[go: up one dir, main page]

RS50811B - Rastvorljivi ctla4 molekul za upotrebu u lečenju reumatskih bolesti - Google Patents

Rastvorljivi ctla4 molekul za upotrebu u lečenju reumatskih bolesti

Info

Publication number
RS50811B
RS50811B YUP-1011/02A YUP101102A RS50811B RS 50811 B RS50811 B RS 50811B YU P101102 A YUP101102 A YU P101102A RS 50811 B RS50811 B RS 50811B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ctla4
molecule
soluble
molecules
cells
Prior art date
Application number
YUP-1011/02A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Cohen
Suzette Carr
David Hagerty
Robert Peach
Jean-Claude Becker
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22804919&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50811(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of YU101102A publication Critical patent/YU101102A/sh
Publication of RS50811B publication Critical patent/RS50811B/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Upotreba rastvorljivog CTLA4 fuzionog molekula koji sadrži ekstracelularni domen CTLA4 molekula, gde ekstracelularni domen CTLA4 molekula sadrži amino kiseline prikazane na Slici 23, koji počinje sa metioninom na položaju +1 ili sa alaninom na položaju -1 i završava sa asparaginskom kiselinom na položaju 124, u proizvodnji farmaceutske smeše za lečenje subjekta koji ima reumatoidni artritis, gde subjekt neuspešno tretiran najmanje jednim antireumatskim lekom koji modifikuje bolest.Prijava sadrži još 3 nezavisna i 19 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
Dati pronalazak uopšteno se odnosi na oblast reumatskih oboljenja. Posebno se
ovaj pronalazak generalno odnosi na postupke i jedinjenja za lečenje reumatskih oboljenja, takvih kao što je reumatoidni artritis, davanjem pacijentu efikasne količine mutantnih CTLA4 molekula.
OSNOVA PRONALASKA
Trenutno ne postoji lek za reumatska oboljenja. Nešto se koriste terapeutska sredstva za lečenje simptoma. Karakteristično je da se terapeutska sredstva primenjuju tokom dužeg vremenskog perioda i terapeutska vrednost je često smanjena štetnim sporednim efektima.
Reumatska oboljenja predstavljaju grupu bolesti koja daluje na mišićno-skeletna
i vezivna tkiva u telu. Ove bolesti karakterišu se hroničnom upalom koja često dovodi do stalnih oštećenja tkiva, deformisanosti, atrofije i onesposobljenosti. Reumatska oboljenja deluju na zglobove, kosti, mekana tkiva, ili na kičmenu moždinu (Mathies, H. 1983 Rheuma) i klasifikovana su kao inflamatorni reumatizam, degenerativni reumatizam, ekstra-
celularni reumatizam, ili bolesti kolagena. Neke od reumatskih bolesti su poznate kao autoimune bolesti uzrokovane izmenjenim imunim odgovorom subjekta.
Reumatoidni artirtis je progresivna reumatska bolest, koja se javlja kod približno 2% odrasle populacije razvijenog sveta (Utsinger, P.D. et al., 1985 Rheumatoid Arthritis, str. 140). Ova bolest se karakteriše perzistentnim inflamatornim sinovitisom koji uzrokuje razaranje hrskavice i eroziju kostiju, što dovodi do strukturnih deformiteta u perifernim zglobovima. Simptomi koji su povezani sa reumatoidnim artrtisom uključuju nateknuost zglobova, lomljivost zglobova, upalu, jutarnju ukrućenost, i bol naročito prilikom savijanja. Subjekti koji imaju razvijene faze artritisa pate od strukturnih oštećenja, uključujući razaranje zglobova sa erozijom kostiju (in „ Principals of Intemal Medicine, Harrison, 13th edition, strane 1648-1655). Osim toga, pacijenti mogu imati ostale kliničke simptome od različitih organskih povreda uključujući povrede kože, bubrega, srca, pluća, centralnog nervnog sistema, i očiju used vaskulitisa koje su povezane sa autoimunim procesima.
Ostali simptomi, koji su u korelaciji sa reumatoidnim artritisom uključuju povišenu brzinu sedimetacije eritrocita, i povišene nivoe seruma C-reaktivnog proteina (CRP) i/ili rastvorljive IL-2 receptorte (IL-2r). Brzina sedimentacije eritrocita povećava se skoro kod svih pacijenata sa aktivnim reumatoidnijm artritisom. Nivo seruma C-reaktivnog proteina je taokdje povišen i odnosi se na bolest i m ogućnost progresivnog oboljenja zgloba. Osim toga, nivo rastvorljivog IL-2r, proizvoda aktiviranih T-ćelija povišen je u krvnom serumu i sinovialnoj tečnosti pacijenata sa aktivnim reumatoidnim artritisom (videti „ Principals of Intemal Medicine, Harrison, 13 th edition, streana 1650).
Veruje se da je reumatoidni artritis autoimuna bolest povezana sa T-ćelijama, koja obuhvata interakcije izmedju T-limfocita i ćelija koje predstavljaju antigen. Generalno, magnituda T-ćelijskog odgovora odredjena je pomoću kostimulatornog odgovora otkrivenog interakcijom izmedju površinskih molekula T-ćelija i njihovih liganada (Mueller, et al., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7: 445-480). Ključni signali za kostimulaciju odbezbedjeni su interakcijom izmedju površinskih receptora T-ćelija, CD28 i CTLA4, i njihovih liganada, kao što su molekuli CD80 koji se odnose na B7 (tj., B7-1) i CD86
(tj., B7-2) prisutnim ćelijama antigena (Linslev, P. i Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev.
(IM7ZIUN0L.) 11: 191-212).
Aktivacija T-ćelije u odsustvu rezultata za kostimulaciju dovodi do anergijskog T-ćelijskog odgovora (Schvvartz, R.H., 1992 (Cell 71): 1065-1068) gde imuni sistem ne odgovara na stimulacije.
Pošto je reumatoidni artritis bolest imunog sistema posredstvom T-ćelija, strategija je da se razviju novi agensi za lečenje reumatoidnog artritisa za identifikovanje molekula koji blokiraju signale za kostimulaciju izmedju T-limfocita i prisutnih ćelija antigena, blokiranjem interakcije izmedju endogenog CD28 ili CTLA4 i B7. Mogući molekuli uključuju rastvorljive CTLA4 molekule koju se modifikuju da bi vezali B7 sa višim afinitetom nego divlji tip CTLA4 (sekvenca koja je pokazana na slici 23) ili CD28, blokirajućina taj načinsignale za kostimulaciju.
Rastvorljivi oblici CD28 i CTLA4 konstruisani su spajanjem varijabilnih molekula koji imaju strukturu po obracu (V) ekstracelulamih domena za CD28 i CTLA4 sa imunoglobulinom (Ig) konstantnih domena što dovodi formiranja CD28lg i CTLA4lg. Nukleotid i aminokiselinska sekvenca od CTLA4lg pokazana je na slici 24 sa proteinom koji počinje sa metioninom na položaju +1 ili alaninom na položaju -1 i završava se lizinom na položaju +357. CTLA4lg vezuje i CD80- i CD86-pozitivne ćelije snažnije nego CD28lg (Linslev, P., et al., 1994 IMMUNITY 1: 793-80]. Nadjeno je da se veliki broj imunih odgovora koji zavise od T-ćelija blokira pomoću CTLA4lg i in vivo i in vitro. (Linslev, P., et al., 1991B, koji sledi; Linslev, P., et al., 1992a Science 257: 792-795; Linslev, P., et al., 1992b J. Exp. Med. 176: 1595-1604; Lenschovv, D. J., et al., 1992 Science 257: 789-792; Tan, P., et al., 1992 J. Exp. Med. 177: 165-173; Turka, L.A. 1992 Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 89: 11102-11105).
Za promenjeni vezivni afinitet prema prirodnim ligandima, kao što je B7, rastvorljivi CTLA4lg fuzioni molekuli modifikuju se mutacijama na amino kiselinama u CTLA4 segmentima u molekulu. REgioni CTLA4 koji, kada se mutiraju imaju različiti afinitet vezivanja ili aviditet za B7 ligande uključuju komplementarnošću odredjeni region 1 (koji su odredjeni pomoću komplementarnosti (CDR-1 kao što je opisano u američkom patentu 6,090, 914,5,773,253,5,844,095; u nerešenoj američkoj patentoj prijavi sa brojem 60/214, 065; i od strane Peach, R. J., et al., 1994, J. EXP. MED. 180: 2049-2058) i komplementarnošću odredjeni region molekula koji imaju strukturu po (CDR-3 ) obrascu (CDR-3 je očuvan region od CTLA4 ekstracelularnog domena kao što je opisano u američkoj patentoj prijavi br. 6,090,914, 5.773,253 i 5,884,095; u američkoj patentoj prijavi br. 60/214,065, i Peach, R. J., et al. J Exp Med 1994, 180: 2049-2058). Molekul koji ima strukturu po CDR-3 obrascu okružuje CDCR-3 region i proširuje ga za nekoliko aminokiselina, ispred / ili iza CDR-3-motiva). Molekul koji ima strukturu po CDR-3 obrascu uključuje heksapeptidni motif MYPPPY koji je visoko konzerviran u svim CD28 i CTLA4 članovima familije. Mutageneza skeniranjem alanina kroz heksapeptidni motif u CTLA4, i za odabrane ostatke u [CD28IG] redukuje ili ukida vezivanje za CD80 (Peach, R. J., et al., [J EXP MED] 1994 180: 2049-2058).
Dalje modifikacije su načinjene na rastvorljivim molekulima CTLA4lg molekulima premeštanjem homologih regiona od CTLA4 i CD28. Ove himemi homologi mutantni CTLA4/CD28 molekuli identifikuju MYPPPY heksapeptidni motiv koji je zajednički za CTLA4 i CD28 kao i za izvesne aminokiselinske ostatke
koji nisu sačuvani u molekulima koji imaju strukturu po CDR-1 i CDR-3- obrascu za CTLA4, kao regionima koji su odgovorni za povećanje afiniteta vezivanja za CTLA4 sa CD80 (Peach, R. J., et al., [J EXP MED] 1994 180: 2049-2058).
Rastvorljivi CTLA4 molekuli, takvi kao što su CTLA4lg, mutantni CTLA4 molekuli ili himemi CTLA4/CD28 homologi mutanti kao što je ranije opisano, uvode novu grupu terapeutskih lekova za lečenje reumatska oboljenja.
Predstavljeni tretmani za reumatska oboljenja, kao što su reumatoidni artritis, uključuju alfa blokere za faktor tumorske nekroze [(TNFA)] ili antagoniste. Ovi imunosupresivni lekovi slabe celokupan imuni sistem pacijenta, i na duži rok povećavaju rizik od infekcije. Još više, ovi lekovi skoro potpuno usporavaju razvoj reumatoidnog artritisa, koji se ponovo javlja ubrzanim korakom posle prekida terapije. Osim toga, produžena terapija sa ovim nespecifičnim lekovima proizvodi toksične sporedne efekte, uključujući tendenciju ka razvoju izvesnih maligniteta, slabljenju funkcije bubrega, supresiju koštane srži, pulmonalnu fibrozu, malignitet, diabetes, i poremećaje funkcija jetre. Ovi lekovi takodje postepeno prestaju da budu aktivni posle 2-5 godina (Kellev's Textbook of Rheumatologv, 6th Edition, strane [1001-1022].
<
Alternativno, terapeutski agensi koji su nespecifično imunosupresivni i antiinflamatorni lekovi koriste se da bi se postiglo olakšanje simptoma. Ovi lekovi zavise od doze i ne štite od progresije bolesti. Ovi lekovi uključuju steroidna jedinjenja, kao što su prednison i metilprednisolon. Steroidi takodje imaju značajne sporedne toksične efekte povezane sa njihovom upotrebom u dužem vremenskom periodu. (Kellevćs Textbook of Rheumatologv, 6th Edition, strane 829-833).
Tako, tekući tretmani za reumatoidni artirits imaju ograničenu efikasnost, uključujući značajne sporedne toksične efekte, i ne mogu se koristiti u kontinuitetu za duže periode vremena.
Shodno tome, postoji potreba za tretmanima koji su efikasni i moćniji u lečenju reumatskih oboljenja, takvih kao što je reumatoidni artritis, i izbegavanju mana uobičajenih postupaka i agenasa, uzimanjem za cilj patofiziološkog mehanizma autoimuniteta.
SUŠTINA PRONALASKA
Dati pronalazak obezbedjuje jedinjenja i postupke za lečenje bolesti imunog sistema, davanjem subjektu rastvoljivih CTLA4 molekula, koji vezuju B7 molekule na B7-pozitivnim ćelijma, inhibirajući na taj način vezivanje endogenih B7 molekula za CTLA4 i/ili CD28 na T-ćelijama. Rastvorljivi CTLA4 molekuli koji se koriste u postupcima prema pronalasku uključuju CTLA4lg i rastvorljive mutantne CTLA4 molekule L104EA29Ylg.
Dati pronalazak takodje obezbedjuje postupke za inhibiranje funkcija T-ćelija ali ne i smanjenje broja T-ćelija kod ljudi stupanjem u kontakt B7-pozitivnih ćelija kod ljudi sa rastvorljivim CTLA4. Primeri rastvorljivih CTLA4 uključuju CTLA4IG i rastvorljive CTLA4 mutantne molekule takvi kao što su L1004EA29YIG.
Dati pronalazak takodje obezbedjuje postupke za lečenje (na primer, ublažavanje siptoma) reumatskih oboljenja, takvih kao što je reumatoidni artritis, davanjem subjektu sa diagnozom reumatoidnog artritisa, rastvorljive CTLA4 molekule kao što su CTLA4IG i/ili rastvorljivi CTLA4 mutantni molekuli L104EA29Ylg. Poželjno je da se za upotrebu u postupcima prema pronalasku, CTLA4 mutantni molekul L104EA29Ylg na primer počinje od metionina u položaju +1 ili alanina na položaju
-1 i završava se sa lizinom na položaju +357 kao što je pokazano na slici 19.
dati pronalazak takodje obezbedjuje postupke za smanjenje patofizioloških promena povezanih za reumatskim oboljenjem, kao što je strukturno oštećenje davanjem subjektu sa dijagnozom reumatoidnog artritisa, rastvorljive CTLA4 molekule.
Dati pronalazak takodje obezbedjuje postupke za smanjenje patofizioloških promena koje su u vezi sa bolestima imunog sistema, takvih kao što su reumatska oboljenja, obuhvatajući farmaceutski prihvatljive nosače i biološki efikasni agens kao što su rastvorljivi CTLA4 molekuli.
Kitovi koji obuhvataju farmaceutske kompozicije sa terapeutskim dejstvom na oboljenja imunog sistema takodje su obuhvaćeni pronalaskom. U jednom izvodjenju, kit obuhvata jednu ili više farmaceutskih kompozicija iz pronalaska koje se koriste za lečenje oboljenja imunog sistema, na primer za lečenje reumatoidnog artritisa. Na primer, farmaceutska kompozicija obuhvata efikasnu količinu rastvorljivih mutantnih CTLA4 molekula koji se vezuju za B7 m olekule n B7-pozitivnim ćelijama, blokirajući time B7 molekule od vezivanja CTLA4 i/ili CD28 na T-ćelije. Dalje kit može da obuhvata jedan ili više imunosupresivnih agenasa koji se koriste zajedno sa farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska. Potencijalni imunosupresivni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni time na kortikosteroide, nesteroidne antiinflamatorne lekove (na primer, Cox-2 inhibitore), ciklosporin prednisone, azatioprin, metotreksat, TNFa blokere ili antagoniste, infliksimab, bilo koji biološki agens koji ima za cilj inflamatorni citokin, hidroksihlorohinin, sulfasalazopriin, zlatne soli, etanrcept, i anakinra.
Dati pronalazak takodje obezbedjuje postupke za smanjenje sedimentaione konstante eritrocita koja je u vezi sa reumtidnim artritisom.
Osim toga, dati pronalazak obezbedjuje postupke za smanjenje nivoa izvesnih komponenti krvnog seruma koju su u vezi sa reumatoidnim artritisom, uključujući C-reaktivne proteine, rastvorljive ICAM-1, rastvorljive-E-selektin i/ili rastvorljivi IL-2r.
DETALJAN OPIS SLIKA
Slika 1A: Demografski podaci za pacijente-individue iz populacije iste vrste. DEmografski podaci uključuju rod, rasu, i trajanje bolesti na način kako je to opisano u primeru 3 koji sledi.
Slika 1B: DEmografski podaci za pacijente-individue iz populacije iste vrste. Demografski podaci uključuju rod, uzrast, težinu, i aktivnost bolesti procenjenu od strane pacijenta i lekara na način na koji je to opisano u primeru 3, koji sledi.
Slika 1C: DEmografski podaci za pacijente-individue iz populacije iste vrste na način na koji je to opisano u primeru 3 koji sledi. Demografski podaci obuhvataju aktivnost bolesti, brzinu sedimetacije eritrocita (ESR), fizičku funkciju (nesposobnost učešća procenjena je na osnovu zdravstvenog upitnika), i C-reaktivni protein (CRP).
SLika 1D: Demografski podaci za pacijente-individue iz populacije iste vrste na način na koji je to opisano u primeru 3 koji sledi. Demografski podaci uključuju nateknuće zglobova, lomljivost zglobova, jutarnju ukrućenost, i bol.
Slika IE: Demografski podaci za pacijente-individue iz populacije iste vrste na način na koji je to opisano u primeru 3 koji sledi.
Demografski podaci uključuju predhodne tretmane.
Slika 2: Kratak opis na 85-ti dan prekida kao što je to opisano u primeru 3 koji sledi.
Slika 3A: ACR odgovori 85-dana kao što je to opisano u primeru 3 koji sledi.
Slika 3B; ACR-odgovori 85-tog dana, uključujući placebo odgovor, kao što je to opisano u primeru 3, koji sledi: ACR-20 odgovori sa ograničenom pouzdanošću od 95%.
Slika 3C: ACR-odgovori 85-tog dana,kao što je to opisano u primeru 3, koji sledi: Razlike u ACR-20 odgovoru prema intervalu sa pouzdanošću od 95%.
Slika 4A: Osnovni (20%-tno poboljšanje) klinički odgovori kod nateknutonog i slomljenog zgloba računato u procentima za pacijente 85-dana kao kao što je to opisano u primeru 3, koji sledi: osnovni klinički odgovor, ACR-20.
Slika 4B: Klinički odgovori (sa procentom poboljšanja) kod nateknutonog i slomljenog zgloba računato u procentima za pacijente 85-dana kao kao što je to opisano u primeru 3: porcenat poboljšanja kod kliničkog odgovora.
Slika 5A: Bolni odgovor (na Likertovoj skali na osnovu srednje jedinične promene od osnovne linije) u procentima za pacijente na dan 85-ti kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: opšte promene aktivnosti bolesti kod pacijenta.
Slika 5B: Opšte promene u aktivnosti bolesti kod pacijenta (na Likertovoj skali na osnovu srednje jedinične promene od osnovne linije) u procentima za pacijente na dan 85-ti kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: opšte promene aktivnosti bolesti kod pacijenta.
Slika 5C: Opšte promene u aktivnosti bolesti konstatovane od strane lekara (na Likertovoj skali na osnovu srednje jedinične promene od osnovne linije) u procentima za pacijenate na dan 85-ti kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: opšte promene aktivnosti bolesti kod lekara.
Slika 5D: Bol (na Likertovoj skali na osnovu jedinice promene srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju) u procentima za pacijente na dan 85-ti kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: promene bola u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 6A: Globalna procena u promeni aktivnosti bolesti kod pacijenta u odnosu na osnovnu liniju za 2 jedinice 85-tog dana kao čto je opisano u primeru 3, koji sledi: poboljšanje u aktivnosti bolesti.
Slika 6B: Globalna procena u promeni aktivnosti bolesti od strane lekara u odnosu na osnovnu liniju za 2 jedinice 85-tog dana kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: poboljšanje u aktivnosti bolesti.
Slika 7A: Procenat smanjenja u nivoima C-reaktivnog proteina (CRP) 85-dana kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: procenat redukcije u CRP nivoima u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 7B: Razlike u smanjenju nivoa C-reaktivnog proteina (CRP) 85-dana kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: razlika u procentu redukcije u CRP nivoima u pogledu intervala sa pouzdanošću od 95%.
Slika 7C: Srednja vrednost redukcije u nivoima C-reaktivnog proteina (CRP) 85-dana kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: srednja vrednost promene u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 8: Srednja vrednost redukcije u nivoima rastvorljivog receptora IL-2 u odnosu na osnovnu liniju 85-tog dana kao što je opisano u primeru 3, koji sledi.
Slika 9A: Efekat CTLA4IG na polomljene zglobove kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: vrednost mediane u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 9B: Efekat CTLA4IG na polomljene zglobove kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: razlika srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 10A: Efekat CTLA4IG na nateknute zglobove kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: razlika srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 10B: Efekat CTLA4IG na nateknute zglobove kao što je opisano u primeru 3, koji sledi: razlika srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 11: Efekat CTLA4IG na razliku srednje vrednosti procene bola u odnosu na osnovnu liniju kao što je opisano u primeru 3, koji sledi.
Slika 12A: Efekat CTLA4IG na razliku srednje vrednosti procene aktivnosti bolesti od strane pacijenta u odnosu na osnovnu liniju kao što je opisano u primeru 3, koji sledi .
Slika 12B; Efekat CTLA4IG na razliku u srednjoj vrednosti procene aktivnosti bolesti od strane lekara u odnosu na osnovnu liniju kao što je opisano u primeru 3, koji sledi .
Slika 13A: Efekat L104EA29Ylg na polomljene zglobove kao što je opisano u primeru 3, razlika mediane u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 13B: Efekat L104EA29Ylg na polomljene zglobove kao što je opisano u primeru 3, razlika srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 14A: Efekat L104EA29Ylg na nateknute zglobove kao što je opisano u primeru 3, razlika mediane u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 14B: Efekat L104EA29Ylg na nateknute zglobove kao što je opisano u primeru 3, razlika srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 15: Efekat L104EA29Ylg na odredjivanje nivoa bola kao što je opisano u primeru 3, razlika srednje vrednosti u odnosu na osnovnu liniju.
Slika 16A: Efekat L104EA29Ylg na pacijenta odredjivanje aktivnosti bolesti srednja razlika u odnosu na osnovnu liniju u jedinici vremena u odnosu na osnovnu liniju kao što je opisano u primeru 3 koji sledi.
Slika 16b: Efekat L104EA29Ylg na procenu razlike srednje vrednosti aktivnosti bolesti od strane lekara u odnosu na osnovnu liniju kao što je opisano u primeru 3 koji sledi.
Slika 17: Procenat poboljšanja kod nesposobnosti pacijenta koja je procenjena pomoću zdravstvenog upitinika (HAQ) poredjenjem s odnovnom linijom 85-tog dana sa CTLA4IG i L104EA29YIG tretmanu kao što je opisano u primeru 3 koji sledi.
