RU2667424C2 - Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка - Google Patents
Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2667424C2 RU2667424C2 RU2014103436A RU2014103436A RU2667424C2 RU 2667424 C2 RU2667424 C2 RU 2667424C2 RU 2014103436 A RU2014103436 A RU 2014103436A RU 2014103436 A RU2014103436 A RU 2014103436A RU 2667424 C2 RU2667424 C2 RU 2667424C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sirna
- mts
- plant
- transgenic plant
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 5
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 title 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 152
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 76
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims abstract description 62
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims abstract description 56
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 285
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 96
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 96
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 96
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 59
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 51
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 34
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 31
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 30
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 28
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 26
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 21
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 19
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 15
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims description 7
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100028626 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Human genes 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims description 4
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims description 4
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 4
- 102100029028 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 claims 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims 1
- QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N shikimate-3-phosphate Chemical compound O[C@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 51
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 51
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 36
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 24
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 17
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 17
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 12
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 12
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 12
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 11
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 10
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 9
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101000951943 Stenotrophomonas maltophilia Dicamba O-demethylase, oxygenase component Proteins 0.000 description 2
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- -1 pat and bar) Chemical compound 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 0 *CCC*CC1CCCCC1 Chemical compound *CCC*CC1CCCCC1 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229910017383 At S90 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000005532 Flumioxazine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N Mecamylamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2C(C)(C)C(NC)(C)C1C2 PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102220534415 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1_S50D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 229940089639 cornsilk Drugs 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical class C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N flumioxazin Chemical compound FC1=CC=2OCC(=O)N(CC#C)C=2C=C1N(C1=O)C(=O)C2=C1CCCC2 FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N fomesafen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000023409 microsporogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108700023195 montirelin Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- KXFJZKUFXHWWAJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoylformic acid Natural products OC(=O)C(=O)C1=CC=C(O)C=C1 KXFJZKUFXHWWAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- LIOPHZNMBKHGAV-UHFFFAOYSA-M potassium;2-(phosphonomethylamino)acetate Chemical compound [K+].OC(=O)CNCP(O)([O-])=O LIOPHZNMBKHGAV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000020985 whole grains Nutrition 0.000 description 1
- 239000001231 zea mays silk Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
- A01N37/46—N-acyl derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
- A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Mycology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к конструкции рекомбинантной ДНК для супрессии экспрессии кодирующей белок последовательности. Также раскрыты трансгенное растение, содержащие указанную конструкцию, семя указанного трансгенного растения, часть указанного трансгенного растения. Раскрыты способ получения указанной конструкции рекомбинантной РНК, способ супрессии экспрессии кодирующей белок последовательности в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, способ индуцирования мужской стерильности в трансгенном растении, способ получения семян, содержащих указанную конструкцию ДНК, способ получения товарного продукта из указанных растения или семени. Изобретение позволяет супрессировать экспрессию кодирующей белок последовательности, придающей растению толерантность к гербициду. 10 н. и 23 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 табл., 12 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 61/504102, поданной 1 июля 2011 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Список последовательностей содержится в файле под названием «MONS294WO.txt» размером 41 килобайт (согласно оценке Microsoft Windows®), который был создан 29 июня 2012 г., представлен в электронном виде и включен в настоящее описание посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Изобретение в целом относится к области сельского хозяйства, растениеводству и молекулярной биологии. В частности, изобретение относится к способам и композициям для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в репродуктивной ткани мужских особей трансгенных растений и их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Гибридные семена, т.е. семена, полученные способом гибридизации или перекрестного опыления близкородственных растений, могут быть выращены в потомственные гибридные растения, обладающие требуемой комбинацией признаков, отсутствующих у любого из родительских растений. Гибридные растения могут демонстрировать лучшие агрономические характеристики, включая улучшение размера растений, урожайность, питательную композицию, устойчивость к заболеваниям, толерантность к гербицидам, толерантность к стрессу, климатическую адаптацию и другие желательные признаки. Эффективное получение гибридных семян требует отсутствия самоопыления растения собственной пыльцой.
[0005] При получении гибридных семян у женской особи родительского растения можно предотвратить образование пыльцы и/или сбрасывание пыльцы для облегчения перекрестного опыления женской особи, а не для самоопыления. Такое предотвращение может быть достигнуто, например, удалением вручную содержащих пыльцу структур (например, удаления соцветия метелки у кукурузы ручным или механическим способом), использованием генетических способов контроля опыления (например, цитоплазматическая стерильность мужских особей, ядерная мужская стерильность) и/или использованием химического препарата.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Изобретение относится в целом к способам избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенных растений, конструкциям рекомбинантной ДНК, пригодным в таких способах, а также трансгенным растениям, клеткам и семенам, содержащим такие конструкции рекомбинантной ДНК. Конструкции рекомбинантной ДНК и трансгенные растения, клетки и семена, содержащие такие конструкции, обеспечивают значительно улучшенный способ использования гербицидов для индукции мужской стерильности у трансгенных растений для получения гибридных семян.
[0007] В одном аспекте изобретение предоставляет конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, которая кодирует рекомбинантный белок и специфический для мужской ткани элемент миРНК (мтс-миРНК), функционально связанный с кодирующей белок последовательностью. В одном варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включен в 3’-нетранслируемый участок кодирующей белок последовательности. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК расположен между кодирующей белок последовательностью и последовательностью полиаденилирования, которая является частью 3’-нетранслируемого участка. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. В другом варианте воплощения изобретения экспрессия рекомбинантного белка в трансгенном растении придает растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду. В другом варианте воплощения изобретения рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.
[0008] Другой аспект изобретения предоставляет способ получения конструкции рекомбинантной ДНК, включая идентификацию элемента мтс-миРНК, включая по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК и функционально связанный элемент мтс-миРНК с кодирующей белок последовательностью, например, последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный белок. В одном варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149, или по меньшей мере один элемент мтс-миРНК, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК является специфичным для метелки.
[0009] В дополнительном аспекте изобретение предоставляет трансгенное растение, включая конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, а также семена, клетку или часть трансгенного растения. В одном варианте воплощения изобретения растение является однодольным растением. В другом варианте воплощения изобретения растение является растением кукурузы (Zea mays).
[0010] В дополнительном аспекте изобретение также предоставляет способ избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения путем экспрессии в трансгенном растении конструкции рекомбинантной ДНК, которая включает кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК. В одном варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК. В другом варианте воплощения изобретения мужская репродуктивная ткань является метелкой растения кукурузы. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149. В другом варианте воплощения изобретения элемент мтс-миРНК является по меньшей мере одним элементом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. В другом варианте воплощения изобретения экспрессия рекомбинантного белка в трансгенном растении придает растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду. В другом варианте воплощения изобретения рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.
[0011] Изобретение также предоставляет способ индукции мужской стерильности у трансгенного растения, включая этап применения гербицида по отношению к трансгенному растению, имеющему в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК, который придает трансгенному растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду, при этом гербицид применяют во время развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, тем самым индуцируя мужскую стерильность в трансгенном растении. В одном варианте воплощения изобретения трансгенное растение является растением кукурузы. В другом варианте воплощения изобретения применение гербицида предотвращает по меньшей мере опадение пыльцы или выпячивание пыльников в обработанном трансгенном растении. В другом варианте воплощения изобретения стадию развития мужской репродуктивной ткани, во время которой используют гербицид, выбранный из группы, состоящей из стадии развития растения кукурузы V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 и V14. В другом варианте воплощения изобретения гербицид выбран из группы, состоящей из ингибиторов ацетил коэнзим A карбоксилазы (ACCase), ингибиторов ацетолактатсинтазы (ALS), ингибиторов фотосистемы II (PSII), ингибиторов протопорфириногеноксидазы (PPO), ингибиторов 4-гидроксифенилдиоксигеназы (HPPD), ингибиторов 5-энолипирувилшикимат 3-фосфатсинтазы (EPSPS), ингибиторов глутаминсинтетазы (GS) и синтетических ауксинов. В другом варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.
[0012] Изобретение также предоставляет способ получения гибридных семян, включая применение эффективного количества гербицида по отношению к трансгенному растению, включающему в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК, при этом гербицид применяют во время развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, тем самым индуцируя мужскую стерильность у трансгенного растения; опыление трансгенного растения пыльцой от второго растения; и сбор гибридных семян от трансгенного растения. В одном варианте воплощения изобретения трансгенное растение является кукурузой. Эффективное количество гербицида является дозой гербицида, достаточной для придания трансгенному растению, включающему конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, мужской стерильности (эффективная доза). В другом варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS. В другом варианте воплощения изобретения глифосат применяют во время развития в эффективной дозе от примерно 0,125 фунтов кислоты в эквиваленте на акр до примерно 8 фунтов кислоты в эквиваленте на акр. Другие специфические варианты воплощения изобретения описаны в представленном ниже подробном описании. В тексте данной заявки и формуле изобретения, если в контексте не указано иначе, слово «включает» и его вариации, такие как «содержит» и «содержащий», будет пониматься как подразумевающее включение указанного целого числа, элемента или этапа, или группы целых чисел, элементов или этапов, но не исключение любого другого целого числа, элемента или этапа, или группы целых чисел, элементов или этапов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0013] Фиг.1 отображает картирование последовательностей мтс-миРНК на элементе мтс-миРНК (SEQ ID NO: 85), как это описано в примере 1. Ось Х слева направо представляет ориентацию элемента мтс-миРНК, при этом верхняя спираль представлена в верхней половине диаграммы, а нижняя спираль представлена в нижней половине диаграммы; нуклеотидная позиция в направлении от 5’ до 3’ показана слева направо вверху и справа налево внизу. Последовательности мтс-миРНК показаны в соответствующих позициях выравнивания. Ось Y представляет относительное обилие мтс-миРНК, экспрессируемой в ткани метелки в виде транскриптов на четверть миллиона последовательностей (tpq). Мтс-миРНК, представленные в библиотеке более часто, обведены кружком.
[0014] Фиг.2 отображает анализ нозерн-блоттинг для измерения экспрессии мРНК, специфической для метелки, как это описано в примере 2.
[0015] Фиг.3 отображает картирование последовательностей мтс-миРНК на элементе мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87), как это описано в примерах 2 и 8. Ось Х слева направо представляет ориентацию элемента мтс-миРНК, при этом верхняя спираль представлена в верхней половине диаграммы, и нижняя спираль представлена в нижней половине диаграммы; нуклеотидная позиция в направлении от 5’ до 3’ показана слева направо вверху и справа налево внизу. Последовательности мтс-миРНК показаны в их соответствующих позициях выравнивания. Указаны три последовательности мтс-миРНК, используемые для получения трех специфических зондов (sR648011 (SEQ ID NO: 8), sR1372590 (SEQ ID NO: 26) и sR410590 (SEQ ID NO: 33)).
[0016] Фиг.4 отображает анализ нозерн-блоттинг временной экспрессии элемента мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87) в зрелой метелке с использованием РНК от различной инбредной зародышевой плазмы, как это описано в примере 2.
[0017] Фиг.5 отображает локализацию экспрессии миРНК in situ в зрелом пыльнике с использованием антисмысловых (слева) или смысловых (справа) зондов для последовательности мтс-миРНК (sR648011, SEQ ID NO: 8), как это описано в примере 2.
[0018] Фиг.6 отображает локализацию белка CP4-EPSPS в пыльниках от необработанных распылением растений, трансгенных на предмет конструкции 3 (фиг.6А) или конструкции 4 (фиг.6В), как это описано в примере 4. Растения кукурузы, трансгенные на конструкцию 3, содержат кассету экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК. Растения с конструкцией 4 являются контролем.
[0019] Фиг.7 отображает трансгенные растения кукурузы, полученные из конструкций, содержащих кассету экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК, которые были вегетативно толерантны к глифосату и имели индуцированную мужскую стерильность с поздним применением глифосата, как это описано в примере 7. Фиг.7А отображает трансгенные растения кукурузы с и без обработки глифосатом. Фиг.7В отображает метелки от необработанных трансгенных растений, и фиг.7С отображает пыльцевые зерна необработанных трансгенных растений. Фиг.7D отображает метелки от обработанных трансгенных растений, и фиг.7Е отображает пыльцевые зерна обработанных трансгенных растений.
[0020] Фиг.8 отображает данные для одного года полевых исследований, измеряющих показатель мужской фертильности (ПМФ) после поздней обработки глифосатом. Фиг.8А отображает среднее значение ПМФ, полученное при трех различных режимах обработки глифосатом (Trt 1, Trt 2 и Trt 3) для NK603 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза), MON 87427 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза с индуцированной глифосатом мужской стерильностью) и двух явлений, связанных с конструкцией 3, как это описано в примере 5; пунктирная линия указывает на промышленный стандарт для мужской стерильности, ПМФ 2. Фиг.8В отображает метелку растения, у которого обработаны распылением только семена. Фиг.8С отображает метелку растения, обработанного распылением глифосатом на поздней стадии для индукции мужской стерильности.
[0021] Фиг.9 отображает результаты полевого исследования, измеряющие количество растений на делянке, при этом мужская стерильность измерена по выпячиванию пыльника через S90, при S90+3 и S90+6, при двух различных режимах обработки глифосатом способом распыления (Trt 2 и Trt 3) для NK603 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза), MON 87427 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза с индуцированной глифосатом мужской стерильностью) и четырех явлений, связанных с конструкцией 3, как это описано в примере 5.
[0022] Фиг.10 отображает результаты исследований жизнеспособности пыльцы, как это описано в примере 5. Фиг.10А и 10В отображают пример позднего выпячивания пыльников в метелке при явлении распыления при наличии стерильности и конструкции 3. Квадрат на фиг.10А является участком, увеличенным на фиг.10В. Пример позднего выпячивания пыльника обведен кружком на Фигуре 10В. Окрашивание пыльцы из стерильного пыльника с поздним выпячиванием при явлениях распыления конструкции 3 по Alexander выявило только нежизнеспособную пыльцу (полупрозрачный голубой цвет, неправильная форма пыльцевых зерен) (фиг.10С). Пыльца от пыльников, необработанных конструкцией 3, была полностью жизнеспособной и при окрашивании по Alexander была непрозрачной, темно-фиолетовой и сферической (фиг.10D).
[0023] Фиг.11 отображает результаты полевого исследования, изучавшего растения NK603 и явления конструкции 3 для получения инбредных зерен и мужской фертильности, как это описано в примере 6. Урожай инбредных зерен был измерен в значениях бушели/акр, а индуцированная мужская стерильность была измерена как показатель мужской фертильности (ПМФ). Горизонтальные усы указывают промышленный стандарт для мужской стерильности, ПМФ 2. Trt 1, Trt 2 и Trt 3 обозначают режимы обработки 1, 2 и 3.
[0024] Фиг.12 отображает результаты полевого исследования, изучавшего нетрансгенные женские инбредные растения (Null), линия MON87427, и три явления конструкции 3, все с одинаковой генетической основой, которые были перекрестно опылены мужским тестером MON810/MON88017 для получения гибридных семян F1. Урожай гибридных зерен был измерен в значениях бушели/акр. Trt 1, Trt 2 и Trt 3 обозначают режимы обработки 1, 2 и 3.
[0025] Фиг.13 отображает анализ пыльцевых зерен из гибридных растений F1, как это описано в примере 7. Панели отображают результаты окрашивания пыльцы по Alexander, полученной в результате трех различных гибридных скрещиваний F1: нетрансгенная женская особь x MON88017 мужская особь; MON87427 женская особь x MON88017 мужская особь; и явление конструкции 3 женская особь x MON88017 мужская особь. Фертильность метелки была функционально восстановлена в гибридах F1, полученных от растений с явлением конструкции 3 с использованием пыльцы MON88017.
[0026] Фиг.14 отображает схематические чертежи вариантов воплощения конструкций рекомбинантной ДНК (представлено в направлении от 5’ к 3’ слева направо), включая (вверху) кодирующую белок последовательность (например, ДНК, кодирующую устойчивый к глифосату EPSPS), функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей элемент мтс-миРНК (например, одну или более, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104) (вверху). В неограничивающем специфическом варианте воплощения изобретения (внизу) конструкция рекомбинантной ДНК включает промотор, функционально связанный, по порядку, с интроном, транзитным пептидом, CP4-EPSPS, кодируемым SEQ ID NO: 95, элементом мтс-миРНК (SEQ ID NO: 81) и 3’UTR.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Конструкции рекомбинантной ДНК
[0027] Изобретение предоставляет композиции и способы для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в репродуктивной ткани мужских особей трансгенных растений и их применение. В одном аспекте изобретение предоставляет конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК, т.е. химерный трансген, включающий кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, и по меньшей мере один элемент мтс-миРНК, функционально связанный с кодирующей белок последовательностью. В одном варианте воплощения изобретения такие конструкции рекомбинантной ДНК являются пригодными для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения. В одном аспекте изобретение предоставляет рекомбинантную молекулу ДНК, включающую конструкцию рекомбинантной ДНК, и способы ее применения. Последовательности нуклеиновых кислот могут быть представлены в качестве ДНК или РНК, в зависимости от того, что указано; описание одной обязательно определяет другую, что известно специалисту в данной области техники. Кроме того, описание данной последовательности нуклеиновой кислоты обязательно определяет точный комплемент такой последовательности, что известно специалисту в данной области техники.
