[go: up one dir, main page]

RS58489B1 - Modulacija eksprimiranja transduktora signala i aktivatora transkripcije 3 (stat3) - Google Patents

Modulacija eksprimiranja transduktora signala i aktivatora transkripcije 3 (stat3)

Info

Publication number
RS58489B1
RS58489B1 RS20190022A RSP20190022A RS58489B1 RS 58489 B1 RS58489 B1 RS 58489B1 RS 20190022 A RS20190022 A RS 20190022A RS P20190022 A RSP20190022 A RS P20190022A RS 58489 B1 RS58489 B1 RS 58489B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cet
stat3
antisense
certain embodiments
nucleic acid
Prior art date
Application number
RS20190022A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric E Swayze
Susan M Freier
Robert A Macleod
Youngsoo Kim
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ionis Pharmaceuticals Inc filed Critical Ionis Pharmaceuticals Inc
Publication of RS58489B1 publication Critical patent/RS58489B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

Opis
Spisak sekvenci
[0001] Ova prijava se podnosi zajedno sa spiskom sekvenci u elektronskom obliku. Spisak sekvenci je data kao datoteka pod nazivom BIOL0142WOSEQ.txt stvorena 29. marta 2012, i veličine je 672 Kb.
Oblast
[0002] U određenim otelotvorenjima pružene su metode, jedinjenja i sastavi za inhibiranje eksprimiranja STAT3 mRNK i proteina u životinji. Takvi postupci, jedinjenja i sastavi su korisni za tretman, prevenciju ili ublažavanje hiperproliferativnih bolesti.
Stanje tehnike
[0003] STAT (transduktori signalna i aktivatori transkripcije) porodica proteina su DNK-vezujući proteini koji igraju dvostruku ulogu u transdukciji signala i aktivaciji transkripcije. Trenutno, postoji šest različitih članova STAT porodice(STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 i STAT6) i nekoliko izoforma (STATl, STATlp, STAT3a i STAT3p). Aktivnost STAT se modulira različitim citokinima i mitogenim stimulusima. Vezivanje citokina na njegov receptor dovodi do aktivacije Janus proteinskih tirozin kinaza (JAK) povezanih sa ovim receptorima. Ovo fosforiliše STAT, što dovodi do translokacije u nukleus i transkripcionu aktivaciju gena za STAT odgovor. Fosforilacija na specifičnom tirozinskom ostatku na STAT rezultuje njihovom aktivacijom, što rezultuje formiranjem homodimera i/ili heterodimera STAT koji se vezuju za specifične genske promotorske sekvence. Događaji posredovani citokinima putem STAT aktivacije uključuju ćelijsku proliferaciju i diferencijaciju i prevenciju apoptoze.
[0004] Specifičnost STAT aktivacije je posledica specifičnih citokina, tj., svaki STAT reaguje na mali broj specifičnih citokina. Takođe su pronađeni i drugi ne-citokinski signalni molekuli, kao što su faktori rasta, koji aktiviraju STAT. Vezivanje ovih faktora na receptor na površini ćelije povezano sa proteinskom tirozin kinazom takođe dovodi do fosforilacije STAT.
[0005] Otkriveno je da STAT3 (i faktor odgovora akutne faze (APRF)) reaguje na interleukin-6 (IL-6) kao i na epidermalni faktor rasta (EGF) (Darnell, Jr., J.E., i dr., Science, 1994, 264, 1415-1421). Pored toga, ustanovljeno je da STAT3 ima važnu ulogu u transdukciji signala pomoću interferona (Yang, C.-H., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 5568-5572). Postoje dokazi koji ukazuju da STAT3 može biti regulisan pomoću MAPK puta. ERK2 indukuje fosforilaciju serina i takođe se povezuje sa STAT3 (Jain, N., i dr., Oncogene, 1998, 17, 3157-3167).
[0006] STAT3 je eksprimiran u većini tipova ćelija (Zhong, Z., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4806-4810). On indukuje eksprimiranje gena uključenih u reakciju na povredu i upalu tkiva. STAT3 je takođe pokazao da sprečava apoptozu kroz eksprimiranje bcl-2 (Fukada, T., i dr., Immuniti, 1996, 5, 449-460).
[0007] Nedavno je STAT3 detektovan u mitohondrijima transformisanih ćelija i pokazalo se da olakšava aktivnosti glikolitike i oksidativne fosforilacije slične onima kod ćelija raka (Gough, D.J., i dr., Science, 2009, 324, 1713-1716). Inhibicija STAT3 u mitohondrijima je oslabila malignu transformaciju aktiviranim Ras. Podaci potvrđuju Ras-posredovanu transformacionu funkciju za STAT3 u mitohondrijima pored svojih nuklearnih uloga.
[0008] Aberantno eksprimiranje ili konstitutivno eksprimiranje STAT3 je povezano sa brojnim procesima bolesti.
[0009] Objava prijave patenta US br.2005/0196781 govori o malim molekulima nukleinske kiseline, kao što su dvolančani SiRNK molekuli, koji moduliraju eksprimiranje STAT3 gena. WO 2005/083124 govori o antisens oligonukleotidima koji moduliraju eksprimiranje STAT3 gena.
Sažetak
[0010] Ovde su pruženi postupci, jedinjenja i sastavi za modulaciju eksprimiranja mRNK i STAT3 proteina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su korisna za modulaciju eksprimiranja mRNK STAT3 i proteina su antisens jedinjenja. U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su antisens oligonukleotidi.
[0011] U određenim otelotvorenjima, modulacija se može pojaviti u ćeliji ili tkivu. U određenim otelotvorenjima, ćelija ili tkivo je u životinji. U nekim otelotvorenjima, životinja je čovek. U nekim otelotvorenjima, nivoi mRNK STAT3 su smanjeni. U određenim otelotvorenjima, nivoi STAT3 proteina su smanjeni. Takva redukcija se može pojaviti u zavisnosti od vremena ili na dozno-zavisni način.
[0012] Takođe su pruženi postupci, jedinjenja i sastavi korisne za prevenciju, tretman i poboljšanje bolesti, poremećaja i stanja. U nekim otelotvorenjima, takve bolesti, poremećaji i stanja su hiperproliferativna oboljenja, poremećaji i stanja. U nekim otelotvorenjima takva hiperproliferativna oboljenja, poremećaji i stanja uključuju rak, kao i povezane malignitete i metastaze. U određenim aspektima, takvi kanceri uključuju rak pluća, uključujući rak malih ćelija pluća(NSCLC), rak pankreasa, kolorektalni kancer, multipli mijelom, hepatocelularni karcinom (HCC), glioblastom, rak jajnika, osteosarkom, rak glave i vrata, rak dojke, epidermoidne karcinome, intestinalne adenome, rak prostate i rak želuca.
[0013] Takve bolesti, poremećaji i stanja mogu imati jedan ili više zajedničkih faktora rizika, uzroka ili ishoda. Određeni faktori rizika i uzroci razvoja hiperproliferativne bolesti uključuju stvari kao što su starenje; upotreba duvana; izlaganje suncu i jonizujućem zračenju; dodir sa određenim hemikalijama; infekcija određenim virusima i bakterijama; određene hormonske terapije; istorija raka u porodici; upotreba alkohola; i određeni izbori načina života, uključujući lošu ishranu, nedostatak fizičke aktivnosti i/ili prekomernu težinu. Određeni simptomi i ishodi povezani sa razvojem hiperproliferativne bolesti uključuju zadebljanje ili ugruške u grudima ili bilo kom drugom delu tela; nove mladeže ili promene u postojećim mladežima; rane koje se ne zaceljuju; promuklost ili kašalj koji ne nestaju; promene u navikama creva ili bešike; nelagodnost nakon jela; teškoće pri gutanju; neobjašnjeni dobitak ili gubitak težine; neobično krvarenje ili pražnjenje; umor; metastaze jednog ili više tumora u telu; kardiovaskularne komplikacije, uključujući srčani zastoj i moždani udar; i smrti.
[0014] U određenim aspektima, postupci tretmana uključuju primenu STAT3 antisens jedinjenja pojedincu kom je to potrebno. U određenim aspektima, postupci tretmana uključuju primenu STAT3 antisens oligonukleotida pojedincu kom je to potrebno.
Detaljan opis
[0015] Podrazumeva se da su i prethodni opšti opis i naredni detaljni opis samo primeri i objašnjenja i nisu ograničavajući za pronalazak, koji je izložen u patentnim zahtevima. U ovom tekstu, upotreba jednine uključuje množinu ako nije drugačije naznačeno. Kad se ovde koristi, upotreba „ili“ znači „i/ili“ osim ako nije drugačije navedeno. Dalje, upotreba izraza „uključujući“, kao i drugih oblika, kao što su „uključuje“ i „uključen“, nije ograničavajuća. Takođe, izrazi kao što su „element“ ili „komponenta“ obuhvataju i elemente i komponente koji sadrže jednu jedinicu i elemente i komponente koji sadrže više od jedne podjedinice, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0016] Naslovi poglavlja koji se ovde koriste su samo za organizacione svrhe, i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisane predmetne materije.
Definicije
[0017] Osim ako nisu date specifične definicije, nomenklatura koja se koristi u vezi sa, i procedure i tehnike analitičke hemije, sintetske organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde, su one koje su dobro poznate i koje se uobičajeno koriste u struci. Standardne tehnike se mogu koristiti za hemijsku sintezu i hemijsku analizu.
[0018] Ako nije drugačije naznačeno, sledeći izrazi imaju sledeća značenja:
„2'-dezoksinukleozid“ označava nukleozid koji sadrži 2'-H furanozil šećerni deo, kao što je nalazi u prirodi u dezoksiribonukleozidima (DNK). U nekim otelotvorenjima, 2'-dezoksinukleozid može da sadrži modifikovanu nukleobazu ili može da sadrži RNK nukleobazu (npr. uracil).
[0019] „2'-O-metoksietil“ (takođe 2'-MOE i 2'-O (CH2)2-OCH3) odnosi se na O-metoksi-etil modifikaciju 2' položaja furozil prstena.2'-O-metoksietil modifikovani šećer je modifikovani šećer.
[0020] „2'-MOE nukleozid“ (takođe 2'-O-metoksietil nukleozid) označava nukleozid koji sadrži 2'-MOE modifikovani ostatak šećera.
[0021] „2'-supstituisani nukleozid“ označava nukleozid koji sadrži supstituent na 2'-položaju koji nije H ili OH. Ukoliko nije drugačije naznačeno, 2'-supstituisani nukleozid nije biciklični nukleozid.
[0022] „5-metilcitozin“ označava citozin modifikovan sa metil grupom vezanom za 5' položaj. 5-metilcitozin je modifikovana nukleobaza.
[0023] „Oko“ znači unutar ± 10% od vrednosti. Na primer, ako je navedeno, „jedinjenja utiču na najmanje oko 70% inhibicije STAT3“, podrazumeva se da su nivoi STAT3 inhibirani u opsegu od 63% i 77%.
[0024] „Aktivni farmaceutski agens“ označava supstancu ili supstance u farmaceutskom sastavu koje pružaju terapeutsku korist kada se daju pojedincu. Na primer, u određenim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ciljan na STAT3 je aktivni farmaceutski agens.
[0025] „Aktivni ciljani region“ ili „ciljani region“ označava region na koji je ciljano jedno ili više aktivnih antisens jedinjenja. „Aktivna antisens jedinjenja“ označavaju antisens jedinjenja koja smanjuju nivoe ciljane nukleinske kiseline ili nivoe proteina.
[0026] „Primena istovremeno“ odnosi se na zajedničko davanje dva agensa na bilo koji način u kom se farmakološki efekti oba agensa javljaju kod pacijenta u isto vreme. Istovremena primena ne zahteva da se oba sredstva primenjuju u jednom farmaceutskom sastavu, u istom doznom obliku, ili istim putem primene. Efekti oba agensa ne moraju da se manifestuju istovremeno. Efekti se samo moraju preklapati u određenom vremenskom periodu i ne moraju biti koekstenzivni.
[0027] „Primena“ znači davanje farmaceutskog agensa pojedincu, i uključuje, ali nije ograničeno na primenu od strane medicinskog stručnjaka i primenu samom sebi.
[0028] „Poboljšanje“ se odnosi na smanjenje najmanje jednog indikatora, znaka ili simptoma povezane bolesti, poremećaja ili stanja. Ozbiljnost indikatora može se odrediti subjektivnim ili objektivnim merama, koje su poznate stručnjacima.
[0029] „Životinja“ se odnosi na ljudsku ili životinju koja nije čovek, uključujući, ali ne ograničavajući se na, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje i primate koji nisu čovek, uključujući, ali ne ograničavajući se na majmune i šimpanze.
[0030] „Antitelo“ se odnosi na molekul karakterisan reakcijom specifično sa antigenom na neki način, gde su antitelo i antigen svaki definisani u odnosu na drugi. Antitelo može da se odnosi na kompletan molekul antitela ili bilo koji njegov fragment ili region, kao što je teški lanac, lak lanac, Fab region i Fc region.
[0031] „Antisens aktivnost“ označava bilo koju detektabilnu ili merljivu aktivnost koja se može pripisati hibridizaciji antisens jedinjenja u ciljanu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, antisens aktivnost je smanjenje količine ili eksprimiranja ciljane nukleinske kiseline ili proteina kodiranog takvom ciljanom nukleinskom kiselinom.
[0032] „Antisens jedinjenje“ označava oligomerno jedinjenje koje je sposobno da se podvrgne hibridizaciji sa ciljanom nukleinskom kiselinom putem vodonične veze. Primeri antisens jedinjenja obuhvataju jednolančana i dvolančana jedinjenja, kao što su, antisens oligonukleotidi, siRNK, shRNK, snoRNK, miRNK i satelitska ponavljanja.
[0033] „Antisens inhibicija“ označava smanjenje ciljanih nivoa nukleinske kiseline ili nivoa ciljanog proteina u prisustvu antisens jedinjenja komplementarnog ciljanoj nukleinskoj kiselini u poređenju sa ciljanim nivoima nukleinske kiseline ili nivoima ciljanog proteina u odsustvu antisens jedinjenja.
[0034] „Antisens oligonukleotid“ označava jednolančani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja dozvoljava hibridizaciju u odgovarajući region ili segment ciljane nukleinske kiseline.
[0035] „Biciklični šećer“ označava furozilni prsten modifikovan premošćivanjem dva atoma. Biciklični šećer je modifikovani šećer.
[0036] „Biciklični nukleozid“ (takođe BNA) označava nukleozid koji ima šećerni deo koji sadrži most koji povezuje dva atoma ugljenika prstena šećera, čime se formira biciklični sistem prstena. U određenim otelotvorenjima, most povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik prstena šećera.
[0037] „Struktura kapice“ ili „deo terminalne kapice“ označava hemijske modifikacije, koje su inkorporirane na oba kraja antisens jedinjenja.
[0038] „cEt“ ili „ograničeni etil“ označava biciklični nukleozid koji ima šećerni deo koji sadrži most koji povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik, gde most ima formulu: 4'-CH (CH)3-O-2'.
[0039] „Ograničeni etil nukleozid“ (takođe cEt nukleozid) označava nukleozid koji sadrži biciklični šećerni deo koji sadrži 4'-CH (CH3-O-2' most.
[0040] „Hemijski različita region“ se odnosi na region antisens jedinjenja koji je na neki način hemijski različit od drugog regiona istog antisens jedinjenja. Na primer, region koji ima 2'-O-metoksietil nukleotide je hemijski različit od regiona koji ima nukleotide bez 2'-O-metoksietil modifikacija.
[0041] „Himerno antisens jedinjenje“ označava antisens jedinjenje koje ima najmanje dva hemijski različita regiona.
[0042] „Ko-primena“ znači davanje dva ili više farmaceutskih agensa pojedincu. Dva ili više farmaceutskih agenasa mogu biti u jednom farmaceutskom sastavu, ili mogu biti u odvojenim farmaceutskim sastavima. Svaki od dva ili više farmaceutskih agenasa može da se primeni preko istih ili različitih puteva primene. Istovremena primena obuhvata paralelnu ili sekvencijalnu primenu.
[0043] „Komplementarnost“ označava kapacitet za uparivanje između nukleobaza prve nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline.
[0044] „Susedne nukleobaze“ označavaju nukleobaze koje su neposredno jedna do druge.
[0045] „rastvarač“ označava sastojak u sastavu koji nema farmakološku aktivnost, ali je farmaceutski neophodan ili poželjan. Na primer, razblaživač u injektiranom sastavu može biti tečnost, npr. rastvor soli.
[0046] „Doza“ označava određenu količinu farmaceutskog agensa koji se daje u jednoj primeni, ili u određenom vremenskom periodu. U nekim otelotvorenjima, doza se može primenjivati u jednom, dva ili više bolusa, Tableta ili injekcija. Na primer, u određenim otelotvorenjima kod kojih je poželjno subkutano davanje, željena doza zahteva zapreminu koju nije lako smestiti u jednu injekcijom, tako da se mogu koristiti dve ili više injekcija kako bi se postigla željena doza. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski agens se primenjuje infuzijom tokom dužeg vremenskog perioda ili kontinuirano. Doze mogu biti navedene kao količina farmaceutskog agensa na sat, dan, nedelju ili mesec.
[0047] „Efektivna količina“ označava količinu aktivnog farmaceutskog agensa dovoljnog kako bi se postigla željeni fiziološki ishod kod pojedinca kom je potreban agens. Efikasna količina može varirati među pojedincima zavisno od zdravstvenog stanja i fizičkog stanja pojedinca koji se tretira, taksonomske grupe pojedinaca kog treba lečiti, formulacije sastava, procene zdravstvenog stanja pojedinca i drugih relevantnih faktora.
[0048] „Potpuno komplementarni“ ili „100% komplementarni“ znači da svaka nukleobaza prve nukleinske kiseline ima komplementarnu nukleobazu u drugoj nukleinskoj kiselini. U određenim otelotvorenjima, prva nukleinska kiselina je antisens jedinjenje i ciljana nukleinska kiselina je druga nukleinska kiselina.
[0049] „Gapmer“ označava himerno antisens jedinjenje u kom se unutrašnji region koji ima mnoštvo nukleozida koji podržavaju H cepanje RNaze nalazi između spoljnih regiona koji imaju jedan ili više nukleozida, gde su nukleozidi koji sadrže unutrašnje područje hemijski različiti od nukleozida ili mnoštva nukleozida koji sadrže spoljne regione. Unutrašnji region se može nazvati „jaz“, i spoljni regioni se mogu nazivati „krila".
[0050] „Proširen jazom“ označava himerno antisens jedinjenje koje ima segment jaza od 12 ili više susednih 2'-dezoksiribonukleozida postavljenih između i neposredno uz 5' i 3' segmente krila koje imaju od jednog do šest nukleozida.
[0051] „Hibridizacija“ označava kalemljenje komplementarnih molekula nukleinske kiseline. U određenim otelotvorenjima, komplementarni molekuli nukleinske kiseline uključuju antisens jedinjenje i ciljanu nukleinsku kiselinu.
[0052] „Hiperproliferativna bolest“ označava bolest koju karakteriše brz ili preteran rast i reprodukcija ćelija. Primeri hiperproliferativnih bolesti uključuju rak, npr., karcinomima, sarkomima, limfomima i leukemijama, kao i prateće malignitete i metastaze.
[0053] „Identifikacija životinje pod rizikom od hiperproliferativnog oboljenja“ označava identifikaciju životinje kojoj je dijagnostikovana hiperproliferativna bolest ili identifikacija životinje predisponirane za razvoj hiperproliferativne bolesti. Pojedinci koji su predisponirani za razvoj hiperproliferativne bolesti uključuju one koji imaju jedan ili više faktora rizika za hiperproliferativnu bolest, uključujući stariju životnu dob; istoriju drugih hiperproliferativnih bolesti; istoriju upotrebe duvana; istoriju izlaganja sunčevom i/ili jonizujućem zračenju; prethodni dodir sa određenim hemikalijama, posebno stalnim dodir; prošle ili sadašnje infekcije određenim virusima i bakterijama; prethodna ili trenutna upotrebu određenih hormonskih terapija; genetska predispozicija; upotreba alkohola; i određeni izbori načina života, uključujući lošu ishranu, nedostatak fizičke aktivnosti i/ili prekomernu težinu. Takva identifikacija može se postići bilo kojom metodom, uključujući procenu medicinske istorije pojedinca i standardnih kliničkih testova ili procena.
[0054] „Neposredno susedan“ znači da ne postoje drugi elementi između neposredno susednih elemenata.
[0055] „Inhibiranje STAT3“ znači smanjenje eksprimiranja nivoa STAT3 mRNK i/ili proteina u prisustvu STAT3 antisens jedinjenja, uključujući STAT3 antisens oligonukleotid, u poređenju sa eksprimiranjem nivoa STAT3 mRNK i/ili proteina u odsustvu STAT3 antisens jedinjenja kao što je antisens oligonukleotid.
[0056] „Pojedinac“ označava čoveka ili životinju koja nije čovek izabranu za tretman ili terapiju.
[0057] „Interukleozidna veza“ se odnosi na hemijsku vezu između nukleozida.
[0058] „Povezani nukleozidi“ označavaju susedne nukleozide koji su povezani zajedno.
[0059] „Neusklađenost“ ili „ne-komplementarna nukleobaza“ se odnosi na slučaj kada nukleobaza prve nukleinske kiseline nije u stanju da se upari sa odgovarajućom nukleobazom druge ili ciljane nukleinske kiseline.
[0060] „Modifikovana internukleozidna veza“ se odnosi na supstituciju ili bilo koju promenu u prirodno nastaloj internukleozidnoj vezi (tj. fosfodiestarsku internukleozidnu vezu).
[0061] „Modifikovana nukleobaza“ se odnosi na bilo koju nukleobazu koja nije adenin, citozin, guanin, timidin ili uracil. „Nemodifikovana nukleobaza“ označava purinske baze adenina (A) i gvanina (G), i pirimidinske baze timina (T), citozina (C) i uracila (U).
[0062] „Modifikovani nukleotid“ označava nukleotid koji ima, nezavisno, modifikovani šećerni deo, modifikovanu internukleozidnu vezu ili modifikovanu nukleobazu.
„Modifikovani nukleozid“ označava nukleozid koji, nezavisno, modifikovani šećerni deo ili modifikovanu nukleobazu.
[0063] „Modifikovani oligonukleotid“ označava oligonukleotid koji sadrži modifikovanu internukleozidnu vezu, modifikovani šećer i/ili modifikovanu nukleobazu.
[0064] „Modifikovani šećer“ se odnosi na zamenu ili promenu prirodnog šećera.
[0065] „Motiv“ označava obrazac hemijski različitih regiona u antisens jedinjenju.
[0066] „Prirodno prisutna internukleozidna veza“ označava fosfodiestersku vezu od 3' do 5'.
[0067] „Prirodni šećerni deo“ označava šećer koji se nalazi u DNK (2'-H) ili RNK (2'-OH).
[0068] „Nukleinska kiselina“ se odnosi na molekule sastavljene od monomernih nukleotida. Nukleinska kiselina uključuje ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), jednolančane nukleinske kiseline, dvolančane nukleinske kiseline, male interferišuće ribonukleinske kiseline (siRNK) i mikroRNK (miRNK).
[0069] „Nukleobaza“ označava heterocikličnu grupu koja se može upariti sa bazom druge nukleinske kiseline.
[0070] „Nukleobazna sekvenca“ označava red nepovezanih nukleobaza nezavisno od bilo koje šećerne, vezivne ili nukleobazne modifikacije.
[0071] „Nukleozid“ označava nukleobazu vezanu za šećer.
[0072] „Nukleozidni mimetik“ uključuje one strukture koje se koriste za zamenu šećera ili šećera i baze, i ne nužno i veze na jednom ili više položaja oligomernog jedinjenja, kao što su na primer nukleozidni mimetici koji imaju morfolino, cikloheksenil, cikloheksil, tetrahidropiranil, biciklo ili triciklo šećerni mimetici, npr., šećerne jedinice bez furanoze. Nukleotidni mimetik uključuje one strukture koje se koriste da zamene nukleozid i vezu na jednom ili više položaju oligomernog jedinjenja kao što su na primer peptidne nukleinske kiseline ili morfolini (morfolini povezani sa -N(H)-C(=O)-O- ili drugom nefosfodiesterskom vezom). Surogat šećera preklapa se sa nešto širem pojmom nukleozidnog mimetičara, ali je namera da pokaže zamenu samo šećerne jedinice (furanoznog prstena). Tetrahidropiranilni prstenovi koji su ovde prikazani ilustruju primer zamene šećera, gde je grupa šećera furanoze zamenjena tetrahidropiranilnim sistemom prstena.
[0073] „Nukleotid“ označava nukleozid koji ima fosfatnu grupu kovalentno vezanu za šećerni deo nukleozida.
[0074] „Efekat van cilja“ se odnosi na neželjeni ili štetni biološki efekat povezan sa modulacijom RNK ili eksprimiranjem proteina gena koji nije ciljana nukleinska kiselina.
[0075] „Oligomerno jedinjenje“ ili „oligomer“ označava polimer povezanih monomernih podjedinica koji je sposoban da hibridizuje najmanje jedan region molekula nukleinske kiseline.
[0076] „Oligonukleotid“ označava polimer povezanih nukleozida od kojih svaki može biti modifikovan ili nemodifikovan, nezavisno jedan od drugog.
[0077] „Parenteralna primena“ označava primenu putem injekcije (npr., bolus injekcije) ili infuzije. Parenteralno davanje uključuje subkutano davanje, intravenozno davanje, intramuskularno davanje, intraarterijsko davanje, intraperitonealno davanje, ili intrakranijalno davanje, npr., Intratekalno ili intracerebroventrikularno davanje.
[0078] „Peptid“ označava molekul koji se formira vezivanjem najmanje dve aminokiseline amidnim vezama. Peptid se odnosi na polipeptide i proteine.
[0079] „Farmaceutski sastav“ označava smešu supstanci koje su pogodne za davanje pojedincu. Na primer, farmaceutski sastav može da sadrži jedan ili više aktivnih farmaceutskih agenasa i sterilni vodeni rastvor. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav pokazuje aktivnost u testu slobodnog preuzimanja u određenim ćelijskim linijama.
[0080] „Farmaceutski prihvatljiv derivat“ obuhvata farmaceutski prihvatljive soli, konjugate, prolekove ili izomere jedinjenja koja su ovde opisana.
[0081] „Farmaceutski prihvatljive soli“ označavaju fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj. soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost roditeljskog oligonukleotida i ne daju neželjene toksikološke efekte.
[0082] „Fosforotioatna veza“ označava vezu između nukleozida gde je fosfodiestarska veza modifikovana zamenom jednog od ne-premostivih atoma kiseonika sa atomom sumpora. Fosforotioatna veza (P=S) je modifikovana internukleozidna veza.
[0083] „Deo“ označava određeni broj susednih (tj. povezanih) nukleobaza nukleinske kiseline. U određenim otelotvorenjima, deo je definisan broj susednih nukleobaza ciljane nukleinske kiseline. U određenim otelotvorenjima, deo je definisan broj susednih nukleobaza antisens jedinjenja.
[0084] „Sprečavanje“ se odnosi na odlaganje ili sprečavanje početka ili razvoja bolesti, poremećaja ili stanja tokom perioda vremena od minuta do neograničenog vremena.
Prevencija takođe znači smanjenje rizika od razvoja bolesti, poremećaja ili stanja.
[0085] „Prolek“ označava terapeutski agens koji je pripremljen u neaktivnom obliku koji se konvertuje u aktivni oblik unutar tela ili njihovih ćelija dejstvom endogenih enzima ili drugih hemikalija ili uslova.
[0086] „Nuspojave“ podrazumevaju fiziološke odgovore koji se mogu pripisati tretmanu osim željenih efekata. U nekim otelotvorenjima, nuspojave uključuju reakcije na mestu injekcije, abnormalnosti testa funkcije jetre, abnormalnosti bubrežne funkcije, toksičnost jetre, toksičnost bubrega, abnormalnosti centralnog nervnog sistema, miopatije i slabost. Na primer, povišeni nivoi aminotransferaze u serumu mogu ukazivati na toksičnost na jetru ili abnormalnost funkcije jetre. Na primer, povišeni bilirubin može ukazivati na toksičnost na jetru ili abnormalnost funkcije jetre.
[0087] „Transduktor signala i aktivator transkripcije 3 nukleinska kiselina“ ili „STAT3 nukleinska kiselina“ označava bilo koju nukleinsku kiselinu koja kodira STAT3. Na primer, u određenim otelotvorenjima, STAT3 nukleinska kiselina uključuje DNK sekvencu koja kodira STAT3, RNK sekvencu transkribovanom iz DNK koja kodira STAT3 (uključujući genomsku DNK koja sadrži introne i egzone), i mRNK sekvencu koja kodira STAT3. „STAT3 mRNK“ označava mRNK koja kodira STAT3 protein.
[0088] „Jednolančani oligonukleotid“ označava oligonukleotid koji se ne hibridizuje sa komplementarnim lancem.
[0089] „Specifično hibridizujući“ odnosi se na antisens jedinjenje koje ima dovoljan stepen komplementarnosti između antisens oligonukleotida i ciljane nukleinske kiseline da indukuje željeni efekat, dok pokazuje minimalan ili nikakav efekat na ne-ciljane nukleinske kiseline u uslovima u kojima je poželjno specifično vezivanje u fiziološkim uslovima u slučaju in vivo testova i terapijske tretmane.
[0090] „Ciljanje“ ili „ciljano“ označava proces dizajniranja i selekcije antisens jedinjenja koje će se specifično hibridizovati sa ciljanom nukleinskom kiselinom i indukovati željeni efekat.
[0091] „Ciljana nukleinska kiselina,“ „ciljana RNK“, „ciljana mRNK“ i „transkript ciljane RNK“ se svi odnose na nukleinsku kiselinu koja može biti ciljana antisens jedinjenjima.
[0092] „Ciljani segment“ označava sekvencu nukleotida ciljane nukleinske kiseline na koju je ciljano antisens jedinjenje. „5' ciljano mesto“ odnosi se na naj-5' nukleotid ciljanog segmenta. „3' ciljano mesto“ odnosi se na naj-3' nukleotid ciljanog segmenta.
[0093] „Terapeutski efikasna količina“ označava količinu farmaceutskog agensa koja pruža terapeutsku korist za pojedinca.
[0094] „Tretirati“ se odnosi na primenu farmaceutskog sastava kako bi se izvršila promena ili poboljšanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0095] „Nemodifikovani nukleotid“ označava nukleotid sastavljen od prirodnih nukleobaza, šećernih grupa i internukleozidnih veza. U određenim aspektima, nemodifikovani nukleotid je RNK nukleotid (tj. P-D-ribonukleozidi) ili DNK nukleotid (tj. P-D-dezoksiribonukleozid).
Određena otelotvorenja
[0096] U određenim otelotvorenjima pruženi su postupci, jedinjenja i sastavi za inhibiranje STAT3 mRNK ili eksprimiranja proteina.
[0097] U određenim otelotvorenjima pruženi su postupci za sprečavanje rasta tumora i zapremine tumora. U određenim otelotvorenjima pruženi su postupci za smanjenje rasta tumora i zapremine tumora.
[0098] U određenim otelotvorenjima pruženi su postupci, jedinjenja i sastavi za tretman, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja i stanja povezanih sa STAT3 kod pojedinca kom je to potrebno. Takođe su razmatrani postupci i jedinjenja za dobijanje leka za tretman, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa STAT3. Bolesti poremećaji i stanja povezani sa STAT3, uključuju hiperproliferativne bolesti, kao što su npr., rak, karcinomi, sarkomi, limfomi i leukemije, kao i prateći maligni poremećaji i metastaze.
[0099] U određenim otelotvorenjima pružena su STAT3 antisens jedinjenja za upotrebu u tretmanu, prevenciji ili poboljšanju bolesti povezane sa STAT3. U nekim otelotvorenjima, STAT3 antisens jedinjenja su STAT3 antisens oligonukleotidi, koji su sposobni da inhibiraju eksprimiranje STAT3 mRNK i/ili STAT3 proteina u ćeliji, tkivu ili životinji.
[0100] U određenim otelotvorenjima pruženo je STAT3 antisens jedinjenje, kao što je ovde opisano, za upotrebu u tretmanu ili prevenciji raka pluća, uključujući rak pluća (NSCLC), rak pankreasa, kolorektalni rak, multipli mijelom, hepatocelularni karcinom (HCC), glioblastom, rak jajnika, osteosarkom, rak glave i vrata, rak dojke, epidermoidne karcinome, intestinalne adenome, rak prostate i rak želuca.
[0101] U određenim otelotvorenjima pružen je STAT3 antisens jedinjenje, kao što je ovde opisano, za upotrebu u tretmanu ili sprečavanju raka metastaziranja.
[0102] U određenim otelotvorenjima pruženo je STAT3 antisens jedinjenje, kao što je ovde opisano, za upotrebu u tretmanu, prevenciji ili poboljšanju hiperproliferativnih bolesti, kao što su npr., rak, karcinomi, sarkomi, limfomi i leukemije, kao i prateći maligniteti i metastaze.
[0103] Ovde su obelodanjena antisens jedinjenja koja su ciljana na STAT3 nukleinsku kiselinu. Kao što je ovde opisano, STAT3 nukleinska kiselina je bilo koja od sekvenci datih u GENBANK pristupni br. NM_139276,2 (uključene ovde kao SEQ ID NO: 1) ili komplement od GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćenog od nukleotida 4185000 do 4264000 (uključen ovde kao SEQ ID NO: 2).
[0104] Ovde su obelodanjena jedinjenja koja sadrže modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 povezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži deo od najmanje 12 susednih nukleobaza komplementarnih delu jednake dužine od nukleobaza 3016 do 3031 od SEQ ID NO: 1, gde je nukleobazna sekvenca komplementarana sa SEQ ID NO: 1.
[0105] U nekim otelotvorenjima, pruženo je jednolančano jedinjenje koje sadrži modifikovani jednolančani oligonukleotid koji se sastoji od 16 povezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 245, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde modifikovani oligonukleotid sadrži:
5'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
3'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
jaz između 5'-krila i 3'-krila koji se sastoji od 10 povezanih 2'-dezoksinukleozida; gde svaki nukleozid svakog od 5'-krila i 3'-krila sadrži ograničeni etil nukleozid; gde je svaka internukleozidna veza fosforotioatna veza; i
gde je svaki citozin 5-metilcitozin.
[0106] U određenim otelotvorenjima, nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 245.
[0107] Kao što je ovde opisano, modifikovani oligonukleotid je 100% komplementaran sa SEQ ID NO: 1 ili 2.
[0108] U određenim otelotvorenjima, modifikovani oligonukleotid se sastoji od jednog lanca modifikovanog oligonukleotida.
[0109] U određenim otelotvorenjima, modifikovani oligonukleotid ima najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu.
[0110] U nekim otelotvorenjima, svaka internukleozidna veza je fosforotioatna internukleozidna veza.
[0111] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan nukleozid sadrži modifikovani šećer.
[0112] U određenim otelotvorenjima, najmanje jedan modifikovani šećer je biciklični šećer.
[0113] U nekim otelotvorenjima, biciklični šećer sadrži 4'-CH2-O-2' most.
[0114] U određenim otelotvorenjima, biciklični šećer sadrži 4'-CH (CH3-O-2' most.
[0115] U određenim otelotvorenjima, modifikovani šećer sadrži 2'-O (CH2)2-OCH3 grupa.
[0116] U određenim otelotvorenjima, modifikovani šećer sadrži 2'-O-CH3 grupa.
[0117] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan nukleozid modifikovanog oligonukleotida sadrži modifikovanu nukleobazu.
[0118] U nekim otelotvorenjima, modifikovana nukleobaza je 5-metilcitozin.
[0119] U nekim otelotvorenjima, modifikovani oligonukleotid sadrži:
5'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
3'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
jaz između 5'-krila i 3'-krila koji se sastoji od 10 povezanih 2'-dezoksinukleozida; gde svaki nukleozid svakog od 5'-krila i 3'-krila sadrži ograničeni etil nukleozid; gde je svaka internukleozidna veza fosforotioatna veza; i
gde je svaki citozin 5-metilcitozin.
[0120] Ovde su obelodanjeni postupci tretmana hiperproliferativne bolesti kod životinje, koje se sastoje od davanja životinji kojoj je to potrebno, jedinjenja koje sadrže modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 povezanih nukleozida i koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži najmanje 12 susednih nukleobaza bilo koje nukleobazne baze sekvence SEQ ID NO: 9-426, 430-442, 445-464, 471-498, 500-1034, 1036-1512 i 1541-2757.
[0121] Određena otelotvorenja pružaju postupke za tretman hiperproliferativne bolesti kod životinje, koji obuhvataju davanje životinji kojoj je to potrebno jedinjenje koje sadrži modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 povezanih nukleozida i koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži najmanje 12 susednih nukleobaza SEQ ID NO: 245.
[0122] U određenim otelotvorenjima, primena smanjuje veličinu tumora kod životinje.
[0123] U određenim otelotvorenjima, primena smanjuje zapreminu tumora kod životinje.
[0124] U nekim otelotvorenjima, primena sprečava metastaze u životinji.
[0125] U određenim otelotvorenjima, davanje produžava preživljavanje životinje.
[0126] U određenim otelotvorenjima, davanje smanjuje kaheksiju kod životinje.
[0127] Određena otelotvorenja pružaju jednolančano jedinjenje koje sadrži modifikovani jednolančani oligonukleotid koji se sastoji od 16 povezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 245, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde modifikovani oligonukleotid sadrži:
5'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
3'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
jaz između 5'-krila i 3'-krila koji se sastoji od 10 povezanih 2'-dezoksinukleozida; gde svaki nukleozid svakog od 5'-krila i 3'-krila sadrži ograničeni etil nukleozid; gde je svaka internukleozidna veza fosforotioatna veza; i
gde je svaki citozin 5-metilcitozin za upotrebu u postupku tretmana hiperproliferativne bolesti kod životinje.
Antisens jedinjenja
[0128] Oligomerna jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, oligonukleotide, oligonukleozide, oligonukleotidne analoge, oligonukleotidne mimetike, antisens jedinjenja, antisens oligonukleotide i siRNK. Oligomerno jedinjenje može biti „antisens“ za ciljanu nukleinsku kiselinu, što znači da je sposoban da se podvrgne hibridizaciji sa ciljanom nukleinskom kiselinom preko vodonične veze.
[0129] U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenje ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u pravcu 5' do 3, sadrži reverzni komplement ciljanog segmenta ciljane nukleinske kiseline na koju je ciljan. U određenim takvim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u pravcu 5' do 3, sadrži reverzni komplement ciljanog segmenta ciljane nukleinske kiseline na koju je ciljan.
[0130] Ovde obelodanjeno antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu ima dužinu od 12 do 30 podjedinica. Ovde obelodanjeno antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu ima dužinu od 14 do 30 podjedinica. Ovde obelodanjeno antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu ima dužinu od 12 do 22 podjedinica. Drugim rečima, takva antisens jedinjenja su od 12 do 30 povezanih podjedinica, 14 do 30 povezanih podjedinica, odnosno 12 do 22 povezane podjedinice. Ovde opisano, antisens jedinjenje je 8 do 80, 12 do 50, 13 do 30, 13 do 50, 14 do 30, 14 do 50, 15 do 30, 15 do 50, 16 do 30, 16 do 50, 17 do 30, 17 do 50, 18 do 22, 18 do 24, 18 do 30, 18 do 50, 19 do 22, 19 do 30, 19 do 50, ili 20 do 30 povezanih podjedinica. Ovde obelodanjena antisens jedinjenja su dugačka 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ili 80 povezanih podjedinica, ili su unutar opsega definisanog bilo kojom od dve gore navedene vrednosti. Ovde obelodanjeno antisens jedinjenje je antisens oligonukleotid, i povezane podjedinice su nukleotidi.
[0131] U određenim otelotvorenjima antisens oligonukleotidi ciljani na STAT3 nukleinsku kiselinu mogu biti skraćeni ili isečeni. Na primer, jedna podjedinica može biti izbrisana sa 5' kraja (5' skraćivanje), ili alternativno sa 3' kraja (3' skraćivanje). Skraćeno ili sečeno antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu može imati dve podjedinice izbrisane sa 5' kraja, ili alternativno može imati dve podjedinice izbrisane sa 3' kraja antisens jedinjenja. Alternativno, izbrisani nukleozidi se mogu dispergovati u antisens jedinjenju, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jedan nukleozid koji se briše sa 5' kraja i jedan nukleozid se briše sa 3' kraja.
[0132] Kada je jedna dodatna podjedinica prisutna u produženom antisens jedinjenju, dodatna podjedinica može biti locirana na 5' ili 3' kraju antisens jedinjenja. Kada su prisutne dve ili više dodatnih podjedinica, dodate podjedinice mogu biti jedna do druge, na primer, u antisens jedinjenju koje ima dve podjedinice koje se dodaju na 5' kraj (dodavanje 5'), ili alternativno na 3' kraj (3) dodatak) antisens jedinjenja. Alternativno, dodate podjedinice mogu biti dispergovane kroz antisens jedinjenje, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jednu podjedinicu koja je dodata na 5' kraj i jednu podjedinicu koja je dodata na 3' kraj.
[0133] Moguće je povećati ili smanjiti dužinu antisens jedinjenja, kao što je antisens oligonukleotid, i/ili uvesti neusklađene baze bez eliminacije aktivnosti. Na primer, u Woolf i dr. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992), serija antisens oligonukleotida 13-25 nukleobaza u dužini je testirana za svoju sposobnost da indukuju cepanje ciljane RNK u modelu injekcije oocita. Antisens oligonukleotidi dužine 25 nukleobaza sa 8 ili 11 neusklađenih baza u blizini krajeva antisens oligonukleotida bili su u stanju da usmere specifično cepanje ciljane mRNK, mada u manjoj meri nego antisens oligonukleotidi koji nisu sadržali nikakve neusklađenosti. Slično, ciljano specifično cepanje je postignuto korišćenjem 13 nukleobaznih antisens oligonukleotida, uključujući one sa 1 ili 3 neusklađenosti.
[0134] Gautschi i dr. (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, mart 2001) pokazali su sposobnost oligonukleotida, koji ima 100% komplementarnost sa bcl-2 mRNK, i ima 3 neusklađenosti sa bcl-kL mRNK, da smanji eksprimiranje i bcl-2 i bcl-kL in vitro i in vivo. Pored toga, ovaj oligonukleotid je pokazao jaku anti-tumorsku aktivnost in vivo.
[0135] Maher i Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) testirali su seriju tandemskih 14 nukleobaznih antisens oligonukleotida i 28 i 42 nukleobazna antisens oligonukleotida koji su sadržali sekvencu dva ili tri tandem antisens oligonukleotida, respektivno, za svoju sposobnost da zaustave translaciju ljudskog DHFR u testu zečjih retikulocita. Svaki od tri 14 nukleobaznih antisens oligonukleotida sama je bio u stanju da inhibira translaciju, iako na skromnijem nivou od 28 ili 42 nukleobaznih antisens oligonukleotida.
[0136] U određenim otelotvorenjima, jedinjenja kakva su ovde opisana su efikasna zbog toga što imaju bar jedan od in vitro IC50manji od 20uM, manji od 19uM, manji od 18uM, manji od 17uM, manji od 16uM, manji od 15uM, manji od 14uM, manji od 13uM, manji od 12uM, manji od 11uM, manji od 10uM, manji od 9uM, manji od 8uM, manji od 7uM, manji od 6uM, manji od 5uM, manji od 4uM, manji od 3uM, manji od 2uM, manji od 1 uM kada se dostavljaju HuVEC ćelijama kao što je ovde opisano.
[0137] U određenim otelotvorenjima, jedinjenja kakva su ovde opisana su efikasna zbog toga što imaju bar jedan od in vitro IC50manji od 1,0 uM, manji od 0,9uM, manji od 0,8uM, manji od 0,7uM, manji od 0,6uM, manji od 0,5uM, manji od 0,4uM, manji od 0,3uM, manji od 0,2uM, manji od 0,1uM kada se dostavljaju HuVEC ćelijama kao što je ovde opisano.
[0138] U određenim otelotvorenjima, jedinjenja kakva su ovde opisana su efikasna zbog toga što imaju bar jedan od in vitro IC50manji od 0,95uM, manji od 0,9oM, manji od 0,85uM, manji od 0,80uM, manji od 0,75uM, manji od 0,70uM, manji od 0,65uM, manji od 0,60uM, manji od 0,55uM, manji od 0,50uM, manji od 0,45 uM, manji od 0,40uM, manji od 0,35uM, manji od 0,30uM, manji od 0,25uM, manji od 0,20uM, manji od 0,15uM, manji od 0,10uM, manji od 0,05uM, manji od 0,04uM manji od 0,03 uM, manji od 0,02 uM, manji od 0,01 uM kada se dostavljaju HuVEC ćelijama kao što je ovde opisano.
[0139] U određenim otelotvorenjima, jedinjenje kao što je ovde opisano je efikasno zbog toga što ima bar jedan od in vitro IC50manji od 20 uM, manji od 15 uM, manji od 10 uM, manji od 5 uM, manji od 2 uM kada se dostavljaju postupcima slobodnog uzimanja u ćelijske linije raka, kao što je ovde opisano.
[0140] U određenim otelotvorenjima, jedinjenja kao što je ovde opisano su visoko tolerisana, kao što je pokazano najmanje jednim od povećanja vrednosti ALT ili AST ne više od 4 puta, 3 puta, ili 2 puta u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom ili povećanjem težine jetre, slezine ili bubrega koje nije veća od 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% ili 2%. U određenim otelotvorenjima, jedinjenja kao što je ovde opisano su visoko tolerisana, kao što je pokazano time što nema povećanja ALT ili AST u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja kakva su ovde opisana su visoko tolerisana, kao što je pokazano time što nema povećanja težine jetre, slezine ili bubrega u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom. U nekim otelotvorenjima, ova jedinjenja uključuju ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670, ISIS 466720; ISIS 481374, ISIS 481390, ISIS 481420, ISIS 481431, ISIS 481453, ISIS 481464, ISIS 481475, ISIS 481495, ISIS 481500, ISIS 481501, ISIS 481525, ISIS 481548, ISIS 481549, ISIS 481597, ISIS 481695, ISIS 481700, ISIS 481702, ISIS 481710, ISIS 481725, ISIS 481750 i ISIS 481763. U određenim otelotvorenjima, takva jedinjenja uključuju jedinjenja koja sadrže sekvencu bilo koje od SEQ ID NO 57, 90, 90, 175, 223, 245, 267, 307, 317, 318, 366, 411, 413, 54, 258, 268, 272, 288, 464, 367, 393, 1564, 1568, 1571, 1572, 1590, 1670, 1693, 1728, 1770, 1826, 1829, 1835, 1847, 1910, 1997, 2168, 2198, 2325, 2339, 2720, 2731, 2732 i 2756.
Motivi antisens jedinjenja
[0141] U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja koja su ciljana na STAT3 nukleinsku kiselinu imaju hemijski modifikovane podjedinice raspoređene u obrascima, ili motive, kako bi se prenela svojstva antisens jedinjenja kao što je pojačana inhibitorna aktivnost, povećani afinitet vezivanja za ciljanu nukleinsku kiselinu, ili otpornost na degradaciju in vivo nukleaze.
[0142] Himerna antisens jedinjenja tipično sadrže najmanje jedna modifikovan region tako da se dobije povećana otpornost na degradaciju nukleaze, povećano preuzimanje ćelija, povećani afinitet vezivanja za ciljanu nukleinsku kiselinu, i/ili povećana inhibitorna aktivnost. Druga oblast himernog antisens jedinjenja može opciono da služi kao supstrat za celularnu endonukleazu RNazu H, koja cepa RNK lanac RNK:DNK dupleksa.
[0143] Antisens jedinjenja koja imaju gapmer motiv se smatraju himernim antisens jedinjenjima. U gapmeru, unutrašnji region koji ima mnoštvo nukleotida koji podržava cepanje RNazeH je pozicioniran između spoljnih regiona koji imaju mnoštvo nukleotida koji su hemijski različiti od nukleozida unutrašnjeg regiona. U slučaju antisens oligonukleotida koji ima gapmer motiv, segment jaza obično služi kao supstrat za cepanje endonukleaze, dok segmenti krila sadrže modifikovane nukleozide. U određenim otelotvorenjima, regioni gapmera se razlikuju prema tipovima šećernih ostataka koji obuhvataju svaku posebnu regiju. Tipovi šećernih ostataka koji se koriste za razlikovanje regiona gapmera mogu u nekim otelotvorenjima da uključuju P-D-ribonukleozide, P-D-dezoksiribonukleozide, 2'-modifikovane nukleozide (takvi 2'-modifikovani nukleozidi mogu uključivati 2'-MOE i 2'-O-CH3, između ostalog), i biciklični šećerom modifikovani nukleozidi (takvi biciklični šećerom modifikovani nukleozidi mogu uključivati one koji imaju ograničen etil). U određenim otelotvorenjima, krila mogu uključivati nekoliko modifikovanih šećernih grupa, uključujući, na primer, 2'-MOE i ograničeni etil. U određenim otelotvorenjima, krila mogu da sadrže nekoliko modifikovanih i nemodifikovanih šećernih grupa. U određenim otelotvorenjima, krila mogu da uključuju različite kombinacije 2'-MOE nukleozida, etil nukleozida sa ograničenjem i 2'-dezoksinukleozida.
[0144] Svaki posebni region može da sadrži uniformne šećerne delove, varijante ili naizmenične šećernog dela. Krilo-jaz-krilo motiv se često opisuje kao „X-Y-Z“, gde „X“ predstavlja dužinu 5'-krila, „Y“ predstavlja dužinu jaza, i „Z“ predstavlja dužinu 3'-krila. „X“ i „Z“ mogu sadržati uniformne, varijante ili naizmenične šećernog dela. U nekim otelotvorenjima, „X“ i „Y“ mogu uključivati jedan ili više 2'-dezoksinukleozida.
„Y“ može da sadrži 2'-dezoksinukleozide. Kad se ovde koristi, gapmer opisan kao „X-Y-Z“ ima konfiguraciju takvu da se jaz nalazi neposredno pored svakog od 5'-krila i 3'-krila. Dakle, ne postoje intervenišući nukleotidi između 5'-krila i jaza, ili jaza i 3'-krila. Bilo koje od antisens jedinjenja koja su ovde opisana mogu imati gapmer motiv. U nekim otelotvorenjima, „X“ i „Z“ su isti, u drugim otelotvorenjima su različiti. U određenim otelotvorenjima, „Y“ je između 8 i 15 nukleozida. X, Y, ili Z mogu biti bilo koji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ili više nukleozida.
[0145] U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu ima 3-10-3 gapmer motiv.
Ciljane nukleinske kiseline, ciljani regioni i nukleotidne sekvence
[0146] Nukleotidne sekvence koje kodiraju STAT3 uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: GENBANK pristupni br. NM_139276,2 (uključen ovde kao SEQ ID NO: 1) i komplement od GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćen od nukleotida 4185000 do 4264000 kao SEQ ID NO: 2).
[0147] Podrazumeva se da je sekvenca prikazana u svakom SEQ ID NO u primerima koji su ovde sadržani nezavisna od bilo koje modifikacije šećernog dela, internukleozidne veze ili nukleobaze. Kao takva, antisens jedinjenja definisana sa SEQ ID NO mogu sadržati, nezavisno, jednu ili više modifikacija šećernog dela, internukleozidnu vezu ili nukleobazu. antisens jedinjenja opisana Isis brojem (Isis No) ukazuju na kombinaciju nukleobazne sekvence i motiva.
[0148] U određenim otelotvorenjima, ciljani region je strukturno definisani region ciljane nukleinske kiseline. Na primer, ciljani region može da obuhvati 3' UTR, 5' UTR, ekson, intron, ekson/intron spoj, kodirajući region, region inicijacije translacije, region terminacije translacije ili drugi definisani region nukleinske kiseline. Strukturno definisani regioni za STAT3 mogu se dobiti pristupnim brojem iz baza podataka o sekvencama kao što je NCBI. U određenim aspektima, ciljani region može obuhvatiti sekvencu od 5' ciljanog mesta jednog ciljanog segmenta unutar ciljanog regiona do 3' ciljanog mesta drugog ciljanog segmenta unutar istog ciljanog regiona.
[0149] Ciljanje obuhvata određivanje najmanje jednog ciljanog segmenta na koji se hibridizuje antisens jedinjenje, tako kako bi se postigla željeni efekat. U određenim otelotvorenjima, željeni efekat je smanjenje nivoa mRNK ciljanih nukleinskih kiselina. U nekim otelotvorenjima, željeni efekat je redukcija nivoa proteina kodiranog ciljanom nukleinskom kiselinom ili fenotipska promena povezana sa ciljanom nukleinskom kiselinom.
[0150] Ciljani region može da sadrži jedan ili više ciljanih segmenata. Više ciljanih segmenata unutar ciljanog regiona može se preklapati. Alternativno, one mogu biti nepreklapajući. U određenim otelotvorenjima, ciljani segmenti unutar ciljanog regiona su odvojeni ne više od oko 300 nukleotida. U određenim varijantama, ciljani segmenti unutar ciljanog regiona su odvojeni brojem nukleotida koji je, oko, nije veći od, nije veći od oko, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, ili 10 nukleotida na ciljanoj nukleinskoj kiselini, ili je opseg definisan bilo kojom od dve prethodne vrednosti. U određenim otelotvorenjima, ciljani segmenti unutar ciljanog regiona su odvojeni ne više od, ili ne više od oko, 5 nukleotida na ciljanoj nukleinskoj kiselini. U određenim otelotvorenjima, ciljani segmenti su susedni. Razmatrani su ciljani regioni definisani opsegom koji ima polaznu nukleinsku kiselinu koja je bilo koja od 5' ciljanih mesta ili 3' ciljana mesta koja su ovde navedena.
[0151] Pogodni ciljani segmenti mogu se naći unutar 5' UTR, kodirajućeg regiona, 3' UTR, introna, eksona ili ekson/intron spoja. Ciljani segmenti koji sadrže početni kodon ili zaustavni kodon su takođe pogodni ciljani segmenti. Prikladni ciljani segment može specifično isključiti određenoi strukturno definisan region kao što je početni kodon ili zaustavni kodon.
[0152] Određivanje pogodnih ciljanih segmenata može uključiti poređenje sekvence ciljane nukleinske kiseline sa drugim sekvencama u genomu. Na primer, BLAST algoritam se može koristiti za identifikaciju regiona sličnosti među različitim nukleinskim kiselinama. Ovo poređenje može da spreči selekciju antisens sekvenci jedinjenja koje mogu da se hibridizuju na nespecifičan način sa sekvencama koje nisu selektovane ciljane nukleinske kiseline (tj. neciljane sekvence ili van-ciljne sekvence).
[0153] Mogu postojati varijacije u aktivnosti (npr., kao što je definisano procentom smanjenja nivoa ciljane nukleinske kiseline) antisens jedinjenja unutar aktivnog ciljanog regiona. U određenim otelotvorenjima, redukcije u nivoima mRNK STAT3 ukazuju na inhibiciju eksprimiranja STAT3. Smanjenje nivoa STAT3 proteina takođe ukazuje na inhibiciju eksprimiranja ciljane mRNK. Dalje, fenotipske promene ukazuju na inhibiciju eksprimiranja STAT3. U određenim otelotvorenjima, smanjen rast ćelija, smanjen rast tumora i smanjena zapremina tumora mogu biti indikatori inhibicije eksprimiranja STAT3. U nekim otelotvorenjima, poboljšanje simptoma povezanih sa rakom može biti indikator inhibicije STAT3 eksprimiranja. U određenim aspektima, redukcija kaheksije je indikativna za inhibiciju eksprimiranja STAT3. U određenim aspektima, redukcija markera kancera može biti indikator inhibicije eksprimiranja STAT3.
Hibridizacija
[0154] U nekim otelotvorenjima, hibridizacija se dešava između antisens jedinjenja opisanog ovde i STAT3 nukleinske kiseline. Najčešći mehanizam hibridizacije je vezivanje vodonika (npr. --Crick, Hoogsteen-ovo ili obrnuto Hoogsteen-ovo vezivanje vodonika) između komplementarnih nukleobaza molekula nukleinske kiseline.
[0155] Hibridizacija se može odvijati pod različitim uslovima. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i određeni su prirodom i sastavom molekula nukleinske kiseline koje treba hibridizovati.
[0156] Postupci za određivanje da li se sekvenca može specifično hibridizovati u ciljanu nukleinsku kiselinu su dobro poznati u struci. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja koja su ovde pružena su specifično hibridizovana sa STAT3 nukleinskom kiselinom.
Komplementarnost
[0157] Antisens jedinjenje i ciljana nukleinska kiselina su komplementarne jedna drugoj kada dovoljan broj nukleobaza antisens jedinjenja može vodonično da se veže sa odgovarajućim nukleobazama ciljane nukleinske kiseline, tako da će doći do željenog efekta (npr. Antisens inhibicija ciljane nukleinske kiseline, kao što je STAT3 nukleinska kiselina).
[0158] Ne-komplementarne nukleobaze između antisens jedinjenja i STAT3 nukleinske kiseline mogu se tolerisati pod uslovom da antisens jedinjenje ostaje sposobno da se specifično hibridizuje sa ciljanom nukleinskom kiselinom. Štaviše, antisens jedinjenje može hibridizovati preko jednog ili više segmenata nukleinske kiseline STAT3 tako da intervenišući ili susedni segmenti nisu uključeni u događaj hibridizacije (npr., struktura petlje, neusklađenost ili struktura ukosnice).
[0159] U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja koja su ovde pružena, ili određeni njihov deo, su, ili su najmanje, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% komplementarni sa STAT3 nukleinskom kiselinom, ciljanim regionom, ciljanim segmentom ili određenim delom. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa ciljanom nukleinskom kiselinom može se odrediti pomoću rutinskih postupaka.
[0160] Na primer, antisens jedinjenje u kom je 18 od 20 nukleobaza antisens jedinjenja komplementarno ciljanom regionu, i stoga bi se specifično hibridizovalo, predstavljalo bi komplementarnost od 90%. U ovom primeru, preostale ne-komplementarne nukleobaze mogu biti grupisane ili isprepletene sa komplementarnim nukleobazama, i ne moraju biti povezane jedna sa drugom ili sa komplementarnim nukleobazama. Kao takvo, antisens jedinjenje koje ima dužinu od 18 nukleobaza koje imaju četiri ne-komplementarne nukleobaze koje su okružene sa dva regiona potpune komplementarnosti sa ciljanom nukleinskom kiselinom, imalo bi 77,8% ukupne komplementarnosti sa ciljanom nukleinskom kiselinom, i tako bi spadalo u opseg ovog pronalaska. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa regionom ciljane nukleinske kiseline može se rutinski odrediti korišćenjem BLAST programa (basic local alignment search tool - osnovni alat za lokalno poravnanje) i PowerBLAST programa poznatih u struci (Altschul i dr., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang i Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). Procenat homologije, identičnost sekvenci ili komplementarnosti, mogu se odrediti, na primer, Gap programom (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), Koristeći podrazumevana podešavanja, kojii koriste algoritam Smith i Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0161] U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja pružena ovde, ili njihovi specifični delovi, su potpuno komplementarni (tj.100% komplementarni) sa ciljanom nukleinskom kiselinom, ili specifičnim delom. Na primer, antisens jedinjenje može biti potpuno komplementarno sa STAT3 nukleinskom kiselinom, ili ciljanim regionom, ili ciljanim segmentom ili ciljanom sekvencom. Kad se ovde koristi, „potpuno
komplementarno“ označava svaku nukleobazu antisens jedinjenja koja je sposobna da precizno upari bazu sa odgovarajućim nukleobazama ciljane nukleinske kiseline. Na primer, antisens jedinjenje od 20 nukleobaza je potpuno komplementarno sa ciljanom sekvencom koja je dugačka 400 nukleobaza, sve dok postoji odgovarajući deo nukleobaze ciljane nukleinske kiseline koji je potpuno komplementaran antisens jedinjenju. Potpuno komplementarno može takođe da se koristi u odnosu na specifični deo prve i/ili druge nukleinske kiseline. Na primer, 20 nukleobazni deo antisens jedinjenja od 30 nukleobaza može biti „potpuno komplementaran“ sa ciljanom sekvencom koja je dugačka 400 nukleobaza. 20 nukleobazni deo od 30 nukleobaznog oligonukleotida je potpuno komplementaran sa ciljanom sekvencom ako ciljana sekvenca ima odgovarajući deo od 20 nukleobaza gde je svaka nukleobaza komplementarna sa 20 nukleobaznim delom antisens jedinjenja. U isto vreme, celokupna antisens jedinjenja od 30 nukleobaza mogu ali ne moraju biti potpuno komplementarne ciljanoj sekvenci, u zavisnosti od toga da li su preostalih 10 nukleobaza antisens jedinjenja takođe komplementarne ciljanoj sekvenci.
[0162] Lokacija ne-komplementarne nukleobaze može biti na 5' kraju ili 3' kraju antisens jedinjenja. Alternativno, ne-komplementarna nukleobaza ili nukleobaze mogu biti na unutrašnjem položaju antisens jedinjenja. Kada su prisutne dve ili više ne-komplementarnih nukleobaza, one mogu biti susedne (tj. povezane) ili nepovezane. U jednom otelotvorenju, ne-komplementarna nukleobaza se nalazi u krilnom segmentu gapmer antisens oligonukleotida.
[0163] U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja koja su, ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 nukleobaza dužine sadrže ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 ne-komplementarne nukleobaze (a) u odnosu na ciljanu nukleinsku kiselinu, kao što je STAT3 nukleinska kiselina, ili određeni njen deo.
[0164] U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenja koja su, ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleobaza dužine ne sadrže više od 6, ne više od 5, ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 ne-komplementarne nukleobaze u odnosu na ciljanu nukleinsku kiselinu kao što je STAT3 nukleinska kiselina, ili određeni njen deo.
[0165] Antisens jedinjenja pružena ovde takođe uključuju ona koja su komplementarni delu ciljane nukleinske kiseline. Kad se ovde koristi, „deo“ se odnosi na definisani broj susednih (tj. povezanih) nukleobaza unutar regiona ili segmenta ciljane nukleinske kiseline. „Deo“ se takođe može odnositi na definisani broj susednih nukleobaza antisens jedinjenja. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 8 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 9 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 10 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna najmanje jednom delu od 11 nukleobaza ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 12 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 13 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 14 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa najmanje 15 nukleobaznim delom ciljanog segmenta. Takođe se razmatraju antisens jedinjenja koja su komplementarna bar 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više nukleobaznim delovima ciljanog segmenta, ili opsegom definisanim sa bilo koje dve od ovih vrednosti.
Identičnost
[0166] Antisens jedinjenja koja su ovde pružena mogu takođe da imaju definisan procenat identičnosti za određenu nukleotidnu sekvencu, SEQ ID NO, ili jedinjenje predstavljeno specifičnim Isis brojem, ili njegovim delom. Kad se ovde koristi, antisens jedinjenje je identično sekvenci koja je ovde opisana ako ima istu sposobnost sparivanja nukleobaza. Na primer, RNK koja sadrži uracil umesto timidina u opisanoj DNK sekvenci bi se smatrala identičnom DNK sekvenci pošto su i uracil i timidin par sa adeninom. Takođe se razmatraju skraćene i produžene verzije ovde opisanih antisens jedinjenja, kao i jedinjenja koja imaju neidentične baze u odnosu na antisens jedinjenja koja su ovde pružena. Ne-identične baze mogu biti jedna do druge ili dispergovane u antisens jedinjenju. Procenat identičnosti antisens jedinjenja se izračunava prema broju baza koje imaju identično uparivanje baza u odnosu na sekvencu sa kojom se upoređuje.
[0167] U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja, ili njihovi delovi, su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični jednom ili više antisens jedinjenja ili SEQ ID NOs, ili njihovog dela, koji je ovde opisan.
[0168] U određenim otelotvorenjima, deo antisens jedinjenja se upoređuje sa delom ciljane nukleinske kiseline jednake dužine. U određenim aspektima, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobazni deo upoređuje se sa delom jednake dužine ciljane nukleinske kiseline.
[0169] U određenim otelotvorenjima, deo antisens oligonukleotida je upoređen sa delom ciljane nukleinske kiseline jednake dužine. U određenim aspektima, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobazni deo upoređuje se sa delom jednake dužine ciljane nukleinske kiseline.
Modifikacije
[0170] Nukleozid je baza-šećer kombinacija. Nukleobazni (takođe poznat kao bazni) deo nukleozida je normalno heterociklična baza. Nukleotidi su nukleozidi koji dalje uključuju fosfatnu grupu kovalentno vezanu za šećerni deo nukleozida. Za one nukleozide koji uključuju pentofuranosil šećer, fosfatna grupa može biti vezana za 2', 3' ili 5' hidroksilnu grupu šećera. Oligonukleotidi se formiraju preko kovalentne veze susednih nukleozida jedan prema drugom, kako bi se formirao linearni polimerni oligonukleotid. Unutar oligonukleotidne strukture, fosfatne grupe se obično pominju pri formiranju internukleozidnih veza oligonukleotida.
[0171] Modifikacije na antisens jedinjenjima obuhvataju supstitucije ili promene na internukleozidnim vezama, šećernim ostacima ili nukleobazama. Modifikovana antisens jedinjenja su često poželjnija u odnosu na nativne forme zbog poželjnih svojstava kao što su, na primer, pojačano preuzimanje ćelija, poboljšani afinitet za cilj nukleinske kiseline, povećana stabilnost u prisustvu nukleaza, ili povećana inhibitorna aktivnost.
[0172] Hemijski modifikovani nukleozidi se takođe mogu koristiti za povećanje afiniteta vezivanja skraćenog ili isečenog antisens oligonukleotida za njegovu ciljanu nukleinsku kiselinu. Prema tome, uporedivi rezultati se često mogu dobiti sa kraćim antisens jedinjenjima koja imaju takve hemijski modifikovane nukleozide.
Modifikovane internukleozidne veze
[0173] Prirodno prisutna internukleozidna veza RNK i DNK je 3' do 5' fosfodiesterska veza. Antisens jedinjenja koja imaju jednu ili više modifikovanih, tj. ne-prirodnih, internukleozidnih veza često se biraju preko antisens jedinjenja koja imaju prirodne internukleozidne veze zbog poželjnih svojstava kao što su, na primer, pojačani ćelijski unos, pojačani afinitet za ciljane nukleinske kiseline, i povećana stabilnost u prisustvu nukleaza.
[0174] Oligonukleotidi koji imaju modifikovane internukleozidne veze uključuju internukleozidne veze koje zadržavaju atom fosfora kao i internukleozidne veze koje nemaju atom fosfora. Reprezentativni fosfor koji sadrže internukleozidne veze uključuje, ali nije ograničen na, fosfodiestre, fosfotiestere, metilfosfonate, fosforamidat i fosforotioate. Postupci pripreme fosfornih i ne-fosfornih veza su dobro poznati.
[0175] U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenja koja su ciljana na STAT3 nukleinsku kiselinu sadrže jednu ili više modifikovanih internukleozidnih veza. U nekim otelotvorenjima, modifikovane internukleozidne veze su fosforotioatne veze. U nekim otelotvorenjima, svaka internukleozidna veza antisens jedinjenja je fosforotioatna internukleozidna veza.
Modifikovani šećerni delovi
[0176] Antisens jedinjenja pružena ovde mogu opciono sadržati jedan ili više nukleozida u kojima je šećerna grupa modifikovana. Takvi šećerno modifikovani nukleozidi mogu da podstaknu pojačanu nukleaznu stabilnost, povećani afinitet vezivanja ili neka druga korisna biološka svojstva za antisens jedinjenja. U određenim otelotvorenjima, nukleozidi sadrže hemijski modifikovani deo ribofuranoznog prstena. Primeri hemijski modifikovanih ribofuranoznih prstenova uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje supstituentskih grupa (uključujući 5' i 2' supstituentske grupe); premošćivanje ne-geminalnih atoma prstena kako bi se formirale biciklične nukleinske kiseline (BNA); zamenu atoma kiseonika ribozilnog prstena sa S, N(R) ili C(R1)(R)2(R = H, C1-C12alkilom ili zaštitnom grupom); i njihove kombinacije. Primeri hemijski modifikovanih šećera uključuju, 2'-F-5'-metil supstituisani nukleozid (pogledati, PCT International Application WO 2008/101157, objavljen 8/21/08 za druge otkrivene 5',2'-bis supstituisane nukleozide), zamena atoma kiseonika ribozil prstena sa S sa dodatnom supstitucijom na 2'-položaju (pogledati, PCT International Application WO US2005/0130923, objavljen 16. juna 2005), ili, alternativno, 5'-supstitucija BNA (pogledati, PCT International Application WO 2007/134181, objavljen 11/22/07, gde je LNA supstituisana sa, na primer, 5'-metil ili 5'-vinil grupom).
[0177] Primeri nukleozida koji imaju modifikovane šećerne delove uključuju, ali nisu ograničeni na, nukleozide koji sadrže 5'-vinil, 5'-metil (R ili S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, i 2'-O(CH2)2OCH3supstituentske grupe. Supstituent na položaju 2' može takođe biti izabran iz grupe koju čine alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) i O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), gde je svaki Rm i Rn, nezavisno, H ili supstituisan ili nesupstituisan C1-C10alkil.
[0178] Kad se ovde koristi, „biciklični nukleozidi“ se odnose na modifikovane nukleozide koji sadrže biciklični šećerni deo. Primeri bicikličnih nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, nukleozide koji sadrže most između 4' i 2' ribozil atoma prstena. U određenim otelotvorenjima, antisens jedinjenja pružena ovde uključuju jedan ili više bicikličnih nukleozida, gde most sadrži 4' do 2' biciklični nukleozid. Primeri takvih 4' do 2' bicikličnih nukleozida, uključuju, ali nisu ograničeni na, jednu od formula: 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' and 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', i njihovi analozi (pogledati, U.S. Patent 7,399,845, objavljen 15. jula 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', i njegovi analozi (pogledati, objavljen PCT International Application WO2009/006478, objavljen 8. januara 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2', i njegovi analozi (pogledati, objavljen PCT International Application WO2008/150729, objavljen 11. decembra 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (pogledati, U.S. Patent Application US2004/0171570, objavljen 2. septembra 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2' gde R je H, C1-C12alkil, ili zaštitna grupa (pogledati, U.S. Patent 7,427,672, objavljen 23. septembra 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (pogledati, Chattopadhyaya, i dr., J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134); i 4'-CH2-C(=CH2)-2', i njegovi analozi (pogledati, objavljen PCT International Application WO 2008/154401, objavljen 8. decembra 2008). Takođe pogledati, na primer: Singh i dr., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin i dr., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar i dr., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh i dr., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava i dr., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul.
4, 2007); Elayadi i dr., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch i dr., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum i dr., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. Patent Nos U.S. 6,670,461, 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 7,399,845; objavljene PCT International applications WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570, i WO 2007/134181; U.S. Patent Publication Nos. US2004/0171570, US2007/0287831, i US2008/0039618; i U.S. Patent Serial Nos. 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787, i 61/099,844; i PCT International Application Nos. PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, i PCT/US2008/068922. Svaki od prethodnih bicikličnih nukleozida može biti pripremljen sa jednom ili više stereohemijskih konfiguracija šećera, uključujući na primer a-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (pogledati PCT međunarodnu prijavu PCT/DK98/00393, objavljenu 25. marta 1999 kao WO 99/14226).
[0179] U određenim otelotvorenjima, biciklični šećerni delovi BNA nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja koja imaju bar jedan most između 4' i 2' položaja pentofuranozil šećernog dela gde takvi mostovi nezavisno sadrže 1 ili od 2 do 4 povezane grupe nezavisno izabrane od - [C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, i -N(Ra)-;
gde:
x je 0, 1, ili 2;
n je 1, 2, 3, ili 4;
svaki Rai Rbje, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisan C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisan C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisan C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisan C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisan heterociklični radikal, heteroaril, supstituisan heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisan C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisan acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisan C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisan C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisan C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisan C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisan acil, heterociklični radikal, supstituisan heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisan C1-C12aminoalkil, ili zaštitna grupa.
[0180] U određenim otelotvorenjima, most bicikličnog šećernog dela je, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- ili, -C(RaRb)-O-N(R)-. U određenim otelotvorenjima, most je 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', i 4'-CH2-N(R)-O-2'-, gde je svaki Ris, nezavisno, H, zaštitna grupa, ili C1-C12alkil.
[0181] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozidi su dalje definisani izomernom konfiguracijom. Na primer, nukleozid koji sadrži 4'-2' metilen-oksi most, može biti u α-L konfiguraciji ili u P-D konfiguraciji. Ranije, α-L-metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA su inkorporirani u antisens oligonukleotide koji su pokazali antisens aktivnost (Frieden i dr., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
[0182] U nekim otelotvorenjima, biciklični nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na, (A) α-L-Metileneoksi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) β-D-Metileneoksi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etileneoksi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) Aminooksi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oksiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) Metil(metileneoksi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil karbociklični (4'CH2-CH(CH3)-2') BNA, i (J) propilen karbociklični (4'-(CH2)3-2') BNA kako je prikazano u nastavku.
gde je Bx bazni deo i R je, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.
[0183] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozid ima Formulu I:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
-Qa-Qb-Qc- je -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O-, ili -N(Rc)-O-CH2;
Rcje C1-C12alkil ili amino zaštitna grupa; i
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalent vezan za potporni medijum.
[0184] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozid ima Formulu II:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalent vezan za potporni medijum;
Zaje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisan C1-C6alkil, supstituisan C2-C6alkenil, supstituisan C2-C6alkinil, acil, supstituisan acil, supstituisan amid, tiol, ili supstituisan tio.
[0185] U jednom otelotvorenju, svaka od supstituisanih grupa je, nezavisno, mono ili poli supstituisana sa supstituentskim grupama nezavisno izabranim od halogena, okso, hidroksila, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, i NJeC(=X)NJcJd, gde je svaki Jc, Jd, i Je, nezavisno, H, C1-C6alkil, ili supstituisan C1-C6alkil i X je O ili NJc.
[0186] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozid ima Formulu III:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalent vezan za potporni medijum;
Zbje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisan C1-C6alkil, supstituisan C2-C6alkenil, supstituisan C2-C6alkinil, ili supstituisan acil (C(=O)-).
[0187] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozid ima Formulu IV:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalent vezan za potporni medijum;
Rdje C1-C6alkil, supstituisan C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisan C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, ili supstituisan C2-C6alkinil;
svaki qa, qb, qci qdje, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisan C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisan C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, ili supstituisan C2-C6alkinil, C1-C6alkoksil, supstituisan C1-C6alkoksil, acil, supstituisan acil, C1-C6aminoalkil, ili supstituisan C1-C6aminoalkil;
[0188] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozid ima Formulu V:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalent vezan za potporni medijum;
qa, qb, qei qfsu svaki, nezavisno, hidrogen, halogen, C1-C12alkil, supstituisan C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisan C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisan C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, supstituisan C1-C12alkoksi, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk;
ili qei qfzajedno su =C(qg)(qh);
qgi qhsu svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, ili supstituisan C1-C12alkil.
[0189] Opisane su sinteza i priprema metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNO monomera adenina, citozina, gvanina, 5-metil-citozina, timina i uracila, zajedno sa njihovim oligomerizacijama i svojstvima prepoznavanja nukleinske kiseline (pogledati, npr. Koshkin i dr., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA i njihova priprema su takođe opisani u WO 98/39352 i WO 99/14226.
[0190] Analozi metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA, metilenoksi(4'-CH2-O-2') BNA, i 2'-tio-BNA, takođe su pripremljene (pogledati, npr. Kumar i dr., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Takođe je opisana priprema zaključanih nukleozidnih analoga koji sadrže oligodezoksiribonukleotidne duplekse kao supstrate za polimeraze nukleinske kiseline.
Pogledati, npr. Wengel i dr., WO 99/14226). Pored toga, sinteza 2'-amino-BNA, novog komformaciono ograničenog visoko-afinitetnog oligonukleotidnog analoga, opisana je u struci (pogledati, npr. Singh i dr., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Pored toga, pripremljene su 2'-amino- i 2'-metilamino-BNA, i prethodno je opisana termička stabilnost njihovih dupleksa sa komplementarnim RNK i DNK lancima.
[0191] U određenim otelotvorenjima, biciklični nukleozid ima Formulu VI:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalent vezan za potporni medijum;
svaki qi, qj, qki qlje, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, supstituisan C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisan C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisan C2-C12alkinil, C1-C12alkoksil, supstituisan C1-C12alkoksil, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk, ili N(H)C(=S)NJjJk; i
qii qjili qli qkzajedno su =C(qg)(qh), gde qgi qhsu svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, ili supstituisan C1-C12alkil.
