ekspresije rekombinante belančevine u ćeliji. Operativno spajanje sekvence koja kodira neku belančevinu i mts-siRNA-elementa može da se ostvari, na primer, preko ugradnje mts-siRNA-elementa u susedstvu sekvence koja kodira neku belančevinu (poput lociranja 5' ili 3' u odnosu na sekvencu koja kodira neku belančevinu, ali ne nužno u kontinuiranom spoju), u ili susedno od nekog netranslatiranog regiona (UTR) rekombinantnog DNA-konstrukta (poput lociranja u ili susedno od 5'-UTR ili 3'-UTR), i/ili nakon sekvence koja kodira neku belančevinu, ali pre poliadenilacijskog signala. U jednom aspektu, jedan ili više mts-siRNA-elementa je locirano između pomenute sekvence koja kodira neku belančevinu i pomenute poliadenilacijske sekvence, tj., 3' od i susedno sa sekvencom koja kodira neku belančevinu. U drugom aspektu, jedan ili više mts-siRNA-elemenata je locirano između STOP-kodona pomenute sekvence koja kodira neku belančevinu i pomenute poliadenilacijske sekvence. U drugom aspektu, jedan ili više mts-siRNA-elemenata je locirano unutar 3'-UTR sekvence susedno pomenutoj sekvenci koja kodira neku belančevinu.
[0016] DNA sekvenca mts-siRNA-elementa može da varira uzimajući u obzir različite moguće kombinacije i lokacije pojedinih mts-siRNA-sekvenca i/ili i mogućnost uvođenja 1-3 nukleotida sa pogrešno-sparenim bazama u nekom mts-siRNA-elementu (u odnosu na neku određenu mts-siRNA sekvencu). Primeri za mts-siRNA-elemente su ovde obezbeđeni u SEQ ID NO: 57-94 i 96-104 i u radnim Primerima. mts-siRNA-element može da funkcionira u oba smera, tj., nije ograničen usmeravanjem, pa kao takav može da se koristi u 5'-3'-orijentaciji ili u 3'-5'-orijentaciji u nekom rekombinantnom DNA-konstruktu.
[0017] mts-siRNA-elementi, mts-siRNA sekvence, i razni mts-siRNA mogu da se identifikuju primenom raznih postupaka koji su poznati stručnjacima, na primer uz pomoć bioinformatičke analize biljnih sRNA- i cDNA-biblioteka. Primer za takve identifikacione postupke je obezbeđen u Primerima ispod. Konkretno, mts-siRNA i mts-siRNA sekvence mogu da se identifikuju iz sRNA-biblioteke. Identifikovane mts-siRNA sekvence mogu da se uporede sa kolekcijama cDNA i/ili genomskih sekvenca sa ciljem da se identifikuju mts-siRNA-elementi (tj., regioni DNA uključujući barem jednu, barem dve, barem tri, ili više od tri mts-siRNA sekvence unutar sekvencinoga okvira od 500 nukleotida), koji su korisni za razvijanje rekombinantnih DNA-konstrukata kao šta je ovde opisano.
[0018] U nekim aspektima, pomenuti mts-siRNA-elementi su sintetizovani ili modifikovani in vitro sa ciljem da sadrže više, manje, ili različite mts-siRNA sekvence i/ili da rearanžiraju relativnu poziciju jedne ili više mts-siRNA sekvenca, pri čemu takva modifikacija je korisna za povećanje ili smanjivanje efekta samog mts-siRNA-elementa. Postupci za sintetizovanje ili za in vitro modifikovanje mts-siRNA-elementa i za određivanje optimalne varijacije za željeni nivo supresije su poznati stručnjacima. Himerni mts-siRNA-elementi mogu takođe da se dizajniraju primenom postupaka poznatih stručnjacima, poput ugradnje dodatnih željenih mtssiRNA sekvenca interno u nekom mts-siRNA-elementu ili uz pomoć spajanja dodatnih mtssiRNA sekvenca 5' ili 3' u odnosu na mts-siRNA-element. Himerni mts-siRNA-element uključuje mts-siRNA-elemente koji poseduju oko 80 nt, oko 100 nt, oko 150 nt, oko 200 nt, oko 250 nt, ili oko 300 nt iz SEQ ID NO: 86; oko 80 nt, oko 100 nt, oko 150 nt, oko 200 nt, oko 250 nt, ili oko 300 nt iz SEQ ID NO: 87; i/ili oko 80 nt, oko 100 nt, oko 150 nt, oko 200
1
nt, oko 250 nt, oko 300 nt, oko 350 nt, oko 400 nt, oko 450 nt, oko 500 nt, ili oko 550 nt iz SEQ ID NO: 85. Dodatni aspekti su obezbeđeni u radnim Primerima.
[0019] Pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt može da se koristi za selektivno suprimiranje ekspresije rekombinantne belančevine u muškim reproduktivnim tkivima neke transgenične biljke koja eksprimira pomenuti konstrukt, tj., koje rezultuje ekspresijom samo u vegetativnim tkivima, ali ne i u muškim reproduktivnim tkivima. Kao šta se ovde koristi, "ekspresija neke rekombinante belančevina" se odnosi na proizvodnju rekombinantne belančevine iz neke sekvence koja kodira neku belančevinu, koje rezultuje nastankom transkripta (mRNA) u ćeliji. Kao šta se ovde koristi, termin "suprimiranje" označava smanjivanje; na primer, suprimiranje ekspresije rekombinantne belančevine označava smanjivanje nivoa rekombinantne belančevine proizvedene u nekoj ćeliji, na primer, preko RNAi-posredovane posttranskripcijske genske supresije.
[0020] Selektivna supresija rekombinantne belančevine, kao šta se ovde koristi, se odnosi na smanjivanje proizvodnje rekombinantne belančevine u nekoj ćeliji ili tkivu ako se uporedi sa referentnom ćelijom ili tkivom za barem oko 75%, barem oko 80%, barem oko 85%, barem oko 90%, barem oko 95%, ili barem oko 99%. Referentna ćelija ili tkivo mogu da budu, na primer, vegetativna ćelija ili tkivo iz iste ili slične transgenične biljke koja eksprimira pomenutu rekombinantnu belančevinu, ili na primer, vegetativna ćelija ili tkivo iz neke transgenične biljke koja poseduje sličan transgen za eksprimiranje pomenute rekombinantne belančevine, ali joj nedostaje mts-siRNA-element. Supresija ekspresije belančevine može da se odredi primenom bilo koje tehnike koja je poznata stručnjaku, poput direktnog merenja akumulacije belančevine u ćeliji ili primercima tkiva uz pomoć tehnika poput ELISA ili Western-blot analize, uz pomoć merenja encimske aktivnosti belančevine, ili uz pomoć fenotipskog određivanja ekspresije belančevine. U jednom aspektu, selektivna supresija rekombinantne belančevine se odnosi na dovoljno smanjivanje ekspresije neke rekombinantne belančevine koja je sposobna da uspostavi toleranciju na herbicid u nekom muškom tkivu neke transgenične biljke, koje rezultuje detektabilnim fenotipom izmenjene muške fertilnosti u nekoj transgeničnoj biljki koja je tretirana sa pomenutim herbicidom u formi spreja za sterilnost. Detekcija izmenjene muške fertilnosti u takvoj transgeničnoj biljki će, prema tome, da ukazuje na selektivnu supresiju rekombinantne belančevine.
[0021] Kao šta se ovde koristi, termin "sekvenca koja kodira neku belančevinu" se odnosi na neki polinukleotidni molekul koji poseduje nukleotidnu sekvencu koja kodira sekvencu nekog polipeptida ili belančevine, tj., polinukleotidna sekvenca koja kodira neku rekombinantnu belančevinu. U zavisnosti o uslovima, pomenuta nukleotidna sekvenca može, ali ne mora da bude translatirana u neki polipeptidni molekul u ćeliji. Granice sekvence koja kodira neku belančevinu se uobičajeno određene uz pomoć START-kodona za početak translacije na 5'-terminusu i STOP-kodona za završetak translacije na 3'-terminusu. Sekvenca koja kodira neku belančevinu uključuje neku sekvencu koja kodira neku belančevinu koja obezbeđuje neku željenu karakteristiku povezanu sa biljnom morfologijom, fiziologijom, rastom i razvojem, prinosom, nutritivnim pojačanjem, rezistencijom na neku bolest ili nametnika, toleranciju na herbicid, ili okolišnom ili hemijskom tolerancijom. Sekvenca koja kodira neku belančevinu može da kodira rekombinantnu belančevinu koja kada je eksprimirana u nekoj transgeničnoj biljki uzrokuje toleranciju na herbicid barem u ćeliji i/ili tkivu gde se pomenuta belančevina eksprimira; selektivnu supresiju belančevine za toleranciju na herbicid u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke zajedno sa pravovremenom aplikacijom herbicida rezultuje barem smanjenom muškom fertilnosti ili muškom sterilnosti. Takva inducibilna muška sterilnost zajedno sa tolerancijom na vegetativni herbicid može da se koristi za povećanje efikasnosti kojom se hibridno seme proizvodi, na primer uz pomoć eliminiranja ili smanjivanja potrebe za fizičkim kastriranjem kukuruzne biljke koja se koristi kao ženska biljka u nekom ukrštanju tokom proizvodnje hibridnog semena. Sistemi za herbicidinducibilnu mušku-sterilnost su već opisani, na primer u U.S. pat. br.6,762,344 i U.S. patentnoj publikaciji 2011/0126310. Primeri za korisne herbicide uključuju inhibitore acetil koencim A karboksilaze (ACCaza) (na primer, razni FOP i DIM), inhibitore acetolaktat sintaze (ALS) (na primer, sulfoniluree (SU) i imidazolinoni (IMI)), inhibitore fotosistema II (PSII) (na primer, traiazini i fenol etre), inhibitore protoporfirinogen oksidaze (PPO) (na primer, flumioksazsin i fomesafen), inhibitore 4-hidroksifenol piruvat dioksigenaze (HPPD) (na primer, izoksaflutol i triketone poput mesotriona), inhibitore 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintaze (EPSPS) (na primer, glifosat), inhibitore glutamin sintetaze (GS) (na primer, glufosinat i fosfinotricin), sintetički auksini (na primer, 2,4-D i dikamba). Primeri za sekvence koje kodiraju belančevine i/ili rekombinante belančevine uključuju gene koji kodiraju rekombinante belančevine koje donose toleranciju na inhibitore HPPD (poput herbicid-neosetljivih HPPD), gene koji kodiraju rekombinante belančevine koje donose toleranciju na glufosinat (poput pat i bar), gene koji kodiraju rekombinantne belančevine koje donose toleranciju na glifosat (poput glifosattolerantne EPSPS poznati kao CP4-EPSPS, a ovde obezbeđeni kao SEQ ID NO: 95), i gene koji kodiraju rekombinante belančevine koje donose toleranciju na dikambu (poput dikamba monooksigenaze (DMO)).
[0022] Rekombinantni DNA-konstrukti iz ovoga pronalaska se proizvode primenom tehnika koje su poznate stanju tehnike, a uključeni su u vektorima, plazmidima, ili plazmidnoj DNA za biljnu transformaciju. Takvi rekombinantni DNA-konstrukti su korisni za proizvodnju transgeničnih biljaka i/ili ćelija, a kao takvi takođe mogu da se i nalaze u genomskoj DNA neke transgenične biljke, semena, ćelije, ili u biljnom delu. Ova specifikacija, prema tome, uključuje aspekte u kojima je rekombinantni DNA-konstrukt lociran u vektoru za biljnu transformaciju, ili u biolistic-čestici za transformiranje biljne ćelije, ili unutar nekog hromosoma ili plazmida neke transgenične biljne ćelije, ili unutar neke transgenične ćelije, transgeničnog biljnog tkiva, transgeničnog biljnog semena, transgeničnog polenskog zrna, ili neke transgenične ili delomično transgenične (na primer, nakalemljena) biljke. Vektor je bilo koji DNA-molekul koji može da se koristi za potrebe biljne transformacije, tj., za uvođenje DNA u ćeliju. Rekombinantni DNA-konstrukti iz ovoga pronalaska mogu, na primer, da se ugrade u neki vektor za biljnu transformaciju i da se koriste za biljnu transformaciju sa ciljem proizvodnje transgeničnih biljaka, semena, i ćelija. Postupci za konstruiranje vektora za biljnu transformaciju su dobro poznati stanju tehnike. Vektori za biljnu transformaciju generalno uključuju, neki prikladan promotor za ekspresiju neke operativno spojene DNA, operativno spojenog rekombinantnog DNA-konstrukta, i neki poliadenilacijski signal (koji može da se nalazio na 3'-UTR sekvenci). Promotori uključuju one koji funkcionišu u biljki kako bi eksprimirali neki operativno spojeni polinukleotid. Takvi promotori su različiti, dobro su poznati stanju tehnike i uključuju one koji su inducibilni, viralni, sintetički, konstitutivni, vremenski regulisani, prostorno regulisani, i/ili prostorno-vremenski regulisani. Dodatne opcione komponente uključuje, jedan ili više od sledećih elemenata: 5'-UTR, pojačivač, cisdelujući element, intron, signalna sekvenca, tranzitna peptidna sekvenca, i jedan ili više selektivnih-marker gena. U jednom aspektu, vektor za biljnu transformaciju sadrži neki rekombinantni DNA-konstrukt.
