RS55962B1 - Postupak za formulaciju vakcine koja sadrži najmanje dva antigena sposobna da se adsorbuju na aluminijum hidroksid oksidu - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na oblast kombinovanih vakcina koje sadrže istovremeno valencu hepatitisa B koja se sastoji od površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBsAg) i valencu Haemophilus influenzae tip b, koja se sastoji od svog kapsularnog polisaharida, koji se zove poliribozilribitolfosfat (PRP) i koji je, da bi bio delotvoran kod dece mlađe od dve godine, vezan za noseći protein, na primer protein tetanusa.

[0002] Takve kombinacije namenjene primeni kod dece u ranom dobu generalno sadrže druge antigene koji omogućavaju da se vakcinišu, jednim postupkom, protiv različitih bolesti, kao i adjuvans na bazi aluminijuma.

[0003] Patentna prijava WO 03/009869 se bavi problemima stabilnosti vakcina i preporučuje, kada je prisutan antigen hepatitisa B, da se izbegava njegova adsorpcija na aluminijum hidroksidu; savetuje se da se adsorbuje na aluminijum hidroksifosfatu, ili da se ne adsorbuje.

[0004] Patentna prijava WO99/13906 opisuje kompoziciju vakcine koja sadrži, kao što je opisano na strani 13, antigene protiv difterije, tetanusa, polija, velikog kašlja, hepatitisa B i infekcija bakterijom Haemophilus influenzae tip b. Neki od tih antigena, da bi bili imunogeni, moraju da se adsorbuju na soli aluminijuma. To je posebno slučaj sa hepatitis B površinskim antigenom ili HBsAg.

[0005] Ili, kako je naznačeno na strani 12 prijave WO99/13906, valenca Hib koja se sastoji od kapsularnog polisaharida vezanog za protein tetanusa ima tendenciju da izgubi svoju imunogenost tokom vremena kada je adsorbovana na solima aluminijuma. Da bi se izbegla ta nepogodnost, rešenje koje je prethodno predloženo u ovoj struci je, kao što je već preporučeno u prethodnoj prijavi PCT/FR96/00791, da se dodaju anjoni, a naročito joni fosfata, karbonata ili citrata.

[0006] Međutim, autori predmetnog pronalaska su zapazili da, ako dodavanje anjona, a naročito fosfata ili karbonata, omogućava efikasno izbegavanje adsorpcije PRP-T na aluminijum hidroksid oksidu (AlOOH), i tako održavanje njegove imunogenosti tokom vremena, to dodavanje takođe ima nedostatak što desorbuje hepatitis B površinski antigen kada je i on adsorbovan na aluminijum hidroksid oksidu.

[0007] Stoga je neophodno da se nađe postupak za pripremu kombinovane vakcine koja sadrži aluminijum hidroksid oksid, u kojoj se hepatitis B površinski antigen održava adsorbovanim na AlOOH dok se antigen Hib održava neadsorbovanim.

[0008] U tu svrhu, predmetni pronalazak ima za cilj postupak za pripremu tečne kombinovane vakcine koja sadrži najmanje:

hepatitis B površinski antigen (HBsAg),

antigen Haemophilus influenzae tip b (Hib) koji se sastoji od kapsularnog polisaharida vezanog za noseći protein,

aluminijum hidroksid oksid (AlOOH),

u kojoj se hepatitis B površinski antigen održava adsorbovanim na AlOOH dok se antigen Hib održava neadsorbovanim,

prema kome:

vrši se adsorpcija hepatitis B površinskog antigena na AlOOH da bi se dobio kompleks AlOOH/HBsAg,

pomenuti kompleks AlOOH/HBsAg se meša sa Hib antigenom u prisustvu katjonskih aminokiselina u koncentraciji od najmanje 100 mg/l, i fosfatnog jona u koncentraciji od 35 do 45 mmol/l.

[0009] Zahvaljujući postupku prema pronalasku, moguće je da se uspostavi željena ravnoteža između održavanja adsorpcije hepatitis B površinskog antigena na aluminijum hidroksid oksidu i održavanja neadsorpcije antigena Hib.

[0010] Prema naročitom otelotvorenju pronalaska, adsorpcija antigena HBsAg se vrši tako što se pomeša suspenzija AlOOH sa suspenzijom HBsAg uz mešanje tokom najmanje 4 sata, poželjno najmanje 12 sati, poželjno između 20 i 24 sata.

[0011] Prema naročitom otelotvorenju pronalaska, pomenutom kompleksu AlOOH/HBsAg se dodaju katjonske aminokiseline pre mešanja sa antigenom Hib.

[0012] Prema alternativnom otelotvorenju pronalaska, katjonske aminokiseline se dodaju pomenutom antigenu Hib pre mešanja sa kompleksom AlOOH/HBsAg. Prema otelotvorenju pronalaska, pomenutom kompleksu AlOOH/HBsAg se dodaju joni fosfata pre mešanja sa antigenom Hib.

[0013] Prema otelotvorenju pronalaska, podešava se pH preparata koji sadrži kompleks AlOOH/HBsAg na 7,1 ± 0,1 pre mešanja sa antigenom Hib.

[0014] Pronalazak takođe ima za cilj kombinovanu vakcinu dobijenu prema postupku iz patentnih zahteva i koja sadrži najmanje:

- hepatitis B površinski antigen,

- antigen difterije u obliku difterijskog toksina D,

- antigen tetanusa u obliku toksina tetanusa T,

- antigene velikog kašlja u obliku prečišćenog toksina (PTxd) i filamentnog hemaglutinina (FHA),

- antigen Haemophilus influenzae tip b, u obliku poliribozilribitolfosfata vezanog za protein tetanusa (PRP-T),

- antigene polija u obliku inaktiviranog virusa tipa 1, 2 i 3.

[0015] Takva kompozicija vakcine ima prednost što je u tečnom obliku, pa se izbegavaju operacije dodavanja liofilizata, pokazalo se da je dovoljno stabilna da ostaje imunogena do dana upotrebe, čak i 36 meseci nakon datuma proizvodnje.

