RS50143B - Postupak za pcr ispitivanje pomešanih uzoraka krvi - Google Patents

Abstract

Postupak za identifikovanje virusno pozitivnih donacija bioloških fluida, naznačen time, što obuhvata:obezbeđivanje većeg broja donacija biološkog fluida.definisanje jedne n-dimenzione matrice, gde je n jedan ceo broj veci od 1, pri čemu matrica sadrži veći broj elemenata, a svaki od elemenata je definisan presekom n-dimenzija matrice, i obeležen oznakom elementa, pri čemu oznaka elementa sadrži jednu indeksnu vrednost za svaku od dimenzija matrice, uzimanje jednog uzorka od svake donacije bioloških fluida, pridodavanje svakog uzorka po jednom pripadajućem od svakog elementa matrice, pri čemu je svaki pojedinačni uzorak identifikovan svojim odgovarajućim elementima u odnosu na matrično obeležavanje, uzimanje alikvota od svakog uzorka, pri čemu je broj alikvota uzet od svakog uzorka definisanog brojem dimenzija koje karakterišu matricu, obrazovanje mešavina od alikvota od svakog od uzoraka, pri čemu svaka od mešavina sadrži po jedan alikvot od uzoraka defmisanih matričnom oznakom u kojoj je jedna dimenziona vrednost indeksa fiksirana, pa je svaka od tih mešavina identifikovana pomenutom fiksiranom dimenzionom vrednošću indeksa, PCR ispitivanje svake mešavine na indikaciju virusa, određivanje pripadajućih dimenzionih indeksa mešavina koje daju pozitivnu indikaciju virusa, i kombinovanje dimenzionih vrednosti indeksa u jednu matričnu oznaku elementa čime se jednoznačno identifikuje jedan jedini matrični element definisan matričnom oznakom koja označava jedan virusno pozitivan uzorak. Prijava sadrži još 11 zavisnih zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE U KOJU SPADA PRONALAZAK

Ovaj se pronalazak uopšteno odnosi na sisteme i na postupke za pripremanje i analizu uzoraka đobijenih od davalaca da bi se pojedinačno iđentifikovali davaoci koji su zaraženi virusom. Tačnije, pronalazak se odnosi na uređaj i postupak za obrazovanje pojedinačnih, posebno hermetički zatvorenih, i međusobno povezanih sudova koji sadrže uzorke iste plazme koja se nalazi u izvađenoj krvi. Pronalazak se takođe odnosi na uređaj i postupak za obrazovanje mešavina za početna pretraživanja iz posuđa u kojima se drži plazma i za ispitivanje mešavina na prisustvo nekog virusa u skladu sa jednim algoritmom radi iđentifikovanja pojedinačnih zagađenih uzoraka uzete krvi pri najmanjem broju ciklusa ispitivanja.

PROBLEM KOJI SE REŠAVA OVIM PRONALASKOM

Pronalaskom se rešava problem kako iz većeg broja donacija krvi izdvojiti onu ili one donacije dobijene od davalaca zaraženih nekim virusom, i kako izraditi potrebnu opremu?

POZNATO STANJE TEHNIKE

Programi davanja krvi, plazme i biološkog fluida jesu suštinski prvi stupnjevi za izradu farmaceutskih proizvoda i proizvoda od krvi koji poboljšavaju kvalitet života i koji se koriste za spašavanje života u raznim traumatskim situaci-jama. Ti se proizvodi koriste za lečenje imunoloških poremećaja, za lečenje hemofilije, a takođe se koriste za održavanje i obnavljanje zapremine krvi u hi-rurškim procedurama i drugim protokolima lečenja. Terapeutska primena krvi, plazme i bioloških fluida zahteva da pribavljene količine tih materijala budu što je najviše moguće obezbeđene od zagađivanja virusima. Obično se jedan uzorak za serološka ispitivanja od svake pojedinačne izvađene količine krvi, plazme ili drugih fluida proverava na razna antitela koja se obrazuju kao odgovor na specifične viruse, kao što je hepatitis C (HCV) i dva oblika humanog virusa gubitka imuniteta kod čoveka (HIV-1 i HIV-2). Pored toga, uzorak za serološko ispitivanje može se ispitati na antitela naznačena za posebne viruse kao što je hepatitis (HBV), kao i na antitela izazvana kao odgovor na te viruse. Ako je uzorak serološki pozitivan na prisustvo bilo kod of specifičnih antitela ili antigena, ta se izvađena količina krvi, ili donacija, isključuje iz dalje upotrebe.

Dok se za antigensko ispitivanje na izvesne viruse, kao što je hepatitis B, smatra daje u bliskoj vezi sa infektivnošću, ispitivanja na antitela nisu. Odavno je poznato da neki davalac krvne plazme može, u stvari, da bude zaražen nekim virusom a da serološko ispitivanje na antitela povezana sa tim virusom bude negativno. Tako, na primer, postoji mirovanje od momenta kada je davalac zara-žen nekim virusom do pojave antitela, izazvanih kao odgovor na taj virus, u dava-očevom sistemu. Taj vremenski period između prve pojave virusa u krvi i prisustva primetljivih antitela obrazovanih kao reagovanje na taj virus poznat je kao "period mirovanja". U slučaju HlV-a, prosečan period mirovanja je približno 22 dana, dok je za za HCV prosečan period mirovanja procenjen na približno 98 dana. Zbog toga ispitivanje usmereno na otkrivanje antitela može dati pogrešna pokazivanja za inficiranog davaoca ako se vrši tokom perioda mirovanja, tj. perioda izmeđi zaraživanja virusom i obrazovanja antitela. Pored toga, mada kon-vencionalno ispitivanje na HBV obuhvata ispitivanja i na antitela i na antigene, ispitivanja osetljivijim postupcima potvrdila su prisustvo HBV virusa u uzorcima koji su bili negativni kod ispitivanja na HBV antigene.

Jedan postupak za ispitivanje donacije koja je prošla postojeća isptivanja na antitela i antigene obuhvata ispitivanje donacija postupkom lančane reakcije polimeraze (PCR). PCR je veoma osetljiv postupak za otkrivanje prisustva spe-cifičnih DNK ili RNK sekvenci povezanih sa nekim od interesantnih virusa u bio-loškom materijalu pojačavanjem virusnog genoma. Pošto je PCR test usmeren na otkrivanje jedne od bitnih komponenata samog virusa, njegovo se prisustvo kod nekog od davalaca može utvrditi skoro neposredno posle inficiranja. Zbog toga tu, teretski, nema perioda mirovanja tokom koga bi ispitivanje moglo dati pogre-šno pokazivanje da nema infekcije. Pogodan opis metodologije i praktične pri-mene PCR ispitivanja sadržani su u američkom patentu br. 5,176,995 čiji je prikaz ovde uključen kao literatura.

PCR ispitivanje je, međutim, veoma skupo, a pošto opšta populacija davalaca obuhvata relativno mali broj PCR pozitivnih davalaca, pojedinačno ispitivanje svake od donacija nije ekonomično, odnosno nije ekonomski prihvatljivo. Zbog toga se traži efikasan i ekonomičan postupak za ispitivanje velikog broja donacija krvi ili plazme, radi uklanjanja jedinica koje su zagađene virusima preko nekog unapred određenog nivoa.

Jedan postupak za ispitivanje velikog broja pojedinačnih donacija plazme jeste da se pomeša izvestan broj tih pojedinačnih donacija. Ta se mešavina potom ispituje PCR postupkom i pojedinačne donacije koje sačinjavaju mešavinu ili se zadržavaju ili se odbacuju, u zavisnosti od ishoda PRC ispitivanja. Mada smanjuje broj PCR ispitivanja, kao i troškove povezane sa njima, ovaj postupak dovodi do gubitka značajnog dela materijala koji ne sadrži viruse. Pošto će jedna jedina donacija zaražena virusom iznad jednog unapred određenog nivoa izazvati da mešavina reaguje PCR pozitivno, ostale donacije koje sačinjavaju tu mešavinu mogu pojedinačno sve biti PCR negativne. Ovaj je rezultat veoma verovatan s obzirom na to da u opštoj populaciji davalaca postoji relativno mali broj PCR pozitivnih davalaca. Kod konvencionalnog pristupa mešanju, sve se donacije posle pozitivnog PCR rezultata bacaju, uključujući i one koje su pojedinačno PCR negativne.

Pored toga, dobijeni materijali, odnosno donacije plazme, često se po prijemu zamrznu. Kada su potrebni uzorci pojedinačnih donacija plazme radi obrazovanja mešavine, svaka se od njih mora odmrznuti, iz nje se vadi određena koli-čina krvi ili plazme, pa se donacija mora ponovo zamrznuti radi čuvanja. Više-struki ciklusi zarnrzavanja/ođmrzavanja mogu negativno uticati na dobijanje interesantne RNK ili DNK kao i proteina koji se nalaze u plazmi, što će nepovoljno uticati na celovitost PCR ispitivanja. Sem toga, svaki put kada se izvlači jedna određena količina plazme iz pojedinačnih donacija radi obrazovanja mešavine, donacija je podložna zagađivanju, i od okolne sredine i od pribora koji se koriste za izvlačenje te količine plazme. Pored toga, ako plazma iz jedne donacije sadrži neki virus, ona može zagaditi ostale donacije. Da bi se izbeglo unošenje virusnih zagađivača u neku donaciju koja nije bila zagađena virusima, uređaj za uzimanje uzoraka se mora ili sterilisati posle svake pojedine upotrebe, ili se koristiti za uzimanje samo jedne jedine količine iz jedne jedine pojedinačne donacije, s tim da se novi uređaj za uzimanje uzoraka koristi za uzimanje potrebne količine iz sledeće pojedinačne donacije. Oba ova postupka izazivaju znatne troškove i zahtevaju veliki utrošak vremena.

Prema tome, postoji potreba za postupak i sistem za dobijanje većeg broja uzoraka krvi ili plazme iz pojedinačnih donacija tako da se ti posebni uzorci mogu pomešati bez zagađivanja preostalih uzoraka. Takođe je poželjno da su postupak i sistem u stanju da obrazuju takve mešavine na brz i efikasan način, a da ne dođe ni do zaražavanja laboratorijskih tehničara ni do zagađivanja atmosfere u laboratoriji za ispitivanje.

Poželjno je, pored toga, da postupak i sistem obezbede efikasno i ekonomično ispitivanje dobijene krvi ili plazme radi identifikovanja samo pojedinačnih PCR pozitivnih donacija sa najmanjim mogućim brojem ciklusa ispitivanja.

PREGLED PRONALASKA

Kod praktičnog izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je ekonomičan i efikasan postupak za pripremanje i ispitivanje uzoraka od većeg broja donacija krvi ili plazme radi pojedinačnog identifikovanja donacija koje su inficirane virusom kao i sistemi i uređaji za praktično izvođenje postupka.

Postupak prema ovom pronalasku daje proizvode od krvi i plazme koji su znatno bezbedniji pošto se može lako i neposredno vršiti ispitivanje na zagađivanje obavljene krvi ili plazme. Ekonomično, vrlo osetljivo ispitivanje može se vršiti odmah po prijemu a zagađene donacije identifikovati ne vodeći računa o periodu mirovanja posle inficiran)a.

Kod jednog praktičnog izvođenja ovog pronalaska, postupak obuhvata stupanj unošenja donacija krvi ili plazme u jedan sabirni sud. Jedan savitljiv sabirni segment je priključen na sud i otvorenje prema unutrašnjosti suda. Sabirni se segment napuni krvlju ili plazmom iz sabirnog suda pa se deo sabirnog segmenta hermetički zatvori sa oba kraja. Hermetički zatvoren deo sabirnog segmenta ukloni se od sabirnog suda pa se, pre ili posle uklanjanja sabirnog segmenta, duž sabirnog segmenta između hermetički zatvorenih krajeva načini više hermetičkih spojeva. Delovi segmenta između susednih hermetičkih spojeva obrazuju sudove, pri čemu svaki od tih sudova sadrži jedan uzorak krvi ili plazme, a intervali između hermetičkih spojeva obezbeđuju dovoljnu zapreminu svakog od pomenutih sudova za planirano ispitivanje.

Kod jednog detaljnijeg izvođenja ovog pronalaska, pojedinačne donacije plazme stavljaju se u sabirnu bocu za plazmu na koju je priključena posuda za ispitivanje preko savitljivog šupljeg segmenta creva. Nakon što je napunjena plazmom davaoca, boca za plazmu se nagne tako da se prenese plazma u posudu za ispitivanje i u segment savitljivog creva, tako da se segment cevi napuni. Segment creva se hermetički zatvara na izvesnim međusobnim rastojanjima duž njegove dužine, pri čemu delovi segmenta creva između pregrada obrazuju kesice od kojih svaka sadrži jedan uzorak plazme iz određene donacije. Segment creva koji je pretvoren u niz kesica odvaja se od sabirne boce za plazmu i zamrzava se do ispitivanja.

Prema jednom dodatnom vidu ovog pronalaska, šuplji segment creva sa-drži niz međusobno povezanih elemenata oblika slova Y (dalje - Y-elementi), uključujući mesto za ubrizgavanje na jednom kraku Y-oblikovanog elementa, dok je krak jednog Y-elementa koji nema mesto za ubrizgavanje priključen na donji kraj sledećeg Y-elementa pomoću jednog segmenta savitljivog plastičnog creva. Međusobno odvojene toplotno zavarene zaptivne pregrade obrazovane su duž svakog segmenta savitljivog plastičnog creva koje razdvaja Y-elemente.

Prema jednom sledećem vidu ovog pronalaska, naprava za izradu više toplotno zavarenih pregrada duž segmenta creva ispunjenog krvlju ili plazmom ima prvu i drugu naspramnu ploču za toplotno zavarivanje. Svaka od ploča ima više međusobno razdvojenih ispupčenja po celoj svojoj dužini između kojih se nalaze udubljenja. Ispupčeni i udubljeni delovi prve ploče poklapaju se sa odgovara-jućim ispupčenim i udubljenim delovima druge ploče. Naspramne ploče za zavarivanje pomeraju se zajedno po segmentu plastičnog creva napunjenog krvlju ili plazmom tako da obrazuju zavarene spojeve na delovima segmenta creva sabi-jenim između ispupčenja i komore između naspramnih udubljenja. Zavarena mesta obrazuju veći broj pojedinačnih i jedna iza druge postavljenih kesica, a svaka od komora obrazovanih između zatvorenih parova udubljenja oblikovana je tako da sadrži jednu kesicu.