[0192] Jedan karbociklični biciklični nukleozid koji ima 4'-(CH2)3-2' most, i alkenil analog, most 4'-CH=CH-CH2-2', su opisani (pogledati, npr. Freier i dr., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 i Albaek i dr., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Sinteza i priprema karbocikličnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovim oligomerizacijama i biohemijskim studijama su takođe opisani (pogledajte, npr. Srivastava i dr., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
[0193] Kad se ovde koristi, „4'-2' biciklični nukleozid“ ili „4' do 2' biciklični nukleozid“ se odnosi na biciklični nukleozid koji sadrži furanozni prsten, koji sadrži most koji povezuje 2' atom ugljenika i 4' atom ugljenika.
[0194] Kad se ovde koristi, „monociklični nukleozidi“ se odnose na nukleozide koji sadrže modifikovane šećerne delove koji nisu biciklični ostaci šećera. U određenim otelotvorenjima, šećerni ostatak, ili analog šećernog dela, nukleozida može biti modifikovan ili supstituisan na bilo kom položaju.
[0195] Kad se ovde koristi, „2'-modifikovani šećer“ označava furanozil šećer modifikovan na položaju 2'. U određenim aspektima, takve modifikacije uključuju supstituente izabrane od: halogenida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, supstituisani i nesupstituisani alkoksi, supstituisani i nesupstituisani tioalkil, supstituisani i nesupstituisani amino alkil, supstituisani i nesupstituisani alkil, supstituisani i nesupstituisani alil, i supstituisani i nesupstituisani alil, i supstituisani i nesupstituisani i supstituisani i nesupstituisani i supstituisani i nesupstituisani i supstituisani i nesupstituisani i supstituisani i nesupstituisani alkinil. U određenim aspektima, 2' modifikacije su izabrane od supstituenata uključujući, ali ne ograničavajući se na:
O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2gde su n i m od 1 do oko 10. Druge 2'-supstituent grupe mogu takođe biti izabrane iz grupe koju čine: C1-C12alkil; supstituisani alkil; alkenil; alkinil; alkaril; aralkil; O-alkaril ili O-aralkil; SH; SCH3; OCN; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocikloalkil; heterocikloalkaril; aminoalkilamino; polialkilamino; supstituisani silil; grupa za cepanje RNK; reporter grupa; interkalator; grupa za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava; i grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava antisens jedinjenja i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleozidi sadrže 2'-MOE bočni lanac (pogledati, npr. Baker i dr., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Takva 2'-MOE supstitucija je opisana kao da ima poboljšani afinitet vezivanja u poređenju sa nemodifikovanim nukleozidima i drugim modifikovanim nukleozidima, kao što je 2'-O-metil, O-propil, i O-aminopropil. Pokazalo se da su i oligonukleotidi koji imaju 2'-MOE supstituent antisens inhibitori eksprimiranja gena sa obećavajućim karakteristikama za in vivo koristiti (pogledati, npr. Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann i dr., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann i dr., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; i Altmann i dr., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0196] Kad se ovde koristi, „modifikovani tetrahidropiran nukleozid“ ili „modifikovani THP nukleozid“ označava nukleozid koji ima šestočlani tetrahidropiran „šećer“, supstituisan u pentofuranozilnom ostatku u normalnim nukleozidima (surogat šećera). Modifikovani THP nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na, ono što se u struci naziva heksitol nukleinska kiselina (HNA), anitol nukleinska kiselina (ANA), manitol nukleinska kiselina (MNA) (pogledati Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10: 841-854), fluoro HNA (F-HNA), ili ona jedinjenja koja imaju Formulu X:
gde nezavisno za svaki od navedenog bar jednog analog tetrahidropiran nukleozida Formule X:
Bx je heterociklični bazni deo;
T3i T4su svaki, nezavisno, internukleozidna vezivna grupa koja vezuje analog tetrahidropiran nukleozida za antisens jedinjenje ili je jedan od T3i T4internukleozidna vezivna grupa koja vezuje analog tetrahidropiran nukleozida za antisens jedinjenje i drugi od T3i T4je H, hidroksil zaštitna grupa, povezana konjugatna grupa, ili 5' ili 3'-terminalna grupa;
q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisan C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisan C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, ili supstituisan C2-C6alkinil; i jedan od R1i R2je hidrogen i drugi je izabran iz grupe koju čine halogen, supstituisan ili nesupstituisan alkoksi, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2, i CN, gde X je O, S, ili NJ1, i svaki J1, J2, i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil.
[0197] U određenim otelotvorenjima, pruženi su modifikovani THP nukleozidi Formule X, gde qm, qn, qp, qr, qs, qt, i qusu svaki H. U određenim otelotvorenjima, barem jedan od qm, qn, qp, qr, qs, qt, i quje nešto drugo osim H. U određenim otelotvorenjima, barem jedan od qm, qn, qp, qr, qs, qti quje metil. U određenim otelotvorenjima, pruženi su THP nukleozidi Formule X, gde jedan od R1i R2je F. U određenim otelotvorenjima, R1je fluoro i R2je H, R1je metoksi i R2je H, i R1je metoksietoksi i R2je H.
[0198] Kad se ovde koristi, „2'-modifikovani“ ili „2'-supstituisani“ se odnosi na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži supstituent na 2' položaju različit od H ili OH.2'-modifikovani nukleozidi, uključuju, ali nisu ograničeni na, biciklične nukleozide u kojima most koji povezuje dva atoma ugljenika u prstenu šećera povezuje 2' ugljenik i drugi ugljenik šećernog prstena i nukleozide sa ne-premošćavajućim 2' supstituentima, kao što su alil, amino, azido, tio, O-alil, OC1-C10alkil, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ili O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), gde je svaki Rmi Rn, nezavisno, H ili supstituisan ili nesupstituisan C1-C10alkil.2'-modifikovani nukleozidi mogu dalje da sadrže druge modifikacije, na primer, na drugim položajima šećera i/ili na nukleobazi.
[0199] Kad se ovde koristi, „2'-F“ se odnosi na šećer koji sadrži fluoro grupu na položaju 2'.
[0200] Kad se ovde koristi, „2'-OMe“ ili „2'-OCH3“ ili „2'-O-metil“, svaki se odnosi na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži - OCH3grupu na 2' položaju šećernog prstena.
[0201] Kad se ovde koristi, „oligonukleotid“ se odnosi na jedinjenje koje sadrži mnoštvo povezanih nukleozida. U određenim otelotvorenjima, jedna ili više od mnoštva nukleozida je modifikovan. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži jedan ili više ribonukleozida (RNK) i/ili dezoksiribonukleozida (DNK).
[0202] Mnogi drugi biciklični i triciklični surogatni sistemi prstena su takođe poznati u struci, i mogu se koristiti za modifikaciju nukleozida za inkorporaciju u antisens jedinjenja (pogledati, npr. članak: Leumann, J.C., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
Takvi sistemi prstena mogu proći kroz različite dodatne supstitucije kako bi se pojačala aktivnost.
[0203] Postupci za pripremu modifikovanih šećera su dobro poznati stručnjacima.
[0204] U nukleotidima koji imaju modifikovane šećerne delove, ostaci nukleobazne grupe (prirodni, modifikovani ili njihova kombinacija) su održavani za hibridizaciju sa odgovarajućom nukleinskom kiselinom.
[0205] U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenja sadrže jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovane šećerne delove. U određenim aspektima, modifikovani šećerni deo je 2'-MOE. U određenim otelotvorenjima, 2'-MOE modifikovani nukleotidi su raspoređeni u gapmer motivu. U određenim otelotvorenjima, modifikovana šećerna grupa je cEt. U određenim aspektima, cEt modifikovani nukleotidi su raspoređeni po krilima gapmer motiva.
Sastavi i postupci za formulisanje farmaceutskih sastava
[0206] Antisens oligonukleotidi se mogu pomešati sa farmaceutski prihvatljivim aktivnim ili inertnim supstancama za pripremu farmaceutskih sastava ili formulacija. Sastavi i postupci za formulaciju farmaceutskih sastava zavise od brojnih kriterijuma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, put primene, obim bolesti, ili dozu koju treba primeniti.
[0207] Antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu može se koristiti u farmaceutskim sastavima kombinovanjem antisens jedinjenja sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Farmaceutski prihvatljivi razblaživač uključuje fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS). PBS je razblaživač pogodan za upotrebu u sastavima koje se isporučuju parenteralno. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, koje se koristi u ovde opisanim postupcima, je farmaceutski sastav koja sadrži antisens jedinjenje koje cilja STAT3 nukleinsku kiselinu i farmaceutski prihvatljiv razblaživač. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljivi razblaživač je PBS. U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenje je antisens oligonukleotid.
[0208] Farmaceutski sastavi koje sadrže antisens jedinjenja obuhvataju bilo koje farmaceutski prihvatljive soli, estre ili soli takvih estara, ili bilo koji drugi oligonukleotid koji je, nakon primene na životinji, uključujući čoveka, sposoban da obezbedi (direktno ili indirektno) biološki aktivan metabolit ili njegov ostatak. U skladu sa tim, na primer, opis se takođe odnosi na farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, prolekove, farmaceutski prihvatljive soli takvih prolekova i druge bioekvivalenate. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, soli natrijuma i kalijuma.
[0209] Prolek može uključivati inkorporaciju dodatnih nukleozida na jednom ili oba kraja antisens jedinjenja koje se cepaju endogenim nukleazama u telu, kako bi se formiralo aktivno antisens jedinjenje.
Konjugovana antisens jedinjenja
[0210] Antisens jedinjenja mogu biti kovalentno vezana za jednu ili više grupa ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje dobijenih antisens oligonukleotida. Tipične konjugovane grupe uključuju delove holesterola i lipidne delove. Dodatne grupe konjugata uključuju ugljene hidrate, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrakinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje.
[0211] Antisens jedinjenja se takođe mogu modifikovati tako da imaju jednu ili više stabilizujućih grupa koje su generalno vezane za jedan ili oba kraja antisens jedinjenja kako bi se poboljšala svojstva kao što je, na primer, stabilnost nukleaze. U stabilizujuće grupe spadaju i strukture kapica. Ove terminalne modifikacije štite antisens jedinjenje koje ima terminalnu nukleinsku kiselinu od degradacije egzonukleaze, i može pomoći u isporuci i/ili lokalizaciji unutar ćelije. Kapica može biti prisutna na 5'-kraju (5'-kapica), ili na 3'-kraju (3'-kapica), ili može biti prisutna na oba kraja. Strukture kapica su dobro poznate u struci i uključuju, na primer, invertovane dezoksi abazne kapice. Dalje, 3' i 5'-stabilizujuće grupe koje se mogu koristiti za zaustavljanje jednog ili oba kraja antisens jedinjenja za davanje stabilnosti nukleaze uključuju one opisane u WO 03/004602 objavljenog 16. januara 2003.
Kultura ćelija i tretman antisens jedinjenja
[0212] Efekti antisens jedinjenja na nivo, aktivnost ili eksprimiranje STAT3 nukleinskih kiselina se mogu testirati in vitro u različitim tipovima ćelija. Tipovi ćelija koji se koriste za takve analize dostupni su od komercijalnih dobavljača (e.g. American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) i uzgajaju se u skladu sa uputstvima prodavca upotrebom komercijalno dostupnih reagensa (npr. Invitrogen Life Technologyes, Carlsbad, CA).
Ilustrativni tipovi ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, HuVEC ćelije, b.END ćelije, HepG2 ćelije, Hep3B ćelije i primarne hepatocite.
In vitro testiranje antisens oligonukleotida
[0213] Ovde su opisani postupci za tretiranje ćelija sa antisens oligonukleotidima, koji se mogu na odgovarajući način modifikovati za tretman sa drugim antisens jedinjenjima.
[0214] Ćelije mogu biti tretirane sa antisens oligonukleotidima kada ćelije dostignu približno 60-80% konfluence u kulturi.
[0215] Jedan reagens koji se obično koristi za uvođenje antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje katjonski reagens za transfekciju lipida LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). antisens oligonukleotidi mogu biti pomešani sa LIPOFECTIN u OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kako bi se postigla željena konačna koncentracija antisens oligonukleotida i LIPOFECTIN koncentracije koja može biti u opsegu od 2 do 12 µg/mL na 100 nM antisens oligonukleotida.
[0216] Drugi reagens koji se koristi za uvođenje antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotid je pomešan sa LIPOFECTAMINE u OPTI-MEM 1 redukovanom serumskom medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) kako bi se postigla željena koncentracija antisens oligonukleotida i LIPOFECTAMINE koncentracija koja može biti u opsegu od 2 do 12 µg/mL na 100 nM antisens oligonukleotida.
[0217] Druga tehnika koja se koristi za uvođenje antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje elektroporaciju.
[0218] Ćelije se tretiraju sa antisens oligonukleotidima rutinskim postupcima. Ćelije se mogu sakupljati 16-24 sata nakon tretiranja antisens oligonukleotidom, gde se vreme RNK ili proteinski nivoi ciljanih nukleinskih kiselina mere postupcima poznatim u struci i ovde opisanim. Generalno, kada se tretmani izvode u višestrukim ponavljanjima, podaci se prikazuju kao prosek ponovljenih tretmana.
[0219] Koncentracija upotrebljenog antisens oligonukleotida varira od ćelijske linije do ćelijske linije. Postupci za određivanje optimalne koncentracije antisens oligonukleotida za određenu ćelijsku liniju su dobro poznati u struci. antisens oligonukleotidi se obično koriste u koncentracijama u rasponu od 1 nM do 300 nM kada su transfektovani sa LIPOFECTAMINE. antisens oligonukleotidi se koriste u višim koncentracijama u rasponu od 625 do 20,000 nM kada su transfektovani pomoću elektroporacije.
Testovi slobodnog preuzimanja
[0220] U određenim otelotvorenjima, aktivnost nezavisna od transfekcije (tj. slobodno preuzimanje) antisens oligonukleotida u ćelijskim linijama raka je mera potentnosti.
Slobodno preuzimanje može se meriti u ćelijskim linijama raka, kao što su, na primer, SK-BR-3 ćelije, U251-MG ćelije, MDA-MB-231 ćelije, H460 ćelije, A431 ćelije, colo205 ćelije, SNB-19 ćelije, SK-OV3 ćelije, H1993 ćelije raka pluća, H358 ćelije raka pluća, PC-9 ćelije raka pluća, KHM-35 ćelije raka pluća, Capan-1 ćelije raka pankreasa, HPAF-11 ćelije raka pankreasa i Colo 201 ćelije kolorektalnog raka.
[0221] U testovima slobodnog preuzimanja, antisens oligonukleotidi se daju ćelijskim linijama bez pomoći agensa za transfekciju ili elektroporacije. antisens oligonukleotidi se daju ćelijskim linijama pri jednoj ili više doza i procenjuje se procenat inhibicije ciljane mRNK ili eksprimiranja proteina. Kada se daju višestruke doze, može se meriti IC50. U određenim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidi koji pokazuju visok stepen potentnosti, mereno procentom inhibicije posle pojedinačne doze ili višestrukih doza, imaju prednost u odnosu na antisens oligonukleotide koji pokazuju manji stepen potentnosti. Oni antisens oligonukleotidi koji pokazuju visok stepen in vitro potentnosti su verovatniji da će pokazati in vivo potentnost.
RNK izolacija
[0222] RNK analiza može biti izvedena na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ mRNK.
Postupci izolacije RNK su dobro poznati u struci. RNK je pripremljena korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci, na primer, korišćenjem TRIZOL reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema preporučenim protokolima proizvođača.
Analiza inhibicije ciljanih nivoa ili eksprimiranja
[0223] Inhibicija nivoa ili eksprimiranja STAT3 nukleinske kiseline može se analizirati na različite načine poznate u struci. Na primer, ciljani nivoi nukleinskih kiselina se mogu kvantitativno odrediti, npr., Northern blot analizom, kompetitivnom lančanom reakcijom polimeraze (PCR), ili kvantitativnom PCR u realnom vremenu. RNK analiza može biti izvedena na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ mRNK. Postupci izolacije RNK su dobro poznati u struci. Northern blot analiza je takođe rutinska u struci. Kvantitativna PCR u realnom vremenu može se pogodno izvršiti korišćenjem komercijalno dostupnog ABI PRISM 7600, 7700 ili 7900 Sequence Detection System, koji je dostupan od PE-Applied Biosystems, Foster City, CA i upotrebljen u skladu sa uputstvima proizvođača.
Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu nivoa ciljanih RNK
[0224] Kvantitativno određivanje nivoa ciljane RNK može se postići kvantitativnom PCR u realnom vremenu koristeći ABI PRISM 7600, 7700 ili 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) prema uputstvima proizvođača. Postupci kvantitativne PCR u realnom vremenu su dobro poznate u struci.
[0225] Pre PCR u realnom vremenu, izolovana RNK je podvrgnuta reakciji reverzne transkriptaze (RT), koja proizvodi komplementarnu DNK (cDNK) koja se zatim koristi kao supstrat za PCR amplifikaciju u realnom vremenu. RT i PCR reakcije u realnom vremenu se izvode sekvencijalno u istom uzorku. RT reagensi i reagensi za PCR u realnom vremenu mogu se dobiti od Invitrogen (Carlsbad, CA). RT PCR u realnom vremenu se izvode postupcima dobro poznatim stručnjacima.
[0226] Ciljane količine gena (ili RNK) dobijene sa PCR u realnom vremenu su normalizovane korišćenjem ili nivoa eksprimiranja gena čije je eksprimiranje konstantno, kao što je ciklofilin A, ili kvantifikovanjem ukupne RNK koristeći RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Eksprimiranje Ciklofilin A se kvantifikuje sa PCR u realnom vremenu, tako što se istovremeno izvodi sa ciljem, multipleksiranjem ili odvojeno. Ukupna RNK je kvantifikovana korišćenjem RIBOGREEN RNK kvantifikacionog reagensa (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Postupci kvantifikacije RNK pomoću RIBOGREEN su prikazane u Jones, L.J., i dr., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). CYTOFLUOR 4000 instrument (PE Applied Biosystems) se koristi za merenje RIBOGREEN fluorescencije.
[0227] Sonde i prajmeri su dizajnirani da hibridizuju sa STAT3 nukleinskom kiselinom. Postupci za projektovanje PCR sondi i prajmera u realnom vremenu su dobro poznati u struci i mogu uključivati upotrebu softvera kao što je PRIMER EXPRESS softver (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Analiza nivoa proteina
[0228] Antisens inhibicija STAT3 nukleinskih kiselina može se proceniti merenjem nivoa STAT3 proteina. Nivoi STAT3 proteina mogu biti procenjeni ili kvantitativno određeni na različite načine koji su dobro poznati u struci, kao što su imunoprecipitacija, Western blot analiza (imunobloting), enzimski imunosorbentni test (ELISA), kvantitativni proteinski testovi, testovi aktivnosti proteina (na primer testovi aktivnosti kaspaze), imunohistohemija, imunocitohemija ili sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS). Antitela koja su usmerena na cilj mogu biti identifikovana i dobijena iz različitih izvora, kao što je MSRS katalog antitela (Aerie Corporation, Birmingham, MI), ili se mogu pripremiti putem konvencionalnih postupaka proizvodnje monoklonskih ili poliklonskih antitela koje su dobro poznate u struci. Antitela koja su korisna za detektovanje STAT3 miša, pacova, majmuna i čoveka su komercijalno dostupna.
In vivo testiranje antisens jedinjenja
[0229] Antisens jedinjenja, na primer, antisens oligonukleotidi, testiraju se na životinjama kako bi se procenila njihova sposobnost da inhibiraju eksprimiranje STAT3 i proizvedu fenotipske promene, kao što su smanjeni rast ćelija, ublažavanje simptoma povezanih sa rakom, redukcija kaheksije i smanjenje markera raka.. Testiranje se može obaviti kod normalnih životinja ili u eksperimentalnim modelima bolesti. Za davanje životinjama, antisens oligonukleotidi su formulisani u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču, kao što je fosfatno puferisan rastvor soli. Primena uključuje parenteralne puteve davanja, kao što su intraperitonealni, intravenski, subkutani, intratekalni i intracerebroventrikularni.
Izračunavanje doziranja antisens oligonukleotida i učestalosti doziranja je u okviru sposobnosti stručnjaka, i zavisi od faktora kao što je put primene i telesna težine životinje. Nakon perioda tretmana antisens oligonukleotidima, RNK je izolovana iz tkiva jetre i mere se promene u eksprimiranju STAT3 nukleinske kiseline. Merene su i promene u nivoima STAT3 proteina.
[0230] U određenim otelotvorenjima, ksenograftni tumorski modeli se koriste za merenje efekta antisens oligonukleotida na rast tumora i metastaze. U ovde opisanom modelu tumora ksenografta, ćelije iz linije kancerogenih ćelija se inokuliraju u životinju. Takve ćelijske linije mogu uključivati, na primer, ćelije ljudskog karcinoma dojke, MDA-MB-231, A431 ljudski epidermoidni karcinom, U251 ćelije ljudskog tumora glioma i ljudske NCI-H460 ćelije karcinoma ne-malih ćelija pluća. Određena jedinjenja koja su ovde opisana i koja su ovde korišćena u modelima ksenografta, mogu da ciljaju ljudski STAT3, STAT3 miša, STAT3 pacova i/ili STAT3 majmuna. Određena jedinjenja koja su ovde opisana i koja su ovde korišćena u modelima ksenografta, mogu da unakrsno reaguju sa jednom ili više vrsta STAT3. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde opisana i koja su ovde korišćena u modelima ksenografta, mogu biti snažniji inhibitori rasta tumora i zapremine tumora nego što sugerišu podaci gde endogeni STAT3 nije redukovan (zbog nedostatka unakrsne reaktivnosti).
Određene indikacije
[0231] U određenim otelotvorenjima, pruženi su postupci, jedinjenja i sastavi za tretman pojedinca koji se sastoje od davanja jednog ili više farmaceutskih sastava koji su ovde dati. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima hiperproliferativno oboljenje. U određenim otelotvorenjima, hiperproliferativna bolest je rak, npr. karcinomi, sarkomi, limfomi i leukemije, kao i povezane maligne bolesti i metastaze. U određenim aspektima, tip raka je rak pluća, uključujući karcinom malih ćelija pluća (NSCLC), rak pankreasa, kolorektalni kancer, multipli mijelom, hepatocelularni karcinom (HCC), glioblastom, rak jajnika, osteosarkom, rak glave i vrata, rak dojke, epidermoidni karcinomi, intestinalni adenomi, rak prostate i rak želuca. U određenim otelotvorenjima, pojedinac je u riziku za hiperproliferativno oboljenje, uključujući rak, npr. karcinome, sarkome, limfome i leukemije, kao i povezane malignitete i metastaze. Ovo uključuje pojedince koji imaju jedan ili više faktora rizika za razvoj hiperproliferativne bolesti, uključujući stvari kao što su starenje; upotreba duvana; izlaganje suncu i jonizujućem zračenju; dodir sa određenim hemikalijama; infekcija određenim virusima i bakterijama; određene hormonske terapije; genetska predispozicija; upotreba alkohola; i određeni izbori načina života, uključujući lošu ishranu, nedostatak fizičke aktivnosti i/ili prekomernu težinu. U određenim aspektima, pojedinac je identifikovan da mu je potreban tretman hiperproliferativne bolesti. U određenim aspektima, pruženi su postupci za profilaktičko smanjenje eksprimiranja STAT3 kod pojedinca.
Određena otelotvorenja obuhvataju tretiranje pojedinca kom je to potrebno davanjem pojedincu terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja koje cilja na STAT3 nukleinsku kiselinu.
[0232] U određenim otelotvorenjima, tretman postupcima, jedinjenjima i sastavima koji su ovde opisani je koristan za sprečavanje metastaziranja raka povezanog sa regulacijom određenih gena, kao što je STAT3, na dodiru tumora kostiju sa kostima. U nekim otelotvorenjima, tretman postupcima, jedinjenjima i sastavima koji su ovde opisani je koristan za sprečavanje raka od metastaziranja u kostima. U nekim otelotvorenjima, tretman postupcima, jedinjenjima i sastavima koji su ovde opisani je koristan za prevenciju karcinoma bubrežnih ćelija, raka dojke, karcinoma malih ćelija pluća i raka prostate od metastaziranja na kostima.
[0233] U jednom otelotvorenju, davanje terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja koje je ciljano na STAT3 nukleinsku kiselinu je praćeno posmatranjem nivoa STAT3 u serumu pojedinca kako bi se odredio odgovor pojedinca na davanje antisens jedinjenja. Odgovor pojedinca na davanje antisens jedinjenja se koristi od strane lekara kako bi se odredila količina i trajanje terapeutske intervencije.
[0234] U određenim otelotvorenjima, davanje antisens jedinjenja koje cilja na STAT3 nukleinsku kiselinu dovodi do smanjenja eksprimiranja STAT3 za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 99%, ili opsegom definisanim sa bilo koje dve od ovih vrednosti. U određenim otelotvorenjima, primena antisens jedinjenja ciljanog na STAT3 nukleinsku kiselinu dovodi do smanjenja rasta ćelija, smanjenja rasta tumora, smanjenja zapremine tumora, ublažavanja simptoma povezanih sa rakom i redukcije markera raka. U nekim otelotvorenjima, primena STAT3 antisens jedinjenja smanjuje rast ćelija, rast tumora i zapreminu tumora za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 99%, ili opsegom definisanim sa bilo koje dve od ovih vrednosti.
[0235] U određenim aspektima, farmaceutski sastavi koje sadrže antisens jedinjenje koje je ciljano na STAT3 se koriste za dobijanje leka za tretman pacijenta koji pati ili je podložan hiperproliferativnoj bolesti.
Određene kombinacione terapije
[0236] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava pruženih ovde se daju zajedno sa jednim ili više drugih farmaceutskih agenasa. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa su dizajnirani da tretiraju istu bolest, poremećaj ili stanje kao jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde date. U određenim otelotvorenjima, takav jedna ili više drugih farmaceutskih agenasa su dizajnirani da tretiraju različitu bolest, poremećaj ili stanje kao jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi. U određenim otelotvorenjima, takav jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa su dizajnirani da tretiraju neželjene sporedne efekte jednog ili više farmaceutskih sastava koji su ovde dati. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi su zajedno primenjeni sa drugim farmaceutskim agensom za za tretman neželjenog efekta tog drugog farmaceutskog agensa. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi se primenjuju zajedno sa drugim farmaceutskim agensom kako bi se proizveo kombinacioni efekat. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi su zajedno primenjeni sa drugim farmaceutskim agensom kako bi se dobio sinergetski efekat.
[0237] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi i jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa se primenjuju istovremeno. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi i jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa se primenjuju u različito vreme. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi i jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa su pripremljeni zajedno u jednoj formulaciji. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi i jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa se pripremaju odvojeno. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa uključuju sve-trans retioninsku kiselinu, azacitidin, azatioprin, bleomicin, karboplatin, kapecitabin, cisplatin, hlorambucil, ciklofosfamid, citarabin, daunorubicin, docetaksel, doksifluridin, doksorubicin, epirubicin, epotilon, etoksid, fluorouracin gemcitabin, hidroksiurea, idarubicin, imatinib, mekloretamin, merkaptopurin, metotreksat, mitoksantron, oksaliplatin, paklitaksel, pemetreksed, tenipozid, tioguanin, valrubicin, vinblastin, vinkristin, vindesin ili vinorelbin. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa uključuju drugi antisens oligonukleotid. U nekim otelotvorenjima, drugi antisens oligonukleotid je drugi STAT3 antisens oligonukleotid.
[0238] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa obuhvataju molekularno ciljane terapije. U određenim aspektima, molekularno ciljana terapija je inhibitor EGFR, inhibitor mTOR, inhibitor HER2 ili inhibitor VEGF/VEGFR. U nekim otelotvorenjima, inhibitori EGFR uključuju gefitinib, erlotinib, lapatinib, cetuksimab, panitumumbo. U nekim otelotvorenjima, inhibitori mTOR uključuju everolimus i temsirolimus. U nekim otelotvorenjima, HER2 inhibitori uključuju trastuzumab i lapatinib. U nekim otelotvorenjima, inhibitori VEGF/VEGFR uključuju pazopanib, bevacizumab, sunitinib i sorafenib.
[0239] U određenim otelotvorenjima, još jedan farmaceutski sastav koji je ovde pružen primenjuje se sa terapijom zračenjem. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava se primenjuju istovremeno sa terapijom zračenjem. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava se primenjuju pre terapije zračenjem. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava se primenjuju nakon terapije zračenjem. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više farmaceutskih sastava se primenjuju u različitim vremenskim tačkama tokom režima terapije zračenjem.
[0240] U nekim otelotvorenjima, terapija zračenjem je korisna za inhibiciju rasta tumora. U nekim otelotvorenjima, terapija zračenjem je korisna za povećanje opšteg preživljavanja. U određenim otelotvorenjima, terapija zračenjem koja se koristi u kombinaciji sa primenom jednog ili više farmaceutskih sastava ovde ima prednosti nad korišćenjem bilo koje same terapije, zato što i terapija zračenjem i primena sa jednim ili više farmaceutskih proizvoda mogu biti ograničeni kako bi se postigao efikasan antiproliferativni odgovor sa ograničenom toksičnošću.
[0241] U određenim otelotvorenjima, lekar dizajnira terapijski režim koji uključuje i zračenje i primenu još jednog farmaceutskog sastava koji je ovde pružen. U određenim otelotvorenjima, lekar dizajnira režim terapije, uključujući radioterapiju, primenu jednog ili više farmaceutskih sastava koji su ovde pruženi, i primenu jednog ili više drugih hemoterapeutskih agenasa.
Podnošljivost
[0242] U određenim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju minimalne neželjene efekte. Neželjeni efekti uključuju reakcije na davanje antisens jedinjenja koje su tipično nepovezane sa ciljanjem STAT3, kao što je upalni odgovor kod životinje. U određenim otelotvorenjima životinje dobro podnose jedinjenja. Povećana podnošljivost može zavisiti od brojnih faktora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, nukleotidnu sekvencu antisens jedinjenja, hemijske modifikacije nukleotida, određeni motiv nemodifikovanih i modifikovanih nukleozida u antisens jedinjenju ili njihove kombinacije. Podnošljivost može biti određena brojnim faktorima. Takvi faktori uključuju telesnu težinu, težinu organa, funkciju jetre, funkciju bubrega, broj trombocita, broj belih krvnih zrnaca.
[0243] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju minimalan uticaj na težinu organa. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja pokazuju manje od 7-struko, 6-struko, 5-struko, 4-struko, 3-struko, 2-struko ili bez značajnog povećanja težine slezine i/ili jetre.
[0244] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju minimalan efekat na funkciju jetre. Faktori za procenu funkcije jetre uključuju nivoe ALT, AST nivoe, nivoe bilirubina u plazmi i nivoe albumina u plazmi. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde prikazana pokazuju manje od 7-struko, manje od 6-struko, manje od 5-struko, manje od 4-struko, manje od 3- struko ili manje od 2- struko ili su bez značajnog povećanja ALT ili AST. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju manje od 3-struko, manje od 2- struko ili su bez značajnog povećanja nivoa bilirubina u plazmi.
[0245] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju minimalan efekat na funkciju bubrega. U određenim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju manje od 3-struko, manje od 2-struko, ili su bez značajnog povećanja koncentracije azota uree krvi (BUN) u plazmi. U određenim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde prikazana pokazuju manje od 6-struko, 5-struko, 4-struko, 3-struko, 2-struko, ili su bez značajnog povećanja u odnosu proteina urina i kreatinina.
[0246] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju minimalan efekat na hematološke faktore. U određenim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju manje od 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ili 5% smanjenja broja trombocita. U određenim otelotvorenjima, jedinjenja koja su ovde pružena pokazuju manje od 4-struko, manje od 3-struko, manje od 2- struko ili su bez značajnog povećanja broja monocita.
[0247] U određenim otelotvorenjima, jedinjenja dalje pokazuju povoljnu farmakokinetiku. U nekim otelotvorenjima, antisens jedinjenja pokazuju relativno visok polu-život u relevantnim biološkim tečnostima ili tkivima.
[0248] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja ili sastavi dalje pokazuju povoljnu viskoznost. U nekim otelotvorenjima, viskoznost jedinjenja ili sastava nije veća od 40cP u koncentraciji od 165-185 mg/mL.
[0249] U drugim otelotvorenjima, jedinjenja pokazuju kombinacije gore navedenih karakteristika i redukuju eksprimiranje STAT3 mRNK u životinjskom modelu sa visokom efikasnošću.
PRIMERI
Neograničavajuće obelodanjenje i uključivanje putem reference
[0250] Dok su određena jedinjenja, sastavi i postupci koji su ovde opisani opisani sa specifičnošću u skladu sa određenim aspektima, sledeći primeri služe samo da ilustruju ovde opisana jedinjenja i nisu namenjeni da ih ograniče.
Primer 1: Antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama
[0251] Antisens oligonukleotidi su dizajnirani da ciljaju ljudsku STAT3 nukleinsku kiselinu i testirani su za svoj efekat na eksprimiranje ljudske STAT3 mRNK in vitro. Himerni antisens oligonukleotidi prikazani u Tabelama 1 i 2 su dizajnirani kao bilo 2-10-2 cEt gapmeri ili 3-10-3 cEt gapmeri.2-10-2 cEt gapmeri su dužine 14 nukleotida, gde centralni segment jaza sadrži deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima koja sadrže po dva nukleozida. 3-10-3 cEt gapmeri su dužine 16 nukleozida, gde centralni segment jaza sadrži deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima koja sadrže po tri nukleozida. Svaki nukleozid u 5' segmentu krila i svaki nukleozid u 3' segmentu krila ima modifikaciju cEt šećera. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.
[0252] Potentnost cEt gapmera je upoređena sa ISIS 337332, ISIS 337333 i ISIS 345785, koji su 5-10-5 MOE gapmera koji ciljaju ljudski STAT3 i dalje su opisani u USPN 7,307,069.
[0253] Kultivisane HuVEC ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po komorici su transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 1,000 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 6; reverzna sekvenca TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, ovde označena kao SEQ ID NO: 7; sekvenca sonde CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 8) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Svi cEt gapmeri i MOE gapmeri su testirani pod istim uslovima.
[0254] „Početno mesto ljudskog cilja“ označava naj-5' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. „Zaustavno mesto ljudskog cilja“ označava naj-3' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. Svaki gapmer, naveden u Tabeli 1, je usmeren na ljudsku STAT3 mRNK, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_139276,2). Svaki gapmer koji je naveden u Tabeli 2 je ciljan na ljudsku STAT3 genomsku sekvencu, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 2 (komplement GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćen od nukleotida 4185000 do 4264000).
Tabela 1
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću cEt i MOE himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ
ID NO: 1
ISIS Ljudsko Ljudsko Sekvenca Motiv Hemija % SEQ BR. početno zaustavno krila inhibicije ID mesto mesto NO 481350 76 91 TCCAGGATCCGGTTGG 3-10-3 cEt 52 9 481575 77 90 CCAGGATCCGGTTG 2-10-2 cEt 41 10 481351 132 147 GGCCGAAGGGCCTCTC 3-10-3 cEt 14 11 481576 133 146 GCCGAAGGGCCTCT 2-10-2 cEt 8 12 481352 225 240 CCTGCTAAAATCAGGG 3-10-3 cEt 15 13 481577 226 239 CT GCTAAAAT CAGG 2-10-2 cEt 12 14 481353 240 255 ATTCCATTGGGCCATC 3-10-3 cEt 78 15 481578 241 254 TTCCATTGGGCCAT 2-10-2 cEt 51 16 481354 264 279 CCGTGTGTCAAGCTGC 3-10-3 cEt 98 17 481579 265 278 CGTGTGTCAAGCTG 2-10-2 cEt 91 18 481355 322 337 ACTGCCGCAGCTCCAT 3-10-3 cEt 95 19 481580 323 336 CTGCCGCAGCTCCA 2-10-2 cEt 76 20 481356 346 361 GACTCTCAATCCAAGG 3-10-3 cEt 83 21 481581 347 360 ACTCTCAATCCAAG 2-10-2 cEt 31 22 481357 375 390 TTCTTTGCTGGCCGCA 3-10-3 cEt 97 23 481582 376 389 TCTTTGCTGGCCGC 2-10-2 cEt 87 24 481358 403 418 GATTATGAAACACCAA 3-10-3 cEt 85 25 481583 404 417 ATTATGAAACACCA 2-10-2 cEt 20 26 481359 429 444 ATACTGCTGGTCAATC 3-10-3 cEt 90 27 481584 430 443 TACTGCTGGTCAAT 2-10-2 cEt 42 28 481360 459 474 GAGAACATTCGACTCT 3-10-3 cEt 75 29 481585 460 473 AGAACATTCGACTC 2-10-2 cEt 77 30 481361 474 489 TAGATTGTGCTGATAG 3-10-3 cEt 90 31 481586 475 488 AGATTGTGCTGATA 2-10-2 cEt 81 32 481362 490 505 ACTGCTTGATTCTTCG 3-10-3 cEt 59 33 481587 491 504 CTGCTTGATTCTTC 2-10-2 cEt 23 34 481363 511 526 CAAGATACCTGCTCTG 3-10-3 cEt 84 35 481588 512 525 AAGATACCTGCTCT 2-10-2 cEt 58 36 481364 542 557 GCCACAATCCGGGCAA 3-10-3 cEt 36 37 481589 543 556 CCACAATCCGGGCA 2-10-2 cEt 69 38 481365 589 604 CAGTGGCTGCAGTCTG 3-10-3 cEt 36 39 481590 590 603 AGTGGCTGCAGTCT 2-10-2 cEt 30 40 481366 607 622 GGCCCCCTTGCTGGGC 3-10-3 cEt 1 41 481591 608 621 GCCCCCTTGCTGGG 2-10-2 cEt 0 42 481367 638 653 GTCACCACGGCTGCTG 3-10-3 cEt 70 43 481592 639 652 TCACCACGGCTGCT 2-10-2 cEt 48 44 481368 659 674 TCCAGCATCTGCTGCT 3-10-3 cEt 81 45 481593 660 673 CCAGCATCTGCTGC 2-10-2 cEt 46 46 481369 675 690 ATCCTGAAGGTGCTGC 3-10-3 cEt 29 47 481594 676 689 TCCTGAAGGTGCTG 2-10-2 cEt 16 48 481370 701 716 TCTAGATCCTGCACTC 3-10-3 cEt 79 49 481595 702 715 CTAGATCCTGCACT 2-10-2 cEt 47 50 481371 709 724 TTTTCTGTTCTAGATC 3-10-3 cEt 83 51 481596 710 723 TTTCTGTTCTAGAT 2-10-2 cEt 48 52 481372 730 745 GGAGATTCTCTACCAC 3-10-3 cEt 85 53 481597 731 744 GAGATTCTCTACCA 2-10-2 cEt 80 54 481373 751 766 AGTTGAAATCAAAGTC 3-10-3 cEt 87 55 481598 752 765 GTTGAAATCAAAGT 2-10-2 cEt 6 56 481374 788 803 AGATCTTGCATGTCTC 3-10-3 cEt 92 57 481599 789 802 GATCTTGCATGTCT 2-10-2 cEt 51 58 481375 799 814 TGTTTCCATTCAGATC 3-10-3 cEt 65 59 481600 800 813 GTTTCCATTCAGAT 2-10-2 cEt 42 60 481376 868 883 TCCGCATCTGGTCCAG 3-10-3 cEt 82 61 481601 869 882 CCGCATCTGGTCCA 2-10-2 cEt 70 62 481785 872 885 TCTCCGCATCTGGT 2-10-2 cEt 28 63 481377 884 899 TCACTCACGATGCTTC 3-10-3 cEt 85 64 481602 885 898 CACTCACGATGCTT 2-10-2 cEt 55 65 481378 892 907 CCGCCAGCTCACTCAC 3-10-3 cEt 89 66 481603 893 906 CGCCAGCTCACTCA 2-10-2 cEt 60 67 481379 955 970 TCCAGTCAGCCAGCTC 3-10-3 cEt 91 68 481604 956 969 CCAGTCAGCCAGCT 2-10-2 cEt 70 69 481380 963 978 CCGCCTCTTCCAGTCA 3-10-3 cEt 73 70 481605 964 977 CGCCTCTTCCAGTC 2-10-2 cEt 55 71 481381 1010 1025 CGATCTAGGCAGATGT 3-10-3 cEt 26 72 481606 1011 1024 GATCTAGGCAGATG 2-10-2 cEt 35 73 481382 1045 1060 GAGATTCTGCTAATGA 3-10-3 cEt 81 74 481607 1046 1059 AGATTCTGCTAATG 2-10-2 cEt 51 75 481383 1053 1068 CTGAAGTTGAGATTCT 3-10-3 cEt 84 76 481608 1054 1067 TGAAGTTGAGATTC 2-10-2 cEt 26 77 481384 1098 1113 AACTTTTTGCTGCAAC 3-10-3 cEt 76 78 481609 1099 1112 ACTTTTTGCTGCAA 2-10-2 cEt 34 79 481385 1113 1128 GTCCCCTTTGTAGGAA 3-10-3 cEt 41 80 481610 1114 1127 TCCCCTTTGTAGGA 2-10-2 cEt 37 81 481386 1186 1201 AGGCACTTTTCATTAA 3-10-3 cEt 45 82 481611 1187 1200 GGCACTTTTCATTA 2-10-2 cEt 32 83 481387 1225 1240 CAGGAT GCAT GGGCAT 3-10-3 cEt 92 84 481612 1226 1239 AGGATGCATGGGCA 2-10-2 cEt 86 85 481388 1269 1284 TTTAGTAGTGAACTGG 3-10-3 cEt 74 86 481613 1270 1283 TTAGTAGTGAACTG 2-10-2 cEt 22 87 481389 1282 1297 CCAGCAACCTGACTTT 3-10-3 cEt 66 88 481614 1283 1296 CAGCAACCTGACTT 2-10-2 cEt 34 89 481390 1305 1320 ATAATTCAACTCAGGG 3-10-3 cEt 92 90 481615 1306 1319 TAATTCAACTCAGG 2-10-2 cEt 48 91 481391 1314 1329 TTTAAGCTGATAATTC 3-10-3 cEt 44 92 481616 1315 1328 TTAAGCTGATAATT 2-10-2 cEt 0 93 481392 1326 1341 GCACACTTTAATTTTA 3-10-3 cEt 49 94 481617 1327 1340 CACACTTTAATTTT 2-10-2 cEt 1 95 481393 1347 1362 GTCCCCAGAGTCTTTG 3-10-3 cEt 39 96 481618 1348 1361 TCCCCAGAGTCTTT 2-10-2 cEt 41 97 481394 1437 1452 GAGGCTGCCGTTGTTG 3-10-3 cEt 62 98 481619 1438 1451 AGGCTGCCGTTGTT 2-10-2 cEt 29 99 481395 1468 1483 CCCTCAGGGTCAAGTG 3-10-3 cEt 72 100 481620 1469 1482 CCTCAGGGTCAAGT 2-10-2 cEt 37 101 481396 1480 1495 CACATCTCTGCTCCCT 3-10-3 cEt 92 102 481621 1481 1494 ACATCTCTGCTCCC 2-10-2 cEt 74 103 481397 1517 1532 ATCAGGGAAGCATCAC 3-10-3 cEt 59 104 481622 1518 1531 TCAGGGAAGCATCA 2-10-2 cEt 49 105 481398 1542 1557 GATCAGGTGCAGCTCC 3-10-3 cEt 73 106 481623 1543 1556 ATCAGGTGCAGCTC 2-10-2 cEt 40 107 481399 1563 1578 ATACACCTCGGTCTCA 3-10-3 cEt 73 108 481624 1564 1577 TACACCTCGGTCTC 2-10-2 cEt 43 109 481400 1579 1594 TCTTGAGGCCTTGGTG 3-10-3 cEt 47 110 481625 1580 1593 CTTGAGGCCTTGGT 2-10-2 cEt 16 111 481401 1589 1604 TCTAGGTCAATCTTGA 3-10-3 cEt 74 112 481626 1590 1603 CTAGGTCAATCTTG 2-10-2 cEt 54 113 481402 1599 1614 GGAGTGGGTCTCTAGG 3-10-3 cEt 52 114 481627 1600 1613 GAGTGGGTCTCTAG 2-10-2 cEt 13 115 481789 1604 1617 CAAGGAGTGGGTCT 2-10-2 cEt 10 116 481403 1607 1622 ACTGGCAAGGAGTGGG 3-10-3 cEt 58 117 481628 1608 1621 CTGGCAAGGAGTGG 2-10-2 cEt 38 118 481404 1633 1648 TCTGACAGATGTTGGA 3-10-3 cEt 50 119 481629 1634 1647 CTGACAGATGTTGG 2-10-2 cEt 64 120 481405 1641 1656 ATTTGGCATCTGACAG 3-10-3 cEt 75 121 481630 1642 1655 TTTGGCATCTGACA 2-10-2 cEt 39 122 481406 1691 1706 TTCTTGGGATTGTTGG 3-10-3 cEt 72 123 481631 1692 1705 TCTTGGGATTGTTG 2-10-2 cEt 33 124 481407 1729 1744 CCCAGGTTCCAATTGG 3-10-3 cEt 50 125 481632 1730 1743 CCAGGTTCCAATTG 2-10-2 cEt 32 126 481408 1780 1795 CTCGCTTGGTGGTGGA 3-10-3 cEt 53 127 481633 1781 1794 TCGCTTGGTGGTGG 2-10-2 cEt 35 128 481409 1795 1810 GCTCGATGCTCAGTCC 3-10-3 cEt 86 129 481634 1796 1809 CTCGATGCTCAGTC 2-10-2 cEt 43 130 481410 1825 1840 CCAAGAGTTTCTCTGC 3-10-3 cEt 91 131 481635 1826 1839 CAAGAGTTTCTCTG 2-10-2 cEt 43 132 481411 1840 1855 AATTCACACCAGGTCC 3-10-3 cEt 72 133 481636 1841 1854 ATTCACACCAGGTC 2-10-2 cEt 42 134 481412 1858 1873 TGATCTGACACCCTGA 3-10-3 cEt 90 135 481637 1859 1872 GATCTGACACCCTG 2-10-2 cEt 79 136 481413 1866 1881 AGCCCATGTGATCTGA 3-10-3 cEt 80 137 481638 1867 1880 GCCCATGTGATCTG 2-10-2 cEt 64 138 481414 1888 1903 CCATGTTTTCTTTGCA 3-10-3 cEt 69 139 481639 1889 1902 CATGTTTTCTTTGC 2-10-2 cEt 16 140 481415 1896 1911 CTTGCCAGCCATGTTT 3-10-3 cEt 88 141 481640 1897 1910 TTGCCAGCCATGTT 2-10-2 cEt 57 142 337332 1898 1917 GAAGCCCTTGCCAGCCATGT 5-10-5 MOE 63 143 481416 1901 1916 AAGCCCTTGCCAGCCA 3-10-3 cEt 87 144 481641 1902 1915 AGCCCTTGCCAGCC 2-10-2 cEt 68 145 337333 1903 1922 AAGGAGAAGCCCTTGCCAGC 5-10-5 MOE 49 146 481417 1903 1918 AGAAGCCCTTGCCAGC 3-10-3 cEt 97 147 481418 1904 1919 GAGAAGCCCTTGCCAG 3-10-3 cEt 92 148 481642 1904 1917 GAAGCCCTTGCCAG 2-10-2 cEt 67 149 481419 1905 1920 GGAGAAGCCCTTGCCA 3-10-3 cEt 83 150 481643 1905 1918 AGAAGCCCTTGCCA 2-10-2 cEt 58 151 481644 1906 1919 GAGAAGCCCTTGCC 2-10-2 cEt 45 152 481420 1948 1963 ACTTTTTCACAAGGTC 3-10-3 cEt 94 153 481645 1949 1962 CTTTTTCACAAGGT 2-10-2 cEt 50 154 481421 2021 2036 CTCAAGATGGCCCGCT 3-10-3 cEt 86 155 481646 2022 2035 TCAAGATGGCCCGC 2-10-2 cEt 41 156 481422 2036 2051 CCTGGAGGCTTAGTGC 3-10-3 cEt 80 157 481647 2037 2050 CTGGAGGCTTAGTG 2-10-2 cEt 0 158 481423 2077 2092 CTCCTTCTTTGCTGCT 3-10-3 cEt 69 159 481648 2078 2091 TCCTTCTTTGCTGC 2-10-2 cEt 51 160 481424 2093 2108 CAAGTGAAAGTGACGC 3-10-3 cEt 70 161 481649 2094 2107 AAGTGAAAGTGACG 2-10-2 cEt 25 162 481425 2115 2130 ACCGCTGATGTCCTTC 3-10-3 cEt 78 163 481650 2116 2129 CCGCTGATGTCCTT 2-10-2 cEt 79 164 481426 2131 2146 ACTGGATCTGGGTCTT 3-10-3 cEt 80 165 481651 2132 2145 CTGGATCTGGGTCT 2-10-2 cEt 64 166 481427 2155 2170 GCTGCTTTGTGTATGG 3-10-3 cEt 75 167 481652 2156 2169 CTGCTTTGTGTATG 2-10-2 cEt 82 168 481428 2164 2179 TGTTCAGCTGCTGCTT 3-10-3 cEt 77 169 481653 2165 2178 GTTCAGCTGCTGCT 2-10-2 cEt 79 170 481429 2172 2187 TGACATGTTGTTCAGC 3-10-3 cEt 84 171 481654 2173 2186 GACATGTTGTTCAG 2-10-2 cEt 70 172 481430 2190 2205 CATGATGATTTCAGCA 3-10-3 cEt 67 173 481655 2191 2204 ATGATGATTTCAGC 2-10-2 cEt 31 174 481431 2206 2221 CCATGATCTTATAGCC 3-10-3 cEt 91 175 481656 2207 2220 CATGATCTTATAGC 2-10-2 cEt 0 176 481432 2233 2248 GTGGAGACACCAGGAT 3-10-3 cEt 55 177 481657 2234 2247 TGGAGACACCAGGA 2-10-2 cEt 58 178 481433 2256 2271 AATGTCAGGATAGAGA 3-10-3 cEt 73 179 481658 2257 2270 ATGTCAGGATAGAG 2-10-2 cEt 62 180 481434 2266 2281 CCTCCTTGGGAATGTC 3-10-3 cEt 73 181 345785 2267 2286 TGCCTCCTCCTTGGGAATGT 5-10-5 MOE 50 182 481659 2267 2280 CTCCTTGGGAATGT 2-10-2 cEt 51 183 481435 2269 2284 CCTCCTCCTTGGGAAT 3-10-3 cEt 49 184 481660 2270 2283 CTCCTCCTTGGGAA 2-10-2 cEt 54 185 481436 2275 2290 CGAATGCCTCCTCCTT 3-10-3 cEt 82 186 481661 2276 2289 GAATGCCTCCTCCT 2-10-2 cEt 76 187 481437 2296 2311 TCTCTGGCCGACAATA 3-10-3 cEt 49 188 481662 2297 2310 CTCTGGCCGACAAT 2-10-2 cEt 43 189 481438 2353 2368 ACTTGGTCTTCAGGTA 3-10-3 cEt 51 190 481663 2354 2367 CTTGGTCTTCAGGT 2-10-2 cEt 52 191 481439 2371 2386 TTGGTGTCACACAGAT 3-10-3 cEt 82 192 481664 2372 2385 TGGTGTCACACAGA 2-10-2 cEt 89 193 481440 2387 2402 GTATTGCTGCAGGTCG 3-10-3 cEt 79 194 481665 2388 2401 TATTGCTGCAGGTC 2-10-2 cEt 43 195 481441 2395 2410 GGTCAATGGTATTGCT 3-10-3 cEt 55 196 481666 2396 2409 GTCAATGGTATTGC 2-10-2 cEt 36 197 481442 2403 2418 CATCGGCAGGTCAATG 3-10-3 cEt 44 198 481667 2404 2417 ATCGGCAGGTCAAT 2-10-2 cEt 31 199 481443 2423 2438 GAATCTAAAGTGCGGG 3-10-3 cEt 78 200 481668 2424 2437 AATCTAAAGTGCGG 2-10-2 cEt 41 201 481444 2431 2446 GCATCAATGAATCTAA 3-10-3 cEt 66 202 481669 2432 2445 CATCAATGAATCTA 2-10-2 cEt 0 203 481445 2439 2454 TCCAAACTGCATCAAT 3-10-3 cEt 70 204 481670 2440 2453 CCAAACTGCATCAA 2-10-2 cEt 60 205 481446 2460 2475 TTCAGCACCTTCACCA 3-10-3 cEt 44 206 481671 2461 2474 TCAGCACCTTCACC 2-10-2 cEt 41 207 481447 2476 2491 GCCCTCCTGCTGAGGG 3-10-3 cEt 10 208 481672 2477 2490 CCCTCCTGCTGAGG 2-10-2 cEt 15 209 481448 2484 2499 CTCAAACTGCCCTCCT 3-10-3 cEt 29 210 481797 2484 2497 CAAACTGCCCTCCT 2-10-2 cEt 11 211 481673 2485 2498 TCAAACTGCCCTCC 2-10-2 cEt 33 212 481449 2503 2518 CCATGTCAAAGGTGAG 3-10-3 cEt 77 213 481674 2504 2517 CATGTCAAAGGTGA 2-10-2 cEt 31 214 481450 2530 2545 GGGAGGTAGCGCACTC 3-10-3 cEt 53 215 481675 2531 2544 GGAGGTAGCGCACT 2-10-2 cEt 41 216 481451 2592 2607 GAATGCAGGTAGGCGC 3-10-3 cEt 55 217 481676 2593 2606 AATGCAGGTAGGCG 2-10-2 cEt 39 218 481452 2631 2646 TTTCAGATGATCTGGG 3-10-3 cEt 71 219 481677 2632 2645 TTCAGATGATCTGG 2-10-2 cEt 38 220 481574 2650 2665 GGAACCACAAAGTTAG 3-10-3 cEt 69 221 481799 2651 2664 GAACCACAAAGTTA 2-10-2 cEt 50 222 481453 2681 2696 GATAGCAGAAGTAGGA 3-10-3 cEt 92 223 481678 2682 2695 ATAGCAGAAGTAGG 2-10-2 cEt 78 224 481454 2702 2717 AAAGTGCCCAGATTGC 3-10-3 cEt 85 225 481679 2703 2716 AAGTGCCCAGATTG 2-10-2 cEt 69 226 481455 2722 2737 CACTCATTTCTCTATT 3-10-3 cEt 74 227 481680 2723 2736 ACTCATTTCTCTAT 2-10-2 cEt 39 228 481456 2767 2782 AACACATCCTTATTTG 3-10-3 cEt 48 229 481681 2768 2781 ACACATCCTTATTT 2-10-2 cEt 47 230 481457 2779 2794 TGGGTCTCAGAGAACA 3-10-3 cEt 88 231 481682 2780 2793 GGGTCTCAGAGAAC 2-10-2 cEt 77 232 481458 2832 2847 CAAGACATTTCCTTTT 3-10-3 cEt 54 233 481683 2833 2846 AAGACATTTCCTTT 2-10-2 cEt 29 234 481459 2908 2923 GGAGGCACTTGTCTAA 3-10-3 cEt 76 235 481684 2909 2922 GAGGCACTTGTCTA 2-10-2 cEt 89 236 481460 2943 2958 TTACAGAAACAGGCAG 3-10-3 cEt 83 237 481685 2944 2957 TACAGAAACAGGCA 2-10-2 cEt 36 238 481461 2969 2984 AGCTATAGGTGGCCTG 3-10-3 cEt 75 239 481686 2970 2983 GCTATAGGTGGCCT 2-10-2 cEt 70 240 481462 2984 2999 ATGCCAGGAGTATGTA 3-10-3 cEt 89 241 481687 2985 2998 TGCCAGGAGTATGT 2-10-2 cEt 80 242 481463 3001 3016 CAAGGTTAAAAAGTGC 3-10-3 cEt 88 243 481688 3002 3015 AAGGTTAAAAAGTG 2-10-2 cEt 13 244 481464 3016 3031 CTATTTGGATGTCAGC 3-10-3 cEt 97 245 481689 3017 3030 TATTTGGATGTCAG 2-10-2 cEt 40 246 481465 3032 3047 TAGATAGTCCTATCTT 3-10-3 cEt 51 247 481690 3033 3046 AGATAGTCCTATCT 2-10-2 cEt 64 248 481466 3047 3062 AAGAAACCTAGGGCTT 3-10-3 cEt 74 249 481691 3048 3061 AGAAACCTAGGGCT 2-10-2 cEt 77 250 481467 3097 3112 GCTGATACAGTGTTTT 3-10-3 cEt 74 251 481692 3098 3111 CTGATACAGTGTTT 2-10-2 cEt 74 252 481468 3112 3127 ATACAGAAAGGCTATG 3-10-3 cEt 71 253 481693 3113 3126 TACAGAAAGGCTAT 2-10-2 cEt 25 254 481469 3127 3142 GCTTAAGTTTCTTAAA 3-10-3 cEt 61 255 481694 3128 3141 CTTAAGTTTCTTAA 2-10-2 cEt 0 256 481470 3461 3476 AGCACCAAGGAGGCTG 3-10-3 cEt 49 257 481695 3462 3475 GCACCAAGGAGGCT 2-10-2 cEt 83 258 481471 3476 3491 AAGCTGAATGCTTAAA 3-10-3 cEt 36 259 481696 3477 3490 AGCTGAATGCTTAA 2-10-2 cEt 33 260 481472 3491 3506 TTACCAGCCTGAAGGA 3-10-3 cEt 76 261 481697 3492 3505 TACCAGCCTGAAGG 2-10-2 cEt 63 262 481473 3506 3521 CAGGGATTATATAAAT 3-10-3 cEt 53 263 481698 3507 3520 AGGGATTATATAAA 2-10-2 cEt 15 264 481474 3521 3536 ACCTGAAGCCCGTTTC 3-10-3 cEt 80 265 481699 3522 3535 CCTGAAGCCCGTTT 2-10-2 cEt 57 266 481475 3536 3551 TGTCTTAAGGGTTTGA 3-10-3 cEt 93 267 481700 3537 3550 GTCTTAAGGGTTTG 2-10-2 cEt 89 268 481476 3551 3566 GGTTGCAGCTTCAGAT 3-10-3 cEt 92 269 481701 3552 3565 GTTGCAGCTTCAGA 2-10-2 cEt 60 270 481477 3567 3582 TCAACACCAAAGGCCA 3-10-3 cEt 95 271 481702 3568 3581 CAACACCAAAGGCC 2-10-2 cEt 89 272 481478 3585 3600 TCCTTAAACCTTCCTA 3-10-3 cEt 84 273 481703 3586 3599 CCTTAAACCTTCCT 2-10-2 cEt 57 274 481479 3600 3615 AAAATGCTTAGATTCT 3-10-3 cEt 80 275 481704 3601 3614 AAATGCTTAGATTC 2-10-2 cEt 32 276 481480 3628 3643 AAATAAGTCTATTTAT 3-10-3 cEt 5 277 481705 3629 3642 AATAAGTCTATTTA 2-10-2 cEt 25 278 481481 3648 3663 GGCCAATACATTACAA 3-10-3 cEt 63 279 481706 3649 3662 GCCAATACATTACA 2-10-2 cEt 56 280 481482 3670 3685 TGCCCAGCCTTACTCA 3-10-3 cEt 55 281 481707 3671 3684 GCCCAGCCTTACTC 2-10-2 cEt 43 282 481483 3685 3700 GTTGTAAGCACCCTCT 3-10-3 cEt 1 283 481708 3686 3699 TTGTAAGCACCCTC 2-10-2 cEt 56 284 481484 3700 3715 AGAAAGGGAGTCAAGG 3-10-3 cEt 60 285 481709 3701 3714 GAAAGGGAGTCAAG 2-10-2 cEt 27 286 481485 3717 3732 GCAGATCAAGTCCAGG 3-10-3 cEt 90 287 481710 3718 3731 CAGATCAAGTCCAG 2-10-2 cEt 88 288 481486 3730 3745 AGCCTCTGAAACAGCA 3-10-3 cEt 75 289 481711 3731 3744 GCCTCTGAAACAGC 2-10-2 cEt 74 290 481487 3746 3761 CCCACAGAAACAACCT 3-10-3 cEt 66 291 481712 3747 3760 CCACAGAAACAACC 2-10-2 cEt 45 292 481488 3761 3776 AGCCCTGATAAGGCAC 3-10-3 cEt 23 293 481713 3762 3775 GCCCTGATAAGGCA 2-10-2 cEt 18 294 481489 3776 3791 AATCAGAAGTATCCCA 3-10-3 cEt 60 295 481714 3777 3790 ATCAGAAGTATCCC 2-10-2 cEt 43 296 481490 3833 3848 GCCTCTAGCAGGATCA 3-10-3 cEt 78 297 481715 3834 3847 CCTCTAGCAGGATC 2-10-2 cEt 79 298 481491 3848 3863 CACGCAAGGAGACATG 3-10-3 cEt 70 299 481716 3849 3862 ACGCAAGGAGACAT 2-10-2 cEt 68 300 481492 3863 3878 TGAGGGACCTTTAGAC 3-10-3 cEt 61 301 481717 3864 3877 GAGGGACCTTTAGA 2-10-2 cEt 44 302 481493 3886 3901 CAGGATTCCTAAAACA 3-10-3 cEt 43 303 481718 3887 3900 AGGATTCCTAAAAC 2-10-2 cEt 7 304 481494 3901 3916 ATGAGGTCCTGAGACC 3-10-3 cEt 60 305 481719 3902 3915 TGAGGTCCTGAGAC 2-10-2 cEt 29 306 481495 3940 3955 CATCATGTCCAACCTG 3-10-3 cEt 92 307 481720 3941 3954 ATCATGTCCAACCT 2-10-2 cEt 63 308 481496 3955 3970 GGGCCCCATAGTGTGC 3-10-3 cEt 29 309 481721 3956 3969 GGCCCCATAGTGTG 2-10-2 cEt 19 310 481497 3977 3992 AGCTCAACCAGACACG 3-10-3 cEt 67 311 481722 3978 3991 GCTCAACCAGACAC 2-10-2 cEt 69 312 481498 3992 4007 GAACCATATTCCCTGA 3-10-3 cEt 90 313 481723 3993 4006 AACCATATTCCCTG 2-10-2 cEt 49 314 481499 4007 4022 CAAGAAACTGGCTAAG 3-10-3 cEt 43 315 481724 4008 4021 AAGAAACTGGCTAA 2-10-2 cEt 17 316 481500 4022 4037 GCCACTGGATATCACC 3-10-3 cEt 92 317 481501 4048 4063 AACTGAATGAAGACGC 3-10-3 cEt 91 318 481726 4049 4062 ACTGAATGAAGACG 2-10-2 cEt 56 319 481502 4063 4078 CCTTTGCCCTGCATGA 3-10-3 cEt 85 320 481727 4064 4077 CTTTGCCCTGCATG 2-10-2 cEt 70 321 481503 4078 4093 AAGTTTATCAGTAAGC 3-10-3 cEt 57 322 481728 4079 4092 AGTTTATCAGTAAG 2-10-2 cEt 22 323 481504 4093 4108 TACGAGGGCAGACTCA 3-10-3 cEt 60 324 481729 4094 4107 ACGAGGGCAGACTC 2-10-2 cEt 22 325 481505 4108 4123 AGGTATACACCCTCAT 3-10-3 cEt 45 326 481730 4109 4122 GGTATACACCCTCA 2-10-2 cEt 47 327 481506 4123 4138 CCTCAGAGGGAGGCCA 3-10-3 cEt 32 328 481731 4124 4137 CTCAGAGGGAGGCC 2-10-2 cEt 0 329 481507 4138 4153 GGGAGGAGTCACCAGC 3-10-3 cEt 64 330 481732 4139 4152 GGAGGAGTCACCAG 2-10-2 cEt 59 331 481508 4205 4220 TAGCCAGCCAAGGCGG 3-10-3 cEt 33 332 481733 4206 4219 AGCCAGCCAAGGCG 2-10-2 cEt 50 333 481509 4220 4235 ACAGGAGAGGCGAGCT 3-10-3 cEt 46 334 481734 4221 4234 CAGGAGAGGCGAGC 2-10-2 cEt 28 335 481510 4237 4252 TAGGTGTTCCCATACG 3-10-3 cEt 95 336 481735 4238 4251 AGGTGTTCCCATAC 2-10-2 cEt 22 337 481511 4258 4273 GGCAGCCCATCCAGCA 3-10-3 cEt 43 338 481736 4259 4272 GCAGCCCATCCAGC 2-10-2 cEt 54 339 481512 4275 4290 CATGCCTCTGAGTCAG 3-10-3 cEt 30 340 481737 4276 4289 ATGCCTCTGAGTCA 2-10-2 cEt 31 341 481513 4290 4305 GTTGCCAAATCCGGCC 3-10-3 cEt 85 342 481738 4291 4304 TTGCCAAATCCGGC 2-10-2 cEt 70 343 481514 4305 4320 GCAAGGTGGTTTTGAG 3-10-3 cEt 85 344 481739 4306 4319 CAAGGTGGTTTTGA 2-10-2 cEt 60 345 481515 4325 4340 AGAAACTCTGATCAGC 3-10-3 cEt 88 346 481740 4326 4339 GAAACTCTGATCAG 2-10-2 cEt 71 347 481516 4364 4379 CAGAGACCAGCTAATT 3-10-3 cEt 78 348 481741 4365 4378 AGAGACCAGCTAAT 2-10-2 cEt 80 349 481517 4394 4409 ATCTTAGAGAAGGTCG 3-10-3 cEt 87 350 481742 4395 4408 TCTTAGAGAAGGTC 2-10-2 cEt 64 351 481518 4425 4440 CCAGGCAGGAGGACTG 3-10-3 cEt 67 352 481743 4426 4439 CAGGCAGGAGGACT 2-10-2 cEt 75 353 481519 4437 4452 CATCAACTGTCTCCAG 3-10-3 cEt 29 354 481744 4438 4451 ATCAACTGTCTCCA 2-10-2 cEt 69 355 481520 4439 4454 CACATCAACTGTCTCC 3-10-3 cEt 73 356 481745 4440 4453 ACATCAACTGTCTC 2-10-2 cEt 74 357 481521 4459 4474 GAAGTAAGAGCTCTGC 3-10-3 cEt 86 358 481746 4460 4473 AAGTAAGAGCTCTG 2-10-2 cEt 67 359 481522 4474 4489 AAGAGTGTTGCTGGAG 3-10-3 cEt 92 360 481747 4475 4488 AGAGTGTTGCTGGA 2-10-2 cEt 95 361 481523 4489 4504 GCTTATTATGTACTGA 3-10-3 cEt 95 362 481748 4490 4503 CTTATTATGTACTG 2-10-2 cEt 15 363 481524 4530 4545 GCCCAAGTCTCACCTT 3-10-3 cEt 70 364 481749 4531 4544 CCCAAGTCTCACCT 2-10-2 cEt 70 365 481525 4541 4556 CCCAATGGTAAGCCCA 3-10-3 cEt 93 366 481750 4542 4555 CCAATGGTAAGCCC 2-10-2 cEt 94 367 481526 4543 4558 AACCCAATGGTAAGCC 3-10-3 cEt 82 368 481751 4544 4557 ACCCAATGGTAAGC 2-10-2 cEt 54 369 481527 4560 4575 TAGGTCCCTATGATTT 3-10-3 cEt 55 370 481752 4561 4574 AGGTCCCTATGATT 2-10-2 cEt 62 371 481528 4579 4594 AAGCCCTGAACCCTCG 3-10-3 cEt 77 372 481753 4580 4593 AGCCCTGAACCCTC 2-10-2 cEt 71 373 481529 4615 4630 CCTAAGGCCATGAACT 3-10-3 cEt 64 374 481754 4616 4629 CTAAGGCCATGAAC 2-10-2 cEt 53 375 481530 4630 4645 ACCAGATACATGCTAC 3-10-3 cEt 87 376 481755 4631 4644 CCAGATACATGCTA 2-10-2 cEt 84 377 481531 4646 4661 TACAATCAGAGTTAAG 3-10-3 cEt 66 378 481756 4647 4660 ACAATCAGAGTTAA 2-10-2 cEt 5 379 481532 4664 4679 TCCTCTCAGAACTTTT 3-10-3 cEt 65 380 481757 4665 4678 CCTCTCAGAACTTT 2-10-2 cEt 81 381 481533 4666 4681 GCTCCTCTCAGAACTT 3-10-3 cEt 80 382 481758 4667 4680 CTCCTCTCAGAACT 2-10-2 cEt 62 383 481534 4693 4708 TTCTTTAATGGGCCAC 3-10-3 cEt 79 384 481759 4694 4707 TCTTTAATGGGCCA 2-10-2 cEt 74 385 481535 4767 4782 ACGGGATTCCCTCGGC 3-10-3 cEt 78 386 481760 4768 4781 CGGGATTCCCTCGG 2-10-2 cEt 78 387 481536 4782 4797 GTAGGTAAGCAACCCA 3-10-3 cEt 91 388 481761 4783 4796 TAGGTAAGCAACCC 2-10-2 cEt 78 389 481537 4830 4845 GAATTTGAATGCAGTG 3-10-3 cEt 84 390 481762 4831 4844 AATTTGAATGCAGT 2-10-2 cEt 2 391 481538 4844 4859 TGAAGTACACATTGGA 3-10-3 cEt 92 392 481763 4845 4858 GAAGTACACATTGG 2-10-2 cEt 96 393 481539 4860 4875 ATAAATTTTTACACTA 3-10-3 cEt 19 394 481764 4861 4874 TAAATTTTTACACT 2-10-2 cEt 1 395 481765 4869 4882 CAATAATATAAATT 2-10-2 cEt 0 396 481541 4934 4949 CTGGAAGTTAAAGTAG 3-10-3 cEt 71 397 481766 4935 4948 TGGAAGTTAAAGTA 2-10-2 cEt 10 398
Tabela 2
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću cEt i MOE himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ
ID NO: 2
ISIS BR. Ljudsko Ljudsko Sekvenca Motiv Hemija % SEQ početno zaustavn krila inhibicije ID mesto o mesto NO 481350 1065 1080 TCCAGGATCCGGTTGG 3-10-3 cEt 52 9 481575 1066 1079 CCAGGATCCGGTTG 2-10-2 cEt 41 10 481351 1121 1136 GGCCGAAGGGCCTCTC 3-10-3 cEt 14 11 481576 1122 1135 GCCGAAGGGCCTCT 2-10-2 cEt 8 12 481542 1988 2003 GGCTCAATTATTTATC 3-10-3 cEt 64 399 481767 1989 2002 GCTCAATTATTTAT 2-10-2 cEt 0 400 481543 1996 2011 AATGCAATGGCTCAAT 3-10-3 cEt 84 401 481768 1997 2010 AT GCAATGGCTCAA 2-10-2 cEt 95 402 481544 2004 2019 ATCCAGTAAATGCAAT 3-10-3 cEt 58 403 481769 2005 2018 TCCAGTAAATGCAA 2-10-2 cEt 55 404 481545 2061 2076 AGAAAACTCCCACTCT 3-10-3 cEt 36 405 481770 2062 2075 GAAAACTCCCACTC 2-10-2 cEt 42 406 481546 2113 2128 CTGTCTTTGTTTCCCT 3-10-3 cEt 70 407 481771 2114 2127 TGTCTTTGTTTCCC 2-10-2 cEt 75 408 481547 2121 2136 AGGCCAGCCTGTCTTT 3-10-3 cEt 87 409 481772 2122 2135 GGCCAGCCTGTCTT 2-10-2 cEt 53 410 481548 2705 2720 CTAATGGTTCTTTGTG 3-10-3 cEt 78 411 481773 2706 2719 TAATGGTTCTTTGT 2-10-2 cEt 9 412 481549 6476 6491 GAAATTCATTCTTCCA 3-10-3 cEt 96 413 481774 6477 6490 AAATTCATTCTTCC 2-10-2 cEt 56 414 481550 10001 10016 ACACACACAGATGTGA 3-10-3 cEt 48 415 481775 10002 10015 CACACACAGATGTG 2-10-2 cEt 35 416 481551 10337 10352 CTACCCAAACATCCCC 3-10-3 cEt 69 417 481776 10338 10351 TACCCAAACATCCC 2-10-2 cEt 62 418 481552 10345 10360 TACAAAAACTACCCAA 3-10-3 cEt 30 419 481777 10346 10359 ACAAAAACTACCCA 2-10-2 cEt 1 420 481553 10364 10379 AGTTTTCAGAAATGGC 3-10-3 cEt 96 421 481778 10365 10378 GTTTTCAGAAATGG 2-10-2 cEt 47 422 481554 15469 15484 CAAGCTTTTCTATGAA 3-10-3 cEt 86 423 481779 15470 15483 AAGCTTTTCTATGA 2-10-2 cEt 60 424 481555 24588 24603 TTATTCAGGTCACTTT 3-10-3 cEt 73 425 481780 24589 24602 TATTCAGGTCACTT 2-10-2 cEt 60 426 481352 40953 40968 CCTGCTAAAATCAGGG 3-10-3 cEt 15 13 481577 40954 40967 CTGCTAAAATCAGG 2-10-2 cEt 12 14 481353 40968 40983 ATTCCATTGGGCCATC 3-10-3 cEt 78 15 481578 40969 40982 TTCCATTGGGCCAT 2-10-2 cEt 51 16 481354 40992 41007 CCGTGTGTCAAGCTGC 3-10-3 cEt 98 17 481579 40993 41006 CGTGTGTCAAGCTG 2-10-2 cEt 91 18 481355 41050 41065 ACTGCCGCAGCTCCAT 3-10-3 cEt 95 19 481580 41051 41064 CTGCCGCAGCTCCA 2-10-2 cEt 76 20 481356 41074 41089 GACTCTCAATCCAAGG 3-10-3 cEt 83 21 481581 41075 41088 ACTCTCAATCCAAG 2-10-2 cEt 31 22 481556 42765 42780 GCATATGCCCTAGGAA 3-10-3 cEt 23 430 481781 42766 42779 CATATGCCCTAGGA 2-10-2 cEt 15 431 481357 42778 42793 TTCTTTGCTGGCCGCA 3-10-3 cEt 97 23 481582 42779 42792 TCTTTGCTGGCCGC 2-10-2 cEt 87 24 481358 42806 42821 GATTATGAAACACCAA 3-10-3 cEt 85 25 481583 42807 42820 ATTATGAAACACCA 2-10-2 cEt 20 26 481359 42832 42847 ATACTGCTGGTCAATC 3-10-3 cEt 90 27 481584 42833 42846 TACTGCTGGTCAAT 2-10-2 cEt 42 28 481360 42862 42877 GAGAACATTCGACTCT 3-10-3 cEt 75 29 481585 42863 42876 AGAACATTCGACTC 2-10-2 cEt 77 30 481361 42877 42892 TAGATTGTGCTGATAG 3-10-3 cEt 90 31 481586 42878 42891 AGATTGTGCTGATA 2-10-2 cEt 81 32 481362 42893 42908 ACTGCTTGATTCTTCG 3-10-3 cEt 59 33 481587 42894 42907 CTGCTTGATTCTTC 2-10-2 cEt 23 34 481557 43043 43058 GCTAATTACTTCTCCT 3-10-3 cEt 57 432 481782 43044 43057 CTAATTACTTCTCC 2-10-2 cEt 25 433 481588 43826 43839 AAGATACCTGCTCT 2-10-2 cEt 58 36 481364 43856 43871 GCCACAATCCGGGCAA 3-10-3 cEt 36 37 481589 43857 43870 CCACAATCCGGGCA 2-10-2 cEt 69 38 481365 43903 43918 CAGTGGCTGCAGTCTG 3-10-3 cEt 36 39 481590 43904 43917 AGTGGCTGCAGTCT 2-10-2 cEt 30 40 481558 50069 50084 GCCCCCTTGCTGCCAA 3-10-3 cEt 0 434 481783 50070 50083 CCCCCTTGCTGCCA 2-10-2 cEt 39 435 481367 50101 50116 GTCACCACGGCTGCTG 3-10-3 cEt 70 43 481592 50102 50115 TCACCACGGCTGCT 2-10-2 cEt 48 44 481368 50122 50137 TCCAGCATCTGCTGCT 3-10-3 cEt 81 45 481593 50123 50136 CCAGCATCTGCTGC 2-10-2 cEt 46 46 481369 50138 50153 ATCCTGAAGGTGCTGC 3-10-3 cEt 29 47 481594 50139 50152 TCCTGAAGGTGCTG 2-10-2 cEt 16 48 481559 50668 50683 TGTTCTAGATCCTGTT 3-10-3 cEt 72 436 481784 50669 50682 GTTCTAGATCCTGT 2-10-2 cEt 79 437 481371 50673 50688 TTTTCTGTTCTAGATC 3-10-3 cEt 83 51 481596 50674 50687 TTTCTGTTCTAGAT 2-10-2 cEt 48 52 481372 50694 50709 GGAGATTCTCTACCAC 3-10-3 cEt 85 53 481597 50695 50708 GAGATTCTCTACCA 2-10-2 cEt 80 54 481373 50715 50730 AGTTGAAATCAAAGTC 3-10-3 cEt 87 55 481598 50716 50729 GTTGAAATCAAAGT 2-10-2 cEt 6 56 481599 51626 51639 GATCTTGCATGTCT 2-10-2 cEt 51 58 481375 51636 51651 TGTTTCCATTCAGATC 3-10-3 cEt 65 59 481600 51637 51650 GTTTCCATTCAGAT 2-10-2 cEt 42 60 481376 51705 51720 TCCGCATCTGGTCCAG 3-10-3 cEt 82 61 481601 51706 51719 CCGCATCTGGTCCA 2-10-2 cEt 70 62 481560 51708 51723 CTCTCCGCATCTGGTC 3-10-3 cEt 63 438 481785 51709 51722 TCTCCGCATCTGGT 2-10-2 cEt 28 63 481378 51905 51920 CCGCCAGCTCACTCAC 3-10-3 cEt 89 66 481603 51906 51919 CGCCAGCTCACTCA 2-10-2 cEt 60 67 481379 51968 51983 TCCAGTCAGCCAGCTC 3-10-3 cEt 91 68 481604 51969 51982 CCAGTCAGCCAGCT 2-10-2 cEt 70 69 481380 51976 51991 CCGCCTCTTCCAGTCA 3-10-3 cEt 73 70 481605 51977 51990 CGCCTCTTCCAGTC 2-10-2 cEt 55 71 481381 52023 52038 CGATCTAGGCAGATGT 3-10-3 cEt 26 72 481606 52024 52037 GATCTAGGCAGATG 2-10-2 cEt 35 73 481382 55443 55458 GAGATTCTGCTAATGA 3-10-3 cEt 81 74 481607 55444 55457 AGATTCTGCTAATG 2-10-2 cEt 51 75 481383 55451 55466 CTGAAGTTGAGATTCT 3-10-3 cEt 84 76 481608 55452 55465 TGAAGTTGAGATTC 2-10-2 cEt 26 77 481384 55496 55511 AACTTTTTGCTGCAAC 3-10-3 cEt 76 78 481609 55497 55510 ACTTTTTGCTGCAA 2-10-2 cEt 34 79 481385 55511 55526 GTCCCCTTTGTAGGAA 3-10-3 cEt 41 80 481610 55512 55525 TCCCCTTTGTAGGA 2-10-2 cEt 37 81 481387 55748 55763 CAGGATGCATGGGCAT 3-10-3 cEt 92 84 481612 55749 55762 AGGATGCATGGGCA 2-10-2 cEt 86 85 481388 55792 55807 TTTAGTAGTGAACTGG 3-10-3 cEt 74 86 481613 55793 55806 TTAGTAGTGAACTG 2-10-2 cEt 22 87 481561 57949 57964 TGACCAGCAACCTATT 3-10-3 cEt 43 439 481786 57950 57963 GACCAGCAACCTAT 2-10-2 cEt 59 440 481390 57969 57984 ATAATTCAACTCAGGG 3-10-3 cEt 92 90 481615 57970 57983 TAATTCAACTCAGG 2-10-2 cEt 48 91 481391 57978 57993 TTTAAGCTGATAATTC 3-10-3 cEt 44 92 481616 57979 57992 TTAAGCTGATAATT 2-10-2 cEt 0 93 481392 57990 58005 GCACACTTTAATTTTA 3-10-3 cEt 49 94 481617 57991 58004 CACACTTTAATTTT 2-10-2 cEt 1 95 481562 59703 59718 CCCAGAGTCTCTGTAA 3-10-3 cEt 36 441 481787 59704 59717 CCAGAGTCTCTGTA 2-10-2 cEt 22 442 481394 59895 59910 GAGGCTGCCGTTGTTG 3-10-3 cEt 62 98 481619 59896 59909 AGGCTGCCGTTGTT 2-10-2 cEt 29 99 481396 60034 60049 CACATCTCTGCTCCCT 3-10-3 cEt 92 102 481621 60035 60048 ACATCTCTGCTCCC 2-10-2 cEt 74 103 481563 60064 60079 TTACATCACAATTGGC 3-10-3 cEt 24 445 481788 60065 60078 TACATCACAATTGG 2-10-2 cEt 3 446 481398 63306 63321 GATCAGGTGCAGCTCC 3-10-3 cEt 73 106 481623 63307 63320 ATCAGGTGCAGCTC 2-10-2 cEt 40 107 481399 63327 63342 ATACACCTCGGTCTCA 3-10-3 cEt 73 108 481624 63328 63341 TACACCTCGGTCTC 2-10-2 cEt 43 109 481400 63343 63358 TCTTGAGGCCTTGGTG 3-10-3 cEt 47 110 481625 63344 63357 CTTGAGGCCTTGGT 2-10-2 cEt 16 111 481401 63353 63368 TCTAGGTCAATCTTGA 3-10-3 cEt 74 112 481626 63354 63367 CTAGGTCAATCTTG 2-10-2 cEt 54 113 481564 64421 64436 GCAAGGAGTGGGTCTG 3-10-3 cEt 33 446 481789 64422 64435 CAAGGAGTGGGTCT 2-10-2 cEt 10 116 481403 64425 64440 ACTGGCAAGGAGTGGG 3-10-3 cEt 58 117 481628 64426 64439 CTGGCAAGGAGTGG 2-10-2 cEt 38 118 481404 64451 64466 TCTGACAGATGTTGGA 3-10-3 cEt 50 119 481629 64452 64465 CTGACAGATGTTGG 2-10-2 cEt 64 120 481405 64459 64474 ATTTGGCATCTGACAG 3-10-3 cEt 75 121 481630 64460 64473 TTTGGCATCTGACA 2-10-2 cEt 39 122 481407 64663 64678 CCCAGGTTCCAATTGG 3-10-3 cEt 50 125 481632 64664 64677 CCAGGTTCCAATTG 2-10-2 cEt 32 126 481408 64714 64729 CTCGCTTGGTGGTGGA 3-10-3 cEt 53 127 481633 64715 64728 TCGCTTGGTGGTGG 2-10-2 cEt 35 128 481409 64729 64744 GCTCGATGCTCAGTCC 3-10-3 cEt 86 129 481634 64730 64743 CTCGATGCTCAGTC 2-10-2 cEt 43 130 481410 64759 64774 CCAAGAGTTTCTCTGC 3-10-3 cEt 91 131 481635 64760 64773 CAAGAGTTTCTCTG 2-10-2 cEt 43 132 481411 65859 65874 AATTCACACCAGGTCC 3-10-3 cEt 72 133 481636 65860 65873 ATTCACACCAGGTC 2-10-2 cEt 42 134 481412 65877 65892 TGATCTGACACCCTGA 3-10-3 cEt 90 135 481637 65878 65891 GATCTGACACCCTG 2-10-2 cEt 79 136 481413 65885 65900 AGCCCATGTGATCTGA 3-10-3 cEt 80 137 481638 65886 65899 GCCCATGTGATCTG 2-10-2 cEt 64 138 481565 66119 66134 TTTCCTGGAGAAAAGA 3-10-3 cEt 4 447 481790 66120 66133 TTCCTGGAGAAAAG 2-10-2 cEt 3 448 481566 66127 66142 AGCCATGTTTTCCTGG 3-10-3 cEt 62 449 481791 66128 66141 GCCATGTTTTCCTG 2-10-2 cEt 73 450 481415 66133 66148 CTTGCCAGCCATGTTT 3-10-3 cEt 88 141 481640 66134 66147 TTGCCAGCCATGTT 2-10-2 cEt 57 142 337332 66135 66154 GAAGCCCTTGCCAGCCATGT 5-10-5 MOE 63 143 481416 66138 66153 AAGCCCTTGCCAGCCA 3-10-3 cEt 87 144 481641 66139 66152 AGCCCTTGCCAGCC 2-10-2 cEt 68 145 337333 66140 66159 AAGGAGAAGCCCTTGCCAGC 5-10-5 MOE 49 146 481417 66140 66155 AGAAGCCCTTGCCAGC 3-10-3 cEt 97 147 481418 66141 66156 GAGAAGCCCTTGCCAG 3-10-3 cEt 92 148 481642 66141 66154 GAAGCCCTTGCCAG 2-10-2 cEt 67 149 481419 66142 66157 GGAGAAGCCCTTGCCA 3-10-3 cEt 83 150 481643 66142 66155 AGAAGCCCTTGCCA 2-10-2 cEt 58 151 481644 66143 66156 GAGAAGCCCTTGCC 2-10-2 cEt 45 152 481420 66185 66200 ACTTTTTCACAAGGTC 3-10-3 cEt 94 153 481645 66186 66199 CTTTTTCACAAGGT 2-10-2 cEt 50 154 481421 66374 66389 CTCAAGATGGCCCGCT 3-10-3 cEt 86 155 481646 66375 66388 TCAAGATGGCCCGC 2-10-2 cEt 41 156 481422 66389 66404 CCTGGAGGCTTAGTGC 3-10-3 cEt 80 157 481647 66390 66403 CTGGAGGCTTAGTG 2-10-2 cEt 0 158 481423 66430 66445 CTCCTTCTTTGCTGCT 3-10-3 cEt 69 159 481648 66431 66444 TCCTTCTTTGCTGC 2-10-2 cEt 51 160 481424 66446 66461 CAAGTGAAAGTGACGC 3-10-3 cEt 70 161 481649 66447 66460 AAGTGAAAGTGACG 2-10-2 cEt 25 162 481425 66468 66483 ACCGCTGATGTCCTTC 3-10-3 cEt 78 163 481650 66469 66482 CCGCTGATGTCCTT 2-10-2 cEt 79 164 481426 66993 67008 ACTGGATCTGGGTCTT 3-10-3 cEt 80 165 481651 66994 67007 CTGGATCTGGGTCT 2-10-2 cEt 64 166 481427 67017 67032 GCTGCTTTGTGTATGG 3-10-3 cEt 75 167 481652 67018 67031 CTGCTTTGTGTATG 2-10-2 cEt 82 168 481428 67026 67041 TGTTCAGCTGCTGCTT 3-10-3 cEt 77 169 481653 67027 67040 GTTCAGCTGCTGCT 2-10-2 cEt 79 170 481429 67034 67049 TGACATGTTGTTCAGC 3-10-3 cEt 84 171 481654 67035 67048 GACATGTTGTTCAG 2-10-2 cEt 70 172 481430 67052 67067 CATGATGATTTCAGCA 3-10-3 cEt 67 173 481655 67053 67066 ATGATGATTTCAGC 2-10-2 cEt 31 174 481431 67068 67083 CCATGATCTTATAGCC 3-10-3 cEt 91 175 481656 67069 67082 CATGATCTTATAGC 2-10-2 cEt 0 176 481432 67095 67110 GTGGAGACACCAGGAT 3-10-3 cEt 55 177 481657 67096 67109 TGGAGACACCAGGA 2-10-2 cEt 58 178 481433 67118 67133 AATGTCAGGATAGAGA 3-10-3 cEt 73 179 481658 67119 67132 ATGTCAGGATAGAG 2-10-2 cEt 62 180 481434 67128 67143 CCTCCTTGGGAATGTC 3-10-3 cEt 73 181 345785 67129 67148 TGCCTCCTCCTTGGGAATGT 5-10-5 MOE 50 182 481659 67129 67142 CTCCTTGGGAATGT 2-10-2 cEt 51 183 481435 67131 67146 CCTCCTCCTTGGGAAT 3-10-3 cEt 49 184 481660 67132 67145 CTCCTCCTTGGGAA 2-10-2 cEt 54 185 481436 67137 67152 CGAATGCCTCCTCCTT 3-10-3 cEt 82 186 481661 67138 67151 GAATGCCTCCTCCT 2-10-2 cEt 76 187 481437 67158 67173 TCTCTGGCCGACAATA 3-10-3 cEt 49 188 481662 67159 67172 CTCTGGCCGACAAT 2-10-2 cEt 43 189 481567 67194 67209 AACAACTACCTGGGTC 3-10-3 cEt 20 451 481792 67195 67208 ACAACTACCTGGGT 2-10-2 cEt 0 452 481438 72272 72287 ACTTGGTCTTCAGGTA 3-10-3 cEt 51 190 481663 72273 72286 CTTGGTCTTCAGGT 2-10-2 cEt 52 191 481568 72290 72305 ACGGTGTCACACAGAT 3-10-3 cEt 85 453 481793 72291 72304 CGGTGTCACACAGA 2-10-2 cEt 93 454 481569 72430 72445 AACACACAAGGTCACT 3-10-3 cEt 62 455 481794 72431 72444 ACACACAAGGTCAC 2-10-2 cEt 81 456 481570 72438 72453 GCTTTTTAAACACACA 3-10-3 cEt 79 457 481795 72439 72452 CTTTTTAAACACAC 2-10-2 cEt 0 458 481571 72528 72543 TGACAAGACACAATGG 3-10-3 cEt 12 459 481796 72529 72542 GACAAGACACAATG 2-10-2 cEt 36 460 481440 72586 72601 GTATTGCTGCAGGTCG 3-10-3 cEt 79 194 481665 72587 72600 TATTGCTGCAGGTC 2-10-2 cEt 43 195 481441 72594 72609 GGTCAATGGTATTGCT 3-10-3 cEt 55 196 481666 72595 72608 GTCAATGGTATTGC 2-10-2 cEt 36 197 481442 72602 72617 CATCGGCAGGTCAATG 3-10-3 cEt 44 198 481667 72603 72616 ATCGGCAGGTCAAT 2-10-2 cEt 31 199 481443 72622 72637 GAATCTAAAGTGCGGG 3-10-3 cEt 78 200 481668 72623 72636 AATCTAAAGTGCGG 2-10-2 cEt 41 201 481444 72630 72645 GCATCAATGAATCTAA 3-10-3 cEt 66 202 481669 72631 72644 CATCAATGAATCTA 2-10-2 cEt 0 203 481445 72638 72653 TCCAAACTGCATCAAT 3-10-3 cEt 70 204 481670 72639 72652 CCAAACTGCATCAA 2-10-2 cEt 60 205 481446 72659 72674 TTCAGCACCTTCACCA 3-10-3 cEt 44 206 481671 72660 72673 TCAGCACCTTCACC 2-10-2 cEt 41 207 481447 72675 72690 GCCCTCCTGCTGAGGG 3-10-3 cEt 10 208 481672 72676 72689 CCCTCCTGCTGAGG 2-10-2 cEt 15 209 481572 72682 72697 CCAAACTGCCCTCCTG 3-10-3 cEt 51 461 481797 72683 72696 CAAACTGCCCTCCT 2-10-2 cEt 11 211 481573 73535 73550 GGTCAGAAAAGCCAGA 3-10-3 cEt 55 462 481798 73536 73549 GTCAGAAAAGCCAG 2-10-2 cEt 59 463 481449 73690 73705 CCATGTCAAAGGTGAG 3-10-3 cEt 77 213 481674 73691 73704 CATGTCAAAGGTGA 2-10-2 cEt 31 214 481450 73717 73732 GGGAGGTAGCGCACTC 3-10-3 cEt 53 215 481675 73718 73731 GGAGGTAGCGCACT 2-10-2 cEt 41 216 481451 73779 73794 GAAT GCAGGTAGGC GC 3-10-3 cEt 55 217 481676 73780 73793 AATGCAGGTAGGCG 2-10-2 cEt 39 218 481452 73818 73833 TTTCAGATGATCTGGG 3-10-3 cEt 71 219 481677 73819 73832 TTCAGATGATCTGG 2-10-2 cEt 38 220 481574 73837 73852 GGAACCACAAAGTTAG 3-10-3 cEt 69 221 481799 73838 73851 GAACCACAAAGTTA 2-10-2 cEt 50 222 481453 73868 73883 GATAGCAGAAGTAGGA 3-10-3 cEt 92 223 481678 73869 73882 ATAGCAGAAGTAGG 2-10-2 cEt 78 224 481454 73889 73904 AAAGTGCCCAGATTGC 3-10-3 cEt 85 225 481679 73890 73903 AAGTGCCCAGATTG 2-10-2 cEt 69 226 481455 73909 73924 CACTCATTTCTCTATT 3-10-3 cEt 74 227 481680 73910 73923 ACTCATTTCTCTAT 2-10-2 cEt 39 228 481456 73954 73969 AACACATCCTTATTTG 3-10-3 cEt 48 229 481681 73955 73968 ACACATCCTTATTT 2-10-2 cEt 47 230 481457 73966 73981 TGGGTCTCAGAGAACA 3-10-3 cEt 88 231 481682 73967 73980 GGGTCTCAGAGAAC 2-10-2 cEt 77 232 481458 74019 74034 CAAGACATTTCCTTTT 3-10-3 cEt 54 233 481683 74020 74033 AAGACATTTCCTTT 2-10-2 cEt 29 234 481459 74095 74110 GGAGGCACTTGTCTAA 3-10-3 cEt 76 235 481684 74096 74109 GAGGCACTTGTCTA 2-10-2 cEt 89 236 481460 74130 74145 TTACAGAAACAGGCAG 3-10-3 cEt 83 237 481685 74131 74144 TACAGAAACAGGCA 2-10-2 cEt 36 238 481461 74156 74171 AGCTATAGGTGGCCTG 3-10-3 cEt 75 239 481686 74157 74170 GCTATAGGTGGCCT 2-10-2 cEt 70 240 481462 74171 74186 ATGCCAGGAGTATGTA 3-10-3 cEt 89 241 481687 74172 74185 TGCCAGGAGTATGT 2-10-2 cEt 80 242 481463 74188 74203 CAAGGTTAAAAAGTGC 3-10-3 cEt 88 243 481688 74189 74202 AAGGTTAAAAAGTG 2-10-2 cEt 13 244 481464 74203 74218 CTATTTGGATGTCAGC 3-10-3 cEt 97 245 481689 74204 74217 TATTTGGATGTCAG 2-10-2 cEt 40 246 481465 74219 74234 TAGATAGTCCTATCTT 3-10-3 cEt 51 247 481690 74220 74233 AGATAGTCCTATCT 2-10-2 cEt 64 248 481466 74234 74249 AAGAAACCTAGGGCTT 3-10-3 cEt 74 249 481691 74235 74248 AGAAACCTAGGGCT 2-10-2 cEt 77 250 481467 74284 74299 GCTGATACAGTGTTTT 3-10-3 cEt 74 251 481692 74285 74298 CTGATACAGTGTTT 2-10-2 cEt 74 252 481468 74299 74314 ATACAGAAAGGCTATG 3-10-3 cEt 71 253 481693 74300 74313 TACAGAAAGGCTAT 2-10-2 cEt 25 254 481469 74314 74329 GCTTAAGTTTCTTAAA 3-10-3 cEt 61 255 481694 74315 74328 CTTAAGTTTCTTAA 2-10-2 cEt 0 256 481470 74648 74663 AGCACCAAGGAGGCTG 3-10-3 cEt 49 257 481695 74649 74662 GCACCAAGGAGGCT 2-10-2 cEt 83 258 481471 74663 74678 AAGCTGAATGCTTAAA 3-10-3 cEt 36 259 481696 74664 74677 AGCTGAATGCTTAA 2-10-2 cEt 33 260 481472 74678 74693 TTACCAGCCTGAAGGA 3-10-3 cEt 76 261 481697 74679 74692 TACCAGCCTGAAGG 2-10-2 cEt 63 262 481473 74693 74708 CAGGGATTATATAAAT 3-10-3 cEt 53 263 481698 74694 74707 AGGGATTATATAAA 2-10-2 cEt 15 264 481474 74708 74723 ACCTGAAGCCCGTTTC 3-10-3 cEt 80 265 481699 74709 74722 CCTGAAGCCCGTTT 2-10-2 cEt 57 266 481475 74723 74738 TGTCTTAAGGGTTTGA 3-10-3 cEt 93 267 481700 74724 74737 GTCTTAAGGGTTTG 2-10-2 cEt 89 268 481476 74738 74753 GGTTGCAGCTTCAGAT 3-10-3 cEt 92 269 481701 74739 74752 GTTGCAGCTTCAGA 2-10-2 cEt 60 270 481477 74754 74769 TCAACACCAAAGGCCA 3-10-3 cEt 95 271 481702 74755 74768 CAACACCAAAGGCC 2-10-2 cEt 89 272 481478 74772 74787 TCCTTAAACCTTCCTA 3-10-3 cEt 84 273 481703 74773 74786 CCTTAAACCTTCCT 2-10-2 cEt 57 274 481479 74787 74802 AAAATGCTTAGATTCT 3-10-3 cEt 80 275 481704 74788 74801 AAATGCTTAGATTC 2-10-2 cEt 32 276 481480 74815 74830 AAATAAGTCTATTTAT 3-10-3 cEt 5 277 481705 74816 74829 AATAAGTCTATTTA 2-10-2 cEt 25 278 481481 74835 74850 GGCCAATACATTACAA 3-10-3 cEt 63 279 481706 74836 74849 GCCAATACATTACA 2-10-2 cEt 56 280 481482 74857 74872 TGCCCAGCCTTACTCA 3-10-3 cEt 55 281 481707 74858 74871 GCCCAGCCTTACTC 2-10-2 cEt 43 282 481483 74872 74887 GTTGTAAGCACCCTCT 3-10-3 cEt 1 283 481708 74873 74886 TTGTAAGCACCCTC 2-10-2 cEt 56 284 481484 74887 74902 AGAAAGGGAGTCAAGG 3-10-3 cEt 60 285 481709 74888 74901 GAAAGGGAGTCAAG 2-10-2 cEt 27 286 481485 74904 74919 GCAGATCAAGTCCAGG 3-10-3 cEt 90 287 481710 74905 74918 CAGATCAAGTCCAG 2-10-2 cEt 88 288 481486 74917 74932 AGCCTCTGAAACAGCA 3-10-3 cEt 75 289 481711 74918 74931 GCCTCTGAAACAGC 2-10-2 cEt 74 290 481487 74933 74948 CCCACAGAAACAACCT 3-10-3 cEt 66 291 481712 74934 74947 CCACAGAAACAACC 2-10-2 cEt 45 292 481488 74948 74963 AGCCCTGATAAGGCAC 3-10-3 cEt 23 293 481713 74949 74962 GCCCTGATAAGGCA 2-10-2 cEt 18 294 481489 74963 74978 AATCAGAAGTATCCCA 3-10-3 cEt 60 295 481714 74964 74977 ATCAGAAGTATCCC 2-10-2 cEt 43 296 481490 75020 75035 GCCTCTAGCAGGATCA 3-10-3 cEt 78 297 481715 75021 75034 CCTCTAGCAGGATC 2-10-2 cEt 79 298 481491 75035 75050 CACGCAAGGAGACATG 3-10-3 cEt 70 299 481716 75036 75049 ACGCAAGGAGACAT 2-10-2 cEt 68 300 481492 75050 75065 TGAGGGACCTTTAGAC 3-10-3 cEt 61 301 481717 75051 75064 GAGGGACCTTTAGA 2-10-2 cEt 44 302 481493 75073 75088 CAGGATTCCTAAAACA 3-10-3 cEt 43 303 481718 75074 75087 AGGATTCCTAAAAC 2-10-2 cEt 7 304 481494 75088 75103 ATGAGGTCCTGAGACC 3-10-3 cEt 60 305 481719 75089 75102 TGAGGTCCTGAGAC 2-10-2 cEt 29 306 481495 75127 75142 CATCATGTCCAACCTG 3-10-3 cEt 92 307 481720 75128 75141 ATCATGTCCAACCT 2-10-2 cEt 63 308 481496 75142 75157 GGGCCCCATAGTGTGC 3-10-3 cEt 29 309 481721 75143 75156 GGCCCCATAGTGTG 2-10-2 cEt 19 310 481497 75164 75179 AGCTCAACCAGACACG 3-10-3 cEt 67 311 481722 75165 75178 GCTCAACCAGACAC 2-10-2 cEt 69 312 481498 75179 75194 GAACCATATTCCCTGA 3-10-3 cEt 90 313 481723 75180 75193 AACCATATTCCCTG 2-10-2 cEt 49 314 481499 75194 75209 CAAGAAACTGGCTAAG 3-10-3 cEt 43 315 481724 75195 75208 AAGAAACTGGCTAA 2-10-2 cEt 17 316 481500 75209 75224 GCCACTGGATATCACC 3-10-3 cEt 92 317 481725 75210 75223 CCACTGGATATCAC 2-10-2 cEt 88 464 481501 75235 75250 AACTGAATGAAGACGC 3-10-3 cEt 91 318 481726 75236 75249 ACTGAATGAAGACG 2-10-2 cEt 56 319 481502 75250 75265 CCTTTGCCCTGCATGA 3-10-3 cEt 85 320 481727 75251 75264 CTTTGCCCTGCATG 2-10-2 cEt 70 321 481503 75265 75280 AAGTTTATCAGTAAGC 3-10-3 cEt 57 322 481728 75266 75279 AGTTTATCAGTAAG 2-10-2 cEt 22 323 481504 75280 75295 TACGAGGGCAGACTCA 3-10-3 cEt 60 324 481729 75281 75294 ACGAGGGCAGACTC 2-10-2 cEt 22 325 481505 75295 75310 AGGTATACACCCTCAT 3-10-3 cEt 45 326 481730 75296 75309 GGTATACACCCTCA 2-10-2 cEt 47 327 481506 75310 75325 CCTCAGAGGGAGGCCA 3-10-3 cEt 32 328 481731 75311 75324 CTCAGAGGGAGGCC 2-10-2 cEt 0 329 481507 75325 75340 GGGAGGAGTCACCAGC 3-10-3 cEt 64 330 481732 75326 75339 GGAGGAGTCACCAG 2-10-2 cEt 59 331 481508 75392 75407 TAGCCAGCCAAGGCGG 3-10-3 cEt 33 332 481733 75393 75406 AGCCAGCCAAGGCG 2-10-2 cEt 50 333 481509 75407 75422 ACAGGAGAGGCGAGCT 3-10-3 cEt 46 334 481734 75408 75421 CAGGAGAGGCGAGC 2-10-2 cEt 28 335 481510 75424 75439 TAGGTGTTCCCATACG 3-10-3 cEt 95 336 481735 75425 75438 AGGTGTTCCCATAC 2-10-2 cEt 22 337 481511 75445 75460 GGCAGCCCATCCAGCA 3-10-3 cEt 43 338 481736 75446 75459 GCAGCCCATCCAGC 2-10-2 cEt 54 339 481512 75462 75477 CATGCCTCTGAGTCAG 3-10-3 cEt 30 340 481737 75463 75476 ATGCCTCTGAGTCA 2-10-2 cEt 31 341 481513 75477 75492 GTTGCCAAATCCGGCC 3-10-3 cEt 85 342 481738 75478 75491 TTGCCAAATCCGGC 2-10-2 cEt 70 343 481514 75492 75507 GCAAGGTGGTTTTGAG 3-10-3 cEt 85 344 481739 75493 75506 CAAGGTGGTTTTGA 2-10-2 cEt 60 345 481515 75512 75527 AGAAACTCTGATCAGC 3-10-3 cEt 88 346 481740 75513 75526 GAAACTCTGATCAG 2-10-2 cEt 71 347 481516 75551 75566 CAGAGACCAGCTAATT 3-10-3 cEt 78 348 481741 75552 75565 AGAGACCAGCTAAT 2-10-2 cEt 80 349 481517 75581 75596 ATCTTAGAGAAGGTCG 3-10-3 cEt 87 350 481742 75582 75595 TCTTAGAGAAGGTC 2-10-2 cEt 64 351 481518 75612 75627 CCAGGCAGGAGGACTG 3-10-3 cEt 67 352 481743 75613 75626 CAGGCAGGAGGACT 2-10-2 cEt 75 353 481519 75624 75639 CATCAACTGTCTCCAG 3-10-3 cEt 29 354 481744 75625 75638 ATCAACTGTCTCCA 2-10-2 cEt 69 355 481520 75626 75641 CACATCAACTGTCTCC 3-10-3 cEt 73 356 481745 75627 75640 ACATCAACTGTCTC 2-10-2 cEt 74 357 481521 75646 75661 GAAGTAAGAGCTCTGC 3-10-3 cEt 86 358 481746 75647 75660 AAGTAAGAGCTCTG 2-10-2 cEt 67 359 481522 75661 75676 AAGAGTGTTGCTGGAG 3-10-3 cEt 92 360 481747 75662 75675 AGAGTGTTGCTGGA 2-10-2 cEt 95 361 481523 75676 75691 GCTTATTATGTACTGA 3-10-3 cEt 95 362 481748 75677 75690 CTTATTATGTACTG 2-10-2 cEt 15 363 481524 75717 75732 GCCCAAGTCTCACCTT 3-10-3 cEt 70 364 481749 75718 75731 CCCAAGTCTCACCT 2-10-2 cEt 70 365 481525 75728 75743 CCCAATGGTAAGCCCA 3-10-3 cEt 93 366 481750 75729 75742 CCAATGGTAAGCCC 2-10-2 cEt 94 367 481526 75730 75745 AACCCAATGGTAAGCC 3-10-3 cEt 82 368 481751 75731 75744 ACCCAATGGTAAGC 2-10-2 cEt 54 369 481527 75747 75762 TAGGTCCCTATGATTT 3-10-3 cEt 55 370 481752 75748 75761 AGGTCCCTATGATT 2-10-2 cEt 62 371 481528 75766 75781 AAGCCCTGAACCCTCG 3-10-3 cEt 77 372 481753 75767 75780 AGCCCTGAACCCTC 2-10-2 cEt 71 373 481529 75802 75817 CCTAAGGCCATGAACT 3-10-3 cEt 64 374 481754 75803 75816 CTAAGGCCATGAAC 2-10-2 cEt 53 375 481530 75817 75832 ACCAGATACATGCTAC 3-10-3 cEt 87 376 481755 75818 75831 CCAGATACATGCTA 2-10-2 cEt 84 377 481531 75833 75848 TACAATCAGAGTTAAG 3-10-3 cEt 66 378 481756 75834 75847 ACAATCAGAGTTAA 2-10-2 cEt 5 379 481532 75851 75866 TCCTCTCAGAACTTTT 3-10-3 cEt 65 380 481757 75852 75865 CCTCTCAGAACTTT 2-10-2 cEt 81 381 481533 75853 75868 GCTCCTCTCAGAACTT 3-10-3 cEt 80 382 481758 75854 75867 CTCCTCTCAGAACT 2-10-2 cEt 62 383 481534 75880 75895 TTCTTTAATGGGCCAC 3-10-3 cEt 79 384 481759 75881 75894 TCTTTAATGGGCCA 2-10-2 cEt 74 385 481535 75954 75969 ACGGGATTCCCTCGGC 3-10-3 cEt 78 386 481760 75955 75968 CGGGATTCCCTCGG 2-10-2 cEt 78 387 481536 75969 75984 GTAGGTAAGCAACCCA 3-10-3 cEt 91 388 481761 75970 75983 TAGGTAAGCAACCC 2-10-2 cEt 78 389 481537 76017 76032 GAATTTGAATGCAGTG 3-10-3 cEt 84 390 481762 76018 76031 AATTTGAATGCAGT 2-10-2 cEt 2 391 481538 76031 76046 TGAAGTACACATTGGA 3-10-3 cEt 92 392 481763 76032 76045 GAAGTACACATTGG 2-10-2 cEt 96 393 481539 76047 76062 ATAAATTTTTACACTA 3-10-3 cEt 19 394 481764 76048 76061 TAAATTTTTACACT 2-10-2 cEt 1 395 481765 76056 76069 CAATAATATAAATT 2-10-2 cEt 0 396 481541 76121 76136 CTGGAAGTTAAAGTAG 3-10-3 cEt 71 397 481766 76122 76135 TGGAAGTTAAAGTA 2-10-2 cEt 10 398