[0023] Pomenuti rekombinantni DNA-konstrukti i vektori za biljnu transformaciju se proizvode primenom bilo kojeg postupka koji je prikladan za pomenutu namenu, uzimajući u obzor, na primer, tip željene ekspresije, željenu sekvencu koja kodira neku belančevinu (čime uzrokuje toleranciju na herbicid), i prikladnost njene primene u biljki u kojoj pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt treba da bude eksprimiran. Opšti postupci koji su korisni za
1
manipulisanje DNA-molekula za pripremu i korišćenje rekombinantnih DNA-konstrukata i vektora za biljnu transformaciju su dobro poznati stanju tehnike, a detaljno su opisani u, na primer, priručnicima ili laboratorijskim instrukcijama uključujući Sambrook & Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (treće izdanje), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001. Pomenuti rekombinantni DNA-konstrukti iz ovoga pronalaska mogu da budu modifikovani primenom postupaka koji su poznati stanju tehnike, kompletno ili delomično, na primer, za povećanu sigurnost manipulisanja DNA (poput mesta prepoznavanja restrikcionih encima ili mesta za kloniranje na bazi rekombinacije), ili za uvođenje sekvenca biljnepreferencije (poput preferencije upotrebe biljnih kodona ili Kozak-konsenzus sekvenca), ili za uključivanje sekvenca koje su korisne za dizajn rekombinantnih DNA-konstrukata (poput spejserskih ili linkerskih sekvenca). U nekim ovde opisanim aspektima, DNA-sekvenca iz rekombinantnog DNA-konstrukta uključuje DNA-sekvencu koja je koton-optimizovana za biljku u kojoj će se pomenuti rekombinanti DNA-konstrukt eksprimirati. Na primer, rekombinantni DNA-konstrukt koji će se eksprimirati u nekoj biljki može da poseduje sve ili samo delove svoje kodon-optimizovane sekvence za ekspresiju u nekoj biljki primenom postupaka koji su poznati stanju tehnike. Pomenuti rekombinantni DNA-konstrukti iz ovoga pronalaska mogu sadrže druge rekombinantne DNA za uvođenje dodatnih svojstava (na primer, u slučaju transformiranih biljaka, ta svojstva uključujući rezistenciju na herbicid, rezistenciju na nametnika, toleranciju na klijanje u hladnom, toleranciju na nedostatak vode) na primer, uz pomoć eksprimiranja ili suprimiranja drugih gena.
TRANSGENIČNE BILJNE ĆELIJE I TRANSGENIČNE BILJKE
[0024] Jedan aspekt ovoga pronalaska uključuje transgenične biljne ćelije, transgenična biljna tkiva, i transgenične biljke ili seme koji sadrže neki rekombinantni DNA-konstrukt iz ovoga pronalaska. Veštački ili rekombinantni biljni hromosomi mogu da sadrže neki rekombinantni DNA-konstrukt iz ovoga pronalaska. Prikladni postupci za transformaciju biljnih ćelijadomaćina za primenu u ovom pronalasku uključuju bukvalno bilo koji postupak uz pomoću kojeg DNA može da se uvede u ćeliju (na primer, gde je rekombinantni DNA-konstrukt stabilno ugrađen u neki biljni hromosom) i svi su dobro poznati stanju tehnike. Primer širokoprimenjivanog postupka za uvođenje nekog rekombinantnog DNA-konstrukta u biljne ćelije je sistem Agrobacterium-transformacije, koji je dobro poznat stručnjacima. Transgenične biljke mogu da se regenerišu iz transformisane biljne ćelije primenom postupaka kulture biljnih ćelija. Transgenična biljka koja je homozigotna za neki transgen može da se dobije seksualnim parenjem (selfing) nezavisno segregirane transgenične biljke, koja sadrži pojedinačnu egzogenu gensku sekvencu, sa samom sobom, na primer F0-biljka, kako bi se proizvelo F1-seme. Jedan četvrtina proizvedenog F1-semena će biti homozigotno sa pomenuti transgen. Biljke izrasle klijanjem F1-semena mogu da se testiraju na heterozigotnost, tipično primenom SNP-testa ili testa termalne amplifikacije koji omogućava razlikovanje između heterozigota i homozigota (tj., zygosity-test).
[0025] Ova specifikacija obezbeđuje transgeničnu biljku koja u svom genomu poseduje rekombinantni DNA-konstrukt iz ovoga pronalaska, uključujući alfalfa, pamuk, kukuruz, uljanu repicu, pirinač, soju, i pšenicu, između ostalog. Takođe, ovde su opisane transgenične biljne ćelije, biljni delovi, i potomci takvih transgeničnih biljaka. Kao šta se ovde koristi, "potomak" uključuje bilo koju biljku, seme, biljnu ćeliju, i/ili biljni deo proizveden iz ili regenerisan iz neke biljke, semena, biljne ćelije, i/ili biljnog dela koji sadrže rekombinantni DNA-konstrukt iz ovoga pronalazaka. Transgenične biljke, ćelije, delovi, i seme proizvedeno iz takvih biljka mogu da budu homozigotni ili heterozigotni za pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt.
[0026] Dalje ovde su opisani aspekti u kojima se pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt nalazi u uobičajenom produktu proizvedenom iz neke transgenične biljke, semena, ili biljnog dela ovde opisani; poput uobičajenih produkata uključujući, ubrane delove biljke, zgnječena ili cela zrna ili seme biljke, ili bilo koja hrana ili produkt koji nije hrana koji sadrže pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt.
POSTUPCI ZA INDUKOVANJE MUŠKE-STERILNOSTI U TRANSGENIČNIM BILJKAMA I ZA PROIZVODNJU HIBRIDNOG SEMENA
[0027] Drugi aspekt uključuje postupak za indukovanje muške-sterilnosti u nekoj transgeničnoj biljki koje podrazumeva dodavanje neke efektivne količine nekog herbicida nekoj transgeničnoj biljki koja sadrži rekombinantni DNA-konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira neku rekombinantnu belančevinu koja donosi toleranciju na herbicid pomenutoj transgeničnoj biljki, a koja je operativno spojena na DNA-sekvencu koja sadrži mts-siRNA-element koji donosi barem toleranciju na vegetativni herbicid pomenutoj transgeničnoj biljki, pri čemu dodavanje herbicida se provodi tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva pomenute transgenične biljke koje indukuje mušku-sterilnost u pomenutoj transgeničnoj biljki.
1
[0028] U jednom aspektu, pomenuta transgenična biljka je biljka kukuruza. Dodavanje herbicida sprečava barem ispuštanje polena ili ekstruziju prašnika. U jednoj izvedbi, razvoj muškog reproduktivnog tkiva nastupa u fazi koja je izabrana iz grupe koja obuhvata fazu V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, i V14 razvoja biljke kukuruza.
[0029] U jednom aspektu, pomenuti herbicid je izabran iz grupe koja obuhvata inhibitore acetil koencim A karboksilaze (ACCaza), inhibitore acetolaktat sintaze (ALS), inhibitore fotosistema II (PSII), inhibitore protoporfirinogen oksidaze (PPO), inhibitore 4-hidroksifenol piruvat dioksigenaze (HPPD), inhibitore 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintaze (EPSPS), inhibitore glutamin sintetaze (GS), i sintetičke auksine. U jednom aspektu, pomenuti herbicid je glifosat, a pomenuta rekombinantna belančevina je glifosat-tolerantna EPSPS.
[0030] Postupak za proizvodnju hibridnog semena obuhvata (a) dodavanje herbicida nekoj transgeničnoj biljki koja sadrži rekombinantni DNA-konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira neku rekombinantnu belančevinu koja donosi toleranciju na herbicid pomenutoj transgeničnoj biljki, a koja je operativno spojena na DNA-sekvencu uključujući mts-siRNA-element, pri čemu se dodavanje herbicida provodi tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva pomenute transgenične biljke koje indukuje mušku-sterilnost u pomenutoj transgeničnoj biljki; (b) fertilizovanje pomenute transgenične biljke sa polenom iz druge biljke; i (c) branje hibridnog semena iz pomenute transgenične biljke. U jednom aspektu, pomenuta transgenična biljka je kukuruz. U jednom aspektu, pomenuti herbicid je glifosat, a rekombinantna belančevina je glifosat-tolerantni EPSPS. U jednom aspektu, pomenuti glifosat se tokom razvoja nanosi u efektivnoj dozi od oko 0.125 funta kiselinskog ekvivalenta po akru do oko 8 funta kiselinskog ekvivalenata po akru.
[0031] Hibridno seme može da se ubere (sakupi) iz muško-sterilne transgenične biljke koja je bila fertilizovana sa polenom iz neke druge biljke, pri čemu pomenuta muško-sterilna transgenična biljka sadrži neki rekombinantni DNA-konstrukt uključujući neku sekvencu koja kodira neku rekombinantnu belančevinu koja pomenutoj transgeničnoj biljki donosi toleranciju na herbicid i koja je operativno spojena na neku DNA sekvencu uključujući mts-siRNA-element, i pri čemu pomenuta transgenična biljka je indukovana da postane muško-sterilna dodavanjem efektivne količine herbicida tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva u pomenutoj transgeničnoj biljki. U jednom aspektu, pomenuto hibridno seme je hibridno seme transgeničnog kukuruza. U jednoj izvedbi, pomenuti herbicid je glifosat, a pomenuta
1
rekombinantna belančevina je EPSPS tolerantan na glifosat. U jednom aspektu, pomenuti glifosat se nanosi tokom razvoja u efektivnoj dozi od oko 0.125 funta kiselinskog ekvivalenta po akru do oko 8 funta kiselinskih ekvivalenata po akru. U jednoj izvedbi, pomenuto nanošenje herbicida sprečava barem ispuštanje polena ili ekstruziju prašnika. U jednom aspektu, pomenuti razvoj muškog reproduktivnog tkiva nastupa u fazi izabranoj iz grupe koja obuhvata faze V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, i V14 razvoja biljke kukuruza.
PRIMERI
Primer 1
[0032] Ovaj primer opisuje identifikaciju mts-siRNA i mts-siRNA-elemenata. Bioinformatička analiza podataka sekvenciranja biblioteke višestrukih kukuruznih malih RNA je identifikovala grupu malih RNA (sRNA) koje su bile obogaćene ili specifično eksprimirane u cvastu kukuruza. Relativna zastupljenost ovih mts-siRNA u kukuruznim cvastima se kreće u rasponu od oko 50 do 631 transkripta po četvrt miliona sekvenci, koja predstavlja normalizovanu zastupljenost. Pomenute sRNA se identifikuju kao siRNA zbog njihove dužine (18-26 nukleotida) i njihovog verovatnog porekla od dsRNA prekursora. Zbog njihovog obrasca ekspresije, pomenute siRNA specifične za muško tkivo su označene kao "mts-siRNA". Kao šta se ovde koristi, "obrazac ekspresije" je bilo koji obrazac ekspresije različitih DNA, RNA, ili belančevina. Na primer, obrazac ekspresije specifičan za cvast se odnosi na specifičnu ili obogaćenu ekspresiju neke DNA, RNA, ili belančevine u tkivu cvasta i/ili ćelije. Primeri za odgovarajuće DNA sekvence za mts-siRNA, ovde označene kao "mts-siRNA sekvence", su obezbeđeni kao SEQ ID NO: 1-56 i 105-149.
[0033] Pomenute mts-siRNA sekvence su tada upoređene sa kolekcijom cDNA sekvenca. Sekvencina uporedba mts-siRNA sa unigenom-kolekcijom kukuruza (sastavljene cDNA sekvence) uz pomoć BLAST je dala iznenađujući rezultat koji pokazuje da veliki broj mtssiRNA klasteriše zajedno, a tada su bile preklopljene unutar DNA-regiona koji se nalazi u nekoliko bliskih, ali jedinstvenih cDNA sekvenca. Sve cDNA sekvence su sadržavale takav region, mada pomenuta DNA sekvenca regiona varira zbog različitih kombinacija i lokacija pojedinačnih mts-siRNA sekvenca i/ili 1-3 pogrešno-sparene baze u pojedinačnim mts-siRNA sekvencama. Takav region, definisan kao da poseduje barem jednu mts-siRNA sekvencu unutar nekog nukleotidnog okvira sekvence, ovde se naziva "mts-siRNA-element". U brojnim aspektima, pomenuta nukleotidni okvir sekvence uključuje barem oko 20 kontinuiranih nukleotida (nt) (na primer, barem 18, 19, 20, 21, 22, 23, ili 24 nt), barem oko 25 nt, barem oko
1
30 nt, barem oko 40 nt, barem oko 50 nt, barem oko 100 nt, ili barem oko 150 nt. Primeri takvih DNA sekvenca za mts-siRNA-elemente su ovde obezbeđeni kao SEQ ID NO: 57-94 i 96-104. mts-siRNA-element može da sadrži više od jedne mts-siRNA sekvence, na primer, barem dve, barem tri, barem četiri, barem pet, ili više od pet mts-siRNA sekvenca unutar nekog određenog nukleotidnog okvira sekvence. Dve ili više mts-siRNA sekvence unutar nekog određenog mtssiRNA-elementa mogu da se preklapaju zbog toga šta barem jedan deo njihovih nukleotidnih sekvenca je međusobno identičan (vidi Tabelu 5 za primere mts-siRNA koje imaju preklopljene nukleotidne sekvence).