Tačnije, naprava za izradu većeg broja zavarenih mesta duž segmenta creva napunjenog krvlju ili plazmom oblikovana je tako da se može ugraditi na komercijalni uređaj za toplotno zavarivanje kao modifikacija.

Kod jednog sledećeg izvođenja pronalaska sistem za sakupljanje i pripremanje uzoraka plazme za ispitivanje obuhvata sabirnu posudu za plazmu i šuplje plastično crevo priključeno na posudu, pri čemu su oba načinjena od plastične mase i oba sadrže jednu kodiranu oznaku načinjenu u plastičnom materijalu. Kodirana oznaka je raspoređena duž glavne ose segmenta creva i kod se ponavlja na određenim razmacima tako da segment creva može po dužini imati više razmaknutih zavarenih spojeva koji obrazuju između sebe kesice. Kodno rastojanje oznaka duž creva odgovara rastojanju kesica, tako da svaka od kesica ima bar jednu kodnu oznaku.

Da bi započeo proces ispitivanja prema pronalasku, prva kesica se odvaja od svakog segmenta creva jedne grupe segmenata koji odgovaraju većem broju pojedinačnih donacija plazme. Deo sadržaja svake od tih kesica se izvlači i obrazuje se mešavina u jednoj posudi.

Kod jednog primera izvođenja ovog pronalaska, prva se mešavina ispituje na prisustvo virusa. Ako je prvo ispitivanje pozitivno, tj. ukazuje da ima virusa, od svakog od segmenata creva od kojih je bila obrazovana prva mešavina uzima se sledeća po redu kesica. Te druge po redu kesice se dele u dve približno jednake podgrupe i sadržaj mešavine jedne od podgrupa se proverava na prisustvo nekog specifičnog virusa. Ako je ispitana podgrupa ngativna, uzima se sledeća po redu kesica od segmenata koji su korišćeni za obrazovanje neispitane podgupe. Kesice se podele na dve približno jednake podgrupe sledeće generacije, pa se od sadržaja kesica svake od podgrupa obrazuju mešavine. Jedna od mešavina podgrupa sledeće generacije ispituje se na prisustvo virusa.

Kada ispitana podgrupa mešavine reaguje pozitivno na postojanje virusa, uzima se po jedna kesica od segmenata creva od kojih je obrazovana ispitivana podgrupa. Postupak se ponavlja tako što se svaka pozitivna smeša dalje deli na sve manje podgrupe, pri čemu svaka sledeća podgrupa sadrži mali deo uzoraka prethodne pozitivne podgrupe, sve dok ne bude identifikovana krajnja kesica koja odgovara jednoj jedinoj donaciji plazme.

Kod jednog sledećeg izvođenja prikazanog pronalaska, dodatni postupak za ispitivanje većeg broja donacija plazme da bi se pojedinačno identifikovale donacije koje imaju pozitivnu indikaciju na virus tokom jednog jedinog ciklusa PCR ispitivanja obuhvata stupnjeve definisanja jedne n-dimenzione rešetke koja definiše interne elemente na mestima preseka svake od n-dimenzija rešetke. Uzorak od većeg broja donacija plazme mapiran je u odgovarajućem elementu rešetke, pri čemu je svaki uzorak definisan matričnom oznakom Xrcsgde indeks oznake matričnog elementa definiše dimenzione oznake rešetke. Iste količine se uzimaju iz svakog uzorka od svake od donacija plazme i obrazuju se pogrupe mešavine. Svaka od mešavina podgrupa obuhvata jednake količine svih uzoraka donacija plazme kod kojih je jedna od dimenzionih oznaka fiksirana. Ove meša-vine podgrupa ispituju se odjednom, u jednom jedinom ciklusu PCR ispitivanja, a dimenziona oznaka svake od mešavina podgrupa koja reaguje pozitivno proce-njuje se u skladu sa redukcijom po postupku manjih vrednosti, čime se nedvosmisleno identifikuje pojedinačni element definisan dimenzionim oznakama svake od pozitivnih mešavina podgrupa, a time se nedvosmisleno identifikuje poje-dinačni pozitivni uzorak.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Ova i druga svojstva, vidovi i prednosti pprikazanog pronalaska bolje će se shvatiti ako se razmotre u vezi sa sledećim detaljnim opisom, priloženim patentnim zahtevima i priloženim crtežima, pri čemu

- slika 1 prikazuje polušematski izgled u perspektivi jednog primera boce za donaciju plazme i posude za uzorak pričvršćene jednim segmentom creva koji se koristi kod praktičnog izvođenja ovog pronalaska, - slika 2 prikazuje polušematski izgled u perspektivi segmenta creva priključenog između boce za donaciju plazme i posude za uzorak i podeljenog na kesice u skladu sa ovim pronalaskom, - slika 2a prikazuje polušematski izgled u perspektivi segmenta creva priključenog između boce za donaciju plazme i posude za uzorak a koji obuhvata niz međusobno povezanih Y-elemenata u skladu sa ovim pronalaskom, - slika 3a prikazuje, u uvećanoj razmeri, pogled odozgo na deo segmenta creva prikazanog na slici 2 pri čemu su prikazani detalji zavarenih spojeva koji razdvajaju kesice, - slika 3b prikazuje polušematski poprečni presek zavarenog spoja segmenta creva, - slika 4 prikazuje polušematski izgled u perspektivi uređaja izvedenog u skladu sa praktičnim izvođenjem ovog pronalaska za pregrađivanje creva u pojedinačne kesice, - slika 4a prikazuje polušematski izgled u perspektivi gornje i donje ploče naprave za zavarivanje toplotom prema ovom pronalasku koja se postavlja na komercijalni uređaj za toplotno zavarivanje, - slika 5 prikazuje polušematski izgled u perspektivi ploče za sakupljanje uzoraka i poklopac izvedene u skladu sa prikazanim pronalaskom, - slika 6 prikazuje polušematski delimični presek jedne kesice za plazmu koja se nalazi u čašici za uzorke ploče za uzimanje uzoraka prema ovom pronalasku, - slika 7 prikazuje polušematski izgled u perspektivi uređaja izvedenog prema ovom pronalasku za mrvljenje kesica sa uzorcima i za istiskivanje sabranih uzoraka fluida u posudu u kojoj se obrazuje mešavina, - slika 8 predstavlja polušematski presek cilindra uređaja za mrvljenje sa slike 7, - slika 9a prikazuje polušematski delimični presek mrežaste ploče na kojoj se mrve paketi koji sadrže uzorke, - slika 9b prikazuje polušematski poged odozgo na mrežastu ploču na kojoj se vide radijalni i koncentrični žlebovi za sakupljanje uzoraka fluida iz smrvljenih sudova sa uzorcima, - slika 10 predstavlja polušematski presek klipa za mrvljenje uređaja sa slike 7, ? - slika 11 predstavlja tehnološku šemu koja prikazuje metodologiju ispitivanja prema pronalasku za određivanje PCR pozitivnih davalaca iz mešavine donacija, - slika 12 predstavlja tehnološku šemu koja prikazuje redosled ispitivanja prema pronalasku za određivanje jedne pojedinačne pozitivne donacije iz meša-vine 512 donacija, - slika 13 predstavlja tehnološku šemu koja prikazuje drugu metodologiju ispitivanja prema pronalasku za određivanje PCR pozitivnih davalaca iz meša-vine donacija, a - slika 14 predstavlja prikaz jedne 3-dimenzione rešetke prema pronalasku koja prikazuje definiciju r, c i s oznake.

DETALJAN OPIS

Prikazani se pronalazak odnosi na sisteme, postupke i uređaje pogodne za ispitivanje donacija krvi ili plazme da bi se otkrile one specifične donacije koje imaju virusno zagađenje iznad jednog unapred određenog nivoa. Te se zagađene donacije potom odbacuju kako bi se sprečilo njihovo uključivanje u struju sirovi-na za fatmaceutske proizvode ili njihova transfuzija u humane pacijente. Ispitivanja za otkrivanje virusa korišćena u skladu sa praktičnim korišćenjem ovog pronalaska mogu biti sva ona koja mogu da neposredno otkriju virus umesto antitela obrazovanih kao odgovor na virus. Ispitivanja obuhvataju ispititvanja lančane reakcije polimeraze (PCR) i druga ispitivanja dovoljno osetljiva da otkriju virus čak i posle mešanja uzoraka od većeg broja donacija.

Kod jednog praktičnog izvođenja ovog pronalaska, koristi se više posebnih donacija krvi ili plazme. Uzorak krvi ili plazme izvlači se iz svake od donacija u odgovarajući savitljiv, šuplji segment creva. Više međusobno odvojenih zavarenih spojeva načini se na odstojanjima dužinom segmenta creva, tako da delovi segmenta između zavarenih mesta obrazuju kesice, pri čemu svaka od kesica sadrži jedan uzorak krvi ili plazme. Kao što će kasnije biti detaljnije objašnjeno, obez-beđena je jedinstvena metodologija u skladu sa ovim pronalaskom za ispitivanje uzoraka plazme iz kesica nakon što se uzorci pretvore u mešavine da bi se tako efikasno i stvarno otkrile i izolovale sve one donacije krvi ili plazme koje su zara-žene virusom.

Na slici 1 prikazan je primer izvođenja sistema obrazovanog prema prikazanom pronalasku za vršenje procesa uzimanja uzoraka. Sistem obuhvata standardnu posudu 20 za donacije plazme, načinjenu od nekog neutralnog materijala kao što je polivinil hlorid (PVC). Posuda 20 za donacije ima zatvarač 22 sa dva šuplja kolenasta priključka, 23 i 24, pričvršćena na gornjoj površini zatvarača. Priključci su povezani sa unutrašnjošću boce za donacije kroz otvore načinjene u tu svrhu u zatvaraču 22. Savitljivo šuplje crevo 26 za punjenje, načinjeno od bio-loški neutralnog materijala kao što je PVC plastični materijal, priključeno je na jedan od kolenasti priključaka 23 i povezano je na svom drugom kraju sa, na primer, iglom zabodenom u davaoca da bi se pribavila donacija. Kod prikazanog iz-vođenja obezbeđena je posuda 28 za ispitivanje za sakupljanje uzorka iz donacije radi serološkog ispitivanja. Posuda 28 za ispitivanje je obično oblikovana kao epruveta i takođe je načinjena od biološki neutralnog materijala. Posuda 28 za ispitivanje ima integralni zatvarač 30 u kome su načinjeni otvori za vezu sa njego-vom unutrašnjošću.

Savitljivo šuplje crevo 32, načinjeno od biološki neutralnog plastičnog materijala, postavljeno je između zatvarača 30 posude 28 za ispitivanje i šupljeg kolenastog priključka 24 zatvarača posude za donacije plazme. Crevo 32 je pri-ključeno na zatvarač 30 tako da fluid koji prolazi kroz crevo ulazi u sud 28 za ispitivanje kroz otvor načinjen u tu svrhu u zatvaraču 30. Crevo 32 može biti trenjem pričvršćeno u tom otvoru, zavareno za njega ultrazvukom, ili na neki drugi način pričvršćeno koaksijalno sa otvorom nekom od tehnika poznatih stru-čnjacima.

Na poklopcu 30 može biti načinjen i drugi otvor u koji se postavlja odušna cev 34 na sličan način kao i crevo 32. Odušna cev 34 obično nije duža od 2,5 do 5 cm, i obično se završava umetnutim filtrom 36 za sprečavanje prodora bakterija, pričvršćenim trenjem.

Kod jednog primera izvođenja, donacija krvi ili plazme uzima se od davaoca i sakuplja se u posudi 20 za donacije radi skladištenja do upotrebe. U slučaju davanja plazme, krv se obično uzima od davaoca i prolazi kroz centrifugu koja kontinualno radi, pri čemu se crvena krvna zrnca izdvajaju centrifugiranjem iz plazme i vraćaju davaocu. Plazma se potom sakuplja.

Nakon što je donacija plazme uzeta od davaoca i posuda 20 za donacije je napunjena, posuda za donacije se nagne tako da se nivo fluida podigne iznad kolenastog priključka 24 povezanog sa crevom 32. Plazma ulazi u crevo, teče kroz crevo i puni posudu 28. Tokom punjenja vazduh zatvoren u posudi 28 izlazi kroz odušnu cev 34, što omogućuje potpuno punjenje posude za ispitivanje. Filtar 36 zadržava sve bakterije iz vazduha koji se vraća, čime se sprečava zagađivanje uzorka iz okolne sredine. Nakon što je posuda za ispitivanje napunjena, plazma iz donacije se pusti da ispuni crevo 32.

Prema slici 2, nakon što je uzorak plazme iz donacije izvučen u crevo 22, crevo se hermetički zatvara zavarenim spojem 38, ili nekim drugim pogodnim načinom za hermetičko zatvaranje, kao što je zavarivanje ultrazvukom, na mestu pored priključka creva na posudu za donaciju plazme. Drugi zavareni spoj 40 obrazuje se na crevu na mestu pored njegovog priključka na posudu 28. Na taj se način dobija duguljasto šuplje crevo zatvoreno na oba kraja koje sadrži jednu količinu donacije plazme.

Napunjeno crevo 32 se odvaja od posude za donaciju plazme i posude za ispitivanje odsecanjem creva po sredini zavarenih spojeva 38 i 40. Izdvojena posuda za donaciju plazme odnosi se na zamrzavanje i skladištenje, dok se izdvojena posuda za ispitivanje odnosi u laboratoriju za serološka ispitivanja. Obično se sadržaj ispituje na različita antitela koja se obrazuju kao odgovor na specifične viruse kao što su hepatitis C (HCV) ili HIV-1 i HIV-2.

Dodatni zavareni spojevi 42 načinjeni su na izvesnim rastojanjima duž creva da bi se našinile uzastopne pojedinačne kesice, od kojih svaka obuhvata deo 44 šupljeg creva. Svaki deo 44 ima jednu određenu količinu plazme potrebnu za obrazovanje specifične generacijske mešavine. Tako, na primer, u kesicama koje treba da se obrazuju za PCR ispitivanje može se hermetički zatvoriti pri-bližno 0,02 do 0,5 ml krvi ili plazme od osnovne donacije.

