ES2625011T3 - Procedimiento de formulación de una vacuna que contiene al menos dos antígenos susceptibles de adsorberse sobre el oxihidróxido de aluminio - Google Patents

Abstract

Procedimiento de preparación de una combinación vaccínea liquida que comprende al menos: - oxihidróxido de aluminio (ALOOH), - un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), - un antígeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituido por polisacárido capsular conjugado a una proteína portadora, en la que el antígeno de superficie de la hepatitis B se mantiene adsorbido en AlOOH mientras que el antígeno de Hib se mantiene no adsorbido, según el cual: - se procede a la adsorción del antígeno de superficie de la hepatitis B en AlOOH para obtener un complejo AlOOH/HBsAg, - se mezcla dicho complejo AlOOH/HBsAg con el antígeno de Hib en presencia de aminoácidos catiónicos a una concentración de al menos 100 mg/l, y de iones fosfato con una concentración de 35 a 45 mMol/l.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de formulacion de una vacuna que contiene al menos dos antigenos susceptibles de adsorberse sobre el oxihidroxido de aluminio

La invencion se refiere al campo de las combinaciones vaccmeas que comprende al mismo tiempo la valencia de la Hepatitis B constituida por el antigeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) y la Valencia de Haemophilus influenzae tipo b, constituida por su polisacarido capsular, llamado polirribosilribitolfosfato (PRP) que, para ser eficaz en ninos menores de dos anos, se conjuga en una protema portadora, por ejemplo la protema tetanica.

Tales combinaciones, que estan destinadas a la administracion a ninos pequenos, comprenden generalmente otros antigenos que permiten vacunar, en una sola operacion, contra diversas enfermedades, asf como un adyuvante a base de aluminio.

La solicitud WO 03/009869 se interesa por el problema de la estabilidad de las vacunas y recomienda, cuando el antigeno de la hepatitis B esta presente, evitar adsorberlo en hidroxido de aluminio; se aconseja adsorberlo sobre hidroxifosfato de aluminio o no adsorberlo.

La solicitud de patente WO99/13906 divulga una composicion vaccmea que comprende, asf como se describe en la pagina 13, unos antigenos contra la difteria, el tetanos, la polio, la tos ferina, la hepatitis B y las infecciones por Haemophilus influenzae tipo b. Algunos de estos antfgenos deben, por ser inmunogenos, ser adsorbidos en una sal de aluminio. Es el caso principalmente del antfgeno de superficie de la hepatitis B o HBsAg.

Ahora bien, tal como se indica en la pagina 12 de la solicitud WO99/13906, la valencia de Hib constituida por el polisacarido capsular conjugado de protema tetanica, tiene tendencia a perder su inmunogenicidad a lo largo del tiempo cuando se adsorbe en las sales de aluminio. Para evitar este inconveniente, la solucion propuesta en la tecnica anterior, tal como ya se ha recomendado en la solicitud anterior PCT/FR96/00791, consiste en agregar aniones y particularmente iones fosfato, carbonato o citrato.

Sin embargo, los autores de la presente invencion constataron que aunque la adicion de aniones, particularmente de fosfatos o carbonatos, permite efectivamente evitar la adsorcion de PRP-T en oxihidroxido de aluminio (ALOOH), y por lo tanto mantener su inmunogenicidad a lo largo del tiempo, esta adicion tambien presenta el inconveniente de desorber el antfgeno de superficie de la hepatitis B cuando este mismo tambien habfa sido adsorbido en oxihidroxido de aluminio.

Por lo tanto es necesario encontrar un procedimiento de preparacion de una combinacion vaccmea que comprenda oxihidroxido de aluminio, en el que el antfgeno de superficie de la hepatitis B se mantenga en adsorcion en AlOOH mientras que el antfgeno de Hib se mantenga en no adsorcion.

Para este fin, la presente invencion tiene por objeto un procedimiento de preparacion de una combinacion vaccmea liquida que comprende al menos:

- un antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg),

- un antfgeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituido por el polisacarido capsular conjugado en una protema portadora,

- oxihidroxido de aluminio (ALOOH),

en la que el antfgeno de superficie de la hepatitis B se mantiene adsorbido en AlOOH mientras que el antfgeno de Hib se mantiene no adsorbido,

segun el cual:

- se procede a la adsorcion del antfgeno de superficie de la hepatitis B en AlOOH para obtener un complejo AlOOH/HBsAg,

- se mezcla dicho complejo AlOOH/HBsAg con el antfgeno de Hib en presencia de aminoacidos cationicos con una concentracion de al menos 100 mg/l, y de iones fosfato con una concentracion de 35 a 45 mMol/l.

Gracias al procedimiento segun la invencion, es posible alcanzar el equilibrio deseado entre el mantenimiento de la adsorcion del antfgeno de superficie de la hepatitis B en oxihidroxido de aluminio y el mantenimiento de la no adsorcion del antfgeno de Hib.

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Segun un modo particular de realizacion de la invencion, se procede a la adsorcion del antigeno HBsAg sobre aluminio mezclando una suspension de AlOOH con una suspension de HBsAg en agitacion durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, preferentemente entre 20 y 24 horas.

Segun un modo particular de realizacion de la invencion, se anaden los aminoacidos cationicos a dicho complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antigeno de Hib.

Segun un modo alternativo de realizacion de la invencion, se anaden los aminoacidos cationicos a dicho antfgeno de Hib antes de mezclar con el complejo AlOOH/HBsAg.

Segun un modo de realizacion de la invencion, se anaden los iones fosfato a dicho complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antfgeno Hib.

Segun un modo de realizacion de la invencion, se ajusta el pH de la preparacion que comprende el complejo AlOOH/HBsAg a 7,1 + 0,1 antes de mezclar con el antfgeno de Hib.

La invencion tambien tiene por objeto una combinacion vaccmea obtenida segun el procedimiento reivindicado y que comprende al menos:

- el antfgeno de superficie de la hepatitis B,

- el antfgeno de difteria en forma de toxina difterica D,

- el antfgeno del tetanos en forma de toxina tetanica T,

- los antfgenos de tos ferina en forma de Toxina purificada (PTxd) y de Hemaglutinina filamentosa (FHA),

- el antfgeno de Haemophilus influenzae tipo b, en forma de polirribosilribitolfosfato conjugado de protema tetanica (PRP-T),

- los antfgenos de polio en forma de virus inactivados de tipo 1, 2 y 3.