[0034] Bioinformatička analiza je pokazala da mogu da se generišu višestruke mts-siRNA iz istog RNA-transkripta, na primer neki transkript proizveden iz jedne od cDNA sekvenca opisanih iznad uključujući mts-siRNA-element. Mnoge mts-siRNA takođe sadrže 1-3 pogrešno-sparene baze kada se uporede sa mts-siRNA-elementima iz grupe blisko srodnih cDNA sekvenca. Za to se veruje da pokazuje da su ove mts-siRNA generisane iz multiplih, blisko-srodnih transkripata, koje rezultuje u veliku, blisko-srodnu grupu mts-siRNA. Tako, RNA-transkript proizveden iz cDNA uključujući mts-siRNA-element (koji sadrži multiple mts-siRNA sekvence) će biti komplementaran sa, pa prema tome i sposoban da hibridizuje, više mts-siRNA i/ili njihovih komplemenata. Tako, prirodne mts-siRNA imaju RNA-sekvencu koja je potpuno ili gotovo potpuno komplementarna sa nekom mts-siRNA sekvencom (na primer, kada pomenuta mts-siRNA ima RNA-sekvencu sa ne više od približno 1-3 pogrešnosparene baze u odnosu na mts-siRNA sekvencu); po logici ta ista mts-siRNA ima RNA-sekvencu koja je potpuno ili gotovo potpuno komplementarna sa nekim segmentom mtssiRNA-elementa.
[0035] Potraga za sličnošću sekvenca mts-siRNA u bazi podataka genomske DNA kukuruza uz primenu BLAST je identifikovala multiple lokuse sa signifikantnom sličnosti sa mtssiRNA-elementom. Ovi lokusi su tada bili analizirani kako bi se pronašli otvoreni okviri čitanja (open reading frames, ORF), ali identifikovani pretpostavljeni polipeptidi nisu imali signifikantnu homologiju sa bilo kojom poznatom belančevinom. Bioinformatička analiza mtssiRNA koje proizvode cDNA-sekvence je pokazala da ne postoji signifikantna sekvencina homologija na nivou nukleotida sa bilo kojim poznatim biljnim genom. Ovi podaci sugerišu da su mts-siRNA mogle biti proizvedene iz takvih lokusa uz pomoć procesiranja dsRNA formiranih između transkripata suprotne polarnosti ili uz pomoć procesiranja dsRNA iz aberantnih transkripata zbog aktivnosti RNA-zavisne RNA-polimeraze. Takođe je moguće da
1
su mts-siRNA procesirane iz internih sekundarnih dsRNA-struktura koje mogu da se formiraju u nekim transkriptima koji proizvode mts-siRNA.
[0036] Reverzna-transkripcija ovih mts-siRNA je obezbedila mts-siRNA sekvence koje su bile mapirane na osnovu jednog od mts-siRNA-elemenata (SEQ ID NO: 87). To je predstavljeno na Slici 1 gde x-os predstavlja poziciju nukleotida u 5'-3'-orijentaciji, levo prema desno (gore) i desno prema levo (dole). Relativna zastupljenost mts-siRNA je prikazana kao transkripti po četvrt milion sekvenca (tpq) šta je prikazano na y-osi. Kao šta može da se vidi iz Slike 1, nekoliko mts-siRNA (zaokruženo) su visoko zastupljene u sRNA-biblioteci koja je specifična za cvast (y-os). Predviđene mts-siRNA sekvence su takođe ne-uniformno distribuirane duž mts-siRNA-elementa (x-os).
Primer 2
[0037] Ovaj primer ilustruje analizu endogene ekspresije mts-siRNA u cvastu. Nativni in planta obrasci ekspresije mts-siRNA su bili analizirani primenom nekoliko različitih postupaka. Ove analize potvrđuju da su sRNA koje hibridizuju sa mts-siRNA-elementima obogaćene i/ili specifično eksprimirane u cvastovima duž kukuruzne germplazme (tj., mtssiRNA su obogaćene i/ili specifično eksprimirane u cvastovima), i da je mts-siRNA obogaćena i/ili specifično eksprimirana u polenskom zrnu u fazi uninuklearne mikrospore tokom razvoja polena.
[0038] Kako bi se demonstrirala in planta cvast-specifična akumulacija mts-siRNA, tri reprezentativne mts-siRNA sekvence (SEQ ID NO: 26 (1372590), SEQ ID NO: 8 (648011), SEQ ID NO: 33 (410590)) su korišćene za dizajniranje proba za Northern-blot analizu sRNA male molekularne težine (LMW) pripremljenih iz kukuruza ili pirinača. Za ove eksperimente, totalna RNA je ekstrahovana iz biljnog tkiva primenom TRIzol<®>reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA (7.5 µg) iz svakog primerka je bila denaturisana na 95° C tokom 5 min pre separacije na 17% PAGE-gelu koji sadrži 7 M ureu u 0.5x TBE-puferu (Allen et al. (2004) Nature Genetics 36:1282-1290). Nakon elektroforeze, gel je bio blotiran na membranu Nytran SuPerCharge<®>(Whatman-Schleicher & Schuell, Florham Park, NJ) uz korišćenje Trans-Blot<®>SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) u skladu sa uputama proizvođača. Rezultujući blot je unakrsno-povezan na 1200 μDžula/cm<2>x 100 u Stratalinker<®>1800 (Stratagen, Cedar Creek, TX). Kako bi se pripremile probe, generisana je matrica RNA-probe uz pomoć PCR koja je sadržavala T7-promotor na jednom kraju i jednu od sekvenca
1
male RNA na suprotnom kraju. sRNA sekvence ugrađene u matricu RNA-probe uključuju: [1] Gma-miR159a (miRBaza.org, pristupni broj: MI0001773), koja je korišćena kao kontrola za nabijanje; [2] sR1372590 (SEQ ID NO: 26); [3] sR648011 (SEQ ID NO: 8); i [4] sR410590 (SEQ ID NO: 33). RNA-probe su bile transkribovane uz pomoć T7 RNA-polimeraze, i označene sa digoksigeninom (DIG) uz pomoć kompleta hemikalija DIG Northern starter (Roche, Indianapolis, IN), u skladu sa uputama proizvođača. Hibridizacija je provedena sa 100 ng DIG-označene probe u hibridizacionom puferu PerfectHyb<™>(Sigma, St. Louis, MO) na 38° C tokom 16 h. Detekcija je provedena uz pomoć kompleta hemikalija DIG Northern starter u skladu sa uputama proizvođača, pre izlaganja filmu Kodak<®>Biomax<™>XAR (Sigma, St. Louis, MO). Testirani primerci su sadržavali sve, ili delove sledećeg: kukuruzni list iz biljaka izraslih u uslovima azotnog stresa; kukuruz izdanak, koren ili endosperm iz biljaka u uslovima stresa od hladi; kukuruzni list i koren iz biljaka koje su rasle u uslovima stresa od suše; kukuruznu svilu; kukuruzni mladi cvast; kukuruzni zreli cvast; neoprašena kukuruzna zrna; kukuruzni embrion - 24 dana nakon polinacije (DAP); kukuruzna zrna - 22 DAP; zrela kukuruzna zrna; kukuruzni embrion - zrela (suva) kukuruzna zrna; kukuruzni endosperm - suvi; pirinač u zrnu; i sadnice pirinača. Dobiveni rezultati sa LMW-Northern-analizom uz pomoć barem tri različite mts-siRNA probe (sR1372590, sR648011, i sR410590) pokazuju signal samo u linijama koje odgovaraju mladom cvastu i zrelom cvastu, koje potvrđuje bioinformatičku analizu i zaključak da je ekspresija mts-siRNA visoko obogaćena ili je specifična za tkivo cvasta.
[0039] Tkivna specifičnost i akumulacija sRNA koje bi mogle da prepoznaju mts-siRNA-element je procenjena duž širokog spektra kukuruzne germplazme primenom LMW-Northeranalize. Za ovu analizu, izabran je mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 87, koji sadrži multiple mts-siRNA sekvence). Ovaj mts-siRNA-element sadrži tri mts-siRNA sekvence korišćene u dizajnu siRNA-proba sR1372590, sR648011, i sR410590, koje omogućava ovim probama da mogu da se koriste za LMW-Northern-analizu primeraka kukuruzne germplazme. Za ove eksperimente, RNA je pripremljena iz dvadeset različitih kukuruznih inbrid-linija (ukrštenih u bliskom srodstvu) koje se razlikuju u genetičkim pozadinama, na primer, u odnosu na rangiranje zrelosti od 83 do 120 (Tabela 1). Za tri od pomenutih inbrid-linija (91DUA6, 01DKD2, i LH244), tkivo je sakupljeno iz mladog cvasta, starog cvasta, lista, klasa (klip), i korena. Tabela 1 prikazuje odgovarajuće V-faze i veličine cvasta u kolekciji mladih cvastova i starih cvastova. Totalna RNA je ekstrahovana primenom rastvora TRIzol<®>. LMW RNA je izolovana uz pomoć kompleta hemikalija mirVana™ miRNA (kat. br. AM1560, Ambion, Austin, TX). LMW-Northern-analiza je provedena primenom akrilamidnog gela Bio-Rad
2
Criterion™ Precast sa 15% TBE-ureom (kat. br. 345-0092, BioRad, Hercules, CA). Gel je blotiran na pozitivno-nabijenu membrane (kat. br. 11209272, Roche Applied Systems, Mannheim, Nemačka). Probe su označeno sa (1) 32-P-random priming, ili (2) sa DIG-DNA uz pomoć kompleta hemikalija Roche PCR labeling, ili (3) sa DIG-RNA probom kao šta je opisano iznad. Sve probe korišćene za analizu Northern-blotova su bile reverzni komplement endogenog transkripta ili cDNA-sekvence mts-siRNA-elementa. Prisutnost sRNA koja hibridizuje sa transgenim mts-siRNA-elementom je specifična za cvast; signal nije bio detektovan u listu, klasu, ili korenu za bilo koji od srodno-ukrštenih kukuruznih genotipa 91DUA6, 01DKD2, i LH244 (Slika 2).
[0040] Sa ciljem da se odredi temporalni ekspresioni obrazac sRNA tokom razvoja cvasta koje bi mogle da prepoznaju mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 87), provedena je LMW-Northernanaliza. RNA je pripremljena iz mladog i starog cvasta iz različitih kukuruznih srodnoukrštenih linija, vidi Tabelu 1. Priprema RNA i LMW-Northern tehnike su uglavnom kao šta je opisano iznad.
Tabela 1: Inbrid-germplazma, rangiranje zrelosti, i faza razvoja cvasta
[0041] Kao šta se vidi na Slici 4, DIG-označena RNA-proba koja odgovara reverznom komplementu mts-siRNA-elementa (SEQ ID NO: 87) hibridizuje sa sRNA u mladom i starom cvastu, sa izuzetkom mladog cvasta koji je bio dug 2.5 inča do 3 inča: linije 5 (inbrid-DIDA404), 9 (inbrid-JEDO115), 10 (inbrid-FIDA240), 16 (inbrid-DIDA403), 17 (inbrid-64DJD1), 18 (inbrid-DIQ423), i 20 (inbrid-LH244). Dodatno, ovaj eksperiment nije detektovao sRNA koja hibridizuje sa mts-siRNA-elementom iz primeraka lista (linije 21 i 22) ili klasa (linije 23 i 24) iz inbrida BIQA208 i LH244. Kolektivno ovi podaci pokazuju da su sRNA molekuli koji hibridizuju sa mts-siRNA-elementom specifično eksprimirani u cvastu svakog inbrid-genotipa koji je testiran kada je cvast bio veći od oko 3.5 inča.
[0042] Analiza in situ hibridizacije obavljena sa ciljem ispitivanja specifične ćelijske ekspresije mts-siRNA-sekvence (sR648011, SEQ ID NO: 8). U kukuruznim prašnicima, mikrospore se proizvede putem mejoze pa se razvijaju u zreli polen. Kukuruzna mikrosporegeneza može grubo da se podeli u sledeće faze: mejoza sporogenih ćelija, oslobađanje tetrada kao slobodne mikrospore, mitoza uninuklearnih (sa jednim jezgrom) mikrospora kako bi se proizveo tricelularni polen, i zrela polenska zrna. Za ove eksperimente, korišćen je kukuruzni cvast pre anteze dobiven iz kukuruznih biljaka izraslih u standardnim uslovima u staklenoj bašti. LNA-probe (probe od zatvorene nukleinske kiseline; locked nucleic acid, LNA; Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) su korišćene kao šta je navedeno ispod pri čemu je pozicija LNA označena sa simbol '+'. Antisense-proba je dizajnirana da detektuje mts-siRNA za sR648011 (SEQ ID NO: 8) (5'-biotin-CAT+GCA+CTG+GTG+AGT+CAC+TGT-3'), dok je sense-proba reverzan komplement pomenute antisense-probe (5'-biotin-ACA+GTG+ACT+CAC+CAG+TGC+ATG-3') za primenu kao negativna kontrola. LNA-probe dozvoljavaju ispiranja u visoko-striktnim uslovima zbog čega obezbeđuju visokospecifičnu hibridizaciju (Válóczi et al., 2006; Nuovo et al., 2009). Sve probe su bile označene biotinom. Primerci kukuruznog cvasta su fiksirani u 4% paraformaldehidu u 1×PBS na 4° C tokom 36 h, a tada su dehidrirani na 4° C u serijama graduirane smeše etanol:H2O. Cvastovi su tada ostavljeni u 75% EtOH i 25% Histoclear (National Diagnostics, Atlanta, GA) tokom 1.5 h, 50% EtOH i 50% Histoclear tokom 1.5 h, 25% EtOH i 75% Histoclear tokom 1.5 h, a 100% Histoclear tokom 3x1.5 h, sve na 25° C. Sledeće, Histoclear je postepeno zamenjen sa rastopljenim paraplastom na 50° C, a cvastovi su preneseni u kalupe i uskladišteni na 4° C pre rezanja. Parafin-uklopljeni cvastovi su rezani na mikrotomu u listovima debljine 8 µm. Načinjene su serije sekcija iz istih prašnika, a susedne sekcije su tada korišćene za ispitivanje sa odgovarajućom sense- ili antisense-probom. Prehibridizacija i hibridizacija su provedene na 42° C, a ispiranje na 55° C. Detekcija biotin-označenih LNA-proba slepljenih sa transkriptima je provedena u anti-biotin-alkalnoj fosfatazi (AP) razblaženoj 1 do 400 i BM Purple AP supstratom (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Slike su napravljene kamerom montiranom na mikroskopu Olympus (Center Valley, PA). Sekcije iz istih prašnika su podeljene u dve grupe – jedna je korišćena za antisense-probu (Slika 5, levi panel), a druga za sense-probu (Slika 5, desni panel). Hibridizacijski signal (tamno-ljubičasto) je detektovan samo u sekcijama koje su hibridizovane sa antisense-probom, ali ne i kod onih koji su bili inkubirani sa sense-probom (Slika 5). Snažan signal koji je dobiven sa antisense-probom ukazuje da ova mts-siRNA je izobilno prisutna (visoko-eksprimirana) u polenskom zrnu u uninuklearnoj fazi mikrospora tokom razvoja polena.