Crevo se zavarivanjem podeli tako da se dobije 5 do 15 pojedinačnih i povezanih kesica. Zavarivanje radi obrazovanja kesica može se vršiti bilo nakon što se crevo odvoji od posude za donaciju plazme i posude za serološko ispitivanje, ili se to radije čini dok je crevo još uvek priključeno na posudu za donaciju plazme kako bi se izbeglo obrazovanje hidrostatičkog pritiska. Hermetičko zatvaranje se može vršiti bilo kojim poznatim postupkom, kao što je termo-kompresiono zavarivanje (toplotno zavarivanje), zavarivanje ultrazvukom ili bilo kojim poznatim postupkom, ukoliko je dužina područja sabijenog i zavarenog dovoljna da omogući da se povezane kesice odvoje jedna od druge prosecanjem kroz središte zavarenog spoja a da se ne povredi celovitost kesica sa obe strane, što se može jasnije sagledati na slikama 3a i 3b. Drugo izvođenje creva prilago-đenog da se podeli na delove koji sadrže iste količine uzoraka krvi ili plazme, prikazano je na slici 2 koja predstavlja polušematski izgled u perspektivi izvođe-nja sabirnog creva priključenog između boce 20 za donaciju plazme i posude 28 za uzorke i podeljenog na delove jednakog sadržaja prema ovom pronalasku.

Sabirno crevo 50 priključeno je između zatvarača 30 posuđe 28 za ispitivanje i kolenastog priključka 24 zatvarača posude za donaciju plazme. Crevo 50 sastoji se od više Y-oblikovanih elemenata 51 (dalje: Y-elemenata) međusobno povezanih u niz savitljivim, šupljim segmentima 52 creva, načinjenim od plasti-čne mase medicinskog kvaliteta. Y-elementi su tipa obično prilagođenog za pri-ključivanje na pribor za intravensku infuziju i obuhvataju cilindrično telo 53 kroz koje proriče fluid, koje ima izlazni otvor 54 na jednom kraju protočne putanje i prilazno mesto 55 na drugom kraju. Ogranak 56 sa otvorom načinjen je uz telo 53 Y-elementa i ima prolaz za fluid povezan sa prolazom za fluid u telu 53.

Jedan Y-element priključen za sledeći lepljenjem jednog savitljivog šup-ljeg creva 52 od plastične mase medicinskog kvaliteta između izlaznog otvora 54 jednog Y-elementa i ogranka 56 sledećeg Y-elementa u nizu. Početno šuplje ulazno crevo 57 zalepljeno je za ogranak prvog Y-elementa u nizu. Početno ulazno crevo 57 priključeno je na kolenasti priključak 24 zatvarača posude za donaciju plazme. Veza se može ostvariti trenjem, navlačenjem creva 57 na kolenasti priključak 24, zavarivanjem ultrazvukom, ili nekim drugim načinom koaksijalnog povezivanja creva sa priključkom, koristeći tehnike poznate stručnjacima. Inače se početno ulazno crevo može završiti standardnom "luer" spojnicom 58 koja će omogućiti razdvojivo povezivanje u nizu spojenih Y-elemenata sa posudom za donaciju koja je opremljena sa odgovarajućim drugim delom "luer" spojnice na kolenastom priključku 24.

Slično tome, krajnji Y-eIement ima kod svog izlaznog otvora zalepljeno jedno savitljivo šuplje krajnje izlazno crevo 59. To crevo takođe može imati na svom slobodnom kraju standardnu "luer" spojnicu.

Na sličan način kao što je opisano kod prvog izvođenja, nakon što se donacija plazme uzme od davaoca i posuda 20 za donaciju plazme se napuni, posuda sa donacijom se nagne tako da se nivo fluida podigne iznad kolenastog pri-ključka 24 povezanog sa ulaznim crevom 57. Plazma ulazi u crevo i teče kroz niz međusobno povezanih Y-elemenata tako što ulazi u svaki od Y-elemenata kroz njegov ogranak 56 i teče u sledeći Y-element kroz izlazni otvor 54 prethodnog Y-elementa. Plazma se istače sve dok se ne napuni posuda 28 za ispitivanje. Nakon što je posuda za ispitivanje napunjena, donacija se i dalje istače sve dok ne budu napunjeni u niz povezani Y-elementi koji sačinjavaju sabirno crevo 50.

Nakon što je uzorak plazme od donacije uvučen u sabirno crevo 50, krajnje izlazno crevo 59 zatvara se zavarenim spojem 40a ili drugim pogodnim načinom za hermetičko zatvaranje kao što je zavarivanje ultrazvukom, a na pogodnom mestu u blizini njegovog priključka na posudu 28 za ispitivanje.

Napunjeno sabirno crevo 50 odvaja se od posude za ispitivanje odsecanjem izlaznog creva 59 od posude za ispitivanje kroz sredinu zavarenog spoja 40a. Alternativno, ako se sabirno crevo 50 završava "luer" spojnicom, crevo 50 se odvaja od posude 28 za ispitivanje razdvajanjem spojnice. Drugi zavareni spoj 38a načinjen je na početnom ulaznom crevu 57 na mestu koje je u blizini njegovog priključenja na posudu 20 za donaciju. Pun deo sabirnog creva 50 odvaja se od donacije plazme odsecanjem početnog ulaznog creva 57 kroz sredinu zavarenog spoja 38a, ili razdvajanjem "luer" spojnice 58 ukoliko je ugrađena. Na taj način je dobijeno dugačko, šuplje, zglobasto crevo zatvoreno sa oba kraja a koje sadrži više Y-elemenata međusobno povezanih u niz. Svaki od međusobno povezanih Y-elemenata sadrži istu količinu donacije krvi ili plazme.

Kao što će kasnije biti detaljnije opisano, segmenti creva koji povezuju izlazni otvor prethodnog Y-elementa sa ogrankom sledećeg Y-elementa takođe su izvedeni sa zavarenim spojevima 42a radi obrazovanja uzastopnih, pojedina-čnih i međusobno povezanih pakovanja jednakih količina, od kojih se svako sastoji od jednog pojedinačnog Y-elementa. Svaki od Y-elemenata sadrži jednu određenu količinu krvi ili plazme potrebnu za obrazovanje jedne specifične generacijske mešavine. Zavaraivanje radi izdvajanja svakog od Y-elemenata može se vršiti bilo nakon što se sabirno crevo odvoji od posude za donacije ili se može vršiti dok je sabirno crevo još uvek priključeno. Poželjno je da se izdvajanje Y-elemenata vrši još dok je sabirno crevo priključeno na posudu sa donacijom plazme tako da spljoštenje creva izazvano smanjenjem zapremine creva tokom izrade zavarenog spoja ne izaziva pojavu unutrašnjeg hidrostatičkog pritiska u uzorku. Kada sabirno crevo 50 ostane priključeno na posudu sa donacijom plazme, višak fluida stvoren smanjenjem zapremine creva izazvane izradom zavarenog spoja može da se vrati u posudu sa donacijom. Na taj je način bezbedno otklonjen višak hidrostatičkog pritiska koji može dovesti do opasnog prskanja kod istakanja uzoraka.

Zatvaranje zavarivanjem se može vršiti bilo kojim pozantim postupkom, kao što je termo-kompresiono zavarivanje (toplotno zavarivanje), zavarivanje ultrazvukom ili slično, ukoliko je dužina područja koje je sabijeno i zavareno dovoljna da omogući da se povezani Y-elementi razdvoje jedan od drugog prese-canjem po sredini zavarenog spoja a da se ne ugrozi celovitost segmenata creva sa obe strane spoja.

Prema slikama 3a i 3b, kod jednog preporučljivog izvođenja zaptivni spoj između kesica (42 na slici 2) i Y-elemenata (51 na slici 2a) obuhvataju pljosnato područje 46 uključujući središne suženje 47 kroz koje se zavareni spoj odseca ili otkida da bi se razdvojile kesice. Odsecanje se vrši kroz središni deo da bi se obezbedilo da će svaka odvojena kesica ostati hermetički zatvorena kod pijos-natog područja 48 na oba kraja posle razdvajanja. Dužina zavarenog područja može biti veća ili manja, u zavisnosti od izabranog postupka presecanja. Razdvajanje se može vršiti skalpelom, posebnom napravom za presecanje i ili jedno-stavno makazama.

Na slici 4 prikazan je primer izvođenja naprave 60 za zavarivanje, pogodne za izradu kesica specifične željene veličine, uklučujući način za lako razdvajanje kesica i identifikovanje njihovog rednog broja duž jednog segmenta. Naprava za 60 za zavarivanje obuhvata naspramnu prvu i drugu ploču, 61, 62, od kojih svaka obuhvata više podignutih ispupčenja 63 za zavarivanje, na nekom među-sobnom odstojanju na naspramnim površinama ploča. Naprava 60 za zavarivanje poželjno je konstruisana tako da se uzdignuta ispupčenja 63 za zavarivanje mogu pomerati duž svojih ploča tako da se međusobna odstojanja između ispupčenja za zavarivanje mogu menjati. Ispupčenja 63 za zavarivanje mogu se rasporediti duž ploča tako da se rastojanje između susednih ploča postepeno smanjuje tako da se zaptivanje duž creva vrši na postepeno sve manjim odstojanjima. Na taj se način mogu obrazovati kesice uzoraka postepeno sve manjih veličina, Što znači i postepeno manje zapremine, pomeranjem naspramnih ispupčenja za zJivarivanje duž njihovih ploča do željenog mesta.

Da bi se obrazovalo više toplotno zavarenih mesta duž segmenta plasti-čnog creva napunjenog uzorkom krvi ili plazme, segment creva se postavlja u napravu 60 za zavarivanje između gornje i donje ploče za zavarivanje, 61 i 62. Naspramne ploče se dovode u blizinu jedna sa drugom tako da sabijaju i zavaruju segmente creva. Kao što je prikazano na slici 4, više međusobno razmaknutih ispupčenja 63 za zavarivanje duž svake od ploča razdvojeno je udubljenjima 64. Kako se naspramne ploče pomeraju jedna prema drugoj da bi obrazovale zavarene spojeve na delovima segmenata plastičnog creva ispunjenih krvlju ili plazmom, koji su sabijeni između ispupčenja 63, u naspramnim udubljenjima 64 obrazuju se komore. Komore se prave da bi prihvatile one delove segmenta creva koji ne treba da se sabiju već da budu oblikovani u kesice. Svaka od komora obrazovanih po jednim zatvorenim parom udubljenja oblikovana je da se u nju smesti jedna kesica.

Grejač 65 izveden je tako da zagreva svako od ispupčenja ploče da bi nas-pramna ispupčenja obrazovala zavareno mesto na segmentu creva kada se naprava za zavarivanje zatvori. Grejač 65 može biti bilo koji od poznatih grejača kao što su grejači sa zračenjem, indukcioni ili otpornički grejači, ili slično. Po-željno je da grejač 65 bude priključen neposredno na svako od ispupčenja 63 ka-ko bi se zagrevali uzdignuti delovi bez nepotrebnog zagrevanja udubljenja. Ako se želi može se postaviti izolacija da bi se smanjio prenos toplote između uzdi-gnutih delova i udubljenja. Kod jednog primera se naprava 66 za hlađenje kao što su rebra za hlađenje, ili radijatorska rebra, struja vazduha ili krilo za hlađe-nje, može priključiti na napravu 60 za zavarivanje. Naprava 66 za hlađenje može se priključiti neposredno na svako od udubljenja 64, tako da se komore obrazovane kada se udubljenja pomeraju jedna prema drugima održavaju na niskoj temperaturi. Na taj način uzorci krvi ili plazme koji se nalaze u kesicama obrazovanim unutar komora tokom procesa zavarivanja neće biti ugroženi visokim temperaturama zavarivanja.

Usko područje (47 na slici 3b) približno u središtu zavarenog spoja nači-njeno je uzdužnom ivicom 67 obrazovanom po sredini ispupčenja 63 ploča za zavarivanje. Kada se segment creva stisne između gornjeg i donjeg ispupčenja za zavarivanje, ivica 67 obrazuje jedno udubljenje na gornjoj i na donjoj površini zavarenog dela. Ta udubljenja sužavaju plastični materijal koji obrazuje središte zavarenog spoja čime se olakšava razdvajanje.

Kod jednog izvođenja pronalaska ivica 67 može biti nazubljena kako bi se načinile perforacije postavljene upravno na glavnu osu segmenta creva. Perforacije omogućuju da se pojedinačne i povezane kesice odvajaju jedna od druge bez opasnosti, povezane sa sečenjem nekim oštrim predmetom, da se povredi celovitost jedne kesice nehotičnim zasecanjem kroz područje koje sadrži uzorak. Pogodno je da se perforacije obrazuju tokom procesa zavarivanja koristeći ispupčenja za zavarivanje sa zupcima. Alternativno, perforacije se mogu načiniti neposredno po zavarivanju koristeći poseban uređaj ili alat za perforiranje.

Takođe je obezbeđen uređaj 68 za otvaranje i zatvaranje naprave 60 za zavarivanje da bi se stegle ploče za zavarivanje i tako obrazovali zavareni spojevi duž segmenta creva. Takvi su uređaji poznati i mogu obuhvata« neki ručni ure-đaj koji otvara i zatvara, kao što je ručica pričvršćena na noseći okvir i koja pomera okvir oko, na primer, nekog šarnira. Drugi pogodni uređaji mogu obu-hvatati vertikalne vodice, opruge ili hidraulične klipne prese, ili druge uobičajene mehaničke, elektrilčne ili hidraulične prese.

Na slici 4a prikazan je polušematski izgled jednog specifičnog izvođenja naprave 70 za zavarivanje, koja se koristi za izradu termo-kompresionih zavarenih spojeva na ravnomernim međusobnim rastojanjima, tako da se obrazuju kesice specifičnih željenih veličina, ili da se izdvoje međusobno povezani Y-elementi u pojedinačne jednake zapremine koje sadrže uzorke. Naprava 70 za zavarivanje ima gornju i donju ploču, 71 i 72, koje se mogu postaviti između pritisne poluge i zaptivne trake jednog komercijalno dostupnog aparata za impulsno zavarivanje, kao što je jedan od takvih aparata ALINE M serije, koje proizvodi i prodaje ALINE Companv iz Santa Fe Springs, Kaiifornija. Specifično izvođenje prikazano na slici 4a je dvodelna glava za zavarivanje prilagođena da se priključi na jedan ALINE MC-15 impulsni aparat za zavarivanje kao njegova modifikacija, i omogućuje da MC-15 izrađuje prethodno napunjene kesice plazme za dalju obradu prema sistemu i postupku ovog pronalaska.