Primer 2: : Antisens inhibicija mišjeg STAT3 u b.END ćelijama
[0255] Antisens oligonukleotidi testirani u studiji opisanoj u Primeru 1 su takođe testirani za svoje efekte na STAT3 mRNK u b.END ćelijama. Kultivisane b.END ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po komorici su transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 7,000 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RTS2381 za sondiranje mišjeg prajmera (prednja sekvenca GCCACGTTGGTGTTTCATAATCT, ovde označena kao SEQ ID NO: 465; reverzna sekvenca GATAGAGGACATTGGACTCTTGCA, ovde označena kao SEQ ID NO: 466; sonda sekvenca TTGGGTGAAATTGACCAGCAATATAGCCG, ovde označena kao SEQ ID NO: 467) je korišćena za merenje RNK. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®.
[0256] Određene sekvence komplementarne sa STAT3 sekvencom mišjeg gena pokazale su dobru inhibiciju u b. END ćelijama. Rezultati su prikazani u Tabeli 3 kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Ljudski oligonukleotidi u Tabeli 3 su upoređeni sa genomskom mišjom sekvencom STAT-3, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 3 (komplement od GENBANK pristupni br. NT_165773.2 skraćena od nukleotida 12286001 do 12344000). „Početno mesto mišjeg cilja“ označava naj-5' nukleotid na koji je gapmer ciljan u mišjoj sekvenci. „Zaustavno mesto mišjeg cilja“ označava naj-3' nukleotid na koje je ciljana gapmer mišja sekvenca.
Tabela 3
Inhibicija nivoa ljudske STAT3 mRNK pomoću određenih cEt himernih antisens oligonukleotida komplementarnih sa SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 3
ISIS NO Mišje početno Mišje zaustavno % inhibicije SEQ ID NO mesto mesto
481549 5283 5298 96 413
481553 9913 9928 94 421
481768 3189 3202 91 402
481356 30356 30371 83 21
481548 4045 4060 82 411
481554 14662 14677 82 423
481426 48328 48343 82 165
481580 30333 30346 81 20
481412 47413 47428 81 135
481417 47636 47651 81 147
481418 47637 47652 80 148
481355 30332 30347 79 19
481396 43120 43135 79 443
481416 47634 47649 79 144
481420 47681 47696 79 153 481358 32842 32857 78 25 481363 33520 33535 78 35 481570 51870 51885 78 457 481382 37857 37872 77 74 481378 36560 36575 76 66 481431 48403 48418 76 175 481453 53034 53049 76 223 481621 43121 43134 75 444 481641 47635 47648 75 145 481637 47414 47427 74 136 481380 36631 36646 73 70 481574 53000 53015 73 221 481601 36392 36405 71 62 481419 47638 47653 71 150 481371 35938 35953 70 51 481642 47637 47650 70 149 481542 3180 3195 69 399 481547 3313 3328 69 409 481772 3314 3327 69 410 481362 32929 32944 69 33 481653 48362 48375 69 170 481786 38812 38825 68 440 481415 47629 47644 68 141 481543 3188 3203 67 401 481793 51714 51727 67 454 481443 52060 52075 67 200 481684 53229 53242 67 236 481398 45226 45241 66 106 481560 36394 36409 65 438 481643 47638 47651 65 151 481430 48387 48402 65 173 481440 52024 52039 65 194 Primer 3: Tolerancija antisens oligonukleotida koji ciljaju STAT3 kod BALB/c miševa [0257] Četrdeset antisens oligonukleotida koji pokazuju visok nivo potentnosti, izabranih između 452 jedinjenja procenjenih u Primeru 1, su dalje testirani na in vivo podnošljivost.
[0258] Grupe od 2-4 muških BALB/c miševa su injektirane subkutano dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 25 mg/kg ISIS antisens oligonukleotida. Jedna grupa od 4 mužjaka BALB/c miša je injektirana subkutano dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS. Ova grupa miševa je korišćena kao kontrolna grupa u koju su upoređene tretirane grupe. Jedan dan posle poslednje doze, uzete su telesne težine, miševi su eutanazirani, i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu.
[0259] Telesne težine miševa su merene pre doze i na kraju perioda tretmana. Izračunato je procentualno povećanje u odnosu na početnu telesnu težinu. Težine jetre, slezine i bubrega su mereni na kraju ispitivanja i upoređeni su sa miševima tretiranim sa PBS.
[0260] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na metaboličku funkciju, koncentracije transaminaza i BUN u plazmi merene su pomoću automatizovanog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Merene su koncentracije ALT (alanin transaminaza), AST (aspartat transaminaza) i BUN.
[0261] Među četrdeset testiranih antisens oligonukleotida, određeni antisens oligonukleotidi, uključujući ISIS 481374, ISIS 481390, ISIS 481420, ISIS 481431, ISIS 481453, ISIS 481464, ISIS 481475, ISIS 481495, ISIS 481500, ISIS 481501, ISIS 481525, ISIS 481548, ISIS 481549, ISIS 481597, ISIS 481695, ISIS 481700, ISIS 481702, ISIS 481710, ISIS 481725, ISIS 481750 i ISIS 481763 ispunili su granice podnošljivosti za parametre telesne težine, težine organa, ALT, AST i BUN.
Primer 4: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama [0262] Gapmeri iz Primera 1 i 2 koji pokazuju značajnu vrednost in vitro inhibicije STAT3 su testirani u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 20,000 ćelija po komorici i transfektovane su korišćenjem elektroporacije sa 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM i 1,0000 nM koncentracije antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 4. Posle tretman perioda od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 6; reverzna sekvenca TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, ovde označena kao SEQ ID NO: 7; sonda sekvenca CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 8) je korišćen za merenja mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0263] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena u Tabeli 4 i izračunata je grafičkim prikazom koncentracija upotrebljenih oligonukleotida u odnosu na procenat inhibicije eksprimiranja STAT3 mRNK postignut pri svakoj koncentraciji i uočavanjem koncentracije oligonukleotida pri kojoj je postignuta 50% inhibicija eksprimiranja STAT3 mRNK u poređenju sa na kontrolu. Kao što je ilustrovano u Tabeli 4, nivoi mRNK STAT3 su značajno redukovani u zavisnosti od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 4
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 u HuVEC ćelijama koristeći elektroporaciju
ISIS br. 31,25 62,5 125,0 250,0 500,0 1000,0 IC50nM nM nM nM nM nM (µM)
481355 19 15 36 61 75 89 0,18
481374 25 42 52 72 82 88 0,10
481390 17 37 44 60 73 86 0,15
481420 23 20 40 60 81 92 0,16
481453 21 37 52 69 79 88 0,12
481464 57 73 81 90 94 94 <0,03
481475 22 46 54 78 83 92 0,10
481500 25 37 42 75 83 90 0,12
481501 32 57 69 82 94 94 0,05
481523 35 60 74 85 90 93 0,04
481525 36 53 60 79 89 92 0,06
481549 0 16 60 81 90 96 0,15
481554 0 15 28 49 70 86 0,25
481597 8 18 39 48 64 83 0,24
481695 15 27 39 50 64 80 0,22
481700 0 17 44 58 80 88 0,20
481710 12 39 65 79 86 90 0,11
481715 11 26 32 44 53 69 0,36
481725 27 40 56 77 89 93 0,09
481750 7 24 46 63 83 89 0,16
481755 17 28 30 54 68 80 0,20
481768 7 21 27 44 67 85 0,26
Primer 5: Dozno-zavisna antisens inhibicije STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u SK-BR-3 ćelijama
[0264] Gapmeri iz Primera 4 su testirani u različitim dozama u SK-BR-3 ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 1 uM.2,5 uM, i 10 uM koncentracija antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 5. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0265] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 5. Kao što je ilustrovano u Tabeli 5, većina ISIS oligonukleotida je bila u stanju da prodre kroz ćelijsku membranu, i nivoi mRNK STAT3 su značajno smanjeni u zavisnosti od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 5
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane SK-BR-3 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 1 µM 2,5 µM 10 µM IC50(µM)
481374 10 18 18 16 8 25 15,9
481390 0 10 11 12 40 72 3,2
481453 14 13 27 45 58 79 1,3
481464 23 32 57 70 85 93 0,5
481475 0 0 35 49 72 88 1,0
481500 7 9 26 45 49 75 1,7
481501 0 0 4 5 53 65 2,7
481523 9 24 56 67 83 92 0,5
481525 0 17 13 15 32 68 4,4
481549 0 0 0 16 33 54 8,2
481597 1 0 11 14 22 44 10,6
481710 5 0 10 13 27 66 6,0
481725 29 45 47 39 39 63 2,6
481750 19 24 36 42 71 80 1,1
481763 30 38 51 63 81 89 0,6
481768 12 5 34 25 32 35 12,4
Primer 6: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u U251-MG ćelijama
[0266] Gapmeri iz Primera 5 su dalje testirani u različitim dozama u U251-MG ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 1 uM. 2,5 uM, i 10 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 6. Nakon približno 24 sata, izolovana je RNK iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0267] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 6. Kao što je ilustrovano u Tabeli 6, većina ISIS oligonukleotida je bila u stanju da prodre kroz ćelijsku membranu, i nivoi mRNK STAT3 su značajno smanjeni na dozno-zavisni način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 6
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNA pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane U251-MG ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 1 µM 2,5 µM 10 µM IC50(µM)
481374 0 0 10 0 12 25 15,7
481390 0 4 10 8 16 31 13,9
481453 4 3 15 16 20 42 11,0
481464 13 11 41 42 54 79 1,3
481475 3 13 26 37 41 67 2,6
481500 2 12 14 12 25 38 11,7
481501 0 0 2 1 14 47 10,3
481523 22 27 39 45 63 83 1,1
481525 1 1 17 17 35 60 6,3
481549 0 0 0 0 9 29 14,5
481597 3 3 12 18 18 47 10,1
481695 0 14 12 22 25 33 12,9
481710 0 0 0 0 6 23 16,8
481725 0 0 5 7 20 38 11,8
481750 4 15 18 18 17 33 13,2
481763 15 16 25 36 36 64 3,2
481768 22 16 18 22 21 37 12,2
Primer 7: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u U251-MG ćelijama
[0268] ISIS 481464 i ISIS 481549, iz gore opisanih studija, su dalje testirani u različitim dozama u ćelijama U251-MG. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,1 uM, 1 uM, 5 uM, 10 uM i 20 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 7. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0269] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 7. Kao što je ilustrovano u Tabeli 7, oba ISIS oligonukleotida su bila u stanju da prodru u ćelijsku membranu.
Tabela 7
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNA pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane U251-MG ćelija
ISIS br. 0,1 µM 1 µM 5 µM 10 µM 20 µM IC50(µM)
481464 0 30 69 80 79 2,3
481549 0 0 26 35 38 >20
Primer 8: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u MDA-MB-231 ćelijama
[0270] ISIS 481464 i ISIS 481549 su dalje testirani u različitim dozama u MDA-MB-231 ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,2 uM, 1,0 uM, 5,0 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 8. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0271] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 8. Kao što je ilustrovano u Tabeli 8, oba ISIS oligonukleotida su bila u stanju da prodru kroz ćelijsku membranu i značajno smanje STAT3 mRNK nivoe na dozno-zavisni način.
Tabela 8
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNA pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane MDA-MB-231 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,2 µM 1,0 µM 5,0 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 0 25 71 85 87 0,6
481549 0 2 33 49 66 4,4
Primer 9: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u A431 ćelijama
[0272] ISIS 481464 i ISIS 481549 su dalje testirani u različitim dozama u ćelijama A431. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,2 uM, 1,0 uM, 5,0 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 9. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0273] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 9. Kao što je ilustrovano u Tabeli 9, oba ISIS oligonukleotida su bila u stanju da prodru kroz ćelijsku membranu i značajno smanje STAT3 mRNK nivoe na dozno-zavisni način.
Tabela 9
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNA pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane A431 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,2 µM 1,0 µM 5,0 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 79 93 98 98 98 <0,02
481549 0 38 68 82 84 0,6
Primer 10: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u H460 ćelijama
[0274] ISIS 481464 i ISIS 481549 su dalje testirani u različitim dozama u H460 ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,2 uM, 1,0 uM, 5,0 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 10. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0275] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 10. Kao što je ilustrovano u Tabeli 10, oba ISIS oligonukleotida su bila u stanju da prodru kroz ćelijsku membranu i značajno smanje nivo STAT3 mRNK na dozno-zavisni način.
Tabela 10
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNA pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane H460 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,2 µM 1,0 µM 5,0 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 46 89 96 97 98 0,01
481549 8 53 78 96 98 0,23
Primer 11: Antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama
[0276] antisens oligonukleotidi su dizajnirani da ciljaju ljudsku STAT3 nukleinsku kiselinu i testirani su za svoj efekat na eksprimiranje ljudske STAT3 mRNK in vitro. Kultivisane HuVEC ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po komorici su transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 1,000 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 6; reverzna sekvenca TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, ovde označena kao SEQ ID NO: 7; sekvenca sonde CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 8) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0277] Himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli 11 su dizajnirani kao 3-10-3 MOE, dezoksi, i cEt gapmeri. Gapmeri su dužine 16 nukleotida, gde centralni segment jaza sadrži deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima koja sadrže po tri nukleozida. Svaki nukleozid u 5'-segmentu krila ima 2'-MOE modifikaciju šećera. Svaki nukleozid u 3'-segmentu krila ima cEt modifikaciju šećera. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. Kolona za hemiju u Tabeli 11 predstavlja šećerni motiv svakog gapmera, gde 'e' označava 2'-MOE nukleozid, 'k' označava ograničeni etil (cEt) nukleozid, i 'd' označava 2'-dezoksinukleozid.
[0278] „Početno mesto ljudskog cilja“ označava naj-5' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. „Zaustavno mesto ljudskog cilja“ označava naj-3' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. Svaki gapmer koji je naveden u Tabeli 11 je ciljan na ljudsku STAT3 mRNK, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_139276,2).
Tabela 11
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ ID
NO: 1
Ljudsko Ljudsko ISIS Sekvenca Hemija % SEQ početno zaustavno BR. inhibicije ID mesto mesto NO 1 16 528170 CGCAGCTCCGGAAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 12 471 2 17 528171 CCGCAGCTCCGGAAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 11 472 4 19 528172 CGCCGCAGCTCCGGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 10 473 5 20 528173 CCGCCGCAGCTCCGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 474 32 47 528174 ACCCCCGGCTCCCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 475 34 49 528175 GAACCCCCGGCTCCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 17 476 35 50 528176 GGAACCCCCGGCTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 23 477 36 51 528177 CGGAACCCCCGGCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 15 478 38 53 528178 GTCGGAACCCCCGGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 479 39 54 528179 CGTCGGAACCCCCGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 480 57 72 528180 TTGTTCCCTCGGCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 481 58 73 528181 CTTGTTCCCTCGGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 28 482 60 75 528182 GGCTTGTTCCCTCGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 483 61 76 528183 GGGCTTGTTCCCTCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 34 484 75 90 528184 CCAGGATCCGGTTGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 34 485 76 91 528185 TCCAGGATCCGGTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 9 77 92 528186 GTCCAGGATCCGGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 28 486 78 93 528187 TGTCCAGGATCCGGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 487 79 94 528188 CTGTCCAGGATCCGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 33 488 81 96 528189 GCCTGTCCAGGATCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 63 489 83 98 528190 GTGCCTGTCCAGGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 490 189 204 528191 AGAGGCCGAGAGGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 2 491 210 225 528192 GGTCCCAACTGTTTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 11 492 232 247 528193 GGGCCATCCTGCTAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 493 233 248 528194 TGGGCCATCCTGCTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 16 494 234 249 528195 TTGGGCCATCCTGCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 9 495 236 251 528196 CATTGGGCCATCCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 496 237 252 528197 CCATTGGGCCATCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 38 497 239 254 528198 TTCCATTGGGCCATCC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 498 240 255 528199 ATTCCATTGGGCCATC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 15 244 259 528200 GCTGATTCCATTGGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 500 245 260 528201 AGCTGATTCCATTGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 20 501 246 261 528202 TAGCTGATTCCATTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 41 502 247 262 528203 GTAGCTGATTCCATTG e-e-e-d(10)-k-k-k 37 503 250 265 528204 GCTGTAGCTGATTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 83 504 251 266 528205 TGCTGTAGCTGATTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 72 505 252 267 528206 CTGCTGTAGCTGATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 506 253 268 528207 GCTGCTGTAGCTGATT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 507 263 278 528208 CGTGTGTCAAGCTGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 73 508 264 279 528209 CCGTGTGTCAAGCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 81 17 265 280 528210 ACCGTGTGTCAAGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 78 509 266 281 528211 TACCGTGTGTCAAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 72 510 267 282 528212 GTACCGTGTGTCAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 81 511 268 283 528213 GGTACCGTGTGTCAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 512 270 285 528214 CAGGTACCGTGTGTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 80 513 271 286 528215 CCAGGTACCGTGTGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 69 514 272 287 528216 TCCAGGTACCGTGTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 515 273 288 528217 CTCCAGGTACCGTGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 44 516 274 289 528218 GCTCCAGGTACCGTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 32 517 275 290 528219 TGCTCCAGGTACCGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 50 518 291 306 528220 GTAGAGCTGATGGAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 12 519 292 307 528221 TGTAGAGCTGATGGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 520 295 310 528222 CACTGTAGAGCTGATG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 521 297 312 528223 GTCACTGTAGAGCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 44 522 302 317 528224 AAGCTGTCACTGTAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 523 303 318 528225 GAAGCTGTCACTGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 524 307 322 528226 TTGGGAAGCTGTCACT e-e-e-d(10)-k-k-k 35 525 308 323 528227 ATTGGGAAGCTGTCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 29 526 310 325 528228 CCATTGGGAAGCTGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 33 527 322 337 519639 ACTGCCGCAGCTCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 37 19 329 344 528229 GCCAGAAACTGCCGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 528 330 345 528230 GGCCAGAAACTGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 1 529 331 346 528231 GGGCCAGAAACTGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 1 530 345 360 528232 ACTCTCAATCCAAGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 14 531 346 361 528233 GACTCTCAATCCAAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 10 21 347 362 528234 TGACTCTCAATCCAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 6 532 351 366 528235 ATCTTGACTCTCAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 533 353 368 528236 CAATCTTGACTCTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 29 534 354 369 528237 CCAATCTTGACTCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 60 535 355 370 528238 CCCAATCTTGACTCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 536 356 371 528239 GCCCAATCTTGACTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 48 537 357 372 528240 TGCCCAATCTTGACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 538 358 373 528241 ATGCCCAATCTTGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 539 359 374 528242 TATGCCCAATCTTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 540 362 377 528243 GCATATGCCCAATCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 16 541 363 378 528244 CGCATATGCCCAATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 50 542 367 382 528245 TGGCCGCATATGCCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 67 543 368 383 528246 CTGGCCGCATATGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 544 369 384 528247 GCTGGCCGCATATGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 54 545 370 385 528248 TGCTGGCCGCATATGC e-e-e-d(10)-k-k-k 35 546 371 386 528249 TTGCTGGCCGCATATG e-e-e-d(10)-k-k-k 22 547 372 387 528250 TTTGCTGGCCGCATAT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 548 373 388 528251 CTTTGCTGGCCGCATA e-e-e-d(10)-k-k-k 27 549 374 389 528252 TCTTTGCTGGCCGCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 550 375 390 528253 TTCTTTGCTGGCCGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 59 23 376 391 528254 ATTCTTTGCTGGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 63 551 378 393 528255 TGATTCTTTGCTGGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 30 552 379 394 528256 GTGATTCTTTGCTGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 553 383 398 528257 GCATGTGATTCTTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 554 384 399 528258 GGCATGTGATTCTTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 47 555 388 403 528259 AAGTGGCATGTGATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 556 391 406 528260 CCAAAGTGGCATGTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 46 557 393 408 528261 CACCAAAGTGGCATGT e-e-e-d(10)-k-k-k 32 558 395 410 528262 AACACCAAAGTGGCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 559 397 412 528263 GAAACACCAAAGTGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 69 560 427 442 528264 ACTGCTGGTCAATCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 561 428 443 528265 TACTGCTGGTCAATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 32 562 430 445 528266 TATACTGCTGGTCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 563 431 446 528267 CTATACTGCTGGTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 38 564 432 447 528268 GCTATACTGCTGGTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 58 565 433 448 528269 GGCTATACTGCTGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 69 566 434 449 528270 CGGCTATACTGCTGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 73 567 435 450 528271 GCGGCTATACTGCTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 71 568 436 451 528272 AGCGGCTATACTGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 54 569 437 452 528273 AAGCGGCTATACTGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 36 570 439 454 528274 GGAAGCGGCTATACTG e-e-e-d(10)-k-k-k 27 571 440 455 528275 AGGAAGCGGCTATACT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 572 441 456 528276 CAGGAAGCGGCTATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 12 573 442 457 528277 GCAGGAAGCGGCTATA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 574 443 458 528278 TGCAGGAAGCGGCTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 575 444 459 528279 TTGCAGGAAGCGGCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 576 445 460 528280 CTTGCAGGAAGCGGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 44 577 463 478 528281 GATAGAGAACATTCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 25 578 464 479 528282 TGATAGAGAACATTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 39 579 469 484 528283 TGTGCTGATAGAGAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 41 580 471 486 528284 ATTGTGCTGATAGAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 38 581 472 487 528285 GATTGTGCTGATAGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 50 582 473 488 528286 AGATTGTGCTGATAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 49 583 475 490 528287 GTAGATTGTGCTGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 584 476 491 528288 CGTAGATTGTGCTGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 8 585 490 505 528289 ACTGCTTGATTCTTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 33 511 526 528290 CAAGATACCTGCTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 48 35 512 527 528291 TCAAGATACCTGCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 586 513 528 528292 CTCAAGATACCTGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 587 514 529 528293 TCTCAAGATACCTGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 31 588 517 532 528294 GCTTCTCAAGATACCT e-e-e-d(10)-k-k-k 42 589 519 534 528295 TGGCTTCTCAAGATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 590 522 537 528296 CATTGGCTTCTCAAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 11 591 523 538 528297 CCATTGGCTTCTCAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 23 592 530 545 528298 GCAATCTCCATTGGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 46 593 531 546 528299 GGCAATCTCCATTGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 594 532 547 528300 GGGCAATCTCCATTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 595 533 548 528301 CGGGCAATCTCCATTG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 596 534 549 528302 CCGGGCAATCTCCATT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 597 535 550 528303 TCCGGGCAATCTCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 29 598 536 551 528304 ATCCGGGCAATCTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 32 599 537 552 528305 AATCCGGGCAATCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 600 538 553 528306 CAATCCGGGCAATCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 24 601 539 554 528307 ACAATCCGGGCAATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 602 540 555 528308 CACAATCCGGGCAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 14 603 541 556 528309 CCACAATCCGGGCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 13 604 543 558 528310 GGCCACAATCCGGGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 27 605 546 561 528311 CCGGGCCACAATCCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 27 606 547 562 528312 ACCGGGCCACAATCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 58 607 548 563 528313 CACCGGGCCACAATCC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 608 549 564 528314 GCACCGGGCCACAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 609 550 565 528315 GGCACCGGGCCACAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 33 610 551 566 528316 AGGCACCGGGCCACAA e-e-e-d(10)-k-k-k 42 611 558 573 528317 TTCCCACAGGCACCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 47 612 586 601 528318 TGGCTGCAGTCTGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 12 613 592 607 528319 CCGCAGTGGCTGCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 10 614 599 614 528320 TGCTGGGCCGCAGTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 14 615 601 616 528321 CTTGCTGGGCCGCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 616 603 618 528322 CCCTTGCTGGGCCGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 6 617 604 619 528323 CCCCTTGCTGGGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 618 605 620 528324 CCCCCTTGCTGGGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 8 619 608 623 528325 TGGCCCCCTTGCTGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 620 615 630 528326 GTTGGCCTGGCCCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 31 621 616 631 528327 GGTTGGCCTGGCCCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 622 617 632 528328 TGGTTGGCCTGGCCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 623 646 661 528329 GCTTCTCCGTCACCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 624 647 662 528330 TGCTTCTCCGTCACCA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 625 649 664 528331 GCTGCTTCTCCGTCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 35 626 667 682 528332 GGTGCTGCTCCAGCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 627 678 693 528333 GACATCCTGAAGGTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 628 682 697 528334 TCCGGACATCCTGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 1 629 683 698 528335 TTCCGGACATCCTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 630 684 699 528336 CTTCCGGACATCCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 631 685 700 528337 TCTTCCGGACATCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 632 686 701 528338 CTCTTCCGGACATCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 633 687 702 528339 TCTCTTCCGGACATCC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 634 688 703 528340 CTCTCTTCCGGACATC e-e-e-d(10)-k-k-k 17 635 689 704 528341 ACTCTCTTCCGGACAT e-e-e-d(10)-k-k-k 37 636 727 742 528342 GATTCTCTACCACTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 33 637 730 745 528343 GGAGATTCTCTACCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 53 731 746 528344 TGGAGATTCTCTACCA e-e-e-d(10)-k-k-k 32 638 732 747 528345 CTGGAGATTCTCTACC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 639 733 748 528346 CCTGGAGATTCTCTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 12 640 738 753 528347 GTCATCCTGGAGATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 54 641 764 779 528348 TTGAGGGTTTTATAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 642 775 790 528349 CTCCTTGACTCTTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 643 781 796 528350 GCATGTCTCCTTGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 29 644 782 797 528351 TGCATGTCTCCTTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 30 645 783 798 528352 TTGCATGTCTCCTTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 17 646 787 802 528353 GATCTTGCATGTCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 61 647 788 803 518346 AGATCTTGCATGTCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 57 790 805 528354 TCAGATCTTGCATGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 648 792 807 528355 ATTCAGATCTTGCATG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 649 794 809 528356 CCATTCAGATCTTGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 37 650 795 810 528357 TCCATTCAGATCTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 55 651 796 811 528358 TTCCATTCAGATCTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 17 652 803 818 528359 TGGTTGTTTCCATTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 33 653 804 819 528360 CTGGTTGTTTCCATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 654 806 821 528361 GACTGGTTGTTTCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 23 655 807 822 528362 TGACTGGTTGTTTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 33 656 813 828 528363 GGTCACTGACTGGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 43 657 814 829 528364 TGGTCACTGACTGGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 62 658 848 863 528365 GTGAGCATCTGTTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 659 852 867 528366 CGCAGTGAGCATCTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 660 853 868 528367 GCGCAGTGAGCATCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 661 854 869 528368 AGCGCAGTGAGCATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 7 662 855 870 528369 CAGCGCAGTGAGCATC e-e-e-d(10)-k-k-k 6 663 857 872 528370 TCCAGCGCAGTGAGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 664 858 873 528371 GTCCAGCGCAGTGAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 11 665 859 874 528372 GGTCCAGCGCAGTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 8 666 860 875 528373 TGGTCCAGCGCAGTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 667 862 877 528374 TCTGGTCCAGCGCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 668 863 878 528375 ATCTGGTCCAGCGCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 8 669 864 879 528376 CATCTGGTCCAGCGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 670 865 880 528377 GCATCTGGTCCAGCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 671 867 882 528378 CCGCATCTGGTCCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 72 672 868 883 528379 TCCGCATCTGGTCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 43 61 869 884 528380 CTCCGCATCTGGTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 34 673 870 885 528381 TCTCCGCATCTGGTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 674 871 886 528382 TTCTCCGCATCTGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 675 872 887 528383 CTTCTCCGCATCTGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 23 676 873 888 528384 GCTTCTCCGCATCTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 677 875 890 528385 ATGCTTCTCCGCATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 678 876 891 528386 GATGCTTCTCCGCATC e-e-e-d(10)-k-k-k 14 679 877 892 528387 CGATGCTTCTCCGCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 680 878 893 528388 ACGATGCTTCTCCGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 681 879 894 528389 CACGATGCTTCTCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 46 682 880 895 528390 TCACGATGCTTCTCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 17 683 881 896 528391 CTCACGATGCTTCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 684 882 897 528392 ACTCACGATGCTTCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 16 685 883 898 528393 CACTCACGATGCTTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 39 686 885 900 528394 CTCACTCACGATGCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 687 886 901 528395 GCTCACTCACGATGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 37 688 888 903 528396 CAGCTCACTCACGATG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 689 889 904 528397 CCAGCTCACTCACGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 690 890 905 528398 GCCAGCTCACTCACGA e-e-e-d(10)-k-k-k 18 691 891 906 528399 CGCCAGCTCACTCACG e-e-e-d(10)-k-k-k 4 692 1068 1083 528477 AATTTGTTGACGGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 693 1069 1084 528478 TAATTTGTTGACGGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 35 694 1070 1085 528479 TTAATTTGTTGACGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 40 695 1072 1087 528480 TCTTAATTTGTTGACG e-e-e-d(10)-k-k-k 6 696 1087 1102 528481 GCAACTCCTCCAGTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 42 697 1088 1103 528482 TGCAACTCCTCCAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 28 698 1094 1109 528483 TTTTGCTGCAACTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 699 1095 1110 528484 TTTTTGCTGCAACTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 700 1114 1129 528485 GGTCCCCTTTGTAGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 35 701 1115 1130 528486 GGGTCCCCTTTGTAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 31 702 1129 1144 528487 GGTGCTGTACAATGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 61 703 1130 1145 528488 CGGTGCTGTACAATGG e-e-e-d(10)-k-k-k 61 704 1131 1146 528489 CCGGTGCTGTACAATG e-e-e-d(10)-k-k-k 37 705 1132 1147 528490 GCCGGTGCTGTACAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 33 706 1133 1148 528491 GGCCGGTGCTGTACAA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 707 1134 1149 528492 CGGCCGGTGCTGTACA e-e-e-d(10)-k-k-k 38 708 1136 1151 528493 ATCGGCCGGTGCTGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 29 709 1137 1152 528494 CATCGGCCGGTGCTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 43 710 1138 1153 528495 GCATCGGCCGGTGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 41 711 1139 1154 528496 AGCATCGGCCGGTGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 712 1140 1155 528497 CAGCATCGGCCGGTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 15 713 1141 1156 528498 CCAGCATCGGCCGGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 39 714 1142 1157 528499 TCCAGCATCGGCCGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 50 715 1144 1159 528500 CCTCCAGCATCGGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 58 716 1146 1161 528501 CTCCTCCAGCATCGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 67 717 1147 1162 528502 TCTCCTCCAGCATCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 76 718 1153 1168 528503 CGATTCTCTCCTCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 68 719 1154 1169 528504 ACGATTCTCTCCTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 69 720 1155 1170 528505 CACGATTCTCTCCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 68 721 1156 1171 528506 CCACGATTCTCTCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 45 722 1157 1172 528507 TCCACGATTCTCTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 42 723 1158 1173 528508 CTCCACGATTCTCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 41 724 1159 1174 528509 GCTCCACGATTCTCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 725 1160 1175 528510 AGCTCCACGATTCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 7 726 1161 1176 528511 CAGCTCCACGATTCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 5 727 1162 1177 528512 ACAGCTCCACGATTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 728 1163 1178 528513 AACAGCTCCACGATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 729 1184 1199 528514 GCACTTTTCATTAAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 14 730 1185 1200 528515 GGCACTTTTCATTAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 731 1199 1214 528516 CGCTCCACCACAAAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 732 1205 1220 528517 GGCTGCCGCTCCACCA e-e-e-d(10)-k-k-k 55 733 1206 1221 528518 GGGCTGCCGCTCCACC e-e-e-d(10)-k-k-k 80 734 1207 1222 528519 AGGGCTGCCGCTCCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 61 735 1208 1223 528520 CAGGGCTGCCGCTCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 63 736 1211 1226 528521 ATGCAGGGCTGCCGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 37 737 1212 1227 528522 CATGCAGGGCTGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 738 1221 1236 528523 ATGCATGGGCATGCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 26 739 1222 1237 528524 GATGCATGGGCATGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 42 740 1223 1238 528525 GGATGCATGGGCATGC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 741 1252 1267 528526 CGCCGGTCTTGATGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 11 742 1253 1268 528527 ACGCCGGTCTTGATGA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 743 1265 1280 528528 GTAGTGAACTGGACGC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 744 1284 1299 528529 GACCAGCAACCTGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 22 745 1285 1300 528530 TGACCAGCAACCTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 31 746 1288 1303 528531 ATTTGACCAGCAACCT e-e-e-d(10)-k-k-k 48 747 1289 1304 528532 AATTTGACCAGCAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 748 1290 1305 528533 GAATTTGACCAGCAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 11 749 1293 1308 528534 AGGGAATTTGACCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 67 750 1294 1309 528535 CAGGGAATTTGACCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 50 751 1295 1310 528536 TCAGGGAATTTGACCA e-e-e-d(10)-k-k-k 38 752 1296 1311 528537 CTCAGGGAATTTGACC e-e-e-d(10)-k-k-k 17 753 1336 1351 528539 CTTTGTCAATGCACAC e-e-e-d(10)-k-k-k 67 754 1338 1353 528540 GTCTTTGTCAATGCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 61 755 1339 1354 528541 AGTCTTTGTCAATGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 65 756 1343 1358 528542 CCAGAGTCTTTGTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 10 757 1345 1360 528543 CCCCAGAGTCTTTGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 7 758 1371 1386 528544 CCGGGATCCTCTGAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 759 1372 1387 528545 TCCGGGATCCTCTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 11 760 1373 1388 528546 TTCCGGGATCCTCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 7 761 1374 1389 528547 TTTCCGGGATCCTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 14 762 1375 1390 528548 ATTTCCGGGATCCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 14 763 1376 1391 528549 AATTTCCGGGATCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 764 1377 1392 528550 AAATTTCCGGGATCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 14 765 1379 1394 528551 TTAAATTTCCGGGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 1 766 1380 1395 528552 GTTAAATTTCCGGGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 767 1381 1396 528553 TGTTAAATTTCCGGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 768 1382 1397 528554 ATGTTAAATTTCCGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 12 769 1384 1399 528555 GAATGTTAAATTTCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 13 770 1392 1407 528556 TGTGCCCAGAATGTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 18 771 1435 1450 528557 GGCTGCCGTTGTTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 48 772 1436 1451 528558 AGGCTGCCGTTGTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 38 773 1437 1452 528559 GAGGCTGCCGTTGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 98 1438 1453 528560 AGAGGCTGCCGTTGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 774 1439 1454 528561 GAGAGGCTGCCGTTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 10 775 1440 1455 528562 AGAGAGGCTGCCGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 17 776 1441 1456 528563 CAGAGAGGCTGCCGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 777 1461 1476 528564 GGTCAAGTGTTTGAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 7 778 1471 1486 528565 GCTCCCTCAGGGTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 48 779 1496 1511 528566 GCTCGGCCCCCATTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 780 1497 1512 528567 GGCTCGGCCCCCATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 45 781 1498 1513 528568 TGGCTCGGCCCCCATT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 782 1499 1514 528569 TTGGCTCGGCCCCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 783 1517 1532 528570 ATCAGGGAAGCATCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 104 1519 1534 528571 CAATCAGGGAAGCATC e-e-e-d(10)-k-k-k 13 784 1523 1538 528572 GTCACAATCAGGGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 30 785 1525 1540 528573 CAGTCACAATCAGGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 27 786 1526 1541 528574 TCAGTCACAATCAGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 51 787 1529 1544 528575 TCCTCAGTCACAATCA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 788 1537 1552 528576 GGTGCAGCTCCTCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 28 789 1543 1558 528577 TGATCAGGTGCAGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 30 790 1544 1559 528578 GTGATCAGGTGCAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 36 791 1545 1560 528579 GGTGATCAGGTGCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 792 1576 1591 528580 TGAGGCCTTGGTGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 10 793 1578 1593 528581 CTTGAGGCCTTGGTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 5 794 1579 1594 528582 TCTTGAGGCCTTGGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 110 1580 1595 528583 ATCTTGAGGCCTTGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 5 795 1581 1596 528584 AATCTTGAGGCCTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 796 1582 1597 528585 CAATCTTGAGGCCTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 7 797 1583 1598 528586 TCAATCTTGAGGCCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 798 1584 1599 528587 GTCAATCTTGAGGCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 799 1585 1600 528588 GGTCAATCTTGAGGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 26 800 1586 1601 528589 AGGTCAATCTTGAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 31 801 1587 1602 528590 TAGGTCAATCTTGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 27 802 1588 1603 528591 CTAGGTCAATCTTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 803 1590 1605 528592 CTCTAGGTCAATCTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 33 804 1592 1607 528593 GTCTCTAGGTCAATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 805 1594 1609 528594 GGGTCTCTAGGTCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 806 1595 1610 528595 TGGGTCTCTAGGTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 807 1596 1611 528596 GTGGGTCTCTAGGTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 34 808 1597 1612 528597 AGTGGGTCTCTAGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 809 1599 1614 528598 GGAGTGGGTCTCTAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 31 114 1600 1615 528599 AGGAGTGGGTCTCTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 10 810 1601 1616 528600 AAGGAGTGGGTCTCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 811 1602 1617 528601 CAAGGAGTGGGTCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 11 812 1609 1624 528602 CAACTGGCAAGGAGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 17 813 1629 1644 528603 ACAGATGTTGGAGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 814 1632 1647 528604 CTGACAGATGTTGGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 11 815 1633 1648 528605 TCTGACAGATGTTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 25 119 1650 1665 528606 CGCCCAGGCATTTGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 816 1651 1666 528607 ACGCCCAGGCATTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 817 1677 1692 528608 GGTCAGCATGTTGTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 11 818 1678 1693 528609 TGGTCAGCATGTTGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 9 819 1680 1695 528610 GTTGGTCAGCATGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 19 820 1682 1697 528611 TTGTTGGTCAGCATGT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 821 1711 1726 528612 GCTTGGTAAAAAAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 822 1712 1727 528613 GGCTTGGTAAAAAAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 823 1713 1728 528614 GGGCTTGGTAAAAAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 824 1736 1751 528615 ACTTGATCCCAGGTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 26 825 1741 1756 528616 CGGCCACTTGATCCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 826 1742 1757 528617 TCGGCCACTTGATCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 827 1743 1758 528618 CTCGGCCACTTGATCC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 828 1744 1759 528619 CCTCGGCCACTTGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 829 1745 1760 528620 ACCTCGGCCACTTGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 16 830 1746 1761 528621 GACCTCGGCCACTTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 831 1747 1762 528622 GGACCTCGGCCACTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 59 832 1748 1763 528623 AGGACCTCGGCCACTT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 833 1749 1764 528624 CAGGACCTCGGCCACT e-e-e-d(10)-k-k-k 32 834 1753 1768 528625 AGCTCAGGACCTCGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 835 1754 1769 528626 CAGCTCAGGACCTCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 58 836 1755 1770 528627 CCAGCTCAGGACCTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 56 837 1778 1793 528628 CGCTTGGTGGTGGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 838 1779 1794 528629 TCGCTTGGTGGTGGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 839 1780 1795 528630 CTCGCTTGGTGGTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 127 1781 1796 528631 CCTCGCTTGGTGGTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 26 840 1782 1797 528632 TCCTCGCTTGGTGGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 841 1783 1798 528633 GTCCTCGCTTGGTGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 40 842 1784 1799 528634 AGTCCTCGCTTGGTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 38 843 1785 1800 528635 CAGTCCTCGCTTGGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 20 844 1786 1801 528636 TCAGTCCTCGCTTGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 23 845 1787 1802 528637 CTCAGTCCTCGCTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 33 846 1788 1803 528638 GCTCAGTCCTCGCTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 847 1789 1804 528639 TGCTCAGTCCTCGCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 848 1791 1806 528640 GATGCTCAGTCCTCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 849 1792 1807 528641 CGATGCTCAGTCCTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 850 1793 1808 528642 TCGATGCTCAGTCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 851 1794 1809 528643 CTCGATGCTCAGTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 32 852 1795 1810 528644 GCTCGATGCTCAGTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 129 1796 1811 528645 TGCTCGATGCTCAGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 853 1797 1812 528646 CTGCTCGATGCTCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 38 854 1799 1814 528647 AGCTGCTCGATGCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 855 1800 1815 528648 CAGCTGCTCGATGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 856 1802 1817 528649 GTCAGCTGCTCGATGC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 857 1803 1818 528650 AGTCAGCTGCTCGATG e-e-e-d(10)-k-k-k 10 858 1804 1819 528651 TAGTCAGCTGCTCGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 4 859 1805 1820 528652 GTAGTCAGCTGCTCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 17 860 1806 1821 528653 TGTAGTCAGCTGCTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 28 861 1807 1822 528654 GTGTAGTCAGCTGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 31 862 1808 1823 528655 AGTGTAGTCAGCTGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 863 1809 1824 528656 CAGTGTAGTCAGCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 30 864 1810 1825 528657 CCAGTGTAGTCAGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 23 865 1811 1826 528658 GCCAGTGTAGTCAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 866 1832 1847 528659 CCAGGTCCCAAGAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 12 867 1852 1867 528660 GACACCCTGAATAATT e-e-e-d(10)-k-k-k 10 868 1853 1868 528661 TGACACCCTGAATAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 10 869 1856 1871 528662 ATCTGACACCCTGAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 12 870 1857 1872 528663 GATCTGACACCCTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 871 1859 1874 528664 GTGATCTGACACCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 61 872 1861 1876 528665 ATGTGATCTGACACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 873 1865 1880 528666 GCCCATGTGATCTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 46 874 1866 1881 528667 AGCCCATGTGATCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 36 137 1867 1882 528668 TAGCCCATGTGATCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 44 875 1869 1884 528669 TTTAGCCCATGTGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 12 876 1907 1922 528670 AAGGAGAAGCCCTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 35 877 1925 1940 528671 TTGTCCAGCCAGACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 878 1926 1941 528672 ATTGTCCAGCCAGACC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 879 1927 1942 528673 TATTGTCCAGCCAGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 23 880 1928 1943 528674 ATATTGTCCAGCCAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 24 881 1929 1944 528675 GATATTGTCCAGCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 52 882 1931 1946 528676 ATGATATTGTCCAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 41 883 1933 1948 528677 CAATGATATTGTCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 23 884 1935 1950 528678 GTCAATGATATTGTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 885 1936 1951 528679 GGTCAATGATATTGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 26 886 1941 1956 528680 CACAAGGTCAATGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 5 887 1942 1957 528681 TCACAAGGTCAATGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 888 1948 1963 518340 ACTTTTTCACAAGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 52 153 1950 1965 528682 GTACTTTTTCACAAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 889 1954 1969 528683 GGATGTACTTTTTCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 890 1958 1973 528684 GCCAGGATGTACTTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 891 1962 1977 528685 AAGGGCCAGGATGTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 892 1963 1978 528686 AAAGGGCCAGGATGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 893 2004 2019 528687 CCGCTCCTTACTGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 21 894 2010 2025 528688 CCGCTCCCGCTCCTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 32 895 2014 2029 528689 TGGCCCGCTCCCGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 52 896 2015 2030 528690 ATGGCCCGCTCCCGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 897 2017 2032 528691 AGATGGCCCGCTCCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 51 898 2018 2033 528692 AAGATGGCCCGCTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 45 899 2019 2034 528693 CAAGATGGCCCGCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 46 900 2020 2035 528694 TCAAGATGGCCCGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 901 2022 2037 528695 GCTCAAGATGGCCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 54 902 2023 2038 528696 TGCTCAAGATGGCCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 903 2024 2039 528697 GTGCTCAAGATGGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 60 904 2041 2056 528698 AGGTGCCTGGAGGCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 17 905 2093 2108 528699 CAAGTGAAAGTGACGC e-e-e-d(10)-k-k-k 2 161 2094 2109 528700 CCAAGTGAAAGTGACG e-e-e-d(10)-k-k-k 13 906 2095 2110 528701 CCCAAGTGAAAGTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 14 907 2128 2143 528702 GGATCTGGGTCTTACC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 908 2129 2144 528703 TGGATCTGGGTCTTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 909 2131 2146 528704 ACTGGATCTGGGTCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 165 2133 2148 528705 GGACTGGATCTGGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 910 2138 2153 528706 TCCACGGACTGGATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 13 911 2139 2154 528707 TTCCACGGACTGGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 912 2140 2155 528708 GTTCCACGGACTGGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 2 913 2141 2156 528709 GGTTCCACGGACTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 42 914 2142 2157 528710 TGGTTCCACGGACTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 63 915 2143 2158 528711 ATGGTTCCACGGACTG e-e-e-d(10)-k-k-k 62 916 2144 2159 528712 TATGGTTCCACGGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 35 917 2146 2161 528713 TGTATGGTTCCACGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 918 2147 2162 528714 GTGTATGGTTCCACGG e-e-e-d(10)-k-k-k 48 919 2193 2208 528715 GCCCATGATGATTTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 36 920 2194 2209 528716 AGCCCATGATGATTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 921 2195 2210 528717 TAGCCCATGATGATTT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 922 2196 2211 528718 ATAGCCCATGATGATT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 923 2197 2212 528719 TATAGCCCATGATGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 14 924 2198 2213 528720 TTATAGCCCATGATGA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 925 2199 2214 528721 CTTATAGCCCATGATG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 926 2200 2215 528722 TCTTATAGCCCATGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 927 2201 2216 528723 ATCTTATAGCCCATGA e-e-e-d(10)-k-k-k 17 928 2202 2217 528724 GATCTTATAGCCCATG e-e-e-d(10)-k-k-k 35 929 2203 2218 528725 TGATCTTATAGCCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 930 2204 2219 528726 ATGATCTTATAGCCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 67 931 2205 2220 528727 CATGATCTTATAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 45 932 2206 2221 528728 CCATGATCTTATAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 175 2207 2222 528729 TCCATGATCTTATAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 933 2208 2223 528730 ATCCATGATCTTATAG e-e-e-d(10)-k-k-k 12 934 2213 2228 528731 GTAGCATCCATGATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 14 935 2214 2229 528732 GGTAGCATCCATGATC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 936 2217 2232 528733 ATTGGTAGCATCCATG e-e-e-d(10)-k-k-k 22 937 2218 2233 528734 TATTGGTAGCATCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 938 2219 2234 528735 ATATTGGTAGCATCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 939 2264 2279 528736 TCCTTGGGAATGTCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 30 940 2266 2281 528737 CCTCCTTGGGAATGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 30 181 2275 2290 528738 CGAATGCCTCCTCCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 29 186 2277 2292 528739 TCCGAATGCCTCCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 33 941 2278 2293 528740 TTCCGAATGCCTCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 942 2279 2294 528741 TTTCCGAATGCCTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 20 943 2280 2295 528742 CTTTCCGAATGCCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 944 2281 2296 528743 ACTTTCCGAATGCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 945 2283 2298 528744 ATACTTTCCGAATGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 946 2285 2300 528745 CAATACTTTCCGAATG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 947 2286 2301 528746 ACAATACTTTCCGAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 948 2288 2303 528747 CGACAATACTTTCCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 11 949 2289 2304 528748 CCGACAATACTTTCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 31 950 2290 2305 528749 GCCGACAATACTTTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 951 2291 2306 528750 GGCCGACAATACTTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 16 952 2293 2308 528751 CTGGCCGACAATACTT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 953 2294 2309 528752 TCTGGCCGACAATACT e-e-e-d(10)-k-k-k 8 954 2295 2310 528753 CTCTGGCCGACAATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 955 2296 2311 528754 TCTCTGGCCGACAATA e-e-e-d(10)-k-k-k 6 188 2297 2312 528755 CTCTCTGGCCGACAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 956 2298 2313 528756 GCTCTCTGGCCGACAA e-e-e-d(10)-k-k-k 35 957 2299 2314 528757 GGCTCTCTGGCCGACA e-e-e-d(10)-k-k-k 57 958 2300 2315 528758 TGGCTCTCTGGCCGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 64 959 2301 2316 528759 CTGGCTCTCTGGCCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 960 2326 2341 528760 TACCTGGGTCAGCTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 961 2328 2343 528761 GCTACCTGGGTCAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 962 2329 2344 528762 CGCTACCTGGGTCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 963 2330 2345 528763 GCGCTACCTGGGTCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 26 964 2349 2364 528764 GGTCTTCAGGTATGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 38 965 2350 2365 528765 TGGTCTTCAGGTATGG e-e-e-d(10)-k-k-k 12 966 2352 2367 528766 CTTGGTCTTCAGGTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 967 2353 2368 528767 ACTTGGTCTTCAGGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 10 190 2358 2373 528768 GATAAACTTGGTCTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 9 968 2360 2375 528769 CAGATAAACTTGGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 969 2361 2376 528770 ACAGATAAACTTGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 7 970 2369 2384 528771 GGTGTCACACAGATAA e-e-e-d(10)-k-k-k 35 971 2373 2388 528772 CGTTGGTGTCACACAG e-e-e-d(10)-k-k-k 52 972 2387 2402 528773 GTATTGCTGCAGGTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 49 194 2388 2403 528774 GGTATTGCTGCAGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 48 973 2389 2404 528775 TGGTATTGCTGCAGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 35 974 2390 2405 528776 ATGGTATTGCTGCAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 20 975 2392 2407 528777 CAATGGTATTGCTGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 24 976 2393 2408 528778 TCAATGGTATTGCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 15 977 2394 2409 528779 GTCAATGGTATTGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 16 978 2395 2410 528780 GGTCAATGGTATTGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 196 2396 2411 528781 AGGTCAATGGTATTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 26 979 2397 2412 528782 CAGGTCAATGGTATTG e-e-e-d(10)-k-k-k 16 980 2398 2413 528783 GCAGGTCAATGGTATT e-e-e-d(10)-k-k-k 10 981 2399 2414 528784 GGCAGGTCAATGGTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 32 982 2400 2415 528785 CGGCAGGTCAATGGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 983 2401 2416 528786 TCGGCAGGTCAATGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 51 984 2403 2418 528787 CATCGGCAGGTCAATG e-e-e-d(10)-k-k-k 26 198 2404 2419 528788 ACATCGGCAGGTCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 20 985 2405 2420 528789 GACATCGGCAGGTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 42 986 2406 2421 528790 GGACATCGGCAGGTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 58 987 2407 2422 528791 GGGACATCGGCAGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 68 988 2423 2438 528792 GAATCTAAAGTGCGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 200 2424 2439 528793 TGAATCTAAAGTGCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 43 989 2427 2442 528794 CAATGAATCTAAAGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 20 990 2462 2477 528795 GGTTCAGCACCTTCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 13 991 2463 2478 528796 GGGTTCAGCACCTTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 24 992 2464 2479 528797 AGGGTTCAGCACCTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 23 993 2465 2480 528798 GAGGGTTCAGCACCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 994 2466 2481 528799 TGAGGGTTCAGCACCT e-e-e-d(10)-k-k-k 24 995 2490 2505 528800 GAGGGACTCAAACTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 996 2492 2507 528801 GTGAGGGACTCAAACT e-e-e-d(10)-k-k-k 22 997 2493 2508 528802 GGTGAGGGACTCAAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 998 2494 2509 528803 AGGTGAGGGACTCAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 13 999 2495 2510 528804 AAGGTGAGGGACTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1000 2497 2512 528805 CAAAGGTGAGGGACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1001 2498 2513 528806 TCAAAGGTGAGGGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1002 2506 2521 528807 ACTCCATGTCAAAGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1003 2510 2525 528808 GTCAACTCCATGTCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1004 2511 2526 528809 GGTCAACTCCATGTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1005 2513 2528 528810 GAGGTCAACTCCATGT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1006 2514 2529 528811 CGAGGTCAACTCCATG e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1007 2515 2530 528812 CCGAGGTCAACTCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1008 2517 2532 528813 CTCCGAGGTCAACTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1009 2518 2533 528814 ACTCCGAGGTCAACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1010 2519 2534 528815 CACTCCGAGGTCAACT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1011 2551 2566 528816 CGTTCTCAGCTCCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1012 2554 2569 528817 TTCCGTTCTCAGCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1013 2555 2570 528818 CTTCCGTTCTCAGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1014 2556 2571 528819 GCTTCCGTTCTCAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 35 1015 2557 2572 528820 AGCTTCCGTTCTCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 1016 2558 2573 528821 CAGCTTCCGTTCTCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1017 2559 2574 528822 GCAGCTTCCGTTCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 66 1018 2614 2629 528823 TTTGGCTGTGTGAGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1019 2615 2630 528824 GTTTGGCTGTGTGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 50 1020 2616 2631 528825 GGTTTGGCTGTGTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1021 2641 2656 528826 AAGTTAGTAGTTTCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1022 2677 2692 528827 GCAGAAGTAGGAGATT e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1023 2690 2705 528828 TTGCTCAAAGATAGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1024 2691 2706 528829 ATTGCTCAAAGATAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1025 2692 2707 528830 GATTGCTCAAAGATAG e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1026 2694 2709 528831 CAGATTGCTCAAAGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1027 2695 2710 528832 CCAGATTGCTCAAAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1028 2699 2714 528833 GTGCCCAGATTGCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 77 1029 2738 2753 528834 GCAGATCACCCACATT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1030 2743 2758 528835 TAAAAGCAGATCACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1031 2809 2824 528836 CTAGCCACCCCCCGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1032 2810 2825 528837 TCTAGCCACCCCCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1033 2811 2826 528838 CTCTAGCCACCCCCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1034 2908 2923 528839 GGAGGCACTTGTCTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 56 235 2909 2924 528840 AGGAGGCACTTGTCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1036 2910 2925 528841 CAGGAGGCACTTGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1037 2911 2926 528842 CCAGGAGGCACTTGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 59 1038 2932 2947 528843 GGCAGAAGGATGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 35 1039 2945 2960 528844 GCTTACAGAAACAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1040 2980 2995 528845 CAGGAGTATGTAGCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1041 2981 2996 528846 CCAGGAGTATGTAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 80 1042 2982 2997 528847 GCCAGGAGTATGTAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 72 1043 2983 2998 528848 TGCCAGGAGTATGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1044 2984 2999 528849 ATGCCAGGAGTATGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 59 241 3001 3016 528850 CAAGGTTAAAAAGTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 243 3008 3023 528851 ATGTCAGCAAGGTTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 61 1045 3010 3025 528852 GGATGTCAGCAAGGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 88 1046 3012 3027 528853 TTGGATGTCAGCAAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 91 1047 3016 3031 518349 CTATTTGGATGTCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 85 245 3030 3045 528854 GATAGTCCTATCTTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1048 3091 3106 528855 ACAGTGTTTTTTGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 59 1049 3108 3123 528856 AGAAAGGCTATGCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1050 3452 3467 528857 GAGGCTGTTAACTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1051 3458 3473 528858 ACCAAGGAGGCTGTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1052 3474 3489 528859 GCTGAATGCTTAAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1053 4022 4037 518344 GCCACTGGATATCACC e-e-e-d(10)-k-k-k 55 317
Primer 12: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama [0279] Gapmeri iz studije opisane u Primeru 11, iznad, koji pokazuju značajan in vitro inhibicija STAT3 su testirani u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 20,000 ćelija po komorici i transfektovane upotrebom elektroporacije sa 23,4375 nM, 93,75 nM, 375,0 nM i 1,500,0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 12. Nakon perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0280] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 12 i izračunata je grafičkim prikazom koncentracija upotrebljenih oligonukleotida u odnosu na procenat inhibicije eksprimiranja STAT3 mRNK postignut pri svakoj koncentraciji, uz obraćanje pažnje na koncentraciju oligonukleotida pri kojoj je postignuto 50% inhibicija eksprimiranja STAT3 mRNK u poređenju sa kontrolom. Kao što je ilustrovano u Tabeli 12, nivoi mRNK STAT3 su značajno redukovani u zavisnosti od doze u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 12
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 u HuVEC ćelija ISIS br. 23,4375 nM 93,75 nM 375,0 nM 1500,0 nM IC50(µM)
518340 0 8 28 63 1,0
518349 13 30 68 90 0,2
528189 8 13 43 71 0,5
528204 4 24 53 79 0,3
528205 0 9 59 80 0,4 528208 0 19 56 84 0,3 528209 0 28 58 90 0,3 528210 0 16 49 87 0,3 528211 0 10 47 86 0,4 528212 0 16 42 83 0,4 528214 0 25 55 88 0,3 528215 3 16 53 82 0,3 528237 13 19 33 73 0,6 528245 3 16 53 78 0,4 528263 0 3 32 76 0,6 528264 9 0 19 50 >1,5 528268 0 7 25 63 1,0 528269 0 11 39 77 0,5 528270 5 9 48 79 0,4 528271 0 14 37 81 0,5 528327 0 0 26 72 0,8 528347 0 2 25 69 0,9 528357 0 17 36 69 0,6 528389 0 3 19 82 0,7 528501 0 17 40 69 0,6 528502 0 10 35 76 0,6 528503 3 1 38 70 0,7 528504 0 19 45 72 0,5 528505 0 7 41 73 0,6 528518 0 24 51 81 0,3 528534 0 8 32 72 0,7 528539 0 7 39 73 0,6 528557 0 9 26 53 >1,5 528565 4 12 31 57 1,3 528567 8 13 25 54 >1,5 528569 9 19 37 60 0,8 528574 5 17 32 62 0,9
528622 10 4 29 68 0,9
528623 0 13 24 62 1,1
528626 1 0 34 68 0,8
528627 22 19 30 64 1,0
528664 0 14 37 74 0,5
528675 0 10 28 62 1,0
528689 0 16 33 65 0,7
528691 0 3 34 61 0,9
528695 1 4 36 66 0,8
528697 3 15 39 72 0,5
528710 13 16 28 63 1,0
528711 8 13 14 62 >1,5
528726 0 8 36 72 0,6
528757 4 10 29 76 0,6
528758 1 5 28 62 1,1
528772 0 2 21 63 1,2
528773 9 8 28 70 0,8
528791 4 9 41 69 0,6
528822 0 0 40 46 >1,5
528833 0 23 47 82 0,4
528846 10 19 49 85 0,3
528847 0 19 45 75 0,4
528852 5 33 66 93 0,2
528853 19 46 77 95 0,1
Primer 13: Antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama
[0281] antisens oligonukleotidi su dizajnirani da ciljaju ljudsku STAT3 nukleinsku kiselinu i testirani su za svoj efekat na eksprimiranje ljudske STAT3 mRNK in vitro. Himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama 13 i 14 su gapmeri 16 ili 17 nukleotida dužine koji imaju različite hemijske modifikacije. Svaki gapmer sadrži centralni segment jaza koji se sastoji od devet ili deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima od kojih svako obuhvata 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida. Svaki od nukleotida u krilima sadrži 2'-MOE šećernu modifikaciju ili cEt šećernu modifikaciju. Gapmer motivi uključuju 3-10-3, 4-9-3, 210-4, 1-10-5 i 3-10-4. Kolona hemije u Tabelama 13 i 14 daje šećerni motiv svakog gapmera, gde 'e' označava 2'-MOE nukleozid, 'k' označava ograničeni etil (cEt) nukleozid, i 'd' označava 2'-dezoksinukleozid. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini.
