EA026058B1

EA026058B1 - Способ получения вакцинной композиции, содержащей поверхностный антиген вируса гепатита b и антиген haemophilus influenzae типа b

Info

Publication number: EA026058B1
Application number: EA201491387A
Authority: EA
Inventors: Ландри Берто; Изабелль Шакорнак; Ален Франсон; Жан-Франсуа О; Граф Сандрин Лентш
Original assignee: Санофи Пастер
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2017-02-28
Also published as: AP2014007848A0; CY1119206T1; BR112014017416B1; KR20140119109A; HUE032539T2; FR2985663B1; UA113000C2; WO2013107988A1; MX349411B; IL233643A0; ES2625011T3; AR089737A1; EP2804628B1; PH12014501546A1; JP2015504085A; US9358294B2; RS55962B1; BR112014017416A8; CA2861304C; HRP20170692T1

Abstract

Объектом изобретения является способ получения вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере, оксигидроксид алюминия (AlOOH), по меньшей мере, поверхностный антиген гепатита В и антиген Haemophilus influenzae типа b. В соответствии с изобретением поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, тогда как антиген Hib сохраняется неадсорбированным. С этой целью поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на AlOOH для получения комплекса AlOOH/HBsAg, затем указанный комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии катионных аминокислот в концентрации по меньшей мере 100 мг/л и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.

Description

Изобретение относится к области комбинаций вакцин, содержащих одновременно валентность гепатита В, состоящую из поверхностного антигена (НВкАд) вируса гепатита В и валентности НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ь, состоящей из ее капсулярного полисахарида, называемого полирибозилрибитолфосфат (РКР), который, для того чтобы он являлся эффективным у детей в возрасте менее двух лет, конъюгируют с белком-носителем, например столбнячным белком.

Такие композиции, которые предназначены для введения детям раннего возраста, как правило, содержат другие антигены, обеспечивающие возможность вакцинации за одну операцию против нескольких заболеваний, а также адъювант на основе алюминия.

Таким образом, в патентной заявке \νϋ 99/13906 описана вакцинная композиция, содержащая, как описано на с. 13, антигены против дифтерии, столбняка, полиомиелита, коклюша, гепатита В и инфекций НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ь. Для того чтобы некоторые из этих антигенов являлись иммуногенными, их необходимо адсорбировать на соли алюминия. В частности, это является случаем поверхностного антигена гепатита В или НВкАд.

Однако, как указано на с. 12 заявки νθ 99/13906, валентность ШЬ, состоящая из капсулярного полисахарида, конъюгированного со столбнячным белком, как правило, теряет свою иммуногенность в течение периода времени, когда ее адсорбируют на солях алюминия. Во избежание этого недостатка решение, предлагаемое в этом известном уровне техники, которое уже рекомендовали в предшествующей заявке РСТ/РК96/00791, заключается в добавлении анионов и, в частности, фосфатных, карбонатных или цитратных ионов.

Однако авторы настоящего изобретения отметили, что в то время как добавление ионов, в частности фосфатов или карбонатов, позволяет эффективно предотвращать адсорбцию РКР-Т на оксигидроксиде алюминия (А1ООН) и, таким образом, сохранять его иммуногенность в течение длительного периода времени, такое добавление также имеет недостаток, заключающийся в десорбции поверхностного антигена гепатита В, когда последний также адсорбировали на оксигидроксиде алюминия.

Таким образом, необходимо найти способ получения комбинации вакцин, содержащей оксигидроксид алюминия, в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на А1ООН, тогда как антиген НЬ сохраняется в неадсорбированном состоянии.

С этой целью объектом настоящего изобретения является способ получения жидкой комбинации вакцин, содержащей по меньшей мере один поверхностный антиген гепатита В (НВкАд);

один антиген НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ь (НЮ), состоящий из капсулярного полисахарида, конъюгированного с белком-носителем;

оксигидроксида алюминия (А1ООН);

в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на А1ООН, тогда как антиген Н1Ь сохраняется в неадсорбированном состоянии;

где антиген гепатита В адсорбируют на А1ООН для получения комплекса поверхностный АЮОН/НВкАд;

указанный комплекс АЮОН/НВкАд смешивают с антигеном НЬ в присутствии катионных аминокислот в концентрации по меньшей мере 100 мг/л и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.

Благодаря способу по изобретению возможно получать желаемое равновесие между поддержанием адсорбции поверхностного антигена гепатита В на оксигидроксиде алюминия и сохранения в неадсорбированном состоянии антигена Н1Ь.

Согласно одному конкретному варианту осуществления изобретения антиген НВкАд адсорбируют алюминий, смешивая суспензию А1ООН с суспензией НВкАд при перемешивании в течение по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, предпочтительно от 20 до 24 ч.

Согласно одному частному варианту осуществления изобретения перед смешиванием с антигеном НЬ к указанному комплексу АЮОН/НВкАд добавляют катионные аминокислоты.

Согласно альтернативному варианту осуществления изобретения перед смешиванием с комплексом АЮОН/НВкАд к указанному антигену НЬ добавляют катионные аминокислоты.

По одному из вариантов осуществления изобретения перед смешиванием с антигеном Н1Ь к указанному комплексу АЮОН/НВкАд добавляют фосфатные ионы.

По одному из вариантов осуществления изобретения перед смешиванием с антигеном Н1Ь регулируют рН препарата, содержащего комплекс АЮОН/НВкАд, до 7,1±0,1.

Объектом изобретения также является вакцинная комбинация, получаемая заявленным в формуле изобретения способом и содержащая по меньшей мере:

поверхностный антиген гепатита В;

антиген дифтерии в форме дифтерийного токсина И;

антиген столбняка в форме столбнячного токсина Т;

антигены коклюша в форме очищенного токсина (РТхб) и фимбриального гемагглютинина (РНА); антиген НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ь в форме полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (РКР-Т);

- 1 026058 антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов типа 1, 2 и 3.

Такая вакцинная композиция обладает преимуществом, которое заключается в том, что она находится в жидкой форме, что позволяет избегать операции получения лиофилизата, было доказано, что она является достаточно стабильной, чтобы оставаться иммуногенной до суток ее использования, и даже через 36 месяцев после даты ее производства.