Donja ploča 72 naprave 70 za zavarivanje načinjena je od pogodnog kru-tog materijala, otpornog na toplotu kao što je lamelirani Kevlar® koga proizvodi i prodaje DuPont Corporation. Kod prikazanog izvođenja, donja je ploča 72 poželjno dužine oko 15 in da bi se mogla pričvrstiti na noseću površinu MC-15 aparata za impulsno zavarivanje. Donja ploča 72 ima uzdužni žleb 73, središne postavljen, koji se pruža ćelom dužinom donje ploče 72. Širina uzdužnog žleba je oko 0,2 in kako bi se moglo smestiti standardno medicinsko crevo koje ima obično spoljni prečnik od oko 0,1875 (3/16) in, tako da naleže sa malim zazorom ćelom dužinom žleba.

Više poprečnih žlebova 74 načinjeno je na međusobnim rastojanjima duž donje ploče 72, a postavljeni su u pravcu upravnom na pravac središneg žleba 73. Poprečni žlebovi 74 imaju širinu od približno 0,5 in i postavljeni su na među-sobnom rastojanju od 1,125 (1-1/8) in, računajući od njihovih središta. Na taj način je svaki od poprečnih žlebova razdvojen od susednih žlebova blokom materijala ploče koji je po sredini podeljen srediŠnim žlebom 73, a koji je širine od oko 0,625 (5/8) in.

Uzdužni žleb 73 i poprečni žlebovi 74 usečeni su samo delimično u materijal donje ploče 72, tako da obrazuju ravnu površinu 75 "koja obrazuje dno i uzdužnog žleba i poprečnih žlebova. Kada se aparat koristi za obrazovanje zavarenih spojeva, komad standardnog medicinskog creva, prečnika 0,1875 (3/16) in umetne se duž uzdužnog žleba 73 i oslanja se na dno 75 donje ploče koje funkci-oniše kao noseća površina tokom procesa zavarivanja.

Grejni element 76, na primer nikl-hrom (NiCr) otpornička žica, postavljen je vijugavo od žleba do žleba i postavljen je uzduž svakog od poprečnih žlebova koji obuhvataju donju ploču, približno po sredini žleba. Gde grejni element 76 prolazi kroz središte poprečnog žleba 74 NiCr žica je zaštićena od dodira sa crevom osetljivim na toplotu tako što se pokrije komadom trake od Teflona®. Uzorci krvi ili plazme koji se nalaze u kesicama obrazovanim u napravi za zavarivanje tokom procesa zavarivanja na taj način nisu oštećeni visokim temperaturama zavarivanja.

Gornja je ploča 71 takođe dužine oko 15 in i visi iznad donje ploče 72 na pritisnoj ploči MC-15 aparata za zavarivanje. Gornja je ploča 71 načinjena od platičnog materijala otpornog na toplotu kao što je Lexan® ili mleveni Kevlar® i obuhvata grupu ravnomerno raspoređenih, uglavnom pravougaonih zubaca koji se pružaju naniže od njenog dna u pravcu donje ploče. Zupci 77 su dužine oko 0,5 in i na međusobnom su rastojanju ođ 1,125 (1-1/8) in, mereno od središta. Očigledno je da su zupci 77 dimenzionisani tako da odgovaraju šupljini obrazo-vanoj poprečnim žlebovima 74 donje ploče 72. Svaki od zubaca 77 gornje ploče71 postavljen je iznad odgovarajućeg preseka jednog poprečnog žleba 74 i uzdužnog žleba donje ploče 72. Sto znači da je svaki od zubaca 77 oblikovan da uđe u ovako obrazovanu šupljinu kada se ploče sklope puštanjem u rad aparata MC-15.

Nakon što se segment creva postavi u uzdužni žleb 73, gornja se ploča 71 potisne u dodir sa donjom pločom 72 spuštanjem poklopca MC-15 aparata za zavarivanje. Kako se poklopac spušta, zupci 77 gornje ploče 71 ulaze u šupljinu obrazovanu poprečnim žlebovima 74 donje ploče 72 i dolaze u dodir sa delom segmenta creva koji leži izložen na dnu 75 na mestu preseka svakog od popre-čnih žlebova 74 sa središnim žlebom 73. Pušta se struja u nikl-hrom otporničku žicu za zagrevanje koja dovodi do omekšavanja plastičnog materijala segmenta creva. Istovremeno se gornja ploča 71 potiskuje na donju ploču tako da se vrši pritiskivanje plastičnog materijala omekšanog grejnim elementom 76.

Posle zavarivanja, segment creva se označi bar na jednom kraju jedinstvenim pokazateljem koji odgovara početnoj donaciji plazme. To se može ostvariti, na primer, lepljenjem etikete na segment ili štampanjem prugastog koda neposredno na materijal creva. Na napravi 70 za zavarivanje pripremljeno je udubljenje 78 za držanje i poravnavanje prethodno odštampane etikete sa pruga-stim kodom. Ta se etiketa obrazuje od pogodnog materijala koji se može zavariti toplotom i lepi se na segment creva na prvom položaju zavarivanja u svrhu identifikacije. Segment creva koji obuhvata kessice koje sadrže uzorke zamrzava se radi daljeg čuvanja.

Vračajući se na sliku 2, jasno je da je važno da se mogu jednoznačno identifikovati svi delovi sistema koji sadrže jednu pojedinačnu donaciju plazme. Tako se mogu u fizičku strukturu sistema sakupljanja plazme postaviti jedinstveni obe-leživači kao što su kodirana vlakna, kodirane tačke, prugasti kodovi, ili druge strukture kodirane jedinstvenim obeleživačem. Tako, na primer, kod jednog iz-vođenja je kodirano vlakno 37 uliveno u posudu 20 za donaciju, kodirano vlakno 39 uliveno je duž ivice zatvarača 22 boce, kodirano vlakno 42 uliveno je duž strane posude 28 za ispitivanje i kodirano vlakno 43 uliveno je u segment cevi na međusobno udaljenim mestima. Jedinstveni obeleživač u segmentu creva pruža se ćelom dužinom segmenta i kod se ponavlja kako bi se omogućila podela segmenta creva a da se održi celovitost identifikacije svakog ođ tako pripremljenih segmenata. Pored toga, svaki od delova sistema donacije identifikovan je istim kodom tako da je identitet donacije održan za sve delove sistema.

Vraćajući se slikama 3a, 3b i 4, vidi se da može biti poželjno i da svaka pojedinačna kesica duž jednog segmenta bude identifikovana nekim slovnim ili brojnim kodom koji odgovara položaju kesice na početnom segmentu creva. Takav kod može biti utisnut, na primer, na stišnjenom delu zavarenog spoja između kesica koristeći neki alat za utiskivanje. Takav alat za utiskivanje može predstavljati jedan integralan deo naprave za zavarivanje koja je opisana na slikama 4 i 4a, tako da se zavarivanje, obrazovanje kesica promenljive veličine i obezbeđenje uskih ili perforiranih područja za lako odvajanje, kao i identifikacioni brojevi mogu izvesti u jednom jedinom radnom hodu. Alternativno, slovni ili brojčani označivači mogu predstavljati deo alata za perforiranje. Poznati su alati za utiskivanje koji imaju mehanizam za pomeranje slovnih ili brojčanih kataktera na sle-deći po redu tako da se uzastopne kesice jednog segmenta creva identifikuju odgovarajućim nizom slovnih (a, b, d,...) ili brojčanih (1,2,3,...) karaktera.

Na taj način se može, ako se priprema prva mešavina za ispitivanje od kesica od nekoliko donacija, izvršiti provera kvaliteta potvrđivanjem da sve kesice za tu mešavinu iz svakog od segmenata creva imaju isti položajni kod, na primer broj 1. Na isti način, kada se priprema druga mešavina za ispitivanje od kesica od uzoraka istih donacija, može se izvršiti provera kvaliteta potvrđivanjem da sve kesice za tu mešavinu iz svakog od segmenata creva imaju, na primer broj 2 utisnut na nekom mestu stišnjenog dela kesice.

Da bi se izvršilo efikasno PCR ispitivanje jedne donacije, serološki uzorak za ispitivanje uzet od svake pojedinačne donacije u posudi 28 za ispitivanje ispituje se na razne poznate antigene i/ili antitela koja su naznačena za specifične viruse. Ako je uzorak pozitivan na jedan ili više ispitivanja poznatih antigena ili antitela, pojedinačna se donacija i njen pripadajući segment creva isključuju iz daljeg ispitivanja i mogu se ukloniti na neki odgovarajući način.

Segmenti creva koji odgovaraju preostalim serološški negativnim donacijama dele se na identifikovane grupe pri čemu svaka od grupa sadrži jedan oda-brani broj donacija. Kao što će kasnije biti opisano, broj donacija po grupi odre-đen je osetljivošću specifičnih visokoosetljivih ispitivanja, kao što je PCR ispitivanje, očekivanom koncentracijom virusne RNK ili DNK od interesa u uzorku plazme, i od očekivane učestalosti pojave jednog PCR pozitivnog uzorka u opštoj populaciji davalaca. Tako, na primer, za otkrivanje virusa hepatitisa C koji sadrži RNK od interesa u populaciji višestrukih davalaca po sistemu plazmafereze, odgovaraju mešavine krvi od 100 do 700 pojedinačnih donacija. Za populaciju kod koje se zagađivanje virusima javlja češće, pogodnije su manje mešavine od 50 do 100 pojedinačnih donacija.

Jedno izvođenje postupka za pripremanje mešavine za PCR ispitivanje prema ovom pronalasku biće opisano u vezi sa slikama 5 i 6. Pripremljena je jedna ploča 80 za uzorke, u primeni slična ploči za titar, ali oblikovana u skladu sa pronalaskom. Ploča 80 za uzorke oblikovana je tako da ima polucilindrične čaši-ce 81 za uzorke postavljene na ploči horizontalno i u pravilnom rasporedu. Pogodna ploča za uzorke koja se koristi kod postupka prema ovom pronalasku ima 64 čašice za uzorke, raspoređene u osam redova po osam čašica, u vidu pravougao-nika. Pripremljena je pokrivna ploča 82 koja ima približno iste spoljne dimenzije kao i ploča 80 za uzorke. Pokrivna ploča 82 načinjena je tako da čvrsto i zaptivno naleže na površinu ploče 80 za uzorke. Na pokrivnoj su ploči načinjeni otvori 83 po istom rasporedu kao i čašice ploče 80 za uzorke. Kada se pokrivna ploča 82 postavi preko površine ploče 80 za uzorke, otvori 83 poravnani su vertikalno sa čašicama 81 za uzorke, čime se uspostavlja veza sa čašicama za uzorke kroz te otvore. Prečnik otvora je znatno manji od površine kesica sa uzorcima za ispitivanje i odgovarajućih čašica za uzorke. Međutim, prečnik otvora je dovoljno ve-lik da omogući da igla ili drugi predmet oblika cevčice prođe kroz otvore i uđe u čašice za uzorke ispod otvora.

Kao što je prikazano u vezi sa slikom 6, krajnja (prve generacije, "broj 1") kesica 84 odvaja se od svakog segmenta creva koji je identifikovan da pripada jednoj PCR grupi koja će se ispitivati. Svaka od krajnjih kesica 84 je isprana, ali nije otvorena, i postavljena je u odgovarajuću čašicu 81 za uzorke na ploči 80 za uzorke. Pokrivna se ploča 82 pričvrsti preko ploče 80 za uzorke, pa se ploča, pokrivna ploča i kesice odmrznu na pogodnoj temperaturi.

Jednaka zapremina između 0,02 i 0,5 ml plazme uzima se iz svake od kesica i skuplja u posudi za ispitivanje. Igla 85, ili neka druga naprava oblika cev-čice, umeće se kroz otvor u pokrivnoj ploči i u čašicu za uzorke na ploči za uzorke neposredno ispod otvora, tako da probuši materijal creva na zidu kesice i ulazi u uzorak plazme u kesici. Kod jednog primera izvođenja igla je priključena na jedan uređaj koji proizvodi kontinualni vakuum, ili usisavanje, da izvuče svu krv ili plazmu koja se nalazi u kesici i da svede na minimum curenje fluida na okolnu ploču. Igla se može držati u nekoj napravi koja omogućuje igli da se kreće kroz otvor i gornji zid kesice, ali ograničava njeno kretanje nadole tako da je igla sprečena da dodirne ili da probuši donji zid kesice postavljene u čašici za uzorke. Kada se cevčica uklanja nakon izvlačenja jednog uzorka, materijal 86 pokrivne ploče koji se nalazi oko otvora sprečava slučajno izvlačenje kesice zajedno sa cevčicom, kako je prikazano na slici 6.

Mada je postupak pripremanja mešavine za PCR ispitivanje opisan u vidu ručnog izvlačenja uzorka umetanjem jedne cevčice pojedinačno u svaku čašicu sa uzorcima, postupak se isto tako može izvesti koristeći jedan automatizovan proces. Ploča za uzorke koja sadrži kesice u svakoj od čašica može se držati tako da omogući da se sklop igala, raspoređenih tako da odgovaraju rasporedu otvora u pokrivnoj ploči, pritisne nadole na ploču sa uzorcima, čime se omogućuje da sve kesice istovremeno budu probušene i iz njih izvučeni uzorci. Alternativno, jedna jedina igla ili naprava za držanje igle može biti automatizovana ili programirana da redom buši kesice i iz njih izvlači fluid. Da bi se sprečilo prenošenje zagađiva-nja za svaku mešavinu se koristi čista igla za izvlačenje uzoraka.

Pored toga, svakom će stručnjaku biti jasno da se kombinacija ploče za uzorke, čašica za uzorke, poklopca, otvora i igle, opisana u vezi sa izvlačenjem uzorka fluida iz jednog paketa uzoraka, isto tako može primeniti na izvlačenje uzoraka fluida iz Y-elemenata sa uzorcima, prikazanih na slici 2a. Konfiguracija čašica za uzorke prema slikama 5 i 6 određena je oblikom posude koja sadrži fluid, pa su potrebne samo neke manje modifikacije da se prilagode za Y-elemente. Tako, na primer, čašice za uzorke mogu imati jedan duguljast cilindar, postavljen vertikalno, u koji se umeće jedan Y-element. Na nekom pogodnom mestu oko gornje ivice svake od čašica za uzorke može biti načinjen jedan urez koje deluje kao držač u koji se može postaviti ogranak Y-elementa. To će takođe delovati tako da usmeri svaki od Y-eIemenata i obezbedi dodatnu položajnu sigurnost. Na isti način kao što je opisano u vezi sa slikamna 5 i 6, fluid se može izvlačiti iz svakog od Y-elemenata umetanjem jedne igle kroz pristupni otvor svakog od Y-elemenata tako da dopre do uzorka. Kada se igla uklanja iz pristu-pnog otvora, materijal pokrivne ploče koji okružuje svaki od otvora deluje kao graničnik i sprečava izvlačenje Y-elementa iz čašice za uzorke.

