RS50371B - 4-pirimidinil-n-acil-l-fenilalanini - Google Patents

Description

Vaskularni (sudovni) ćelijski adhezioni molekul-1 (VCAM-1), član familije supergena imunoglobulina (Ig), ekspresira (istiskuje) se na aktiviranom ali ne na mirujućem endotelu. Integrin VLA-4 (a4pi) , koji se ekspresira (istiskuje) na mnogim tipovima ćelija uključujući cirkulišuće limfocite (iz krvotoka), ezinofile, bazofile i monocite, ali ne i neutrofile, je glavni receptor za VCAM-1. Antitela za VCAM-1 ili VLA-4 mogu blokirati adheziju ovih mononuklearnih leukocita, kao i ćelija melanoma, za aktiviran endotelin vitro.Antitela za bilo koji protein su bila efektivna pri inhibiranju infiltracije leukocita i sprečavanju razaranja tkiva u nekoliko animalnih (životinjskih) modela zapaljenja. Pokazano je da anti-VLA-4 monoklonalna antitela blokiraju T-ćelijsku emigraciju u adjuvansom (pomoćnim sredstvom) indukovanom artritisu, sprečavaju akumulaciju ezinofila i bronhokonstrikciju u modelima astme i smanjuju paralizu i inhibiraju infiltriranje monocita i limfocita u eksperimentalnom autoimunom encefalitisu (EAE). Pokazano je da anti-VCAM-1 monoklonalna antitela produžuju vreme preživljavanja kardijačnih alografa. Nedavna proučavanja su pokazala da anti-VLA-4 monoklonalna antitela mogu sprečiti insulitis i dijabetes u dijabetskim miševima koji nisu gojazni, i znatno smanjiti zapaljenje u modelu kolitisa kod tamarina (marmoseta) sa vrhova pamučnog drveta. Dalje je pokazano da se VCAM ekspresira (istiskuje) na endotelnim ćelijama zapaljivog kolonskog tkiva u TNB/etanolskom pacovskom modelu zapaljive bolesti creva( Gastroenterology116

(1999) 874-883) .

Na taj način, jedinjenja koja inhibiraju interakciju između integrina koji sadrže014i VCAM-1 će biti prikladna kao terapijski agensi za lečenje hroničnih zapaljivih bolesti kao što su reumatoidni artritis (RA), multipla skleroza (MS), astma i zapaljiva bolest creva (IBD). Jedinjenja data ovim pronalaskom imaju ovaj efekat.

Kao što se upotrebljeva u ovoj specifikaciji, termin "halogen" označava bilo koji od četiri halogena, brom, hlor, fluor i jod ukoliko nije drugačije ukazano. Pogodni halogeni su brom, fluor i hlor.

Termin "niži alkil", sam ili u kombinaciji, označava pravolančanu ili račvastu alkil-grupu koja sadrži maksimalno šest C-atoma, kao što su metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, sek-butil, izobutil, terc-butil, n-pentil, n-heksil i slično.

Termin "supstituisan niži alkil" označava nižu alkil-grupu kao što je gore definisana koja je supstituisana jednom ili više grupa nezavisno odabranih između cikloalkila, nitro-grupe, ariloksi, arila, hidroksi, halogena, cijan-grupe, niže alkoksi-grupe, nižeg alkanoila, nižeg alkiltio, nižeg alkilsulfinila, nižeg alkilsulfonila, amino i mono- ili di-niži alkilamino-grupe. Primeri supstituisanih nižih alkil-grupa uključuju 2-hidroksietil, 3-oksobutil, cijanmetil i 2-nitropropil.

Termin "perfluor-niži alkil" za svrhe R4, R22i R23označava supstituisanu nižu alkil-grupu kao što je gore definisana koja je metil- ili etil-grupa u kojoj su svi vodonici zamenjeni fluorom, tj. trifluormetil i pentafluoretil.

Termin "niži alkenil" označava alkilensku grupu koja ima 2-10 C-atoma sa dvostrukom (dvogubom) vezom lociranom između bilo koja dva susedna C-atoma.

Termin "cikloalkil" označava nesupstituisani ili supstituisani tročlani do sedmočlani karbociklični prsten. Prikladni supstituenti prema ovom pronalasku su hidroksi, halogen, cijan, niži alkoksi, niži alkanoil, niži alkil, aroil, niži alkiltio, niži alkilsulfinil, niži alkilsulfonil, aril, heteroaril i supstituisan amino.

Termin "niži alkoksi" označava pravolančanu ili račvastu alkoksi-grupu koja sadrži maksimalno šest C-atoma, kao što je metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, terc-butoksi i slično.

Termin "niži alkiltio" označava nižu alkil-grupu koja je vezana za ostatak molekula preko dvovalentnog atoma sumpora, na primer, metil-merkapto- ili izopropil-merkapto-grupu. Termin "niži alkilsulfinil" označava nižu alkil-grupu kao što je gore definisana koja je vezana za ostatak molekula preko atoma sumpora u sulfinil-grupi. Termin "niži alkilsulfonil" označava nižu alkil-grupu kao što je gore definisana koja je vezana za ostatak molekula preko atoma sumpora u sulfonil-grupi.

Termin "aril" označava mono- ili bicikličnu aromatičnu grupu, kao što je fenil ili naftil, koja je nesupstituisana ili supstituisana sa uobičajenim supstituentskim grupama. Pogodni supstituenti su niži alkil, niži alkoksi, hidroksi-niži alkil, hidroksi, hidroksialkoksi, halogen, niži alkiltio, niži alkilsulfinil, niži alkilsulfonil, cijan, nitro, perfluoralkil, alkanoil, aroil, arilalkinil, niži alkinil i niži alkanoilamino. Primeri aril-grupa koje se mogu koristiti prema ovom pronalasku su fenil, p-tolil, p-metoksifenil, p-hlorfenil, m-hidroksifenil, m-metiltio-fenil, 2-metil-5-nitrofenil, 2,6-dihlorfenil, 1-naftil i slično.

Termin "arilalkil" označava nižu alkil-grupu kao što je gore definisana u kojoj su jedan ili više atoma vodonika zamenjeni aril- ili heteroaril-grupom kao što je gore definisana. Bilo koja uobičajena aralkil-grupa može se koristiti prema ovom pronalasku, kao što je benzil i slično.

Termin "heteroaril" označava nesupstituisani ili supstituisani petočlani ili šestočlani monociklični heteroaromatični prsten ili devetočlani ili desetočlani biciklični heteroaromatični prsten koji sadrži 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma koji su nezavisno jedan od drugog odabrani između N, S ili 0. Primeri heteroaril-prstenova su piridin, benzimidazol, indol, imidazol, tiofen, izohinolin, hinazolin i slično. Supstituenti kao što su gore definisani za "aril" su uključeni u definiciju heteroarila.

Termin "niži alkoksikarbonil" označava nižu alkoksi-grupu koja je vezana za ostatak molekula preko karbonilne grupe. Primeri alkoksikarbonil-grupa su etoksikarbonil i slično.

Termin "niži alkilkarboniloksi" označava niži alkilkarboniloksi-grupu koja je vezana za ostatak molekula preko atoma kiseonika, na primer, acetoksi-grupu. Termin "aciloksi" ima isto značenje.

Termin "niži alkanoil" označava nižu alkil-grupu koja je vezana za ostatak molekula preko karbonilne grupe i u smislu prethodne definicije obuhvata grupe kao što su acetil, propionil i slično. Termin "perfluor-niži alkanoil" označava perfluor-nižu alkil-grupu (supstituisanu nižu alkil-grupu u kojoj su svi vodonici zamenjeni fluorom, pogodno trifluormetil- ili pentafluoretil-grupu) koja je vezana za ostatak molekula preko karbonilne grupe.

Termin "perfluor-niži alkanoilamino" označava perfluor-nižu alkanoil-grupu koja je vezana za ostatak molekula preko amino grupe.

Termin "niži alkilkarbonilamino" označava niže alkilkarbonil-grupe koje su vezane za ostatak molekula preko atoma azota, kao što je acetilamino. Termin "niži alkilaminokarbonil" označava niže alkilamino-grupe koje su vezane za ostatak molekula preko karbonilne grupe.

Termin "arilaminokarbonil" označava aril-grupe koje su vezane za amino-grupu koja je dalje vezana za ostatak molekula preko karbonilne grupe.

Termin "aroil" označava mono- ili bicikličnu aril-ili heteroaril-grupu koja je vezana za ostatak molekula preko karbonilne grupe. Primeri aroil-grupa su benzoil, 3-cijanbenzoil, 2-naftoil, nikotinoil i slično.

Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u ovoj oblasti nauke i tehnike i mogu se napraviti pomoću uobičajenih metoda uzimajući u obzir hemijsku strukturu ovog jedinjenja. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli za kiselinska jedinjenja su soli alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala, kao što su soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma, zatim soli baznih amina ili baznih amino-kiselina, potom amonijumove ili alkilamonijumove soli. Naročito poželjne soli za jedinjenja data ovim pronalaskom su natrijumove soli, npr., soli kiselinskog jedinjenja u kojem R6označava vodonik. Natrijumova so neke kiseline data ovim pronalaskom se lako dobiva iz kiseline tretiranjem natrijum-hidroksidom. Za bazna jedinjenja, primeri su soli neorganskih ili organskih kiselina, kao što su hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, azotna, fosforna, limunska, mravlja, fumarna, maleinska, sirćetna, ćilibarna, vinska, metansulfonska i p-toluensulfonska kiselina.

U jednom oličenju ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I:

i njegove farmaceutski prihvatljive soli. Prema ovom pronalasku Rioznačava grupu Y-l, Y-2 ili Y-3 kao što su dole opisane:

Rioznačava grupu formule Y-l:

u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik, niži alkil, niži alkoksi, cikloalkil, aril, arilalkil, nitro, cijan, niži alkiltio, niži alkilsulfinil, niži alkilsulfonil, niži alkanoil, halogen ili perf luor-niži alkil i najmanje jedan od R22i R23

• je različit od vodonika i R24označava vodonik, niži alkil, niži alkoksi, aril, nitro, cijan, niži alkilsulfonil ili halogen, ili

Rioznačava grupu formule Y-2, koja označava petočlani ili šestočlani heteroaromatični prsten koji je vezan preko atoma ugljenika za amidni karbon.il pri čemu pomenuti prsten sadrži jedan, dva ili tri heteroatoma odabrana.iz grupe koja še sastoji od N, 0 -i S i jedan ili dva atoma pomenutog prstena su nezavisno supstituisani nižim alkilom, cikloalkilom, halogenom, cijan-grupom, perfluoralkilom ili arilom i najmanje jedan od pomenutih supstituisanih atoma je susedan atomu ugljenika vezanom za amidni karbonil, ili

Rioznačava grupu formule Y-3 koja označava tročlani do sedmočlani prsten formule:

u kojoj R25označava niži alkil, nesupstituisan ili fluorom supstituisan niži alkenil ili grupu formule R26-(CH2)e-, pri čemu R26označava aril, heteroaril, azido, cijan, hidroksi, niži alkoksi, niži alkoksikarbonil, niži alkanoil, niži alkiltio, niži alkilsulfonil, niži alkilsulfinil, perfluor-niži

alkanoil, nitro ili R26označava grupu formule

-NR28R29, u kojoj R28označava vodonik ili niži alkil, R29označava vodonik, niži alkil, niži alkoksikarbonil, niži alkanoil, aroil, perfluor-niži alkanoilamino, niži alkilsulfonil, niži alkilamino-karbonil, arilaminokarbonil, ili

R28i R2g uzeti zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju četvoro-, peto- ili šestočlani zasićeni heterociklični prsten koji opciono sadrži jedan dodatni heteroatom odabran između 0, S i N-R40,.

Q označava -(CH2)fO-, -(CH2)fS-, - (CH2) fN (R27)-,

-(CH2)f<->,

R27označava vodonik, niži alkil,aril,niži 'alkanoil, aroil ili niži alkoksikarbonil,

R40označava vodonik, niži alkil, aril, niži alkanoil, aroil ili niži alkoksikarbonil,

atomi ugljenika u prstenu su nesupstituisani ili supstituisani nižim alkilom ili halogenom,

e je ceo broj od 0 do 4 i

f je ceo broj od 0 do 3,

R2označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži

alkil, arilalkil ili aril,

R3označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži

alkil, arilalkil ili aril,

R4označava vodonik, halogen, niži alkil, supstituisan niži alkil (kao što je perfluor-niži alkil) ili aril,

R5označava vodonik, niži alkil, hlor ili niži alkoksi,

R6označava vodonik, niži alkil, niži alkilkarboniloksi-niži alkil, supstituisan niži alkil iliReoznačava grupu formule P-3:

u kojoj R32označava vodonik ili niži alkil, R33označava vodonik, niži alkil, aril, R34označava vodonik ili niži alkil, h je ceo broj od 0 do 2, g je ceo broj od 0 do 2, pri čemu zbir h i g iznosi 1 do 3, .

ili Reoznačava grupu formule P-4 :

u kojoj su R32, g i h definisani kao što je gore dato, Q' označava 0, S, -(CH2)j- ili grupu formule N-R35, u kojoj R35označava vodonik, niži alkil, niži alkanoil, niži alkoksikarbonil, j je 0, 1 ili 2.

Jedinjenja data ovim pronalaskom mogu postojati kao stereoizomeri i diastereomeri, pri čemu su svi oni obuhvaćeni unutar opsega ovog pronalaska. Svako od ovih jedinjenja koja su pomenuta u gore i dole datim različitim oličenjima razmatra se (ima se u vidu) i u njegovom farmaceutski prihvatljivom obliku soli.

U prvom naročitom oličenju jedinjenja formule I

R2označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil, arilalkil ili aril,

R3označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil, arilalkil ili aril i

R4označava vodonik, niži alkil, perfluor-niži alkil ili aril.

U drugom naročitom oličenju jedinjenja formule I R2označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril,

R3označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril i

R4označava vodonik, halogen, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril.

U trećem naročitom oličenju jedinjenja formule I i njegovom gore pomenutom prvom i drugom oličenju, prvenstveno prvom naročitom oličenju,

R.2označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril,

R3označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril i

R4označava vodonik, niži alkil, perfluor-niži alkil ili aril.

U pogodnom oličenju jedinjenja formule I i njegova tri gore pomenuta naročita oličenja, prvenstveno u trećem naročitom oličenju, R4označava vodonik, niži alkil ili perfluor-niži alkil.

U pogodnijem oličenju jedinjenja formule I i njegova tri gore pomenuta naročita oličenja, prvenstveno u prvom naročitom oličenju, Rioznačava grupu formule Y-l kao što je definisana u formuli I i R22 i R23 nezavisno jedan od drugog označavaju niži alkil ili halogen i R24označava vodonik. U drugom pogodnijem oličenju, Rioznačava grupu formule Y-l kao što je definisana u formuli I i R22 i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik ili halogen i R24označava niži alkoksi, prvenstveno metoksi.

Drugo pogodnije oličenje jedinjenja formule I i njegova naročita oličenja predstavljaju Rikao grupu formule Y-3 kao što je definisana u formuli I u kojoj R25označava grupu formule R26-(CH2)e- u kojoj R26 označava niži alkoksi, Q označava -(CH2)f-, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3, prvenstveno 2.

Drugo pogodnije oličenje jedinjenja formule I i njegova naročita oličenja je jedinjenje formule lb:

u kojoj je Ridefinisan kao što je dato u formuli I, R2označava niži alkil, R3označava niži alkil, R4označava vodonik, perfluor-niži alkil ili niži alkil, R5 označava vodonik ili niži alkil i R5označava vodonik, niži alkil, pogodno metil, niži alkilkarboniloksi-niži alkil, prvenstveno 1-(acetoksi)etil, grupu P-3 kao što je definisana u formuli I ili grupu P-4 kao što je definisana u formuli I. U okviru ovog pogodnijeg oličenja, naročito je pogodno da Rxoznačava grupu formule Y-l kao što je definisana u formuli I, pri čemu R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju perfluor-niži alkil, prvenstveno trifluormetil; niži alkil, prvenstveno metil, etil, propil ili izopropil; ili halogen, prvenstveno fluor, hlor ili brom i R24označava vodonik.

Kada Rioznačava naročito pogodnu grupu formule Y-l kao što je definisana u prethodnom paragrafu, pogodno je da i) R2i R3označavaju niži alkil, R4označava vodonik ili niži alkil i R5i R6označavaju vodonik, ili ii) R2i R3označavaju niži alkil, R4označava vodonik ili niži alkil, R5označava vodonik i R6označava vodonik, niži alkil ili niži alkilkarboniloksi-niži alkil ili R6označava grupu formule P-3 kao što je definisana u formuli I ili R6označava grupu formule P-4 kao što je definisana u formuli I (pogodno R35 označava vodonik), naročito gde R6označava niži alkil ili R6označava niži alkilkarboniloksi-niži alkil ili R6označava grupu formule P-3 u kojoj R32označava vodonik, R33i R34označavaju niži alkil, h je 1 i g je 0 ili R6označava grupu formule P-4 u kojoj R32označava vodonik, h je 1, g je 0 i Q' označava 0 ili iii) R2i R3označavaju niži alkil, R4označava perfluor-niži alkil i R5i R6označavaju vodonik ili iv)

R2i R3označavaju niži alkil, R4označava vodonik, R5označava niži alkil i R6označava vodonik.

Naročita jedinjenja u vezi sa pogodnim oličenjem i) koje je pomenuto u prethodnom paragrafu su odabrana između sledećih jedinjenja

N-[ (2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[ (2-brom-6-metilf enil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[(2-etil-6-metilfenil)karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-điokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin

N-[[2- (2-metiletil) -6-metilfenil]karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[ (2, 6-dif luorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[[2-f luor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[[2, 6-di- (2-metiletil) fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[(2-hlor-6-etilfenil)karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[ (2-hlor-6-propilf enil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[[2-hlor-6- (2-metiletil) fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidin.il) -L-fenilalanin,

N-[(2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin.

Druga jedinjenja su odabrana iz grupe sledećih jedinjenja

N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin,

N-[ (2-brom-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin ili

N-[ (2-brom-5-metoksif enil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin.

Naročita jedinjenja koja su u vezi sa gore datim ii) u kojima R6označava niži alkil odabrana su između sledećih jedinjenja

etil-estar N-[(2, 6-dihlorfenil)karboni1]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina,

etil-estar N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina ili

etil-estar N-[(2, 6-difluorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina,

u kojima R6označava niži alkilkarboniloksi-niži alkil, naročita jedinjenja su odabrana između sledećih jedinjenja

1-(acetoksi)etil-estar N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina,

1-(acetoksi)etil-estar N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina ili

1- (acetoksi)etil-estar N-[ (2,6-difluorfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina,

u kojima R6označava grupu formule P-3, naročita jedinjenja su odabrana između sledećih jedinjenja

2- [(N,N-dietil) amino]etil-estar N-[ (2, 6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2, 4-điokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina,

2-[(N,N-dietil) amino]etil-estar N-[ (2-hlor-6-metil-fenil)karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina ili

2-[(N,N-dietil) amino]etil-estar N-[(2, 6-difluorfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina,

u kojima R6označava grupu formule P-4, naročita jedinjenja su odabrana između sledećih jedinjenja

2-(4-morfolino)etil-estar N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina ili

2-(4-morfolino)etil-estar N-[(2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina.