[0028] «Мужская тканеспецифичная миРНК» или «мтс-миРНК» является малой РНК (мРНК) из от примерно 18 до примерно 26 нуклеотидов (например, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов), обогащенной или специфически экспрессируемой в мужской репродуктивной ткани(ях) (например, мужском соцветии) растения, т.е. имеющей мужскую тканеспецифичную схему экспрессии. Мужская тканеспецифичная миРНК встречается естественным образом у растений и может быть определена с использованием известных в данной области техники способов, таких как низкомолекулярный нозерн-анализ. Последовательность ДНК, являющаяся комплементарной мтс-миРНК, обозначается в настоящем описании как «последовательность мтс-миРНК». Примеры последовательностей мтс-миРНК для мтс-миРНК эндогенного растения представлены как SEQ ID NO: 1-56 и 105-149. В варианте воплощения изобретения последовательность мтс-миРНК является точным комплементом ДНК (без несоответствий) для заданной мтс-миРНК. В других вариантах воплощения изобретения последовательность мтс-миРНК варьирует в пределах 1-3 нуклеотидных несоответствий в сравнении с заданной мтс-миРНК, но при этом обладает достаточной комплементарностью для связывания или гибридизации, например, при обычных физиологических условиях, с такой мтс-миРНК. «Комплементарность» обозначает способность нуклеотидов в одной полинуклеотидной цепи образовывать пары с нуклеотидами другой полинуклеотидной цепи в соответствии со стандартными правилами комплементарности Уотсона-Крика (т.е. пары гуанина с цитозином (Г:Ц) и пары аденина с тимином (А:Т) или урацилом (А:У); возможна внутрицепочечная гибридизация между двумя или более комплементарных участков отдельного полинуклеотида. При включении в конструкцию рекомбинантной ДНК, как это описано в настоящем описании, мтс-миРНК способна осуществлять миРНК-опосредованную супрессию или нарушение экспрессии гена и/или белка.
[0029] По меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или более трех последовательностей мтс-миРНК могут быть соединены в кластер или даже перекрываться в одной молекуле ДНК. Такая молекула ДНК обозначается в настоящем описании как «мужской тканеспецифичный элемент миРНК» или «элемент мтс-миРНК» и определяется как включающая по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или более трех последовательностей мтс-миРНК в окне последовательности из примерно 500 нуклеотидов. Элемент мтс-миРНК может иметь любую длину, такую как примерно 20 нуклеотидов (нт), примерно 25 нт, примерно 30 нт, примерно 40 нт, примерно 50 нт, примерно 60 нт, примерно 70 нт, примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт, примерно 300 нт, примерно 350 нт, примерно 400 нт, примерно 450 нт, примерно 500 нт, примерно 550 нт или примерно 600 нт.
[0030] Конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению является молекулой ДНК, включающей по меньшей мере кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включая элемент мтс-миРНК. Термин «рекомбинантный» обозначает молекулу или клетку, или организм, который был получен искусственно посредством генной инженерии и, таким образом, является продуктом деятельности человека и обычно не встречается иным образом в природе. Как используется в настоящем описании, конструкция рекомбинантной ДНК является молекулой рекомбинантной ДНК, включающей две или более гетерологичных последовательностей ДНК. Термин «гетерологичный» обозначает взаимосвязь между двумя или более последовательностей нуклеиновых кислот или белка, которые были получены из различных источников (например, из разных мест в геноме или от различных видов). В одном примере промотор и кодирующая белок последовательность ДНК являются гетерологичными относительно друг друга, если промотор не является нативным промотором кодирующей белок последовательности ДНК. В другом примере кодирующая белок последовательность является гетерологичной относительно элемента мтс-миРНК, если такая комбинация не встречается естественным образом в природе, например, элемент мтс-миРНК растения, функционально связанный с геном толерантности к гербициду, такому как CP4-EPSPS. Кроме того, отдельная последовательность может быть «гетерологичной» относительно клетки или организма, в которую ее вводят (т.е. последовательность, не встречающаяся естественным образом в такой отдельной клетке или организме).
[0031] Термин «функционально связанный» обозначает две молекулы полинуклеотидов, связанных таким образом, что одна молекула может влиять на экспрессию другой. Например, первая молекула полинуклеотида функционально связана со второй молекулой полинуклеотида, при этом молекулы полинуклеотидов располагаются таким образом, что первая молекула полинуклеотида может влиять на экспрессию другой молекулы полинуклеотида. Две молекулы полинуклеотидов могут быть частью отдельной неразрывной молекулы полинуклеотида и могут быть смежными или разделенными. Например, элемент мтс-миРНК функционально связан с кодирующей белок последовательностью, если, после транскрипции в клетке мужской репродуктивной ткани, присутствие элемента мтс-миРНК приводит к супрессии экспрессии рекомбинантного белка в клетке. Функциональная связь кодирующей белок последовательности и элемента мтс-миРНК может быть достигнута, например, посредством введения элемента мтс-миРНК, прилегающего к кодирующей белок последовательности (такой как расположенная на 5’ или 3’ конце кодирующей белок последовательности, но не обязательно смежным образом), в или прилегающего к нетранслируемому участку (UTR) конструкции рекомбинантной ДНК (такой как расположенная в или после 5’ UTR или 3’ UTR) и/или после кодирующей белок последовательности и перед сигналом полиаденилирования. В одном варианте воплощения изобретения один или более элементов мтс-миРНК располагаются между кодирующей белок последовательностью и последовательностью полиаденилирования, т.е. в направлении 3’ и прилегая к кодирующей белок последовательности. В другом варианте воплощения изобретения один или более элементов мтс-миРНК расположены между стоп-кодоном кодирующей белок последовательности и последовательностью полиаденилирования. В другом варианте воплощения изобретения один или более элементов мтс-миРНК расположены в пределах 3’ UTR последовательности, прилегающей к кодирующей белок последовательности.
[0032] Последовательность ДНК элемента мтс-миРНК может варьировать при использовании различных комбинаций и расположений отдельных последовательностей мтс-миРНК и/или при введении 1-3 нуклеотидных несоответствий в элементе мтс-миРНК (относительно заданной последовательности мтс-миРНК). Примеры элементов мтс-миРНК представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 57-94 и 96-104 и в рабочих Примерах. Элемент мтс-миРНК может функционировать в любом направлении, т.е. он ненаправленный и, таким образом, он может использоваться в направлении от 5’ к 3’ или в направлении от 3’ к 5’ в конструкции рекомбинантной ДНК.
[0033] Элементы мтс-миРНК, последовательности мтс-миРНК и мтс-миРНК могут быть идентифицированы способами, известными специалистам в данной области, например, посредством биоинформационного анализа мРНК растений и библиотек кДНК. Пример такого способа идентификации представлен в примерах ниже. В частности, мтс-миРНК и последовательности мтс-миРНК могут быть идентифицированы из библиотек мРНК. Идентифицированные последовательности мтс-миРНК могут быть сопоставлены с кДНК и/или геномными коллекциями последовательностей для идентификации элементов мтс-миРНК (т.е. участков ДНК, включающих по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три или более трех последовательностей мтс-миРНК в окне из 500 нуклеотидов в последовательности), которые пригодны для разработки конструкций рекомбинантной ДНК, как это описано в настоящем описании.
[0034] В некоторых вариантах воплощения изобретения такие элементы мтс-миРНК синтезируют или модифицируют in vitro для содержания большего, меньшего или различного количества последовательностей мтс-миРНК и/или для изменения относительного положения одной или более последовательностей мтс-миРНК, при этом такая модификация является преимущественной в увеличении или снижении эффекта элемента мтс-миРНК. Способы синтеза или in vitro модификации элемента мтс-миРНК и определения оптимальной вариации требуемого уровня супрессии известны специалистам в данной области. Химерные элементы мтс-миРНК также могут быть получены с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как вставка дополнительных требуемых последовательностей мтс-миРНК внутри элемента мтс-миРНК или присоединение дополнительных последовательностей мтс-миРНК на 5’ или 3’ конце относительно элемента мтс-миРНК. Неограничивающие варианты воплощения химерного элемента мтс-миРНК включают элементы мтс-миРНК, имеющие примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт или примерно 300 нт последовательности SEQ ID NO: 86; примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт или примерно 300 нт последовательности SEQ ID NO: 87; и/или примерно 80 нт, примерно 100 нт, примерно 150 нт, примерно 200 нт, примерно 250 нт, примерно 300 нт, примерно 350 нт, примерно 400 нт, примерно 450 нт, примерно 500 нт или примерно 550 нт последовательности SEQ ID NO: 85. Дополнительные варианты воплощения изобретения представлены в рабочих Примерах.
[0035] Конструкция рекомбинантной ДНК может использоваться для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужских репродуктивных тканях трансгенного растения, экспрессирующих конструкцию, т.е. для получения экспрессии по меньшей мере в вегетативных тканях, но не в мужских репродуктивных тканях. Как используется в настоящем описании, «экспрессия рекомбинантного белка» обозначает выработку рекомбинантного белка из кодирующей белок последовательности и полученного транскрипта (иРНК) в клетке. Как используется в настоящем описании, термин «супрессия» обозначает снижение; например, супрессия экспрессии рекомбинантного белка обозначает снижение уровня рекомбинантного белка, вырабатываемого в клетке, например, посредством посттранскрипционной супрессии гена, опосредованной интерференцией РНК.
[0036] Избирательная супрессия рекомбинантного белка, как используется в настоящем описании, обозначает снижение выработки рекомбинантного белка в клетке или ткани в сравнении с эталонной клеткой или тканью по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95% или по меньшей мере примерно на 99%. Эталонная клетка или ткань может быть, например, вегетативной клеткой или тканью от одного и того же или подобного трансгенного растения, экспрессирующего рекомбинантный белок, или, например, вегетативной клеткой или тканью трансгенного растения, имеющего подобный трансген для экспрессии рекомбинантного белка, но с отсутствием элемента мтс-миРНК. Супрессия экспрессии белка может быть определена с использованием любого способа, известного специалисту в данной области, такого как непосредственное измерение накопления белка в образце клетки или ткани с использованием способа, такого как ELISA или вестерн-блоттинг, путем измерения ферментативной активности белка или путем фенотипичного определения экспрессии белка. В одном варианте воплощения изобретения избирательная супрессия рекомбинантного белка обозначает достаточное снижение экспрессии рекомбинантного белка, способного придавать толерантность к гербициду в мужской ткани трансгенного растения, что приводит к определяемому фенотипу измененной мужской фертильности у трансгенного растения, по отношению к которому был применен гербицид в качестве воздействия на стерильность. Определение измененной мужской фертильности у такого трансгенного растения, таким образом, будет указывать на избирательную супрессию рекомбинантного белка.
[0037] Как используется в настоящем описании, термин «кодирующая белок последовательность» обозначает молекулу полинуклеотида, имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную или белковую последовательность, т.е. полипептидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок. В зависимости от условий нуклеотидная последовательность может фактически транслироваться или не транслироваться в полипептидную молекулу в клетке. Границы кодирующей белок последовательности обычно определяются старт-кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующая белок последовательность по изобретению включает, но не ограничивается этим, кодирующую белок последовательность, которая обеспечивает требуемые характеристики, связанные с морфологией, физиологией, ростом и развитием растения, урожайностью, повышением питательности, устойчивостью к болезням или вредителям, толерантностью к гербицидам или толерантностью к окружающей среде или химическим препаратам. В одном варианте воплощения изобретения кодирующая белок последовательность по изобретению кодирует рекомбинантный белок, который, при экспрессии в трансгенном растении, придает толерантность к гербицидам по меньшей мере клетке и/или ткани, в которой возникает экспрессируемый белок; избирательная супрессия белка толерантности к гербициду в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения в сочетании со своевременным применением гербицида приводит по меньшей мере к пониженной мужской фертильности или к мужской стерильности. Такая индуцируемая мужская стерильность в комбинации с вегетативной толерантностью к гербицидам может использоваться для повышения эффективности, с которой получают гибридные семена, например, способом элиминации или снижения необходимости физического удаления пестиков у растения кукурузы, используемого в качестве женского в заданном скрещивании во время получения гибридных семян. Системы индуцируемой гербицидами мужской стерильности были описаны, например, в патенте США № 6762344 и публикации патента США 2011/0126310. Примеры гербицидов, пригодных при практическом применении изобретения, включают, но не ограничиваются этим, ингибиторы ацетил коэнзим A карбоксилазы (ACCase) (например, т.н. fops и dims), ингибиторы ацетолактатсинтазы (ALS) (например, сульфонилмочевины (SU) и имидазолиноны (IMI)), ингибиторы фотосистемы II (PSII) (например, триазины и фениловые эфиры), ингибиторы протопорфириногеноксидазы (PPO) (например, флумиоксазин и фомесафен), ингибиторы 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD) (например, изоксафлутол и трикетоны, такие как мезотрион), ингибиторы 5-энолипирувилшикимат 3-фосфатсинтазы (EPSPS) (например, глифосат), ингибиторы глутаминсинтетазы (GS) (например, глуфосинат и фосфинотрицин), синтетические ауксины (например, 2,4-D и дикамба). Примеры кодирующих белок последовательностей и/или рекомбинантных белков для использования в практическом применении изобретения включают, но не ограничиваются этим, гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к ингибиторам HPPD (таким как нечувствительный к гербицидам HPPD), гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к глюфосинату (такому как pat и bar), гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к глифосату (такому как толерантный к глифосату EPSPS, известному как CP4-EPSPS, представленному в настоящем описании как SEQ ID NO: 95), и гены, кодирующие рекомбинантные белки, придающие толерантность к дикамбе (такой как дикамба монооксигеназа (DMO)).
[0038] Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению получают способами, известными в данной области техники, и в различных вариантах воплощения изобретения они включены в векторы трансформации растения, плазмиды или ДНК пластид. Такие конструкции рекомбинантной ДНК пригодны для получения трансгенных растений и/или клеток и, таким образом, они также могут содержаться в геномной ДНК трансгенного растения, семени, клетки или части растения. Следовательно, изобретение включает варианты воплощения, в которых конструкция рекомбинантной ДНК расположена в векторе трансформации растения или на биолистической частице для трансформации клетки растения, или в хромосоме, или пластиде клетки трансгенного растения, или в трансгенной клетке, ткани трансгенного растения, семени трансгенного растения, пыльцевом зерне трансгенного растения или в трансгенном или частично трансгенном (например, привитом) растении. Вектором является любая молекула ДНК, которая может использоваться в целях трансформации растения, т.е. введения ДНК в клетку. Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению могут быть, например, вставлены в вектор трансформации растения и использоваться для трансформации растения с целью получения трансгенных растений, семян и клеток. Способы построения векторов трансформации растения хорошо известны в данной области техники. Векторы трансформации растения по изобретению обычно включают, но не ограничиваются этим: подходящий промотор для экспрессии функционально связанной ДНК, функционально связанную конструкцию рекомбинантной ДНК и сигнал полиаденилирования (который может быть включен в последовательность 3’UTR). Промоторы, пригодные для практического применения изобретения, включают промоторы, функционирующие в растении для экспрессии функционально связанного полинуклеотида. Такие промоторы различны и хорошо известны в данной области техники, и включают промоторы, являющиеся индуцируемыми, вирусными, синтетическими, конститутивными, временно регулируемыми, пространственно регулируемыми и/или пространственно-временно регулируемыми. Дополнительные необязательные компоненты включают, но не ограничиваются этим, один или более следующих элементов: 5’ UTR, энхансер, цис-действующий элемент, интрон, сигнальная последовательность, транзитная пептидная последовательность и один или более избирательных маркерных генов. В одном варианте воплощения изобретения вектор трансформации растения включает конструкцию рекомбинантной ДНК.