Stručnjaku će takođe biti jasno da je ta konfiguracija isto tako pogodna za izvođenje pronalaska koristeći jedan automatizovan proces. Grupa igala može biti raspoređena tako da odgovara rasporedu otvora u pokrivnoj ploči, tako da omogućuje da se pristupni otvori svi istovremeno buše i iz njih izvuku uzorci. Alternativno, jedna jedina igla ili naprava za držanje igle može biti automatizovana ili programirana da redom buši pristupne otvore Y-elemenata i iz njih izvlači fluid.

Jedno dodatno izvođenje uređaja i postupka pogodnih za pripremanje mešavine za PCR ispitivanje prema prikazanom pronalasku biće opisano u vezi sa slikama 7, 8, 9a, 9b i 10. Prema slici 7, mešavina donacija plazme koja sadrži fluid istočen iz većeg broja uzoraka plazme našinjena je od izvesnog broja paketa uzoraka donacija u hidrauličnoj presi 90 sa električnim pogonom. Hidraulična presa 90 ima cilindar 91 za gnječenje u koji se stavljaju paketi sa uzorcima i hidraulički pokretan klip 92 koji mrvi pakete uzoraka. Uzorci iz paketa istaču se iz cilindra 91 za gnječenje pogodnim gasom pod pritiskom, kao što je vazduh ili azot pod pritiskom, i sakupljaju se u jednu posudu kao mešavina.

Na početku se po jedna generacijska kesica (na primer kesica br. 1) odvoji od svakog segmenta creva identifikovanog da pripada jednoj određenoj PCR grupi koja treba da se ispituje. Svaka od generacijskih kesica je oprana ali ne i otvorena, i stavljena u cilindar 91 za gnječenje prese 90. Punjenje cilindra za gnječe-nje vrši se u atmosferi biološki bezbednog poklopca klase II i struje vazduha radi obezbeđenja protiv nenamernog zagađivanja okolne sredine paketom koji je izgubio svoju strukturnu celovitost. Na način koji će biti detaljnije opisan, klip 92 za gnječenje se umetne u otvor 91a cilindra 91 za gnječenje tako da je zadrža-vanje sadržaja cilindra 91 za gnječenje osigurano i da cilindar 91 i klip 92 potpuno zatvaraju paket uzoraka. Način na koji se klip 92 za gnječenje spreže sa cilindrom 91 za gnječenje obezbeđuje da je okolna sredina oko cilindra 91 zaštićena od zagađivanja bilo kojim opasnim virusom koji se može naći u bilo kom od uzoraka koji se nalaze u paketima uzoraka.

Potom se cilindar 91 za gnječenje postavlja na cilindarsko sedište 93 koje stavlja cilindar u pravilan položaj na hidrauličnoj presi 90 i omogućuje hidrauli-čkom vretenu 94 povezanom sa hidrauličkim cilindrom 95 da se poravna i spoji sa klipom 92 za gnječenje. Na način koji će inače biti detaljnije opisan, klip 92 za gnječenje je rastavljivo povezan sa hidrauličkim vretenom 94 tako da se klip 92 može i podizati i spuštati hidrauličkim cilindrom 95.

Nakon što su cilindar 91 i klip 92 pravilno postavljeni na cilindarsko sedi-šte 93 i priključeni na hidraulički cilindar 95 posredstvom vretena 94, aktivira se upravljački ventil 96 tako da hidraulički cilindar deluje silom na vreteno 94 i klip 92, koji gnječi i kida pakete uzoraka u cilindru 91 za gnječenje. Hidraulički cilindar 95 pokreće se jednim električnim motorom 97 od 4 KS, 240 V, koji pokreće hidrauličku klipnu pumpu 98 koja potiskuje hidraulički fluid u rezervoar 99 fluida iz koga se pokreće cilindar 95. Na vreteno deluje sila od oko 4000 lbs koja stvara preko klipa 92 pritisak od oko 800 do 900 psi na paketima sa uzorcima.

Nakon što su paketi sa uzorcima iskidani, uzorci donacija fluida koji se nalaze u cilindru istaču se iz cilindra 91 za gnječenje gasom pod pritiskom dove-denim, na primer, iz cilindra 100 vazduha pod pritiskom koji je preko regulatora 101 pritiska povezan sa ventilom 102 trenutnog dejstva postavljenim na klipu 92 za gnječenje. Da bi se omogućio pravilan rad ventila 100, klip 92 se prvo malo odigne iz svog potpuno izvučenog položaja za gnječenje.Vazduh pod pritiskom se ispušta u cilidar 91 kroz regulator 101 pritiska sve dok se ne dostigne granični pritisak ventila. Ventil 102 se tada otvara i pušta gas pod pritiskom u unutra-šnjost cilindra koji istiskuje mešavinu plazme iz cilindra 91 za gnječenje kroz sabirni otvor 103 načinjen na dnu cilindra. Mešavina plazme se sakupi u poseban sud povezan sa sabirnim otvorom 103 crevom ili cevi kada fluid bude istisnut iz cilindra vazduhom pod pritiskom. Vazduh pod pritiskom ispušta se u biološki bezbedni poklopac klase II nakon prolaska kroz sifon sa hlornim krečom.

Na slici 8 prikazan je poprečni presek cilindra 91 za gnječenje izrađen prema principima ovog pronalaska. Cilindar 91 za gnječenje obuhvata uglavnom kružnu osnovnu ploču 105 koja ima gornju i donju površinu i kružni rub 106 sa unutrašnjim navojem koji se pruža naviše od gornje površine. Cilindrični zid 107 cilindra otvoren je sa oba kraja a na spoljnoj površini svog donjeg kraja ima na-voj. Na unutrašnjoj površini zida 107 cilindra kod donjeg njegovog kraja načinjen je urez, ili žleb, 108 koji obrazuje prstenasti rub 109 koji je postavljen paralelno gornjoj površini osnovne ploče 105 i ima prema njoj naspramnu površinu. Pri uvrtanju zida 107 cilindra u osnovnu ploču 105, prstenasti rub 109 zida 107 cilindra zahvata rešetkastu ploču 110 postavljenu na površini osnovne ploče 105 tako da bude sabijena između prstenastog ruba 109 i gornje površine osnovne ploče.

Prema slikama 9a i9b, rešetkasta ploča 110 je kružna ploča na koju se potiskuju paketi koji sadrže uzorke kada se gnječe klipom 92 za gnječenje. Kao što je prikazano na slici 9b, rešetkasta ploča 110 obuhvata odvode za fluid koji sadrže radijalne žlebove 111 i koncentrične kružne žlebove 112, pri čemu su svi žlebovi širine oko 1.32 in, a urezani su u gornju površinu rešetkaste ploče. Radijalni su žlebovi usečeni pod uglom tako da se spuštaju prema sredini rešetkaste ploče 110 gde se ulivaju u aksijalno postavljen ocednik ili sabirnik 113 koji se prazni kroz ocedni otvor 114, prečnika 1/4 in (prikazana na slici 8) izbušen u osnovnoj ploči 105.

Prema slici 8 izvedeno je zaptivanje između zida 107 cilindra i rešetkaste ploče 110 zahvatanjem i sabijanjem jednog O-prstena 115, postavljenog u zaptivni žleb 116 urezan u tu svrhu u osnovnoj ploči 105. Zaptivni je žleb 116 postavljen u osnovnoj ploči tako da se O-prsten nalazi ispod linije dodira rešetkaste ploče zida 107 cilindra. U osnovnoj ploči 105 načinjen je upor 117, dok je u rešet-kastoj ploči načinjen odgovarajući urez 118 po obodu, tako daje omogućeno pravilno postavljanje rešetkaste ploče na osnovnu ploču radi tačnog postavljanja O-prstena, tako da zid 7 cilindra pravilno zahvati rešetkastu ploču a njihova linija dodira da pravilno nalegne na O-prsten.

Na slici 10 prikazan je, delimično u preseku, klip 92 za gnječenje izveden prema principima ovog pronalaska. Cilindar 92 za gnječenje ima glavu 120 cilindra koja iz koje se pruža aksijalno, središne postavljena čašica 121 cilindričnih zidova sa jednim otvorenim krajem, a koja obrazuje sedište 123 za cilindrično vreteno 94 hidrauličkog cilindra.

Prstenasta prirubnica 122 izvedena je oko gornje ivice otvora čašice 121. Spolja je ivica prirubnice 122 zakošena tako da se njen prečnik povećava u smeru prema glavi 120 cilindra. Kada se hidrauličko vreteno 94 umeće u sedište 123, dve zaporke 124, potiskivane oprugama, kreću se po zakošenoj površini prstena-ste prirubnice 122 dok ne dostignu u svoj položaj i zahvate donju stranu prste-naste prirubnice.

Radi sprezanja sa seđištem 123 svaka od zaporki ima jedan zakošen zubac 125 koji se kreću duž zakošenje površine prirubnice 122 glave cilindra tako da razdvajaju zaporke 124 na koje deluju opruge. Pri daljem kretanju hidrauličkog vretena 94 zakošeni zupci 125 zaporki prođu pored zakošene površine prirubnice 122. Opruge zaporki potiskuju zakošene zupce u zahvat sa spoljnom površinom zida čašice. Na taj način zaporke 124 zahvataju donju površinu prirubnice 122 tako da drže klip 92 za gnječenje i obezbeđuju kretanje klipa u oba smera,

Pored toga, svakom će stručnjaku biti jasno da se oprugom potiskivane zaporke 124 mogu lako odvojiti od prirubnice 122 jednostavnim stezanjem krajeva zaporki suprotnih zakošenim zupcima 125. Prema tome, vidi se da glava 120 klipa, aksijalna čašica 121, prirubnica 122 i zaporke 124 obezbeđuju brzo i lako odvajanje hidrauličkog vretena 94 od klipa 92 za gnječenje. Ovo svojsto brzog razdvajanja omogućuje da se sklop klipa 92 i cilindra 91 lako odvoji od seđišta 93 cilindra hidrauličke prese 90 radi čišćenja, sterilisanja, ponovnog punjenja dodat-tnim paketima sa uzorcima i sličnog.

Kao što je prikazano na na slici 10, klip 92 za gnječenje dalje obuhvata nekoliko O-prstenova postavljenih u zaptivne žlebove 178 načinjene po spoljnoj po-vršini glave 120 klipa. O-prstenovi su postavljeni da bi se ostvarilo potpuno zaptivanje između spoljne površine glave 120 cilindra i unutrašnje površine zida 107 cilindra 91 za gnječenje. Više zaptivnih O-prstenova obezbeđuje određeni nivo bezbednosti i pouzdanosti kako bi se obezbedilo zadržavanje potencijalno zara-ženog fluida uzoraka unutar cilindra 91. Mada se na izvođenju prikazanom na slici 10 vide tri O-prstena 126, jasno je da se, prema pronalasku, može postaviti veći ili manji broj zaptivnih O-prstenova. Sve što se traži jeste da se ostvari zaptivanje između klipa 92 za gnječenje i cilindra 91 za gnječenje koje će obezbediti zadržavanje potencijalno zagađenog fluida unutar cilindra.

Prema slici 8, zid cilindra za gnječenje ima sa unutrašnje strane zakošen upor 130 širine 0,020 in koji je načinjen mašinskom obradom unutrašnje površine zida cilindra. Prvi deo, dužine oko 1,0 in, od vrha zida 107 cilindra obrađen je, prema tome, tako da ima unutrašnji prečnik oko 0,040 in veći od unutrašnjeg prečnika ostalog dela zida 107 cilindra koji se pruža nadole do rešetkaste ploče 110 i osnove 105. Prelaz između upora i ostalog dela zida zakošen je kako bi se obezbedio relativno gladak ugaoni prelaz od malo većeg gornjeg unutrašnjeg prečnika u malo manji donji unutrašnji prečnik.

Upor na zidu 107 cilindra načinjen je zato da se cilindar 92 za gnječenje može ručno umetnuti u otvor cilindra 91 za gnječenje uz minimalni dodir između O-prstenova (126 na slici 10) i unutrašnje površine cilindra. Kada se ručno sa-stavljeni klip i cilindar postave na sedište silindra (93 na slici 7) pusti se hidrau-ličko vreteno 94 da se spregne sa sedištem 123 klipa i izvlači se sve dok se zaporke ne spregnu sa donjom površinom prirubnice 122 glave klipa. Hidraulično vreteno se potom dalje izvlači tako da sve više potiskuje klip u cilindar, tako da O-prstenovi prođu pored upora 130 na unutrašnjoj površini zida cilindra. Kada pro-đu taj upor, O-prstenovi budu potpuno sabijeni između unutrašnje površine zida 107 cilindra i zaptivnih žlebova 127, tako da obezbeđuju potpuno zaptivanje.

U toku rada klip 92 za gnječenje razvija pritisak od oko 800 do 900 psi (4000 lb sile na vrhu hidrauličkog vretena) što je dovoljan pritisak da pokida pa-ketiće sa uzorcima u cilindru. Tečnost od uzoraka krvi ili plazme teče duž žle-bova za fluid načinjenih u rešetkastoj ploči i u središni sabirnik gde se sakuplja i ističe kroz izlazni otvor i u posudu za mešavinu. Posle operacije gnječenja aktivira se hidraulični cilindar 95 tako da se klip 92 za gnječenje malo odigne (oko 1/2 do 1 in) iznad mase iskidanih paketića plazme, čime se obrazuje jedna komora unutar cilindra. Gas pod pritiskom, na primer vazduh pod pritiskom, pušta se u komoru kroz ventil 102 u klipu 92. Stavljanje komore pod pritisak potiskuje svu zaostalu tečnost od uzoraka krvi ili plazme iz cilindra kroz izlazni otvor 103 i u plosudu za obrazovanje mešavine.