Primer 3
[0043] Ovaj primer ilustruje konstrukte za biljnu transformaciju i proizvodnju transgeničnih biljaka. mts-siRNA-element je ugrađen u 3'-UTR ekspresione kasete transgena i korišćen da se proizvedu transgenične kukuruzne biljke sa ciljem testiranja efekta elementa na ekspresiju transgena u transgeničnim biljkama. mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 87) je ugrađen u 3'-UTR ekspresione kasete CP4-EPSPS-transgena koja je korišćena za transformaciju kukuruza. Ovaj mts-siRNA-element je izabran zato jer poseduje veliku zastupljenost mts-siRNA-sekvenca u sebi (Slika 3), uključujući sekvence za tri od siRNA-proba (sR1372590, sR648011 i sR410590) koje su korišćene kod LMW-Northern-analize u Primeru 2. Ovaj mts-siRNA-element takođe dozvoljava testiranje efekta pogrešno-sparenih baza u mts-siRNA. mts-siRNA-
2
element koji je ovde testiran (SEQ ID NO: 87) poseduje jednu nukleotidnu promenu (CΔT: AAGCTATTGATTCCCTAAGTGCCA) ako se uporedi sa jednom od izvornih mts-siRNA-sekvenca (SEQ ID NO: 33, korišćena za dizajn probe sR410590). mts-siRNA-element je ugrađen u kasetu transgena u reverzno-komplementarnoj orijentaciji u odnosu na poziciju u endogenoj cDNA, ali element verovatno funkcioniše slično u obe orijentacije jer se u kukuruznom cvastu mogu pronaći cvast-specifični siRNA-molekuli komplementarni sa oba lanca mts-siRNA-elementa (Slike 1 i 3).
[0044] Konstruirano je nekoliko ekspresionih kaseta CP4-EPSPS/mts-siRNA-element (Tabela 2) koje su korišćene za transformaciju kukuruznih biljaka. Različite kombinacije ekspresionih elemenata su testirane u ekspresionim kasetama CP4-EPSPS/mts-siRNA-element. Ekspresioni elementi poput promotora, vodećih sekvenca, introna, tranzitnih peptida hloroplasta, i 3'-UTR su potrebni efikasnu i stabilnu ekspresiju transgena pri čemu su svi dobro poznati stanju tehnike. Ekspresione kasete CP4-EPSPS/mts-siRNA-element su dizajnirane da sadrže jedan od dva odvojena promotora; operativno spojena na DNA jedne od dve odvojene vodeće sekvence; operativno spojena na DNA jednog od dva introna; operativno spojena na jedan od dva DNA molekula koja kodiraju isti tranzitni peptid hloroplasta (CTP); operativno spojena na DNA molekul izveden iz gena aroA iz Agrobacterium sp. soja CP4 koji kodira CP4-EPSPS-belančevinu; operativno spojena na DNA koja kodira mts-siRNA-element; operativno spojena na jedan od dva 3'-UTR DNA molekula. Konstrukt 4 sadrži CP4-EPSPS-gen divljeg tipa, a svi ostali vektori sadrže verziju CP4-EPSPS-gena sa optimizovanim biljnim kodonom. Konstrukti 3, 5, i 6 (Tabela 2) su dizajnirani za otkrivanje da li će mts-siRNA-element, koji je ugrađen u 3'-UTR, proizvesti biljke sa cvast-specifičnom senzitivnosti na glifosat uz vegetativnu toleranciju na glifosat. Konstrukti 4 i 7 su kontrolni konstrukti, kojima nedostaje mts-siRNA-element.
Tabela 2: Konstrukti za biljnu transformaciju
[0045] Transgenične biljke kukuruza transformirane sa jednom od pet ekspresionih kaseta su proizvedene primenom dobro-poznatih postupaka. Ukratko, kukuruzne ćelije su transformirane primenom Agrobacterium-posredovane transformacije sa jednim od konstrukata navedenih u Tabeli 2 (pojedinačno) nakon čega su regenerisane u intaktne kukuruzne biljke. Pojedinačne biljke su izabrane iz populacije biljka koje su pokazale integritet ekspresije transgene kasete i rezistenciju na glifosat. Ukorenjene biljke sa normalnim fenotipskim karakteristikama su izabrane i presađene u zemlju za rast i dodatnu procenu. R0-biljke su presađene u zemlju za rast, poprskane sa 0.75 lb/akru glifosata u fazama V3-V4, nakon toga i sa 0.75 lb/akra glifosata u fazama V7-V9, a tada su unakrsno-oprašene sa polenom ne-transgeničnih biljaka kukuruza iste germplazme (za konstrukte 3, 5, i 6 događaja) ili su samo-oprašene (za konstrukte 4 i 7 događaja) kako bi proizvele R1-seme. Biljke su tada izabrane kombinovanjem analitičkih tehnika, uključujući TaqMan, PCR-analizu, vegetativnu toleranciju na prskanje sa herbicidom i rejtinga smanjene (željene) muške fertilnosti nakon primene herbicida (glifosat).
Primer 4
[0046] Ovaj primer ilustruje postupke za analizu transgeničnih biljaka u staklenoj bašti. Transgenične biljke transformirane sa ekspresionim kasetama CP4-EPSPS/mts-siRNA-element su analizirane na vegetativnu toleranciju na glifosat i na mušku fertilnost. Pokazano je da su transgenične biljke generisane iz konstrukata koji sadrži ekspresione kasete CP4-EPSPS/mts-siRNA-element su posedovale vegetativnu toleranciju na glifosat i indukovanu muški-sterilnost primenom kasne aplikacije glifosata.
2
[0047] R0-biljke su uzgojene u duplikatima u staklenoj bašti pa su ostavljene ne-poprskane ili su bile poprskane sa 0.75 lb/akru glifosata u (ranoj) V6-fazi, nakon čega sa još 0.75 lb/akru glifosata u (kasnoj) V9-fazi (Slika 7 i Tabela 3). R0-događaji koji su testirani su događaji sa više kopija. Sve R0-biljke koje su ostavljene ne-poprskane pokazale su normalnu ekstruziju prašnika i potpuno fertilan polen kao šta je određeno primenom bojanja po Alexander-u. Sve R0-biljke koje su poprskane su bile vegetativno tolerantne na glifosat. R0-biljke proizvedene iz konstrukata 4 i 7, koji ne sadrže mts-siRNA-element, nisu pokazale cvast-senzitivnost na glifosat ili indukovanu mušku-sterilnost. R0-biljke proizvedene iz konstrukata 3, 5, i 6, koji sadrže mts-siRNA-element, su pokazale cvast-senzitivnost na glifosat i indukovanu muškusterilnost; ove biljke nisu pokazivale, ili je bila beznačajna, ekstruziju prašnika, a >99% polena nije bilo vijabilno kao šta je određeno bojanjem po Alexander-u.
Tabela 3: Podaci prskanja sa glifosatom
[0048] Ovi nalazi pokazuju da prisutnost mts-siRNA-elementa u 3'-UTR transgene kasete dovodi do cvast-specifično utišavanje transgena. Cvast-specifičan gubitak mRNA-transkripta proizvedenog od strane ekspresione kasete CP4-EPSPS/mts-siRNA-element nastupa u cvastovima koji su osetljivi na glifosat, koje dovodi do pojave biljke sa indukovanom muškomsterilnosti, dok druga tkiva biljke ostaju tolerantna na glifosat, koje dovodi do pojave vegetativne tolerancije na glifosat uz dobru žensku fertilnost.
[0049] Imunolokalizacija je tada korišćena da se odredi CP4-EPSPS-belančevina u transgeničnim biljnim tkivima. Cvast je dobiven iz biljaka koje su transformirane sa konstruktom 3 ili konstruktom 4 i iz ne-transgeničnog kukuruza (LH198). Biljke su uzgojene u staklenoj bašti uz 14 h svetla na 80° F i 8 h tame na 70° F. Jedna semenka je posejana po
2
saksiji. Saksije su nasumično aranžirane na podu staklene bašte. Biljke su zalivane po potrebi i gnojene sa smešom azota, kalijuma i fosfora (20-20-20). Biljke iz konstrukta 3 ili konstrukta 4 su poprskane sa glifosatom u koncentraciji 0.75 lb/akru tokom V2-faze kako bi se potvrdila vegetativna tolerancija na glifosat. Mladi cvastovi su sakupljeni tokom faze V10-V11 kako bi se tkiva prašnika skupila iz mikrospore tokom faze majčine ćelije i u slobodnim fazama; zreli cvastovi su sakupljeni u T7-fazi, 1-2 dana pre ispuštanja polena, za tkiva prašnika sa potpuno razvijenim polenom. Prašnici su odstranjeni iz klasa cvasta uz pomoć pincete i odmah fiksirani u 3.7% formaldehidu u slanom rastvoru puferovanom sa fosfatom (PBS) pod blagim vakuumom. Nakon ispiranja u PBS, tkiva su stavljena u medijum za uklapanje i odmah smrznuta. Smrznuti blokovi sa tkivom su uskladišteni na -80° C do rezanja na mikrotomu na -20° C nakon čega su sakupljeni na nabijenim slajdovima.
[0050] Tkivne sekcije su blokirane u agensu za blokiranje (10% normalni kozji serum, 5% kravlji serumski albumin, 0.1% Triton X-100 u PBS) tokom 2 h. Sekcije su inkubirane sa antitelom protiv CP4-EPSPS (1/500 u PBS). Nakon ispiranja sekcija (tri puta u PBS), tkivne sekcije su inkubirane sa sekundarnim antitelom, kozji anti-mišji IgG konjugiran sa Alexafluoroforom 488 (Invitrogen, Eugen, Oregon). Kao negativna kontrola, inkubacija sa antitelom protiv CP4-EPSPS je izbegnuta. Kao pozitivna kontrola, korišćeno je antitelo protiv α-tubulina (Sigma, St. Louis, MO), citoskeletna belančevina eksprimirana u većini tipova ćelija, umesto antitela protiv CP4-EPSPS u odvojenim sekcijama. Primarno i sekundarno antitelo su inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 2-4 h, a tada su dodatno inkubirana preko noći na 4° C. Nakon ispiranja, tkiva su slikana uz pomoć konfokalnog mikroskopa Zeiss Laser Scanning Mikroscope (LSM) 510 META uz korišćenje lasera od 488 nm za eksitaciju i 500-550 nm za emisiju (filterski set). Isti parametar slikanja je upotrebljen za sve primerke uključujući kontrole. Slike fluorescentnih i svetlih polja su skenirane za svaku sekciju pa su spojene primenom LSM-softvera sa ciljem prikazivanja strukturne informacije. Jaki signal je dobiven sa antitelom protiv CP4-EPSPS u filamentoznom tkivu (Slika 6A, kratka strelica) i polenom (Slika 6A, duga strelica) u zrelom cvastu iz biljaka generisanih iz konstrukata 4 (Slika 6A), koji ne sadrže mts-siRNA-element. Biljke na Slici 6A su hemizigoti za transgenu kasetu, pa prema tome samo oko 50% polena je pokazivalo pozitivan CP4-EPSPS-signal. Suprotno, snažan signal je dobiven sa antitelom protiv CP4-EPSPS samo u filamentoznom tkivu (Slika 6B, kratka strelica), a signala nije bilo u polenu (Slika 6B, doga strelica) u zrelom cvastu iz biljaka koje su bile generisane sa konstruktom 3 koji sadrži mts-siRNA-element (Slika 6B). Antitelo u pozitivnoj kontroli (anti-alfa-tubulin) je pokazalo signal u polenu unutar zrelog
2
cvasta iz biljaka generisanih iz konstrukta 4 ili konstrukta 3. Podaci za negativne kontrole očekivano nisu pokazali signal. Podaci za konvencionalnu ne-transgeničnu kontrolu očekivano ne pokazuju signal za bojanje sa antitelom protiv CP4-EPSPS i pozitivni signal kod bojanja sa antitelom protiv alfa-tubulina. Ovi podaci pokazuju da se niti jedan, ili ima vrlo malo, transkripata transformacione kasete koja sadrži mts-siRNA-element translatira u polenu, ali da je transkript bio translatiran u vegetativnom filamentoznom tkivu. Nestanak ekspresije CP4-EPSPS-belančevine u polenu koreliše sa primećenom cvast-specifičnom osetljivosti na glifosat u biljkama generisanih iz konstrukta 3.