[0282] Potentnost himernih antisens oligonukleotida je upoređena sa ISIS 481464, ISIS 518344 i ISIS 518349 (opisano ranije u tekstu).
[0283] Kultivisane HuVEC ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po komorici su transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 1,000 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet za proučavanje ljudskih prajmera RTS199, opisan gore, je korišćen za merenje nivoa mRNK. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0284] „Početno mesto ljudskog cilja“ označava naj-5' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. „Zaustavno mesto ljudskog cilja“ označava naj-3' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. Svaki gapmer koji je naveden u Tabeli 13 je ciljan na ljudsku STAT3 mRNK, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_139276,2). Svaki gapmer naveden u Tabeli 14 je ciljan na ljudsku STAT3 genomsku sekvencu, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 2 (komplement GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćen od nukleotida 4185000 do 4264000).
Tabela 13
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ ID
NO: 1
Ljudsko Ljudsko ISIS Sekvenca Hemija % SEQ početno zaustavno BR. inhibicije ID mesto mesto NO 728 743 530423 AGATTCTCTACCACTT k-d(10)-k-e-k-e-e 70 1054 729 745 530053 GGAGATTCTCTACCACT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 84 1055 729 744 530373 GAGATTCTCTACCACT e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1056 730 745 530121 GGAGATTCTCTACCAC e-k-k-d(10)-k-k-e 77 53 730 745 530168 GGAGATTCTCTACCAC e-e-k-d(10)-k-k-e 75 53 730 745 530218 GGAGATTCTCTACCAC e-d-k-d(10)-k-k-e 61 53 730 745 530268 GGAGATTCTCTACCAC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 76 53 730 745 530318 GGAGATTCTCTACCAC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 27 53 786 801 530424 ATCTTGCATGTCTCCT k-d(10)-k-e-k-e-e 42 1057 787 803 530058 AGATCTTGCATGTCTCC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1058 787 802 530374 GATCTTGCATGTCTCC e-k-d(10)-k-e-k-e 71 647 788 803 530122 AGATCTTGCATGTCTC e-k-k-d(10)-k-k-e 80 57 788 803 530169 AGATCTTGCATGTCTC e-e-k-d(10)-k-k-e 72 57 788 803 530219 AGATCTTGCATGTCTC e-d-k-d(10)-k-k-e 55 57 788 803 530269 AGATCTTGCATGTCTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 76 57 788 803 530319 AGATCTTGCATGTCTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 30 57 892 907 528400 CCGCCAGCTCACTCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 57 66 893 908 528401 CCCGCCAGCTCACTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1059 894 909 528402 CCCCGCCAGCTCACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1060 897 912 528403 AAGCCCCGCCAGCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 72 1061 898 913 528404 AAAGCCCCGCCAGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1062 899 914 528405 AAAAGCCCCGCCAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1063 900 915 528406 CAAAAGCCCCGCCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 29 1064 901 916 528407 ACAAAAGCCCCGCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1065 903 918 528408 TGACAAAAGCCCCGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1066 904 919 528409 CTGACAAAAGCCCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1067 905 920 528410 GCTGACAAAAGCCCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1068 906 921 528411 CGCTGACAAAAGCCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1069 907 922 528412 TCGCTGACAAAAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1070 908 923 528413 ATCGCTGACAAAAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1071 909 924 528414 CATCGCTGACAAAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1072 911 926 528415 TCCATCGCTGACAAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 11 1073 912 927 528416 CTCCATCGCTGACAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1074 913 928 528417 ACTCCATCGCTGACAA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1075 914 929 528418 TACTCCATCGCTGACA e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1076 915 930 528419 GTACTCCATCGCTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1077 916 931 528420 CGTACTCCATCGCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 35 1078 930 945 528421 GAGAGTTTTCTGCACG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1079 932 947 528422 GTGAGAGTTTTCTGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1080 951 966 528423 GTCAGCCAGCTCCTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1081 962 977 528424 CGCCTCTTCCAGTCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1082 964 979 528425 GCCGCCTCTTCCAGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1083 965 980 528426 TGCCGCCTCTTCCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1084 970 985 528427 TCTGTTGCCGCCTCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1085 971 986 528428 ATCTGTTGCCGCCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1086 972 987 528429 AATCTGTTGCCGCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 23 1087 973 988 528430 CAATCTGTTGCCGCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1088 974 989 528431 GCAATCTGTTGCCGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 48 1089 975 990 528432 GGCAATCTGTTGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1090 976 991 528433 AGGCAATCTGTTGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1091 977 992 528434 CAGGCAATCTGTTGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1092 978 993 528435 GCAGGCAATCTGTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1093 982 997 528436 CAATGCAGGCAATCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1094 983 998 528437 CCAATGCAGGCAATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1095 984 999 528438 TCCAATGCAGGCAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1096 985 1000 528439 CTCCAATGCAGGCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1097 986 1001 528440 CCTCCAATGCAGGCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1098 1003 1018 528441 GGCAGATGTTGGGCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1099 1004 1019 528442 AGGCAGATGTTGGGCG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1100 1005 1020 528443 TAGGCAGATGTTGGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 1 1101 1006 1021 528444 CTAGGCAGATGTTGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1102 1007 1022 528445 TCTAGGCAGATGTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 7 1103 1008 1023 528446 ATCTAGGCAGATGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 3 1104 1010 1025 528447 CGATCTAGGCAGATGT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 72 1011 1026 528448 CCGATCTAGGCAGATG e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1105 1013 1028 528449 AGCCGATCTAGGCAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 4 1106 1014 1029 528450 TAGCCGATCTAGGCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 11 1107 1015 1030 528451 CTAGCCGATCTAGGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1108 1016 1031 528452 TCTAGCCGATCTAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1109 1017 1032 528453 TTCTAGCCGATCTAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 1110 1018 1033 528454 TTTCTAGCCGATCTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 29 1111 1019 1034 528455 TTTTCTAGCCGATCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1112 1020 1035 528456 GTTTTCTAGCCGATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1113 1022 1037 528457 CAGTTTTCTAGCCGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 50 1114 1023 1038 528458 CCAGTTTTCTAGCCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 70 1115 1024 1039 528459 TCCAGTTTTCTAGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1116 1025 1040 528460 ATCCAGTTTTCTAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1117 1029 1044 528461 CGTTATCCAGTTTTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1118 1043 1058 528462 GATTCTGCTAATGACG e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1119 1044 1059 528463 AGATTCTGCTAATGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 1120 1048 1063 528464 GTTGAGATTCTGCTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1121 1049 1064 528465 AGTTGAGATTCTGCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 48 1122 1056 1071 528466 GGTCTGAAGTTGAGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1123 1058 1073 528467 CGGGTCTGAAGTTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1124 1059 1074 528468 ACGGGTCTGAAGTTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1125 1060 1075 528469 GACGGGTCTGAAGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1126 1061 1076 528470 TGACGGGTCTGAAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1127 1062 1077 528471 TTGACGGGTCTGAAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1128 1063 1078 528472 GTTGACGGGTCTGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1129 1064 1079 528473 TGTTGACGGGTCTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1130 1065 1080 528474 TTGTTGACGGGTCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 55 1131 1066 1081 528475 TTTGTTGACGGGTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 63 1132 1067 1082 528476 ATTTGTTGACGGGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1133 1899 1914 530425 GCCCTTGCCAGCCATG k-d(10)-k-e-k-e-e 73 1134 1900 1916 530054 AAGCCCTTGCCAGCCAT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 75 1135 1900 1915 530375 AGCCCTTGCCAGCCAT e-k-d(10)-k-e-k-e 77 1136 1901 1916 530123 AAGCCCTTGCCAGCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 86 144 1901 1916 530170 AAGCCCTTGCCAGCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 87 144 1901 1916 530220 AAGCCCTTGCCAGCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 74 144 1901 1916 530270 AAGCCCTTGCCAGCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 87 144 1901 1916 530320 AAGCCCTTGCCAGCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 17 144 1946 1961 530426 TTTTTCACAAGGTCAA k-d(10)-k-e-k-e-e 55 1137 1947 1963 530059 ACTTTTTCACAAGGTCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1138 1947 1962 530376 CTTTTTCACAAGGTCA e-k-d(10)-k-e-k-e 77 1139 1948 1963 530124 ACTTTTTCACAAGGTC e-k-k-d(10)-k-k-e 79 153 1948 1963 530171 ACTTTTTCACAAGGTC e-e-k-d(10)-k-k-e 69 153 1948 1963 530221 ACTTTTTCACAAGGTC e-d-k-d(10)-k-k-e 64 153 1948 1963 530271 ACTTTTTCACAAGGTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 73 153 1948 1963 530321 ACTTTTTCACAAGGTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 44 153 2204 2219 530427 ATGATCTTATAGCCCA k-d(10)-k-e-k-e-e 43 931 2205 2221 530060 CCATGATCTTATAGCCC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 77 1140 2205 2220 530377 CATGATCTTATAGCCC e-k-d(10)-k-e-k-e 66 932 2206 2221 530125 CCATGATCTTATAGCC e-k-k-d(10)-k-k-e 65 175 2206 2221 530172 CCATGATCTTATAGCC e-e-k-d(10)-k-k-e 59 175 2206 2221 530222 CCATGATCTTATAGCC e-d-k-d(10)-k-k-e 48 175 2206 2221 530272 CCATGATCTTATAGCC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 63 175 2206 2221 530322 CCATGATCTTATAGCC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 55 175 2679 2694 530428 TAGCAGAAGTAGGAGA k-d(10)-k-e-k-e-e 49 1141 2680 2696 530061 GATAGCAGAAGTAGGAG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 49 1142 2680 2695 530378 ATAGCAGAAGTAGGAG e-k-d(10)-k-e-k-e 48 1143 2681 2696 530126 GATAGCAGAAGTAGGA e-k-k-d(10)-k-k-e 70 223 2681 2696 530173 GATAGCAGAAGTAGGA e-e-k-d(10)-k-k-e 62 223 2681 2696 530223 GATAGCAGAAGTAGGA e-d-k-d(10)-k-k-e 44 223 2681 2696 530273 GATAGCAGAAGTAGGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 63 223 2681 2696 530323 GATAGCAGAAGTAGGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 63 223 3012 3027 530513 TTGGATGTCAGCAAGG k-d(10)-k-e-k-e-e 88 1047 3013 3028 530507 TTTGGATGTCAGCAAG e-k-d(10)-k-e-k-e 86 1144 3013 3028 530514 TTTGGATGTCAGCAAG k-d(10)-k-e-k-e-e 80 1144 3014 3029 530430 ATTTGGATGTCAGCAA k-d(10)-k-e-k-e-e 87 1145 3014 3029 530468 ATTTGGATGTCAGCAA e-k-k-d(10)-k-k-e 81 1145 3014 3029 530476 ATTTGGATGTCAGCAA e-e-k-d(10)-k-k-e 82 1145 3014 3029 530484 ATTTGGATGTCAGCAA e-d-k-d(10)-k-k-e 74 1145 3014 3029 530492 ATTTGGATGTCAGCAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 83 1145 3014 3029 530500 ATTTGGATGTCAGCAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1145 3014 3029 530508 ATTTGGATGTCAGCAA e-k-d(10)-k-e-k-e 83 1145 3015 3031 530062 CTATTTGGATGTCAGCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 94 1146 3015 3030 530380 TATTTGGATGTCAGCA e-k-d(10)-k-e-k-e 94 1147 3015 3030 530469 TATTTGGATGTCAGCA e-k-k-d(10)-k-k-e 91 1147 3015 3030 530477 TATTTGGATGTCAGCA e-e-k-d(10)-k-k-e 87 1147 3015 3030 530485 TATTTGGATGTCAGCA e-d-k-d(10)-k-k-e 87 1147 3015 3030 530493 TATTTGGATGTCAGCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 81 1147 3015 3030 530501 TATTTGGATGTCAGCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 74 1147 3015 3030 530515 TATTTGGATGTCAGCA k-d(10)-k-e-k-e-e 87 1147 3016 3031 481464 CTATTTGGATGTCAGC k-k-k-d(10)-k-k-k 93 245 3016 3031 518349 CTATTTGGATGTCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 245 3016 3031 519637 CTATTTGGATGTCAGC e-k-k-d(10)-k-k-e 96 245 3016 3031 530175 CTATTTGGATGTCAGC e-e-k-d(10)-k-k-e 93 245 3016 3031 530225 CTATTTGGATGTCAGC e-d-k-d(10)-k-k-e 85 245 3016 3031 530275 CTATTTGGATGTCAGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 91 245 3016 3031 530325 CTATTTGGATGTCAGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 91 245 3017 3032 530470 TCTATTTGGATGTCAG e-k-k-d(10)-k-k-e 91 1148 3017 3032 530478 TCTATTTGGATGTCAG e-e-k-d(10)-k-k-e 87 1148 3017 3032 530486 TCTATTTGGATGTCAG e-d-k-d(10)-k-k-e 84 1148 3017 3032 530494 TCTATTTGGATGTCAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 60 1148 3017 3032 530502 TCTATTTGGATGTCAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 64 1148 3017 3032 530509 TCTATTTGGATGTCAG e-k-d(10)-k-e-k-e 80 1148 3018 3033 530471 TTCTATTTGGATGTCA e-k-k-d(10)-k-k-e 83 1149 3018 3033 530479 TTCTATTTGGATGTCA e-e-k-d(10)-k-k-e 74 1149 3018 3033 530487 TTCTATTTGGATGTCA e-d-k-d(10)-k-k-e 71 1149 3018 3033 530495 TTCTATTTGGATGTCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 68 1149 3018 3033 530503 TTCTATTTGGATGTCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 53 1149 3459 3474 530431 CACCAAGGAGGCTGTT k-d(10)-k-e-k-e-e 44 1150 3460 3476 530055 AGCACCAAGGAGGCTGT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 45 1151 3460 3475 530381 GCACCAAGGAGGCTGT e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1152 3461 3476 530128 AGCACCAAGGAGGCTG e-k-k-d(10)-k-k-e 52 257 3461 3476 530176 AGCACCAAGGAGGCTG e-e-k-d(10)-k-k-e 66 257 3461 3476 530226 AGCACCAAGGAGGCTG e-d-k-d(10)-k-k-e 51 257 3461 3476 530276 AGCACCAAGGAGGCTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 70 257 3461 3476 530326 AGCACCAAGGAGGCTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 52 257 3527 3542 528860 GGTTTGACCTGAAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1153 3528 3543 528861 GGGTTTGACCTGAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1154 3529 3544 528862 AGGGTTTGACCTGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1155 3530 3545 528863 AAGGGTTTGACCTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 43 1156 3531 3546 528864 TAAGGGTTTGACCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 50 1157 3532 3547 528865 TTAAGGGTTTGACCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1158 3547 3562 528866 GCAGCTTCAGATGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 60 1159 3548 3563 528867 TGCAGCTTCAGATGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1160 3583 3598 530388 CTTAAACCTTCCTATT k-d(10)-k-e-k-e-e 14 1161 3584 3599 530338 CCTTAAACCTTCCTAT e-k-d(10)-k-e-k-e 47 1162 3585 3600 530086 TCCTTAAACCTTCCTA e-k-k-d(10)-k-k-e 58 273 3585 3600 530133 TCCTTAAACCTTCCTA e-e-k-d(10)-k-k-e 53 273 3585 3600 530183 TCCTTAAACCTTCCTA e-d-k-d(10)-k-k-e 52 273 3585 3600 530233 TCCTTAAACCTTCCTA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 29 273 3585 3600 530283 TCCTTAAACCTTCCTA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 32 273 3590 3605 528868 GATTCTCCTTAAACCT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1163 3591 3606 530389 AGATTCTCCTTAAACC k-d(10)-k-e-k-e-e 44 1164 3592 3607 530339 TAGATTCTCCTTAAAC e-k-d(10)-k-e-k-e 41 1165 3593 3608 530087 TTAGATTCTCCTTAAA e-k-k-d(10)-k-k-e 43 1166 3593 3608 530134 TTAGATTCTCCTTAAA e-e-k-d(10)-k-k-e 28 1166 3593 3608 530184 TTAGATTCTCCTTAAA e-d-k-d(10)-k-k-e 13 1166 3593 3608 530234 TTAGATTCTCCTTAAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 15 1166 3593 3608 530284 TTAGATTCTCCTTAAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 14 1166 3595 3610 530390 GCTTAGATTCTCCTTA k-d(10)-k-e-k-e-e 83 1167 3596 3611 530340 TGCTTAGATTCTCCTT e-k-d(10)-k-e-k-e 89 1168 3597 3612 528869 ATGCTTAGATTCTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 83 1169 3597 3612 530088 ATGCTTAGATTCTCCT e-k-k-d(10)-k-k-e 90 1169 3597 3612 530135 ATGCTTAGATTCTCCT e-e-k-d(10)-k-k-e 91 1169 3597 3612 530185 ATGCTTAGATTCTCCT e-d-k-d(10)-k-k-e 85 1169 3597 3612 530235 ATGCTTAGATTCTCCT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 28 1169 3597 3612 530285 ATGCTTAGATTCTCCT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 86 1169 3597 3612 530391 ATGCTTAGATTCTCCT k-d(10)-k-e-k-e-e 79 1169 3598 3614 530021 AAATGCTTAGATTCTCC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 87 1170 3598 3613 530341 AATGCTTAGATTCTCC e-k-d(10)-k-e-k-e 88 1171 3599 3614 530089 AAATGCTTAGATTCTC e-k-k-d(10)-k-k-e 71 1172 3599 3614 530136 AAATGCTTAGATTCTC e-e-k-d(10)-k-k-e 66 1172 3599 3614 530186 AAATGCTTAGATTCTC e-d-k-d(10)-k-k-e 51 1172 3599 3614 530236 AAATGCTTAGATTCTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 74 1172 3599 3614 530286 AAATGCTTAGATTCTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1172 3682 3697 528870 GTAAGCACCCTCTGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1173 3684 3699 528871 TTGTAAGCACCCTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1174 3686 3701 528872 GGTTGTAAGCACCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1175 3687 3702 528873 AGGTTGTAAGCACCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1176 3688 3703 528874 AAGGTTGTAAGCACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1177 3690 3705 528875 TCAAGGTTGTAAGCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1178 3691 3706 528876 GTCAAGGTTGTAAGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1179 3692 3707 528877 AGTCAAGGTTGTAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1180 3694 3709 528878 GGAGTCAAGGTTGTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 6 1181 3695 3710 528879 GGGAGTCAAGGTTGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1182 3714 3729 530392 GATCAAGTCCAGGGAG k-d(10)-k-e-k-e-e 47 1183 3715 3731 530022 CAGATCAAGTCCAGGGA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 80 1184 3715 3730 530342 AGATCAAGTCCAGGGA e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1185 3715 3730 530393 AGATCAAGTCCAGGGA k-d(10)-k-e-k-e-e 46 1185 3716 3732 530023 GCAGATCAAGTCCAGGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1186 3716 3731 530090 CAGATCAAGTCCAGGG e-k-k-d(10)-k-k-e 78 1187 3716 3731 530137 CAGATCAAGTCCAGGG e-e-k-d(10)-k-k-e 76 1187 3716 3731 530187 CAGATCAAGTCCAGGG e-d-k-d(10)-k-k-e 68 1187 3716 3731 530237 CAGATCAAGTCCAGGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 36 1187 3716 3731 530287 CAGATCAAGTCCAGGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1187 3716 3731 530343 CAGATCAAGTCCAGGG e-k-d(10)-k-e-k-e 68 1187 3716 3731 530394 CAGATCAAGTCCAGGG k-d(10)-k-e-k-e-e 49 1187 3717 3732 518343 GCAGATCAAGTCCAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1188 3717 3733 530024 AGCAGATCAAGTCCAGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 79 1189 3717 3732 530091 GCAGATCAAGTCCAGG e-k-k-d(10)-k-k-e 81 1188 3717 3732 530138 GCAGATCAAGTCCAGG e-e-k-d(10)-k-k-e 81 1188 3717 3732 530188 GCAGATCAAGTCCAGG e-d-k-d(10)-k-k-e 78 1188 3717 3732 530238 GCAGATCAAGTCCAGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 29 1188 3717 3732 530288 GCAGATCAAGTCCAGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 69 1188 3717 3732 530344 GCAGATCAAGTCCAGG e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1188 3718 3733 530092 AGCAGATCAAGTCCAG e-k-k-d(10)-k-k-e 85 1190 3718 3733 530139 AGCAGATCAAGTCCAG e-e-k-d(10)-k-k-e 79 1190 3718 3733 530189 AGCAGATCAAGTCCAG e-d-k-d(10)-k-k-e 77 1190 3718 3733 530239 AGCAGATCAAGTCCAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 61 1190 3718 3733 530289 AGCAGATCAAGTCCAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 75 1190 3720 3735 528880 ACAGCAGATCAAGTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1191 3721 3736 528881 AACAGCAGATCAAGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1192 3737 3752 528882 ACAACCTAGCCTCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1193 3738 3753 528883 AACAACCTAGCCTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1194 3740 3755 528884 GAAACAACCTAGCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1195 3741 3756 528885 AGAAACAACCTAGCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1196 3742 3757 528886 CAGAAACAACCTAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1197 3755 3770 528887 GATAAGGCACCCACAG e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1198 3756 3771 528888 TGATAAGGCACCCACA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1199 3757 3772 528889 CTGATAAGGCACCCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1200 3759 3774 528890 CCCTGATAAGGCACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1201 3760 3775 528891 GCCCTGATAAGGCACC e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1202 3765 3780 528892 TCCCAGCCCTGATAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1203 3767 3782 528893 TATCCCAGCCCTGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1204 3770 3785 528894 AAGTATCCCAGCCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1205 3771 3786 528895 GAAGTATCCCAGCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1206 3772 3787 528896 AGAAGTATCCCAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1207 3773 3788 528897 CAGAAGTATCCCAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1208 3892 3907 528898 TGAGACCAGGATTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1209 3896 3911 528899 GTCCTGAGACCAGGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1210 3977 3992 528900 AGCTCAACCAGACACG e-e-e-d(10)-k-k-k 54 311 3979 3994 528901 TGAGCTCAACCAGACA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1211 3984 3999 528902 TTCCCTGAGCTCAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1212 3992 4007 528903 GAACCATATTCCCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 30 313 3995 4010 528904 TAAGAACCATATTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1213 4022 4037 518344 GCCACTGGATATCACC e-e-e-d(10)-k-k-k 89 317 4067 4082 528905 TAAGCCTTTGCCCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 64 1214 4068 4083 528906 GTAAGCCTTTGCCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1215 4069 4084 528907 AGTAAGCCTTTGCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1216 4070 4085 528908 CAGTAAGCCTTTGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1217 4072 4087 528909 ATCAGTAAGCCTTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1218 4073 4088 528910 TATCAGTAAGCCTTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1219 4077 4092 528911 AGTTTATCAGTAAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1220 4083 4098 528912 GACTCAAGTTTATCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1221 4085 4100 528913 CAGACTCAAGTTTATC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1222 4086 4101 528914 GCAGACTCAAGTTTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1223 4087 4102 528915 GGCAGACTCAAGTTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 1 1224 4088 4103 528916 GGGCAGACTCAAGTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1225 4089 4104 528917 AGGGCAGACTCAAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1226 4091 4106 528918 CGAGGGCAGACTCAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1227 4093 4108 528919 TACGAGGGCAGACTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 324 4094 4109 528920 ATACGAGGGCAGACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1228 4095 4110 528921 CATACGAGGGCAGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1229 4096 4111 528922 TCATACGAGGGCAGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1230 4098 4113 528923 CCTCATACGAGGGCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1231 4099 4114 528924 CCCTCATACGAGGGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1232 4100 4115 528925 ACCCTCATACGAGGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1233 4225 4240 528926 TACGCACAGGAGAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1233 4226 4241 528927 ATACGCACAGGAGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1234 4227 4242 528928 CATACGCACAGGAGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 6 1235 4228 4243 528929 CCATACGCACAGGAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 4 1236 4229 4244 528930 CCCATACGCACAGGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1237 4230 4245 528931 TCCCATACGCACAGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1238 4231 4246 528932 TTCCCATACGCACAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1239 4232 4247 528933 GTTCCCATACGCACAG e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1240 4233 4248 528934 TGTTCCCATACGCACA e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1241 4234 4249 528935 GTGTTCCCATACGCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1242 4234 4249 530395 GTGTTCCCATACGCAC k-d(10)-k-e-k-e-e 71 1242 4235 4250 528936 GGTGTTCCCATACGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 71 1243 4235 4251 530025 AGGTGTTCCCATACGCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 90 1244 4235 4250 530345 GGTGTTCCCATACGCA e-k-d(10)-k-e-k-e 93 1243 4235 4250 530396 GGTGTTCCCATACGCA k-d(10)-k-e-k-e-e 71 1243 4236 4251 528937 AGGTGTTCCCATACGC e-e-e-d(10)-k-k-k 73 1245 4236 4252 530026 TAGGTGTTCCCATACGC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 87 1246 4236 4251 530093 AGGTGTTCCCATACGC e-k-k-d(10)-k-k-e 95 1245 4236 4251 530140 AGGTGTTCCCATACGC e-e-k-d(10)-k-k-e 89 1245 4236 4251 530190 AGGTGTTCCCATACGC e-d-k-d(10)-k-k-e 82 1245 4236 4251 530240 AGGTGTTCCCATACGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 50 1245 4236 4251 530290 AGGTGTTCCCATACGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 69 1245 4236 4251 530346 AGGTGTTCCCATACGC e-k-d(10)-k-e-k-e 89 1245 4237 4252 528938 TAGGTGTTCCCATACG e-e-e-d(10)-k-k-k 72 336 4237 4252 530094 TAGGTGTTCCCATACG e-k-k-d(10)-k-k-e 88 336 4237 4252 530141 TAGGTGTTCCCATACG e-e-k-d(10)-k-k-e 80 336 4237 4252 530191 TAGGTGTTCCCATACG e-d-k-d(10)-k-k-e 74 336 4237 4252 530241 TAGGTGTTCCCATACG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 53 336 4237 4252 530291 TAGGTGTTCCCATACG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 68 336 4238 4253 528939 CTAGGTGTTCCCATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1247 4239 4254 528940 GCTAGGTGTTCCCATA e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1248 4240 4255 528941 TGCTAGGTGTTCCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1249 4242 4257 528942 CGTGCTAGGTGTTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 77 1250 4304 4319 528943 CAAGGTGGTTTTGAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1251 4305 4320 528944 GCAAGGTGGTTTTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 28 344 4320 4335 528945 CTCTGATCAGCTGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 74 1252 4321 4336 528946 ACTCTGATCAGCTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1253 4362 4377 528947 GAGACCAGCTAATTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1254 4395 4410 528948 CATCTTAGAGAAGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 59 1255 4435 4450 528949 TCAACTGTCTCCAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 67 1256 4435 4450 530397 TCAACTGTCTCCAGGC k-d(10)-k-e-k-e-e 60 1256 4436 4451 528950 ATCAACTGTCTCCAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1257 4436 4452 530027 CATCAACTGTCTCCAGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 56 1258 4436 4451 530347 ATCAACTGTCTCCAGG e-k-d(10)-k-e-k-e 49 1257 4437 4452 530095 CATCAACTGTCTCCAG e-k-k-d(10)-k-k-e 40 354 4437 4452 530142 CATCAACTGTCTCCAG e-e-k-d(10)-k-k-e 43 354 4437 4452 530192 CATCAACTGTCTCCAG e-d-k-d(10)-k-k-e 42 354 4437 4452 530242 CATCAACTGTCTCCAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 0 354 4437 4452 530292 CATCAACTGTCTCCAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 36 354 4437 4452 530398 CATCAACTGTCTCCAG k-d(10)-k-e-k-e-e 28 354 4438 4454 530028 CACATCAACTGTCTCCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 57 1259 4438 4453 530348 ACATCAACTGTCTCCA e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1260 4439 4454 530096 CACATCAACTGTCTCC e-k-k-d(10)-k-k-e 72 356 4439 4454 530143 CACATCAACTGTCTCC e-e-k-d(10)-k-k-e 74 356 4439 4454 530193 CACATCAACTGTCTCC e-d-k-d(10)-k-k-e 62 356 4439 4454 530243 CACATCAACTGTCTCC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 34 356 4439 4454 530293 CACATCAACTGTCTCC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 59 356 4441 4456 528951 GACACATCAACTGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1261 4475 4490 528952 GAAGAGTGTTGCTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1262 4477 4492 528953 CTGAAGAGTGTTGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1263 4479 4494 528954 TACTGAAGAGTGTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1264 4485 4500 530510 ATTATGTACTGAAGAG k-d(10)-k-e-k-e-e 53 1265 4486 4501 530504 TATTATGTACTGAAGA e-k-d(10)-k-e-k-e 25 1266 4486 4501 530511 TATTATGTACTGAAGA k-d(10)-k-e-k-e-e 31 1266 4487 4502 530432 TTATTATGTACTGAAG k-d(10)-k-e-k-e-e 15 1267 4487 4502 530463 TTATTATGTACTGAAG e-k-k-d(10)-k-k-e 20 1267 4487 4502 530472 TTATTATGTACTGAAG e-e-k-d(10)-k-k-e 17 1267 4487 4502 530480 TTATTATGTACTGAAG e-d-k-d(10)-k-k-e 4 1267 4487 4502 530488 TTATTATGTACTGAAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 13 1267 4487 4502 530496 TTATTATGTACTGAAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 0 1267 4487 4502 530505 TTATTATGTACTGAAG e-k-d(10)-k-e-k-e 37 1267 4488 4504 530063 GCTTATTATGTACTGAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1268 4488 4503 530382 CTTATTATGTACTGAA e-k-d(10)-k-e-k-e 17 1269 4488 4503 530465 CTTATTATGTACTGAA e-k-k-d(10)-k-k-e 63 1269 4488 4503 530473 CTTATTATGTACTGAA e-e-k-d(10)-k-k-e 45 1269 4488 4503 530481 CTTATTATGTACTGAA e-d-k-d(10)-k-k-e 14 1269 4488 4503 530489 CTTATTATGTACTGAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 13 1269 4488 4503 530497 CTTATTATGTACTGAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 7 1269 4488 4503 530512 CTTATTATGTACTGAA k-d(10)-k-e-k-e-e 21 1269 4489 4504 519638 GCTTATTATGTACTGA e-k-k-d(10)-k-k-e 86 362 4489 4504 530177 GCTTATTATGTACTGA e-e-k-d(10)-k-k-e 71 362 4489 4504 530227 GCTTATTATGTACTGA e-d-k-d(10)-k-k-e 51 362 4489 4504 530277 GCTTATTATGTACTGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 70 362 4489 4504 530327 GCTTATTATGTACTGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 61 362 4490 4505 530466 AGCTTATTATGTACTG e-k-k-d(10)-k-k-e 82 1270 4490 4505 530474 AGCTTATTATGTACTG e-e-k-d(10)-k-k-e 62 1270 4490 4505 530482 AGCTTATTATGTACTG e-d-k-d(10)-k-k-e 53 1270 4490 4505 530490 AGCTTATTATGTACTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 42 1270 4490 4505 530498 AGCTTATTATGTACTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 45 1270 4490 4505 530506 AGCTTATTATGTACTG e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1270 4491 4506 530467 AAGCTTATTATGTACT e-k-k-d(10)-k-k-e 50 1271 4491 4506 530475 AAGCTTATTATGTACT e-e-k-d(10)-k-k-e 26 1271 4491 4506 530483 AAGCTTATTATGTACT e-d-k-d(10)-k-k-e 19 1271 4491 4506 530491 AAGCTTATTATGTACT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 13 1271 4491 4506 530499 AAGCTTATTATGTACT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 15 1271 4492 4507 528955 TAAGCTTATTATGTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1272 4499 4514 528956 TATCAGTTAAGCTTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1273 4502 4517 528957 GTTTATCAGTTAAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1274 4539 4554 530433 CAATGGTAAGCCCAAG k-d(10)-k-e-k-e-e 62 1275 4540 4555 528958 CCAATGGTAAGCCCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 66 1276 4540 4556 530056 CCCAATGGTAAGCCCAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1277 4540 4555 530383 CCAATGGTAAGCCCAA e-k-d(10)-k-e-k-e 64 1276 4541 4556 518345 CCCAATGGTAAGCCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 80 366 4541 4556 519636 CCCAATGGTAAGCCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 90 366 4541 4556 530178 CCCAATGGTAAGCCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 86 366 4541 4556 530228 CCCAATGGTAAGCCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 77 366 4541 4556 530278 CCCAATGGTAAGCCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 86 366 4541 4556 530328 CCCAATGGTAAGCCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 80 366 4542 4557 528959 ACCCAATGGTAAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 73 1277 4544 4559 528960 AAACCCAATGGTAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 1278 4545 4560 528961 TAAACCCAATGGTAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1279 4546 4561 528962 TTAAACCCAATGGTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1280 4547 4562 528963 TTTAAACCCAATGGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1281 4554 4569 528964 CCTATGATTTAAACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 17 1282 4558 4573 528965 GGTCCCTATGATTTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1283 4559 4574 528966 AGGTCCCTATGATTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1284 4615 4630 528967 CCTAAGGCCATGAACT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 374 4616 4631 528968 ACCTAAGGCCATGAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1285 4617 4632 528969 TACCTAAGGCCATGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1286 4618 4633 528970 CTACCTAAGGCCATGA e-e-e-d(10)-k-k-k 55 1287 4619 4634 528971 GCTACCTAAGGCCATG e-e-e-d(10)-k-k-k 66 1288 4620 4635 528972 TGCTACCTAAGGCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1289 4621 4636 528973 ATGCTACCTAAGGCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 71 1290 4622 4637 528974 CATGCTACCTAAGGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1291 4623 4638 528975 ACATGCTACCTAAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1292 4636 4651 528976 GTTAAGACCAGATACA e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1293 4637 4652 528977 AGTTAAGACCAGATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1294 4638 4653 528978 GAGTTAAGACCAGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1295 4639 4654 528979 AGAGTTAAGACCAGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1296 4644 4659 530399 CAATCAGAGTTAAGAC k-d(10)-k-e-k-e-e 36 1297 4645 4661 530029 TACAATCAGAGTTAAGA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 29 1298 4645 4660 530349 ACAATCAGAGTTAAGA e-k-d(10)-k-e-k-e 33 1299 4646 4661 528980 TACAATCAGAGTTAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 378 4646 4661 530097 TACAATCAGAGTTAAG e-k-k-d(10)-k-k-e 41 378 4646 4661 530144 TACAATCAGAGTTAAG e-e-k-d(10)-k-k-e 16 378 4646 4661 530194 TACAATCAGAGTTAAG e-d-k-d(10)-k-k-e 28 378 4646 4661 530244 TACAATCAGAGTTAAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 0 378 4646 4661 530294 TACAATCAGAGTTAAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 7 378 4648 4663 528981 GCTACAATCAGAGTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1300 4649 4664 528982 TGCTACAATCAGAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1301 4650 4665 528983 TTGCTACAATCAGAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1302 4662 4677 530400 CTCTCAGAACTTTTGC k-d(10)-k-e-k-e-e 65 1303 4663 4679 530030 TCCTCTCAGAACTTTTG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 47 1304 4663 4678 530350 CCTCTCAGAACTTTTG e-k-d(10)-k-e-k-e 54 1305 4664 4679 530098 TCCTCTCAGAACTTTT e-k-k-d(10)-k-k-e 42 380 4664 4679 530145 TCCTCTCAGAACTTTT e-e-k-d(10)-k-k-e 38 380 4664 4679 530195 TCCTCTCAGAACTTTT e-d-k-d(10)-k-k-e 43 380 4664 4679 530245 TCCTCTCAGAACTTTT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 28 380 4664 4679 530295 TCCTCTCAGAACTTTT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 39 380 4770 4785 528984 CCCACGGGATTCCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1306 4771 4786 528985 ACCCACGGGATTCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1307 4772 4787 528986 AACCCACGGGATTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1308 4773 4788 528987 CAACCCACGGGATTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1309 4774 4789 528988 GCAACCCACGGGATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 48 1310 4775 4790 528989 AGCAACCCACGGGATT e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1311 4777 4792 528990 TAAGCAACCCACGGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1312 4778 4793 528991 GTAAGCAACCCACGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1313 4779 4794 528992 GGTAAGCAACCCACGG e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1314 4780 4795 528993 AGGTAAGCAACCCACG e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1315 4780 4795 530434 AGGTAAGCAACCCACG k-d(10)-k-e-k-e-e 51 1315 4781 4796 528994 TAGGTAAGCAACCCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1316 4781 4797 530064 GTAGGTAAGCAACCCAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 53 1317 4781 4796 530384 TAGGTAAGCAACCCAC e-k-d(10)-k-e-k-e 48 1316 4782 4797 528995 GTAGGTAAGCAACCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 64 388 4782 4797 530129 GTAGGTAAGCAACCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 79 388 4782 4797 530179 GTAGGTAAGCAACCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 74 388 4782 4797 530229 GTAGGTAAGCAACCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 64 388 4782 4797 530279 GTAGGTAAGCAACCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 55 388 4782 4797 530329 GTAGGTAAGCAACCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 61 388 4784 4799 528996 AGGTAGGTAAGCAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1318 4788 4803 528997 TTATAGGTAGGTAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1319 4792 4807 528998 CACCTTATAGGTAGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1320 4794 4809 528999 ACCACCTTATAGGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1321 4797 4812 529000 TAAACCACCTTATAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1322 4798 4813 529001 ATAAACCACCTTATAG e-e-e-d(10)-k-k-k 7 1323 4810 4825 529002 GGACAGCAGCTTATAA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1324 4811 4826 529003 AGGACAGCAGCTTATA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1325 4811 4826 530401 AGGACAGCAGCTTATA k-d(10)-k-e-k-e-e 41 1325 4812 4827 529004 CAGGACAGCAGCTTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 38 1326 4812 4828 530031 CCAGGACAGCAGCTTAT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1327 4812 4827 530351 CAGGACAGCAGCTTAT e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1326 4812 4827 530402 CAGGACAGCAGCTTAT k-d(10)-k-e-k-e-e 60 1326 4813 4829 530032 GCCAGGACAGCAGCTTA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1328 4813 4828 530099 CCAGGACAGCAGCTTA e-k-k-d(10)-k-k-e 73 1329 4813 4828 530146 CCAGGACAGCAGCTTA e-e-k-d(10)-k-k-e 70 1329 4813 4828 530196 CCAGGACAGCAGCTTA e-d-k-d(10)-k-k-e 67 1329 4813 4828 530246 CCAGGACAGCAGCTTA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 39 1329 4813 4828 530296 CCAGGACAGCAGCTTA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 67 1329 4813 4828 530352 CCAGGACAGCAGCTTA e-k-d(10)-k-e-k-e 67 1329 4814 4829 530100 GCCAGGACAGCAGCTT e-k-k-d(10)-k-k-e 77 1330 4814 4829 530147 GCCAGGACAGCAGCTT e-e-k-d(10)-k-k-e 84 1330 4814 4829 530197 GCCAGGACAGCAGCTT e-d-k-d(10)-k-k-e 71 1330 4814 4829 530247 GCCAGGACAGCAGCTT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 53 1330 4814 4829 530297 GCCAGGACAGCAGCTT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 75 1330 4814 4829 530403 GCCAGGACAGCAGCTT k-d(10)-k-e-k-e-e 77 1330 4815 4831 530033 TGGCCAGGACAGCAGCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 65 1331 4815 4830 530353 GGCCAGGACAGCAGCT e-k-d(10)-k-e-k-e 83 1332 4816 4831 530101 TGGCCAGGACAGCAGC e-k-k-d(10)-k-k-e 59 1333 4816 4831 530148 TGGCCAGGACAGCAGC e-e-k-d(10)-k-k-e 79 1333 4816 4831 530198 TGGCCAGGACAGCAGC e-d-k-d(10)-k-k-e 54 1333 4816 4831 530248 TGGCCAGGACAGCAGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 32 1333 4816 4831 530298 TGGCCAGGACAGCAGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 73 1333 4827 4842 530404 TTTGAATGCAGTGGCC k-d(10)-k-e-k-e-e 67 1334 4828 4844 530034 AATTTGAATGCAGTGGC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 69 1335 4828 4843 530354 ATTTGAATGCAGTGGC e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1336 4828 4843 530405 ATTTGAATGCAGTGGC k-d(10)-k-e-k-e-e 55 1336 4829 4845 530035 GAATTTGAATGCAGTGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 69 1337 4829 4844 530102 AATTTGAATGCAGTGG e-k-k-d(10)-k-k-e 71 1338 4829 4844 530149 AATTTGAATGCAGTGG e-e-k-d(10)-k-k-e 70 1338 4829 4844 530199 AATTTGAATGCAGTGG e-d-k-d(10)-k-k-e 58 1338 4829 4844 530249 AATTTGAATGCAGTGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 47 1338 4829 4844 530299 AATTTGAATGCAGTGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 47 1338 4829 4844 530355 AATTTGAATGCAGTGG e-k-d(10)-k-e-k-e 72 1338 4830 4845 530103 GAATTTGAATGCAGTG e-k-k-d(10)-k-k-e 77 390 4830 4845 530150 GAATTTGAATGCAGTG e-e-k-d(10)-k-k-e 73 390 4830 4845 530200 GAATTTGAATGCAGTG e-d-k-d(10)-k-k-e 63 390 4830 4845 530250 GAATTTGAATGCAGTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 59 390 4830 4845 530300 GAATTTGAATGCAGTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 65 390 4842 4857 530435 AAGTACACATTGGAAT k-d(10)-k-e-k-e-e 62 1339 4843 4859 530057 TGAAGTACACATTGGAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 69 1340 4843 4858 530385 GAAGTACACATTGGAA e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1341 4844 4859 529005 TGAAGTACACATTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 64 392 4844 4859 530130 TGAAGTACACATTGGA e-k-k-d(10)-k-k-e 85 392 4844 4859 530180 TGAAGTACACATTGGA e-e-k-d(10)-k-k-e 82 392 4844 4859 530230 TGAAGTACACATTGGA e-d-k-d(10)-k-k-e 65 392 4844 4859 530280 TGAAGTACACATTGGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 75 392 4844 4859 530330 TGAAGTACACATTGGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 52 392 4852 4867 529006 TTACACTATGAAGTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1342 4929 4944 529007 AGTTAAAGTAGATACA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1343 4934 4949 529008 CTGGAAGTTAAAGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 30 397 4943 4958 529009 CGTTTATTTCTGGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1344 4957 4972 529010 CGGTTCCTATATAACG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1345 4958 4973 529011 ACGGTTCCTATATAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1346
Tabela 14
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ ID
NO: 2
Ljudsko Ljudsko ISIS BR. Sekvenca Hemija % SEQ početno zaustavno inhibicije ID mesto mesto NO 1359 1374 529012 GTCATCCCGAAGAGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1347 1386 1401 529013 CCCGAGTCCCTTCCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1348 1390 1405 529014 GCGCCCCGAGTCCCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1349 1412 1427 529015 CGAAGAACGAAACTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1350 1418 1433 529016 TTTCTCCGAAGAACGA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1351 1461 1476 529017 CGAGTGCGCCCTCGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1352 1548 1563 529018 GTGACAGTCGCTCCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1353 1549 1564 529019 CGTGACAGTCGCTCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1354 1590 1605 529020 GCGCTTTCCGACCCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1355 1790 1805 529021 GTACCGGTCTGTCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 23 1356 1794 1809 529022 AAGAGTACCGGTCTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 69 1357 1796 1811 529023 GAAAGAGTACCGGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 72 1358 1906 1921 529024 CTGGCTTGACGGGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 64 1359 1907 1922 529025 GCTGGCTTGACGGGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 73 1360 1966 1981 529026 CCGACTTTACCAGGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 78 1361 1968 1983 529027 GGCCGACTTTACCAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 92 1362 1972 1987 529028 TTCTGGCCGACTTTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1363 2031 2046 529029 CGTCCTATGCAATTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 24 1364 2039 2054 529030 GTTCATTCCGTCCTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1365 2198 2213 529031 GACGGTTTGAATCTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1366 2201 2216 529032 GGCGACGGTTTGAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1367 2204 2219 529033 TTGGGCGACGGTTTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1368 2207 2222 529034 AACTTGGGCGACGGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1369 2253 2268 529035 CGACCTGATATGGCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1370 2255 2270 529036 AACGACCTGATATGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1371 2257 2272 529037 ACAACGACCTGATATG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 1372 2338 2353 530406 ATACAGTAAGACCAGC k-d(10)-k-e-k-e-e 65 1373 2339 2355 530036 ACATACAGTAAGACCAG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1374 2339 2354 530356 CATACAGTAAGACCAG e-k-d(10)-k-e-k-e 65 1375 2340 2355 530104 ACATACAGTAAGACCA e-k-k-d(10)-k-k-e 67 1376 2340 2355 530151 ACATACAGTAAGACCA e-e-k-d(10)-k-k-e 64 1376 2340 2355 530201 ACATACAGTAAGACCA e-d-k-d(10)-k-k-e 42 1376 2340 2355 530251 ACATACAGTAAGACCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 58 1376 2340 2355 530301 ACATACAGTAAGACCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1376 2383 2398 530407 AAAATTTACAACCCAT k-d(10)-k-e-k-e-e 9 1377 2384 2400 530037 CAAAAATTTACAACCCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 42 1378 2384 2399 530357 AAAAATTTACAACCCA e-k-d(10)-k-e-k-e 34 1379 2385 2400 530105 CAAAAATTTACAACCC e-k-k-d(10)-k-k-e 40 1380 2385 2400 530152 CAAAAATTTACAACCC e-e-k-d(10)-k-k-e 33 1380 2385 2400 530202 CAAAAATTTACAACCC e-d-k-d(10)-k-k-e 10 1380 2385 2400 530252 CAAAAATTTACAACCC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 29 1380 2385 2400 530302 CAAAAATTTACAACCC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 14 1380 2408 2423 530408 AATGCTTTATCAGCAC k-d(10)-k-e-k-e-e 36 1381 2409 2425 530038 CCAATGCTTTATCAGCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 71 1382 2409 2424 530358 CAATGCTTTATCAGCA e-k-d(10)-k-e-k-e 46 1383 2410 2425 530106 CCAATGCTTTATCAGC e-k-k-d(10)-k-k-e 70 1384 2410 2425 530153 CCAATGCTTTATCAGC e-e-k-d(10)-k-k-e 50 1384 2410 2425 530203 CCAATGCTTTATCAGC e-d-k-d(10)-k-k-e 43 1384 2410 2425 530253 CCAATGCTTTATCAGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 33 1384 2410 2425 530303 CCAATGCTTTATCAGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 40 1384 2669 2684 530409 ACTAAAATCAAGGCTC k-d(10)-k-e-k-e-e 42 1385 2670 2686 530039 AGACTAAAATCAAGGCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1386 2670 2685 530359 GACTAAAATCAAGGCT e-k-d(10)-k-e-k-e 82 1387 2671 2686 530107 AGACTAAAATCAAGGC e-k-k-d(10)-k-k-e 77 1388 2671 2686 530154 AGACTAAAATCAAGGC e-e-k-d(10)-k-k-e 57 1388 2671 2686 530204 AGACTAAAATCAAGGC e-d-k-d(10)-k-k-e 28 1388 2671 2686 530254 AGACTAAAATCAAGGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 3 1388 2671 2686 530304 AGACTAAAATCAAGGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 22 1388 2703 2718 530429 AATGGTTCTTTGTGAT k-d(10)-k-e-k-e-e 60 1389 2704 2720 530065 CTAATGGTTCTTTGTGA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1390 2704 2719 530379 TAATGGTTCTTTGTGA e-k-d(10)-k-e-k-e 54 1391 2705 2720 530127 CTAATGGTTCTTTGTG e-k-k-d(10)-k-k-e 80 411 2705 2720 530174 CTAATGGTTCTTTGTG e-e-k-d(10)-k-k-e 69 411 2705 2720 530224 CTAATGGTTCTTTGTG e-d-k-d(10)-k-k-e 32 411 2705 2720 530274 CTAATGGTTCTTTGTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 38 411 2705 2720 530324 CTAATGGTTCTTTGTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 32 411 5000 5015 530410 CTGAAATTCCTTGGTC k-d(10)-k-e-k-e-e 53 1392 5001 5017 530040 AACTGAAATTCCTTGGT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 67 1393 5001 5016 530360 ACTGAAATTCCTTGGT e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1394 5002 5017 530108 AACTGAAATTCCTTGG e-k-k-d(10)-k-k-e 70 1395 5002 5017 530155 AACTGAAATTCCTTGG e-e-k-d(10)-k-k-e 53 1395 5002 5017 530205 AACTGAAATTCCTTGG e-d-k-d(10)-k-k-e 44 1395 5002 5017 530255 AACTGAAATTCCTTGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 33 1395 5002 5017 530305 AACTGAAATTCCTTGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 22 1395 5699 5714 530411 ACTCTTTCAGTGGTTT k-d(10)-k-e-k-e-e 91 1396 5700 5716 530041 GTACTCTTTCAGTGGTT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 89 1397 5700 5715 530361 TACTCTTTCAGTGGTT e-k-d(10)-k-e-k-e 88 1398 5701 5716 530109 GTACTCTTTCAGTGGT e-k-k-d(10)-k-k-e 89 1399 5701 5716 530156 GTACTCTTTCAGTGGT e-e-k-d(10)-k-k-e 91 1399 5701 5716 530206 GTACTCTTTCAGTGGT e-d-k-d(10)-k-k-e 89 1399 5701 5716 530256 GTACTCTTTCAGTGGT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 33 1399 5701 5716 530306 GTACTCTTTCAGTGGT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 83 1399 5883 5898 529038 CTACACTTTACGCTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1400 6474 6489 530436 AATTCATTCTTCCATA k-d(10)-k-e-k-e-e 49 1401 6475 6491 530066 GAAATTCATTCTTCCAT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 82 1402 6475 6490 530386 AAATTCATTCTTCCAT e-k-d(10)-k-e-k-e 53 1403 6476 6491 530131 GAAATTCATTCTTCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 97 413 6476 6491 530181 GAAATTCATTCTTCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 82 413 6476 6491 530231 GAAATTCATTCTTCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 75 413 6476 6491 530281 GAAATTCATTCTTCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 69 413 6476 6491 530331 GAAATTCATTCTTCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 53 413 6846 6861 529039 TTAAAGAGTTGCGGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1404 6847 6862 529040 ATTAAAGAGTTGCGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1405 8078 8093 530412 AGATTTACCTTCCTTA k-d(10)-k-e-k-e-e 50 1406 8079 8095 530042 GCAGATTTACCTTCCTT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 78 1407 8079 8094 530362 CAGATTTACCTTCCTT e-k-d(10)-k-e-k-e 76 1408 8080 8095 530110 GCAGATTTACCTTCCT e-k-k-d(10)-k-k-e 84 1409 8080 8095 530157 GCAGATTTACCTTCCT e-e-k-d(10)-k-k-e 69 1409 8080 8095 530207 GCAGATTTACCTTCCT e-d-k-d(10)-k-k-e 55 1409 8080 8095 530257 GCAGATTTACCTTCCT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 39 1409 8080 8095 530307 GCAGATTTACCTTCCT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 77 1409 9123 9138 530413 GCCCCTATGTATAAGC k-d(10)-k-e-k-e-e 73 1410 9124 9140 530043 CTGCCCCTATGTATAAG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 42 1411 9124 9139 530363 TGCCCCTATGTATAAG e-k-d(10)-k-e-k-e 25 1412 9125 9140 530111 CTGCCCCTATGTATAA e-k-k-d(10)-k-k-e 35 1413 9125 9140 530158 CTGCCCCTATGTATAA e-e-k-d(10)-k-k-e 36 1413 9125 9140 530208 CTGCCCCTATGTATAA e-d-k-d(10)-k-k-e 14 1413 9125 9140 530258 CTGCCCCTATGTATAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 5 1413 9125 9140 530308 CTGCCCCTATGTATAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 25 1413 9862 9877 530414 TTCTTCCTGAGACACA k-d(10)-k-e-k-e-e 61 1414 9863 9879 530044 GCTTCTTCCTGAGACAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 78 1415 9863 9878 530364 CTTCTTCCTGAGACAC e-k-d(10)-k-e-k-e 59 1416 9864 9879 530112 GCTTCTTCCTGAGACA e-k-k-d(10)-k-k-e 84 1417 9864 9879 530159 GCTTCTTCCTGAGACA e-e-k-d(10)-k-k-e 69 1417 9864 9879 530209 GCTTCTTCCTGAGACA e-d-k-d(10)-k-k-e 54 1417 9864 9879 530259 GCTTCTTCCTGAGACA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 57 1417 9864 9879 530309 GCTTCTTCCTGAGACA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 46 1417 9864 9879 530415 GCTTCTTCCTGAGACA k-d(10)-k-e-k-e-e 51 1417 9865 9881 530045 TGGCTTCTTCCTGAGAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1418 9865 9880 530365 GGCTTCTTCCTGAGAC e-k-d(10)-k-e-k-e 78 1419 9866 9881 530113 TGGCTTCTTCCTGAGA e-k-k-d(10)-k-k-e 60 1420 9866 9881 530160 TGGCTTCTTCCTGAGA e-e-k-d(10)-k-k-e 54 1420 9866 9881 530210 TGGCTTCTTCCTGAGA e-d-k-d(10)-k-k-e 28 1420 9866 9881 530260 TGGCTTCTTCCTGAGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 0 1420 9866 9881 530310 TGGCTTCTTCCTGAGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 26 1420 9873 9888 530416 CTCCTGTTGGCTTCTT k-d(10)-k-e-k-e-e 57 1421 9874 9890 530046 TCCTCCTGTTGGCTTCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 76 1422 9874 9889 530366 CCTCCTGTTGGCTTCT e-k-d(10)-k-e-k-e 75 1423 9874 9889 530417 CCTCCTGTTGGCTTCT k-d(10)-k-e-k-e-e 66 1423 9875 9891 530047 TTCCTCCTGTTGGCTTC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 75 1424 9875 9890 530114 TCCTCCTGTTGGCTTC e-k-k-d(10)-k-k-e 80 1425 9875 9890 530161 TCCTCCTGTTGGCTTC e-e-k-d(10)-k-k-e 81 1425 9875 9890 530211 TCCTCCTGTTGGCTTC e-d-k-d(10)-k-k-e 73 1425 9875 9890 530261 TCCTCCTGTTGGCTTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 78 1425 9875 9890 530311 TCCTCCTGTTGGCTTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 82 1425 9875 9890 530367 TCCTCCTGTTGGCTTC e-k-d(10)-k-e-k-e 80 1425 9876 9891 530115 TTCCTCCTGTTGGCTT e-k-k-d(10)-k-k-e 74 1426 9876 9891 530162 TTCCTCCTGTTGGCTT e-e-k-d(10)-k-k-e 68 1426 9876 9891 530212 TTCCTCCTGTTGGCTT e-d-k-d(10)-k-k-e 58 1426 9876 9891 530262 TTCCTCCTGTTGGCTT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 23 1426 9876 9891 530312 TTCCTCCTGTTGGCTT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 52 1426 9876 9891 530418 TTCCTCCTGTTGGCTT k-d(10)-k-e-k-e-e 59 1426 9877 9893 530048 GGTTCCTCCTGTTGGCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 82 1427 9877 9892 530368 GTTCCTCCTGTTGGCT e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1428 9878 9893 530116 GGTTCCTCCTGTTGGC e-k-k-d(10)-k-k-e 90 1429 9878 9893 530163 GGTTCCTCCTGTTGGC e-e-k-d(10)-k-k-e 79 1429 9878 9893 530213 GGTTCCTCCTGTTGGC e-d-k-d(10)-k-k-e 72 1429 9878 9893 530263 GGTTCCTCCTGTTGGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 73 1429 9878 9893 530313 GGTTCCTCCTGTTGGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 61 1429 9964 9979 529041 GTAATGTGCAGCAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1430 9991 10006 530711 ATGTGAGGGCACATTT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1431 10286 10301 529042 CCAAGCCGTTTATTTC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1432 10291 10306 529043 GGAAGCCAAGCCGTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1433 11261 11276 530413 GCCCCTATGTATAAGC k-d(10)-k-e-k-e-e 73 1410 11262 11278 530043 CTGCCCCTATGTATAAG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 42 1411 11262 11277 530363 TGCCCCTATGTATAAG e-k-d(10)-k-e-k-e 25 1412 11263 11278 530111 CTGCCCCTATGTATAA e-k-k-d(10)-k-k-e 35 1413 11263 11278 530158 CTGCCCCTATGTATAA e-e-k-d(10)-k-k-e 36 1413 11263 11278 530208 CTGCCCCTATGTATAA e-d-k-d(10)-k-k-e 14 1413 11263 11278 530258 CTGCCCCTATGTATAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 5 1413 11263 11278 530308 CTGCCCCTATGTATAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 25 1413 12345 12360 530414 TTCTTCCTGAGACACA k-d(10)-k-e-k-e-e 61 1414 12346 12362 530044 GCTTCTTCCTGAGACAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 78 1415 12346 12361 530364 CTTCTTCCTGAGACAC e-k-d(10)-k-e-k-e 59 1416 12347 12362 530112 GCTTCTTCCTGAGACA e-k-k-d(10)-k-k-e 84 1417 12347 12362 530159 GCTTCTTCCTGAGACA e-e-k-d(10)-k-k-e 69 1417 12347 12362 530209 GCTTCTTCCTGAGACA e-d-k-d(10)-k-k-e 54 1417 12347 12362 530259 GCTTCTTCCTGAGACA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 57 1417 12347 12362 530309 GCTTCTTCCTGAGACA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 46 1417 12347 12362 530415 GCTTCTTCCTGAGACA k-d(10)-k-e-k-e-e 51 1417 12348 12364 530045 TGGCTTCTTCCTGAGAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1418 12348 12363 530365 GGCTTCTTCCTGAGAC e-k-d(10)-k-e-k-e 78 1419 12349 12364 530113 TGGCTTCTTCCTGAGA e-k-k-d(10)-k-k-e 60 1420 12349 12364 530160 TGGCTTCTTCCTGAGA e-e-k-d(10)-k-k-e 54 1420 12349 12364 530210 TGGCTTCTTCCTGAGA e-d-k-d(10)-k-k-e 28 1420 12349 12364 530260 TGGCTTCTTCCTGAGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 0 1420 12349 12364 530310 TGGCTTCTTCCTGAGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 26 1420 12356 12371 530416 CTCCTGTTGGCTTCTT k-d(10)-k-e-k-e-e 57 1421 12357 12373 530046 TCCTCCTGTTGGCTTCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 76 1422 12357 12372 530366 CCTCCTGTTGGCTTCT e-k-d(10)-k-e-k-e 75 1423 12357 12372 530417 CCTCCTGTTGGCTTCT k-d(10)-k-e-k-e-e 66 1423 12358 12374 530047 TTCCTCCTGTTGGCTTC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 75 1424 12358 12373 530114 TCCTCCTGTTGGCTTC e-k-k-d(10)-k-k-e 80 1425 12358 12373 530161 TCCTCCTGTTGGCTTC e-e-k-d(10)-k-k-e 81 1425 12358 12373 530211 TCCTCCTGTTGGCTTC e-d-k-d(10)-k-k-e 73 1425 12358 12373 530261 TCCTCCTGTTGGCTTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 78 1425 12358 12373 530311 TCCTCCTGTTGGCTTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 82 1425 12358 12373 530367 TCCTCCTGTTGGCTTC e-k-d(10)-k-e-k-e 80 1425 12359 12374 530115 TTCCTCCTGTTGGCTT e-k-k-d(10)-k-k-e 74 1426 12359 12374 530162 TTCCTCCTGTTGGCTT e-e-k-d(10)-k-k-e 68 1426 12359 12374 530212 TTCCTCCTGTTGGCTT e-d-k-d(10)-k-k-e 58 1426 12359 12374 530262 TTCCTCCTGTTGGCTT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 23 1426 12359 12374 530312 TTCCTCCTGTTGGCTT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 52 1426 12359 12374 530418 TTCCTCCTGTTGGCTT k-d(10)-k-e-k-e-e 59 1426 12360 12376 530048 GGTTCCTCCTGTTGGCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 82 1427 12360 12375 530368 GTTCCTCCTGTTGGCT e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1428 12361 12376 530116 GGTTCCTCCTGTTGGC e-k-k-d(10)-k-k-e 90 1429 12361 12376 530163 GGTTCCTCCTGTTGGC e-e-k-d(10)-k-k-e 79 1429 12361 12376 530213 GGTTCCTCCTGTTGGC e-d-k-d(10)-k-k-e 72 1429 12361 12376 530263 GGTTCCTCCTGTTGGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 73 1429 12361 12376 530313 GGTTCCTCCTGTTGGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 61 1429 12586 12601 530710 TACAATTCCTGCCTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1434 15467 15482 530437 AGCTTTTCTATGAAAA k-d(10)-k-e-k-e-e 5 1435 15468 15484 530067 CAAGCTTTTCTATGAAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 53 1436 15468 15483 530387 AAGCTTTTCTATGAAA e-k-d(10)-k-e-k-e 24 1437 15469 15484 530132 CAAGCTTTTCTATGAA e-k-k-d(10)-k-k-e 74 423 15469 15484 530182 CAAGCTTTTCTATGAA e-e-k-d(10)-k-k-e 48 423 15469 15484 530232 CAAGCTTTTCTATGAA e-d-k-d(10)-k-k-e 21 423 15469 15484 530282 CAAGCTTTTCTATGAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 19 423 15469 15484 530332 CAAGCTTTTCTATGAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 20 423 16863 16878 530419 TAATTGTGTACTGGCA k-d(10)-k-e-k-e-e 75 1438 16864 16880 530049 TATAATTGTGTACTGGC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 88 1439 16864 16879 530369 ATAATTGTGTACTGGC e-k-d(10)-k-e-k-e 92 1440 16865 16880 530117 TATAATTGTGTACTGG e-k-k-d(10)-k-k-e 73 1441 16865 16880 530164 TATAATTGTGTACTGG e-e-k-d(10)-k-k-e 65 1441 16865 16880 530214 TATAATTGTGTACTGG e-d-k-d(10)-k-k-e 37 1441 16865 16880 530264 TATAATTGTGTACTGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 48 1441 16865 16880 530314 TATAATTGTGTACTGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 42 1441 17385 17400 530709 TGGAGTAACAGGAACT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1442 21456 21471 530720 AAAGTTTCCCAATAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 17 1443 22061 22076 529044 AGTCCTACCACGGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1444 24514 24529 529045 TGACGATGCTTGGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1445 24515 24530 529046 CTGACGATGCTTGGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1446 24579 24594 529047 TCACTTTCCCTATACG e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1447 25105 25120 530717 GTAGGTTGAGCAAGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 77 1448 26061 26076 530420 ACTTTAGCCCCTTCCA k-d(10)-k-e-k-e-e 44 1449 26062 26078 530050 CAACTTTAGCCCCTTCC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 64 1450 26062 26077 530370 AACTTTAGCCCCTTCC e-k-d(10)-k-e-k-e 55 1451 26063 26078 530118 CAACTTTAGCCCCTTC e-k-k-d(10)-k-k-e 58 1452 26063 26078 530165 CAACTTTAGCCCCTTC e-e-k-d(10)-k-k-e 38 1452 26063 26078 530215 CAACTTTAGCCCCTTC e-d-k-d(10)-k-k-e 29 1452 26063 26078 530265 CAACTTTAGCCCCTTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 3 1452 26063 26078 530315 CAACTTTAGCCCCTTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 30 1452 26767 26782 529048 AATTCATCGAGCTAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1453 37758 37773 529049 TGCCCCAATTAGGCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1454 37759 37774 529050 TTGCCCCAATTAGGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1455 41484 41499 530714 CCCTGTGGCTCCTTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1456 41760 41775 529051 TACTGTCCTCGAGACA e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1457 42754 42769 530719 AGGAAAAGGAAGAATG e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1458 42766 42781 529052 CGCATATGCCCTAGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 7 1459 42768 42783 529053 GCCGCATATGCCCTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1460 42769 42784 529054 GGCCGCATATGCCCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 51 1461 43072 43087 529055 CGGGTAAGTATACAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1462 43074 43089 529056 CACGGGTAAGTATACA e-e-e-d(10)-k-k-k 4 1463 43075 43090 529057 TCACGGGTAAGTATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1464 43077 43092 529058 GCTCACGGGTAAGTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1465 45633 45648 529059 GTATACAATGGCCTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 59 1466 46633 46648 529060 CGACCCAATCAGATGC e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1467 47430 47445 530708 GGATAAAATACAAAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1468 47617 47632 529061 GTTCCGAAAAAACCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 59 1469 47619 47634 529062 GGGTTCCGAAAAAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1470 47752 47767 530712 TGCAAACTTTTTCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1471 48092 48107 529063 ACCCGCTATCCACTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1472 48402 48417 530421 CACTTTCCATTCTAGT k-d(10)-k-e-k-e-e 20 1473 48403 48419 530051 CACACTTTCCATTCTAG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 48 1474 48403 48418 530371 ACACTTTCCATTCTAG e-k-d(10)-k-e-k-e 36 1475 48404 48419 530119 CACACTTTCCATTCTA e-k-k-d(10)-k-k-e 47 1476 48404 48419 530166 CACACTTTCCATTCTA e-e-k-d(10)-k-k-e 53 1476 48404 48419 530216 CACACTTTCCATTCTA e-d-k-d(10)-k-k-e 34 1476 48404 48419 530266 CACACTTTCCATTCTA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 31 1476 48404 48419 530316 CACACTTTCCATTCTA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 34 1476 48429 48444 529064 AGCCCCTATGGTTACC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1477 48567 48582 529065 GTCTAGAGGCCTATCC e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1478 48568 48583 529066 GGTCTAGAGGCCTATC e-e-e-d(10)-k-k-k 17 1479 49762 49777 530718 AGATGTTGGATGTCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1480 50692 50707 530423 AGATTCTCTACCACTT k-d(10)-k-e-k-e-e 70 1054 50693 50709 530053 GGAGATTCTCTACCACT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 84 1055 50693 50708 530373 GAGATTCTCTACCACT e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1056 50694 50709 530121 GGAGATTCTCTACCAC e-k-k-d(10)-k-k-e 77 53 50694 50709 530168 GGAGATTCTCTACCAC e-e-k-d(10)-k-k-e 75 53 50694 50709 530218 GGAGATTCTCTACCAC e-d-k-d(10)-k-k-e 61 53 50694 50709 530268 GGAGATTCTCTACCAC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 76 53 50694 50709 530318 GGAGATTCTCTACCAC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 73 53 50838 50853 529067 CCGCCTTAAGATCTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1481 51714 51729 529068 CCCTTACTCTCCGCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1482 51734 51749 529069 GGGAAGTGGTCCGACC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1483 51757 51772 529070 CCGCAAGTGAGCGAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 6 1484 51760 51775 529071 ATCCCGCAAGTGAGCG e-e-e-d(10)-k-k-k 11 1485 51763 51778 529072 GAAATCCCGCAAGTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1486 