Kada je završeno gnječenje i obrazovanje mešavine, izlazni vod priključen na izlazni otvor 103 zatvori se stezaljkom da bi se sprečilo izlaženje iz cilindra sve zaostale tečnosti od uzoraka. Izlazni se vod potom stavlja u posudu sa hlornim krečom pa se pusti da hidraulički cilindar dalje podiže klip u cilindru, tako da dolazi do usisavanja koje uvlači hlorni kreč iz posude u cilindar. Poželjno je da se gnječenje i usisavanje ponove još dva puta kako bi se sva "povratna" tečnost od uzoraka krvi ili plazme potpuno izstisla iz cilindra 91 za gnječenje i hlorni kreč dobio punu mogućnost da potpuno ispuni unutrašnjost komore za gnječenje, čime se smanjuje ukupno virusno zagađenje koga bi moglo biti u cilindru.

Potom se aktiviraju brzorastavne zaporke pa se kombinacija klip/cilindar skida sa hidraulične prese 90 i podvrgava proceduri sterilisanja, na primer u nekom autoklavu. Klip i cilindar se mogu hemijski očistiti potapanjem u 10% ras-tvor hlornog kreča, posle čega sledi ciklus ispiranja u H20, 1% SDS (natrijum dodecil sulfat) kao površinski aktivnom sredstvu, pa opet u H20, pre obrade u autoklavu. Ako nema dovoljno vremena za sterilizovanje u autoklavu, hemijsko se čišćenje može završiti 70% rastvorom ETOH i sterilne H20. Ako se želi dodatno hemijsko čišćenje, ono se vrši pod biološki bezbednim poklopcem klase II koji ima odušku kroz jedan HEPA filtar. Još dok je pod poklopcem u cilindar za gnječenje se stavlja sledeća grupa sa paketićima uzoraka koji treba da se poki-daju pa se cilindar 92 za gnječenje ručno stavlja u otvor cilindra 91 za gnječenje i potiskuje nadole sve dok O-prstenovi klipa ne dođu u dodir sa kosim uporom obrazovanim na unutrašnjem zidu cilindra. Ponovo napunjenja kombinacija cilindar/klip spremna je da se postavi na cilindarsko sedište 93 drobilice 90. Aktivira se hidraulični cilindar 95 i hidraulično vreteno 94 spušta se na klip 92 tako da brzo rastavne zaporke zahvataju prsten za držanje na klipu. Ponavlja se gnječe-nje, ispuštanje tečnosti i postupak čišćenja hlornim krečom.

Stručnjak će iz prethodnog opisa sagledati da električno pokretana hidra-ulična presa (drobilica) 90 omogućuje prikupljanje uzoraka krvi ili plazme iz velikog broja paketića sa uzorcima uz minimalan utrošak vremena. Broj paketića sa uzorcima koji se mogu pokidati takvim jednim uređajem ograničen je, pre svega, veličinom uređaja i pritiskom kojim može klip za gnječenje delovati na masu pa-ketića sa uzorcima u cilindru. Pritisak od 800 do 900 psi koji razvija hidraulička presa prema prikazanom izvođenju dovoljan je da potpuno iskida do 64 paketića sa uzorcima, opisanih u vezi sa slikom 2. Prema tome, velika mešavina koja sadr-ži do 512 uzoraka može se obrazovati tokom osam radnih ciklusa drobilice prema ovom pronalasku. To obezbeđuje značajnu uštedu u vremenu kod obrazovanja mešavine u odnosu na postupak kod koga se 512 paketića pojedinačno bušilo iglom da bi se iz njih prikupili uzorci.

Osim toga, stručnjaku će biti jasno da se jedinstvena mešavina koja sadrži do 512, ili više, uzoraka može obrazovati jednom drobilicom koja je dovoljno velika da primi u cilindar veći broj paketića sa uzorcima. Hidraulična presa će takođe biti većih dimenzija da bi obezbedila veću snagu radi savlađivanja većeg otpora povećanog broja paketića. Kao što je ranije pomenuto, veličina mešavine biće ograničena jedino željenom veličinom drobilice.

Na slici 11 prikazan je algoritam metodologije PCR ispitivanja prema pronalasku koji omogućuje identifikaciju jedine PCR pozitivne donacije sa najmanjim brojem pojedinačnih ispitivanja.

Proces počinje blokom 200 sa definisanjem odgovarajuće veličine početne mešavine koja, sa svoje strane, zavisi od raznih činilaca kao što je učestanost pojave interesantnog virusa u opštoj populaciji davalaca, verovatna krajnja koncentracija virusne DNK ili RNK posle razblaživanja u mešavini i slično.

Mada je PCR ispitivanje veoma osetljivo i sposobno da otkrije jedan jedini virus u nekom zagađenom uzorku, virus mora neophodno biti prisutan u uzorku za PCR ispitivanje da bi se dobio pozitivan rezultat. Ako je, na primer, jedan uzorak iz neke zagađene donacije koja ima relativno nisku koncentraciju virusa pomešan sa velikim brojem nezagađenih uzoraka, koncentracija virusa u krajnjoj mešavini može biti tako mala, da postoji statistička verovatnoća da virusa nema u uzorku uzetom iz mešavine za PCR ispitivanja. Takve mešavine mogu zbilja dati negativne rezultate kod ispitivanja na zaraženost virusima.

Tako, na primer, ako je uzorak od 0,02 ml pripremljen od donacije plazme zaražene virusima sa koncentracijom od 500 virusa po ml uzorka, uzorak od 0,02 ml sadržaće, prosečno, 10 virusa. Ako je ovaj uzorak od 0,02 ml pomeša sa približno 500 drugih uzoraka od 0,02 ml od nezagađenih donacija, dobijena mešavina od 10 ml sadržaće viruse u koncentraciji od 1 virusa po ml. Prema to-me, ako se jedan uzorak od 1 ml uzme iz mešavine za PCR ispitivanje, postoji značajna statistička verovatnoća da PCR uzorak neće sadržiti ni jedan virus.

Ovako male koncentracije zagađenosti virusima predstavljaju malu opa-snost za proizvode izvedene od plazme pošto postoji nekoliko postupaka za neu-tralisanje virusa koji se nalaze u donacijama u tako malim koncentracijama. Ovi postupci neutralisanja virusa obuhvataju korišćenje rastvarača/deterdženta ili zagrevanje na iznad 60°C tokom odgovarajućeg vremena ili slično. Ovi su postupci, uopšteno, opisani kao sposobni za redukovanje koncentracije za izvestan broj "logaritamskih jedinica". Tako, na primer, postupak rastvarač/deterdžent sposo-ban je da smanji virusno zagađivanje hepatitisa C bar za IO<7>po ml ili "7 logaritamskih jedinica". Na taj se način proizvodi od plazme kao što su faktor VIII, faktor IX ili protrombinski kompleks mogu pripremati od donacija plazme rutinski obrađenih, na primer, postupkom rastvarač/deterdžent nakon što su kod PCR ispitivanja bile negativne.

Za proizvode od krvi, koji se rutinski neposredno daju nekom primaocu transfuzijom, ostaje neki mali rizik od virusnog zagađivanja male koncentracije, nakon što su takve donacije kod PCR ispitivanja bile negativne.

Kod izvođenja prikazanog u vezi sa slikom 11, procenjeni su napred ras-matrani činioci, kao što je učestanost pojave interesantnih virusa kod populacije davalaca i verovatna koncentracija virusa posle razređivanja. Programira se od-govarajuće dimenzonisana smeša za PCR ispitivanje prvog nivoa koja smanjuje statističku verovatnoću da će vuirusi koji se nalaze u malim koncentracijama pro-ći nezapaženi. Mešavina se priprema u bloku 201 sakupljanjem sadržaja krajnjih kesica identifikovanih sekcija creva, a na napred opisan način. U bloku 202 vrši se PCR ispitivanje na prvom nivou PCR mešavine.

Blok 203 predstavlja odlučujuću tačku u metodologiji prema pronalasku koja zavisi od rezultata PCR ispitivanja vršenog u bloku 202. U slučaju negati-vnog rezultata, pretpostavlja se da sve donacije koje pripadaju uzorcima koji su korišćeni za obrazovanje PCR mešavine prvog nivoa nisu zagađene virusima, pa se puštaju na dalju preradu u farmaceutske proizvode. To znači da se metodologija zasniva na negativnom rezultatu PCR ispitivanja.

Kada PCR ispitivanje da pozitivnu indikaciju, to ukazuje da je neki virusni zagađivač prisutan u jednoj, ili u više od jedne, donacija koje su sačinjavale prvobitnu PCR mešavinu prvog nivoa. U bloku 204 uzima se sledeća kesica koja je bila pored prve odvojene iz segmenata creva koji odgovaraju donacijama koje su sačinjavale prvobitnu PCR smešu prvog nivoa. Te se sledeće kesice sa uzorcima dele u dve približno jednake grupe označene sa A i B radi jasnoće.

Ove dve podgrupe se potom odvojeno mešaju koristeći odvojene, čiste cevčice za obrazovanje obe smeše ovih podgrupa na isti način kako je napred opisano, a samo se jedna od ovih podsmeša podvrgava PCR ispitivanju, kako je označeno u bloku 205. Za svrhe pronalaska potpuno je bez značaja koja će se od ove dve podgrupe ispitivati. U bloku 205 podgrupa A je naznačena kao podgrupa koja će se ispitivati, ali je isto tako lako mogla biti određena podgrupa B a da se ne remeti metodologija pronalaska.

U bloku 206 donosi se odluka u zavisnosti od rezultata PCR ispitivanja mešavine podgrupe A. U slučaju da smeša podgrupe A da negativan rezultat za PCR ispitivanje na viruse, više se ne vrše ispitivanja na uzorcima donacija koje sačinjavaju podgrupu A. Umesto toga, kako je ukazano u bloku 207, sledeće po redu kesice sa uzorcima uzete od segmenata creva koji su obrazovali podgrupu B dele se u dve približno jednake podgrupe A' i B'. Svaka od podgrupa u ovom stupnju obuhvata približno polovinu broja uzoraka koji su sačinjavali neposredno prethodnu podgrupu. Sadržaji podgrupa kesica sa uzorcima opet se mešaju odvojeno na isti način kao što je napred opisano. U slučaju da podgrupa A pokaže pozitivan rezultat kod PCR ispitivanja, što ukazuje da je bar jedna od njenih sas-tavnih donacija zagađena virusom, druga neispititana podgrupa (podgrupa B u primeru sa slike 11) ispituje se u bloku 208 da bi se potvrdilo da li i ona nije ta-kođe PCR pozitivna. Podgrupa A sada postaje podgrupa koja se dalje deli na dve jednake podgrupe (A<1>i B'), kako je naznačeno u bloku 209.

U bloku 210 PCR ispitivanje se vrši na samo jednoj od mešavina podgrupa, A' ili B', definisanih u prethodnom stupnju 207 ili 209. Postupak se ponavlja i vraća do bloka 206 gde se odlučujući stupanj primenjuje na rezultate PCR ispitivanja izvršenog u bloku 210. Opet će, ako PCR ispitivanje za ispitivanu podgrupu bude negativno, neispitivana podgrupa biti dalje podeljena na dve pribli-žno jednake podgrupe, od koji svaka sadrži približno po polovinu uzorraka od prethodne podgrupe. U slučaju da je ispitivana podgrupa dala PCR pozitivan rezultat, ispitivana će podgrupa biti dalje podeljena na dve približno jednake podgrupe, od kojih svaka sadrži po polovinu uzoraka od prethodne podgrupe. U tom će slučaju neispitana podgrupa biti podvrgnuta PCR ispitivanju da bi se potvrdilo da ona nije takođe PCR pozitivna.

Metodologija ispitivanja se nastavlja od bloka 206 do bloka 209 sve dok se ne zaključi da je ispitivanje završeno. Ispitivanje je dovršeno kada podela na podgrupe dovede do obrazovanja dveju podgrupa od kojih svaka sadrži samo po jednu kesicu sa uzorkom koji odgovara jednoj jedinoj donaciji. Jedan od uzoraka se podvrgava PCR ispitivanju u bloku 210 pa ako su rezultati ispitivanja negativni drugi se uzorak identifikuje kao onaj koji pripada virusno zaraženoj donaciji. Ako je ispitivani uzorak dao pozitivan rezultat, preostali se uzorak takođe podvrgava PCR ispitivanju da bi se potvrdilo da on nije takođe PCR pozitivan.

Po završetku svih ispitivanja metodologija prema pronalasku se završava u bloku 211. Treba da bude očigledno iz algoritma prikazanog na slici 11 da metodologija ispitivanja zahteva da se vrše po dva PCR ispitivanja na svakom nivou ispitivanja ako je početno ispitana mešavina bila pozitivna. Jedno početno ispitivanje za jednu od dveju podgrupa i sledeće ispitivanje da je odgovarajuća prvobitno neispitana mešavina stvarno negativna. Metologija ispitivanja zahteva samo jedno PCR ispitivanje na svakom nivou ispitivanja ako je početno ispitana meša-vina negativna.

Primena sistema i postupka ispitivanja uzoraka prema pronalasku biće opisana u vezi sa jednom posebnom veličinom mešavine za PCR ispitivanje, kako je prikazano na slici 12. Prema slici 12, krajnje kesice 512 pojedinačnih donacija obrazuju početnu mešavinu 212 za PCR ispitivanje. U cilju ilustrovanja, pretpo-staviće se da je samo jedan od 512 uzoraka uzet iz jedne donacije koja je bila zagađena jednim interesantnim virusom. Segment creva prikazan na slici 12 koji ima 10 jednakih i povezanih kesica predstavlja segmente creva prvobitno priklju-čenih a potom odvojenih od zagađenih posuda donacije plazme.

Početna mešavina 512 uzoraka podvrgava se PCR ispitivanju i zbog prisustva zagađenog uzorka daje pozitivnu indikaciju virusa. U stupnju 213 pripremaju se dve mešavine (256A i 256B) donacija od sledećih po redu kesica uzetih od segmenata koji su obrazovali prethodnu pozitivnu mešavinu. Mešavina 256B se podvrgava PCR ispitivanju i, kako je prikazano na slici 12, daje negativnu indikaciju virusa, što ukazuje da mešavina 256A sadrži uzorak iz zagađene donacije.

U stupnju 214 pripremljene su dve mešavine od po 128 donacija od slede-ćih po redu kesica od segmenata creva koji su sačinjavali mešavinu 256A. Na taj način je, prema pronalasku, mešavina 256A podeljena a da nije PCR ispitivana. U stupnju 203 mešavina 128A se PRC ispituje i pošto daje negativnu indikaciju virusa zna se da mešavina 128B sadrži kesicu sa uzorkom od zagađene donacije. Mešavina 128B tada se deli na dve smeše od po 64 donacije (64A i 64B) uzimanjem sledećih po redu kesica od segmenata creva čije su prethodne kesice obrazovale mešavinu 128B.