По изобретению вакцинная композиция содержит поверхностный антиген гепатита В (НВкАд). В частности, этот антиген может представлять собой поверхностный антиген гепатита В, такой как антиген, содержащийся в вакцине КесотЫуах НВ™, или в любой другой вакцине против гепатита В. В частности, он может представлять собой рекомбинантый антиген, получаемый ферментацией дрожжей Нап8епи1а ро1утотрка, модифицированных способом, разработанным Сгисе11, такой как антиген, содержащийся в вакцине Нерауах-Оепе™. Для целей изобретения количество НВкАд, содержащегося в 0,5-мл дозе, преимущественно составляет от 5 до 15 мкг и, в частности, 10 мкг.

По изобретению вакцинная композиция содержит антиген НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ь (НЬ). Этот антиген состоит из капсулярного полисахарида бактерии или полирибозилрибитолфосфата (РКР), который конъюгирован с белком-носителем. Белок-носитель может представлять собой любой белок, используемый в этом отношении в области вакцин. Он может представлять собой, например, дифтерийный токсин Ό, столбнячный токсин Т, липопротеин Ό НаеторЫ1и8 1пПиеп/ае. СКМ197 или белок наружной мембраны N. тетпдЫЫк (ОМР). Для получения РКР-Т конъюгата предпочтительно используют столбнячный белок. Для целей настоящего изобретения конъюгат РКР-Т может содержаться в пропорции от 1 до 30 мкг РКР в 0,5-мл дозе, преимущественно от 5 до 25 мкг РКР в дозе, предпочтительно от 10 до 15 мкг РКР в дозе, наиболее предпочтительно от 10 до 12 мкг РКР в дозе и более конкретно 12 мкг РКР, конъюгированного с 22-36 мкг столбнячного белка.

По изобретению вакцинная композиция содержит оксигидроксид алюминия А1ООН. Эту соль алюминия очень часто неправильно называют гидроксидом алюминия. А1ООН, который можно использовать для целей настоящего изобретения, может представлять собой, например, соль А1ООН, поставляемую ВгепЩад АО, или КеЬубтаде1 НРА от Кеке18 Согр. (Вегке1еу НещкК N1), несмотря на то, что способ получения каждого из двух адъювантов различается. Количество используемого А1ООН рассчитывают таким образом, чтобы обеспечивать получение достаточного иммунного ответа, в частности он зависит от числа и природы антигенов, содержащихся в композиции, а также от количества каждого из этих антигенов.

Только в качестве информации максимальная адсорбция НВкАд на А1ООН составляет приблизительно 780 мкг белка на 1 мг алюминия (общепринято количество А1ООН выражают как количество алюминия А1³+). Для дозы вакцины, содержащей 10 мкг НВкАд без других дополнительных антигенов, таким образом, будет достаточно 13 мкг алюминия, количество, которое, тем не менее, является недостаточным для получения желаемой эффективности, когда добавляют другие антигены. Таким образом, в зависимости от добавления одного или более дополнительных антигенов 10 мкг НВкАд можно приводить в контакт с от 0,01 до 1,25 мг алюминия, что является максимальным количеством, рекомендуемым европейской фармакопеей.

Например, 0,5-мл доза вакцины для детей, содержащей антигены дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, может общепринято содержать от 0,5 до 0,7 мг алюминия, предпочтительно приблизительно 0,6 мг алюминия.

По изобретению поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на А1ООН, что означает, что по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% от общего количества такого антигена, содержащегося в композиции, находится в адсорбированной форме.

По изобретению антиген ШЬ сохраняется неадсорбированным на А1ООН, что означает, что по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75% от общего количества этого антигена, содержащегося в композиции, содержится в неадсорбированной форме.

По изобретению период времени, во время которого поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на А1ООН, и антиген НЬ сохраняется неадсорбированным, составляет по меньшей мере 3 месяца, предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 12 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 18 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 24 емсяца, более предпочтительно по меньшей мере 36 месяцев, начиная от даты производства композиции, когда температура хранения составляет 5±3°С. Предпочтительно количество адсорбированных или неадсорбированных антигенов является стабильным в течение длительного периода времени, но оно также может изменяться, при условии, что оно остается в приемлемых пределах. Таким образом, когда по меньшей мере 85% от общего количества НВкАд, содержащегося в композиции, адсорбировано на А1ООН в течение 3 месяцев, начиная с даты производства композиции, хранимой при температуре 5±3°С, также воз- 2 026058 можным является то, что после одного года и также при аналогичных условиях хранения 8 0% от общего количества НВкАд, содержащегося в композиции, сохраняется адсорбированным.

Для оценки количество адсорбированного антигена специалисты в данной области могут использовать любой известный способ.

Касательно определения процента адсорбции НВкАд можно использовать способ сэндвич-ЕБ18А в соответствии с правилами, установленными Еигореап рЬагтасоре1а 2.7.1. В кратком изложении НВкАд захватывается первичным моноклональным антителом против НВкАд типа 1дМ в лунках 96-луночного планшета. Связанный таким образом НВкАд покрывают вторичным моноклональным антителом против НВкАд типа 1дС. которое в свою очередь детектируют посредством связанного с пероксидазой поликлонального антитела против 1дО. Хромогенный субстрат для пероксидазы тетраметилбензидин (ТМВ) служит в качестве проявляющего средства. При его добавлении проявляется окраска, интенсивность которой является пропорциональной количеству НВкАд, захваченного в лунке. Результаты анализируют способом параллельных линий, описанным в Еигореап рЬагтасоре1а 5.3.3. Процент адсорбции получают на основании определения общего содержания НВкАд и содержания неадсорбированного НВкАд.

Касательно количества неадсорбированного РКР-Т можно проводить оценку посредством НРАЕСРАЭ (высокоэффективной ионообменной хроматографией - импульсной амперометрической детекцией).