Una composicion vaccmea de este tipo presenta la ventaja de presentarse en forma lfquida, lo que evita realizar operaciones de recuperacion de liofilizado; se muestra suficientemente estable para permanecer inmunogena hasta el dfa de su utilizacion, y esto incluso 36 meses despues de la fecha de su fabricacion.

Segun la invencion, la composicion vaccmea comprende un antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Este antfgeno puede ser en particular un antfgeno de superficie de la hepatitis B como el presente en la vacuna Recombivax HB™, o en cualquier otra vacuna contra hepatitis B. Principalmente puede tratarse del antfgeno recombinante obtenido mediante fermentacion de una levadura Hansenula polymorpha modificada, segun la tecnologfa desarrollada por Crucell, tal como el presente en la vacuna Hepavax-Gene™. Para los fines de la invencion, la cantidad de HBsAg presente en una dosis de 0,5 ml esta comprendida ventajosamente entre 5 y 15 |ig, y en particular de 10 |ig.

Segun la invencion, la composicion vaccmea comprende un antfgeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib). Este antfgeno esta constituido por el polisacarido capsular de la bacteria o Polirribosilribitolfosfato (PRP) que se conjuga en una protema portadora.

La protema portadora puede ser cualquier protema en uso para ese fin en el campo de las vacunas. Puede ser, por ejemplo la toxina difterica D, la toxina tetanica T, la lipoprotema D de Haemophilus influenzae, la CRM197 o la protema de membrana externa (OMP) de N. meningitidis. Se utiliza preferentemente la protema tetanica para obtener el conjugado PRP-T. Para los fines de la presente invencion, el conjugado PRP-T puede estar presente a razon de 1 a 30 |ig de PRP por dosis de 0,5 ml; ventajosamente de 5 a 25 |ig de PRP por dosis; preferentemente de 10 a 15 |ig de PRP por dosis; de manera muy preferida de 10 a 12 |ig de PRP por dosis, y mas particularmente 12 |ipg de PRP, conjugado a 22-36 |ig de protema tetanica.

Segun la invencion, la composicion vaccmea comprende oxihidroxido de aluminio AlOOH. Por abusos del lenguaje, a menudo esta sal de aluminio se denomina hidroxido de aluminio. El AlOOH que se puede utilizar para los fines de la presente invencion puede ser, por ejemplo el AlOOH comercializado por Brenntag AG o Rehydragel HPA de Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ), aunque el modo de produccion de cada uno de los dos adyuvantes difiere. Se calcula la cantidad de AlOOH utilizada para permitir alcanzar una respuesta inmunitaria satisfactoria; depende en particular del numero y la naturaleza de los antfgenos presentes en la composicion asf como de la cantidad de cada uno de estos antfgenos.

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A tftulo meramente informativo, el maximo de adsorcion del HBsAg sobre AlOOH es del orden de 780 |ig de protema por mg de aluminio (clasicamente la cantidad de AlOOH se expresa en cantidad de aluminio Al3+). Para una dosis vaccmea que comprende 10 |ig de HBsAg, sin otros antfgenos adicionales, sena suficiente, por lo tanto, con 13 |ig de aluminio, cantidad sin embargo insuficiente para obtener la eficacia deseada cuando se anaden otros antigenos. Asf, en funcion de la adicion de uno o varios antigenos adicionales, se pueden poner en contacto 10 |ipg de HBsAg con 0,01 mg a 1,25 mg de aluminio, que es la cantidad maxima recomendada por la Farmacopea Europea.

Por ejemplo, una dosis de 0,5 ml de una vacuna pediatrica que comprende unos antigenos de difteria, tetanos, tos ferina y hepatitis B, puede contener de manera convencional de 0,5 a 0,7 mg de aluminio, preferentemente alrededor de 0,6 mg de aluminio.

Segun la invencion, el antfgeno de superficie de la hepatitis B se mantiene adsorbido en AlOOH, lo que significa que al menos un 60%, preferentemente al menos un 65%, preferentemente al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95% de la cantidad total de este antfgeno presente en la composicion esta en forma adsorbida.

Segun la invencion, el antfgeno de Hib se mantiene no adsorbido en AlOOH, lo que significa que al menos un 65%, preferentemente al menos un 70%, preferentemente al menos un 75%, de la cantidad total de este antfgeno presente en la composicion lo esta en forma no adsorbida.

Segun la invencion, el tiempo durante el cual el antfgeno de superficie de la hepatitis B se mantiene adsorbido en el AlOOH y el antfgeno de Hib se mantiene no adsorbido, es de al menos 3 meses, preferentemente al menos 6 meses, preferentemente al menos 12 meses, preferentemente al menos 18 meses, preferentemente al menos 24 meses, mas preferentemente al menos 36 meses a partir de la fecha de fabricacion de la composicion cuando la temperatura de conservacion es de 5 + 3°C. Preferentemente, la cantidad de antfgenos adsorbidos o no adsorbidos es estable a lo largo del tiempo, pero tambien puede variar, con la condicion de quedarse en unos lfmites aceptables. Asf, cuando al menos el 85% de la cantidad total del HBsAg presente en la composicion se adsorbe sobre AlOOH durante 3 meses a partir de la fecha de fabricacion de la composicion conservada a una temperatura de 5 + 3°C, es totalmente posible que al cabo de un ano y, siempre en las mismas condiciones de conservacion, el 80% de la cantidad total del HBsAg presente en la composicion se mantenga adsorbido.

Para apreciar la cantidad de antfgeno adsorbido, el experto en la materia puede utilizar cualquier metodo conocido.

En lo que se refiere a la determinacion del porcentaje de adsorcion de HBsAg, es posible utilizar un metodo ELISA tipo sandwich segun las normas definidas por la Farmacopea Europea 2.7.1. Brevemente, el HBsAg es capturado por un anticuerpo monoclonal primario anti-HBsAg de tipo IgM, en pocillos de una placa de 96 pocillos. El HBsAg asf fijado es recubierto por un anticuerpo monoclonal secundario anti-HBsAg, de tipo IgG, que a su vez es detectado por un anticuerpo policlonal anti-IgG, acoplado a la peroxidasa. Un sustrato cromogeno de la peroxidasa, la tetrametilbencidina (TMB), sirve de agente revelador. Durante su adicion, se desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de HBsAg capturado en los pocillos. El analisis de los resultados se efectua segun el metodo de las rectas paralelas descrito en la Farmacopea Europea 5.3.3. El porcentaje de adsorcion se obtiene a partir de la determinacion del contenido total en HBsAg y del contenido en HBsAg no adsorbido.