Potom se mešavina 64B podvrgava PCR ispitivanju i, prema primeru sa slike 12, daje pozitivnu indikaciju virusa. U ovom se slučaju vrši PCR ispitivanje na mešavini 64A radi provere da je stvarno negativna i da nema drugih zagađe-nih uzoraka osim onih u mešavini 64B. U stupnju 216 mešavina 64A se deli na dve smeše od po 32 donacije, 32A i 32B, uklanjanjem sledećih po redu kesica od segmenata creva korišćenih za obrazovanje prethodne mešavine 64B. Potom se mešavina 32B izlaže PCR ispitivanju, daje negativnu indikaciju virusa, kao što je pokazano, pa se mešavina 32A zbog toga deli na dve mešavine od po 16 donacija, 16A i 16B. Mešavine od po 16 donacija opet se pripremaju uzimanjem sle-dećih po redu kesica sa uzorcima od segmenata creva koji su obrazovali prethodnu pozitivnu mešavinu 32A.

U stupnju 217, mešavina 16B se izlaže PCR ispitivanju i daje pozitivnu indikaciju virusa. Zbog toga se mešavina 16A izlaže PCR ispitivanju da se potvrdi da je negativna i da se svi zagađeni uzorci nalaze u mešavini 16B.

U stupnju 218 se mešavina 16B deli na dve mešavine od po 8 donacija, 8A i 8B, uzimanjem sledećih po redu kesica sa uzorcima od segmenata creva koji su obrazovali prethodnu pozitivnu mešavinu 16B. Potom se mešavina 8B izlaže PCR ispitivanju i, kao što je prikazano, daje negativnu indikaciju virusa, ukazu-jući da mešavina 8A sadrži uzorak iz jedne zagađene donacije. Sada se mešavina 8A deli u stupnju 219 na dve mešavine od po 4 donacije, 4A i 4B. PCR ispitivanje se vrši na mešavini 4B koja daje negativn indikaciju, čime ukazuje da mešavina 4A sadrži uzorak iz zagađene donacije. Mešavina 4A se potom deli u stupnju 220 na dve mešavine 2A i 2B na isti način kao što je napred opisano. Posle PCR ispitivanja mešavina 2A daje negativnu indikaciju virusa, što ukazuje da je jedan od dva uzorka koji sačinjavaju grupu 2B uzet iz segmenta creva pripadajuće ? zagađene donacije.

U stupnju 221 pojedinačne se donacije ispituju odvajanjem poslednje kesice od segmenata creva koji sačinjavaju grupu 2B. Krajnje pojedinačne donacije izložene su PCR ispitivanju da bi ce identifikovala specifična pozitivna donacija koja se potom uklanja sa skladišta i na odgovarajući način uništava. Preostalih 511 bezvirusnih donacija zadržava se za dalju obradu u farmaceutske proizvode.

U prikazanom primeru jedna jedina zagađena donacija bila je pojedina-čno identifikovana iz grupe od 512 takvih donacija izvođenjem svega 13 posebnih PCR ispitivanja, uključujući primarno PCR ispitivanje na početnoj mešavini od 512 donacija. Postupak prema pronalasku omogućuje izostavljanje jednog PCR ispitivanja na jednoj mešavini neke podgrupe sve dok pripadajuće ispitane podgrupe, tj. njihove mešavine, daju negativnu indikaciju virusa. Izostavljanjem ne-kih od PCR ispitivanja postupak prema pronalasku smanjuje broj PCR ispitivanja koja se moraju izvesti da bi se identifikovala specifična pozitivna donacija a da se ne žrtvuje preciznost metodologije PCR ispitivanja. Po postupku prema pronalasku biće identifikovane sve pozitivne donacije ali bez zahteva da se sve donacije ispituju.

Iz primera izvođenja prema slici 12 vidi se da se bilo koja od dve postepeno smanjivane podgrupe može izložiiti PCR ispitivanju i da položaj pozitivnog uzorka može da se menja. Ako bi uzorak iz pozitivne donacije bio prisutan u svakoj prvo ispitivanoj mešavini neke podgrupe, bilo bi potrebno 18 ispitivanja da bi se pojedinačno identifikovala pozitivna donacija (jedno početno ispitivanje koje daje pozitivnu indikaciju i jedno dodatno ispitivanje da bi se potvrdilo da je odgovarajuća druga mešavina negativna).

Na isti način, ako bi svaka prvo ispitivana mešavina neke podgrupe da-vala negativnu indikaciju, bilo bi potrebno 10 ispitivanja da se identifikuje pozitivna donacija. U praksi teže pozitivni i negativni rezultati ispitivanja da se jedna-ko rasporede, pa je, u prošeku, potrebno 14 ispitivanja da bi se identifikovala jedinstvena pozitivna donacija od početne mešavine od 512 jedinica.

Iz napred rečenog je jasno da su sistem i postupak prema ovom pronalasku, uključujući dobavljanje segmenata creva koji sedrže pojedinačne i povezane kesice od kojih svaka sadrži uzorak jedne od donacija plazme, pogodni za obez-beđivanje više mešavina za PCR ispitivanja. Za razčiku od konvencionalnih priprema mešavina, kod kojih se niz početnih i sledećih mešavina obrazuje istovremeno od jednog jedinog uzorka svake od donacija, ovaj pronalazak omogućuje obrazovanje mešavine za ispitivanje neposredno pred ispitivanje. "Pravovre-meno" obrazovanje mešavina omogućuje obrazovanje mešavina za ispitivanje od pojedinačnih kesica samo ako je potrebno. Verovatnoća đa će doći do zagađivanja isključena je pošto se mešavine obrazuju u različitim trenucima vremena i svaka od hermetički zatvorenih kesica sa uzorcima. Pored toga, kesice sa uzorcima ostaju zamrznute sve dok ne budu potrebne za obrazovanje mešavine za ispitivanje. Izbegnuti su višestruki ciklusi zamrzavanja-odrnrzavanja koji bi mogli nepovoljno uticati na dobijanje interesantne DNK ili RNK, čime se obezbeđuje celovitost PCR ispitivanja.

Mada je napred opisan postupak efikasan za identifikovanje jedne virusno pozitivne donacije sa najmanjim brojem relativno skupih PCR ispitivanja, ima i drugih postupaka za identifikovanje pojedinačnih pozitivnih donacija u skladu sa ovim pronalaskom. Tačnije, jedan takav postupak ima svojstvo da može identifikovati pojedinačne pozitivne donacije u dva do tri ciklusa PCR ispitivanja, čime se značajno smanjuju vreme i troškovi potrebni za pregled velikog broja donacija.

Tako, na primer, kod napred opisanog postupka, kad se jedna određena mešavina jedne podgrupe identifikuje da sadrži pozitivnu donaciju, tehničar mora da identifikuje donacije koje su doprinele uzorke za obrazovanje te određene mešavine. Te se donacije moraju ponovo pokupiti i od svakog odgovarajućeg segmenta creva mora se uzeti dodatni paketić sa uzorkom. Moraju se obrazovati dve mešavine sledeće generacije i ponoviti PCR ispitivanje. Ovo sakupljanje, obrazovanje mešavina novih podgrupa i PCR ispitivanje ponavljaju se za sve manje i manje mešavine podgrupa sve dok se ovim postupkom ne identifikuje donacija zagađena virusom.

Međutim, kod svakog ciklusa PCR ispitivanja troši se značajna količina vremena (prikupljanje, obrazovanje mešavina podgrupa, PCR ispitivanje). Ako se kao primer uzme 512 uzoraka za mešavinu prve generacije, jasno je da će biti potrebno najmanje 10 ciklusa PCR ispitivanja da bi se identifikovala pojedinačna donacija zagađena virusom. Mada je veoma jeftin, opisani postupak može predstavljati problem za laboratoriju za PCR ispitivanja kada je vreme bitno.

Jedna metodologija za pojedinačno identifikovanje virusno pozitivnih donacija krvi ili plazme uz najmanji broj PCR ispitivanja biće opisana u vezi sa slikama 13 i 14.

Na slici 13 prikazanje algoritam jedne metodologije PCR ispitivanja prema pronalasku za efikasno otkrivanje jedne posebne PCR pozitivne donacije u mešavini uz minimalan broj ciklusa PCR analize. Kao i kod napred opisanog postupka, postupak sa slike 13 pretpostavlja da PCR ispitivanje ima dovoljnu osetljivost da otkrije prisustvo jednog pozitivnog uzorka u mešavini odgovarajuće veličine. Samo radi ilustrovanja, početna je grupa birana da predstavlja 512 donacija krvi ili plazme. Prosečni će stručnjaci shvatiti da veličina početne grupe može biti veća ili manja, u zavisnosti od posebnog genomnog markera koji se ocenjuje, od osetljivosti procedure korištenog PCR ispitivanja, očekivane vrednosti koncentracije genomnog markera u jednom reprezentativnom uzorku i veličine reprezentativnih uzoraka.

Postupak počinje u bloku 301 definisanjem jedne n-dimenzione matrice uzoraka. Matrica može biti bilo koje veličine i može sadržati bilo koji broj dimenzija od 2 do n, ali je preporučljiva jedna 3-dimenziona pravilna matrica organizovana kao kocka.

Primer takve jedne matrice prikazan je na slici 14 koja je grafički prikaz kockaste matrice, naznačene 3-dimenzionim indeksima - red, kolona i sloj (r, c, s). Na primeru matrice na slici 12 postoje 3 reda, 3 kolone i 3 sloja, što daje 3<3>ili 27 elemenata. Kod ovog primera izvođenja smatra se da red obuhvata sve elemente defmisane jednim imaginarnim vertikalnim presekom kroz kockastu pravilnu matricu. Kod izvođenja sa slike 14, elementi koji sačinjavaju, na primer, red 3 matrice označeni su slovom r3.

Na isti način, kolona sadrži sve elemente matrice defmisane sledećim imaginarnim vertikalnim presekom u pravcu upravnom na pravac jednog reda. Kod primera izvođenja na slici 14, elementi koji sadrže, na primer, kolonu 1 imaju slovoCi. Sloj je definisan kao svi elementi koji obrazuju jedan horizontalan presek kroz primer matrice sa slike 14. Na sličan način kako su definisani red i kolona, elementi koji sačinjavaju sloj 1 označeni su slovima st.

Zbog toga svaki od 27 elemenata u matrici sa slike 14 jedinstveno pripada jednom od 3 reda, jednoj od 3 kolone ijednom od 3 sloja. Matematički to se može izraziti vezom Xrcs, gde X predstavlja jedan element, a RCS je jedan dimenzioni indeks, gde svaki od indeksa ima vrednost od 1 do 3. Poseban element Xm može se identifikovati kao element na preseku reda 1, kolone 1 i sloja 3.

Iz prethodnog se vidi da, mada je primer matrice sa slike 14 jedna 3,x 3 x 3 matrica, princip defmisanja matrice i obrazovanje elemenata važe i za matrice sa mnogo većim brojem redova, kolona i slojeva. Tačnije, matrica sa 8 redova, 8 kolona, 8 slojeva može se predstaviti matematički sa Xrcs, gde r, c i s mogu imati vrednosti od 1 do 8. Na taj acin jedna 8x8x8 matrica može da prihvati oznake za 512 elemenata.

Prema algoritmu sa slike 13, a prema definiciji n-dimenzione matrice uzoraka, pojedinačni uzorci donacija krvi ili plazme raspoređeni su u svaki od elemenata definisanih matricom. Kod primera jedne 3-dimenzione matrice sa 8 x 8 x 8 elemenata, po jedan uzorak od svake od 512 pojedinačnih donacija povezan je sa jednim matričnim elementom i identifikovan je odgovarajućom jedinstvenom Xrcsoznakom.

Potom se uzme ista kolicna od svakog uzorka i obrazuje se više mešavina. Svaka od mešavina sadrži iste količine svih uzoraka (Xrcs) kod kojih je 1 od dimenzionih indeksa fiksiran. Drugim recima, u skladu sa napred opisanom matricom, svi uzorci (Xres) koji imaju r = 1, bez obzira na oznaku kolone ili sloja, obrazuju jednu mešavinu. Na isti način za r = 2, r = 3,.... r = n. Na isti način za c = 1, nezavisno od oznake za red ili sloj, c = 2, ... c = n. Na isti način za s = 1, bez obzira na oznaku kolone ili reda, s = 2,... s = n. Na taj način svaka od mešavina predstavlja svaki red, kolonu, sloj ili drugi dimenzioni indeks, tako da kad bi bila definisana jedna n-dimenziona matrica bilo bi n-dimenzija puta (ukupan broj uzoraka)<1/n>mešavina. Kod primera 3-dimenzione matrice 8x8x8 koja sadrži 512 uzoraka biće 24 mešavine podgrupa (8 mešavina redova, 8 mešavina kolona i 8 mešavina slojeva). Obrazovanje mešavina prema pronalasku može sa posmatrati kao slično matematičkom postupku redukovanja jedne determinante postupkom minora. Slično tome, smatraće se da se svaki uzorak nalazi u N malih mešavina, 1 za svaku dimenziju matrice.

Pored obrazovanja malih mešavina, data količina svakog od uzoraka, ili data količima svake od malih mešavina, kombinuju se radi obrazovanja jedin-stvene glavne mešavine koja sadrži po jedan uzorak od svih 512 donacija koje obrazuju postojeću zapreminu donacija. Nakon što su obrazovane sve mešavine, svi preostali uzorci i male mešavine i glavna mešavina mogu se ponovo zamrznuti i pohraniti do trenutka kada se želi vršiti PCR ispitivanje.

Kada se želi vršiti PCR ispitivanje, ono se prvo vrši na glavnoj smeši koja predstavlja reprezentativnu mešavinu istih količina svih uzoraka koji sačinjavaju matricu. Ako su rezultati za glavnu mešavinu negativni, nema, bar na nivou osetljivosti PCR ispitivanja, virusno pozitivnih donacija koje predstavljaju uzorci koji su obrazuju matricu. Donacije krvi ili plazme koje su dale uzorke za matricu mo-gu se pustiti na dalju upotrebu. Međutim, ako je PCR ispitivanje glavne mešavi-ne pozitivno za jedan određeni genomsku marker, ulazi se u drugi ciklus PCR ispitivanja, u bloku 300, u kome se svaka od malih smeša ispituje.