[0039] Конструкции рекомбинантной ДНК и векторы трансформации растения по данному изобретению получают любым способом, подходящим для намеченного применения, принимая во внимание, например, тип требуемой экспрессии, требуемую кодирующую белок последовательность (и, таким образом, толерантность к гербицидам), а также удобство использования в растении, в котором конструкция рекомбинантной ДНК должна экспрессироваться. Общие способы, пригодные для работы с молекулами ДНК для получения и применения конструкций рекомбинантной ДНК и векторов трансформации растения, хорошо известны в данной области техники и описаны подробно, например, в справочниках и лабораторных указателях, включая Sambrook and Russell, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (third edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001. Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению могут быть модифицированы способами, известными в данной области техники, полностью или частично, например, для повышенного удобства работы с ДНК (такие как сайты распознавания рестриктазы или сайты клонирования на основе рекомбинации) или для включения преимущественных для растения последовательностей (таких как использование растительного кодона или консенсусных последовательностей Kozak), или для включения последовательностей, пригодных для разработки конструкции рекомбинантной ДНК (таких как последовательности спейсера или линкера). В определенных вариантах воплощения изобретения последовательность ДНК конструкции рекомбинантной ДНК включает последовательность ДНК, которая была оптимизирована кодоном для растения, в котором необходима экспрессия конструкции рекомбинантной ДНК. Например, конструкция рекомбинантной ДНК для экспрессии в растении может иметь все или части оптимизированной кодоном последовательности для экспрессии в растении известными в данной области техники способами. Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению могут находиться совместно с другими рекомбинантными ДНК для придания дополнительных признаков (например, в случае трансформированных растений, признаком, включающим резистентность к гербицидам, резистентность к вредителям, толерантность к прорастанию в холодных условиях, толерантность к дефициту воды), например, способом экспрессии или супрессии других генов.
Клетки трансгенного растения и трансгенные растения
[0040] Аспект изобретения включает клетки трансгенного растения, ткани трансгенного растения и трансгенные растения или семена, которые включают конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению. Дополнительный аспект по изобретению включает искусственные или рекомбинантные хромосомы растения, которые включают конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению. Подходящие способы трансформации клеток растения-хозяина для использования в данном изобретении включают фактически любой способ введения ДНК в клетку (например, если конструкция рекомбинантной ДНК стабильно интегрирована в хромосому растения) и хорошо известны данной области техники. Типичный и широко используемый способ введения конструкции рекомбинантной ДНК в растения представлен системой трансформации Agrobacterium, которая хорошо известна специалистам в данной области. Трансгенные растения могут быть регенерированы из клетки трансформированного растения способами культивации растительной клетки. Трансгенное растение, гомозиготное относительно трансгена, может быть получено половым скрещиванием (самоопылением) независимого сегреганта трансгенного растения, которое содержит одну экзогенную генную последовательность для самого себя, например, растение F0, для получения семян F1. Одна четвертая часть полученных семян F1 будет гомозиготна относительно трансгена. Растения, выращенные из пророщенного семени F1, могут быть тестированы на предмет гетерозиготности обычно с использованием анализа ОНП или анализа термальной амплификации, который позволяет различить гетерозиготы и гомозиготы (т.е. анализ зиготности).
[0041] Изобретение предоставляет трансгенное растение, имеющее в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, включая, без ограничения, помимо всего прочего, люцерну, хлопок, кукурузу, рапс, рис, сою и пшеницу. Изобретение также предоставляет клетки трансгенного растения, части растения и потомство такого трансгенного растения. В контексте данного изобретения «потомство» включает любое растение, семя, клетку растения и/или часть растения, полученные или регенерированные из растения, семени, клетки растения и/или части растения, которые включают конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению. Трансгенные растения, клетки, части и семена, полученные из таких растений, могут быть гомозиготными или гетерозиготными на предмет конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению.
[0042] Кроме того, данное изобретение включает варианты воплощения, в которых конструкция рекомбинантной ДНК находится в готовом продукте, полученном из трансгенного растения, семени или части растения по данному изобретению; такие готовые продукты включают, но не ограничиваются этим, собранные части растения, дробленные или цельные зерна или семена растения, или любой пищевой или непищевой продукт, включающий конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению.
Способы индуцирования мужской стерильности у трансгенных растений и получения гибридных семян
[0043] Другой аспект изобретения включает способ индуцирования мужской стерильности у трансгенного растения, включающий применение эффективного количества гербицида относительно трансгенного растения, включающего конструкцию рекомбинантной ДНК, которая включает кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, который придает трансгенному растению толерантность к гербициду, и функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей элемент мтс-миРНК, который придает трансгенному растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду, при этом применение гербицида проводится во время развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, что индуцирует мужскую стерильность у трансгенного растения.
[0044] В одном варианте воплощения изобретения трансгенное растение является растением кукурузы. В одном варианте воплощения изобретения применение гербицида предотвращает по меньшей мере осыпание пыльцы или выпячивание пыльников. В одном варианте воплощения изобретения развитие мужской репродуктивной ткани является стадией, выбранной из группы, состоящей из стадии развития растения кукурузы V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 и V14.
[0045] В одном варианте воплощения изобретения гербицид выбран из группы, состоящей из ингибиторов ацетил коэнзим A карбоксилазы (ACCase), ингибиторов ацетолактатсинтазы (ALS), ингибиторов фотосистемы II (PSII), ингибиторов протопорфириногеноксидазы (PPO), ингибиторов 4-гидроксифенил пируват диоксигеназы (HPPD), ингибиторов 5-энолипирувилшикимат 3-фосфатсинтазы (EPSPS), ингибиторов глутаминсинтетазы (GS) и синтетических ауксинов. В одном варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS.
[0046] Дополнительный аспект изобретения включает способ получения гибридных семян, включающий: (а) применение гербицида к трансгенному растению, включающему конструкцию рекомбинантной ДНК, которая включает кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, который придает трансгенному растению толерантность к гербициду, и функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей элемент мтс-миРНК, при этом применение гербицида проводится во время развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, что приводит к индуцированию мужской стерильности в трансгенном растении; (б) опыление трансгенного растения пыльцой второго растения и (в) сбор гибридных семян трансгенного растения. В одном варианте воплощения изобретения трансгенное растение является кукурузой. В одном варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS. В одном варианте воплощения изобретения глифосат применяют во время развития в эффективной дозе от примерно 0,125 фунтов кислоты в эквиваленте на акр до примерно 8 фунтов кислоты в эквиваленте на акр.
[0047] В другом аспекте изобретение включает гибридное семя, собранное у трансгенного растения с мужской стерилизацией, которое было опылено пыльцой второго растения, при этом мужское стерильное трансгенное растение включает конструкцию рекомбинантной ДНК, которая включает кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, который придает трансгенному растению толерантность к гербицидам, функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей элемент мтс-миРНК, и при этом у трансгенного растения была индуцирована мужская стерильность применением эффективного количества гербицида в течение развития мужской репродуктивной ткани трансгенного растения. В одном варианте воплощения изобретения гибридное семя является гибридным семенем трансгенной кукурузы. В одном варианте воплощения изобретения гербицид является глифосатом, а рекомбинантный белок является толерантным к глифосату EPSPS. В одном варианте воплощения изобретения глифосат применяют во время развития в эффективной дозе от примерно 0,125 фунтов кислоты в эквиваленте на акр до примерно 8 фунтов кислоты в эквиваленте на акр. В одном варианте воплощения изобретения применение гербицида предотвращает по меньшей мере осыпание пыльцы или выпячивание пыльников. В одном варианте воплощения изобретения развитие мужской репродуктивной ткани является стадией, выбранной из группы, состоящей из стадии развития растения кукурузы V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 и V14.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
[0048] Данный пример описывает идентификацию мтс-миРНК и элементов мтс-миРНК. Биоинформационный анализ данных секвенирования из нескольких библиотек малых РНК кукурузы идентифицировал группу малых РНК (мРНК), которые находились в избыточном количестве или специфически экспрессировались в метелках кукурузы. Относительное распространение таких мтс-миРНК в метелках кукурузы варьировало от примерно 50 до 631 транскрипта на четверть миллиона последовательностей, что является нормализованным количеством. Такие мРНК идентифицированы в качестве миРНК по причине их длины (18-26 нуклеотидов) и их вероятного происхождения от предшественника дсРНК. По причине своей схемы экспрессии миРНК, специфическую для мужской ткани, обозначают как «мтс-миРНК». В контексте данного изобретения «схема экспрессии» является любой схемой дифференциальной экспрессии ДНК, РНК или белка. Например, специфическая для метелки схема экспрессии обозначает специфическую или повышенную экспрессию ДНК, РНК или белка в ткани метелки и/или клетки. Примеры соответствующей последовательности ДНК для мтс-миРНК, обозначенные в настоящем описании как «последовательности мтс-миРНК», представлены в виде SEQ ID NO: 1-56 и 105-149.
[0049] Такие последовательности мтс-миРНК затем были сопоставлены с коллекциями последовательностей кДНК. Сравнение последовательности мтс-миРНК относительно коллекции генов кукурузы unigene (сборные последовательности кДНК) с использованием BLAST привело к удивительному результату о том, что большое количество мтс-миРНК было собрано в виде кластеров вместе и отмечались даже перекрывания в участке ДНК, находящемся в нескольких близкородственных, но при этом уникальных, последовательностях кДНК. В группе последовательностей кДНК все последовательности содержали такой участок, однако последовательность ДНК участка варьировала по причине различных комбинаций и расположений отдельных последовательностей мтс-миРНК и/или 1-3 нуклеотидных несоответствий отдельным последовательностям мтс-миРНК. Такой участок, определенный как имеющий по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК в окне нуклеотидной последовательности, обозначается в настоящем описании как «элемент мтс-миРНК». В различных вариантах воплощения изобретения окно нуклеотидной последовательности включает по меньшей мере примерно 20 смежных нуклеотидов (нт) (например, по меньшей мере 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нт), по меньшей мере примерно 25 нт, по меньшей мере примерно 30 нт, по меньшей мере примерно 40 нт, по меньшей мере примерно 50 нт, по меньшей мере примерно 100 нт или по меньшей мере примерно 150 нт. Примеры последовательности ДНК для элементов мтс-миРНК представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 57-94 и 96-104. Элемент мтс-миРНК может иметь более чем одну последовательность мтс-миРНК, например, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более пяти последовательностей мтс-миРНК в заданном окне нуклеотидной последовательности. Две или более последовательностей мтс-миРНК в заданном элементе мтс-миРНК могут перекрываться по причине того, что по меньшей мере часть их нуклеотидных последовательностей является идентичной (см. Таблицу 5, где представлены примеры мтс-миРНК с перекрывающимися нуклеотидными последовательностями).
[0050] Биоинформационный анализ показал, что множественные мтс-миРНК могут быть получены из одного и того же транскрипта РНК, например, транскрипта, полученного из одной из последовательностей кДНК, описанных выше как включающих элемент мтс-миРНК. Также было выявлено, что множество мтс-миРНК имеют 1-3 несоответствия при сравнении с элементами мтс-миРНК в группе близкородственных последовательностей кДНК. Считается, что это указывает на то, что такие мтс-миРНК получают из множественных близкородственных транскриптов, что приводит к получению большой близкородственной группы мтс-миРНК. Таким образом, транскрипт РНК, полученный из кДНК, включающей элемент мтс-миРНК (содержащий множество последовательностей мтс-миРНК), будет комплементарен и, следовательно, способен гибридизировать во множественные мтс-миРНК и/или их комплементы. Таким образом, встречающаяся в природе мтс-миРНК имеет последовательность РНК, которая является идеальным или почти идеальным комплементом последовательности мтс-миРНК (например, когда мтс-миРНК имеет последовательность РНК не более чем примерно с 1-3 несоответствиями относительно последовательности мтс-миРНК); в целом такая мтс-миРНК имеет последовательность РНК, являющуюся идеальным или почти идеальным комплементом к сегменту элемента мтс-миРНК.
[0051] Поиск подобия последовательностей мтс-миРНК относительно базы данных геномной ДНК кукурузы с использованием BLAST выявил множество локусов с подобием по существу относительно элемента мтс-миРНК. Такие локусы затем были проанализированы с использованием открытых рамок считывания (ORF), однако идентифицированные гипотетические полипептиды, как было определено, не имели гомологии по существу с любым известным белком. Биоинформационный анализ мтс-миРНК, приводящих к получению последовательностей кДНК, показал, что значительная гомологичность последовательностей на нуклеотидном уровне относительно любого известного гена растения отсутствует. Такие данные указывают на то, что мтс-миРНК может быть получена из любого такого локуса способом процессинга дсРНК, образованной между транскриптами с противоположной полярностью, или способом процессинга дсРНК от аберрантных транскриптов по причине РНК-зависимой активности РНК-полимеразы. Также возможно, что мтс-миРНК подвергается процессингу из внутренних вторичных структур дсРНК, которые могут быть образованы в некоторых транскриптах, приводящих к образованию мтс-миРНК.
[0052] Обратная транскрипция мтс-миРНК приводила к образованию последовательностей мтс-миРНК, которые были картированы в один из элементов мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87). Это представлено на Фигуре 1, где ось Х представляет расположение нуклеотидов в направлении от 5’ к 3’ слева направо вверху и справа налево внизу. Относительный избыток мтс-миРНК представлен в виде транскриптов на четверть миллиона последовательностей (tpq), отложенных на оси Y. Как это можно видеть из Фигуры 1, несколько мтс-миРНК (обведены кружком) широко представлены в специфичной для метелки библиотеке мРНК (ось Y). Прогнозируемые последовательности мтс-миРНК также неоднородно распределены среди элемента мтс-миРНК (ось X).
Пример 2
[0053] Данный пример показывает анализ мтс-миРНК эндогенной экспрессии в метелках. Нативные схемы экспрессии мтс-миРНК in planta были проанализированы с использованием нескольких различных способов. Такие анализы подтвердили, что мРНК, гибридизирующие в элементы мтс-миРНК, находятся в преобладающем количестве и/или специфически экспрессируются в метелках в зародышевой плазме кукурузы (т.е. мтс-миРНК находятся в избыточном количестве и/или специфически экспрессируются в метелках), и что в варианте воплощения изобретения мтс-миРНК находится в преобладающем количестве в и/или экспрессируется специфически в пыльцевом зерне на стадии развития пыльцы в виде одноядерной микроспоры.
[0054] Для доказательства накопления мтс-миРНК специфически в метелках in planta использовали три репрезентативные последовательности мтс-миРНК (SEQ ID NO: 26 (1372590), SEQ ID NO: 8 (648011), SEQ ID NO: 33 (410590)) для разработки зондов для низкомолекулярного (НМ) анализа нозерн-блоттингом с использованием мРНК, полученных из кукурузы или риса. Для таких экспериментов вся РНК была экстрагирована из ткани растения с использованием реагента TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA). РНК (7,5 мкг) из каждого образца была денатурирована при 95°C в течение 5 минут перед разделением на геле 17% PAGE, содержащем 7 M мочевины в 0,5X TBE буфере (Allen et al. (2004) Nature Genetics 36:1282-1290). После электрофореза гель был подвергнут блоттингу на мембране Nytran SuPerCharge® (Whatman-Schleicher & Schuell, Florham Park, NJ) с использованием системы для полусухого электрофоретического переноса клеток Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) в соответствии с протоколом производителя. Полученный блот был перекрестным способом соединен при 1200 микроджоулей/см2 × 100 в Stratalinker® 1800 (Stratagene, Cedar Creek, TX). Для приготовления зондов матрица с зондом РНК была получена способом ПЦР и содержала промотор Т7 на одном конце и одну из последовательностей малых РНК на противоположном конце. Последовательности мРНК, включенные в матрицу зонда РНК, включали: [1] Gma-miR159a (miRBase.org номер доступа MI0001773), которую использовали в качестве контроля для загрузки, [2] sR1372590 (SEQ ID NO: 26), [3] sR648011 (SEQ ID NO: 8) и [4] sR410590 (SEQ ID NO: 33). Зонды РНК были транскрибированы с использованием РНК полимеразы Т7 и мечены дигоксигенином (DIG) с использованием набора DIG Northern Starter (Roche, Indianapolis, IN) в соответствии с протоколом производителя. Гибридизацию проводили со 100 нг меченого DIG зонда в буфере гибридизации PerfectHyb™ (Sigma, St. Louis, MO) при 38°C в течение 16 часов. Определение проводили с использованием набора DIG Northern Starter, в соответствии с протоколом производителя, перед воздействием на пленку Kodak ® Biomax™ XAR (Sigma, St. Louis, MO). Протестированные образцы включали все или подгруппу из следующего: лист кукурузы от растений, выращенных при стрессовом воздействии азотом; росток, корень или эндосперм кукурузы от растений, выращенных при стрессовом воздействии холодом; лист и корень кукурузы от растений, выращенных при стрессовом воздействии сухости; кукурузные рыльца; молодые метелки кукурузы; зрелые метелки кукурузы; неопыленные ядра кукурузы; эмбрион кукурузы - 24 дня после опыления (ДПО); ядра кукурузы - 22 ДПО; зрелые ядра кукурузы; эмбрион кукурузы - зрелые (сухие) ядра; эндосперм кукурузы - сухой; рисовое зерно и рисовые проростки. Результаты, полученные с помощью НМ нозерн-блоттинга с использованием по меньшей мере трех разных зондов мтс-миРНК (sR1372590, sR648011 и sR410590), выявили сигнал только в рядах, соответствующих молодой метелке и зрелой метелке, что подтверждает биоинформационный анализ и заключение о том, что экспрессия мтс-миРНК сильно повышена или специфична для ткани метелки.