Naročita jedinjenja koja su u vezi sa gore datim iii) su odabrana između sledećih jedinjenja

N-[l-(2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanin,

N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6- (trif luormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanin ili

N-[[2-fluor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanin.

Naročita jedinjenja u vezi sa gore datim iv) su odabrana između sledećih jedinjenja

N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-meti1-L-fenilalanin,

N-[ (2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanin ili

N-[(2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanin.

U jedinjenjima ovog pronalaska gore definisane formule lb, u kojoj je Ridefinisan kao što je dato u formuli I, R2označava niži alkil, R3označava niži alkil, R4označava vodonik, perfluor-niži alkil ili niži alkil, R5označava vodonik ili niži alkil i R6označava vodonik, niži alkil, niži alkilkarboniloksi-niži alkil, grupu formule P-3 kao što je definisana u formuli I ili grupu formule P-4 kao što je definisana u formuli I, takođe je pogodno da Rioznačava grupu formule Y-3 kao što je definisana u formuli I, pri čemu R25označava grupu formule R26~(CH2)e-u kojoj R26označava niži alkoksi, Q označava -(CH2)f-, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3. U takvim jedinjenjima je pogodno da R2i R3označavaju niži alkil, R4označava vodonik ili niži alkil i R5i R6označavaju vodonik.

Naročita jedinjenja u vezi sa ovim su

4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-N-[[l-(2-metoksietil) ciklopenti 1]karbonil]-L-f enilalanin,

N-[[l- (2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin ili

4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-N-[[1- (2-metoksietil) ci kl opent i 1] karboni l]-L-f enilalanin.

U drugoj grupi jedinjenja ovog pronalaska formule lb:

u kojoj je Ridefinisan kao što je dato u formuli I, R2označava niži alkil, R3označava niži alkil, R4označava vodonik, perfluor-niži alkil ili niži alkil, R5označava vodonik ili niži alkil iRsoznačava vodonik, niži alkil, niži alkilkarboniloksi-niži alkil, grupu formule P-3 kao što je definisana u formuli I ili grupu formule P-4 kao što je definisana u formuli I, naročito je pogodno da R2i R3označavaju niži alkil i R4, R5i R6označavaju vodonik, naročito gde Rioznačava grupu formule Y-l kao što je definisana u formuli I, prvenstveno gde R22 i R23nezavisno jedan od drugog označavaju niži alkil ili halogen i R24označava vodonik ili gde R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik ili halogen i R24označava niži alkoksi.

U jedinjenju iz prethodnog paragrafa gde R2i R3označavaju niži alkil i R4, R5i R6označavaju vodonik, takođe je pogodno da Rioznačava petočlani ili šestočlani heteroaromatični prsten koji je vezan preko C-atoma za amidni karbonil pri čemu pomenuti prsten sadrži jedan, dva ili tri heteroatoma odabrana iz grupe koja se sastoji od N, 0 i S i jedan ili dva atoma pomenutog prstena su nezavisno jedan od drugog supstituisani nižim alkilom, cikloalkilom, halogenom, cijan-grupom, perfluoralkilom ili arilom i najmanje jedan od pomenutih supstituisanih atoma je susedan C-atomu vezanom za amidni karbonil.

U jedinjenju iz pretposlednjeg paragrafa gde R2i R3označavaju niži alkil i R4, R5i R6 označavaju vodonik, takođe je pogodno da Rioznačava grupu formule Y-3 kao što je definisana u formuli I, prvenstveno gde R2soznačava grupu formule R26"(CH2)e- u kojoj R26označava niži alkoksi, Q označava -(CH2)f-, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3, prvenstveno 2.

U drugom oličenju onog oličenja jedinjenja formule I, u kojem R2označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril, R3označava vodonik, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril i R4označava vodonik, halogen, niži alkil, supstituisan niži alkil ili aril, tj., drugog naročitog oličenja, pogodno Rioznačava Y-l pri čemu su R22i R23 definisani kao u formuli I. Pogodno R22i R23 nezavisno jedan od drugog označavaju niži alkil ili halogen i R24označava vodonik, ili R22i R23 nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik ili halogen i R24označava niži alkoksi.

U drugom oličenju drugog naročitog oličenja jedinjenja formule I, Rioznačava Y-2. U daljem oličenju drugog naročitog oličenja, Rioznačava Y-3, naročito u kojem R25 označava grupu formule R26-(CH2)e- u kojoj R26označava niži alkoksi, Q označava -(CH2)f-, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3, prvenstveno 2.

U specifičnijem oličenju drugog naročitog oličenja jedinjenja formule I,

R2označava niži alkil,

R3označava niži alkil,

R4označava vodonik, niži alkil ili halogen,

R5označava vodonik i

R6označava vodonik.

Pogodno oličenje u okviru ovog specifičnijeg oličenja jedinjenja formule I je ono u kojem R4označava vodonik. U okviru ovog pogodnog oličenja Rioznačava Y-l kao što je definisana u formuli I, naročito u kojem su R22i R23nezavisno jedan od drugog niži alkil ili halogen i R24je vodonik ili u kojem su R22i R23nezavisno jedan od drugog vodonik ili halogen i R24je niži alkoksi. Sa ovim u ovom pogodnom oličenju Rije takođe opciono Y-2 kao što je definisano u formuli I ili je Rxopciono takođe Y-3 kao što je definisano u formuli I, naročito pri čemu u Y-3 R25označava grupu formule R26-(CH2)e- u kojoj R26označava niži alkoksi, Q označava -(CH2)f-, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3, prvenstveno 2.

Dodatno, pogodno oličenje ovog pronalaska je jedinjenje formule I:

u kojoj Rioznačava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik, niži alkil, niži alkoksi, cikloalkil, aril, arilalkil, nitro, cijan, niži alkiltio, niži alkilsulfinil, niži alkilsulfonil, niži alkanoil, halogen ili perf luor-niži alkil i najmanje jedan' od R22i R23je različit od vodonika i R24označava vodonik, niži alkil, niži alkoksi, aril, nitro, cijan,. niži alkilsulf onil ili halogen, R2 označavaniži alkil,R3označava nižialkil, R4označava vodonik ili niži alkil, R5označava vodonik i R6. označava vodonik. Pogodnije oličenje u okviru gornjeg oličenja ovog pronalaska je jedinjenje gore date formule I u kojoj Rioznačava grupu formule Y-l

u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik, niži alkil ili halogen, R24označava vodonik ili niži alkoksi, R2 označava niži alkil, R3 označava niži alkil, R4 označava vodonik ili niži alkil, R5 označava vodonik i R6 označava niži alkil, niži alkilkarboniloksi-niži alkil ili prvenstveno vodonik.

Drugo pogodno oličenje ovog pronalaska je jedinjenje gore date formule I u kojoj Rioznačava petočlani ili šestočlani heteroaromatični prsten koji je preko atoma ugljenika vezan za amidni karbonil pri čemu pomenuti prsten sadrži jedan, dva ili tri heteroatoma odabrana iz grupe koja se sastoji od N, 0 i S i jedan ili dva atoma pomenutog prstena su nezavisno jedan od drugog supstituisani nižim alkilom, cikloalkilom, halogenom, cijan-grupom, perfluoralkilom ili arilom i najmanje jedan od pomenutih supstituisanih atoma je susedan atomu ugljenika vezanom za amidni karbonil, R2označava niži alkil, R3označava niži alkil, R4označava vodonik, perfluor-niži alkil ili niži, alkil, R5označavavodonik i Reoznačava vodonik.

Drugo pogodno oličenje ovog pronalaska' je jedinjenje. gore date formule I u kojoj Rioznačava grupu formule Y-3 koja označava tročlani do sedmočlani prsten formule:

u kojoj R25označava niži alkil, nesupstituisani ili fluorom supstituisani niži alkenil ili grupu formule R26-(CH2)e-, pri čemu R26označava aril, heteroaril, azido, cijan, hidroksi, niži alkoksi, niži alkoksikarbonil, niži alkanoil, niži alkiltio, niži alkilsulfonil, niži alkilsulfinil, perfluor-niži alkanoil, nitro ili R26označava grupu formule -NR2sR29rpri čemu R28označava vodonik ili niži alkil, R2g označava vodonik, niži alkil, niži alkoksikarbonil, niži alkanoil, aroil, perfluor-niži alkanoilamino, niži alkilsulfonil, niži alkilamino-karbonil, arilaminokarbonil ili R2ei R29uzeti zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju četvoro-, peto- ili šestočlani zasićeni heterociklični prsten koji opciono sadrži jedan dodatni heteroatom odabran između 0, S i N-R40, Q označava -(CH2)fO-, -

(CH2)fS-, - (CH2) fN (R27)"(CH2)f-, R27označava vodonik, niži alkil, aril, niži alkanoil, aroil ili niži alkoksikarbonil, R40označava vodonik, niži alkil, aril, niži alkanoil, aroil ili niži alkoksikarbonil, atomi ugljenika u prstenu su nesupstituisani ili supstituisani nižim alkilom ili halogenom, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3, R2označava niži alkil, R3označava niži alkil, R4označava vodonik, perfluor-niži alkil ili niži alkil, R5označava vodonik i R6označava vodonik.

Pogodnije oličenje ovog pronalaska je jedinjenje gore.date formule I u kojoj Rioznačava grupu formule Y-3 koja.označava tročlani do sedmočlani prsten formule:

u kojoj R25označava grupu formuleR26- (CH2) e-,pri čemu R26označava niži alkoksi, Q označava -(CH2)f-, e je ceo broj od 0 do 4 i f je ceo broj od 0 do 3, R2označava niži alkil, R3označava niži alkil, R4označava vodonik, perfluor-niži' alkil ili niži alkil, R5označava vodonik i Reoznačava vodonik. U drugom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja formule II u kojoj su R2- ■ R5 definisani kao što je dato u formuli I i Pii P2svaki označava zaštitnu grupu. Specifičnije, Pioznačava standardnu zaštitnu grupu za azot kao što je terc-butiloksikarbonil- (Boe) ili karbobenziloksi-grupa . i P2 označava standardnu zaštitnu grupu za karboksi-grupu . kao š.to su niži alkil ili supstituisani niži alkil. Ova jedinjenja su prikladni intermedijeri u dobivanju jedinjenja formule I.

Jedinjenja data ovim pronalaskom inhibiraju vezivanje-VCAM-1 i fibronektina za VLA-4 na cirkulišućim limfočitima, ezinofilima, bazofilima i monocitima ("ćelijama koje istiskuju (ekspresuju) VLA-4"). Poznato je da je vezivanje VCAM-1 i fibronektina za VLA-4 na takvim ćelijama implicirano u nekim bolesnim stanjima, kao što su reumatoidni artritis, multipla skleroza, zapaljiva bolest creva i naročito u vezivanju ezinofila za endotel vazdušnog puta koji doprinosi prouzrokovanju zapaljenja pluća koje se dešava u astmi. Na taj način, jedinjenja data ovim pronalaskom su prikladna za lečenje astme.

Na bazi njihove sposobnosti da inhibiraju vezivanje VCAM-1 i fibronektina za VLA-4 na cirkulišućim limfocitima, ezinofilima, bazofilima i monocitima, jedinjenja data ovim pronalaskom mogu se primeniti kao lek ili kao farmaceutska smeša naročito za lečenje poremećaja za koje je poznato da su u vezi sa takvim vezivanjem ili su posredovani takvim vezivanjem. Primeri takvih poremećaja su reumatoidni artritis, multipla skleroza, astma i zapaljiva bolest creva. Jedinjenja data ovim pronalaskom se pogodno primenjuju u lečenju bolesti koje obuhvataju pulmonarno zapaljenje, kao što je astma. Pulmonarno zapaljenje koje se odigrava u astmi vezano je za aktiviranje i infiltraciju plućnog krila ezinofilima, monocitima i limfocitima koji su aktivirani nekim događajem ili supstancom koji okidaju astmu.

Dalje, jedinjenja data ovim pronalaskom takođe inhibiraju vezivanje VCAM-1 i MadCAM za ćelijski receptor a4,|37, koji je takođe poznat kao LPAM, koji se istiskuje (ekspresira) na limfocitima, ezinofilima i T-ćelijama. Iako precizna uloga interakcije a4,|37 sa različitim ligandima u zapaljivim stanjima kao što je astma, nije potpuno razjašnjena niti se potpuno razume, jedinjenja data ovim pronalaskom koja inhibiraju vezivanje kako receptora a4,(3l tako i receptora a4,p7 su naročito efikasna u animalnim modelima astme. Dalje, rad sa monoklonalnim antitelima za oc4,p7 ukazuje da su jedinjenja koja inhibiraju vezivanje oc4,p7 za MadCAM ili VCAM prikladna za lečenje zapaljive bolesti creva. Ona bi takođe bila prikladna za lečenje drugih bolesti u kojima je implicirano takvo vezivanje kao uzrok bolesne povrede ili simptoma bolesti.

Jedinjenja data ovim pronalaskom se mogu davati oralno, rektalno ili parenteralno, npr., intravenski, intramuskularno, potkožno, intratekalno ili transdermalno (kroz kožu) ili podjezično, ili kao oftalmološki preparati, ili kao aerosol u slučaju pulmonarnog zapaljenja. Primeri oblika davanja su kapsule, tablete, suspenzije ili rastvori za oralno davanje, supozitorije, injekcioni rastvori, kapi za oči, melemi (masti) ili rastvori za sprej.

Pogodan oblik primene je intravensko, intramuskularno, oralno ili inhalaciono davanje. Doziranja u kojima se u efektivnim količinama daju jedinjenja ovog pronalaska zavise od prirode specifičnog aktivnog sastojka, starosti i zahteva pacijenta i načina davanja. Doziranja se mogu odrediti pomoću uobičajenih načina, npr., pomoću kliničkih proba (ispitivanja) sa ograničenim dozama. Na taj način, ovaj pronalazak dalje obuhvata postupak lečenja (tretiranja) domaćina koji pati od neke bolesti u kojem je vezivanje VCAM-1 ili fibronektina za ćelije koje istiskuju (ekspresuju) VLA-4 uzročni faktor u simptomima bolesti ili bolesnoj povredi davanjem količine jedinjenja ovog pronalaska koja je dovoljna da inhibira vezivanje VCAM-1 ili fibronektina za ćelije koje istiskuju (ekspresuju) VLA-4 tako da se smanje gore pomenuti simptomi ili gore pomenuta povreda. Uopšte su pogodna doziranja od oko 0,1-100 mg/kg telesne težine na dan, pri čemu su naročito pogodna doziranja od 1-25 mg/kg telesne težine na dan a sasvim specijalno su pogodna doziranja od 1-10 mg/kg telesne težine na dan.

Sa drugog aspekta ovaj pronalazak se dalje odnosi na lekove ili farmaceutske smeše koje sadrže farmaceutski efektivnu količinu jedinjenja datog ovim pronalaskom i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za dobivanje farmaceutske smeše koji obuhvata dovođenje jedinjenja datog ovim pronalaskom ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i kompatibilnog farmaceutskog nosača u galenski oblik davanja. Takve smeše mogu biti formulisane pomoću bilo kojeg uobičajenog načina. Tablete ili granulati mogu sadržati niz veziva, punila, nosača ili razblaživača. Tečne smeše mogu biti, na primer, u obliku sterilnog rastvora koji se može mešati sa vodom. Pored aktivnog sastojka, kapsule mogu sadržati punilo ili ugušćivač. Dalje, takođe mogu biti prisutni aditivi za poboljšanje ukusa i mirisa kao i supstance koje se obično upotrebljavaju kao sredstva za čuvanje, stabilizovanje, kvašenje (zadržavanje vlage) i emulgovanje kao i soli za variranje osmotskog pritiska, puferi i drugi aditivi.

Ranije pomenuti noseći materijali i razblaživači mogu sadržati bilo koje uobičajene farmaceutski prihvatljive organske ili neorganske supstance, npr., vodu, želatin, laktozu, škrob, magnezijum-stearat, talk, gumirabiku, polialkilen-glikole i slično.

Oralni jedinični oblici doziranja, kao što su

tablete i kapsule, pogodno sadrže od 25 mg do 1000 mg jedinjenja datog ovim pronalaskom.

Uopšte se jedinjenja data ovim pronalaskom mogu dobiti polazeći od pogodnih derivata fenilalanina preko reakcije 5-halogen-2,4-dioksopirimidona koja je katalizovana paladijumom.

Kao što je prikazano na Reakcionoj shemi 1, derivat 4-jod- ili 4-bromfenilalanina kao što je 1, pretvara se u zaštićen derivat fenilalanina 2 u kojem R5' označava vodonik, hlor, niži alkil ili niži alkoksi, Pioznačava standardnu zaštitnu grupu za azot kao što je Boe ili karbobenziloksi-grupa i P2označava niži alkil ili supstituisan niži alkil koji je odgovarajuće odabran da služi kao zaštitna grupa ili element nekog proleka. Grupa P2se može uvesti pomoću uobičajenog (konvencionalnog) načina koji je blizak stručnjacima koji praktikuju herniju peptida. Redosled dodavanja Pii P2nije kritičan i zavisiće od posebnog izbora reagenasa. Diskusija primene i uvođenja zaštitnih grupa je data u knjizi: Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis,Wiley Interscience, New York, 1991. Alternativno tome, jedinjenje formule 1 može se pretvoriti u jedinjenje formule4,u kojem Ri<1>označava komponentu acil-grupe date ovim pronalaskom. Pogodna metoda je da se prvo uvede estarska grupa P2, čemu sledi reakcija kuplovanja slobodnog amina uz primenu uobičajenih reagenasa za kuplovanje peptida, na primer, HBTU u prisustvu baznog tercijarnog amina kao što je dietilizopropilamin. Ponovo, poseban izbor reagenasa može diktirati menjanje redosleda uvođenja Ri' i P2. Pretvaranje jedinjenja formula 2 ili 4 u derivate 3 ili 5, u kojima M označava supstituisan atom kalaja ili bora, može se realizovati tretiranjem sa pogodnim hemijskim vrstama, na primer, heksametildikalajem, heksabutil-dikalajem ili tetra-alkoksidiborom u prisustvu izvora paladijuma(0). Ova metodologija je iskazana i data sa referencama u knjizi: F. Diedrich and P. J. Stang,Metal Catalyzed Cross Coupling Reactions,Wiley-VCH, Weinheim, Nemačka, 1998.

Pirimidin-2,4-dioni (derivati uracila) formule 6 u kojoj R4' označava vodonik, niži alkil ili perfluor-niži alkil su dobro poznati u literaturi ili se mogu dobiti pomoću poznatih postupaka. 1,3-Disupstituisani pirimidin-2,4-dioni formule 7 u kojima R2<1>i R3' označavaju niži alkil, aril-niži alkil ili aril, takođe su poznata jedinjenja ili se mogu dobiti pomoću standardnih procedura. Publikacije koje saopštavaju sintetičke metode za njihovo konstruisanje uključuju: Shigeo Senda et al.,Chem. Pharm. Buli.22(1974) 189-195,Chem. Pharm. Buli.