Na način sličan napred opisanom, veličina glavne mešavine birana je tako daje statistička verovatnoća da u glavnoj mešavini (512 uzoraka) bude više od jednog pozitivnog uzorka mala, poželjeno manja od 1 do 2%. To se može ostvariti procenom učestanosti interesantnih virusa u opšto populaciji do nivoa pouzdanosti od 98% do 99%. Tako, na primer, ako je utvrđeno da je samo 1 davalac od opšte populacije davalaca od 1000 zaražen interesantnim virusom do nivoa pouzdanosti od 98%, postoji verovatnoća od 2% da će se naći više od 1 zaraže-' nog davaoca među sledećih 1000 davalaca koji se ocenjuju. To obezbeđuje da će algoritam, u opštem slučaju, moći da identifikuje pojedinačnu reaktivnu jedinicu u mešavini odgovarajuće veličine u ciklusu PCR ispitivanja. Prema pronalasku, pod uslovom da ima jedan jedini pozitivni uzorak u matrici, 3 od malih mešavina sadržaće jednu reprezentativnu količinu pozitivne donacije, 1 u svakoj dimenziji. Kod prikazanog primera izvođenja (matrica od 512 uzoraka) postoji 8 malih me-šavina po redovima, 8 malih mešavina po kolonama i 8 malih mešavina po slo-jevima. Ako je glavna mešavina pozitivna, tada će se red 1, kolona 1 i sloj 1 po-kazati pozitivnim tokom drugog ciklusa PCR ispitivanja kako je prikazano u bloku 307.

Tako, na primer, ako je reaktivni uzorak bio pridodan matričnom elementu X113, mala mešavina reda 1 daće pozitivan rezultat PCR ispitivanja, dok će male mešavine reda 2 i sledećiih redova biti negativne. Dalje će mala mešavina reda 1 dati pozitivan rezultat dok će male mešavine reda 2 i sledećih redova biti negativne. Na isti način će male mešavine sloja 1 i sloja 2 dati negativan rezultat, mešavina sloja 3 daće pozitivan rezultat, dok će sledeće male mešavine sloja biti negativne. 3 pozitivne male mešavine (red 1, kolona 1 i sloj 3) imaju samo jedan jedini zajednički element, X113. Na taj je način pozitivna donacija jedinstveno identifikovana kao uzorak pridodat elementu XU3.

Ako postoji više nego 1 reaktivna donacija u matrici, reaktivne donacije takođe mogu biti jednoznačno identifikovane postupkom prema pronalasku sa ne više nego 1 dodatnim ciklusom PCR ispitivanja. Ako se zapazi da više od 1 male mešavine jednog dimenzionog indeksa daje pozitivan rezultat, dok samo jedna jedina mala mešavina koja predstavlja svaki od preostalih dimenzionih indeksa daje pozitivni rezultat, više nego 1 pozitivna donacija može se jednozna-čno identifikovati matematičkom obradom rezultata ispitivanja bez potrebe da se izvodi treći ciklus PCR ispitivanja.

Tako, na primer, ako jedna mala mešavina reda 1, i nijedna druga, daje pozitivan rezultat, jedna mala mešavina kolone 1, i nijedna druga, daje pozitivan rezultat, i mala mešavina sloja 1 i mala mešavina sloja 3 daju pozitivne rezultate, postoje samo dve pozitivne donacije koje sačinjavaju matricu i one se mogu jednoznačno definisati kao Xmi Xm- Nije potrebno nikakvo dalje ispitivanje da bi se došlo do ovog rezultata.

Ako se, s druge strane, zapazi da više malih mešavina daje pozitivne rezultate i da njihovi identiteti ukazuju na promene duž 2 dimenziona indeksa kako je prikazano u bloku 310, biće jasno da će biti z2 elemenata identifikovano kao potencijalno pridodalo jednoj pozitivnoj donaciji, gde je z stvaran broj pozitivnih donacija koje sačinjavaju matricu.

Ako, na primer, mala mešavina reda 1, i nijedna druga, daje pozitivne rezultate, male mešavine kolona 1 i 3 daju pozitivne rezultate i male smeše slojeva 1 i 3 daju pozitivne rezultate, to ukazuje da su potencijalno pozitivni mogući elementi Xm, X113, X131i X|33. Pošto je to umnožak samo dva od dimenzionih indeksa (kolona i sloj), a za moguće elemente, vidi se da postoje samo dve stvarno pozitivne donacije koje sačinjavaju matricu. U ovim okolnostima mogu se sve 4 donacije uslovno identifikovati kao pozitivne i baciti, ili, alternativno, može se uzeti reprezentativna količina od svakog od ta 4 elementa i pojedinačno izložiti PCR ispitivanjima tokom trećeg ciklusa PCR ispitivanja u bloku 311, kako bi se pojedinačno identifikovale 2 od 4 donacije koje su stvarno pozitivne.

Na sličan se način matematički može utvrditi da će, ako ima više od 2 pozitivne donacije u matrici, i da njihovi identifikatori variraju u više od 2 dimenzije, biti identifikovano najviše z" potencijalno pozitivnih mogućih elemenata, gde je z stvaran broj pozitivnih donacija, a n je broj dimenzija koje se menjaju. U ovim se okolnostima uzimaju reprezentativne količine svih sumljivih elemenata u matrici i neposredno se ispituju.

Može se videti da postupak prema pronalasku obezbeđuje jednoznačnu identifikaciju donacija koje su reaktivne na jedan određeni genomni marker u jednom jedinom ciklusu PCR ispitivanja za jednu početnu glavnu mešavinu, u 2 ciklusa PCR ispitivanja za sve matrice koje sadrže jednu jedinu reaktivnu donaciju ili više reaktivnih donacija koje se menjaju duž jednog jedinog dimenzionog indeksa, a u 3 ciklusa PCR ispitivanja za svaku drugu situaciju.

Prema tome, primena ovog pronalaska obezbeđuje da snabdevanje krvlju i proizvodi od krvi ili plazme pripremljeni od nje budu suštinski bezbedniji zbog toga što je prikupljena krv koliko je to moguće nezagađena virusima. Jeftina visoko osetljiva neposredna ispitivanja na prisustvo virusa vrše se lako. Na taj su način izbegnuta lažna prikazivanja zagađivanja virusina obično povezana sa ispitivanjem na antitela tokom perioda mirovanja nakon inficiranja. Pored toga, ovaj pronalazak omogućuje jeftinu primenu visoko osetljivih ispitivanja koja su u stanju da otkriju prisustvo jednog jedinog virusa u ispitivanom uzorku, što pomaže da se obezbedi snabdevanje krvlju u kojoj neće biti virusnog zagađenja.

Stručnjaci će shvatiti da prethodni primeri i opisi raznih preporučljivih izvođenja ovog pronalaska samo ilustruju pronalazak u celini, a da se mogu vršiti promene oblika, veličine i broja pojedinih komponenata ovog pronalaska, kao i vrsta primenjenih ispitivanja, u duhu i opsegu pronalaska. Tako će, na primer, stručnjaku biti jasno da se dužina pojedinačnih i spojenih kesica, a time i njihov zapreminski sadržaj, mogu postupno povećavati dužinom segmenta creva. Kako se uzastopne mešavine podgrupa za ispitivanje obrazuju od sve manjeg broja uzoraka, zapremina plazme koja obrazuje mešavinu neminovno se smanjuje. Jasno je da, radi održavanja dovoljne zapremine plazme u svakoj sledećoj mešavini podgrupe, sledeće kesice sa uzorcima mogu imati veću zapreminu kako bi se ostvarila željena krajnja zapremina mešavine. Da bi se ostvarile mešavine u opsegu od oko 1 ml do oko 10 ml, jasno je da zapremine uzastopnih kesica treba da se postupno povećavaju od oko 0,02 ml do oko 0,5 ml. Kod jednog primera izvođenja, zapremina kesice je 0,02 ml u prvoj kesici koja se koristi za najveću mešavinu, a 0,2 ml u poslednjoj kesici.

Stničnjacima će biti jasno da sistem prema pronalasku nije ograničen na posudu za sakupljanje plazme i na pripadajući segment creva prema prikazanom primeru. Isto tako efikasno se mogu koristiti kesice za krv ili druge posude za biološke fluide a na njih se mogu priključiti pogodni segmenti creva, bilo pre sakupljanja fluida, bilo nakon završenog prikupljanja fluida. Sve što se zahteva jeste da se količine bioloških fluida potrebne za uzorke prenesu u segment creva koji se zatim oblikuje u kesice prema pronalasku.

Prema tome, prikazani pronalazak nije ograničen na opisana specifična izvođenja, več je definisan opsegom priloženih patentnih zahteva.

Claims (12)

1. Postupak za identifikovanje virusno pozitivnih donacija bioloških fluida, naznačen time, što obuhvata: obezbeđivanje većeg broja donacija biološkog fluida. definisanje jedne n-dimenzione matrice, gde je n jedan ceo broj veći od 1, pri čemu matrica sadrži veći broj elemenata, a svaki od elemenata je definisan presekom n-đimenzija matrice, i obeležen oznakom elementa, pri čemu oznaka elementa sadrži jednu indeksnu vrednost za svaku od dimenzija matrice, uzimanje jednog uzorka od svake donacije bioloških fluida, pridodavanje svakog uzorka po jednom pripadajućem od svakog elementa matrice, pri čemu je svaki pojedinačni uzorak identifikovan svojim odgovarajućim elementima u odnosu na matrično obeležavanje, uzimanje alikvota od svakog uzorka, pri čemu je broj alikvota uzet od svakog uzorka đefmisanog brojem dimenzija koje karakterišu matricu, obrazovanje mešavina od alikvota od svakog od uzoraka, pri čemu svaka od mešavina sadrži po jedan alikvot od uzoraka defmisanih matričnom oznakom u kojoj je jedna dimenziona vrednost indeksa fiksirana, pa je svaka od tih mešavina identifikovana pomenutom fiksiranom dimenzionom vrednošću indeksa, PCR ispitivanje svake mešavine na indikaciju virusa, određivanje pripadajućih dimenzionih indeksa mešavina koje daju pozitivnu indikaciju virusa, i kombinovanje dimenzionih vređnosti indeksa u jednu matričnu oznaku elementa čime se jednoznačno identifikuje jedan jedini matrični element definisan matričnom oznakom koja označava jedan virusno pozitivan uzorak.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što svaka od n-dimenzija matrice sadrži jednak, ceo broj elemenata.

3. Postupak prema zahtevu 2, naznačen time, što je matrica 3-dimenziona, pri čemu je matrica podeljena na redove, kolone i slojeve, i što je svaki od elemenata okarakterisan jednom matričnom oznakom Xres, gde dimenzioni indeksi r, c i s označavaju elemente koji obuhvataju jedan red, jednu kolonu ijedan sloj matrice.

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što stupanj obrazovanja mešavina dalje obuhvata: obrazovanje mešavina od alikvota od uzoraka identifikovanih identičnim r indeksima ali različitim c i s indeksima, obrazovanje mešavina od alikvota od uzoraka identifikovanih identičnim c indeksima ali različitim r i s indeksima, obrazovanje mešavina od alikvota od uzoraka identifikovanih identičnim s indeksima ali različitim r i c indeksima, i procenu svake od r, c i s mešavina na pozitivnu indikaciju virusa dobijenu posle PCR ispitivanja.

5. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time, što dalje obuhvata: određivanje celobrojnog indeksa svake od r mešavina koja je dala pozitivnu indikaciju virusa, određivanje celobrojnog indeksa svake od c mešavina koja je dala pozitivnu indikaciju virusa, i određivanje celobrojnog indeksa svake od s mešavina koja je dala pozitivnu indikaciju virusa.

6. Postupak prema zahtevu 5, naznačen time, što dalje obuhvata stupanj zamene celobrojnih indeksa r, c i s mešavina koje su dale pozitivnu indikaciju virusa dimenzionira indeksima r, c i s matričnih oznaka, čime se jednoznačno identifikuje pojedinačni matrični element definisan pomenutom matričnom oznakom, tako da se jednoznačno identifikuje odgovarajući virusno pozitivan uzorak.

7. Postupak prema zahtevu 6, naznačen time, što 3-dhnenziona matrica obuhvata jedan 8 x 8 x 8 raspored elemenata kod koje svaki od dimenzionih indeksa r, c i s ima celobrojne vrednosti od 1 do 8.

8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što se uzimaju tri alikvota od svakog pojedinačnog uzorka biološkog fluida jedne od donacija.

9. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time, što dalje obuhvata obrazovanje osam redova mešavina, pri čemu je svaki od redova mešavine pojedinačno identifikovan jednim celim brojem od 1 do 8, a svaki je red mešavine obrazovan od 64 uzoraka alikvota; obrazovanje osam kolona mešavina, pri čemu je svaka od kolona mešavine pojedinačno identifikovana jednim celim brojem od 1 do 8, a svaka je kolona mešavine obrazovana od 64 uzoraka alikvota, obrazovanje osam slojeva mešavina, pri čemu je svaki od slojeva mešavine pojedinačno identifikovan jednim celim brojem od 1 do 8, a svaki je sloj mešavine obrazovan od 64 uzoraka alikvota.

10. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što procena dimenzionih indeksa identifikuje veći broj elemenata definisanih dimenzionim indeksima svake od pozitivnih mešavina, ako više od jedne mešavine jednog jedinog dimenzionog indeksa daje pozitivnu indikaciju virusa dok samo jedna jedina mešavina koja predstavlja svaki od preostalih dimenzionih indeksa daje pozitivnu indikaciju virusa, Čime se jednoznačno identifikuje više od jednog virusno pozitivnog uzorka.

11. Postupak prema zahtevu 10, naznačen time, što procena dimenzionih indeksa identifikuje z<n>mogućih virusno pozitivnih elemenata ako je više mešavina koje predstavljaju svaki od dimenzionih indeksa dalo pozitivnu indikaciju virusa, pri čemu z predstavlja stvaran broj pozitivnih uzoraka i gde n predstavlja broj dimenzija koje imaju više pozitivnih mešavina.

12. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što dalje obuhvata stupanj uzimanja jednog dodatnog alikvota od svakog od uzoraka identifikovanih za svaki od z" mogućih virusno pozitivnih elemenata: PCR ispitivanja alikvota na indikaciju virusa, i jednoznačno identifikovanje svih virusno pozitivnih uzoraka.