[0055] Тканевая специфичность и накопление мРНК, которые могут распознавать элемент мтс-миРНК, были оценены с использованием широкого спектра зародышевой плазмы и НМ нозерн-блоттинга. Для этого анализа был отобран элемент мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87, содержащий множественные последовательности мтс-миРНК). Такой элемент мтс-миРНК включает три последовательности мтс-миРНК, используемые для разработки зондов миРНК sR1372590, sR648011 и sR410590, что позволяет использовать эти зонды для НМ нозерн-блоттинга образцов зародышевой плазмы кукурузы. Для этих экспериментов была получена РНК от двадцати различных инбредных линий кукурузы с разным генетическим фоном, например, с относительной зрелостью, варьирующей от 83 до 120 (таблица 1). Для трех таких инбредных линий (91DUA6, 01DKD2 и LH244) была собрана ткань из молодой метелки, старой метелки, листка, початка и корня. В таблице 1 представлены соответствующие стадии V и размер метелки при сборе молодой метелки и старой метелки. Вся РНК была экстрагирована с использованием раствора TRIzol®. НМ РНК была выделена с использованием набора для выделения миРНК mirVana™ (№ по каталогу AM1560, Ambion, Austin, TX). НМ нозерн-блоттинг был проведен с использованием акриламидного геля Bio-Rad Criterion™ Precast 15% TBE-мочевина (№ по каталогу 345-0092, BioRad, Hercules, CA). Гель был подвергнут блоттингу на положительно заряженной мембране (№ по каталогу 11209272, Roche Applied Systems, Mannheim, Germany). Зонды были помечены (1) 32-P для случайного примирования или (2) DIG ДНК с использованием набора для мечения Roche PCR, или (3) зондом DIG РНК, как это описано выше. Все зонды, используемые для зондирования нозерн-блотов, были обратно комплементарны эндогенному транскрипту или последовательности кДНК элемента мтс-миРНК. Присутствие мРНК, которая гибридизировала в трансгенный элемент мтс-миРНК, было специфическим для метелки; сигнала для листа, початка или корня для любого из трех инбредных генотипов кукурузы 91DUA6, 01DKD2 и LH244 определено не было (фиг.2).
[0056] Для определения временной схемы экспрессии во время развития мРНК метелки, которая смогла бы распознавать элемент мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87), был проведен НМ нозерн-блоттинг. РНК была получена из молодых и старых метелок от различных инбредных линий кукурузы, см. Таблицу 1. Получение РНК и способ НМ нозерн-блоттинга проводили по существу, как это описано выше.
| Таблица 1 | |||||
| Инбредная зародышевая плазма, показатель зрелости и стадия развития метелки | |||||
| Молодая метелка | Старая метелка | ||||
| Инбред | Показатель зрелости | Стадия | Размер метелки (дюймы) |
Стадия | Размер метелки (дюймы) |
| C3SUD402 | 108 | V9 | 5 | V12 | 10 |
| HIQA202 | 113 | V9-10 | 4,5 | V13 | 13 |
| BEBE788 | 83 | V10-11 | 10 | V13 | 7,5 |
| BIQA207 | 103 | V10 | 7 | V11 | 9,5 |
| DIDA404 | 112 | V10 | 2,5-3 | V11 | 9,5 |
| 5DA92 | 107 | V10-11 | 5,7 | V12 | 11 |
| DIDA406 | 109 | V10 | 6,5 | V12 | 9 |
| 80DJD5 | 114 | V10 | 6,5 | V11 | 10 |
| JEDO115 | 120 | V9 | 2,5 | V11-12 | 10 |
| FIDA240 | 116 | V9-10 | 2,5 | V12 | 11 |
| BIQA347 | 99 | V9-10 | 3,5 | V11-12 | 10,5-11 |
| HOQA203 | 105 | V10-11 | 5,5 | V12-13 | 11 |
| 91DUA6 | 90 | V10-11 | 10 | V12-13 | 10 |
| BIDA345 | 95 | V10 | 5 | V12-13 | 10 |
| 01DKD2 | 111 | V9-10 | 5 | V13 | 10,5-11 |
| DIDA403 | 108 | V10 | 2,5-3 | V12 | 10,5-11 |
| 64DJD1 | 105 | V9-10 | 2,5-3 | V12 | 10,5-11 |
| DIQA423 | 108 | V9-10 | 3 | V12 | 9,5 |
| BIQA208 | 102 | V10 | 5,5 | V13 | 9,5 |
| LH244 | 111 | V9-10 | 1-2,5 | V13 | 10 |
[0057] Как это можно видеть на фиг.4, меченый DIG зонд РНК, соответствующий обратному комплементу элемента мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87), гибридизировал в мРНК как в молодой, так и в старой метелке, за исключением того, что длина молодой метелки была от 2,5 дюймов до 3 дюймов: ряды 5 (инбред DIDA404), 9 (инбред JEDO115), 10 (инбред FIDA240), 16 (инбред DIDA403), 17 (инбред 64DJD1), 18 (инбред DIQ423) и 20 (инбред LH244). Кроме того, этот эксперимент подтвердил отсутствие определения гибридизации мРНК в элемент мтс-миРНК из образцов листа (ряды 21 и 22) или початка (ряды 23 и 24) от инбредов BIQA208 и LH244. В целом эти данные указывают на то, что мРНК, гибридизирующие в элемент мтс-миРНК, специфически экспрессируются в метелке каждого тестированного инбредного генотипа, когда метелка превышает в длину примерно 3,5 дюймов.
[0058] Анализ гибридизации in situ проводился для изучения клеточно-специфической экспрессии последовательности мтс-миРНК (sR648011, SEQ ID NO: 8). В пыльниках кукурузы микроспоры вырабатываются посредством мейоза, и развиваются в зрелую пыльцу. Микроспорогенез кукурузы может быть четко разделен на следующие стадии: мейоз спорогенных клеток, высвобождение тетрад в виде свободных микроспор, митоз одноядерных микроспор с получением трехклеточной пыльцы и зрелые пыльцевые зерна. Для этих экспериментов использовали метелки кукурузы, собранные до периода цветения у растений кукурузы, выращенных в стандартных условиях в теплице. Зонды запертой нуклеиновой кислоты (LNA) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) использовали, как это указано ниже, при этом положение LNA указано символом «+». Антисмысловой зонд был разработан для определения мтс-миРНК для sR648011 (SEQ ID NO: 8) (5’-биотин-CAT+GCA+CTG+GTG+AGT+CAC+TGT-3’), в то время как смысловым зондом был обратный комплемент антисмыслового зонда (5’-биотин-ACA+GTG+ACT+CAC+CAG+TGC+ATG-3’) для использования в качестве отрицательного контроля. Зонды LNA позволяют проводить промывание в очень строгих условиях и, следовательно, обеспечивают высокоспецифичную гибридизацию (Válóczi et al., 2006; Nuovo et al., 2009). Все зонды были мечены биотином. Образцы метелки кукурузы были фиксированы в 4% параформальдегиде в 1×ФСБ при 4°C в течение 36 часов и затем дегидратированы при 4°C с использованием установленных серий этанол:H2O. Затем метелки были помещены в 75% EtOH и 25% Histoclear (National Diagnostics, Atlanta, GA) на время 1,5 ч, 50% EtOH и 50% Histoclear на время 1,5 ч, 25% EtOH и 75% Histoclear на время 1,5 ч и 100% Histoclear на время 3×1,5 ч, все при 25°C. Затем Histoclear был постепенно замещен расплавленным парапластом при 50°C, а метелки были перенесены в формы, и их хранили при 4°C перед разделением. Погруженные в парафин метелки были разделены на срезы микротомом толщиной 8 мкм. Серия срезов была получена из одних и тех же пыльников, и затем прилегающие срезы использовали для зондирования смысловым или антисмысловым зондом, соответственно. Прегибридизацию и гибридизацию проводили при 42°C с промыванием при 55°C. Определение меченых биотином зондов LNA, ренатурированных с транскриптом, проводилось с разведением от 1 до 400 антибиотин щелочной фосфатазы (ЩФ) и субстрата BM Purple AP (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Изображения были получены с помощью камеры на микроскопе Olympus (Center Valley, PA). Срезы от одних и тех же пыльников были поделены на две группы - одну использовали для антисмыслового зонда (фиг.5, слева), а вторую - для смыслового зонда (фиг.5, справа). Сигнал гибридизации (темно-фиолетовый) был определен только на срезах, которые были гибридизированы антисмысловым зондом, но не на срезах, которые были инкубированы со смысловым зондом (фиг.5). Сильный сигнал, полученный для антисмыслового зонда, указывает, что такая мтс-миРНК находится в чрезмерном количестве (активно экспрессируется) в пыльцевом зерне на стадии одноядерной микроспоры в ходе развития пыльцы.
Пример 3
[0059] Данный пример иллюстрирует конструкции для трансформации растения и получение трансгенного растения. Элемент мтс-миРНК был введен в 3’UTR кассеты трансгенной экспрессии и использовался для получения трансгенных растений кукурузы для исследования воздействия элемента на трансгенную экспрессию в трансгенных растениях. Элемент мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87) был вставлен в 3’UTR кассеты трансгенной экспрессии CP4-EPSPS для трансформации кукурузы. Такой элемент мтс-миРНК был выбран по причине обилия в нем последовательностей мтс-миРНК (фиг.3), включая последовательности трех зондов миРНК (sR1372590, sR648011 и sR410590), используемых для НМ нозерн-блоттинга в примере 2. Такой элемент мтс-миРНК также позволял протестировать эффект несоответствий мтс-миРНК. Протестированный в настоящем описании элемент мтс-миРНК (SEQ ID NO: 87) имеет одно нуклеотидное изменение (C∆T: AAGCTATTGATTCCCTAAGTGCCA) в сравнении с одной из исходных последовательностей мтс-миРНК (SEQ ID NO: 33, использовали для разработки зонда sR410590). Элемент мтс-миРНК был вставлен в трансгенную кассету в обратной комплементарной ориентации относительно своего положения в эндогенной кДНК, однако считается, что элемент функционирует подобным образом в обоих направлениях, поскольку специфичные для метелки молекулы миРНК, комплементарные любой цепи элемента мтс-миРНК, могут быть обнаружены в метелке кукурузы (фиг.1 и 3).
[0060] Было сконструировано несколько кассет экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК (таблица 2), которые использовали для трансформации растения кукурузы. В кассетах экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК тестировали различные комбинации элементов экспрессии. Элементы экспрессии, такие как промоторы, лидеры, интроны, транзитные пептиды хлоропластов и 3’UTR, необходимые для эффективной и стабильной экспрессии трансгена, хорошо известны в данной области техники. Кассеты экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК были разработаны для включения одного из двух отдельных промоторов; функциональной связи с ДНК одного из двух лидеров; функциональной связи с ДНК одного из двух интронов; функциональной связи с одной из двух молекул ДНК, кодирующих один и тот же транзитный пептид хлоропластов (CTP); функциональной связи с молекулой ДНК, полученной из гена aroA от Agrobacterium sp. штамма CP4 и кодирующей белок CP4-EPSPS; функциональной связи с ДНК, кодирующей элемент мтс-миРНК; функциональной связи с 3’UTR одной из двух молекул ДНК. Конструкция 4 содержала ген CP4-EPSPS дикого типа, а все другие векторы содержали версию гена CP4-EPSPS, оптимизированного растительным кодоном. Конструкции 3, 5 и 6 (таблица 2) были разработаны для определения того, будет ли элемент мтс-миРНК, включенный в 3’-UTR, приводить к получению растений со специфичной чувствительностью метелок к глифосату и вегетативной толерантностью к глифосату. Конструкции 4 и 7 являются контрольными конструкциями без элемента мтс-миРНК.
| Таблица 2 | |||||||
| Конструкции для трансформации растений | |||||||
| Конст-рукция | Промотор | Лидер | Интрон | CTP | Транс-ген | мтс-миРНК | 3’UTR |
| 3 | A | A | A | A | CP4 | SEQ ID NO: 87 | A |
| 4 | A | A | A | A | CP4 | ** | A |
| 5 | B | B | B | B | CP4 | SEQ ID NO: 87 | A |
| 6 | B | B | B | B | CP4 | SEQ ID NO: 87 | B |
| 7 | B | B | B | B | CP4 | ** | A |
[0061] Трансгенные растения кукурузы, трансформированные каждой из пяти кассет экспрессии, были получены с использованием хорошо известных способов. Вкратце, клетки кукурузы были трансформированы Agrobacterium-опосредованной трансформацией каждой из конструкций, перечисленных в таблице 2 (индивидуально), и регенерированы в интактные растения кукурузы. Отдельные растения, характеризовавшиеся целостностью кассеты трансгенной экспрессии и резистентностью к глифосату, были отобраны из популяции растений. Укоренившиеся растения с нормальными фенотипическими характеристиками были отобраны и перенесены на почву для роста и дальнейшей оценки. Растения R0 были перенесены на почву для роста, орошены 0,75 фунта/акр глифосатом на стадии V3-V4, затем 0,75 фунта/акр глифосатом на стадии V7-V9 и затем опылены перекрестным образом пыльцой нетрансгенных растений кукурузы из одинаковой зародышевой плазмы (для конструкций 3, 5 и 6 явлений) или самоопылены (для конструкций 4 и 7 явлений) с получением семян R1. Затем растения были отобраны комбинацией аналитических способов, включая TaqMan, анализ ПЦР и вегетативную толерантность к распылению гербицидов и пониженному (требуемому) показателю мужской фертильности после распыления гербицида (глифосата).
Пример 4
[0062] Этот пример демонстрирует способы анализа трансгенных растений в теплице. Трансгенные растения, трансформированные кассетой экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК, были проанализированы на предмет вегетативной толерантности к глифосату и мужской фертильности. Было выявлено, что трансгенные растения, полученные из конструкций, содержащих кассеты экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК, обладают вегетативной толерантностью к глифосату и индуцированной мужской стерильностью при позднем применении глифосата.
[0063] Растения R0 были выращены в двух повторностях в теплице, и не были обработаны или были обработаны глифосатом 0,75 фунта/акр на стадии V6 (ранней), а затем глифосатом 0,75 фунта/акр на стадии V9 (поздней) (Фигура 7 и Таблица 3). Исследуемые явления R0 были явлениями с множественными копиями. Все растения R0, которые не были обработаны, имели нормальное выпячивание пыльников и полностью фертильную пыльцу, как это определено окрашиванием по Alexander. Все растения R0, которые были обработаны, имели вегетативную толерантность к глифосату. Растения R0, полученные из конструкций 4 и 7, которые не содержали элемента мтс-миРНК, не обладали чувствительностью метелки к глифосату или индуцированной мужской стерильностью. Растения R0, полученные из конструкций 3, 5 и 6, которые содержали элемент мтс-миРНК, обладали чувствительностью метелок к глифосату и индуцированной мужской стерильностью; такие растения не имели или имели всего лишь несколько выпячиваний пыльников, и >99% пыльцы было нежизнеспособной, как это определено окрашиванием по Alexander.
| Таблица 3 | ||
| Данные обработки глифосатом | ||
| Конструкция | Ранняя обработка глифосатом Вегетативная толерантность |
Поздняя обработка глифосатом Индуцированная мужская стерильность |
| 3 | Да | Да |
| 4 | Да | Нет |
| 5 | Да | Да |
| 6 | Да | Да |
| 7 | Да | Нет |
[0064] Такие наблюдения показали, что присутствие элемента мтс-миРНК в 3’UTR трансгенной кассеты приводило к сайленсингу трансгена, специфичному для метелки. Специфичная для метелки потеря транскрипта иРНК, выработанного кассетой экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК, привела к получению метелок, которые были чувствительны к глифосату, к получению растения с индуцированной мужской стерильностью, в то время как другие ткани растения были толерантны к глифосату, что привело к развитию вегетативной толерантности к глифосату и хорошей женской фертильности.