Slika 18: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca od L104EUIg kao što je opisano u primeru 1 koji sledi.
Slika 19: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca od L104EA29Ylg kao što je opisano u primeru 4, koji sledi.
Slika 20: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca od L104EA29Ylg kao što je opisano u primeru 1, koji sledi.
Slika 21: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca od L104EA29Tlg kao što je opisano u primeru 1, koji sledi.
Slika 22: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca od L104EA29Wlg kao što je opisano u primeru 1, koji sledi.
Slika 23: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca CTLA4 recepotora.
Slika 24: Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca CTLA4IG.
Slika 25: SDS gel (slika 25A) za CTLA4iG (putanja 1)m L104Elg (putanja 2) i L104EA29Ylg (putanja 3A); i ekskluziona hromatografija za CTLA4IG (Slika 25B) i L104EA29Ylg (Slika 25C).
Slike 26 (levi i desni opisi): Dijagram od CTLA4 prikazuje V-ostruko uvijanje fuzionog produkta ekstracelularnog domena (tercijalne strukture) CTLA4 po tipu Ig-a (slično 5) dobijen iz rastvora koji je odredjen pomoću NMR spektroskopije.
Slika 26 (desni opis) pokazuje prošireni pregled za CDR-1 (S25-R33) regiona i MYPPPY region koji pokazuje lokaciju i orijentaciju bočnog lanca i mutacije koje povećavaju aviditet, L 104 i A29 .
Slike 27A& 27B: FACS ogledi pokazuju vezivanje L104EA29Ylg, L104Elg, i CTLA4IG za humani CD80- ili CHO ćelije koje su zaražene CD86- kao što je opisano u primeru 2, koji sledi.
Slike 28A& 28B: Grafikoni koji pokazuju inhibiranje proliferacije za CD80-pozitivne i CD86-pozitivne CHO ćelije kao što je opisano u primeru 2, koji sledi.
Slike 29A& 29B: Grafikoni koji pokazuju da je L104EA29Ylg efikasniji nego CTLA4IG prilkom inhibiranja proliferacije u primamim i sekundarnim alogeno stimulisanih T ćelija kao što je opisano u primer 2, koji sledi.
Slike 30A-C: Grafikoni koji pokazuju da je L104EA29Ylg efikasniji nego CTLA4IG prilkom inhibiranja IL-2 (Slika 30A), IL-4 (Slika 30B) i gama (g)-interferona (slika 30C) citokinske produkcije za alogeno stimulisane T-ćelije kao što je opisano u primeru 2, koji sledi.
Slika 31: Grafikoni koji pokazuju da je L104EA29YIG efikasniji nego CTLA4IG prilkom inhibiranja proliferacije za (PHA) za T-ćelije majmuna koje su stimulisane fitohemaglutininom kao što je opisano u primeru 2, koji sledi.
Slike 32: Grafikoni koji pokazuje uravnoteženu analizu vezivanja L104EA29Ylg, L1-4EIG, i divljeg tipa CTLA4IG za CD86IG.
Slike 33A & B: Redukcija u promenama srednje vrednosti za rastvorljive ICAM-1 i rastvorljive E-selektivne nivoa u odnosu na osnovnu liniju 85-tog dana kao što je opisano u primeru 3, koji sledi.
DETALJAN OPIS DEFINICIJA IZ PRONALASKA
Svi naučni i tehnički pojmovi koji su korišćeni u ovoj prijavi imaju značenja koja se uobičajeno koriste u stanju tehnike ukoliko drugačije nije naznačeno. Kada se koriste u ovoj prijavi, sledeće reči i fraze imaju odredjena značenja.
Kao što je ovde korišćeno upotrebljava „ ligand „ se odnosi na molekul koji specifično prepoznaje i vezuje drugi molekul, na primer, ligand za CTLA4 je B7 molekul.
Kao što je ovde korišćeno „ divlji tip CTLA4" ili „ CTLA4 koji nije mutiran " ima aminokiselinksu sekvencu molekula CTLA4 koje je pune dužine i koji se javlja u prirodi, kao što je pokazano n a slici 23 (takdoje kako je opisano u U.S. Patent Br. 5,434,131,5,844, 095, 5, 851, 795), ili bilo koju segment njegovih derivata, koji prepoznaje i vezuje B7 molekul ili interferuje sa B7 tako da blokira vezivanje za CD28 i/ili CTLA4 (na primer, endogeni CD28 i/ili CTLA4 koji počinje sa metioninom na položaju +1 i završava se sa asparaginskom kiselinom na položaju +124. Divlji tip CTLA4 je protein na površini ćelije, sa N-terminalnim ekstracelularnim domenom, transmembranskim domenom, i C-terminalnim citoplazmatičnim domenom. Ekstracelularni domen vezuje se za ciljne molekule, kao što je B7 molekul. U ćeliji se prirodni, divlji tip proteina CTLA4 prevodi kao nerazvijeni polipeptid, koji obuhvata signalni peptid na N-terminalnom kraju. Nerazvijeni polipeptid podleže post-translatornom procesu, koji obuhvata cepanje i uklanjanje signalnog peptida da bi se kao produkt cepanja dobio CTLA4 sa novodobijenim N-terminalnim krajem koji se razlikuje od N-terminalnog kraja u nezrelom obliku. Onaj koji je upućen u stanje tehnike shvatiće da se može javiti dodatni post-translacioni proces, kojim se uklanja jedna ili više aminokiselina sa novo formiranog N-terminalnog kraja produkta cepanja CTLA4. Alternativno, signalni peptid ne može se potpuno ukloniti, proizvodeći molekule koji počinju pre uobičajene polazne aminokiseline, metionina. Tako, odrasli CTLA4 protein počinje sa metioninom na položaju +1 ili sa alaninom na -1. Odrasli oblik CTLA4 molekula uključuje ekstracelularni domen ili bilo koji njegov deo, koji se vezuje za B7.
Kao što je ranije korišćeno, „ CTLA4 mutantni molekul „ označava divlji tip CTLA4 kao što je pokazano na slici 23, ili bilo koji deo ili nejgov derivat, koji ima mutaciju ili veliki broj mutacija (po mogućstvu u esktracelularnom domenu divljeg tipa CTLA4). CTLA4 mutantni molekul ima sekvencu koja je slična ali nije identična sekvenci divljeg tipa molekula CTLA4, ali se još uvek vezuje za B7. Mutacije mogu da obuhvate jednu ili više aminokiselinskih ostataka supstituisanih sa aminokiselinom sa konzervativnom (na primer, supstitutom leucinom sa izoleucinom) ili nekonzervativnom (na primer, supstitut glicina sa triptofanom) strukturom ili hemijskim svojstvima, aminokiselinskim delecijama, dodacima, ili odvajanjem delova molekula. CTLA4 mutantni molekuli mogu da obuhvate molekul koji nije CTLA4 ili koji je prikačen na isti. Mutantni molekuli mogu biti rastvorljivi (na primer, koji cirkulišu) su ili vezani na površinu ćelije. Dodatni mutantni CTLA4 molekuli uključuju one koje su opisani u američkoj patentoj prijavi br. 6,090,914 5,844,095 i 5,773,253; i kao što je opisano od strane Peach, R. J. et al., in J. Exp. Med., 180: 2049-2058 (1994)]. CTLA4 mutantni molekuli mogu se dobiti i sintetičkim putem ili rekombinacijom.
„ CTLA4lg „ je rastvorljivi fuzioni protein koji obuhvata ekstracelularni domen divljeg tipa CTLA4 koji je spojen sa zadnjim delom Ig-a, ili njegovim delom koji vezuje B7 (molekul). Posebna primena obuhvata ekstracelularni domen divljeg tipa CTLA4 (kao što je pokazano na slici 23) koji počinje sa metioninom na položaju +1 i završava se sa asparaginskom kiselinom na položaju +124; ili koji počinje sa alaninom na položaju -1 do asparaginske kiseline na položaju +124; spojni aminokiselinski ostatak glutamina na položaju +125; i imunoglobulinski deo koji obuhvata glutaminsku kiselinu na položaju +126 preko lizina u položaju +357 (DNA koja kodira CTLA4IG deponovana je 31.maja 1991, u Američkoj kolekciji kultura (ATCC), 10801 Universitv Blvd., Manassas, VA (20110-2209) prema odredbama Budimpeštanskog sporazuma, i saglasnosti sa ATCC pristupnim brojem ATCC 68629; Linslev, P., et al., (1994 Immunitv 1: 793-80). CTLA4lg-24, ćelijske linije jajnika Kineskog hrčka (CHO)
koja eksprimuje CTLA4IG deponovana je 31.maja, 1991 sa ATCC identifikacionim brojem CRL-10762). Rastvorljivi CTLA4IG molekuli koji su korišćeni u postupcima i/ili kitovima iz pronalaska mogu ili ne moraju da obuhvate signalnu (vodeću) peptidnu sekvencu. KArakteristično je da u postupcima i/ili kitovima iz pronalaska molekuli ne uključuju signalnu peptidnu sekvencu.
„ L104EA29Ylg "je fuzioni protein koji je rastvorljivi mutantni CTLA4 molekul koji obuhvata ekstracelularni domen divljeg tipa CTLA4 sa aminokiselinskim izmenama A29Y (tirozinski aminokiselinski ostatak koji supstituiše alanin u položaju 29) i L104E (aminokiselinski ostatak glutaminske kiseline koji supstituiše leucin u položaju +104), ili njen deo koji vezuje B7 molekul, koji je povezan sa zadnjim delom Ig-a (koji je uključen u Sliku 19); (DNA koja kodira L104EA29Ylg deponovana je 20.juna 2000 sa ATCC brojem PTA-2104;pokazanu američkoj patentnoj prijavi br. 09/579,927,60/287,576 i 60/214,065, koja je u potpunosti sadržana prema navedenoj referenci u tekstu). Rastvorljivi L104EA29YIG molekuli koji su korišćeni u postupcima i/ili kitovima iz pronalaska mogu ili ne moraju da obuhvate signalnu (vodeću) peptidnu sekvencu. KArakteristično je da u postupcima i/ili kitovima iz pronalaska molekuli ne uključuju signalnu peptidnu sekvencu.
Kao što je već korišćeno, „ rastvorljiv „ se odnosi na bilo koji molekul, ili fragmente i njegove derivate, koji nisu vezani ili prikačeni na ćeliju, tj. koji cirkulišu. Na primer, CTLA4, B7 ili CD28 mogu se rastvoriti kačenjem imunoglobulinskog dela (Ig) posebno na ekstracelularni domen od CTLA4, B7 ili CD28. Alternativno molekul kao što je CTLA4 može se rastvoriti uklanjanjem njegovog transmembranskog domena. Karakteristično je da rastvorljivi molekuli koji se koriste u postupcima iz pronalaska molekuli ne uključuju signalnu (ili vodeću) sekvencu.
Kao što je već ranije korišćeno, pojam „ rastvorljivi CTLA4 molekuli „ predstavlja molekule koji nisu CTLA4 i koji su vezani za površinu ćelije ili bilo koji funkcionalni deo CTLA4 molekula koji vezuje B7 (molekul) uključuje ali nije ograničen na to: CTLA4lg fuzione proteine (na primer, ATCC 68629), gde ekstracelularni domen CTLA4 spojen sa imunoglobulinskim delom (IG) prevodi fuzioni molekul u rastvorljivi oblik, ili njegove fragmente i derivate, gde su proteini sa ekstracelularnim domenom CTLA4 spojeni ili povezani sa delom biološki aktivnog ili hemijski aktivnog proteina kao što je E7 genski proizvod papiloma virusa (CTLA4-E7), antigen p97 povezan sa melanomom (CTLA4-p97) ili HIV env protein (CTLA4-env gp120), ili njeni fragmenti i derivati; hibridni (himerni) fuzioni proteini kao što su CD28/CTLA4IG, ili njegovi fragmenti i derivati; CTLA4 molekuli sa transmembranskim domenom se uklanjaju da bi preveli protein u rastvorljivi oblik (Oaks, M. K., etal., 2000 Cellular Immunologv 201: 144-153, ili njene fragmente ili derivate. „ Rastvorljivi CTLA4 molekuli „ takodje uključuju njegove, fragmente, delove ili derivate, i rastvorljive CTLA4 mutantne molekule koji poseduju vezivnu aktivnost za CTLA4. Rastvorljivi molekuli koji se koriste u postupcima iz pronalaska molekuli ne uključuju signalnu (ili vodeću) sekvencu. Karakteristično je da rastvorljivi molekuli koji se koriste u postupcima iz pronalaska molekuli ne uključuju signalnu (ili vodeću) sekvencu.
Kao što je ovde već korišćeno „ ekstracelularni domen za CTLA4 „ je deo CTLA4 koji prepoznaje i vezuje CTLA4 ligande, kao što su B7 molekuli. Na primer, ekstracelularni domen za CTLA4 obuhvata metionin na položaju +1 i završava se sa asparaginskom kiselinom na položaju +124 (slika 23). Alternativno, ekstracelularni domen CTLA4 obuhvata alanin na položaju -1 do asparaginske kiseline na položaju +124 (slika 23).
Ekstracelularni domen uključuje fragmente ili derivate CTLA4 koji vezuju B7 molekul. Ekstracelularni domen za CTLA4 kakav je pokazan na slici 23, može takodje da uključi mutacije koje menjaju vezivni aviditet od CTLA4 molekula za B7 molekul.
Kao što je ovde već korišćeno, pojam „ mutacija „ označava promenu u nukleotidnoj ili aminokiselinskoj sekvenci divljeg tipa molekula, na primer, promena u DNA i/ ili aminokiselinskoj sekvenci ekstracelularnog domena divljeg tipa CTLA4. Mutacija u DNA može da izmeni kodon koji dovodi do izmene u aminokiselnskoj sekvenci. Promene u DNA obuhvataju supstitucije, delecije, insercije, alternativno cepanje, ili cepanje. Aminokiselinska izmena može da obuhvati supstitucije, delecije, insercije,adicije, cepanje, ili greške koje se javljaju prilkom procesu ili cepanja proteina. Alternativno, mutacije u nukleotidnoj sekvenci mogu da dovedu do tihe mutacije u aminokiselinskoj sekvenci na način na koji je to već dobro objašnjeno u stanju tehnike. Na osnovu toga, izvesni nukleotidni kodoni kodiraju istu aminokiselinu.
Primeri uključuju nukleotidne kodone CGU, CGG, CGC, i CGA koji kodiraju amino kiselinu, arginin (R); ili kodone GAU, i GAC koji kodiraju amino kiselinu, asparaginsku kiselinu (D).
Tako protein može da se kodira pomoću jednog ili više molekula nukleinskih kiselina koji se razlikuju u njihovoj specifičnoj nukleotidnoj sekveci, ali još uvek mogu da kodiraju proteinske molekule sa identičnim sekvencama. Aminokiselinske sekvence za kodiranje su sledeće:
Mutantni molekuli mogu da imaju jednu ili više mutacija.
Kao što je već rečeno, „ ne-CTLA4 proteinska sekvenca „ ili „ ne-CTLA4 molekul „ označava bilo koji proteinski molekul koji ne vezuje B7 molekul i koji ne ometa vezivanje CTLA4 na njegov ciljni molekul. Primer obuhvata, ali nije ograničen na imunoglobulinski (Ig) konstantni region ili njegov deo. Po mogućstvu, konstantni Ig region je humani ili je konstantni Ig region od majmuna, na primer, humani C(gama)1, uključujući zglob, CH2 i CH3 regione. Ig konstantni region može se mutirati da bi se smanjile njegove efektorske funkcije (U.S. Patents 5,637,481, 5,844,095 i 5,434,131).
Kao što je korišćeno u ovoj prijavi, „fragmenti" ili „delovi" predstavljaju bilo koji deo ili segment od CTLA4 molekula, po mogućstvu ekstracelularni domen od CTLA4 ili deo segmenta, koji prepoznaje i vezuje njegov ciljni molekul, na primer, B7 molekul.
Kao što je korišćeno u ovoj prijavi, „ B7 " odnosi se na B7 familiju molekula koja obuhvata, ali nije ograničen na B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) i B7-3 koji mogu da prepoznaju i vežu CTLA4 i/ili CD28.
Kao što je korišćeno, „ B7-pozitivne ćelije „ su bilo koje ćelije sa jednim ili više vrsta B7 molekula koje su eksprimovane na površini ćelije.
Kao što je korišćeno u ovoj prijavi „ derivat " je molekul koji deli homologu sekvencu i aktivnost molekula od kojih je stvoren. Na primer, derivat CTLA4 uključuje rastvorljivi TLA4 molekul sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 70% slična aminokiselinskoj sekvenci ekstracelularnog domena divljeg tipa CTLA4, i koji prepoznaje i vezuje B7, na primer, CTLA4lg ili rastvorljivi CTLA4 mutantni molekul L104EA29Ylg.
Kao što je korišćeno u ovoj prijavi, pojam da bi se „ blokirao " ili „ inhibirao " receptor, signal ili molekul označava da pojačava aktivnost recepotra, signala ili molekula, kada se detektuje pomoću probe koja je poznata u stanju tehnike. Na primer, blokada imunog odgovora posredstvom ćelije može se detektovati odredjivanjem smanjenjem simptoma u vezi reumatskih oboljenja. Blokada ili inhibicija može biti delimična ili potpuna.
Kao što je korišćeno u ovoj prijavi „ blokiranje interakcije sa B7 " označava sprečavnje vezivanja B7 molekula za njegove ligande, kao što je CD28 i/ili CTLA4, opstruirajući time interkciju T-ćelije i B7-pozitivne ćelije. Primeri agenasa koji blokiraju B7 interakciju uključuju ali nisu ograničeni na molekule kao što su antitela (ili delovi molekula ili derivati) koja prepoznaju i koja se vezuju na bilo koji od CTLa4, CD28 ili B7 molekule (na primer, B7-1, B7-2); rastvorljivi oblik (ili delovi molekula ili derivati) molekula kao što je rastvorljivi CTLA4; peptidni fragment ili ostali mali molekuli koji sunapravljeni da pojačavajućelijski signal preko interakcije posredstvom CTLA4/CD28/B7. Poželjnim izvodjenjem, agens za blokiranje je rastvorljivi CTLA4 molekul, kao što je CTLA4lg (ATCC 68629) ili L104EA29Ylg (ATCC PTA-2104), rastvorljivi CD28 molekul kao što je CD28lg (ATCC 68628), rastvorljivi B7 molekul kao što je B7lg (ATCC 68627), anti-B7 monoklonirano anttelo (na primer, ATCC HB-253), ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 i monoklonirana antitela kao što je opisano od Anderson et al., u američkom patentu 6,13,898 ili Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128(2)823-827), anti-CTLA4 monoklinično antitelo ( na primer ATCC HB-304, i monokloniranA antitela kao što je opisano u referencama 82-83) i/ili anti-CD28 monoklonirano antitelo (na primer, ATCC HB 11944 i mAb 9.3 kao što je opisano od strane Hansen-a (Hansen et al., 1980. Immunogenetics 10: 247-260) ili Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 4(1): 18-22)).
Kao što se u ovom tekstu koristi „ bolest imunog sistema „ označava bilo koju bolest posredstvom T-ćelijskih interakcija sa B7-pozitivniim ćelijama obuhvata, ali nije ograničena na autoimune bolesti, poremećaji u vezi sa presadjivanjem i imunoproliferativne bolesti. Primeri za bolesti imunog sistema uključuju bolest odbacivanja transplantiranog tkiva (GVHD) (n aprimer koja može proisteći od transplatacije koštane srži, ili izazivanjem otpornosti), imuni poremećaji u vezi sa odbacivanjem transplantiranog tkiva, hroničnim odbijanjem, tkivni ili ćelijski alo-ili ksenokalemovi, režnjevi, uključujući čvrste organe, kožu, režnjevi, mišiće, heptocite, neurone. Primeri imunosupresivnih bolesti uključuju ali nisu ograničeni na psorijazu, T-ćelijski limfoma, akutna limfoblastna leukemija T-ćelija, testikularni angiocentrični T-ćelijski limfom, benigni limfocitični angitis, lupus (na primer, lupus eritematozus, lupus nefritis), Hašimotov tiroiditis, primarna miksedema, Gravesova bolest, pemiciozna anemia, autoimuni atrofični gastritis, Adisonova bolest, diabetes (na primer, insulin zavisni diabetes melitus, tip I diabetes melitusa,
tip II diabetes melitusa, good pasturov sindrom, miastenia gravis, pemfigus, Kronova bolest, simpatična oftalmija, autoimuni uveitis, multipl skelroza, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenija, primarna biliarna ciroza, hronični hepatitis, ulcerativni kolitis, Sjorgensov sindrom, reumatska oboljenja (na primer, reumatoidni artritis), polimiozitis, skleroderma, i mešane bolesti vezivnog tkiva.
Kao što je ovde korišćeno pojam „ reumatoidni artritis „ označava bilo koju bolest koja utiče na zglobove, kosti, mekana tkiva, ili kičme (Mathies, H. 1983 Rheuma) i obuhvata inflamatomi reumatizam, degenerativni reumatizam, ekstra-celularni reumatizam, i bolesti kolagena. Osim toga, reumatske bolesti obuhvataju, ali nisu ograničene na hronični poliartritis, psorijazna artropatija, reumatoidni artritis, panartitis nodoza, sistemski lupus eritematozu, progresivna sistemska skleroderma, periartitis humeroskapularis, uratni artrits, hondrokalcinoza, dermatomiozitis, mulskularni reumatizam, miozitis i miogelozis. Neka reumatska oboljenja poznata su kao autoimune bolesti koje su uzrokovane promenjenim autoimunim odgovorom osobe .
Kao što je ovde upotrebljeno „ genska terapija „ je proces za lečenje genetskih manipulacija tako da se sekvenca nukleinskih kiselina prenosi na ćeliju, ćelija eksprimuje bilo koji genetski proizvod kodiran nukleinskom kiselinom. Na primer, kao što je poznato onima koji su upućeni u stanje tehnike, transfer nukleinskih kiselina može se izvesti insercijom vektora ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu od interesa, u ćelilje ex vivo ili in vitro pomoću širokog spektra postupaka koji obuhvataju na primer, precipitaciju kalcijum fosfata, dietilaminoetil dekstran, polietilen glikol (PEG), elektroporaciju, direktno ubrzigavanje, lipofekciju ili virusnu infekciju (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor LAboratorv PRess 1989); Kriegler M. GeneTransfer ad Expression: A Laboratorv Manual (W. H. Freeman and Co., New York, N.Y., 1993) i Wu, Methods in Enzymology (Academivc PRess, New York 1993), od kojih je svaka sadržana u ovom tekstu prema navedenim referencama). Alternativno, sekvence nukleinskih kiselina od interesa mogu se prevesti u ćeliju in vivo sa velikim brojem vekotra i širokim spektrom postupaka koji obuhvataju, na primer, direktnu primenu nuleinske kiseline na subjekt (VVilliams et al., 1991, PNAS 88: 2726-2730), ili insercijom nukleinske kiseline u virusni vektor i inficiranjem osobe virusom (Battleman et al., 1993 J Neurosci 13: 94-951; Caroll et al., 1993 J Cell Biochem 17E:241; Lebkovvski et al., amaerički patent br. 5,354,678c DAvison and Elliott, Molecular Virologv: A Practical Approach (IRL PRess, New York, 1993)). Ostali postupci koji se koriste za in vivo transfer uključuju inkapsulairanje nukleinskih kiselina u lipozome, i direktan transfer lipozoma, ili lipozoma kombinovanih sa hemaglutinizirajući Sendai virusa na osobu (američki patent 5,824,655), koji je potpunosti obuhvaćen). Transinficirane i inficirane ćelije eksprimuju proteinski proizvod koji se kodira pomoću nukleinske kiseline da bi se poboljšala bolest ili simptomi bolesti.