En lo que se refiere a la cantidad de PRP-T no adsorbida, se puede realizar la evaluacion mediante HPAEC-PAD (cromatograffa de intercambio de iones de alto rendimiento - deteccion amperometrica pulsada).

Segun el procedimiento de la invencion, el antfgeno de superficie de la hepatitis B se adsorbe sobre AlOOH. Esta etapa puede realizarse poniendo en contacto el antfgeno de superficie de la hepatitis B y el AlOOH en ausencia de cualquier otro antfgeno y dejando que el antfgeno de superficie de la hepatitis B se adsorba sobre AlOOH durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, de manera muy preferida entre 20 y 24 horas, para obtener una preparacion que contiene un complejo AlOOH/HBsAg. Esta adsorcion puede realizarse, segun la invencion, en ausencia de iones fosfato. El objetivo perseguido por un tiempo de contacto prolongado entre el antfgeno de superficie de la hepatitis B y el AlOOH consiste en maximizar las interacciones electroestaticas y favorecer las interacciones estables, que asf pueden dar lugar a una adsorcion por intercambio de ligandos. Este contacto se realiza ventajosamente bajo agitacion.

Segun el procedimiento de la invencion, se realiza la mezcla del complejo AlOOH/HBsAg con el antfgeno de Hib en presencia de aminoacidos cationicos y de iones fosfato.

Para los fines de la invencion, se entiende por aminoacidos cationicos unos aminoacidos cuyo pHi es superior al pH de la composicion vaccmea y que estaran por lo tanto en forma cationica al pH de la vacuna; se trata principalmente de Lisina (Lys), la Arginina (Arg) o la Histidina (His); cada uno de estos aminoacidos puede utilizarse solo o en mezcla es decir para 2 (Lys + Arg; Lys + His; Arg + His), o para los 3 juntos (Lys + Arg + His). Segun un modo particular, los aminoacidos cationicos pueden estar asociados en forma de dipeptido. Se citan principalmente los

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dipeptidos Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys e His-Arg. De manera alternativa, un dipeptido util para los fines de la presente invencion puede estar compuesto de un aminoacido cationico y de un aminoacido no cargado seleccionado entre Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp y Gln. Asf, en la practica, se puede utilizar una preparacion que contiene uno o varios aminoacidos cationicos en forma libre y/o de dipeptido. Tambien es posible utilizar preparaciones de aminoacidos que comprenden al mismo tiempo aminoacidos cationicos en cantidad deseada, en mezcla con otros aminoacidos. Para no producir una bajada demasiado pronunciada del pH al agregar los aminoacidos, se puede prever aumentar el pH de la preparacion que comprende los aminoacidos antes de agregarla al complejo AloOH/HBsAg, mediante una base, en particular sosa.

Segun la invencion, la cantidad de aminoacidos cationicos presentes en la composicion vaccmea al final, debe ser de al menos 100 mg/l, ventajosamente de al menos 300 mg/l, ventajosamente de al menos 400 mg/l; de manera muy preferida de al menos 500 mg/l. No hay una dosis maxima critica. Sin embargo, es preferible que la cantidad maxima sea como maximo de 2 mg/ml, incluso preferentemente como maximo de 1 mg/ml; incluso preferentemente como maximo de 800 |ig/ml; de manera mas preferida como maximo de 700 |ig/ml. Durante el calculo de la cantidad de aminoacidos cationicos a agregar, conviene tener en cuenta unos aminoacidos cationicos susceptibles de ser aportados por los medios en los que estan presentes los antfgenos que no sean HBsAg y el antfgeno de Hib.

Segun una alternativa del procedimiento, se puede determinar la cantidad de aminoacidos cationicos con respecto al peso del polisacarido capsular de Hib y prever una relacion en peso de polisacarido de Hib/aminoacido cationico de 1:4 a 1:100, ventajosamente de 1:10 a 1:80, preferentemente de 1:l5 a 1: 60, de manera muy particularmente preferida de 1:20 a 1:30 o 40.

Segun el procedimiento de la invencion, la mezcla del complejo AlOOH/HBsAg con el antfgeno de Hib se realiza en presencia de aminoacidos cationicos, pero tambien en presencia de iones fosfato. Segun un modo de realizacion de la invencion, los iones fosfatos se anaden al complejo AlOOH/HBsAg antes de su puesta en contacto con el antfgeno Hib. El aporte de iones fosfato puede, por ejemplo, realizarse mediante adicion de hidrogenofosfato de sodio o de hidrogenofosfato de potasio, o tambien mediante una mezcla de los 2. La cantidad de iones fosfato se calcula para que el maximo de antfgenos de superficie de la hepatitis B quede adsorbido sobre AlOOH evitando al mismo tiempo la adsorcion del antfgeno Hib. Esta cantidad vana en funcion de la naturaleza y del numero de antfgenos presentes, y en particular en funcion de los antfgenos distintos a los antfgenos HBsAg e Hib.

Asf, para una combinacion vaccmea que comprende los antfgenos utilizados habitualmente en las vacunas pediatricas que son ademas de HBsAg y del antfgeno Hib, los antfgenos de difteria, tetanos, tos ferina, tambien puede ser ventajoso agregar iones fosfato de manera tal que la concentracion de iones fosfato en la composicion vaccmea obtenida al final sea al menos igual a 35 mMol/l, y mas particularmente este comprendida entre 35 y 45 mMol/l, incluidos los extremos; preferentemente entre 38 y 44 mMol/l, incluidos los extremos; de manera mas preferida, entre 38 y 42 mMol/l, incluidos los extremos. Segun un modo preferido, la concentracion de iones fosfato en la composicion vaccmea obtenida en ultimo lugar es de 40 mMol/l.

Segun un modo alternativo, los iones fosfato se anaden en una cantidad en la que estan presentes en la composicion vaccmea en una concentracion final comprendida entre 35 y 38 mMol/l, incluidos los extremos. Se complementa anadiendo ademas iones carbonato, pero en cantidad limitada, ya que se ha observado que una cantidad demasiado grande de iones carbonatos era desfavorable. Ventajosamente, pueden anadirse en una cantidad tal que esten presentes en la composicion vaccmea en una concentracion final inferior o igual a 10 mMol/l.

Para evitar una descarga ionica demasiado importante que podna desestabilizar el HBsAg y favorecer su desorcion, se recomienda anadir los iones fosfato en varias (por ejemplo en 2) operaciones (etapas) distintas. Asf, los iones fosfato pueden anadirse en una primera operacion, en una cantidad que permita alcanzar una concentracion final comprendida entre 20 y 30 mMol/l, incluidos los extremos; despues, en una segunda operacion, en una cantidad que permita alcanzar una concentracion final tal como la especificada a continuacion.