[0065] Затем использовали иммунолокализацию для измерения белка CP4-EPSPS в тканях трансгенных растений. От растений, трансформированных конструкцией 3 или конструкцией 4, а также от нетрансгенной кукурузы (LH198) были получены метелки. Растения были выращены в теплице с 14 часами света при 26,67°С(80°F) и 8 часами темноты при 21,11°С(70°F). В каждый горшок было посажено по одному семени. Горшки были случайным образом расположены на полу теплицы. Растения поливали при необходимости и удобряли 20-20-20 смесью азота, калия и фосфора, соответственно. Растения с конструкцией 3 или конструкцией 4 были обработаны распылением глифосатом в количестве 0,75 фунта/акр на стадии V2 для подтверждения вегетативной толерантности к глифосату. Молодые метелки были собраны на стадиях V10-V11 для получения тканей пыльников на стадиях микроспоры материнской клетки и свободной микроспоры; зрелые метелки были собраны на стадии Т7, за 1-2 дня перед опадением пыльцы, для получения тканей пыльников с полностью развившейся пыльцой. Пыльники были извлечены из вторичного колоска метелки с использованием препаровального пинцета, и непосредственно зафиксированы в 3,7% формальдегиде в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при мягком вакууме. После промывания в ФСБ ткани были помещены в заделывающую среду и немедленно заморожены. Замороженные блоки тканей хранили при минус 80°C до момента получения срезов при минус 20°C с использованием микротома, после чего срезы были собраны на заряженных покровных стеклах.
[0066] Срезы тканей были блокированы блокирующим агентом (10% нормальная сыворотка козы, 5% бычий сывороточный альбумин, 0,1% Тритон Х-100 в ФСБ) в течение 2 часов. Срезы были инкубированы с антителом к CP4-EPSPS (1/500 в ФСБ). После трехкратного промывания срезов в ФСБ срезы тканей были инкубированы с вторичным антителом козы к IgG мыши, конъюгированным с флуорофором Alexa 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon). Для отрицательного контроля инкубацию антитела CP4-EPSPS не проводили. В качестве положительного контроля антитело к α-тубулину (Sigma, St. Louis, MO), белку цитоскелета, экспрессируемому в большинстве типов клеток, было замещено антителом CP4-EPSPS на отдельных срезах. Первичные и вторичные антитела были инкубированы при комнатной температуре в течение 2-4 часов и затем дополнительно инкубированы в течение ночи при 4°C. После промывания ткани были визуализированы лазерным сканирующим конфокальным микроскопом Zeiss (ЛСМ) 510 META с использованием лазера 488 нм для возбуждения и 500-550 нм для набора эмиссионных фильтров. Такой же самый параметр визуализации применяли для образцов, включая контроль. Флуоресцентные изображения и изображения в ярком поле были сканированы с каждого среза, и объединены с использованием программного обеспечения ЛСМ, впоследствии для получения структурной информации. Сильный сигнал был получен для антитела к CP4-EPSPS в ткани филаментов (фиг.6А, короткая стрелка) и пыльцы (фиг.6А, длинная стрелка) в зрелой метелке от растений, полученных с конструкцией 4 (фиг.6А) с отсутствием элемента мтс-миРНК. Растение с фиг.6А является гемизиготным на предмет кассеты трансгена, таким образом, только примерно 50% пыльцы обладало положительным сигналом CP4-EPSPS. В отличие от этого, сильный сигнал был получен для антитела к CP4-EPSPS только в ткани филаментов (фиг.6В, короткая стрелка), а для пыльцы сигнал отсутствовал (фиг.6В, длинная стрелка) в зрелой метелке от растений, полученных с конструкцией 3, содержащей элемент мтс-миРНК (фиг.6В). Антитело положительного контроля (антитело к альфа-тубулину) характеризовалось сигналом пыльцы в зрелой метелке от растений, полученных с конструкцией 4 или конструкцией 3. Данные для отрицательных контролей характеризовались ожидаемым отсутствием сигнала. Данные для стандартного нетрансгенного контроля характеризовались ожидаемым отсутствием сигнала от окрашивания антителом к CP4-EPSPS и положительным сигналом при окрашивании с антителом к альфа-тубулину. Эти данные указывают на то, что в пыльце или не транслируются, или транслируются всего несколько транскриптов из кассеты трансформации, содержащей элемент мтс-миРНК, однако транскрипт был транслирован в вегетативную ткань филамента. Потеря экспрессии белка CP4-EPSPS в пыльце коррелирует с наблюдаемой и специфичной для метелки чувствительностью к глифосату у растений, полученных из конструкции 3.
Пример 5
[0067] Этот пример иллюстрирует полевое исследование трансгенного растения на предмет мужской фертильности или стерильности. В полевых условиях было исследовано тринадцать подтвержденных уникальных явлений трансгенных растений R1-R3, полученных способом трансформации кассетой экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК (конструкция 3), на предмет эффективности кассеты экспрессии. В первый год тринадцать явлений были тестированы при расположении на одном поле. Во второй год восемь явлений были тестированы при расположении в четырех местах на поле. В третий год четыре явления были тестированы при расположении в четырех местах на поле. В течение трех лет полевых исследований средний показатель мужской фертильности (ПМФ) для явлений, полученных из конструкции 3, был приблизительно равен или ниже ПМФ 2, что считается промышленным стандартом мужской стерильности.
[0068] Данные для одногодичных полевых исследований эффективности представлены на фиг.8 со средним показателем ПМФ, полученным при трех различных режимах обработки глифосатом распылением, представленных на графике (фиг.8А) для NK603 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза), MON87427 (CP4-EPSPS трансгенная кукуруза с индуцированной глифосатом мужской стерильностью) и двух явлений из конструкции 3. Фотографии метелок растений, выращенных во время данного отдельного полевого исследования эффективности, иллюстрируют фертильную метелку во время обработки растений распылением глифосатом 0,75 фунта/акр только на стадии V3 (фиг.8В); и стерильную метелку (отсутствие или минимальное выпячивание пыльников) на растениях, обработанных глифосатом распылением 0,75 фунта/акр на стадии V3, затем 0,75 фунта/акр на стадии V8, после чего 0,75 фунта/акр на стадии V10 (фиг.8С). Для такого полевого исследования режимы распыления были следующими: обработка 1 состояла из 0,75 фунта/акр глифосата на стадии V3 (борьба с сорняками); обработка 2 состояла из 0,75 фунта/акр глифосата на стадии V3 (борьба с сорняками), затем 0,75 фунта/акр на стадии V8, затем 0,75 фунта/акр на стадии V10; обработка 3 состояла из 0,75 фунта/акр глифосата на стадии V3 (борьба с сорняками), затем 1,25 фунта/акр на стадии V8, затем 1,25 фунта/акр на стадии V10. Последние две обработки (т.е. на стадиях V8 и V10) обозначаются как обработки для получения стерильности. Эти результаты указывают, что только с обработкой глифосатом распылением 1 для борьбы с сорняками все растения (NK603, MON87427 и явления конструкции 3) имели мужскую фертильность. При обработке глифосатом распылением 2 для получения стерильности растения NK603 имели ПМФ=5, MON87427 были стерильными с ПМФ=2, и явления 2 и 3 конструкции 3 имели частичную мужскую фертильность с ПМФ<3. При обработке глифосатом распылением 3 для получения стерильности растения NK603 имели ПМФ=5, MON87427 имели мужскую стерильность с ПМФ<2, и явления 2 и 3 конструкции 3 имели мужскую стерильность с ПМФ около или ниже значения 2.
[0069] Несмотря на то, что среднее значение ПМФ было примерно или на уровне 2, выпячивание пыльников отмечалось в явлениях конструкции 3 при обработке глифосатом при S90+3 и S90+6 (фиг.9). Для таких данных четыре отдельных явления конструкции 3 были сопоставлены с растениями MON87427 и NK603 при двух режимах обработки распылением глифосатом: обработка 2 состояла из 1,5 фунта/акр глифосата на стадиях V2/V3 (борьба с сорняками), затем 0,75 фунта/акр глифосата на стадии единиц степени роста (ЕСР) 875 (~V8), затем 0,75 фунта/акр глифосата на стадии ЕСР 1025 (~V10), и обработка 3 состояла из 1,5 фунта/акр глифосата на стадиях V2/V3 (борьба с сорняками), затем 1,25 фунта/акр глифосата на стадии ЕСР 875 (~V8), затем 1,25 фунта/акр глифосата на стадии ЕСР 1025 (~V10). Количество растений на делянку (68-74 растения/делянку), демонстрирующих выпячивание пыльников, было подсчитано при S90, S90+3 и S90+6, при этом S90 является днем, когда 90% растений в поле выбросили рыльца; S90+3 является 3 днем после S90; и S90+6 является 6 днем после S90. Как это видно на Фигуре 9, при S90 отмечалось 70(±15) растений NK603 на делянку с выпячиванием пыльников при обоих режимах обработки глифосатом. В отличие от этого, для MON87427 и четырех явлений конструкции 3 отмечалось 1(±12) растение на делянку с выпячиванием пыльников при S90 для обоих режимов обработки глифосатом. При S90+3 и S90+6 отмечалось от 30(±12) до 70(±12) растений на делянку для четырех явлений конструкции 3 с выпячиванием пыльников при любом режиме обработки глифосатом, что примерно то же самое, что и для NK603. Выпячивание пыльников для явления MON87427 оставалось на уровне S90 для временных точек S90+3 и S90+6 и для каждого режима обработки глифосатом. Любое растение с ≥1 выпятившимся пыльником было рассчитано в качестве положительного на предмет выпячивания пыльников. Такое позднее выпячивание пыльников, т.е. S90+3 и S90+6, возникает во время развития кукурузы, когда отмечается максимальная высота роста метелки, и существует значительное расстояние для обеспечения машинного среза метелки с минимальным повреждением двух верхних листьев растения кукурузы, обеспечивая, таким образом, минимальное влияние на выход инбреда. Кроме того, выпячивание пыльников на стадии S90+3 или позднее считается как имеющее незначительное влияние на чистоту семян.
[0070] Анализ жизнеспособности пыльцы проводили для определения того, является ли низкий уровень (при этом стабильное выпячивание пыльников, наблюдаемое от S90+3 до S90+6) индикатором потенциальной поздней мужской фертильности. Фиг.10А и 10В отображают пример позднего выпячивания пыльников в метелке при явлении распыления при наличии стерильности и конструкции 3. Квадрат на фиг.10А является участком, увеличенным на фиг.10В. Пример позднего выпячивания пыльника обведен кружком на Фигуре 10В. Для определения жизнеспособности пыльцы пыльца была собрана от поздних выпятившихся пыльников, и окрашена способом Alexander, Фигура 10С. Пыльца также была собрана от не подвергшихся обработке распылением явлений конструкции 3 в тот же самый день, и окрашена в качестве сравнения способом Alexander, фиг.10D. Результаты такого окрашивания по Alexander показывают только нежизнеспособную пыльцу (полупрозрачный голубой цвет, неправильная форма пыльцевых зерен) от поздно выламывающихся пыльников подвергнутых обработке распылением явлений конструкции 3 (фиг.10С). Полностью жизнеспособная пыльца оказалась непрозрачной, темно-фиолетовой и сферической при окрашивании по Alexander (фиг.10D). Кроме окрашивания пыльцы, собранной от индивидуально выделенных поздно выламывающихся пыльников, мешки для опыления были помещены на некоторые подвергнутые обработке распылением явления конструкции 3 для определения опадения пыльцы. Какого-либо заметного опадения пыльцы в такие мешки для опыления не было определено, что не позволило получить какого-либо семени при использовании для перекрестного опыления початков. Этот результат указывает на отсутствие опадения пыльцы от поздних выпятившихся пыльников или на то, что любая опавшая пыльца является нежизнеспособной.
[0071] В целом эти данные указывают на то, что, несмотря на низкий уровень выпячивания пыльников при обработке распылением для получения стерильности для явлений конструкции 3, такие выпятившиеся пыльники не сбрасывали жизнеспособную пыльцу.
Пример 6
[0072] Этот пример отображает полевые исследования трансгенных растений, определявшие урожайность. Растения конструкции 3 R2 были тестированы на предмет инбредного и гибридного урожая. Для инбредного урожая растения R2 конструкции 3 были тестированы в четырех разных полевых местах на предмет урожайности, вегетативной толерантности к обработке глифосатом и мужской стерильности при обработке глифосатом. Для таких полевых исследований четыре явления конструкции 3 были высажены на делянки в количестве 68-74 растения/делянку. Обработка распылением была следующей: обработка 1 состояла из 1,5 фунта/акр глифосата на стадии V3 (борьба с сорняками); обработка 2 состояла из 1,5 фунта/акр глифосата на стадии V3, затем 0,75 фунта/акр на стадии V8, затем 0,75 фунта/акр на стадии V11; обработка 3 состояла из 1,5 фунта/акр глифосата на стадии V3, затем 1,25 фунта/акр на стадии V8, затем 1,25 фунта/акр на стадии V11. Как это можно видеть на фиг.11, явления конструкции 3 при всех трех режимах обработки глифосатом обладали хорошей вегетативной толерантностью (белые полосы), как это измерено по высоте растения, и хорошим инбредным урожаем (черные полосы), как это измерено в бушелях/акр. Эти же самые явления обладали полной мужской фертильностью при режиме обработки глифосатом для контроля сорняков (обработка 1), но имели мужскую стерильность с показателем ПМФ, равным или менее 2 (серые полосы) при режимах обработки глифосатом 2 или 3. Горизонтальные полосы на фиг.11 указывают промышленный стандарт стерильности, ПМФ 2. NK603 представлено для сравнения. Измерения урожайности инбредных семян для явлений конструкции 3 и NK603 с обработкой глифосатом распылением представлены в таблице 4, где MST = % влажности семян, TWT = натурная масса (показатель плотности, обычно в фунтах на бушель) и S50D является количеством дней до 50% выброса рыльцев из початков на делянке. Значительная разница (нр), измеренная для урожайности при любых из четырех явлений конструкции 3, исследуемых при обработке глифосатом 2 или 3 в сравнении с контролем NK603, отсутствовала.
| Таблица 4 | |||
| Измерения урожайности инбредных зерен | |||
| Сравнение режимов обработки 2 и 3 с режимом 1 | |||
| Явления | MST | TWT | S50D |
| cNK603 | нр | нр | нр |
| Явление 1 | нр | нр | нр |
| Явление 2 | нр | нр | нр |
| Явление 4 | нр | нр | нр |
| Явление 3 | нр | нр | нр |
[0073] Для урожайности гибридного зерна F1 явления R3 конструкции 3 были тестированы в четырех полевых местах. Для таких полевых исследований гибридного урожая нетрансгенные женские инбредные растения (Null), линия MON87427, и три явления конструкции 3, все с одинаковой генетической основой, были перекрестно опылены мужским тестером MON810/MON88017 для получения гибридных семян F1. Гибридные семена F1, полученные от каждого из таких скрещиваний, были высеяны на стандартных делянках в количестве 68-74 растений/делянку. Обработка распылением состояла из обработки 1 без распыления глифосатом; обработки 2 - 2,25 фунта/акр глифосата на стадии V4, затем 2,25 фунта/акр на стадии V7; обработки 3 - 2,25 фунта/акр глифосата на стадии V4, затем 2,25 фунта/акр на стадии V7, затем 2,25 фунта/акр на стадии V10. Растения F1 были открыто опылены для получения зерна F2, что является урожаем, измеренным в бушелях/акр. Все три явления конструкции 3 имели эквивалентную урожайность гибридных зерен F1 при всех режимах обработки глифосатом при сравнении с контрольными скрещиваниями NullxMON810/MON88017 и MON87427xMON810/MON88017 (фиг.12).
Пример 7
[0074] Данный пример иллюстрирует восстановление мужской фертильности в гибридных растениях F1. Гибридные растения F1, полученные от скрещивания явлений конструкции 3, в качестве женского партнера были тестированы на предмет мужской фертильности. Было проведено три различных скрещивания гибридов F1: нетрансгенное женское растение x MON88017 мужское растение; MON87427 женское растение x MON88017 мужское растение; и явление конструкции 3 женское растение x MON88017 мужское растение. Гибридные семена F1 были собраны от каждого из таких трех скрещиваний, высеяны в поле, и обработаны распылением глифосатом 1,125 фунта/акр на стадии V4, затем 1,125 фунта/акр на стадии V10. Мужскую фертильность в F1 оценивали по показателю мужской фертильности (ПМФ) и по определению жизнеспособности пыльцы при окрашивании по Alexander. Для каждого из таких скрещиваний ПМФ гибридных растений F1 составил 5 или отмечалась полная фертильность. Окрашивание жизнеспособной пыльцы по Alexander выявило 50% жизнеспособной пыльцы, произведенной гибридом F1 при каждом скрещивании, как и ожидалось (Фигура 13). Эти данные указывают, что мужская фертильность может быть функционально восстановлена в гибридных растениях F1, полученных из трансгенных растений с индуцированной глифосатом мужской стерильностью, трансформированных кассетой экспрессии CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК.
Пример 8
[0075] Данный пример иллюстрирует вариантную и химерную конструкцию элемента мтс-миРНК. Отдельные мтс-миРНК были картированы на элемент мтс-миРНК, как это представлено на Фигуре 3; ось Х указывает на расположение нуклеотидов в направлении от 5’ к 3’ слева направо вверху и справа налево внизу, и ось Y указывает на относительное обилие мтс-миРНК, указанное в виде транскриптов на четверть миллиона последовательностей (tpq). Мтс-миРНК также были неоднородно распределены среди элемента мтс-миРНК (ось X).