Primer 5
[0051] Ovaj primer ilustruje terensko testiranje transgeničnih biljaka kako bi se pratila muška fertilnost ili sterilnost. Trinaest potvrđenih događaja R1-R3 u jednoj kopiji u transgeničnim biljkama generisanih transformacijom sa ekspresionom kasetom (konstrukt 3) CP4-EPSPS/mts-siRNA-element su testirani terenski (na polju) sa ciljem utvrđivanja efikasnosti ekspresione kasete. Tokom prve godine, trinaest događaja je testirano u jednoj terenskoj lokaciji. Tokom druge godine, osam događaja je testirano na četiri terenske lokacije. Tokom treće godine, četiri događaja su testirana na četiri terenske lokacije. Tokom pomenute tri godine terenskih testiranja, prosečno rangiranje muške fertilnosti (average male fertility rating, MFR) za događaje generisane iz konstrukta 3 je bilo blizu ili ispod MFR 2, šta se smatra industrijskim standardom za mušku sterilnost.
[0052] Podaci za efikasnost jedne godine terenskih istraživanja su prikazani na Slici 8, uz prosečni MFR dobiven kroz tri različita režima prskanja sa glifosatom šta je u grafikonu (Slika 8A) predstavljeno za NK603 (CP4-EPSPS, transgenični kukuruz), MON87427 (CP4-EPSPS, transgenični kukuruz sa glifosat-inducibilnom muškom-sterilnosti), i dva događaja iz konstrukta 3. Fotografije cvasta iz biljaka uzgojenih tokom ovog naročitog terenskog istraživanja efikasnosti ilustruju fertilan cvast kada su biljke bile poprskane sa glifosatom u koncentraciji 0.75 lb/akru samo u V3-fazi (Slika 8B); i sterilan cvast (bez ili uz minimalnu ekstruziju prašnika) u biljkama koje su bile poprskane sa glifosatom u koncentraciji od 0.75 lb/akru u V3-fazi, nakon toga sa 0.75 lb/akru u V8-fazi, a nakon toga i sa 0.75 lb/akru u V10-fazi (Slika 8C). Za ovo terensko istraživanje, režimi prskanja su bili: tretman 1 koji podrazumeva primenu 0.75 lb/akru glifosata u V3-fazi (korov, kontrola); tretman 2 koji podrazumeva primenu 0.75 lb/akru glifosata u V3-fazi (korov, kontrola), nakon toga 0.75 lb/akru u V8-fati, a nakon toga 0.75 lb/akru u V10-fazi; tretman 3 podrazumeva primenu 0.75
2
lb/akru glifosata u V3-fazi (korov, kontrola), nakon toga 1.25 lb/akru u V8-fazi, a nakon toga 1.25 lb/akru u V10-fazi. Pomenuta dva kasna prskanja (tj., V8-faza i V10-faza) se nazivanju prskanja za sterilnost. Ovi rezultati ukazuju da kada je primenjen tretman 1 (samo korovkontrola; prskanje sa glifosatom), sve biljke (NK603, MON87427, i događaji sa konstruktom 3 događaja) su bile muški-fertilne. Kod tretmana 2 (prskanje sa glifosatom za sterilnost), NK603-biljke su imale MFR=5, MON87427 su bile sterilne uz MFR=2, a događaji 2 i 3 iz konstrukta 3 su bili delomično muški-fertilne uz MFR<3. Kod tretmana 3 (prskanje sa glifosatom za sterilnost), NK603-biljke su imale MFR=5, MON87427 su bile muški-sterilne uz MFR<2, a događaji 2 i 3 iz konstrukta 3 su bili muški-sterilni uz MFR koji je blizu ili ispod vrednosti 2.
[0053] Mada je prosečni MFR blizu vrednosti 2, ekstruzija prašnika je primećena kod događaja iz konstrukta 3 (S90+3 i S90+6) tretiranih sa glifosatom (Slika 9). Za ove podatke, četiri odvojena događaja iz konstrukta 3 su upoređena sa biljkama MON87427 i NK603 uzimajući u obzir dva režima prskanja sa glifosatom: tretman 2 koji podrazumeva primenu 1.5 lb/akru glifosata u V2/V3-fazi (korov, kontrola), nakon toga 0.75 lb/akru glifosata kod 875 jedinica za stepen rasta (growing degree units, GDU) (∼V8-faza), a nakon toga 0.75 lb/akru glifosata kod 1025 GDU (∼V10-faza) i tretman 3 koji podrazumeva primenu 1.5 lb/akru glifosata u V2/V3-fazi (korov, kontrola), nakon toga 1.25 lb/akru glifosata kod 875 GDU (∼V8-faza), nakon toga 1.25 lb/akru glifosata kod 1025 GDU (∼V10-faza). Broj biljka po parceli (68-74 biljka/parceli) koje su pokazivale ekstruziju prašnika je ocenjen tokom S90, S90+3 i S90+6, pri čemu S90 je dan kada 90% biljka u polju ima svilu; S90+3 je 3 dana nakon S90; a S90+6 je 6 dana nakon S90. Kao šta se vidi na Slici 9, tokom S90 je bilo 70(±15) NK603-biljka po parceli koje su pokazivale ekstruziju prašnika za oba režima tretmana sa glifosatom. Suprotno, kod ON87427 i četiri događaja iz konstrukta 3 je bilo 1(±12) biljaka po parceli koje su pokazivale ekstruziju prašnika tokom S90 za oba režima tretmana sa glifosatom. Tokom S90+3 i S90+6 je bilo 30(±12) do 70(±12) biljaka po parceli kod pomenuta četiri događaja iz konstrukta 3 koje su pokazivale ekstruziju prašnika sa bilo kojim režimom za tretman sa glifosatom, koje je blizu onome što je viđeno kod NK603. Pomenuta ekstruzija prašnika kod MON87427-događaja se zadržala na nivou S90 kod obe vremenske tačke, S90+3 i S90+6, i za svaki režim za tretman sa glifosatom. Bilo koja biljka sa ≥1 ekstrudiranim prašnicima je uračunata kao pozitivna za ekstruziju prašnika. Ovaj kasni proces ekstruzije prašnika, tj. S90+3 i S90+6, se javlja u periodu razvoja kukuruza u kojem nastupa maksimalni rast visine cvasta pa ima dovoljno
2
razmaka da je moguće mašinsko rezanje cvasta uz minimalnu povredu gornja dva lista kukuruzne biljke, koje znači minimalan uticaj na inbrid-prinos. Takođe, ekstruzija prašnika u S90+3 ili kasnije se smatra da ima mali uticaj na čistoću semena.
[0054] Analiza vijabilnosti polena je provedena sa ciljem da se odredi da li je niski nivo, ali konzistentan nivo procesa ekstruzije prašnika primećen u periodu S90+3 do S90+6, indikacija za potencijalno kasno izražene muške fertilnosti. Slike 10A i 10B ilustruju primer kasne ekstruzije prašnika u cvastu iz događaja iz konstrukta 3 poprskanog za sterilnost. Kutija na Slici 10A je deo koji je povećan na Slici 10B. Primer za kasnu ekstruziju prašnika je zaokružen na Slici 10B. Za određivanje vijabilnosti polena, polen je sakupljen iz kasno ekstrudiranih prašnika i obojen po Alexander-u, Slika 10C. Polen je istog dan takođe sakupljen iz nepoprskanih događaja iz konstrukta 3 pa je obojen po Alexander-u kao uporedba, Slika 10D. Rezultat ovakvog bojanja po Alexander-u pokazuje samo ne-vijabilan polen (prozirno svetloplavo, nepravilna forma polenskih zrna) iz kasno otvaranje prašnika kod poprskanih događaja iz konstrukta 3 (Slika 10C). Potpuno vijabilan polen je neproziran, tamno-ljubičast i sferičan bojanjem po Alexander-u (Slika 10D). Osim bojanja polena sakupljenog iz pojedinačnoizolovanih kasno ekstrudiranih prašnika, vreće za polinaciju su stavljene na neke poprskane događaje iz konstrukta 3 sa ciljem da se odredi ispuštanje polena. Nije primećeno ispuštanje polen u pomenutim vrećama za polinaciju, šta je sprečilo nastanak dobiveno semena kod unakrsne polinacije recipijentnih klasova. Ovaj rezultat sugeriše da nema ispuštanja polena iz kasno ekstrudiranih prašnika ili da polen koji je ispušten nije bio vijabilan.
[0055] Kolektivno, ovi podaci pokazuju da mada postoji nizak nivo ekstruzije prašnika u događajima iz konstrukta 3, koji su bili poprskani za sterilnost, primećeni ekstrudirani prašnici nisu ispuštali vijabilan polen.
Primer 6
[0056] Ovaj primer ilustruje terensko testiranje prinosa transgeničnih biljaka. R2-biljke iz konstrukta 3 su testirane na inbrid-prinos i hibrid-prinos. Kod inbrid-prinosa, R2-biljke iz konstrukta 3 su testirane u četiri terenske lokacije za prinos, vegetativnu toleranciju na prskanje sa glifosatom, i mušku-sterilnost indukovanu prskanjem sa glifosatom. Za ova terenska istraživanja, četiri događaja iz konstrukta 3 su posađena u parcele od 68-74 biljka/parceli. Tretmani prskanja su sledeći: tretman 1 podrazumeva primenu 1.5 lb/akru glifosata u V3-fazi (korov, kontrola); tretman 2 podrazumeva primenu 1.5 lb/akru glifosata u V3-fazi, nakon toga 0.75 lb/akru u V8-fazi, a nakon toga 0.75 lb/akru u V11-fazi; tretman 3 podrazumeva primenu 1.5 lb/akru glifosata u V3-fazi, nakon toga 1.25 lb/akru u V8-fazi, a nakon toga 1.25 lb/akru u V11-fazi. Kao šta može da se vidi na Slici 11, pomenuti događaji iz konstrukta 3 u sva tri režima tretmana sa glifosatom su pokazala dobru vegetativnu toleranciju (beli stupci), kao šta je izmereno uz pomoć visine biljaka, i dobar inbrid-prinos (crni stupci) izmereno kao bušeli (Bu)/akru. Ovi isti događaji su potpuno muški-fertilni kada su tretirani samo sa tretmanom 1 (korov, kontrola; glifosat), ali su bili muški-sterilni uz MFR vrednost koja je jednaka ili manja od 2 (sivi stupci) kada su tretirani sa tretmanom 2 ili 3 (glifosat). Horizontalni stupac na Slici 11 pokazuje industrijski standard za sterilnost, MFR 2. NK603 je namenjen za uporedbu. Merenja prinosa inbrid-zrna za događaje konstrukta 3 i NK603 kod prskanja sa glifosatom su prikazani u Tabeli 4, gde MST=% vlage zrna, TWT=testirana težina (rangiranje gustine, density rating, tipično funte po bušelu), a S50D je broj dana do pojave svile u 50% klasova na parceli. Nije postojala značajna razlika (nd) u prinosu bilo kojeg od četiri događaja iz konstrukta 3 testiranih sa glifosat-tretmanom 2 ili 3 ako se uporedi sa NK603-kontrolom.
Tabela 4: Merenja prinosa inbrid-zrna
[0057] Kod prinosa u zrnu F1-hibrida, R3-događaji iz konstrukta 3 su testirani na četiri terenske lokacije. Za ova terenska istraživanja hibridnog prinosa, ne-transgenični ženski inbrid (Null), linija MON87427, i tri događaja iz konstrukta 3, svi u istoj genetičkoj pozadini, su unakrsno oprašeni sa muškim MON810/MON88017-testerom sa ciljem dobijanja semena F1-hibrida. Pomenuto seme F1-hibrida generisano iz svakog ukrštavanja je posađeno u standardne parcele od 68-74 biljaka/parceli. Tretmani prskanja obuhvataju tretman 1 bez prskanja glifosatom; tretman 2 uz 2.25 lb/akru glifosata u V4-fazi, a nakon toga 2.25 lb/akru u V7-fazi; tretman 3 uz 2.25 lb/akru glifosata u V4-fazi, nakon toga uz 2.25 lb/akru u V7-fazi, a nakon toga uz 2.25 lb/akru u V10-fazi. Pomenute F1-biljke su ponovo oprašene sa ciljem da se dobije F2-zrno, čiji
1
je prinos izmeren u bušelima/akru (Bu/akr). Sva tri događaja iz konstrukta 3 su pokazala ekvivalentan prinos F1-hibridnog zrna u svim glifosat-tretmanima ako se upoređeni sa kontrolnim ukrštanjima NullxMON810/MON88017 i MON87427xMON810/MON88017 (Slika 12).