Segun un modo de realizacion preferido del procedimiento segun la invencion, se ajusta ademas el pH de la preparacion obtenida a 7,1 + 0,1, antes de mezclar el antfgeno Hib con el complejo AlOOH/HBsAg. En efecto, se ha observado que este valor de pH tiene un efecto positivo en el mantenimiento en estado no adsorbido del antfgeno Hib.

Segun un modo de realizacion particular, se ajusta ademas el pH a 7,1 + 0,1 despues de la fase de mezcla.

Asf, gracias al procedimiento segun la invencion, se puede obtener una composicion vaccmea en la que:

(i) al menos el 60 o el 80%, preferentemente al menos el 85% de la cantidad total del antfgeno de superficie de la hepatitis B presente en la composicion se adsorbe sobre AlOOH durante al menos 3 meses a partir de la fecha de fabricacion de la composicion conservada a una temperatura de 5 + 3°C; y

(ii) al menos el 65, el 70 o el 75% de la cantidad total del antfgeno Hib presente en la composicion no se adsorbe sobre AlOOH.

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La expresion "complejo AlOOH/HBsAg" debe interpretarse como significando que el complejo comprende al menos el antigeno HBsAg adsorbido sobre AlOOH. El complejo puede contener otros antigenos, ya se precise esto o no.

Uno o varios antigenos adicionales pueden venir ademas para formar el complejo. Principalmente puede tratarse de anatoxina difterica (D), anatoxina tetanica (T), antigenos acelulares de tos ferina tales como: la toxina destoxificada de Bordetella pertussis (PTxd), la hemaglutinina filamentosa (FHA), la pertactina (antigeno de 69 kDa) y unos aglutinogenos (fimbriae) de esta misma bacteria. Segun un modo particularmente ventajoso, para formar el complejo se pueden anadir los antigenos D, T, PTxd y FHA.

Los antigenos adicionales pueden anadirse de diversas maneras. Pueden anadirse de manera secuencial despues del antigeno de superficie de la hepatitis B adsorbido previamente (i) o bien sobre la cantidad total de AlOOH que debe estar presente en la composicion vaccmea; (ii) o bien sobre una cantidad parcial, completada despues para alcanzar la cantidad total. De manera alternativa, los antfgenos adicionales pueden ser adsorbidos de manera independiente, cada uno sobre una cantidad parcial de AlOOH, al igual que el HBsAg. Tambien se puede prever un proceso de adsorcion mixta - siendo algunos antigenos adsorbidos de manera separada; siendo otro adsorbidos de manera secuencial.

Segun un modo particular del procedimiento segun la invencion, se agita la composicion obtenida despues de la adicion de cada antfgeno.

Segun un modo ventajoso y dado unicamente a modo de ejemplo, el HBsAg se adsorbe de manera separada sobre una cantidad parcial de AlOOH que corresponde a aproximadamente un 30% (la tercera parte) de la cantidad total de AlOOH presente en la composicion final. En paralelo, los antfgenos D y T se adsorben de manera secuencial sobre la parte complementaria del AlOOH. Despues, en la preparacion que contiene el complejo AlOOH-D-T, se anaden los antfgenos de tos ferina PTxd y FHA, habiendo sido cada uno de estos 2 ultimos antfgenos ellos mismos previamente adsorbidos individualmente sobre AlOOH. Finalmente, se reunen las dos preparaciones (complejo AlOOH - HBsAg y complejo AlOOH - D-T-PTxd-FHA) para formar una preparacion que comprende el complejo AlOOH - HBsAg-D-T-PTxd-FHA, en el que las cantidades de cada uno de los elementos se seleccionaron para obtener dosis vaccmeas de 0,5 ml que comprenden, clasicamente:

- de 5 a 15 |ig de HBsAg/dosis; preferentemente 10 |ig/dosis,

- de 20 a 40 Lf de D/dosis; preferentemente de 25 a 35 Lf/dosis; de manera muy preferida, 30 Lf/dosis. (Lf = lfmite de floculacion), (dicho de otra forma, la cantidad de D es superior o igual a 20 Ul/dosis)

- de 5 a 25 Lf de T/dosis; preferentemente de 10 a 15 Lf/dosis; de manera mas preferida, 10 Lf/dosis, (dicho de otra forma, la cantidad de T es superior o igual a 40 Ul/dosis)

- de 20 a 30 |ig de FHA/dosis; preferentemente 25 |ig/dosis,

- de 20 a 30 |ig de PTxd/dosis; preferentemente 25 |ig/dosis.

Segun un modo particular de realizacion de la invencion, se anaden tambien unos antfgenos de polio constituidos, en general, por unos virus inactivados. Se puede prever la adicion de virus de polio de 3 tipos que habitualmente estan presentes en vacunas pediatricas, es decir los tipos 1,2 o 3, o bien en el caso que no fuera necesario vacunar contra los 3 tipos, introducir solo los tipos contra los que se requiere obtener proteccion. Las cantidades de virus de polio por dosis pueden estar particularmente:

- entre 20 y 43 DU (unidades de antfgenos D), en particular 40 para el tipo 1,

- entre 5 y 9 DU, en particular 8, para el tipo 2,

- entre 17 y 36 DU, en particular 32, para el tipo 3.

Estos antfgenos no se adsorben necesariamente previamente sobre una sal de aluminio antes de ser anadidos a la preparacion vaccmea.

Segun un modo de realizacion particular, el procedimiento segun la invencion es un procedimiento segun el cual:

(i) (a) se pone en contacto el HBsAg y el AlOOH en ausencia de cualquier otro antfgeno, y se deja adsorber el HBsAg sobre AlOOH durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas, de manera mas preferida alrededor de 24 horas, para obtener una preparacion que contenga un complejo AlOOH/HBsAg;

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(i) (b) a la preparacion obtenida en el punto (i) (a), se anade una preparacion que comprende los antigenos D, T, PTxd y FHA, previamente adsorbidos en AlOOH, y de manera opcional, unos antigenos adicionales de Bordetella pertussis como la Pertactina y los aglutinogenos;

(ii) a la preparacion obtenida en el punto (i) (b), se anaden iones fosfato para obtener una concentracion final en la vacuna de 40 mMol/l,

(iii) a la preparacion obtenida en el punto (ii), se anaden de manera opcional, los antigenos de polio;

(iv) a la preparacion obtenida en el punto (ii) o (iii), se anade una preparacion que contiene el antigeno Hib;

(v) se ajusta el pH a 7,1 + 0,1; y

(vi) (a) se anade al menos un aminoacido cationico para complementar la preparacion obtenida en el punto (ii) o (iii) antes de la adicion del antigeno Hib, o

(b) se anade al antigeno Hib al menos un aminoacido cationico;

Siendo dicho aminoacido cationico anadido en una cantidad suficiente para obtener una concentracion final en la vacuna de al menos 100 mg/l.