Da bi se ovaj pronalazak opisao, opis koji je prikazan u daljem tekstu mora biti potpuno razumljiv.
JEDINJENJA I POSTUPCI IZ PRONALASKA
Dati pronalazak obezbedjuje kompozicije i postupke za lečenje bolesti imunog sistema, kao što su reumatske bolesti, davanjem pacijentu efikasne količine liganda koji vezuje B7, na primer rastvorljivi CTLA4 molekuli (kao što su CTLA4lg i/ili L104EA29lg) i mABs koji prepoznaje i vezuje B7. Efikasna količina definisana je kao količina rastvorljivih CTLA4 molekula koji kada se vežu za B7 molekule na B7-pozitivnim ćelijama, inhibiraju B7 molekule u vezi daljeg vezivanja endogenih liganada kao što su CTLA4 i CD28.
Poželjnim izvodjenjem, reumatsko oboljenje je bolest imunog sistema. Reumatska oboljenja su bilo koje bolesti koje se karakterišu (I) inflamacijom ili degeneracijom mišićno-skeletnih ili vezivnih struktura tkiva u organzimu, posebno zglobova, i uključujući mišiće, tetive, hrskavicu, sinovialna i vlaknasta tkiva, (ii) koja su praćena nateknutošću zglobova, krhost zglobova, upala, jutarnju ukrućenost, i bol, ili slabljenjem funkcije pokretljivosti ili funkcije ovih struktura, i u nekim slučajevima, (iii) koja su često praćena serološkim dokazima reumatoidnog faktora i ostalim indikatorima.
Reumatska oboljenja uključuju ali nisu ograničena na reumatoidni artritis. Simptomi reumatoidnog artritisa uključuju natektnutost zglobova, krhost zglobova, upalu, jutarnju ukrućenost, i bol koji dovodi do fizičke nemoći. Pacijenti kojima je naneta bol u ranijim fazama artritisa pate od simptoma strukturnog oštećenja i oslabljenog bola. Ostali organi takodje mogu biti oštećeni autoimunim mehanizmom.
Kompozicije
Dati pronalazak obezbedjuje kompozicije za lečenje bolesti imunog sistema, kao što su reumatska oboljenja, koja obuhvataju rastvorljive CTLA4 molekule. Dati pronalazak dalje obezbedjuje koOmpozicije koje obuhvataju biološki agens koji inhibira T=ćelijsku funkciju ali ne i trošenje T-ćelija kod ljudi stupanjem u kontakt B7-pozitivnih ćelija kod ljudi sa rastvorljivim CTLA4. Primeri rastvorljivih CTLA4 uključuju CTLA4lg i rastvorljivi mutantni CTLA4 molekul, na primer, L104EA29Ylg. CTLA4 molekuli, sa mutantnim ili sekvencama divljeg tipa, može se rastvoriti uklanjanjem CTLA4 transmembranskog segmenta (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunologv 201:144-153).
Alternativno, rastvorljivi CTLA4 molekuli, sa mutantnim ili sekvencama divljeg tipa, mogu biti fuzioni proteini, u kojima su XTLA4 molekuli spojeni sa defovima koji nisu CTLA4 kao što su imunoglobulinski molekuli (Ig) koji rastvaraju CTLA4 m olekule. Na primer, CTLa4 fuzioni proteini mogu da obuhvate ekstracelularni domen od CTLA4 koji je spojen za imunoglobulinski konstantni domen, pri čemu nastaje CTLA4lg molekul (Slika 24) (Linsley, P. S., et al., 1994 lmmunity 1:793-80).
Za kliničke protokole, poželjno je da imunoglobulinski region ne izaziva štetne imuni odgovor kod pacijenta. Poželjni deo je imunoglobulinski konstantni region, koji obuhvata imunoglobulinske konstantne regione ljudi i majmuna. Primer za odgovarajući imunoglobulinski region je humani Cg1 uključujući zaglavak, CH2 CH3 regiona koji mogu da posreduju efektorskim funkcijma kao što su vezivanje za Fc receptore, citotoksičnost koja je zavisna od komplementa (CDC), ili ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC). Imunoglobulinski deo može da ima jednu ili više mutacija (na primer, u CH2 domenu, da bi se smanjile funkcije efektora koa što su CDC ili ADCC) gde mutacije moduliraju sposobnost vezivanja imunoglobulina za ligand, povećanjem ili smanjenjem sposobnosti vezivanja imunoglobulina za Fc receptore. Na primer, mutacije u imunoglobulinu mogu da obuhvate promene u bilo kojem od cisteinskih ostataka unutar zglobnog domena, na primer, cisteini u položajima +130, +136, i +139 supstituisani su sa serinom (Slika 24). Kao što je pokazano na slici 24, imunoglobulinski molekul može takodje da uključi prolin u položaju +148 koji je supstituisan sa serinom. Mutacije na imunoglobulinskom delu molekula mogu dalje da obuhvate leucin u položaju +144 koji se supstituiše sa fenilalaninom, eluucinom u položaju +145 koji se supstituiše sa glutaminskom kiselinom, ili glicinom u položaju +147 koji je supstituisan sa alaninom.
Dodatni delovi molekula koji nisu CTLA4 za upotrebu u rastvorljivim CTLA4 molekulima ili rastvorljivi CTLA4 mutantni molekul uključuju, ali nisu ograničeni na p97 molekul, env gp120 molekul, E7 molekul, i ova molekul (Dash, B. et al. 1994 J Ge. Virol. 75 (Pt 6):1389-97; Ikeda, t., etal., 1994 Gene 138(1-2_: 193-6; Falk, K., et al., 1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. et al. 1994 Virologv 204(2):789-93). Ostali m olekuli su takodje mogući (Gerard, C et al. 1994 Neuroscience 62(3): 721; Byrn, R. et al., 1989 63(10):4370; Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).
Rastvorljivi CTLA4 m olekul prema pronalasku uključuje signalnu peptidnu sekvencu koja je povezana za N-terminalni kraj ekstracelularnog domena od dela CTLA4 molekula. Signalni peptid može biti bilo koja sekvenca koja dopušta sekreciju molekula, uključujući signalni peptid iz onkostatina M (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), ili CD5 (Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323:346-349), ili signalni peptid iz bilo kojeg ekstracelularnog proteina.
Rastvorljivi CTLA4 molekul iz pronalaska obuhvata signalni peptid onkostatin M koji je vezan na N-terminalnom kraju ekstracelularnog domena CTLA4, i humanog imunoglobulinskog molekula (na primer, zglob, CH2 i CH3) vezanog za C-terminalni kraj ekstracellulamog domena (divlje tipa ili mutirani) CTLA4. Molekul uključuje signalni peptid onkostatin M koji obuhvata aminokiselinsku skevencu sa metioninom u položaju -26 preko alanina na položaju -1, deo CTLA4 obuhvata aminokiselinsku skevencu sa metioninom u položaju +1 preko glutamina u položaju +125, i imunoglobulinski deo koji obuhvata aminokiselinsku skevencu sa glutaminskom kiselinom u položaju +126 preko lizina u položaju +357.
Rastvorljivi mutantni CTLA4 molekuli iz pronalaska, koji obuhvataju mutirane sekvence CTLA4 opisane ranije, fuzioni su molekuli koji obuhvataju lgCy1 delove spojene sa mutiranim CTLA4 fragmentima.
Jednim izvodjenjem, rastvorljivi mutantni CTLA4 molekuli obuhvataju lgCy1 spojene za CTLA4 fragment koji obuhvata mutaciju na jednom aktivnom mestu u ekstracelularnom domenu. Ekstracelularni domen za CTLA4 obuhvata metionin u položaju +1 preko asparaginske kiseline u položaju +124 (na primer, Slika 23). Ekstracelularni deo CTLA4 može da obuhvati alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124 (na primer, Slika 23).
Primeri mutacija na jednom mestu uključuje sledeće gde je leuicin u položaju +104 promenjen u bilo koju drugu aminokiselinu:
Pronalazak dalje obezbedjuje mutantne molekule sa ekstracelularnim domenom od CTLA4 sa dve mutacije, koji su spojeni sa Ig Cy1 polovinom. Primeri obuhvataju sledeće gde je leucin u položaju +104 promenjen sa sledećom amino kiselinom (na priemer, glutaminskom kisleinom) i glicin u položaju +105, serin u položaju +25, treonin u položaju +30 ili alanin u položaju +29 oromenien ie u bilo koiu druau aminokiselinu:
Još dalje pronalazak obezbedjuje mutantne molekule sa ekstracelularnim domenom CTLA4 koji obuhvata tri mutacije, koji su spojeni sa Ig Cy1 polovinom. Obuhvaćeni su sledeći primeri gde je leucin u položaju +104 promenjen sa sledećom amino kiselinom (na priemer, glutaminskom kisleinom), alanin u položaju +29 promenjen je sa sledećom amino kiselinom (na primer, tirozin) i serin uDoln7aiu +?5.rjromenien ie u bilo koiu druau aminokiselinu:
Rastvorljivi mutantni CTLA4 molekuli mogu da imaju spojeni aminokiselinski ostatak koji je smešten izmedju dela CTLA4 i Ig dela molekula. Spojni aminokiselinski ostatak može biti bilo koja aminokiselina, uključujući glutamin. Ona može biti uvedena pomoću molekulskih ili hemijskih sintetičkih postupaka koji su poznati u stanju tehnike.
Dati pronalazak obezbedjuje mutantne CTLA4 molekule koji uključuju signalnu peptidnu sekvencu vezanu za N-terminalni kraj ekstracelularnog domena od CTLA4 dela mutantnog molekula. Signalni peptid može biti bilo koja sekvenca koja dozvoljava sekreciju mutantnog molekula, uključujući signalni peptid od onkostatina M (Malik et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), ili CD5 (Johnes, N.H. et al., 1986 Nature 323:346-349), ili signalni peptid od bilo kojeg ekstracelularnog proteina.
PRonalazak obezbedjuje rastvorljive mutantne CTLA4 molekule koji obuhvataju mutaciju na jednom mestu u ekstracelulamom domenu CTLA4 kao što su L104EIG (kao što je obuhvaćeno slikom 18) ili L104Slg, gde su L104Elg i L104Slg mutirani u njihovim CTLA4 sekvencama tako da se leucin u položaju +104 supstituiše sa glutaminskom kiselinom ili serinom, svaki za sebe u vezi sa drugim. Molekuli sa jednim mestom za mutaciju dalje obuhvataju delove CTLA4 koji obuhvataju metionin u položaju 1+1 preko asparaginske kiseline u položaju +124, vezivni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +125, i imunoglobulinski deo koji obuhvata glutaminsku kiselinu u položaju +126 preko lizina u položaju +357. Imunoglobulinski deo mutantnog molekula takodje se može mutirati tako da se cisteini u položajima +130, +136 i +139 supstituišu sa serinom, i prolin u položaju +148 se supstituiše sa serinom. Alternativno, rastvorljivi mutantni molekul CTLA4 sa jednim mestom za mutaciju može da ima deo CTLA4 koji obuhvata alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124.
PRonalazak obezbedjuje rastvorljive mutantne CTLA4 molekule koji obuhvataju mutaciju na dva mesta u estracelularnom domenu CTLA4, kao što su L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg ili L104EA29Wlg, gde se leucin u položaju +104 supstituiše sa glutaminskom kiselinom i alanin u položaju +29 se može zameniti sa tirozinom, leucinom, treoninom i triptofanom, svaki za sebe u vezi sa drugim. Sekvence za L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg ili L104EA29Wlg, polazeći od metionina u položaju 1+1 i završavajući se sa lizinom u položaju +357, plus singnalna (vodeća) peptidna sekvenca uključene su u sekvencu koja je pokazana na slikama 19-22, respektivno. Mutantni molekuli sa dvostrukim mestom za mutaciju dalje obuhvataju delove CTLA4 koji obuhvataju metionin u položaju 1+1 preko asparagaginske kiseline u položaju +124, vezni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +125, i imunoglobulinski deo koji obuhvata glutaminsku kiselinu u položaju +126 preko lizina u položaju +357.
Imunoglobulinski deo mutantnog molekula takodje se može mutirati tako da se cisteini u položajima +130, +136 i +139 supstituišu sa serinom, i prolin u položaju +148 se supstituiše sa serinom. Alternativno, rastvorljivi mutantni molekul CTLA4 sa jednim mestom za mutaciju može da ima deo CTLA4 koji obuhvata alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124.
Pronalazak obezbedjuje rastvorljive mutantne CTLA4 molekule koji obuhvataju dvostruku mutaciju u ekstracelulamom domenu CTLA4, kao što su L104EA29Flg, L104EA29Wlg, L104EA29Llg, gde se leucin u položaju +104 supstituiše sa glutaminskom kiselinom i giicin u položaju +105 se može zameniti sa fenilalaninom, triptofanom i leucinom.
Mutantni molekuli sa dvostrukim mestom za mutaciju dalje obuhvataju delove CTLA4 koji okružuju metionin u položaju 1+1 preko asparagaginske kiseline u položaju +124, vezni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +125, i imunoglobulinski deo koji obuhvata glutaminsku kiselinu u položaju +126 preko lizina u položaju +357. Imunoglobulinski deo mutantnog molekula takodje se može mutirati tako da se cisteini u položajima +130, +136 i +139 supstituišu sa serinom, i prolin u položaju +148 se supstituiše sa serinom. Alternativno, rastvorljivi mutantni molekul CTLA4 sa jednim mestom za mutaciju može da ima deo CTLA4 koji obuhvata alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124. PRonalazak obezbedjuje L104EA29Rlg koji je molekul sa dvostrukim mestom za mutaciju uključujući CTLA4 deo koji okružuje metionin u položaju 1+1 preko asparagaginske kiseline u položaju +124, vezni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +125, i imunoglobulinski deo okružuje (obuhvata) glutaminsku kiselinu u položaju +126 preko lizina u položaju +357. Segment (deo) koji ima ekstracelularni doemn CTLA4 mutira tako da se serin u položaju +25 supstituiše sa argininon, i leucin u položaju +104 se supstituiše sa glutaminskom kiselinom. Alternativno, L104ES25Rlg može da ima CTLA4 deo koji obuhvata alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124.
Pronalazak obezbedjuje rastvorljive mutantne CTLA4 molekule koji obuhvataju mutaciju na dva mesta (dvostruku mutaciju) u ekstracelulamom domenu CTLA4, kao što su L104ET30Glg i L104ET30Nlg, u kojim a se leucin u položaju +104 supstituiše sa glutaminskom kiselinom i u kojima se treonin u položaju +30 supstituiše sa glicinom i asparaginom po tom redosledu. Molekuli sa dvostrukim mutacijama dalje obuhvataju CTLA4 segmente koji obuhvataju metionin u položaju +1 preko asparaginske kisleine u položaju +124, vezni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +126 preko lizina u položaju +357. Imunoglobulinski segment mutantnog molekula takodje se može mutirati, tako da se cisteini u položajima +130, +136, i +139 supstituisani sa serinom, i prolin u položaju +148 se supstituiše sa serinom. Alternativno, L104ES25Rlg može da ima CTLA4 deo koji obuhvata alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124.
Pronalazak dalje obezbedjuje rastvorljive mutantne CTLA4 molekule koji obuhvataju mesto za trostruku mutaciju u ekstracelulamom domenu CTLA4, kao što su L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg, L104EA29YS25Rlg, u kojima se leucin u položaju +104 supstituiše sa glutaminskom kiselinom, alanin u položaju +29 se zamenjuje sa tirozinom i serin u položaju +25 se zamenjuje sa lizinom, asparaginom i argininom. Mutantni molekuli sa mestom za trostruku mutaciju dalje obuhvataju segmente CTLA4 koji obuhvataju metionin u položaju +1 preko asparaginske kisleine u položaju +124, vezni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +126 preko lizina u položaju +357. Imunoglobulinski segment mutantnog molekula takodje se može mutirati, tako da su cisteini u položajima +130, +136, i +139 supstituisani sa serinom, i prolin u položaju +148 se supstituiše sa serinom. Alternativno, L104ES25Rlg može da ima CTLA4 deo koji obuhvata alanin u položaju -1 preko asparaginske kiseline u položaju +124.
Dodatna izvodjenja rastvorljivih CTLA4 m utantnih molekula uključuju himerne CTLA4/CD28 homologe mutantne molekule koji vezuju B7 (Peach, RJ. et al., 1993 J Exp Med 180:2049-2058). Primeri ovih himernih CTLA4/CD28 mutantnih molekula uključuju HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 i HS14 (američki patent br. 5,773,253).
Poželjna izvodjenja pronalaska predstavljaju rastvorljivi CTLA4 molekuli kao što su CTLA4lg (kao što je pokazano na slici 24, polazeći od metionina u položaju +1 a završavajući se sa lizinom u položaju +357). Pronalazak dalje obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji obuhvataju nukelotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence koje odgovraraju rastvorljivim CTLA4 molekulima iz pronalaska. Jednim izvodjenjem, DNA je molekul nukleinske kiseline (na primer, cDNA) ili njegov hibrid. DNA koji kodira CTLA4lg (Slika 24) deponovana je 31.maja, 1991. godine u američkoj kolekciji ćelijskih kultura (ATCC), 10801 Universitv Blvd., Manassas, VA 20110-2209 i dodeljen mu je ATCC pristupni broj ATCC 68629. DNA koji kodira L104EA29Ylg (sekvenca koja je obuhvaćena slikom 19) deponovana je 19.juna, 2000. godine u američkoj kolekciji ćelijskih kultura (ATCC), i dodeljen mu je ATCC pristupni broj PTA-2104. Alternativno, molekuli nukleinskih kiselina su RNA ili njihovi hibridi.
Osim toga, pronalazak obezbedjuje vektor, koji obuhvata nukleotidnu sekvencu iz pronalaska. Primeri ekspresije vektora uključuju ali nisu ograničeni na vektore ćelija domaćina sisara (na primer, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clonotech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life TEchnologuies); pVPAck Vectors, pCMV vektors (Stratagene)), vektori retrovirusa (na primer, pFB vektori (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ili njihovi modifikovani oblici, vektori adenovirusa; virusni vektori koji su vezani za adeno viruse, bakulovirusni vektori, vektori kvasca (na primer, pESC vektori (Stratagene)).
Takodje je prisutan i vektorski sistem domaćina. Vektorski sistem domaćina obuvata vekotr iz pronalaska u pogodnoj ćeliji domaćina. Primeri za takve pogodne ćelije domaćina uključuu ali nisu ograničeni na prokariotske i eukariotske ćelije. U saglasnosti sa praksom iz pronalaska eukariotske ćelije su takodje pogodne domaćinske ćelije. Primeri eukariotskih ćelija uključuju bilo koju životinjsku ćeliju gde su primarne ili mrtve, ćelije kvasca (na primer, Saccharomvces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe, i Pichia pastoris), i biljne ćelije. Ćelije mieloma, COS i CHO ćelije primeri su životinjskih ćelija koje mogu biti korišćene kao ćelije domaćina. CHo ćelije posebno uključuju ali nisu ograničene na DG44<*>Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997, Biochemistrv 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-on ćelijske linije (Clonotech(, CHO ćelije označene kao ECACC 85050302 (CAMR, SAilsburv, VViltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Geneva, IT), CHO klon B (GEIMG, Geneva, IT), CHO-K1/SF označene kao ECACC 93061607 (CAMR, Sailsburv, VViltshire, UK), i RR-CHOK1 označene kao ECACC 92052129 (CAMR, Sailsburv, VViltshire, UK). Primeri biljnih ćelija obuhvataju ćelije duvana (cela stablijka, ćelijska kultura, ili kalus), kukuruza, soje i ćelije pirinča. Kukuruzno seme, sojino seme i seme pirinča su takodje prihvatljive.
Mutantni CTLA4 molekuli iz pronalaska mogu se izolovati kao prirodni peptidi, ili iz bilo kojeg izvora bilo da su prirodni, sintetički, polusitetički ili rekombinantni. PRema tome, CTLA4 mutantni polipeptidni molekuli mogu se izolovati kao prirodni proteini od bilo koje vrste, posebno od sisara, uključujući govedje, ovčije, svinjske, misije, konjske i po mogućstvu ljudske. Alternativno, CTLA4 mutantni polipeptidni molekuli mogu se izolovati kao rekombinantni polipeptidi koji se eksprimuju u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, ili su izolovane kao hemijski sintetizani polipeptidi.
Vešt stručnjak može lako upotrebiti standardne izolacione postupke da bi se dobili izolovani mutantni CTLA4 molekuli. Priroda i stepen izolovanja zavisiće od izvora i namene izolovanih molekula.
Mutantni CTLA4 molekuli i njihovi fragmenti ili derivati, mogu se porizovesti rekombinantnim metodama. Shodno tome, izlolovana nukleotidna sekvenca koja kodira divlji tip
CTLA4 molekula može se podešavati da bi se uvele mutacije, što dovodi do pojave nukleotidne sekvence koja kodira CTLA4 mutantne polipeptidne molekule. Na primer, nukeotidna sekvenca koja kodira CTLA4 mutantne molekule može se dobiti mutagenim postupcima koji upućuju na položaje, korišćenjem prajmera i PCR amplifikacije. Prajmeri mogu da obhvate specifične sekvence koje su naznačene da uvedu željene mutacije. Alternativno, prajmeri mogu da obuhvate slučajne ili polu-slučajen sekvence da bi se uvele slučajne mutacije. Standardne metode rekombinacije (Molvvcular Cloning; A Laboratorv Manual, 2nd edition, Sanvrook, Fritch, and Maniatis 1989, Cold Spring Harbour Press) i tehnologija PCR-a (američki patent br. 4,603,102) mogu se upotrebiti za dobijanje i izolovanje CTLA4 mutantnih polipeptida koji kodiraju CTLA4 mutantne polipeptide.
Pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju oboljenja imunog sistema koji obuhvata farmaceutski efikasnu količinu rastvorljivih CTLA4 molekula. U odredjenim izvodjenjima, oboljenja imunog sistema povezani su sa CD28/CTLA4/B7 interakcijama. Rastvorljivi CTLA4 molekuli po mogućstvu su rastvorljivi CTLA4 molekuli sa sekvencom divljeg tipa i/ ili rastvorljivi CTLA4 molekuli sa jednom ili više m utacija u ekstracelulamom domenu CTLA4. Farmaceutsk kompozicija može da obuhvati rastvorljive CTRLA4 proteinske molekule i/ili molekule nukleinske kiseline, i/ili vektore koji kodiraju molekule. Poželjnim izvodjenjima, rastvorljivi CTLA4 molekuli imaju aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnog domena od CTRLA4 kao što je pokazano i na slici 24 i na slici 19 (CTLA4lg ili L104EA29Ylg). Kao što je u ovom tekstu opisano još poželjnije je da rastvorljivi CTLA4 mutantni molekul bude L104EA29Ylg. Kompozicije mogu dodatno da obuhvate ostale terapeutske agesne, koji obuhvataju ali nisu ograničeni na toksine, enzime, antitetla ili konjugate.
Kao što je standardna praksa u stanju tehnike, obezbedjena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata molekule iz pronalaska pomešane sa prihvatljivim nosačem ili adjuvantom koji je poznat onima koji su upućeni u stanje tehnike. Farmaceutske kompozicije po mogućstvu obuhvataju odgovrarajuće nosače i adjuvante koji uključuju bilo koji materijal koji kada se kombinuju sa molekulom iz pronalaska (na primer, rastvorljivi CTLA4 m olekul, takav kao što je CTLA4lg ili L104EA29Y) zadržava molekulsku aktivnost i ne reaguje na imuni sistem pacijenta. Ovi nosači i adjuvanti uključuju ali nisu ograničeni na izmenjivače jona, aluminijum, aluminijum stearat, lecitin, proteine seruma, kao što je humani albuminski serum, supstance koje se k oriste kao puferi kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, parcijalne smese glicerida od zasićenih biljnih masnih kiselina, fiziološki rastvor soli puferisan fosfatom, voda, emulzije (na primer, ulje/vodena emulzija), soli ili elektroliti takvi kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, koloidni silika gel, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, i polietilen glikol. Ostali nosači mogu takodje da obuhvate sterilne rastvore, tableter, uključujući tablete sa omotačem i kapsule. Karakteristični je da takvi nosači sadrže ekscipijente kao što su škrob, mleko, šećer (na primer, saharoza, glukoza, maltoza), zivesne vrste gline, želatin, stearinska kisleina ili njihove soli, magnezijum ili kalcijum stearat, talk, biljne masti ili ulja, gume, glikoli, ili ostali poznati escipijenti. Takvi nosači takodje mogu da obuhvate dodatke za aromu i boju ili ostale sastojke. Kompozicije koje obuhvataju takve nosače formulisani su dobro poznatim konvencionalnim postupcima, Takve kompozicije mogu se formulisati bez različitih lipidnih kompozicija, kao šo su na primer, lipozomi kao i različite polimerne kompozicije, takve kao što su polimerne mikrosfere.
Postupci
Pronalazak obezbedjuje postupke za regulisanje funkcionalnih CTLA4- i CD28-pozitivnih ćelijskih interakcija sa B7-pozitivnim ćelijama. Postupci obuhvataju stupanjem u kontakt B7-pozitivnih ćelija sa rastvorljivim CTLA4 molekulom iz pronalaska takod da gradi rastvorljive CTLA4/B7 komplekse, komplekse koji usporavaju reakciju endogenog CTLA4 i/ili CD28 molekula sa B7 molekulom.
Dati pronalazak takodje obezbedjuje postupke za inhibiranje funkcija T-ćelija ali ne i smanjenje broja T-ćelija kod ljudi stupanjem u kontakt B7-pozitivnih ćelija kod ljudi sa rastvorljivim CTLA4. Primeri rastvorljivih CTLA4 uključuju CTLA4lg i rastvorljive CTLA4 mutantne molekule takvi kao što su L1004EA29Ylg.
Dati pronalazak obezbedjuje kompozicije i postupke za lečenje bolesti imunog sistema, kao što su reumatske bolesti. Postupci obuhvataju primenu terapeutske kompozicije, koja obuhvata rastvorljive CTLA4 molekule iz pronalaska, na pacijenta u količini koja je efikasna da ublaži najmanje jedan od simptoma u vezi sa bolestima imunog sistema. Osim toga, pronalazak može da obezbedi dugotrajnu terapiju za oboljenja imunog sistema blokiranjem pozitivnih ćelijskih interakcija izmedju T-ćelija i B7, blokirajući time T-ćelijsku stimulaciju pomoću signala za kostimulaciju, kao što je B7 koji se vezuje za CD28, što dovodi do indukcije T-ćelijske anergije ili tolerancije. Bolesti imunog sistema uklljučuju ali nisu ograničeni na autoimune bolesti, imunoproliferativne bolesti, poremećaji u vezi sa presadjivanjem. Primeri za bolesti imunog sistema uključuju bolest odbacivanja transplantiranog tkiva (GVHD) (n aprimer koja može proisteći od transplatacije koštane srži, ili izazivanjem otpornosti), imuni poremećaji u vezi sa odbacivanjem transplantiranog tkiva, hroničnim odbijanjem, tkivni ili ćelijski alo-ili ksenokalemovi, režnjevi,uključujući čvrste organe, kožu, režnjevi, mišiće, heptocite, neurone. Primeri imunosupresivnih bolesti uključuju ali nisu ograničeni na psorijazu, T-ćelijski limfoma, akutna limfoblastna leukemija T-ćelija, testikularni angiocentrični T-ćelijski limfom, benigni limfocitični angitis, lupus (na primer, lupus eritematozus, lupus nefritis), Hašimotov tiroiditis, primarna miksedema, Gravesova bolest, perniciozna anemia, autoimuni atrofični gastritis, Adisonova bolest, diabetes (na primer, insulin zavisni diabetes melitus, tip I diabetes melitusa, tip II diabetes melitusa, good pasturov sindrom, miastenia gravis, pemfigus, Kronova bolest, simpatična oftalmija, autoimuni uveitis, multipl skelroza, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska trombocitopenija, primarna biliama ciroza, hronični hepatitis, ulcerativni kolitis, Sjorgensov sindrom, reumatska oboljenja (na primer, reumatoidni artritis), polimiozitis, skleroderma, i mešane bolesti vezivnog tkiva.
Rastvorljivi CTLA4 molekuli iz pronalaska pokazuju in vivo inhibitorska svojstva. Prema uslovima gde postoje interakcije pozitivnih T-ćelija i B7, na primer T ćelijske/B ćelijske interakcije, javljaju se kao rezultat kontakta izmedju T ćelija i B7-pozitivnih ćelija, vezivanja uvedenih CTLA4 molekula da bi reagovali sa B7-pozitivnim ćelijama, na primer B ćelijama koj mogu da inhibiraju interakacije izmedju T ćelija i B7-pozitivnih ćelija što rezultuje regulacijom imunog odgovora.
Pronalazak obezbedjuje postupke za donju regulaciju imunih odgovora.
Ovakava regulacija imunog odgvora od strane rastvorljivih CTLA4 molekula iz pronalaska može da bude način za inhibiranje ili blokiranje imunog odgovora koji se već razvija ili mogu da obuhvate zaštitu od indukcije imunog odgovora. Rastvorljivi CTRLA4 molekuli iz pronalaska mogu da inhibiraju funkcije aktiviranih T-ćelija, kao što su proliferacija T limfocita i sekrecija citokina, supresijom T ćelijskog odgovora ili izazivanjem specifične tolerancije u T ćelijama, ili i na jedan i na drugi način. Rastvorljivi CTRLA4 molekuli iz datog pronalaska koji ometaju put (niz reakcija) za CTRLA4/CD28/B7 mogu da inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju i/ili citokinsku sekreciju, i tako dovode do smanjenog razaranje tkiva i indukcije T-ćelija i anergije.
poželjno izvodjenje pronalaska obuhvata upotrebu rastvorljivog CTLA4 mutantnog molekula L104EA29Ylg za regulaciju funkcionalnih interakcija CTLA4- i CD28-pozitivnih ćelija sa B7-pozitivnim ćelijama, za lečenje oboljenja sistema kao što su reumatska oboljenja i/za donju regulaciju imunih odgovra. L104EA29Ylg iz pronalaska je rastvorljivi CTLA4 mutantni molekul koji obuhvata najmanje dve aminokiselinske promene, i to zamenu leucina (L) sa glutaminskom kiselinom u položaju +104 i alanina (A) sa tirozinom (Y) u položaju +29. L104EA29Ylg molekul može da obuhvati dalje mutacije preko dve koje su ovde naznačene.
Poželjno izvodjenje obuhvata postupke za lečenje reumatskog oboljenja, kao što je reumatoidni artritis, davanjem efikasne količine rastvorljivih CTRLA4 molekula pacijentu. Davanje efikasne količine terapeutske kompozicije, na taj način oslobadja pacijenta najmanje jednog simptoma u vezi sa bolešću, uključujući smanjenje: nateknuosti zglobova, lomljivosti zglobova, upala, jutarnje ukrućenosti i bola i strukturnog oštećenja što kasnije utiče na smanjenje fizičke nesposobnosti. Postupci iz pronalaska mogu se koristiti za ublažavanje najmanje jednog simptoma u vezi sa reumatoidnim artritisom, uključujući smanjenje brzine sedimentacije eritrocita, nivoa seruma u C-reaktivnom proteinu, rastvorljivom ICAM-1, rastvorljivom E-selektinu i/ili rastvorljivom IL-2r.
Količina olakšavanja simptoma koja je obezbedjena datim pronalaskom može se meriti korišćenjem bilo kojeg prihvaćenog kriterijuma utvrdjenog za merenje i dokumentovanje olakšavanja simptoma u kliničkoj primeni.
Prihvatljivi kriterijum za merenje olakšavanja simptoma bolesti može da obuhvati rezultate na osnovu kriterijuma utvrdjenog od strane Američkog koledža za reumatologiju (na primer, ACR 20), četiri merenja olakšavanja simptoma bolesti (u: „ CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-lnflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988), i upitinika o procenjivanju zdravlja (HAQ) (Fries, J. F., et al., 1982 J. of Rheumatologv 9: 789-793). Za generalni opis ovih kriterijuma, videti „ Guidance for Industrv: Clinical Developement Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA)", Februar ,1999.
Pacijenti koji su tretirani datim pronaalskom obuhvataju sisare, uključujući ljude, majmune, pse, mačke, krave, konje, zečev, miševe i pacove.
Dati pronalazak obezbedjuje različite postupke, lokalne ili sistemske, za davanje rastvorljivih CTRLA4 molekula. Postupci obuhvataju intravenozne, intramuslkularne, intraperitonealne, oralne, inhalacione i subkutanozne postupke, kao i postupke za ugradjivanje pumpe, kontinualnu infuziju, gensku terapiju, lipozome, čepiće, lokalni kontakt, vezikule, kapsule i postupke ubrizgavanja. Terapeutski agens, obavijen sa nosačem liofilizuje se radi čuvanja i rekonstituiše se sa vodom ili puferskim rastvorom sa neutralnim pH (oko pH 7-8, na primer, pH 7.5) pre same primene.
Kao što je standardan praksa u stanju tehnike, kompozicije iz pronalaksa mogu se davati pacijentu u vidu bilo koje farmaceutski prihvatljive forme.
U saglasnosti sa praksom iz pronalaska, postupci obuhvataju davanjem subjektu rastvorljivivih CTRLA4 molekula iz pronalaska radi regulisanja interakcija izmedju CD28- i/ili CTLA4-pozitivnih ćelija. B7-pozitivne ćelije stupaju u kontakt sa efikasnom količinom rastvorljivih CTRLA4 molekula iz pronalaska, ili njihovih fragmenata ili derivata, tako da grade rastvorljive VTRLA4/B7 komplekse. Kompleksi ometaju interkaciju izmedju endogene CTRLA4 i CD28 molekule sa B7 familijama molekula.
Rastvorljivi CTRLA4 molekuli mogu se primeniti na pacijenta u količini i u vremenu (na primer, dužina vremena i/ili umnožena vremena) dovoljnom za blokiranje endogenih molekula koje je potrebno za vezivanje njihovih odnosnih liganada, Blokiranje engonenog vezivanje B7/ligand na ovaj na.in inhibira interakcije izmedju B7-pozitivnih ćelija sa CD28- i/ili CTLA4-pozitivnih ćelija.
Doza terapeutskog agensa zavisi od mnogo faktora koji uključuju ali nisu ograničeni na vrstu obolelog tkiva, vrste atoimune bolesti k oja se leči, ozbiljnosti bolesti, zdravlja pacijenta i odgovora na tretman sa agensima.
Shodno tome, doze za korišćene agense mogu da variraju u zavisnosti od svakog pacijenta i od načina primene. Rastvorljivi CTRLA4 molekuli mog se primeniti u količinama izmedju 0.1 do 20.0 mg/kg težine pacijenta na dan, po mogućstvi izmedju 0.5 i 10.0 mg/kg/na dan.
Pronalazak takodje obuhvata primenu kompozicija iz pronalaska zajedno sa ostalim farmaceutskim agensima za lečenje bolesti imunog sistema.
Na primer, reumatska oboljenja mogu se lečiti sa molekulima iz pronalaska u vezi sa ali bez ograničenja na imunosupresante kao što su kortikosteroidi, ciklosporini (Mathiesen 1989 Cancer LEtt. 44(2):151-156), prednison, azatiprin, metotreksat (R. Handschumacher, in: Drugs Used for Immunosupression" strane 1264-1276). , TNFoc blokeri ili antagonisti (New England Journal of Medicine, vol. 340: 253-259, 1999; The Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Intemal Medicine, vol 130: 478-486), ili bilo koji drugi biološki agens koji cilja bilo koji inflamatorni citokin, nesteroidni antiinflamatorni lekovi/Cox-2-inhibitore, hidroksihlorohinin, sulfasalazopirin, zlatne soli, etanrept, infliksimab, rapamicin, mikofenolat mofetil, azatioprin, takrolizmus, basiliksimab, citoksan, interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatiramer acetat, mitoksantron hidrohlorid, anakinra i/ili ostali komercijalni proizvodi izvedeni iz biotehnoloških procesa.
Rastvorljivi VTRLA4 molekuli (po mogućstvu, L104EA29Ylg) mogu se takodje koristiti u kombinaciji sa jednim ili više sledećih agenasa da bi se regulisao imuni odgovor: rastvorljivi gp39 (takodje poznat kao CD40 ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), rastvorljivi CD29, rastvorljivi CD40, rastvorljivi CD80(na primer, ATCC 68627), rastvorljivi CD86, rastvorljivi CD28 (na primer, 68628), rastvorljivi CD56, rastvorljivi Thy-1, rastvorljivi CD3, rastvorljivi TCR, rastvorljivi VLA-4, rastvorljivi VCAM-1, rastvorljivi LECAM-1, rastvorljivi ELAM-1, rastvorljivi CD44, antitela koja reaguje sa gp39 (na primer, ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 i ATCC HB-12056), antitela koja reaguju sa CD40 (na primer, ATCC HB-9110), antitela koja reaguju sa B7 (na primer, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, itd), antitela koja reaguju sa CD28 (na primer, ATCC HB-11944 ili mAb 9.3 kao što je opisano od Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1 ):18-22, 1980), antitela koja reaguje sa LF-1 (na primer, ATCC HB-9579 i ATCC TIB-213), antitela koja reaguju sa LFA-2, antitela koja reaguju sa IL-2, antitela koja reaguju sa IL-12, antitela koja reaguju sa IFN-gama, antitela koja reaguju sa CD2, antitela koja reguju sa CD48, anitela koja reaguju sa ICM (na primer, ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 i ICAM-3), antitela koja reaguju sa CTLA4 (na primer, ATCC HB-304), antitela koja reaguju sa Thy-1, antitela koja reaguju sa CD56, antitela koja reaguju sa CD3, antitela koja reaguju sa CD29, antitela koja reaguju sa TCR, antitela koja reaguju sa VLa-4, antitela koja reaguju sa VCAM-1, antitela koja reaguju sa LECAM-1, antitela koja reaguju sa ELAM-1, antitela koja reguju sa CD44. U odredjenim izvodjenjima, monoklinična antitela su poželjna. U ostalim izvodjenjima, poželjna su fragmenti antitela. Kao što će osoba koja je upućena u stanje tehnike lako razumeti, kombinacija može da obuhvati rastvorljive CTRLA4 molekule iz pronalaska i još jedan imunosupresivni agens, rastvorljive CTLA4 molekule sa još dva druga imunosupresivna agensa, rastvorljivi CTRL4 molekuli sa još tri imunusupresivna agensa, itd. Odredjivanje optimalne kombinacije i doziranja može se odrediti i optimizirati korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike.
Neke specifične kombinacije uključuju sledeće: L104EA29Ylg i CD80 monokliničnih antitela (mAbs); L104EA29Ylg i CD86 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 mAbs, i CD86 mAbs; L104EA29Ylg i gp39 mAbs; L104EA29Ylg i CD40 mAbs; L104EA29Ylg i CD28 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 i CD86 mAbs, i gp39 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 i CD86 mAbs i CD40 mAbs; i L104EA29Ylg, anti-LFA1 mAb, i anti-gp39 mAb. Specifični primer za gp39 mAbje MR1. OStale kombinacije če biti jasno procenjene i shvaćene od strane onih koji su upućeni u stanje tehnike.
Rastvorljivi CTRLA molekuli iz pronalaska, na primer L104EA29Ylg, mogu se primeniti kao jedini aktivni sastojak ili zajedno sa ostalim lekovima u imunomoduliranim mačinima lečenja ili kao drugi anti-inflamatorni agensi na primer, za lečenje ili prevenciju alo- ili ksenokalemske akutno ili hronično odbijanje ili zapaljenski ili autoimuni poremećaji, ili da bi se izazvala izdržljivost (podnošenje leka). Na primer, mogu se koristiti u kombinaciji sa kalcineurinskim inhibitorom, na primer, ciklosporin A ili FK506; imunosupresivni makrolid, na primer, rapamicin ili njegov derivat; na primer, 40-O-(2-hidroksi)etil-rapamicin, limfocitni agresivni agens, na primer, FTY720 ili njegov analog; kortikosteroida, ciklofosfamida; azatiofena; metotreksat; leflunomida ili njegovog analoga; mizoribina; mikrofenolne kiseline; mikrofenolat mofetil; 15-deoksispergualin ili njegov analog; imunosupresivni monoklinična antitela, na primer, monoklinična antitela do leukocitnih recepotra, na primer, MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB ili njihovi ligandi; ili ostala imunomodulatorna jedinjenja, na primer, CTLA4/CD28-lg, ili ostali adhezioni molekulski inhibitori, n primer, mAbs ili inhibitori sa malom k molekulksom masom koji obuhvataju LFA-1 antagoniste, Selektinske antagoniste i VLA-4 antagoniste. JEdinjenje je naročito korisno u kombinaciji sa jedinjenjima koja inerferuju CD40 i njegov ligans, na primer, antitela do CD40 i antitela do CD40-L.
Kada se rastvorljivi CTLA4 mutantni molekuli iz pronalaska primenjuju u vezi sa ostalim imunosupresivnim/imunomodulatorskim ili antiinflamatornoj terapiji, na primer, kao što je već ranije odredjeno, dozamako-adminsiteredimunosupresanata, imunomodulatorskog ili antiinflamatornog jedinjenja zavisi će od vrste primenjenog leka, na primer da li je to steroid ili ciklosporin, na upotrebljenom specifičnom leku, od uslova koji se leče i tako dalje.
U saglasnosti sa predhodno iznetim, dati pronalazak obezbedjuje u još jednom aspektu postupke koji obuhvataju ko-primenu, na primer, istovremeno ili u sekvenci, ili terapeutski efikasnu količinu rastvorljivih CTRLA4 molekula iz pronalaska, na primer, CTLA4lg i/ili L104EA29Ylg, u slobodnom obliku ili u farmaceutski prihvatljivom obliku soli, i drugu supstancu koja predstavlja lek, pomenuta druga sustanca je imunosupresant, imunomodulator ili anti-inflamatorni lek, na primer, kao što je ranije naznačeno. Dalje su predstavljene terapeutske kombincije, na primer, kit za uptrebu u bilo kojem od postupaka koji su ranije definisani, koji obuhvata rastvorljiv CTLA4 molekul, u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli, koja se koristi istovremeno ili u sekvenci sa najmanje jednom farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata imunosupresant, imunomodulirajući ili anti-inflamtorni lek. Kit može da obuhvati instrukcije za njegovu primenu.
Pronalazak takodje obezbedjuje postupke za proizvodnju rastvorljivog CTLA4 mutantnog molekula iz pronalaska. Ekspresija rastvorljivog CTLA4 mutantnog molekula može biti u prokariotskim ćelijama ili eukariotskim ćelijama.
Prokariote su najčešće predstavljene pomoću različitih sojeva bakterija. Bakterije mogu biti gram pozitivne ili gram negativne. Poželjne su gram negativne bakterije, kao što je E. coli. Ostali mikrobiološki sojevi takodje mogu biti korišćeni. SEkvence k oje kodiraju rastvorljive CTLA4 molekule mogu se insertovati u vekotr koji je naznačen za eksprimovanje stranih sekvenci u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli. Ovi vektori mogu da obuhvate najčešće korišćene prokariotske kontrolne sekvence koje su ovde definisane da bi uključili promotere za transkripcionu inicijaciju, po slobodnom izboru sa operatorom, duž vezivnog mesta za ribozomske sekvence, uključujući najčešće korišćene promotore kao što su promoterski sistemi za beta-laktamazu (penicilaza) i laktozu (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), promoterski sistem za triptofan (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids REs. 8:4057) i Pl promoter izveden iz lambde i ribzomsko vezivno mesto za N-gen (Shimatake, et la., (1981) Nature 292: 128).
Takvi vektori ekspresije takodje obuhvataju izvore replikacije i selektivne markere kao što su beta-laktamaza ili gen neomicin fosfotranseraze koji poseduju optornost na antibiotike, tako da vektori koji se mogu replicirati u bakteriji i ćelijama koje nose plazmide, mogu biti izabrani kada porastu u prisustvu antibiotika, kao što su ampicilin ili kanamicin.
Eksprimovani plazmid može se uvesti u prokariotsku ćeliju preko velikog broja standardnih postupaka, koji nisu ograničeni na CaCl2-šok (Cohen, (1972) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, i Sambrook et al. (eds.), „ Molecular CLoning: A Laboratorv Manaual „, drugo izdanje, Cold SPring Harbour Press (1989)) i elektroporaciju.