51905 51920 528400 CCGCCAGCTCACTCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 57 66 51906 51921 528401 CCCGCCAGCTCACTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1059 51907 51922 528402 CCCCGCCAGCTCACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1060 51910 51925 528403 AAGCCCCGCCAGCTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 72 1060 51911 51926 528404 AAAGCCCCGCCAGCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1062 51912 51927 528405 AAAAGCCCCGCCAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1063 51913 51928 528406 CAAAAGCCCCGCCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 29 1064 51914 51929 528407 ACAAAAGCCCCGCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1065 51916 51931 528408 TGACAAAAGCCCCGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1066 51917 51932 528409 CTGACAAAAGCCCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1067 51918 51933 528410 GCTGACAAAAGCCCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1068 51919 51934 528411 CGCTGACAAAAGCCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1069 51920 51935 528412 TCGCTGACAAAAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1070 51921 51936 528413 ATCGCTGACAAAAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1071 51922 51937 528414 CATCGCTGACAAAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1072 51924 51939 528415 TCCATCGCTGACAAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 11 1073 51925 51940 528416 CTCCATCGCTGACAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1074 51926 51941 528417 ACTCCATCGCTGACAA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1075 51927 51942 528418 TACTCCATCGCTGACA e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1076 51928 51943 528419 GTACTCCATCGCTGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1077 51929 51944 528420 CGTACTCCATCGCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 35 1078 51943 51958 528421 GAGAGTTTTCTGCACG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1079 51945 51960 528422 GTGAGAGTTTTCTGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1080 51964 51979 528423 GTCAGCCAGCTCCTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1081 51975 51990 528424 CGCCTCTTCCAGTCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1082 51977 51992 528425 GCCGCCTCTTCCAGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1083 51978 51993 528426 TGCCGCCTCTTCCAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1084 51983 51998 528427 TCTGTTGCCGCCTCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1085 51984 51999 528428 ATCTGTTGCCGCCTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1086 51985 52000 528429 AATCTGTTGCCGCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 23 1087 51986 52001 528430 CAATCTGTTGCCGCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1088 51987 52002 528431 GCAATCTGTTGCCGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 48 1089 51988 52003 528432 GGCAATCTGTTGCCGC e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1090 51989 52004 528433 AGGCAATCTGTTGCCG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1091 51990 52005 528434 CAGGCAATCTGTTGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1092 51991 52006 528435 GCAGGCAATCTGTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1093 51995 52010 528436 CAATGCAGGCAATCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1094 51996 52011 528437 CCAATGCAGGCAATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1095 51997 52012 528438 TCCAATGCAGGCAATC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1096 51998 52013 528439 CTCCAATGCAGGCAAT e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1097 51999 52014 528440 CCTCCAATGCAGGCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1098 52016 52031 528441 GGCAGATGTTGGGCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1099 52017 52032 528442 AGGCAGATGTTGGGCG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1100 52018 52033 528443 TAGGCAGATGTTGGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 1 1101 52019 52034 528444 CTAGGCAGATGTTGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1102 52020 52035 528445 TCTAGGCAGATGTTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 7 1103 52021 52036 528446 ATCTAGGCAGATGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 3 1104 52023 52038 528447 CGATCTAGGCAGATGT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 72 52024 52039 528448 CCGATCTAGGCAGATG e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1105 52026 52041 528449 AGCCGATCTAGGCAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 4 1106 52027 52042 528450 TAGCCGATCTAGGCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 11 1107 52028 52043 528451 CTAGCCGATCTAGGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1108 52029 52044 528452 TCTAGCCGATCTAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1109 52030 52045 528453 TTCTAGCCGATCTAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 24 1110 52031 52046 528454 TTTCTAGCCGATCTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 29 1111 52032 52047 528455 TTTTCTAGCCGATCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1112 52033 52048 528456 GTTTTCTAGCCGATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1113 52035 52050 528457 CAGTTTTCTAGCCGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 50 1114 52036 52051 528458 CCAGTTTTCTAGCCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 70 1115 52083 52098 529073 TCAATCTAGCTTTCGA e-e-e-d(10)-k-k-k 33 1487 52084 52099 529074 TTCAATCTAGCTTTCG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1488 52119 52134 529075 GTACCAATTCTGTGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 33 1489 55441 55456 528462 GATTCTGCTAATGACG e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1119 55442 55457 528463 AGATTCTGCTAATGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 38 1120 55446 55461 528464 GTTGAGATTCTGCTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1121 55447 55462 528465 AGTTGAGATTCTGCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 48 1122 55454 55469 528466 GGTCTGAAGTTGAGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1123 55456 55471 528467 CGGGTCTGAAGTTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1124 55457 55472 528468 ACGGGTCTGAAGTTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1125 55458 55473 528469 GACGGGTCTGAAGTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1126 55459 55474 528470 TGACGGGTCTGAAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1127 55460 55475 528471 TTGACGGGTCTGAAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1128 55461 55476 528472 GTTGACGGGTCTGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1129 55462 55477 528473 TGTTGACGGGTCTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1130 55463 55478 528474 TTGTTGACGGGTCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 55 1131 55464 55479 528475 TTTGTTGACGGGTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 63 1132 55465 55480 528476 ATTTGTTGACGGGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1133 56208 56223 529076 GTAACACCTCACCCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1490 58396 58411 530715 TCTGCCACCCAGGTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1491 59836 59851 529077 TAAATTTCCGGGATCT e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1492 64187 64202 529078 CCGGTCCCTTGTAAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1493 64289 64304 529079 GCCAACTCTAGGCGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1494 64551 64566 529080 CGCAAGAGATCCCGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1495 64552 64567 529081 TCGCAAGAGATCCCGG e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1496 64959 64974 529082 TGATCACCTCGACTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1497 66136 66151 530425 GCCCTTGCCAGCCATG k-d(10)-k-e-k-e-e 73 1134 66137 66153 530054 AAGCCCTTGCCAGCCAT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 75 1135 66137 66152 530375 AGCCCTTGCCAGCCAT e-k-d(10)-k-e-k-e 77 1136 66138 66153 530123 AAGCCCTTGCCAGCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 86 144 66138 66153 530170 AAGCCCTTGCCAGCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 87 144 66138 66153 530220 AAGCCCTTGCCAGCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 74 144 66138 66153 530270 AAGCCCTTGCCAGCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 87 144 66138 66153 530320 AAGCCCTTGCCAGCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 83 144 66183 66198 530426 TTTTTCACAAGGTCAA k-d(10)-k-e-k-e-e 55 1137 66184 66200 530059 ACTTTTTCACAAGGTCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1138 66184 66199 530376 CTTTTTCACAAGGTCA e-k-d(10)-k-e-k-e 77 1139 66185 66200 530124 ACTTTTTCACAAGGTC e-k-k-d(10)-k-k-e 79 153 66185 66200 530171 ACTTTTTCACAAGGTC e-e-k-d(10)-k-k-e 69 153 66185 66200 530221 ACTTTTTCACAAGGTC e-d-k-d(10)-k-k-e 64 153 66185 66200 530271 ACTTTTTCACAAGGTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 73 153 66185 66200 530321 ACTTTTTCACAAGGTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 153 66875 66890 529083 GCCACCCTAGTGTTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1498 67066 67081 530427 ATGATCTTATAGCCCA k-d(10)-k-e-k-e-e 43 931 67067 67083 530060 CCATGATCTTATAGCCC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 77 1140 67067 67082 530377 CATGATCTTATAGCCC e-k-d(10)-k-e-k-e 66 932 67068 67083 530125 CCATGATCTTATAGCC e-k-k-d(10)-k-k-e 65 175 67068 67083 530172 CCATGATCTTATAGCC e-e-k-d(10)-k-k-e 59 175 67068 67083 530222 CCATGATCTTATAGCC e-d-k-d(10)-k-k-e 48 175 67068 67083 530272 CCATGATCTTATAGCC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 63 175 67068 67083 530322 CCATGATCTTATAGCC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 45 175 67270 67285 530716 TTTGCCTATCTATCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 11 1499 67346 67361 529084 CGGTCACCCCAACAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 33 1500 69470 69485 529085 AAGGGCGATGGTAATG e-e-e-d(10)-k-k-k 4 1501 71614 71629 530422 GTACAATTGCTTCAAC k-d(10)-k-e-k-e-e 46 1502 71615 71631 530052 CAGTACAATTGCTTCAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 51 1503 71615 71630 530372 AGTACAATTGCTTCAA e-k-d(10)-k-e-k-e 51 1504 71616 71631 530120 CAGTACAATTGCTTCA e-k-k-d(10)-k-k-e 78 1505 71616 71631 530167 CAGTACAATTGCTTCA e-e-k-d(10)-k-k-e 69 1505 71616 71631 530217 CAGTACAATTGCTTCA e-d-k-d(10)-k-k-e 47 1505 71616 71631 530267 CAGTACAATTGCTTCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 64 1505 71616 71631 530317 CAGTACAATTGCTTCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 60 1505 72138 72153 530713 CTCATGCCAAGATTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1506 72299 72314 529086 AAGCCACTTACGGTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1507 72874 72889 529087 CGTCTATTTCCAGTGT e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1508 73648 73663 529088 ACTAGTTCAGTTGTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1509 73866 73881 530428 TAGCAGAAGTAGGAGA k-d(10)-k-e-k-e-e 49 1141 73867 73883 530061 GATAGCAGAAGTAGGAG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 49 1142 73867 73882 530378 ATAGCAGAAGTAGGAG e-k-d(10)-k-e-k-e 48 1143 73868 73883 530126 GATAGCAGAAGTAGGA e-k-k-d(10)-k-k-e 70 223 73868 73883 530173 GATAGCAGAAGTAGGA e-e-k-d(10)-k-k-e 62 223 73868 73883 530223 GATAGCAGAAGTAGGA e-d-k-d(10)-k-k-e 44 223 73868 73883 530273 GATAGCAGAAGTAGGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 63 223 73868 73883 530323 GATAGCAGAAGTAGGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 37 223 74199 74214 530513 TTGGATGTCAGCAAGG k-d(10)-k-e-k-e-e 88 1047 74200 74215 530507 TTTGGATGTCAGCAAG e-k-d(10)-k-e-k-e 86 1144 74200 74215 530514 TTTGGATGTCAGCAAG k-d(10)-k-e-k-e-e 80 1144 74201 74216 530430 ATTTGGATGTCAGCAA k-d(10)-k-e-k-e-e 87 1145 74201 74216 530468 ATTTGGATGTCAGCAA e-k-k-d(10)-k-k-e 81 1145 74201 74216 530476 ATTTGGATGTCAGCAA e-e-k-d(10)-k-k-e 82 1145 74201 74216 530484 ATTTGGATGTCAGCAA e-d-k-d(10)-k-k-e 74 1145 74201 74216 530492 ATTTGGATGTCAGCAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 83 1145 74201 74216 530500 ATTTGGATGTCAGCAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1145 74201 74216 530508 ATTTGGATGTCAGCAA e-k-d(10)-k-e-k-e 83 1145 74202 74218 530062 CTATTTGGATGTCAGCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 94 1146 74202 74217 530380 TATTTGGATGTCAGCA e-k-d(10)-k-e-k-e 94 1147 74202 74217 530469 TATTTGGATGTCAGCA e-k-k-d(10)-k-k-e 91 1147 74202 74217 530477 TATTTGGATGTCAGCA e-e-k-d(10)-k-k-e 87 1147 74202 74217 530485 TATTTGGATGTCAGCA e-d-k-d(10)-k-k-e 87 1147 74202 74217 530493 TATTTGGATGTCAGCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 81 1147 74202 74217 530501 TATTTGGATGTCAGCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 74 1147 74202 74217 530515 TATTTGGATGTCAGCA k-d(10)-k-e-k-e-e 87 1147 74203 74218 481464 CTATTTGGATGTCAGC k-k-k-d(10)-k-k-k 93 245 74203 74218 518349 CTATTTGGATGTCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 245 74203 74218 519637 CTATTTGGATGTCAGC e-k-k-d(10)-k-k-e 96 245 74203 74218 530175 CTATTTGGATGTCAGC e-e-k-d(10)-k-k-e 93 245 74203 74218 530225 CTATTTGGATGTCAGC e-d-k-d(10)-k-k-e 85 245 74203 74218 530275 CTATTTGGATGTCAGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 91 245 74203 74218 530325 CTATTTGGATGTCAGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 91 245 74204 74219 530470 TCTATTTGGATGTCAG e-k-k-d(10)-k-k-e 91 1148 74204 74219 530478 TCTATTTGGATGTCAG e-e-k-d(10)-k-k-e 87 1148 74204 74219 530486 TCTATTTGGATGTCAG e-d-k-d(10)-k-k-e 84 1148 74204 74219 530494 TCTATTTGGATGTCAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 60 1148 74204 74219 530502 TCTATTTGGATGTCAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 64 1148 74204 74219 530509 TCTATTTGGATGTCAG e-k-d(10)-k-e-k-e 80 1148 74205 74220 530471 TTCTATTTGGATGTCA e-k-k-d(10)-k-k-e 83 1149 74205 74220 530479 TTCTATTTGGATGTCA e-e-k-d(10)-k-k-e 74 1149 74205 74220 530487 TTCTATTTGGATGTCA e-d-k-d(10)-k-k-e 71 1149 74205 74220 530495 TTCTATTTGGATGTCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 68 1149 74205 74220 530503 TTCTATTTGGATGTCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 53 1149 74646 74661 530431 CACCAAGGAGGCTGTT k-d(10)-k-e-k-e-e 44 1150 74647 74663 530055 AGCACCAAGGAGGCTGT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 45 1151 74647 74662 530381 GCACCAAGGAGGCTGT e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1152 74648 74663 530128 AGCACCAAGGAGGCTG e-k-k-d(10)-k-k-e 52 257 74648 74663 530176 AGCACCAAGGAGGCTG e-e-k-d(10)-k-k-e 66 257 74648 74663 530226 AGCACCAAGGAGGCTG e-d-k-d(10)-k-k-e 51 257 74648 74663 530276 AGCACCAAGGAGGCTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 70 257 74648 74663 530326 AGCACCAAGGAGGCTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 52 257 74714 74729 528860 GGTTTGACCTGAAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1153 74715 74730 528861 GGGTTTGACCTGAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1154 74716 74731 528862 AGGGTTTGACCTGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1155 74717 74732 528863 AAGGGTTTGACCTGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 43 1156 74718 74733 528864 TAAGGGTTTGACCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 50 1157 74719 74734 528865 TTAAGGGTTTGACCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1158 74734 74749 528866 GCAGCTTCAGATGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 60 1159 74735 74750 528867 TGCAGCTTCAGATGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1160 74770 74785 530388 CTTAAACCTTCCTATT k-d(10)-k-e-k-e-e 14 1161 74771 74786 530338 CCTTAAACCTTCCTAT e-k-d(10)-k-e-k-e 47 1162 74772 74787 530086 TCCTTAAACCTTCCTA e-k-k-d(10)-k-k-e 58 273 74772 74787 530133 TCCTTAAACCTTCCTA e-e-k-d(10)-k-k-e 53 273 74772 74787 530183 TCCTTAAACCTTCCTA e-d-k-d(10)-k-k-e 52 273 74772 74787 530233 TCCTTAAACCTTCCTA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 29 273 74772 74787 530283 TCCTTAAACCTTCCTA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 32 273 74777 74792 528868 GATTCTCCTTAAACCT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1163 74778 74793 530389 AGATTCTCCTTAAACC k-d(10)-k-e-k-e-e 44 1164 74779 74794 530339 TAGATTCTCCTTAAAC e-k-d(10)-k-e-k-e 41 1165 74780 74795 530087 TTAGATTCTCCTTAAA e-k-k-d(10)-k-k-e 43 1166 74780 74795 530134 TTAGATTCTCCTTAAA e-e-k-d(10)-k-k-e 28 1166 74780 74795 530184 TTAGATTCTCCTTAAA e-d-k-d(10)-k-k-e 13 1166 74780 74795 530234 TTAGATTCTCCTTAAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 15 1166 74780 74795 530284 TTAGATTCTCCTTAAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 14 1166 74782 74797 530390 GCTTAGATTCTCCTTA k-d(10)-k-e-k-e-e 83 1167 74783 74798 530340 TGCTTAGATTCTCCTT e-k-d(10)-k-e-k-e 89 1168 74784 74799 528869 ATGCTTAGATTCTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 83 1169 74784 74799 530088 ATGCTTAGATTCTCCT e-k-k-d(10)-k-k-e 90 1169 74784 74799 530135 ATGCTTAGATTCTCCT e-e-k-d(10)-k-k-e 91 1169 74784 74799 530185 ATGCTTAGATTCTCCT e-d-k-d(10)-k-k-e 85 1169 74784 74799 530235 ATGCTTAGATTCTCCT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 28 1169 74784 74799 530285 ATGCTTAGATTCTCCT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 86 1169 74784 74799 530391 ATGCTTAGATTCTCCT k-d(10)-k-e-k-e-e 79 1169 74785 74801 530021 AAATGCTTAGATTCTCC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 87 1170 74785 74800 530341 AATGCTTAGATTCTCC e-k-d(10)-k-e-k-e 88 1171 74786 74801 530089 AAATGCTTAGATTCTC e-k-k-d(10)-k-k-e 71 1172 74786 74801 530136 AAATGCTTAGATTCTC e-e-k-d(10)-k-k-e 66 1172 74786 74801 530186 AAATGCTTAGATTCTC e-d-k-d(10)-k-k-e 51 1172 74786 74801 530236 AAATGCTTAGATTCTC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 74 1172 74786 74801 530286 AAATGCTTAGATTCTC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1172 74869 74884 528870 GTAAGCACCCTCTGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 26 1173 74871 74886 528871 TTGTAAGCACCCTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1174 74873 74888 528872 GGTTGTAAGCACCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1175 74874 74889 528873 AGGTTGTAAGCACCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1176 74875 74890 528874 AAGGTTGTAAGCACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1177 74877 74892 528875 TCAAGGTTGTAAGCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1178 74878 74893 528876 GTCAAGGTTGTAAGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1179 74879 74894 528877 AGTCAAGGTTGTAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 28 1180 74881 74896 528878 GGAGTCAAGGTTGTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 6 1181 74882 74897 528879 GGGAGTCAAGGTTGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1182 74901 74916 530392 GATCAAGTCCAGGGAG k-d(10)-k-e-k-e-e 47 1183 74902 74918 530022 CAGATCAAGTCCAGGGA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 80 1184 74902 74917 530342 AGATCAAGTCCAGGGA e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1185 74902 74917 530393 AGATCAAGTCCAGGGA k-d(10)-k-e-k-e-e 46 1185 74903 74919 530023 GCAGATCAAGTCCAGGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1186 74903 74918 530090 CAGATCAAGTCCAGGG e-k-k-d(10)-k-k-e 78 1187 74903 74918 530137 CAGATCAAGTCCAGGG e-e-k-d(10)-k-k-e 76 1187 74903 74918 530187 CAGATCAAGTCCAGGG e-d-k-d(10)-k-k-e 68 1187 74903 74918 530237 CAGATCAAGTCCAGGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 36 1187 74903 74918 530287 CAGATCAAGTCCAGGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 56 1187 74903 74918 530343 CAGATCAAGTCCAGGG e-k-d(10)-k-e-k-e 68 1187 74903 74918 530394 CAGATCAAGTCCAGGG k-d(10)-k-e-k-e-e 49 1187 74904 74919 518343 GCAGATCAAGTCCAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 5 1188 74904 74920 530024 AGCAGATCAAGTCCAGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 79 1189 74904 74919 530091 GCAGATCAAGTCCAGG e-k-k-d(10)-k-k-e 81 1188 74904 74919 530138 GCAGATCAAGTCCAGG e-e-k-d(10)-k-k-e 81 1188 74904 74919 530188 GCAGATCAAGTCCAGG e-d-k-d(10)-k-k-e 78 1188 74904 74919 530238 GCAGATCAAGTCCAGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 29 1188 74904 74919 530288 GCAGATCAAGTCCAGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 69 1188 74904 74919 530344 GCAGATCAAGTCCAGG e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1188 74905 74920 530092 AGCAGATCAAGTCCAG e-k-k-d(10)-k-k-e 85 1190 74905 74920 530139 AGCAGATCAAGTCCAG e-e-k-d(10)-k-k-e 79 1190 74905 74920 530189 AGCAGATCAAGTCCAG e-d-k-d(10)-k-k-e 77 1190 74905 74920 530239 AGCAGATCAAGTCCAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 61 1190 74905 74920 530289 AGCAGATCAAGTCCAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 75 1190 74907 74922 528880 ACAGCAGATCAAGTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1191 74908 74923 528881 AACAGCAGATCAAGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1192 74924 74939 528882 ACAACCTAGCCTCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1193 74925 74940 528883 AACAACCTAGCCTCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1194 74927 74942 528884 GAAACAACCTAGCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1195 74928 74943 528885 AGAAACAACCTAGCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1196 74929 74944 528886 CAGAAACAACCTAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1197 74942 74957 528887 GATAAGGCACCCACAG e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1198 74943 74958 528888 TGATAAGGCACCCACA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1199 74944 74959 528889 CTGATAAGGCACCCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1200 74946 74961 528890 CCCTGATAAGGCACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1201 74947 74962 528891 GCCCTGATAAGGCACC e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1202 74952 74967 528892 TCCCAGCCCTGATAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1203 74954 74969 528893 TATCCCAGCCCTGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1204 74957 74972 528894 AAGTATCCCAGCCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1205 74958 74973 528895 GAAGTATCCCAGCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1206 74959 74974 528896 AGAAGTATCCCAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1207 74960 74975 528897 CAGAAGTATCCCAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1208 75079 75094 528898 TGAGACCAGGATTCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1209 75083 75098 528899 GTCCTGAGACCAGGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 1210 75164 75179 528900 AGCTCAACCAGACACG e-e-e-d(10)-k-k-k 54 311 75166 75181 528901 TGAGCTCAACCAGACA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1211 75171 75186 528902 TTCCCTGAGCTCAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1212 75179 75194 528903 GAACCATATTCCCTGA e-e-e-d(10)-k-k-k 30 313 75182 75197 528904 TAAGAACCATATTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1213 75209 75224 518344 GCCACTGGATATCACC e-e-e-d(10)-k-k-k 89 317 75254 75269 528905 TAAGCCTTTGCCCTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 64 1214 75255 75270 528906 GTAAGCCTTTGCCCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1215 75256 75271 528907 AGTAAGCCTTTGCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1216 75257 75272 528908 CAGTAAGCCTTTGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1217 75259 75274 528909 ATCAGTAAGCCTTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1218 75260 75275 528910 TATCAGTAAGCCTTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1219 75264 75279 528911 AGTTTATCAGTAAGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1220 75270 75285 528912 GACTCAAGTTTATCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 37 1221 75272 75287 528913 CAGACTCAAGTTTATC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1222 75273 75288 528914 GCAGACTCAAGTTTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1223 75274 75289 528915 GGCAGACTCAAGTTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 1 1224 75275 75290 528916 GGGCAGACTCAAGTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1225 75276 75291 528917 AGGGCAGACTCAAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 9 1226 75278 75293 528918 CGAGGGCAGACTCAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1227 75280 75295 528919 TACGAGGGCAGACTCA e-e-e-d(10)-k-k-k 20 324 75281 75296 528920 ATACGAGGGCAGACTC e-e-e-d(10)-k-k-k 14 1228 75282 75297 528921 CATACGAGGGCAGACT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1229 75283 75298 528922 TCATACGAGGGCAGAC e-e-e-d(10)-k-k-k 8 1230 75285 75300 528923 CCTCATACGAGGGCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1231 75286 75301 528924 CCCTCATACGAGGGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1232 75287 75302 528925 ACCCTCATACGAGGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1233 75412 75427 528926 TACGCACAGGAGAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1233 75413 75428 528927 ATACGCACAGGAGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1234 75414 75429 528928 CATACGCACAGGAGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 6 1235 75415 75430 528929 CCATACGCACAGGAGA e-e-e-d(10)-k-k-k 4 1236 75416 75431 528930 CCCATACGCACAGGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1237 75417 75432 528931 TCCCATACGCACAGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1238 75418 75433 528932 TTCCCATACGCACAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1239 75419 75434 528933 GTTCCCATACGCACAG e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1240 75420 75435 528934 TGTTCCCATACGCACA e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1241 75421 75436 528935 GTGTTCCCATACGCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 20 1242 75421 75436 530395 GTGTTCCCATACGCAC k-d(10)-k-e-k-e-e 71 1242 75422 75437 528936 GGTGTTCCCATACGCA e-e-e-d(10)-k-k-k 71 1243 75422 75438 530025 AGGTGTTCCCATACGCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 90 1244 75422 75437 530345 GGTGTTCCCATACGCA e-k-d(10)-k-e-k-e 93 1243 75422 75437 530396 GGTGTTCCCATACGCA k-d(10)-k-e-k-e-e 71 1243 75423 75438 528937 AGGTGTTCCCATACGC e-e-e-d(10)-k-k-k 73 1245 75423 75439 530026 TAGGTGTTCCCATACGC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 87 1246 75423 75438 530093 AGGTGTTCCCATACGC e-k-k-d(10)-k-k-e 95 1245 75423 75438 530140 AGGTGTTCCCATACGC e-e-k-d(10)-k-k-e 89 1245 75423 75438 530190 AGGTGTTCCCATACGC e-d-k-d(10)-k-k-e 82 1245 75423 75438 530240 AGGTGTTCCCATACGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 50 1245 75423 75438 530290 AGGTGTTCCCATACGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 69 1245 75423 75438 530346 AGGTGTTCCCATACGC e-k-d(10)-k-e-k-e 89 1245 75424 75439 528938 TAGGTGTTCCCATACG e-e-e-d(10)-k-k-k 72 336 75424 75439 530094 TAGGTGTTCCCATACG e-k-k-d(10)-k-k-e 88 336 75424 75439 530141 TAGGTGTTCCCATACG e-e-k-d(10)-k-k-e 80 336 75424 75439 530191 TAGGTGTTCCCATACG e-d-k-d(10)-k-k-e 74 336 75424 75439 530241 TAGGTGTTCCCATACG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 53 336 75424 75439 530291 TAGGTGTTCCCATACG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 68 336 75425 75440 528939 CTAGGTGTTCCCATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1247 75426 75441 528940 GCTAGGTGTTCCCATA e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1248 75427 75442 528941 TGCTAGGTGTTCCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1249 75429 75444 528942 CGTGCTAGGTGTTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 77 1250 75491 75506 528943 CAAGGTGGTTTTGAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1251 75492 75507 528944 GCAAGGTGGTTTTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 28 344 75507 75522 528945 CTCTGATCAGCTGAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 74 1252 75508 75523 528946 ACTCTGATCAGCTGAG e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1253 75549 75564 528947 GAGACCAGCTAATTTG e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1254 75582 75597 528948 CATCTTAGAGAAGGTC e-e-e-d(10)-k-k-k 59 1255 75622 75637 528949 TCAACTGTCTCCAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 67 1256 75622 75637 530397 TCAACTGTCTCCAGGC k-d(10)-k-e-k-e-e 60 1256 75623 75638 528950 ATCAACTGTCTCCAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1257 75623 75639 530027 CATCAACTGTCTCCAGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 56 1258 75623 75638 530347 ATCAACTGTCTCCAGG e-k-d(10)-k-e-k-e 49 1257 75624 75639 530095 CATCAACTGTCTCCAG e-k-k-d(10)-k-k-e 40 354 75624 75639 530142 CATCAACTGTCTCCAG e-e-k-d(10)-k-k-e 43 354 75624 75639 530192 CATCAACTGTCTCCAG e-d-k-d(10)-k-k-e 42 354 75624 75639 530242 CATCAACTGTCTCCAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 0 354 75624 75639 530292 CATCAACTGTCTCCAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 36 354 75624 75639 530398 CATCAACTGTCTCCAG k-d(10)-k-e-k-e-e 28 354 75625 75641 530028 CACATCAACTGTCTCCA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 57 1259 75625 75640 530348 ACATCAACTGTCTCCA e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1260 75626 75641 530096 CACATCAACTGTCTCC e-k-k-d(10)-k-k-e 72 356 75626 75641 530143 CACATCAACTGTCTCC e-e-k-d(10)-k-k-e 74 356 75626 75641 530193 CACATCAACTGTCTCC e-d-k-d(10)-k-k-e 62 356 75626 75641 530243 CACATCAACTGTCTCC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 34 356 75626 75641 530293 CACATCAACTGTCTCC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 59 356 75628 75643 528951 GACACATCAACTGTCT e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1261 75662 75677 528952 GAAGAGTGTTGCTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 57 1262 75664 75679 528953 CTGAAGAGTGTTGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1263 75666 75681 528954 TACTGAAGAGTGTTGC e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1264 75672 75687 530510 ATTATGTACTGAAGAG k-d(10)-k-e-k-e-e 53 1265 75673 75688 530504 TATTATGTACTGAAGA e-k-d(10)-k-e-k-e 25 1266 75673 75688 530511 TATTATGTACTGAAGA k-d(10)-k-e-k-e-e 31 1266 75674 75689 530432 TTATTATGTACTGAAG k-d(10)-k-e-k-e-e 15 1267 75674 75689 530463 TTATTATGTACTGAAG e-k-k-d(10)-k-k-e 20 1267 75674 75689 530472 TTATTATGTACTGAAG e-e-k-d(10)-k-k-e 17 1267 75674 75689 530480 TTATTATGTACTGAAG e-d-k-d(10)-k-k-e 4 1267 75674 75689 530488 TTATTATGTACTGAAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 13 1267 75674 75689 530496 TTATTATGTACTGAAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 0 1267 75674 75689 530505 TTATTATGTACTGAAG e-k-d(10)-k-e-k-e 37 1267 75675 75691 530063 GCTTATTATGTACTGAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1268 75675 75690 530382 CTTATTATGTACTGAA e-k-d(10)-k-e-k-e 17 1269 75675 75690 530465 CTTATTATGTACTGAA e-k-k-d(10)-k-k-e 63 1269 75675 75690 530473 CTTATTATGTACTGAA e-e-k-d(10)-k-k-e 45 1269 75675 75690 530481 CTTATTATGTACTGAA e-d-k-d(10)-k-k-e 14 1269 75675 75690 530489 CTTATTATGTACTGAA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 13 1269 75675 75690 530497 CTTATTATGTACTGAA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 7 1269 75675 75690 530512 CTTATTATGTACTGAA k-d(10)-k-e-k-e-e 21 1269 75676 75691 519638 GCTTATTATGTACTGA e-k-k-d(10)-k-k-e 86 362 75676 75691 530177 GCTTATTATGTACTGA e-e-k-d(10)-k-k-e 71 362 75676 75691 530227 GCTTATTATGTACTGA e-d-k-d(10)-k-k-e 51 362 75676 75691 530277 GCTTATTATGTACTGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 70 362 75676 75691 530327 GCTTATTATGTACTGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 61 362 75677 75692 530466 AGCTTATTATGTACTG e-k-k-d(10)-k-k-e 82 1270 75677 75692 530474 AGCTTATTATGTACTG e-e-k-d(10)-k-k-e 62 1270 75677 75692 530482 AGCTTATTATGTACTG e-d-k-d(10)-k-k-e 53 1270 75677 75692 530490 AGCTTATTATGTACTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 42 1270 75677 75692 530498 AGCTTATTATGTACTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 45 1270 75677 75692 530506 AGCTTATTATGTACTG e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1270 75678 75693 530467 AAGCTTATTATGTACT e-k-k-d(10)-k-k-e 50 1271 75678 75693 530475 AAGCTTATTATGTACT e-e-k-d(10)-k-k-e 26 1271 75678 75693 530483 AAGCTTATTATGTACT e-d-k-d(10)-k-k-e 19 1271 75678 75693 530491 AAGCTTATTATGTACT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 13 1271 75678 75693 530499 AAGCTTATTATGTACT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 15 1271 75679 75694 528955 TAAGCTTATTATGTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1272 75686 75701 528956 TATCAGTTAAGCTTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1273 75689 75704 528957 GTTTATCAGTTAAGCT e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1274 75726 75741 530433 CAATGGTAAGCCCAAG k-d(10)-k-e-k-e-e 62 1275 75727 75742 528958 CCAATGGTAAGCCCAA e-e-e-d(10)-k-k-k 66 1276 75727 75743 530056 CCCAATGGTAAGCCCAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 73 1277 75727 75742 530383 CCAATGGTAAGCCCAA e-k-d(10)-k-e-k-e 64 1276 75728 75743 518345 CCCAATGGTAAGCCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 80 366 75728 75743 519636 CCCAATGGTAAGCCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 90 366 75728 75743 530178 CCCAATGGTAAGCCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 86 366 75728 75743 530228 CCCAATGGTAAGCCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 77 366 75728 75743 530278 CCCAATGGTAAGCCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 86 366 75728 75743 530328 CCCAATGGTAAGCCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 80 366 75729 75744 528959 ACCCAATGGTAAGCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 73 1277 75731 75746 528960 AAACCCAATGGTAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 43 1278 75732 75747 528961 TAAACCCAATGGTAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1279 75733 75748 528962 TTAAACCCAATGGTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 13 1280 75734 75749 528963 TTTAAACCCAATGGTA e-e-e-d(10)-k-k-k 2 1281 75741 75756 528964 CCTATGATTTAAACCC e-e-e-d(10)-k-k-k 17 1282 75745 75760 528965 GGTCCCTATGATTTAA e-e-e-d(10)-k-k-k 31 1283 75746 75761 528966 AGGTCCCTATGATTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1284 75802 75817 528967 CCTAAGGCCATGAACT e-e-e-d(10)-k-k-k 19 374 75803 75818 528968 ACCTAAGGCCATGAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 25 1285 75804 75819 528969 TACCTAAGGCCATGAA e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1286 75805 75820 528970 CTACCTAAGGCCATGA e-e-e-d(10)-k-k-k 55 1287 75806 75821 528971 GCTACCTAAGGCCATG e-e-e-d(10)-k-k-k 66 1288 75807 75822 528972 TGCTACCTAAGGCCAT e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1289 75808 75823 528973 ATGCTACCTAAGGCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 71 1290 75809 75824 528974 CATGCTACCTAAGGCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 1291 75810 75825 528975 ACATGCTACCTAAGGC e-e-e-d(10)-k-k-k 34 1292 75823 75838 528976 GTTAAGACCAGATACA e-e-e-d(10)-k-k-k 45 1293 75824 75839 528977 AGTTAAGACCAGATAC e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1294 75825 75840 528978 GAGTTAAGACCAGATA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1295 75826 75841 528979 AGAGTTAAGACCAGAT e-e-e-d(10)-k-k-k 62 1296 75831 75846 530399 CAATCAGAGTTAAGAC k-d(10)-k-e-k-e-e 36 1297 75832 75848 530029 TACAATCAGAGTTAAGA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 29 1298 75832 75847 530349 ACAATCAGAGTTAAGA e-k-d(10)-k-e-k-e 33 1299 75833 75848 528980 TACAATCAGAGTTAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 378 75833 75848 530097 TACAATCAGAGTTAAG e-k-k-d(10)-k-k-e 41 378 75833 75848 530144 TACAATCAGAGTTAAG e-e-k-d(10)-k-k-e 16 378 75833 75848 530194 TACAATCAGAGTTAAG e-d-k-d(10)-k-k-e 28 378 75833 75848 530244 TACAATCAGAGTTAAG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 0 378 75833 75848 530294 TACAATCAGAGTTAAG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 7 378 75835 75850 528981 GCTACAATCAGAGTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1300 75836 75851 528982 TGCTACAATCAGAGTT e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1301 75837 75852 528983 TTGCTACAATCAGAGT e-e-e-d(10)-k-k-k 44 1302 75849 75864 530400 CTCTCAGAACTTTTGC k-d(10)-k-e-k-e-e 65 1303 75850 75866 530030 TCCTCTCAGAACTTTTG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 47 1304 75850 75865 530350 CCTCTCAGAACTTTTG e-k-d(10)-k-e-k-e 54 1305 75851 75866 530098 TCCTCTCAGAACTTTT e-k-k-d(10)-k-k-e 42 380 75851 75866 530145 TCCTCTCAGAACTTTT e-e-k-d(10)-k-k-e 38 380 75851 75866 530195 TCCTCTCAGAACTTTT e-d-k-d(10)-k-k-e 43 380 75851 75866 530245 TCCTCTCAGAACTTTT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 28 380 75851 75866 530295 TCCTCTCAGAACTTTT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 39 380 75957 75972 528984 CCCACGGGATTCCCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1306 75958 75973 528985 ACCCACGGGATTCCCT e-e-e-d(10)-k-k-k 36 1307 75959 75974 528986 AACCCACGGGATTCCC e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1308 75960 75975 528987 CAACCCACGGGATTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 39 1309 75961 75976 528988 GCAACCCACGGGATTC e-e-e-d(10)-k-k-k 48 1310 75962 75977 528989 AGCAACCCACGGGATT e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1311 75964 75979 528990 TAAGCAACCCACGGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 27 1312 75965 75980 528991 GTAAGCAACCCACGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 47 1313 75966 75981 528992 GGTAAGCAACCCACGG e-e-e-d(10)-k-k-k 42 1314 75967 75982 528993 AGGTAAGCAACCCACG e-e-e-d(10)-k-k-k 54 1315 75967 75982 530434 AGGTAAGCAACCCACG k-d(10)-k-e-k-e-e 51 1315 75968 75983 528994 TAGGTAAGCAACCCAC e-e-e-d(10)-k-k-k 53 1316 75968 75984 530064 GTAGGTAAGCAACCCAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 53 1317 75968 75983 530384 TAGGTAAGCAACCCAC e-k-d(10)-k-e-k-e 48 1316 75969 75984 528995 GTAGGTAAGCAACCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 64 388 75969 75984 530129 GTAGGTAAGCAACCCA e-k-k-d(10)-k-k-e 79 388 75969 75984 530179 GTAGGTAAGCAACCCA e-e-k-d(10)-k-k-e 74 388 75969 75984 530229 GTAGGTAAGCAACCCA e-d-k-d(10)-k-k-e 64 388 75969 75984 530279 GTAGGTAAGCAACCCA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 55 388 75969 75984 530329 GTAGGTAAGCAACCCA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 61 388 75971 75986 528996 AGGTAGGTAAGCAACC e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1318 75975 75990 528997 TTATAGGTAGGTAAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1319 75979 75994 528998 CACCTTATAGGTAGGT e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1320 75981 75996 528999 ACCACCTTATAGGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 15 1321 75984 75999 529000 TAAACCACCTTATAGG e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1322 75985 76000 529001 ATAAACCACCTTATAG e-e-e-d(10)-k-k-k 7 1323 75997 76012 529002 GGACAGCAGCTTATAA e-e-e-d(10)-k-k-k 12 1324 75998 76013 529003 AGGACAGCAGCTTATA e-e-e-d(10)-k-k-k 40 1325 75998 76013 530401 AGGACAGCAGCTTATA k-d(10)-k-e-k-e-e 41 1325 75999 76014 529004 CAGGACAGCAGCTTAT e-e-e-d(10)-k-k-k 38 1326 75999 76015 530031 CCAGGACAGCAGCTTAT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1327 75999 76014 530351 CAGGACAGCAGCTTAT e-k-d(10)-k-e-k-e 58 1326 75999 76014 530402 CAGGACAGCAGCTTAT k-d(10)-k-e-k-e-e 60 1326 76000 76016 530032 GCCAGGACAGCAGCTTA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 74 1328 76000 76015 530099 CCAGGACAGCAGCTTA e-k-k-d(10)-k-k-e 73 1329 76000 76015 530146 CCAGGACAGCAGCTTA e-e-k-d(10)-k-k-e 70 1329 76000 76015 530196 CCAGGACAGCAGCTTA e-d-k-d(10)-k-k-e 67 1329 76000 76015 530246 CCAGGACAGCAGCTTA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 39 1329 76000 76015 530296 CCAGGACAGCAGCTTA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 67 1329 76000 76015 530352 CCAGGACAGCAGCTTA e-k-d(10)-k-e-k-e 67 1329 76001 76016 530100 GCCAGGACAGCAGCTT e-k-k-d(10)-k-k-e 77 1330 76001 76016 530147 GCCAGGACAGCAGCTT e-e-k-d(10)-k-k-e 84 1330 76001 76016 530197 GCCAGGACAGCAGCTT e-d-k-d(10)-k-k-e 71 1330 76001 76016 530247 GCCAGGACAGCAGCTT e-d-d-k-d(9)-k-k-e 53 1330 76001 76016 530297 GCCAGGACAGCAGCTT e-e-e-e-d(9)-k-k-e 75 1330 76001 76016 530403 GCCAGGACAGCAGCTT k-d(10)-k-e-k-e-e 77 1330 76002 76018 530033 TGGCCAGGACAGCAGCT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 65 1331 76002 76017 530353 GGCCAGGACAGCAGCT e-k-d(10)-k-e-k-e 83 1332 76003 76018 530101 TGGCCAGGACAGCAGC e-k-k-d(10)-k-k-e 59 1333 76003 76018 530148 TGGCCAGGACAGCAGC e-e-k-d(10)-k-k-e 79 1333 76003 76018 530198 TGGCCAGGACAGCAGC e-d-k-d(10)-k-k-e 54 1333 76003 76018 530248 TGGCCAGGACAGCAGC e-d-d-k-d(9)-k-k-e 32 1333 76003 76018 530298 TGGCCAGGACAGCAGC e-e-e-e-d(9)-k-k-e 73 1333 76014 76029 530404 TTTGAATGCAGTGGCC k-d(10)-k-e-k-e-e 67 1334 76015 76031 530034 AATTTGAATGCAGTGGC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 69 1335 76015 76030 530354 ATTTGAATGCAGTGGC e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1336 76015 76030 530405 ATTTGAATGCAGTGGC k-d(10)-k-e-k-e-e 55 1336 76016 76032 530035 GAATTTGAATGCAGTGG e-e-k-d(10)-k-e-k-e 69 1337 76016 76031 530102 AATTTGAATGCAGTGG e-k-k-d(10)-k-k-e 71 1338 76016 76031 530149 AATTTGAATGCAGTGG e-e-k-d(10)-k-k-e 70 1338 76016 76031 530199 AATTTGAATGCAGTGG e-d-k-d(10)-k-k-e 58 1338 76016 76031 530249 AATTTGAATGCAGTGG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 47 1338 76016 76031 530299 AATTTGAATGCAGTGG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 47 1338 76016 76031 530355 AATTTGAATGCAGTGG e-k-d(10)-k-e-k-e 72 1338 76017 76032 530103 GAATTTGAATGCAGTG e-k-k-d(10)-k-k-e 77 390 76017 76032 530150 GAATTTGAATGCAGTG e-e-k-d(10)-k-k-e 73 390 76017 76032 530200 GAATTTGAATGCAGTG e-d-k-d(10)-k-k-e 63 390 76017 76032 530250 GAATTTGAATGCAGTG e-d-d-k-d(9)-k-k-e 59 390 76017 76032 530300 GAATTTGAATGCAGTG e-e-e-e-d(9)-k-k-e 65 390 76029 76044 530435 AAGTACACATTGGAAT k-d(10)-k-e-k-e-e 62 1339 76030 76046 530057 TGAAGTACACATTGGAA e-e-k-d(10)-k-e-k-e 69 1340 76030 76045 530385 GAAGTACACATTGGAA e-k-d(10)-k-e-k-e 70 1341 76031 76046 529005 TGAAGTACACATTGGA e-e-e-d(10)-k-k-k 64 392 76031 76046 530130 TGAAGTACACATTGGA e-k-k-d(10)-k-k-e 85 392 76031 76046 530180 TGAAGTACACATTGGA e-e-k-d(10)-k-k-e 82 392 76031 76046 530230 TGAAGTACACATTGGA e-d-k-d(10)-k-k-e 65 392 76031 76046 530280 TGAAGTACACATTGGA e-d-d-k-d(9)-k-k-e 75 392 76031 76046 530330 TGAAGTACACATTGGA e-e-e-e-d(9)-k-k-e 52 392 76039 76054 529006 TTACACTATGAAGTAC e-e-e-d(10)-k-k-k 16 1342 76116 76131 529007 AGTTAAAGTAGATACA e-e-e-d(10)-k-k-k 0 1343 76121 76136 529008 CTGGAAGTTAAAGTAG e-e-e-d(10)-k-k-k 30 397 76130 76145 529009 CGTTTATTTCTGGAAG e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1344 76144 76159 529010 CGGTTCCTATATAACG e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1345 76145 76160 529011 ACGGTTCCTATATAAC e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1346
Primer 14: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama [0285] Gapmeri iz studije opisane u Primeru 13 koji pokazuju značajnu in vitro inhibiciju STAT3 su testirani u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 20,000 ćelija po komorici i transfektovane upotrebom elektroporacije sa 39,1 nM, 156,3 nM, 625,0 nM i 2,500,0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 15. Nakon perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0286] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 15. Kao što je ilustrovano u Tabeli 15, nivoi mRNK STAT3 su značajno smanjeni na dozno-zavisni način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 15
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 u HuVEC ćelija ISIS br. 39,1 nM 156,3nM 625,0 nM 2500,0 nM IC50(µM)
481464 6 51 84 94 0,2
518345 0 9 56 84 0,6
518349 16 3 47 83 0,6
519636 16 41 75 89 0,2
519637 24 43 84 94 0,2 519638 6 34 70 92 0,3 528403 0 4 39 77 0,9 528458 0 15 46 81 0,7 528475 1 10 51 76 0,7 528476 0 11 42 80 0,7 528869 25 19 67 86 0,3 528880 0 3 45 76 0,8 528937 0 1 49 82 0,8 528938 0 9 50 82 0,7 528942 0 20 59 88 0,5 528959 0 4 55 79 0,7 529022 0 0 52 81 0,8 529023 0 0 53 90 0,6 529024 0 0 47 80 0,8 529025 0 11 50 90 0,6 529026 0 31 73 96 0,4 529027 0 7 36 80 0,9 530021 6 30 69 92 0,3 530025 10 33 73 92 0,3 530026 3 18 52 80 0,6 530041 0 28 72 91 0,4 530048 0 22 53 83 0,5 530049 2 16 69 92 0,4 530053 0 16 66 90 0,5 530062 4 56 85 94 0,2 530066 0 12 46 84 0,7 530088 2 39 77 93 0,3 530091 3 12 59 84 0,5 530092 7 27 65 85 0,4 530093 7 46 79 96 0,2 530094 0 17 63 89 0,5 530109 9 30 72 94 0,3 530110 0 23 61 83 0,5 530112 0 13 42 90 0,6 530114 0 21 62 79 0,6 530116 22 40 71 92 0,2 530123 8 19 72 93 0,3 530130 0 33 64 89 0,4 530131 4 34 81 93 0,3 530135 22 38 79 94 0,2 530138 6 23 57 86 0,4 530140 4 22 62 91 0,4 530147 0 15 51 83 0,6 530156 7 41 81 96 0,2 530161 0 20 46 78 0,7 530170 0 29 67 90 0,4 530175 37 52 84 95 0,1 530178 8 24 70 86 0,4 530180 0 0 61 82 0,6 530181 0 27 52 86 0,5 530185 0 22 54 86 0,5 530190 17 17 60 87 0,4 530206 8 29 73 93 0,3 530225 0 27 67 91 0,4 530228 11 16 64 86 0,4 530261 5 25 57 91 0,4 530270 7 11 62 91 0,4 530275 14 34 73 91 0,3 530278 1 27 60 85 0,4 530285 5 20 61 82 0,5 530306 3 14 66 85 0,5 530311 6 27 59 86 0,4 530320 3 17 56 85 0,5 530325 5 35 70 92 0,3 530328 4 34 61 87 0,4 530340 8 34 74 90 0,3 530341 2 23 77 89 0,4 530344 16 20 64 89 0,4 530345 15 35 77 94 0,2 530346 5 24 66 92 0,4 530353 7 25 57 83 0,5 530354 2 24 60 81 0,5 530359 0 4 44 89 0,7 530361 13 30 59 92 0,3 530365 0 0 45 88 0,7 530367 0 15 49 88 0,5 530368 0 27 64 89 0,4 530369 10 28 78 95 0,3 530373 13 29 64 92 0,3 530375 0 14 53 90 0,5 530380 8 40 80 94 0,2 530390 11 21 66 90 0,4 530391 20 7 49 86 0,5 530411 5 19 81 95 0,3 530430 0 8 53 91 0,6 530466 0 4 53 87 0,6 530468 4 17 65 90 0,4 530469 8 38 86 94 0,2 530470 5 39 78 91 0,3 530471 0 21 69 91 0,4 530476 7 9 32 89 0,7 530477 0 12 64 87 0,5 530478 0 14 59 90 0,5 530485 0 10 61 85 0,5 530486 0 17 64 80 0,5 530492 0 25 71 89 0,4
530493 4 23 58 88 0,4
530507 5 17 65 82 0,5
530508 0 14 56 89 0,5
530509 0 17 54 86 0,5
530513 6 24 74 91 0,3
530514 1 7 52 78 0,7
530515 0 19 73 89 0,4
Primer 15: Antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama
[0287] Dodatni antisens oligonukleotidi su dizajnirani za ciljanje STAT3 nukleinske kiseline i testirani su za svoje efekte na STAT3 mRNK in vitro. Kultivisane HuVEC ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po komorici su transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 1,000 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet za proučavanje ljudskih prajmera RTS199, opisan gore, je korišćen za merenje nivoa mRNK. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0288] Himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli 16 su 3-10-3 dezoksi, MOE i cEt gapmeri ili 3-10-4 dezoksi, MOE i cEt gapmeri. 3-10-3 gapmeri su dužine 16 nukleozida, gde centralni segment jaza sadrži deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima koja sadrže po 3 nukleozida.3-10-4 gapmeri su dužine 17 nukleozida, gde centralni segment jaza sadrži deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je na 5' pravcu krilom koje se sastoji od 3 nukleozida i na 3' pravcu krilom koje se sastoji o 4 nukleozida.
Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. Kolona hemije u Tabeli 16 predstavlja šećerni motiv svakog gapmera, gde 'e' označava 2'-MOE nukleozid, 'k' označava ograničeni etil (cEt) nukleozid, i 'd' označava 2'-dezoksinukleozid.
[0289] „Početno mesto ljudskog cilja“ označava naj-5' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. „Zaustavno mesto ljudskog cilja“ označava naj-3' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena. Svaki gapmer, naveden u Tabeli 16, je ciljan na ljudsku STAT3 mRNK, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_139276,2). Svaki gapmer naveden u Tabeli 17 je ciljan na ljudsku STAT3 genomsku sekvencu, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 2 (komplement GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćena od nukleotida 4185000 do 4264000).
Tabela 16
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ ID NO: 1
Ljudsko Ljudsko ISIS BR. Sekvenca Hemija % SEQ početno zaustavno inhibicije ID mesto mesto NO 730 745 530011 GGAGATTCTCTACCAC k-k-k-d(10)-e-e-e 73 53 1901 1916 529974 AAGCCCTTGCCAGCCA e-e-e-d(10)-k-k-k 83 144 1901 1916 530012 AAGCCCTTGCCAGCCA k-k-k-d(10)-e-e-e 73 144 2206 2221 530015 CCATGATCTTATAGCC k-k-k-d(10)-e-e-e 38 175 3016 3031 481464 CTATTTGGATGTCAGC k-k-k-d(10)-k-k-k 94 245 3461 3476 529975 AGCACCAAGGAGGCTG e-e-e-d(10)-k-k-k 54 257 3461 3476 530013 AGCACCAAGGAGGCTG k-k-k-d(10)-e-e-e 58 257 3584 3600 530018 TCCTTAAACCTTCCTAT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 46 1510 3585 3600 529944 TCCTTAAACCTTCCTA e-e-e-d(10)-k-k-k 44 273 3585 3600 529977 TCCTTAAACCTTCCTA k-k-k-d(10)-e-e-e 66 273 3592 3608 530019 TTAGATTCTCCTTAAAC e-e-k-d(10)-k-e-k-e 43 1511 3593 3608 529945 TTAGATTCTCCTTAAA e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1166 3593 3608 529978 TTAGATTCTCCTTAAA k-k-k-d(10)-e-e-e 49 1166 3596 3612 530020 ATGCTTAGATTCTCCTT e-e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1512 3597 3612 529979 ATGCTTAGATTCTCCT k-k-k-d(10)-e-e-e 86 1169 3599 3614 529946 AAATGCTTAGATTCTC e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1172 3599 3614 529980 AAATGCTTAGATTCTC k-k-k-d(10)-e-e-e 25 1172 3716 3731 529947 CAGATCAAGTCCAGGG e-e-e-d(10)-k-k-k 68 1187 3716 3731 529981 CAGATCAAGTCCAGGG k-k-k-d(10)-e-e-e 83 1187 3718 3733 529948 AGCAGATCAAGTCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 75 1190 3718 3733 529982 AGCAGATCAAGTCCAG k-k-k-d(10)-e-e-e 84 1190 4236 4251 529983 AGGTGTTCCCATACGC k-k-k-d(10)-e-e-e 96 1245 4237 4252 529984 TAGGTGTTCCCATACG k-k-k-d(10)-e-e-e 91 336 4437 4452 529949 CATCAACTGTCTCCAG e-e-e-d(10)-k-k-k 48 354 4437 4452 529985 CATCAACTGTCTCCAG k-k-k-d(10)-e-e-e 37 354 4439 4454 529950 CACATCAACTGTCTCC e-e-e-d(10)-k-k-k 58 356 4439 4454 529986 CACATCAACTGTCTCC k-k-k-d(10)-e-e-e 72 356 4646 4661 529987 TACAATCAGAGTTAAG k-k-k-d(10)-e-e-e 0 378 4664 4679 529951 TCCTCTCAGAACTTTT e-e-e-d(10)-k-k-k 38 380 4664 4679 529988 TCCTCTCAGAACTTTT k-k-k-d(10)-e-e-e 40 380 4782 4797 530016 GTAGGTAAGCAACCCA k-k-k-d(10)-e-e-e 60 388 4813 4828 529952 CCAGGACAGCAGCTTA e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1329 4813 4828 529989 CCAGGACAGCAGCTTA k-k-k-d(10)-e-e-e 63 1329 4814 4829 529953 GCCAGGACAGCAGCTT e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1330 4814 4829 529990 GCCAGGACAGCAGCTT k-k-k-d(10)-e-e-e 75 1330 4816 4831 529954 TGGCCAGGACAGCAGC e-e-e-d(10)-k-k-k 79 1333 4816 4831 529991 TGGCCAGGACAGCAGC k-k-k-d(10)-e-e-e 52 1333 4829 4844 529955 AATTTGAATGCAGTGG e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1338 4829 4844 529992 AATTTGAATGCAGTGG k-k-k-d(10)-e-e-e 23 1338 4830 4845 529956 GAATTTGAATGCAGTG e-e-e-d(10)-k-k-k 60 390 4830 4845 529993 GAATTTGAATGCAGTG k-k-k-d(10)-e-e-e 51 390 4844 4859 530014 TGAAGTACACATTGGA k-k-k-d(10)-e-e-e 67 392
Tabela 17
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ ID NO: 2
Ljudsko Ljudsko ISIS BR. Sekvenca Hemija % SEQ početno zaustavno inhibicije ID mesto mesto NO 74203 74218 CTATTTGGATGTCAGC 481464 k-k-k-d(10)-k-k-k 94 245 74772 74787 TCCTTAAACCTTCCTA 529944 e-e-e-d(10)-k-k-k 44 273 74780 74795 TTAGATTCTCCTTAAA 529945 e-e-e-d(10)-k-k-k 22 1166 74786 74801 AAATGCTTAGATTCTC 529946 e-e-e-d(10)-k-k-k 46 1172 74903 74918 CAGATCAAGTCCAGGG 529947 e-e-e-d(10)-k-k-k 68 1187 74905 74920 AGCAGATCAAGTCCAG 529948 e-e-e-d(10)-k-k-k 75 1190 75624 75639 CATCAACTGTCTCCAG 529949 e-e-e-d(10)-k-k-k 48 354 75626 75641 CACATCAACTGTCTCC 529950 e-e-e-d(10)-k-k-k 58 356 75851 75866 TCCTCTCAGAACTTTT 529951 e-e-e-d(10)-k-k-k 38 380 76000 76015 CCAGGACAGCAGCTTA 529952 e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1329 76001 76016 GCCAGGACAGCAGCTT 529953 e-e-e-d(10)-k-k-k 65 1330 76003 76018 TGGCCAGGACAGCAGC 529954 e-e-e-d(10)-k-k-k 79 1333 76016 76031 AATTTGAATGCAGTGG 529955 e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1338 76017 76032 GAATTTGAATGCAGTG 529956 e-e-e-d(10)-k-k-k 60 390 2340 2355 ACATACAGTAAGACCA 529957 e-e-e-d(10)-k-k-k 21 1376 2385 2400 CAAAAATTTACAACCC 529958 e-e-e-d(10)-k-k-k 10 1380 2410 2425 CCAATGCTTTATCAGC 529959 e-e-e-d(10)-k-k-k 51 1384 2671 2686 AGACTAAAATCAAGGC 529960 e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1388 5002 5017 AACTGAAATTCCTTGG 529961 e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1395 5701 5716 GTACTCTTTCAGTGGT 529962 e-e-e-d(10)-k-k-k 91 1399 8080 8095 GCAGATTTACCTTCCT 529963 e-e-e-d(10)-k-k-k 55 1409 9125 9140 CTGCCCCTATGTATAA 529964 e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1413 11263 11278 CTGCCCCTATGTATAA 529964 e-e-e-d(10)-k-k-k 18 1413 9864 9879 GCTTCTTCCTGAGACA 529965 e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1417 12347 12362 GCTTCTTCCTGAGACA 529965 e-e-e-d(10)-k-k-k 52 1417 9866 9881 TGGCTTCTTCCTGAGA 529966 e-e-e-d(10)-k-k-k 51 1420 12349 12364 TGGCTTCTTCCTGAGA 529966 e-e-e-d(10)-k-k-k 51 1420 9875 9890 TCCTCCTGTTGGCTTC 529967 e-e-e-d(10)-k-k-k 80 1425 12358 12373 TCCTCCTGTTGGCTTC 529967 e-e-e-d(10)-k-k-k 80 1425 9876 9891 TTCCTCCTGTTGGCTT 529968 e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1426 12359 12374 TTCCTCCTGTTGGCTT 529968 e-e-e-d(10)-k-k-k 56 1426 9878 9893 GGTTCCTCCTGTTGGC 529969 e-e-e-d(10)-k-k-k 69 1429 12361 12376 GGTTCCTCCTGTTGGC 529969 e-e-e-d(10)-k-k-k 69 1429 16865 16880 TATAATTGTGTACTGG 529970 e-e-e-d(10)-k-k-k 41 1441 26063 26078 CAACTTTAGCCCCTTC 529971 e-e-e-d(10)-k-k-k 32 1452 48404 48419 CACACTTTCCATTCTA 529972 e-e-e-d(10)-k-k-k 30 1476 71616 71631 CAGTACAATTGCTTCA 529973 e-e-e-d(10)-k-k-k 49 1505 66138 66153 AAGCCCTTGCCAGCCA 529974 e-e-e-d(10)-k-k-k 83 144 74648 74663 AGCACCAAGGAGGCTG 529975 e-e-e-d(10)-k-k-k 54 257 2705 2720 CTAATGGTTCTTTGTG 529976 e-e-e-d(10)-k-k-k 25 411 74772 74787 TCCTTAAACCTTCCTA 529977 k-k-k-d(10)-e-e-e 66 273 74780 74795 TTAGATTCTCCTTAAA 529978 k-k-k-d(10)-e-e-e 49 1166 74784 74799 ATGCTTAGATTCTCCT 529979 k-k-k-d(10)-e-e-e 86 1169 74786 74801 AAATGCTTAGATTCTC 529980 k-k-k-d(10)-e-e-e 25 1172 74903 74918 CAGATCAAGTCCAGGG 529981 k-k-k-d(10)-e-e-e 83 1187 74905 74920 AGCAGATCAAGTCCAG 529982 k-k-k-d(10)-e-e-e 84 1190 75423 75438 AGGTGTTCCCATACGC 529983 k-k-k-d(10)-e-e-e 96 1245 75424 75439 TAGGTGTTCCCATACG 529984 k-k-k-d(10)-e-e-e 91 336 75624 75639 CATCAACTGTCTCCAG 529985 k-k-k-d(10)-e-e-e 37 354 75626 75641 CACATCAACTGTCTCC 529986 k-k-k-d(10)-e-e-e 72 356 75833 75848 TACAATCAGAGTTAAG 529987 k-k-k-d(10)-e-e-e 0 378 75851 75866 TCCTCTCAGAACTTTT 529988 k-k-k-d(10)-e-e-e 40 380 76000 76015 CCAGGACAGCAGCTTA 529989 k-k-k-d(10)-e-e-e 63 1329 76001 76016 GCCAGGACAGCAGCTT 529990 k-k-k-d(10)-e-e-e 75 1330 76003 76018 TGGCCAGGACAGCAGC 529991 k-k-k-d(10)-e-e-e 52 1333 76016 76031 AATTTGAATGCAGTGG 529992 k-k-k-d(10)-e-e-e 23 1338 76017 76032 GAATTTGAATGCAGTG 529993 k-k-k-d(10)-e-e-e 51 390 2340 2355 ACATACAGTAAGACCA 529994 k-k-k-d(10)-e-e-e 44 1376 2385 2400 CAAAAATTTACAACCC 529995 k-k-k-d(10)-e-e-e 0 1380 2410 2425 CCAATGCTTTATCAGC 529996 k-k-k-d(10)-e-e-e 65 1384 2671 2686 AGACTAAAATCAAGGC 529997 k-k-k-d(10)-e-e-e 44 1388 5002 5017 AACTGAAATTCCTTGG 529998 k-k-k-d(10)-e-e-e 35 1395 5701 5716 GTACTCTTTCAGTGGT 529999 k-k-k-d(10)-e-e-e 91 1399 8080 8095 GCAGATTTACCTTCCT 530000 k-k-k-d(10)-e-e-e 80 1409 9125 9140 CTGCCCCTATGTATAA 530001 k-k-k-d(10)-e-e-e 21 1413 11263 11278 CTGCCCCTATGTATAA 530001 k-k-k-d(10)-e-e-e 21 1413 9864 9879 GCTTCTTCCTGAGACA 530002 k-k-k-d(10)-e-e-e 74 1417 12347 12362 GCTTCTTCCTGAGACA 530002 k-k-k-d(10)-e-e-e 74 1417 9866 9881 TGGCTTCTTCCTGAGA 530003 k-k-k-d(10)-e-e-e 67 1420 12349 12364 TGGCTTCTTCCTGAGA 530003 k-k-k-d(10)-e-e-e 67 1420 9875 9890 TCCTCCTGTTGGCTTC 530004 k-k-k-d(10)-e-e-e 83 1425 12358 12373 TCCTCCTGTTGGCTTC 530004 k-k-k-d(10)-e-e-e 83 1425 9876 9891 TTCCTCCTGTTGGCTT 530005 k-k-k-d(10)-e-e-e 77 1426 12359 12374 TTCCTCCTGTTGGCTT 530005 k-k-k-d(10)-e-e-e 77 1426 9878 9893 GGTTCCTCCTGTTGGC 530006 k-k-k-d(10)-e-e-e 89 1427 12361 12376 GGTTCCTCCTGTTGGC 530006 k-k-k-d(10)-e-e-e 89 1427 16865 16880 TATAATTGTGTACTGG 530007 k-k-k-d(10)-e-e-e 21 1441 26063 26078 CAACTTTAGCCCCTTC 530008 k-k-k-d(10)-e-e-e 58 1452 48404 48419 CACACTTTCCATTCTA 530009 k-k-k-d(10)-e-e-e 59 1476 71616 71631 CAGTACAATTGCTTCA 530010 k-k-k-d(10)-e-e-e 75 1505 50694 50709 GGAGATTCTCTACCAC 530011 k-k-k-d(10)-e-e-e 73 53 66138 66153 AAGCCCTTGCCAGCCA 530012 k-k-k-d(10)-e-e-e 73 144 74648 74663 AGCACCAAGGAGGCTG 530013 k-k-k-d(10)-e-e-e 58 257 76031 76046 TGAAGTACACATTGGA 530014 k-k-k-d(10)-e-e-e 67 392 67068 67083 CCATGATCTTATAGCC 530015 k-k-k-d(10)-e-e-e 38 175 75969 75984 GTAGGTAAGCAACCCA 530016 k-k-k-d(10)-e-e-e 60 388 2705 2720 CTAATGGTTCTTTGTG 530017 k-k-k-d(10)-e-e-e 46 411 74771 74787 TCCTTAAACCTTCCTAT 530018 e-e-k-d(10)-k-e-k-e 46 1510 74779 74795 TTAGATTCTCCTTAAAC 530019 e-e-k-d(10)-k-e-k-e 43 1511 74783 74799 ATGCTTAGATTCTCCTT 530020 e-e-k-d(10)-k-e-k-e 85 1512
Primer 16: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama [0290] Gapmeri iz studije opisane u Primeru 15 koji pokazuju značajni in vitro inhibiciju STAT3 su testirani u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su stavljene pri gustini od 20,000 ćelija po komorici i transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 39,1 nM, 156,3 nM, 625,0 nM i 2,500,0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 18. Nakon perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0291] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 18. Kao što je ilustrovano u Tabeli 18, nivoi mRNK STAT3 su značajno smanjeni na dozno-zavisni način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 18
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 u HuVEC ćelija ISIS br. 39,1 nM 156,3 nM 625,0 nM 2500,0 nM IC50(µM)
481464 41 78 92 91 0,04
529962 30 51 86 95 0,12
529979 0 43 81 95 0,27
529982 0 0 70 90 0,56
529983 31 67 87 94 0,08
529984 17 44 83 97 0,19
529999 29 51 83 96 0,13
530006 18 38 77 94 0,22
530020 2 39 75 92 0,28
Primer 17: Uticaj ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju STAT3 u tretmanu ksenograft modela MDA-MB-231 ljudskog raka dojke
[0292] BALB/c goli miševi inokulisani sa ljudskim ćelijama kancera dojke MDA-MB-231 su tretirani sa ISIS 481464 i ISIS 481549. ISIS 481549 je unakrsno reaktivan sa mišjim sekvencama (tj. hibridizuje se na mišju sekvencu). Procenjen je rast tumora i podnošljivost oligonukleotida kod miševa.
Tretman
[0293] Studija je sprovedena kod Pharmaron Inc (Beijing, P.R. China). BALB/c goli miševi su dobijeni od Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. MDA-MB-231 ćelije ljudskog karcinoma dojke su održavane in vitro kao monoslojna kultura u Leibovitz-ovom L-15 medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina, i 2 mM L-glutamina. Ćelije su održavane na 37°C u atmosferi od 5% CO2 u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA tretmanom. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i izbrojane za inokulaciju tumora.
[0294] Tri grupe od osam nasumično odabranih 6-8 nedelja starih ženki BALB/c golih miševa su inokulisane u desni bok sa MDA-MB-231 fragmentima tumora (3 mm x 2 mm x 2 mm, koji su nastali iz inokulacije tumora) za razvoj tumora. Tretman antisens oligonukleotida započinje 11. dana nakon inokulacije tumora, kada je srednja veličina tumora dostigla približno 100 mm<3>. Dve grupe su injektirane intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 481464 ili ISIS 481549. Kontrolna grupa miševa je intraperitonealno injektirana dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS.
[0295] Sve procedure koje se odnose na rukovanje životinjama, negu i tretman, izvršene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institucionalni odbor za negu i korišćenje životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC). Životinje su rutinski proveravane za bilo kakve efekte rasta tumora na normalno ponašanje, kao što su pokretljivost, konzumacija hrane, promene telesne težine i bilo koji drugi abnormalni efekat.
RNK analiza
[0296] RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Nivoi STAT3 mRNK kod miševa su takođe mereni primenom kompleta mSTAT3_LTS00664 za sondiranje prajmera (prednja sekvenca CGACAGCTTCCCCATGGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1513; reverzna sekvenca ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1514; sonda sekvenca CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1515). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovani na ciklofilin. Kao što je prikazano u Tabeli 19, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao je redukcijom i ljudskih i mišjih STAT3 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 19
Procenat inhibicije STAT3 mRNA u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u MDA-MB-231 ksenograft modelu
ISIS br. ljudski STAT3 mišji STAT3
481464 25 16
481549 22 44
Uticaj na rast tumora
[0297] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije pomoću šestara.
Zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,536 x a x b<2>, gde su a i b dugi i kratki prečnici tumora. Veličina tumora je korišćena za proračune T-C i TV/ CVvrednosti. T-C je izračunat sa T kao srednjim vremenom (u danima) potrebnim da tumori u tretiranim grupama dostignu prethodno određenu veličinu (900 mm<3>), i C kao srednje vreme (u danima) da tumori u kontrolnoj grupi dostignu istu veličinu. TV/ CV vrednost (eksprimirana kao procenat) je indikacija anti-tumorske efikasnosti ISIS oligonukleotida, gde su TV i CV bili srednja zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, respektivno, na određeni dan (dan 32).
[0298] Rezultati su prikazani u Tabelama 20 i 21. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS 481464 i ISIS 481549 značajno ometao rast tumora.
Tabela 20
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u MDA-MB-231 ksenograft modelu Dan PBS ISIS 481464 ISIS 481549
11 103 104 104
15 185 142 158
18 292 200 205
22 519 305 326
25 745 430 436
29 1,332 643 688
32 1,741 921 984
Tabela 21
Efekat antisens inhibicije STAT3 na inhibiciju rasta tumora u MDA-MB-231 ksenograft modelu
Tretman Veličina tumora (mm<3>) na dan 32 TV/CV(%) T-C pri 900 mm<3>
PBS 1,741 - -
ISIS 481464 921 53 6
ISIS 481549 984 57 5
Merenje telesne težine
[0299] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, telesne težine su redovno merene tokom perioda tretmana. Podaci su prikazani u Tabeli 22 i ukazuju da tretman sa ISIS 481464 ili ISIS 481549 ne uzrokuje značajan porast ili gubitak težine.
Tabela 22
Merenja telesne težine miševa u MDA-MB-231 ksenograft modelu
Dan 11 Dan 15 Dan 18 Dan 22 Dan 25 Dan 29 Dan 32
PBS 21,8 22,2 22,5 22,5 22,9 23,4 24,0
ISIS 481464 22,3 22,8 23,0 23,2 23,8 23,9 24,9
ISIS 481549 22,2 22,5 23,0 23,3 23,7 23,7 24,6
Primer 18: Uticaj ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju STAT3 u tretmanu ksenograft modela ljudskog epidermoidnog karcinoma A431
[0300] BALB/c goli miševi inokulisani ljudskim epidermoidnim ćelijama raka A431 su tretirani sa ISIS 481464 i ISIS 481549. ISIS 481549 je unakrsno reaktivan sa mišjom sekvencom (tj. hibridizuje se na mišu sekvence). Procenjen je efekat tretmana na rast tumora i podnošljivost kod miševa.
Tretman
[0301] Studija je sprovedena kod Pharmaron Inc (Beijing, P.R. China). BALB/c goli miševi su dobijeni od Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. A431 ljudske epidermoidne ćelije karcioma su održavane in vitro kao monoslojna kultura u DMEM medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina, i 2 mM L-glutamina. Ćelije su održavane na 37°C u atmosferi od 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA tretmanom. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i izbrojane za inokulaciju tumora.
[0302] Tri grupe od osam nasumično odabranih 6-8 nedelja starih ženki BALB/c golih miševa su inokulisane potkožno sa 5 x 10<6>A431 tumorskim ćelijama za razvoj tumora.
Tretman antisens oligonukleotida je počeo 8. dana nakon inokulacije tumora kada je srednja veličina tumora dostigla približno 95 mm<3>. Dve grupe su injektirane intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 481464 ili ISIS 481549. Kontrolna grupa miševa je intraperitonealno injektirana dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa PBS.
[0303] Sve procedure koje se odnose na rukovanje životinjama, negu i tretman, izvršene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institucionalni odbor za negu i korišćenje životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC). U trenutku rutinskog nadgledanja, životinje su proveravane za bilo kakav efekat rasta tumora na normalno ponašanje, kao što je pokretljivost, konzumacija hrane, promene telesne težine i bilo koji drugi abnormalni efekat.
RNK analiza
[0304] RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Nivoi mišje STAT3 mRNK su takođe mereni primenom kompleta mSTAT3_LTS00664 za sondiranje prajmera, opisanog gore. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovani na ciklofilin. Kao što je prikazano u Tabeli 23, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao je redukcijom i ljudskih i mišjih STAT3 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 23
Inhibicija STAT3 mRNK u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u A431 ksenograft modelu
ISIS br. ljudski STAT3 mišji STAT3 481464 63 26
481549 29 38
Analiza proteina
[0305] Protein je ekstrakovan iz tumorskih lizata za western analizu nivoa STAT3 proteina kod ljudi sa STAT3 monoklonskim antitelom (Cell Signaling Technology, Cat # 9135).
Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovani na house-keeping protein, COX-II. Kao što je prikazano u Tabeli 24, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao je smanjenjem nivoa STAT3 proteina u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 24
Nivoi inhibicije STAT3 proteina u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u A431 ksenograft modelu
ISIS br. % reduction
481464 99
481549 22
Uticaj na rast tumora
[0306] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,5 x a x b<2>, gde su a i b dugi i kratki prečnici tumora. Veličina tumora je korišćena za proračune T-C i TV/ CV vrednosti. T-C je izračunat sa T kao srednjim vremenom (u danima) potrebnim da tumori u tretiranim grupama dostignu prethodno određenu veličinu (800 mm<3>), i C kao srednjim vremenom (u danima) da tumori u kontrolnoj grupi dostignu istu veličinu. Vrednost Tv/Cv (izražena kao procenat) je indikacija anti-tumorske efikasnosti ISIS oligonukleotida, gde je TV i CV bili su srednja zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, respektivno, na određeni dan (dan 33).
[0307] Rezultati su prikazani u Tabelama 25 i 26. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS 481464 ili ISIS 481549 značajno ometao rast tumora.
Tabela 25
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u A431 ksenograft modelu Dans PBS ISIS 481464 ISIS 481549 8 94 95 95 14 178 157 132 17 308 261 202 21 528 412 304 24 682 552 426 28 875 698 555 31 1,071 898 716 33 1,210 1,030 858
Tabela 26
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora inhibicije u A431 ksenograft modelu Tretman Veličina tumora (mm<3>) na dan 33 TV/CV(%) T-C pri 800 mm<3>PBS 1,210 -
ISIS 481464 1,030 85 3
ISIS 481549 858 71 6
Merenje telesne težine
[0308] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, telesne težine su redovno merene tokom perioda tretmana. Podaci su prikazani u Tabeli 27 i ukazuju na to da tretman sa ISIS 481464 ili ISIS 481549 ne utiče na ukupno zdravlje miševa.
Tabela 27
Merenja telesne težine miševa u A431 ksenograft modelu Dan 8 Dan 14 Dan 17 Dan 21 Dan 24 Dan 28 Dan 31 Dan 33
PBS 20 20 20 21 21 21 22 22
ISIS 481464 20 21 21 21 21 22 22 23
ISIS 481549 20 20 21 21 21 22 22 22
Primer 19: Efekat ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju STAT3 u tretmanu ksenograft modela NCI-H460 ljudskog raka ne-malih ćelija pluća (NSCLC)
[0309] BALB/c goli miševi inokulirani sa ljudskim NCI-H460 ljudskim NSCLC tretirani su sa ISIS 491464, koji cilja na ljudski STAT3, i ISIS 481549, koji cilja i ljudski i mišji STAT3. Procenjen je efekat tretmana na rast tumora i podnošljivost kod miševa.
Tretman
[0310] Studija je sprovedena kod Pharmaron Inc (Beijing, P.R. China). BALB/c goli miševi su dobijeni od Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. NCI-H460 ljudske NSCLC ćelije su održavane in vitro kao monosjojna kultura u RPMI-1640 medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina, i 2 mM L-glutamina. Ćelije su održavane na 37°C u atmosferi od 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA tretmanom. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i izbrojane za inokulaciju tumora.
[0311] Tri grupe od osam nasumično dodeljenih 6-8 nedelja starih ženki BALB/c golih miševa su inokulisane subkutano sa 2 x 10<6>NCI-H460 tumorskih ćelija za razvoj tumora. Tretman antisens oligonukleotida je počeo 6. dana nakon inokulacije tumora kada je srednja veličina tumora dostigla približno 100 mm<3>. Dve grupe su injektirane intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 25 mg/kg ISIS 481464 ili ISIS 481549. Treća grupa miševa je intraperitonealno injektirana dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS, i služila je kao kontrolna grupa.
[0312] Sve procedure koje se odnose na rukovanje životinjama, negu i tretman, izvršene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institucionalni odbor za negu i korišćenje životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC). U vreme rutinskog nadgledanja, životinje su proveravane za bilo kakav efekat rasta tumora na normalno ponašanje, kao što je pokretljivost, konzumacija hrane, promene telesne težine i bilo koji drugi abnormalni efekat.
RNK analiza
[0313] RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Nivoi mišje STAT3 mRNK su takođe mereni primenom kompleta mSTAT3_LTS00664 za sondiranje prajmera, opisanog gore. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovan na ciklofilin. Kao što je prikazano u Tabeli 28, tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao je redukcijom i ljudskih i mišjih STAT3 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 28
Inhibicija STAT3 mRNK u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u NCI-H460 ksenograft modelu
ISIS br. ljudski STAT3 mišji STAT3 481464 34 0
481549 20 35
Uticaj na rast tumora
[0314] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,5 x a x b<2>, gde su a i b dugi i kratki prečnici tumora. Veličina tumora je korišćena za proračune T-C i TV/CVvrednosti. T-C je izračunat sa T kao srednjim vremenom (u danima) potrebnim da tumori u tretiranim grupama dostignu prethodno određenu veličinu (1500 mm<3>), i C kao srednjim vremenom (u danima) kako bi tumori u kontrolnoj grupi dostigli istu veličinu. TV/CVvrednost (eksprimirana kao procenat) je indikacija anti-tumorske efikasnosti ISIS oligonukleotida, gde su TVi CVsrednja zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, respektivno, na određeni dan (dan 20).
[0315] Rezultati su prikazani u Tabelama 29 i 30. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS 481464 ili ISIS 481549 značajno ometao rast tumora.
Tabela 29
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u NCI-H460 ksenograft modelu Dans PBS ISIS 481464 ISIS 481549 6 104 104 103 8 303 197 197 11 746 498 443 13 1,175 676 654 15 1,642 982 954 18 2,277 1,571 1,577 20 2,859 1,996 2,093 22 - 2,609 2,679
Tabela 30
Efekat antisens inhibicije STAT3 na inhibiciju rasta tumora u NCI-H460 ksenograft modelu
Tretman Veličina tumora (mm<3>) na dan TV/CV(%) T-C pri 1,500 mm<3>
20
PBS 1,210 - -
ISIS 481464 1,030 85 3
ISIS 481549 858 71 6
Merenje telesne težine
[0316] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, telesne težine su redovno merene tokom perioda tretmana. Podaci su prikazani u Tabeli 31 i pokazuju da tretman sa ISIS 481464 ili ISIS 481549 ne utiče na ukupno zdravlje miševa.
Tabela 31
Merenja telesne težine miševa u NCI-H460 ksenograft modelu Dan 6 Dan 8 Dan 11 Dan 13 Dan 15 Dan 18 Dan 20 Dan 22
PBS 20 20 20 20 20 20 21 -
ISIS 481464 20 20 20 20 19 19 20 20
ISIS 481549 20 20 20 20 20 19 20 20 Primer 20: Efekat antisens inhibicije ljudskog STAT3 u mišjem modelu ljudskog ortotopnog glioblastoma
[0317] NU/J miševi ortotopički implantirani sa ljudskim ćelijama glioblastoma su tretirani sa ISIS 455291, 5-10-5 MOE gapmer koji ima sekvencu CAGCAGATCAAGTCCAGGGA (SEQ ID NO: 1590). Procenjen je efekat tretmana na rast tumora i podnošljivost kod miševa.
Tretman
[0318] Trideset NU/J miševa je implantirano stereotaktički u desni frontalni režanj sa 5 x 10<5>U-87 MG-luc2 ćelija. Na dan 15 nakon implantacije tumorskih ćelija, 15 od ovih miševa je dozirano intrakranijalno sa bolus injekcijom na mestu implantacije tumora sa 100 µg ISIS 455291, koji je rastvoren u 2 µL PBS. Preostalih 15 miševa je dozirano intrakranijalno bolus injekcijom na mestu implantacije tumora sa 2 µL PBS. Druga grupa miševa je služila kao kontrolna grupa.
Analiza
[0319] Na dan 18 nakon transplantacije tumora, pet miševa iz svake grupe su eutanazirani sa CO2inhalacijom, i uzorci mozga su sakupljeni za RNK analizu. RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Tretman sa ISIS 455291 rezultovao je 27% redukcijom ljudske STAT3 mRNK u tumorskom tkivu u poređenju sa PBS kontrolom.
[0320] Preostali miševi u svakoj grupi su redovno praćeni do 2 nedelje za analizu preživljavanja. Medijan preživljavanja za PBS kontrolnu grupu bio je 30,5 dana. Medijalno preživljavanje miševa tretiranih ISIS oligonukleotidima je bilo 35 dana. Vrednost P je bila 0,2088.
Primer 21: Efekat tretmana sa ISIS 481549 u APC/min+ miševi
[0321] Procenjen je efekat tretmana sa ISIS 481549 na nivoe mRNK STAT3 i brojeve intestinalnog adenoma u APC/Min<+>mišjem modelu. APC/min<+>soj miševa je predisponiran za spontano formiranje crevnog adenoma u celom intestinalnom traktu u ranom uzrastu (Moser A.R. i dr., Science 1990.247: 322-324).
Tretman
[0322] Dve grupe od 4 mužjaka devet nedelja starih APC/min<+>miševima su subkutano injektirane sa 5 mg/kg ili 25 mg/kg ISIS 481549, primenjeno pet puta nedeljno (ukupne nedeljne doze od 25 mg/kg i 125 mg/kg, respektivno) tokom 4 nedelje. Grupa od 4 mužjaka devet nedelja starih APC/min<+>miševa je subkutano injektirana sa 50 mg/kg kontrolnog oligonukleotida, ISIS 141923, primenjeno pet puta nedeljno (ukupna nedeljna doza od 250 mg/kg) tokom 4 nedelje. Kontrolna grupa od 4 mužjaka devet nedelja starih APC/min<+>miševa je subkutano injektirana sa PBS koji je primenjen pet puta nedeljno tokom 4 nedelje. Miševi su eutanazirani sa sigurnošću praćenom cervikalnom dislokacijom 48 sati nakon završne injekcije.
[0323] Uklonjeni su debelo crevo i creva, odvojeni i očišćeni. Približno 5 cm gornjeg intestinalnog trakta je isečeno i homogenizovano u 2,5 mL RLT pufera (Qiagen) sa 1% 2-merkaptoetanola (RLT-BMe) i smešteno u suvi led. Debelo crevo je presečeno na pola i proksimalna polovina tkiva je homogenizovana u 2,5 mL RLT-BMe i stavljena u suvi led. Mali deo jetre (0,2 g) je isečen i homogenizovan u RLT-BMe i stavljen u suvi led.
RNK analiza
[0324] RNK je izolovana iz tkiva koristeći PureLink™ Total RNA Purification komplet (Invitrogen; # 12173-011A), prema protokolu proizvođača. RT-PCR je izveden korišćenjem StepOnePlus sistema (Applied Biosystems), prema protokolu proizvođača. Komplet mSTAT3_LTS000664 za sondiranje mišjeg prajmera (prednji prajmer CGACAGCTTCCCCATGGA, ovde označen kao SEQ ID NO: 1513; obrnuti prajmer ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC, ovde označen kao SEQ ID NO: 1514; sonda CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1515) je korišćena za merenje STAT3 mRNK nivoa. Nivo mRNK housekeeping gena, Ciklofilin, je meren sa setom uzorka prajmera mcyclo_24 (prednji prajmer TCGCCGCTTGCTGCA, ovde označen kao SEQ ID NO: 1516; obrnuti prajmer ATCGGCCGTGATGTCGA, ovde označen kao SEQ ID NO: 1517; sonda CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1518) i korišćen je za normalizaciju nivoa mRNK STAT3.
[0325] Tretman sa ISIS 481549 rezultovao je statistički značajnim smanjenjem eksprimiranja mRNK STAT3 u jetri pri doziranju od 25 mg/kg/nedelja i 125 mg/kg/nedelja u jetri, tankom crevu i debelom crevu (Tabela 32) u odnosu na PBS kontrolu. Značajne razlike između tretmana i kontrolnih grupa utvrđene su Studentovim dvosmernim t testom (p <0,05).
Tabela 32
Procenat inhibicije nivoa eksprimiranja STAT3 mRNK kod APC/Min<+>miševa Tretman (mg/kg/nedelja) Jetra Tanko crevo Debelo crevo ISIS 141923 (250) 0 0 0 ISIS 481549 (125) 98 73 82 ISIS 481549 (25) 79 41 32
Analiza broja adenoma
[0326] Izvršena je histološka analiza tankog creva kako bi se mikroskopski procenili brojevi adenoma. Tretman sa ISIS 481549 kod 125 mg/kg/nedeljno je rezultovao statistički značajnim smanjenjem broja tumora u poređenju sa PBS kontrolom (Tabela 33). Značajne razlike između tretmana i kontrolnih grupa utvrđene su Studentovim dvosmernim t testom (p <0,05).
Tabela 33
Broj adenoma kod APC/Min<+>miševa
Tretman (mg/kg/nedelja) Broj debelog creva
ISIS 141923 (250) 5
ISIS 481549 (125) 1
ISIS 481549 (25) 5
PBS 6
Primer 22: Uticaj antisens oligonukleotida koji ciljaju STAT3 u tretmanu PC-9 NSCLC ksenograft modela
[0327] BALB/c goli miševi (Charles River), inokulisani sa ćelijskom linijom ljudskog raka ne-malih ćelija pluća, PC-9, tretirani su sa ISIS 481549 i ISIS 481464. Procenjen je rast tumora i STAT3 ciljana redukcija kod miševa.
Tretman
[0328] Ženke BALB/c golih miševa starih od šest do osam nedelja su inokulirane potkožno sa 7 x 10<6>PC-9 ljudskih NSCLC ćelije. Miševi koji su pokazali srednju zapreminu tumora od 150-200 mm<3>su odabrani i randomizirani u različite grupe tretmana. Dve grupe od 7 miševa su injektirane subkutano sa 25 mg/kg ISIS 481549 ili ISIS 481464 primenjene pet puta nedeljno (ukupne nedeljne doze od 125 mg/kg) tokom 6 nedelja. Grupa od 7 miševa je injektirana subkutano sa 25 mg/kg ISIS 347526 (TCTTATGTTTCCGAACCGTT, bez poznatog mišjeg ili ljudskog cilja, ovde označena kao SEQ ID NO: 1519) koji je primenjen pet puta nedeljno (ukupne nedeljne doze od 125 mg/kg) 6 nedelja. Konačna doza antisens oligonukleotida data je 24 časa pre nego što su miševi eutanizovani.
RNK analiza
[0329] Tumori su sakupljeni i RNK je izolovana korišćenjem Qiagen RNAeasy Mini Kit (# 74106), prema protokolu proizvođača. Nivoi mRNK STAT3 su mereni upotrebom ABI StepOnePlus RT-PCR instrumenta sa kompletom RTS2033 za sondiranje ljudskog prajmera (prednji prajmer GAGGCCCGCCCAACA, ovde označen kao SEQ ID NO: 1520; obrnuti prajmer TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označen kao SEQ ID NO: 1521; ovde označen kao SEQ ID NO: 1522). Nivoi mRNK housekeeping gena, GAPDH, mereni su pomoću kompleta za sondiranje ljudskog prajmera (prednji prajmer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, ovde označen kao SEQ ID NO: 1523; reverzni prajmer GAAGATGGTGATGGGATTTC, ovde označen kao SEQ ID NO: 1524; kao SEQ ID NO: 1525) i korišćen je za normalizaciju nivoa RNK. Rezultati su prikazani u Tabeli 34 i ukazuju da antisens oligonukleotidi redukuju nivoe STAT3 mRNK.
Tabela 34
Procenat inhibicije nivoa eksprimiranja STAT3 mRNK u NSCLC ksenograft modelu u poređenju sa ASO kontrolom
Tretman (mg/kg) % inhibicije
ISIS 481464 (25) 40
ISIS 481549 (25) 22
Analiza rasta tumora
[0330] Tumori su mereni redovno tokom perioda ispitivanja. Inhibicija rasta tumora (TGI) izračunata je korišćenjem formule
TGI = [1 - (X od STAT3 ASO grupe (konačni)) - X od STAT3 ASO grupe (dan1)) / (X od kontrolne ASO grupe (konačni) – X od kontrolne ASO grupe (dan1))] x 100%, gde X = srednja zapremina tumora.
gde X = srednja zapremina tumora.
[0331] Razlika tretirane grupe i kontrolne grupe je procenjena korišćenjem statističkog testa ANOVA. Rezultati su prikazani u Tabeli 35. Podaci ukazuju da je rast tumora bio značajno inhibiran ISIS 481464 sa TGI od 97% do 52. dana. Tretman pomoću ISIS 481549 inhibirao je rast PC-9 tumora za 78%.
Tabela 35
Merenja rasta tumora u NSCLC ksenograft modelu
Dan 10 13 18 20 25 28 31 34 38 42 45 48 52
ISIS 481464 233 241 267 240 229 201 201 254 218 222 221 236 255
ISIS 481549 233 217 239 188 237 299 326 318 328 410 341 389 398
ISIS 347526 240 279 295 344 295 354 383 407 540 573 655 890 940
Analiza telesne težine
[0332] Masa tela je merena redovno tokom perioda ispitivanja. Rezultati su prikazani u Tabeli 36 i pokazuju da nije bilo značajnih promena u telesnoj težini tretiranih grupa u poređenju sa kontrolnim grupama.
Tabela 36
Merenja telesne težine u NSCLC ksenograft modelu
Dan 10 13 18 20 25 28 31 34 38 42 45 48 52
ISIS 18,65 19,44 18,98 19,66 19,40 19,45 19,89 20,26 19,86 20,31 20,13 20,03 20,11
481464
ISIS 18,13 19,06 18,65 19,30 19,31 19,36 19,23 19,18 18,28 17,21 16,49 15,48 15,01
481549
ISIS 18,34 19,29 19,05 19,65 19,63 19,98 20,08 20,69 19,90 20,19 20,25 20,09 20,19
347526
Primer 23: Efekat ISIS 481464 u tretmanu LG-476 NSCLC ksenograft modela [0333] NOD.Cg- Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ miševi (NSG; JAX # 5557), koji su imunodeficijentni, inokulisani su ljudskom ćelijskom linijom raka ne-malih pluća, LG-476 (Jackson Laboratory) i tretirani sa ISIS 481464. Rast tumora i STAT3 ciljano smanjenje je procenjeno kod miševa.
Tretman
[0334] Ženke NSG miševa stare četiri do šest nedelja su inokulirane potkožno sa LG-476 ljudskim NSCLC ćelijama i praćene tri puta nedeljno za klinička posmatranja, telesne težine i zapreminu tumora. Kad su tumori dostigli 1.000 mm<3>, tumori su sakupljeni i fragmentirani. Fragmenti tumora veličine 3-5 mm<3>su implantirani subkutano u desni stražnji bok 30 NSG miševa. Miševi su praćeni tri puta nedeljno. Kada su pojedinačni tumori dostigli zapreminu od 200-250 mm<3>, miševi su nasumično raspoređeni u 2 grupe i ubrizgani su 25 mg/kg ISIS 481464 ili PBS, primenjeno 5 puta nedeljno (nedeljne doze od 125 mg/kg) tokom 3 nedelje. Tumori su sakupljeni 24 sata nakon poslednje doze.
RNK analiza
[0335] Lizati iz tumora su pripremljeni upotrebom ABI StepOnePlus RT-PCR instrumenta sa kompletom RTS2033 za sondiranje prajmera specifičnih za ljude. Nivoi mRNK housekeeping gena, Ciklofilin, mereni su kompletom za sondiranje prajmera specifičnih za ljude (prednji prajmer GACGGCGAGCCCTTGG, ovde označen kao SEQ ID NO: 1526; reverzni prajmer TGCTGTCTTTGGGACCTTGTC, ovde označen kao SEQ ID NO: 1527; sonda CCGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTCG ovde označena kao SEQ ID NO: 1528).
Značajne razlike između tretmana i kontrolnih grupa utvrđene su pomoću Studentovog dvosmernog t test (p <0,05).
[0336] Tretman sa ISIS 481464 rezultovao je 43% smanjenjem nivoa STAT3 mRNK u težini tumora u poređenju sa PBS kontrolom (Slika 8), što je statistički značajno.
Analiza proteina
[0337] Ukupni lizati ćelija su pripremljeni homogenizacijom tumora u ledeno hladnom testu radio-imunoprecipitacije (RIPA) koji sadrži koktel inhibitora proteaze. Lizati su analizirani pomoću Western blot testa korišćenjem STAT3 antitela (Abcam Antibodies, #ab32500).
Takođe su ispitivani housekeeping proteini, citokromoksidaza II (COXII; #ab79393) i survivin (#ab76424). Nivoi STAT3 su normalizovani ili na COXII protein ili na survivin protein i kvantifikovani korišćenjem softvera ImageJ.
[0338] Tretman sa ISIS 481464 rezultovao je 50% smanjenjem nivoa STAT3 proteina u masi tumora u poređenju sa PBS kontrolom, što je statistički značajno.
Analiza rasta tumora
[0339] Tumori su mereni redovno tokom perioda ispitivanja. Tretman sa ISIS 481464 doveo je do smanjenja zapremine tumora za približno 39% u poređenju sa PBS kontrolom.
Primer 24: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u PC9 ćelije
[0340] ISIS 481464, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u PC9 ćelijama, ćelijskoj liniji karcinoma ne-malih ćelija pluća. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 37. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0341] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 37. Kao što je ilustrovano u Tabeli 37, ISIS 481464 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 37
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane PC9 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 20 51 84 94 96 0,19
Primer 25: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u C42B ćelijama
[0342] ISIS 481464, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u C42B ćelijama, ćelijskoj liniji kancera prostate. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 38. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0343] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 38. Kao što je ilustrovano u Tabeli 38, ISIS 481464 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 38
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane C42B ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 21 38 75 87 96 0,45 Primer 26: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u Colo201 ćelijama
[0344] ISIS 481464, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u Colo201 ćelijama, ćelijskoj liniji kolorektalnog karcinoma. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 39. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0345] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 39. Kao što je ilustrovano u Tabeli 39, ISIS 481464 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 39
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane Colo201 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 36 53 81 93 96 0,09
Primer 27: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u BT474M1 ćelijama
[0346] ISIS 481464, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u BT474M1 ćelijama, ćelijskoj liniji karcinoma dojke. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 40. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0347] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 40. Kao što je ilustrovano u Tabeli 40, ISIS 481464 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 40
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane BT474M1 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 13 25 74 94 95 0,24
Primer 28: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u H929 ćelijama
[0348] ISIS 481464, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u ćelijama H929, ćelijska linija multiplog mijeloma. Ćelije su nanesene pri gustini od 10,000-12,000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,01 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 41. Posle približno 72 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK u STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0349] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 41. Kao što je ilustrovano u Tabeli 41, ISIS 481464 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 41
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane H929 ćelija
ISIS br. 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 91 95 95 95 0,04
Primer 29: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u MM1R ćelijama
[0350] ISIS 481464, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u MM1R ćelijama, ćelijska linija multiplog mijeloma. Ćelije su nanesene pri gustini od 10,000-12,000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,01 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 42. Posle približno 72 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK u STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0351] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 42. Kao što je ilustrovano u Tabeli 42, ISIS 481464 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 42
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane MM1R ćelija
ISIS br. 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
481464 91 96 95 95 0,04
Primer 30: Uticaj antisens oligonukleotida koji ciljaju STAT3 u tretmanu ksenograft modela SK-OV3 raka jajnika
[0352] BALB/c goli miševi su inokulisani sa ćelijskom linijom ljudskog karcinoma jajnika, SK-OV3 i tretirani sa ISIS 481464 ili ISIS 481549. ISIS 481549 je unakrsno reaktivan sa sekvencom miša (tj., hibridizuje se na mišju sekvencu).
Studija 1
[0353] Ćelije ljudskog raka jajnika SK-OV3 (približno 100 mm<3>) su intraperitonealno injektirane u gole miševe. Deset dana kasnije, miševi su inokulirani subkutano sa 25 mg/kg ISIS 481464 ili ISIS 481549, primenjeni dva puta nedeljno tokom 11 nedelja. Miševi su eutanazirani 24 sata nakon konačne doze.
RNK analiza
[0354] Lizati su pripremljeni korišćenjem kompleta za ekstrakciju RNK (Invitrogen) u RT-PCR analizi nivoa STAT3 mRNK, upotrebom kompleta za sondiranje ljudskog prajmera (RTS2033) i kompleta za sondiranje mišjeg prajmera (mSTAT3-LTS0664). Rezultati su prikazani u Tabeli 43. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao redukcijom i ljudskih i mišjih STAT3 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 43
Procenat inhibicije STAT3 mRNK u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u SK-OV3 ksenograft modelu
ISIS br. ljudski STAT3 mišji STAT3 481464 63 0
481549 21 61
Analiza proteina
[0355] Lizati su pripremljeni sa RIPA puferom za Western blot analizu nivoa STAT3 proteina, koristeći antitelo protiv fosforilovanog STAT3 (Cell Signaling). Rezultati su prikazani na Slici 1. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS 481549 rezultovao redukcijom fosforilovanog STAT3 proteina u poređenju sa PBS kontrolom.
Analiza nivoa IL-6
[0356] Lizati su pripremljeni korišćenjem kompleta za ekstrakciju RNK (Invitrogen) za RT-PCR analizu nivoa IL-6 mRNK, upotrebom seta za sondu prajmera mIL6-LTS00629.
Rezultati su prikazani u Tabeli 44. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije IL-6, u odnosu na PBS kontrolu. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS 481549 rezultovao značajnim smanjenjem i IL-6 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 44
Procenat inhibicije IL-6 mRNK u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u SK-OV3 ksenograft modelu
ISIS br. Mišji IL-6 (%)
481464 8
481549 54
Analiza težine tumora
[0357] Tumori su sakupljeni. Izmerene su težine tumora i rezultati su prikazani u Tabeli 45. Rezultati su prikazani kao procenat težine PBS kontrole tumora. Podaci ukazuju da je tretman sa ISIS 481549 rezultovao značajnim smanjenjem težine tumora u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 45
Procenat smanjenja težine tumora u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u SK-OV3 ksenograft modelu
ISIS br. Težina (%)
481464 58
481549 89
Studija 2
[0358] Ćelijse ljudskog raka jajnika SK-OV3 (približno 100 mm<3>) su potkožno inokulisane u gole miševe. Deset dana kasnije, miševi su inokulisani intraperitonealno sa 50 mg/kg bilo ISIS 481464 ili 50 mg/kg ISIS 481464 i ISIS 481549 u kombinaciji, primenjenih pet puta nedeljno tokom 6 nedelja. Miševi su eutanazirani 24 sata nakon konačne doze.
Analiza zapremina tumora
[0359] Tumori su redovno korišćeni uz pomoć Vernier šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu, zapremina tumora = 1⁄2 (dužina x širina<2>). Rezultati su prikazani na Slici 2. Podaci ukazuju da je tretman miševa kombinacijom ISIS 481464 i ISIS 481549 rezultovao značajnom inhibicijom rasta tumora.
Primer 31: Studija podnošljivosti ISIS 481464 kod cinomolgus majmuna
[0360] Procenjene su efikasnost i podnošljivost ISIS 481464 kod cinomolgus majmuna.
Tretman
[0361] Muški i ženski naivni cinomolgus majmuni su raspoređeni u pet grupa za tretman. Tri grupe od po 5 majmuna su dobijale početne doze od 3 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg svaka dva dana tokom prve nedelje ispitivanja (na dan 1, 3, 5 i 7) nakon čega je usledila primena jednom nedeljno nakon toga (počevši od 14. dana). Kontrolna grupa od 5 majmuna primila je PBS svaka dva dana tokom prve nedelje ispitivanja (na dan 1, 3, 5 i 7) kao početne doze, nakon čega je usledila primena jednom nedeljno (počevši od 14. dana). Ove doze su davane putem jednosatne intravenske (i.v.) infuzije. Peta grupa od 5 majmuna primila je početne doze od 30 mg/kg subkutano svaka dva dana tokom prve nedelje ispitivanja (na dan 1, 3, 5 i 7) nakon čega je usledila subkutana (sc) primena jednom nedeljno (počevši od 14. dana).
[0362] Za i.v. infuzije, životinje su bile vezane, bez sedacije, na stolicama za vezivanje. Kateter je stavljen u jednu od cefalnih vena i ISIS 481464 rastvor u odgovarajućoj dozi je infundiran konstantnom brzinom tokom približno 1 sata pomoću kalibrisane pumpe šprica (Stoelting Co, USA). Mesto doziranja je rotirano između desne i leve ruke i zabeleženo je vreme doziranja. Brzina infuzije je odabrana da isporuči izračunati obim doze i preciznost pumpi je praćena i zabeležena za svaku dozu. Na kraju perioda infuzije, rastvor za doziranje je prebačen u PBS. U slučaju s.c. primene, injekcije su izvršene u rotaciji u pravcu kazaljke na satu na 4 mesta na leđima. Mesta ubrizgavanja su održavana periodičnim brijanjem i trajno numerisana tetoviranjem.
[0363] Tri majmuna iz svake grupe su žrtvovani 44. dana, što je bilo približno 48 sati nakon poslednje doze na dan 42. Ostala 2 majmuna iz svake grupe su posmatrana za toksikološke efekte. Planirana eutanazija životinja sprovedena je eksangvinacijom nakon anestezije izazvane ketamin/ksilazinom i primenom natrijum pentobarbitala. Protokoli opisani u Primeru odobreni su od strane Odbora za institucionalnu negu i upotrebu životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC).
RNK analiza
[0364] Tkivo jetre je homogenizovano u 3 mL pufera za lizu RLT (Qiagen) dopunjeno sa 1% 2-merkaptoetanola (Sigma). RNK je prečišćena iz dobijenog homogenata upotrebom Qiagen RNeasy ploče sa 96 komorica za prečišćavanje RNK, prema protokolu proizvođača. Posle prečišćavanja, RNK uzorci su podvrgnuti RT-PCR analizi koristeći Perkin-Elmer ABI Prism 7700 sistem za detekciju sekvence i STAT3 set pondera RTS3235 (prednji prajmer AAGTTTATCTGTGTGACACCAACGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1532; SEQ ID NO: 1533; sonda TGCCGATGTCCCCCCGCA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1534). Nivoi mRNK STAT3 su normalizovani na CiclophilinA majmuna, koji je kvantifikovan upotrebom seta uzorka primera mk_cycloA_2<nd>(napredni prajmer TGCTGGACCCAACACAAATG, ovde označena kao SEQ ID NO: 1535; reverzni prajmer TGCCATCCAACCACTCAGTC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1536; sonda TTCCCAGTTTTTCATCTGCACTGCCAX, ovde označena kao SEQ ID NO: 1537).
[0365] Tretman sa ISIS 481464 koncentracijom doze od 30 mg/kg ili preko i.v. infuzija ili s.c. injekcija rezultovala je statistički značajnim smanjenjem eksprimiranja mRNK STAT3 u jetri (Tabela 46) u poređenju sa PBS kontrolom. Značajne razlike između tretmana i kontrolnih grupa utvrđene su pomoću Studentovog t testa (p <0,05).
Tabela 46
Procenat inhibicije nivoa STAT3 mRNK kod cinomolgus majmuna Tretman % inhibicije 3 mg i.v. 0
10 mg i.v. 7
30 mg i.v. 52
30 mg s.c. 51
Analiza proteina
[0366] Tkivo jetre je homogenizovano u 1 mL ledeno hladnog RIPA pufera (Sigma) koji sadrži inhibitorne koktele i proteaze i fosfataze (Roche). Ukupni lizati su odvojeni sa Bis-Tris PAGE (Invitrogen), prebačeni na PVDF membranu i imunoblotovani primenom primarnih antitela za STAT3 (Cell Signaling, # 9132) i GAPDH (Advanced Immunochemicals, # 06-1-G4-C5). Imunospecifične trake su detektovane pomoću Enhanced Chemiluminescence Plus detekcionog kompleta (Amersham Biosciences) nakon izlaganja rendgenskom filmu.
Intenzitet traka je zatim skeniran i kvantifikovan korišćenjem softvera ImageJ. Značajne razlike između tretmana i kontrolnih grupa utvrđene su pomoću Studentovog t testa (p <0,05).
[0367] Došlo je do dozno-zavisnog smanjenja nivoa STAT3 proteina, kao što je prikazano u Tabeli 47, sa 33% i 82% smanjenja pri 3 mg/kg/nedeljno i 10 mg/kg/nedeljno. Protein STAT3 nije bio detektovan na 30 mg/kg/nedeljno bez obzira na put doziranja.
Tabela 47
Procenat inhibicije STAT3 protein levels kod cinomolgus majmuna Tretman % inhibicije 3 mg i.v. 33
10 mg i.v. 82
30 mg i.v. 100
30 mg s.c. 100
Funkcija jetre
[0368] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, prikupljeni su uzorci krvi iz svih studijskih grupa. Uzorci krvi su sakupljeni preko femoralne venepunkture 44. dana, 48 sati nakon doziranja. Uzorci krvi (1 mL) su sakupljeni u epruvetama bez antikoagulanta za separaciju seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi približno 60 min i zatim centrifugirane na 3.000 rpm tokom 10 minuta kako bi se dobio serum. Nivoi različitih markera funkcije jetre su mereni korišćenjem Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). Izmereni su nivoi ALT i AST u plazmi, i rezultati su prikazani u Tabeli 48, eksprimirani u IU/L. Podaci o muškim i ženskim majmunima prikazani su odvojeno. Rezultati ukazuju da tretman sa ISIS 481464 nije imao efekta na funkciju jetre izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.
Tabela 48
Efekat tretmana antisens oligonukleotidom na markere funkcionisanja jetre u plazmi cinomolgus majmuna
Mužjaci ALT Ženke ALT Mužjaci AST Ženke AST (IU/L) (IU/L) (IU/L) (IU/L)
PBS 59 69 83 69
3 mg/kg i.v. 47 56 50 47 10 mg/kg i.v. 56 89 70 60 30 mg/kg i.v. 74 75 60 73 30 mg/kg s.c. 62 78 61 92
Funkcija bubrega
[0369] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, uzeti su uzorci krvi iz svih studijskih grupa. Uzorci krvi su sakupljeni preko femoralne venepunkture 44. dana, 48 sati nakon doziranja. Uzorci krvi (1 mL) su sakupljeni u epruvetama bez antikoagulanta za separaciju seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi približno 60 min i zatim centrifugirane na 3.000 rpm tokom 10 minuta kako bi se dobio serum. Nivoi različitih markera funkcije bubrega su mereni korišćenjem Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). Rezultati su prikazani u Tabeli 49, eksprimirani u mg/dL. Podaci o hemiji plazme ukazuju da tretman sa ISIS 481464 nije imao nikakvog efekta na funkciju bubrega izvan očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.
Tabela 49
Efekat tretmana antisens oligonukleotidom na nivoe plazma BUN i kreatinina (mg/dL) kod cinomolgus majmuna
Mužjaci Ženke BUN Mužjaci Kreatinin Ženke Kreatinin BUN
PBS 19 30 0,68 0,88
3 mg/kg i.v. 23 28 0,85 0,86 10 mg/kg i.v. 26 27 0,89 0,94 30 mg/kg i.v. 25 26 0,91 0,86 30 mg/kg s.c. 27 28 0,97 0,85
Merenje telesne težine
[0370] kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, merene su telesne težine i prikazane su u Tabelama 50 i 51. Rezultati ukazuju da je efekat tretmana sa ISIS 481464 na telesne težine bio unutar očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.
Tabela 50
Efekat tretmana antisens oligonukleotidom na telesne težine (g) kod mužjaka cinomolgus majmuna
Dan 1 Dan 7 Dan 14 Dan 21 Dan 28 Dan 35 Dan 42
PBS 2523 2463 2484 2471 2509 2523 2551
3 mg/kg i.v. 2604 2564 2594 2572 2589 2654 2687 10 mg/kg i.v. 2603 2453 2581 2561 2591 2633 2655 30 mg/kg i.v. 2608 2583 2613 2644 2668 2713 2776 30 mg/kg s.c. 2533 2441 2470 2521 2554 2609 2619 Tabela 51
Efekat tretmana antisens oligonukleotidom na telesne težine (g) kod ženki cinomolgus majmuna
Dan 1 Dan 7 Dan 14 Dan 21 Dan 28 Dan 35 Dan 42
PBS 2266 2252 2276 2237 2362 2365 2373
3 mg/kg i.v. 2253 2242 2283 2250 2346 2350 2377 10 mg/kg i.v. 2293 2277 2318 2254 2358 2387 2361 30 mg/kg i.v. 2259 2261 2289 2268 2368 2412 2406 30 mg/kg s.c. 2293 2275 2322 2281 2385 2389 2394
Primer 32: Antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama
[0371] antisens oligonukleotidi su dizajnirani za ciljanje STAT3 nukleinske kiseline i testirani su za svoje efekte na STAT3 mRNK in vitro. Kultivisane HuVEC ćelije pri gustini od 5,000 ćelija po komorici su transfektovane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 30 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet RDS2033 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 5; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 6; sekvencija probe CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 7) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0372] Himerni antisens oligonukleotidi u Tabelama 52 i 53 su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde se centralni segment jaza sastoji od deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima koja sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5' segmentu krila i svaki nukleotid u 3' segmentu krila ima 2'-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. „Početno mesto ljudskog cilja“ označava naj-5' nukleozid na koji je gapmer ciljan u ljudskoj sekvenci gena.
„Zaustavno mesto ljudskog cilja“ označava naj-3' nukleozid na koji je gapmer ciljana sekvenca ljudskog gena. Svaki gapmer koji je naveden u Tabeli 52 je ciljan na ljudsku STAT3 mRNK, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM-139276,2). Svaki gapmer naveden u Tabeli 53 je ciljan na ljudsku STAT3 genomsku sekvencu, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 2 (komplement GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćena od nukleotida 4185000 do 4264000).
[0373] Potentnost gapmera je upoređena sa ISIS 337332, ISIS 337333 i ISIS 345785, koji su takođe 5-10-5 MOE gapmeri koji ciljaju na STAT3 i koji su dalje opisani u USPN 7,307,069.
Tabela 52
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida koji imaju 5-10-5
MOE krila i dezoksi jaz koji cilja SEQ ID NO: 1
ISIS BR. Ljudsko Ljudsko Sekvenca % inhibicije SEQ ID početno zaustavno NO mesto mesto
337332 1898 1917 GAAGCCCTTGCCAGCCATGT 91 1541
337333 1903 1922 AAGGAGAAGCCCTTGCCAGC 87 1542
345785 2267 2286 TGCCTCCTCCTTGGGAATGT 82 1543
455860 2831 2850 ACACAAGACATTTCCTTTTT 64 1544
455246 3452 3471 CAAGGAGGCTGTTAACTGAA 84 1545
455247 3454 3473 ACCAAGGAGGCTGTTAACTG 78 1546
455248 3456 3475 GCACCAAGGAGGCTGTTAAC 69 1547
455249 3458 3477 AAGCACCAAGGAGGCTGTTA 83 1548
455250 3460 3479 TAAAGCACCAAGGAGGCTGT 77 1549
455251 3462 3481 CTTAAAGCACCAAGGAGGCT 78 1550
455252 3464 3483 TGCTTAAAGCACCAAGGAGG 80 1551
455253 3466 3485 AATGCTTAAAGCACCAAGGA 75 1552
455254 3468 3487 TGAATGCTTAAAGCACCAAG 80 1553
455255 3470 3489 GCTGAATGCTTAAAGCACCA 82 1554
455256 3472 3491 AAGCTGAATGCTTAAAGCAC 67 1555
455257 3474 3493 GGAAGCTGAATGCTTAAAGC 79 1556
455258 3476 3495 AAGGAAGCTGAATGCTTAAA 79 1557
455259 3478 3497 TGAAGGAAGCTGAATGCTTA 72 1558
455260 3480 3499 CCTGAAGGAAGCTGAATGCT 75 1559
455261 3527 3546 TAAGGGTTTGACCTGAAGCC 72 1560
455262 3577 3596 TAAACCTTCCTATTTCAACA 77 1561 455263 3579 3598 CTTAAACCTTCCTATTTCAA 64 1562 455264 3581 3600 TCCTTAAACCTTCCTATTTC 73 1563 455265 3583 3602 TCTCCTTAAACCTTCCTATT 87 1564 455266 3585 3604 ATTCTCCTTAAACCTTCCTA 80 1565 455267 3587 3606 AGATTCTCCTTAAACCTTCC 87 1566 455268 3589 3608 TTAGATTCTCCTTAAACCTT 84 1567 455269 3591 3610 GCTTAGATTCTCCTTAAACC 87 1568 455270 3593 3612 ATGCTTAGATTCTCCTTAAA 87 1569 455271 3595 3614 AAATGCTTAGATTCTCCTTA 89 1570 455272 3597 3616 TAAAATGCTTAGATTCTCCT 88 1571 455273 3639 3658 ATACATTACAAAGGAAAATA 12 1572 455274 3641 3660 CAATACATTACAAAGGAAAA 28 1573 455275 3673 3692 CACCCTCTGCCCAGCCTTAC 63 1574 455276 3675 3694 AGCACCCTCTGCCCAGCCTT 79 1575 455277 3677 3696 TAAGCACCCTCTGCCCAGCC 65 1576 455278 3679 3698 TGTAAGCACCCTCTGCCCAG 62 1577 455279 3681 3700 GTTGTAAGCACCCTCTGCCC 62 1578 455280 3683 3702 AGGTTGTAAGCACCCTCTGC 75 1579 455281 3685 3704 CAAGGTTGTAAGCACCCTCT 83 1580 455282 3687 3706 GTCAAGGTTGTAAGCACCCT 86 1581 455283 3689 3708 GAGTCAAGGTTGTAAGCACC 69 1582 455284 3691 3710 GGGAGTCAAGGTTGTAAGCA 37 1583 455285 3693 3712 AAGGGAGTCAAGGTTGTAAG 56 1584 455286 3695 3714 GAAAGGGAGTCAAGGTTGTA 61 1585 455287 3697 3716 GAGAAAGGGAGTCAAGGTTG 56 1586 455288 3709 3728 ATCAAGTCCAGGGAGAAAGG 55 1587 455289 3711 3730 AGATCAAGTCCAGGGAGAAA 69 1588 455290 3713 3732 GCAGATCAAGTCCAGGGAGA 80 1589 455291 3715 3734 CAGCAGATCAAGTCCAGGGA 90 1590 455292 3717 3736 AACAGCAGATCAAGTCCAGG 77 1591 455293 3719 3738 GAAACAGCAGATCAAGTCCA 81 1592 455294 3721 3740 CTGAAACAGCAGATCAAGTC 75 1593 455295 3723 3742 CTCTGAAACAGCAGATCAAG 76 1594 455296 3725 3744 GCCTCTGAAACAGCAGATCA 74 1595 455297 3727 3746 TAGCCTCTGAAACAGCAGAT 75 1596 455298 3729 3748 CCTAGCCTCTGAAACAGCAG 76 1597 455299 3731 3750 AACCTAGCCTCTGAAACAGC 83 1598 455300 3733 3752 ACAACCTAGCCTCTGAAACA 57 1599 455301 3735 3754 AAACAACCTAGCCTCTGAAA 72 1600 455302 3737 3756 AGAAACAACCTAGCCTCTGA 78 1601 455303 3739 3758 ACAGAAACAACCTAGCCTCT 69 1602 455304 3741 3760 CCACAGAAACAACCTAGCCT 70 1603 455305 3743 3762 ACCCACAGAAACAACCTAGC 80 1604 455306 3745 3764 GCACCCACAGAAACAACCTA 70 1605 455307 3747 3766 AGGCACCCACAGAAACAACC 75 1606 455308 3749 3768 TAAGGCACCCACAGAAACAA 70 1607 455309 3751 3770 GATAAGGCACCCACAGAAAC 65 1608 455310 3753 3772 CTGATAAGGCACCCACAGAA 66 1609 455311 3755 3774 CCCTGATAAGGCACCCACAG 81 1610 455312 3757 3776 AGCCCTGATAAGGCACCCAC 79 1611 455313 3759 3778 CCAGCCCTGATAAGGCACCC 74 1612 455314 3761 3780 TCCCAGCCCTGATAAGGCAC 74 1613 455315 3763 3782 TATCCCAGCCCTGATAAGGC 66 1614 455316 3765 3784 AGTATCCCAGCCCTGATAAG 48 1615 455317 3767 3786 GAAGTATCCCAGCCCTGATA 63 1616 455318 3769 3788 CAGAAGTATCCCAGCCCTGA 82 1617 455319 3771 3790 ATCAGAAGTATCCCAGCCCT 80 1618 455320 3879 3898 GATTCCTAAAACAAACAGGA 37 1619 455321 3881 3900 AGGATTCCTAAAACAAACAG 42 1620 455322 3883 3902 CCAGGATTCCTAAAACAAAC 72 1621 455323 3885 3904 GACCAGGATTCCTAAAACAA 71 1622 455324 3887 3906 GAGACCAGGATTCCTAAAAC 43 1623 455325 3889 3908 CTGAGACCAGGATTCCTAAA 77 1624 455326 3891 3910 TCCTGAGACCAGGATTCCTA 76 1625 455327 3893 3912 GGTCCTGAGACCAGGATTCC 69 1626 455328 3895 3914 GAGGTCCTGAGACCAGGATT 76 1627 455329 3897 3916 ATGAGGTCCTGAGACCAGGA 81 1628 455330 3899 3918 CCATGAGGTCCTGAGACCAG 84 1629 455331 3901 3920 TTCCATGAGGTCCTGAGACC 75 1630 455332 3903 3922 TCTTCCATGAGGTCCTGAGA 75 1631 455333 3905 3924 CTTCTTCCATGAGGTCCTGA 79 1632 455334 3907 3926 CTCTTCTTCCATGAGGTCCT 83 1633 455335 3909 3928 CCCTCTTCTTCCATGAGGTC 74 1634 455336 3911 3930 CCCCCTCTTCTTCCATGAGG 72 1635 455337 3913 3932 CTCCCCCTCTTCTTCCATGA 72 1636 455338 3977 3996 CCTGAGCTCAACCAGACACG 79 1637 455339 3979 3998 TCCCTGAGCTCAACCAGACA 73 1638 455340 3981 4000 ATTCCCTGAGCTCAACCAGA 75 1639 455341 3983 4002 ATATTCCCTGAGCTCAACCA 65 1640 455342 3985 4004 CCATATTCCCTGAGCTCAAC 78 1641 455343 3987 4006 AACCATATTCCCTGAGCTCA 81 1642 455344 3989 4008 AGAACCATATTCCCTGAGCT 77 1643 455345 3991 4010 TAAGAACCATATTCCCTGAG 73 1644 455346 3993 4012 GCTAAGAACCATATTCCCTG 81 1645 455347 4067 4086 TCAGTAAGCCTTTGCCCTGC 79 1646 455348 4069 4088 TATCAGTAAGCCTTTGCCCT 72 1647 455349 4071 4090 TTTATCAGTAAGCCTTTGCC 76 1648 455350 4073 4092 AGTTTATCAGTAAGCCTTTG 84 1649 455351 4075 4094 CAAGTTTATCAGTAAGCCTT 82 1650 455352 4077 4096 CTCAAGTTTATCAGTAAGCC 82 1651 455353 4079 4098 GACTCAAGTTTATCAGTAAG 70 1652 455354 4081 4100 CAGACTCAAGTTTATCAGTA 78 1653 455355 4083 4102 GGCAGACTCAAGTTTATCAG 67 1654 455356 4085 4104 AGGGCAGACTCAAGTTTATC 51 1655 455357 4087 4106 CGAGGGCAGACTCAAGTTTA 54 1656 455358 4089 4108 TACGAGGGCAGACTCAAGTT 56 1657 455359 4091 4110 CATACGAGGGCAGACTCAAG 59 1658 455360 4093 4112 CTCATACGAGGGCAGACTCA 74 1659 455361 4095 4114 CCCTCATACGAGGGCAGACT 67 1660 455362 4122 4141 CAGCCTCAGAGGGAGGCCAG 40 1661 455363 4124 4143 ACCAGCCTCAGAGGGAGGCC 34 1662 455364 4126 4145 TCACCAGCCTCAGAGGGAGG 49 1663 455365 4128 4147 AGTCACCAGCCTCAGAGGGA 50 1664 455366 4225 4244 CCCATACGCACAGGAGAGGC 81 1665 455367 4227 4246 TTCCCATACGCACAGGAGAG 72 1666 455368 4229 4248 TGTTCCCATACGCACAGGAG 80 1667 455369 4231 4250 GGTGTTCCCATACGCACAGG 76 1668 455370 4233 4252 TAGGTGTTCCCATACGCACA 87 1669 455371 4235 4254 GCTAGGTGTTCCCATACGCA 92 1670 455372 4237 4256 GTGCTAGGTGTTCCCATACG 81 1671 455373 4304 4323 GAGGCAAGGTGGTTTTGAGT 55 1672 455374 4306 4325 CTGAGGCAAGGTGGTTTTGA 74 1673 455375 4308 4327 AGCTGAGGCAAGGTGGTTTT 79 1674 455376 4310 4329 TCAGCTGAGGCAAGGTGGTT 80 1675 455377 4312 4331 GATCAGCTGAGGCAAGGTGG 77 1676 455378 4314 4333 CTGATCAGCTGAGGCAAGGT 60 1677 455379 4316 4335 CTCTGATCAGCTGAGGCAAG 74 1678 455380 4318 4337 AACTCTGATCAGCTGAGGCA 77 1679 455381 4320 4339 GAAACTCTGATCAGCTGAGG 78 1680 455382 4322 4341 CAGAAACTCTGATCAGCTGA 78 1681 455383 4360 4379 CAGAGACCAGCTAATTTGAT 69 1682 455384 4362 4381 TTCAGAGACCAGCTAATTTG 78 1683 455385 4364 4383 AATTCAGAGACCAGCTAATT 77 1684 455386 4366 4385 TTAATTCAGAGACCAGCTAA 83 1685 455387 4423 4442 CTCCAGGCAGGAGGACTGGG 79 1686 455388 4425 4444 GTCTCCAGGCAGGAGGACTG 65 1687 455389 4427 4446 CTGTCTCCAGGCAGGAGGAC 57 1688 455390 4429 4448 AACTGTCTCCAGGCAGGAGG 75 1689 455391 4431 4450 TCAACTGTCTCCAGGCAGGA 86 1690 455392 4433 4452 CATCAACTGTCTCCAGGCAG 80 1691 455393 4435 4454 CACATCAACTGTCTCCAGGC 86 1692 455394 4437 4456 GACACATCAACTGTCTCCAG 85 1693 455395 4471 4490 GAAGAGTGTTGCTGGAGAAG 73 1694 455396 4473 4492 CTGAAGAGTGTTGCTGGAGA 78 1695 455397 4475 4494 TACTGAAGAGTGTTGCTGGA 83 1696 455398 4477 4496 TGTACTGAAGAGTGTTGCTG 86 1697 455399 4479 4498 TATGTACTGAAGAGTGTTGC 74 1698 455400 4481 4500 ATTATGTACTGAAGAGTGTT 74 1699 455401 4483 4502 TTATTATGTACTGAAGAGTG 84 1700 455402 4485 4504 GCTTATTATGTACTGAAGAG 84 1701 455403 4487 4506 AAGCTTATTATGTACTGAAG 77 1702 455404 4489 4508 TTAAGCTTATTATGTACTGA 75 1703 455405 4491 4510 AGTTAAGCTTATTATGTACT 81 1704 455406 4493 4512 TCAGTTAAGCTTATTATGTA 58 1705 455407 4495 4514 TATCAGTTAAGCTTATTATG 65 1706 455408 4497 4516 TTTATCAGTTAAGCTTATTA 46 1707 455409 4499 4518 TGTTTATCAGTTAAGCTTAT 68 1708 455410 4501 4520 TCTGTTTATCAGTTAAGCTT 83 1709 455411 4539 4558 AACCCAATGGTAAGCCCAAG 87 1710 455412 4541 4560 TAAACCCAATGGTAAGCCCA 87 1711 455413 4543 4562 TTTAAACCCAATGGTAAGCC 78 1712 455414 4545 4564 GATTTAAACCCAATGGTAAG 31 1713 455415 4547 4566 ATGATTTAAACCCAATGGTA 71 1714 455416 4549 4568 CTATGATTTAAACCCAATGG 67 1715 455417 4551 4570 CCCTATGATTTAAACCCAAT 70 1716 455418 4553 4572 GTCCCTATGATTTAAACCCA 83 1717 455419 4555 4574 AGGTCCCTATGATTTAAACC 64 1718 455420 4589 4608 TATCTGCTCCAGAGAAGCCC 76 1719 455421 4591 4610 AATATCTGCTCCAGAGAAGC 78 1720 455422 4614 4633 CTACCTAAGGCCATGAACTT 74 1721 455423 4616 4635 TGCTACCTAAGGCCATGAAC 82 1722 455424 4618 4637 CATGCTACCTAAGGCCATGA 84 1723 455425 4636 4655 CAGAGTTAAGACCAGATACA 84 1724 455426 4638 4657 ATCAGAGTTAAGACCAGATA 83 1725 455427 4640 4659 CAATCAGAGTTAAGACCAGA 77 1726 455428 4642 4661 TACAATCAGAGTTAAGACCA 81 1727 455429 4644 4663 GCTACAATCAGAGTTAAGAC 86 1728 455430 4646 4665 TTGCTACAATCAGAGTTAAG 85 1729 455431 4648 4667 TTTTGCTACAATCAGAGTTA 85 1730 455432 4650 4669 ACTTTTGCTACAATCAGAGT 73 1731 455433 4652 4671 GAACTTTTGCTACAATCAGA 80 1732 455434 4654 4673 CAGAACTTTTGCTACAATCA 82 1733 455435 4656 4675 CTCAGAACTTTTGCTACAAT 79 1734 455436 4658 4677 CTCTCAGAACTTTTGCTACA 76 1735 455437 4660 4679 TCCTCTCAGAACTTTTGCTA 75 1736 455438 4662 4681 GCTCCTCTCAGAACTTTTGC 85 1737 455439 4664 4683 CAGCTCCTCTCAGAACTTTT 85 1738 455440 4666 4685 CTCAGCTCCTCTCAGAACTT 80 1739 455441 4668 4687 GGCTCAGCTCCTCTCAGAAC 75 1740 455442 4770 4789 GCAACCCACGGGATTCCCTC 82 1741 455443 4772 4791 AAGCAACCCACGGGATTCCC 77 1742 455444 4774 4793 GTAAGCAACCCACGGGATTC 74 1743 455445 4776 4795 AGGTAAGCAACCCACGGGAT 76 1744 455446 4778 4797 GTAGGTAAGCAACCCACGGG 82 1745 455447 4780 4799 AGGTAGGTAAGCAACCCACG 88 1746 455448 4782 4801 ATAGGTAGGTAAGCAACCCA 83 1747 455449 4784 4803 TTATAGGTAGGTAAGCAACC 59 1748 455450 4786 4805 CCTTATAGGTAGGTAAGCAA 65 1749 455451 4788 4807 CACCTTATAGGTAGGTAAGC 62 1750 455452 4790 4809 ACCACCTTATAGGTAGGTAA 57 1751 455453 4792 4811 AAACCACCTTATAGGTAGGT 75 1752 455454 4794 4813 ATAAACCACCTTATAGGTAG 35 1753 455455 4796 4815 TTATAAACCACCTTATAGGT 39 1754 455456 4798 4817 GCTTATAAACCACCTTATAG 58 1755 455457 4800 4819 CAGCTTATAAACCACCTTAT 86 1756 455458 4802 4821 AGCAGCTTATAAACCACCTT 86 1757 455459 4804 4823 ACAGCAGCTTATAAACCACC 80 1758 455460 4806 4825 GGACAGCAGCTTATAAACCA 69 1759 455461 4808 4827 CAGGACAGCAGCTTATAAAC 72 1760 455462 4810 4829 GCCAGGACAGCAGCTTATAA 76 1761 455463 4812 4831 TGGCCAGGACAGCAGCTTAT 89 1762 455464 4814 4833 AGTGGCCAGGACAGCAGCTT 80 1763 455465 4816 4835 GCAGTGGCCAGGACAGCAGC 78 1764 455466 4818 4837 ATGCAGTGGCCAGGACAGCA 85 1765 455467 4820 4839 GAATGCAGTGGCCAGGACAG 80 1766 455468 4822 4841 TTGAATGCAGTGGCCAGGAC 83 1767 455469 4824 4843 ATTTGAATGCAGTGGCCAGG 84 1768 455470 4826 4845 GAATTTGAATGCAGTGGCCA 81 1769 455471 4828 4847 TGGAATTTGAATGCAGTGGC 85 1770 455472 4830 4849 ATTGGAATTTGAATGCAGTG 64 1771 455473 4832 4851 ACATTGGAATTTGAATGCAG 80 1772 455474 4834 4853 ACACATTGGAATTTGAATGC 73 1773 455475 4836 4855 GTACACATTGGAATTTGAAT 80 1774 455476 4838 4857 AAGTACACATTGGAATTTGA 77 1775 455477 4840 4859 TGAAGTACACATTGGAATTT 68 1776 455478 4842 4861 TATGAAGTACACATTGGAAT 66 1777 455479 4844 4863 ACTATGAAGTACACATTGGA 83 1778 455480 4846 4865 ACACTATGAAGTACACATTG 76 1779 455481 4848 4867 TTACACTATGAAGTACACAT 78 1780 455482 4850 4869 TTTTACACTATGAAGTACAC 76 1781 455483 4852 4871 ATTTTTACACTATGAAGTAC 60 1782 455484 4854 4873 AAATTTTTACACTATGAAGT 35 1783 455485 4856 4875 ATAAATTTTTACACTATGAA 9 1784 455486 4858 4877 ATATAAATTTTTACACTATG 0 1785 455487 4860 4879 TAATATAAATTTTTACACTA 21 1786 455488 4862 4881 AATAATATAAATTTTTACAC 10 1787 455489 4864 4883 ACAATAATATAAATTTTTAC 7 1788 455490 4925 4944 AGTTAAAGTAGATACAGCAA 71 1789 455491 4927 4946 GAAGTTAAAGTAGATACAGC 63 1790 455492 4929 4948 TGGAAGTTAAAGTAGATACA 69 1791 455493 4931 4950 TCTGGAAGTTAAAGTAGATA 65 1792 455494 4933 4952 TTTCTGGAAGTTAAAGTAGA 55 1793 455495 4935 4954 TATTTCTGGAAGTTAAAGTA 57 1794 455496 4937 4956 TTTATTTCTGGAAGTTAAAG 36 1795 455497 4939 4958 CGTTTATTTCTGGAAGTTAA 77 1796
Tabela 53
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida koji imaju 5-10-5 MOE krila i dezoksi jaz koji cilja SEQ ID NO: 2
ISIS Ljudsko Ljudsko Sekvenca % SEQ ID BR. početno zaustavno inhibicije NO mesto mesto
455498 917 936 CACGCCGTCATGCATAATTC 0 1797 455499 919 938 GGCACGCCGTCATGCATAAT 0 1798 455500 940 959 GCCCAGCCCCAGCCTGGCCG 35 1799 455501 962 981 ACAGCCCCTTCAGCCAATCC 15 1800 455502 964 983 TTACAGCCCCTTCAGCCAAT 14 1801 455503 966 985 AATTACAGCCCCTTCAGCCA 28 1802 455504 968 987 TGAATTACAGCCCCTTCAGC 6 1803 455505 970 989 GCTGAATTACAGCCCCTTCA 15 1804 455506 972 991 CCGCTGAATTACAGCCCCTT 4 1805 455507 974 993 AACCGCTGAATTACAGCCCC 8 1806 455508 976 995 GAAACCGCTGAATTACAGCC 16 1807 455509 978 997 CGGAAACCGCTGAATTACAG 24 1808 455510 980 999 TCCGGAAACCGCTGAATTAC 12 1809 455511 982 1001 GCTCCGGAAACCGCTGAATT 15 1810 455512 984 1003 CAGCTCCGGAAACCGCTGAA 23 1811 455513 986 1005 CGCAGCTCCGGAAACCGCTG 4 1812 455514 988 1007 GCCGCAGCTCCGGAAACCGC 13 1813 455515 1378 1397 AGTCCCTTCCGAGGCCCGCT 81 1814 455516 1408 1427 CGAAGAACGAAACTTCCCTC 68 1815 455517 1697 1716 CAGACACACCTATTCCTGCC 82 1816 455518 1748 1767 TTATGCAATAAAGCCTACCC 70 1817 455519 1795 1814 TTAGAAAGAGTACCGGTCTG 75 1818 455520 1987 2006 AATGGCTCAATTATTTATCT 59 1819 455521 2083 2102 TTTACCCAAGATCTTGGCTC 76 1820 455522 2175 2194 ACTTCAGTGCAACCACACCC 70 1821 455523 2205 2224 CCAACTTGGGCGACGGTTTG 67 1822 455524 2281 2300 CTAACCACTGATTTTGTCAC 56 1823 455525 2316 2335 GTACACACTATACACATTTT 85 1824 455526 2346 2365 CTTTAGTTGCACATACAGTA 80 1825 455527 2383 2402 GCCAAAAATTTACAACCCAT 86 1826 455528 2413 2432 TTCAAGCCCAATGCTTTATC 76 1827 455529 2561 2580 CTGGAACATGTAATAAGGAA 71 1828 455530 2669 2688 AGAGACTAAAATCAAGGCTC 87 1829 455531 2900 2919 TAGACTCTAGACCCAATTCC 77 1830 455532 3780 3799 GAAATGACCACTGATCAAGC 74 1831 455533 3867 3886 AAGTTGGTCACCACCTCTAC 81 1832 455534 4291 4310 AACTTATTCTTCATAGCAAC 58 1833 455535 4587 4606 TATTTGGGACCCAGTTGAAA 60 1834 455536 5000 5019 AGAACTGAAATTCCTTGGTC 88 1835 455537 5030 5049 AAGTTTTAAAAGCTTCCCCT 76 1836 455538 5554 5573 TCACCCAAAGTACCAAATCA 71 1837 455539 5667 5686 CAAAAGTTATGGTGAAATTT 44 1838 455540 5699 5718 AAGTACTCTTTCAGTGGTTT 88 1839 455541 6844 6863 AATTAAAGAGTTGCGGTAAT 68 1840 455542 6926 6945 GTTTCATGAAAACGGACAAT 78 1841 455543 7050 7069 AGGATTCAGTCCCAGATCTG 18 1842 455544 7282 7301 TCAATAATGATGACTTTCTC 72 1843 455545 7528 7547 TTAAACCCAATTATTAACAG 45 1844 455546 7624 7643 GTAAAACACACATTTTATAT 62 1845 455547 7682 7701 GTAAACAGAAAGGGCTGCAA 86 1846 455548 8078 8097 GGGCAGATTTACCTTCCTTA 89 1847 455549 8126 8145 GGGTAGCAGGAAGGAAAGCC 80 1848 455550 8214 8233 AATATAAGTTCTTTGGCTGA 60 1849 455551 8244 8263 TACAATAGCAATCACCTTAG 89 1850 455552 8284 8303 CCATGAAACCCTCAAACATA 75 1851 337332 66135 66154 GAAGCCCTTGCCAGCCATGT 91 1541 337333 66140 66159 AAGGAGAAGCCCTTGCCAGC 87 1542 345785 67129 67148 TGCCTCCTCCTTGGGAATGT 82 1543 455246 74639 74658 CAAGGAGGCTGTTAACTGAA 84 1545 455247 74641 74660 ACCAAGGAGGCTGTTAACTG 78 1546 455248 74643 74662 GCACCAAGGAGGCTGTTAAC 69 1547 455249 74645 74664 AAGCACCAAGGAGGCTGTTA 83 1548 455250 74647 74666 TAAAGCACCAAGGAGGCTGT 77 1549 455251 74649 74668 CTTAAAGCACCAAGGAGGCT 78 1550 455252 74651 74670 TGCTTAAAGCACCAAGGAGG 80 1551 455253 74653 74672 AATGCTTAAAGCACCAAGGA 75 1552 455254 74655 74674 TGAATGCTTAAAGCACCAAG 80 1553 455255 74657 74676 GCTGAATGCTTAAAGCACCA 82 1554 455256 74659 74678 AAGCTGAATGCTTAAAGCAC 67 1555 455257 74661 74680 GGAAGCTGAATGCTTAAAGC 79 1556 455258 74663 74682 AAGGAAGCTGAATGCTTAAA 79 1557 455259 74665 74684 TGAAGGAAGCTGAATGCTTA 72 1558 455260 74667 74686 CCTGAAGGAAGCTGAATGCT 75 1559 455261 74714 74733 TAAGGGTTTGACCTGAAGCC 72 1560 455262 74764 74783 TAAACCTTCCTATTTCAACA 77 1561 455263 74766 74785 CTTAAACCTTCCTATTTCAA 64 1562 455264 74768 74787 TCCTTAAACCTTCCTATTTC 73 1563 455265 74770 74789 TCTCCTTAAACCTTCCTATT 87 1564 455266 74772 74791 ATTCTCCTTAAACCTTCCTA 80 1565 455267 74774 74793 AGATTCTCCTTAAACCTTCC 87 1566 455268 74776 74795 TTAGATTCTCCTTAAACCTT 84 1567 455269 74778 74797 GCTTAGATTCTCCTTAAACC 87 1568 455270 74780 74799 ATGCTTAGATTCTCCTTAAA 87 1569 455271 74782 74801 AAATGCTTAGATTCTCCTTA 89 1570 455272 74784 74803 TAAAATGCTTAGATTCTCCT 88 1571 455273 74826 74845 ATACATTACAAAGGAAAATA 12 1572 455274 74828 74847 CAATACATTACAAAGGAAAA 28 1573 455275 74860 74879 CACCCTCTGCCCAGCCTTAC 63 1574 455276 74862 74881 AGCACCCTCTGCCCAGCCTT 79 1575 455277 74864 74883 TAAGCACCCTCTGCCCAGCC 65 1576 455278 74866 74885 TGTAAGCACCCTCTGCCCAG 62 1577 455279 74868 74887 GTTGTAAGCACCCTCTGCCC 62 1578 455280 74870 74889 AGGTTGTAAGCACCCTCTGC 75 1579 455281 74872 74891 CAAGGTTGTAAGCACCCTCT 83 1580 455282 74874 74893 GTCAAGGTTGTAAGCACCCT 86 1581 455283 74876 74895 GAGTCAAGGTTGTAAGCACC 69 1582 455284 74878 74897 GGGAGTCAAGGTTGTAAGCA 37 1583 455285 74880 74899 AAGGGAGTCAAGGTTGTAAG 56 1584 455286 74882 74901 GAAAGGGAGTCAAGGTTGTA 61 1585 455287 74884 74903 GAGAAAGGGAGTCAAGGTTG 56 1586 455288 74896 74915 ATCAAGTCCAGGGAGAAAGG 55 1587 455289 74898 74917 AGATCAAGTCCAGGGAGAAA 69 1588 455290 74900 74919 GCAGATCAAGTCCAGGGAGA 80 1589 455291 74902 74921 CAGCAGATCAAGTCCAGGGA 90 1590 455292 74904 74923 AACAGCAGATCAAGTCCAGG 77 1591 455293 74906 74925 GAAACAGCAGATCAAGTCCA 81 1592 455294 74908 74927 CTGAAACAGCAGATCAAGTC 75 1593 455295 74910 74929 CTCTGAAACAGCAGATCAAG 76 1594 455296 74912 74931 GCCTCTGAAACAGCAGATCA 74 1595 455297 74914 74933 TAGCCTCTGAAACAGCAGAT 75 1596 455298 74916 74935 CCTAGCCTCTGAAACAGCAG 76 1597 455299 74918 74937 AACCTAGCCTCTGAAACAGC 83 1598 455300 74920 74939 ACAACCTAGCCTCTGAAACA 57 1599 455301 74922 74941 AAACAACCTAGCCTCTGAAA 72 1600 455302 74924 74943 AGAAACAACCTAGCCTCTGA 78 1601 455303 74926 74945 ACAGAAACAACCTAGCCTCT 69 1602 455304 74928 74947 CCACAGAAACAACCTAGCCT 70 1603 455305 74930 74949 ACCCACAGAAACAACCTAGC 80 1604 455306 74932 74951 GCACCCACAGAAACAACCTA 70 1605 455307 74934 74953 AGGCACCCACAGAAACAACC 75 1606 455308 74936 74955 TAAGGCACCCACAGAAACAA 70 1607 455309 74938 74957 GATAAGGCACCCACAGAAAC 65 1608 455310 74940 74959 CTGATAAGGCACCCACAGAA 66 1609 455311 74942 74961 CCCTGATAAGGCACCCACAG 81 1610 455312 74944 74963 AGCCCTGATAAGGCACCCAC 79 1611 455313 74946 74965 CCAGCCCTGATAAGGCACCC 74 1612 455314 74948 74967 TCCCAGCCCTGATAAGGCAC 74 1613 455315 74950 74969 TATCCCAGCCCTGATAAGGC 66 1614 455316 74952 74971 AGTATCCCAGCCCTGATAAG 48 1615 455317 74954 74973 GAAGTATCCCAGCCCTGATA 63 1616 455318 74956 74975 CAGAAGTATCCCAGCCCTGA 82 1617 455319 74958 74977 ATCAGAAGTATCCCAGCCCT 80 1618 455320 75066 75085 GATTCCTAAAACAAACAGGA 37 1619 455321 75068 75087 AGGATTCCTAAAACAAACAG 42 1620 455322 75070 75089 CCAGGATTCCTAAAACAAAC 72 1621 455323 75072 75091 GACCAGGATTCCTAAAACAA 71 1622 455324 75074 75093 GAGACCAGGATTCCTAAAAC 43 1623 455325 75076 75095 CTGAGACCAGGATTCCTAAA 77 1624 455326 75078 75097 TCCTGAGACCAGGATTCCTA 76 1625 455327 75080 75099 GGTCCTGAGACCAGGATTCC 69 1626 455328 75082 75101 GAGGTCCTGAGACCAGGATT 76 1627 455329 75084 75103 ATGAGGTCCTGAGACCAGGA 81 1628 455330 75086 75105 CCATGAGGTCCTGAGACCAG 84 1629 455331 75088 75107 TTCCATGAGGTCCTGAGACC 75 1630 455332 75090 75109 TCTTCCATGAGGTCCTGAGA 75 1631 455333 75092 75111 CTTCTTCCATGAGGTCCTGA 79 1632 455334 75094 75113 CTCTTCTTCCATGAGGTCCT 83 1633 455335 75096 75115 CCCTCTTCTTCCATGAGGTC 74 1634 455336 75098 75117 CCCCCTCTTCTTCCATGAGG 72 1635 455337 75100 75119 CTCCCCCTCTTCTTCCATGA 72 1636 455338 75164 75183 CCTGAGCTCAACCAGACACG 79 1637 455339 75166 75185 TCCCTGAGCTCAACCAGACA 73 1638 455340 75168 75187 ATTCCCTGAGCTCAACCAGA 75 1639 455341 75170 75189 ATATTCCCTGAGCTCAACCA 65 1640 455342 75172 75191 CCATATTCCCTGAGCTCAAC 78 1641 455343 75174 75193 AACCATATTCCCTGAGCTCA 81 1642 455344 75176 75195 AGAACCATATTCCCTGAGCT 77 1643 455345 75178 75197 TAAGAACCATATTCCCTGAG 73 1644 455346 75180 75199 GCTAAGAACCATATTCCCTG 81 1645 455347 75254 75273 TCAGTAAGCCTTTGCCCTGC 79 1646 455348 75256 75275 TATCAGTAAGCCTTTGCCCT 72 1647 455349 75258 75277 TTTATCAGTAAGCCTTTGCC 76 1648 455350 75260 75279 AGTTTATCAGTAAGCCTTTG 84 1649 455351 75262 75281 CAAGTTTATCAGTAAGCCTT 82 1650 455352 75264 75283 CTCAAGTTTATCAGTAAGCC 82 1651 455353 75266 75285 GACTCAAGTTTATCAGTAAG 70 1652 455354 75268 75287 CAGACTCAAGTTTATCAGTA 78 1653 455355 75270 75289 GGCAGACTCAAGTTTATCAG 67 1654 455356 75272 75291 AGGGCAGACTCAAGTTTATC 51 1655 455357 75274 75293 CGAGGGCAGACTCAAGTTTA 54 1656 455358 75276 75295 TACGAGGGCAGACTCAAGTT 56 1657 455359 75278 75297 CATACGAGGGCAGACTCAAG 59 1658 455360 75280 75299 CTCATACGAGGGCAGACTCA 74 1659 455361 75282 75301 CCCTCATACGAGGGCAGACT 67 1660 455362 75309 75328 CAGCCTCAGAGGGAGGCCAG 40 1661 455363 75311 75330 ACCAGCCTCAGAGGGAGGCC 34 1662 455364 75313 75332 TCACCAGCCTCAGAGGGAGG 49 1663 455365 75315 75334 AGTCACCAGCCTCAGAGGGA 50 1664 455366 75412 75431 CCCATACGCACAGGAGAGGC 81 1665 455367 75414 75433 TTCCCATACGCACAGGAGAG 72 1666 455368 75416 75435 TGTTCCCATACGCACAGGAG 80 1667 455369 75418 75437 GGTGTTCCCATACGCACAGG 76 1668 455370 75420 75439 TAGGTGTTCCCATACGCACA 87 1669 455371 75422 75441 GCTAGGTGTTCCCATACGCA 92 1670 455372 75424 75443 GTGCTAGGTGTTCCCATACG 81 1671 455373 75491 75510 GAGGCAAGGTGGTTTTGAGT 55 1672 455374 75493 75512 CTGAGGCAAGGTGGTTTTGA 74 1673 455375 75495 75514 AGCTGAGGCAAGGTGGTTTT 79 1674 455376 75497 75516 TCAGCTGAGGCAAGGTGGTT 80 1675 455377 75499 75518 GATCAGCTGAGGCAAGGTGG 77 1676 455378 75501 75520 CTGATCAGCTGAGGCAAGGT 60 1677 455379 75503 75522 CTCTGATCAGCTGAGGCAAG 74 1678 455380 75505 75524 AACTCTGATCAGCTGAGGCA 77 1679 455381 75507 75526 GAAACTCTGATCAGCTGAGG 78 1680 455382 75509 75528 CAGAAACTCTGATCAGCTGA 78 1681 455383 75547 75566 CAGAGACCAGCTAATTTGAT 69 1682 455384 75549 75568 TTCAGAGACCAGCTAATTTG 78 1683 455385 75551 75570 AATTCAGAGACCAGCTAATT 77 1684 455386 75553 75572 TTAATTCAGAGACCAGCTAA 83 1685 455387 75610 75629 CTCCAGGCAGGAGGACTGGG 79 1686 455388 75612 75631 GTCTCCAGGCAGGAGGACTG 65 1687 455389 75614 75633 CTGTCTCCAGGCAGGAGGAC 57 1688 455390 75616 75635 AACTGTCTCCAGGCAGGAGG 75 1689 455391 75618 75637 TCAACTGTCTCCAGGCAGGA 86 1690 455392 75620 75639 CATCAACTGTCTCCAGGCAG 80 1691 455393 75622 75641 CACATCAACTGTCTCCAGGC 86 1692 455394 75624 75643 GACACATCAACTGTCTCCAG 85 1693 455395 75658 75677 GAAGAGTGTTGCTGGAGAAG 73 1694 455396 75660 75679 CTGAAGAGTGTTGCTGGAGA 78 1695 455397 75662 75681 TACTGAAGAGTGTTGCTGGA 83 1696 455398 75664 75683 TGTACTGAAGAGTGTTGCTG 86 1697 455399 75666 75685 TATGTACTGAAGAGTGTTGC 74 1698 455400 75668 75687 ATTATGTACTGAAGAGTGTT 74 1699 455401 75670 75689 TTATTATGTACTGAAGAGTG 84 1700 455402 75672 75691 GCTTATTATGTACTGAAGAG 84 1701 455403 75674 75693 AAGCTTATTATGTACTGAAG 77 1702 455404 75676 75695 TTAAGCTTATTATGTACTGA 75 1703 455405 75678 75697 AGTTAAGCTTATTATGTACT 81 1704 455406 75680 75699 TCAGTTAAGCTTATTATGTA 58 1705 455407 75682 75701 TATCAGTTAAGCTTATTATG 65 1706 455408 75684 75703 TTTATCAGTTAAGCTTATTA 46 1707 455409 75686 75705 TGTTTATCAGTTAAGCTTAT 68 1708 455410 75688 75707 TCTGTTTATCAGTTAAGCTT 83 1709 455411 75726 75745 AACCCAATGGTAAGCCCAAG 87 1710 455412 75728 75747 TAAACCCAATGGTAAGCCCA 87 1711 455413 75730 75749 TTTAAACCCAATGGTAAGCC 78 1712 455414 75732 75751 GATTTAAACCCAATGGTAAG 31 1713 455415 75734 75753 ATGATTTAAACCCAATGGTA 71 1714 455416 75736 75755 CTATGATTTAAACCCAATGG 67 1715 455417 75738 75757 CCCTATGATTTAAACCCAAT 70 1716 455418 75740 75759 GTCCCTATGATTTAAACCCA 83 1717 455419 75742 75761 AGGTCCCTATGATTTAAACC 64 1718 455420 75776 75795 TATCTGCTCCAGAGAAGCCC 76 1719 455421 75778 75797 AATATCTGCTCCAGAGAAGC 78 1720 455422 75801 75820 CTACCTAAGGCCATGAACTT 74 1721 455423 75803 75822 TGCTACCTAAGGCCATGAAC 82 1722 455424 75805 75824 CATGCTACCTAAGGCCATGA 84 1723 455425 75823 75842 CAGAGTTAAGACCAGATACA 84 1724 455426 75825 75844 ATCAGAGTTAAGACCAGATA 83 1725 455427 75827 75846 CAATCAGAGTTAAGACCAGA 77 1726 455428 75829 75848 TACAATCAGAGTTAAGACCA 81 1727 455429 75831 75850 GCTACAATCAGAGTTAAGAC 86 1728 455430 75833 75852 TTGCTACAATCAGAGTTAAG 85 1729 455431 75835 75854 TTTTGCTACAATCAGAGTTA 85 1730 455432 75837 75856 ACTTTTGCTACAATCAGAGT 73 1731 455433 75839 75858 GAACTTTTGCTACAATCAGA 80 1732 455434 75841 75860 CAGAACTTTTGCTACAATCA 82 1733 455435 75843 75862 CTCAGAACTTTTGCTACAAT 79 1734 455436 75845 75864 CTCTCAGAACTTTTGCTACA 76 1735 455437 75847 75866 TCCTCTCAGAACTTTTGCTA 75 1736 455438 75849 75868 GCTCCTCTCAGAACTTTTGC 85 1737 455439 75851 75870 CAGCTCCTCTCAGAACTTTT 85 1738 455440 75853 75872 CTCAGCTCCTCTCAGAACTT 80 1739 455441 75855 75874 GGCTCAGCTCCTCTCAGAAC 75 1740 455442 75957 75976 GCAACCCACGGGATTCCCTC 82 1741 455443 75959 75978 AAGCAACCCACGGGATTCCC 77 1742 455444 75961 75980 GTAAGCAACCCACGGGATTC 74 1743 455445 75963 75982 AGGTAAGCAACCCACGGGAT 76 1744 455446 75965 75984 GTAGGTAAGCAACCCACGGG 82 1745 455447 75967 75986 AGGTAGGTAAGCAACCCACG 88 1746 455448 75969 75988 ATAGGTAGGTAAGCAACCCA 83 1747 455449 75971 75990 TTATAGGTAGGTAAGCAACC 59 1748 455450 75973 75992 CCTTATAGGTAGGTAAGCAA 65 1749 455451 75975 75994 CACCTTATAGGTAGGTAAGC 62 1750 455452 75977 75996 ACCACCTTATAGGTAGGTAA 57 1751 455453 75979 75998 AAACCACCTTATAGGTAGGT 75 1752 455454 75981 76000 ATAAACCACCTTATAGGTAG 35 1753 455455 75983 76002 TTATAAACCACCTTATAGGT 39 1754 455456 75985 76004 GCTTATAAACCACCTTATAG 58 1755 455457 75987 76006 CAGCTTATAAACCACCTTAT 86 1756 455458 75989 76008 AGCAGCTTATAAACCACCTT 86 1757 455459 75991 76010 ACAGCAGCTTATAAACCACC 80 1758 455460 75993 76012 GGACAGCAGCTTATAAACCA 69 1759 455461 75995 76014 CAGGACAGCAGCTTATAAAC 72 1760 455462 75997 76016 GCCAGGACAGCAGCTTATAA 76 1761 455463 75999 76018 TGGCCAGGACAGCAGCTTAT 89 1762 455464 76001 76020 AGTGGCCAGGACAGCAGCTT 80 1763 455465 76003 76022 GCAGTGGCCAGGACAGCAGC 78 1764 455466 76005 76024 ATGCAGTGGCCAGGACAGCA 85 1765 455467 76007 76026 GAATGCAGTGGCCAGGACAG 80 1766 455468 76009 76028 TTGAATGCAGTGGCCAGGAC 83 1767 455469 76011 76030 ATTTGAATGCAGTGGCCAGG 84 1768 455470 76013 76032 GAATTTGAATGCAGTGGCCA 81 1769 455471 76015 76034 TGGAATTTGAATGCAGTGGC 85 1770 455472 76017 76036 ATTGGAATTTGAATGCAGTG 64 1771 455473 76019 76038 ACATTGGAATTTGAATGCAG 80 1772 455474 76021 76040 ACACATTGGAATTTGAATGC 73 1773 455475 76023 76042 GTACACATTGGAATTTGAAT 80 1774 455476 76025 76044 AAGTACACATTGGAATTTGA 77 1775 455477 76027 76046 TGAAGTACACATTGGAATTT 68 1776 455478 76029 76048 TATGAAGTACACATTGGAAT 66 1777 455479 76031 76050 ACTATGAAGTACACATTGGA 83 1778 455480 76033 76052 ACACTATGAAGTACACATTG 76 1779 455481 76035 76054 TTACACTATGAAGTACACAT 78 1780 455482 76037 76056 TTTTACACTATGAAGTACAC 76 1781 455483 76039 76058 ATTTTTACACTATGAAGTAC 60 1782 455484 76041 76060 AAATTTTTACACTATGAAGT 35 1783 455485 76043 76062 ATAAATTTTTACACTATGAA 9 1784 455486 76045 76064 ATATAAATTTTTACACTATG 0 1785 455487 76047 76066 TAATATAAATTTTTACACTA 21 1786 455488 76049 76068 AATAATATAAATTTTTACAC 10 1787 455489 76051 76070 ACAATAATATAAATTTTTAC 7 1788 455490 76112 76131 AGTTAAAGTAGATACAGCAA 71 1789 455491 76114 76133 GAAGTTAAAGTAGATACAGC 63 1790 455492 76116 76135 TGGAAGTTAAAGTAGATACA 69 1791 455493 76118 76137 TCTGGAAGTTAAAGTAGATA 65 1792 455494 76120 76139 TTTCTGGAAGTTAAAGTAGA 55 1793 455495 76122 76141 TATTTCTGGAAGTTAAAGTA 57 1794 455496 76124 76143 TTTATTTCTGGAAGTTAAAG 36 1795 455497 76126 76145 CGTTTATTTCTGGAAGTTAA 77 1796 455553 9123 9142 ACCTGCCCCTATGTATAAGC 89 1852 11261 11280