В соответствии со способом по изобретению поверхностный антиген гепатита В адсорбируется на А1ООН. Этот этап можно проводить, приводя поверхностный антиген гепатита В и А1ООН в контакт при отсутствии любого другого антигена и оставляя поверхностный антиген гепатита В адсорбироваться на А1ООН в течение по меньшей мере 4 ч, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, более предпочтительно от 20 до 24 ч, таким образом, чтобы получать препарат, содержащий комплекс А1ООН/НВкАд. По изобретению такую адсорбцию можно проводить при отсутствии фосфатных ионов. Цель, преследуемая путем увеличенного времени контактирования поверхностного антигена гепатита В и А1ООН, заключается в максимальном увеличении электростатических взаимодействий и в обеспечении стабильных взаимодействий, которые могут, таким образом, приводить к адсорбции путем замещения лиганда. Это контактирование преимущественно проводят при перемешивании.

В соответствии со способом по изобретению комплекс А1ООН/НВкАд смешивают с антигеном НЛ в присутствии катионных аминокислот и фосфатных ионов.

Для целей изобретения термин катионные аминокислоты предназначен для обозначения аминокислот, рН которых является выше чем рН вакцинной композиции и которые, таким образом, находятся в катионной форме при рН вакцины, в частности они представляют собой лизин (Бук), аргинин (Агд) или гистидин (Н1к); каждую из этих аминокислот можно использовать отдельно, в виде смеси по 2 (Бук+Агд; Бук+Н|к; Агд+НБ) или все 3 вместе (Бук+Агд+НН). В одном конкретном варианте осуществления катионные аминокислоты могут быть ассоциированы в форме дипептида. В частности, можно указать дипептиды Бу^-Бух Бук-Агд, Бук-Н1к, Агд-Агд, Агд-Бук, Агд-НН, НЮНН НБ-Бук и НБ-Агд. Альтернативно, дипептид, пригодный для целей настоящего изобретения, может состоять из катионной аминокислоты и незаряженной аминокислоты, выбранной из А1а, Уа1, Беи, Но, Рго, Мер РЬе, Тгр, С1у, 8ег, ТЬг, Сук, Туг, Акр и Οίη. Таким образом, на практике можно использовать препарат, содержащий одну или более катионных аминокислот в свободной форме и/или форме дипептида. Также возможно использовать препараты аминокислот, содержащие катионные аминокислоты в желаемом количестве, в виде смеси с другими аминокислотами. Для того, чтобы не получать слишком большое падение рН во время добавления аминокислот, можно предусматривать повышение рН препарата, содержащего аминокислоты, перед их добавлением к комплексу А1ООН/НВкАд, посредством основания, в частности гидроксида натрия.

По изобретению количество катионных аминокислот, содержащихся в конечном итоге в вакцинной композиции, должно составлять по меньшей мере 100 мг/л, преимущественно по меньшей мере 300 мг/л, преимущественно по меньшей мере 400 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 500 мг/л. Не существует критической максимальной дозы. Однако предпочтительно, чтобы максимальное количество составляло не более 2 мг/мл, более предпочтительно не более 1 мг/мл, более предпочтительно не более 800 мкг/мл, более предпочтительно не более 700 мкг/мл. Когда добавляют рассчитанное количество катионных аминокислот, необходимо учитывать катионные аминокислоты, которые могут вводиться со средой, в которой содержатся антигены, отличные от НВкАд и антигена НШ

В соответствии с одним из альтернативных способов можно определять количество катионных аминокислот относительно массы капсулярного полисахарида НЪ и обеспечивать массовое отношение полисахарид НЪ/катионная аминокислота от 1:4 до 1:100, преимущественно от 1:10 до 1:80, предпочтительно от 1:15 до 1:60 или особенно предпочтительно от 1:20 до 1:30 или 40.

В соответствии со способом по изобретению комплекс А1ООН/НВкАд смешивают с антигеном НЛ в присутствии катионных аминокислот, а также в присутствии фосфатных ионов. По одному из вариантов осуществления изобретения фосфатные ионы добавляют к комплексу А1ООН/НВкАд перед тем, как их приводят в контакт с антигеном НЪ. Введение фосфатных ионов можно, например, проводить путем добавления вторичного кислого фосфата натрия или вторичного кислого фосфата калия, или же в виде смеси двух. Количество фосфатных ионов рассчитывают таким образом, чтобы адсорбированным А1ООН оставалось максимальное количество поверхностных антигенов гепатита В, при этом одновре- 3 026058 менно предотвращая адсорбцию антигена НФ. Это количество изменяется в зависимости от природы и числа содержащихся антигенов и, в частности, в зависимости от антигенов, отличных от антигенов НВкЛд и НФ.

Таким образом, для вакцинной комбинации, содержащей антигены, обычно используемые в вакцинах для детей, которые являются в дополнение к НВкЛд и антигену НФ, антигенам дифтерии, столбняка и коклюша, предпочтительным может являться добавление фосфатных ионов таким образом, что получаемая концентрация фосфатных ионов в вакцинной композиции в конечном итоге является по меньшей мере равной 35 ммоль/л и более конкретно составляет от 35 до 45 ммоль/л, включая границы, предпочтительно от 38 до 44 ммоль/л, включая границы, более предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л, включая границы. По одному предпочтительному варианту осуществления получаемая конечная концентрация фосфатных ионов в вакцинной композиции составляет 40 ммоль/л.

По одному альтернативному варианту осуществления фосфатные ионы добавляют в таком количестве, чтобы они содержались в вакцинной композиции в конечной концентрации от 35 до 38 ммоль/л, включая границы. Это получают также добавлением карбонатных ионов, но, тем не менее, в ограниченном количестве, т.к. фактически отмечали, что избыточное количество карбонатных ионов является неблагоприятным. Преимущественно их можно добавлять в таком количестве, чтобы они содержались в вакцинной композиции в конечной концентрации, меньшей или равной 10 ммоль/л.

Во избежание избыточного ионного воздействия, которое может дестабилизировать НВкЛд и способствовать его десорбции, рекомендуют добавлять фосфатные ионы несколькими (пример 2) отдельными операциями (этапами). Таким образом, фосфатные ионы можно добавлять при первой операции в количестве, которое позволяет получать конечную концентрацию от 20 до 30 ммоль/л, включая границы, затем при второй операции в количестве, которое позволяет получать конечную концентрацию, как конкретно указано выше.