Segun un modo particular, la composicion vaccmea segun la invencion es una composicion que comprende HBsAg, toxina difterica D, la toxina tetanica T, los antigenos de tos ferina PTxd y FHA que se preadsorben previamente sobre AlOOH, el antigeno Hib, y opcionalmente la valencia de polio, en la que:

(i) al menos el 85%, preferentemente al menos el 90% de la cantidad total del HBsAg presente en la composicion se mantiene adsorbido en el AlOOH durante al menos 3 meses a partir de la fecha de fabricacion de la composicion conservada a una temperatura de 5 + 3°C; y

(ii) al menos el 65, el 70 o preferentemente el 75% de la cantidad total del antigeno Hib presente en la composicion

no se adsorbe sobre AlOOH y esta cantidad se mantiene relativamente estable a lo largo del tiempo.

Ademas, gracias al procedimiento segun la invencion, tambien se mantienen adsorbidos los antfgenos distintos de HBsAg que mostraron ser ventajosos adsorbidos sobre el oxihidroxido de aluminio para ser inmunogenos.

Asf, se indica a modo de ejemplo que una composicion segun la invencion puede comprender:

- de 10 a 30 |ig de HBsAg/ml, preferentemente 20 |ig/ml;

- de 40 a 80 Lf de D/ml, preferentemente de 50 a 70Lf/ml;

- de 10 a 50 Lf de T/ml, preferentemente de 10 a 30Lf/ml;

- de 40 a 60 |ig de FHA/ml, preferentemente 50 |ig/ml;

- de 40 a 60 |ig de PTxd/ml, preferentemente 50 |ig/ml;

- de 2 a 60 |ig de PRP/ml, preferentemente 20-24 |ig/ml;

- de 1 a 2 mg de AlOOH/ml; preferentemente 1,2 mg de AlOOH/ml;

- unos iones fosfato en una concentracion de 35 a 45 mMol/l, preferentemente de 38 a 42 mMol/l de iones fosfato;

- de 100 a 1000 |ig/ml de aminoacidos cationicos, preferentemente de 400 a 800 |ig/ml; y de manera opcional,

- los tipos 1,2 y 3 del virus de polio en forma inactivada en cantidad respectiva de 80, 16 y 64 DU/ml.

Como se ha indicado anteriormente, una composicion segun la invencion tambien puede comprender unos antfgenos adicionales de Bordetella pertussis, como Pertactina (de 69kDa) o los aglutinogenos.

Descripcion de la figura: la Figura 1 es un esquema de un procedimiento de la tecnica anterior segun el cual se mezcla despues de la adicion de cada componente.

EJEMPLO — Preparacion a escala industrial de una preparacion a granel (250 l) de una vacuna hexavalente HepB- Dt-Tt-Perfussis-polio-HiB

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Esta preparacion se efectua en condiciones esteriles y bajo agitacion continua.

A - Preparacion del HBsAg adsorbido en AlOOH

En una cuba de 50 l, se introduce de manera aseptica una suspension homogenea de gel de oxihidroxido de aluminio (AlOOH) comercializada por Brenntag AG, a 8 g de Aluminio/l.

Despues de filtrar sobre un filtro de 0,22 |im, el volumen necesario de HBsAg, para obtener una concentracion de 20 |ig/ml en la vacuna final, se anade en modo continuo en la cuba que ya contema el AlOOH.

La mezcla se dejo bajo agitacion durante 20-24 horas a temperatura ambiente con el fin de obtener una suspension homogenea.

B - Preparacion de D + T + PTxd + FHA adsorbidas sobre gel de aluminio

En paralelo, se prepara una mezcla de gel de aluminio, anatoxina difterica (D), anatoxina tetanica (T), anatoxina de Bordetella pertussis (PTxd) y hemaglutmina filamentosa de Bordetella pertussis (FHA) de la siguiente forma:

En una cuba de 250 l, se introduce de manera aseptica, una suspension homogenea de gel de AlOOH comercializada por Brenntag AG, a 8 g de aluminio/l.

En la cuba de 250 l que ya contema el AlOOH, se introducen sucesivamente, despues de filtrar sobre un filtro de 0,22 |im, las soluciones de D y, despues de la homogeneizacion, de T con el fin de obtener las concentraciones respectivas en D y T en la vacuna final de 60 Lf (limite de floculacion)/ml y 20 Lf/ml.

Una vez obtenida la mezcla homogenea, se anaden sucesivamente en esta cuba, de manera aseptica, la suspension de PTxd previamente adsorbida sobre AlOOH, y despues la suspension de FHA previamente adsorbida sobre AlOOH para obtener las concentraciones en PTxd y FHA en la vacuna final de 25 |ig/ml.

Finalmente, se anade, despues de filtrar en un filtro de 0,22 |im, el volumen necesario de tampon fosfato 500 mM para obtener una concentracion en iones fosfato de 20 a 30 mMol/l.

La suspension D-T-PTxd-FHA-AlOOH asf obtenida se dejo bajo agitacion durante al menos 14 horas a una temperatura de 5 + 3 °C.

C - Preparacion de la mezcla HBsAg + D + T + PTxd + FHA adsorbidos sobre gel de aluminio A la preparacion obtenida en el punto B, se anade de manera aseptica la preparacion obtenida en el punto A.

Esta mezcla se deja bajo agitacion con el fin de obtener una suspension homogenea.

Despues, se anade el volumen necesario de tampon fosfato 500 mM despues de filtrar sobre un filtro de 0,22 |im para obtener una concentracion en iones fosfato de 40 mMol/l en la composicion final.