[0016] Prema pronalasku, kompozicija vakcine sadrži hepatitis B površinski antigen (HBsAg). Taj antigen može naročito da bude hepatitis B površinski antigen, kao onaj prisutan u vakcini Recombivax HB™, ili u svakoj drugoj vakcini protiv hepatitisa B. Može naročito da se radi o rekombinantnom antigenu dobijenom fermentacijom modifikovanog kvasca Hansenula polymorpha, prema tehnologiji koju je razvio Crucell, kao što je onaj prisutan u vakcini Hepavax-Gene™. U svrhu pronalaska, količina HBsAg prisutna u dozi od 0,5 ml je povoljno između 5 i 15 µg, a naročito 10 µg.

[0017] Prema pronalasku, kompozicija vakcine sadrži antigen Haemophilus influenzae tip b (Hib). Taj antigen se sastoji od kapsularnog polisaharida bakterije ili poliribozil ribitol fosfata (PRP) koji je vezan za noseći protein.

[0018] Noseći protein može biti bilo koji protein koji se kao takav koristi u oblasti vakcina. To može, na primer, biti difterijski toksin D, toksin tetanusa T, lipoprotein D Haemophilus influenzae, CRM197 ili protein eksterne membrane (OMP) N. meningitidis. Poželjno se koristi protein tetanusa da bi se dobio konjugat PRP-T. U svrhu pronalaska, konjugat PRP-T može biti prisutan u količini od 1 do 30 µg PRP po dozi od 0,5 ml, pogodno od 5 do 25 µg PRP po dozi, poželjno je 10 do 15 µg PRP po dozi, još poželjnije je 10 do 12 µg PRP po dozi, a najpoželjnije 12 µg PRP po dozi, vezano za 22-36 µg proteina tetanusa.

[0019] Prema pronalasku, kombinovana vakcina sadrži aluminijum hidroksid oksid AlOOH. Ta aluminijumova so se često pogrešno zove aluminijum hidroksid. AlOOH može da se koristi u svrhu predmetnog pronalaska, možda na primer komercijalno dostupni AlOOH kompanije Brenntag AG, ili Rehydragel HPA kompanije Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ), iako se način proizvodnje ova dva adjuvansa razlikuje. Upotrebljena količina AlOOH se izračunava tako da se omogući postizanje zadovoljavajućeg imunog odgovora; ona posebno zavisi od broja i prirode antigena prisutnih u kompoziciji, kao i od količine svakog antigena.

[0020] Samo informativno, maksimalna adsorpcija HBsAg na AlOOH je reda veličine 780 µg proteina po mg aluminijuma (na klasičan način, količina AlOOH je izražena kao količina Al<3+>). Za dozu vakcine koja sadrži 10 µg HBsAg, bez drugih dodatnih antigena, dovoljno je dakle 13 µg aluminijuma, što je sasvim nedovoljna količina za obezbeđivanje delotvornosti ako se dodaju i drugi antigeni. Tako, u funkciji dodavanja jednog ili više dodatnih antigena, može se dovesti u kontakt 10 µg HBsAg sa 0,01 mg do 1,25 mg aluminijuma, što je maksimalna količina koju preporučuje Evropska farmakopeja.

[0021] Na primer, doza od 0,5 ml pedijatrijske vakcine koja sadrži antigene difterije, tetanusa, velikog kašlja, hepatitisa B, može na klasičan način da sadrži od 0,5 do 0,7 mg aluminijuma, poželjno je oko 0,6 mg aluminijuma.

[0022] Prema pronalasku, hepatitis B površinski antigen se održava adsorbovanim na AlOOH, što znači da je najmanje 60%, poželjno je najmanje 65%, poželjno je najmanje 70%, poželjno je najmanje 75%, poželjno je najmanje 80%, poželjno je najmanje 85% poželjno je najmanje 90%, poželjno je najmanje 95% ukupne količine tog antigena prisutnog u kompoziciji u adsorbovanom obliku.

[0023] Prema pronalasku, antigen Hib se održava neadsorbovanim na AlOOH, što znači da je najmanje 65%, poželjno je najmanje 70%, poželjno je najmanje 75%, ukupne količine tog antigena prisutnog u kompoziciji u neadsorbovanom obliku.

[0024] Prema pronalasku, period tokom koga se hepatitis B površinski antigen održava adsorbovanim na AlOOH a antigen Hib se održava neadsorbovanim iznosi najmanje 3 meseca, poželjno je najmanje 6 meseci, poželjno je najmanje 12 meseci, poželjno je najmanje 18 meseci, poželjno je najmanje 24 meseca, još poželjnije je najmanje 36 meseci od datuma proizvodnje kompozicije, kada je temperatura čuvanja 5 ± 3°C. Poželjno, količina adsorbovanih ili neadsorbovanih antigena je stabilna tokom vremena, ali takođe može i da varira, pod uslovom da ostane u prihvatljivim granicama. Tako, kada je najmanje 85% ukupne količine HBsAg prisutne u kompoziciji adsorbovano na AlOOH tokom 3 meseca od datuma proizvodnje kompozicije koja se čuva na temperaturi od 5 ± 3°C, sasvim je moguće da će na kraju jedne godine, pod istim uslovima čuvanja, 80% ukupne količine HBsAg prisutne u kompoziciji biti održano u adsorbovanom stanju.

[0025] Da bi se procenila količina adsorbovanog antigena, stručnjaci za ovu oblast mogu da koriste sve poznate metode.

[0026] Što se tiče procenta adsorpcije HBsAg, moguće je koristiti metodu ELISA sendvič tipa, prema propisima koje je definisala Evropska farmakopeja 2.7.1. Ukratko, HBsAg je vezan pomoću primarnog monoklonskog antitela anti-HBsAg IgM tipa, u bazenima ploče sa 96 bazena. Tako fiksirani HBsAg pokriva se sekundarnim monoklonskim antitelom anti-HBsAg IgG tipa, koje se detektuje poliklonskim antitelom anti-IgG, vezanim za peroksidazu. Hromogeni supstrat peroksidaze, tetrametilbenzidin (TMB) služi kao sredstvo za razvijanje. Prilikom njegovog dodavanja razvija se boja čiji intenzitet je srazmeran količini HBsAg koji je vezan u bazenima. Analiza rezultata vrši se po metodi paralelnih pravih opisanoj u Evropskoj farmakopeji 5.3.3. Procenat adsorpcije se dobija polazeći od određivanja ukupnog sadržaja HBsAg i sadržaja neadsorbovanog HBsAg.