По одному предпочтительному варианту осуществления способа по изобретению, кроме того, перед смешиванием антигена Н1Ъ с комплексом ЛЮОН/НВкЛд рН получаемого препарата доводят до 7,1±0,1. Фактически отмечали, что такое значение рН оказывает положительное действие на сохранение антигена НФ в неадсорбированном состоянии.

По одному конкретному варианту осуществления, кроме того, после смешивания фаз рН доводят до 7,1±0,1.

Таким образом, способом по изобретению можно получать вакцинную композицию, в которой:

(ί) по меньшей мере 60 или 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% от общего количества поверхностного антигена гепатита В, содержащегося в композиции, является адсорбированным на А1ООН в течение по меньшей мере 3 месяцев, начиная с даты производства композиции, хранящейся при температуре 5±3°С; и (и) по меньшей мере 65, 70 или 75% от общего количества антигена НФ, содержащегося в композиции, не является адсорбированным на А1ООН.

Выражение комплекс АЮОН/НВкАд следует интерпретировать, как означающее, что комплекс содержит, по меньшей мере, антиген НВкАд, адсорбированный на А1ООН. Комплекс может содержать другие антигены, несмотря на то, указаны они или не указаны.

Кроме того, один или более дополнительных антигенов могут образовывать комплекс. В частности, они могут представлять собой дифтерийный анатоксин (Ό), столбнячный токсин (Т), бесклеточные антигены коклюша, такие как обезвреженный токсин Вогйс1с11а ρθτΦκκίκ (ΡΤχά), фимбриальный гемагглютинин (РНА), петрактин (антиген 69 кДа) и агглютиногены (фимбрии) некоторых таких бактерий. В соответствии с одним особенно эффективным вариантом осуществления для образования комплекса можно добавлять антигены Ό, Τ, ΡΤχά и РНА.

Дополнительные антигены можно добавлять различными способами. Их можно добавлять последовательно после поверхностного антигена гепатита В, предварительно адсорбированного (ί) на общем количестве А1ООН, которое должно содержаться в вакцинной композиции, (ίί) или на частичном количестве, затем добавляемом для получения общего количества. Альтернативно, дополнительные антигены можно адсорбировать раздельно, каждый на частичном количестве А1ООН, также как НВкАд. Также можно обеспечивать способ смешанной адсорбции, где некоторые антигены адсорбируют раздельно, другие адсорбируют последовательно.

По одному конкретному варианту осуществления способа по изобретению после добавления каждого антигена получаемую композицию перемешивают.

По одному предпочтительному варианту осуществления, приводимому только в качестве примера, НВкАд адсорбируют раздельно на частичном количестве А1ООН, соответствующем приблизительно 30% (одной трети) от общего количества А1ООН, содержащегося в конечной композиции. Параллельно антигены Ό и Т последовательно адсорбируют на дополнительной части А1ООН. Затем к препарату, содержащему комплекс А1ООН-Б-Т. добавляют антигены коклюша ΡΤχά и РНА, где каждый из этих двух антигенов коклюша в свою очередь предварительно адсорбировали на А1ООН. В заключении объединяют два препарата (комплекс АЮОН-НВзАд и комплекс А1ООН-^-Τ-ΡΤxά-РНА) таким образом, чтобы

- 4 026058 получать препарат, содержащий АЮОН-НВзАд-О-Т-РТхй-РНА, в котором количества каждого из элементов выбирали, чтобы получать дозы вакцин 0,5 мл, общепринято содержащие от 5 до 15 мкг НВзАд/доза, предпочтительно 10 мкг/доза;

от 20 до 40 Ы ϋ/доза, предпочтительно от 25 до 35 Ы/доза, более предпочтительно 30 Ы/доза (Ы предел флокуляции) (выражаемая другим образом, количество ϋ является большим или равным 20 МЕд/доза);

от 5 до 25 Ы Т/доза, предпочтительно от 10 до 15 Ы/доза, более предпочтительно 10 Ы/доза (выражаемая другим образом, количество Т является большим или равным 40 МЕд/доза);

от 20 до 30 мкг РНА/доза, предпочтительно 25 мкг/доза; от 20 до 30 мкг РТхй/доза, предпочтительно 25 мкг/доза.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления изобретения также добавляют антигены полиомиелита, который общепринято состоят из инактивированных вирусов. Можно предусматривать добавление 3 типов, как правило, содержащихся в вакцинах для детей, т.е. типы 1, 2 или 3, или также в случае, когда нет необходимости вакцинировать против 3 типов, вводить только типы, от которых предполагают обеспечивать защиту. Количества полиовируса в дозе, в частности, могут составлять от 20 до 43 Όυ (единиц антигена ϋ), в частности 40 для 1 типа; от 5 до 9 ϋυ, в частности 8 для 2 типа; от 17 до 36 ϋυ, в частности 32, для 3 типа.

Эти антигены необязательно предварительно адсорбируют на соли алюминия перед добавлением в вакцинный препарат.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления способ по изобретению представляет собой способ, где:

(ί) (а) НВзАд и А1ООН приводят в контакт в отсутствие любого другого антигена и оставляют НВзАд адсорбироваться на А1ООН в течение по меньшей мере 4 ч, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, более предпочтительно приблизительно 24 ч, таким образом, чтобы получать препарат, содержащий комплекс АЮОН/НВзАд;

(ί) (Ь) к препарату, получаемому в пункте (ί) (а), добавляют препарат, содержащий антигены ϋ, Т, РТхй и РНА, предварительно адсорбированные на А1ООН, и необязательно дополнительные антигены Вогйс1с11а рет1и8818, такие как петрактин и агглютиногены;

(ίί) к препарату, получаемому в пункте (ί) (Ь), добавляют фосфатные ионы, чтобы получать конечную концентрацию в вакцине 40 ммоль/л;

(ш) к препарату, получаемому в пункте (ίί), необязательно добавляют антигены полиомиелита;