D - Saturacion de los sitios electroestaticos del complejo gel de aluminio/HBsAg + D + T + PTxd + FHA por una solucion de aminoacidos

Se realiza una solucion de aminoacidos que contiene 12 aminoacidos esenciales, de la siguiente composicion:

- Clorhidrato de Arginina

2,1 g/l, es decir 1,73 g/l de Arginina

- Cistina

1,2 g/l

- Histidina

0,8 g/l

- Isoleucina

2,6 g/l

- Leucina

2,6 g/l

- Clorhidrato de Lisina

3,65 g/l es decir 2,91 g/l de Lisina

- Metionina

0,75 g/l

- Fenilalanina

1,65 g/l

- Treonina

2,4 g/l

- Triptofano

0,4 g/l

- Tirosina

1,8 g/l

- Valina

2,35 g/l

Es decir 21,2 g/l de aminoacidos de los cuales 5,44 g/l son aminoacidos cationicos (His - Arg - Lys).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se anaden 450 ml de sosa (NaOH) 2,5 N (0,5 l/min). Se deja proseguir la homogeneizacion bajo agitacion durante 10 min.

Esta solucion de aminoacidos, filtrada en un filtro de 0,22 |im, se anade en modo continuo a la mezcla obtenida en C, con el fin de obtener una concentracion de 572 |ig/ml de aminoacidos cationicos en la composicion final.

E - Ajuste del pH

El pH de la suspension obtenida en el punto D se ajusta a pH 7,1 (7,0 - 7,2) utilizando una solucion madre de sosa a 2.5 N filtrada.

F - Adicion de antigenos de polio

Se introduce entonces en la cuba que contiene la suspension obtenida en E, una preparacion que contiene los serotipos 1, 2 y 3 del virus de polio en forma inactivada (cepas Mahoney, MEF-1 y Saukett respectivamente) filtrada sobre filtro de 0,22 |im.

6 - Adicion del PRP-T

Se prepara en primer lugar una solucion intermediaria de PRP-T de la siguiente manera: a una preparacion de PRP- T filtrada sobre filtro de 0,22 |im se anade el tampon Tris sacarosa previamente filtrado sobre filtro de 0,22 |im para constituir una mezcla intermediaria.

Esta mezcla se introduce asepticamente en la mezcla obtenida en F.

H - Etapa final de ajuste

Despues de homogeneizar la suspension obtenida en G, se anade una cantidad suficiente de agua PPI filtrada previamente a fin de alcanzar el volumen objetivo de 250 l. Despues, si es necesario, el pH de la mezcla se ajusta a pH 7,1 + 0,1 anadiendo una solucion de sosa 2,5 N o de acido acetico al 10% filtrado previamente.

La mezcla se almacena a 5 + 3°C; y despues se reparte en jeringas o frascos a razon de 0,5 ml/dosis.

Una dosis de 0,5 ml contiene asf 600 |ig de Al3+, 10 |ig de HBsAg, no menos de 20 IU de D, no menos de 40 IU de T, 25 |ig de Pt, 25 |ig de FHA, entre 20 y 43 DU (unidad de antfgeno D) de polio tipo 1, entre 5 y 9 DU de polio tipo 2, entre 17 y 36 DU de polio tipo 3, 12 |ig de PRP (en forma de PRP-T), unos iones fosfato con una concentracion de 40 mMol/l, tampon Tris sacarosa a una concentracion de 2,5 mMol/l de Tris y de 2,125% de sacarosa, asf como 286 |ig de aminoacidos cationicos (His - Arg - Lys).

Ensayo clmico

La composicion vaccmea preparada segun el siguiente ejemplo se ensayo en un ensayo clmico, en comparacion con una vacuna hexavalente ya existente en el mercado, Infanrix Hexa™, que permite vacunar a los ninos contra las mismas enfermedades que la vacuna preparada segun la invencion (difteria, tetanos, tos ferina, polio, infecciones de Hib y hepatitis B) , pero que presenta principalmente el inconveniente de tener una parte liofilizada y, por lo tanto, requiere una operacion de recuperacion del liofilizado antes de la administracion.

Durante el ensayo clmico, se administraron los 2 tipos de composiciones vaccmea a ninos, en un esquema de vacunacion que comprende 3 dosis administradas en 2, 4 y 6 meses. La vacuna lfquida preparada segun el procedimiento de la invencion demostro ser bien tolerada y tan inmunogena como la vacuna disponible en el mercado.

DATOS EXPERIMENTALES

Porcentaje de adsorcion de HBsAg/Cantidad de PRP-T no adsorbido

Tres lotes de producto final a granel (PFV39-41-42) asf como tres lotes repartidos en frascos (S12-13-14), todos los lotes que se obtuvieron segun el ejemplo proporcionado, se conservaron a + 5°C y se analizaron en diferentes momentos durante un periodo de 9 y 22 meses respectivamente. El analisis se refirio al porcentaje de adsorcion del HBsAg y la cantidad de PRP-T no adsorbido.

Se realizo la determinacion del porcentaje de adsorcion del HBsAg, tal como se ha indicado anteriormente, a partir de la determinacion del contenido total en HBsAg y del contenido en HBsAg no adsorbido, siendo la determinacion en HBsAg realizada gracias a un metodo ELISA tipo sandwich segun las normas definidas por la Farmacopea Europea 2.7.1. Brevemente, el HBsAg se capturo por un anticuerpo monoclonal primario anti-HBsAg de tipo IgM, en

5

10

15

20

25

30

35

40

pocillos de una placa de 96 pocillos. El HBsAg as^ fijado se recubrio con un anticuerpo monoclonal secundario anti- HBsAg, de tipo IgG, que a su vez fue detectado por un anticuerpo policlonal anti-IgG, acoplado a la peroxidasa. Un sustrato cromogeno de la peroxidasa, la tetrametilbencidina (TMB), sirvio de agente revelador. Durante su adicion, se desarrollo un color cuya intensidad era proporcional a la cantidad de HBsAg capturado en los pocillos. El analisis de los resultados se efectuo segun el metodo de las rectas paralelas descrito en la Farmacopea Europea 5.3.3.

A fin de determinar el porcentaje de adsorcion del HBsAg, se sometio la vacuna a una centrifugacion (8800 g; 5 min; 20°C), lo que permitio recuperar el sobrenadante que contiene el HBsAg no adsorbido. Las muestras de sobrenadantes que se ensayaron se diluyeron en tampon ELISA que comprende un tampon de desorcion en serie de 2 en un intervalo comprendido por ejemplo entre 1/400 y 1/12800.

Las muestras de vacunas total y de gama estandar se diluyeron en tampon ELISA que comprende un tampon de desorcion, en serie de 2 en un intervalo comprendido por ejemplo entre 1/800 y 1/25600.