U saglansosti sa praksom u vezi pronalaska, eukariotske ćelije su takodje pogodne da se koriste kao ćelije domaćina. Primeri eukariotskih ćelija uključuju bilo koju životinjsku ćeliju, bilo da je primarna ili imortalizovana, ćelije kvasca (na primer, Saccharomvces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe, i Pichia pastoris), i biljne ćelije. Ćelije mieloma, COS i CHO ćelije primeri su životinjskih ćelija koje mogu biti korišćene kao ćelije domaćina. CHo ćelije posebno uključuju ali nisu ograničene na DG44 (Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997, Biochemistrv 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-on ćelijske linije (Clonotech(, CHO ćelije označene kao ECACC 85050302 (CAMR, SAilsburv,VViltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Geneva, IT), CHO klon B (GEIMG, Geneva, IT), CHO-K1/SF označene kao ECACC 93061607 (CAMR, Sailsburv, VViltshire, UK), i RR-CHOK1 označene kao ECACC 92052129 (CAMR, Sailsburv, VViltshire, UK). Primeri biljnih ćelija obuhvataju ćelije duvana (cela stablijka, ćelijska kultura, ili kalus), kukuruza, soje i ćelije pirinča. Kukuruzno seme, sojino seme i seme pirinča su takodje prihvatljive.
Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju CTLA4 mutantne molekule mogu se takodje insertovati u vektor koji je označen za ekspresiju stranih sekvenci u eukariotskom domaćinu. Regulatorski elementi vektora mogu da variraju prema posebnim eukariotskim čelima domaćina.
Najčešće korišćene eukariotske kontrolne sekvence za upotrebu u vekotrima ekspresije uključuju promotere i kontrolne sekvence koje su kompatibilne sa ćelijama sisara, kao što su na primer CMV-promoter (CDM-8 vektor) i pileći sarkoma virus (ATR) (PLN-vektor).
Pomcnućemo još neke promotore koji su u uobičajenoj upotrebi: rani i kasni promotor izvedeni iz genoma majmunskog virusa 40 (Simian Virus 40- SV40) (Fiers, i sar.. (1973) Nature 273:113), ili drugi virusni promotori koji potiču od polioma virusa. Adenovirusa 2 i goveđeg papilloma virusa. Treba pomenuti i inducibilni promotor, hMTII (Karin, i sar.,
(1982) Nature 299:797-802) kojin se takođe koristi.
Vektori za ekspresiju mutantnih CTLA 4 molekula u eukariotima često moraju da sadrže sekvence koje nazivamo pojačivači (enhancer regions).Ovi regioni su važni za optimizaciju ekspresije gena i smešteni su ili uzvodno ili nizvodno u odnosu na region promotora.
Kao primeri vektora za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji kao domaćinu, uzimaju se vektori kojima se ubacuju geni u ćelije sisara kao domaćina (npr. BPV-l. pHvg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl(Life Technologies); pVPakc vektori, pCMV vectori, pSG5 vectori (Stratagene)), retroviralni vektori (npr., pFB vektori (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ili modifikovane forme pomenutih, adenoviralni vektori; vektori izvedeni iz virusa koji su vezani za žlezdano tkivo, vektori baculovirusa, vektori kvasaca (npr., pESC vektori (Stratagene)). Ova lista ne obuhvata sve, te nije ograničavajuća.
Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju mutantne CTLA44 molekule mogu da se integrišu u genom eukariotske ćelije domaćina i da se repliciraju uz rcplikaciju genoma ćelije domaćina. Postoji i druga mogućnost, da vektor koji nosi mutantni CTLA4 molekul sadrži i oridžine (origins) replikacije, što mu omogućava ekstrahromozomalnu replikaciju.
Za ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina u Saccharomvces cerevisiae. sa oridžinom replikacije iz endogenog plazmida kvasca, može da se koristi 2p. kruga (circle). (Broach,
(1983) Meth. Enz. 101:3()7). Druga mogućnost je da se uzme sekvenca iz genoma kvasca koje su sposobne za autonomnu replikaciju (pogledaj, npr., Stinchcomb i sar.. (1979) Nature 282:39: Tschemper i sar., (1980) Gene 10:157; i Clarke i sar., (1983) Meth. Enz. 101:300). Sekvence za kontrolu transkripcije u vektorima koji se inkorporiraju u genom kvasca obuhvataju promotore za sintezu glikolitičkih enzima (Hess i sar., (1968) J. Adv. Enzvme Reg. 7:149; Holland i sar., (1978) Biochemistrv 17:4900). Pored ovih u upotrebi su i sledeći promotori: CMV promotor koji se nalazi smešten u CDM8 vektoru (Tovama i Okavama,
(1990) FEBS 268:217-221), promotor za 3-fosfoglicerat kinazu (Hitzeman i sar., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) kao i drugi promotori za glikolitičke enzime.
Drugi promotori su inducibilni, što znači da njihovu aktivnost regulišu stimulusi iz spoljašnje sredine ili komponente medijuma u kojem se kultivišu ćelije. U ove inducibilne promotore ubrajaju se oni koji potiču iz gena za heat shock proteine, alkohol dehirogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu. enzima koji su uključeni u procese razgradnje jedinjenja azota i enzima koji su odgovorni za iskorišćenje maltoze i galaktoze.
Regulatome sekvence mogu da budu smeštene na 3' kraju kodirajuće sekvence. Ove sekvence imaju ulogu u stabilizaciji informacione RNK. To su sekvence za terminaciju i mogu se naći u 3' regionu koji se ne prepisuje u RNK. i sledi posle kodirajuće sekvence u nekim genima koji su izvedeni iz genoma kvasca i sisara.
U tipične vektore za biljke i biljne ćelije, mada tu listu ovaj niz ne iscrpjuje, se ubrajaju Agrobacterium T!plazmidi, mozaik virus karfiola (CaMV) i zlatni mozaik vitus paradajza
(TGMV).
Opšti aspekti transformacija u sistemu sisarske ćelije kao domaćina, su opisane kod Axela (U.S. Patent No. 4.399,216 izdato 16.avgusta 1983. godine). Sisarska ćelija može da se transformiše po različitim metodima od kojih ćemo neke navesti. To su: transfekcija u prisustvu kalcijum-tbsfata, mikroinjiciranje, elektroporacija, ili transdukcija preko virusa kao vektora.
Ima više metoda za uvođenje strane sekvece DNK u genom bilke i kvasca, kao na primer: (1) mehaničke metode kao što je mikroinjiciranje u pojedinačne ćelije ili protoplaste, zatim vorteksovanje ćelija sa staklenim kuglicama u prisustvu DNK, ili ubacivanje pod pritiskom (shooting) sfera od zlata ili tungstena koje su obložene sa DNK. u ćelije ili protoplaste; (2) ubacivanje DNK povećavanjem permeabilnosti ćelijske membrane za makromolekule. tretiranjem ćelija polietilen-glikolom ili podvrgavanjem ćelija visoko naponskim električnim inpulsima (elektroporacija); ili (3) korišćenje lipozoma (koji sadrže cDNK) koji fuzionišu sa ćelijskom membranom.
Kada su mutantni CTLA4 molekuli, opisani u ogledima, jednom ispoljeni, moguće ih je izolovati i prikupiti različitim uobičajenim metodama, kao što je liziranje ćelija (npr., sonifikacijom, ekstrakcijom lizozimom i/ili deterdžentima) i prikupljanje proteina primenom standardnih metoda za prečišćavanje proteina, npr., afinitetnom hromatogratijom ili jonoizmenjivačkom hromatografijom, da bi na taj način dobili u velikoj meri prečišćen proizvod (R. Scopes u :" Protein Puritications. Principles and Practice". Third Edition. Springer-Verlag (1994); Sambrook i sar. (eds), " Molecular cloning: A Laboratorv Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Ekspresija mutantnih CTLA4 molekula može da se detektuje uobičajenim metodama. Na primer, mutantni molekul može da se detektuje bojenjem SDS-PAGE gelova sa Coomassie bojom i imunoblotom sa antitelima koja vezuju CTLA4.
U primerima koji slede prikazan je ovaj pronalazak, kao i nove mogućnosti za produkciju i upotrebu istog, pored već uobičajenih. Ni na koji način prikazi u primerima ne treba da ograničavaju mogućnosti koje pruža pronalazak.
PRIMER 1
U daljem tekstu biće prikazani metodi za dobijanje sekvenci nukleotida koji kodiraju CTLA4 molekul iz pronalaska.
Prvo je konstruisan plazmid koji sadrži sekvencu CTLA4Ig i pokazano je da eksprimira molekul CTLA4Ig kao što je opisano u U.S.patentu br. 5,434.131.5.885,579 i 5,851.795. Onda su produkovani molekuli koji sadrže jednostuke mutacije (npr.. L104EIg) izvedeni iz sekvence koju kodira CTLA4Ig, ovi molekuli su eksprimirani i određena je kinetika vezivanja za različite molekule B7. Ll()4EIg nukleotidna sekvenca ( kao što prikazuje slika 18) je korišćena kao matrica od koje je dobjena CTLA4 mutirana sekvenca sa dvostrukom mutacijom (što prikazuju slike 19-22). koja je eksprimirana i određena je kinetika vezivanja ovako dobijenog proteina. CTLA4 sekvence, mutirane na dva mesta obuhvataju: L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg i L104EA29WIg. Dobijeni su i mutanti koji sasdrže mutacije na tri mesta.
Konstrukcija CTLA4
Nukleotidna sekvenca koja kodira CTLA4Ig sadrži ekstracelularni domen CTLA4 molekula i IgCgamal domen, i konstruisana je kao što je opisano u U.S. patentima br. 5,434,131.5,844,095 i 5,851,795, sadržaj ovih tačakaje referencom uključen u ovaj tekst. Gen za ekstracelularni domen CTLA4 je kloniran PCR-om, pri tom su korišćeni sintetički oligonukleotidi koji odgovaraju sekvenci objavljenoj u radu (Dariavach i sar.. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).
Signalni peptid za CTLA4 nije identiftkovan u genu za CTLA4. Zato je za N-kraj predviđene sekvence za CTLA4 vezan signalni peptid onkostatina M (Malik i sar.. Mol, and Cell Biol. 9: 2847 (1989)) u dva koraka koristeći preklapajuće oligonukleotide. U prvom koraku korišćen jc oligonukleotid CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCAT GGCAATGCACGTGGCCCAGCC kao uzvodni prajmer (koji kodira 15 amunokiselina na C-kraju u signalnom peptidu onkostatina M koje su pripojene za niz od 7 aminokiselina na N-kraju CTLA4 molekula), i TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (koji kodira aminokiselinske ostatke 119-125 u aminokiselinskoj sekvenci koja kodira receptor za CTLA4 i sadrži mesto na koje deluje restrikcioni enzim Bcl I) kao nizvodni prajmer. Matrica za ovaj korak je je bila cDNK, koja je sintetisana iz lmikrog kompletne RNK iz H38 ćelija (to je sa HTLV II inficirana ćelijska linija T-ćelijske leukemije, dobijena ljubaznošću doktora Salahudina i Galloa, NCI, Bethesda, MD). Deo produkata PCR-a iz prvog koraka je reamplifikovan. koristeći preklapajući uzvodni prajmer, koji kodira N-terminalni deo signalnog peptida onkostatina M, koji sadrži mesto na koje deluje restrikciona endonukleaza
Hind III, CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGC
TGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC isti nizvodni prajmer. Produkt PCR reakcije je podvrgnut enzimskoj digestiji sa Hind III i Bcl I i ligiran sa fragmentima dobijenim đigestijom sa Bcl I/Xba I, cDNK koja kodira aminokiselinske sekvence koje odgovaraju regionu zgloba. CH2 i CH3 regione IgCgama 1 u Hind III/Xba I isečen ekspresioni vektor. CDM8 ili Hind III/Xba I isečen ekspresioni vektor piLN (takođe poznat kao tcLN).
DNK koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja odgovara CTLA4Ig, je deponovana sa ATCC pod uredbama Budimpeštanskog sporazuma 31. maja 1991.godine, i dodeljen mu je pristupni broj 68629.
Mutageneza CTLA4I g na bazi kodona:
Da bi identifikovali mutirane CTLA4Ig molekule koji imaju manju brzinu disocijacije u reakciji vezivanja za CD80 i/ili CD86 molekule, tj., sa poboljšanom sposobnošću vezivanja, razrađena je strategija za mutagenezu i pretraživanje i odabir najboljih mutanata. U ovom izvođenju, mutacije su indukovane na mestu samih i/ili u blizini ostataka u CDR-1, CDR-2 (takođe poznat i kao C niz) i/ili CDR-3 regionima ekstracelularnog domena CTLA4 (kao što je opisano u U.S. patentima 6,090,914,5,773,253 i 5,844,095; u U.S. patentim prijavama prijavljen sa serijskim brojem 60/214,065; i po radu Peach, RJ.i sar.. J. Exp. Med. (1994), 180:2049-2058. Molekul koji ima strukturu po CDR-obrascu (CDR-like region) prevazilazi po dužini niza svaki od CDR regiona i produžava se, za po nekoliko aminikiselina sa svake strane CDR motiva). Ova mesta su odabrana na osnovu rezultata eksperimenata koji su proučavali himere, CD28/CTLA4 fuzione proteine (Peach i sar.. J. Exp. Med.. 1994, 180:2049-2058), i na osnovu modela koji omogućava da se predvidi koji će bočni lanac aminokiselinskog ostatka biti izložen rastvaraču i gubitak identičnosti ili homologije aminokiselinskih ostataka na određenim pozicijama između CD28 i CTLA4. Takođe, svaki ostatak koji je prostorno u neposrednoj blizini (5 do 20 Angstrom jedinica) iđentifikovanih ostataka se smatra delom ovog pronalaska.
U cilju sinteze i odabiranja rastvorljivog mutiranog CTLA4 molekula sa izmenjenim afinitetom prema B7 molekulu ( CD80, CD86), usvojena je strategija dva koraka. Eksperimenti zahtevaju da se prvo generiše biblioteka mutacija najednom određenom kođonu ekstracelularnog dela CTLA4 molekula i potom pretraživanje i odabir uz pomoć BIAcore anlize, kako bi identifikovali mutante sa promenjenom aktivnošću prema B7. BIAcore sistem za testiranje (Pharmacia. Piscataway, NJ.) koristi sistem za detekciju rezonancije površinskog plazmona. koji u osnovi podrazumeva kovalentno vezivanje CDSOIg ili CD86Ig za senzorski čip koji je obložen dekstranom. a koji je smešten u detekroru. Molekul koji se ispituje se može injicirati u komoru sa senzorskim čipom i količina komplementarnog proteina koji se vezuje može da se odredi na osnovu promene molekulske mase entiteta koji je fizički vezan za dekstranom oobloženu stranu senzorskog čipa; promena u molekulskoj masi može da se meri sistemom za detekciju.
Nukleotidne sekvence jednostrukih mutanata su dobijene polazeći od nemutirane (wild-type) DNK koja kodira CTLA41g (U.S. patenti br. 5.434,131. 5,844,095; 5.951,795; i 5,885.796;
ATCC pristupanje ugovoru br. 68629) kao matrice. Mutageni oligonukleotidni prajmeri za PCR su dizajnirani za nasumičnu mutagenezu određenog kodona. dopuštajući svaku bazu na pozicijama 1 i 2 kodona. osim na poziciji 3 gde su dozvoljene samo guanin i timidin (XXG/T ili takođe zasbeležen i kao NNG/T). Ovim postupkom, može se nasumično mutirati određeni kodon za jednu aminokiselinu, tako da kodira svaku od 20 amuinokiselina. U tom smislu. XXG/T mutageneza daje 32 potencijalna kodona. koji kodiraju svaku od 20 aminokiselina. Produkti PCR-a koji kodiraju mutacije u neposrednoj blizini petlje sa CDR3 strukturnim motivom u CTLA4Ig (MYPPPY), su enzimski razgrađeni sa Sac I/Xba I i subklonirani u slično isečen CTLA4Ig (kao što prikazuje slika 24)7tLN vektor za ekspresiju. Ovim metodom je dobijen CTLA4 molekul mutiran najednom mestu-jednostruki mutant, nazvan L104Elg (to je prikazano na slici 18).
Za mutagenezu u blizini petlje sa strukturnim motivom CDR-1 u okviru CTLA4Ig molekula, dodato je sa 5' kraja petlje "silent" restrikciono mesto za Nhel, mutagenezom koja je usmerena PCR prajmerima. Produkti PCR-a su enzimski razgrađeni sa Nhel/Xbal i subklonirani u slično isečen CTLA4Ig ili L104EIg vektor za ekspresiju. Ovim metodom je dobijen CTLA4 molekul mutiran na dva mesta-đvostruki mutant, nazvan Ll()4EA29YIg (uključeno je u prikaz na slici 19). Opširnije, molekul nukleinske kiseline koji kodira jednostruko mutirani molekul CTLA4. Ll()4EIg, je upotrebljen kao matrica za dobijanje dvostruko mutiranog CTLA4 molekula. Ll()4EA29YIg.
Nukleotidne sekvence sa mutacijama na dva mesta koji kodiraju CTLA4 mutante, kao što je L104EA29YIg (deponovan 19 juna 2000. godine, u American Type Culture Collection
(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 i odobren mu je ATCC pristup ugovoru pod brojem PTA-2104), su dobijene ponavljanjem procedure mutageneze koja je gore opisana koristeći L104EIg kao matricu. Primenom ovog metoda dobijene su brojne nukleotidne sekvence sa dvostrukim mutacijama, kao što su one koje kodiraju mutante CTLA4 molekula L104EA29YIg (ove mutacije uključuje sekvenca prikazana na slici 19), L104EA29LIg (ove mutacije uključuje sekvenca prikazana na slici 20), Ll04EA29Tlg (ove mutacije uključuje sekvenca prikazana na slici 21) i L104EA29WIg (ove mutacije uključuje sekvenca prikazana na slici 22). Takođe su dobijeni i trostruki mutanti kao što su: L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg i Ll04EA29YS25RIg.
Nukleotidne sekvence rastvorljivih varijanti CTLA4 molekula su eksprimirane i primenjene u drugoj fazi, kliničkim ispitivanjima, koja su opisana u primeru 3. u tekstu niže.
Upućeni u ovu problematiku će primetiti da se replikacijom nukleinskih sekvenci, pogotovo uz amplifikaciju pomoću PCR-a, sa lakoćom uvode promene baza u DNK nizu. Međutim, promene nukleotida neće uvek dovesti do promene u odgovarajućoj aminokiselini, jer neki kodoni redundantno kodiraju istu aminokiselinu. Svaku promenu nukleotida u odnosu na wild-type sekvencu, bilo da su "silent" (tj., ne dvodi do promene u amunokielini koju kodira taj kodon) ili pak, ukoliko nije jasno naznačeno u ovom tekstu, su obuhvaćene sadržinom ovog pronalaska.
PRIMER 2
U primeru koji sledi, opisane su metode za pretraživanje i odabir, koje se koriste za identifikaciju jednostruko i dvostruko mutiranih CTLA4 polipeptida, koji su dobijeni ekspresijom nukleotidnih sekvenci čija je konstrukcija opisana u Primeru 1, a koji su pokazali veći aviditet prema B7 molekulima, u odnosu na nemutirani CTLA4Ig molekul.
Savremenain vitroiin vivoistraživanja, su pokazala da molekul CTLA4Ig sam po sebi nije u stanju da u potpunosti blokira primovanje T ćelije koja je aktivirana specifičnim antigenom. Eksperimentiin vitrosa CTLA4Ig i drugim monoklonskim antitelima specifičnim za CD80 ili CD86. u kojima je merena inhibicija proliferacije T ćelija, pokazuju da anti-CD80 monoklonsko antitelo nije povećalo inhibiciju koju ostvaruje sam CTLA41g molekul. Međutim, anti-CD86 monoklonsko antitelo povećava inhibiciju izazvanu sa CTLA4Ig, što znači đa CTLA4 Ig nije jednako efikasan u blokiranju interakcije sa CD86. Ovi podaci su u skladu sa ranijim rezultatima koje su objavili Linslev i sar.. (Immunitv, (1994),1:793-801) koji pokazuju daje za inhibiciju ćelijskog odgovora posredovanu sa CD80, potrebna približno 100 puta manja koncentracija CTLA4Ig u poređenju sa odgovorom koji posreduje CD86. Na osnovu ovih rezultata, doneta je pretpostavka da mutirani CTLA4 rastvorljivi molekuli, koji imaju veći aviditet prema CD86 u odnosu na wild-type CTLA4, efikasnije blokiraju prajming ćelija koje su aktivirane specifičnim antigenom, u odnosu na CTLA4Ig.
Sa ovog aspekta, rastvorljivi CTLA4 mutirani molekuli, koji su opisani u Primeru 1. su podvrgnuti pretraživanju i selekciji koristeći novu proceduru za pretraživanje, da bi identifikovali one mutacije u ekstracelulamom domenu CTLA4 koje povećavaju aviditet vezivanja za CD80 i CD86. Ova strategija za pretraživanje je proizvela jedan efikasan metod za direktnu identifikaciju mutanata koji imaju jasno manju brzinu disocijacije , bez potrebe da se ispitivani protein prvo prečisti ili kvantifikuje, budući da za određivanje brzine disocijacije nije potrebno znati koncentraciju (0'Shannessy i sar.. (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).
COS ćelije su transfektovane sa pojedinačnim miniprep purifikovanim DNK plazmiđima i kultivisane su nekoliko dana. Kondicionirani međijumi trodnevne kulture su naneti na BIAcore senzorske čipove (Pharmacia Biotcch AB, Uppsala, Svveden) koji su obloženi sa solubilnim CD8()Ig ili CD86Ig. Specifično vezivanje i disocijacija proteina mutanata je mereno rezonancijom površinskih plazmona (O'Shannessv, D.J., i sar., 1997Anal. Biochem.212:457-468). Svi eksperimenti su urađeni na BIAcore™ ili BIAcore 2000™ biosenzorima na temperaturi od 25°C. Ligandi su imobilisani na NCM5 senzorskim čipovima (Pharmacia), čistoće za istraživanja (research grade), standarnim kuplovanjem sa N-etil-N'-(dimetilaminopropil) karbodiimid N-hidroksisukcinimidom (Johnsson. B., i sar., (1991) Anal. Bioshem. 198:268-277: Khilko. S.N., isar., (1993) J. Biol. Chem. 268:15425-15434).
Metod za pretraživanje i selekciju ( screening)
COS ćelije koje se kultivišu u ploči za kultivaciju sa 24 bunarića, su kratkotrajno transfektovane sa mutiranim CTLAIg. 3 dana kasnije su prikupljeni medijumi u kojima su bile kultivisane ćelije. Ovako kondicionirani medijumi sadrže rastvorni mutirani CTLA4Ig molekul.