455554 9484 9503 TTTGTAATATCTAACAGATA 20 1853 455555 9630 9649 TATATGACAGCCTCAATTTC 68 1854 455556 9677 9696 GGCATTTGTGTAAACAGGAA 81 1855 455557 9746 9765 TGTTAAATATTACTTAAAAT 4 1856 455558 9776 9795 AATTCCTTGGGTGGTAATCC 81 1857 455559 10071 10090 GGAAAGTTACAGGACAGGAA 77 1858 455560 10352 10371 GAAATGGCTTCTACAAAAAC 47 1859 455561 10472 10491 GGTCAGAATACCACAAACTA 80 1860 455562 10634 10653 AGTCTAATGCTTTTAGATTC 59 1861 455563 11567 11586 CATTGGAAAACTTAGGGTAA 37 1862 455564 11597 11616 ATTCTCACTGGGTATAGAGG 72 1863 455565 11700 11719 TAGCATTAATCTTTCCTAGG 92 1864 455566 9886 9905 GACTCAAAATAAGGTTCCTC 86 1865 12369 12388
455567 12430 12449 ACAGATTTATTCATATAAGC 62 1866 455568 14060 14079 AGATCCATAGATTCTTTCTT 80 1867 455569 14129 14148 ATCTGAATCAGAATATCTGC 88 1868 455570 14190 14209 GAAGACTTTATATTCTATGG 59 1869 455571 14355 14374 TATCCTTAATATTCAGGTAC 82 1870 455572 14501 14520 TTATTAAGACATCTGAAATA 31 1871 455573 14701 14720 TTAAGTGACTACACATGGAT 76 1872 455574 14761 14780 GATAATGTAACAACCCTATC 42 1873 455575 14828 14847 CTGAAGCATGAATTCACATT 83 1874 455576 15316 15335 AAATTCCACTACTCATGAAA 62 1875 455577 15370 15389 CTTCAGAGAATATCTCATTT 83 1876 455578 15400 15419 CACATCATAGTTTTGCATGA 70 1877 455579 15525 15544 TCTGACCCATAAAGTTTAAA 70 1878 455580 16568 16587 TTGGTTAATAATAATGTATC 44 1879 455581 16832 16851 TCACACATTTGTCAAAATCC 89 1880 455582 16863 16882 TATATAATTGTGTACTGGCA 93 1881 455583 16930 16949 TGCCAGTGGTTCAGCAGAGG 77 1882 455584 17215 17234 AATGTTTATAGCAGCTTTAT 56 1883 455585 17330 17349 GTCACTTTGAATATAGTTTG 79 1884 455586 17426 17445 GGCTAAAATCCAAAACACTG 65 1885 455587 18449 18468 AACAGTATTTGAGAAAACTT 21 1886 455588 19883 19902 GGGCTACAACTCAATAACAA 63 1887 455589 20512 20531 AAGTCCTTATCATTTAGCTC 69 1888 455590 21035 21054 GATATTCCCAAAGTGACAGG 75 1889 455591 21188 21207 ATAATGAGACTTTAGCACTC 86 1890 455592 21422 21441 AATCTAAACTTCCAGCCAGG 78 1891 455593 21493 21512 ACAATAATGCATGCAAATGT 67 1892 455594 21675 21694 CACTGCTATTTCCCCAGCAA 89 1893 455595 21710 21729 CTTAAGCCCCATAAGAACAA 65 1894 455596 21823 21842 ATCTAAAACAGCAACATCTC 57 1895 455597 23917 23936 TAGTGATTGAATGTAGACTT 81 1896 455598 23980 23999 TTAGGCCACTAAGTCTGAGC 83 1897 455599 24178 24197 CAGCTGAAATCAGCCTTTGA 69 1898 455600 24345 24364 AATCTAGCTAAGTCCATAAC 43 1899 455601 24504 24523 TGCTTGGATATATAGAAGTC 80 1900 455602 24578 24597 AGGTCACTTTCCCTATACGA 81 1901 455603 24608 24627 AGAAGGAAGATTCTTTTCTC 73 1902 455604 24924 24943 CTAAGAGAGGCAACTGAAAT 60 1903 455605 25063 25082 GGCTCGAGGGCCACTGAAGG 59 1904 455606 25093 25112 AGCAAGCACATTGTCATGTC 83 1905 455607 25132 25151 GGCTGCCAAACTTTTCAAAA 76 1906 455608 25626 25645 TTTGTTCTTGCCTAAAATGC 45 1907 455609 25688 25707 TTCCTTCAAGTCAACTTATC 69 1908 455610 26031 26050 CCAGCCTACAGATGACTTTC 78 1909 455611 26061 26080 GCCAACTTTAGCCCCTTCCA 85 1910 455612 26104 26123 AATGCAAAATCTTTACCCTT 58 1911 455613 26139 26158 CCAGCTCAAAAACACACACT 80 1912 455614 26227 26246 GTTTGAAAAATTCAAGAATG 26 1913 455615 26388 26407 ATAGTGTCTGGCTCATAATA 48 1914 455616 26597 26616 TCAGGTCCTCAAAAACACCA 84 1915 455617 26648 26667 TGGCTGGTACCAGCTGGTGG 76 1916 455618 26766 26785 ACAAATTCATCGAGCTAATG 52 1917 455619 26908 26927 AGAATAGCATGGATTTGAAT 49 1918 455620 26999 27018 CACAAACTTGATCTTGCCAC 77 1919 455626 36534 36553 GAATGTAAAGTATCTTGTTC 47 1920 455627 36578 36597 TATAAAATACACACTGGATT 57 1921 455628 36614 36633 GAAATGTGGCTGCTTCAAAC 36 1922 455629 36649 36668 TGGAGTCACTAGCCACATGT 71 1923 455630 36691 36710 GCATACAAATTTACTGAAAC 58 1924 455631 36904 36923 CAAGTTAAAATCTGCCTCAC 62 1925 455632 36975 36994 GGCATGTATTGATTGCCCTC 68 1926 455633 37026 37045 AGTAAAAGCAGTGGCTGACG 60 1927 455634 37086 37105 CACCTGCCACAGGACAAATG 28 1928 455635 37755 37774 TTGCCCCAATTAGGCCAATA 76 1929 455636 37822 37841 AAGGGCTTAAATTCCACTGG 73 1930 455637 37873 37892 GTACTTTACATGTGCAGCAC 81 1931 455638 38268 38287 AATATATCCAAAATGTTATT 8 1932 455639 38694 38713 GCAGCATCCAACAGAAATAG 62 1933 455640 39294 39313 GAGACTGAACACACGCAAAC 65 1934 455641 39324 39343 GTTCTCTGGGATAGTGAGAA 49 1935 455642 39792 39811 GAGAAACCCAGCCAGCTAAT 69 1936 455643 39937 39956 GGAAGATCTGCCTGAGATTC 46 1937 455644 40132 40151 TACAGCATCCAGCTCAGTGC 63 1938 455645 40633 40652 CCCAGTTTAGAACAATACAA 65 1939 455646 40866 40885 GTAGCCATTGCCCAACACAG 63 1940 455647 40901 40920 CACCACAAGTCCCAGTAGGG 58 1941 455648 40923 40942 TAAACCAAAGTGTGCATATG 11 1942 455649 41087 41106 AAGGACTTACCAATCTTGAC 7 1943 455650 41114 41133 ACCTAACAATTTGGAGAGTC 44 1944 455651 41239 41258 TTACAAGACCAAAGGGTGCC 68 1945 455652 41329 41348 AAATCAACCTTCAAGACATC 13 1946 455653 41397 41416 AAAAATATGTCTACCACATC 52 1947 455654 41431 41450 AAGTTCTAGCTATGACAGAA 23 1948 455655 41575 41594 AGCCTGCAGAACTATGAGCC 48 1949 455656 41629 41648 ATTGGAAGCTTGCTGAGGCC 44 1950 455657 41644 41663 CTGCCTTCCGCCATGATTGG 48 1951 455658 41747 41766 CGAGACAGTGAGTTCTTGTG 64 1952 455659 42067 42086 CTGGCCCTTCACCAAATCAG 62 1953 455660 42139 42158 GGTCAGATTTATTAGTACAA 65 1954 455661 42904 42923 ATCATACCTGAAGAAACTGC 16 1955 455662 43059 43078 ATACAGAGCTTTGAGAAAGG 38 1956 455663 43194 43213 TGTAACAGTGAGAGTCATCT 71 1957 455664 43284 43303 TCTGAGTCTTTACACAGTAT 72 1958 455665 43724 43743 TTCATCAAGGAAAGCATTTA 31 1959 455666 43765 43784 TGGAGATGTGGACTGAACTG 19 1960 455667 43908 43927 CCTGGGCCGCAGTGGCTGCA 63 1961 455668 43926 43945 GTTTTGTCTCAGGTCTCACC 75 1962 455669 43941 43960 CCAGACCAGGGATTTGTTTT 34 1963 455670 43974 43993 CTCATTATAAAGTTGTTTGA 55 1964 455671 44507 44526 TGTACTATGAAAGTTTGTCA 80 1965 455672 44525 44544 AATGATATTGGAATAATCTG 26 1966 455673 44540 44559 CTTTGGAAAAGTTTGAATGA 26 1967 455674 44583 44602 CAGCCTCATAAAATAAGCTG 19 1968 455675 45414 45433 TACTGAGAATAGTGTTTCAC 71 1969 455676 45440 45459 AAGACATCCTTATCTTTTGC 75 1970 455677 45512 45531 TTCCAATATTTGTACCCTCA 87 1971 455678 45626 45645 TACAATGGCCTTTCTAAACC 64 1972 455679 45712 45731 AGATCTTTACTTTCATTACA 54 1973 455680 46058 46077 TATGCAAATTGCATACATTT 59 1974 455681 46091 46110 TTTCCAGATATTTTCCCATA 88 1975 455682 46241 46260 GTGTATTTCACCACAATTTT 78 1976 455683 46571 46590 TGTCTTTGAACATGATCTTC 67 1977 455684 46676 46695 GCATGACTAATTAAAACATC 58 1978 455685 46759 46778 CAGAGCAAGTGGCAGGGCTG 69 1979 455686 46791 46810 CAGAGAGAGTAAAAATTGTT 49 1980 455687 46905 46924 CAGCAGAAAGCAGTTAAATT 56 1981 455688 46941 46960 CAGTAATGGTGAGGGTGATG 28 1982 455689 46956 46975 GGTCCCCATTTCCTACAGTA 67 1983 455690 47307 47326 ACACCTGAGCATATCAGTTT 67 1984 455691 47400 47419 CAGAAAATCCTAGTGCTGCC 62 1985 455692 47424 47443 ATAAAATACAAAGGTTTTCC 23 1986 455693 47467 47486 TCCAAATTGACTTAAACCAC 74 1987 455694 47528 47547 TTGAAAACATCCTTGGGATA 44 1988 455695 47579 47598 CAGGCTGGATTTGGGCCACG 76 1989 455696 47649 47668 GCCACAGATAATGCATAAAT 39 1990 455697 47795 47814 CTGGGTTGAGGCCACAAATA 78 1991 455698 47929 47948 GTTTGTGTACTTATAATCCC 75 1992 455699 47974 47993 GACAAAATGACACACATCCT 72 1993 455700 48188 48207 TTTCACACAATTGATAACTT 57 1994 455701 48208 48227 CAGGCCAACACAGAAAGCTG 70 1995 455702 48277 48296 AGAAACCCACCTCTAATACC 31 1996 455703 48402 48421 GCCACACTTTCCATTCTAGT 90 1997 455704 48417 48436 TGGTTACCAGCTCAAGCCAC 72 1998 455705 48566 48585 CAGGTCTAGAGGCCTATCCC 73 1999 455706 48665 48684 TCTTCAAAGAACCCAGCACC 63 2000 455707 48697 48716 AGATGGAGAGAAAGACTCTG 61 2001 455708 48728 48747 CCCACAGTGACAGTGACTCA 89 2002 455709 48768 48787 CTTAGAAGTTTTGGGAAGGT 60 2003 455710 48802 48821 ATGGTCCCTATCCAAGCCCA 81 2004 455711 48828 48847 ATGGGCAACCATTCTCTTCC 80 2005 455712 49754 49773 GTTGGATGTCTACTTAAACG 63 2006 455713 49845 49864 GACCACATGTTCAGCTAAGA 68 2007 455714 49923 49942 AAACAGAGGCAGTGGTGCTG 62 2008 455715 50053 50072 CCAAAAAGGAGGTCAATGCA 30 2009 455716 50522 50541 GTATCCCCAAGAGAAGGCTC 59 2010 455717 50571 50590 TCAAATGAAGCCAAAACCTC 63 2011 455718 50774 50793 CACTTTCTAGAGATTTTAAC 1 2012 455719 51623 51642 TCAGATCTTGCATGTCTGCG 2 2013 455720 51753 51772 CCGCAAGTGAGCGAGACACA 49 2014 455721 51827 51846 CCACATTCTTTAGTCAACTC 59 2015 455722 51856 51875 CAGAAAACATTTCCTCAGAC 3 2016 455723 52033 52052 ACCAGTTTTCTAGCCGATCT 90 2017 455724 52056 52075 AGGAAAAGCTTCTTTCATCC 34 2018 455725 52071 52090 GCTTTCGAGAAAGAAAGGAA 44 2019 455726 53203 53222 TGGATGAAGGTAAAAGTGCA 42 2020 455727 53246 53265 TCACTATAGGGCCTTGCACA 53 2021 455728 53262 53281 AGCTGGTGCAACATGCTCAC 69 2022 455729 53329 53348 GCATTCTCATGTAGAGTTGC 0 2023 455730 53344 53363 GATATGAATAGACAGGCATT 63 2024 455731 53431 53450 ATTCCCAGAACTTAAGCTTC 40 2025 455732 53571 53590 ATTCCATCATTCTTTGATGG 47 2026 455733 53900 53919 TGCACAAGGAATAAGTGAAT 51 2027 455734 54378 54397 AGAAGGGCTTGAACTACATG 15 2028 455735 54577 54596 GAGCCCAGATATGCAGAACA 58 2029 455736 54592 54611 AAATGACAAGCATCTGAGCC 16 2030 455737 54632 54651 ATTTATACCACTAGGAGGCA 52 2031 455738 55241 55260 TTCAGTGACATTAAGAAAAG 28 2032 455739 55256 55275 ATCTTAAGTTTACAGTTCAG 64 2033 455740 55277 55296 GCATGAAATTTACAATTTTT 26 2034 455741 55418 55437 TCCTGCCAATAAATTAAGAA 0 2035 455742 55657 55676 GAAGTCAGCCCGCCTCTCAC 33 2036 455743 55841 55860 GTGTCCCTCAGTAAAATCTC 53 2037 455744 55877 55896 ATGACCCTGGCCACCAACTC 63 2038 455745 55961 55980 CAGAATCAGAGAGCAAGCAG 56 2039 455746 56125 56144 CCTTAAAATCCACAGGGAAG 5 2040 455747 56151 56170 TCCCCATCACTAAGCCTTAC 31 2041 455748 56203 56222 TAACACCTCACCCTACAGGC 56 2042 455749 56287 56306 ACACCATACTAAGTTTCTGA 68 2043 455750 57995 58014 CTTGTCAATGCACACTTTAA 80 2044 455751 58074 58093 TCTAGTTCAAATGATGTCTG 66 2045 455752 58089 58108 AATAAAGACAGAGTCTCTAG 30 2046 455753 58106 58125 CAAAATGAAGATCTCTGAAT 23 2047 455754 58173 58192 AGCTTTGTGGCTTTGTTCAG 60 2048 455755 58259 58278 TGAATGACATGTACAAGTAA 52 2049 455756 58377 58396 TGTGTAAGGACTATATACTC 64 2050 455757 58471 58490 TTCAGCACAGTAACATACTG 41 2051 455758 58496 58515 AGATGTGTTACAATTGCCTA 76 2052 455759 58696 58715 TTTACATCCTGAAAGGTATT 51 2053 455760 59471 59490 ATATGTACTTATTAAACCTA 18 2054 455761 59748 59767 ACAAAAGGAAGCCTCTAGGC 0 2055 455762 59913 59932 CCAAGTGTTTGAATTCTGCA 83 2056 455763 60155 60174 CAGGTTGATGTTTCTAATTC 60 2057 455764 60170 60189 CTACAGCTGAAAGAACAGGT 76 2058 455765 60249 60268 ATGTTCCAAGCCAGAGAGCT 54 2059 455766 60323 60342 GGTGTGGAGAACAACTCAGC 72 2060 455767 60373 60392 GGGAATTTGGAAAGCCCCAG 0 2061 455768 60392 60411 CAGCCGCAGGAGCTGGATGG 42 2062 455769 60407 60426 GGAGCCAAGCAGGGTCAGCC 73 2063 455770 60433 60452 GGAGAGAAAAACAGGGCACT 69 2064 455771 60448 60467 TATCCCACCTCAGTGGGAGA 1 2065 455772 60602 60621 TCTGAATCAATGAAAAGCAG 79 2066 455773 60703 60722 CATCACAATTTTTAAAAATG 0 2067 455774 61216 61235 GTATTTTTAAAACACATATA 0 2068 455775 61251 61270 CTTAATATACATATGAATAC 14 2069 455786 61340 61359 CAAATATCACAGAGACAGTC 88 2070 455787 61758 61777 GTACAGCAACCTTATTTTAA 5 2071 455788 61853 61872 TTAAATCCTGGGAATGGCAC 83 2072 455789 61959 61978 CTAATGTTGATGGGTATTTA 60 2073 455790 62043 62062 CATGGTTATGTGTATCTGCA 89 2074 455791 62067 62086 TTCACTTGATGTGAAATGAA 18 2075 455792 62500 62519 TGCCAGGGACACAACTTGCT 82 2076 455793 62595 62614 ATGGCATTCAGTACTAACAG 59 2077 455794 62610 62629 TTTTCCTCAGAGAGAATGGC 67 2078 455795 63284 63303 AGTCACAATCAGGGAAGCCT 77 2079 455796 63449 63468 AGTAATCATTCCACCTTCTC 70 2080 455797 63464 63483 CAGTGTTAAGCAAACAGTAA 41 2081 455798 63554 63573 ATACACACATCTTCTAAGCA 48 2082 455799 63576 63595 TCAAGTTTGCTGAAAGCTGA 48 2083 455800 63591 63610 ATAGAGATTTTCATATCAAG 41 2084 455801 64070 64089 ACAGGGAGGTCTCAGGAATC 77 2085 455802 64122 64141 TTTAAGACCTTGGAGGCATT 36 2086 455803 64586 64605 AGGGATGGTGCTCATTGTCT 20 2087 455804 64810 64829 GCCGGATCCCTTTTCTGGGC 64 2088 455805 64955 64974 TGATCACCTCGACTGAAAAC 65 2089 455806 65058 65077 GTGCCACCTTCCAACACACA 74 2090 455807 65530 65549 CAGACAGGTGTATTTGGTGG 65 2091 455808 65895 65914 ACTTTGCAAAATTTAGCCCA 77 2092 455809 65928 65947 TCCCATTCCCACGAGAATTT 76 2093 455810 65972 65991 GCCTTCAAGCCAGAGCCCTC 76 2094 455811 65987 66006 GACCAAGAGTTCAGGGCCTT 59 2095 455812 66099 66118 GTAATGGGAAAGCCAAGTCT 51 2096 455813 66128 66147 TTGCCAGCCATGTTTTCCTG 67 2097 455814 66283 66302 AGGGCATCCATCCCCTGCCA 7 2098 455815 66664 66683 TCACTGGAGCAAGCAAAACA 64 2099 455816 66775 66794 GGTCATAGAAAATAAACTTG 62 2100 455817 66863 66882 AGTGTTGAGACCCTGAACAC 53 2101 455818 66918 66937 AGAGAAAACTGCCCATTTTT 71 2102 455819 66948 66967 AGATCATGGAACCTACAGCT 18 2103 455820 66963 66982 GGACATGGGAAGGAAAGATC 27 2104 455821 67191 67210 CAACAACTACCTGGGTCAGC 51 2105 455822 67271 67290 AGGCATTTGCCTATCTATCC 58 2106 455823 67334 67353 CCAACAAAAGCACTCACTAC 56 2107 455824 67773 67792 TGAAATCTGGGCCTCAAACC 78 2108 455825 67843 67862 GAAACCCTTTCTTCAGACCA 79 2109 455826 68621 68640 TCAAAACAGCAAGTGCTGAA 60 2110 455827 69053 69072 AACCCTAAAGGATCACATTA 43 2111 455828 69357 69376 CAAAGAGCCGTGTGGCAGGG 65 2112 455829 69395 69414 GACCAGCCGTGGGACCCCAA 84 2113 455830 69473 69492 CCACAGGAAGGGCGATGGTA 58 2114 455831 69498 69517 GCAGGAAAGGACCTGGCCTC 45 2115 455832 70567 70586 TTAGGGAGCTGACACCCTAG 56 2116 455833 70645 70664 CAATTCAGTGCAGAATTCAA 80 2117 455834 70675 70694 TCTGAGTTTACTTTGGGCCA 75 2118 455835 70725 70744 CATGATGACCATGTGAAAGA 82 2119 455836 70890 70909 CTGAATGCTTACACCAAGAG 83 2120 455837 70973 70992 CCAATTTTCTATGAGCTTTG 85 2121 455838 71013 71032 CTTTTATGTATAAAATAAGA 6 2122 455839 71573 71592 CCAGGTACATCTTCAATAGC 75 2123 455840 71610 71629 GTACAATTGCTTCAACTAGA 87 2124 455841 71698 71717 ACATTTTTGGATGAGGGCAT 81 2125 455842 71750 71769 AAAGCCAAAGGTTATATCTC 77 2126 455843 71765 71784 AATGCTTGTGGTTCCAAAGC 79 2127 455844 71929 71948 TGTAAAAGTTTAACAGCCTC 70 2128 455845 71992 72011 CATAACCTTTTCCCACCTGA 79 2129 455846 72036 72055 CAGTTCTTTGCACAAAGCTG 76 2130 455847 72127 72146 CAAGATTGTCTGGAAAGCTC 76 2131 455848 72202 72221 TCGCATTCAGTAAGCAGAGC 47 2132 455849 72229 72248 AAACCAGTTTTCTTACTGAC 17 2133 455850 72285 72304 CGGTGTCACACAGATAAACT 73 2134 455851 72367 72386 TTAACTCTCACCCAGTGTCC 61 2135 455852 72406 72425 GTACTAAACATAGCCCAGGG 78 2136 455853 72687 72706 AAATACTCACCAAACTGCCC 4 2137
455854 72768 72787 GTGACCAGCTCTCGGTGTGT 10 2138
455855 73340 73359 GATTTGGTTTGTCCAAACTG 49 2139
455856 73530 73549 GTCAGAAAAGCCAGATTTAC 46 2140
455857 73621 73640 GCAACTGGCAGGCCACGCCC 39 2141
455858 73636 73655 AGTTGTCCACCCTCTGCAAC 0 2142
455859 73683 73702 TGTCAAAGGTGAGGGACTCT 57 2143
455860 74018 74037 ACACAAGACATTTCCTTTTT 64 1544
Primer 33: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama [0374] Gapmeri iz studije opisane u Primeru 32 pokazuju značajne rezultate in vitro inhibicija STAT3 je testirana u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 5,000 ćelija po komorici i transfektovane uz upotrebu LipofectAMINE2000® reagensa sa 1,1 nM, 3,3 nM, 10,0 nM i 30,0 nM koncentracije antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 54. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom realnom vremenu PCR. Komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 6; reverzna sekvenca TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC, ovde označena kao SEQ ID NO: 7; sonda sekvenca CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 8) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0375] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 54 i izračunato je grafičkim prikazom koncentracija upotrebljenih oligonukleotida u odnosu na procenat inhibicije eksprimiranja STAT3 mRNK postignute pri svakoj koncentraciji, i uočavanje koncentracije oligonukleotida pri kojoj je postignuta 50% inhibicija eksprimiranja STAT3 mRNK. u poređenju sa kontrolom. Kao što je ilustrovano u Tabeli 54, nivoi mRNK STAT3 su značajno redukovani na dozno-zavisni način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 54
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama ISIS br. 1,1 nM 3,3 nM 10,0 nM 30,0 nM IC50(nM)
337332 7 19 46 80 10,4 345785 8 22 46 74 11,3 455265 20 43 64 85 5,0 455267 16 30 62 79 6,7 455269 23 49 72 84 4,0 455270 3 28 60 79 8,1 455271 16 40 71 86 4,9 455272 28 30 57 86 5,7 455282 18 28 55 80 7,4 455291 21 45 75 85 4,1 455370 6 23 53 78 9,0 455371 15 46 73 90 4,5 455391 10 30 54 75 8,5 455393 6 33 62 81 7,0 455394 5 33 63 85 6,7 455398 7 25 56 76 8,8 455411 10 21 58 82 7,9 455412 15 27 50 79 8,4 455429 17 43 67 81 5,2 455438 20 43 66 83 5,0 455439 10 41 67 84 5,7 455447 7 23 53 87 7,7 455457 9 24 52 79 8,8 455458 8 34 62 83 6,7 455463 6 37 63 85 6,3 455471 11 42 67 78 5,9 455525 0 9 42 72 13,4 455527 0 21 60 87 7,8 455530 11 26 62 83 7,1 455536 5 21 62 85 7,6 455540 8 28 65 87 6,5 455547 6 19 45 67 13,4 455548 0 41 68 90 5,8
455551 0 3 33 72 15,9
455553 0 29 64 87 7,2
455565 0 19 54 86 8,8
455566 13 28 45 76 9,6
455569 0 16 47 76 11,1
455581 0 19 62 85 8,6
455582 0 26 70 89 6,9
455591 7 17 47 68 12,8
455594 0 16 48 76 10,9
455611 14 43 68 81 5,4
455637 10 22 56 76 8,9
455677 0 18 46 72 11,9
455681 16 19 42 69 13,0
455703 9 40 72 92 5,1
455708 11 15 45 77 10,7
455723 3 9 33 68 17,0
455762 0 9 42 70 14,1
455786 21 32 50 79 7,4
455790 13 19 56 84 7,8
455840 17 30 52 77 7,9
Primer 34: Antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama sa oligonukleotidima dizajniranim od mikrovlakana
[0376] Dodatni gapmeri su dizajnirani na osnovu gapmera prikazanih u Primeru 1 koji su pokazali inhibiciju od najmanje 50%. Ovi gapmeri su dizajnirani tako što su napravljeni gapmeri blago pomaknuti uzvodno i nizvodno (tj. „mikrokorak“) originalnih gapmera. Ovi gapmeri su testirani in vitro. ISIS 337332 je takođe uključen u analizu kao komparator.
Kultivisane HuVEC ćelije pri gustini od 5,000 ćelija po komorici su transfektovane upotrebom LipofectAMINE 2000® reagensa sa 30 nM antisens oligonukleotida. Nakon perioda tretmana od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Komplet ljudskih prajmera za sondiranje RTS199, opisan gore, korišćen je za merenje nivoa STAT3 mRNK. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
Rezultati su prikazani u Tabeli 55.
[0377] Himerni antisens oligonukleotidi u Tabeli 55 su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri označeni zvezdicom (*) u Tabeli 55 su originalni gapmeri od kojih su gapmeri ISIS 465226-466744, napravljeni pomoću mikrokoraka.5-10-5 gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde se centralni segment jaza sastoji od deset 2'-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5' i 3' pravcima) krilima od po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5' segmentu krila i svaki nukleozid u 3' segmentu krila ima 2'-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. „Ciljano početno mesto“ označava naj-5' nukleozid na koje je ciljan gapmer. „Ciljano mesto zaustavljanja“ označava naj-3' nukleozid na koji je ciljan gapmer. Svaki gapmer koji je naveden u Tabeli 55 je ciljan na ciljani region koji pokriva nukleobaze 2313-76017 od SEQ ID NO: 2 (komplement GENBANK pristupni br. NT_010755,14 skraćen od nukleotida 4185000 do 4264000).
Tabela 55
Nivoi inhibicije ljudske STAT3 mRNK pomoću himernih antisens oligonukleotida ciljanih za SEQ
ID NO: 2
ISIS BR. Početno Zaustavno Sekvenca % SEQ ID mesto mesto inhibicije NO
466646 2313 2332 CACACTATACACATTTTTAA 3 2144
466647 2314 2333 ACACACTATACACATTTTTA 11 2145
466648 2315 2334 TACACACTATACACATTTTT 8 2146
455525* 2316 2335 GTACACACTATACACATTTT 47 1824
466649 2317 2336 GGTACACACTATACACATTT 46 2147
466650 2318 2337 AGGTACACACTATACACATT 46 2148
466651 2319 2338 CAGGTACACACTATACACAT 54 2149
466652 2320 2339 GCAGGTACACACTATACACA 68 2150
466653 2321 2340 AGCAGGTACACACTATACAC 43 2151
466654 2322 2341 CAGCAGGTACACACTATACA 56 2152
466655 2323 2342 CCAGCAGGTACACACTATAC 72 2153
466656 2324 2343 ACCAGCAGGTACACACTATA 52 2154
466657 2325 2344 GACCAGCAGGTACACACTAT 69 2155 466658 2326 2345 AGACCAGCAGGTACACACTA 15 2156 466659 2327 2346 AAGACCAGCAGGTACACACT 49 2157 466660 2328 2347 TAAGACCAGCAGGTACACAC 59 2158 466661 2329 2348 GTAAGACCAGCAGGTACACA 73 2159 466662 2330 2349 AGTAAGACCAGCAGGTACAC 65 2160 466663 2331 2350 CAGTAAGACCAGCAGGTACA 64 2161 466664 2332 2351 ACAGTAAGACCAGCAGGTAC 53 2162 466665 2333 2352 TACAGTAAGACCAGCAGGTA 67 2163 466666 2334 2353 ATACAGTAAGACCAGCAGGT 75 2164 466667 2335 2354 CATACAGTAAGACCAGCAGG 66 2165 466668 2336 2355 ACATACAGTAAGACCAGCAG 55 2166 466669 2337 2356 CACATACAGTAAGACCAGCA 71 2167 466670 2338 2357 GCACATACAGTAAGACCAGC 83 2168 466671 2339 2358 TGCACATACAGTAAGACCAG 28 2169 466672 2340 2359 TTGCACATACAGTAAGACCA 70 2170 466673 2341 2360 GTTGCACATACAGTAAGACC 39 2171 466674 2342 2361 AGTTGCACATACAGTAAGAC 53 2172 466675 2343 2362 TAGTTGCACATACAGTAAGA 43 2173 455527* 2383 2402 GCCAAAAATTTACAACCCAT 48 1826 465806 2384 2403 AGCCAAAAATTTACAACCCA 29 2174 465807 2385 2404 CAGCCAAAAATTTACAACCC 7 2175 465808 2386 2405 CCAGCCAAAAATTTACAACC 35 2176 465809 2387 2406 GCCAGCCAAAAATTTACAAC 10 2177 465810 2388 2407 AGCCAGCCAAAAATTTACAA 37 2178 465811 2389 2408 CAGCCAGCCAAAAATTTACA 29 2179 465812 2390 2409 ACAGCCAGCCAAAAATTTAC 3 2180 465813 2391 2410 CACAGCCAGCCAAAAATTTA 6 2181 465814 2392 2411 GCACAGCCAGCCAAAAATTT 35 2182 465815 2393 2412 AGCACAGCCAGCCAAAAATT 22 2183 465816 2394 2413 CAGCACAGCCAGCCAAAAAT 23 2184 465817 2395 2414 TCAGCACAGCCAGCCAAAAA 33 2185 465818 2396 2415 ATCAGCACAGCCAGCCAAAA 32 2186 465819 2397 2416 TATCAGCACAGCCAGCCAAA 48 2187 465820 2398 2417 TTATCAGCACAGCCAGCCAA 32 2188 465821 2399 2418 TTTATCAGCACAGCCAGCCA 0 2189 465822 2400 2419 CTTTATCAGCACAGCCAGCC 49 2190 465823 2401 2420 GCTTTATCAGCACAGCCAGC 69 2191 465824 2402 2421 TGCTTTATCAGCACAGCCAG 48 2192 465825 2403 2422 ATGCTTTATCAGCACAGCCA 74 2193 465826 2404 2423 AATGCTTTATCAGCACAGCC 62 2194 465827 2405 2424 CAATGCTTTATCAGCACAGC 67 2195 465828 2406 2425 CCAATGCTTTATCAGCACAG 71 2196 465829 2407 2426 CCCAATGCTTTATCAGCACA 47 2197 465830 2408 2427 GCCCAATGCTTTATCAGCAC 81 2198 465831 2409 2428 AGCCCAATGCTTTATCAGCA 75 2199 465832 2410 2429 AAGCCCAATGCTTTATCAGC 57 2200 465349 2655 2674 AGGCTCCAACCTCTAAAACA 41 2201 465350 2656 2675 AAGGCTCCAACCTCTAAAAC 34 2202 465351 2657 2676 CAAGGCTCCAACCTCTAAAA 43 2203 465352 2658 2677 TCAAGGCTCCAACCTCTAAA 51 2204 465353 2659 2678 ATCAAGGCTCCAACCTCTAA 38 2205 465354 2660 2679 AATCAAGGCTCCAACCTCTA 29 2206 465355 2661 2680 AAATCAAGGCTCCAACCTCT 56 2207 465356 2662 2681 AAAATCAAGGCTCCAACCTC 24 2208 465357 2663 2682 TAAAATCAAGGCTCCAACCT 46 2209 465358 2664 2683 CTAAAATCAAGGCTCCAACC 45 2210 465359 2665 2684 ACTAAAATCAAGGCTCCAAC 50 2211 465366 2666 2685 GACTAAAATCAAGGCTCCAA 51 2212 465367 2667 2686 AGACTAAAATCAAGGCTCCA 64 2213 465368 2668 2687 GAGACTAAAATCAAGGCTCC 76 2214 455530* 2669 2688 AGAGACTAAAATCAAGGCTC 74 1829 455536* 5000 5019 AGAACTGAAATTCCTTGGTC 52 1835 465833 5001 5020 CAGAACTGAAATTCCTTGGT 81 2215 465834 5002 5021 ACAGAACTGAAATTCCTTGG 81 2216 465835 5003 5022 AACAGAACTGAAATTCCTTG 48 2217 465836 5004 5023 GAACAGAACTGAAATTCCTT 46 2218 465837 5005 5024 AGAACAGAACTGAAATTCCT 39 2219 465838 5006 5025 AAGAACAGAACTGAAATTCC 22 2220 465839 5007 5026 AAAGAACAGAACTGAAATTC 3 2221 465840 5008 5027 AAAAGAACAGAACTGAAATT 0 2222 465841 5009 5028 CAAAAGAACAGAACTGAAAT 0 2223 465842 5010 5029 ACAAAAGAACAGAACTGAAA 0 2224 465843 5011 5030 TACAAAAGAACAGAACTGAA 3 2225 465844 5012 5031 CTACAAAAGAACAGAACTGA 0 2226 465845 5013 5032 CCTACAAAAGAACAGAACTG 13 2227 465846 5014 5033 CCCTACAAAAGAACAGAACT 0 2228 465847 5015 5034 CCCCTACAAAAGAACAGAAC 7 2229 465848 5016 5035 TCCCCTACAAAAGAACAGAA 33 2230 465849 5017 5036 TTCCCCTACAAAAGAACAGA 18 2231 465850 5018 5037 CTTCCCCTACAAAAGAACAG 0 2232 465851 5019 5038 GCTTCCCCTACAAAAGAACA 43 2233 465852 5020 5039 AGCTTCCCCTACAAAAGAAC 32 2234 465853 5021 5040 AAGCTTCCCCTACAAAAGAA 0 2235 465854 5022 5041 AAAGCTTCCCCTACAAAAGA 15 2236 465855 5023 5042 AAAAGCTTCCCCTACAAAAG 14 2237 465856 5024 5043 TAAAAGCTTCCCCTACAAAA 4 2238 465857 5025 5044 TTAAAAGCTTCCCCTACAAA 0 2239 465858 5026 5045 TTTAAAAGCTTCCCCTACAA 11 2240 465859 5027 5046 TTTTAAAAGCTTCCCCTACA 11 2241 465860 5688 5707 CAGTGGTTTTTATAAATGAC 29 2242 465861 5689 5708 TCAGTGGTTTTTATAAATGA 19 2243 465862 5690 5709 TTCAGTGGTTTTTATAAATG 4 2244 465863 5691 5710 TTTCAGTGGTTTTTATAAAT 0 2245 465864 5692 5711 CTTTCAGTGGTTTTTATAAA 0 2246 465865 5693 5712 TCTTTCAGTGGTTTTTATAA 0 2247 465866 5694 5713 CTCTTTCAGTGGTTTTTATA 35 2248 465867 5695 5714 ACTCTTTCAGTGGTTTTTAT 67 2249 465868 5696 5715 TACTCTTTCAGTGGTTTTTA 60 2250 465886 5697 5716 GTACTCTTTCAGTGGTTTTT 85 2251 465887 5698 5717 AGTACTCTTTCAGTGGTTTT 62 2252 455540* 5699 5718 AAGTACTCTTTCAGTGGTTT 76 1839 465888 5700 5719 CAAGTACTCTTTCAGTGGTT 80 2253 465906 5701 5720 TCAAGTACTCTTTCAGTGGT 74 2254 465926 5702 5721 CTCAAGTACTCTTTCAGTGG 80 2255 465927 5703 5722 CCTCAAGTACTCTTTCAGTG 71 2256 465928 5704 5723 CCCTCAAGTACTCTTTCAGT 54 2257 465929 5705 5724 TCCCTCAAGTACTCTTTCAG 33 2258 465930 5706 5725 GTCCCTCAAGTACTCTTTCA 56 2259 465931 5707 5726 TGTCCCTCAAGTACTCTTTC 43 2260 465932 5708 5727 ATGTCCCTCAAGTACTCTTT 33 2261 465486 7674 7693 AAAGGGCTGCAAAAAATCTG 39 2262 465487 7675 7694 GAAAGGGCTGCAAAAAATCT 11 2263 465488 7676 7695 AGAAAGGGCTGCAAAAAATC 28 2264 465489 7677 7696 CAGAAAGGGCTGCAAAAAAT 39 2265 465490 7678 7697 ACAGAAAGGGCTGCAAAAAA 29 2266 465506 7679 7698 AACAGAAAGGGCTGCAAAAA 36 2267 465507 7680 7699 AAACAGAAAGGGCTGCAAAA 35 2268 465508 7681 7700 TAAACAGAAAGGGCTGCAAA 47 2269 455547* 7682 7701 GTAAACAGAAAGGGCTGCAA 72 1846 465509 7683 7702 GGTAAACAGAAAGGGCTGCA 70 2270 465510 7684 7703 TGGTAAACAGAAAGGGCTGC 63 2271 465511 7685 7704 CTGGTAAACAGAAAGGGCTG 60 2272 465526 7686 7705 CCTGGTAAACAGAAAGGGCT 65 2273 465527 7687 7706 ACCTGGTAAACAGAAAGGGC 26 2274 465528 7688 7707 AACCTGGTAAACAGAAAGGG 53 2275 465529 7689 7708 TAACCTGGTAAACAGAAAGG 35 2276 465530 7690 7709 ATAACCTGGTAAACAGAAAG 3 2277 465531 7691 7710 GATAACCTGGTAAACAGAAA 17 2278 465532 7692 7711 AGATAACCTGGTAAACAGAA 14 2279 465533 7693 7712 AAGATAACCTGGTAAACAGA 26 2280 455548* 8078 8097 GGGCAGATTTACCTTCCTTA 77 1847 466722 8241 8260 AATAGCAATCACCTTAGGAA 53 2281 466723 8242 8261 CAATAGCAATCACCTTAGGA 62 2282 466724 8243 8262 ACAATAGCAATCACCTTAGG 48 2283 455551* 8244 8263 TACAATAGCAATCACCTTAG 65 1850 466725 8245 8264 CTACAATAGCAATCACCTTA 15 2284 466726 8246 8265 ACTACAATAGCAATCACCTT 45 2285 466727 8247 8266 AACTACAATAGCAATCACCT 42 2286 466728 8248 8267 AAACTACAATAGCAATCACC 26 2287 466729 8249 8268 AAAACTACAATAGCAATCAC 14 2288 466730 8250 8269 CAAAACTACAATAGCAATCA 0 2289 466731 8251 8270 TCAAAACTACAATAGCAATC 29 2290 466732 8252 8271 TTCAAAACTACAATAGCAAT 20 2291 466733 8253 8272 TTTCAAAACTACAATAGCAA 14 2292 466734 8254 8273 GTTTCAAAACTACAATAGCA 58 2293 466735 8255 8274 TGTTTCAAAACTACAATAGC 28 2294 466736 8256 8275 GTGTTTCAAAACTACAATAG 42 2295 466737 8257 8276 AGTGTTTCAAAACTACAATA 13 2296 466738 8258 8277 AAGTGTTTCAAAACTACAAT 18 2297 466739 8259 8278 CAAGTGTTTCAAAACTACAA 30 2298 466740 8260 8279 CCAAGTGTTTCAAAACTACA 49 2299 466741 8261 8280 ACCAAGTGTTTCAAAACTAC 46 2300 466742 8262 8281 AACCAAGTGTTTCAAAACTA 41 2301 466743 8263 8282 CAACCAAGTGTTTCAAAACT 13 2302 455553* 9123 9142 ACCTGCCCCTATGTATAAGC 75 1852 11261 11280
466744 9124 9143 CACCTGCCCCTATGTATAAG 67 2303 11262 11281
466745 9125 9144 CCACCTGCCCCTATGTATAA 69 2304 11263 11282
466746 9126 9145 TCCACCTGCCCCTATGTATA 68 2305 11264 11283
466747 9127 9146 TTCCACCTGCCCCTATGTAT 69 2306 11265 11284
466748 9128 9147 ATTCCACCTGCCCCTATGTA 58 2307 11266 11285
466749 9129 9148 TATTCCACCTGCCCCTATGT 38 2308 11267 11286
466750 9130 9149 TTATTCCACCTGCCCCTATG 47 309 11268 11287
466751 9131 9150 TTTATTCCACCTGCCCCTAT 54 2310 466752 9132 9151 TTTTATTCCACCTGCCCCTA 50 2311 466753 9133 9152 GTTTTATTCCACCTGCCCCT 58 2312 466754 9134 9153 TGTTTTATTCCACCTGCCCC 53 2313 466755 9135 9154 ATGTTTTATTCCACCTGCCC 69 2314 466756 9136 9155 TATGTTTTATTCCACCTGCC 3 2315 466757 9137 9156 TTATGTTTTATTCCACCTGC 48 2316 466758 9138 9157 ATTATGTTTTATTCCACCTG 53 2317 466759 9139 9158 AATTATGTTTTATTCCACCT 24 2318 466760 9140 9159 TAATTATGTTTTATTCCACC 10 2319 466761 9141 9160 CTAATTATGTTTTATTCCAC 13 2320 466762 9142 9161 CCTAATTATGTTTTATTCCA 23 2321 466763 9143 9162 TCCTAATTATGTTTTATTCC 27 2322 466764 9144 9163 CTCCTAATTATGTTTTATTC 21 2323 466765 9145 9164 CCTCCTAATTATGTTTTATT 30 2324 465740 9862 9881 TGGCTTCTTCCTGAGACACA 81 2325 12345 12364
465741 9863 9882 TTGGCTTCTTCCTGAGACAC 68 2326 12346 12365
465742 9864 9883 GTTGGCTTCTTCCTGAGACA 81 2327 12347 12366
465743 9865 9884 TGTTGGCTTCTTCCTGAGAC 68 2328 12348 12367
465744 9866 9885 CTGTTGGCTTCTTCCTGAGA 44 2329 12349 12368
465745 9867 9886 CCTGTTGGCTTCTTCCTGAG 73 2330 12350 12369
465746 9868 9887 TCCTGTTGGCTTCTTCCTGA 61 2331 12351 12370
465747 9869 9888 CTCCTGTTGGCTTCTTCCTG 53 2332 12352 12371
465748 9870 9889 CCTCCTGTTGGCTTCTTCCT 78 2333 12353 12372
465749 9871 9890 TCCTCCTGTTGGCTTCTTCC 73 2334 12354 12373
465750 9872 9891 TTCCTCCTGTTGGCTTCTTC 70 2335 12355 12374
465751 9873 9892 GTTCCTCCTGTTGGCTTCTT 89 2336 12356 12375
465752 9874 9893 GGTTCCTCCTGTTGGCTTCT 86 2337 12357 12376
465753 9875 9894 AGGTTCCTCCTGTTGGCTTC 73 2338 12358 12377
465754 9876 9895 AAGGTTCCTCCTGTTGGCTT 85 2339 12359 12378
465755 9877 9896 TAAGGTTCCTCCTGTTGGCT 82 2340 12360 12379
465756 9878 9897 ATAAGGTTCCTCCTGTTGGC 72 2341 12361 12380
465757 9879 9898 AATAAGGTTCCTCCTGTTGG 61 2342 12362 12381
465758 9880 9899 AAATAAGGTTCCTCCTGTTG 40 2343 12363 12382
465759 9881 9900 AAAATAAGGTTCCTCCTGTT 41 2344 12364 12383
465760 9882 9901 CAAAATAAGGTTCCTCCTGT 20 2345 12365 12384
465761 9883 9902 TCAAAATAAGGTTCCTCCTG 57 2346 12366 12385
465762 9884 9903 CTCAAAATAAGGTTCCTCCT 48 2347 12367 12386
465763 9885 9904 ACTCAAAATAAGGTTCCTCC 52 2348 12368 12387
455566* 9886 9905 GACTCAAAATAAGGTTCCTC 59 1855 12369 12388
465764 9887 9906 TGACTCAAAATAAGGTTCCT 54 2349 12370 12389
465765 9888 9907 CTGACTCAAAATAAGGTTCC 47 2350 12371 12390
465766 9889 9908 CCTGACTCAAAATAAGGTTC 55 2351 12372 12391
465767 9890 9909 ACCTGACTCAAAATAAGGTT 48 2352 12373 12382
455553* 9123 9142 ACCTGCCCCTATGTATAAGC 75 1852 11261 11280
466744 9124 9143 CACCTGCCCCTATGTATAAG 67 2303 11262 11281
466745 9125 9144 CCACCTGCCCCTATGTATAA 69 2304 11263 11282
466746 9126 9145 TCCACCTGCCCCTATGTATA 68 2305 11264 11283
466747 9127 9146 TTCCACCTGCCCCTATGTAT 69 2306 11265 11284
466748 9128 9147 ATTCCACCTGCCCCTATGTA 58 2307 11266 11285
466749 9129 9148 TATTCCACCTGCCCCTATGT 38 2308 11267 11286
466750 9130 9149 TTATTCCACCTGCCCCTATG 47 2309 11268 11287
465726 11695 11714 TTAATCTTTCCTAGGCAAAG 19 2353 465727 11696 11715 ATTAATCTTTCCTAGGCAAA 22 2354 465728 11697 11716 CATTAATCTTTCCTAGGCAA 43 2355 465729 11698 11717 GCATTAATCTTTCCTAGGCA 68 2356 465730 11699 11718 AGCATTAATCTTTCCTAGGC 80 2357 455565* 11700 11719 TAGCATTAATCTTTCCTAGG 74 1864 465731 11701 11720 TTAGCATTAATCTTTCCTAG 42 2358 465732 11702 11721 ATTAGCATTAATCTTTCCTA 22 2359 465733 11703 11722 GATTAGCATTAATCTTTCCT 40 2360 465734 11704 11723 AGATTAGCATTAATCTTTCC 0 2361 465735 11705 11724 AAGATTAGCATTAATCTTTC 10 2362 465736 11706 11725 TAAGATTAGCATTAATCTTT 3 2363 465737 12342 12361 CTTCTTCCTGAGACACAGCC 71 2364 465738 12343 12362 GCTTCTTCCTGAGACACAGC 74 2365 465739 12344 12363 GGCTTCTTCCTGAGACACAG 83 2366 465740 9862 9881 TGGCTTCTTCCTGAGACACA 81 2325 12345 12364
465741 9863 9882 TTGGCTTCTTCCTGAGACAC 68 2326 12346 12365
465742 9864 9883 GTTGGCTTCTTCCTGAGACA 81 2327 12347 12366
465743 9865 9884 TGTTGGCTTCTTCCTGAGAC 68 2328 12348 12367
465744 9866 9885 CTGTTGGCTTCTTCCTGAGA 44 2329 12349 12368
465745 9867 9886 CCTGTTGGCTTCTTCCTGAG 73 2330 12350 12369
465746 9868 9887 TCCTGTTGGCTTCTTCCTGA 61 2331 12351 12370
465747 9869 9888 CTCCTGTTGGCTTCTTCCTG 53 2332 12352 12371
465748 9870 9889 CCTCCTGTTGGCTTCTTCCT 78 2333 12353 12372
465749 9871 9890 TCCTCCTGTTGGCTTCTTCC 73 2334 12354 12373
465750 9872 9891 TTCCTCCTGTTGGCTTCTTC 70 2335 12355 12374
465751 9873 9892 GTTCCTCCTGTTGGCTTCTT 89 2336 12356 12375
465752 9874 9893 GGTTCCTCCTGTTGGCTTCT 86 2337 12357 12376
465753 9875 9894 AGGTTCCTCCTGTTGGCTTC 73 2338 12358 12377
465754 9876 9895 AAGGTTCCTCCTGTTGGCTT 85 2339 12359 12378
465755 9877 9896 TAAGGTTCCTCCTGTTGGCT 82 2340 12360 12379
465756 9878 9897 ATAAGGTTCCTCCTGTTGGC 72 2341 12361 12380
465757 9879 9898 AATAAGGTTCCTCCTGTTGG 61 2342 12362 12381
465758 9880 9899 AAATAAGGTTCCTCCTGTTG 40 2343 12363 12382
465759 9881 9900 AAAATAAGGTTCCTCCTGTT 41 2344 12364 12383
465760 9882 9901 CAAAATAAGGTTCCTCCTGT 20 2345 12365 12384
465761 9883 9902 TCAAAATAAGGTTCCTCCTG 57 2346 12366 12385
465762 9884 9903 CTCAAAATAAGGTTCCTCCT 48 2347 12367 12386
465763 9885 9904 ACTCAAAATAAGGTTCCTCC 52 2348 12368 12387
455566* 9886 9905 GACTCAAAATAAGGTTCCTC 59 1865 12369 12388
465764 9887 9906 TGACTCAAAATAAGGTTCCT 54 2349 12370 12389
465765 9888 9907 CTGACTCAAAATAAGGTTCC 47 2350 12371 12390
465766 9889 9908 CCTGACTCAAAATAAGGTTC 55 2351 12372 12391
465767 9890 9909 ACCTGACTCAAAATAAGGTT 48 2352 12373 12392
465369 14101 14120 TGAGGATGACCCCAGATAAA 64 2367 465370 14102 14121 GTGAGGATGACCCCAGATAA 60 2368 465371 14103 14122 TGTGAGGATGACCCCAGATA 47 2369 465372 14104 14123 CTGTGAGGATGACCCCAGAT 68 2370 465373 14105 14124 CCTGTGAGGATGACCCCAGA 67 2371 465374 14106 14125 GCCTGTGAGGATGACCCCAG 70 2372 465375 14107 14126 TGCCTGTGAGGATGACCCCA 75 2373 465376 14108 14127 ATGCCTGTGAGGATGACCCC 72 2374 465377 14109 14128 TATGCCTGTGAGGATGACCC 58 2375 465378 14110 14129 CTATGCCTGTGAGGATGACC 56 2376 465379 14111 14130 GCTATGCCTGTGAGGATGAC 65 2377 465380 14112 14131 TGCTATGCCTGTGAGGATGA 23 2378 465386 14113 14132 CTGCTATGCCTGTGAGGATG 64 2379 465387 14114 14133 TCTGCTATGCCTGTGAGGAT 66 2380 465388 14115 14134 ATCTGCTATGCCTGTGAGGA 69 2381 465389 14116 14135 TATCTGCTATGCCTGTGAGG 59 2382 465390 14117 14136 ATATCTGCTATGCCTGTGAG 51 2383 465391 14118 14137 AATATCTGCTATGCCTGTGA 57 2384 465392 14119 14138 GAATATCTGCTATGCCTGTG 60 2385 465393 14120 14139 AGAATATCTGCTATGCCTGT 53 2386 465394 14121 14140 CAGAATATCTGCTATGCCTG 55 2387 465395 14122 14141 TCAGAATATCTGCTATGCCT 64 2388 465396 14123 14142 ATCAGAATATCTGCTATGCC 43 2389 465397 14124 14143 AATCAGAATATCTGCTATGC 37 2390 465398 14125 14144 GAATCAGAATATCTGCTATG 22 2391 465399 14126 14145 TGAATCAGAATATCTGCTAT 33 2392 465400 14127 14146 CTGAATCAGAATATCTGCTA 58 2393 465401 14128 14147 TCTGAATCAGAATATCTGCT 77 2394 455569* 14129 14148 ATCTGAATCAGAATATCTGC 67 1868 465406 14130 14149 CATCTGAATCAGAATATCTG 45 2395 465407 14131 14150 CCATCTGAATCAGAATATCT 47 2396 465408 14132 14151 ACCATCTGAATCAGAATATC 55 2397 465409 14133 14152 GACCATCTGAATCAGAATAT 72 2398 465410 14134 14153 GGACCATCTGAATCAGAATA 70 2399 465411 14135 14154 AGGACCATCTGAATCAGAAT 67 2400 465426 14136 14155 AAGGACCATCTGAATCAGAA 71 2401 465427 14137 14156 CAAGGACCATCTGAATCAGA 73 2402 465428 14138 14157 CCAAGGACCATCTGAATCAG 64 2403 465429 14139 14158 ACCAAGGACCATCTGAATCA 54 2404 465446 14140 14159 GACCAAGGACCATCTGAATC 65 2405 465447 14141 14160 GGACCAAGGACCATCTGAAT 72 2406 465448 14142 14161 AGGACCAAGGACCATCTGAA 68 2407 465449 14143 14162 AAGGACCAAGGACCATCTGA 78 2408 465450 14144 14163 TAAGGACCAAGGACCATCTG 37 2409 465451 14145 14164 CTAAGGACCAAGGACCATCT 73 2410 465452 14146 14165 ACTAAGGACCAAGGACCATC 65 2411 465453 14147 14166 AACTAAGGACCAAGGACCAT 54 2412 465454 14148 14167 AAACTAAGGACCAAGGACCA 49 2413 465455 14149 14168 CAAACTAAGGACCAAGGACC 61 2414 465456 14150 14169 TCAAACTAAGGACCAAGGAC 53 2415 465457 14151 14170 CTCAAACTAAGGACCAAGGA 59 2416 465534 16802 16821 CAACAGAGTGAAATGTAATG 16 2417 465535 16803 16822 TCAACAGAGTGAAATGTAAT 12 2418 465536 16804 16823 CTCAACAGAGTGAAATGTAA 52 2419 465537 16805 16824 GCTCAACAGAGTGAAATGTA 74 2420 465538 16806 16825 TGCTCAACAGAGTGAAATGT 17 2421 465539 16807 16826 ATGCTCAACAGAGTGAAATG 37 2422 465540 16808 16827 AATGCTCAACAGAGTGAAAT 14 2423 465541 16809 16828 GAATGCTCAACAGAGTGAAA 30 2424 465542 16810 16829 AGAATGCTCAACAGAGTGAA 23 2425 465543 16811 16830 TAGAATGCTCAACAGAGTGA 43 2426 465544 16812 16831 ATAGAATGCTCAACAGAGTG 38 2427 465545 16813 16832 CATAGAATGCTCAACAGAGT 38 2428 465546 16814 16833 CCATAGAATGCTCAACAGAG 56 2429 465547 16815 16834 TCCATAGAATGCTCAACAGA 37 2430 465548 16816 16835 ATCCATAGAATGCTCAACAG 48 2431 465549 16817 16836 AATCCATAGAATGCTCAACA 24 2432 465550 16818 16837 AAATCCATAGAATGCTCAAC 34 2433 465551 16819 16838 AAAATCCATAGAATGCTCAA 30 2434 465552 16820 16839 CAAAATCCATAGAATGCTCA 32 2435 465553 16821 16840 TCAAAATCCATAGAATGCTC 46 2436 465554 16822 16841 GTCAAAATCCATAGAATGCT 57 2437 465555 16823 16842 TGTCAAAATCCATAGAATGC 32 2438 465556 16824 16843 TTGTCAAAATCCATAGAATG 5 2439 465557 16825 16844 TTTGTCAAAATCCATAGAAT 2 2440 465558 16826 16845 ATTTGTCAAAATCCATAGAA 17 2441 465559 16827 16846 CATTTGTCAAAATCCATAGA 17 2442 465560 16828 16847 ACATTTGTCAAAATCCATAG 31 2443 465561 16829 16848 CACATTTGTCAAAATCCATA 43 2444 465562 16830 16849 ACACATTTGTCAAAATCCAT 42 2445 465563 16831 16850 CACACATTTGTCAAAATCCA 56 2446 455581* 16832 16851 TCACACATTTGTCAAAATCC 55 1880 465564 16833 16852 ATCACACATTTGTCAAAATC 34 2447 465565 16834 16853 CATCACACATTTGTCAAAAT 40 2448 465566 16835 16854 TCATCACACATTTGTCAAAA 41 2449 465567 16836 16855 ATCATCACACATTTGTCAAA 37 2450 465568 16837 16856 CATCATCACACATTTGTCAA 44 2451 465569 16838 16857 ACATCATCACACATTTGTCA 60 2452 465570 16839 16858 TACATCATCACACATTTGTC 9 2453 465571 16840 16859 ATACATCATCACACATTTGT 48 2454 465572 16841 16860 TATACATCATCACACATTTG 46 2455 465573 16842 16861 ATATACATCATCACACATTT 28 2456 455582* 16863 16882 TATATAATTGTGTACTGGCA 79 1881 465458 16864 16883 TTATATAATTGTGTACTGGC 83 2457 465459 16865 16884 TTTATATAATTGTGTACTGG 22 2458 465460 16866 16885 TTTTATATAATTGTGTACTG 8 2459 465461 16867 16886 ATTTTATATAATTGTGTACT 0 2460 465462 16868 16887 TATTTTATATAATTGTGTAC 1 2461 465463 16869 16888 CTATTTTATATAATTGTGTA 9 2462 465464 16870 16889 ACTATTTTATATAATTGTGT 0 2463 465465 16871 16890 AACTATTTTATATAATTGTG 7 2464 465466 16872 16891 AAACTATTTTATATAATTGT 13 2465 465606 21187 21206 TAATGAGACTTTAGCACTCT 67 2466 455591* 21188 21207 ATAATGAGACTTTAGCACTC 62 1890 465607 21189 21208 AATAATGAGACTTTAGCACT 41 2467 465608 21190 21209 CAATAATGAGACTTTAGCAC 54 2468 465609 21191 21210 GCAATAATGAGACTTTAGCA 6 2469 465610 21193 21212 CTGCAATAATGAGACTTTAG 77 2470 465611 21194 21213 ACTGCAATAATGAGACTTTA 53 2471 465612 21195 21214 AACTGCAATAATGAGACTTT 39 2472 465266 21638 21657 ATTTGAATAAATGAATGAAA 0 2473 465267 21639 21658 TATTTGAATAAATGAATGAA 0 2474 465268 21640 21659 ATATTTGAATAAATGAATGA 0 2475 465269 21641 21660 AATATTTGAATAAATGAATG 0 2476 465270 21642 21661 AAATATTTGAATAAATGAAT 0 2477 465271 21643 21662 CAAATATTTGAATAAATGAA 0 2478 465272 21644 21663 TCAAATATTTGAATAAATGA 0 2479 465273 21645 21664 CTCAAATATTTGAATAAATG 0 2480 465274 21646 21665 GCTCAAATATTTGAATAAAT 0 2481 465275 21647 21666 TGCTCAAATATTTGAATAAA 6 2482 465276 21648 21667 ATGCTCAAATATTTGAATAA 0 2483 465277 21649 21668 AATGCTCAAATATTTGAATA 0 2484 465278 21650 21669 GAATGCTCAAATATTTGAAT 19 2485 465279 21651 21670 AGAATGCTCAAATATTTGAA 0 2486 465280 21652 21671 CAGAATGCTCAAATATTTGA 5 2487 465281 21653 21672 ACAGAATGCTCAAATATTTG 9 2488 465282 21654 21673 TACAGAATGCTCAAATATTT 1 2489 465283 21655 21674 CTACAGAATGCTCAAATATT 0 2490 465284 21656 21675 ACTACAGAATGCTCAAATAT 0 2491 465285 21657 21676 AACTACAGAATGCTCAAATA 2 2492 465286 21658 21677 CAACTACAGAATGCTCAAAT 12 2493 465287 21659 21678 GCAACTACAGAATGCTCAAA 26 2494 465288 21660 21679 AGCAACTACAGAATGCTCAA 39 2495 465289 21661 21680 CAGCAACTACAGAATGCTCA 53 2496 465290 21662 21681 CCAGCAACTACAGAATGCTC 26 2497 465291 21663 21682 CCCAGCAACTACAGAATGCT 42 2498 465292 21664 21683 CCCCAGCAACTACAGAATGC 40 2499 465293 21665 21684 TCCCCAGCAACTACAGAATG 13 2500 465294 21666 21685 TTCCCCAGCAACTACAGAAT 30 2501 465295 21667 21686 TTTCCCCAGCAACTACAGAA 16 2502 465296 21668 21687 ATTTCCCCAGCAACTACAGA 5 2503 465297 21669 21688 TATTTCCCCAGCAACTACAG 7 2504 465298 21670 21689 CTATTTCCCCAGCAACTACA 20 2505 465299 21671 21690 GCTATTTCCCCAGCAACTAC 7 2506 465300 21672 21691 TGCTATTTCCCCAGCAACTA 25 2507 465301 21673 21692 CTGCTATTTCCCCAGCAACT 31 2508 465302 21674 21693 ACTGCTATTTCCCCAGCAAC 14 2509 455594* 21675 21694 CACTGCTATTTCCCCAGCAA 43 1893 465303 21676 21695 TCACTGCTATTTCCCCAGCA 23 2510 465304 21677 21696 TTCACTGCTATTTCCCCAGC 45 2511 465305 21678 21697 GTTCACTGCTATTTCCCCAG 11 2512 465306 21679 21698 AGTTCACTGCTATTTCCCCA 62 2513 465307 21680 21699 CAGTTCACTGCTATTTCCCC 52 2514 465308 21681 21700 TCAGTTCACTGCTATTTCCC 40 2515 465309 21682 21701 TTCAGTTCACTGCTATTTCC 29 2516 465310 21683 21702 CTTCAGTTCACTGCTATTTC 40 2517 465311 21684 21703 TCTTCAGTTCACTGCTATTT 25 2518 465312 21685 21704 TTCTTCAGTTCACTGCTATT 18 2519 465313 21686 21705 ATTCTTCAGTTCACTGCTAT 7 2520 465314 21687 21706 CATTCTTCAGTTCACTGCTA 33 2521 465315 21688 21707 ACATTCTTCAGTTCACTGCT 39 2522 465316 21689 21708 GACATTCTTCAGTTCACTGC 49 2523 465317 21690 21709 AGACATTCTTCAGTTCACTG 50 2524 465318 21691 21710 AAGACATTCTTCAGTTCACT 37 2525 465319 21692 21711 AAAGACATTCTTCAGTTCAC 26 2526 465320 21693 21712 CAAAGACATTCTTCAGTTCA 13 2527 465321 21694 21713 ACAAAGACATTCTTCAGTTC 0 2528 465322 21695 21714 AACAAAGACATTCTTCAGTT 11 2529 465323 21696 21715 GAACAAAGACATTCTTCAGT 10 2530 465324 21697 21716 AGAACAAAGACATTCTTCAG 14 2531 465325 21698 21717 AAGAACAAAGACATTCTTCA 7 2532 465326 21699 21718 TAAGAACAAAGACATTCTTC 13 2533 465327 21700 21719 ATAAGAACAAAGACATTCTT 1 2534 465328 21701 21720 CATAAGAACAAAGACATTCT 16 2535 465329 21702 21721 CCATAAGAACAAAGACATTC 38 2536 465330 21703 21722 CCCATAAGAACAAAGACATT 11 2537 465331 21704 21723 CCCCATAAGAACAAAGACAT 0 2538 465332 21705 21724 GCCCCATAAGAACAAAGACA 30 2539 465333 21706 21725 AGCCCCATAAGAACAAAGAC 22 2540 465334 21707 21726 AAGCCCCATAAGAACAAAGA 21 2541 465613 26034 26053 TCTCCAGCCTACAGATGACT 32 2542 465614 26035 26054 CTCTCCAGCCTACAGATGAC 31 2543 465615 26036 26055 TCTCTCCAGCCTACAGATGA 29 2544 465616 26037 26056 CTCTCTCCAGCCTACAGATG 22 2545 465617 26038 26057 CCTCTCTCCAGCCTACAGAT 44 2546 465618 26039 26058 TCCTCTCTCCAGCCTACAGA 41 2547 465619 26040 26059 TTCCTCTCTCCAGCCTACAG 32 2548 465620 26041 26060 GTTCCTCTCTCCAGCCTACA 0 2549 465621 26042 26061 AGTTCCTCTCTCCAGCCTAC 44 2550 465622 26043 26062 CAGTTCCTCTCTCCAGCCTA 39 2551 465623 26044 26063 CCAGTTCCTCTCTCCAGCCT 47 2552 465624 26045 26064 TCCAGTTCCTCTCTCCAGCC 49 2553 465625 26046 26065 TTCCAGTTCCTCTCTCCAGC 46 2554 465626 26047 26066 CTTCCAGTTCCTCTCTCCAG 47 2555 465627 26048 26067 CCTTCCAGTTCCTCTCTCCA 28 2556 465628 26049 26068 CCCTTCCAGTTCCTCTCTCC 28 2557 465629 26050 26069 CCCCTTCCAGTTCCTCTCTC 21 2558 465630 26051 26070 GCCCCTTCCAGTTCCTCTCT 65 2559 465631 26052 26071 AGCCCCTTCCAGTTCCTCTC 60 2560 465632 26053 26072 TAGCCCCTTCCAGTTCCTCT 56 2561 465633 26054 26073 TTAGCCCCTTCCAGTTCCTC 52 2562 465634 26055 26074 TTTAGCCCCTTCCAGTTCCT 53 2563 465635 26056 26075 CTTTAGCCCCTTCCAGTTCC 39 2564 465636 26057 26076 ACTTTAGCCCCTTCCAGTTC 31 2565 465637 26058 26077 AACTTTAGCCCCTTCCAGTT 46 2566 465638 26059 26078 CAACTTTAGCCCCTTCCAGT 37 2567 465639 26060 26079 CCAACTTTAGCCCCTTCCAG 48 2568 455611* 26061 26080 GCCAACTTTAGCCCCTTCCA 62 1870 465640 26062 26081 AGCCAACTTTAGCCCCTTCC 71 2569 465641 26063 26082 CAGCCAACTTTAGCCCCTTC 70 2570 465642 26064 26083 TCAGCCAACTTTAGCCCCTT 66 2571 465643 26065 26084 CTCAGCCAACTTTAGCCCCT 35 2572 465644 26066 26085 ACTCAGCCAACTTTAGCCCC 49 2573 465645 26067 26086 TACTCAGCCAACTTTAGCCC 33 2574 465646 26068 26087 CTACTCAGCCAACTTTAGCC 28 2575 465647 26069 26088 ACTACTCAGCCAACTTTAGC 12 2576 465648 26070 26089 AACTACTCAGCCAACTTTAG 34 2577 465649 26071 26090 TAACTACTCAGCCAACTTTA 26 2578 455637* 37873 37892 GTACTTTACATGTGCAGCAC 78 1931 465650 37874 37893 TGTACTTTACATGTGCAGCA 71 2579 465651 37875 37894 GTGTACTTTACATGTGCAGC 75 2580 465652 37876 37895 TGTGTACTTTACATGTGCAG 65 2581 465653 37877 37896 CTGTGTACTTTACATGTGCA 65 2582 465654 37878 37897 CCTGTGTACTTTACATGTGC 60 2583 465655 37879 37898 TCCTGTGTACTTTACATGTG 51 2584 465656 37880 37899 CTCCTGTGTACTTTACATGT 48 2585 465657 37881 37900 TCTCCTGTGTACTTTACATG 25 2586 465658 37882 37901 ATCTCCTGTGTACTTTACAT 33 2587 465659 37883 37902 AATCTCCTGTGTACTTTACA 23 2588 465660 37884 37903 AAATCTCCTGTGTACTTTAC 24 2589 465661 37885 37904 TAAATCTCCTGTGTACTTTA 26 2590 465666 37886 37905 CTAAATCTCCTGTGTACTTT 16 2591 465667 37887 37906 TCTAAATCTCCTGTGTACTT 27 2592 465668 37888 37907 TTCTAAATCTCCTGTGTACT 30 2593 465669 37889 37908 TTTCTAAATCTCCTGTGTAC 30 2594 465670 37890 37909 TTTTCTAAATCTCCTGTGTA 11 2595 465671 37891 37910 GTTTTCTAAATCTCCTGTGT 37 2596 465672 37892 37911 AGTTTTCTAAATCTCCTGTG 49 2597 465686 37893 37912 AAGTTTTCTAAATCTCCTGT 19 2598 465687 37894 37913 GAAGTTTTCTAAATCTCCTG 46 2599 465688 37895 37914 CGAAGTTTTCTAAATCTCCT 53 2600 465689 37896 37915 ACGAAGTTTTCTAAATCTCC 45 2601 465690 37897 37916 TACGAAGTTTTCTAAATCTC 9 2602 465706 37898 37917 CTACGAAGTTTTCTAAATCT 14 2603 465707 37899 37918 GCTACGAAGTTTTCTAAATC 32 2604 455677* 45512 45531 TTCCAATATTTGTACCCTCA 49 1971 465574 45513 45532 TTTCCAATATTTGTACCCTC 43 2605 465575 45514 45533 CTTTCCAATATTTGTACCCT 50 2606 465576 45515 45534 GCTTTCCAATATTTGTACCC 58 2607 465577 45516 45535 TGCTTTCCAATATTTGTACC 35 2608 465578 45517 45536 TTGCTTTCCAATATTTGTAC 31 2609 465579 45518 45537 CTTGCTTTCCAATATTTGTA 29 2610 465580 45519 45538 CCTTGCTTTCCAATATTTGT 35 2611 465581 45520 45539 CCCTTGCTTTCCAATATTTG 26 2612 465582 45521 45540 TCCCTTGCTTTCCAATATTT 34 2613 465583 45522 45541 GTCCCTTGCTTTCCAATATT 39 2614 465584 45523 45542 TGTCCCTTGCTTTCCAATAT 44 2615 465585 45524 45543 CTGTCCCTTGCTTTCCAATA 60 2616 465586 45525 45544 TCTGTCCCTTGCTTTCCAAT 59 2617 465587 45526 45545 TTCTGTCCCTTGCTTTCCAA 47 2618 455681* 46091 46110 TTTCCAGATATTTTCCCATA 48 1975 465335 46092 46111 GTTTCCAGATATTTTCCCAT 71 2619 465336 46093 46112 TGTTTCCAGATATTTTCCCA 53 2620 466676 48396 48415 CTTTCCATTCTAGTTTTACC 1 2621 466677 48397 48416 ACTTTCCATTCTAGTTTTAC 19 2622 466678 48398 48417 CACTTTCCATTCTAGTTTTA 23 2623 466679 48399 48418 ACACTTTCCATTCTAGTTTT 9 2624 466680 48400 48419 CACACTTTCCATTCTAGTTT 31 2625 466681 48401 48420 CCACACTTTCCATTCTAGTT 64 2626 455703* 48402 48421 GCCACACTTTCCATTCTAGT 75 1997 466682 48403 48422 AGCCACACTTTCCATTCTAG 56 2627 466683 48404 48423 AAGCCACACTTTCCATTCTA 40 2628 466684 48405 48424 CAAGCCACACTTTCCATTCT 24 2629 466685 48406 48425 TCAAGCCACACTTTCCATTC 39 2630 466686 48407 48426 CTCAAGCCACACTTTCCATT 38 2631 466687 48408 48427 GCTCAAGCCACACTTTCCAT 53 2632 466688 48409 48428 AGCTCAAGCCACACTTTCCA 59 2633 466689 48410 48429 CAGCTCAAGCCACACTTTCC 51 2634 466690 48411 48430 CCAGCTCAAGCCACACTTTC 43 2635 466691 48412 48431 ACCAGCTCAAGCCACACTTT 30 2636 466692 48413 48432 TACCAGCTCAAGCCACACTT 35 2637 466693 48414 48433 TTACCAGCTCAAGCCACACT 32 2638 466694 48415 48434 GTTACCAGCTCAAGCCACAC 53 2639 466695 48416 48435 GGTTACCAGCTCAAGCCACA 54 2640 455704* 48417 48436 TGGTTACCAGCTCAAGCCAC 61 1998 455708* 48728 48747 CCCACAGTGACAGTGACTCA 58 2002 465708 48729 48748 TCCCACAGTGACAGTGACTC 61 2641 465709 48730 48749 TTCCCACAGTGACAGTGACT 60 2642 465710 48731 48750 CTTCCCACAGTGACAGTGAC 55 2643 455723* 52033 52052 ACCAGTTTTCTAGCCGATCT 24 2017 466696 52034 52053 TACCAGTTTTCTAGCCGATC 54 2644 466697 52035 52054 TTACCAGTTTTCTAGCCGAT 41 2645 466698 52036 52055 TTTACCAGTTTTCTAGCCGA 37 2646 466699 52037 52056 CTTTACCAGTTTTCTAGCCG 17 2647 466700 52038 52057 CCTTTACCAGTTTTCTAGCC 11 2648 466701 52039 52058 TCCTTTACCAGTTTTCTAGC 24 2649 466702 52040 52059 ATCCTTTACCAGTTTTCTAG 1 2650 466703 52041 52060 CATCCTTTACCAGTTTTCTA 7 2651 466704 52042 52061 TCATCCTTTACCAGTTTTCT 0 2652 466705 52043 52062 TTCATCCTTTACCAGTTTTC 15 2653 466706 52044 52063 TTTCATCCTTTACCAGTTTT 0 2654 466707 52045 52064 CTTTCATCCTTTACCAGTTT 9 2655 466708 52046 52065 TCTTTCATCCTTTACCAGTT 0 2656 466709 52047 52066 TTCTTTCATCCTTTACCAGT 8 2657 466710 52048 52067 CTTCTTTCATCCTTTACCAG 11 2658 466711 52049 52068 GCTTCTTTCATCCTTTACCA 8 2659 466712 52050 52069 AGCTTCTTTCATCCTTTACC 6 2660 466713 52051 52070 AAGCTTCTTTCATCCTTTAC 0 2661 466714 52052 52071 AAAGCTTCTTTCATCCTTTA 18 2662 466715 52053 52072 AAAAGCTTCTTTCATCCTTT 2 2663 466716 52054 52073 GAAAAGCTTCTTTCATCCTT 9 2664 466717 52055 52074 GGAAAAGCTTCTTTCATCCT 1 2665 455724* 52056 52075 AGGAAAAGCTTCTTTCATCC 0 2018 455762* 59913 59932 CCAAGTGTTTGAATTCTGCA 36 2056 466766 59914 59933 ACCAAGTGTTTGAATTCTGC 58 2666 466767 59915 59934 TACCAAGTGTTTGAATTCTG 32 2667 466768 59916 59935 ATACCAAGTGTTTGAATTCT 21 2668 466769 59917 59936 CATACCAAGTGTTTGAATTC 9 2669 466770 59918 59937 ACATACCAAGTGTTTGAATT 14 2670 466771 59919 59938 CACATACCAAGTGTTTGAAT 26 2671 466772 59920 59939 CCACATACCAAGTGTTTGAA 8 2672 466773 59921 59940 CCCACATACCAAGTGTTTGA 19 2673 466774 59922 59941 TCCCACATACCAAGTGTTTG 5 2674 466775 59923 59942 CTCCCACATACCAAGTGTTT 25 2675 466776 59924 59943 CCTCCCACATACCAAGTGTT 32 2676 466777 59925 59944 TCCTCCCACATACCAAGTGT 12 2677 466778 59926 59945 CTCCTCCCACATACCAAGTG 10 2678 466779 59927 59946 GCTCCTCCCACATACCAAGT 15 2679 466780 59928 59947 AGCTCCTCCCACATACCAAG 5 2680 466781 59929 59948 GAGCTCCTCCCACATACCAA 23 2681 465768 61325 61344 CAGTCTAGAATAGCCATGGA 71 2682 465769 61326 61345 ACAGTCTAGAATAGCCATGG 72 2683 465770 61327 61346 GACAGTCTAGAATAGCCATG 78 2684 465771 61328 61347 AGACAGTCTAGAATAGCCAT 74 2685 465772 61329 61348 GAGACAGTCTAGAATAGCCA 70 2686 465773 61330 61349 AGAGACAGTCTAGAATAGCC 70 2687 465774 61331 61350 CAGAGACAGTCTAGAATAGC 63 2688 465775 61332 61351 ACAGAGACAGTCTAGAATAG 55 2689 465776 61333 61352 CACAGAGACAGTCTAGAATA 64 2690 465777 61334 61353 TCACAGAGACAGTCTAGAAT 71 2691 465778 61335 61354 ATCACAGAGACAGTCTAGAA 79 2692 465779 61336 61355 TATCACAGAGACAGTCTAGA 66 2693 465780 61337 61356 ATATCACAGAGACAGTCTAG 64 2694 465781 61338 61357 AATATCACAGAGACAGTCTA 48 2695 465782 61339 61358 AAATATCACAGAGACAGTCT 65 2696 455786* 61340 61359 CAAATATCACAGAGACAGTC 63 2070 465783 61341 61360 GCAAATATCACAGAGACAGT 69 2697 465786 61342 61361 TGCAAATATCACAGAGACAG 78 2698 465787 61343 61362 ATGCAAATATCACAGAGACA 72 2699 465788 61344 61363 AATGCAAATATCACAGAGAC 59 2700 465789 61345 61364 AAATGCAAATATCACAGAGA 23 2701 465790 61346 61365 AAAATGCAAATATCACAGAG 28 2702 465791 61347 61366 TAAAATGCAAATATCACAGA 0 2703 465792 61348 61367 TTAAAATGCAAATATCACAG 12 2704 465793 61349 61368 TTTAAAATGCAAATATCACA 3 2705 465794 61350 61369 GTTTAAAATGCAAATATCAC 2 2706 465795 61351 61370 AGTTTAAAATGCAAATATCA 0 2707 465796 61352 61371 CAGTTTAAAATGCAAATATC 13 2708 465797 61353 61372 TCAGTTTAAAATGCAAATAT 0 2709 465798 61354 61373 TTCAGTTTAAAATGCAAATA 0 2710 465799 61355 61374 ATTCAGTTTAAAATGCAAAT 1 2711 465800 61356 61375 TATTCAGTTTAAAATGCAAA 0 2712 465801 61357 61376 ATATTCAGTTTAAAATGCAA 0 2713 455790* 62043 62062 CATGGTTATGTGTATCTGCA 69 2074 465337 62044 62063 ACATGGTTATGTGTATCTGC 69 2714 465338 62045 62064 CACATGGTTATGTGTATCTG 40 2715 465339 62046 62065 CCACATGGTTATGTGTATCT 32 2716 337332 66135 66154 GAAGCCCTTGCCAGCCATGT 79 1541 455840* 71610 71629 GTACAATTGCTTCAACTAGA 81 2124 466782 71611 71630 AGTACAATTGCTTCAACTAG 54 2717 466783 71612 71631 CAGTACAATTGCTTCAACTA 68 2718 466784 71613 71632 GCAGTACAATTGCTTCAACT 72 2719 465588 71614 71633 GGCAGTACAATTGCTTCAAC 69 2720 455264* 74768 74787 TCCTTAAACCTTCCTATTTC 26 1563 465226 74769 74788 CTCCTTAAACCTTCCTATTT 45 2721 455265* 74770 74789 TCTCCTTAAACCTTCCTATT 57 1564 465227 74771 74790 TTCTCCTTAAACCTTCCTAT 54 2722 455266* 74772 74791 ATTCTCCTTAAACCTTCCTA 52 1565 465228 74773 74792 GATTCTCCTTAAACCTTCCT 64 2723 455267* 74774 74793 AGATTCTCCTTAAACCTTCC 60 1566 465229 74775 74794 TAGATTCTCCTTAAACCTTC 22 2724 455268* 74776 74795 TTAGATTCTCCTTAAACCTT 55 1567 465230 74777 74796 CTTAGATTCTCCTTAAACCT 69 2725 455269* 74778 74797 GCTTAGATTCTCCTTAAACC 84 1568 465231 74779 74798 TGCTTAGATTCTCCTTAAAC 64 2726 455270* 74780 74799 ATGCTTAGATTCTCCTTAAA 50 1569 465232 74781 74800 AATGCTTAGATTCTCCTTAA 71 2727 455271* 74782 74801 AAATGCTTAGATTCTCCTTA 69 1570 465233 74783 74802 AAAATGCTTAGATTCTCCTT 69 2728 455272* 74784 74803 TAAAATGCTTAGATTCTCCT 56 1571 455281* 74872 74891 CAAGGTTGTAAGCACCCTCT 63 1580 465234 74873 74892 TCAAGGTTGTAAGCACCCTC 54 2729 455282* 74874 74893 GTCAAGGTTGTAAGCACCCT 8 1581 465235 74875 74894 AGTCAAGGTTGTAAGCACCC 65 2730 455283* 74876 74895 GAGTCAAGGTTGTAAGCACC 48 1582 455290* 74900 74919 GCAGATCAAGTCCAGGGAGA 77 1589 465236 74901 74920 AGCAGATCAAGTCCAGGGAG 80 2731 455291* 74902 74921 CAGCAGATCAAGTCCAGGGA 82 1590 465237 74903 74922 ACAGCAGATCAAGTCCAGGG 82 2732 455292* 74904 74923 AACAGCAGATCAAGTCCAGG 69 1591 455369* 75418 75437 GGTGTTCCCATACGCACAGG 75 1668 465238 75419 75438 AGGTGTTCCCATACGCACAG 68 2733 455370* 75420 75439 TAGGTGTTCCCATACGCACA 67 1669 465239 75421 75440 CTAGGTGTTCCCATACGCAC 82 2734 455371* 75422 75441 GCTAGGTGTTCCCATACGCA 85 1670 465240 75423 75442 TGCTAGGTGTTCCCATACGC 77 2735 455372* 75424 75443 GTGCTAGGTGTTCCCATACG 72 1671 455390* 75616 75635 AACTGTCTCCAGGCAGGAGG 65 1689 465241 75617 75636 CAACTGTCTCCAGGCAGGAG 51 2736 455391* 75618 75637 TCAACTGTCTCCAGGCAGGA 52 1690 465242 75619 75638 ATCAACTGTCTCCAGGCAGG 76 2737 455392* 75620 75639 CATCAACTGTCTCCAGGCAG 63 1691 465243 75621 75640 ACATCAACTGTCTCCAGGCA 70 2738 455393* 75622 75641 CACATCAACTGTCTCCAGGC 75 1692 465244 75623 75642 ACACATCAACTGTCTCCAGG 61 2739 455394* 75624 75643 GACACATCAACTGTCTCCAG 69 1693 455397* 75662 75681 TACTGAAGAGTGTTGCTGGA 77 1696 465245 75663 75682 GTACTGAAGAGTGTTGCTGG 84 2740 455398* 75664 75683 TGTACTGAAGAGTGTTGCTG 76 1697 465246 75665 75684 ATGTACTGAAGAGTGTTGCT 72 2741 455399* 75666 75685 TATGTACTGAAGAGTGTTGC 70 1698 455411* 75726 75745 AACCCAATGGTAAGCCCAAG 77 1710 465247 75727 75746 AAACCCAATGGTAAGCCCAA 61 2742 455412* 75728 75747 TAAACCCAATGGTAAGCCCA 72 1711 465248 75729 75748 TTAAACCCAATGGTAAGCCC 69 2743 455413* 75730 75749 TTTAAACCCAATGGTAAGCC 38 1712 455428* 75829 75848 TACAATCAGAGTTAAGACCA 58 1727 465249 75830 75849 CTACAATCAGAGTTAAGACC 58 2744 455429* 75831 75850 GCTACAATCAGAGTTAAGAC 71 1728 465250 75832 75851 TGCTACAATCAGAGTTAAGA 59 2745 455430* 75833 75852 TTGCTACAATCAGAGTTAAG 47 1729 455437* 75847 75866 TCCTCTCAGAACTTTTGCTA 36 1736 465251 75848 75867 CTCCTCTCAGAACTTTTGCT 47 2746 455438* 75849 75868 GCTCCTCTCAGAACTTTTGC 75 1737 465252 75850 75869 AGCTCCTCTCAGAACTTTTG 71 2747 455439* 75851 75870 CAGCTCCTCTCAGAACTTTT 68 1738 465253 75852 75871 TCAGCTCCTCTCAGAACTTT 62 2748 455440* 75853 75872 CTCAGCTCCTCTCAGAACTT 58 1739
455446* 75965 75984 GTAGGTAAGCAACCCACGGG 69 1745
465254 75966 75985 GGTAGGTAAGCAACCCACGG 79 2749
455447* 75967 75986 AGGTAGGTAAGCAACCCACG 80 1476
465255 75968 75987 TAGGTAGGTAAGCAACCCAC 84 2750
455448* 75969 75988 ATAGGTAGGTAAGCAACCCA 71 1474
455456* 75985 76004 GCTTATAAACCACCTTATAG 37 1755
465256 75986 76005 AGCTTATAAACCACCTTATA 43 2751
455457* 75987 76006 CAGCTTATAAACCACCTTAT 57 1756
465257 75988 76007 GCAGCTTATAAACCACCTTA 73 2752
455458* 75989 76008 AGCAGCTTATAAACCACCTT 75 1757
465258 75990 76009 CAGCAGCTTATAAACCACCT 65 2753
455459* 75991 76010 ACAGCAGCTTATAAACCACC 46 1758
455462* 75997 76016 GCCAGGACAGCAGCTTATAA 70 1761
466718 75998 76017 GGCCAGGACAGCAGCTTATA 87 2754
455463* 75999 76018 TGGCCAGGACAGCAGCTTAT 83 1762
466719 76000 76019 GTGGCCAGGACAGCAGCTTA 76 2755
455464* 76001 76020 AGTGGCCAGGACAGCAGCTT 82 1763
455470* 76013 76032 GAATTTGAATGCAGTGGCCA 75 1769
466720 76014 76033 GGAATTTGAATGCAGTGGCC 87 2756
455471* 76015 76034 TGGAATTTGAATGCAGTGGC 75 1770
466721 76016 76035 TTGGAATTTGAATGCAGTGG 72 2757
455472* 76017 76036 ATTGGAATTTGAATGCAGTG 60 1771
Primer 35: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama [0378] Gapmeri iz studije opisane u Primeru 3 koji pokazuju značajan in vitro inhibicije STAT3 su testirani u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 5,000 ćelija po komorici i transfektovane uz upotrebu LipofectAMINE2000® reagensa sa 8,8 nM, 17,5 nM, 35,0 nM i 70,0 nM koncentracije antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 56. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0379] Kao što je ilustrovano u Tabeli 56, nivoi mRNK STAT3 su redukovani na doznozavisni način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 56
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 u HuVEC ćelija koristeći LipofectAMINE 2000® reagens
ISIS br. 8,8 nM 17,5 nM 35,0 nM 70,0 nM
337332 50 71 81 88
455269 62 69 79 82
455291 72 81 87 88
455371 71 83 88 90
455447 53 70 81 79
455463 68 79 84 87
455464 69 78 84 86
455471 62 82 88 90
455547 43 64 75 87
455565 41 73 83 92
455582 50 67 81 87
455637 50 65 79 85
455703 45 65 81 85
455840 58 70 80 85
465236 62 76 81 85
465237 67 81 86 90
465239 64 77 85 92
465240 50 66 76 83
465245 70 81 87 87
465254 54 75 81 86
465255 63 74 84 85
465335 46 62 74 80
465449 49 71 84 84
465458 54 73 84 88
465509 66 80 86 83
465510 48 66 76 82
465511 56 68 75 79
465526 53 68 76 76
465537 41 60 77 85
465588 52 73 76 79
465610 35 57 71 79
465730 51 75 85 87
465739 72 81 88 90
465740 70 81 86 89
465742 63 76 87 88
465748 48 62 67 74
465751 70 81 87 87
465752 76 82 88 89
465754 70 83 86 87
465755 70 81 85 89
465770 52 69 77 77
465771 40 55 64 75
465778 40 69 75 77
465786 56 71 76 83
465830 66 77 83 82
465833 50 67 79 86
465834 42 67 77 81
465886 58 73 83 87
465888 49 68 82 12
465926 43 64 76 82
466661 47 63 80 84
466666 39 66 80 86
466670 73 83 89 90
466718 73 78 84 85
466719 63 73 83 83
466720 80 87 86 86
Primer 36: Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskog STAT3 u HuVEC ćelijama
[0380] Gapmeri iz studije opisane u Primeru 3 su dalje testirani u različitim dozama u HuVEC ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 20,000 ćelija po komorici i transfektovane korišćenjem elektroporacije sa 187,5 nM, 375,0 nM, 750,0 nM, 1,500,0 nM, 3.000,0 nM i 6.000,0 nM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 57. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK je korišćen komplet RTS199 za sondiranje ljudskog prajmera, opisan gore. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0381] Kao što je ilustrovano u Tabeli 57, nivoi mRNK STAT3 su značajno redukovani na dozno-zavisni način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidima.