[0027] Što se tiče količine neadsorbovanog PRP-T, ona može da se proceni pomoću HPAEC-PAD (jonoizmenjivačka hromatografija visokih performansi – pulsna amperometrijska detekcija).

[0028] Prema postupku iz pronalaska, hepatitis B površinski antigen se adsorbuje na AlOOH. Taj korak može da se izvede dovođenjem u kontakt hepatitis B površinskog antigena i AlOOH u odsustvu bilo kog drugog antigena, i ostavljanjem da se hepatitis B površinski antigen adsorbuje na AlOOH tokom najmanje 4 sata, poželjno je najmanje 12 sati, a najpoželjnije između 20 i 24 sata, da bi se dobio preparat koji sadrži kompleks AlOOH/HBsAg. Ta adsorpcija može da se izvede, prema pronalasku, u odsustvu jona fosfata. Cilj ovog produženog vremena kontakta između hepatitis B površinskog antigena i AlOOH sastoji se u tome da se maksimalno povećaju elektrostatičke interakcije i da se favorizuju stabilne interakcije, što može dovesti do adsorpcije izmenom liganda. Taj kontakt se povoljno postiže mešanjem.

[0029] Prema postupku iz pronalaska, mešanje kompleksa AlOOH/HBsAg sa antigenom Hib se ostvaruje u prisustvu katjonskih aminokiselina i fosfatnih jona.

[0030] U svrhu pronalaska, pod katjonskim aminokiselinama se podrazumevaju aminokiseline čiji pHi je veći od pH kompozicije vakcine, i koje su dakle u katjonskom obliku na pH vakcine; radi se naročito o lizinu (Lys), argininu (Arg), ili histidinu (His); svaka od ovih aminokiselina može da se primeni sama, ili u smeši bilo po 2 (Lys Arg ; Lys His ; Arg His), bilo po 3 zajedno (Lys Arg His). Prema naročitom otelotvorenju, katjonske aminokiseline mogu biti povezane u oblik dipeptida. Posebno se navode dipeptidi Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys i His-Arg. Na alternativan način, dipeptid koji je koristan u svrhu pronalaska može se sastojati od katjonske aminokiseline i nenaelektrisane aminokiseline, izabrane između Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp i Gln. Tako, u praksi, može da se koristi preparat koji sadrži jednu ili više katjonskih aminokiselina u slobodnom obliku i/ili u obliku dipeptida. Takođe je moguće da se koriste preparati aminokiselina koji sadrže istovremeno katjonske aminokiseline u željenoj količini, u smeši sa drugim aminokiselinama. Kako se ne bi pojavio preveliki pad pH usled dodavanja aminokiselina, može da se predvidi da se pH preparata koji sadrži aminokiseline poveća pre nego što se one dodaju kompleksu AlOOH/HBsAg, pomoću baze, a naročito natrijum hidroksida.

[0031] Prema pronalasku, količina katjonskih aminokiselina prisutna u finalnoj kompoziciji vakcine treba da bude najmanje 100 mg/l, povoljno najmanje 300 mg/l, povoljno najmanje 400 mg/l, a najpoželjnije je najmanje 500 mg/l. Ne postoji maksimalna kritična doza.

Međutim, poželjno je da maksimalna količina bude najviše 2 mg/ml, poželjnije je najviše 1 mg/ml, poželjnije je najviše 800 µg/ml, najpoželjnije je najviše 700 µg/ml. Tokom proračuna količine katjonskih aminokiselina koja će se dodati, treba voditi računa o katjonskim aminokiselinama koje mogu da potiču od medijuma u kojima su prisutni drugi antigeni, koji nisu HBsAg i antigen Hib.

[0032] Prema jednoj alternativi postupka, može da se odredi količina katjonskih aminokiselina na osnovu mase kapsularnog polisaharida Hib, i da se predvidi maseni odnos polisaharid Hib/katjonske aminokiseline od 1: 4 do 1: 100, povoljno 1: 10 do 1: 80, poželjno je 1: 15 do 1: 60, a najpoželjnije 1: 20 do 1: 30 ili 40.

[0033] Prema postupku iz pronalaska, mešanje kompleksa AlOOH/HBsAg sa antigenom Hib se ostvaruje u prisustvu katjonskih aminokiselina, ali takođe u prisustvu fosfatnih jona. Prema jednom otelotvorenju pronalaska, joni fosfata se dodaju kompleksu AlOOH/HBsAg pre dovođenja u kontakt sa antigenom Hib. Dodavanje fosfatnih jona može, na primer, da se ostvari dodatkom natrijum hidrogen fosfata, ili kalijum hidrogen fosfata, ili još smešom ova 2. Količina fosfatnih jona izračunava se tako da maksimalna količina hepatitis B površinskog antigena ostane adsorbovana na AlOOH, istovremeno izbegavajući adsorpciju antigena Hib. Ta količina varira u zavisnosti od prirode i broja prisutnih antigena, a naročito u zavisnosti od drugih antigena osim antigena HBsAg i Hib.

[0034] Tako, za kombinovanu vakcinu koja sadrži antigene koji se obično koriste u pedijatrijskim vakcinama, pored HBsAg i antigena Hib, antigena difterije, tetanusa, velikog kašlja, može biti povoljno da se dodaju fosfatni joni na takav način da koncentracija fosfatnih jona u krajnjoj kompoziciji vakcine bude najmanje jednaka 35 mmol/l, konkretnije između 35 i 45 mmol/l, uključujući i granične vrednosti, poželjno je između 38 i 44 mmol/l, uključujući i granične vrednosti, a najpoželjnije između 38 i 42 mmol/l, uključujući i granične vrednosti.

Prema poželjnom otelotvorenju, koncentracija fosfatnih jona u kompoziciji vakcine dobijena na kraju iznosi 40 mmol/l.