Primer 7
[0058] Ovaj primer ilustruje obnavljanje muške fertilnosti u F1-hibridnim biljkama. F1-hibridne biljke generisane iz unakrsnog ukrštanja događaja iz konstrukta 3 pri čemu je ženski roditelj bio testiran na mušku fertilnost. Tri različita F1-hibridna ukrštanja su provedena: netransgenični ženski x MON88017 muški roditelj; MON87427 ženski x MON88017 muški roditelj; i događaj iz konstrukta 3 ženski roditelj x MON88017 muški roditelj. F1-hibridno seme je sakupljeno iz svaka od tri unakrsna ukrštanja, posađeno u zemlju (polje), i poprskano sa glifosatom u koncentraciji 1.125 lb/akru u V4-fazi, nakon toga sa 1.125 lb/akru u V10-fazi. Muška fertilnost u F1 je procenjena primenom rangiranja muške fertilnosti (male fertility rating, MFR) i bojanjem po Alexander-u sa ciljem procene vijabilnosti. Za svako ukrštanje, MFR F1-hibridnih biljaka je iznosio 5 tj. potpuno fertilne biljke. Bojanje po Alexander-u radi određivanja vijabilnosti je pokazalo da je 50% polena proizvedeno u F1-hibridu iz svakog ukrštanja bilo vijabilno, kao šta je očekivano (Slika 13). Ovi podaci pokazuju da muška fertilnost može da se funkcionalno obnovi u F1-hibridnim biljkama proizvedenih iz transgeničnih biljaka sa glifosat-inducibilnom muškom-sterilnosti koje su bile transformirane sa ekspresionom kasetom CP4-EPSPS/mts-siRNA-element.
Primer 8
[0059] Ovaj primer ilustruje varijantu i konstrukciju himernog mts-siRNA-elementa. Pojedinačni mts-siRNA su mapirani u mts-siRNA-elementu kao šta je predstavljeno na Slici 3; x-os pokazuje nukleotidnu poziciju od 5'- prema 3'-orijentaciji sa leva na desno (gore) i sa desno na levo (dole), a y-os pokazuje relativnu zastupljenost mts-siRNA koje je navedeno kao transkripti po četvrt-miliona sekvenci (tpq). mts-siRNA su takođe ne-uniformno distribuirane duž pomenutog mts-siRNA-elementa (x-os).
[0060] Koristeći ovu informaciju, proizvedene su varijante mts-siRNA-elementa i/ili himere uz pomoć jednog ili više mts-siRNA-elementa koji su preuređeni da sadrže više (ili manje) totalnih mts-siRNA-sekvenci (opciono ili alternativno, jedna ili više mts-siRNA-sekvenci je dodano ili izrezano), koje rezultuje većim (ili manjim) utišavanjem operativno spojene
2
sekvence koja kodira neku belančevinu. Takve varijante ili himerni mts-siRNA-elementi su korisni kod povećanja ili smanjivanja selektivne supresije ekspresije rekombinantne belančevine u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke.
[0061] Primeri za varijante i himere mts-siRNA-elemenata su konstruirani primenom fragmenata SEQ ID NO: 87. Prva varijanta (SEQ ID NO: 88) je konstruirana primenom fragmenta od 104 nukleotida sa 5'-kraja SEQ ID NO: 87. Druga varijanta (SEQ ID NO: 89) je konstruirana primenom fragmenta od 80 nukleotida sa 3'-polovine SEQ ID NO: 87. Himerni mts-siRNA-elementi su konstruirani spajanjem jednog fragmenta (SEQ ID NO: 88) na drugi fragment (SEQ ID NO: 89) sa ciljem formiranja novih himernih mts-siRNA-elemenata (SEQ ID NO: 90 i SEQ ID NO: 91). Dodatni himerni mts-siRNA-elementi su konstruirani spajanjem tri pojedinačne mts-siRNA koji se nalaze unutar SEQ ID NO: 87: prva himera (SEQ ID NO: 92) je konstruirana spajanjem mts-siRNA-sekvenca SEQ ID NO: 26, 27, i 8; druga himera (SEQ ID NO: 93) je konstruirana spajanjem mts-siRNA sekvenca SEQ ID NO: 10, 33, i 5; a treća himera (SEQ ID NO: 94) je konstruirana spajanjem mts-siRNA sekvenca SEQ ID NO: 26, 10, i 33. Ove varijante i himere mogu da budu operativno spojene na sekvencu koja kodira neku belančevinu sa ciljem proizvodnje rekombinantnih DNA-konstrukata (vidi Sliku 14) koji mogu da budu testirani u biljkama i biljnim ćelijama sa ciljem provere selektivne supresije rekombinante belančevine kodirane sa sekvencom koja kodira neku belančevinu u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke.
Primer 9
[0062] Ovaj primer ilustruje dizajniranje varijanata i himera mts-siRNA-elemenata. Varijante i himere mts-siRNA-elemenata su dizajnirane na bazi mts-siRNA-elementa dužine 300-nukleotida (nt) sa sekvencom SEQ ID NO: 81, koji je sličan sa mts-siRNA-elementima dužine 300-nukleotida sa sekvencama SEQ ID NO: 82 i 87. Visoko-konzervisana konsenzus-sekvenca za mts-siRNA-elemente sa sekvencama SEQ ID NO: 81, 82, i 87 je obezbeđena u sekvenci SEQ ID NO: 96. Pojedinačno, svaki od njih je takođe koristan kao mts-siRNA-element ili kao baza za dizajniranje varijanata ili himernih mts-siRNA-elemenata, na primer, uz pomoć izbora fragmenata mts-siRNA-elementa identifikovanih iz genomskih sekvenca ili cDNA, poput fragmenata koji sadrže barem jednu mts-siRNA-sekvencu, i kombinovanjem i spajanjem takvih fragmenata.
[0063] Izabrana su dva fragmenta unutar sekvence SEQ ID NO: 81; fragment A (SEQ ID NO: 97) koji sadrži 104 kontinuirana nukleotida sa 5'-regiona (pozicije 1-104) iz SEQ ID NO: 81 i fragment B (SEQ ID NO: 98) koji sadrži 80 kontinuiranih nukleotida sa 3'-regiona (pozicije 215-294) iz SEQ ID NO: 81; jasno je da su oba fragmenta, A (SEQ ID NO: 97) ili B (SEQ ID NO: 98), pojedinačni mts-siRNA-elementi koji sadrže barem jednu mts-siRNA-sekvencu. Lokacija fragmenata A i B (označena potcrtanim tekstom) je prikazana u sledećoj punoj sekvenci SEQ ID NO: 81, gde su takođe označene lokacije mts-siRNA-sekvenca (označenih sa tekstom u kurzivu; segmenti u kurzivu koji su veći od 18 kontinuiranih nukleotida mogu da sadrže više od jedne preklapajuće mts-siRNA-sekvence) za koje se zna da pripadaju ovom mtssiRNA-elementu:
GGACAACAAGCACCTTCTTGCCTTGCAAGGCCTCCCTTCCCTATGGTAGCCACTTGAG TGGATGACTTCACCTTAAAGCTATCGATTCCCTAAGTGCCAGACATAATAGGCTATA CATTCTCTCTGGTGGCAACAATGAGTCATTTTGGTTGGTGTGGTAGTCTATTATTG AGTTTGTTTTGGCACCGTACTCCCATGGAGAGTACAAGACAAACTCTTCACCGTTG TAGTCGTTGATGGTATTGGTGGTGACGACATCCTTGGTGTGCATGCACTGGTGAGTCA CTGTTGTACTCGGCG (SEQ ID NO: 81). Varijante mts-siRNA-elemenata su dizajnirane primenom "A" i "B" fragmenata, uključujući "A+B" mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 99) i "B+A" mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 100). Himerni element (SEQ ID NO: 101) je dizajniran tako da sadrži mts-siRNA-sekvence (prikazane sa tekstom u kurzivu u SEQ ID NO: 81) za koje se zna da se nalaze u mts-siRNA-elementu (SEQ ID NO: 81).
[0064] Slično, mts-siRNA-element dugačak 251-nt (SEQ ID NO: 102) i mts-siRNA-element dugačak 121-nt (SEQ ID NO: 103, fragment SEQ ID NO: 102, tj., kontinuirani segment lociran na nukleotidnim pozicijama 47-167 u SEQ ID NO: 102) su identifikovani iz kukuruzne genomske sekvence (Zm_B73_CR10::Segment{75361491..75361742}) kao cvast-specifični i kao oni koji odgovaraju mts-siRNA iz mladog cvasta (kukuruz LH244, biblioteka 347; pojedinačno identifikovani mts-siRNA u nekim slučajevima se preklapaju preko velikog dela njihove sekvence i variraju samo za nekoliko nukleotida; vidi Tabelu 5). Na bazi SEQ ID NO: 102 i 103 je dizajniran himerni mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 104).
4
03 :1 N ID
SE u aniir ap
A
Ni -sts
5: ael ab T
Primer 10
[0065] Ovaj primer ilustruje vektore i transgenične biljne ćelije, tkiva, i biljke koje sadrže rekombinantne DNA-konstrukte uključujući sekvencu koja kodira neku rekombinantnu belančevinu i mts-siRNA-element operativno spojen na pomenutu sekvenca koja kodira neku belančevinu.
[0066] Biljni transformacioni vektor koji sadrži rekombinantni DNA-konstrukt je korišćen za Agrobacterium-posredovanu transformaciju kukuruznih ćelija. Ovaj transformacioni vektor sadrži DNA za Agrobacterium-posredovani transfer T-DNA, kasetu za ekspresiju (promotoroperativno spojen na DNA-sekvencu od interesa), kasetu za ekspresiju selektivnog markera (za prikladnu selekciju transformiranih kukuruznih ćelija ili biljka), i DNA za održavanje vektora u E. coli (na primer, sekvenca za početak replikacije u E. coli). Ovaj transformacioni vektor sadrži kasetu za ekspresiju koja obuhvata rekombinantni DNA-konstrukt koji je okružen sa desnim i levim graničnim sekvencama iz Agrobacterium, pri čemu pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt uključuje transgen CR-AGRtu.aroA-CP4.nat za toleranciju na herbicid (obezbeđen kao SEQ ID NO: 95) kao DNA-sekvenca koja kodira neku rekombinantnu belančevinu. Pomenuti transgen CR-AGRtu.aroA-CP4.nat za toleranciju na herbicid je operativno spojen na mt-siRNA koja je obezbeđena sa SEQ ID NO: 81 kao DNA-sekvenca koja kodira neki mts-siRNA-element.
[0067] Transformacioni vektori za ekspresiju različitih rekombinantnih DNA-konstrukata su konstruirani uz pomoć ugrađivanja nekog polinukleotida, koji sadrži mts-siRNA-element (na primer, SEQ ID NO: 57-94 ili 97-104), u pomenuti biljni transformacioni vektor. Pomenuti mts-siRNA-element je ugrađen susedno od DNA-sekvence koja kodira neku rekombinantnu belančevinu ili unutar 3'-netranslatiranog regiona DNA-sekvence koja kodira neku rekombinantnu belančevinu. Takvi biljni transformacioni vektori su korisni za pripremu transgeničnih biljaka u kojima može da se indukuje muška-sterilnost aplikacijom herbicida.
[0068] Postupci za transformaciju biljaka su dobro poznati stanju tehnike. Na primer, kukuruzne biljke neke transformabilne linije su uzgojene u staklenoj bašti, a klasovi su sakupljeni kada su embrioni bili dugi 1.5 do 2.0 mm. Površina klasova je sterilizirana sa 80% etanolom, a nakon toga uz pomoć sušenja na vazduhu. Nezreli embrioni su izolovani iz pojedinačnih kukuruznih zrna iz steriliziranih klasova. Pre inokulacije kukuruznih ćelija, pojedinačne kulture Agrobacterium, od kojih svaka sadrži transformacioni vektor za eksprimiranje barem jednog rekombinantog DNA-konstrukta, su uzgojene preko noći na sobnoj temperaturi. Ćelijske kulture iz nezrelih kukuruznih embriona su inokulirane sa Agrobacterium, inkubirane na sobnoj temperaturi uz prisutnost Agrobacterium tokom 5 do 20 min, ko-kultivirane sa Agrobacterium tokom 1 do 3 dana na 23° C u tami, presađene na medijum za selekciju i kultivirane tokom približno 2 sedmice kako bi se omogućilo razvoj embriogenog kalusa. Embriogeni kalus je presađen u medijum za uzgoj koji sadrži 100 mg/L paromomicina i sup-kultiviran u intervalima od oko dve sedmice. Obnovljeno je više transformiranih biljnih ćelija tokom 6 do 8 sedmica nakon inicijacije selekcije.
[0069] Transgenične kukuruzne biljke su regenerisane iz transgeničnih biljnih ćelija kalusa iz svakog od više transgeničnih događaja koji rezultuju nakon transformacije i selekcije, tako da je transgenični kalus svakog događaja stavljen u medijum koji potiče razvoj izdanka i korena u sadnicama koje su tada presađene u zemlji u saksiji za poticanje inicijalnog rasta u komori za rast na 26° C, a nakon toga sledi rast u vlažnoj polici pre njihovog transplantiranja u saksije gde su biljke uzgojene do zrelosti. Regenerisane biljke su samo-fertilizovane. Seme prve generacije ("R1") je sakupljeno. Biljke uzgojene iz R1-semena ("R2" biljke) su korišćene za proizvodnju potomaka.
Primer 11
[0070] Ovaj primer ilustruje postupke za selektiranje mts-siRNA sekvenca i mts-siRNA-elemenata za primenu u rekombinantnim DNA-konstruktima koji sadrže sekvencu koja kodira neku rekombinantnu belančevinu i mts-siRNA-element operativno spojen na pomenutu sekvencu koja kodira neku belančevinu.