Una placa de 96 pocillos recubiertos con el anticuerpo monoclonal primario se incubo durante 12 h a 5°C y se lavo con una solucion de PBS-Tween 20. Las diluciones de los sobrenadantes, de la vacuna total y de la gama estandar se repartieron en los pocillos. Despues, se anadio el anticuerpo secundario y se revelo con el anticuerpo conjugado con peroxidasa y TMB (tetrametilbencidina). La reaccion se detuvo anadiendo HC1 1 N. Despues de cada etapa, la placa se incubo durante 30 min a 25°C y despues se lavo con la solucion de PBS-Tween 20. Se anadio un blanco (tampon de dilucion) a los pocillos disponibles y se sometio a los mismos tratamientos. La placa se leyo a DO 450 y 630 nm.

Se evaluo la cantidad de PRP-T no adsorbida por HPAEC- PAD (cromatograffa de intercambio de iones de alto rendimiento - deteccion amperometrica pulsada) de la siguiente forma:

Se preparo en primer lugar una gama estandar de PRP-T de referencia de 0,5 a 12,5 |ig/ml.

Se centrifugaron las muestras a ensayar asf como las muestras de la gama estandar a 5000 g durante 5 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se recogieron, despues se hidrolizaron con una solucion de NaCl 1,5 N que contiene la glucosamina-l-fosfato como estandar interno. Se anadio un blanco (NaCl 0,9%; NaOH 1,5 N + estandar interno).

La cromatograffa se realizo con una etapa movil compuesta de NaOH 35 mM y de acetato de sodio 114 mM inyectada en la columna a razon de 1,2 ml/min.

Se calculo la concentracion en PRP no adsorbido (|ig/ml) a partir de la siguiente igualdad:

(Superficie del pico PRP/superficie del pico estandar interno) = a x [concentracion en PRP] + b en la que "a" es la pendiente y "b" es la ordenada en el origen, y a y b se determinaron a partir de la recta de regresion.

Los resultados se presentan en las 4 tablas siguientes:

Porcentaje de adsorcion del HBsAg en la formulacion del producto final a granel (PFV 39-41-42) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

PFV39 PFV41 PFV42

0

95 97 98

1 meses

92 93 95

2 meses

92 92 93

3 meses

91 90 91

4 meses

89 90 92

5 meses

85 88 91

6 meses

89 88 89

9 meses

88 86 91

Porcentaje de adsorcion del HBsAg en la formulacion conservada en frascos (lotes S12-S13-S14) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

S12 S13 S14

0

95 97 98

4 meses

88 88 90

5 meses

85 86 88

7 meses

85 80 86

10 meses

83 84 87

13 meses

82 86 84

16 meses

81 83 85

Porcentaje de adsorcion del HBsAg en la formulacion conservada en frascos (lotes S12-S13-S14) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

S12 S13 S14

22 meses

83 78 86

PRP-T no adsorbido (|ig/ml) en la formulacion del producto final a granel (PFV 39-41-42) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

PFV39 PFV41 PFV42

0

22,6 20,0 21,0

1 mes

23,1 19,5 20,4

2 meses

23,3 21,6 22,0

3 meses

24,9 22,6 23,1

4 meses

24,2 22,0 20,7

5 meses

22,2 22,7 24,5

6 meses

27,7 22,9 21,6

9 meses

27,0 24,8 23

PRP-T no adsorbido (|ig/ml) en la formulacion conservada en frascos (lotes S12-S13-S14) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

S12 S13 S14

0

22,6 20,0 21,0

4 meses

21,1 21,1 19,8

5 meses

23,0 19,6 18,6

7 meses

23,1 21,0 19,5

10 meses

25,0 23,4 21,8

13 meses

24,6 22,6 20,8

16 meses

23,5 22,3 20,8

22 meses

23,9 22,0 19,9

A modo de comparacion, se ensayo tambien la adsorcion a lo largo del tiempo del HBsAg contenido en tres lotes de 5 producto final a granel (FDN5-6-7) as^ como en tres lotes repartidos en frascos (S44-45-46) de una preparacion kquida compuesta de los mismos antfgenos pero obtenida segun un procedimiento de formulacion lineal descrito en la Figura 1 y por lo tanto diferente del descrito en el siguiente ejemplo. Esta preparacion contema en 0,5 ml: 10 |ig de HBsAg, 30 Lf de Dt, 10 Lf de Tt, 25 |ig de Pt, 25 |ig de FHA, 40 DU del virus de polio tipo 1, 8 DU del virus de polio tipo 2, 32 DU del virus de polio tipo 3, 12 |ig de PRP (en forma de PRP-T), 0,6 mg de Al, iones fosfato con una 10 concentracion de 55 mMol/l, iones carbonato con una concentracion de 20 mMol/l, tampon Tris sacarosa con una concentracion de 2,5 mMol/l en Tris y 2,125% en sacarosa, y 14 |ig de aminoacidos cationicos (His - Arg - Lys) provenientes del medio M199 (Valencia polio), pH 6,8 - 7,2.

Los resultados obtenidos eran los siguientes:

Porcentaje de adsorcion del HBsAg en la formulacion del producto final a granel (FDN5-6-7) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

FDN5 FDN6 FDN7

0

81 85 81

1 mes

78 82 62

2 meses

74 78 63

3 meses

66 84 62

6 meses

61 77 61

Porcentaje de adsorcion del HBsAg en la formulacion conservada en frascos (lotes S44-S45-S46) a + 5°C

Tiempo trascurrido despues de la operacion de formulacion

S44 S45 S46

0

81 85 81

7 meses

63 64 77

10 meses

57 65 51

13 meses

47 54 53

16 meses

33 56 38

22 meses

44 47 36

28 meses

44 51 44

34 meses

45 54 42

40 meses

49 52 48

Las cantidades de PRP-T no adsorbido medidas durante el mismo periodo indicaron que habfa pocas variaciones con respecto al tiempo 0 y por lo tanto eran satisfactorias. Sin embargo, estos resultados muestran que en este caso que no corresponde a una formulacion obtenida gracias a un procedimiento segun la invencion, el antfgeno de superficie de la hepatitis B no quedaba adsorbido en oxihidroxido de aluminio.

5

Datos experimentales relativos a los aminoacidos cationicos

Una composicion segun la invencion preparada directamente en funcion del protocolo experimental aplicado en el ejemplo proporcionado y una composicion obtenida gracias a un protocolo modificado en el que se habla sustituido 10 una composicion que contiene unicamente los tres aminoacidos cationicos (Arg - Lys - His) a la composicion de los 12 aminoacidos esenciales, se compararon en lo que se refiere a la cantidad de PRP-T no adsorbida finalmente. No se observo diferencia alguna en la cantidad de PRP-T no adsorbido, lo que demuestra que solo importan los aminoacidos cationicos.