[0035] Prema alternativnom otelotvorenju, fosfatni joni se dodaju u takvoj količini da su prisutni u kompoziciji vakcine u finalnoj koncentraciji između 35 i 38 mmol/l, uključujući granične vrednosti. Na kraju se dodaju karbonatni joni, ali u ograničenoj količini, jer je primećeno da je prevelika količina karbonatnih jona nepovoljna. Povoljno, oni mogu da se dodaju u takvoj količini da su prisutni u kompoziciji vakcine u krajnjoj koncentraciji koja je manja ili jednaka 10 mmol/l.

[0036] Da bi se izbegao preveliki jonski šok koji bi destabilizovao HBsAg i favorizovao njegovu desorpciju, preporučuje se da se fosfatni joni dodaju u više (na primer, 2) odvojenih operacija (koraka). Tako, fosfatni joni mogu da se dodaju u jednoj prvoj operaciji, u količini koja omogućava da se postigne finalna koncentracija između 20 i 30 mmol/l, uključujući granične koncentracije, a zatim u drugoj operaciji, u količini koja omogućava da se postigne finalna koncentracija kao što je ona koja je precizirana u gornjem tekstu.

[0037] Prema poželjnom otelotvorenju postupka prema pronalasku, podešava se pored toga pH dobijenog preparata na 7,1 ± 0,1, pre mešanja antigena Hib sa kompleksom AlOOH/HBsAg. U stvari, primećeno je da takva vrednost pH ima pozitivan efekat na održavanje stanja neadsorbovanosti antigena Hib.

[0038] Prema naročitom otelotvorenju, pored toga se pH podešava na 7,1 ± 0,1 nakon faze mešanja.

[0039] Tako, zahvaljujući postupku prema pronalasku, može da se dobije kompozicija vakcine u kojoj:

(i) najmanje 60 ili 80%, poželjno je najmanje 85% ukupne količine hepatitis B površinskog antigena prisutnog u kompoziciji je adsorbovano na AlOOH tokom najmanje 3 meseca počevši od datuma proizvodnje kompozicije koja se čuva na temperaturi 5 ± 3°C; i

(ii) najmanje 65, 70 ili 75% ukupne količine antigena Hib prisutnog u kompoziciji nije adsorbovano na AlOOH.

[0040] Izraz „kompleks AlOOH/HBsAg“ treba tumačiti tako da znači da kompleks sadrži najmanje antigen HBsAg adsorbovan na AlOOH. Kompleks može da sadrži druge antigene, bilo da je to naznačeno ili ne.

[0041] Jedan ili više dodatnih antigena mogu pored toga da formiraju kompleks. Može naročito da se radi o anatoksinu difterije (D), anatoksinu tetanusa (T), acelularnim antigenima velikog kašlja kao što je: detoksifikovani toksin Bordetella pertussis (PTxd), filamentni hemaglutinin (FHA), pertaktin (antigen od 69 kDa) i aglutinogeni (fimbrije) te iste bakterije. Prema naročito povoljnom otelotvorenju, radi formiranja kompleksa mogu da se dodaju antigeni D, T, PTxd i FHA.

[0042] Dodatni antigeni mogu da se dodaju na različite načine. Oni mogu da se dodaju redom, nakon hepatitis B površinskog antigena, prethodno adsorbovanog (i) bilo na ukupnoj količini AlOOH koja treba da bude prisutna u kompoziciji vakcine; (ii) bilo na delimičnoj količini, koja se na kraju dopunjava da bi se postigla ukupna količina. Alternativno, dodatni antigeni mogu odvojeno da se adsorbuju, svaki na delimičnoj količini AlOOH kao HBsAg. Može takođe da se predvidi mešani proces adsorpcije – neki antigeni se adsorbuju odvojeno, a drugi se adsorbuju redno.

[0043] Prema naročitom otelotvorenju postupka prema pronalasku, dobijena kompozicija se meša nakon dodavanja svakog antigena.

[0044] Prema povoljnom otelotvorenju datom samo kao primer, HBsAg se odvojeno adsorbuje na delimičnoj količini AlOOH koja odgovara oko 30% (jednoj trećini) ukupne količine AlOOH prisutne u finalnoj kompoziciji. Uporedno sa tim, antigeni D i T se na redan način adsorbuju na komplementarnom delu AlOOH. Zatim se kombinaciji koja sadrži kompleks AlOOH-D-T dodaju antigeni velikog kašlja PTxd i FHA, pri čemu je svaki od ova 2 poslednja antigena prethodno samostalno adsorbovan na AlOOH. Najzad, dva preparata (kompleks AlOOH - HBsAg i kompleks AlOOH - D-T-PTxd-FHA) se spajaju da bi se dobio preparat koji sadrži kompleks AlOOH - HBsAg-D-T-PTxd-FHA, u kome su količine svakog elementa izabrane da se dobiju doze vakcina od 0,5 ml koje obuhvataju, na klasičan način:

od 5 do 15 µg HBsAg po dozi, poželjno 10 µg po dozi,

- od 20 do 40 Lf D po dozi, poželjno je od 25 do 35 Lf po dozi, a najpoželjnije je 30 Lf po dozi. (Lf = limit flokulacije), (izraženo na drugi način, količina D je veća ili jednaka 20 UI/dozi)

- od 5 do 25 Lf T /dozi, poželjno je od 10 do 15 Lf/dozi, a najpoželjnije je 10 Lf/dozi, (izraženo na drugi način, količina T je veća ili jednaka 40 UI/dozi)

- od 20 do 30 µg FHA/dozi, poželjno 25 µg/dozi,

- od 20 do 30 µg PTxd/dozi, poželjno 25 µg/dozi.

[0045] Prema naročitom otelotvorenju pronalaska, dodaju se takođe antigeni polija koji se sastoje, na klasičan način, od inaktiviranih virusa. Može da se predvidi da se dodaju tri tipa polio virusa uobičajeno prisutna u pedijatrijskim vakcinama, to jest tip 1, 2 ili 3, ili u slučajevima gde nije potrebno vakcinisanje protiv 3 tipa, unošenje samo tipova protiv kojih se traži vakcina. Količina polio virusa po dozi može naročito da bude:

- između 20 i 43 DU (jedinice antigena D), a naročito 40 za tip 1,

- između 5 i 9 DU, a naročito 8, za tip 2,

- između 17 i 36 DU, naročito 32, za tip 3.