(ίν) к препарату, получаемому в пункте (ίί) или (ίίί), добавляют препарат, содержащий антиген НФ;

(ν) рН доводят до 7,1±0,1 и (νί) (а) перед добавлением антигена НФ добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту таким образом, чтобы дополнять препарат, получаемый в пункте (ίί) или (ίίί); или (Ь) к антигену НФ добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту;

где указанную катионную аминокислоту добавляют в количестве, достаточном для получения конечной концентрации в вакцине по меньшей мере 100 мг/л.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления вакцинная композиция по изобретению представляет собой композицию, содержащую НВзАд, дифтерийный токсин ϋ, столбнячный токсин Т, антигены коклюша РТхй и ЕНА, предварительно адсорбированные на А1ООН, антиген НФ и необязательно валентность полиомиелита, в которой:

(т) по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90% от общего количества НВзАд, содержащегося в композиции, сохраняется адсорбированным на А1ООН в течение по меньшей мере 3 месяцев, начиная с даты производства композиции, хранящейся при температуре 5±3°С; и (ίί) по меньшей мере 65, 70 или предпочтительно 75% от общего количества антигена НФ, содержащегося в композиции, не является адсорбированным на А1ООН, где это количество остается относительно стабильным в течение длительного периода времени.

Кроме того, способом по изобретению также обеспечивают сохранение в адсорбированном состоянии отличных от НВзАд антигенов, для которых продемонстрировано, что преимуществом является то, что они должны быть адсорбированы на оксигидроксиде алюминия, чтобы являться иммуногенными.

Таким образом, в качестве примера указывают, что композиция по изобретению может содержать от 10 до 30 мкг НВзАд/мл, предпочтительно 20 мкг/мл;

от 40 до 80 Ы ϋ/мл, предпочтительно от 50 до 70 Ы/мл;

от 10 до 50 Ы Т/мл, предпочтительно от 10 до 30 Ы/мл;

от 4 0 до 60 мкг ЕНА/мл, предпочтительно 50 мкг/мл;

от 40 до 60 мкг РТхй/мл, предпочтительно 50 мкг/мл;

от 2 до 60 мкг РРР/мл, предпочтительно 20-24 мкг/мл;

от 1 до 2 мг А1ООН/мл, предпочтительно 1,2 мг А1ООН/мл;

фосфатные ионы в концентрации от 35 до 45 ммоль/л, предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л фос- 5 026058 фатных ионов;

от 100 до 1000 мкг/мл катионных аминокислот, предпочтительно от 400 до 800 мкг/мл, и необязательно

1, 2 и 3 типа полиовируса в неактивированной форме в соответствующем количестве 80, 16 и 64 БИ/мл.

Как указано выше, композиция по изобретению также может содержать дополнительные антигены Вогбе1е11а репи8818, такие как петрактин (69 кДа) или агглютиногены.

Описание чертежа

Чертеж представляет собой схему способа известного уровня техники, где смешивание проводят после добавления каждого компонента.

Пример. Получение в промышленном масштабе нефасованной (250 л) шестивалентной вакцины НерВ-Б1-Т1-Рег1и8818-полиомиелит-Н|В.

Такое получение проводят в стерильных условиях и при постоянном перемешивании.

A. Получение НВкАд, адсорбированного на А1ООН.

Гомогенную суспензию геля оксигидроксида алюминия (А1ООН), поставляемую Вгеийад АО, при 8 г алюминия/л в стерильных условиях вводили в 50-л резервуар.

После фильтрования через 0,22-мкм фильтр в резервуар, уже содержащий А1ООН, непрерывно добавляли объем НВ§А§, необходимый для получения концентрации в конечной вакцине 20 мкг/мл.

Смесь оставляли при перемешивании в течение 20-24 ч при температуре окружающей среды таким образом, чтобы получать гомогенную суспензию.

B. Получение Б+Т+РТхб+РНА, адсорбированных на геле алюминия.

Параллельно получают смесь геля алюминия, дифтерийного анатоксина (Б), столбнячного токсина (Т), анатоксина Вогбе1е11а рейи8818 (РТхб) и фимбриального гемагглютинина (РНА) Вогбе1е11а репи8818 следующим ниже способом.

В 250-л резервуар вносят в стерильных условиях гомогенную суспензию геля А1ООН, поставляемую Вгепи1ад АО, при 8 г алюминия/л.

В 250-л резервуар, уже содержащий А1ООН, после фильтрования через 0,22-мкм фильтр последовательно вводят растворы Б, а затем после гомогенизации Т, для получения соответствующих концентраций Б и Т в конечной вакцине 60 Б£ (предел флокуляции)/мл и 20 БГ/мл.

После получения гомогенной смеси в этот резервуар последовательно вводят в стерильных условиях суспензию РТхб, предварительно адсорбированного на А1ООН, а затем суспензию РНА, предварительно адсорбированного на А1ООН, для получения концентраций РТхб и РНА в конечной вакцине 25 мкг/мл.

В заключение после фильтрования через 0,22-мкм фильтр добавляют объем 500 мМ фосфатного буфера, необходимый для получения концентрации фосфатных ионов от 20 до 30 ммоль/л.

Получаемую суспензию Б-Т-РТхб-РНА-А1ООН оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 14 ч при температуре 5±3°С.

C. Получение смеси НВ8А§+Б+Т+РТхб+РНА, адсорбированных на геле алюминия.

Препарат, полученный в п.А, добавляют в стерильных условиях к препарату, полученному в п.В.

Эту смесь оставляют перемешиваться таким образом, чтобы получать гомогенную суспензию.

Затем объем добавляют 500 мМ фосфатного буфера, необходимый для получения концентрации фосфатных ионов 40 ммоль/л в конечной композиции, после фильтрования через 0,22-мкм фильтр.

Б. Насыщение электростатических участков комплекса геля алюминия/НВ8А§+Б+Т+РТхб+РНА раствором аминокислот.