Kondicionirani medijum iz kulture COS ćelija je propušten preko BIAcore senzorskih čipova, koji su modifikovani sa CD86Ig ili sa CD80Ig (na način kako je to opisano u radu Greene i sar., 1996 J. Biol. Chem.. 271:26762-26771), i mutirani molekuli su identitikovani na osnovu brzina disocijacije: pozitivno je selektovan onaj mutantni oblik koji ima brzinu disocijacije manju od wild-type CTLA4Ig mlekula. DNK koje odgovaraju selektovanim uzorcima medijuma su sekvencionirane i pripremljena je veća količina DNK da bi prešli na preparativno kultivisanje COS ćelija i njihovu transfekciju, kako bi iz ovih kultura izolovati mutirani CTLA4Ig protein prečišćavanjem medijuma u kom su kultivisani transfektanti, na proteinu A.
BIAcore analiza i analiza podataka iz eksperimenata kojima je mereno ravnotežno vezivanje, su vršene kako je opisano u radu J. Greene i sar.,1996./. Biol. Chem.271:26762-26771 i u U.S. patentnoj prijavi sa serijskim br. 09/579,927. i 60/214.065, koji su u ovom tekstu pomenuti referencom.
Analiza BIAcore podataka
Osnovna linija senzorgrama je standardizovana kao nula jedinica odgovora (RU) pre analize. Uzorci su pušteni preko šam-mođifikovanih protočnih ćelija da bi odredili background RU vrednosti; background se javlja usled velikih razlika u refraktivnom indeksu, jer se refraktivni indeks menja od rastvora do rastvora. Ravnotežne konstante disocijacije (Kd) se izračunavaju iz grafika zavisnostiRcqod C, gde je R^ odgovor u steady-state minus odgovor šam-modifikovanog čipa. a C je molarna koncentracija analita. Krive kojima je grafički predstavljeno vezivanje su analizirane uz pomoć komercionalnog softvera (Prism. GraphPAD Softvvare).
Eksperimentalni podaci su prvo fitovani da odgovaraju modelu za vezivanje jednog Uganda za jedan receptor (model vezivanja sa l mestom, tj.. prost langmurov sistem, A+B<-*AB), i ravnotežne kostante asocijacije (Kd=[A],[B]\ [AB]) su izračunate iz jednačine R=RIIWX* C/(Kd+C). Zatim su podaci fitovani u najjednostavniji model vezivanja liganda na dva mesta (tj., za receptor koji ima dva međusobno neinteragujuća mesta za vezivanje liganda, što opisuje jednačina R=Rmaxi' C/(K<u+C)+ RmuX2 • C7(K<j2+C).
Analiza koliko dobro fituju dobijeni podaci u ova dva modela je izvršena vizuelno, poređenjem sa eksperimentalnim podacima i statistički, korišćenjem F testa suma kvadrata. Najbolje je odgovarao jednostavniji model vezivanja zajedno mesto i ovaj model je i izabran, ukoliko model sa dva mesta vezivanja nije značajno bolje odgovarao (p<0,l).
Analize asocijacije i disocijacije su vršene korišćenjem BIA evaluation Softvvare (Pharmacia). Konstante brzine asocijacije konsu izračunate na dva načina, uzimajući u obzir obe homogene interakcije sa jednim mestom na jednom receptom i paralelne interakcije sa dva mesta na receptom odjednom. Za interakcije sa jednim mestom, konvrednosti se izračunavaju prema jednačini Rt=Req( 1 -exp"Mt"Ul)), gde je Rt odgovor u datom vremenu, t; Req je odgovor u steady-state ravnotežnom stanju; to je vreme na početku injiciranja; i ks=dR/dt=kon • Ck0lr, gde je C koncentracija analita, preračunato u smislu monomernih vezivnih mesta. Za interakcije sa dva mesta na receptom, vrednosti kl)nse izračunavaju prema jednačini Rt=Rt;qi(l-exp"<kslu>"<l>",)+ Req2(l-exp"<ks2>(<t>"<tu>)). Za svaki model, vrednosti konse određuju iz izračunatog nagiba prave (do oko 70% maksimalne asocijacije) na grafiku koji prikazuje zavisnost ksod C.
Podaci dobijeni mernjem disocijacije su analizirani za model vezivanja na jednom mestu (AB=A+B) ili za model vezivanja na dva mesta (AiBj=Ai+Bj); konstante brzina se izračunavaju iz krivih koje najbolje odgovaraju. Uglavnom se koristi model vezivnog mesta izuzev ako su ostaci veći od backgrounda koji pravi aparat (2-10 RU, prema aparatu). U tom slučaju se koristi model sa dva vezivna mesta. Poluvremena zauzetosti receptora se izračunavaju na osnovu zavisnosti ti/?-0,693/koif.
Protočna citometrija
Mišja monoklonska antitela (mAt) L307.4 (anti-CD80) je kupljeno od Becton Dickinson (San Jose, California) i 1T2.2 (anti-B7.0 [poznat i kao CD86] ). od Pharmingena (San Diego. California). Za detektovanje CD80-pozitivnih i/ili CD86-pozitivnih CHO ćelija metodom imunohemijskog bojenja, CHO ćelije su prikupjene iz boca za gajenje ćelija inkubiranjem u PBS-u (phosphate-buffered ssaline) sa lOmM EDTA. Suspenzija CHO ćelija (1-10 x 103) je prvo inkubirana sa mAt ili sa proteinom koji je produkt fuzije sa imunoglobuliunskim molekulom u DMEM sa 10% fetalnim goveđim serumom (fetal bovine serum-FBS), ćelije su zatim isprane i inkubirane sa kozjim anti-mišjim ili anti-humanim imunoglobulinima koji su konjugovani sa fluorescein-izotiocijanatom (Tago. Burlingame, California). PO isteku druge inkubacije, ćelije su ponovo isprane i analizirane na FACScan (Becton Dickinson).
SDS- PAGE i molekulsko prosejavanje ( frontalna hromatografija)
SDS-PAGE je urađena na Tris/glicin 4-20% akrilamidnim gelovima (Novex. San Diego, CA). Analitički gelovi su obojeni sa Coomassie Blue bojom, i slike vlažnih gelova su ovekovečene digitalnim skeniranjem. CTLA4Ig (25 u«) i L104EA29YIg (25 u,g) su analizirane molekulskim prosejavanjem na TSK-GEL G300 SW\ikoloni (7.8 x 30 mm,Tosohaas, Montgomervville, PA) i kolona je ekvilibrisana u PBS-u sa 0.02%NaN3, pri brzini protoka 1, Omi/min.
CTLA4Xrn<is i I.104EA29YX,ros
Jednolančani molekul CTLA4Xo2osje dobijen kao stoje opisano ranije (Linslev i sar., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Ukratko, za matricu je uzet plazmid, onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4), uzvodni (sens) prajmer. GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTG TACTGCTCACACAG je odabran tako da odgovara sekvencama u vektoru: a nizvodni (antisens) prajmer GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC da se uklapa u poslednjih sedam aminokiselina (aminokiseline od 118 do 124) u ekstracelulamom domenu CTLA4, i sadrži mesto na koje specifično deluju restrikcioni enzimi i stop kodon (TGA). Nizvodni prajmer ima specifičnu mutaciju označenu kao C120S
(serin umesto cisteina na poziciji 120). Detaljnije, nukleotidna sekvenca GCA (nukleotidi 34-36) nizvodnog prajmera, gore navedenog, je zamenjena sa jednom od sledećih: AGA. GGA. TGA, CGA, ACT. ili GCT. Ljudima koji su stručni u ovoj oblasti odmah će pasti u oči. da je GCA kodon komplementaran sa TGC (čita se od 5' ka 3' kraju pa su ove dve nukleotidne sekvence inverzno komplementarne) sekvencom, koja kodira cistein. Isto tako nukleotidne sekvence AGA, GGA, TGA, CGA, ACT ili GCT su reversno komplementarne kodonima za serin. Proizvodi lančane reakcije polimcraze su razgrađeni rcstrikcionim enzimimaHind\\\ IXba\i subklonirani u vektor za ekspresiju jcLN (Bristol-Myers Squibb Companv, Princeton, NJ). L104EA29YXci2os je dobijen na identičan način. Svaki konstruisani vektor za ekspresiju je potvrđen sekvencioniranjem vektorske DNK.
Identifikacija i biohemijska karakterizacija mutanata sa visokim aviditetom
Za mutagenezu je odabrano 24 aminokiselina; tako je dobijeno -2300 proteina mutanata koji su testirani za reakciju vezivanja za CD86Ig, metodom određivanja rezonancije sa površinskim plazmonom (SPR; kao što je opisano, u tekstu iznad). Predominantni efekti mutageneze su sumirani u tabeli II, u daljem tekstu. Nasumična mutageneza nekoliko aminokiselina u CDR-1 regionu (S25-R33) očigledno nije uticalo na vezivanje liganda. Mutageneza E31 i R33 i ostataka M97-Y102 je dovela do slabijeg vezivanja liganda. Mutagenezom ostataka S25, A29 i T30, K93, L96, Y103, L104 i G105 su dobijeni proteini sa smanjenom brzinom vezivanja i/ili otpuštanja liganda. Ovi rezultati su potvrdili rezultate prethodnih istraživanja, da su ostaci u CDR-1 (S25-R33) regionu i ostaci u blizini ili u samom segmentu M97-Y102, značajni i utiču na vezivanje liganda (Peach i sar., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).
Mutagenezom na mestima S25, T30, K93, L96, Y103 i G105, dobijeni su proteini mutanti koji imaju manju brzinu otpuštanja pri interakciji sa CD86Ig. Međutim u ovim slučajevima spora disocijacija je kompromitovana sporim vezivanem što je rezultovalo đa proteini mutanti imaju približno isti aviditiet prema CD86Ig kao i CTLA4 nemutirani (wild-type) protein. Šta više. mutageneza K93 dovodi do jake agregacije, što može da objasni zapažene promene u kinetici vezivanja za CD86Ig molekul.
LI04 molekul je podvrgnut nasumičnoj mutagenezi. da bi potom COS ćelije bile transfektovane mutantnim varijantama ovog molekula. Prikupljeni su uzorci medijuma u kojima su transfektovane ćelije bile kultivisane, i izvršena je selekcija na imobilizovanim CD86Ig. Izdvojeno je šest uzoraka medijuma koji sadrže mutirane proteine koji imaju priblližno 2 puta manju brzinu disocijacije u odnosu na nemutirani CTLA4. Kada je određena sekvenca odgovarajuće cDNK odabranih mutanata, nađeno je da svaki mutant sadrži mutaciju u sekvenci za leucin zamenjenu sekvencom koja kodira glutaminsku kiselinu (L104E). Zanimljivo je da substitucija leucina 104 sa asparaginskom kiselinom (L104D) nije uticala na vezivanje za CD86Ig.
Mutageneza proteina je ponovljena na svakom mestu iz tabele II, ali ovog puta koristeći sekvencu sa mutacijom L104E kao matricu za PCR, umesto nemutiranog, wilđ-type, CTLA4Ig molekula kako je to gore opisano. SPR analizom, ponovo na imobilizovanim CD86Ig, je identifikovano šest uzoraka medijuma u kojima su kultivisane ćelije koje eksprimiraju mutirane proteine sa mutagenezom na alaninu 29, koji imaju približno 4 puta manje brzine disocijacije u odnosu na nemutirani, wilđ-type, CTLA4Ig. Dva najsporija mutant-proteina su imala substitucije tirozinom (L104EA29Y), dva leucinom (L104EA29L), jedan triptofanom (L104EA29W) i jedan treoninom (L104EA29T). Očigledno, kada se nasumično mutira samo alanin, ne dobijaju se mutanti sa sporijom disocijacijom u odnosu na nemutirani. wilđ-type, CTLA4Ig.
SDS-PAGE elektroforezom i frontalnom hromatogratijom određena je relativna molekulska masa i stanje agregacije prečišćenih L104E i L104EA29YIg. L104EA29YIg (~lp.g; pozicija 3 na gelu) i L104EI« (~lug: pozicija 2 na gelu) imaju istu elktroforetsku pokretljivost kao i CTLA4Ig (~lug; pozicija 1 na gelu) pod ređukujućim uslovima (~50kDa; +2-merkaptoetanol) i pod neredukujućim uslovima (~100kDa; -2-ME) (slika 25A). Frontalnom hromatogratijom je pokazano da L104EA29YIg (slika 25C) ima istu pokretljivost kao i dimerni CTLA4Ig (slika 25B). Najveći pikovi predstavljaju dimerni oblik proteina, dok manji pik koji se brže eluira (slika 25B) predstavlja agregate veće molekulske mase. Približno 5.0% CTLA4Ig je prisutno u obliku agregata koji ima veću molekulsku masu, ali ništa nije ukazivalo na to da L104EIg i L104EA29Ylg formiraju agregate. U tom smislu jače vezivanje L104Elg i L104EA29YIg za CD86Ig nije moglo biti posledica agregacije izazvane mutagenezom.
Analiza termodinamike i kinetike vezivanja
Analiza termodinamike i kinetike vezivanja CTLA4Ig, L104EIg i L104EA29Ylg, koji su prethodno prečišćeni na proteinu A. je izvršena peko rezonancije površinskog plazmona (SPR). Rezultati ove analize su prikazani u tabeli 1, u daljem tekstu. Ravnotežne konstante disocijacije (Kd; tabela 1) su izračunate na osnovu krivih zavisnosti vezivanja od koncentracije, u opsegu koncentracija 5.0-200nM. Vezivanje L104EA29Ylg za CD86Ig je jače od L104EIg ili CTLA4Ig. L104EA29YIg ima manju vrednost Kd(3.21 nM) od L104EIg (6,06 nM) ili od CTLA4Ig (13.9 nM), što ukazuje na veći aviditet vezivanja L104EA29Ylg za CD86Ig u odnosu na ostale pomenute varijante CD86Ig-liganda. L104EA29YIg ima manju vrednost Kd(3,66 nM) od L104EIg (4.47 nM) ili od CTLA4Ig (6,51 nM), što ukazuje na veći aviditet vezivanja L104EA29Ylg za CD80Ig.
Analiza kinetike vezivanja je pokazala da su komparativne brzine asocijacije u reakciji vezivanja CTLA4Ig, L104EIg i L104EA29YIg za CD80Ig međusobno slične, što je slučaj i sa brzinama asocijacije u reakciji vezivanja za CD86Ig (tabela I). Međutim, brzine disocijacije u reakciji vezivanja nisu ekvivalentne (tabela I). U poređenju sa CTLA4Ig. Ll()4EA29Ylg ima približno 2 puta manju brzinu disocijacije u reakciji vezivanja CD80Ig i približno 4 puta manju reakciju disocijacije u reakciji vezivanja CD86Ig. Vrednosti brzine disocijacije Ll()4EIg se nalaze između L104EA29YIg i CTLA4Ig. Budući da uvođenje ovih mutacija nije hitnije uticalo na brzine asocijacije, povećanje aviditeta L104EA29YIg prema CD80Ig i CD861g. je po svoj prilici posledica smanjenja brzina disocijacije.
Da bi odredili da li je do povećanja aviditeta L104EA29YIg prema Cd86Ig i CD80Ig, došlo usleđ mutacija koje deluju na proces asocijacije monomera u dimer, ili su pak ove mutacije uvele strukturne promene. koje su uslovile povećanje aviditeta na nivou monomera, napravljeni su jenolančani molekuli od ekstracelularnih domena CTLA4Ig i L104EA29YIg; zatim je izvršena mutageneza cisteina 120 u serin, kao što je opisano gore, i u radu Linslev i sar.. (1995) J. Biol. Chem.. 270:15417-15424 (84). Pre nego što su njihove karaktristike vezivanja liganda analizirane pomoću SPR, za prečišćene proteine CTLA4X</i2osi L104EA29YXci2os je pokazano da su monomerni, metodom "gel permeation chromatographv" (Linslev i sar., (1995), gore opisano). Rezultati su pokazali da je afinitet vezivnja i jednog i drugog monomernog proteina za CD86Ig približno 35-80 puta manji od afiniteta dimernih oblika ovih proteina (tabela I). Ovaj rezultat ide u prilog objavljenim podacima, kojima je ustanovljeno da je dimerizacija CTLA4 neophodna za vezivanje liganda sa visokim aviditetom (Greene i sar., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).
L104EA29YXci2osse vezuje kako za CD80Ig tako i za CD86Ig sa 2 puta većim afinitetom u poređenju sa CTLA4Xci2os- Afinitet je povećan zato što je brzina disocijacije u reakciji vezivanja za oba liganda približno 3 puta manja. Dakle, nađeno je da mutant L104EA29Y jače vezuje ligand i smatra se da je to posledica strukturnih promena koje su dovele do povećanja aviditeta, ali zbog toga što je svaki monomerni lanac struktuno izmenjen a ne zbog promena u načinu na koji molekuli dimerizuju.
Pložaj i strukturna analiza mutacij a koje povećavaju aviditet
Struktura ekstracelularnog domena CTLA4 sa strukturnim motivom IgV, u rastvoru, je nedavno određena NMR spektroskopijom (Metzle i sar., (1997) Nature Struct. Biol.. 4:527-531). Tako je bilo moguće tačno odrediti položaj Ieucina 104 i alanina 29 u trodimenzionalnoj strukturi proteinskog molekula (slika 26 prikazi levo i desno). Leucin 104 je smešten u blizini veoma konzervirane aminokiselinske sekvence MYPPPY. Alanin 29 je smešten u blizini C-kraja CDR-1 regiona (S25-R33). koji je prostorno u neposrednoj blizini MYPPPY regiona. Dok ostaci u bazi ova dva regiona značajno interaguju međusobno, između LI04 i A29 ne postoji direktna interakcija, iako oba ostatka pripadaju hidrofobnom jezgru proteina. Strukturnie promene koje su posledica mutacije u dva mutanta kod kojih je povećan aviditet, određene su i opisane proučavanjem modela. Mutacija A29Y se može lako smestiti u usek između CDR-1 (S25-R33) i MYPPPY regiona, i moguće je da ova promena stabilizuje konformaciju MYPPPY regiona. Kod nemutiranog, wild-type, CTLA4. LI04 ostvaruje znatne hiđrofobne interakcije sa L96 i V94 u blizini MYPPPY regiona. Malo je verovatno da mutirani protein sa mutacijom u glutaminsku kiselinu na ovoj poziciji zauzima konformaciju LI04 u nemutiranom proteinu, iz dva razloga. Prvo, nema dovoljno prostora đa bi se smestio dugački bočni ostatak glutamata, a da ne dođe do značajnijeg narušavanja strukture u CDR-1 (S25-R33 regionu). Drugo, energetski nije povoljno pohraniti negativno naelektrisani bočni ostatak glutaminske kiseline u hidrofobni džep. Umesto da poprimi istu konformaciju, proučavanja uz pomoć modela, predviđaju da bočni ostatak glutaminske kiseline iskoči na površinu molekula, gde se njegovo naelektrisanje stabilizuje solvatacijom. Napon koji uvodi ovakva konformaciona promena može lako da se rastereti sa G105. što uvodi minimum izvrtanja ostataka u drugim delovima regiona.
Vezivanje mutanata sa velikim aviditetom za CHO ćelije koje eksprimiraj u CD80 ili CD86
Vezivanje CTLA4Ig i mutiranih molekula za stabilno transfektovane CD80+ i CD86+ CHO ćelije, je analizirano na FACS aparatu (slika 27) kao što je ovde opisano. CD80-pozitivne i CD86-pozitivne CHO ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama CTLA41g, L104EA29YIg ili Ll()4EIg, i zatim su isprane. Vezani imunoglobulinski fuzioni proteini su detektovani sa kozjim anti-humanim imunoglobulinima koji su konjugovani fluoresecin izotiocijanatom.
Slika 27 prikazuje CD80-pozitivne ili Cd86-pozitivne CHO ćelije (1.5x10°) koje su 2h inkubirane sa različitim koncentracijama CTLA4Ig (zatvoreni kvadrati), L104EA29Ylg (kružići) ili L104EIg (trouglići), na 23° C, ćelije su isprane i inkubirane sa kozjim anti-humanim Ig antitelom koje je konjugovano sa fluorescein-izotiocijanatom. Analizirano je vezivanje na 5000 vijabilnih ćelija (jednostruko određivanje) na FACScan i izmeren je srednji intenzitet tluorescence (MFI) dobijenih histograma korišćenjem PC-LYSYS. Rezultati su korigovani za nespecifičnu fluorescencu, koja je merena na ćelijama koje su inkubirane samo sa reagensom iz drugog koraka (MFI=7). Sa kontrolnim antitelom L6 mAt (80 p.g/ml) izmereno je MFI<30. Ovi rezultati su reprezentativni za četiri različita eksperimenta.
Vezivanje L104EA29YIg, L104EIg i CTLA4Ig za humane CD80-transfektovane CHO ćelije je približno ekvivalentno (slika 27A). Ll04EA29YIg i L104Elg vezuju jače CHO ćelije koje su stabilno transfektovane sa humanim CD86 u poređenju sa CTLA4Ig (slika27B).
Funkcionalni testovi:
Humane CD4-pozitivne T ćelije su izolovane negativnim imunomagnetnim sortiranjem (Linslev i sar., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Izolovane CD4-pozitivne T ćelije su stimulisane torbo 1 miristat acetatom (PMA) plus CD80-pozitivne ili CD86-pozitivne CHO ćelije u prisustvu titrirajućih koncentracija inhibitora. CD4-pozitivne T ćelije (8-10 x!04 ) su kultivisane u prisustvu lnM PMA. sa ili bez ozračenih CHO ćelija stimulatora. Proliferativni odgovor je meren dodavanjem radioaktivnog [3H] timidina, 1 uCi/bunariću. u toku poslednjih 7 sati 72-časovne kulture. Uzorci u kojima je merena inhibicija proliferacije su bili sledeći: T ćelije stimulisane sa PMA plus CDS80-pozitivne CHO ćelije, ili CD86-pozitivne CHO ćelije kojima su dodati potencijalni inhibitori L104EA29Ylg i CTLA41g. Rezultati su prikazani na slici 28. L104EA29YIg inhibira proliferaciju CD80-pozitivnih PMA tretiranih CHO ćelija u većoj meri od CTLA4Ig (slika 28A). L104EA29YIg je takođe efikasniji od CTLA41g u inhibiciji proliferacije CD86-pozitivnih PMA tretiranih CHO ćelija (slika 28B). Zbog toga je L104EA29YIg potentniji inhibitor kostimulacije T ćelija i preko CD80 i preko CD86 molekula.
Na slici 29 je prikazana inhibicija alogeno stimulisanih humanih T ćelija, pripremljenih na gore opisan način, sa L104EA29YIg i CTLA4Ig„ i dalje alogeno stimulisanih sa ćelijskom linjom humanog B limfoblastoma (LCL), označene kao PM. koje eksprimiraju CD80 i CD86 (T ćelije 3xl0<4>/bunariću i PM 8xl0<J>/bunariću). Primarna alogena stimulacija je trajala 6 dana. a onda su ćelije pulsirane sa<J>H-timidinom, 7 sati pre merenja inkorporacije radioaktivnosti.