[0076] Используя данную информацию, были получены варианты элемента мтс-миРНК и/или химерные варианты, полученные с использованием одного или более элементов мтс-миРНК, для содержания большего количества (или меньшего) всех последовательностей мтс-миРНК (необязательно или альтернативно одну или более последовательностей мтс-миРНК добавляют или удаляют), что приводит к большему (или меньшему) сайленсингу функционально связанной кодирующей белок последовательности. Такие варианты или химерные элементы мтс-миРНК пригодны для повышения или снижения избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения.
[0077] Примеры вариантов и химер элементов мтс-миРНК были построены с использованием фрагментов SEQ ID NO: 87. Первый вариант (SEQ ID NO: 88) был построен с использованием фрагмента из 104 нуклеотидов от 5’-конца SEQ ID NO: 87. Второй вариант (SEQ ID NO: 89) был построен с использованием фрагмента из 80 нуклеотидов от 3’-половины SEQ ID NO: 87. Химерные элементы мтс-миРНК были построены путем соединения одного фрагмента (SEQ ID NO: 88) с другим фрагментом (SEQ ID NO: 89) с образованием новых химерных элементов мтс-миРНК (SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 91). Дополнительные химерные элементы мтс-миРНК были построены путем соединения трех отдельных мтс-миРНК, содержащихся в SEQ ID NO: 87: первая химера (SEQ ID NO: 92) была построена соединением последовательностей мтс-миРНК SEQ ID NO: 26, 27 и 8; вторая химера (SEQ ID NO: 93) была построена соединением последовательностей мтс-миРНК SEQ ID NO: 10, 33 и 5; третья химера (SEQ ID NO: 94) была построена соединением последовательностей мтс-миРНК SEQ ID NO: 26, 10 и 33. Такие варианты и химеры могут быть функционально связаны с кодирующими белок последовательностями для получения конструкций рекомбинантной ДНК (см. фиг.14), которые могут быть тестированы в растениях и растительных клетках на предмет избирательной супрессии рекомбинантного белка, кодируемого кодирующей белок последовательностью в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения.
Пример 9
[0078] Данный пример иллюстрирует разработку вариантных и химерных элементов мтс-миРНК. Вариантные и химерные элементы мтс-миРНК были разработаны на основе 300-нуклеотидного (нт) элемента мтс-миРНК, имеющего SEQ ID NO: 81, который подобен 300-нуклеотидным элементам мтс-миРНК, имеющим SEQ ID NO: 82 и 87. Высококонсервативной консенсусной последовательностью для элементов мтс-миРНК SEQ ID NO: 81, 82 и 87 является SEQ ID NO: 96. В отдельности каждый из них также может быть пригодным в качестве элемента мтс-миРНК или в качестве основы для разработки вариантных или химерных элементов мтс-миРНК, например, путем отбора фрагментов элемента мтс-миРНК, идентифицированных из геномной последовательности или кДНК, таких как фрагментов, включающих по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, и комбинированием или соединением таких фрагментов.
[0079] Было отобрано два фрагмента в SEQ ID NO: 81; фрагмент A (SEQ ID NO: 97) содержал 104 смежных нуклеотида от 5’ участка (положения 1-104) SEQ ID NO: 81, а фрагмент B (SEQ ID NO: 98) содержал 80 смежных нуклеотидов от 3’ участка (положения 215-294) SEQ ID NO: 81; очевидно, что фрагмент A (SEQ ID NO: 97) или фрагмент B (SEQ ID NO: 98) по-отдельности являются элементами мтс-миРНК, содержащими по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК. Расположение фрагментов А и В (указано подчеркнутым текстом) представлено в следующей полной последовательности SEQ ID NO: 81, которая также указывает расположение последовательностей мтс-миРНК (указано курсивом; элементы, указанные курсивом, имеют более 18 смежных нуклеотидов и могут включать более чем одну перекрывающуюся последовательность мтс-миРНК), картированных для данного элемента мтс-миРНК:
GGACAACAAGCACCTTCTTGCCTTGCAAGGCCTCCCTTCCCTATGGTAGCCACTTGAGTGGATGACTTCACCTTAAAGCTATCGATTCCCTAAGTGCCAGACATAATAGGCTATACATTCTCTCTGGTGGCAACAATGAGTCATTTTGGTTGGTGTGGTAGTCTATTATTGAGTTTGTTTTGGCACCGTACTCCCATGGAGAGTACAAGACAAACTCTTCACCGTTGTAGTCGTTGATGGTATTGGTGGTGACGACATCCTTGGTGTGCATGCACTGGTGAGTCACTGTTGTACTCGGCG (SEQ ID NO: 81). Вариантные элементы мтс-миРНК были разработаны с использованием фрагментов «А» и «В», включая элемент мтс-миРНК «А+В» (SEQ ID NO: 99) и элемент мтс-миРНК «В+А» (SEQ ID NO: 100). Химерный элемент (SEQ ID NO: 101) был разработан для включения последовательностей мтс-миРНК (представлено выше курсивом в SEQ ID NO: 81), которые были картированы для элемента мтс-миРНК (SEQ ID NO: 81).
[0080] Подобным образом элемент мтс-миРНК из 251 нт в длину (SEQ ID NO: 102) и элемент мтс-миРНК из 121 нт в длину (SEQ ID NO: 103, фрагмент SEQ ID NO: 102, т.е. непрерывный элемент, расположенный в положениях нуклеотидов 47-167 последовательности SEQ ID NO: 102) были идентифицированы из геномной последовательности кукурузы (Zm_B73_CR10::Segment{75361491..75361742}) в качестве специфичных для метелки и соответствующих мтс-миРНК из молодой метелки (кукуруза LH244, библиотека 347; отдельно идентифицированные мтс-миРНК в некоторых случаях перекрывают большую часть своей последовательности и варьируют только в нескольких нуклеотидах; см. таблицу 5). Основываясь на SEQ ID NO: 102 и 103, был разработан химерный элемент мтс-миРНК (SEQ ID NO: 104).
| Таблица 5 | |||||||
| Картированные мтс-миРНК в SEQ ID NO: 103 | |||||||
| ID в библи-отеке | ID мРНК (специ-фично для каждой библио-теки) | Нача-ло на кар-те* | Ко-нец на кар-те* | Спи-раль | Экспрес-сия (tpq для lib9, необра-ботанные значения для других) | SEQ ID NO: | Последовательности (в качестве эквивалентна ДНК) |
| 347 | 710618 | 48 | 72 | -1 | 1 | 105 | ACCAAAGCCGCAATACTTAGCCCTA |
| 347 | 325 | 49 | 72 | -1 | 667 | 106 | ACCAAAGCCGCAATACTTAGCCCT |
| 9 | 75221 | 49 | 72 | -1 | 14,0375 | 107 | ACCAAAGCCGCAATACTTAGCCCT |
| 9 | 79587 | 49 | 70 | -1 | 1,7547 | 108 | CAAAGCCGCAATACTTAGCCCT |
| 347 | 1443964 | 49 | 70 | -1 | 1 | 109 | CAAAGCCGCAATACTTAGCCCT |
| 347 | 1798947 | 50 | 72 | -1 | 1 | 110 | ACCAAAGCCGCAATACTTAGCCC |
| 9 | 993198 | 51 | 74 | 1 | 5,264 | 111 | GGCTAAGTATTGCGGCTTTGGTAG |
| 346 | 2511625 | 56 | 79 | -1 | 1 | 112 | GACAACTACCAAAGCCGCAATACT |
| 347 | 1978935 | 62 | 84 | -1 | 1 | 113 | GATATGACAACTACCAAAGCCGC |
| 347 | 955660 | 63 | 86 | -1 | 1 | 114 | TAGATATGACAACTACCAAAGCCG |
| 347 | 1183103 | 64 | 84 | -1 | 1 | 115 | GATATGACAACTACCAAAGCC |
| 347 | 36752 | 73 | 96 | -1 | 12 | 116 | ATCAAAAGTTTAGATATGACAACT |
| 347 | 151532 | 75 | 98 | 1 | 4 | 117 | TTGTCATATCTAAACTTTTGATAG |
| 347 | 1372 | 97 | 120 | -1 | 197 | 118 | ACGAGTACTCTAACATATAAGACT |
| 347 | 316040 | 97 | 117 | -1 | 2 | 119 | AGTACTCTAACATATAAGACT |
| 347 | 1310155 | 98 | 121 | 1 | 1 | 120 | GTCTTATATGTTAGAGTACTCGTT |
| 347 | 26503 | 99 | 122 | 1 | 15 | 121 | TCTTATATGTTAGAGTACTCGTTA |
| 347 | 490490 | 109 | 132 | -1 | 2 | 122 | ATCAAAACCCTAACGAGTACTCTA |
| 347 | 1125767 | 114 | 137 | -1 | 1 | 123 | AGACAATCAAAACCCTAACGAGTA |
| 347 | 442804 | 115 | 138 | -1 | 2 | 124 | GAGACAATCAAAACCCTAACGAGT |
| 347 | 965720 | 118 | 141 | -1 | 1 | 125 | CAGGAGACAATCAAAACCCTAACG |
| 345 | 1549424 | 119 | 142 | -1 | 1 | 126 | ACAGGAGACAATCAAAACCCTAAC |
| 347 | 311196 | 120 | 143 | -1 | 2 | 127 | CACAGGAGACAATCAAAACCCTAA |
| 347 | 190 | 121 | 144 | -1 | 1018 | 128 | ACACAGGAGACAATCAAAACCCTA |
| 346 | 591709 | 121 | 144 | -1 | 2 | 129 | ACACAGGAGACAATCAAAACCCTA |
| 347 | 363241 | 121 | 143 | -1 | 2 | 130 | CACAGGAGACAATCAAAACCCTA |
| 347 | 1603891 | 121 | 141 | -1 | 1 | 131 | CAGGAGACAATCAAAACCCTA |
| 347 | 135176 | 122 | 144 | -1 | 4 | 132 | ACACAGGAGACAATCAAAACCCT |
| 347 | 48157 | 123 | 146 | 1 | 9 | 133 | GGGTTTTGATTGTCTCCTGTGTAT |
| 347 | 1866298 | 123 | 144 | -1 | 1 | 134 | ACACAGGAGACAATCAAAACCC |
| 347 | 1707358 | 124 | 147 | -1 | 1 | 135 | AATACACAGGAGACAATCAAAACC |
| 347 | 1788406 | 129 | 146 | 1 | 1 | 136 | TGATTGTCTCCTGTGTAT |
| 347 | 519539 | 130 | 153 | 1 | 2 | 137 | GATTGTCTCCTGTGTATTTACCCT |
| 347 | 383791 | 133 | 156 | -1 | 2 | 138 | GAGAGGGTAAATACACAGGAGACA |
| 347 | 273115 | 135 | 158 | 1 | 2 | 139 | TCTCCTGTGTATTTACCCTCTCGC |
| 345 | 1244664 | 135 | 157 | -1 | 1 | 140 | CGAGAGGGTAAATACACAGGAGA |
| 346 | 1460995 | 135 | 157 | -1 | 1 | 141 | CGAGAGGGTAAATACACAGGAGA |
| 347 | 697148 | 135 | 157 | 1 | 1 | 142 | TCTCCTGTGTATTTACCCTCTCG |
| 347 | 1716970 | 136 | 159 | 1 | 1 | 143 | CTCCTGTGTATTTACCCTCTCGCA |
| 347 | 839648 | 137 | 157 | -1 | 1 | 144 | CGAGAGGGTAAATACACAGGA |
| 347 | 8578 | 145 | 168 | -1 | 38 | 145 | TACAATAAGTGCGAGAGGGTAAAT |
| 9 | 519321 | 145 | 168 | -1 | 8,7734 | 146 | TACAATAAGTGCGAGAGGGTAAAT |
| 347 | 423280 | 145 | 167 | -1 | 2 | 147 | ACAATAAGTGCGAGAGGGTAAAT |
| 347 | 377787 | 146 | 168 | -1 | 2 | 148 | TACAATAAGTGCGAGAGGGTAAA |
| 9 | 444803 | 146 | 167 | -1 | 1,7547 | 149 | ACAATAAGTGCGAGAGGGTAAA |
| *Расположение нуклеотида в SEQ ID NO: 103 | |||||||
Пример 10
[0081] Данный пример иллюстрирует векторы и клетки трансгенного растения, ткани и растения, содержащие конструкции рекомбинантной ДНК, включающие кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, и элемент мтс-миРНК, функционально связанный с кодирующей белок последовательностью.
[0082] Вектор трансформации растения, включающий конструкцию рекомбинантной ДНК, используют для опосредованной Agrobacterium трансформации клеток кукурузы. Такой вектор трансформации включает ДНК для опосредованного Agrobacterium трансфера Т-ДНК, кассеты экспрессии (промотора, функционально связанного с интересующей последовательностью ДНК), кассеты избирательного маркера экспрессии (для удобного отбора трансформированных клеток кукурузы или растений) и ДНК для поддержания вектора в E. coli (например, происхождение последовательности репликации от E. coli). В одном варианте воплощения изобретения вектор трансформации включает кассету экспрессии, включающую конструкцию рекомбинантной ДНК, фланкированную правой и левой граничными последовательностями от Agrobacterium, при этом конструкция рекомбинантной ДНК включает трансген толерантности к гербицидам CR-AGRtu.aroA-CP4.nat (представлено как SEQ ID NO: 95) в качестве последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный белок. Трансген толерантности к гербицидам CR-AGRtu.aroA-CP4.nat функционально связан с мтс-миРНК, представленной как SEQ ID NO: 81 в качестве последовательности ДНК, кодирующей элемент мтс-миРНК.
[0083] Векторы трансформации для экспрессии различных конструкций рекомбинантной ДНК построены путем вставки полинуклеотида, включающего элемент мтс-миРНК (например, SEQ ID NO: 57-94 или 97-104), в вектор трансформации растения. Элемент мтс-миРНК вставлен в прилегающем положении к последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный белок, или в 3’-нетранслируемый участок последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный белок. Такие векторы трансформации растения пригодны для получения трансгенных растений, у которых может быть индуцирована мужская стерильность применением гербицида.
[0084] Способы трансформации растений хорошо известны в данной области техники. Например, растения кукурузы трансформируемой линии выращивают в теплице и початки собирают, когда эмбрион достигает в длину от 1,5 до 2,0 мм. Поверхность початков стерилизуют 80% этанолом, затем высушивают на воздухе. Незрелые эмбрионы удаляют из отдельных ядер стерилизованных початков. Перед инокуляцией клеток кукурузы отдельные культуры Agrobacterium, каждая из которых содержит вектор трансформации для экспрессии по меньшей мере одной конструкции рекомбинантной ДНК по данному изобретению, выращивают в течение ночи при комнатной температуре. Клеточные культуры незрелых эмбрионов кукурузы инокулируют Agrobacterium, инкубируют при комнатной температуре с Agrobacterium в течение 5-20 минут, сокультивируют с Agrobacterium в течение 1-3 дней при 23 градусах по Цельсию в темноте, переносят в избирательную среду, и культивируют в течение примерно 2 недель для развития эмбрионального каллюса. Эмбриональный каллюс переносят в питательную среду, содержащую 100 мг/л паромомицина, и субкультивируют при интервале примерно две недели. Множественные явления трансформированных клеток растений восстанавливаются спустя 6-8 недель после начала отбора.
[0085] Трансгенные растения кукурузы регенерируют из каллюса клетки трансгенного растения для каждого из множественных трансгенных явлений, возникших в результате трансформации и отбора, путем помещения трансгенного каллюса каждого явления в среду для инициации развития отростков и корней в проростках, которые переносят в горшковую почву для начального роста в камере роста при 26 градусах по Цельсию, затем роста на скамейке с водяной пылью перед пересадкой в горшки, где растения вырастают до зрелости. Регенерированные растения самоопыляются. Первое поколение семян («R1») собирают. Растения от семян R1 (растения «R2») используют для получения потомства.
Пример 11
[0086] Данный пример иллюстрирует способы выбора последовательностей мтс-миРНК и элементов мтс-миРНК для использования в конструкциях рекомбинантной ДНК, включающих кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, и элемент мтс-миРНК, функционально связанный с кодирующей белок последовательностью.
[0087] Один способ верификации эффективности элемента мтс-миРНК для избирательной супрессии экспрессии рекомбинантного белка в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения включает использование анализа протопласта, при этом протопласты растительных клеток сотрансформируют: (а) вектором, содержащим конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, и элемент мтс-миРНК, функционально связанный с кодирующей белок последовательностью; и (б) РНК, имеющими последовательности миРНК, соответствующие элементу(ам) мтс-миРНК (или, с другой стороны, последовательности(ям) мтс-миРНК)), при этом уровень экспрессии рекомбинантного белка ожидается обратно пропорциональным степени, до которой элемент мтс-миРНК расщепляется РНК.