Tabela 57
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 u HuVEC ćelijama koristeći elektroporaciju
ISIS br. 187,5 375,0 750,0 1500,0 3000,0 6000,0 IC50nM nM nM nM nM nM (µM)
337332 35 51 73 84 97 98 0,3
455269 64 76 87 89 92 90 <0,2
455291 63 79 88 90 90 93 <0,2
455371 50 81 90 94 96 95 <0,2
455447 37 49 61 91 94 96 0,3
455463 57 78 89 93 95 94 <0,2
455464 57 67 78 80 79 87 <0,2
455471 50 73 81 86 91 92 <0,2
455547 19 49 63 82 92 94 0,5
455582 42 62 82 92 97 97 0,2
455637 44 60 63 87 91 92 0,2
455840 39 58 75 81 88 89 0,2
465236 56 67 71 83 91 92 <0,2
465237 56 75 87 92 94 93 <0,2
465239 60 78 88 95 99 99 <0,2 465240 49 67 80 85 94 95 0,1 465245 54 67 81 86 90 90 <0,2 465254 28 50 63 76 91 92 0,4 465255 46 55 78 89 92 94 0,2 465335 25 52 65 89 95 95 0,4 465449 28 56 78 72 96 96 0,3 465458 19 68 84 91 96 97 0,3 465509 42 68 77 84 88 88 0,1 465510 15 43 60 73 85 88 0,6 465511 19 39 47 68 79 86 0,8 465526 15 39 54 64 82 84 0,8 465537 44 65 82 90 95 90 0,1 465565 12 45 62 80 93 97 0,6 465588 44 66 82 85 85 87 0,1 465610 33 56 72 89 96 97 0,3 465730 48 51 72 91 94 91 0,2 465739 42 78 85 93 96 92 0,9 465740 54 69 80 96 98 98 <0,2 465742 67 55 91 93 87 93 <0,2 465748 49 67 88 96 98 99 0,1 465751 56 63 82 91 98 98 0,1 465752 62 79 84 93 96 90 <0,2 465754 41 69 84 63 94 93 <0,2 465755 47 56 67 83 93 97 0,2 465770 52 54 70 85 88 83 0,2 465771 38 62 76 83 84 86 0,2 465778 40 58 79 84 96 96 0,2 465786 41 68 88 94 95 93 0,1 465830 50 73 89 93 88 92 <0,2 465833 27 44 76 89 88 97 0,4 465834 8 27 57 80 93 97 0,7 465886 58 79 90 97 98 96 <0,2
465888 39 60 65 90 94 97 0,3
465926 23 50 41 85 93 94 0,5
466661 31 58 76 90 95 96 0,3
466666 44 55 79 92 96 97 0,2
466670 50 54 82 96 96 96 0,2
466718 55 79 90 93 95 96 <0,2
466719 44 52 73 65 87 91 0,3
466720 48 78 90 90 90 90 <0,2
Primer 37: Tolerancija antisens oligonukleotida koji ciljaju ljudski STAT3 u CD1 miševima
[0382] Trideset devet antisens oligonukleotida koji pokazuju visok nivo potentnosti su dalje testirani na in vivo podnošljivost.
[0383] Grupe od osam mužjaka CD1 miševa su injektirane subkutano dva puta nedeljno tokom 6 nedelja sa 50 mg/kg ISIS antisens oligonukleotida. Jedna grupa od osam muških CD1 miševa je injektirana subkutano dva puta nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Ova grupa je služila kao kontrolna grupa. Tri dana nakon poslednje doze miševi su eutanazirani i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu. Težine jetre, slezine i bubrega su merene na kraju ispitivanja i upoređene su sa miševima tretiranim sa PBS.
[0384] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, koncentracije transaminaza u plazmi merene su pomoću automatizovanog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Merene su koncentracije ALT (alanin transaminaza) i AST (aspartat transaminaza) u plazmi.
[0385] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, merene su koncentracije azota uree krvi (BUN) u plazmi pomoću automatizovanog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY).
[0386] Krv dobijena od svih grupa miševa poslata je u Antech Diagnostics za hematokrit (HCT), srednju zapreminu krvnih zrnaca (MCV), srednja vrednost korpuskularnog hemoglobina (MCH) i srednju koncentraciju korpuskularnog hemoglobina (MCHC), kao i merenja razlike broja krvnih ćelija, kao što je sadržaj VBC, RBC i ukupnog hemoglobina.
[0387] Od 39 testiranih antisens oligonukleotida, određeni antisens oligonukleotidi, uključujući ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670 i ISIS 466720 ispunili su granice podnošljivosti za težinu organa, ALT, AST, BUN i hematološke parametre.
Primer 38: Merenje poluživota antisens oligonukleotida u CD1 mišjoj jetri
[0388] CD1 miševi su tretirani opisanim ISIS antisens oligonukleotidima i procenjen je poluživot oligonukleotida u jetri.
Tretman
[0389] Grupe od dvanaest CD1 miševa su injektirane subkutano dva puta nedeljno tokom 2 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455393, ISIS 455553 ISIS 455394, ISIS 455429, ISIS 455438, ISIS 455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455540, ISIS 455548, ISIS 455429, ISIS 455463, ISIS 455464, ISIS 455471, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465239, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465742, ISIS 465751, ISIS 465752, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670, ISIS 466718 i ISIS 466720. Četiri miša iz svake grupe su žrtvovana 3 dana, 28 56 dana nakon završne doze. Za analizu su sakupljene jetre.
Merenje koncentracije oligonukleotida
[0390] Merena je koncentracija oligonukleotida pune dužine kao i ukupna koncentracija oligonukleotida (uključujući i degradirani oblik). Postupak koji se koristi je modifikacija prethodno objavljenih postupaka (Leeds i dr., 1996; Geary i dr., 1999), koji uključuje fenolhloroform (tečnost-tečnost) ekstrakciju nakon čega sledi ekstrakcija čvrste faze. Interni standard (ISIS 355868, 27-mer 2'-O-metoksietil modifikovani fosforotioatni oligonukleotid, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, ovde označen kao SEQ ID NO: 2758) je dodat pre ekstrakcije. Koncentracije uzorka tkiva su izračunate korišćenjem kalibracionih krivih, sa donjom granicom kvantifikacije (LLOQ) od približno 1,14 µg/g. Polu-životi su zatim izračunati pomoću WinNonlin softvera (PHARSIGHT).
[0391] Polu-životi svakog oligonukleotida su prikazani u Tabeli 58. antisens oligonukleotidi sa polu-životima u roku od 11-34 dana su izabrani za dalje studije.
Tabela 58
Polu-život ISIS oligonukleotida u jetri CD1 miševa
ISIS br. Polu-život (Dani)
455265 12
455269 48
455271 16
455272 16
455291 19
455371 28
455394 17
455703 27
455429 15
455471 15
455527 13
455530 12
455536 20
455548 13
455611 37
465236 22
465237 17
465588 14
465740 15
465754 23
465830 23
466670 11
466720 17
Primer 39: Podnošljivost antisens oligonukleotida koji ciljaju ljudski STAT3 kod Sprague-Dawley pacova
[0392] Dvadeset tri antisens oligonukleotida koji pokazuju visok nivo potentnosti su dalje testirani na in vivo podnošljivost.
[0393] Grupe od četiri Sprague-Dawley pacova su injektirane subkutano dva puta nedeljno tokom 6 nedelja sa 50 mg/kg ISIS antisens oligonukleotida. Jedna grupa pacova je injektirana subkutano dva puta nedeljno tokom 6 nedelja sa PBS. Ova grupa je služila kao kontrolna grupa. Tri dana nakon što je poslednja doza pacova eutanizovana i organi i plazma su sakupljeni za dalju analizu. Ponderi jetre, slezine i bubrega su mereni na kraju studije i upoređeni su sa pacovima tretiranim sa PBS
[0394] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, koncentracije transaminaza u plazmi merene su pomoću automatizovanog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Merene su koncentracije AST (aspartat transaminaza) i ukupnog bilirubina u plazmi.
[0395] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, BUN, ukupni protein urina i kreatinin su mereni korišćenjem automatizovanog kliničkog hemijskog analizatora (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY).
[0396] Od 23 testirana antisens oligonukleotida, određeni antisens oligonukleotidi, uključujući ISIS 455269, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465754, ISIS 465830 i ISIS 466670 su ispunili granice podnošljivosti za težinu organa, AST, bilirubin, BUN, ukupni protein urina i kreatinin.
Primer 40: Merenje poluživota antisens oligonukleotida u jetri i bubrezima Sprague-Dawley pacova
[0397] Sprague Dawley pacovi su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima i procenjen je polu-život oligonukleotida kao i proteklo vreme za degradaciju oligonukleotida i eliminaciju iz jetre i bubrega.
Tretman
[0398] Grupe od četiri Sprague Dawley pacova su injektirane subkutano dva puta nedeljno tokom 2 nedelje sa 20 mg/kg ISIS 455265, ISIS 455269, ISIS 455271, ISIS 455272, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455394, ISIS 455703, ISIS 455439, ISIS 455703455471, ISIS 455527, ISIS 455530, ISIS 455536, ISIS 455548, ISIS 455611, ISIS 465236, ISIS 465237, ISIS 465588, ISIS 465740, ISIS 465754, ISIS 465830, ISIS 466670 i ISIS 466720. Pacovi su žrtvovani, i jetra i bubrezi su sakupljeni za analizu.
Merenje koncentracije oligonukleotida
[0399] Merena je koncentracija oligonukleotida pune dužine kao i ukupna koncentracija oligonukleotida (uključujući i degradirani oblik). Postupak koji se koristi je modifikacija prethodno objavljenih postupaka (Leeds i dr., 1996; Geary i dr., 1999), koji uključuje fenolhloroform (tečnost-tečnost) ekstrakciju nakon čega sledi ekstrakcija čvrste faze. Interni standard (ISIS 355868, 27-mer 2'-O-metoksietil modifikovani fosforotioatni oligonukleotid, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, ovde označen kao SEQ ID NO: 2758) je dodat pre ekstrakcije. Koncentracije uzorka tkiva su izračunate korišćenjem kalibracionih kriva, sa donjom granicom kvantifikacije (LLOQ) od približno 1,14 µg/g. Izračunati su odnosi bubrega i jetre koncentracija oligonukleotida pune dužine, kao i ukupnih koncentracija oligonukleotida. Rezultati su prikazani u Tabeli 59.
Tabela 59
Odnos bubrega i jetre koncentracija oligonukleotida pune dužine i ukupnih oligonukleotida kod Sprague-Dawley pacova
ISIS br. Puna dužina Ukupni
455265 3,6 3,8
455269 2,1 2,4
455271 3,1 3,0
455272 2,9 3,1
455291 2,7 3,3
455371 2,2 2,4
455394 1,8 2,2
455703 2,3 2,8
455429 3,8 3,9
455471 2,7 2,9
455527 5,0 3,9
455530 3,9 2,9
455536 3,5 3,6
455548 2,5 2,9
455611 2,3 2,3
465236 2,3 3,3
465237 2,4 2,7
465588 2,8 2,6
465740 2,4 2,6
465754 1,6 1,8
465830 5,1 2,6
466670 3,1 4,4
466720 2,3 2,6
Primer 41: Dozno-zavisna antisens inhibicije STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u SK-BR-3 ćelijama
[0400] Gapmeri iz studija podnošljivosti glodara opisanih u Primerima 6-9 su testirani u različitim dozama u SK-BR-3 ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane bez bilo kog reagensa za transfekciju sa 0,02 uM, 0,10 uM, 0,50 uM, 1,00 uM.2,50 uM, i 10,00 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je specifikovano u Tabeli 60. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK korišćen je komplet RTS199 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera, kao što je gore opisano. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0401] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 60.
Tabela 60
Dozno-zavisna antisens inhibicija ljudskih STAT3 pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane SK-BR-3 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 1 µM 2,5 µM 10 µM IC50(µM)
455265 22 14 25 19 30 37 >10,0
455269 17 17 21 45 64 67 1,3
455271 0 0 0 11 16 53 9,0
455272 0 0 0 5 12 51 9,6
455291 9 15 31 45 58 76 1,2
455371 16 20 34 37 54 70 1,7
455394 0 2 14 6 30 55 8,3
455429 0 0 0 12 29 57 7,9
455471 0 16 28 24 42 58 2,9
455527 5 15 14 21 35 45 >10,0
455530 0 14 12 14 28 36 >10,0
455536 0 0 0 1 8 26 >10,0
455548 16 14 17 17 20 44 >10,0
455611 19 1 3 21 35 38 >10,0
455703 0 0 0 0 3 33 >10,0
465236 0 7 15 19 37 60 3,8
465237 2 13 22 29 50 67 2,3
465588 5 3 21 18 42 44 >10,0
465740 1 14 0 19 14 39 >10,0
465754 0 0 4 15 39 55 7,7
465830 6 18 23 17 42 67 3,0
466670 21 19 33 35 58 71 1,6
466720 0 0 11 13 27 53 8,7
Primer 42: Merenje viskoznosti ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju na STAT3 [0402] Viskoznost antisens oligonukleotida izabranih iz studija opisanih u Primerima 6-10 merena je sa ciljem da se probiju antisens oligonukleotidi koji imaju viskoznost veću od 40 cP. Oligonukleotidi koji imaju viskoznost veću od 40 cP bi bili previše viskozni za davanje bilo kom subjektu.
[0403] ISIS oligonukleotidi (32-35 mg) su izmereni u staklenoj bočici, dodato je 120 µL vode i antisens oligonukleotid je rastvoren u rastvoru zagrevanjem bočice na 50°C. Deo (75 µL) prethodno zagrejanog uzorka je pipetiran u mikro-viskometar (Cambridge). Temperatura mikro viskozimetra je podešena na 25°C i merena je viskoznost uzorka. Drugi deo (20 µL) prethodno zagrejanog uzorka je pipetiran u 10 mL vode za UV očitavanje na 260 nM na 85°C ( Cary UV instrument). Rezultati su prikazani u Tabeli 61 i ukazuju da su svi rastvori antisens oligonukleotida optimalni po viskoznosti prema gore navedenom kriterijumu.
Tabela 61
Viskoznost ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju ljudski STAT3 ISIS br. Viskoznost
455269 6,1
455291 13,6
466371 7,2
455703 17,6
455429 9,3
465237 26,2
465754 19,7
465830 8,1
466670 15,9
Primer 43: Uticaj ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju ljudski STAT3 kod cinomolgus majmuna
[0404] Devet antisens oligonukleotida koji pokazuju visok nivo potentnosti su dalje testirani na cinomolgus majmunima. Procenjena je podnošljivost antisens oligonukleotida i farmakokinetički profil jetre i bubrega.
[0405] Studija je sprovedena u Korea Institute of Toxicology, Republic of Korea. Pre studije, majmuni su držani u karantinu u vremenskom periodu od 30 dana, tokom kojih su sprovedeni standardni paneli hemije i hematologije seruma, ispitivanje uzoraka fekalija za jajašca i parazite, i test tuberkuloze kako bi se otkrili abnormalni ili bolesni majmuni. Devet grupa od četiri nasumično dodeljena mužjaka cinomolgus majmuna svi injektirani subkutano tri puta nedeljno tokom prve nedelje, i zatim dva puta nedeljno u narednih 7 nedelja, sa 25 mg/kg ISIS antisens oligonukleotida. Kontrolna grupa od 4 cinomolgus majmuna je injektirana PBS subkutano tri puta nedeljno tokom prve nedelje, i zatim dva puta nedeljno u narednih 7 nedelja. Žrtvovanje svih grupa je sprovedeno 55. dana, što je 48 sati nakon poslednje doze.
[0406] Tokom perioda ispitivanja, majmuni su svakodnevno posmatrani zbog znakova bolesti ili poremećaja. Svaka životinja koja pokazuje neželjene efekte na tretman je uklonjena i upućena veterinaru i direktoru studije.
[0407] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na opšte zdravlje životinja, težine slezine, bubrega, jetre i žučnog mehura su merene 55. dana. Merene su težine organa i težine tretiranih grupa su upoređene sa odgovarajućim PBS kontrolnim težinama.
[0408] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, uzeti su uzorci krvi iz svih studijskih grupa. Majmunima nije data hrana preko noći pre uzimanja krvi. Približno 1 mL svakog uzorka krvi je sakupljeno u epruvetama bez ikakvog antikoagulanta za separaciju seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi tokom 90 min i zatim centrifugirane (3000 rpm tokom 10 min na sobnoj temperaturi) kako bi se dobio serum.
Koncentracije transaminaza su merene korišćenjem Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). Koncentracije ALT u plazmi (alanin transaminaza), AST (aspartat transaminaza) i BUN su merene 55. dana. C-reaktivni protein (CRP), koji se sintetiše u jetri i služi kao marker upale, je takođe slično meren 55. dana.
[0409] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na faktore koji su uključeni u upalu, krv je sakupljena 55. dana od svih životinja za analizu komplementarnih nivoa C3, nivoa MIP-1β citokina i broja trombocita.
[0410] Za analizu komplementa C3, približno 0,5 mL svakog uzorka krvi je sakupljeno u epruvetama bez antikoagulanta za separaciju seruma. Za analizu nivoa citokina, približno 2 mL svakog uzorka krvi je sakupljeno u epruvetama bez antikoagulanta za separaciju seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi tokom 90 minuta i zatim su centrifugirane (3000 o/min tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi) kako bi se dobio serum. Komplement C3 je meren korišćenjem automatskog analizatora (Toshiba 200 FR NEO hemijski analizator, Toshiba co., Japan). Serum je korišćen za analizu citokina pomoću devet panela Searchlight Multiplex Array.
[0411] Za broj trombocita, oko 0,5 mL svakog uzorka krvi je sakupljeno u epruvetama koje sadrže kalijum so od EDTA. Uzorci su analizirani na broj trombocita pomoću ADVIA120 hematološkog analizatora (Bayer, USA).
[0412] Koncentracija oligonukleotida je merena u jetri i bubrezima 55. dana. Postupak koji se koristi je modifikacija prethodno objavljenih postupaka (Leeds i dr., 1996; Geary i dr., 1999), koji uključuje fenol-hloroform (tečnost-tečnost) ekstrakciju, nakon čega sledi ekstrakcija u čvrstoj fazi. Interni standard (ISIS 355868, 27-mer 2'-O-metoksietil modifikovani fosforotioatni oligonukleotid, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, ovde označen kao SEQ ID NO: 2758) je dodat pre ekstrakcije. Koncentracije uzorka tkiva su izračunate korišćenjem kalibracionih kriva, sa donjom granicom kvantifikacije (LLOQ) od približno 1,14 µg/g.
[0413] Među 9 testiranih antisens oligonukleotida, određeni antisens oligonukleotidi, uključujući ISIS 455269, ISIS 455371, ISIS 455429 i ISIS 455670 su ispunili granice podnošljivosti za težinu organa, ALT, AST, BUN i hematološke parametre.
Primer 44: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u MDA-MB-231 ćelijama
[0414] ISIS oligonukleotidi iz studije opisane u Primeru 12 su dalje testirani u različitim dozama u MDA-MB-231 ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane bez bilo kakvog reagensa za transfekciju sa 0,02 uM, 0,20 uM, 1,00 uM, 5,00 uM i 10,00 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 62. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su bili izolovani meren kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK korišćen je komplet RTS199 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera, kao što je gore opisano. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 62.
Tabela 62
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane MDA-MB-231 ćelija ISIS br. 0,02 µM 0,20 µM 1,00 µM 5,00 µM 10,00 µM IC50(µM)
455269 0 3 30 47 59 6,4
455291 1 3 13 41 47 8,3
455371 5 0 10 34 43 >10,0
455429 0 0 22 31 43 >10,0
455703 0 5 13 28 39 >10,0
465237 0 0 22 39 41 >10,0
465754 5 1 22 30 46 >10,0
465830 0 0 17 43 52 7,5
466670 4 7 18 49 56 6,5
Primer 45: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u U251-MG ćelijama
[0415] ISIS oligonukleotidi iz studije opisane u Primeru 12 su dalje testirani pri različitim dozama u U251-MG ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane bez bilo kakvog reagensa za transfekciju sa 0,1 uM, 1,0 uM, 5,0 uM, 10,0 uM i 20,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 63. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su bili mereni kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK korišćen je komplet RTS199 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera, kao što je gore opisano. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 63.
Tabela 63
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane U251-MG ćelija
ISIS br. 0,1 µM 1,0 µM 5,0 µM 10,0 µM 20,0 µM IC50(µM)
455269 3 16 31 47 56 11,9
455291 0 11 29 42 51 14,1
455371 3 0 25 33 39 >20,0
455429 6 0 25 33 39 >20,0
455703 5 2 13 33 36 >20,0
465237 2 0 7 2 6 >20,0
465754 0 0 8 16 4 >20,0
465830 0 0 18 2 10 >20,0
466670 0 0 18 25 37 >20,0
Primer 46: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u A431 ćelijama
[0416] ISIS oligonukleotidi iz studije opisane u Primeru 12 su dalje testirani u različitim dozama u ćelijama A431. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane bez bilo kakvog reagensa za transfekciju sa 0,02 uM, 0,2 uM, 1,0 uM, 5,0 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 64. Nakon približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su bili izolovani meren kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK korišćen je komplet RTS199 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera, kao što je gore opisano. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0417] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 64. Kao što je ilustrovano u Tabeli 64, ISIS oligonukleotidi su bili u stanju da prodru u ćelijsku membranu i značajno redukuju nivoe STAT3 mRNK na doznozavisni način.
Tabela 64
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane A431 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,2 µM 1,0 µM 5,0 µM 10,0 µM IC50(µM)
455269 41 64 86 86 89 0,15
455291 25 61 83 85 86 0,17
455371 30 65 82 88 92 0,15
455429 15 73 84 87 88 0,19
455703 12 55 72 82 82 0,13
465237 23 72 82 86 87 0,13
465754 0 67 73 79 83 0,15
465830 0 50 67 71 78 0,21
466670 36 79 88 93 94 0,03
Primer 47: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u H460 ćelijama
[0418] ISIS oligonukleotidi iz studije opisane u Primeru 12 su dalje testirani u različitim dozama u H460 ćelijama. Ćelije su nanesene pri gustini od 4.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane bez bilo kakvog reagensa za transfekciju sa 0,02 uM, 0,20 uM, 1,00 uM, 5,00 uM i 10,00 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 65. Posle približno 24 sata, iz ćelija je izolovana RNK i nivoi mRNK STAT3 su bili meren kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Za određivanje nivoa mRNK korišćen je komplet RTS199 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera, kao što je gore opisano. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa ukupnim sadržajem RNK, mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0419] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 65. Kao što je ilustrovano u Tabeli 65, ISIS oligonukleotidi su bili u stanju da prodru u ćelijsku membranu i značajno redukuju nivoe STAT3 mRNK na doznozavisni način.
Tabela 65
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane H460 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,20 µM 1,00 µM 5,00 µM 10,00 µM IC50(µM)
455269 3 69 81 92 94 0,1
455291 0 29 79 88 92 0,3
455371 0 20 63 85 89 0,8
455429 3 37 75 87 88 0,6
455703 4 24 69 87 92 0,3
465237 0 20 72 87 89 0,6
465754 10 45 80 91 92 0,2
465830 10 28 65 82 89 0,7
466670 15 32 71 90 93 0,3 Primer 48: Uticaj ISIS oligonukleotida koji ciljaju STAT3 u tretmanu ksenograft modela U251 ljudskog glioma kancera
[0420] BALB/c goli miševi inokulisani ljudskim ćelijama U251 glioma tumora su tretirani sa ISIS oligonukleotidima iz studije opisane u Primeru 12. Procenjen je efekat tretmana na rast tumora kod miševa.
Tretman
[0421] BALB/c goli miševi su supkutano implantirani sa 1 x 10<6>tumorskih ćelija. Četvrtog dana implantacije, grupe od po 4 miševa su primile 50 mg/kg ubrizganih intraperitonealno pet puta nedeljno tokom 3 i pol nedelje od ISIS 455269, ISIS 455291, ISIS 455371, ISIS 455703, ISIS 455429, ISIS 465237, ISIS 455429, ISIS 465237, ISIS 465754, ISIS 465830, ili ISIS 466670. Jednoj grupi miševa je davano 50 mg/kg injekcija intravenski pet puta nedeljno tokom 3 i po nedelje kontrolnog oligonukleotida, ISIS 141923. Jednoj grupi miševa je dat PBS injektiran intraperitonealno pet puta nedeljno tokom 3 i po nedelje.
Uticaj na rast tumora
[0422] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,5 x a x b<2>, gde su a i b dugi i kratki prečnici tumora. Rezultati su prikazani u Tabeli 66. Podaci ukazuju da tretman sa ISIS oligonukleotidima značajno ometa rast tumora. 'n/a' označava da tačke podataka za tu vremensku tačku nisu dostupne.
Tabela 66
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u U251 ksenograft modelu Dan 10 Dan 14 Dan 17 Dan 21 Dan 23 Dan 29 Dan 32 Dan 35
PBS 205 216 285 381 519 771 937 1,141
ISIS 141923 175 178 296 404 544 719 923 1,027
ISIS 455269 157 151 227 307 349 418 486 542
ISIS 455291 149 169 193 238 297 429 635 610
ISIS 455371 141 169 253 379 375 598 838 912
ISIS 455429 180 160 251 337 427 546 807 897
ISIS 455703 156 161 246 342 414 615 872 991
ISIS 465237 149 166 245 326 350 551 703 744
ISIS 465830 173 205 287 346 383 696 844 825
ISIS 466670 112 172 208 254 274 492 462 669
Primer 49: Efekat ISIS 455291 koji je ciljao STAT3 u tretmanu ksenograft modela MDA-MB-231 ljudskog raka dojke
[0423] BALB/c goli miševi inokulisani sa ljudskim ćelijama raka dojke MDA-MB-231 su tretirani sa ISIS 455291. Efekat tretmana na rast tumora i podnošljivost u miševima je procenjen.
Tretman
[0424] Studija je sprovedena kod Pharmaron Inc (Beijing, P.R. China). BALB/c goli miševi su dobijeni od Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. MDA-MB-231 ćelije ljudskog karcinoma dojke su održavane in vitro kao monoslojna kultura u Leibovitz-ovom L-15 medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina i 2 mM L-glutamina. Ćelije su održavane na 37°C u atmosferi od 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA tretmanom. Ćelije koje rastu eksponencijalnom fazom rasta su sakupljene i izbrojane za inokulaciju tumora.
[0425] Dve grupe od osam nasumično odabranih 6-8 nedelja starih ženki BALB/c golih miševa su sve inokulisane na desnom bok sa MDA-MB-231 fragmentima tumora (3 mm x 2 mm x 2 mm, koji su nastali iz inokulacije tumora) za razvoj tumora. Tretman antisens oligonukleotida započinje 11. dana nakon inokulacije tumora kada je srednja veličina tumora dostigla približno 100 mm<3>. Jedna od grupa je injektirana intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 455291. Druga grupa miševa je intraperitonealno injektirana dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS, i služila je kao kontrolna grupa.
[0426] Sve procedure koje se odnose na rukovanje životinjama, negu i tretman, izvršene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institucionalni odbor za negu i korišćenje životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC). U vreme rutinskog nadgledanja, životinje su proveravane za bilo kakav efekat rasta tumora na normalno ponašanje, kao što je pokretljivost, konzumacija hrane, promene telesne težine i bilo koji drugi abnormalni efekat.
RNK analiza
[0427] RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Nivoi STAT3 mRNK kod miševa su takođe mereni primenom kompleta mSTAT3_LTS00664 za sondiranje prajmera (prednja sekvenca CGACAGCTTCCCCATGGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1513; reverzna sekvenca ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1514; sonda sekvenca CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1515). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovan na ciklofilin. Kao što je prikazano u Tabeli 67, tretman sa ISIS 455291 rezultovao je redukcijom i ljudskih i mišjih STAT3 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 67
Inhibicija STAT3 mRNK u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u MDA-MB-231 ksenograft modelu
% inhibicije Ljudski STAT3 91 Mišji STAT3 94
Uticaj na rast tumora
[0428] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,536 x a x b<2>, gde su a i b dugi i kratki prečnici tumora. Veličina tumora je korišćena za proračune T-C i TV/CVvrednosti. T-C je izračunat sa T kao srednjim vremenom (u danima) potrebnim da tumori u tretiranim grupama dostignu prethodno određenu veličinu (900 mm)3), i C kao srednjim vremenom (u danima) da tumori u kontrolnoj grupi dostignu istu veličinu. TV/CVvrednost (eksprimirana kao procenat) je indikacija anti-tumorske efikasnosti ISIS oligonukleotida, gde je TVi CVbili su srednja zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, respektivno, na određeni dan (dan 32).
[0429] Rezultati su prikazani u Tabelama 68 i 69. Podaci ukazuju da inhibicija STAT3 mRNK značajno ometa rast tumora.
Tabela 68
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u MDA-MB-231 ksenograft modelu Dani PBS ISIS 455291
11 103 103
15 185 156
18 292 205
22 519 320
25 745 437
29 1,332 792
32 1,741 1,075
Tabela 69
Efekat antisens inhibicije STAT3 na inhibiciju rasta tumora u MDA-MB-231 ksenograft modelu
Tretman Veličina tumora (mm<3>) na dan 32 TV/CV(%) T-C pri 900 mm<3>
PBS 1,741 - -
ISIS 455291 1,075 62 4
Merenje telesne težine
[0430] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, telesne težine su redovno merene tokom perioda tretmana. Podaci su prikazani u Tabeli 70 i pokazuju da tretman sa ISIS 455291 ne utiče na ukupnu telesnu težinu miševa.
Tabela 70
Merenja telesne težine miševa u MDA-MB-231 ksenograft modelu
Dan 11 Dan 15 Dan 18 Dan 22 Dan 25 Dan 29 Dan 32
PBS 22 22 23 23 23 23 24
ISIS 455291 22 22 23 23 24 24 25
Primer 50: Efekat ISIS 455291 koji cilja STAT3 u tretmanu kslenograft modela ljudskog epidermoidnog karcinoma A431
[0431] BALB/c goli miševi inokulisani ljudskim ćelijama epidermoidnog raka A431 su tretirani sa ISIS 455291. Efekat tretmana na rast tumora i toleranciju kod miševa je procenjen.
Tretman
[0432] Studija je sprovedena kod Pharmaron Inc (Beijing, P.R. China). BALB/c goli miševi su dobijeni od Beijing HFK Bio-Technology Co., Ltd. A431 ljudske ćelije epidermoidnog karcinoma održavane su in vitro kao monoslojna kultura u DMEM medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina i 2 mM L-glutamina. Ćelije su održavane na 37°C u atmosferi od 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA tretmanom. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i izbrojane za inokulaciju tumora.
[0433] Dve grupe od osam nasumično odabranih 6-8 nedelja starih ženki BALB/c golih miševa su inokulisane potkožno sa 5 x 10<6>A431 tumorskih ćelija za razvoj tumora. Tretman antisens oligonukleotida je počeo 8. dana nakon inokulacije tumora kada je srednja veličina tumora dostigla približno 95 mm<3>. Jedna od grupa je injektirana intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 4 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 455291. Druga grupa miševa je injektirana intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS, i služila je kao kontrolna grupa.
[0434] Sve procedure koje se odnose na rukovanje životinjama, negu i tretman, izvršene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institucionalni odbor za negu i korišćenje životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC). U vreme rutinskog nadgledanja, životinje su proveravane za bilo kakav efekat rasta tumora na normalno ponašanje, kao što je pokretljivost, konzumacija hrane, promene telesne težine i bilo koji drugi abnormalni efekat.
RNK analiza
[0435] RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Nivo mRNK STAT3 miševa je takođe meren pomoću seta mSTAT3_LTS00664 prajmera. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovan na ciklofilin. Kao što je prikazano u Tabeli 71, tretman sa ISIS 455291 rezultovao je redukcijom i ljudskih i mišjih STAT3 mRNK u poređenju sa PBS kontrolom.
Tabela 71
Inhibicija STAT3 mRNK u tretman grupama u odnosu na PBS kontrolu u A431 ksenograft modelu
% inhibicije Ljudski STAT3 67 Mišji STAT3 92
Uticaj na rast tumora
[0436] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,5 x a x b<2>, gde su a i b dugi i kratki prečnici tumora. Veličina tumora je korišćena za proračune T-C i TV/CVvrednosti. T-C je izračunat sa T kao srednjim vremenom (u danima) potrebnim da tumori u tretiranim grupama dostignu prethodno određenu veličinu (800 mm<3>), i C kao srednjim vremenom (u danima) da tumori u kontrolnoj grupi dostignu istu veličinu. TV/CVvrednost (eksprimirana kao procenat) je indikacija anti-tumorske efikasnosti ISIS oligonukleotida, gde je TVi CVbili su srednja zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, respektivno, na određeni dan (dan 33).
[0437] Rezultati su predstavljeni u Tabelama 72 i 73. Podaci ukazuju da inhibicija STAT3 mRNK ometa rast tumora.
Tabela 72
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u A431 ksenograft modelu Dani PBS ISIS 455291
8 94 95
14 178 173
17 308 242
21 528 393
24 682 572
28 875 759
31 1,071 984
33 1,210 1,112
Tabela 73
Efekat antisens inhibicije STAT3 na inhibiciju rasta tumora u A431 ksenograft modelu Tretman Veličina tumora (mm<3>) na dan 33 TV/CV(%) T-C pri 800 mm<3>
PBS 1,210 - -
ISIS 455291 1,112 92 2
Merenje telesne težine
[0438] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, telesne težine su redovno merene tokom perioda tretmana. Podaci su prikazani u Tabeli 74 i pokazuju da tretman sa ISIS 455291 ne utiče na ukupnu telesnu težinu miševa.
Tabela 74
Merenja telesne težine miševa u A431 ksenograft modelu
Dan 8 Dan 14 Dan 17 Dan 21 Dan 24 Dan 28 Dan 31 Dan 33
PBS 20 20 20 21 21 21 22 22
ISIS 455291 20 21 21 22 22 22 23 23
Primer 51: Efekat ISIS 455291 koji cilja STAT3 u tretmanu ksenograft modela NCI-H460 ljudskog raka ne-malih ćelija pluća (NSCLC)
[0439] BALB/c goli miševi inokulisani ljudskim NCI-H460 ljudskim NSCLC tretirani su sa ISIS 455291. Efekat tretmana na rast tumora i podnošljivost kod miševa su procenjeni.
Tretman
[0440] Studija je sprovedena kod Pharmaron Inc (Beijing, P.R. China). BALB/c goli miševi su dobijeni od Pekinških HFK Bio-Technology Co., Ltd. NCI-H460 ljudske NSCLC ćelije su održavane in vitro kao monosjojna kultura u RPMI-1640 medijumu dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 2 mM L-glutamina. Ćelije su održavane na 37°C u atmosferi od 5% CO2u vazduhu. Tumorske ćelije su rutinski subkultivisane dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA tretmanom. Ćelije koje rastu u eksponencijalnoj fazi rasta su sakupljene i izbrojane za inokulaciju tumora.
[0441] Dve grupe od osam nasumično dodeljenih 6-8 nedelja starih ženki BALB/c golih miševa su inokulisane subkutano sa 2 x 10<6>NCI-H460 tumorskih ćelije za razvoj tumora. Tretman antisens oligonukleotida je počeo 6. dana nakon inokulacije tumora kada je srednja veličina tumora dostigla približno 100 mm3. Jedna od grupa je injektirana intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa 50 mg/kg ISIS 455291. Druga grupa miševa je intraperitonealno injektirana dva puta nedeljno tokom 3 nedelje sa PBS, i služila je kao kontrolna grupa.
[0442] Sve procedure koje se odnose na rukovanje životinjama, negu i tretman, izvršene su u skladu sa smernicama koje je odobrio Institucionalni odbor za negu i korišćenje životinja (Institutional Animal Care and Use Committee - IACUC). U vreme rutinskog nadgledanja, životinje su proveravane za bilo kakav efekat rasta tumora na normalno ponašanje, kao što je pokretljivost, konzumacija hrane, promene telesne težine i bilo koji drugi abnormalni efekat.
Uticaj na rast tumora
[0443] Veličina tumora je merena dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem šestara, i zapremine tumora su izračunate koristeći formulu: V = 0,5 x a x b<2>, gde a i b su dugi i kratki prečnici tumora. Veličina tumora je korišćena za proračune T-C i TV/CVvrednosti. T-C je izračunat sa T kao srednjim vremenom (u danima) potrebnim da tumori u tretiranim grupama dostignu prethodno određenu veličinu (1500 mm<3>), i C kao srednjim vremenom (u danima) da tumori u kontrolnoj grupi dostignu istu veličinu. TV/CVvrednost (eksprimirana kao procenat) je indikacija anti-tumorske efikasnosti ISIS oligonukleotida, gde je TVi CVbili su srednja zapremina tretiranih i kontrolnih grupa, respektivno, na određeni dan (20. dan).
[0444] Rezultati su prikazani u Tabelama 75 i 76. Podaci ukazuju da inhibicija STAT3 značajno ometa rast tumora.
Tabela 75
Efekat antisens inhibicije STAT3 na rast tumora u NCI-H460 ksenograft modelu Dani PBS ISIS 455291
6 104 104
8 303 180
11 746 408
13 1,175 620
15 1,642 819
18 2,277 1,320
20 2,859 1,812
22 - 2,330
Tabela 76
Efekat antisens inhibicije STAT3 na inhibiciju rasta tumora u NCI-H460 ksenograft modelu
Tretman Veličina tumora (mm<3>) na dan 20 TV/CV(%) T-C pri 800 mm<3>
PBS 1,210 - -
ISIS 455291 1,812 63 4
Merenje telesne težine
[0445] Kako bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na sveukupno zdravlje životinja, telesne težine su redovno merene tokom perioda tretmana. Podaci su prikazani u Tabeli 77 i pokazuju da tretman sa ISIS 455291 ne utiče na ukupnu telesnu težinu miševa.
Tabela 77
Merenja telesne težine miševa u NCI-H460 ksenograft modelu
Dan 6 Dan 8 Dan 11 Dan 13 Dan 15 Dan 18 Dan 20 Dan 22
PBS 20 20 20 20 20 20 21 -
ISIS 455291 20 20 20 20 20 19 20 20
Primer 52: Efekat antisens inhibicije ljudskog STAT3 u ljudskom modelu ortotopskog miša glioblastoma
[0446] NU/J miševi ortotopički implantirani sa ljudskim ćelijama glioblastoma su tretirani sa ISIS 455291, 5-10-5 MOE gapmerom koji ima sekvencu CAGCAGATCAAGTCCAGGGA (SEQ ID NO: 1590. Efekat tretmana na rast tumora i podnošljivost kod miševa je procenjeni.
Tretman
[0447] Trideset NU/J miševa je implantirano stereotaktički u desni frontalni režanj sa 5 x 10<5>U-87 MG-luc2 ćelija. Na dan 15 nakon implantacije tumorskih ćelija, 15 od ovih miševa je dozirano intrakranijalno sa bolus injekcijom na mestu implantacije tumora sa 100 µg ISIS 455291, koji je rastvoren u 2 µL PBS. Preostalih 15 miševa je dozirano intrakranijalno bolus injekcijom na mestu implantacije tumora sa 2 µL PBS. Druga grupa miševa je služila kao kontrolna grupa.
Analiza
[0448] Na dan 18 nakon transplantacije tumora, pet miševa iz svake grupe su eutanazirani sa CO2inhalacijom i uzorci mozga su sakupljeni za RNK analizu. RNK je ekstrakovana iz tumorskog tkiva za PCR analizu u realnom vremenu nivoa ljudskog STAT3 mRNK upotrebom kompleta RTS199 za sondiranje prajmera, koji je opisan gore. Tretman sa ISIS 455291 rezultovao je 27% redukcijom ljudske STAT3 mRNK u tumorskom tkivu u poređenju sa PBS kontrolom.
[0449] Preostali miševi u svakoj grupi su redovno praćeni do 2 nedelje za analizu preživljavanja. Medijana preživljavanja za PBS kontrolnu grupu bila je 30,5 dana. Medijalno preživljavanje miševa tretiranih ISIS oligonukleotidima je bilo 35 dana. Vrednost P je bila 0,2088.
Primer 53: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u PC9 ćelije
[0450] ISIS 455703 i ISIS 455291, iz gore opisanih studija, su dalje testirani u različitim dozama u PC9 ćelijama, ćelijska linija karcinoma pluća bez malih ćelija. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 78. Posle približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnim realnim PCR. Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem beta-aktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531).
Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0451] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 78. Kao što je ilustrovano u Tabeli 78, ISIS 455703 i ISIS 455291 su bili u stanju da prodru u ćelijsku membranu.
Tabela 78
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane PC9 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM)
455703 6 5 17 50 49 9,0
455291 0 0 42 67 75 1,2
Primer 54: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u C42B ćelijama
[0452] ISIS 455291, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u C42B ćelijama, ćelijskoj liniji kancera prostate. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 79. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR.
Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0453] Kao što je prikazano u Tabeli 79, ISIS 455291 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 79
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane C42B ćelija
ISIS br. 0,02 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM
455291 0 0 17 10 41
Primer 55: Dozno-zavisna antisens inhibicija STAT3 nakon slobodnog preuzimanja antisens oligonukleotida u Colo201 ćelijama
[0454] ISIS 455291, iz gore opisanih studija, je dalje testiran u različitim dozama u Colo201 ćelijama, ćelijskoj liniji kolorektalnog karcinoma. Ćelije su nanesene pri gustini od 3.000 ćelija po komorici. Ćelije su inkubirane sa 0,02 uM, 0,1 uM, 0,5 uM, 2,5 uM i 10,0 uM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno u Tabeli 80. Posle približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi mRNK STAT3 su mereni kvantitativnom PCR.
Komplet RTS2033 za sondiranje ljudskog STAT3 prajmera (prednja sekvenca GAGGCCCGCCCAACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1520; reverzna sekvenca TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 1521; sonda sekvenca CTGCCTAGATCGGC, ovde označena kao SEQ ID NO: 1522) je korišćen za merenje mRNK nivoa. Nivoi mRNK STAT3 su prilagođeni u skladu sa sadržajem betaaktina, housekeeping gena, mereno pomoću kompleta HTS5002 za sondiranje ljudskog prajmera (prednja sekvenca CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1529; reverzna sekvenca GCCATGCCAATCTCATCTTGT, ovde označena kao SEQ ID NO: sonda sekvenca CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA, ovde označena kao SEQ ID NO: 1531). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije STAT3, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0455] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana u Tabeli 80. Kao što je ilustrovano u Tabeli 29, ISIS 455291 je bio u stanju da prodre u ćelijsku membranu.
Tabela 80
Nivoi dozno-zavisne antisens inhibicije STAT3 mRNK pomoću slobodnog preuzimanja ISIS oligonukleotida od strane Colo201 ćelija
ISIS br. 0,02 µM 0,1 µM 0,5 µM 2,5 µM 10,0 µM IC50(µM) 455291 21 18 34 52 81 1,2

Claims (7)

Patentni zahtevi
1. Jednolančano jedinjenje koje sadrži modifikovani jednolančani oligonukleotid koji se sastoji od 16 povezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 245, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde modifikovani oligonukleotid sadrži:
5'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
3'-krilo koje se sastoji od 3 povezana nukleozida;
jaz između 5'-krila i 3'-krila koji se sastoji od 10 povezanih 2'-dezoksinukleozida; gde svaki nukleozid svakog od 5'-krila i 3'-krila sadrži ograničeni etil nukleozid; gde je svaka internukleozidna veza fosforotioatna veza; i
gde je svaki citozin 5-metilcitozin.
2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde je oligonukleotid kovalentno vezan za jednu ili više konjugatnih grupa.
3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde jedna ili više konjugatnih grupa obuhvataju ugljene hidrate.
4. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i farmaceutski prihvatljiv rastvarač ili nosač.
5. Jednolančano jedinjenje koje sadrži modifikovani jednolančani oligonukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, ili njegova farmaceutski prihvatljivu so, ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 4 za upotrebu u tretmanu hiperproliferativne bolesti kod životinje.
6. Jedinjenje ili sastav prema patentnom zahtevu 5, gde je životinja čovek.
7. Jedinjenje ili sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6, gde je hiperproliferativna bolest rak.
Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20190022A 2011-04-01 2012-03-30 Modulacija eksprimiranja transduktora signala i aktivatora transkripcije 3 (stat3) RS58489B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161471045P 2011-04-01 2011-04-01
US201161471001P 2011-04-01 2011-04-01
US201161471035P 2011-04-01 2011-04-01
US201161471015P 2011-04-01 2011-04-01
US201161558308P 2011-11-10 2011-11-10
US201161558316P 2011-11-10 2011-11-10
EP12763390.7A EP2697243B1 (en) 2011-04-01 2012-03-30 Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
PCT/US2012/031642 WO2012135736A2 (en) 2011-04-01 2012-03-30 Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58489B1 true RS58489B1 (sr) 2019-04-30

Family

ID=46932413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190022A RS58489B1 (sr) 2011-04-01 2012-03-30 Modulacija eksprimiranja transduktora signala i aktivatora transkripcije 3 (stat3)

Country Status (35)

Country Link
US (4) US8816056B2 (sr)
EP (2) EP2697243B1 (sr)
JP (1) JP5943993B2 (sr)
KR (2) KR102050469B1 (sr)
CN (2) CN103562215B (sr)
AU (1) AU2012236206C1 (sr)
BR (1) BR112013024768B1 (sr)
CA (1) CA2831915C (sr)
CL (1) CL2013002773A1 (sr)
CO (1) CO6821885A2 (sr)
CY (1) CY1121460T1 (sr)
DK (1) DK2697243T3 (sr)
DO (1) DOP2013000216A (sr)
EA (2) EA201792185A3 (sr)
EC (1) ECSP13012909A (sr)
ES (1) ES2709495T3 (sr)
GT (1) GT201300232A (sr)
HR (1) HRP20182169T1 (sr)
HU (1) HUE042173T2 (sr)
IL (2) IL228569A (sr)
LT (1) LT2697243T (sr)
ME (1) ME03317B (sr)
MX (1) MX340086B (sr)
MY (1) MY163004A (sr)
NI (1) NI201300101A (sr)
PE (2) PE20142463A1 (sr)
PH (1) PH12013502049A1 (sr)
PL (1) PL2697243T3 (sr)
PT (1) PT2697243T (sr)
RS (1) RS58489B1 (sr)
SG (1) SG193504A1 (sr)
SI (1) SI2697243T1 (sr)
SM (1) SMT201900060T1 (sr)
WO (1) WO2012135736A2 (sr)
ZA (1) ZA201308153B (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SMT201900060T1 (it) 2011-04-01 2019-02-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulazione dell'espressione del trasduttore di segnale e dell'attivatore di trascrizione 3 (stat3)
CA2868096C (en) 2012-03-28 2019-12-31 Somalogic, Inc. Aptamers to pdgf and vegf and their use in treating pdgf and vegf mediated conditions
RU2730677C2 (ru) * 2012-10-15 2020-08-24 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Соединение для модуляции экспрессии гена c9orf72 и его применение
EP2906697A4 (en) 2012-10-15 2016-06-22 Ionis Pharmaceuticals Inc METHOD FOR MONITORING THE C9ORF72 EXPRESSION
EP2920308B1 (en) 2012-10-31 2018-12-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Cancer treatment
BR112015027322A8 (pt) 2013-05-01 2018-01-02 Isis Pharmaceuticals Inc Compostos antissenso conjugados e sua utilização
JP6487913B2 (ja) * 2013-07-02 2019-03-20 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 成長ホルモン受容体のモジュレータ
JP6630273B2 (ja) 2013-09-09 2020-01-15 ソマロジック・インコーポレーテッド 安定性が向上したｐｄｇｆ及びｖｅｇｆアプタマー並びにｐｄｇｆ及びｖｅｇｆ媒介性の疾患及び障害の治療におけるそれらの使用
BR112016007751A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-12 Ionis Pharmaceuticals Inc composições para modulação de expressão de c9orf72
EP3845547A1 (en) 2014-05-01 2021-07-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Galnac3 conjugated modified oligonucleotide for modulating angiopoietin-like 3 expression
MX380866B (es) 2014-05-01 2025-03-12 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para modular la expresión del factor b del complemento.
BR122020024446B8 (pt) 2014-05-01 2022-06-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos para modulação da expressão do receptor do hormônio de crescimento
US10570169B2 (en) 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
US10731163B2 (en) * 2014-09-02 2020-08-04 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft Oligonucleotide targeted to the A20-3′ untranslated region
HUE043227T2 (hu) 2014-10-24 2019-08-28 Astrazeneca Ab Kombináció
MX366128B (es) 2015-04-16 2019-06-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones para modular la expresion de c90rf72.
EP3316894A4 (en) 2015-07-02 2019-06-19 City of Hope COMPOUNDS AND COMPOSITIONS USING PHOSPHOROIDED OLIGODESOXYNUCLEOTIDE AND METHOD OF USE THEREOF
ES2917181T3 (es) 2015-07-10 2022-07-07 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2)
EA038277B1 (ru) 2015-10-14 2021-08-04 Байо-Пат Холдингз, Инк. P-этокси нуклеиновые кислоты для липосомальной лекарственной формы
US11260073B2 (en) 2015-11-02 2022-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating C90RF72
EP3372233B1 (en) 2015-11-06 2021-07-07 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
CN113952353A (zh) 2015-11-06 2022-01-21 Ionis制药公司 调节载脂蛋白(a)表达
WO2017188898A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Nanyang Technological University G-quadruplex-containing antisense oligonucleotides
CN105985961B (zh) * 2016-07-22 2019-01-29 广西师范大学 抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用
MX2019003070A (es) 2016-09-16 2019-10-14 Bio Path Holdings Inc Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales.
CN109661233A (zh) 2016-10-06 2019-04-19 Ionis 制药公司 缀合低聚化合物的方法
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
SG11201909336VA (en) * 2017-04-19 2019-11-28 Bio Path Holdings Inc P-ethoxy nucleic acids for stat3 inhibition
US12234457B2 (en) 2017-04-19 2025-02-25 Bio-Path Holdings, Inc. P-ethoxy nucleic acids for BCL2 inhibition
GB2574793B (en) * 2018-05-01 2022-09-28 Flexenable Ltd Organic liquid crystal display device with one or more oxygen permeable films
TWI869213B (zh) * 2018-09-19 2025-01-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
CA3147366A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 Adam T. BOUTIN Extracellular vesicles with stat3-antisense oligonucleotides
EP4037693A1 (en) 2019-09-30 2022-08-10 Astrazeneca AB Combination treatment for cancer
WO2021097437A1 (en) * 2019-11-14 2021-05-20 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Oligonucleotide interference treatments of prostate cancer
JP7674354B2 (ja) * 2019-12-05 2025-05-09 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 肝線維症および線維症に関連する他の疾患に対するエキソソームベースの療法
CN114908094B (zh) * 2022-05-31 2024-03-12 中山大学 一类反义寡核苷酸分子及其在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用
WO2024003241A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Astrazeneca Ab Treatment for immuno-oncology resistant subjects with an anti pd-l1 antibody an antisense targeted to stat3 and an inhibitor of ctla-4

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
WO1993005182A1 (en) 1991-09-05 1993-03-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
EP0676469A3 (en) 1994-04-04 1998-03-25 Tadamitsu Kishimoto Transcription Factor APRF
CA2190471A1 (en) 1994-05-16 1995-11-23 Carlos Eduardo Lopez-Nieto Processes, apparatus and compositions for characterizing nucleotide sequences
EP0717110A1 (en) 1994-11-22 1996-06-19 Association Francaise Contre Les Myopathies LGMD gene
US5877021A (en) 1995-07-07 1999-03-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. B7-1 targeted ribozymes
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
US6514725B1 (en) 1997-01-10 2003-02-04 Tadamitsu Kishimoto STAT function-regulatory protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US7098192B2 (en) * 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
US6159694A (en) 1999-04-08 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of stat3 expression
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
AU1368300A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Universite De Liege Cold-active beta galactosidase, the process for its preparation and the use thereof
US6248586B1 (en) 1999-12-17 2001-06-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PKA catalytic subunit C-alpha expression
EP1392272B1 (en) 2001-05-11 2014-08-06 Merrion Research III Limited Permeation enhancers
US20050196781A1 (en) * 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of STAT3 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1499627A2 (en) 2001-07-03 2005-01-26 ISIS Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
WO2003008578A2 (en) 2001-07-20 2003-01-30 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Reagents and methods for identifying gene targets for treating cancer
US7259150B2 (en) * 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP2957568B1 (en) 2002-11-05 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
EP2213738B1 (en) 2002-11-14 2012-10-10 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物
CN1733916A (zh) * 2005-07-01 2006-02-15 中国人民解放军第三军医大学 抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法
CN100357436C (zh) * 2005-07-01 2007-12-26 中国人民解放军第三军医大学 抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法
EP1984381B1 (en) 2006-01-27 2010-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2008109494A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting stat3 gene expression and uses thereof
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
US8278283B2 (en) 2007-07-05 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted or unsaturated bicyclic nucleic acid analogs
US20100298409A1 (en) 2007-09-17 2010-11-25 Intradigm Corporation Compositions comprising stat3 sirna and methods of use thereof
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
SMT201900060T1 (it) 2011-04-01 2019-02-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulazione dell'espressione del trasduttore di segnale e dell'attivatore di trascrizione 3 (stat3)
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
EP2920308B1 (en) 2012-10-31 2018-12-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Cancer treatment
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

Also Published As

Publication number Publication date
KR102050469B1 (ko) 2019-12-02
CO6821885A2 (es) 2013-12-31
EA201792185A2 (ru) 2018-06-29
CA2831915C (en) 2021-01-12
DOP2013000216A (es) 2013-12-15
BR112013024768A2 (pt) 2018-06-05
HUE042173T2 (hu) 2019-06-28
ZA201308153B (en) 2016-01-27
ME03317B (me) 2019-10-20
AU2012236206A1 (en) 2013-05-02
PE20181518A1 (es) 2018-09-21
SG193504A1 (en) 2013-10-30
EP2697243A4 (en) 2015-04-01
AU2012236206C1 (en) 2018-03-08
CY1121460T1 (el) 2020-05-29
JP5943993B2 (ja) 2016-07-05
EP3466960A2 (en) 2019-04-10
SI2697243T1 (sl) 2019-05-31
ECSP13012909A (es) 2013-12-31
CN107012144A (zh) 2017-08-04
KR20190092590A (ko) 2019-08-07
IL228569A (en) 2017-12-31
EA201391329A1 (ru) 2014-07-30
MX340086B (es) 2016-06-24
AU2012236206B2 (en) 2015-09-17
CN103562215A (zh) 2014-02-05
WO2012135736A3 (en) 2012-12-06
MY163004A (en) 2017-07-31
HRP20182169T1 (hr) 2019-04-19
IL255858A (en) 2018-01-31
SMT201900060T1 (it) 2019-02-28
CA2831915A1 (en) 2012-10-04
EP2697243A2 (en) 2014-02-19
CL2013002773A1 (es) 2014-04-04
PT2697243T (pt) 2019-01-29
PL2697243T3 (pl) 2019-05-31
US20200385716A1 (en) 2020-12-10
IL228569A0 (en) 2013-12-31
EA201792185A3 (ru) 2018-10-31
WO2012135736A2 (en) 2012-10-04
NI201300101A (es) 2014-07-08
US20160348104A1 (en) 2016-12-01
US10479993B2 (en) 2019-11-19
CN103562215B (zh) 2017-04-26
PE20142463A1 (es) 2015-01-22
GT201300232A (es) 2015-02-11
EP2697243B1 (en) 2018-10-31
ES2709495T3 (es) 2019-04-16
JP2014511686A (ja) 2014-05-19
NZ616036A (en) 2015-09-25
EA029317B1 (ru) 2018-03-30
MX2013011423A (es) 2014-04-30
DK2697243T3 (en) 2019-02-11
US8816056B2 (en) 2014-08-26
US20140336237A1 (en) 2014-11-13
US9359608B2 (en) 2016-06-07
LT2697243T (lt) 2019-04-10
KR20140027205A (ko) 2014-03-06
US20120277284A1 (en) 2012-11-01
EP3466960A3 (en) 2019-04-24
BR112013024768B1 (pt) 2022-02-08
PH12013502049A1 (en) 2013-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2697243T3 (en) MODULE EXPRESSION OF SIGNAL TRANSDUCER AND TRANSCRIPTION ACTIVATOR 3 (STAT3)
EP2794880B1 (en) Methods for modulating metastasis-associated-in-lung-adenocarcinoma-transcript-1(malat-1) expression
RS60230B1 (sr) Kompozicije za moduliranje ekspresije c9orf72
WO2016167780A1 (en) Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
EP4474389A2 (en) Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
RS62526B1 (sr) Kompozicije za modulaciju ekspresije ataksina 2
CN106146591A (zh) 血管生成素样3表达的调节
WO2016112132A1 (en) Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
CN105637090A (zh) 用于调节c9orf72表达的组合物
AU2014337506A1 (en) Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
JP5951752B2 (ja) Ｐｔｐ１ｂ発現のアンチセンス調節
WO2018102745A1 (en) Modulation of lnc05 expression
HK40007095A (en) Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
WO2011123394A1 (en) Modulation of matrix metalloproteinase 13 (mmp-13) expression
NZ616036B2 (en) Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
HK1193824B (en) Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
HK1193824A (en) Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
HK40120876A (en) Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
HK40039446A (en) Compositions for modulating c9orf72 expression
HK40069167A (en) Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
HK1250255B (en) Compositions for modulating c9orf72 expression