Sekundarna alogena stimulacija je ostvarena na sledeći način: T ćelije koje su prethodno 7 dana alogeno stimulisane su prikupljene preko medijuma za separaciju limfocita (LSM-lymphocyte separation medium) (ICN, Aurora, OH) i ostavljene da miruju 24h. Zatim su T ćelije restimulisane (sekundarna stimulacija), u prisustvu titrirajućih količina L104EA29YIg ili CTLA4Ig, dodavanjem PM u istom odnosu kao i gore. Stimulacija je trajala 3 dana. onda su ćelije pulsirane sa radioaktivno obeleženim timidinom i prikupljene kao što je gore navedeno. Efekat L104EA29YIg na primarno alogeno stimulisane T ćelije je prikazan na slici 29A. Efekat Ll04EA29YIg na sekundarno alogeno stimulisane T ćelije je prikazan na slici 29B. Ll04EA29YIg inhibira kako primarni, tako i sekundarni T ćelijski proliferativni odgovor snažnije u odnosu na CTLA4Ig.
Da bi odredili produkciju citokina (slika 30) postavljene su ploče sa sekundarno alogeno stimulisanim kulturama, u duplikatu. Posle 3 dana ko-kultivacije medijumi iz kultura su testirani sa ELISA kitom (Biosource, Camarillo. CA) pod uslovima preporučenim od strane proizvođača. Rezultati ovih testova pokazuju da L104EA29YIg potentnije blokira produkciju citokina 1L-2, IL-4 i -v-IFN, od strane T ćelija, nakon sekundarne alogene stimulacije (slike 30A-C).
Efekti L104EA29YIg i CTLA4Ig na mešani limfocitni odgovor (MLR-mixed lymphocyte response) sa majmunskim limfocitima su prikazani na slici 31. Mononukleari iz periferne krvi (PBMC'S; 3.5xl0<4>ćelija/bunariću od svakog majmuna) od dva majmuna su purifikovani preko medijuma za separaciju limfocita (LSM) i dodat im je fitohemaglutinin (PHA) 2ug/ml. Ćelije su stimulisane 3 dana. a zatim im je dodat radioaktivni timidin 16 sati pre prikupljanja ćelija. LI 04EA29YIg bolje inhibira proliferaciju majmunskih T ćelija u odnosu na CTLA4Ig.
PRIMER 3
Sledi opis faze II-klinička ispitivanja urađena na pacijentima koji su tretirani sa rastvornim oblikom mutiranog CTLA4 molekula koji se označava kao L104EA29YIg (takođe poznat kao LEA29Y ili LEA) ili sa CTLA4Ig, sa ciljem da se umanji bar jedan simptom od niza simptoma vezanih za reumatoidni artritis: oticanje zgobova. osetljivost zglobova, zapaljenje, jutarnja ukočenost i bolovi. U ovim istraživanjima je upotrebljen molekul CTLA4Ig koji na + 1 poziciji ima metionin (ili alanin na poziciji -1) i završava sa lizinom na poziciji +357, što se može primetiti na slici 24. DNK koja kodira izvođenje moekula CTLA4Ig je deponovan kao ATCC 68629. Molekul L104EA29YIg koji je u ovim istraživanjima korišćen, počinje sa metioninom na poziciji +1 (ili sa alaninom na poziciji -1) i završava sa lizinom na poziciji +357, što se vidi na slici 19. DNK koja kodira embođiment molekula L104EA29YIg je deponovan kao ATCC PTA2104.
U daljem tekstu biće opisan protokol davanja L104EA29YIg i CTLA4Ig humanim pacijentima, da bi im umanjili bar jedan biološki surogatni marker reumatoidnog artritisa, uključujući i smanjenje brzine sedimentacije eritrocita i nivoe C-reaktivnog proteina i/ili IL-2 receptora u serumu.
Grupe pacijenata
U istraživanju je učestvovalo ukupno 214 pacijenata, od kojih je bilo 54 muškarca i 160 žena (slike 1A, 1B). Pacijenti prikazani na osnovnoj liniji su imali prosečno trajanje bolesti od 3,4 (±2,0) godine i uzimali su bez znakova oporavka bar jedan antireumatik koji modifikuje bolest (DMARD-Disease Modifving Antirheumatic Drug). Dopušteno je uzimanje stabilnih nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAIDS-Nonsteroidal Anti-inllammatory Drugs) ili steroida (<<>10 mg/dan), a zabranjeno je paralelno uzimanje DMARD lekova. Pacijenti su nasumično raspoređeni u grupe od 25 do 32 pacijenta po grupi koja prima određeni tretman. Trideset dva pacijenta su primila placebo, 92 je primilo L104EA29YIg i 90 je primilo CTLA4Ig. Pacijenti kod kojih je protokol sproveden u potpunosti i koji nisu prekidali tretman pre 57. dana, su primili ukupno 4 intravenske infuzije, po jednu infuziju na dan, dana 1,15, 29 i 57. Stanje svih pacijenata je bilo procenjeno dana 1,15, 29, 43, 57, 71 i 85. Primali su doze od 0.5, 2,0 ili 10,0 mg/kg L104EA29YIg (koji je označen kao LEA.5, LEA2 i LEA10, koji su odgovarajućim redosledom prikazani na slici 1A-1E) ili CTLA4Ig (koji je označen kao CTLA.5, CTLA2 i CTLA10, koji su odgovarajućim redosledom prikazani na slici 1A-IE).
Kod svih pacijenata je obraćena pažnja na pojavu peri-infuzionih tegoba i opšte sigurnosti; pacijenti su popunjavali upitnik u kom su nabrojana moguće tegobe koje se mogu javiti kad se lek daje intravenski, u roku od 24 sata nakon infuzije. Osim toga pacijenti su bili dodatno podsticani da upišu u izveštaj svako neprijatno iskustvo vezano za tretman. Rutinski je praćena biohemija krvi i hematološka slika kod pacijenata, tj., određivan je nivo medijatora inflamatornog odgovora, kao što su citokini (TNF, IL-6), triptaza i komplement u uzorcima pacijenata. Primarni cilj je bio da se odredi koji deo ispitanika zadovoljava kriterijum ACR-20 85.dana od početka tretmana.
Skladištenje materijala za testiranje
Substance L104EA29YIg i CTLA4Ig su pakovane u staklenim bočicama-vajlama za jednokratnu upotrebu, CTLA4Ig po 200 mg/vajli ili L104EA29Ylg po 100 mg/vajli. Za infuziju CTLA4Ig i L104EA29YIg su razblaženi do finalne koncentracije od 25 mg/ml u sterilnoj vodi za injekcije (SWFI-sterile vvater for injection).
Protokol tretmana ispitivanom supstancom
Sve infuzije su date intravenski tokom 1 h (slike 1-17). Svi ispitanici su primili najmanje po jednu infuziju ispitivanog leka.
Grupa 1 : 32 pacijenta, placebo koji odgovara CTLA4Ig ili L104EA29YIg
Grupa 2 : 26 pacijenata; CTLA4Ig u dozi od 0,5 mg/kg.
Grupa 3 : 32 pacijenta; CTLA4Ig u dozi od 2,0 mg/kg.
Grupa 4 : 32 pacijenta; CTLA4Ig u dozi od 10,0 mg/kg.
Grupa 5 : 32 pacijenta; L104EA29YIg u dozi od 0,5 mg/kg.
Grupa 6 : 29 pacijenta; L104EA29YIg u dozi od 2,0 mg/kg.
Grupa 7:31 pacijent; L104EA29YIg u dozi od 10,0 mg/kg.
Kliničko praćenje
Kod pacijenata su praćeni osnovni simptomi koji se javljaju kod obolelih, pre primanja bilo kakve infuzije. Pod ovim osnovnim simptomima se podrazumevaju: oticanje zglobova, osetljivost zglobova, zapaljenje, jutarnja ukočenost, kako pacijentova tako i lekareva procena aktivnosti bolesti i invalidnost procenjena na osnovu Health Questionarire Assesment-HAQ. koja je na slici 1C prikazana kao skor fizičkih funkcija koje je pacijent u stanju da obavlja, i bol (slike od 1A dolD). Osim toga, osnovne procene su obuhvatile i brzinu sedimentacije eritrocita (ESR) i nivo C-reaktivnog proteina (CRP) i solubilnog receptora za IL-2 u serumu.
Proučavanje kliničkog odgovora je zasnovano na kriterijumima koje je ustanovio Američki koledž za reumatologiju (ACR-American College of Rheumatologv). Ispitanik ispunjava kriterijum ACR20 ako je kod njega došlo do 20% poboljšanja u osetljivim i bolnim zglobovima i 20% poboljšanja u 3 od 5 preostalih posmatranih simptoma, kao što su opšti utisak pacijenta i lekara o promenama zdravstvenog stanja pacijenta, bol, invalidnost i jedan reaktant akutne faze (Felson, D. T., i sar., 1993Arthritis and Rheumatism36:729-740; Felson, D. T., i sar.,1995 Arthritis and Rheumatism38:1-9)
Biomarkeri
Potencijalni biomarkeri aktivnosti bolesti (reumatoidni faktor, CRP. ESR. rastvorljivi IL-2R, rastvorljivi ICAM-1, rastvorljivi E-selektin i MMP-3) su takođe određivani. Za određivanje koncentracija IL-2sRa. sICAM-1, sE-selektin i MMP-3 u serumu korišćeni su imunoenzimski testovi (EIA-enzyme immunoassay). Nivo TNFa i IL-6 je određen pre davanja infuzije i 2 sata posle, ukoliko je bilo potrebno.
Nivo IL-2sRa, sICAM-1 i sE-selektina je meren sa komecionalno dostupnim kolorimetrijskim EIA kitovima koje proizvodi R&D Svstems. INC. (Minneapolis, MN). Opsezi koncentracija za kvantifikaciju odgovarajuće supstance su sledeći: 312-12000pg/ml, 40907 ng/ml i 10-206 ng/ml. Inter-test koeficijent varijacije ima odgovarajuće vrednnosti: 4,48-8.4%, 3.8-5,0% i 5,5-9,0%. Prema uputstvu proizvođača kita za kvantifikaciju, normalne vrednosti koncentracija u serumu se kreću u opsegu 676-2132 pg/ml, respektivno.
Koncentracija MMP-3 je merena sa komercijalno dostupnim EIA kitom koji prodaje Amesham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Opseg za kvantifikaciju je 30-7680 ng/ml. Inter-test koeficijent varijacije ima vrednosti 6,3-10,6%. Prema uputstvu proizvođača normalne vrednosti u serumu se kreću između 28-99ng/ml.
Nivo IL-6 i TNFa je određen sa komercionalno dostupnim hemiluminescentnim EIA kitovima kupljenim od R&D Systems. Inc. (Minneapolis, MN). Opseg za kvantifikaciju je 0,3-3000 pg/ml, odnosno 0,7-7000 pg/ml. Inter-test koeficijent varijacije se kreće od 3.1-5,7%, odnosno 6.4-20,7%. Prema uputstvu proizvođača normalne vrednosti u serumu iznose
<0,3-12 pg/ml, odnosno <0.7-7,5 pg/ml.
Testiranje antitela
Prikupljeni su uzorci seruma da bi u njima odredili prisustvo antitela koja su specifična za lek pre davanja prve doze, dana 1, i približno 15, 29. 57, 85 i 169 dana. Usled visokog titra antitela specifičnih za imunoglobulinski deo molekula koji je postojao i pre prve doze leka, pribeglo se određivanju titra antitela specifičnih za molekule CTLA4Ig i LEA29Y modifikovane tako da im nedostaju konstantni Ig regioni.
Immulon II ELIISA ploče sa 96 bunarića (Dynex, Chantilly, Virginia) su obložene sa CTLA4Ig, CTLA4Ig bez Ig konstantnog regiona, LEA29Y ili LEA29Y bez Ig konstantnog regiona pri odgovarajućim koncentracijama od 2, 4, 2 ili 1 ug/ml u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS-phosphate buffered saline), i inkubirane preko noći na 2-8° C. Ploče se ispiraju sa PBS koji sadrži 0.05% Tvveen 20 i blokiraju se 1 sat na 37° C sa PBS koji sadrži 1% goveđi albumin iz seruma (BSA-bovine serum albumin). Ploče se ispiraju i u odgovarajuće bunariće se dodaju serumi za testiranje u serijskim razblaženjima ili serumi za standardizaciju (QC-quality control) i inkubiraju se 2 sata na 37" C. Serumi su razblaženi 3 puta u PBS-u sa 0,25% BSA i 0.05% Tvveen 20 počinjući od razblaženja 1:10. Ploče su isprane i dodat je koktel antitela, kozji anti-humani kapa i lambda Ig konjugovani sa alkalnom fosfatazom (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). Posle inkubacije od 1 h na 37° C, ploče su isprane i u svaki bunarić je dodato 1 mg/ml para-nitrofenil-fosfata u dietanolaminskom puferu. Po isteku 30 minuta na 25° C reakcija je zaustavljena dodavanjem 3N NaOH i merena je apsorbanca (na dve talasne dužine: 405 nm i 550 nm). Rezultati su izraženi kao "endpoint" titar (EPT), koji je definisan kao recipročna vrednost najvećeg razblaženja koje je dalo pet puta veću ili jednaku vrednost apsorbance u odnosu na srednju apsorbancu background-a ploče. Background ploče je određen kao apsorbanca koja je izmerena u odsustvu seruma. Vrednosti su smatrane pozitivne za serokonverziju ukoliko su bile najmanje 2 serijska razblaženja (9 puta) ili više, veće u odnosu na EPT vrednosti pre davanja doze. Serumski QC (quality control) uzorci koji su pozitivni za CTLA4Ig- ili LEA29Y-specifična antitela su produkovani iz imunizovanih majmuna. Alikvot odgovarajućeg QC uzorka je testiran u svakom analitičkom merenju. Rezultati analitičkih merenja se prihvataju samo ukoliko su QC uzorci u okviru kriterijuma prihvatljivosti testa.
Rezultati
U svim dozama davanja, CTLA4I« i L104EA29YIg se dobro tolerišu. Tegobe koje se kod pacijenata javljaju pri infuziji se ne razlikuju od grupe do grupe, osim glavobolje. Glavobolja kao deo odgovora pacijenta na tretman je 85. dana bila dozno zavisno povećana, tj., 23%, 44% i 53% kod CTLA4Ig tretiranih pacijenata, i 34%, 45% i 61% kod L104EA29YIg tretiranih pacijenata; odgovarajuće doze su 0,5, 2.0 i 10,0 mg/kg. Međutim, i kod pacijenata koji su primili placebo 31% je imalo glavobolje.
Slika 2 prikazuje procenat pacijenata koji su prekinuli tretman i istupili iz kliničkog ispitivanja zbog napada artritisa i drugih tegoba. Mnogo je veći procenat pacijenata koji su primali placebo i koji su morali da prekinu tretman zbog napada artritisa. Pacijenti iz grupe koja je primala CTLA4Ig su u manjoj meri prekidali trertman, i to utoliko manje što je doza leka bila veća. Samo je nekoliko pacijenata koji su primali L104EA29YIg prekinulo tretman. Rezultati ukazuju na dobar inverzni dozno-zavisan odgovor sa CTLA4Ig i bolji terapeutski odgovor kod pacijenata koji su primali L104EA29YIg terapiju.
Slika 3A prikazuje ACR-20, -50 i -70 odgovore pacijenata koji su tretirani sa CTLA4Ig, L104EA29YIg ili placebo, 85, dana. Slično tome, slike 3B i C opisuju ACR-20 modgovore sa 95% ograničenom pouzdanošću. Može se izvesti zaključak da su odgovori dozno zavisni, sa jasnim i značajnim odgovorom pri dozi od 10 mg/kg telesne težine pacijenata.
Slike 4A i B prikazuju procenat pacijenata sa smanjenom otečenošću zglobova i ublaženom osetljivošću zglobova u poređenju sa pacijentima koji nisu pokazali nikakav odgovor na tretman sa CTLA41g, L104EA29YIg ili placebo. Može se zaključiti da su terapeutski odgovori dozno zavisni. Kod većeg procenta pacijenata uočeno je poboljšanje stanja od 20, 50, 70, pa čak i 100% u grupama koje su primale dozu od 2 i 10 mg/kg, za oba ispitivana produkta.
Na slikama 5A, B, C i D prikazanje procenat pacijenata kod kojih je umanjen bol, aktivnost bolesti po proceni pacijenta i lekara, srednja vrednost jedinica skora. tretiranih sa CTLA4Ig, L104EA29YIg ili placebo.Može se zaključiti da je terapeutski odgovor po Likertovoj skali, dozno zavisan u korist grupa sa aktivnim tretmanom u odnosu na placebo tretirane grupe, 85. dana. Likertova skala je vrednosna skala verbalnog procenjivanja pri čemu se služimo pridevima da bi rangirali simptome (The American College of Rheumatologv Preliminarv Ćore Set of Disease Activitv Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740).
Slike 6A i B prikazuju ocene utvrđene aktivnosti bolesti od strane pacijenta i lekara, koje se razlikuju najmanje za 2 jedinice od bazne linije i posledica su tretmana sa CTLA4Ig, L104EA29YIg ili placebo.Može se zaključiti da su odgovori dozno zavisili, sa zapaženiijim oporavkom kod tretmana sa većim dozama aktivnih lekova.
Slike 7A i B prikazuju procenat smanjenja nivoa C-reaktivnog proteina (CRP-C-reactive protein) kod pacijenata koji su tretirani sa CTLA4Ig, L104EA29Ylg ili placebo. Može se zaključiti da su odgovori dozno zavisni sa jasnim smanjenjem kod grupa koje su primale aktivne supstance, u dozama od 2 i 10 mg/kg. Dalje na slici 7B se vidi da su razlike prilično značajne u poređenju sa placebo, sa 95% ograničenom pouzdanošću. Slika 7C prikazuje promene u razlikama nivoa u serumu u odnosu na baznu liniju, 85. dana .
Slika 8 prikazuje količinu solubilnog IL-2 receptora u serumu pacijenata tretiranih sa CTLA4Ig, L104EA29YIg ili placebo. Može se zaključiti daje smanjenje nivoa solubilnog IL-2 dozno zavisno.
Slika 33 prikazuje količinu solubilnog ICAM-1 i solubilnog E-selektina u serumu kod pacijenata tretiranih sa CTLA4Ig, L104EA29Ylg ili placebo. Može se zaključiti da je smanjenje mivoa solubilnog ICAM-1 i E-selektina dozno zavisno.
Slike 9A i B prikazuju medijanu i srednju vrednost bodova za vrednovanje osetljivosti zglobova kod pacijenata koji su tretirani sa CTLA4Ig ili placebo tokom određenog vremenskog intervala. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjena osetljivost zglobova) izgleda da je mnogo značajnija kod grupa koje su tretirane sa dozama os 2 i 10 mg/kg aktivne supstance. u poređenju sa placebo ili sa grupama koje su primale 0,5 mg/kg. Slike 10 A i B prikazuju medijane i srednje vrednosti bodova kojima se procenjuje otečenost zglobova kod pacijenata tretiranih sa CTLA4Ig ili placebo. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjena otečenost zglobova) izgleda da je mnogo značajnija kod grupa koje su tretirane sa dozama od 2 i 10 mg/kg aktivne supstance, u poređenju sa placebo ili sa grupama koje su primale 0,5 mg/kg.
Na slici 11 je prikazana srednja vrednost skorova ustanovljenog bola u određenom vremenskom periodu, kod pacijenata tretiranih sa CTLA4Ig ili placebo. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjen bol) izgleda daje mnogo značajnija kod grupa koje su tretirane sa dozama od 2 i 10 mg/kg aktivne supstance, u poređenju sa placebo ili sa grupama koje su primale 0,5 mg/kg.
Slike 12 A i B srednje vrednosti skorova aktivnosti bolesti koju utvrđuju pacijent ili lekar, kod pacijenata tretiranih sa CTLA4Ig ili placebo, u određenom vremenskom periodu. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjena aktivnost bolesti) izgleda daje mnogo značajnija kod grupa koje su tretirane sa dozama od 2 i 10 mg/kg aktivne supstance, u poređenju sa placebo ili sa grupama koje su primale 0,5 mg/kg.
Slike 13A i B prikazuju medijanu i srednju vrednost bodova za vrednovanje osetljivosti zglobova kod pacijenata koji su tretirani sa L104EA29YIg (označava se kao LEA na slikama) ili placebo tokom određenog vremenskog intervala. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjena osetljivost zglobova) izgleda daje dozno zavisna.
Slike 14 A i B prikazuju medijane i srednje vrednosti bodova kojima se procenjuje otečenost zglobova kod pacijenata tretiranih sa L104EA29YIg (označava se kao LEA na slikama) ili placebo. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjena otečenost zglobova) izgleda daje mnogo značajnija kod grupa koje su tretirane sa dozama od 2 i 10 mg/kg aktivne supstance, u poređenju sa placebo ili sa grupama koje su primale 0,5 mg/kg.
Na slici 15 je prikazana srednja vrednost skorova ustanovljenog bola u određenom vremenskom periodu, kod pacijenata tretiranih sa L104EA29YIg (označava se kao LEA na slikama) ili placebo. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjen bol) izgleda da ima doznu zavisnost.
Slike 16 A i B srednje vrednosti skorova aktivnosti bolesti koju utvrđuju pacijent ili lekar, kod pacijenata tretiranih sa L104EA29YIg (označava se kao LEA na slikama) ili placebo, u određenom vremenskom periodu. Promena u odnosu na baznu liniju (npr., smanjena aktivnost bolesti) izgleda da ima doznu zavisnost.
Procenat oporavka fizičke hendikepiranosti je ustanovljen kroz HAQ, 85 .dana kod pacijenata koji su tretirani sa CTLA4Ig, L104EA29YIg ili placebo, i prikazanje na slici 17 (Health Assessment Ouestionnaire (HAQ); Fries, J. F., i sar., 1982 ./.of Rheumatology9:789-793). Postoji jasna dozna zavisnost oporavka od ovog parametra.
Promene nivoa solubilnog IL-2r i C-reaktivnog proteina u odnosu na baznu liniju su dozno zavisni u obe trtetirane grupe pacijenata. Posle tretmana nivoi solubilnog IL-2r su bili -2%, - 10% i -22% za CTLA4Ig i -4%, -18% i -32% za L104EA29YIg, za odgovarajuće doze 0,5, 2.0 i 10,0 mg/kg respektivno, u poređenju sa +3% kod placebo tretirane grupe. Nivoi C-reaktivnog proteina su bili +12%, -15% i -32% za CTLA4Ig i +47%, -33% i -47% za L104EA29YIg, za odgovarajuće doze 0.5, 2,0 i 10,0 mg/kg respektivno, u poređenju sa +20% kod placebo tretirane grupe (slika 7A).