[0088] Это иллюстрируется следующим неограничивающим примером. Анализ проводили на двух последовательностях мтс-миРНК (соответствующих двум миРНК, которые сильно экспрессируются в метелке кукурузы). Вкратце, протопласт листа кукурузы сотрансформируют с помощью: (а) плазмиды (3 микрограмма/320000 клеток), содержащей конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, кодирующую рекомбинантный белок (CP4-EPSPS, SEQ ID NO: 95), и элемент мтс-миРНК (SEQ ID NO: 81), и (б) первой дсРНК, в которой первая цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 150 в направлении от 5’ к 3’, а вторая цепь является комплементарной первой цепи, и второй дсРНК, в которой первая цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 151 в направлении от 5’ к 3’, а вторая цепь является комплементарной первой цепи. ДсРНК (от Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa) были протестированы в количестве 0, 5, 25 или 50 нанограмм/320000 клеток, при этом общее количество РНК, используемое в каждом анализе сотрансформации, было скорректировано с «наполняющей» РНК, состоящей любой из микроРНК395 (в качестве зрелого 21-mer, представленного как дсРНК) или тРНК дрожжей в количестве до 50 нанограмм/320000 клеток. Уровень белка CP4-EPSPS определяли ИФА и использовали для оценки способности тестированных дсРНК супрессировать экспрессию рекомбинантного белка. Результаты приводятся в таблице 6.
| Таблица 6 | |||
| Уровень белка CP4-EPSPS | |||
| Тестированная дсРНК | дсРНК (нг) | Наполняющая РНК (нг) | Белок CP4-EPSPS (нг/мг всего белка) |
| Нет (контроль) | 0 | 50 | 317 |
| SEQ ID NO: 150 | 5 | 45 | 294 |
| 25 | 25 | 167* | |
| 50 | 0 | 114* | |
| SEQ ID NO: 151 | 5 | 45 | 315 |
| 25 | 25 | 223* | |
| 50 | 0 | 91* | |
| *Статистическая значимость в сравнении с контролем | |||
[0089] Каждая из дсРНК (SEQ ID NO: 150 и 151) сильно супрессировала экспрессию CP4-EPSPS (указано по сниженному накоплению белка CP4-EPSPS) при сотрансформации с плазмидой, содержащей конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок CP4-EPSPS последовательность, и элемент мтс-миРНК. Наблюдаемая супрессия CP4-EPSPS была дозозависимой от количества дсРНК и независимой от типа наполняющей РНК. Супрессия CP4-EPSPS не отмечалась в контрольных образцах, сотрансформированных наполняющей РНК вместо исследуемых дсРНК.
Пример 12
[0090] Данный пример иллюстрирует конструкции рекомбинантной ДНК, векторы и трансформированные растения по изобретению. Векторы и способы трансформации, подобные описанным в примере 10, использовались для получения стабильно трансформированных растений кукурузы, содержащих в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей элемент мтс-миРНК. Исследовали шесть комбинаций схема конструкции/элемент мтс-миРНК (см. Таблицу 7). Растения были дважды обработаны распылением (на стадиях V5 и V8) 0,75 фунта/акр/A Roundup WeatherMAX®. Результаты приводятся в таблице 7. Для каждой комбинации схема конструкции/элемент мтс-миРНК примерно 20 растений было не обработано для сравнения с обработанными глифосатом растениями. У необработанных растений была собрана пыльца, и определена хорошая мужская фертильность (данные не указаны). Растения кукурузы, трансформированные конструкцией по схеме В, обладали более выраженной мужской стерильностью, чем растения кукурузы, трансформированные конструкцией по схеме А. Схемы конструкций (от 5’ к 3’, слева направо) были представлены: конструкция A является промотор A/интрон A/транзитный пептид A/CP4-EPSPS (SEQ ID NO: 95)/элемент мтс-миРНК/3’UTR, и конструкция B является промотор B/интрон B/транзитный пептид B/CP4-EPSPS/элемент мтс-миРНК/3’UTR. Как указано ниже, «ни» обозначает «не измерено». Шкала показателя мужской фертильности (ПМФ) следующая: 5 = образование пыльника нормальное, объем пыльцы такой же, как и на необработанных делянках, пыльца может осыпаться или не осыпаться; 4 = образование пыльника нормальное на 50%, но осыпание пыльцы слабое или не осыпается достаточное количество пыльцы; 3 = метелки выглядят нормальными, но отмечается спорадическое выпячивание пыльников (>10 пыльников на метелку), осыпается незначительно пыльцы или пыльца не осыпается; 2,5 = пыльца не осыпается, количество пыльников значительно уменьшено (<10 пыльников на метелку) или появляются слишком поздно (1 неделя) относительно окончания образования рылец; 2 = пыльца не осыпается, пыльников нет или они появляются слишком поздно (1 неделя) относительно окончания образования рылец; и 1 = пыльца не осыпается, метелки имеют аномально утонченный фенотип или образование пыльников замедлено на две или более недель после образования рылец. S90 представлена тогда, когда 90% растений имеют рыльца, готовые для опыления, и S90+3 представлена 3 днями спустя после S90.
| Таблица 7 | |||||
| Данные распыления схема конструкции/элемент мтс-миРНК | |||||
| Схема конструкции* | SEQ ID NO элемента мтс-миРНК: | Вегетативное повреждение | Опадание пыльцы при S90 | ПМФ при S90 до S90+2 | % аномаль-ной пыльцы |
| A | 97 | Нет | Нет | 5 | 100% |
| A | 97 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| A | 97 | Нет | Нет | 2 | 100% |
| A | 98 | Нет | Да | 5 | ни |
| A | 98 | Нет | Нет | 3 | 60% |
| A | 98 | Нет | Нет | 5 | 70% |
| A | 98 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| A | 104 | Нет | Нет | 4 | ни |
| A | 104 | Нет | Нет | 2 | 50% |
| A | 104 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| B | 101 | Нет | Нет | 2 | ни |
| B | 101 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| B | 101 | Нет | Нет | 4 | ни |
| B | 101 | Нет | Нет | 2 | ни |
| B | 101 | Нет | Нет | 2,5 | ни |
| B | 101 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| B | 101 | Нет | Нет | 2 | 100% |
| B | 101 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| B | 101 | Нет | Нет | 2,2 | ни |
| B | 101 | Нет | Нет | 3 | 20% |
| B | 101 | Нет | Нет | 2 | 100% |
| B | 97 | Нет | Нет | 2,5 | ни |
| B | 97 | Нет | Нет | 2 | 100% |
| B | 97 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| B | 97 | Нет | Нет | 4 | 100% |
| B | 97 | Нет | Нет | 2 | ни |
| B | 98 | Нет | Нет | 2 | 100% |
| B | 98 | Нет | Нет | 2,5 | 100% |
| B | 98 | Нет | Нет | 2 | =ни |
| B | 98 | Нет | Нет | 2,5 | =ни |
[0091] Все описанные в настоящем описании материалы и способы, и представленная формула изобретения могут быть получены и использоваться без излишних экспериментов в соответствии с представленными выше инструкциями. Представленные выше примеры включены для демонстрации вариантов воплощения изобретения. Специалистам в данной области станет очевидно, что описанные в примерах способы, представляющие способы изобретателей, широко используются на практике и, следовательно, могут рассматриваться в качестве неотъемлемых преимущественных вариантов воплощения изобретения на практике. Однако специалистам в данной области, в свете данного изобретения, должна быть очевидна возможность внесения множественных изменений в описанные специфические варианты воплощения изобретения, а также получение подобных или похожих результатов без отклонения от сущности и объема изобретения. Все такие подобные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, считаются включенными в сущность, объем и концепцию изобретения, как это определено прилагаемой формулой изобретения.
Claims (37)
1. Конструкция рекомбинантной ДНК для супрессии экспрессии кодирующей белок последовательности, придающей растению толерантность к гербициду, в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, экспрессирующего указанную кодирующую белок последовательность, придающую растению толерантность к гербициду, где указанная конструкция включает кодирующую белок последовательность, придающую растению толерантность к гербициду, функционально связанную с последовательностью ДНК, включающей специфический для мужской ткани элемент миРНК (мтс-миРНК), имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-94 и 96-149, где указанный элемент мтс-миРНК является гетерологичным по отношению к указанной кодирующей белок последовательности, придающей растению толерантность к гербициду.
2. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что указанный элемент мтс-миРНК содержит одну последовательность мтс-миРНК.
3. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.2, отличающаяся тем, что указанная последовательность мтс-миРНК выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149.
4. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что указанный элемент мтс-миРНК выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104.
5. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что экспрессия указанной кодирующей белок последовательности в трансгенном растении придает указанному растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду.
6. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.5, отличающаяся тем, что указанная кодирующая белок последовательность кодирует толерантный к глифосату EPSPS.
7. Способ получения конструкции рекомбинантной ДНК по п.1, включающий идентификацию элемента мтс-миРНК, содержащего последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-94 и 96-149, и функциональное связывание такого указанного элемента мтс-миРНК с кодирующей белок последовательностью, где указанный элемент мтс-миРНК является гетерологичным по отношению к указанной кодирующей белок последовательности.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна последовательность мтс-миРНК является по меньшей мере последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149, или указанный элемент мтс-миРНК выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный элемент мтс-миРНК является специфичным для метелки.
10. Трансгенное растение, проявляющее супрессию экспрессии белка, имеющее в своем геноме конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1.
11. Семя трансгенного растения по п.10, проявляющее супрессию экспрессии белка, содержащее конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1.
12. Часть трансгенного растения по п.10, проявляющая супрессию экспрессии белка, содержащая конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, где частью растения является пыльца, корни, листья или метелки.
13. Трансгенное растение по п.10, отличающееся тем, что указанное трансгенное растение является однодольным растением.
14. Трансгенное растение по п.10, отличающееся тем, что указанное трансгенное растение является растением кукурузы.
15. Способ супрессии экспрессии кодирующей белок последовательности в мужской репродуктивной ткани трансгенного растения, включающий экспрессию в указанном трансгенном растении конструкции рекомбинантной ДНК по п.1.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная мужская репродуктивная ткань является метелкой растения кукурузы.
17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный элемент мтс-миРНК содержит три последовательности мтс-миРНК.
18. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный элемент мтс-миРНК включает по меньшей мере одну последовательность мтс-миРНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-56 и 105-149.
19. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный элемент мтс-миРНК выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-94 и 96-104.
20. Способ по п.15, отличающийся тем, что экспрессия указанной кодирующей белок последовательности в трансгенном растении придает указанному растению по меньшей мере вегетативную толерантность к гербициду.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что белок, кодируемый указанной последовательностью, является толерантным к глифосату EPSPS.
22. Способ индуцирования мужской стерильности в трансгенном растении, включающий применение эффективного количества гербицида к трансгенному растению, включающему конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, при этом указанное применение гербицида проводится во время развития мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, индуцируя тем самым, мужскую стерильность в указанном трансгенном растении.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное трансгенное растение является растением кукурузы.
24. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное применение гербицида предотвращает по меньшей мере осыпание пыльцы или выпячивание пыльника.
25. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное развитие мужской репродуктивной ткани является стадией, выбранной из группы, состоящей из стадии развития растения кукурузы V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 и V14.
26. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный гербицид выбран из группы, состоящей из ингибиторов ацетил коэнзим A карбоксилазы (ACCase), ингибиторов ацетолактатсинтазы (ALS), ингибиторов фотосистемы II (PSII), ингибиторов протопорфириногеноксидазы (PPO), ингибиторов 4-гидроксифенил пируват диоксигеназы (HPPD), ингибиторов 5-энолипирувилшикимат 3-фосфатсинтазы (EPSPS), ингибиторов глутаминсинтетазы (GS) и синтетических ауксинов.
27. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный гербицид является глифосатом, а белок, кодируемый указанной последовательностью, является толерантным к глифосату EPSPS.
28. Способ получения семян, содержащих конструкцию ДНК по п.1, включающий:
a. применение эффективного количества гербицида к трансгенному растению, включающему конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, при этом указанное применение гербицида проводится во время развития мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, индуцируя тем самым мужскую стерильность в указанном трансгенном растении;
б. оплодотворение указанного трансгенного растения пыльцой второго растения;
в. сбор семян от указанного трансгенного растения; и
г. обнаружение присутствия конструкции ДНК по п.1 в собранных семенах.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанное трансгенное растение является кукурузой.
30. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный гербицид является глифосатом, а белок, кодируемый указанной последовательностью, является толерантным к глифосату EPSPS.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный глифосат применяют во время указанного развития в эффективной дозе от примерно 0,125 фунтов кислоты в эквиваленте на акр до примерно 8 фунтов кислоты в эквиваленте на акр.
32. Семя, полученное способом по п.28, способное к воспроизведению растения, проявляющего подавленную экспрессию кодирующей белок последовательности в мужской репродуктивной ткани, и содержащее конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1.