Получают раствор аминокислот, содержащий 12 незаменимых аминокислот, обладающий следующей ниже композицией:

гидрохлорид аргинина 2,1 г/л, т.е. 1,7 3 г/л аргинина;

цистин 1,2 г/л;

гистидин 0,8 г/л;

изолейцин 2,6 г/л;

лейцин 2,6 г/л;

гидрохлорид лизина 3,65 г/л, т.е. 2,91 г/л лизина;

метионин 0,75 г/л;

фенилаланин 1,65 г/л;

треонин 2,4 г/л;

триптофан 0,4 г/л;

тирозин 1,8 г/л;

валин 2,35 г/л.

Таким образом получают 21,2 г/л аминокислот, включая 5,44 г/л катионных аминокислот (Н18-Лг§Ьу8).

Добавляют 450 мл 2,5н. гидроксида натрия (ЫаОН) (0,5 л/мин). Продолжают проводить гомогенизацию при перемешивании в течение 10 мин.

- 6 026058

Этот раствор аминокислот, профильтрованный через 0,22-мкм фильтр, непрерывно добавляют в смесь, полученную в п.С, таким образом, чтобы получать концентрацию 572 мкг/мл катионных аминокислот в конечной композиции.

Е. Доведение рН.

рН суспензии, полученной в п.Э. регулируют до рН 7,1 (7,0-7,2) с использованием профильтрованного исходного 2,5н. раствора гидроксида натрия.

Р. Добавление антигенов полиомиелита.

Затем в резервуар, содержащий суспензию, полученную в п.Е, вводят препарат, содержащий 1, 2 и 3 серотипы полиовируса в неактивированной форме (штаммы МаЪопеу, МЕР-1 и §аикей соответственно), профильтрованный через 0,22-мкм фильтр.

С. Добавление РКР-Т.

Сначала получают промежуточный раствор РКР-Т следующим образом: к препарату РКР-Т, профильтрованному через 0,22-мкм фильтр, добавляют ТЙ8-сахарозный буфер, предварительно профильтрованный через 0,22-мкм фильтр, чтобы получить промежуточную смесь.

Эту смесь вводят в стерильных условиях в смесь, полученную в п.Р.

Н. Конечная фаза регуляции.

После гомогенизации суспензии, полученной в п.С, добавляют достаточное количество предварительно профильтрованной воды РР1 для получения целевого объема 250 л. Затем при необходимости доводят рН смеси до рН 7,1±0,1, добавляя предварительно профильтрованный 2,5н. раствор гидроксида натрия или 10% раствор уксусной кислоты.

Смесь хранят при 5±3°С, затем распределяют в шприцы или флаконы в пропорции 0,5 мл/доза.

Таким образом, одна 0,5-мл доза содержит 600 мкг А1³⁺, 10 мкг НВ8Лд, не менее 20 МЕд Ό, не менее 40 МЕд Т, 25 мкг Р1, 25 мкг РНА, от 20 до 43 ЭИ (антигенных единиц Ό) полиомиелита 1 типа, от 5 до 9 ЭИ полиомиелита 2 типа, от 17 до 36 ЭИ полиомиелита 3 типа, 12 мкг РКР (в форме РКР-Т), фосфатные ионы в концентрации 40 ммоль/л, Тпк-сахарозный буфер в концентрации 2,5 ммоль/л Тг18 и 2,125% сахарозы, а также 286 мкг катионных аминокислот (Н18-Лт§-Еу8).

Клиническое испытание.

В клиническом испытании тестировали вакцинную композицию, полученную в соответствии с указанным выше примером, в сравнении с шестивалентной вакциной Ιηίαητίχ Неха™, уже представленной на рынке, которая обеспечивает возможность вакцинации детей от таких же заболеваний, как вакцина, получаемая по изобретению (от дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита, инфекций НЛ и гепатита В), но которая, в частности, обладает недостатком, заключающимся в том, что она содержит лиофилизированную часть, и, таким образом, перед процедурой введения необходимой является операция восстановления лиофилизата.

Во время клинического испытания детям вводили 2 типа вакцинных композиций по схеме вакцинации, включающей 3 дозы, вводимые в 2, 4 и 6 месяцев. Продемонстрировано, что жидкая вакцина, получаемая способом по изобретению, является осень хорошо переносимой и такой же иммуногенной, как вакцина, представленная на рынке.

Экспериментальные данные

Процент адсорбции НВ8Лд/количество неабсорбированного РКР-Т.

Три серии конечного нефасованного продукта (РРУ39-41-42), а также три серии распределенного по флаконам (§12-13-14) - все серии получали в соответствии с предоставленным примером - хранили при +5°С и анализировали в различные моменты времени в течение периода 9 и 22 месяца соответственно. Анализ касался процента адсорбции НВ8Лд и количества неабсорбированного РКР-Т.

Определение процента адсорбции НВ8Лд проводили, как указано выше, начиная определения общего содержания НВ8Лд и содержания неадсорбированного НВ8Лд, где определение НВ8Лд проводили с использованием способа сэндвич-ЕЕРЗЛ в соответствии с правилами, определяемыми Еигореап рйаттаеоре1а 2.7.1. В кратком изложении, НВ8Лд захватывался первичным моноклональным антителом против НВ8Лд типа 1дМ в лунках 96-луночного планшета. Связанный таким образом НВ8Лд покрывали вторичным моноклональным антителом против НВ8Лд типа 1дС, которое в свою очередь детектировали посредством связанного с пероксидазой 1дС поликлонального антитела против 1дС. Хромогенный субстрат для пероксидазы тетраметилбензидин (ТМВ) служил в качестве проявляющего средства. При его добавлении проявляется окраска, интенсивность которой являлась пропорциональной количеству НВ8Лд, захваченного в лунке. Результаты анализировали способом параллельных линий, описанным в Еигореап рйаттасоре1а 5.3.3.

Для определения процента адсорбции НВ8Лд вакцину подвергали центрифугированию (8800 д 5 мин, 20°С), что позволяло собирать супернатант, содержащий неадсорбированный В8Лд. Образцы супернатантов, которые необходимо тестировать, разбавляли буфером для ЕЬ1§Л, содержащим десорбционный буфер, в 2-кратных серийных разведениях в диапазоне, например, от 1/400 до 1/12800.