[0071] Jedan postupak za verificiranje efikasnosti mts-siRNA-elementa za selektivno suprimiranje ekspresije neke rekombinantne belančevine u muškom reproduktivnom tkivu u nekoj transgeničnoj biljki podrazumeva primenu protoplast-testa gde se protoplasti biljne ćelije ko-transformiraju sa: (a) vektorom koji sadrži rekombinantni DNA-konstrukt uključujući sekvencu koja kodira neku belančevinu i mts-siRNA-element operativno spojen na pomenutu sekvencu koja kodira neku belančevinu; i (b) RNA(ili više njih) koje sadrže sekvencu siRNA(ili više njih) koje odgovaraju mts-siRNA-elementu(ima) (ili alternativno, mts-siRNA sekvencu(e)), pri čemu je očekivano da nivo ekspresije rekombinantne belančevine bude obrnuto proporcionalan stepenu kojim je mts-siRNA-element pocepan sa RNA(ili više njih).
[0072] Pomenuto je ilustrovano sa sledećim primerom. Pomenuti test je primenjen na dve mtssiRNA-sekvence (koje odgovaraju dve siRNA za koje se zna da su visoko-eksprimirane u kukuruznom cvastu). Ukratko, protoplasti iz kukuruznog lista su ko-transformirani sa: (a) plazmidom (3 μg/320000 ćelija) koji sadrži rekombinantni DNA-konstrukt koji obuhvata sekvencu koja kodira neku rekombinantnu belančevinu (CP4-EPSPS, SEQ ID NO: 95) i neki mts-siRNA-element (SEQ ID NO: 81), i (b) prvom dsRNA u kojoj prvi lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO: 150 u 5'-3'-smeru, a drugi lanac je komplementaran prvom, i sa drugom dsRNA u kojoj prvi lanac ima sekvencu SEQ ID NO: 151 u 5'-3'-smeru, a drugi lanac je komplementaran prvom. Pomenute dsRNA (od Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Ajova) su testirane u količini od 0, 5, 25, ili 50 ng/320000 ćelija, pri čemu je totalna RNA koja je korišćena u svakom testu za ko-transformaciju podešena do 50 ng/320,000 ćelija uz pomoć "filler" (punilo) RNA koja se sastoji od miRNA395 (kao zreo 21-mer, obezbeđen kao dsRNA) ili kvašćeve tRNA. Nivo CP4-EPSPS-belančevine je određen primenom ELISA pa je korišćen da se evaluira sposobnost testiranih dsRNA da suprimiraju ekspresiju pomenute rekombinantne belančevine. Rezultati su prikazani u Tabeli 6.
Tabela 6: Nivo CP4-EPSPS-belančevine
[0073] Svaka dsRNA (SEQ ID NO: 150 i 151) snažno suprimira ekspresiju CP4-EPSPS-belanlevine (označeno kao smanjena akumulacija CP4-EPSPS-belančevine) kada su ko-
4
transformirane sa plazmidom koji sadrži rekombinantni DNA-konstrukt koji obuhvata sekvencu koja kodira CP4-EPSPS-belančevinu i mts-siRNA-element. Primećena supresija CP4-EPSPS-belančevine je dozno-zavisna o količini dsRNA, a ne zavisi o tipu filler-RNA. Supresija CP4-EPSPS-belančevine nije primećena u kontrolnim primercima kotransformiranih sa filler-RNA umesto sa testiranim dsRNA.
Primer 12
[0074] Ovaj primer ilustruje rekombinantne DNA-konstrukte, vektore, i transformirane biljke. Vektori i postupci za transformaciju slični onima opisanima u Primeru 10 se koriste za proizvodnju stabilno-transformiranih kukuruznih biljaka koje u svojem genomu sadrže rekombinantni DNA-konstrukt koji obuhvata sekvencu koja kodira neku belančevinu koja je operativno spojena na DNA-sekvencu koja obuhvata mts-siRNA-element. Testirano je šest dizajniranih kombinacija konstrukt/mts-siRNA-element (vidi Tabelu 7). Biljke su poprskane dva puta (tokom V5- i V8-faze) sa 0.75 lb a.e./A Roundup WeatherMAX<®>. Rezultati su prikazani u Tabeli 7. Za svaku dizajniranu kombinaciju konstrukt/mts-siRNA-element oko 20 biljaka je ostavljeno ne-poprskano radi uporedbe sa biljkama koje su bile poprskane sa glifosatom. Ne-poprskane biljke su sve ispuštale polen i posedovale dobru mušku-fertilnost (podaci nisu prikazani). Kukuruzne biljke transformirane sa dizajniranim konstruktom B su pokazale snažnije izraženu mušku-sterilnost u odnosu na kukuruzne biljke transformirane sa dizajniranim konstruktom A. Dizajnirani konstrukti (5'-3', levo prema desno) su Konstrukt A: promotor A/intron A/tranzitni peptid A/CP4-EPSPS (SEQ ID NO: 95)/mts-siRNA-element/3'-UTR i Konstrukt B: promotor B/intron B/tranzitni peptid B/CP4-EPSPS/mts-siRNA-element/3'-UTR. Kao šta se koristi ispod, "n.m." znači nije izmereno (not measured). Skala rangiranja muške fertilnosti (MFR) je sledeća: 5 = pojava prašnika je normalna, volumen polena je isti kao i kod ne-poprskanih parcela, no može, ali ne mora da dolazi od ispuštanja polena; 4 = pojava prašnika 50% od normalnog, no ispuštanje blago ili nema ispuštanja normalne količine polena; 3 = cvast izgleda normalno, ali postoji sporadična ekstruzija prašnika (>10 prašnika po cvastu) i malo ili nimalo ispuštenog polena; 2.5 = nema ispuštanja polena, anteza je značajno redukovana (<10 prašnika po cvastu) ili nastupa veoma kasno (1 sedmica) u odnosu na kraj svilanja kukuruza; 2 = nema ispuštanja polena, nema anteze ili anteza nastupa veoma kasno (1 sedmica) u odnosu na kraj svilanja; i 1 = nema ispuštanja polena, cvast ima abnormalan stick-fenotip ili anteza kasni dve ili više sedmica nakon svilanja. S90 označava da 90% biljka ima svilu spremnu za polinaciju, a S90+3 znači 3 dana nakon S90.
Tabela 7: podaci prskanja za kombinacije dizajnirani konstrukt/mts-siRNA-element
4
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni DNA-konstrukt, naznačen time, što obuhvata sekvencu koja kodira neku belančevinu koja je operativno spojena na DNA-sekvencu koja obuhvata siRNA-element koji je specifičan za muško tkivo (mts-siRNA), pri čemu pomenuti mts-siRNA-element je heterologan u odnosu na pomenutu sekvenca koja kodira neku belančevinu, i pri čemu:
a. pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem jednu mts-siRNA-sekvencu izabranu iz SEQ ID NO:1-56 i 105-149; ili
b. pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104; ili c. pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104, gde su ugrađene 1-3 pogrešno-sparene baze; ili
d. pomenuti mts-siRNA-element obuhvata barem 20 kontinuiranih nukleotida iz mts-siRNA-elementa izabranog iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104;
pri čemu je ekspresija belančevine kodirane sa pomenutom sekvencom koja kodira neku belančevinu suprimirana u muškim reproduktivnim tkivima neke transgenične biljke koja eksprimira pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt.
2. Rekombinantni DNA-konstrukt iz zahteva 1, naznačen time, što pomenuta sekvenca koja kodira neku belančevinu kodira EPSPS-belančevinu tolerantnu na glifosat.
3. Postupak za pripremu rekombinantog DNA-konstrukta, naznačen time, što podrazumeva identifikovanje mts-siRNA-elementa koji sadrži barem jednu mtssiRNA-sekvencu i operativno spajanje pomenutog mts-siRNA-elementa na sekvencu koja kodira neku belančevinu, pri čemu je pomenuti mts-siRNA-element heterologan u odnosu na pomenutu sekvencu koja kodira neku belančevinu, i pri čemu:
a. pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem jednu mts-siRNA-sekvencu koja je izabrana iz SEQ ID NO:1-56 i 105-149; ili
b. pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104; ili c. pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104, gde su ugrađene 1-3 pogrešno-sparene baze; ili
d. pomenuti mts-siRNA-element obuhvata barem 20 kontinuiranih nukleotida iz mts-siRNA-elementa izabranog iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104;
pri čemu je ekspresija pomenute belančevine kodirane sa pomenutom sekvencom koja kodira neku belančevinu suprimirana u muškim reproduktivnim tkivima neke transgenične biljke koja eksprimira pomenuti rekombinantni DNA-konstrukt.
4. Postupak iz zahteva 3, naznačen time, što
i. barem jedna mts-siRNA sekvenca je izabrana iz SEQ ID NO:1-56 i 105-149 ili pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO:57-94 ili 96-104; ili ii. pomenuti mts-siRNA-element je cvast-specifičan.
5. Transgenična biljka ili seme, potomak, ili njihov biljni deo, naznačeni time, što u svojem genomu sadrže rekombinantni DNA-konstrukt iz zahteva 1.
6. Transgenična biljka iz zahteva 5, naznačena time, što
i. pomenuta transgenična biljka je monokotiledona biljka; ili
ii. pomenuta transgenična biljka je kukuruz.
7. Postupak za selektivno suprimiranje ekspresije rekombinantne belančevina u muškom reproduktivnom tkivu neke transgenične biljke, naznačen time, što u pomenutoj transgeničnoj biljki podrazumeva eksprimiranje rekombinantnog DNA-konstrukta iz zahteva 1.
8. Postupak iz zahteva 7, naznačen time, što
i. pomenuto muško reproduktivno tkivo je cvast kukuruza; ili
ii. pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem tri mts-siRNA sekvence; ili iii. pomenuti mts-siRNA-element sadrži barem jednu mts-siRNA sekvencu izabranu iz SEQ ID NO:1-56 i 105-149; ili
iv. pomenuti mts-siRNA-element je izabran iz SEQ ID NO:57-94 i 96-104; ili v. ekspresija pomenute rekombinantne belančevine u nekoj transgeničnoj biljki uzrokuje barem vegetativnu toleranciju na herbicid u pomenutoj biljki, preferirano pomenuta rekombinantna belančevina je EPSPS-belančevina tolerantna na glifosat.
9. Postupak za indukovanje muške-sterilnost u nekoj transgeničnoj biljki, naznačen time, što podrazumeva nanošenje efektivne količine nekog herbicida na transgeničnu biljku koja sadrži rekombinantni DNA-konstrukt iz zahteva 1, pri čemu se pomenuta primena herbicida provodi tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva pomenute transgenične biljke čime se indukuje mušku-sterilnost u pomenutoj transgeničnoj biljki.
10. Postupak iz zahteva 9, naznačen time, što
i. pomenuta transgenična biljka je kukuruz; ili
ii. pomenuta primena herbicida sprečava barem ispuštanje polena ili ekstruziju prašnik; ili
iii. pomenuti razvoj muškog reproduktivnog tkiva je faza izabrana iz faze V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, i V14 razvoja biljke kukuruza; ili
iv. pomenuti herbicid je izabran iz inhibitora acetil koencim A karboksilaze (ACCaza), inhibitora acetolaktat sintaze (ALS), inhibitora fotosistema II (PSII), inhibitora protoporfirinogen oksidaze (PPO), inhibitora 4-hidroksifenol piruvat dioksigenaze (HPPD), inhibitora 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintaze (EPSPS), inhibitora glutamin sintetaze (GS), i sintetičkih auksina; ili
v. pomenuti herbicid je glifosat, a pomenuta rekombinantna belančevina je EPSPS tolerantan na glifosat.
1
RS20201573A 2011-07-01 2012-06-29 Postupci i jedinjenja za selektivnu regulaciju ekspresije belančevina RS61292B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161504102P 2011-07-01 2011-07-01
PCT/US2012/045040 WO2013006472A1 (en) 2011-07-01 2012-06-29 Methods and compositions for selective regulation of protein expression
EP12807530.6A EP2726493B1 (en) 2011-07-01 2012-06-29 Methods and compositions for selective regulation of protein expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61292B1 true RS61292B1 (sr) 2021-02-26

Family

ID=47392140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201573A RS61292B1 (sr) 2011-07-01 2012-06-29 Postupci i jedinjenja za selektivnu regulaciju ekspresije belančevina

Country Status (18)

Country Link
US (5) US9139838B2 (sr)
EP (1) EP2726493B1 (sr)
CN (1) CN103635483B (sr)
AP (1) AP2013007316A0 (sr)
AR (2) AR088133A1 (sr)
BR (1) BR112013033972B1 (sr)
CA (1) CA2840646C (sr)
CL (2) CL2013003776A1 (sr)
HU (1) HUE051995T2 (sr)
MX (1) MX354471B (sr)
PE (1) PE20141518A1 (sr)
PH (1) PH12013502605B1 (sr)
RS (1) RS61292B1 (sr)
RU (1) RU2667424C2 (sr)
UA (1) UA121189C2 (sr)
UY (1) UY34176A (sr)
WO (1) WO2013006472A1 (sr)
ZA (1) ZA201309287B (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2420929T3 (es) 2002-07-18 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Procedimientos de utilización de polinucleótidos artificiales y sus composiciones para reducir el silenciamiento de transgenes
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
WO2007047016A2 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Monsanto Technology, Llc Methods for producing hybrid seed
EP3378953A1 (en) 2006-10-12 2018-09-26 Monsanto Technology LLC Plant micrornas and methods of use thereof
EP3144391A3 (en) 2009-11-23 2017-06-21 Monsanto Technology LLC Transgenic maize event mon 87427 and the relative development scale
UA121189C2 (uk) 2011-07-01 2020-04-27 Монсанто Текнолоджи Ллс Конструкція рекомбінантної днк, яка індукує чоловічу стерильність в трансгенній рослині, та спосіб її застосування
WO2014200842A2 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
US20150024388A1 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 Malaysian Palm Oil Board Expression of SEP-like Genes for Identifying and Controlling Palm Plant Shell Phenotypes
MD4770B1 (ro) 2013-12-18 2021-10-31 BASF Agro B.V. Plante cu toleranţă sporită la erbicide
US10683513B2 (en) * 2013-12-31 2020-06-16 Dow Agrosciences Llc Tissue-specific expression and hybrid plant production
PE20231848A1 (es) * 2015-07-22 2023-11-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas
CA3051585A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
US11603536B2 (en) 2017-09-29 2023-03-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient maize genome editing
US11220694B1 (en) 2018-01-29 2022-01-11 Inari Agriculture, Inc. Rice cells and rice plants
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
US11802288B1 (en) 2018-01-29 2023-10-31 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient soybean genome editing
MX2020008124A (es) 2018-02-02 2020-09-18 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon87429 y metodos para su uso.