20(1972) 1389-1396, i Yasuo Morita et al.,Chem. Comm.1997, 359-360. Za slučaj kada R2' i R3' označavaju niži alkil ili aril-niži alkil, jedinjenja formule 7 se mogu dobiti alkilovanjem jedinjenja formule 6 tretiranjem sa agensima za alkilovanje kao što su jodmetan, benzil-bromid, alil-bromid u prisustvu baze kao što je kalijum-karbonat i opciono, katalizatora za transfer faza. Za manje reaktivne agense za alkilovanje, može biti neophodno da se upotrebi jača baza kao što je alkalnometalni hidroksid i da se reakciona smeša zagreva. Jedinjenja formula 6 ili 7 kao što su gore definisana mogu se halogenovati u položaju 5 tretiranjem sa uobičajenim reagensima za halogenovanje kao što su brom, N-jodsukcinimid ili N-bromsukcinimid u pogodnom rastvaraču kao što je glacijalna sirćetna kiselina ili

vodena sirćetna kiselina dajući halogenpirimidine formule 8, u kojoj X označava Br ili J, R2' i R3<1>nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik, niži alkil, aril-niži alkil ili aril, R4' označava vodonik, niži alkil ili perfluor-niži alkil.

Kao što je prikazano u Reakcionoj shemi 3, jedinjenje formule 8 može se primeniti u reakciji kuplovanja sa derivatom fenilalanina formule 3 ili 5 koja je katalizovana paladijumom. Na primer, kada M označava supstituisan kalaj, tretiranje smeše jedinjenja formule 8 i fenilalanina formule 3 ili 5 sa izvorom paladijuma(0) kao što je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum ili bis-(trifenilfosfin)paladijum-dihlorid u prisustvu inertnog rastvarača kao što je DMF pri temperaturi između sobne temperature i 100°C daje jedinjenje formule 9 ili10.Jedinjenja strukture 9 mogu se pretvoriti u jedinjenja strukture10uklanjanjem zaštitne grupe Pi, što se može izvršiti uobičajenim sredstvima u zavisnosti od izbora Pi. Na primer, ako Pioznačava Boc-grupu, ona se može ukloniti tretiranjem jakom kiselinom, kao što je trifluorsirćetna kiselina, opciono u prisustvu rastvarača kao što je dihlormetan i sredstva za hvatanje (trapovanje). Dobiveni slobodni amin se zatim može acilovati kiselinom formule Ri'CO2H uz primenu uobičajenih tehnika kuplovanja peptida. Na primer, tretiranjem sa HBTU u prisustvu baznog tercijarnog amina kao što je dietilizopropilamin u prisustvu aprotičnog rastvarača kao što je DMF dajući jedinjenje strukture10.

Ako je slobodna kiselina11željeni finalni proizvod, estarska grupa, P2se može ukloniti pomoću uobičajenih sredstava. Na primer, u slučaju da P2označava niži alkil, na primer, metil, on se može ukloniti tretiranjem sa alkalnometalnim hidroksidom, na primer, litijum-hidroksidom, u pogodnom rastvaraču, na primer, vodenom THF koji opciono sadrži metanol da potpomogne rastvorijivost. Ako P2označava benzil- ili supstituisanu benzil-grupu, ona se takođe može ukloniti katalitičkom hidrogenizacijom iznad katalizatora od plemenitog metala, na primer, paladijuma na uglju.

Alternativno tome, kao što je prikazano u Reakcionoj shemi 4, jedinjenje strukture8,u kojoj X označava bromid ili jodid, može se pretvoriti u hemijsku vrstu formule12,u kojoj M' označava supstituisan atom kalaja, bora ili cinka. U slučaju derivata kalaja ili bora, u kojima M' označava supstituisan atom kalaja ili bora, ova konverzija se može vršiti tretiranjem pogodnom hemijskom vrstom, na primer, heksametil-dikalajem, heksabutil-dikalajem ili tetraalkoksidiborom u prisustvu izvora paladijuma(0). Za formiranje cinkovih derivata 12, M' = Žn(halogen), pretvaranje se može izvršiti tretiranjem jedinjenja formule 8, X = J sa izvorom aktiviranog metalnog cinka u pogodnom inertnom rastvaraču,.na primer, dimetila'cetamidu pri temperaturi od sobne temperature do 100°C dok konverzija ne bude potpuna dajući jedinjenje formule12,M' = Zn(halogen). Ova jedinjenja formule12se mogu reagovati sa 4-supstituisanim derivatom fenilalanina formule 4 u kojoj X' označava jod, brom ili trifluormetilsulfoniloksi u prisustvu izvora paladijuma(0) (nula) dajući jedinjenje formule10'.U slučaju kada estarska grupa predstavljena sa P2nije deo ciljnog jedinjenja, ona se može ukloniti uz primenu postupaka hidrolize koji odgovaraju posebnom P2. Na primer, ako P2označava niži alkil, na primer, metil, on se može ukloniti standardnom baznom hidrolizom uz primenu alkalnometalnog hidroksida, na primer, litijum-hidroksida. U varijaciji ove procedure, može biti poželjno da se zaštitna grupa prenosi kroz reakciju kuplovanja i supstituiše u kasnijem periodu. U tom slučaju, jedinjenje formule2',u kojoj Pi' označava niži alkoksikarbonil ili benziloksikarbonil i X' ima gore dato značenje, može se kuplovati sa pirimidin-dionom strukture12dajući jedinjenje strukture9'koje se sa svoje strane može pretvoriti u jedinjenje dato ovim pronalaskom uz primenu opštih procedura koje su gore zabeležene u reakcionoj shemi 3.

Alternativni put do jedinjenja datih ovim pronalaskom, kao što je prikazano u Reakcionoj shemi 5, koja se naročito može primeniti na jedinjenja u kojima je R5' različit od vodonika, je da se konstruiše (izgradi) aldehid formule14.Ovo se može izvršiti reagovanjem jedinjenja formule12sa jedinjenjem formule13,u kojoj Rs' označava niži alkil ili niži alkoksi i X" označava jodidnu, bromidnu ili trifluormetilsulfonil-vrstu i R8označava zaštićen alkohol ili aldehid. Za alkohole, pogodne zaštitne grupe uključuju silil-etre, benzil-etre. Aldehidi se mogu zaštititi kao njihovi acetalni derivati. Jedinjenje formule12se može pretvoriti u aldehid formule 15 konverzionim stupnjevima koji bi, kada je Realkohol, mogli uključivati uklanjanje zaštitne grupe, ako je to neophodno, čemu sledi oksidacija. Za to se može koristiti bilo koji od uobičajenih reagenasa za selektivnu oksidaciju primarnih benzilalkohola do aldehida, na primer, tretiranje sa aktivnim mangan-dioksidom u inertnom rastvaraču. U slučaju kada Rg označava zaštićen aldehid, pretvaranje aldehida formule 15 se može vršiti uklanjanjem pogodne zaštitne grupe, na primer, hidrolizom acetala razblaženom.kiselinom. Reakcija jedinjenja 15 koja daje dehidroamino-kiselinu formule 16 može se vršiti tretiranjem sa Wittigovim reagensom formule 17 u kojoj Pi' označava niži alkoksikarbonil ili benziloksikarbonil i P2ima gore dato značenje. Na primer, tretiranje jedinjenja 15 sa trimetil-estrom (±)-N-(benziloksikarbonil)-a-fosfono-glicina u prisustvu pogodne baze, na primer, tetrametil-guanidina direktno vodi do dehidroamino-kiseline formule16,P2= metil i Pi<1>= benziloksikarbonil. Enantioselektivna redukcija jedinjenja16do L-amino-kiseline18može se vršiti uz primenu većeg broja redukcionih reagenasa pogodnih za tu svrhu, na primer, nedavno opisanog etil-DuPHOS-rodijumovog reagensa (M.J. Burk, J.E. Feaster, W.A. Nugent, R.L. Harlow,J. Am. Chem. Soc.115(1993) 10125) uz bitnu primenu literaturne procedure. Dalje pretvaranje jedinjenja18u jedinjenja data ovim pronalaskom može se vršiti uz primenu gore diskutovanih opštih procedura.

U jednom oličenju, N-acil-grupa, Ri' strukture11,se izvodi iz 2-supstituisane benzoeve kiseline. Odgovarajuće 2-supstituisane benzoeve kiseline su komercijalno raspoložive ili se mogu dobiti pomoću konvencionalnih načina. Na primer, orto-supstituisani aril-jodidi ili triflati mogu se karbonilovati u prisustvu ugljen-monoksida i pogodnog paladijumovog katalizatora. Dobivanje takvih jodidnih ili triflatnih intermedijera zavisi od željenih posebnih modela supstitucije i oni se mogu dobiti direktnim jodovanjem ili diazotovanjem anilina čemu sledi tretiranje sa izvorom jodida, na primer, kalijum-jodidom. Triflati se mogu izvesti iz odgovarajućih fenola pomoću uobičajenih načina kao što je tretiranjem anhidridom trifluormetan-sulfonske kiseline u prisustvu baze kao što je trietilamin ili diizopropil-etilamin u inertnom rastvaraču. Kao što je prikazano u Reakcionoj shemi 6, jedan drugi način dobivanjaorto-supstituisanih benzoevih kiselina uključuje tretiranje derivata 2-metoksifeniloksazolina kao što je jedinjenje19,Zii Z2= vodonik, alkil, hlor, perfluoralkil, niži alkoksi, sa alkil-Grinjarovim reagensom čemu sledi hidroliza oksazolinskog prstena koja se vrši prema opštem postupku opisanom u referenci A.I. Mevers, R. Gabel, E.D. Mihelick,J. Org. Chem.43 (1978) 1372-1379, dajući kiselinu formule 20. 2- ili 2,6-Disupstituisani benzonitrili takođe služe kao uobičajeni prekursori za odgovarajuće benzoeve kiseline. U slučaju visoko zaprečenih nitrila, na primer, 2-hlor-6-metil-benzonitrila, uobičajena hidroliza pod kiselim ili baznim uslovima je teško izvodljiva i bolji rezultati se dobivaju redukcijom sa DIBAL-om do odgovarajućeg benzaldehida čemu sledi oksidacija pomoću oksidacionog reagensa na bazi hroma. Drugi postupci su ilustrativno dati u referenci Chen et al., W0 99/10312.

Pozivajući se sada na Reakcioni shemu 7, ciklične kiseline formule 23 su poznata jedinjenja ili se mogu dobiti uz primenu standardnih metodologija. Za dobivanje supstituisanih alkil- ili cikloalkil-karboksilnih kiselina mogu se koristiti reakcije alkilovanja uz primenu alkalnometalnog dianjona kiseline ili monoanjona odgovarajućeg estra.

Na primer, estar cikloalkil-karboksilne kiseline formule 21 može se tretirati jakom bazom, na primer, litijum-diizopropilamidom u inertnom rastvaraču, na primer, THF čemu sledi dodavanje (adicija) grupe R4i-Lv u kojoj R41označava željeni bočni niz, kao što je benzil, niži alkil, niži alkoksi-alkil, azido-niži alkil i slično a Lv označava odlazeću grupu kao što je bromidna, jodidna, mezilatna ili slična grupa za koju se zna da participira u reakcijama alkilovanja estarskih enolata. Estarski proizvod 22 se može hidrolizovati do kiseline 23 uz primenu alkalnometalnog hidroksida u pogodnom rastvaraču, na primer, vodenom alkoholu. U zavisnosti od prirode R41i eventualnog jedinjenja-mete, jedinjenje 23 se može kuplovati do amina kao što je jedinjenje 1 i direktno pretvoriti u jedinjenje-metu ili se R41može podvrgnuti daljem manipulisanju u pogodnoj tački sinteze. Na primer, ako R4ioznačava azido-niži alkil-vrstu, azid se može redukovati uz primenu, na primer, trialkil-fosfinskog reagensa čemu sledi funkcionalizacija aminskog proizvoda alkilovanjem, acilovanjem, sulfonilovanjem i sličnim postupcima koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti nauke i tehnike. Ako R4iinkorporira odlazeću grupu, na primer, terminalni atom broma, ova grupa se može istisnuti odgovarajućim nukleofilom, na primer, natrijum-metil-merkaptidom, dajući (u ovom slučaju) tioetar koji može biti željeni proizvod ili se sa njim može dalje manipuli.sati, na primer, oksidacijom do sulfoksida ili sulfona uz primenu standardnih reakcionih uslova. Drugi nukleofili koji se mogu upotrebiti da se proizvedu intermedijeri koji vode do jedinjenja datih ovim. pronalaskom uključuju: natrijum-cijanid, natrijum-metoksid, natrijum-azid, morfolin i druge. Kada R4iinkorporira ketalnu grupu, ova grupa se može hidrolizovati u pogodnoj tački u sintezi dajući keto-grupu. Sa svoje strane, sa ovom grupom se dalje može manipulisati, na primer, redukcijom do alkohola ili pretvaranjem do derivata kao što je oksim.

Primeri primene ovih postupaka na sintezu jedinjenja formule23su dati u referenci Chen et al., W0 99/10313.

Uopšte, orto-supstituisane aromatične kiseline koje su potrebne za dobivanje jedinjenja u kojima R<1>= Y-l mogu se dobiti kao što je dato u primerima u referenci Chen et al., W0 99/10313.

Za sintezu 2-hlor-6-alkilbenzoevih kiselina formule28,u kojoj R43označava niži alkil, naročito je pogodan postupak opisan u Reakcionoj shemi 8. Tako, komercijalno raspoloživ aldehid formule24se pretvara u imin25u kojem R42označava niži alkil, pogodno butil, tretiranjem butilaminom u inertnom, hidrofobnom organskom rastvaraču, na primer, heptanu. Rezultujuće jedinjenje formule25se tretira viškom Grinjarovog derivata26u inertnom rastvaraču, na primer, THF, čemu sledi tretiranje kiselinom u toku obrade pri čemu se dobiva aldehid formule.27. Oksidacija aldehida27do- kiseline formule28može se vršiti pomoću uobičajenih sredstava, na primer, tretiranjem rastvora jedinjenja27u pogodnom rastvaraču kao što je vodeni acetonitril sa natrijum-hloritom i 30%-nim vodonik-peroksidom pri sobnoj temperaturi ili ispod sobne temperature.

Može se želeti da se naprave estri-prolekovi jedinjenja datih ovim pronalaskom za koje bi bilo pogodnije da se estarska vrsta uvodi na kraju sinteze. Za tu svrhu se može koristiti mnoštvo različitih uobičajenih tehnika za formiranje estara iz karboksilnih kiselina. Tipične metode koje mogu biti prikladne bi uključivale kuplovanje alkohola za karboksilnu kiselinu u prisustvu kiseline, na primer, hlorovodonične kiseline, postupak koji je obično poznat kao Fišerova esterifikacija. Alternativno tome, može se koristiti diimid koji posreduje kuplovanje između karboksilne kiseline i alkohola sa opcionom primenom promotora kao što je 4,4-dimetilaminopiridin. Tipičan diimid je dicikloheksil-karbodiimid. Druga alternativa je da se tretira karboksilna kiselina sa reaktivnim alkil-halogenidom, na primer, alkil-jodidom ili aciloksimetil-hloridom u prisustvu baze, na primer, natrijum-bikarbonata u inertnom rastvaraču, na primer, DMF. Specijalni izbor metode će biti određen prirodom posebne kombinacije karboksilne kiseline i željene estarske vrste i biće očigledan stručnjaku verziranom u ovoj oblasti nauke i tehnike. Estarske grupe koje mogu činiti prolekove mogu se uvesti na bilo kojoj pogodnoj tački u sintezi. Na primer, grupa P2u formuli 1 može predstavljati poželjni estarski prolek i može se zadržati u finalnom proizvodu.

PRIMERI

Sledeći primeri služe u svrhu ilustrovanja i nisu namenjeni da ograniče opseg ovog pronalaska ni na koji način.

Opšte metode: Tačke topljenja su određene na Thomas-Hoover-ovm aparatu i nisu korigovane. Optičke rotacije su određene na Perkin-Elmer polarimetru modelu 241.<1>H-NMR spektri su snimani na Varian XL-200, Mecury-300 ili Unitvplus 400 MHz spektrimetrima uz primenu tetrametil-silana (TMS) kao internog standarda. Maseni spektri sa elektronskim impaktom (udarom) (EI, 70 ev) i brzim bombardovanjem atoma (FAB) su uzeti na VG Autospec ili VG 70E-HF masenim spektrometrima. Za hromatografiju na koloni je upotrebljavan silikagel Mallinkrodt SiliCar 230-400 meša za fleš hromatografiju; kolone su korišćene pod pritiskom azota od 0-35,7 kPa na glavi kolone da se pomogne protok. Hromatogrami na tankom sloju su dobiveni na staklenim pločama sa tankim slojem koje su prevučene silikagelom firme E. Merck (E. Merck# 1.05719) i učinjeni su vidljivim posmatranjem u aparatu za posmatranje sa UV svetlošću pri 254 nm, izlaganjem pari joda ili prskanjem sa fosfomolibdenskom kiselinom (PMA) u vodenom etanolu ili posle izlaganja Cl2sa 4, 41-tetrametildiaminodifenil-metanskim reagensom koji je napravljen prema referenci E. Von Arx, M. Faupel and M. Brugger,J. Chromatography120

(1976) 224-228. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom sa reverznom fazom (RP-HPLC) je izvođena uz primenu hromatografa Rainin HPLC koji koristi C-18 kolonu dimenzija 41,4 x 300 mm, 8 uM, Dynamax™ pri protoku od 49 ml/min uz primenu gradijenta smeše acetonitril/voda (od

kojih svaki sadrži 0,75% TFA (trifluorsirćetne kiseline)) tipično od 5% do 95% acetonitrila u toku perioda od 35-40

minuta. Uslovi za HPLC su tipično opisani u formatu (5-95-35-2145); ovo se odnosi na linearni gradijent smeše od 5% do 95% acetonitrila u vodi u toku 35 minuta uz praćenje eluensa sa UV detektorom na talasnoj dužini od 214 nM.

Metilenhlorid (dihlormetan), 2-propanol, DMF, THF, toluen, heksan, etar i metanol su bili čistoće Fisher ili Baker reagent grade (čistoće reagensa) i upotrebijeni su bez dodatnog prečišćavanja osim ako je to izričito naznačeno, acetonitril je bio Fisher ili Baker hplc grade (hplc čistoće) i kao takav je upotrebljen.

Ovde su korišćene sledeće definicije (skraćenice):

THF je tetrahidrofuran,

DMF je N,N-dimetilformamid,

DMA je N,N-dimetilacetamid,

HOBT je 1-hidroksibenzotriazol,

BOP je [ (benzotriazol-l-il) oksi]tris-(dimetilamino)-fosfonijum-heksafluorfosfat,

HATU je O-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronijum-heksafluorfosfat,

HBTU je O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronijum-heksaf luor fosfat ,

DIPEA je diizopropiletilamin,

DMAP je 4-(N, N-dimetilamino)piridin,

DPPA je difenilfosforil-azid,

DPPP je 1, 3-bis(difenilfosfino)propan,

DBU je 1,8-diazabiciklo[5 . 4 . 0]undec-7-en,

NaH je natrijum-hidrid,

TLC je hromatografija na tankom sloju,

LDA je litijum-diizopropilamid,

B0P-C1 je hlorid bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosfinske kiseline,

NMP je N-metilpirolidinon,

Lawesson-ov reagens je [2,4-bis(4-metoksifenil)-1,3-ditia-2, 4-difosfetan-2,4-disulfid],

NIS je anhidrid N-jodćilibarne kiseline,

Silikagelna hromatografija na Biotage kolonama se odnosi na primenu sistema za fleš hromatografiju koji se dobija od odeljka Biotage Division firme Dyax Corporation koji koristi prethodno pakovane kolone sa 40 g (40s kolone), 90 g (40m kolone) ili 800 g (75m kolone). Eluiranje je vršeno sa smešama heksan/etilacetat pod pritiskom azota od 71,35-107,03 kPa.

Primer 1

Metil-estar N-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]—4-[ (tributil) -

stanil]-L-f enilalanina

Rastvor metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-jod-L-fenilalanina (5,3 g, 13 mmol) i heksabutil-dikalaja (27,5 ml, 54 mmol) u toluenu (50 ml) je oslobođen kiseonika alternativnim zamrzavanjem smeše u kupatilu sa tečnim azotom pod vakuumom, i zatim otapanjem pod argonom (3 x)-. Dodat je tetrakis (trif enilf osf in) - paladijum (280 mg, 0,22 mmol) i reakciona smeša je zagrevana uz refluksovanje u toku 45 minuta dok se boja nije promenila od žute u crnu. Tankoslojna hromatografija (etilacetat/heksan 1:6) je pokazala prisustvo male količine polaznog jodida i dodata je dopunska porcija (140 mg, 0,11 mmol) katalizatora. Nastavljeno je sa refluksovanjem još 1 sat. Smeša je ostavljena da se ohladi i potom je koncentrovana. Dobiveni ostatak je primljen u heksan (200 ml) i trietilamin (30 ml) i dobivena smeša je mešana 30 minuta i potom filtrirana. Filtrat je koncentrovan i hromatografisan na suvoj koloni silikagela koja sadrži 150 g silikagela i eluiran heksanom a zatim smešom etilacetat/heksani (1:6) dajući metil-estar N-[ (1, 1-dimetiletoksi) karbonil]-4-[ (tributil) - stanil]-L-fenilalanina (5,7 g, 77%) u obliku bistrog ulja. LR( + )LSIMS (C27H47N04Sn) : m/z 1081 (2M-C4H9) , 570 (M+H) .

Primer 2

N-[ (2-Hlor-6-metilf enil) karbonil]-4- (1,3-dimetil-2,4-

diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin

a) Dobivanje 5-joduracila

Smeša uracila (28,6 mmol, 3,2 g) i jod-monohlorida

(49,2 mmol, 7,988 g) u metanolu (120 ml) je refluksovana u toku 4 0 sati. Rastvarač je udaljen pod vakuumom i ostatak je kristalisan iz smeše etanol/voda (1:1, 150 ml) i zatim skladišten u frižideru u toku 3 sata. Dobivene iglice su sakupljene filtriranjem i sukcesivno ispirane smešom etanol/voda (1:1, 50 ml), vodom (30 ml), heksanom

(30 ral) i zatim osušene na vazduhu. Dobiveno je 5,47 g (80%) 5-jod-uracila u obliku belih iglica (t.t. 278-282°C,Lit. 274-276°C,Synthetic Communication18 (1988) 855-867). EI-HRMS m/e izračunato za C4H3JN2O2(M<+>) 237, 9239, nađeno 237,9244.

b) Dobivanje 1,3-dimetil-5-jod-uracila

Smeša 5-jod-uracila (22,2 mmol, 5,28 g) i sprašenog kalijum-karbonata (60 mmol, 10,3 g) u DMF (188 ml) mešana je 24 sata na sobnoj temperaturi i zatim je dodat metil-jodid (53,5 mmol, 3,33 ml). Zatim je reakciona smeša mešana još 72 sata na sobnoj temperaturi i potom sipana u smešu vode (150 ml) i etilacetata (150 ml). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan etilacetatom (2 x 100 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača su dali sirovu čvrstu materiju koja je kristalisana iz smeše etanol/voda (3:1, 150:50 ml) i skladištena u frižideru preko noći. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i sukcesivno ispirane smešom etanol/voda (3:1, 120 ml), vodom (30 ml), heksanom (30 ml) i zatim osušene u vakuumu. Dobiveno je 4,61 g (78%) l,3-dimetil-5-jod-uracila u obliku belih iglica (t.t. 226-228°C, Lit. 225-227°C,5ynthetic Communication18(1988) 855-867). EI-HRMS m/e izračunato za C6H7JN2O2(M<+>) 266, 0021, nađeno 266, 0023. c) Dobivanje metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-piriraidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju cinka u prahu (30 mmol, 2,0 g) u THF (3,0 ml) dodat je 1,2-dibrom-etan (2,0 mmol, 0,174 ml) na sobnoj temperaturi. Suspenzija je zagrevana jakim fenom na 60-65°C dok nije prestalo izdvajanje gasovitog etilena (što je primećeno). Ovaj postupak je ponovljen tri puta. Zatim je suspenzija ohlađena na sobnu temperaturu i dodat je trimetilhlorsilan (1,0 mmol, 0,15 ml) i smeša je zatim mešana 10 minuta.-Vruć rastvor (jodno jedinjenje nije bilo dobro rastvorno u rastvaraču i taložilo se nakon hlađenja na sobnu temperaturu) 5-jod-1, 3-dimetiluracila (11,0 mmol, 2,92 g) u THF (3,0 ml) i DMA (10 ml) je dodat u suspenziju cinka. Posle dodavanja, smeša je zagrevana na 73°C. Unutrašnja temperatura reakcione smeše je porasla na 77-78°C zbog egzotermske reakcije. Reakciona smeša je mešana na temperaturi kupatila od 73°C u toku 1,5 sat a zatim je ohlađena na sobnu temperaturu i potom mešana još 1,5 sat.<1>H-NMR-spektar hidrolizata alikvota od 0,25 ml smeše je ukazao na prisustvo tragova polazne materije i jodoliza 0,25 ml alikvota smeše dala je nazad jodid. Reakciona smeša je zagrevana na 70°C i mešana još 30 minuta. Posle hlađenja na sobnu temperaturu reakciona smeša je razblažena sa THF (5 ml) i ostavljena da stoji 30-60 minuta da se slegne višak cinka.

Gore dobiveno cinkovo jedinjenje (5,5 mmol) je dodato u suspenziju Pd(dba)2(0,07 mmol, 40 mg), trifurilfosfina (TFP) (0,26 mmol, 66,6 mg) i metil-estra Boc-4-jod-L-fenilalanina (4,5 mmol, 1,823 g) u THF (10 ml) pri sobnoj temperaturi i svetložuta smeša je mešana 15 sati. Smeša je sipana u zasićen vodeni rastvor amonijum-hlorida i ekstrahovana etilacetatom (3 x 50 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i osušeni iznad magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvora su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni. Dobiveno je 0,80 g (43%) metil-estra N-[(l,l-dimetiletoksi) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije: t.t. 65-69°C. EI-HRMS m/e izračunato za C2iH27N306(M<+>) 418, 1978, nađeno 418, 1965.

d) Dobivanje metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Rastvor metil-estra N-[(1, 1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (1,94 mmol, 0,811 g) u dioksanu (5 ml) je tretiran sa 4,ON rastvorom hlorovodonika u dioksanu (5,0 ml, 20 mmol) pri sobnoj temperaturi i rastvor je mešan još 30 minuta. Za to vreme se polako formirao žut talog. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i ispirane heksanom dajući 412 mg (prinos 60%), t.t. 187-193°C. Matični lug je koncentrovan pod vakuumom i dobiveni ostatak je trljan sa dihlormetanom. Spojene čvrste materije, koje su sadržale nešto polaznog materijala, spojene su i rastvorene u metanolu. Glavni deo metanola je uparen i zatim je dodat dihlormetan da se formira talog. Čvrste materije su sakupljene i osušene dajući 330 mg (48%) hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (t.t. 187-193°C) . EI-HRMS m/e izračunato za Ci6Hi9N304(M+H) 318, 1454, nađeno 318, 1447. e) Dobivanje metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil) -L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,5 mmol, 0,180 g), 2-hlor-6-metilbenzoeve kiseline (0,55 mmol, 0,084 g) i HBTU (0,6 mmol, 0,227 g) u DMF (4 ml) dodat je diizopropiletilamin (3,0 mmol, 0,52 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 1 minut, sve se rastvorilo i dobiven bistar žut rastvor je mešan 15 sati na sobnoj temperaturi. Za to vreme rastvor je postao smeđ i zatim je razblažen etilacetatom (25 ml). Etilacetatni sloj je sukcesivno ispiran vodom (2 x 20 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (25 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (25 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela. Dobiveno je 151,5 mg (prinos 72%) metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4- (1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije, t.t. 155-157°C. EI-HRMS m/e izračunato za C24H24N3O5CI (M<+>) 470, 1483, nađeno 470, 1484.

f) Dobivanje N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,278 mmol, 131 mg) u etanolu (4 ml) je dodat 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (3 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 40-45°C i dobiveni bistar rastvor je mešan 2-3 sata. Etanol je udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (20 ml) i NaOH (3 ml, 1,0N) da se rastvori natrijumova so. Vodeni rastvor je ispiran etrom (50 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 50 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 107 mg (85%) N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonilj-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije, t.t. 234-236°C. EI-HRMS m/e izračunato za C23H22N3O5CI (M+H) 456,1326, nađeno 456, 1326.

Primer 3

Dobivanje 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidxnil) -N-[[l-(2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-L-f enilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 2 i polazeći od metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 1-(2-metoksietil)-ciklopentan-karboksilne kiseline (viđeti W0 9910312) dobiven je 4-(1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-N-[[l-(2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-L-f enilalanin. EI-HRMS m/e izračunato za C24H31N3O6(M+H) 458,2292, nađeno 458,2279.

Primer 4

Dobivanje N-[ (2-brom-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3-

dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 2 i polazeći od metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-brom-6-metilbenzoeve kiseline dobiven je N-[ (2-brom-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin. EI-HRMS m/e izračunato za C23H22N305Br (M+H) 500,0822, nađeno 500,0825.

Primer 5

Dobivanje N-[ (2-brom-5-metoksifenil) karbonil]-4- (1,3-

dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 2 i polazeći od metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-brom-5-metoksibenzoeve kiseline dobiven je N-[ (2-brom-5-metoksifenil)karbonil]-4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin. EI-HRMS m/e izračunato za C23H22N306Br (M+H) 516, 0770, nađeno 516,0780.

Primer 6

N-[ (2 , 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 ,4-

diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin

a) Dobivanje 5-jod-1,3,6-trimetil-uracila

Smeša 5-jod-6-metil-uracila (22,18 mmol, 5,58 g) i

sprašenog kalijum-karbonata (60 mmol, 8,29 g) u DMF (188

ml) mešana je 24 sata na sobnoj temperaturi i zatim je dodat metil-jodid (90,6 mmol, 3,33 ml). Reakciona smeša je mešana još 7 6 sati na sobnoj temperaturi i potom je sipana u smešu vode (150 ml) i etilacetata (150 ml). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan etilacetatom (2 x 100 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (150 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača su dali sirovu čvrstu materiju koja je kristalisana iz smeše etanol/voda (3:1, 150:50 ml) i skladištena u frižideru preko noći. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i sukcesivno ispirane smešom etanol/voda (3:1, 120 ml), vodom (30 ml), heksanima (30 ml) i zatim osušene u visokom vakuumu. Dobiveno je 5,8 g (prinos 93%) 5-jod-l,3,6-trimetil-uracila u obliku bele čvrste materije, t.t. 155-157°C. EI-HRMS m/e izračunato za C7H9JN2O2(M<+>) 279, 9709, nađeno 279,9709.

b) Dobivanje metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju cinka u prahu (800 mmol, 52,29 g) u THF (26,0 ml) dodat je 1,2-dibrom-etan (53,2 mmol, 4,58 ml) na sobnoj temperaturi. Ova suspenzija je zagrevana jakim fenom na 60-65°C dok nije prestalo izdvajanje gasovitog etilena (što je primećeno). Suspenzija je ohlađena na sobnu temperaturu, dodat je trimetilhlorsilan (26,6 mmol, 3,38 ml) i smeša je mešana 15 minuta. Suspenzija 5-jod-1,3,6-trimetil-uracila (266 mmol, 74,6 g) u DMA (225 ml) je zagrejana da se dobije bistar rastvor i zatim je u jednoj porciji dodata u reakcionu smešu. Posle dodavanja, smeša je zagrevana na 70°C. Unutrašnja temperatura reakcione smeše je porasla na 80-85°C zbog egzotermske reakcije. Reakciona smeša je mešana na temperaturi od 70°C u toku 3-4 sata a zatim je tankoslojna hromatografija alivotnog dela smeše, koji je razoren zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida, ukazala na odsustvo polaznog materijala. Reakciona smeša je razblažena sa THF (140 ml), ohlađena na sobnu temperaturu i višak cinka u prahu je ostavljen da se slegne u toku 2-3 sata.

Ovaj rastvor koji sadrži cinkovo jedinjenje (266 mmol) je dodat u rastvor Pd(dba)2(8 mmol, 4,6 g) , tri-o-tolilfosfina [P(Tol)3](29,6 mmol, 9, 0 g) i metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]-4-jod-L-fenil-alanina (186 mmol, 75,56 g) u THF (280 ml) pri sobnoj temperaturi i svetložuta smeša je mešana 48 sati na 50-55°C. Reakciona smeša je sipana u zasićen vodeni rastvor amonijum-hlorida i ekstrahovana etilacetatom (3 x 750 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (1,5 1) i osušeni iznad magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvora su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (75m) kolone. Dobiveno je 57,88 g (prinos 72%) metil-estra N-[(1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. EI-HRMS m/e izračunato za C22H29N306(M<+>) 431, 2056, nađeno 431,2054.

c) Dobivanje hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Jedan deo gore dobivenog čvrstog metil-estra N-[(l,l-dimetiletoksi) -karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (17,15 mmol, 7,4 g) tretiran je sa 4, ON rastvorom hlorovodonika u dioksanu (68 mmol, 17 ml) pri sobnoj temperaturi i rastvor je mešan još 1 sat pri čemu se formirao beli talog. Smeša je razblažena dietiletrom i bistar gornji deo tečnosti iznad taloga je dekantovan i dobiveni ostatak je osušen prvo na rotacionom vakuum uparivaču a zatim u visokom vakuumu. Dobiveno je 6,28 g (prinos 99%) hidrohloridne soli metil-estra 4-(l,3,6-trimeti1-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne žute čvrste materije. FAB-HRMS m/e izračunato za C17H21N3O4(M+H) 332, 1610, nađeno 332,1617.

d) Dobivanje metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimeti1-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (3,12 mmol, 1,15 g) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (3,51 mmol, 0,735 g) u dihlormetanu (40 ml) dodat je diizopropiletilamin (9,36 mmol, 1,63 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 1 minut, sve se rastvorilo i dobiven bistar žut rastvor je mešan 20 sati na sobnoj temperaturi. Rezultujući smeđi rastvor je razblažen dihlormetanom (50 ml). Dihlor-metanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 50 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (50 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koneentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 1,46 g (prinos 93%) metil-estra N-[ (2, 6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. FAB-HRMS m/e izračunato za C24H23CI2N3O5(M+H) 504, 1093, nađeno 504,1083.

e) Dobivanje N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1, 3 , 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (2,2 mmol, 1,11 g) u etanolu (12 ml) je dodat 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (8,8 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 45-50°C i dobiveni bistar rastvor je mešan približno 2 sata. Etanol je udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (50 ml) i NaOH (5 ml, 1,0N) tako da se rastvori natrijumova so.. Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (50 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 75 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 970 mg (prinos 90%) N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4 - (1,3,6-trimeti 1-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina u obliku bele čvrste materije, t.t. 225-227°C. FAB-HRMS m/e izračunato za C23H21CI2N3O5(M+H) 490, 0937, nađeno 490,0940.

Primer 7

Dobivanje N-[[l- (2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

a) Dobivanje metil-estra N-[[l-(2-metoksietil) - ciklopentil]karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,4 mmol, 173 mg), HBTU (0,5 mmol, 189 mg) i l-(2-metoksietil)ciklopentan-karboksilne kiseline (0,5 mmol, 8 6 mg) u DMF (2 ml) na sobnoj temperaturi je dodat diizopropil-etilamin (1,2 mmol, 0,29 ml). Posle 5 minuta, sve se rastvorilo i dobiven bistar žut rastvor je mešan 24 sata na sobnoj temperaturi. Rezultujući tamnosmeđi rastvor je razblažen etilacetatom (30 ml). Etilacetatni sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 30 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (30 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (30 ml) i potom osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage ( 4 Om) kolone. Dobiveno je 139 mg (prinos 72%) metil-estra N-[[l-(2-metoksietil) -ciklopentil]karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. FAB-HRMS m/e izračunato za C26H35N3O6(M+H) 486,2604, nađeno 486,2602.

b) Dobivanje N-[[l-(2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju metil-estra N-[[l-(2-metoksietil)-ciklopentil]karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,273 mmol, 133 mg) u etanolu (3 ml) na sobnoj temperaturi je dodat 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (1,5 ml). Smeša je zagrejana na 40-45°C i dobiveni bistar rastvor je mešan 15 sati. Etanol je udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (25 ml) i NaOH (3 ml, 1,0N) tako da se rastvori natrijumova so. Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom. (50 ml), da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 25 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 121 mg (prinos 94%) N-[[l-(2-metoksietil)-ciklopentil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. FAB-HRMS m/e izračunato za C25H33N3O6(M+H) 472,2448, nađeno 472,2467.

Primer 8

Dobivanje N-[ (2-brom-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-brom-6-metilbenzoeve kiseline dobiven je N-[ (2-brom-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku bele čvrste materije: t.t. 240-242°C. FAB-HRMS m/e izračunato za C24H24BrN305(M+H) 514, 0978, nađeno 514, 0965.

Primer 9

Dobivanje N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-hlor-6-metilbenzoeve kiseline dobiven je N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku bele čvrste materije: t.t. 238-240°C. FAB-HRMS m/e izračunato za C24H24CIN3O5(M+H) 470,1483, nađeno 470, 1489.

Primer 10

Dobivanje N-[ (2-etil-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-etil-6-metilbenzoeve kiseline dobiven je N-[ (2-etil-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku bele čvrste materije: t.t. 127-133°C. ES-HRMS m/e izračunato za C26H29N3O5(M+Na) 494, 1498, nađeno 494,1501.

Primer 11

Dobivanje N-[[2- (2-metiletil) -6-metilfenil]karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2 , 4-d.iokso-5-pirimid.inil) -L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-(2-metiletil)-6-metil-benzoeve kiseline dobiven je N-[[2- (2-metiletil)-6-metil-fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C27H31N3O5(M+Na) 500,2156, nađeno 500,2160.

Primer 12

Dobivanje N-[ (2 , 6-dif luorfenil) karbonxl]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2,6-difluorbenzoeve kiseline dobiven je N-[ (2,6-difluorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C23H21F2N3O5(M+Na) 480,1483, nađeno 480, 1489.

Primer 13

Dobivanja N-[[2-fluor-6- (trifluormetil) f enil]karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-fluor-6-(trifluormetil)-benzoeve kiseline dobiven je N-[[2-fluor-6-(trifluormetil) fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku bele čvrste materije: t.t. 218-220°C. ES-HRMS m/e izračunato za C25H23F4N305(M+Na) 530,1310, nađeno 530,1317.

Primer 14

Dobivanje N-[[2 , 6-di- (2-metiletil) fenil]karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 7 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2,6-di-(2-metiletil)-benzoeve kiseline dobiven je N-[[2, 6-di-(2-metiletil) -

fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C29H35N3O5(M+Na) 530,1310, nađeno 530,1317.

Primer 15

Dobivanje N-[ (2-hlor-6-etilfenil)karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

a) Dobivanje N-(2-hlor-6-fluorbenzilidin)butilamina (Ro 50-5007/000, 30935-229)

U suspenziju 2-hlor-6-fluorbenzaldehida (416 mmol, 66 g) u heptanima (200 ml) dodat je n-butilamin (460 mmol, 45,5 ml) pri sobnoj temperaturi. Posle dodavanja je došlo do egzotermske reakcije tako da su se čvrste materije potpuno rastvorile. Rastvor je mešan 3 sata na sobnoj temperaturi, zatim je prenet u levak za odvajanje i potom ispiran zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (200 ml) i potom osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali žuto ulje koje je prečišćeno destilacijom u visokom vakuumu (t.klj. 95-98°C/4,5 mm Hg) tako da se dobije 86,31 g (prinos 97%) N-(2-hlor-6-fluorbenzilidin)butilamina u obliku žutog ulja. EI-HRMS m/e izračunato za CnHi3ClFN (M<+>) 213, 0720, nađeno 213,0 /14 .

b) Dobivanje 2-hlor-6-etilbenzaldehida

Urastvor N-(2-hlor-6-fluorbenzilidin)butilamina (15

mmol, 3,21 g) u THF (20 ml) ukapavanjem je dodat rastvor

etilmagnezijum-bromida (30 mmol, 30 ml, IM) u THF uz održavanje temperature pri 5-15°C. Posle dodavanja je reakciona smeša ostavljena da se zagreje na 20°C a potom je mešana 5 sati. Zatim je smeša ohlađena na 0°C (kupatilo sa ledom) i ukapavanjem je dodat 20%-ni vodeni rastvor HC1 (50 ml) uz održavanje temperature ispod 15°C hlađenjem u ledenom kupatilu. Posle dodavanja je reakciona smeša ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu a potom je mešana 15 sati. Zatim je smeša razblažena vodom (75 ml) i ekstrahovana etilacetatom (2 x 50 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su 2,27 g (prinos 90%) 2-hlor-6-etilbenzaldehida u obliku žutog ulja. EI-HRMS m/e izračunato za C9H9C10

(M<+>) 167,0264, nađeno 167,0263.

c) Dobivanje 2-hlor-6-etilbenzoeve kiseline

U suspenziju 2-hlor-6-etilbenzaldehida (13,5 mmol,

2,27 g) u acetonitrilu (25 ml) (koja je temperirana na

sobnu temperaturu) dodat je rastvor monobaznog natrijum-fosfata (3,4 mmol, 0,465 g) u vodi (7,5 ml) a zatim 30%-ni vodonik-peroksid (1,8 ml). Zatim je ukapavanjem dodat rastvor natrijum-hlorita (23,7 mmol, 2,15 g) u vodi (20 ml) na 0°C uz održavanje temperature ispod 3°C. Posle dodavanja je žuta suspenzija mešana 15 sati pri 0°C do sobne temperature. Posle toga je analiza smeše pomoću tan.koslojne hromatograf i je pokazala odsustvo polaznog

materijala. Zatim je ukapavanjem dodavan rastvor natrijum-bisulfita (20,5 mmol, 2,8 g) u vodi (10 ml) pri 0°C sve dok nije nestala žuta boja (KJ-hartija daje pozitivnu reakciju). Bitno je dobro hlađenje da bi se kontrolisala egzotermska reakcija. Posle 1 sat je udaljen rastvarač destilacijom u vakuumu. Neutralne nečistoće su ekstrahovane dietiletrom (200 ml). Zatim je bazni vodeni rastvor neutralisan sa 10%-nim vodenim rastvorom HC1 do pH~1. Istaložena bela čvrsta materija je sakupljena filtriranjem i osušena na vazduhu dajući 2,415 g (prinos 97%) 2-hlor-6-etilbenzoeve kiseline u obliku amorfne bele čvrste materije. EI-HRMS m/e izračunato za C9H9CIO2(M<+>) 184,0291, nađeno 184,0295.

d) Dobivanje metil-estra N-[ (2-hlor-6-etilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,5 mmol, 184 mg), HBTU (0,7 mmol, 265 mg) i 2-hlor-6-etil-benzoeve kiseline (0,7 mmol, 0129 mg) u DMF (2 ml) dodat je diizopropiletilamin'(1,25 mmol, 0,22 ml) na

sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, sve se rastvorilo i dobiveni bistar žuti rastvor je mešan 15 sati na sobnoj

temperaturi. Rezultujući tamnosmeđ rastvor je razblažen etilacetatom (30 ml). Etilacetatni sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 30 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (30 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (30 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (4Om) kolone. Dobiveno je 175 mg (prinos 70%) metil-estra N-[ (2-hlor-6-etilfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C26H28C1N305(M+Na) 520, 1611, nađeno 520,1613.

e) Dobivanje N-[(2-hlor-6-etilfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2-hlor-6-etilfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,33 mmol, 164 mg) u etanolu (2 ml) je dodat 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (0,7 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 3 sata na sobnoj temperaturi. Etanol je udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (30 ml). Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (30 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 35 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 138 mg (prinos 87%) N-[ (2-hlor-6-etilfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije, t.t. 187-190°C. ES-HRMS m/e izračunato za C25H26CIN3O5(M+Na) 506,1459, nađeno 506,1455.

Primer 16

Dobivanje N-[ (2-hlor-6-propilfenil) karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

a) Dobivanje 2-hlor-6-propilbenzoeve kiseline

Primenjujući opšti postupak opisan u primeru 15 i polazeći od N-(2-fluor-6-hlorbenzilidin)butilamina i propil-magnezijum-bromida dobivena je 2-hlor-6-propil-benzoeva kiselina. b) Dobivanje N-[ (2-hlor-6-propilfenil) karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 15 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-hlor-6-propilbenzoeve kiseline dobiven je N-[ (2-hlor-6-propilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku bele čvrste materije: t.t. 225-227°C. ES-HRMS m/e izračunato za C26H28C1N305(M+Na) 520, 1611, nađeno 520,1615.

Primer 17

Dobivanje N-[[2-hlor-6- (2-metiletil) fenil]karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

a) Dobivanje 2-hlor-6-(2-metiletil)benzoeve kiseline

Primenjujući opšti postupak opisane u primeru 15 i polazeći od N-(2-fluor-6-hlorbenzilidin)butilamina i izopropil-magnezijum-bromida dobivena je 2-hlor-6-(2-meti 1eti 1 )benzoeva kiselina. b) Dobivanje N-[[2-hlor-6- (2-metiletil) f enil]karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 15 i polazeći od metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-hlor-6-(2-metiletil)-benzoeve kiseline dobiven je N-[[2-hlor-6- (2-metiletil) -

fenil]karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin u obliku bele čvrste materije: t.t. 205-209°C. ES-HRMS m/e izračunato za C26H28CIN3O5(M+Na) 520,1611, nađeno 520,1617.

Primer 18

N-[ (2 , 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1,3-dietil-6-metil-2 , 4-

diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin

a) Dobivanje 5-jod-1,3-dietil-6-metil-uracila

U suspenziju 5-jod-6-metil-uracila (20,97 mmol, 5,45 g) i sprašenog kalijum-karbonata (60 mmol, 8,29 g) u DMF (188 ml) je dodat etil-jodid (83,88 mmol, 6,7 ml). Reakciona smeša je mešana 15 sati na sobnoj temperaturi i potom sipana u smešu vode (150 ml) i etilacetata (150 ml). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan etilacetatom (2 x 100 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (150 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača su dali sirovu čvrstu materiju koja je trljana sa smešom dihlormetan/dietiletar/heksani (1:1:1). Dobiveno je 3,89 g (prinos 60%) 5-jod-l,3-dietil-6-metil-uracila u obliku bele kristalne čvrste materije, t.t.. 159-161,5°C. EI-HRMS m/e izračunato za C9H13JN202(M<+>) 308,0022, nađeno 308,0018.

b) Dobivanje metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-

fenilalanina

U suspenziju cinka u prahu (33 mmol, 1,96 g) u THF (3 ml) dodat je na sobnoj temperaturi 1,2-dibrom-etan (3 mmol, 0,261 ml). Ova suspenzija je jakim fenom zagrevana na 60-65°C dok nije prestalo izdvajanje gasovitog etilena. Suspenzija je ohlađena na sobnu temperaturu, dodat je trimetilhlorsilan (1,5 mmol, 0,19 ml) i smeša je zatim mešana 15 minuta. Suspenzija 5-jod-1,3-dietil-6-metil-uracila (11 mmol, 3,39 g) u DMA (6 ml) je zagrejana da se dobije bistar rastvor i zatim je u jednoj porciji dodata u gornju reakcionu smešu. Posle dodavanja, smeša je zagrevana na 7 0°C. Unutrašnja temperatura reakcione smeše je porasla na 75°C zbog egzotermske reakcije. Reakciona smeša je održavana na 70°C u toku 15 sati posle čega je analiza aiivotnog dela reakcione smeše (koji je razoren zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida) pomoću tankoslojne hromatografije pokazala odsustvo polaznog materijala. Reakciona smeša je razblažena sa THF (6 ml) i potom ohlađena na sobnu temperaturu. Višak cinka u prahu je ostavljen da se slegne.

Ovaj rastvor koji sadrži gore dobiveno cinkovo jedinjenje (11 mmol) je dodat u rastvor Pd(dba)2(0,14 mmol, 80 mg), trifurilfosfina (TFP) (0,52 mmol, 134 mg) i metil-estra N-[(1, 1-dimetiletoksi)karbonil]-4-j od-L-fenil-alanina (9 mmol, 3,65 g) u THF (6 ml) pri sobnoj temperaturi i svetložuta smeša je mešana 72 sata na 50-55°C. Reakciona smeša je sipana u zasićen vodeni rastvor amonijum-hlorida (100 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 75 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (150 ml) i osušeni iznad magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (4Om) kolone. Dobiveno je 1,78 g (prinos 43%) metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1, 3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C24H33N306(M+Na) 482,2262, nađeno 482,2262.

c) Dobivanje hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U rastvor metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)-karbonil]-4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (3,87 mmol, 1,78 g) u dioksanu (10 ml) dodat je 4N rastvor hlorovodonika u dioksanu (20 mmol, 5 ml) pri sobnoj temperaturi i rastvor je mešan još 1 sat. Rastvor je koncentrovan i potom razblažen dietiletrom tako da se formira bela čvrsta materija. Matični lug je dekantovan i dobiveni ostatak je osušen prvo na rotacionom vakuum uparivaču a zatim u visokom vakuumu. Dobiveno je 0,72 g (prinos 47%) hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C19H25N3O4(M+Na) 382, 1737, nađeno 382,1736.

d) Dobivanje metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(l,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,76 mmol, 0,3 g) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (0,84 mmol, 0,175 g) u dihlormetanu (2 ml) dodat je diizopropiletilamin (3,03 mmol, 0,53 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, sve se rastvorilo i dobiveni bistar žuti rastvor je mešan 15 sati na sobnoj temperaturi. Nastali smeđi rastvor je razblažen dihlormetanom (25 ml). Dihlormetanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 25 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (25 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (25 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiveno je 0,40 g (prinos 99%) metil-estra N-[ (2, 6-dihlorfenil) -karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C26H27CI2N3O5(M+Na) 554, 1221, nađeno 554,1229.

e) Dobivanje N-[(2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidini 1)-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,77 mmol, 0,41 g) u etanolu (2 ml) dodat je 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (1,5 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 50°C i dobiveni bistar rastvor je mešan 2 sata. Zatim je etanol udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (25 ml) i NaOH (2 ml, 1,0N) tako da se rastvori natrijumova so. Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (30 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahdvan etilacetatom (2 x 25 ml). Spojeni organski

■ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 320 mg (prinos 80%) N-[(2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne

bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C25H25C12N305(M+Na) 541, 3921, nađeno 541, 3925.

Primer 19

Dobivanje N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

a) Dobivanje metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,758 mmol, 300 mg), HBTU (0,84 mmol, 318 mg) i 2-hlor-6-metilbenzoeve kiseline (0,84 mmol, 142 mg) u DMF (2 ml) dodat je diizopropiletilamin (1,9 mmol, 0,33 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, sve se rastvorilo i dobiveni bistar žuti rastvor je mešan 48 sati na sobnoj temperaturi. Rezultujući tamnosmeđi rastvor je razblažen etilacetatom (30 ml). Etilacetatni sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 30 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (30 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (30 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je

380 mg (prinos 98%) metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1, 3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C27H30CIN3O5(M+Na) 535,1026, nađeno 535,1024 .

b) Dobivanje N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,82 mmol, 420 mg) u etanolu (2 ml) je dodat 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (1,6 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 50°C i rezultujući bistar rastvor je mešan 2 sata na toj temperaturi. Etanol je udaljen pod sniženim' pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (25 ml) i NaOH (3 ml, 1,0N) da se rastvori natrijumova so. Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (30 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x

25 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom

osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 277 mg (prinos 68%) N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1, 3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C26H28CIN3O5(M+Na) 520,1611, nađeno 520,1616.

Primer 20

Dobivanje 4- (1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidi-

nil) -N-[[l- (2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-L-f enil-

alanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 19 i polazeći od metil-estra 4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 1-(2-metoksietil)-ciklopentan-karboksilne kiseline dobiven je 4-(1,3-dietil-6-metil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-N-[[l- (2-metoksietil) ciklopentil]karbonil]-L-fenilalanin u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C27H37N306(M+Na) 522,2575, nađeno 522,2581.

Primer 21

N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trif luormetil) -5-pirimidinil]-L-f enilalanin

a) Dobivanje 3-metil-6-(trifluormetil)-uracila

U prethodno izmešan rastvor natrijum-metoksida (55 mmol, 2,97 g) i etil-3-amino-4, 4,4-trifluorkrotonata (55 mmol, 10,0 g) u DMSO (19 ml, koji je osušen iznad molekulskih sita) dodat je metil-izocijanat (55 mmol, 3,2 g) u DMSO (2,5 ml) u toku 15 minuta na 20°C. Rastvor je mešan 15 minuta a zatim je dodata druga porcija natrijum-metoksida (27,5 mmol, 1,34 g). Posle mešanja u toku 15 minuta na 20°C, dodat je na ovoj temperaturi metil-izocijanat (14 mmol, 0,8 g). Posle daljih 15 minuta, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i mešana je preko noći. Dobivena žuta suspenzija je sipana u vodu (50 ml) da se dobije svetložuti rastvor. Neutralne nečistoće su ekstrahovane dietiletrom (3 x 50 ml). Vodeni sloj je zakiseljen koncentrovanom hlorovodoničnom kiselinom dajući belu čvrstu materiju. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i potom ispirane vodom. Posle sušenja na vazduhu je dobiveno 6,79 g (prinos 63%) 3-metil-6-(trifluormetil)uracila u obliku bele čvrste materije: t.t. 235-237°C. EI-HRMS m/e izračunato za C6H5F3N202 ■ (M+j 194,0303, nađeno 194,0303. b) Dobivanje 1,3-dimetil-6-(trifluormetil)uracila U suspenziju 3-metil-6-(trifluormetil)uracila (20,6 mmol, 4,0 g) i sprašenog kalijum-karbonata (41,2 mmol, 5,7 g) u DME (30 ml) dodat je metil-jodid (82,4 mmol, 5,13 ml). Zatim je reakciona smeša refluksovana 4 sata posle čega je analiza reakcione smeše pomoću tankoslojne hromatografije ukazala na odsustvo polaznog materijala. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i potom razblažena vodom (50 ml). Zatim je DME udaljen pod sniženim pritiskom dajući belu suspenziju. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i ispirane vodom. Posle sušenja na vazduhu je dobiveno 3,55 g (prinos 83%) 1,3-dimetil-6-(trifluormetil)uracila u obliku bele čvrste materije: t.t. 85-87°C. EI-HRMS m/e izračunato za C7H7F3N2O2(M<+>) 208,0459, nađeno 208,0460. c) Dobivanje 1,3-dimetil-5-jod-6-(trifluormetil)uracila

Smeša 1,3-dimetil-6-(trifluormetil)uracila (16,91

mmol, 3,52 g), trifluorsirćetne kiseline (20 ml) i

anhidrida trifluorsirćetne kiseline (5 ml) je refluksovana 5 minuta. Zatim je dodat NIS (16,91 mmol, 3,8 g) i dobivena smeša je mešana 15 sati posle čega je analiza reakcione smeše pomoću tankoslojne hromatografije pokazala prisustvo male količine polaznog materijala. Dodata je druga porcija NIS (8,45 mmol, 1,9 g) i refluksovanje je nastavljeno još 5 sati. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i potom polako sipana u zasićen vodeni rastvor kalijum-karbonata (100 ml). Zatim je dodat rastvor natrijum-tiosulfata da se ukloni višak boje joda. Dobivene čvrste materije su sakupljene filtriranjem i ispirane vodom. Posle sušenja na vazduhu je dobiveno 3,73 g (prinos 66%) 1,3-dimetil-5-jod-6-(trifluormetil)uracila u obliku bele čvrste materije: t.t. 149-151°C. EI-HRMS m/e izračunato za C7H6F3JN302(M<+>) 333,9426, nađeno 333,9436.

d) Dobivanje metil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina

U suspenziju cinka u prahu (33 mmol, 1,96 g) u THF (3 ml) dodat je na sobnoj temperaturi 1,2-dibrom-etan (3 mmol, 0,261 ml). Ova suspenzija je zagrevana jakim fenom na 60-65°C dok nije prestalo izdvajanje gasovitog etilena. Suspenzija je ohlađena na sobnu temperaturu, dodat je trimetilhlorsilan (1,5 mmol, 0,19 ml) i smeša je zatim mešana 15 minuta. Suspenzija 1,3-dimetil-5-jod-6-(trifluormetil)uracila (10 mmol, 3,34 g) u DMA (8 ml) je zagrejana da se dobije bistar rastvor i zatim je u jednoj porciji dodata u gornju reakcionu smešu. Posle dodavanja, smeša je zagrejana na 70°C. Unutrašnja temperatura reakcione smeše je porasla na 75°C zbog egzotermske reakcije. Reakciona smeša je mešana na 70°C u toku približno 3 sata posle čega je tankoslojna hromatografija alikvotnog dela reakcione smeše, koji je razoren zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida, ukazala na odsustvo polaznog materijala. Reakciona smeša je razblažena sa THF (5 ml), ohlađena na sobnu temperaturu i višak cinka u prahu je ostavljen da se slegne.

Gornji rastvor cinkovog jedinjenja (10 mmol) je dodat u rastvor Pd(dba)2(1,0 mmol, 520 mg), trifurilfosfina (TFP) (4,0 mmol, 0,93 g) i metil-estra N-[(l,l-dimetiletoksi) karbonil]-4-jod-L-fenilalanina (7 mmol, 2,84

g) u THF (10 ml) pri sobnoj temperaturi i svetložuta smeša je mešana 12 sati na 45°C. Reakciona smeša je sipana

u zasićen vodeni rastvor amonijum-hlorida (100 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 75 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (150 ml) i osušeni iznad anhidroavnog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 1,45 g (prinos 42%) metil-estra N-[(l,l-

dimetiletoksi) Jcarbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C22H26F3N3O6(M+Na) 508,1666, nađeno 508, 1670.

e) Dobivanje hidrohloridne soli metil-estra 4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina

Čvrst metil-estar N-[(1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-[1,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (2,92 mmol, 1,42 g) je tretiran sa 4N rastvorom hlorovodonika u dioksanu (28 mmol, 7 ml) pri sobnoj temperaturi i rastvor je mešan još 2 sata. Reakciona smeša je razblažena dihlormetanom (5 ml) i potom koncentrovana pod sniženim pritiskom na rotacionom vakuum uparivaču. Dobiveni ostatak je razblažen dietiletrom tako da se formira svetlosmeđa čvrsta materija. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i potom ispirane dietiletrom. Posle sušenja je dobiveno 1,21 g (prinos 91%) hidrohloridne soli metil-estra 4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina u obliku svetlosmeđe čvrste materije: t.t. 244-247°C. ES-HRMS m/e izračunato za C^H^NaO,, (M+H) 386,1322 nađeno 386,1319. f) Dobivanje metil-estra N-[(2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-[1,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (1,0 mmol, 421 mg) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (1,1 mmol, 0,235 g) u dihlormetanu (3 ml) dodat je diizopropiletilamin (4,4 mmol, 0,622 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 1 minut, sve se rastvorilo i dobiveni svetlosmeđi rastvor je mešan 72 sata na sobnoj temperaturi. Nastali tamnosmeđi rastvor je razblažen dihlormetanom (25 ml). Dihlormetanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 25 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (25 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (25 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiveno je 0,541 g (prinos 97%) metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4-[1,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C24H20CI2F3N3O5(M+Na) 580,0624, nađeno 580,0629.

g) Dobivanje N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2, 4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenil-alanina

U suspenziju metil-estra N-[(2, 6-dihlorfenil)-karbonil]-4-[1,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (0,422 mmol, 0,236 g) u piridinu (15 ml) je dodat litijum-jodid (4,22 mmol, 0,571

g) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrevana uz refluksovanje u toku 15 sati. Reakciona smeša je ohlađena

na sobnu temperaturu, razblažena sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline i ekstrahovana etilacetatom (2 x 25 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom

osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 201 mg (prinos 87%) N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina u obliku svetložute čvrste materije: t.t. 125-128°C. ES-HRMS m/e izračunato za C23H18CI2F3N3O5(M+Na) 566,0469, nađeno 566,0468.

Primer 22

Dobivanje N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2 , 4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanina

Rastvor 2-hlor-6-metilbenzoeve kiseline (190 mg, 1,14 mmol) u dihlormetanu (7 ml) koji sadrži DMF (4 kapi) je tretiran sa oksalil-hloridom (0,42 ml, 4,8 mmol) i smeša je mešana 2 sata. Smeša je koncentrovana, azeotropski zagrevana sa toluenom da se uklone tragovi oksalil-hlorida i dobiveni ostatak je direktno upotrebljen u sledećem stupnju.

Smeša gore dobivenog hlorida kiseline, hidrohloridne soli metil-estra 4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trifluormetil )-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (423 mg, 1, 003 mmol) u dihlormetanu (5 ml) je tretirana diizopropiletilaminom (DIPE/A) (0, 625 ml, 4,46 mmol) i dobiveni svetlosmeđi rastvor je mešan 3 dana. Smeša je koncentrovana, razbla-žena etilacetatom, ispirana sa IN HC1 i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i uparavanje rastvarača dali su ostatak koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiven je metil-estar N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4~diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (179 mg, 33%) u obliku bele pene. ES-HRMS m/e izračunato za C25H23CIF3N3O5(M+Na) 560, 1171, nađeno 560,1172.

Rastvor gore dobivenog metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (260 mg, 0,48 mmol) i litijum-jodida (653,4 mg, 4,8 mmol) u piridinu (14 ml) je zagrevan uz refluksovanje preko noći. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu, razblažena sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline i ekstrahovana etilacetatom. Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni. Dobiveni ostatak je trljan sa etrom, heksanom i dihlormetanom dajući N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2, 4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanin (205 mg, 81%) u obliku bele čvrste materije: t.t. 243-247°C. ES-HRMS m/e izračunato za C24H21CIF3N3O5(M+Na) 546,1014, nađeno 546,1013.

Primer 23

Dobivanje N-[[2-fluor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4-[1,3-dimetil-2,4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina

Rastvor 2-fluor-6-trifluormetilbenzoeve kiseline (125 mg, 0,60 mmol) (Aldrich 33080-9) u dihlormetanu (3 ml) koji sadrži DMF (2 kapi) je tretiran sa oksalil-hloridom (0,21 ml, 2,4 mmol) i smeša je mešana 2 sata. Smeša je koncentrovana, azeotropski zagrevana sa toluenom da se uklone tragovi oksalil-hlorida i dobiveni ostatak je direktno upotrebljen u sledećem stupnju.

Smeša gore dobivenog hlorida kiseline, hidrohloridne soli metil-estra 4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-f enilalanina (210 mg, 0,50 mmol)

u dihlormetanu (3 ml) je tretirana diizopropiletilaminom (DIPEA) (0,336 ml, 2,4 mmol) i dobiveni svetlosmeđi rastvor je mešan 3 dana. Smeša je koncentrovana, razbla-žena etilacetatom, ispirana sa IN HC1 i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i potom osušena iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i uparavanje rastvarača dali su ostatak koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiven je metil-estar N-[[2-fluor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trif luormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (179 mg, 62%) u obliku bele pene. ES-HRMS m/e izračunato za C25H20F7N3O5(M+Na) 598, 1183, nađeno 598, 1186.

Rastvor gore dobivenog metil-estra N-[[2-fluor-6-(trif luormetil) fenil]karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trif luormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanina (266 mg, 0,46 mmol) i litijum-jodida (624 mg, 4,6 mmol) u piridinu (14 ml) je zagrevan uz refluksovanje preko noći. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu, razblažena sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline i ekstrahovana etilacetatom. Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni. Dobiveni ostatak je trljan sa etrom i dihlormetanom dajući N-[[2-fluor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanin (167 mg, 64%) u obliku bele čvrste materije: t.t. 122-125°C. ES-HRMS m/e izračunato za 02^^7^0-5 (M+Na) 584, 1027, nađeno 584,1028.

Primer 24

N-[ (2-Hlor-6-metilf enil) karbonil]-4- (1,3-dimetil-2 , 4-

diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanin

a) Dobivanje 4-[ (1, 1-dimetiletoksi) karbonil]amino-3-metilbenzilalkohola

Smeša 4-nitro-3-metilbenzilalkohola (56,53 mmol, 9,45 g), di-terc-butil-dikarbonata (63 mmol, 13,74 g) i paladijuma na uglju (450 mg) u etilacetatu (240 ml) je hidrogenizovana u toku 2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša filtrirana kroz kolonu celita uz ispiranje kolone etilacetatom (50 ml). Filtrat je koncentrovan u vakuumu dajući 10,18 g (prinos 76%) 4-[(1, 1-dimetiletoksi) karbonil]amino-3-metilbenzilalkohola u obliku svetložute čvrste materije. EI-HRMS m/e izračunato za Ci3Hi9N03(M<+>) 237,0126, nađeno 237, 0129.

b) Dobivanje 4-[[ (1, 1-dimetiletoksi) karbonil]amino]-3-metilbenzaldehida

U rastvor 4-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]amino-3-metilbenzilalkohola (42,9 mmol, 10,18 g) u dihlormetanu (85 ml) su dodati mangan-dioksid (138 mmol, 12 g) i molekulska sita 4A (6 g) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 7 6 sati na sobnoj temperaturi a zatim je filtrirana kroz kolonu celita uz ispiranje kolone dihlormetanom. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage kolone (40m). Dobiveno je 7,82 g (prinos 77%) 4-[[ (1, 1-dimetiletoksi) karbonil]-amino]-3-metilbenzaldehida u obliku bele čvrste materije: t.t. 109-111°C. EI-HRMS m/e izračunato za Ci3H17N03(M<+>) 235,1208, nađeno 235,1207.

c) Dobivanje metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-[[ (1, 1-

dimetiletoksi)karbonil]amino]-3-metildehidrofenil-alanina

U rastvor trimetil-estra N-(benzioksikarbonil)-oc-fosfonoglicina (18 mmol, 5,96 g) (Aldrich Chemical Companv) u dihlormetanu (30 ml) dodat je tetrametil-guanidin (18 mmol, 2,07 g) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 1 sat na sobnoj temperaturi a zatim je ohlađena na -30°C. Zatim je u jednoj porciji dodat rastvor 4-[[ (1, 1-dimetiletoksi) karbonil]amino]-3-metilbenzaldehida (15 mmol, 3,52 g) dihlormetanu (12,5 ml). Posle 30 minuta na toj temperaturi, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i potom je mešana 15 sati. Zatim je reakciona smeša razblažena dietiletrom (100 ml) i sukcesivno ispirana sa 0,5N hlorovodoničnom kiselinom (2 x 50 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (100 ml) , zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom je osušena iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 3,87 g (prinos 58%) metil-estra N-(benziloksikarbonil) -4-[[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]amino]-3-metil-dehidrofenilalanina u obliku bele čvrste materije. EI-HRMS m/e izračunato za C24H28N2O6(M<+>) 440, 1527, nađeno 440,1524.

d) Dobivanje metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-[[ (1, 1-dimetiletoksi)karboni ljamino]-3-metil-L-f enilalanina

Struja argona je propuštana preko noći kroz rastvor metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-[[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]amino]-3-metil-dehidrofenilalanina (8,08 mmol, 3,56 g) u metanolu (25 ml) u Parovom sudu za rad pod pritiskom. Zatim je u boksu za rad sa rukavicama pod strujom argona dodat katalizator, ( + )-1,2-bis( (2S,5S)-2,5-dimetilfosfolano)benzen(ciklooktadien)-rodijum(I)-trifluormetansulfonat [[Rh (COD) (S, S) - (me) DuPHOS]+Tf0-] (-40 mg). Rastvor je mešan pod pritiskom vodonika (428,13 kPa) pri sobnoj temperaturi u toku 22 sata. Dobiven rastvor je koncentrovan i sirov proizvod je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 2 g (prinos 55%) metil-estra N-(benziloksi- . karbonil) -4-[[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]amino]-3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. EI-HRMS m/e izračunato za C24H3oN206(M<+>) 442, 1627, nađeno 442,1629.'

e) Dobivanje hidrohloridne soli metil-estra N-(benzil oksikarbonil ) -4-amino-3-metil-L-fenilalanina

U rastvor metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-[[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]amino]-3-metil-L-fenilalanina (4,52 mmol, 2 g) u dioksanu (12 ml) dodat je 4N rastvor hlorovodonika u dioksanu (48 mmol, 2 ml) pri sobnoj temperaturi i rastvor je mešan približno 2 sata pri čemu se formirao talog. Čvrste materije su razblažene dietiletrom, matični lug je dekantovan i dobiveni ostatak je osušen prvo na rotacionom vakuum uparivaču a zatim u visokom vakuumu. Dobiveno je 1,487 g (prinos 87%) hidrohloridne soli metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-amino-3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne žute čvrste materije. FAB-HRMS m/e izračunato za Ci9H22N204(M+H) 343,0142, nađeno 343,0144.

f) Dobivanje metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-jod-3-

meti1-L-fenilalanina

Suspenzija sumporne kiseline (0,3 ml), vode (36 ml) i hidrohloridne soli metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-amino-3-metil-L-fenilalanina (2,9 mmol, 1,1 g) zagrevana je da se dobije bistar rastvor. Zatim je ohlađena na -1°C (ledeno kupatilo) i ukapavanjem je dodat rastvor natrijum-nitrita (5,8 mmol, 400 mg) u vodi (8 ml). Reakciona smeša je mešana 30 minuta i zatim je dodat rastvor kalijum-jodida (8,7 mmol, 1,5 g) u vodi (6 ml) pri čemu je dobivena smeđa suspenzija. Posle mešanja u toku 30 minuta, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i potom je mešana još 1 sat. Zatim je reakciona smeša razblažena vodom (100 ml) i ekstrahopvana etilacetatom (3 x 50 ml). Spojeni ekstrakti su sukcesivno ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bisulfita (100 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 0,84 g (prinos 64%) metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-jod-3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za Ci9H2oJN04(M+Na) 476, 0329, nađeno 476,0336.

g) Dobivanje metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenil-alanina

U suspenziju cinka u prahu (15 mmol, 0,98 g) u THF (1,5 ml) dodat je na sobnoj temperaturi 1,2-dibrom-etan (1 mmol, 0,13 ml). Ova suspenzija je jakim fenom zagrevana na 60-65°C dok nije prestalo izdvajanje gasovitog etilena. Zatim je suspenzija ohlađena na sobnu temperaturu, dodat je trimetilhlorsilan (0,5 mmol, 70 ul) i smeša je zatim mešana još 15 minuta. Suspenzija 5-jod-1,3-dimetil-uracila (2,5 mmol, 665 mg) u DMA (2 ml) je zagrejana da sc dobije bistar rastvor i zatim je u jednoj porciji dodata u gornju reakcionu smešu. Posle dodavanja, smeša je zagrejana na 70°C. Reakciona smeša je mešana na 70°C približno 3 sata posle čega je analiza alikvotnog dela reakcione smeše (koji je razoren zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida) pomoću tankoslojne hromatografije pokazala odsustvo polaznog materijala. Reakciona smeša je razblažena sa THF (2 ml), ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu i višak cinka u prahu je ostavljen da se slegne.

Gore dobiven rastvor cinkovog jedinjenja (2,5 mmol) je dodat u rastvor Pd(dba)2(0,05 mmol, 27 mg), trifurilfosfina (TFP) (0,2 mmol, 50 mg) i metil-estra N-(benziloksikarbonil) -4-jod-3-metil-L-fenilalanina (0,5 mmol, 227 mg) u THF (2 ml) pri sobnoj temperaturi i rezultujuća svetložuta smeša je mešana 15 sati na 45°C. Reakciona smeša je zatim sipana u zasićen vodeni rastvor amonijum-hlorida i ekstrahovana etilacetatom (3 x 30 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiven je 161 mg (prinos 69%) metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C25H27N306(M+Na) 488, 1792, nađeno 488, 1801.

h) Dobivanje metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina

Smeša metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,34 mmol, 159 mg), cikloheksena (1 ml) i 10%-nog paladijuma na uglju (100 mg) u etanolu (3 ml) je zagrevana uz refluksovanje u toku 20 sati. Zatim je filtrirana kroz kolonu celita i kolona je ispirana etanolom (10 ml). Spojeni filtrat i ispirotine su koncentrovani i dobivei ostatak je osušen pod visokim vakuumom dajući 96 mg (prinos 85%) metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku u obliku lepljive žute čvrste materije.. ES-HRMS

m/e izračunato za C17H21N3O4(M+Na) 354, 1424, nađeno 354,1424. i) Dobivanje metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-meti1-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,125 mmol, 46 mg), HBTU (0,125 mmol, 47,5 mg) i 2-hlor-6-metilbenzoeve kiseline (0,137 mmol, 25 mg) u DMF (2 ml) dodat je diizopropiletilamin (0,312 mmol, 44fil) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, sve se rastvorilo i dobiveni bistar žut rastvor je mešan 72 sata na sobnoj temperaturi. Nastali tamnosmeđi rastvor je razblažen etilacetatom (30 ml). Etilacetatni sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 30 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (30 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (30 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiveno je 42 mg

(prinos 70%) metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku uljastog ostatka. ES-HRMS m/e izračunato za C25H26CIN3O5(M+Na) 506, 1454, nađeno 506,1459.

j) Dobivanje N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenil-alanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,083 mmol, 40 mg) u etanolu (1 ml) dodat je 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (0,2 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je etanol udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (5 ml). Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (20 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 25 ml). Spojeni organski ekstrakti su

ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 34 mg (prinos 87%) N-[ (2-hlor-6-metil-

fenil)karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C24H24CIN3O5(M+Na) 492,1295, nađeno 492,1301.

Primer 25

Dobivanje N-[ (2 , 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina

a) Dobivanje metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra 4-(1,3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,128 mmol, 47 mg) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (0,153 mmol, 32 mg) u dihlormetanu (1 ml) dodat je diizopropiletilamin (0,45 mmol, 77 ul) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, sve se

rastvorilo i dobiven bistar žut rastvor je mešan 15 sati na sobnoj temperaturi. Nastali smeđ rastvor je razblažen dihlormetanom (25 ml). Dihlormetanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 25 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (25 ml) i zasićenim vodenim rastvorom

natrijum-hlorida (25 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (4Om) kolone. Dobiveno je 52 mg (prinos 81%) metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil) -3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C24H23CI2N3O5(M+Na) 526,0907, nađeno 526,0912.

b) Dobivanje N-[(2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2, 6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil) -3-metil-L-fenilalanina (0,1 mmol, 59 mg) u etanolu (1 ml) dodat je 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (0,2 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je etanol udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (10 ml). Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (20 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HCl i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 15 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 20 mg (prinos 41%) N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C23II21CI2N3O5(M+Na) 512,0752, nađeno 512,0754.

Primer26

N-[ (2 , 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 ,4-

diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanin

a) Dobivanje metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-(1,3,6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenil-alanina

U suspenziju cinka u prahu (15 mmol, 0,98 g) u THF (1,5 ml) dodat je na sobnoj temperaturi 1,2-dibrom-etan (1 mmol, 0,13 ml). Ova suspenzija je zagrevana jakim fenom na 60-65°C dok nije prestalo izdvajanje gasovitog etilena. Zatim je suspenzija ohlađena na sobnu temperaturu, dodat je trimetilhlorsilan (0,5 mmol, 70 ul) i smeša je zatim mešana 15 minuta. Suspenzija 5-jod-1,3,6-trimetiluracila (2,5 mmol, 700 mg) u DMA (2 ml) je zagrejana da se dobije bistar rastvor i zatim je u jednoj porciji dodata u gornju reakcionu smešu. Posle dodavanja, reakciona smeša je zagrevana na 70°C u toku 3-4 sata posle čega je tankoslojna hromatografija alivotnog dela reakcione smeše, koji je razoren zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida, ukazala na odsustvo polaznog materijala. Zatim je reakciona smeša razblažena sa THF (3 ml) i potom ohlađena na sobnu temperaturu. Višak cinka u prahu je ostavljen da se slegne.

Gore dobiven rastvor koji sadrži cinkovo jedinjenje (2,5 mmol) je dodat u rastvor Pd(dba)2(0,05 mmol, 27 mg), trifurilfosfina (TFP) (0,2 mmol, 50 mg) i metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-jod-3-metil-L-fenilalanina (0,5 mmol, 277 mg) u THF (2 ml) pri sobnoj temperaturi i svetložuta smeša je mešana 15 sati na 45°C. Zatim je reakciona smeša sipana u zasićen vodeni rastvor amonijum-hlorida i ekstrahovana etilacetatom (3 x 30 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i osušeni iznad anhidrovnog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (4Om) kolone. Dobiven je 71 mg (prinos 30%) metil-estra N-(benziloksikarbonil)-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku žutog ulja. ES-HRMS m/e izračunato za C26H29N3O6(M+Na) 502,2173, nađeno 502,2174.

b) Dobivanje metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina

Smeša metil-estra N-(benziloksikarbonil)- A-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,145 mmol, 70 mg), cikloheksena (1 ml) i 10%-nog paladijuma na uglju (100 mg) u etanolu (2 ml) je zagrevana uz refluksovanje u toku 15 sati. Zatim je filtrirana kroz kolonu celita i kolona je ispirana etanolom (10 ml). Spojeni filtrat i ispirotine su koncentrovani pod sniženim pritiskom. Dobiveni ostatak je osušen pod visokim vakuumom dajući 36 mg (prinos 72%) metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku svetložute čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C18H23N3O4(M+Na) 368,1327, nađeno 368,1321.

c) Dobivanje metil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimeti1-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,089 mmol, 34 mg) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (0,1 mmol, 21 mg) u dihlormetanu (2 ml) dodat je diizopropiletilamin (0,4 mmol, 70 u.1) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, sve je prešlo u rastvor i dobiveni bistar žut rastvor je mešan 15 sati na sobnoj temperaturi. Nastali smeđi rastvor je razblažen dihlormetanom (25 ml). Dihlor-metanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 25 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (25 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (25 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 22 mg (prinos 48%) metil-estra N-[(2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina u obliku viskoznog ulja. ES-HRMS m/e izračunato za C25H25CI2N3O5(M+Na) 541,1065, nađeno 541,1063.

d) Dobivanje N-[(2, 6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1, 3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenil-alanina

U suspenziju metil-estra N-[ (2 , 6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanina (0,04 mmol, 22 mg) u etanolu (2 ml) dodat je 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (0,5 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je etanol udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (10 ml). Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (20 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 15 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 20 mg (prinos 93%) N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenil-alanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C23H21CI2N3O5[ (M-H)+2Na] 548,0725, nađeno 548,0733.

Primer 27

Etil-estar N-[ (2 , 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju N-[ (2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4-[l, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil]-L-fenilalanina (0, 6 mmol, 300 mg) i natrijum-bikarbonata (3,6 mmol, 302 mg) u DMF(4 ml) dodat je jodetan (3,6 mmol, 0,29 ml) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 72 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša sipana u vodu (50 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 20 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (60 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na silikagelu uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 155 mg (prinos 50%) etil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku kristalne bele čvrste materije: t.t. 262-265°C. ES-HRMS m/e izračunato za C25H25CI2N3O5(M+Na) 540,1062, nađeno 540,1049.

Primer 28

Dobivanje 2-[ (N,N-dietil) amino]etil-estra N-[ (2 , 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1,3,6-trimetil-2 , 4-diokso-5-

pirimidinil)-L-fenilalanina

Smeša N-[(2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (320 mg, 0,65 mmol), hidrohlorida 2-[ (N, N-dietil) aminojetil-hlorida (579 mg, 3,26 mmol) i kalijum-karbonata (451 mg, 3,27 mmol) u smeši etilacetata (5 ml) i vode (5 ml) držana je na sobnoj temperaturi preko noći. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan etilacetatom. Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida, osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i koncentrovani dajući 2-[ (N, N-dietil) amino]etil-estar N-[(2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (190 mg, 49%) u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C29H34Cl2N405(M+Na) 589, 1978, nađeno 589,1980.

Zakiseljavanje vodenog sloja je dalo nazad povraćen N-[(2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin (167 mg).

Primer 29

Dobivanje 2-[ (N,N-dietil) amino]etil-estra N-[ (2-hlor-6-

metilfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-

pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 28 i polazeći od N-[(2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i

hidrohlorida 2-[(N, N-dietil)amino]etil-hlorida dobiven je 2-[ (N, N-dietil) amino]etil-estar N-[ (2-hlor-6-metilf enil) - karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C30H37CIN4O5(M+H) 569,2525, nađeno 569,2530.

Primer 30

Dobivanje etil-estra N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 27 i polazeći od N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i jodetana dobiven je etil-estar N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil) -L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C26H28C1N305(M+H) 520, 1610, nađeno 520,1591.

Primer 31

Dobivanje 2-(4-morfolino)etil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trintefcil-2 , 4-diokso-5-pirimidinil) -L-fenilalanina

a) Dobivanje N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju metil-estra N-[ (1, 1-dimetiletoksi)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (8,8 mmol, 3,79 g) u etanolu (20 ml) dodat je 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (17,57 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je smeša razblažena vodom (50 ml) i etanol je udaljen pod sniženim pritiskom. Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (100 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 100 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (200 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 3,44 g (prinos 94%) N-[ (1,1-dimetiletoksi)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku svetlosmeđe penaste čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C2iH27N306(M+Na) 440,1792, nađeno 440,1792.

b) Dobivanje 2-(4-morfolino)etil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U rastvor N-[(1, 1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (1,21 mmol, 505 mg) i 2-(4-morfolino)etanola (2,42 mmol, 318 mg) u THF (8 ml) dodati su di-izo-propilkarbodiimid (DIC) (1,82 mmol, 0,287 ml) i 4-dimetilaminopiridin (0,6 mmol, 74 mg) na sobnoj temperaturi. Dobiveni rastvor je mešan 72 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša sipana u vodu (50 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 50 ml). Spojeni ekstrakti su sukcesivno ispirani vodom (2 x 50 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 428 mg (prinos 67%) 2-(4-morfolino)etil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C27H38N407(M+Na) 553,2633, nađeno 553,2636. c) Dobivanje hidrohloridne soli 2-(4-morfolino)etil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina Čvrst 2-(4-morfolino)etil-estar N-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]-4-(1,3, 6-1rimeti1-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (1,6 mmol, 0,85 g) je tretiran sa 4N rastvorom hlorovodonika u dioksanu (16,02 mmol, 4 ml) na sobnoj temperaturi i rastvor je mešan 3 sata pri čemu se formirao beli talog. Čvrste materije su razblažene dietiletrom, matični lug je dekantovan i dobiveni ostatak je prvo osušen na rotacionom vakuum uparivaču a zatim pod visokim vakuumom. Dobiveno je 0,75 g (prinos 99%) hidrohloridne soli 2-(4-morfolino)etil-estra 4-(l,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne žute čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C22H30N4O5(M+H) 431,2289, nađeno 431,2292. d) Dobivanje 2-(4-morfolino)etil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil) karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli 2-(4-morfolino)etil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,85 mmol, 399 mg) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (0,95 mmol, 0,201 g) u dihlormetanu (4 ml) je dodat diizopropiletilamin (DIPEA) (4,75 mmol, 0,66 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta se sve rastvorilo i dobiveni bistar žut rastvor je mešan 48 sati na sobnoj temperaturi. Rezultujući svetlosmeđi rastvor je razblažen dihlormetanom (50 ml). Dihlormetanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN hlorovodoničnom kiselinom (2 x 50 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (50 ml)

i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 0,427 (75%) 2-(4-morfolino)etil-estra N-[(2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije: t.t. 90-94°C. ES-HRMS m/e izračunato za C29H32Cl2N406(M+H) 603, 1772, nađeno 603, 1782.

Primer 32

Dobivanje 2-(4-morfolino)etil-estra N-[ (2-hlor-6-metil-f enil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 31 i polazeći od 2-(4-morfolino)etil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-hlor-6-metilbenzoil-hlorida dobiven je 2-(4-morfolino)etil-estar N-[(2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C30H35CIN4O6(M+H) 583,2318, nađeno 583,2326.

Primer 33

Dobivanje 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-pirimidinil) -L-fenilalanina

a) Dobivanje 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju N-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (1,006 mmol, 420 mg) i natrijum-bikarbonata (5,03 mmol, 422 mg) u DMF (8 ml) dodat je 1-hloretil-acetat (5,03 mmol, 616 mg) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 4 8 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša sipana u vodu (50 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 50 ml). Spojeni ekstrakti su sukcesivno ispirani vodom (2 x 50 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiveno je 390 mg (prinos 77%) 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C2sH33N308(M+Na) 526,2160, nađeno 526,2143.

b) Dobivanje hidrohloridne soli 1-(acetoksi)etil-estra 4-(1, 3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

Čvrst 1-(acetoksi)etil-estar N-[ (1,1-dimetiletoksi) - karbonil]-4 -(1,3,6-trimeti1-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin (1,4 mmol, 0,705 g) je tretiran sa 4N rastvorom hlorovodonika u dioksanu (20 mmol, 5 ml) na sobnoj temperaturi i rastvor je mešan 2 sata pri čemu se formirao beli talog. Smeša je razblažena dietiletrom i dihlormetanom i čvrste materije su sakupljene filtriranjem zatim ispirane dietiletrom. Posle sušenja na vazduhu dobiveno je 0,63 g (prinos 99%) hidrohloridne soli 1-(acetoksi)etil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne sive čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C20H26N3O6(M+H) 404,1816, nađeno 404,1818. c) Dobivanje 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1,3, 6-trimeti1-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli 1-(acetoksi)etil-estra 4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,723 mmol, 399 mg) i 2,6-dihlorbenzoil-hlorida (0,8 mmol, 0,17 g) u dihlormetanu (5 ml) je dodat diizopropiletilamin (DIPEA) (3,2 mmol, 0,45 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta se sve rastvorilo i dobiven bistar žut rastvor je mešan 48 sati na sobnoj temperaturi. Rezultujući svetlosmeđi rastvor je razblažen dihlormetanom (50 ml). Dihlormetanski sloj je sukcesivno ispiran sa IN hlorovodoničnom kiselinom (2 x 50 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (50 ml)

i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiveno je 0,312 g (prinos 67%) 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije: t.t. 168-170°C. ES-HRMS m/e izračunato za C27H27CI2N3O7(M+Na) 598, 1118, nađeno 598,1122.

Primer 34

Dobivanje 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (2-hlor-6-metil-f enil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-

pirimidinil)-L-fenilalanina

Primenjujući opšte postupke opisane u primeru 33 i polazeći od 1-(acetoksi)etil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina i 2-hlor-6-metil-benzoil-hlorida dobiven je 1-(acetoksi)etil-estar N-[(2-hlor-6-metilf enil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku bele čvrste materije: t.t. 84-88°C. ES-HRMS m/e izračunato za C28H30C1N3O-; (M+Na) 578, 1664, nađeno 578, 1665.

Primer 35

Dobivanje L-prolil-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-

pirimidinil)-L-fenilalanina

a) Dobivanje metilestra L-[ (1,1-dimetiletoksi)karbonil]-prolil-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju hidrohloridne soli metil-estra 4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (7 mmol, 2,57 g), HBTU (8,75 mmol, 3,32 g) i L-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]prolina (8,75 mmol, 1,88 g) u DMF (28 ml) dodat je diizopropiletilamin (21 mmol, 3,65 ml) na sobnoj temperaturi. Posle 2 minuta se sve rastvorilo i dobiveni bistar žut rastvor je mešan 48 sati na sobnoj temperaturi. Rezultujući tamnosmeđi rastvor je razblažen etilacetatom (100 ml). Etilacetatni sloj je sukcesivno ispiran sa IN vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 50 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (100 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (100 ml) i potom je osušen iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje rastvarača dali su sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 2,5 g (prinos 67%) metil-estra L-[ (1,1-dimetiletoksi)-karbonil]prolil-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C27H3SN4O7(M+Na) 551,2476, nađeno 551,2476.

b) Dobivanje L-[(1,1-dimetiletoksi)karbonil]prolil-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina

U suspenziju metil-estra L-[ (1,1-dimetiletoksi)-karbonil]prolil-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (1,51 mmol, 800 mg) u etanolu (8 ml) dodat je 1,0N vodeni rastvor natrijum-hidroksida (5 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 45-50°C i dobiveni bistar rastvor je mešan 3 sata. Etanol je udaljen pod sniženim pritiskom i dobiveni ostatak je razblažen vodom (25 ml). Vodeni rastvor je ispiran dietiletrom (50 ml) da se uklone bilo kakve neutralne nečistoće. Vodeni sloj je zakiseljen sa 1,0N HC1 i dobiveni proizvod je ekstrahovan etilacetatom (2 x 50 ml). Spojeni organski ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali 640 mg (prinos 83%) L-[(l,1-dimetiletoksi)-karbonil]prolil-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C26H34N407(M+Na) 537,2320, nađeno 537,2321.

c) Dobivanje L-prolil-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

Čvrst L-[ (1,1-dimetiletoksi) karbonil]prolil-4- (1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin (0,89 mmol, 4 62 mg) je tretiran sa 4N rastvorom hlorovodonika u dioksanu (16 mmol, 4 ml) pri sobnoj temperaturi i rastvor je mešan još 3 sata. Zatim je rastvarač udaljen u vakuumu i dobiveni ostatak je osušen u visokom vakuumu dajući sirov ostatak koji je trljan sa dihlormetanom, dietiletrom i acetonitrilom. Dobiveno je 395 mg (prinos 99%) hidrohloridne soli L-prolil-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne svetložute čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C21H26N4O5(M+H) 415, 1976, nađeno 415, 1976.

Primer36

Dobivanje etil-estra N-[ (2,6-difluorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina

U suspenziju N-[ (2, 6-dif luorfenil) karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,743 mmol, 340 mg) i natrijum-bikarbonata (5,94 mmol, 499 mg)

u DMF (3,8 ml) dodat je jodetan (5,94 mmol, 0,4 75 ml) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 4 8 sati na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša sipana u vodu (100 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 25 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (80 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40s) kolone. Dobiveno je 335 mg (prinos 93%) etil-estra N-[ (2,6-difluorfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku kristalne bele čvrste materije: t.t. 218-219°C. ES-HRMS m/e izračunato za C25H25F2N305(M+Na) 508, 1654, nađeno 508,1660.

Primer 37

Dobivanje2-[ (N,N-dietil) amino]etil-estraN-[ (2 ,6-dif luorfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-

pirimidinil)-L-fenilalanina

Smeša N-[ (2, 6-difluorfenil)karbonil]-4-(1, 3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (1,0 mmol, 460 mg), hidrohlorida 2-[(N,N-dietil) amino]etil-hlorida (8,05 mmol, 1,43 g) i kalijum-karbonata (8,05 mmol, 1,11 g) u etilacetatu (5 ml) i vodi (5 ml) mešana je na sobnoj temperaturi preko noći. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan etilacetatom (2 x 40 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (50 ml) i osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 426 mg (prinos 76%) 2-[ (N, N-dietil) amino]etil-estra N-[ (2, 6-dif luorfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C29H34F2N4O5(M+H) 557,2570, nađeno 557,2575.

Primer38

Dobivanje 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (2,6-difluorfenil)-karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2 , 4-diokso-5-pirimidinil) -L-fenilalanina

U suspenziju N-[(2, 6-dif luorfenil) karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina (0,743 mmol, 340 mg) i natrijum-bikarbonata (5,94 mmol, 499 mg) u DMF (3,0 ml) dodat je 1-hloretil-acetat (5,94 mmol, 0,73 g) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 4 8 sati na sobnoj temperaturi. Zatim je reakciona smeša sipana u vodu (50 ml) i ekstrahovana etilacetatom (3 x 25 ml). Spojeni ekstrakti su ispirani zasićenim vodenim rastvorom natrijum-hlorida (80 ml) i potom osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata. Filtriranje sredstva za sušenje i koncentrovanje filtrata su dali sirov proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silikagela uz primenu Biotage (40m) kolone. Dobiveno je 265 mg (prinos 66%) 1-(acetoksi)etil-estra N-[ (2,6-difluorfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina u obliku amorfne bele čvrste materije. ES-HRMS m/e izračunato za C27H27F2N3O7(M+Na) 566, 1709, nađeno 566,1710.

Primeri bioloških proba

Primer A

VLA-4/VCAM-1 proba klasifikovanja (prosejavanja)

Antagonistička aktivnost VLA-4, koja je definisana kao sposobnost da se nadmeće za vezivanje za imobilisan VCAM-1, kvantifikovana je uz primenu ELISA probe sa dualnim antiteiima na čvrstoj fazi. Za VCAM-1 vezan VLA-4 (OC4P1integrin) je detektovan pomoću kompleksa anti-integrinskog piantitela: HRP-konjugovanog anti-mišjeg IgG: hromogenog supstrata (K-plavo). U početku je ovo zahtevalo prevlačenje pločica sa 96 udubljenja (Nunc Maxisorp) sa rekombinantnim humanim VCAM-1 (0,4 ug u 100 jrl PBS) , zatvaranje svake pločice i zatim ostavljanje pločica da stoje pri 4°C u toku 18 sati. Pločice prevučene sa VCAM su zatim blokirane sa 250 ul 1%-nog BSA/0,02%-nog NaN3 da se smanji nespecifično vezivanje. Na dan izvođenja probe, sve pločice su dva puta ispirane sa puferom za VCAM probu (200 ui/udubljenje 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM MnCl2, 0,05% Tween 20, pH 7,4). Testirana jedinjenja su rastvorena u 100%-nom DMSO a zatim razblažena 1:20 u puferu za VCAM probu kome je dodat 1 mg/ml BSA (tj., finalni DMSO = 5%). Izvršena je serija razblaženja 1:4 da se postigne opseg koncentracije od 0,005 nM - 1,563 uM za svako testirano jedinjenje. Na pločice prevučene sa VCAM-om dodato je 100 ul/udubljenje od svakog razblaženja, čemu je sledilo 10 ul VLA-4 koji potiče od Ramos-ovih ćelija. Ove pločice su uzastopno mešane na platformi za mućkanje u toku 1 minut, inkubirane 2 sata na 37°C i zatim ispirane četiri puta sa 200 ul/udubljenje pufera za VCAM probu. U svako udubljenje je dodato po 100 ul mišjeg anti-humanog integrinskog pi antitela (0,6 ug/ml u puferu za VCAM probu + 1 mg/ml BSA) i ostavljeno da se inkubira 1 sat na 37°C.Na završetku ovog perioda inkubacije, sve pločice su ispirane četiri puta sa puferom za VCAM probu (200 ul/udubljenje). Zatim je u svako udubljenje dodato odgovarajuće drugo antitelo, HRP-konjugovan kozji anti-mišji IgG (100 ul/udubljenje @ 1:800 razblaženje u puferu za VCAM probu + 1 mg/ml BSA), čemu je sledilo inkubiranje u toku 1 sat na sobnoj temperaturi i zaključeno sa tri ispiranja (200 ul/udubljenje) puferom za VCAM probu. Razvijanje boje je započeto dodavanjem 100 ul/udubljenje K-plavog (inkubacija u toku 15 minuta, sobna temperatura) i završeno (prekinuto) dodavanjem 100 ul/udubljenje crvenog pufera za stopiranje. Sve pločice su zatim čitane na UV/Vis spektrofotometru na 650 nm. Rezultati su izračunati kao %-na inhibicija ukupnog vezivanja (tj., VLA-4 + VCAM-1 u odsustvu testiranog jedinjenja). Dobiveni rezultati su dati u sledećoj Tabeli I (A = IC50< 1 nM, B = IC50< 10 nM) :

Primer B

Protokol probe klasifikovanja na bazi Ramos-ovih

(VLA-4)/VCAM-1 ćelija

Materij ali:

Rastvorni rekombinantni humani VCAM-1 (smeša 5- i 7-Ig domena) je prečišćen iz medija za gajenje CHO ćelija pomoću imunoafinitetne hromatografije i održavan u rastvoru koji sadrži 0,1 M Tris-glicin (pH 7,5), 0,1 MNaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,02% NaN3i 10 ug/ml leupeptina. Calcein-AM je prodavala firma Molecular Probes Inc.

Metode:

Antagonistička aktivnost VLA-4 (ct4piintegrina) , koja je definisana kao sposobnost da se nadmeće (bori) sa VLA-4 sa ćelijske površine za vezivanje za imobilisani VCAM-1, kvantifikovana je uz primenu probe adhezije Ramos-ovih VCAM-1 ćelija. Ramos-ove ćelije, koje nose VLA-4 sa površine ćelija, su obeležene fluorescentnom bojom (Calcein-AM) i ostavljene da vežu VCAM-1 u prisustvu ili odsustvu testiranih jedinjenja. Smanjenje jačine fluorescencije vezano za adherentne ćelije (% inhibicije) reflektovalo je kompetitivnu inhibiciju adhezije ćelija posredovanu sa VLA-4.

U početku je ovo zahtevalo prevlačenje pločica (Nunc Maxisorp) sa 96 udubljenja sa rekombinantnim humanim VCAM-1 (100 ng u 100 ul PBS), zatvaranje svake pločice i zatim ostavljanje pločica da stoje pri 4°C u toku 18 sati. Pločice prevučene sa VCAM su dva puta uzastopno ispirane sa 0,05%-nim Tween-20 u PBS a zatim blokirane u toku 1 sat (sobna temperatura) sa 200 ul blokirajućeg pufera (1% BSA/0,02% timerosal) da se smanji nespecifično vezivanje. Posle inkubacije sa blokirajućim puferom pločice su preokrenute, osušene upijanjem i preostali pufer je aspirovan (isisan u parnom stanju). Svaka pločica je zatim ispirana sa 300 ul PBS, preokrenuta i preostali PBS je aspirovan (isisan u parnom stanju).

Testirana jedinjenja su rastvorena u 100%-nom DMSO a zatim razblažena 1:25 u puferu za probu adhezije VCAM ćelija (4 mM CaCl2, 4 mM MgCl2u 50 mM TRIS-HC1, pH 7,5)

(finalni DMSO = 4%). Izvršena je serija od osam razblaženja 1:4 za svako jedinjenje (generalni opseg koncentracije od 1 nM - 12.500 nM). Na pločice prevučene sa VCAM-om dodato je 100 ul/udubljenje od svakog razblaženja, čemu je sledilo 100 ul Ramosovih ćelija (200.000 ćelija/udubljenje u 1%-nom BSA/PBS). Pločice koje sadrže testirana jedinjenja i Ramosove ćelije su ostavljene da se inkubiraju u toku 45 minuta na sobnoj temperaturi, posle čega je dodato 165 ul/udubljenje PBS. Pločice su preokrenute da se uklone neadherentne ćelije, osušene upijanjem i dodato je 300 ul/udubljenje PBS.Pločice su ponovo preokrenute, osušene upijanjem i preostali pufer je blago aspirovan (isisan u parnom stanju). U svako udubljenje je dodato 100 ul pufera za liziranje (0,1% SDS u 50 mM TRIS-HC1, pH 8,5) i mešano 2 minuta na rotacionoj platformi za mućkanje. Pločice su zatim čitane u odnosu na jačinu fluorescencije na sistemu Cvtofluor 2300 (Millipore) za merenje fluorescencije (ekscitacija = 485 nm, emisija = 530 nm). Dobiveni rezultati su prikazani na sledećoj Tabeli II, gde (A = IC50< 100 nM, B = IC5o< 10.000 nM) :

Primer C

ProtokolCI4P7probe

Dve nedelje do jedan dan pre probe, Nunc visoko-vezujuće F96 Maxisorp imuno-pločice, #442404 ili #439454, prevučene su sa 25 ng/udubljenje (0,25 ug/ml) MadCam u zapremini od 100 ug/udubljenje. Pločice su pokrivene zatvaračem i umotane u omot od šarana čemu je sledila inkubacija u frižideru u toku najmanje 24 sata. Upotrebljen pufer za prevlačenje je bio: 10 mM karbonatni/bikarbonatni pufer načinjen od: 0,8 g/l natrijum-karbonata i 1,55 g/l natrijum-bikarbonata, podešen na pH 9,6 sa IN HC1. Puferi za probu su se sastojali od sledećih pufera:

Pločice su dva puta ispirane puferom i zatim blokirane na sobnoj temperaturi u toku najmanje 1 sat sa blokirajućim puferom. Zatvorene pločice su ponekad blokirane preko noći u frižideru. Pločice su zatim ispirane sa PBS i ručno osušene do suva upijanjem.

Preostala tečnost je aspirovana (usisana u parnom obliku) iz udubljenja*

Dovoljno RPMI 8866 ćelija je uklonjeno iz skladišta za probu (2xl0<6>ćelija/ml x 10 ml/pločica x broj pločica) i stavljeno u kivetu za centrifugu. Kivete su punjene do zapremine sa PBS i rotirane pri 200 x G u toku 8 minuta. Pufer je odliven i ćelije su ponovo suspendovane do 10xl0<6>ćelija/ml u PBS i zatim je dodat skladišni rastvor kalceina u DMSO (5 mg/ml) pri 5 ul/ml suspenzije ćelija. Suspenzija je inkubirana 30 minuta pri 37°C u mraku. Ćelije su zatim ispirane sa PBS. PBS je odliven i ćelije su ponovo suspendovane u ćelijskom puferu pri koncentraciji od 2xl0<6>ćelija/ml za prevlačenje u probi.

Napravljeni su skladišni rastvori testiranih jedinjenja pri željenih 25 prvih razblaženja u 100%-nom DMSO. Prva razblaženja za standardnu probu, kao i za testirana jedinjenja bila su 1:25 u čistom vezujućem puferu, dok je ostatak serijskih razblaženja bio u razblažujućem puferu (vezujući pufer/4% DMSO). Skladišne koncentracije i razblaženja jedinjenja za klasifikovanje (prosejavanje) su određene pomoću unapred (anticipirane) predviđene aktivnosti.

Za probu je 129 ul vezujućeg pufera prevučeno u prvi red udubljenja a 100 ul razblažujućeg pufera je prevučeno u preostala udubljenja. Alikvotni deo od 5,4 ul svakog jedinjenja je pipetiran u triplikatu u odgovarajuća obeležena udubljenja. Jedinjenja su dalje sukcesivno razblažena niz ploču (34 ul + 100 ul => četvorostruko razblaženje). Za kontrolnu probu, 100 ul razblažujućeg pufera + 100 ul ćelijskog pufera je prevučeno u nespecifična udubljenja sa fonom (bez ćelija, bez jedinjenja) i 100 ul razblažujućeg pufera + 100 ul ćelija je prevučeno u ukupna vezujuća udubljenja (bez jedinjenja = 100%-no vezivanje). U svako udubljenje koje sadrži jedinjenje dodate su obeležene ćelije pri 2xl0<6>ćelija/ml, 100 ul/udubljenje (= 2xl0<5>ćelija/udubljenje). Pločice su zatvorene i inkubirane u mraku u toku 45 minuta pri sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, nevezane ćelije su uklonjene dodavanjem 150 ul/udubljenje PBS. Pločice su preokrenute, osušene upijanjem na papirnim ubrusima i ispirane pažljivim dodavanjem 200 ul PBS u udubljenja i ponovo osušene upijanjem. Preostali pufer je pažljivo aspirovan (isisan u parnom stanju) iz ovih udubljenja. U svako udubljenje je dodato finalnih 100 ul PBS.

Pločice su zatim čitane u odnosu na jačinu fluorescencije na sistemu Cvtofluor 2300 (Millipore) za merenje fluorescencije (ekscitacija = 485 nm, emisija = 530 nm). Vrednosti IC50svakog jedinjenja su određene pomoću linearne regresione analize. Dobiveni rezultati su prikazani na sledećoj Tabeli III:

Claims (36)

1. Jedinjenje formule I: u kojoj Ri označava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik, Ci-6alkil, Ci-6alkoksi, cikloalkil, aril, aril Ci-6alkil, nitro, cijan, Ci_6alkiltio, Ci_6alkilsulf inil, Ci_6alkilsulfonil, Ci_6alkilkarbonil, halogen ili perfluor Ci_6alkil i najmanje jedan od R22i R23je različit od vodonika; i R24označava vodonik, Ci-6alkil, Ci-6alkoksi, aril, nitro, cijan, Ci_6alkilsulfonil ili halogen; ili Rioznačava grupu formule Y-2, koja označava petočlani ili šestočlani heteroaromatični prsten koji je vezan preko atoma ugljenika za amidni karbonil pri čemu pomenuti prsten sadrži jedan, dva ili tri heteroatoma odabrana iz grupe koja se sastoji od N,

0 i S i jedan ili dva atoma pomenutog prstena su nezavisno supstituisani Ci-6alkilom, cikloalkilom, halogenom, cijan-grupom, perfluoralkilom ili arilom i najmanje jedan od pomenutih supstituisanih atoma je susedan atomu ugljenika vezanom za amidni karbonil; R2označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci_6alkil, aril Ci-6alkil ili aril; R3označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci- 6 alkil, aril Ci-6alkil ili aril; R4označava vodonik, halogen, Ci-6alkil, supstituisan Ci-6alkil ili aril; R5označava vodonik, Ci-6alkil, hlor ili Ci_6alkoksi; R6označava vodonik, Ci-6alkil, Ci_6alkilkarboniloksi Ci-6alkil, supstituisan Ci-6alkil, ili R6označava grupu formule P-3: u kojoj R32označava vodonik ili Ci_6alkil; R33označava vodonik, Ci-6alkil, aril; R34označava vodonik ili Ci-6alkil; h je ceo broj od 0 do 2; g je ceo broj od 0 do 2; zbir h i g iznosi 1 do 3, ili R6označava grupu formule P-4: u kojoj su R32, g i h definisani kao što je gore dato, Q' označava 0, S, -(CH2)j- ili grupu formule N-R35, u kojoj R35označava vodonik, Ci_6alkil, Ci_6alkilkarbonil, Ci_6alkoksikarbonil; j je 0, 1 ili 2; ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; pri čemu termin "supstituisan Ci_6alkil" označava Ci_6alkil grupu koja je supstituisana jednom ili sa više grupa odabranih nezavisno od grupa cikloalkil, nitro, ariloksi, aril, hidroksi, halogen, cijan, Ci-6alkoksi, Cx_6alkilkarbonil, Ci-6alkiltio, Ci_ealkilsulfinil, Ci-6alkilsulfonil, amino i mono ili di Ci-6alkil amino; termin "aril" označava mono- ili bicikličku aromatičnu grupu; termin "cikloalkil" označava tročlani do sedmočlani karbociklični prsten.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što R2označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci-6 alkil, aril Ci-6alkil ili aril; R3označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci-6 alkil, aril Ci_6alkil ili aril; i R4označava vodonik, Ci-6alkil, perfluor Ci-6 alkil ili aril.

3. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što R2označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci-6 alkil ili aril; R3označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci_e alkil ili aril; i R4označava vodonik, halogen, Ci_6alkil, supstituisan Ci_6alkil ili aril.

4. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-3, naznačeno time, što R2označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci-6 alkil ili aril; R3označava vodonik, Ci-6alkil, supstituisan Ci-6 alkil ili aril; i R4označava vodonik, Ci-6alkil, perf luor Ci-6 alkil ili aril.

5. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-4, naznačeno time, što R4označava vodonik, Ci-&alkil, ili perf luor Ci_6alkil.

6. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-4, naznačeno time, što Rioznačava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju Ci-6alkil ili halogen; i R24označava vodonik.

7. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-4, naznačeno time, što Rioznačava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik ili halogen; i R24označava Ci-6alkoksi.

8. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-4 formule I: u kojoj Riima značenje kao što je definisano u zahtevu 1; R2označava Ci_6alkil; R3označava Ci_6alkil; R4označava vodonik, perf luor Ci-6alkil, ili Ci_6alkil; R5označava vodonik ili Ci-6alkil; i R6označava vodonik, Ci-6alkil, Ci-6alkilkarboniloksi Ci-6alkil, ili R6označava grupu formule P-3 kao što je definisana u zahtevu 1, ili R6označava grupu formule P-4 kao što je definisana u zahtevu 1.

9. Jedinjenje prema zahtevu 8, naznačeno time, što Ri označava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju perfluor Ci_6alkil, Ci-6alkil, ili halogen; i R24 označava vodonik.

10. Jedinjenje prema zahtevu 9, naznačeno time, što R2i R3označavaju Ci-6alkil, R4označava vodonik ili Ci-6alkil, i R5i R6označavaju vodonik.

11. Jedinjenje prema zahtevu 10, naznačeno time, što je

N-[(2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[ (2-brom-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[(2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[(2-etil-6-metilfenil) karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin;

N-[[2- (2-metiletil) -6-metilfenil]karbonil]-4- (1,3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin;

N-[(2, 6-dif luorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[[2-fluor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin;

N-[[2, 6-di- (2-metiletil) fenil]karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[(2-hlor-6-etilfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[ (2-hlor-6-propilfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[ (2-hlor-6- (2-metiletil) fenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin;

N-[(2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; ili N-[(2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dietil-6-metil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin.

12. Jedinjenje prema zahtevu 10, naznačeno time, što je N-[ (2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; N-[ (2-brom-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin; ili N-[ (2-brom-5-metoksifenil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanin.

13. Jedinjenje prema zahtevu 9, naznačeno time, što R2i R3označavaju Ci-6alkil; R4označava vodonik ili Ci-6alkil, R5označava vodonik i R6označava vodonik, Ci-6alkilkarboniloksi Ci-6alkil, Ci-6alkil, ili R6označava grupu formule P-3: u kojoj R32označava vodonik ili Ci_6alkil, R33označava vodonik, Ci-6alkil ili aril; R34označava vodonik ili Ci-6alkil; h je ceo broj od 0 do 2; g je ceo broj od 0 do 2; zbir higjeldo3; ili R6označava grupu formule P-4: u kojoj su R32, g i h definisani kao što je gore dato; Q' označava 0, S, -(CH2)j- ili grupu formule N-R35, u kojoj R35označava vodonik.

14. Jedinjenje prema zahtevu 13, naznačeno time, što R6označava Ci- 6 alkil.

15. Jedinjenje prema zahtevu 14, naznačeno time, što je etil-estar N-[ (2, 6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimiđinil)-L-fenilalanina; etil-estar N-[ (2-hlor-6-metilfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina; ili etil-estar N-[(2,6-difluorfenil)karbonil]-4-(1, 3, 6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina.

16. Jedinjenje prema zahtevu 13, naznačeno time, što R6označava Ci-6alkilkarboniloksi Ci-6alkil.

17. Jedinjenje prema zahtevu 16, naznačeno time, što je 1-(acetoksi)etil-estar N-[(2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenil-alanina; 1-(acetoksi)etil-estar N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina; ili

1- (acetoksi)etil-estar N-[(2,6-difluorfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina.

18. Jedinjenje prema zahtevu 13, naznačeno time, što Rćoznačava grupu formule P-3 u kojoj R32označava vodonik, R33i R34označavaju Ci-6alkil; h je 1; i g je 0.

19. Jedinjenje prema zahtevu 18, naznačeno time, što je

2- [ (N, N-dietil) amino]etil-estar N-[ (2, 6-dihlorfenil) - karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina;

2-[ (N,N-dietil) amino]etil-estar N-[ (2-hlor-6-metil-fenil)karbonil]-4-(1,3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina; ili 2-[(N, N-dietil) amino]etil-estar N-[(2, 6-dif luorfenil) - karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina.

20. Jedinjenje prema zahtevu 13, naznačeno time, što R6označava grupu formule P-4 u kojoj R32označava vodonik; h je 1; g je 0; i Q' je 0.

21. Jedinjenje prema zahtevu 20, naznačeno time, što je 2-(4-morfolino)etil-estar N-[(2,6-dihlorfenil)-karbonil]-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina; ili 2-(4-morfolino)etil-estar N-[ (2-hlor-6-metilfenil)-karbonilj-4-(1,3,6-trimetil-2,4-diokso-5-pirimidinil)-L-fenilalanina.

22. Jedinjenje prema zahtevu 9, naznačeno time, što R2i R3 označavaju C3.-6 alkil; R4označava perf luor Ci-6alkil, i R5 i R6označavaju vodonik.

23. Jedinjenje prema zahtevu 22, naznačeno time, što je N-[l-(2,6-dihlorfenil)karbonil]-4-[l,3-dimetil-2,4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanin; N-[(2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6- (trifluormetil) -5-pirimidinil]-L-fenilalanin; ili N-[[2-f luor-6- (trifluormetil) fenil]karbonil]-4-[l, 3-dimetil-2, 4-diokso-6-(trifluormetil)-5-pirimidinil]-L-fenilalanin.

24. Jedinjenje prema zahtevu 9, naznačeno time, što R2i R3označavaju Ci-6alkil; R4označava vodonik; R5označava Ci_6alkil; i R6označava vodonik.

25. Jedinjenje prema zahtevu 24, naznačeno time, što je N-[(2-hlor-6-metilfenil) karbonil]-4- (1, 3-dimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanin; N-[l- (2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4-(1, 3-dimetil-2,4-diokso-5-pirirnidinil)-3-metil-L-fenilalanin; ili N-[ (2, 6-dihlorfenil) karbonil]-4- (1, 3, 6-trimetil-2, 4-diokso-5-pirimidinil)-3-metil-L-fenilalanin.

26. Jedinjenje prema zahtevu 8, naznačeno time, što R2i R3označavaju Ci-6alkil; i R4označava vodonik, i R5i R6označavaju vodonik.

27. Jedinjenje prema zahtevu 26, naznačeno time, što Rioznačava grupu formule Y-l.

28. Jedinjenje prema zahtevu 26, naznačeno time, što Ri označava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju Ci-6alkil ili halogen; i R24označava vodonik.

29. Jedinjenje prema zahtevu 27, naznačeno time, što Rioznačava grupu formule Y-l u kojoj R22i R23nezavisno jedan od drugog označavaju vodonik ili halogen; i R24označava Ci-6alkoksi.

30. Jedinjenje prema zahtevu 26, naznačeno time, što Rioznačava petočlani ili šestočlani heteroaromatični prsten koji je vezan preko atoma ugljenika za amidni karbonil pri čemu pomenuti prsten sadrži jedan, dva ili tri heteroatoma odabrana iz grupe koja se sastoji od N, 0 i S i jedan ili dva atoma pomenutog prstena su nezavisno supstituisani Ci-6alkilom, cikloalkilom, halogenom, cijan-grupom, perfluoralkilom, ili arilom i najmanje jedan od pomenutih supstituisanih atoma je susedan atomu ugljenika vezanom za amidni karbonil.

31. Jedinjenje formule u kojoj su R2-R5definisani kao što je dato u zahtevu 1, i Pioznačava terc-butiloksikarbonil-(Boc) ili karbobenziloksi-grupu, i P2označava Ci-6alkil ili supstituisan Ci-6alkil.

32. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-30 za primenu kao lek.

33. Farmaceutska smeša koja sadrži jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-30 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač.

34. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-30 za primenu u lečenju bolesnih stanja posredovanih vezivanjem VCAM-1 ili VLA-4 ili ćelija koje istiskuju (ekspresuju) VLA-4, naročito u lečenju reumatoidnog artritisa, multipla skleroze, zapaljive bolesti creva i astme.

35. Postupak za proizvodnju farmaceutske smeše, naznačen time, što obuhvata dovođenje jedinjenja prema bilo kojem od zahteva 1-30 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i kompatibilnog farmaceutskog nosača u galenski oblik davanja.

36. Primena jedinjenja prema bilo kojem od zahteva 1-30 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u proizvodnji leka za lečenje reumatoidnog artritisa, multipla skleroze, zapaljive bolesti creva i astme.