Образцы общей вакцины и стандартного диапазона разбавляли буфером ЕЬ1§Л, содержащим десорбционный буфер, в 2-кратных серийных разведениях в диапазоне, например, от 1/8 до 1/25600.

- 7 026058

96-луночный планшет, покрытый первичным моноклональным антителом, инкубировали в течение 12 ч при 5°С, а затем промывали раствором ΡΒδ-Тгееи 20. Разбавления супернатантов общей вакцины и стандартного диапазона распределяли по лункам. Затем добавляли вторичное антитело и проводили проявление с использованием связанного с пероксидазой антитела и ТМВ (тетраметилбензидина). Реакцию останавливали добавлением 1н. НС1. После каждого этапа планшет инкубировали в течение 30 мин при 25°С, а затем последовательно промывали раствором ΡΒδ-Т^ееи 20. Холостую пробу (буфер для разведения) добавляли в доступные лунки и подвергали аналогичным обработкам. Планшет считывали при ΘΌ 450 и 630 нм.

Количество неадсорбированного ΡΡΡ-Т оценивали НРАЕС-ΡΑΌ (высокоэффективной анионообменной хроматографией - импульсной амперометрической детекцией) следующим ниже способом.

Сначала получали стандартный диапазон ΡΡΡ-Т эталона от 0,5 до 12,5 мкг/мл.

Образцы, которые необходимо тестировать, а также образцы стандартного диапазона центрифугировали при 5000 д в течение 5 мин при температуре окружающей среды. Собирали супернатанты, а затем подвергали гидролизу 1,5н. раствором ЫаС1, содержащим глюкозамин-1-фосфат в качестве внутреннего стандарта. Добавляли холостую пробу (0,9% ЫаС1, 1,5н. ЫаОН+внутренний стандарт).

Проводили хроматографию с подвижной фазой, состоящей из 35 мМ ЫаОН и 114 мМ ацетата натрия, впрыскиваемых в колонку со скоростью 1,2 мл/мин.

Концентрацию неадсорбированного ΡΡΡ (мкг/мл) рассчитывали с использованием следующего уравнения:

(площадь поверхности пика ΡΡΡ/площадь поверхности пика внутреннего стандарта)=ах [концентрация ΡΡΡΙ+Ь.

в котором а представляет собой наклон и Ь представляет собой отрезок на оси у, где а и Ь определяют на основании линии регрессии.

Результаты приведены в 4 таблицах ниже.

Процент адсорбции НВзАд в составе конченого нефасованного продукта (ΡΥΓ 39-41-42) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования	РР5739	ΡΡΥ41	ΡΕΥ42
0	95	97	98
1 месяц	92	93	95
2 месяца	92	92	93
3 месяца	91	90	91
4 месяца	89	90	92
5 месяцев	85	88	91

месяцев месяцев


Процент адсорбции НВвАд в составе, хранящемся во флаконах (серии 312-313-314) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования	312	513	514
0	95	97	98
4 месяца	88	88	90
5 месяцев	85	86	88
7 месяцев	85	80	86
10 месяцев	83	84	87
13 месяцев	82	86	84
16 месяцев	81	83	85
22 месяца	83	78	86

- 8 026058

Неадсорбированный РКР-Т (мкг/мл) в составе конечного нефасованного продукта (РУК 39-41-42) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования	ГРУЗ 9	РЕУ41	РЕ1742
0	22, 6	20, 0	21, 0
1 месяц	23, 1	19, 5	20, 4
2 месяца	23, 3	21, 6	22, 0
3 месяца	24, 9	22, 6	23, 1
4 месяца	24,2	22, 0	20, 7
5 месяцев	22,2	22,7	24, 5
б месяцев	27,1	22, 9	21, 6
9 месяцев	27, 0	24, 8	23

Неадсорбированный РКР-Т (мкг/мл) в составе, хранящемся во
флаконах (серии 312-313-314) при + 5°С
Время, прошедшее после операции
формулирования
0	22,	6 20, 0	21, 0
4 месяца	21,	1 21, 1	19, 8
5 месяцев	23,	0 19, 6	18, 6
7 месяцев	23,	1 21, 0	19, 5

10 месяцев	25, 0	23, 4	21, 8
13 месяцев	24, 6	22, 6	20, 8
16 месяцев	23, 5	22,3	20, 8
22 месяца	23, 9	22, 0	19, 9

Для сравнения также в течение определенного периода времени тестировали адсорбцию НВзАд, содержащегося в трех сериях конечного нефасованного продукта (ΡΌΝ5-6-7), а также в трех сериях распределенного по флаконам (§ 44-45-46), жидкого препарата, состоящего из аналогичных антигенов, но получаемого способом линейного формулирования, описанного на фиг. 1, и таким образом отличающегося от способа, описанного в примере выше. Этот препарат содержал в 0,5 мл: 10 мкг НВкЛд, 30 Ь£ Όΐ, 10 Ь£ Τΐ, 25 мкг Ρΐ, 25 мкг РНЛ, 40 Όυ поливируса 1 типа, 8 Όυ поливируса 2 типа, 32 Όυ поливируса 3 типа, 12 мкг ΡΚΡ (в форме ΡΡΡ-Τ), 0,6 мг А1, фосфатные ионы в концентрации 55 ммоль/л, карбонатные ионы в концентрации 20 ммоль/л, Τήδ-сахарозный буфер в концентрации 2,5 ммоль/л относительно Τήδ и 2,125% относительно сахарозы и 14 мкг катионных аминокислот (Н15-Агд-Бу5). получаемых из среды М199 (валентность полиомиелита), рН 6,8-7,2.

Получаемые результаты были такими, как указано ниже.

Процент адсорбции НВдАд в составе конечного нефасованногс продукта (ΚΏΝ5-6-7) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования	ГРЫ5	ΡΌΝ6	ΡΡΝ7
0	81	85	81
1 месяц	78	82	62
2 месяца	74	78	63
3 месяца	66	84	62
б месяцев	61	77	61

Процент адсорбции НВзАд в составе, хранящемся во флаконах (серии Ξ44-Ξ45-Ξ46) при +5^0
Время, прошедшее после операции формулирования	344	345	346
0	81	85	81

- 9 026058

Количества неадсорбированного РКР-Т, измеряемого в течение аналогичного периода времени, демонстрировали, что существовало небольшое изменение по сравнению с моментом времени 0 и, таким образом, являлось удовлетворительным. Однако эти результаты демонстрируют, что в этом случае, который не относится к составу, получаемому способом по изобретению, поверхностный антиген гепатита В не сохранялся адсорбированным на оксигидроксиде алюминия.