[0046] Ti antigeni nisu neophodno prethodno adsorbovani na aluminijumovoj soli pre dodavanja u preparat vakcine.

[0047] Prema naročitom otelotvorenju, postupak prema pronalasku je postupak prema kome:

(i) (a) dovodi se u kontakt HBsAg i AlOOH u odsustvu bilo kog drugog antigena, i ostavi se da se HBsAg adsorbuje na AlOOH tokom najmanje 4 sata, poželjno je najmanje 12 sati, a najpoželjnije oko 24 sata, da bi se dobio preparat koji sadrži kompleks AlOOH/HBsAg;

(i) (b) preparatu dobijenom pod tačkom (i) (a) dodaje se preparat koji sadrži antigene D, T, PTxd i FHA, prethodno adsorbovane na AlOOH, i opciono, dodatne antigene Bordetella pertussis, kao što je pertaktin i aglutinogeni;

(ii) preparatu dobijenom pod tačkom (i) (b) dodaju se fosfatni joni da bi finalna koncentracija dobijena u vakcini bila 40mmol/l;

(iii) preparatu dobijenom pod tačkom (ii) dodaju se opciono polio antigeni;

(iv) preparatu dobijenom pod tačkom (ii) ili (iii) dodaje se preparat koji sadrži antigen Hib;

(v) podešava se pH na 7,1 ± 0,1; i

(vi)

(a) dodaje se najmanje jedna katjonska aminokiselina da bi se dovršio preparat dobijen pod tačkom (ii) ili (iii) pre dodavanja antigena Hib, ili

(b) u antigen Hib dodaje se najmanje katjonska aminokiselina;

pomenuta katjonska aminokiselina se dodaje u dovoljnoj količini da se dobije finalna koncentracija u vakcini koja iznosi najmanje 100 mg/l.

[0048] Prema naročitom otelotvorenju, kompozicija vakcine prema pronalasku je kompozicija koja sadrži HBsAg, toksin difterije D, toksin tetanusa T, antigene velikog kašlja PTxd i FHA prethodno adsorbovane na AlOOH, antigen Hib, i opciono polio valencu, u kojoj:

(i) najmanje 85%, poželjno je najmanje 90%, ukupne količine HBsAg prisutnog u kompoziciji se održava adsorbovanim na AlOOH tokom najmanje 3 meseca počevši od datuma proizvodnje kompozicije koja se čuva na temperaturi 5 ± 3°C; i

(ii) najmanje 65, 70 ili poželjno 75% ukupne količine antigena Hib prisutnog u kompoziciji nije adsorbovano na AlOOH, i ta količina ostaje relativno stabilna tokom vremena.

[0049] Pored toga, zahvaljujući postupku prema pronalasku, antigeni koji nisu HBsAg za koje se pokazalo da je povoljno da se adsorbuju na aluminijum hidroksid oksidu da bi bili imunogeni, takođe se održavaju adsorbovanima.

[0050] Tako, navodi se kao primer da kompozicija prema pronalasku može da sadrži:

- od 10 do 30 µg HBsAg/ml, poželjno 20 µg/ml;

- od 40 do 80 Lf D/ml, poželjno od 50 do 70 Lf/ml;

- od 10 do 50 Lf T/ml, poželjno od 10 do 30 Lf/ml;

- od 40 do 60 µg FHA/ml, poželjno 50 µg/ml;

- od 40 do 60 µg PTxd/ml, poželjno 50 µg/ml;

- od 2 do 60 µg PRP/ml, poželjno 20-24 µg/ml;

- od 1 do 2 mg AlOOH/ml, poželjno je 1,2 mg AlOOH/ml;

- fosfatne jone u koncentraciji od 35 do 45 mmol/l, poželjno od 38 do 42 mmol/l fosfatnih jona;

- od 100 do 1000 µg/ml katjonskih aminokiselina, poželjno 400 do 800 µg/ml; i opciono

- polio virus tip 1, 2 i 3, u inaktiviranom obliku u količini od 80, 16, odnosno 64

DU/ml.

[0051] Kao što je prethodno naznačeno, kompozicija prema pronalasku takođe može da sadrži dodatne antigene Bordetella pertussis, kao što je pertaktin (od 69 kDa) ili aglutinogeni.

[0052] Opis slike: Slika 1 je šema postupka iz prethodne struke prema kome se, nakon dodavanja svakog sastojka, meša.

PRIMER – Priprema na industrijskoj skali u rasutom stanju (250 l) šestovalentne vakcine HepB-Dt-Tt-Pertussis-polio-HiB

[0053] Ta priprema se obavlja pod sterilnim uslovima i uz stalno mešanje.

A – Priprema HBsAg adsorbovanog na AlOOH

[0054] U rezervoar 501, na aseptičan način se dodaje homogena suspenzija gela aluminijum hidroksid oksida (AlOOH) dobavljača Brenntag AG, sa 8 g aluminijuma/l.

[0055] Nakon filtracije kroz filter od 0,22 µm, potrebna zapremina HBsAg za dobijanje koncentracije od 20 µg/ml u finalnoj vakcini dodavana je neprekidno u rezervoar koji već sadrži AlOOH.

[0056] Smeša je ostavljena uz mešanje tokom 20 do 24 sata na sobnoj temperaturi tako da se dobije homogena suspenzija.

B – Priprema D T PTxd FHA adsorbovanih na gelu aluminijuma

[0057] Istovremeno, pripremljena je smeša gela aluminijuma, anatoksina difterije (D), anatoksina tetanusa (T), anatoksina Bordetella pertussis (PTxd) i filamentnog hemaglutinina Bordetella pertussis (FHA) na sledeći način:

U rezervoar od 250 l, na aseptičan način se dodaje homogena suspenzija gela AlOOH dobavljača Brenntag AG, sa 8 g aluminijuma/l.

[0058] U rezervoar od 250 l, koji već sadrži AlOOH, dodaju se redom, nakon filtracije kroz filter od 0,22 µm, rastvor D a zatim nakon homogenizacije rastvor T tako da dobijene koncentracije D i T u finalnoj vakcini budu 60 Lf (limit flokulacije)/ml, odnosno 20 Lf/ml.