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
CN113122567B (zh) * 2019-12-31 2023-08-01 杭州瑞丰生物科技有限公司 一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法
CN112080501B (zh) * 2020-09-10 2021-11-23 隆平生物技术(海南)有限公司 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用
TW202300650A (zh) 2021-03-26 2023-01-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 真核系統中環狀多核糖核苷酸的產生
AR125217A1 (es) 2021-03-26 2023-06-28 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Producción de polirribonucleótidos circulares en un sistema procariota
EP4314289A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system
CN117693589A (zh) * 2021-06-23 2024-03-12 维萨梅布有限公司 用于调节基因表达的组合物和方法
AU2022375817A1 (en) 2021-11-01 2024-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023141540A2 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2024229356A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial solemoviridae satellite rnas
WO2024229359A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial tymovirales satellite rnas
AR133211A1 (es) 2023-05-03 2025-09-10 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Arn satélite artificiales de tombusviridae
AR132585A1 (es) 2023-05-03 2025-07-16 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Sistemas de amplificación de arn satélite endornavirales para plantas
AR132591A1 (es) 2023-05-03 2025-07-16 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Arn satélite de secoviridae artificiales
WO2024229385A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial ghabrivirales satellite rnas
AR132587A1 (es) 2023-05-03 2025-07-16 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Arn satélite de martellivirales artificiales
WO2024229398A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial amalgavirus satellite rnas
AR132590A1 (es) 2023-05-03 2025-07-16 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Sistemas de amplificación de arn satélite partitivirales para plantas

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5A (en) * 1836-08-10 Thomas Blanchard Machine for mortising solid wooden shells of ships' tackle-blocks
US676234A (en) 1897-12-30 1901-06-11 Thomas Humpage Toothed gearing.
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
NZ217113A (en) 1985-08-07 1988-06-30 Monsanto Co Production of eucaryotic plants which are glyphosate resistant, vectors (transformation and expression), chimeric gene and plant cells
US4735649A (en) 1985-09-25 1988-04-05 Monsanto Company Gametocides
US5068193A (en) 1985-11-06 1991-11-26 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducing alien DNA in vivo
DE3765449D1 (de) 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
IE63004B1 (en) 1987-05-05 1995-03-08 Sandoz Ltd Plant tissue transformation
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US6191343B1 (en) 1988-02-03 2001-02-20 Pioneer Hi-Bred International Molecular methods of hybrid seed production
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
NZ227835A (en) 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
ATE195218T1 (de) 1988-06-20 2000-08-15 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Verfahren zur bekämpfung von pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen proteinase-inhibitoren
GB8818706D0 (en) 1988-08-05 1988-09-07 Ici Plc Dna constructs & plants incorporating them
EP0360750A3 (en) 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Novel herbicide tolerant plants
DE69034190T2 (de) 1989-02-02 2006-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
EP0814166A3 (en) 1989-08-09 1998-05-13 DeKalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DE69033764T2 (de) 1989-08-10 2002-05-23 Aventis Cropscience N.V., Gent Pflanzen mit modifizierten Blüten
DK0426641T3 (da) 1989-10-31 2000-10-23 Monsanto Co Promotor til transgene planter
WO1991009948A1 (en) 1990-01-05 1991-07-11 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
DE4013099A1 (de) 1990-04-25 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
DE59109256D1 (de) 1990-06-23 2004-01-22 Bayer Cropscience Gmbh Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
AU655945B2 (en) 1990-08-31 1995-01-19 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
DE69133512T2 (de) 1990-11-23 2006-09-28 Bayer Bioscience N.V. Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
US5436389A (en) 1991-02-21 1995-07-25 Dekalb Genetics Corp. Hybrid genetic complement and corn plant DK570
DE4126414A1 (de) 1991-08-09 1993-02-11 Hoechst Ag Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
US5583210A (en) * 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5750868A (en) 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
FR2736929B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
WO1997023634A2 (en) 1995-12-21 1997-07-03 New Zealand Institute For Crop & Food Research Limited Production of true-breeding transgenic seeds from plants heterozygous for transgene insertions
US6476291B1 (en) 1996-12-20 2002-11-05 New Zealand Institute For Food And Crop Research Limited True breeding transgenics from plants heterozygous for transgene insertions
GB9611981D0 (en) 1996-06-07 1996-08-07 Zeneca Ltd Enhancement of gene expression
US6040497A (en) 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
AU6882298A (en) 1997-04-03 1998-10-22 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US6271439B1 (en) 1998-03-04 2001-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for regulating cell death and enhancing disease resistance to plant pathogens
EP1062354A2 (en) * 1998-03-09 2000-12-27 Monsanto Company Glyphosate as a gametocide
US6750377B1 (en) 1998-06-19 2004-06-15 Advanta Technology Ltd. Method of breeding glyphosate resistant plants
ES2325874T3 (es) 1998-11-17 2009-09-22 Monsanto Technology Llc Plantas que matabolizan fosfonatos.
US6072110A (en) 1999-01-19 2000-06-06 Novartis Ag Inbred maize line NP2029
US20100293669A2 (en) 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US6384304B1 (en) 1999-10-15 2002-05-07 Plant Genetic Systems N.V. Conditional sterility in wheat
CA2641218C (en) 1999-12-16 2014-02-25 Monsanto Technology Llc Hybrid promoter for use in plants
AR044724A1 (es) * 2000-03-27 2005-10-05 Syngenta Participations Ag Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum
US20020062499A1 (en) * 2000-05-08 2002-05-23 Conner Timothy W. Methods for translational repression of gene expression in plants
BR122013026754B1 (pt) 2000-06-22 2018-02-27 Monsanto Company Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato
US7266512B2 (en) 2000-07-18 2007-09-04 Cnet Networks, Inc. System and method for establishing business to business connections via the internet
US6646186B1 (en) * 2000-07-26 2003-11-11 Stine Seed Farm Inc. Hybrid soybeans and methods of production
AU2001287862B2 (en) 2000-09-29 2006-12-14 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
ATE509110T1 (de) 2000-10-30 2011-05-15 Monsanto Technology Llc Canola event pv-bngt(rt73), zusammensetzungen und verfahren zum nachweis davon
GB0108048D0 (en) * 2001-03-30 2001-05-23 Isis Innovation Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants
US7977046B2 (en) 2002-05-10 2011-07-12 Monsanto Technology Llc Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants
US7230168B2 (en) 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
AU2003207323B2 (en) 2002-02-26 2007-09-13 Syngenta Limited A method of selectively producing male or female sterile plants
ES2420929T3 (es) 2002-07-18 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Procedimientos de utilización de polinucleótidos artificiales y sus composiciones para reducir el silenciamiento de transgenes
CA2492917C (en) 2002-07-19 2011-10-18 University Of South Carolina Compositions and methods for the modulation of gene expression in plants
AU2003903132A0 (en) * 2003-06-20 2003-07-03 Molecular Plant Breeding Nominees Ltd. Plant promoter
US8344211B2 (en) * 2008-08-13 2013-01-01 Ceres, Inc. Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides
EP2361984A1 (en) 2003-10-09 2011-08-31 E. I. du Pont de Nemours and Company Gene silencing by using modified micro-RNA molecules
PT1708560E (pt) 2003-12-15 2015-06-03 Monsanto Technology Llc Planta de milho mon88017 e composições e métodos para a sua detecção
KR20070061524A (ko) * 2004-07-20 2007-06-13 제넨테크, 인크. 안지오포이에틴-유사 4 단백질을 사용하는 조성물 및 방법
US7750207B2 (en) * 2004-09-01 2010-07-06 Monsanto Technology Llc Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter
US8404927B2 (en) 2004-12-21 2013-03-26 Monsanto Technology Llc Double-stranded RNA stabilized in planta
US8314290B2 (en) 2004-12-21 2012-11-20 Monsanto Technology Llc Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs
EP1824967B1 (en) 2004-12-21 2014-11-05 Monsanto Technology, LLC Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP1838144B1 (en) 2005-01-07 2016-08-31 Oregon State University Method to trigger rna interference
EP1874936B1 (en) 2005-04-19 2013-10-30 BASF Plant Science GmbH Improved methods controlling gene expression
WO2007047016A2 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Monsanto Technology, Llc Methods for producing hybrid seed
ZA200803234B (en) * 2005-10-13 2009-01-28 Monsanto Technology Llc Methods for producing hybrid seed
US7491813B2 (en) 2005-12-07 2009-02-17 Monsanto Technology Llc Promoter polynucleotides identified from Zea mays for use in plants
US8158850B2 (en) * 2007-12-19 2012-04-17 Monsanto Technology Llc Method to enhance yield and purity of hybrid crops
EP2294204B1 (en) 2008-06-03 2013-02-27 Nordsaat Saatzuchtgesellschaft mbH Process of producing male sterile monocotyledonous plants
US20120210458A9 (en) 2009-02-27 2012-08-16 Yongwei Cao Isolated Novel Nucleic Acid and Protein Molecules from Corn and Methods of Using Thereof
MY176497A (en) 2009-03-30 2020-08-12 Monsanto Technology Llc Transgenic rice event 17314 and methods of use thereof
JP5762400B2 (ja) 2009-03-30 2015-08-12 モンサント テクノロジー エルエルシー イネ遺伝子組換え事象１７０５３およびその使用方法
EP3144391A3 (en) 2009-11-23 2017-06-21 Monsanto Technology LLC Transgenic maize event mon 87427 and the relative development scale
WO2011079070A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Gradalis, Inc. Furin-knockdown bi-functional rna
UA121189C2 (uk) * 2011-07-01 2020-04-27 Монсанто Текнолоджи Ллс Конструкція рекомбінантної днк, яка індукує чоловічу стерильність в трансгенній рослині, та спосіб її застосування
PE20231848A1 (es) 2015-07-22 2023-11-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas
MX2020008124A (es) 2018-02-02 2020-09-18 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon87429 y metodos para su uso.

Also Published As

Publication number Publication date
CL2013003776A1 (es) 2014-08-01
US9139838B2 (en) 2015-09-22
CL2016000869A1 (es) 2016-10-07
US20180030474A1 (en) 2018-02-01
ZA201309287B (en) 2014-08-27
PH12013502605A1 (en) 2014-02-10
HUE051995T2 (hu) 2021-04-28
BR112013033972A2 (pt) 2016-09-13
PE20141518A1 (es) 2014-11-17
PH12013502605B1 (en) 2018-11-14
EP2726493A1 (en) 2014-05-07
MX354471B (es) 2018-03-07
CA2840646A1 (en) 2013-01-10
RU2667424C2 (ru) 2018-09-19
CA2840646C (en) 2020-09-01
WO2013006472A1 (en) 2013-01-10
US20200340010A1 (en) 2020-10-29
US20130007908A1 (en) 2013-01-03
EP2726493B1 (en) 2020-10-14
UA121189C2 (uk) 2020-04-27
US9816106B2 (en) 2017-11-14
EP2726493A4 (en) 2015-03-18
US20160208283A1 (en) 2016-07-21
CN103635483B (zh) 2016-11-09
UY34176A (es) 2013-01-31
BR112013033972B1 (pt) 2021-09-28
RU2014103436A (ru) 2015-08-10
MX2013015338A (es) 2014-01-31
US10689667B2 (en) 2020-06-23
AR088133A1 (es) 2014-05-14
US11560574B2 (en) 2023-01-24
AP2013007316A0 (en) 2013-12-31
CN103635483A (zh) 2014-03-12
AR126724A2 (es) 2023-11-08
US20230392162A1 (en) 2023-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230392162A1 (en) Methods and Compositions for Selective Regulation of Protein Expression
CN106191101B (zh) 玉米转殖项5307
JP4592954B2 (ja) グルホシネート耐性イネ
US11873499B2 (en) Methods of increasing nutrient use efficiency
AU2020273330B2 (en) Methods and compositions for selective regulation of protein expression
WO2018215779A1 (en) Methods for increasing grain productivity
US12421522B2 (en) Modulation of transgene expression in plants
WO2021003592A1 (en) Sterile genes and related constructs and applications thereof
WO2023183895A2 (en) Use of cct-domain proteins to improve agronomic traits of plants
WO2025184173A1 (en) Methods and compositions for modifying plant growth and development