33. Способ получения товарного продукта, включающий получение трансгенного растения, семени или части растения по пп.10, 11 или 12 или семени по п.32 и обработку указанных растений или семян, таким образом получая товарный продукт.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161504102P | 2011-07-01 | 2011-07-01 | |
| US61/504,102 | 2011-07-01 | ||
| PCT/US2012/045040 WO2013006472A1 (en) | 2011-07-01 | 2012-06-29 | Methods and compositions for selective regulation of protein expression |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014103436A RU2014103436A (ru) | 2015-08-10 |
| RU2667424C2 true RU2667424C2 (ru) | 2018-09-19 |
Family
ID=47392140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014103436A RU2667424C2 (ru) | 2011-07-01 | 2012-06-29 | Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US9139838B2 (ru) |
| EP (1) | EP2726493B1 (ru) |
| CN (1) | CN103635483B (ru) |
| AP (1) | AP2013007316A0 (ru) |
| AR (2) | AR088133A1 (ru) |
| BR (1) | BR112013033972B1 (ru) |
| CA (1) | CA2840646C (ru) |
| CL (2) | CL2013003776A1 (ru) |
| HU (1) | HUE051995T2 (ru) |
| MX (1) | MX354471B (ru) |
| PE (1) | PE20141518A1 (ru) |
| PH (1) | PH12013502605B1 (ru) |
| RS (1) | RS61292B1 (ru) |
| RU (1) | RU2667424C2 (ru) |
| UA (1) | UA121189C2 (ru) |
| UY (1) | UY34176A (ru) |
| WO (1) | WO2013006472A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201309287B (ru) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1551966B1 (en) | 2002-07-18 | 2013-06-05 | Monsanto Technology LLC | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| US20060200878A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| EP1934354B1 (en) | 2005-10-13 | 2017-11-08 | Monsanto Technology, LLC | Methods for producing hybrid seed |
| EP2985353A1 (en) | 2006-10-12 | 2016-02-17 | Monsanto Technology LLC | Plant micrornas and methods of use thereof |
| CA2780448C (en) | 2009-11-23 | 2018-02-13 | Monsanto Technology Llc | Transgenic maize event mon 87427 and the relative development scale |
| UY34176A (es) * | 2011-07-01 | 2013-01-31 | Monsanto Technology Llc | ?una construcción de adn, método para prepararla, plantas y semillas que la incluyen y métodos para generarlas?. |
| AU2014278519B2 (en) * | 2013-06-11 | 2020-09-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Methods for generating transgenic plants |
| US20150024388A1 (en) * | 2013-07-19 | 2015-01-22 | Malaysian Palm Oil Board | Expression of SEP-like Genes for Identifying and Controlling Palm Plant Shell Phenotypes |
| MD4770B1 (ru) | 2013-12-18 | 2021-10-31 | BASF Agro B.V. | Растения с повышенной толерантностью к гербицидам |
| US10683513B2 (en) * | 2013-12-31 | 2020-06-16 | Dow Agrosciences Llc | Tissue-specific expression and hybrid plant production |
| EA037898B1 (ru) * | 2015-07-22 | 2021-06-03 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способы и композиции для селективной регуляции экспрессии белков |
| CA3051585A1 (en) | 2017-01-28 | 2018-08-02 | Inari Agriculture, Inc. | Novel plant cells, plants, and seeds |
| US11603536B2 (en) | 2017-09-29 | 2023-03-14 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient maize genome editing |
| US11802288B1 (en) | 2018-01-29 | 2023-10-31 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient soybean genome editing |
| US11220694B1 (en) | 2018-01-29 | 2022-01-11 | Inari Agriculture, Inc. | Rice cells and rice plants |
| US11926835B1 (en) | 2018-01-29 | 2024-03-12 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient tomato genome editing |
| CA3086855C (en) | 2018-02-02 | 2022-05-03 | Monsanto Technology Llc | Maize event mon87429 and methods of use thereof |
| US11866719B1 (en) | 2018-06-04 | 2024-01-09 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants |
| CN113122567B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-08-01 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 一种利用除草剂控制玉米雄性不育的方法 |
| CN112080501B (zh) * | 2020-09-10 | 2021-11-23 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 重组启动子、基因表达盒及其在植物育种中的应用 |
| US20240263206A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-08-08 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides |
| US20240181079A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-06-06 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system |
| TW202305130A (zh) | 2021-03-26 | 2023-02-01 | 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 | 原核系統中環狀多核糖核苷酸之產生 |
| MX2024000135A (es) * | 2021-06-23 | 2024-01-23 | Versameb Ag | Composiciones y metodos para modular la expresion de genes. |
| WO2023077118A1 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
| WO2023141540A2 (en) | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
| WO2024229403A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Endornaviral satellite rna amplification systems for plants |
| WO2024229385A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Artificial ghabrivirales satellite rnas |
| WO2024229359A2 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Artificial tymovirales satellite rnas |
| AR132591A1 (es) | 2023-05-03 | 2025-07-16 | Flagship Pioneering Innovations Vii Llc | Arn satélite de secoviridae artificiales |
| WO2024229398A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Artificial amalgavirus satellite rnas |
| WO2024229362A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | ARTIFICIAL MARTELLIVIRALES SATELLITE RNAs |
| WO2024229347A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Artificial tombusviridae satellite rnas |
| AR132589A1 (es) | 2023-05-03 | 2025-07-16 | Flagship Pioneering Innovations Vii Llc | Arn satélite de solemoviridae artificiales |
| AR132590A1 (es) | 2023-05-03 | 2025-07-16 | Flagship Pioneering Innovations Vii Llc | Sistemas de amplificación de arn satélite partitivirales para plantas |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for mortising solid wooden shells of ships' tackle-blocks | |
| US5583210A (en) * | 1993-03-18 | 1996-12-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling plant development |
| EA006761B1 (ru) * | 2000-03-27 | 2006-04-28 | Зингента Партисипейшнс Аг | Промоторные последовательности вируса желтого скручивания листьев цестровых и способы их применения |
| US7355096B2 (en) * | 2003-06-20 | 2008-04-08 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | Ryegrass pollen-specific promoters and expression constructs |
| RU2380411C2 (ru) * | 2004-07-20 | 2010-01-27 | Дженентек, Инк. | Способ ингибирования пролиферации гепатоцитов, способ ингибирования клеточной адгезии гепатоцитов и способ ингибирования биологической активности angptl4 в гепатоцитах или предшественниках гепатоцитов |
| US20110035838A1 (en) * | 2004-12-21 | 2011-02-10 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA Constructs and Methods for Controlling Gene Expression |
Family Cites Families (86)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US676234A (en) | 1897-12-30 | 1901-06-11 | Thomas Humpage | Toothed gearing. |
| US5094945A (en) | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| US4535060A (en) | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US5034322A (en) | 1983-01-17 | 1991-07-23 | Monsanto Company | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
| US4761373A (en) | 1984-03-06 | 1988-08-02 | Molecular Genetics, Inc. | Herbicide resistance in plants |
| US4940835A (en) | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| NZ217113A (en) | 1985-08-07 | 1988-06-30 | Monsanto Co | Production of eucaryotic plants which are glyphosate resistant, vectors (transformation and expression), chimeric gene and plant cells |
| US4735649A (en) | 1985-09-25 | 1988-04-05 | Monsanto Company | Gametocides |
| US5068193A (en) | 1985-11-06 | 1991-11-26 | Calgene, Inc. | Novel method and compositions for introducing alien DNA in vivo |
| ATE57390T1 (de) | 1986-03-11 | 1990-10-15 | Plant Genetic Systems Nv | Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen. |
| NZ224470A (en) | 1987-05-05 | 1991-06-25 | Sandoz Ltd | Method of transforming plant cell material; plant cell material and plants |
| US4971908A (en) | 1987-05-26 | 1990-11-20 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US6191343B1 (en) | 1988-02-03 | 2001-02-20 | Pioneer Hi-Bred International | Molecular methods of hybrid seed production |
| NZ227835A (en) | 1988-02-03 | 1992-09-25 | Paladin Hybrids Inc | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| US5356799A (en) | 1988-02-03 | 1994-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| EP0348348B1 (de) | 1988-06-20 | 2000-08-09 | Novartis AG | Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen Proteinase-Inhibitoren |
| GB8818706D0 (en) | 1988-08-05 | 1988-09-07 | Ici Plc | Dna constructs & plants incorporating them |
| EP0360750A3 (en) | 1988-09-22 | 1991-01-02 | Ciba-Geigy Ag | Novel herbicide tolerant plants |
| ATE294872T1 (de) | 1989-02-02 | 2005-05-15 | Pioneer Hi Bred Int | Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten |
| AU644097B2 (en) | 1989-08-09 | 1993-12-02 | Monsanto Technology, Llc | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| DE69034268D1 (de) | 1989-08-10 | 2011-03-03 | Bayer Bioscience Nv | Pflanzen mit modifizierten Blüten |
| ATE196318T1 (de) | 1989-10-31 | 2000-09-15 | Monsanto Co | Promotor für transgene pflanzen |
| WO1991009948A1 (en) | 1990-01-05 | 1991-07-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Rice actin gene and promoter |
| US5641876A (en) | 1990-01-05 | 1997-06-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Rice actin gene and promoter |
| US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| CA2074355C (en) | 1990-01-22 | 2008-10-28 | Ronald C. Lundquist | Method of producing fertile transgenic corn plants |
| DE4013099A1 (de) | 1990-04-25 | 1991-10-31 | Hoechst Ag | Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen |
| DE59109256D1 (de) | 1990-06-23 | 2004-01-22 | Bayer Cropscience Gmbh | Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung |
| UA32548C2 (ru) | 1990-08-31 | 2001-02-15 | Монсанто Компані | Изолированная последовательность днк, которая кодирует epsps фермент, изолированная последовательность днк, которая кодирует белок, выявляющий epsps активность, рекомбинантная двухниточная молекула днк, способ получения генетически трансформированных растений |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| ES2147551T3 (es) | 1990-11-23 | 2000-09-16 | Aventis Cropscience Nv | Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas. |
| US5436389A (en) | 1991-02-21 | 1995-07-25 | Dekalb Genetics Corp. | Hybrid genetic complement and corn plant DK570 |
| DE4126414A1 (de) | 1991-08-09 | 1993-02-11 | Hoechst Ag | Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung |
| US5750868A (en) | 1994-12-08 | 1998-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| GB9515941D0 (en) | 1995-08-03 | 1995-10-04 | Zeneca Ltd | DNA constructs |
| FR2736926B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene |
| FR2736929B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes |
| WO1997023634A2 (en) | 1995-12-21 | 1997-07-03 | New Zealand Institute For Crop & Food Research Limited | Production of true-breeding transgenic seeds from plants heterozygous for transgene insertions |
| US6476291B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-05 | New Zealand Institute For Food And Crop Research Limited | True breeding transgenics from plants heterozygous for transgene insertions |
| GB9611981D0 (en) | 1996-06-07 | 1996-08-07 | Zeneca Ltd | Enhancement of gene expression |
| DK0975778T3 (da) | 1997-04-03 | 2007-10-08 | Dekalb Genetics Corp | Anvendelse af glyphostat-resistende majslinier |
| US6040497A (en) | 1997-04-03 | 2000-03-21 | Dekalb Genetics Corporation | Glyphosate resistant maize lines |
| US6271439B1 (en) | 1998-03-04 | 2001-08-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for regulating cell death and enhancing disease resistance to plant pathogens |
| AU2992999A (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-27 | Monsanto Company | Glyphosate as a gametocide |
| US6750377B1 (en) | 1998-06-19 | 2004-06-15 | Advanta Technology Ltd. | Method of breeding glyphosate resistant plants |
| WO2000029596A1 (en) | 1998-11-17 | 2000-05-25 | Monsanto Company | Phosphonate metabolizing plants |
| US6072110A (en) | 1999-01-19 | 2000-06-06 | Novartis Ag | Inbred maize line NP2029 |
| US20100293669A2 (en) | 1999-05-06 | 2010-11-18 | Jingdong Liu | Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
| US6384304B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-05-07 | Plant Genetic Systems N.V. | Conditional sterility in wheat |
| CA2394984C (en) | 1999-12-16 | 2008-11-18 | Monsanto Technology Llc | Novel plant expression constructs |
| US20020062499A1 (en) * | 2000-05-08 | 2002-05-23 | Conner Timothy W. | Methods for translational repression of gene expression in plants |
| BR122013026754B1 (pt) | 2000-06-22 | 2018-02-27 | Monsanto Company | Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato |
| US7266512B2 (en) | 2000-07-18 | 2007-09-04 | Cnet Networks, Inc. | System and method for establishing business to business connections via the internet |
| US6646186B1 (en) * | 2000-07-26 | 2003-11-11 | Stine Seed Farm Inc. | Hybrid soybeans and methods of production |
| WO2002026995A1 (en) | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Syngenta Limited | Herbicide resistant plants |
| AU2002230899B2 (en) | 2000-10-30 | 2006-11-09 | Monsanto Technology Llc | Canola event PV-BNGT04(RT73) and compositions and methods for detection thereof |
| GB0108048D0 (en) * | 2001-03-30 | 2001-05-23 | Isis Innovation | Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants |
| US7977046B2 (en) | 2002-05-10 | 2011-07-12 | Monsanto Technology Llc | Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants |
| US7230168B2 (en) | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
| WO2003072792A2 (en) | 2002-02-26 | 2003-09-04 | Syngenta Limited | A method of selectively producing male or female sterile plants |
| EP1551966B1 (en) | 2002-07-18 | 2013-06-05 | Monsanto Technology LLC | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| EP1551967B1 (en) | 2002-07-19 | 2011-08-31 | University Of South Carolina | Compositions and methods for the modulation of gene expression in plants |
| US8344211B2 (en) * | 2008-08-13 | 2013-01-01 | Ceres, Inc. | Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides |
| AU2004280634A1 (en) | 2003-10-09 | 2005-04-21 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene silencing by using micro-RNA molecules |
| PT1708560E (pt) | 2003-12-15 | 2015-06-03 | Monsanto Technology Llc | Planta de milho mon88017 e composições e métodos para a sua detecção |
| US7750207B2 (en) * | 2004-09-01 | 2010-07-06 | Monsanto Technology Llc | Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter |
| US8314290B2 (en) | 2004-12-21 | 2012-11-20 | Monsanto Technology Llc | Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs |
| US8404927B2 (en) | 2004-12-21 | 2013-03-26 | Monsanto Technology Llc | Double-stranded RNA stabilized in planta |
| WO2006073727A2 (en) | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Monsanto Technology, Llc | Recombinant dna constructs and methods for controlling gene expression |
| AU2006203892B2 (en) | 2005-01-07 | 2011-03-24 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Method to trigger RNA interference |
| WO2006111512A1 (en) | 2005-04-19 | 2006-10-26 | Basf Plant Science Gmbh | Improved methods controlling gene expression |
| EP1934354B1 (en) | 2005-10-13 | 2017-11-08 | Monsanto Technology, LLC | Methods for producing hybrid seed |
| ZA200803234B (en) * | 2005-10-13 | 2009-01-28 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing hybrid seed |
| US7491813B2 (en) | 2005-12-07 | 2009-02-17 | Monsanto Technology Llc | Promoter polynucleotides identified from Zea mays for use in plants |
| WO2009085982A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Monsanto Technology Llc | Method to enhance yield and purity of hybrid crops |
| EA201071408A1 (ru) | 2008-06-03 | 2011-06-30 | Нордзаат Заатцухтгезелльшафт Мбх | Способ получения однодольных растений с мужской стерильностью |
| WO2010099084A2 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Monsanto Technology Llc | Isolated novel nucleic acid and protein molecules from corn and methods of using those molecules |
| WO2010117737A1 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Monsanto Technology Llc | Rice transgenic event17053 and methods of use thereof |
| MY176497A (en) | 2009-03-30 | 2020-08-12 | Monsanto Technology Llc | Transgenic rice event 17314 and methods of use thereof |
| CA2780448C (en) * | 2009-11-23 | 2018-02-13 | Monsanto Technology Llc | Transgenic maize event mon 87427 and the relative development scale |
| SG181881A1 (en) * | 2009-12-23 | 2012-07-30 | Gradalis Inc | Furin-knockdown bi-functional rna |
| UY34176A (es) | 2011-07-01 | 2013-01-31 | Monsanto Technology Llc | ?una construcción de adn, método para prepararla, plantas y semillas que la incluyen y métodos para generarlas?. |
| EA037898B1 (ru) | 2015-07-22 | 2021-06-03 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Способы и композиции для селективной регуляции экспрессии белков |
| CA3086855C (en) | 2018-02-02 | 2022-05-03 | Monsanto Technology Llc | Maize event mon87429 and methods of use thereof |
-
2012
- 2012-06-29 UY UY0001034176A patent/UY34176A/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 HU HUE12807530A patent/HUE051995T2/hu unknown
- 2012-06-29 PH PH1/2013/502605A patent/PH12013502605B1/en unknown
- 2012-06-29 AR ARP120102369A patent/AR088133A1/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 CA CA2840646A patent/CA2840646C/en active Active
- 2012-06-29 AP AP2013007316A patent/AP2013007316A0/xx unknown
- 2012-06-29 EP EP12807530.6A patent/EP2726493B1/en active Active
- 2012-06-29 BR BR112013033972-1A patent/BR112013033972B1/pt active IP Right Grant
- 2012-06-29 US US13/538,670 patent/US9139838B2/en active Active
- 2012-06-29 PE PE2013002913A patent/PE20141518A1/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 CN CN201280032386.3A patent/CN103635483B/zh active Active
- 2012-06-29 UA UAA201400939A patent/UA121189C2/uk unknown
- 2012-06-29 RS RS20201573A patent/RS61292B1/sr unknown
- 2012-06-29 WO PCT/US2012/045040 patent/WO2013006472A1/en not_active Ceased
- 2012-06-29 MX MX2013015338A patent/MX354471B/es active IP Right Grant
- 2012-06-29 RU RU2014103436A patent/RU2667424C2/ru active
-
2013
- 2013-12-10 ZA ZA2013/09287A patent/ZA201309287B/en unknown
- 2013-12-27 CL CL2013003776A patent/CL2013003776A1/es unknown
-
2015
- 2015-05-22 US US14/720,052 patent/US9816106B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-13 CL CL2016000869A patent/CL2016000869A1/es unknown
-
2017
- 2017-10-05 US US15/726,363 patent/US10689667B2/en active Active
-
2020
- 2020-04-10 US US16/845,907 patent/US11560574B2/en active Active
-
2022
- 2022-08-05 AR ARP220102116A patent/AR126724A2/es unknown
- 2022-12-01 US US18/060,851 patent/US20230392162A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for mortising solid wooden shells of ships' tackle-blocks | |
| US5583210A (en) * | 1993-03-18 | 1996-12-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling plant development |
| EA006761B1 (ru) * | 2000-03-27 | 2006-04-28 | Зингента Партисипейшнс Аг | Промоторные последовательности вируса желтого скручивания листьев цестровых и способы их применения |
| US7355096B2 (en) * | 2003-06-20 | 2008-04-08 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | Ryegrass pollen-specific promoters and expression constructs |
| RU2380411C2 (ru) * | 2004-07-20 | 2010-01-27 | Дженентек, Инк. | Способ ингибирования пролиферации гепатоцитов, способ ингибирования клеточной адгезии гепатоцитов и способ ингибирования биологической активности angptl4 в гепатоцитах или предшественниках гепатоцитов |
| US20110035838A1 (en) * | 2004-12-21 | 2011-02-10 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA Constructs and Methods for Controlling Gene Expression |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2667424C2 (ru) | Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка | |
| CN112831585B (zh) | 转基因玉米事件lp007-4及其检测方法 | |
| CN112852991B (zh) | 转基因玉米事件lp007-7及其检测方法 | |
| AU2020273330B2 (en) | Methods and compositions for selective regulation of protein expression | |
| US12213421B2 (en) | Nucleic acid sequence for detecting soybean plant DBN8002 and detection method therefor | |
| CN113151533B (zh) | 转基因玉米事件lp007-6及其检测方法 | |
| WO2021042228A1 (en) | Abiotic stress tolerant plants and methods | |
| CN116144671B (zh) | 转基因玉米事件lp026-3及其检测方法 | |
| EP3604545A2 (en) | Soy plants comprising the transgenic event cigbdt-def1 or cigbis-def5 | |
| WO2021016906A1 (en) | Abiotic stress tolerant plants and methods | |
| CN119842954A (zh) | 转基因玉米事件lp111-2及其检测方法 |