[0059] Kada se dobije homogena smeša, u taj rezervoar se sukcesivno i na aseptičan način dodaje suspenzija PTxd prethodno adsorbovana na AlOOH, zatim suspenzija FHA prethodno adsorbovana na AlOOH, da bi dobijene koncentracije PTxd, odnosno FHA u finalnoj vakcini bile 25 µg/ml.

[0060] Najzad se dodaje, nakon filtracije kroz filter od 0,22 µm, neophodna zapremina fosfatnog pufera 500 mM, da se dobije koncentracija fosfatnih jona od 20 do 30 mmol/l.

[0061] Tako dobijena suspenzija D-T-PTxd-FHA-AlOOH ostavljena je uz mešanje najmanje 14 sati na temperaturi 5 ± 3°C.

C – Priprema smeše HBsAg D T PTxd FHA adsorbovanih na gelu aluminijuma [0062] U preparat dobijen pod tačkom B dodaje se na aseptičan način preparat dobijen pod tačkom A.

[0063] Ova smeša je ostavljena uz mešanje, tako da se dobije homogena suspenzija.

[0064] Najzad se nakon filtracije kroz filter od 0,22 µm dodaje potrebna zapremina fosfatnog pufera 500 mM, da se dobije koncentracija fosfatnih jona od 40 mmol/l u krajnjoj kompoziciji.

D – Zasićenje elektrostatičkih mesta na kompleksu aluminijum gel / HBsAg D+ T PTxd FHA pomoću rastvora aminokiselina

[0065] Priprema se rastvor aminokiselina koji sadrži 12 esencijalnih aminokiselina, sledećeg sastava:

[0066] Odnosno, 21,2 g/l aminokiselina, od čega 5,44 g/l katjonskih aminokiselina (His -Arg - Lys).

[0067] Dodaje se 450 ml natrijum hidroksida (NaOH) 2,5 M (0,51 / min). Homogenizacija se nastavlja uz mešanje tokom 10 min.

[0068] Taj rastvor aminokiselina, filtriran preko filtera od 0,22 µm, dodaje se kontinualno u smešu dobijenu pod C, tako da dobijena koncentracija katjonskih aminokiselina u finalnoj smeši bude 572 µg/ml.

E – Podešavanje pH

[0069] pH rastvora dobijenog pod D podešen je na pH 7,1 (7,0–7,2) pomoću filtriranog stok rastvora 2,5 M natrijum hidroksida.

F – Dodavanje polio antigena

[0070] U rezervoar koji sadrži suspenziju dobijenu pod E dodat je preparat koji sadrži serotipove 1, 2 i 3 polio virusa u inaktiviranoj formi (sojevi Mahoney, MEF-1, odnosno Saukett) filtriran preko filtera od 0,22 µm.

G – Dodavanje PRP-T

[0071] Prvo se priprema intermedijerni rastvor PRP-T na sledeći način: u preparat PRP-T filtriran preko filtera od 0,22 µm dodaje se pufer tris saharoza, prethodno filtriran preko filtera od 0,22 µm, radi dobijanja intermedijarne smeše.

[0072] Ta smeša se aseptično uvodi u smešu dobijenu pod F.

H – Finalna faza podešavanja

[0073] Nakon homogenizacije suspenzije dobijene pod G, dodata je dovoljna količina prethodno filtrirane vode za injekcije, tako da se postigne ciljana zapremina od 250 l. Zatim, ako je potrebno, pH smeše se podesi na 7,1 ± 0,1 dodavanjem 2,5 M rastvora natrijum hidroksida ili 10% sirćetne kiseline, prethodno filtriranih.

[0074] Smeša se čuva na 5 ± 3°C, a zatim se podeli u špriceve ili bočice u dozi od 0,5 ml/dozi.

[0075] Doza od 0,5 ml tako sadrži 600 µg Al<3+>, 10 µg HBsAg, najmanje 20 IU D, najmanje 40 IU T, 25 µg Pt, 25 µg FHA, između 20 i 43 DU (jedinica antigena D) polio virusa tip 1, između 5 i 9 DU polio virusa tip 2, između 17 i 36 DU polio virusa tip 3, 12 µg PRP (u obliku PRP-T), fosfatne jone u koncentraciji od 40 mmol/l, pufer tris saharoza koncentracije 2,5 mmol/l trisa i 2,125% saharoze, kao i 286 µg katjonskih aminokiselina (His - Arg - Lys).

Kliničko ispitivanje

[0076] Kompozicija vakcine pripremljena prema gornjem primeru ispitana je u kliničkom ispitivanju, u poređenju sa šestovalentnom vakcinom već prisutnom na tržištu, Infanrix Hexa™, koja omogućava vakcinaciju dece protiv istih bolesti kao vakcina pripremljena prema pronalasku (difterija, tetanus, veliki kašalj, polio, infekcije Hib i hepatitis B), ali koja ima nedostatak da ima liofilizovani deo, i tako zahteva operaciju dodavanja liofilizata pre primene.

[0077] Tokom kliničke studije, 2 tipa kompozicija vakcina su primenjene na deci, prema rasporedu vakcinacije koji uključuje 3 doze date sa 2, 4 i 6 meseci. Pokazalo se da tečna vakcina pripremljena prema postupku iz pronalaska ima veoma dobru podnošljivost, i istu imunogenost kao vakcina sa tržišta.

EKSPERIMENTALNI PODACI

Procenat adsorpcije HBsAg / količina neadsorbovanog PRP-T

[0078] Tri šarže finalnog proizvoda u rasutom stanju (PFV39-41-42), kao i tri šarže raspoređene u bočice (S12-13-14), pri čemu su sve šarže dobijene prema datom primeru, čuvane su na 5°C i analizirane u različitim terminima tokom perioda od 9, odnosno 22 meseca. Analiza je fokusirana na procenat adsorpcije HBsAg i količinu neadsorbovanog PRP-T.

[0079] Određen je procenat adsorpcije HBsAg, kako je ranije prikazano počevši od ukupnog sadržaja HBsAg i sadržaja neadsorbovanog HBsAg, pri čemu je HBsAg određen ELISA sendvič testom prema pravilima koja propisuje Evropska farmakopeja 2.7.1. Ukratko, HBsAg je vezan za primarno monoklonsko antitelo anti-HBsAg tipa IgM, u bazenu ploče sa 96 bazena. Tako vezan HBsAg je pokriven sekundarnim monoklonskim antitelom anti-HBsAg tipa IgG, koje se detektuje poliklonskim antitelom anti-IgG, vezanim za peroksidazu.

Hromogeni supstrat peroksidaze, tetrametilbenzidin (TMB) služio je kao sredstvo za razvijanje. Prilikom njegovog dodavanja razvijala se boja čiji intenzitet je srazmeran količini HBsAg koji je vezan u bazenima. Analiza rezultata vršena je po metodi paralelnih pravih opisanoj u Evropskoj farmakopeji 5.3.3.

[0080] Da bi se odredio procenat adsorpcije HBsAg, vakcina je centrifugirana (8800 g; 5 min; 20°C), što je omogućilo da se sakupi supernatant koji sadrži neadsorbovani HBsAg. Uzorci supernatanta za ispitivanje razblaženi su u duplikatu u ELISA puferu koji sadrži pufer za desorpciju, u rasponu od npr.1/400 do 1/12800.

[0081] Uzorci ukupne vakcine i standardnog rastvora razblaženi su u duplikatu u ELISA puferu koji sadrži pufer za desorpciju, u rasponu od npr.1/800 do 1/25600.

[0082] Ploča sa 96 bazena prekrivenih primarnim monoklonskim antitelom inkubirana je 12 h na 5°C, a zatim isprana rastvorom PBS-Tween 20. Razblaženja supernatanta, ukupne vakcine i standardnog rastvora raspoređena su u bazene. Zatim je dodato sekundarno antitelo i otkriveno je sa antitelom vezanim za peroksidazu i TMB (tetrametilbenzidin). Reakcija je prekinuta dodavanjem 1 M HCl. Nakon svakog koraka, ploča je inkubirana 30 min na 25°C, a zatim ispirana rastvorom PBS-Tween 20. Slepa proba (pufer za razblaživanje) je dodata u raspoložive bazene, i podvrgnuta istom postupku. Ploča je očitana na 450 i 630 nm.

[0083] Količina neadsorbovanog PRP-T je određena pomoću HPAEC-PAD (jonoizmenjivačka hromatografija visokih performansi – pulsna amperometrijska detekcija) na sledeći način:

Prvo je pripremljen standardni rastvor PRP-T od 0,5 do 12,5 µg/ml.

[0084] Ispitivani rastvori su centrifugirani, kao i standardni rastvori, na 5000 g tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Supernatanti su sakupljeni, a zatim hidrolizovani pomoću rastvora 1,5 M NaCl koji sadrži glukozamin-1-fosfat kao interni standard. Dodata je slepa proba (0,9% NaCl, 1,5 M NaOH interni standard).

[0085] Hromatografija je izvedena pomoću mobilne faze koja se sastojala od 35 mM NaOH i 114 mM natrijum acetata, koja je injektovana na kolonu sa protokom 1,2 ml/min.

[0086] Koncentracije neadsorbovanog PRP (µg/ml) izračunate su na osnovu sledeće jednačine:

(površina pika PRP / površina pika internog standarda) = a x [koncentracija PRP] b, u kojoj je „a“ nagib a „b“ odsečak na y-osi, pri čemu su a i b određeni sa regresione prave.

[0087] Rezultati su predstavljeni u 4 tabele u nastavku:

[0088] Poređenja radi, takođe je ispitana adsorpcija tokom vremena HBsAg sadržanog u tri šarže finalnog proizvoda u rasutom stanju (FDN5-6-7), kao i tri šarže raspodeljene u bočice (S44-45-46) tečnog preparata koji sadrži iste antigene, ali je dobijen prema linearnom postupku formulacije opisanom na Slici 1, koji se dakle razlikuje od onog opisanog u gornjem primeru. Taj preparat je sadržao u 0,5 ml: 10 µg HBsAg, 30 Lf Dt, 10 Lf Tt, 25 µg Pt, 25 µg FHA, 40 DU polio virusa tip 1, 8 DU polio virusa tip 2, 32 DU polio virusa tip 3, 12 µg PRP (u obliku PRP-T), 0,6 mg Al, fosfatne jone čija koncentracija je bila 55 mmol/l, karbonatne jone čija koncentracija je bila 20 mmol/l, pufer tris saharoza čija koncentracija je bila 2,5 mmol/l trisa i 2,125% saharoze, i 14 µg katjonskih aminokiselina (His - Arg - Lys) iz medijuma M 199 (valenca polio), pH 6,8–7,2.

[0089] Dobijeni su sledeći rezultati:

[0090] Količine neadsorbovanog PRP-T izmerenog u istom periodu pokazale su da ima malo razlika u odnosu na vreme 0, pa su zadovoljavajuće. Međutim, ti rezultati pokazuju da u tom slučaju koji ne odgovara formulaciji dobijenoj po postupku prema pronalasku, hepatitis B površinski antigen ne ostaje adsorbovan na aluminijum hidroksid oksidu.

Eksperimentalni podaci koji se odnose na katjonske aminokiseline

[0091] Kompozicija prema pronalasku direktno vezana za primenjeni eksperimentalni protokol i kompozicija dobijena zahvaljujući modifikovanom protokolu naznačena time što je kompozicija koja sadrži samo tri katjonske aminokiseline (Arg - Lys - His) zamenjena kompozicijom 12 esencijalnih aminokiselina, upoređene su u pogledu krajnje neadsorbovane količine PRP-T. Nije primećena nikakva razlika u količini neadsorbovanog PRP-T, što pokazuje da su važne samo katjonske aminokiseline.

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripremu tečne kombinovane vakcine koja sadrži najmanje:

- aluminijum hidroksid oksid (AlOOH),

- hepatitis B površinski antigen (HBsAg),

- antigen Haemophilus influenzae tip b (Hib) koji se sastoji od kapsularnog polisaharida vezanog za noseći protein,

u kojoj se hepatitis B površinski antigen održava adsorbovanim na AlOOH dok se antigen Hib održava neadsorbovanim,

prema kome:

- vrši se adsorpcija hepatitis B površinskog antigena na AlOOH da bi se dobio kompleks AlOOH/HBsAg,

- pomenuti kompleks AlOOH/HBsAg se meša sa Hib antigenom u prisustvu katjonskih aminokiselina u koncentraciji od najmanje 100 mg/l, i fosfatnog jona u koncentraciji od 35 do 45 mmol/l.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, prema kome se adsorpcija antigena HBsAg na aluminijumu izvodi tako što se pomeša suspenzija AlOOH sa suspenzijom HBsAg uz mešanje tokom najmanje 4 sata.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, prema kome se adsorpcija antigena HBsAg na aluminijumu izvodi tako što se pomeša suspenzija AlOOH sa suspenzijom HBsAg uz mešanje tokom najmanje 12 sati.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, prema kome se adsorpcija antigena HBsAg na aluminijumu izvodi tako što se pomeša suspenzija AlOOH sa suspenzijom HBsAg uz mešanje između 20 i 24 sata.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se dodaju katjonske aminokiseline pomenutom kompleksu AlOOH/HBsAg pre mešanja sa antigenom Hib.

6. Postupak prema jednom od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačen time što se dodaju katjonske aminokiseline pomenutom antigenu Hib pre mešanja sa kompleksom

AlOOH/HBsAg.

7. Postupak prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se dodaju fosfatni joni kompleksu AlOOH/HBsAg pre mešanja sa antigenom Hib.

8. Postupak prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se podešava pH preparata koji sadrži kompleks AlOOH/HBsAg na 7,1 ± 0,1 pre mešanja sa antigenom Hib.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se još sastoji od:

- pripreme kompozicije koja sadrži najmanje jedan antigen izabran između antigena difterije, tetanusa, polija, velikog kašlja, kao i aluminijum hidroksid oksid, i

- mešanja pomenutog kompleksa AlOOH/HBsAg sa pomenutom kompozicijom, pre prelaska na mešanje sa antigenom Hib.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što se sastoji od pripreme pomenute kompozicije dodavanjem svakog antigena sukcesivno u suspenziju aluminijum hidroksid oksida, i mešanjem između svakog dodavanja antigena.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što:

- adsorbuje se HBsAg na delimičnoj količini AlOOH koja predstavlja trećinu ukupnog AlOOH prisutnog u finalnoj kompoziciji, tokom 20–24 sata, da bi se dobio kompleks AlOOH/HBsAg,

- istovremeno se adsorbuje, na komplementarnoj količini AlOOH, sukcesivno: toksin difterije D, toksin tetanusa T, prečišćeni toksin Bordetella pertussis PTxd koji je prethodno adsorbovan na AlOOH, filamentni hemaglutinin Bordetella pertussis FHA koji je prethodno adsorbovan na AlOOH, zatim se dodaju joni fosfata, a zatim se dodaje kompleks AlOOH/HBsAg,

- ponovo se dodaju joni fosfata u količini koja dopušta da se postigne koncentracija od 40 mmol/l u finalnoj kompoziciji,

- dodaje se najmanje jedna katjonska aminokiselina u količini koja dopušta da se postigne koncentracija od 100 mg/l u finalnoj kompoziciji,

- podešava se pH na 7,1 ± 0,1,

- dodaju se antigeni polija u obliku inaktiviranog virusa tipa 1 i/ili tipa 2 i/ili tipa 3, - dodaje se antigen Hib,

- podešava se pH na 7,1 ± 0,1,

- dobijena kompozicija se raspodeljuje u špriceve ili bočice.

12. Postupak prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se na industrijskoj skali priprema najmanje 250 l kompozicije vakcina.

13. Kompozicija vakcina dobijena prema postupku iz bilo kog prethodnog patentnog zahteva, koja sadrži najmanje hepatitis B površinski antigen (HBsAg) i antigen Hib koji se sastoji od poliribozilribitolfosfata vezanog za protein tetanusa (PRP-T)

14. Kompozicija vakcina prema prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što sadrži pored toga antigene difterije, tetanusa, polija, velikog kašlja.

15. Kompozicija vakcina prema jednom od prethodnih patentnih zahteva 13 ili 14, naznačena time što sadrži najmanje:

- hepatitis B površinski antigen, HBsAg,

- antigen difterije u obliku difterijskog toksina D,

- antigen tetanusa u obliku toksina tetanusa T,

- antigene velikog kašlja u obliku prečišćenog toksina (PTxd) i filamentnog hemaglutinina (FHA),

- antigen Haemophilus influenzae tip b, u obliku poliribozilribitolfosfata vezanog za protein tetanusa (PRP-T),

- antigene polija u obliku inaktiviranog virusa izabranog između tipa 1, 2 i 3.

16. Kompozicija vakcina prema patentnom zahtevu 14, naznačena time što sadrži najmanje:

- od 10 do 30 µg HBsAg/ml;

- od 40 do 80 Lf D/ml;

- od 10 do 50 Lf T/ml;

- od 40 do 60 µg FHA/ml;

- od 40 do 60 µg PTxd/ml;

- od 2 do 60 µg PRP/ml u obliku konjugata PRP-T;

- od 1 do 2 mg AlOOH/ml;

- od 35 do 45 mmol/l jona fosfata;

- od 100 do 1000 mg/l katjonskih aminokiselina;

- polio virus tip 1, 2 i 3, u inaktiviranom obliku u količini od 80, 16, odnosno 64 DU/ml.

17. Kompozicija vakcina prema patentnom zahtevu 16, naznačena time što sadrži najmanje:

- 20 µg/ml HBsAg,

- 50 do 70 Lf/ml D,

- 10 do 30 Lf/ml T,

- 50 µg/ml FHA,

- 50 µg/ml PTxd,

- 20–24 µg/ml PRP u obliku konjugata PRP-T,

- 1,2 mg/ml AlOOH,

- od 38 do 42 mmol/l jona fosfata,

- od 400 do 800 mg/l katjonskih aminokiselina,

- polio virus tip 1, 2 i 3, u inaktiviranom obliku u količini od 80, 16, odnosno 64 DU/ml.