15 Se hace constar que con relacion a esta fecha, el mejor metodo conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invencion, es el que resulta claro de la presente descripcion de la invencion.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de preparacion de una combinacion vaccmea liquida que comprende al menos:

   - oxihidroxido de aluminio (ALOOH),

   - un antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg),

   - un antigeno de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) constituido por polisacarido capsular conjugado a una protema portadora,

   en la que el antigeno de superficie de la hepatitis B se mantiene adsorbido en AlOOH mientras que el antigeno de Hib se mantiene no adsorbido,

   segun el cual:

   - se procede a la adsorcion del antfgeno de superficie de la hepatitis B en AlOOH para obtener un complejo AlOOH/HBsAg,

   - se mezcla dicho complejo AlOOH/HBsAg con el antigeno de Hib en presencia de aminoacidos cationicos a una concentracion de al menos 100 mg/l, y de iones fosfato con una concentracion de 35 a 45 mMol/l.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, segun el cual se procede a la adsorcion del antigeno HBsAg sobre aluminio mezclando una suspension de AlOOH con una suspension de HBsAg en agitacion durante al menos 4 horas.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1, segun el cual se procede a la adsorcion del antigeno HBsAg sobre aluminio mezclando una suspension de AlOOH con una suspension de HBsAg en agitacion durante al menos 12 horas.
4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1, segun el cual se procede a la adsorcion del antfgeno HBsAg sobre aluminio mezclando una suspension de AlOOH con una suspension de HBsAg en agitacion durante entre 20 y 24 horas.
5. 5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se anaden los aminoacidos cationicos a dicho complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antfgeno de Hib.
6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que se anaden los aminoacidos cationicos a dicho antfgeno de Hib antes de mezclar con el complejo AlOOH/HBsAg.
7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se anaden los iones fosfato al complejo AlOOH/HBsAg antes de mezclar con el antfgeno de Hib.
8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se ajusta el pH de la preparacion que comprende el complejo AlOOH/HBsAg a 7,1 + 0,1 antes de mezclar con el antfgeno de Hib.
9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que consiste ademas en:

   - preparar una composicion que comprende al menos un antfgeno seleccionado entre los antfgenos de difteria, tetanos, polio, tos ferina, ademas de oxihidroxido de aluminio, y

   - mezclar dicho complejo AlOOH/HBsAg con dicha composicion, antes de proceder a la mezcla con el antfgeno de Hib.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado por que consiste en preparar dicha composicion anadiendo cada uno de los antfgenos sucesivamente a una suspension de oxihidroxido de aluminio y agitando entre cada adicion de antfgenos.
11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que:

    - se adsorbe el HBsAg sobre una cantidad parcial de AlOOH que representa la tercera parte del AlOOH total presente en la composicion final, durante un periodo de 20 a 24 horas, a fin de formar un complejo AlOOH/HBsAg,

    - se adsorbe en paralelo, sobre una cantidad complementaria de AlOOH, sucesivamente: la toxina difterica D, la toxina tetanica T, la toxina purificada de Bordetella pertussis PTxd adsorbida ella misma previamente sobre AlOOH,

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65

    hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis FHA adsorbida ella misma previamente sobre AlOOH, despues se anaden iones fosfato, y a continuacion se anade el complejo AlOOH/HBsAg,

    - se anaden nuevamente unos iones fosfato en una cantidad que permite alcanzar una concentracion de 40 mMol/l en la composicion final,

    - se anade al menos un aminoacido cationico en una cantidad que permite alcanzar una concentracion de al menos 100 mg/l en la composicion final,

    - se ajusta el pH a 7,1 + 0,1,

    - se anaden unos antigenos de polio en forma de virus inactivados de tipo 1, y/o de tipo 2 y/o de tipo 3,

    - se anade el antigeno Hib,

    - se ajusta el pH a 7,1 + 0,1,

    - se reparte la composicion obtenida en jeringa o en frascos.
12. 12. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se preparan a escala industrial al menos 250 l de composicion vaccmea.
13. 13. Composicion vaccmea obtenida segun el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y que comprende al menos el antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y el antigeno de Hib constituido por polirribosilribitolfosfato conjugado de protema tetanica (PRP-T)-
14. 14. Composicion vaccmea segun la reivindicacion anterior, caracterizada por que comprende ademas unos antigenos de difteria, tetanos, polio y tos ferina.
15. 15. Composicion vaccmea segun una de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizada por que comprende al menos:

    - el antfgeno de superficie de la hepatitis B, HBsAg,

    - el antfgeno de difteria en forma de toxina difterica D,

    - el antfgeno de tetanos en forma de toxina tetanica T,

    - los antfgenos de tos ferina en forma de Toxina Purificada (PTxd) y de Hemaglutinina filamentosa (FHA),

    - el antfgeno de Haemophilus influenzae tipo b, en forma de polirribosilribitolfosfato conjugado de protema tetanica (PRP-T),

    - los antfgenos de polio en forma de virus inactivados seleccionados entre los tipos 1, 2 y 3.
16. 16. Composicion vaccmea segun la reivindicacion 14, caracterizada por que comprende al menos:

    - de 10 a 30 |ig de HBsAg/ml;

    -de 40 a 80 Lf de D/ml;

    -de 10 a 50 Lf de T/ml;

    - de 40 a 60 |ig de FHA/ml;

    - de 40 a 60 |ig de PTxd/ml;

    - de 2 a 60 |ig de PRP/ml en forma de conjugado PRP-T;

    - de 1 a 2 mg de AlOOH/ml;

    - de 35 a 45 mMol/l de iones fosfato;

    - de 100 a 1000 mg/l de aminoacidos cationicos;

    - los tipos 1,2 y 3 del virus de polio en forma inactivada en la cantidad respectiva de 80, 16 y 64 DU/ml.
17. 17. Composicion vaccmea segun la reivindicacion 16, caracterizada por que comprende al menos:

    - 20 |ig/ml de HBsAg,

    5

    - 50 a 70 Lf/ml de D,

    -10 a 30 Lf/ml de T,

    10 -50 |ig/ml de FHA,

    - 50 |ig/ml de PTxd,

    - 20-24 |ig/ml de PRP en forma conjugada PRP-T,

    15

    -1,2 mg/ml de AlOOH,

    - de 38 a 42 mMol/l de iones fosfato,

    20 - de 400 a 800 mg/l de aminoacidos cationicos,

    - los tipos 1,2 y 3 del virus de la polio en forma inactivada en cantidad respectiva de 80, 16 y 64 DU/ml.