Экспериментальные данные, относящиеся к катионным аминокислотам.

Сравнивали композицию по изобретению, получаемую непосредственно по экспериментальному протоколу, проводимому в предоставленном примере, и композицию, получаемую по протоколу, модифицированному таким образом, что композицию, содержащую только три катионные аминокислоты (Агд-Ьу8-Нт8), заменяли на композицию из 12 незаменимых аминокислот в отношении неадсорбированного количества РКР-Т в конце. Не наблюдали какого-либо различия количества неадсорбированного РКР-Т, таким образом демонстрируя, что важными являются только катионные аминокислоты.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения жидкой вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере: оксигидроксид алюминия (А1ООН);

один поверхностный антиген гепатита В (НВкАд);

один антиген НаешорЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ь (НФ). состоящий из полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (РКР-Т);

в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на А1ООН, тогда как антиген НФ сохраняется неадсорбированным, согласно которому поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на А1ООН для получения комплекса АЮОН/НВкАд;

указанный комплекс АЮОН/НВкАд смешивают с антигеном НФ в присутствии аминокислот, которые находятся в вакцинной композиции в катионной форме, в концентрации от 100 до 2 мг/мл и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.
2. Способ по п.1, где антиген НВкАд адсорбируют на алюминии смешиванием суспензии А1ООН с суспензией НВкАд при перемешивании в течение по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, предпочтительно от 20 до 24 ч.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что катионные аминокислоты добавляют к указанному комплексу АЮОН/НВкАд до смешивания с антигеном НФ.
4. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что катионные аминокислоты добавляют к указанному антигену НФ до смешивания с комплексом АЮОН/НВкАд.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фосфатные ионы добавляют к указанному комплексу АЮОН/НВкАд до смешивания с антигеном НФ.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что рН препарата, содержащего комплекс АЮОН/НВкАд, доводят до 7,1+0,1 до смешивания с антигеном НФ.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что он также включает получение композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, выбранный из антигенов дифтерии, столбняка, полиомиелита и коклюша, а также оксигидроксид алюминия;

смешивание указанного комплекса АЮОН/НВкАд с указанной композицией до проведения смешивания с антигеном НФ.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что он включает получение указанной композиции путем последовательного добавления каждого из антигенов к суспензии оксигидроксида алюминия и перемешивания после добавления каждого антигена.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что

НВкАд адсорбируют на частичном количестве А1ООН, представляющем одну треть от общего А1ООН, содержащегося в конечной композиции, в течение периода от 20 до 24 ч для получения комплекса АЮОН/НВкАд;

параллельно на дополнительном количестве А1ООН последовательно адсорбируют дифтерийный

- 10 026058 токсин Ό, столбнячный токсин Т, очищенный токсин ΡΤχά Вогбс1с11а рет1и88, в свою очередь, предварительно адсорбированный на А1ООН, и фимбриальный гемагглютинин РИА ВоМе1е11а репи8818, в свою очередь, предварительно адсорбированный на А1ООН, затем к ним добавляют фосфатные ионы, затем к ним добавляют комплекс АЮОН/НВкАд;

снова добавляют фосфатные ионы в количестве, обеспечивающем получение концентрации в конечной композиции 40 ммоль/л;

добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту в количестве, обеспечивающем получение концентрации в конечной композиции по меньшей мере 100 мг/л;

рН доводят до 7,1±0,1;

добавляют антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов 1 типа 1 и/или 2 типа, и/или 3 типа;

добавляют антиген НЪ; рН доводят до 7,1+0,1;

получаемую композицию распределяют в шприцы или во флаконы.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что в промышленном масштабе получают по меньшей мере 250 л вакцинной композиции.
11. Вакцинная композиция, полученная способом по любому из пп.1-10 и содержащая, по меньшей мере, оксигидроксид алюминия (А1ООН), поверхностный антиген гепатита В (НВкАд) и антиген Ηίό. который состоит из полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (ΡΚΡ-Τ).
12. Вакцинная композиция по п.11, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антигены дифтерии, столбняка, полиомиелита и коклюша.
13. Вакцинная композиция по любому из пп.11 или 12, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере:

поверхностный антиген гепатита В, НВкАд; антиген дифтерии в форме дифтерийного токсина Ό; антиген столбняка в форме столбнячного токсина Т;

антигены коклюша в форме очищенного токсина (ΡΤχά) и фимбриального гемагглютинина (РНА); антиген НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае типа Ъ в форме полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (ΡΚΡ-Τ);

антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов, выбираемых из типов 1, 2 и 3.
14. Вакцинная композиция по п.13, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере: от 10 до 30 мкг НВкАд/мл, предпочтительно 20 мкг/мл;

от 40 до 80 Ы Ό/мл, предпочтительно от 50 до 70 Ы/мл; от 10 до 50 Ы Т/мл, предпочтительно от 10 до 30 Ы/мл; от 40 до 60 мкг РНА/мл, предпочтительно 50 мкг/мл; от 40 до 60 мкг ΡΤχά/мл, предпочтительно 50 мкг/мл;

от 2 до 60 мкг ΡΚΡ/мл, предпочтительно 20-24 мкг/мл в форме конъюгата ΡΡΡ-Τ; от 1 до 2 мг А1ООН/мл, предпочтительно 1,2 мг А1ООН/мл; от 35 до 45 ммоль/л, предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л фосфатных ионов; от 100 до 1000 мг/л катионных аминокислот, предпочтительно от 400 до 800 мг/л;

1, 2 и 3 типы поливируса в инактивированной форме в соответствующем количестве 80, 16 и

64 Όυ/мл, где Ы обозначает предел флокуляции.