Nisu zapažene nikakve klinički značajne promene u rezultatima rutinskih hematoloških testova, biohemijskih testova sa izuzetkom blage supresije u nivou IgA i IgG pri većim dozama oba leka, fizičkog stanja ili drugih vitalnih znakova. Treba primetiti da ni jedan preparat nije indukovao antitela specifična za lek.
Primer 4
U primerima koji slede, opisana je laza II kliničkog istraživanja na humanim pacijentima koji će primiti L104EA29YIg da bi umanjili ili predupredili strukturna oštećenja, uključujući eroziju kostiju i zglobova, koristeći vrednosne radiografske mere. Ovaj oporavak u vidu smanjenja ili sprečavanja strukturnih oštećenja, se prati uporedo sa kliničkim oporavkom koji se određuje na osnovu kliničkih parametara.
Status strukture kostiju se prati kod nekih pacijenata pre tretmana sa CTLA4Ig ili L104EA29YIg; Ovi pacijenti primaju između 0,5 i 20 mg/kg CTLA4Ig ili L104EA29YIg intenzivno svake dve do dvanaest nedelja (pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim sredstvima) kako bi održali njihov terapeutski učinak tokom vremena. Radiografski snimci šake i stopala pacijenata su urađeni u vremenskim intervalima koji su bili prethodno definisani: na 6 meseci i posle na godinu dana, po preporuci FDA uputstva. Ovi pacijenti su praćeni tokom perioda posle 6 i 12 meseci da bi utvrdili da li tretman sa CTLA4Ig ili L104EA29YIg usporava progresiju propadanja kostiju, a posle jedanput godišnje. Pacijenti su praćeni radografskim metodama, uključujući Rentdgenske zrake i/ili magnetnu rezonancu (MRJ-magnetic resonance imagigng), po standardnom protokolu (Larsen, A. K. i M. Eek 1977Acta Radiol. Diag.18:481-491; Sharp, J. T., i sar., 1985Arthritis and Rheumatism28:1326-1335). Na osnovu snimaka koji su prikupljeni radiografskim metodama, je ocenjivana prevencija strukturnog oštećenja, kao i usporavanje progresije erozije kostiju i oštećenja hrskavice, sa suženjem prostora zgloba i/ili prevencije novih erozija.

Claims (23)

1. Upotreba rastvorljivog CTLA4 fuzionog molekula koji sadrži ekstracelularni domen CTLA4 molekula, gde ekstracelularni domen CTLA4 molekula sadrži amino kiseline prikazane na Slici 23, koji počinje sa metioninom na položaju +1 ili sa alaninom na položaju -1 i završava sa asparaginskom kiselinom na položaju 124, u proizvodnji farmaceutske smeše za lečenje subjekta koji ima reumatoidni artritis, gde subjekt neuspešno tretiran najmanje jednim antireumatskim lekom koji modifikuje bolest.
2. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 1, naznačena time što je antireumatski lek koji modifikuje bolest: metotreksat, ciklofosfonamid, azatioprin, ciklosporin A ili, blokator ili antagonist tumor nekrozis faktora alfa (TNFa).
3. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, za umanjivanje simptoma reumatoidnog artritisa.
4. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 3, naznačena time što je simptom izdvojen iz grupe, koja se sastoji od: oticanja zglobova, osetljivosti zglobova, inflamacije, jutarnje ukočenosti i bola.
5. Upotreba, kao u ma kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je farmaceutska smeša za primenjivanje rastvorljivog CTLA4 fuzionog molekula subjektu, u količini od 10 mg/kg težine.
6. Upotreba rastvorljivog CTLA4 fuzionog molekula koji sadrži ekstracelularni domen CTLA4 molekula, gde ekstracelularni domen CTLA4 molekula sadrži amino kiseline prikazane na Slici 23, koji počinje sa metioninom na položaju +1 ili sa alaninom na položaju -1 i završava sa asparaginskom kiselinom na položaju 124, u proizvodnji farmaceutske smeše za umanjivanje ili sprečavanje strukturnog oštećenja kod subjekta koji ima reumatsku bolest.
7. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 6, naznačena time što je strukturno oštećenje erozija kosti ili zgloba.
8. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 6 ili 7, naznačena time što farmaceutska smeša služi za primenu rastvorljivog CTLA4 fuzionog molekula subjektu, u količini između 0.5 i 20 mg/kg težine.
9. Upotreba prvog i drugog sredstva, gde a) prvo sredstvo je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul koji sadrži ekstracelularni domen CTLA4 molekula, gde ekstracelularni domen CTLA4 molekula sadrži amino kiseline prikazane na Slici 23, koji je sa metioninom na poziciji +1 ili sa alaninom na poziciji -1 i, koji se završava sa asparaginskom kiselinom na poziciji 124, i b) drugo sredstvo je odabrano iz grupe, koja se sastoji od kortikosteroida, nesteroidnih anti-inflamatornih lekova, prednizona, azatioprina, metotreksata, blokatora ili antagonista TNFa, hidroksihlorohina, sulfasalazina, soli zlata, anakinra, ciklofosfamida i leflunomida, u proizvodnji farmaceutske smeše za lečenje reumatične bolesti.
10. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 9, naznačena time što je blokator ili antagonist TNFa infliksimab ili etanercept.
11. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 9 ili 10, naznačena time što je farmaceutska smeša za uzastopno ili istovremeno primenjivanje prvog i drugog sredstva.
12. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 6 ili 9, gde je reumatska bolest izdvojena od: reumatoidnog artritisa, polimiozitisa, skleroderme, mešane bolesti vezivnog tkiva, upalnog reumatizma, degenerativnog reumatizma, reumatizma izvan članaka, bolesti kolagena, hroničnog poliartritisa, artropatske psorijaze, ankiloznog spondilitisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, nodoznog panarteritisa, sistemskog lupusa eritematozusa, progresivne sistemske skleroderme, humeroskapularnog periartritisa, artritisa uratika, hondrokalcinoze, dermatomiozitisa, mišićnog reumatizma, miozitisa i miogeloze.
13. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 6 ili 9, naznačena time što je reumatska bolest reumatoidni artritis.
14. Upotreba, kao u ma kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul sadrži konstantni region imunoglobulina ili njegov deo.
15. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 14, naznačena time što je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul CTLA4lg.
16. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 15, naznačena time što je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul CTLA4lg, prikazan na Slici 24, koji ima sekvencu koja započinje sa metioninom na položaju +1 ili sa alaninom na položaju -1 i koja se završava lizinom na položaju +357.
17. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 15, naznačena time što je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul CTLA4lg kojeg kodira molekul nukleinske kiseline označen sa ATCC No. 68629.
18. Farmaceutska smeša, koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i efektivnu količinu prvog sredstva i drugog sredstva, naznačena time što a) prvo sredstvo je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul koji sadrži ekstracelularni domen CTLA4 molekula, gde ekstracelularni domen CTLA4 molekula sadrži amino kiseline prikazane na Slici 23, koji je sa metioninom na poziciji +1 ili sa alaninom na poziciji -1 i, koji se završava sa asparaginskom kiselinom na poziciji 124, i b) drugo sredstvo je odabrano iz grupe, koja se sastoji od kortikosteroida, nesteroidnih anti-inflamatornih lekova, prednizona, azatioprina, metotreksata, blokatora ili antagonista TNFa, hidroksihlorohina, sulfasalazina, soli zlata, anakinra, ciklofosfamida i leflunomida.
19. Farmaceutska smeša, kao u patentnom zahtevu 17, naznačena time što je blokator ili antagonist TNFa infliksimab ili etanercept.
20. Farmaceutska smeša, kao u patentnom zahtevu 18 ili 19, naznačena time što rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul sadrži konstantni region imunoglobulina ili njegov deo.
21. Farmaceutska smeša, kao u patentnom zahtevu 20, naznačena time što je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul CTLA4lg.
22. Farmaceutska smeša, kao u patentnom zahtevu 21, naznačena time što je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul CTLA4lg, koji je prikazan na Slici 24, koji ima sekvencu koja počinje sa metioninom na položaju +1 ili sa alaninom na položaju -1 i, koji se završava lizinom na položaju +357.
23. Farmaceutska smeša, kao u patentnom zahtevu 21, naznačena time što je rastvorljivi CTLA4 fuzioni molekul CTLA4lg, koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline označene sa ATCC No. 68629.
YUP-1011/02A 2000-07-03 2001-07-02 Rastvorljivi ctla4 molekul za upotrebu u lečenju reumatskih bolesti RS50811B (sr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21591300P 2000-07-03 2000-07-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU101102A YU101102A (sh) 2006-01-16
RS50811B true RS50811B (sr) 2010-08-31

Family

ID=22804919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-1011/02A RS50811B (sr) 2000-07-03 2001-07-02 Rastvorljivi ctla4 molekul za upotrebu u lečenju reumatskih bolesti

Country Status (38)

Country Link
US (1) US7455835B2 (sr)
EP (4) EP1372696B1 (sr)
JP (1) JP2004517806A (sr)
KR (3) KR100895552B1 (sr)
CN (1) CN1318086C (sr)
AR (2) AR035037A1 (sr)
AT (1) ATE401909T1 (sr)
AU (2) AU2001273174B2 (sr)
BG (2) BG66024B1 (sr)
BR (1) BR0112104A (sr)
CA (2) CA2413190C (sr)
CY (3) CY1109786T1 (sr)
CZ (1) CZ303959B6 (sr)
DE (1) DE60135029D1 (sr)
DK (2) DK1935427T3 (sr)
EE (1) EE05378B1 (sr)
ES (2) ES2310557T3 (sr)
HR (1) HRP20030071B1 (sr)
HU (3) HU227669B1 (sr)
IL (2) IL153593A0 (sr)
IS (1) IS2834B (sr)
LT (2) LT1935427T (sr)
LV (1) LV12993B (sr)
MX (1) MXPA02012603A (sr)
MY (1) MY137552A (sr)
NO (3) NO20026264L (sr)
PE (1) PE20020772A1 (sr)
PL (2) PL212205B1 (sr)
PT (2) PT1935427T (sr)
RS (1) RS50811B (sr)
RU (1) RU2287340C2 (sr)
SI (3) SI1935427T1 (sr)
SK (1) SK287940B6 (sr)
TR (1) TR201807700T4 (sr)
TW (2) TWI311564B (sr)
UY (1) UY26815A1 (sr)
WO (1) WO2002002638A2 (sr)
ZA (1) ZA200210058B (sr)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6887471B1 (en) * 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
JP4751493B2 (ja) * 1996-03-20 2011-08-17 ブリストル−マイヤーズ スクイッブ カンパニー Ｇｐ３９／ｃｄ４０およびｃｔｌａ４／ｃｄ２８／ｂ７経路のブロックによって免疫反応を阻止する方法およびそれに使用する組成物
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
EP3029062A1 (en) * 2000-05-26 2016-06-08 Bristol-Myers Squibb Company Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof
IL152316A0 (en) * 2000-06-09 2003-05-29 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and kits for treating transplant rejection
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
CA2413190C (en) * 2000-07-03 2009-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
HUP0303930A3 (en) * 2001-01-26 2012-09-28 Univ Emory Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
ATE390931T1 (de) 2001-05-23 2008-04-15 Bristol Myers Squibb Co Verfahren zum schützen eines allogenen inseltransplantats mit löslichen ctla4- mutationsmolekülen
AU2003243152A1 (en) * 2002-04-19 2003-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid
KR101088223B1 (ko) * 2002-12-23 2011-11-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 단백질 생산을 위한 포유류 세포 배양 방법에서의 생산물품질 향상
BR0317723A (pt) * 2002-12-23 2005-11-22 Bristol Myers Squibb Co Processo de cultura de células de mamìfero para a produção de proteìna
AU2003299971A1 (en) 2002-12-30 2004-07-29 Amgen Inc. Combination therapy with co-stimulatory factors
EP1670499A4 (en) 2003-08-04 2009-07-22 Bristol Myers Squibb Co METHODS OF TREATING A CARDIOVASCULAR DISEASE USING A SOLUBLE CTLA4 MOLECULE
CA2543484C (en) 2003-10-27 2014-02-04 Amgen Inc. Modulation of immune response to an immunogen with ctla-4 and tnfbp
US7815765B2 (en) * 2004-04-01 2010-10-19 Swei Mu Wang Method for forming laminated synthetic leather
TWI423986B (zh) 2005-12-20 2014-01-21 必治妥美雅史谷比公司 組合物及製造組合物之方法
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
CA2634547C (en) 2005-12-20 2016-10-11 Bristol-Myers Squibb Company Stable ctla4 formulation for subcutaneous administration
US7528111B2 (en) 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
AU2012202324B2 (en) * 2007-11-01 2014-08-28 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
DK2222697T3 (da) * 2007-11-01 2013-03-11 Perseid Therapeutics Llc Immunsuppressive polypeptider og nukleinsyrer
AU2014250683B2 (en) * 2007-11-01 2015-11-26 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
ES2615861T3 (es) * 2008-10-30 2017-06-08 Yeda Research And Development Company Ltd. Células T de memoria central anti-terceros, métodos de producción de las mismas y uso de las mismas en trasplante y tratamiento de enfermedades
CA2921304C (en) 2009-07-30 2018-06-05 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN102030828B (zh) * 2009-09-25 2014-10-29 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体
PL2536745T3 (pl) 2010-02-19 2017-01-31 Xencor, Inc. Nowe immunoadhezyny CTLA4-IG
WO2011113019A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Abbott Biotherapeutics Corp. Ctla4 proteins and their uses
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
JP2013540731A (ja) 2010-09-08 2013-11-07 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 安定かつ長期間の生着のための免疫抑制薬物組合せ
CN105907713A (zh) 2010-09-08 2016-08-31 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
WO2013010537A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
EP2753351B1 (en) 2011-09-08 2017-06-21 Yeda Research and Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN113138279A (zh) 2012-06-27 2021-07-20 法姆制药有限责任公司 融合蛋白组合物的应用
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014151230A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating granulomatosis with polyangiitis
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
KR20160145789A (ko) * 2014-04-25 2016-12-20 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 초기 ra를 갖는 대상체에서의 무약물 완화를 달성하기 위한 ctla4 화합물의 용도
EP3283508B1 (en) 2015-04-17 2021-03-17 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
US11179448B2 (en) 2015-07-16 2021-11-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory T cells and use of same in immunotherapy
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
EP3443000B1 (en) 2016-04-15 2025-11-12 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
IL268126B2 (en) 2017-01-18 2024-02-01 Yeda Res & Dev Genetically engineered Veto cells and their uses in immunotherapy
KR102813968B1 (ko) 2017-10-10 2025-05-29 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
MX2020004540A (es) 2017-10-18 2020-08-03 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras de ligando icos variante y composiciones y metodos relacionados.
EP3735417A1 (en) 2018-01-03 2020-11-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
WO2019175380A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175384A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
US20210023209A1 (en) 2018-03-16 2021-01-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
JP7645185B2 (ja) 2019-01-15 2025-03-13 アンスティチュート、ナシオナル、ドゥ、ラ、サンテ、エ、ドゥ、ラ、ルシェルシュ、メディカル 変異したインターロイキン－３４（ｉｌ－３４）ポリペプチドおよび治療におけるその使用
JP2025016812A (ja) * 2021-12-16 2025-02-05 レグセル株式会社 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644792A (en) * 1899-09-14 1900-03-06 Stanhope Boal Heater.
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3424893A1 (de) 1984-07-06 1986-02-06 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Photographisches silberhalogenidaufzeichnungsmaterial
IL92382A (en) * 1988-11-23 1994-12-29 Univ Michigan Use of a ligand specific for CD28 in the manufacture of medicament
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US7070776B1 (en) * 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
DK0606217T4 (da) 1991-06-27 2009-03-30 Bristol Myers Squibb Co CTL4-receptor, fusionsproteiner indeholdende den samt anvendelse deraf
US5624823A (en) * 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
AU684461B2 (en) 1992-04-07 1997-12-18 Regents Of The University Of Michigan, The CD28 pathway immunoregulation
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
DK0700430T3 (da) 1993-06-04 2005-08-15 Us Navy Fremgangsmåder til selektivt af stimulere proliferation af T-celler
WO1994028912A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Cd28 pathway immunosuppression
EP0721346B1 (en) 1993-09-02 1998-06-10 Trustees of Dartmouth College Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance
CN1142765A (zh) * 1993-12-01 1997-02-12 三共株式会社 以聚戊二烯基衍生物作为有效成分的炎症性细胞素产生抑制剂
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
AU1333195A (en) 1994-06-03 1996-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
CA2191733A1 (en) * 1994-06-07 1995-12-21 Daniel A. Vallera Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
US5634055A (en) * 1994-09-27 1997-05-27 Bidplus, Inc. Method for selecting assignments
WO1996014865A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Repligen Corporation Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5993800A (en) * 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
JP4751493B2 (ja) * 1996-03-20 2011-08-17 ブリストル−マイヤーズ スクイッブ カンパニー Ｇｐ３９／ｃｄ４０およびｃｔｌａ４／ｃｄ２８／ｂ７経路のブロックによって免疫反応を阻止する方法およびそれに使用する組成物
JPH1067653A (ja) * 1996-06-17 1998-03-10 Eisai Co Ltd 関節疾患治療剤
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
AU748533B2 (en) 1997-06-11 2002-06-06 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy, The Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive T lymphocyte mediated immune responses
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
US6797269B2 (en) * 1998-04-03 2004-09-28 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells as immunosuppressants
EP1082124A1 (en) * 1998-06-05 2001-03-14 Supergen, Inc. Compositions comprising methotrexate and pentostatin for treating rheumatoid arthritis
JP2000086519A (ja) * 1998-09-17 2000-03-28 Mitsui Chemicals Inc 抗リウマチ薬効果増強剤
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
US6040292A (en) * 1999-06-04 2000-03-21 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating diabetes
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
AU2001264936A1 (en) 2000-05-23 2001-12-03 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
EP3029062A1 (en) 2000-05-26 2016-06-08 Bristol-Myers Squibb Company Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
IL152316A0 (en) * 2000-06-09 2003-05-29 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and kits for treating transplant rejection
CA2413190C (en) * 2000-07-03 2009-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
HUP0303930A3 (en) * 2001-01-26 2012-09-28 Univ Emory Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
ATE390931T1 (de) * 2001-05-23 2008-04-15 Bristol Myers Squibb Co Verfahren zum schützen eines allogenen inseltransplantats mit löslichen ctla4- mutationsmolekülen

Also Published As

Publication number Publication date
CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
EP1935427A2 (en) 2008-06-25
EP1372696B1 (en) 2008-07-23
HUP0301727A2 (hu) 2003-09-29
EP1935427B1 (en) 2018-03-07
HU227669B1 (en) 2011-11-28
NO20026264D0 (no) 2002-12-27
WO2002002638A2 (en) 2002-01-10
EE200300004A (et) 2004-10-15
CA2413190A1 (en) 2002-01-10
KR20080025216A (ko) 2008-03-19
HUS1000008I1 (hu) 2019-06-28
TR201807700T4 (tr) 2018-06-21
PL365942A1 (en) 2005-01-24
TW200902546A (en) 2009-01-16
ZA200210058B (en) 2005-02-23
MY137552A (en) 2009-02-27
DK1935427T3 (en) 2018-06-06
ES2310557T3 (es) 2009-01-16
HU226847B1 (en) 2009-12-28
RU2287340C2 (ru) 2006-11-20
AU2001273174C1 (en) 2002-01-14
EP2281568A2 (en) 2011-02-09
LT5063B (lt) 2003-11-25
AU2001273174B2 (en) 2006-05-18
HUP0301727A3 (en) 2008-08-28
ES2667203T3 (es) 2018-05-10
SI1372696T1 (sl) 2008-12-31
UY26815A1 (es) 2002-01-31
LT2003002A (en) 2003-07-25
NO20100579L (no) 2003-02-19
DK1372696T3 (da) 2008-11-03
CY2008017I1 (el) 2009-11-04
NO20026264L (no) 2003-02-19
BG110611A (bg) 2010-05-31
CN1477968A (zh) 2004-02-25
WO2002002638A3 (en) 2003-10-30
SI1935427T1 (en) 2018-05-31
LT1935427T (lt) 2018-05-10
AU7317401A (en) 2002-01-14
PE20020772A1 (es) 2002-09-06
SK17742002A3 (sk) 2004-11-03
PT1372696E (pt) 2008-10-24
US7455835B2 (en) 2008-11-25
CN1318086C (zh) 2007-05-30
CA2630062C (en) 2014-10-14
TWI322153B (en) 2010-03-21
IS2834B (is) 2013-05-15
BR0112104A (pt) 2004-07-20
BG107362A (bg) 2003-09-30
AR066511A2 (es) 2009-08-26
HRP20030071A2 (en) 2005-02-28
PT1935427T (pt) 2018-05-16
EP1935427A3 (en) 2011-05-25
KR20080075564A (ko) 2008-08-18
IL153593A0 (en) 2003-07-06
AR035037A1 (es) 2004-04-14
EP1372696A2 (en) 2004-01-02
PL207534B1 (pl) 2010-12-31
HRP20030071B1 (hr) 2014-01-03
KR100895552B1 (ko) 2009-04-29
IL153593A (en) 2009-09-01
CY2008017I2 (el) 2016-08-31
SK287940B6 (sk) 2012-05-03
YU101102A (sh) 2006-01-16
CY1120577T1 (el) 2019-07-10
EP2281568A3 (en) 2013-04-24
CA2630062A1 (en) 2002-01-10
ATE401909T1 (de) 2008-08-15
EP3384924A1 (en) 2018-10-10
SI21078A (sl) 2003-06-30
NO20100580L (no) 2003-02-19
CY1109786T1 (el) 2011-04-06
US20030083246A1 (en) 2003-05-01
EE05378B1 (et) 2011-02-15
CA2413190C (en) 2009-04-07
JP2004517806A (ja) 2004-06-17
KR100864120B1 (ko) 2008-10-16
PL212205B1 (pl) 2012-08-31
TWI311564B (en) 2009-07-01
HK1058486A1 (en) 2004-05-21
MXPA02012603A (es) 2003-05-14
CZ303959B6 (cs) 2013-07-17
DE60135029D1 (de) 2008-09-04
BG66024B1 (bg) 2010-11-30
BG66454B1 (bg) 2014-10-31
IS6667A (is) 2003-01-02
KR20030017606A (ko) 2003-03-03
LV12993B (en) 2003-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1935427B1 (en) Uses of soluble CTLA4 mutant molecules
AU2001263466C1 (en) Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
AU2001273174A1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule
EP1496931A1 (en) Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid
HK1120221B (en) Uses of soluble ctla4 mutant molecules
HK1120221A (en) Uses of soluble ctla4 mutant molecules
HK1262138A1 (en) Uses of soluble ctla4 mutant molecules
HK1153945A (en) Uses of soluble ctla4 mutant molecules
BG107210A (bg) Разтворими ctla4 мутантни молекули и тяхното използване
HK1058486B (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule