RS20130234A1

RS20130234A1 - Terapijsko humano anti-il-1r1 monoklonsko antitelo

Info

Publication number: RS20130234A1
Application number: RS20130234A
Authority: RS
Inventors: Frank Martin; Haichun Huang; Chris Vezina; Alison Witte; Xueming Qian; Gary Elliott; Brian Varnum
Original assignee: Medarex Inc.; Amgen Inc.
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2014-02-28
Also published as: CA2824167A1; US20140039164A1; CN104178491A; KR101317045B1; JP2006517179A; EA018072B1; EP2213685B1; NZ605429A; NO20151100L; TW200716676A; EP1572946A2; EA033750B1; JP4317817B2; AU2008207483A1; CN100471871C; PT1572946E; ZA200501792B; IL198420A; SG2013096847A1; JP2009040781A

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na antitela za receptor tipa 1 interleukina-1 (IL-1R1) koja se specifično vezuju za polipeptid iz sekvence čiji je ID br: 76.

Description

TERAPIJSKOHUMANOANTI-IL-1R1 MONOKLONSKO ANTITELO

Patentna prijava predmatnog pronalaska se odnosi i zahteva prioritet od U.S. privremene patentne prijave serijski broj 60/408,719, kojaje podneta 06. 09. 2002., čiji je opis ovde inkorporiran po referenci.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja se vezuju za protein receptora tipa 1 interleukina-1 (IL-1R1). Takođe, obezbeđeni su preparati, posebno farmaceutski preparati i postupci lečenja oboljenja koja su posredovana sa IL-1, kao što su reumatoidni artritis, osteoartitis i druga infiamatorna oboljenja.

Pozadina pronalaska

Dobijanje antitela

Inflamacija predstavlja odgovor tela na povrede nastale mehaničkim oštećenjem, infekcijom ili stimulacijom antigena. Inflamatorne reakcije su često patološke. Takva stanja nastaju kada se inflamacija javlja u preteranoj meri, kada je stimulisana na neodgovarajući način ili kada perzistira nakon uklanjanja agensa koji je naneo oštećenje.

Inflamatorni odgovor je posredovan između ostalog citokinima. Jedan od najpotentnijih inflamatornih citokina koji je do sada otkriven jeste interleukin-1 (IL-1). Pojačanje signala koje je izazvano sa IL-1 dovodi do perzistentne inflamacije koja je udružena sa nekoliko oboljenja, pri čemu se IL-1 smatra ključnim medijatorom u mnogim oboljenjima i medicinskim stanjima. Ovaj citokin se primarno proizvodi (mada ne i ekskluzivno) od strane ćelija makrofagne/monocitne linije i može da se nađe u dva oblika IL-1 alfa (IL-la) i IL-1 beta(IL-ip). IL-1 stimuliše ćelijske odgovore interakcijom sa heterodimernim receptornim kompleksom koji se sastoji od dva transmemranska proteina, od IL-1 receptora tipa 1 (IL-IRI) i od pomoćnog proteina IL-1 receptora (IL-IRAcP). IL-1 se prvo vezuje za IL-1R1; tek nakon toga se ovom kompleksu priključuje IL-IRAcP (Greenfeder et al, 1995, J. Biol. Chem. 270:13757 - 13765; Yoon i Dinarello, 1998, J. Immunobiology 160:3170 - 3179; Cullinana et al., 1998, J. Immunology 161:5614 - 5620), da bi potom usledilo prevođenje signala koje dovodi do indukcije ćelijskog odgovora.

Studije vezivanja koje uključuju ćelije sugerišu da IL-IRAcP stabilizuje IL-1R signalni kompleks, tako što usporava otpuštanje Uganda (Wesche et al., 1998, FEBS Letters 429:303 - 306). Dok je interakcija IL-1 sa IL-1R detaljno opisana, interakcija IL-IRAcP sa receptorom za koji je vezan ligand ostaje slabo definisana. Iako IL-IRAcP nema značajno jek afinitet ni za IL-1 ni za IL-1R1, već samo snažan afinitet za kompleks ova dva proteina, izgleda da se vezivanjem IL-1 sa IL-1R stvaraju nova vezna mesta za IL-IRAcP, što možda čak obuhvata i učešće IL-1 ostataka u ovom procesu (Ettorre et al., 1997, Eur. Cvtokine Netw. 8:161 - 171). Drugi molekul, antagonista IL-1 receptora (IL-lra) se nadmeće sa IL-la i IL-ip za vezivanje za receptor, ali ne uspeva da regrutuje IL-IRAcP, što dovodi do blokiranja receptora koji ne prevodi signal. Aktivnost IL-1 može dodatno da bude modifikovana posredstvom IL-1R tipa 2, lažnog receptora koji vezuje ligand, ali ne učestvuje u sprovođenju signala, zato što mu nedostaje intracelularni domen. IL-lra i IL-1R tipa 2, deluju tako da smanjuju ozbiljnost i trajanje inflamatornih procesa koji su posredovani sa IL-1 (Wesche et al., 1998, FEBS Letters 429:303 - 306; Dripps et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 10331 - 10336; Dripps et al, 1991, J. Biol. Chem. 266: 20331 - 20335).

Inhibitori interleukina-1 mogu da se proizvedu iz bilo kog proteina koji je sposoban da specifično spreči aktivaciju ćelijskih receptora za IL-1, pri čemu se u ovome mogu upotrebiti brojni mehanizmi. Navedeni mehanizmi obuhvataju smanjenje proizvodnje IL-1, vezivanje slobodnog IL-1, sprečavanjem vezivanja IL-1 za IL-1R, dejstvom na formiranje kompleksa IL-1R i IL-IRAcP, ili dejstvom na sprovođenje signala koji nastaje nakon vezivanja IL-1 za njegov receptor. Razlikujemo nekoliko klasa inhibitora IL-1: • antagonisti interleukin-1 receptora, kao što je IL-lra koji je opisan ispod; • anti-IL-lR monoklonska antitela (npr., opisana u objavljenoj evropskoj patentnoj prijavi broj EP 623674, čiji je opis ovde inkorporiran po referenci; • IL-1 vezujući proteini, kao što su rastvorljivi IL-1 receptori (npr., kao što je opisano u U.S. patentnim prijavama 5,492,888; 5,488,032; 5,464,937; 5,319,071 i 5,180,812; čiji je opis ovde inkorporiran po referenci); • anti-IL-1 monoklonska antitela (npr., opisana u međunarodim patentnim prijavama brojevi WO 9501997, WO9006371, U. S. patentnoj prijavi 4,935,343, EP 267611 i EP 220063, čiji je opis ovde inkorporiran prema referenci; • akcesorni proteini IL-1 receptora i za njih specifična antitela (npr., opisani u međunarodnim patentnim prijavama WO 96/23067 i WO 99/37773, čiji je opis ovde inkorporiran prema referenci); • inhibitori IL-1 P konvertujućeg enzima (ICE) ili kaspaze I (npr., kao što je opisano u međunarodnim patentnim prijavama WO 99/46248, WO 99/47545 i WO 99/47154, , čiji su opisi ovde inkorporirani prema referenci), koji mogu da se koriste za inhibiciju proizvodnje i sekrecije IL-lp;

• inhibitori interleukin-1 P proteaze; i

• druga jedinjenja i proteini kojiin vivoblokiraju sintezu ili ekstracelularno otpuštanje IL-1.

Primeri IL-1 inhibitora su opisani u sledećim referencama: U.S. patentne prijave 5,747,444; 5,359,032; 5,608,035; 5,843,905; 5,359,032; 5,866,576; 5,869,660; 5,869,315; 5,872,095; 5,955,480 i 5,965,564; međunarodnim patentnim prijavama WO 98/21957, WO 96/09323, WO 91/17184, WO 96/40907, WO 98/32733, WO 98/42325, WO 98/44940. WO 98/47892, WO 98/56377, WO 99/03837, WO 99/06426, WO 99/06042, WO 91/17249, WO 98/32733, WO 98/17661, WO 97/08174, WO 95/34326, WO 99/36426 i WO 99/36415; Evropskim patentim prijavam EP534987 i EP89479 i francuskoj patentnoj prijavi FR 2762514. Opisi svih ivh prijava su ovde inkorporirani prema referenci.

Antagonista receptora za interleukin-1 (IL-lra) je humani protein koji deluje kao prirodni inhibitor IL-1 i pripada porodici IL-1 proteina, koja obuhvata IL-la i IL-1 p. Poželjni antagonisti receptora (uključujući i IL-lra i njegove varijante i derivate), kao i postupci za njihovo dobijanje i korišćenje su opisani u U.S. patentoj prijavi 5,075,222; međunarodnim patentim prijavama EO 91/08285; WO 91/17184; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 97/28828 i WO 99/36541, australijskoj patentnoj prijavi AU 9173636 i francuskoj patentnoj prijavi FR 2706772; čiji su opisi ovde inkorporirani prema referenci. Proteini obuhvataju glikozilirane kao i ne glikozilirane oblike antagonista IL-1 receptora.

Specifično u U.S. patentu br. 5,075,222 (u daljem tekstu označenom kao patent "222") su opisane tri korisne forme IL-lra i njegovih varijanti. IL-lraa je opisan korišćenjem SDS-PAGE kao molekul mase 22-23 kD, čija je izoelektrična tačka otprilike 4,8, i koji je eluiran na Mono Q FPLC koloni sa oko 52 mM NaCl u Tris puferu, pH vrednost 7,6. IL-lraP je opisan kao protein mase 22-23 kD, koji je eluiran na Mono Q koloni sa 48 mM NaCl. Oba oblika proteina IL-lraa i IL-lraP su gliozilirani. IL-lrax je opisan kao protein mase 20 kD, koji je eluiran na Mono Q koloni sa 48 mM NaCl i koji nije glikoziliran. Patent '222 takođe opisuje postupke za izolovanje gena koji kodiraju inhibitore, postupke za kloniranje gena u odgovarajuće vektore i ćelijske tipove, kao i za ekspresiju gena u cilju proizvodnje inhibitora. Mada je efikasan IL-lra ima relativno kratak poluživot u plazmi. U postojećoj upotrebi IL-lra se primenjuje jednom dnevno. Stoga, u struci postoji potreba za antagonistom IL-1 receptora sa značajno dužim poluživotom u plazmi.

Sprečavanje prevođenja signala koji nastaje sa IL-1, tako što se sprečava vezivanje IL-1 za svoj receptor, predstavlja primamljiv terapijski pristup za lečenje oboljenja koja su posredovana sa IL-1. Posto je potreba za klinički efikasnim inhibitorima IL-1 signalnog puta koji mogu da ublaže efekte IL-1 posredovanih oboljenja i koji su pogodni za dopremanje u humani organizam. Humano antitelo koje blokira IL-1 signalni put bi bilo posebno poželjno u zadovoljavanju ove potrebe i trebalo bi da obezbedi duži poluživot antagoniste od poluživota trenutno dostupnog leka.

Suština pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela koja se vezuju za tip 1 receptora za interleukin-1 (IL-1R1). Poželjno, antitela inhibiraju IL-1 signalni put tako što se nadmeću sa IL-la i IL-1 p pri vezivanju za IL-1R1. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske linije hibridoma, koje proizvode, a najpoželjnije sekretuju u podlogu ćelijske kulture, monoklonska antitela, prema predmetnom pronalasku. Antitela, prema predmetnom pronalasku, uspešno blokiraju IL-1 signalni put u humanim ćelijama i stoga su korisna u lečenju paijenata koji su oboleli od oboljenja posredovanih sa IL-1. Predmetni pronalazak, dalje, obezbeđuje fuzione proteine koji sadrže sekvence Fc regiona antitela i jednu ili više sekvenci koje su izabrane iz grupe koju čine: sekvenca čiji je ID broj 10, sekvenca čiji je ID broj 12, sekvenca čiji je ID broj 14, sekvenca čiji je ID broj 16, sekvenca čiji je ID broj 18, sekvenca čiji je ID broj 20, sekvenca čiji je ID broj 22, sekvenca čiji je ID broj 24, sekvenca čiji je ID broj 26, sekvenca čiji je ID broj 28, sekvenca čiji je ID broj 30, sekvenca čiji je ID broj 32, sekvenca čiji je ID broj 34, sekvenca čiji je ID broj 36, sekvenca čiji je ID broj 38, sekvenca čiji je ID broj 40. Fuzioni proteini mogu da se dobiju korišćenjem postupaka koji su opisani, npr., u WO 00/24782, koji je ovde inkorporiran po referenci. Takvi molekuli mogu biti eksprimirani, npr., u ćelijama sisara (npr., u ćelijama jajnika kineskog hrčka) ili u bakterijskim žćelijama, (npr., E. Coli).

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, poželjno monoklonska antitela, najpoželjnije humana antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselnisku sekvencu čiji je ID broj 2, sekvencu čiji je ID broj 6, ili sekvencu čiji je ID broj 8 ili njihov antigen-vezujući fragment ili njihov imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, poželjno monoklonska antitela, najpoželjnije humana antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 4 ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, antitela, prema predmetnom pronalasku, sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 10, sekvencu čiji je ID broj 14 ili sekvencu čiji je ID broj 16, ili njihove antigen - vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente. U drugim rešenjima, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 12 ili 18 ili antigen vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ovih sekvenci. U dodatnim rešenjima, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 20, sekvencu čiji je ID broj 22, sekvencu čiji je ID broj 24; sekvencu čiji je ID broj 26; sekvencu čiji je ID broj 28; sekvencu čiji je ID broj 30; sekvencu čiji je ID broj 32; sekvencu čiji je ID broj 34; ili sekvencu čiji je ID broj 36, ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente ovih sekvenci. U daljim rešenjima, laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 38 ili 40, ili antigen - vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente ovih sekvenci. Takvi lanci antitela su korisni u dobijanju antitela koja se specifično vezuju za IL-1R1, kao i za dobijanje bispecifičnih antitela čiji se molekul vezuje za IL-1R1 i/ili za neki drugi ciljni molekul (npr., za receptor za TNF ili za TNF).

Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje antitela koja se speifično vezuju za IL-1R1 pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 10 ili antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ove sekvence, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 12 ili antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ove sekvence.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži prvi varijabilni region, gde prvi varijabilni region sadrži sekvencu koja je najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, a najpoželjnije oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 10 i gde laki lanac sadrži drugi varijabilni region pri čemu drugi varijabilni region sadrži sekvencu koja je najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, a najpoželjnije oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 12, pri čemu antitelo interaguje sa IL-1 Rl.

Predmetni pronalazak, dalje, obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za IL-1R1 pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 14 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 12 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži prvi varijabilni region, gde prvi varijabilni region sadrži sekvencu koja je najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, a najpoželjnije oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 14, i gde laki lanac sadrži drugi varijabilni region, pri čemu drugi varijabilni region sadrži sekvencu koja je 90%, poželjnije najmanje 95%, a najpoželjnije oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 12, pri čemu antitelo interaguje sa IL-1R1.

Predmetni pronalazak, dalje, obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za IL-1 Rl, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 16 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 18 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, koja se sastoje od teškog lanca i lakog lanca, pri čemu teški lanac sadrži prvi varijabilni region, a prvi varijabilni region sadrži sekvencu koja je 90%, poželjnije najmanje 95%, a najpoželjnije oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 16, a gde laki lanac sadrži drugi varijabilni region, pri čemu drugi varijabilni region sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 90%, poželjnije najmanje 95%, a najpoželjnije oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 18, pri čemu antitelo interaguje sa IL-1 Rl.

Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje antitela, koja se specifično vezuju za IL-IRI, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 20, sekvencu čiji je ID broj 22, sekvencu čiji je ID broj 24, sekvencu čiji je ID broj 26, sekvencu čiji je ID broj 28 ili sekvencu čiji je ID broj 30 ili antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ovih sekvenci, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 38 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

Predmetni pronalazak, dalje obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za IL-1 Rl, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 32, sekvencu čiji je ID broj 34 ili sekvencu čiji je ID broj 36, ili antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ovih sekvenci, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 40 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

Predmetni pronalazak, dalje, obezbeđuje rešenja za sve gore navedene slučajeve, pri čemu su obuhvaćena jednolančana antitela, jednolančana Fv antitela, Fab antitela, Fab' antitela i (Fab')2antitela.

U posebnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 38 ili sekvencu čiji je ID broj 40 ili antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ove sekvence.

Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 20, sekvencu čiji je ID broj 22, sekvencu čiji je ID broj 24, sekvencu čiji je ID broj 26, sekvencu čiji je ID broj 28, sekvencu čiji je ID broj 30, sekvencu čiji je ID broj 32, sekvencu čiji je ID broj 34, sekvencu čiji je ID broj 36, ili antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ovih sekvenci.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na izolovana humana antitela, koja se specifično vezuju za IL-1R1, gde antitelo sadrži: (a) okvirne regione humanog teškog lanca, CDR1 humanog teškog lanca, CDR2 region humanog teškog lanca i CDR3 region humanog teškog lanca; (b) okvirne regione humanog lakog lanca, CDR1 region humanog lakog lanca, CDR2, region humanog lakog lanca, CDR3 region humanog lakog lanca. U određenim rešenjima, CDR1 region humanog teškog lanca može biti CDR1 region teškog lanca 26F5, 27F2 ili 15C4, kao što je prikazano na Slici 10, a CDR1 region humanog lakog lanca, može biti CDR1 region lakog lanca 26F5, 27F2 ili 15C4, ako što je prikazano na Slici 11. U drugim rešenjima, CDR2 region humanog teškog lanca, može biti CDR2 region teškog lanca 26F5, 27F2 ili 15C4, kao što je prikazano na Slici 10, a CDR2 region humanog lakog lanca, može biti CDR2 region lakog lanca 26F5, 27F2 ili 15C4, kao što je prikazano an Slici 11. U drugim rešenjima CDR3 region humanog teškog lanca, je CDR3 region teškog lanca 26F5, 27F2 ili 15C4, kao što je prikazano na Slici 10, a CDR3 region humanog lakog lanca je region lakog lanca 26F5, 27F2 ili 15C4, kao što je prikazano na Slici 11.

Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo, koje se specifično vezuje za receptor tipa 1 interleukina-1 (IL-1R1), koje sadrži: CDR1 region humanog teškog lanca, pri čemu CDR! region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 61, sekvencu čiji je ID broj 62 ili sekvencu čiji je ID broj 63; CDR2 region humanog teškog lanca, pri čemu je CDR2 region teškog lanca, pri čemu taj region ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 64, sekvencu čiji je ID broj 65 ili sekvencu čiji je ID broj 66; i/ili CDR3 region humanog teškog lanca, pri čemu CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 68 ili sekvencu čiji je ID broj 69.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovano humano antitelo, koje se specifično vezuje za receptor tipa 1 interleukina-1 (IL-1R1), koje sadrži; CDR1 region humanog lakog lanca, pri čemu CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 70 ili sekvencu čiji je ID broj 71; CDR2 region humanog teškog lanca, pri čemu CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 72 ili sekvencu čiji je ID broj 73; i/ili CDR3 region humanog teškog lanca, pri čemu CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 74 ili sekvencu čiji je ID broj 75.

U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku se vezuju za treći domen IL-1R1, koji je prikazan na slici 17. Poželjno, epitop za antitelo, prema predmetnom pronalasku se sastoji od aminokiselinske sekvence YSV, koja je označena kao Epitop 4 i koja je prikazana na Slici 24. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na fuzione proteine i druge molekule koji su sposobni da se vezuju za Epitop 4 (zajedno sa napred pomenutim antitelima, ovde se zbirno označava kao "specifični partneri pri vezivanju"), koja mogu da se dobiju korišćenjem postupaka koji su opisani u WO 00/24782, koji je ovde inkorporiran po referenci. Navedeni molekuli mogu biti eksprimirani, u ćelijama sisara, (npr., u ćelijama jajnika kineskog hrčka) ili u bakterijskim ćelijama (npr., u ćelijama E. Coli).

Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za mapiranje epitopa željenog antigena. U jednom rešenju postupak obuhvata korake: (a) generisanja seta fuzionih proteina, pri čemu svaki fuzioni protein sadrži (i) avidin, (ii) fragment tog antigena; (b) pretraživanja seta fuzionih proteina i otkrivanje onih koji se vezuju za jedan ili više specifičnih partnera pri vezivanju za odgovarajući antigen; (c) izolovanja fuzionih proteina na podlozi koja sadrži biotin, pri čemu se avidin vezuje za biotin i (d) analiziranja fuzionih proteina koji su vezani sa specifičnim partnerima za vezivanje ili partnerima za određivanje veznim mesta na antigenu za specifičnog partnera za vezivanje ili za partnere. U posebnom rešenju, specifični partneri za vezivanje su antitela.

U dodatnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje oboljenja, stanja ili poremećaja koja su posredovana sa IL-1, koji obuhvataju korak primene farmaceutski efikasne količine jednog ili mnoštva monoklonskih antitela prema predmetnom pronalasku ili antigen vezujućih ili imunološki funkcionalnih imunoglobulinskih fragmenata ovih antitela kod osobe kojoj je ovakav tretman potreban.

Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje postupke za detekciju nivoa IL-1R1 u biološkom uzorku, koja obuhvata korak uspostavljanja kontakta uzorka sa monoklonskim antitelom, prema predmetnom pronalasku, ili sa njegovim antigen vezujućim fragmentom. Anti-IL-IR antitela rpema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u bilo kom poznatom postupku testiranja kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni ili indirektni sendvič testovi, testovi imunoprecipitacije i sa enzimom povezani imunosorbentni testovi (ELISA)

(videti, Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str. 147 - 158, CRC Press, Inc.) za detekciju i kvantifikaciju IL-1R. Antitela mogu da se vežu za IL-1R sa afinitetom koji je odgovarajući za postupak testiranja koji se koristi.

Specifična poželjna rešenja predmetnog pronalaska će postati jasna na osnovu sledećeg detaljnijeg opisa specifičnih poželjnih jedinjenja i na osnovu patentnih zahteva.

Kratak opis slika

Slika 1A-1B opisuju cDNK sekvencu (Slika 1A) koja kodira konstantni region teškog lanca humanog anti-IL-lRl antitela klase IgGl (sekvenca čiji je ID broj 1) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 1B) konstantnog regiona teškog lanca humanog anti-IL-lRl antitela klase IgGl (sekvenca čiji je ID broj 2).

Slika 2A-2B opisuju cDNK sekvencu (Slika 2A) koja kodira konstantni region kapa lanca humanog anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 3) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 2B) konstantnog regiona kapa lanca humanog anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 4).

Slika 3A-3B opisuju cDNK sekvencu (Slika 3A) koja kodira konstantni region teškog lanca humanog anti-IL-lRl antitela klase IgG2 (sekvenca čiji je ID broj 5) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 3B) konstantnog regiona teškog lanca humanog anti-IL-lRl antitela klase (sekvenca čiji je ID broj 6).

Slike 4A-4B opisuju cDNK sekvencu (Slika 4A), koja kodira konstantni region teškog lanca humanog anti-IL-lRl antitela klase IgG4 (sekvenca čiji je ID broj 7) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 4B) konstantnog regiona teškog lanca humanog anti-IL-lRl antitela klase IgG4 (sekvenca čiji je ID broj 8).

Slike 5A-5B opisuju cDNK sekvencu (Slika 5A) koja kodira varijabilni region teškog lanca 26F5 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 9) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 5B) varijabilnog regiona teškog lanca 26F5 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 10).

Slike 6A-6B opisuju cDNK sekvencu (Slika 6A) koja kodira varijabilni region kapa lanca 26F5 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 11) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 6B) varijabilnog regiona kapa lanca 26F5 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 12).

Slike 7A-7B opisuju cDNK sekvencu (Slika 7A) koja kodira varijabilni region teškog lanca 27F2 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 13) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 7B) varijabilnog region teškog lanca 27F2 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 14).

Slike 8A-8B opisuju cDNK sekvencu (Slika 8A) koja kodira varijabilni region teškog lanca 15C4 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 15) i aminokiselinsku sekvencu

(Slika 8B) varijabilnog regiona teškog lanca 15FC anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 16).

Slike 9A-9B opisuju cDNK sekvencu (Slika 9A) koja kodira varijabilni region kapa lanca 15C4 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 17) i aminokiselinsku sekvencu (Slika 9B) varijabilnog regiona kapa lanca 15C4 anti-IL-lRl antitela (sekvenca čiji je ID broj 18).

Slika 10 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci teških lanaca iz anti-IL-lRl antitela koja su označena kao 15C4, 27F2 i 26F5. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR- comlementaritv determining region) su podvučeni. CDR1 za 26F5 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 61; za 27F2 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 62; za 15C4 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 63. CDR2 za 26F5 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 64; za 27F2 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 65; za 15C4 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 66; CDR3 za 26F5 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 67; za 27F2 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 68; za 15C4 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 69.

Slika 11 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci lakih lanaca iz anti-IL-lRl-y antitela označenih kao 15C4, 27F2 i 26F5. CDR1 za 26F5/27F2 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 70; za 15C4 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 71. CDR2 za 26F5/27F2 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 72; za 15C4 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 73. CDR3 za 26F5/27F2 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 74; za 15C4 je označen kao sekvenca čiji je ID broj 75.

Slika 12 je grafikon koji ilustruje inhibitorni efekat anti-IL-lRl antitela na stvaranje kompleksa IL-1R/IL-1 p/IL-1 RAcP.

Slika 13 je grafikon koji pokazuje inhibitorni efekat anti-IL-lRl monoklonskog antitela, koje je ovde opisano i označeno kao 15C4, na stvaranje kompleksa IL-lR/IL-la/IL-lRacP.

Slika 14 je grafikon koji predstavlja sposobnost anti-IL-lRl antitela da blokiraju vezivanje sa IL-1 P, pri čemu neinterferiraju značajno sa vezivanjem sa IL-lra u poređenju sa IgG kontrolom.

Slika 15A je grafikon koji pokazuje inhibiciju proizvodnje IL-6 u primarnim humanim hondrocitima putem anti-IL-lRl antitela, koja su ovde identifikovana i označena kao 15C4 i 26F5 i 27F2 u poređenju sa IL-lra.

Slika 15B je grafikon koji pokazuje inhibiciju proizvodnje IL-6 u primarnim humanim hondrocitima, putem IL-lra i monoklonskih antitela 15F4 i 27F2 u poređenju sa klasom monoklonskih antitela koja su predstavljena kao 10H7 i 24E12.

Slika 16 je grafikon koji pokazuje inhibiciju proizvodnje IL-6 u punoj humanoj krvi, pomoću anti-IL-lRl monoklonskih antitela označenih kao 15C4, 26F5 i 27F2 u poređenju sa IL-lra.

Slika 17 predstavlja humanu aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 76) i nukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 77) i pacovsku nukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 78) i aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 79) trećeg domena IL-1R1. Numerisane prečke iznad humane sekvence ukazuju 15 različitih mesta koja su mutirana kako bi se dobilo 15 različitih mutiranih proteina. Pacovski ostaci koji su uvedeni mutacijom su nabrojani ispod pacovske nukleotidne sekvence.

Slika 18 pokazuje rezultate Western blot analize, koji pokazuju da anti-IL-lRl monoklonsko antitelo prepoznaje IL-1R1 mutante.

Slika 19 je crtež koji predstavlja (I) aktivaciju IL-1 signalnog puta koji započinje vezivanjem IL-1 R za IL-1R1, kao i regrutaciju IL-IRacP i tri klase anti-IL-lRl antitela, (II) blokatore trećeg domena epitopa IL-1, (III) blokatore trećeg domena RacP, kao i (IV) blokatore prvog i drugog domena epitopa IL-1.

Slika 20 prikazuje kristalnu strukturu antitela 15C4 i 27F2 sa mutacijom 10 kao što je ovde opisano, sivi ostaci predstavljaju 15C4 i 27F2 epitope.

Slika 21 prikazuje epitope 15C4 u trećem domenu ekstracelularnog IL-1R1.

Slika 22 prikazuje epitope 24E12 u trećem domenu ekstracelularnog IL-1R1.

Slika 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 59) himeričnog proteina avidin-humani-IL-lRl-FLAG, prema predmetnom pronalasku.

Slika 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 60) himeričnog proteina avidin-cvnomolgus IL-1R1-FLAG. Rekombinantni pileći avidin (prikazan italikom) je priključen zrelom ekstracelularnom domenu cvnomolgus IL-1R1 proteina (podvučeno sa C-terminalnom FLAG oznakom prikazanom u boldu) putem veznika od šest aminokiselina. Četiri aminokiseline iz humanog IL-1R1 koje su same uvedene, ako i u kombinaciji u cvnomolgus sekvencu su prikazane boldom u okviru cvnomolgus sekvence. Epitop 4 je prikazan boldom, italikom i podvučen je.

Slika 25A prikazuje rezultate Western blot analize vezivanja anti-humanog IL-1R1 antitela (anti-huIL-lRl) sa IL-1R1. (<*>) označava da su antitela korišćena u koncentraciji od 5 ug/ml, dok su ostala antitela korišćena u koncentraciji od 1 ug/ml. ;Sliak 25B prikazuje rezultat denzitometrijske analize upotrebom Western blot tehnike na uzorcima u duplikatu. ;Slika 26 prikazuje grafikone koji predstavljaju vezivanje anti-huIL-lRl antitela za avidin IL-1R1-FLAG proteine u višestrukom testu vezivanja sa malim česticama. ;Detaljan opis poželjnih rešenja;Naslovi odeljaka koji se ovde koriste služe isključivo u organizacione svrhe i ni na koji način ne ograničavaju opisanu subjektnu materiju. Reference koje su citirane u ovoj patentnoj prijavi su jasno inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. ;Definicije;Oboljenje ili medicinsko stanje se smatra "oboljenjem koje je posredovano sa interleukinom-1", ukoliko je to oboljenje ili medicinsko stanje koje se prirodno javlja ili koje se eksperimentalno indukuje udruženo sa povišenim nivoima IL-1 u telesnim tečnostima ili tkivima ili ukoliko ćelije ili tkiva, koja su uzeta iz tela, proizvode povšene nivoe IL-1 u kulturi. Povišeni nivoi IL-1 obuhvataju, npr., nivoe koji prevazilaze one koji se mogu normalno naći u određenoj ćeliji ili tkivu i to može biti bilo koji detektabilni nivo IL-1 u ćeliji ili tkivu koje normalno ne eksprimira IL-1. U mnogim slučajevima oboljenje koje je posredovano sa IL-1 se takođe prepoznaje na osnovu dve sledeće karakteristike: (1) patološki nalazi koji su udruženi sa oboljenjem ili medicinskim stanjem, mogu eksperimentalno da se imitiraju kod eksperimentalnih životinja nakon primene IL-1 ili nakon povećenja ekspresieje IL-1; i (2) patološki nalazi koji su indukovani u modelima oboljenje ili medicinskog stanja na eksperimentalnim životinjama, moguće je da se inhibira njihova pojava ili da se njihova pojava spreči tretiranjem sredstvima koja inhibiraju efekte IL-1. U većini oboljenja koja su posredovana sa IL-1 zadovoljena su najmanje dva od pomenuta tri uslova, a u mnogim oboljenjima koja su posredovana sa IL-1 zadooljena su sva tri navedena uslova. ;Lista akutnih i hroničnih oboljenja koja su posredovana sa IL-1 koja nije sveobuhvatna, obuhvata, bez ograničenja, sledeća oboljenja: akutni pankreatitis; amiotrofična lateralna skleroza (ALS); Alchajmerova bolest; kaheksija/anoreksija, uključujući kaheksiju izazvanu HlV-bolešću; astma i druge plućne bolesti; ateroskleroza; autoimuni vaskulitis, sindrm hroničnog umora; oboljenja koja su udružena sa Clostridium-om, uključujući dijareju koja je udružena sa Clostridium-om; koronarna stanja i indikacije, uključujući kongestivnu srčanu slabost, koronarnu restenozu, infark miokarda, disfunkciju miokarda, (npr., koja je udružena sa sepsom), i premošćavanja koronarnih arterija vaskularnim presatkom; kancer, kao što je multipli mijelom i mijelogene (npr., AML ili CML) i druge leukemije, kao i metastaze tumora; dijabetes (npr., insulin zavisni dijabetes); endometrioza; stanje sa povišenom temperaturom; fibromialgija; glomerulonefritis; oboljenje presadak protiv domaćina/odbacivanje transplantata; hemoragijski šok; hiperalgezija; inflamatorna bolest creva; inflamatorna stanja zgloba, uključujući osteoartritis, psoriatični astritis i reumatoidni artritis; inflamatorna bolest oka, koja može biti udružena sa, npr., transplantacijom rožnjače; ishemija, uključujući celebralnu ishemiju (npr., povreda mozga kao rezultata traume, epilepsije, krvarenja ili možda nog udara, stanja koja vode do neurodegeneracije); Kavasakijeva bolest; poremećaj učenja, bolesti pluća (npr., ARDS); multiplaskleroza; miopatije (npr., poremećaji metabolizma proteina u mišićima, naročito u sepsi); stanja praćenja neurotoksičnošću (npr., kao u infekciji sa HIV); osteoporoza; bol, uključujući bol povezan sa kancerom; Parkinsonova bolest; periodontalna bolest; prevremeni porođaj; psorijaza; reperfuziona povreda; septički šok; sporedni efekti radiacione terapije, oboljenje temporo-mandibularnog zgloba; poremećaji sna; uveitis; ili inflamatorna stanja koja nastaju zbog istezanja uvrtanja, oštećenja hrskavice, traume, ortopedske hirurške intervencije, infekcije ili drugih oboljenja. Postupci prema predmetnom pronalasku, za tretiranje ovih akutnih i hroničnih oboljenja koja su posredovana sa IL-1, kao i za tretiranje drugih stanja i oboljenja su posredovana sa IL-1, opisana su u tekstu koji sledi. ;Za dobijanje rekombinantne DNK, za sintezu oligonukleotida i za uspostavljanje tkivne kulture i transformaciju ćelija (npr., za elektroporaciju, transfekciju ili lipofekciju) mogu da se koriste konvencionalne tehnika. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvode prema uputstvima koje daje proizvođač ili na način koji je uobičajen u struci ili na način koji je ovde opisan. Tehnike koje su napred navedene i odgovarajući postupci, generalno mogu da se izvode na konvencionalni način koji je poznat u struci i koji je opisan u različitim opštim ili specifičnim referencama, koje su citirane i diskutovane u specifikaciji predmetnog pronalaska. Videti, npr., Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, treće izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., koja je ovde inkorporirana apo referenci za bilo koju svrhu da se koristi. Osim ukoliko nisu obezbeđene specifične definicije, nomenklatura koja se koristi, kao i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hernije, sintetske organske hernije, i medicinske i farmaceutske hernije koje su ovde opisane, predstavljaju one koje su dobro poznate i najčešće korišćene u struci. Za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparacije, formulacije i načine pripremanja leka, kao i za tretman pacijenata mogu da se koriste standardne tehnike. ;Sledeći pojmovi, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, koji se koriste u opisu predmetnog pronalaska, imaju sledeće značenje. ;Pojam "izolovani polinukleotid" označava da predmetni polinukleotid (1) nije povezan (kovalentno ili nekovalentno) sa celim ili sa delom dugog polinukleotida sa kojim je predmetni polinukleotid udružen u prirodi; (2) udruženje sa molekulom sa kojim inače nije udružen u prirodi ili (3) u prirodi se ne jevlja udružen sa bilo kojim drugim nukleotidom. Takav izolovani polinukleotid može biti genomska DNK, cDNK, iRNK ili druga RNK, može biti sintetskog porekla ili može biti kombinacija prethodno navevenih. ;Pojam "izolovani protein" ovde označava da predmetni protein (1) nije udružen barem sa nekim drugim proteinima sa kojima bi se normalno našao u prirodi, (2) praktično nije udružen sa drugim proteinima iz istog izvora, npr., iz iste vrste, (3) eksprimiran je od strane ćelije koja je poreklom iz druge vrste, (4) izdvojen je od najmanje oko 50% polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojim aje inače udružen u prirodi, (5) nije povezan (kovalentno ili nekovalentno) sa delom proteina sa kojima je "izolovani protein" inače udružen u prirodi, (6) operativno je povezan (kovalentno ili nekovalentno) sa polipeptidom sa kojim nije udružen u prirodi ili (7) postoji u prirodi. Takav izolovani protein može da kodira genomska DNK, cDNK, iRNK ili druga RNK, nukleotidna sekvenca sintetskog porekla ili bilo koja kombinacija prethodno navedenih nukleotida. Poželjno, izolovani protein praktično nije udružen sa drugim proteinima ili polipeptidima ili sa drugim kontaminantima koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju i koji bi interferirali sa njegovom terapijskom, dijagnostičkom, profilaktičkom, istraživačkom ili nekom drugom upotrebom. ;Pojmovi "polipeptid" ili "protein" označavaju jedan ili više lanaca aminokiselina, pri čemu svaki lanac sadrži aminokiseline koje su kovalentno povezane peptidnim vezama i pri čemu navedeni polipeptid ili protein sadrži mnoštvo lanaca koji su nekovalentno i/ili kovalentno povezani jedni sa drugima peptidnim vezama, koji poseduju sekvencu nativnih proteina tj. proteina koje proizvode ćelije koje postoje u prirodi i specifično ne rekombinantne ćelije ili koje proizvode genetskim inžinjeringom dobijene ili rekombinantne ćelije, i obuhvataju molekule koji poseduju aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina ili sekvencu u kojoj se nalaze delecije adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na nativnu sekvencu. Pojmovi "polipeptid" i "protein" specifično obuhvataju anti-IL-lRl antitela ili sekvence sa delecijama, adicijama i/ili supstitucijama jedne ili više aminokiselina u odnosu na sekvencu anti-IL-lRl antitela. Stoga, pojmovi, "polipeptid" ili "protein" mogu da sadrže jedan (kada se nazivaju "monomer") ili (mnoštvo kada se nazivaju "multimeri") lanaca aminokiselina. ;Pojam "polipeptidni fragment" se odnosi na polipeptid koji može biti monomeran ili multimeran, koji poseduje amino-terminalnu deleciju, karboksi-terminalnu deleciju i/ili internu deleciju ili supstituciju u odnosu na nativni ili rekombinantno dobijeni polipeptid. U određenim rešenjima, polipeptidni fragment može da sadrži minokiselinski lanac od najmanje 5 do oko 500 aminokiselina. U određenim rešenjima, fragmenti su dugi najmanje 5, 6, 8, 10 , 14, 20, 50, 70, 100, 110,150, 200, 250, 300, 350,400, ili 450 aminokiselina. Posebno korisni polipeptidni fragmenti obuhvataju funkcionalne domene uključujući vezne domene. U sličaju anti-IL-lRl antitela, korisni fragmenti uključuju bez ograničenja, CDR region, posebno CDR3 region teškog ili lakog lanca; varijabilni domen teškog ili lakog lanca; deo nekog lanca antitela ili samo njegov varijabilni region uključujući dva CDR i tome slično. ;Pojam "imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment" kao što se ovde koristi označava polipeptidni fragment koji sadrži barem varijabilne domene imunoglobulinskog teškog i lakog lanca. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, prema predmetnom pronalasku, je sposoban da se vezuje za ligand, sprečava vezivanje Uganda za njegov receptor, prekida biološki odgovor koji je posledica vezivanja Uganda za receptor, ili koji je sposoban da vrši bilo koju od prethodno navedenih funkcija. Poželjno, imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, prema predmetnom pronalasku, se specifično vezuje za IL-1R1. ;Pojmovi "onaj koji se prirodno javlja" i "nativni" označavaju da biološki materijali (molekuli, sekvence, proteinski kompleksi, ćelije i si.) na koje se pojmovi odnose, mogu da se nađu u prirodi i nisu podvrgnuti manipulaciji od strane čoveka. Na primer, polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i koja može da bude izolovana iz prirodnog izvora i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka označena je kao ona koja se javlja u prirodi. Slično tome, pojmovi "koji se ne javlja u prirodi" ili "ne-nativni" se odnose na materijal koji se ne nalazi u prirodi i koji je strukturno modifikovan i sintetisan od strane čoveka. ;Pojam "operativno poveza" označava da su komponente na koje se pojam odnosu u takvom odnosu koji im dozvoljava da ispoljavaju njihove inherentne funkcije u odgovarajućim uslovima. Na primer, kontrolna sekvenca je "operativno povezana" za sekvencu koja kodira proteinputem ligacije, tako daje ekspresija sekvence koja kodira protein omogućena u uslovima koji su kompatibilni sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci. ;Pojam "kontrolna sekvenca" označava da subjektna polinukleotidna sekvenca može da utiče na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje je ligirana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci zavisi od organizma domaćina. U određenim rešenjima kontrolne sekvence za prokariote obuhvataju promoter, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za terminaciju transkripcije. U drugim posebnim rešenjim kontrolne sekvence za eukariote obuhvataju promotere koji sadrže jedno ili mnoštvo mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, za sekvence koje pospešuju transkripciju i za sekvencu ua terminaciju transkripcije. U određenim rešenjima pojam "kontrolne sekvence" obuhvata vodeće sekvence i/ili fuzione partner sekvence. ;Pojam "polinukleotid" označava jednolančane i dvolančane polimere nukleinskih kiselina od najmanje 10 baza u dužinu. U određenim rešenjima, nukleotidi koji sačinjavaju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili mogu biti modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Navedene modifikacije obuhvataju modifikacije baza kao što su bromuridinski i inizinski derivati, modifikacije riboze, kao što je 2',3' - dideoksiriboza, kao i modifikacije internukleotidnog povezivanja kao što su fosforotioatna, fosforoditionatna, fosforoselenoatna, fosforodiselenoatna, fosforoanilotiolatna, fosforoaniladatna i fosforoamidatna veza. Navedeni pojam obuhvata jednolančane i dvolančane oblike DNK. ;Pojam "oligonukleotid" označava polinukleotid koji sadrži 200 baza ili manje. U poželjnim rešenjima, oligonukleotidi sadrže 10 do 60 baza. U još poželjnijim rešenjima, oligonukleotidi poseduju 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 do 40 baza. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., kada se koriste u konstrukciji mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu biti kodirajući ili komplementarni oligonukleotidi. ;Pojam "nukleotidi koji se javljaju u prirodi" obuhvata deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Pojam "modifikovani nukleotidi" obuhvata nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama ili sa modifikovanim ili supstituisanim bazama. Pojam "oligonukleotidne veze" obuhvata veze kao što su fosforotioatna, fosforoditioatna, fosforoselenoatna, fosforodiselenoatna, fosforoanilotiolatna, fosforoaniladatna i fosforoamidatna i slične. Videti, npr., LaPlanche et al., (1986), Nucl. Acids Res. 14:9081; Stec et al., (1984), J. Am. Chem. Soc. 106: 6077; Stein et al., (1988), Nucl. Acids Res., 16: 3209; Zon et al., (1991), Anti-Cancer Drug Design 6: 539; Zon et al., (1991), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str., 87-108 (urednik F.Eckstein), Oxford Universitv Press, Engleska; Stec et al., U.S. patent broj 5,151,510; Uhlmann & Peyan ;(1990), Chemisal Reviews 90: 543, čiji je opis ovde u potpunosti inkorporiran po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Oligonukleotid prema predmetnom pronalasku može da sadrži oznaku, uključujući radio oznaku, fluoroscentnu oznaku, haptensku ili antigenu oznaku radi sprovođenja testova detekcije. ;Pojam "vektor" označava bilo koji molekul (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid ili virus) koji se koristi za transfer kodirajuće informacije u ćeliju domaćina. ;Pojam "vektor ekspredije" ili "ekspresioni konstrukt" označava vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (zajedno sa ćelijom domaćinom) ekspresiju jednog ili više heterologih kodirajućih regiona sa kojima su operativno povezani. Ekspresioni konstrukt može da sadrži, bez ograničenja sekvence koje utiču ili kontrolišu transkripciju, translaciju i obradu RNK ukoliko su prisutni introni, kodirajućeg regiona sa kojim je operativno povezana. ;Pojam "ćelija domaćin" označava ćeliju koja je transformisana i koja je sposobna za transformaviju sa sekvencom nukleinske kiseline i koja zato eksprimira izabrani gen koji je od interesa. Pojam obuhvata potomstvo ćelije roditelja, bez iobzira da li je potomstvo identično morfološki ili genetski u odnosu na ćeliju roditelja, sve dotle dok je izabrani gen prisutan u genomu. ;Pojam "transdukcija" označava transfer gena iz jedne bakterije u drugu obično pomoću faga. Pojam "transdukcija" takođe označava prihvatanje i transfer eukariotskih ćelijskih sekvenci pomoću retrovirusa. ;Pojam "transfekcija" označava preuzimanje strane ili egzogene DNK od strane ćelije, a za ćeliju se kaže da je "transficirana" onda kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su dobro poznate u struci i dobro su opisane. Videti, npr., Graham et al,. 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Biology, Elsevier; i Chu et al., 1981, Gene 13: 197. Navedene tehnike mogu da se koriste za uviđenje jednog ili više egzogenih molekula DNK u pogodnu ćeliju domaćina. ;Pojam "transformacija" označava promenu u genetskim karakteristikama ćelije, a za ćeliju se kaže daje "transformirana" onda kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK. Na primer, za ćeliju se kaže daje transformirana onda kada je genetski modifikovana u odnosu na svoje nativno stanje pomoću transfekcije, transdukcije ili na neki drugi način, nakon transfekcije ili transdukcije, transformirana DNK može da se rekombinuje sa DNK same ćelije tako što se fizički integriše u hromozom ćelije ili može da se prolazno održi kao epizomski element bez sposobnosti replikacije ili može da se replicira nezavisno kao plazmid Za ćeliju se smatra daje stabilno transformirana onda kada se transformirana DNK replicira u isto vreme kada se ćelija domaćin deli. ;Pojam "antigen" označava molekul ili deo molekula koji ej sposoban da se veže sa selktivnim sredstvom za vezivanje, kao što je antitelo i koji je dodatno poseduje sposobnost da dovede do proizvodnje antitela u organizmu životinje, koje može da se veže za neki epitop tog antigena. Određeni antigen može imati jedan ili više epitopa. ;Pojam "epitop" obuhvata svaku determinantnu, poželjno polipeptidnu determinantu, koja je sposobna da se specifično veže za molekul imunoglobulina ili T- ćelijski receptor. U određenim rešenjima, epitopske determinante obuhvataju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforil ili sulfonil grupe, a u određenim rešenjima mogu da poseduju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifično naelektrisanje. Epitop je region na antigenu koji se vezuje za antitelo. U određenim rešenjim aza antitelo se kaže da se specifično vezuje za antigen onda kada specifično prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula. U poželjnim rešenjima za antitelo se kaže da specifično vezuje antigen onda kada je konstanta disocijacije kompleksa manja ili jednaka od oko 10 nM, poželjnije kada je konstanta disocijacije kompleksa manja ili jednaka od oko 100 pM a najpoželjnije je kada je konstanta disocijacije kompleksa manja ili jednaka od oko 10 pM. ;Pojam "identičnost" označava odnos između sekvenci dva ili više molekula polipeptida ili dva ili više molekula nukleinskih kiselina, koji se određuje upoređivanjem ovih sekvenci. U struci, pojam "identičnost" takođe označava stepen povezanosti sekvencimolekula nukleinskih kiselina ili polipeptida, koji se određuje poklapanjem sekvenci dva ili više nukleotida ili dve ili više aminokiselina. Pojmom "identičnost" se označava procenat identičnih poklapanja između dve ili više sekvenci uz korišćenje poravnanja praznina ;(ukoliko takve postoje) upotrebom specifičnog matematičkog modela ili kompjuterskog programa (tj., upotrebom "algoritama"). ;Pojam "sličnost" koji se koristi u struci u vezi sa povezanim konceptom; međutim, nasuprot pojmovima "identičnost", pojam "sličnost" se odnosi na meru povezanosti koja obuhvata i identična poklapanja i poklapanja konzervativnih supstitucija. Ukoliko dve polipeptidne sekvence imaju, na primer, 10/20 identičnih aminokiselina, a ostatak su nekonzervativne supstitucije, tada je procenat identičnosti i sličnosti 50%. Ukoliko u istom primeru postoji pet ili više pozicija na kojima su konzervativne supstitucije, tada procenat identičnosti ostaje 50%, ali je procenat sličnosti 75% (15/20). Stoga, u slučajevima u kojima postoje konzervativne supstitucije, proenat sličnosti između dva polipetida će biti veći od procenta identičnosti između ova dva polipeptida. ;Identitet i sličnost povezanih nukleinskih kiselina i polipeptida se može lako izračunati korišćenjem poznatih postupaka. Ovi postupci obuhvataju, bez ograničenja, one koji su opisani u "Computational Molecular Biologv", Lesk, A.M., urednik, Oxford Universitv Press, New York Press (1988); "Biocomputing; Informatics and Genome Projects", Smith, D.W., urednik, Academic Press, New York (1993); "Computer Analvsis of Sequence Data, Part 1", Griffin, A.M. & Griffin, H.G., urednici, Humana Press, New Jersev (1994); "Sequence Analvsis in Molecular Biologv", von Heinje, G., Academic Press (1987); "Sequence Analvsis Primer", Gribskov, M. & Devereux, J., urednici, M. Stockton Press, New York (1991); Carillo et al., SIAM, J. Applied Math., 48 : 1073 (1988); i Durbin et al., Biological Sequence Analvsis, 1998, Cambridge Universitv Press. ;Poželjni postupci za određivanje identiteta su tako dizajnirani da daju podatke o najvećem poklapanju između ispitivanih sekvenci. Postupci kojim se određuje identitet su opisani u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poželjni postupci koji uključuju upotrebu kompjuterskog programa za određivanje identiteta između dve sekvence obuhvataju, bez ograničenja, GCG programski paket, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12 : 387 (1984); Genetics Computer Group, Universitv of Wisconskin, Medison, WI), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215 : 403 - 410 (1990)). BLASTX program je javno dostupan od strane Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnologv Information - NCBI) i iz drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., gore navedeno (1990)). Dobro poznati Smith Waterman algoritam takođe može biti korišćen za određivanje identiteta. ;Određene šeme poravnanja koje se koriste za poravnanje dve aminokiselinske sekvence mogu da dovedu do poklapanja samo kratkih regiona dve sekvence, a ove male poravnate regije mogu posedovati veoma veliki stepen identičnosti sekvenci, iako nema značajnog odnosa između sekvenci u punoj dužini. Shodno tome, u određenim rešenjima, primena određenog postupka poravnavanja (GAP program) dovešće do poravnanja koje se proteže na najmanje 50 susednih aminokiselina ciljnog polipeptida. ;Na primer, korišćenjem GAP kompjuterskog algoritma (Genetics Computers Group, Universitv of Wisconsin, Medison, WI), dva polipeptida, za koje treba da se odredi stepen identičnosti sekvenci, poravnati su radi optimalnog poklapanja njihovih odgovarajućih aminokiselinskih sekvenci ("poklapanje segmenata", koje je utvrđeno algoritmom). U određenim rešenjima, zajedno sa algoritmom su korišćeni zabrana za praznine na početku (koja se izračunava kao 3 x prosečna dijagonala; "prosečna dijagonala" je prosečna vrednost dijagonale matriksa za poređenje koji se koristi; "dijagonala" je vrednost ili broj koji je dodeljen svakom perfektnom poklapanju aminokiselina od strane određenog matriksa za poređenje) i zabrana za praznine u produžetku (koja je obično 1/10 puta u odnosu na veličinu zabrane za praznine na početku), a korišćen je i matriks za poređenje, na primer, PAM 250 ili BLOSUM 62. U određenim rešenjima, algoritam takođe koristi standardni matriks za poređenje (videti Davhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 : 345 - 352, za PAM 250 matriks za poređenje; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 10915 - 10919 za BLOSUM 62 matriks za poređenje). ;U određenim rešenjima, parametri za poređenje polipeptidne sekvence obuhvataju sledeće: ;Algoritam: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48 : 443 - 453 (1970): ;Matriks za poređenje: BLOSUM 62, Henikoff et al., gore navedeno (1992); ;Zabrana za praznine na početku: 12 ;Zabrana za dužinu praznine: 4 ;Prag sličnosti: 0 ;GAP program može biti od koristi uz upotrebu gore navedenih parametara. U određenim rešenjima, prethodno navedeni parametri su standardni parametri za poređenje polipeptida (bez zabrane za prazninu na kraju) pri korišćenju GAP algoritma. ;Pojam "onaj koji se prirodno javlja", kada se odnosi na aminokiseline, označava dvadeset konvencionalnih aminokiselina. Videti, Immunologv - A Svnthesis, 2. izdanje, (urednici E. S. Golub & D. R. Gren), Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991), koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. ;Peptidni analozi se uobičajeno koriste u farmaceutsakoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa svojstvima koja su analogna onima koje poseduje peptid koji služi za uzor. Pomenuti tipovi ne-peptidnog jedinjenja se označavaju kao "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Videti Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 : 29 (1986); Veber & Freidinger, TINS str. 392 (1985); i Evans et al., J. Med. Chem. 30 : 1229 (1987), koje su ovde uključene po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Ova jedinjenja se često razvijaju uz pomoć kompjuterizovanog molekulskog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima, mogu da se koriste za dobijanje sličnog terapijskog ili profilaktičkog dejstva. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu koji služi kao osnovni uzor (tj. peptidu ili polipeptidu koji poseduje određeno biohemijsko svojstvo ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali koji poseduje jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih vezom izabranom između: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-, postupcima koji su dobro poznati u struci. Sistematska supstitucija jedne ili više amino kiselina konsenzus sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizina), može da se koristi u određenim rešenjima kako bi se dobili poželjniji peptidi. Dodatno, konzervativni peptidi, koji sadrže konsenzus sekvencu ili praktično identičnu varijaciju konsenzus sekvence, mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u struci (Rizo i Geirasch, Ann. Rev. Biochem. 61 : 387 (1992), koja je ovde uključena po referenci u bilo koju svrhu da se koristi); na primer, dodavanjem unutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih za formiranje intramolekulskih disulfidnih mostova, koji dovode do ciklizacije peptida. ;Pojam "antitelo" ili "peptidi antitela" se odnosi na intaktno antitelo, ili na njegov vezujući fragment koji se pri specifičnom vezivanju nadmeće sa intaktnim antitelom i obuhvata himerična, humanizovana, potpuno humana i bispecifična antitela. U određenim rešenjima, vezujući fragmenti se dobijaju tehnikama rekombinantne DNK. U dodatnim rešenjima, vezujući fragmenti se dobijaju enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Vezujući fragmenti obuhvataju, bez ograničenja, Fab, Fab', F(ab')2, Fv i jednolančana antitela. ;Pojam "teški lanac" obuhvata teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu dužinu sekvence varijabilnog regiona da ispolje specifičnost za IL-1R1. Teški lanac pune dužine obuhvata domen varijabilnog regiona, Vh, i tri domena konstantnog regiona, ChI, Ch2, Ch3. Vh domen je na amino terminalu polipeptida, a Ch3 domen je na korboksi terminalu. ;Pojam "laki lanac" obuhvata laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu dužinu sekvence varijabilnog regiona da ispolje specifičnost za IL-1R1. Laki lanac pune dužine obuhvata domen varijabilnog regiona, Vl, i domen konstantnog regiona, Cl. Kao kod teškog lanca, domen varijabilnog regiona lakog lanca se nalazi na amino terminalu polipeptida. ;"Fab fragment" se sastoji od jednog lakog ranca i od ChI i od varijabilnih regiona jednog teškog ranca. Teški lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca. ;"Fab' fragment" sadrži jedan laki lanac i jedan teški lanac koji ima više od konstantnog regiona, između domena ChI i Ch2, tako da se disulfidna veza između lanaca može stvoriti između dva teška lanca, kako bi nastao molekul F(ab')2. ;"F(ab')2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između CHi i CH2domena, tako da je omogućeno stvaranje disulfidne veze između dva teška lanca. ;"Fv region" sadrži varijabilne regione poreklom i od teškog i od lakog lanca, ali mu nedostaju konstantni regioni. ;"Jednolančana antitela" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teškog i lakog lanca povezani fleksibilnim veznikom, kako bi se dobio pojedinačni polipeptidni lanac koji formira antigen-vezujući region. O jednolančanim antitelima se detaljno diskutuje u Mežunarodnoj patentnoj patentnoj prijavi br. WO 88/01649 i u U.S. patentima br. 4,946,788 i 5,260,203, čiji su opisi ovde inkorporirani po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. ;"Bivalentno antitelo" koje se razlikuje od "multispecifičnog" ili od "multifunkcionalnog" antitela, u određenim rešenjima tipično poseduje identična vezujuća mesta. ;"Bispecifično" ili "bifunkcionalno" antitelo je hibridno antitelo koje poseduje dva različita para teškog i lakog lanca i dva različita vezna mesta. Bispecifična antitela mogu da se dobiju upotrebom raznih postupaka, uključujući, bez ograničenja, fuziju hibridoma ili ;povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsvilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79 : 315 - 321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148 : 1547 - 1553. ;Prilikom procene sposobnosti vezivanja i specifičnosti antitela prema predmetnom pronalasku, antitelo "značajno inhibira" adheziju Uganda za receptor onda kada antitelo u višku smanjuje količinu receptora vezanog za ligand najmanje za oko 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili više (merenoin vitrotestom kompetitivnog vezivanja). ;Pojam "sredstvo" označava hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt dobijen iz bioloških materijala. ;Pojmovi "oznaka" ili "obeležen" odnose se na uključivanje markera koji se mogu detektovati, npr., na inkorporaciju radioaktivno obeležene amino kiseline ili na vezivanje biotinskih podjedinica za polipeptid, koje se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr., streptavidinom koji poželjno sadrži marker, kao što je fluoroscentni marker, hemiluminescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U određenim rešenjima, oznaka ili marker takođe može da poseduje terapijsku vrednost. Različiti postupci obeležavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u struci i mogu ovde poželjno da se primene. Primeri oznaka za polipeptide obuhvataju, bez ograničenja, sledeće: radioizotope ilii radionuklide (npr.,3H,14C,1<5>N,<35>S,<90>Y, "Tc,<ni>In,125I,<131>I), fluoroscentne oznake (npr., fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin ili lantanid fosfori), enzimske oznake (npr, peroksidaza rena, P-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne oznake, haptenske oznake kao što su biotinil grupe, kao i prethodno određene polipeptidne epitope koje prepoznaju sekundarni reporteri (npr., leucinske uklapajuće parne sekvence, vezujuća mesta za sekundarna antitela, domene za vezivanje metala, epitopske oznake). U određenim rešenjima, oznake su prikačene kracima za razdvajanje (kao što je (CH2)n, gde je n < 20) različitih dužina u cilju smanjenja potencijalne sterične prenapregnutosti. ;Pojam "biološki uzorak" obuhvata, bez ograničenja, svaku količinu supstance poreklom iz živog bića ili bića koje je bilo živo. Pomenuta živa bića obuhvataju, bez ograničenja, ljude, miševe, majmune, pacove, zečeve i druge životinje. Pomenute supstance obuhvataju, bez ograničenja, krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kost, kostnu srž, limfne čvorove, sinovijsko tkivo, hondrocite, sinovijske makrofage, endotelijalne ćelije, vaskularno tkivo (posebno inflamatorno vaskularno tkivo) kožu. ;Pojam "farmaceutsko sredstvo" i "lek" se odnose na hemijsko jedinjenje ili preparat koji je sposoban da indukuje pojavu željenog terapijskog dejstva pošto se na odgovarajući način primeni kod pacijenta. ;Pojam "pacijent" obuhvata ljude i životinje. ;Osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, pojmovi u jednini obuhvataju i oblike u množini, a važi i obratno. ;Aminokiseline;Dvadeset aminokiselina koje se prirodno javljaju i njihove skraćenice se koriste na konvencionalan način. Videti, Immunologv - A Svnthesis, 2. izdanje, (urednici E. S. Golub & D. R. Gren), Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991), koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi, kao što su a-, a-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline i druge nekonvencionalne aminokiseline, takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide prema predmetnom pronalasku. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina obuhvataju: 4-hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, e-N,N,N-trimetil lizin, e-N-acetil lizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, a-N-metilarginin i druge slične amino i imino kiseline (npr. 4-hidroksiprolin). U nomenklaturi polipeptida koja se ovde koristi, L smer je smer amino terminala, a R smer je smer karboksi terminala, shodno standardnoj upotrebi i konvenciji. ;Slično tome, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, L kraj jednolančane polinukleotidne sekvence je 5' kraj; L smer dvostruke polinukleotidne sekvence se označava kao 5' kraj. Smer 5' ka 3' dodatku nascentnog RNK prepisa se označava kao smer transkripcije; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao i RNK i koji imaju smer 5' ka 5' kraju RNK transkripta s označavaju kao "uzvodne sekvence"; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji imaju smer 3' ka 3' kraju označavaju se kao "nizvodne sekvence". ;Prirodni ostaci se mogu podeliti u klase na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca: 1) hidrofobni: norleucin (Nor ili Nle), Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) kiseli: Asp, Glu; 4) bazni: His, Lys, Arg; ;5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i ;6) aromatični: Trp, Tyr, Phe. ;Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate zamenu jednog člana neke od navedenih klasa sa drugim članom iste klase. Konzervativne aminokiselinske supstitucije obuhvataju veštačke aminokiselinske ostatke, koji su tipično inkorporirani hemijskom sintezom peptida, pre nego sintezom u biološkim sistemima. Ovde spadaju peptidomimetski i drugi obrnuti ili invertovani oblici aminokiselinskih podjedinica. ;Nekonzervativne supstitucije obuhvataju izmenu člana jedne klase sa članom druge klase. Ovako supstituisani ostaci se mogu uvesti u regione humanog antitela koji su homologi sa ne-humanim antitelima, ili u nehomologe regione molekula. ;Prema određenim rešenjima, pri pravljenu ovakvih izmena se mora uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Svakoj aminokiselini je priprisan hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i karakteristika naelektrisanja. Vrednosti ovih indeksa su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9) i arginin (-4,5). ;Važnost hidropatskog indeksa aminokiselina u ispoljavanju interaktivne biološke funkcije na proteinu je poznata u struci (videti, na primer, Kyte et al., J. Mol. Biol., 157 : 105 - 131 (1982)). Poznato je da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje poseduju sličan hidropatski indeks ili vrednost, nakon čega one još uvek zadržavaju sličnu biološku aktivnost. Prilikom pravljenja promena zasnovanih na hidropatskom indeksu, u određenim rešenjima, obuhvaćene su supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 2. U određenim rešenjima, takođe su obuhvaćene i supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 1, a u određenim rešenjima, obuhvaćene su i supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 0,5. ;U struci je takođe poznato da se mogu efikasno napraviti supstitucije aminokiselina koje su slične po hidrofilnosti, posebno onda kada su biološki funkcionalni protein ili peptid koji su kreirani na taj način namenjeni upotrebi u imunološkim rešenjima, kao što je to slučaj u predmetnom pronalasku. U određenim rešenjima, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, koja je određena hidrofilnošću susednih aminokiselina, korelira sa imunogenošću i antigenošću, tj. sa biološkim svojstvima proteina. ;Aminokiselinskim ostacima su pripisane sledeće vrednosti hidrofilnosti: arginin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin ('0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); cistein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5) i triptofan (-3,4). Prilikom pravljenja promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti, u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 2, u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 1, a u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 0,5. Takođe, na osnovu hidrofilnosti se mogu identifikovati epitopi od primarnih aminokiselinskih sekvenci. Ovakvi regioni se takođe označavaju i kao "osnovni epitopski regioni". ;Primeri aminokiselinskih supstitucija su prikazani u Tabeli 1. ; ;Iskusni stručnjak može da odredi odgovarajuće varijante polipeptida koji su ovde predstavljeni korišćenjem dobro poznatih tehnika. U određenim rešenjima, stručnjak može da identifikuje odgovarajuća područja molekula koja se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se veruje da nisu važni za ispoljavanje aktivnosti. U određenim rešenjima, mogu se identifikovati ostaci i delovi molekula koji su konzervirani kod različitih polipeptida. U određenim rešenjima, čak se i područja koja mogu biti značajna za ispoljavanja biološke aktivnosti ili za strukturu mogu podvrgnuti konzervativnim supstitucijama aminokiselina bez narušavanja biološke aktivnosti ili negativnog uticaja na strukturu polipeptida. ;Dodatno, stručnjak može da izvrši ispitivanja povezanosti strukture i funkcije identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za ispoljavanje aktivnosti ili za strukturu. S obzirom na ovakvo poređenje, može se predvideti važnost aminokisleinskih ostataka u proteinu koji koreliraju sa aminokiselinskim ostacima važnim za ispoljavanje aktivnosti ili za strukturu sličnih proteina. Stručnjak može izabrati hemijski slične aminokiselinske ostatke za supstitucije predviđenih važnih aminokiselinskih ostataka. ;Stručnjak takođe može da analizira trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na strukturu sličnih polipeptida. Na osnovu takvih informacija, stručnjak može da predvidi redosled aminokiselinskih ostataka antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. U određenim rešenjima, stručnjak može da izabere da ne pravi radikalne promene aminokiselinskih ostataka predviđenih da budu na površini proteina, jer takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, stručnjak može da napravi test varijante koje sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Tada varijante mogu da budu ispitane korišćenjem testova koji su poznati stručnjacima. Takve varijante mogu da posluže za prikupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena određenog aminokiselinskog ostatka dovodi do gubitka, neželjenog smanjenja ili ispoljavanja nepoželjne aktivnosti, varijante sa takvom promenom mogu da se izbegnu. Drugim rečima, na osnovu informacija koje se prikupljaju tokom ovih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako da odredi aminokiseline kod kojih dalje supstitucije treba izbegavati, bilo same po sebi ili u kombinaciji sa drugim mutacijama. ;Brojne naučne publikacije su posvećene predviđanju sekundarne strukture. Videti Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4) : 422 - 427 (1996), Chou et al., Biochemistrv, 13 : 222 - 245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211 - 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 : 45 - 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47 : 251 - 276 i Chou et al., Biophys. J., 26 : 367 - 384 (1979). Štaviše, trenutno su dostupni kompjuterski programi koji su od pomoći u predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak za predviđanje sekundarne strukture se zasniva na modelovanju homologijom. Na primer, dva polipeptida ili proteina čije sekvence poseduju identičnost veću od 30% ili sličnost veću od 40%, obično imaju slične strukturne topologije. Rast banke podataka proteinske strukture (Protein Structural Database - PBD) omogućava poboljšano predviđanje sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj pregiba unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Videti, Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1) : 244 - 247 (1999). Sugerisano je (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3) : 369 - 376 (1997)) da postoji ograničen broj pregiba u datom polipeptidu ili proteinu i da onda kada se razreši kritičan broj struktura, predviđanje strukture postaje dramatično preciznije. ;Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture obuhvataju "razmenu" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. biol., 7 (3): 377 - 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1) : 15 - 19 (1996)), "analizu profila" (Bowie et al., Science, 253 : 164 - 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enyzm., 183 : 146 - 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13) : 4355 - 4358 ;(1987)) i "evolucionu vezu" (videti Holm, navedeno ranije (1999) i Brenner, navedeno ranije ;(1997)). ;U određenim rešenjima, varijante antitela obuhvataju glikozilirane varijante kod kojih je broj i/ili tip glikozilacionih mesta izmenjen u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama roditeljskog polipeptida. U određenim rešenjima, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj glikozilacionih mesta sa N-vezom u poređenju sa nativnim proteinom. Mesto za glikozilaciju povezano za N je okarakterisano sekvencom: Asn - X - Ser ili Asn - X - Thr, pri čemu aminokiselinski ostatak označen sa X može biti bilo koji aminokiselinski ostatak izuzev prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka u cilju stvaranja ove sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za adiciju na N povezanog ugljenohidratnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu uklanjaju postojeći ugljenohidratni lanac povezan za N. Takođe, obezbeđeno je preuređivanje za N povezanih ugljenohidratnih lanaca kod kojih je jedno ili više za N povezanih mesta za glikozilaciju (tipično ona koja se prirodno javljaju) eliminisano i kod kojih je jedno ili više novih za N povezanih mesta stvoreno. Dodatne poželjne varijante antitela obuhvataju varijante sa cisteinom kod kojih je jedan ili više cisteinskih ostataka deletirano ili supstituisano drugim aminokiselinama (npr., serin) u odnosu na roditeljsku aminokiselinsku sekvencu. Cisteinske varijante mogu biti korisne onda kada se antitelo mora ponovo saviti u biološki aktivnu komformaciju, kao što je to slučaj nakon izolacije nerastvornih inkluzionih tela. Cisteinske varijante generalno imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina i tipično poseduju paran broj tih ostataka u cilju minimiziranja interakcija nastalih postojanjem neuparenih cisteina. ;Prema određenim rešenjima, aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za nastanak proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja i/ili (5) predstavljaju ili modifikuju druga fizičko-hemijska ili funkcionalna svojstva takvih polipeptida. Prema određenim rešenjima, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u određenim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se naprave u prirodnoj sekvenci (u određenim rešenjima, u delu polipeptida van domena koji stvaraju intermolekulske kontakte). U određenim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije tipično ne mogu značajno da menjaju strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr. zamena aminokiseline ne treba da narušava heliks koji postoji u roditeljskoj sekvenci ili da narušava druge tipove sekundarne strukture koji su karakteristični za roditeljsku sekvencu). Primeri u struci priznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura su opisani u publikaciji "Proteins, Structures and Molecular Principles", Creighton, urednik, W. H. Freeman & Companv, New York (1984); "Introduction to Protein Structure", C. Branden & J. Tooze, urednici, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); i Thornton et al., Nature, 354 : 105 (1991), koje su sve ovde inkorporirane po referenci. ;Dobijanje antitela;Strukturne jedinice prirodnih antitela su tipično tetrameri. Svaki takav tetramer se tipično sastoji od 2 identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" lanac kompletne dužine (u određenim rešenjima oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac kompletne dužine (u određenim rešenjima oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca tipično obuhvata varijabilni region od oko 100-110 ili više amino kiselina, koje su tipično odgovorne za prepoznavanje antigena. Na karboksi-terminalnom delu svakog lanca je tipično definisan konstantni region koji može biti odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su tipično klasifikovani kaoki A, laki lanci. Teški lanci su tipično klasifikovani kao u,, 8, y, a ili e i oni definišu izotip antitela IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. IgG poseduje nekoliko podklasa, uključujući, bez ograničenja, IgGl i IgG2, IgG3 i IgG4. IgM poseduje nekoliko podklasa, uključujući, bez ograničenja IgMl i IgM2. IgA je slično podeljena na podklase, uključujući, bez ograničenja, IgAl i IgA2. Tipično, u okviru lakih i teških lanaca pune dužine, varijabilni i konstantni regioni su povezani sa "J" regionom od oko 12 ili više amino kiselina, pri čemu teški lanac takođe sadrži "D" region od oko 10 ili više amino kiselina. Videti, na primer, "Fundamental immunologv", poglavlje 7 (Paul, W. ed., 2 izdanje, Raven Press, N.Y. ;(1989)) (koja je ovde uključena u celosti u bilo koju svrhu da se koristi). Varijabilni regioni para lakog i teškog lanca, tipično formiraju antigen-vezujuće mesto. ;Varijabilni regioni tipčno pokazuju istu opštu strukturu relativno konzerviranih okvirnih regiona (FR - framework) koji su povezani sa tri hipervarijabilna regiona, koji se takođe nazivaju regionima koji određuju komplementarnost ili CDR. CDR-ovi iz dva lanca svakog para su tipično poredani od strane okvirnih regiona, koji mogu da omoguće vezivanje za specifičan epitop. Od N-terminala do C-terminala, varijabilni regioni i lakih i teških lanaca tipično sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dodeljivanje amino kiselina svakom domenu tipično je u saglasnosti sa definicijama Kabat klasifikacije sekvenci proteina koji su od interesa za imunologiju (Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD (1987 i 1991)) ili su u saglasnosti sa definicijama datim u Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196 : 901 - 917 (1987); Chothia et al., Nature 342 : 878 - 883 (1989). ;Antitela su postala korisna od interesa kao farmakološka sredstava sa razvojem monoklonskih antitela. Monoklonska antitela se dobijaju korišćenjem bilo kog postupka kojim se dobijaju molekuli antitela iz kontinuiranih ćelijskih linija u kulturi. Primeri pogodnih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela obuhvataju postupke sa hibridomima koji su opisani u Kohler et al., 1975, Nature 256: 495 - 497, kao i postupak za dobijanje humanog B - ćelijskog hibridoma (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; i Brodeur et al., 1987, Monoklonal Antibodv Production Techniques and Applications; Marcel Dekker, Inc., New York, str. 51-63. ;Monoklonska antitela mogu da budu modifikovana za upotrebu kao terapeutska sredstva. Jedan primer predstavljaju "himerična antitela" u kojima je deo teškog lanca i/ili laki lanac identičan ili homolog sa odgovarajućom sekvencom u antitelima koja su izvedena iz određene druge vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homolog sa odgovarajućom sekvencom u antitelima koja su izvedena iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela. Drugi primeri su fragmenti ovih antitela sve dote dok ispoljavaju željenu biološk aktivnost. Videti, U.S. Patent broj 4,816,567; i Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 - 6855. Povezan sa tim jeste i razvoj "CDR-grafted" presađenih antitela, kod kojih antitelo sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost iz određene vrste ili koji pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) antitela identičan ili homolog sa odgovarajućom sekvencom u antitelima koja su izvedena iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela. ;Drugu novinu predstavljaju "humanizovana" antitela. Postupci za humanizaciju nehumanih antitela su dobro poznati u struci, (videti, U.S. patent broj 5,585,089 i 5,693,762). Generalno, humanizovano natitelo se dobija od određene životinje a zatim se određeni aminokiselinski ostaci, tipično iz delova antitela koji ne učestvuju u prepoznavanju antigena, modifikuju kako bi bili homologi navedenim ostacima u humanom antitelu odgovarajućeg izotipa. Humanizacija može biti izvedena, na primer, korišćenjem postupaka koji su poznati u struci (Jones et al., 1986, Nature 321: 522 - 525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeven et al., 1988, Science 239: 1524 - 1536), supstitucijom barem jednog dela varijabilnog regiona glodara za odgovarajuće regione humanog antitela. ;Skoriji i više obećavajući jeste razvoj humanih antitela bez izlaganja antigena ljudskom organizmu ("potpuno humano antitelo"). Korišćenjem transgenih životinja (npr., miševa) koje su sposobne za proizvodnju repertoara humanih antitela u odsustvu proizvodnje endogenih mišijih imunoglobulina, omogućeno je da se takva natitela proizvode imunizacijom sa antigenom (koji tipično ima najamnje 6 uzastopnih aminokiselina), koje je opciono konjugovano sa nosiocima. Videti, na primer, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 - 2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255 - 258; i Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7: 33. U jednom primeru ovih postupaka transgene životinje se proizvode onesposobljavanjem endogenih mišijih imunoglobulinskih lokusa koji kodiraju misije teške i lake imunoglobulinske lance, a zatim insercijom lokusa koji kodiraju proteine humanog teškog i lakog lanca u njihov genom. Parcijalno modifikovane životinje koje poseduju nepotpuni set modifikacija, se zatim ukrštaju kako bi se dobile životinje koje poseduju sve željene modifikacije imunog sistema. Kada se primeni imunogen, ove transgene životinje proizvode antitela koja su imunospecifična za ove antigene i koja imaju humane (a ne misije) aminokiselinske sekvence, uključujući odgovarajuće varijabilne regione. Videti PCT publikacije WO 96/33735 i WO 94/02602, koje su ovde inkrporirane prema referenci. Još postupaka opisano je u U.S. patentima broj 5,545,807, PCT publikaciji broj WO 91/100741, WO 90/04036 i u evropskim patentima EP 546073B1 i EP 546073A1, koji su ovde inkorporirani prema referenci. Humana natitela takođe mogu biti proizvedena ekspresijom rekombinantne DNK u ćelijama domaćinima ili ekspresijom u ćelijama hibridoma kao što je ovde opisano. ;Potpuno humana antitela, takođe mogu da se dobiju pomoću biblioteka faga (kao što je opisano u Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). Ovi procesi imitiraju imunu selekciju pomoću prikazivanja repertoara antitela na površini filamentoznog bakteriofaga i pomoću supsekventne naknadne selekcije faga na osnovu njihovog vezivanja za antigen po izboru. Jedna od takvih tehnika je opisana u PCT publikaciji broj WO 99/10494, koja je ovde inkorporirana po referenci a koja opisuje izolaciju antitela za MPL- i msk- receptore visokog afiniteta koji su po funkciji agonistika. ;Kada se odrede nukleotidne sekvence koje kodiraju takva antitela, himerična, CDR-transplantirana, humanizovana i potpuno humana antitela, takođe mogu da se dobiju korišćenjem rekombinantnih postupaka. Nukleinske kiseline koje kodiraju antitela se uvode u ćelije domaćine i eksprimiraju se korišćenjem materijala i postupaka koji su generalno poznati u struci. ;Predmetni pronalazak obezbeđuje jedno ili mnoštvo potpuno humanih monoklonskih antitela protiv humanog IL-1R1. Poželjno, antitela se vezuju za treći domen IL-1R1. U poželjnim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje nukleotidne sekvence koje kodiraju i aminokiselinske sekvence koje sadrže teški i laki lanac imunoglobulinskih molekula, posebno sekvence koje odgovaraju njihovim varijabilnim regionima. U poželjnim rešenjim aobezbeđene su sekvence koje odgovaraju regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), specifično regionima CDR1 - CDR3. U dodatnim poželjnim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske linije hibridoma koje eksprimiraju navedene imunoglobulinske molekule i koje proizvode monoklonska antitela, najpoželjnije prečišćena humana monoklonska antitela protiv humanog IL-1R1. ;Sposobnost da se klonira i rekonstruiše humani lokus veličine megabaze u veštačkim hromozomima gljivica (YAC - yeast artificial chromosomes), kao i sposobnost da se isti uvedu u mišije germinativne ćelije, predstavlja poželjni pristup razjašnjavanju funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa kao i za stvaranje korisnih modela humanih oboljenja. Dalje, korišćenje takve tehnologije za supstitucije mišijih lokusa sa njihovim humanim ekvivalentima, omogućava jedinstvene uvide u ekspresiju i regulaciju proizvoda humanog gena tokom razvoja, uvide u njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i uvide u njihovu uključenost u pokretanje i progresiju bolesti. ;Važna praktična primena takve strategije jeste "humanizacja" mišijeg humoralnog imunog sistema. Uvođenje humanih imunoglobulinskih Ig lokusa u organizam miša u kome su endogeni Ig geni inaktivirani daje mogućnost za proučavanje mehanizama koji se nalaze u osnovi programirane ekspresije i sklapanja antitela, ako i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Dalje, takve strategija obezbeđuje izvor proizvodnje potpuno humanih monoklonskih antitela (MAt), posebno za njihovu upotrebu kao terapijskih sredstava. Očekuje se da potpuno humana antitela minimiziraju imunogene i alergijske odgovore koji su svojstveni mišijim MAt- ova ili MAt- ova koji su izvedeni iz mišiji, a na taj način očekuje se i povećenje efikasnosti i sigurnosti primenjenih antitela pri terapijskim primenama. Potpuno humana antitela mogu da se koriste u tretmanu hroničnih i ponovo-javljajućih humanih oboljenja, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis i druga inflamatorna stanja, čiji tretman zahteva ponoovljenu primenu antitela. ;Stručnjak može genetskim inžinjeringom da stvori sojeve miševa koji su deficijentni za proizvodnju mišijih antitela sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa tako da miševi proizvode humana antitela u odsustvu mišijih antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu da sačuvaju veliku raznovrsnost varijabilnih gena kao i odgovarajuću regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Korišćenjem mišije mašinerije za diverzifikaciju antitela i njihovu selekciju i odsustvo imunološke tolerancije prema humanim proteinaima, reprodukovani repertoar humanih antitela u sojevima miševa obezbeđuje antitela visokog afiniteta protiv bilo kog antigena od interesa uključujući i humane antigene. Korišćenjem tehnologije hibridoma, mogu se dobiti i selekcionirati antigen specifična humana MAt željenom specifičnošću. ;U određenim rešenjima, stručnjak može da koristi konstantne regione iz drugih vrsta zajedno sa humanim varijabilnim regionima, tako da navedeni miševi proizvode himerična antitela. Antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju imunizacijom takvih životinja sa IL-1R1 pune dužine sa rastvorljivim oblicima IL-1R1 ili sa njegovim fragmentima. Videti, npr., internacionalnu patentnu prijavu WO 93/12227. ;CDR-ovi varijabilnih regiona lakog i teškog lanca anti-IL-lRl antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se transplantiraju na okvirne regione poreklom iz iste ili druge vrste. U određenim rešenjima, CDR-ovi varijabilnih regiona lakog i teškog lanca, anti-IL-1R1 antitela mogu da se transplantiraju na konsensus humanih okvirnih regiona. Da bi se dobio konsenzus humani okvirni region, okvirni regioni iz nekoliko aminokiselinskih sekvenci humanog teškog ili lakog lanca se poravnaju kako bi se identifikovala konsenzus aminokiselinska sekvenca. Okvirni regioni teškog ili lakog lanca anti-IL-lRl antitela mogu da se zamene sa okvirnim regionima iz različitih teških ili lakih lanaca. Retke aminokiseline u okvirnim regionima teških ili lakih lanaca anti-IL-lRl antitela se tipično ne zamenjuju dok ostatak aminokiseline okvirnog regiona može da se zameni. retke aminokiseline su specifične aminokiseline koje se nalaze na položajuma u kojima se obično ne nalaze kod okvirnih regiona. Transplantirani varijabilni regioni iz anti-IL-lRl antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se koriste sa konstantnim regionom koji je različit od konstantnog regiona anti-IL-lRl antitela. Alternativno, transplantirani varijabilni regioni su deo jednolančanog Fv antitela. Presađivanje CDR-ova je opisano, npr., u U.S. patentima 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 i 5,530,101, koji su ovde inkorporirani po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. ;U određenim rešenjima,predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-lRl antitela koja sadrže CDR1 region humanog teškog lanca, čija aminokiselinska sekvenca poseduje ID broj 61, sekvenca koja ima ID broj 62, i sekvenca koja ima ID broj 63; sadrži CDR2 region humanog teškog lanca čija sekvenca ima ID broj 64, sekvencu koja ima ID broj 65, sekvencu koja ima ID broj 66; i/ili CDR3 region humanog teškog lanca čija aminokiselinska sekvenca sekvenca ima ID broj 67, sekvencu koja ima ID broj 68, sekvencu koja ima ID broj 69. ;U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-lRl antitela, koja sadrže CDR1 region humanog lakog lanca aminokiselinska sekvenca poseduje ID broj 70 ili ID broj 71; CDR2 humanog teškog lanca čija aminokiselinska sekvenca poseduje ID broj 72 ili 73; i/ili CDR3region humanog teškog lanca čija aminokiselinska sekvenca poseduje ID broj 74 ili ID broj 75. ;Antitela, prema predmetnom pronalasku, se poželjno dobijajau korišćenjem transgenih miševa kod kojih je u ćelije koje proizvode antitela ubačen veći deo lokusa za proizvodnju humanih antitela, i koji su dalje tako genetski modifikovani da su deficijentni za proizvodnu endogenih mišijih antitela. Takvi miševi su sposobni za proizvodnju humanih imunoglobulinskih molekula i antitela i ne proizvode ili proizvode značajno smanjene količine mišijih imunoglobulinskih molekula ili antitela. Tehnologije kojima se postiže navedeno su opisane u patentima, patentnim prijavama i referencama koje su ovde opisane u specifikaciji. U poželjnim rešenjima,iskusni stručnjak može da koristi postupke koji su opisani u međinarodnoj patentnoj prijavi broj WO 98/24893, koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Videti, takođe, Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156, koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. ;Monoklonska antitela (MAt), prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju korišćenjem brojnih tehnika uključujući konvencionalnu metodologiju za dobijanje monoklonskih antitela, npr., standardu tehniku hibridizacije somatskih ćelija koja je opisana u Kohler & Milstein, 1975, Nature 256: 495. Iako su poželjni postupci hibridizacije somatskih ćelija u principu, mogu se koristiti druge tehnike za dobijanje monoklonskih antitela, npr., tehnike virusne ili onkogene transformacije B-limfocita. ;U poželjnom rešenju humana monoklonska antitela, koja su usmerena protiv IL-1R1 mogu da se dobiju korišćenjem miševa koji su označeni kao "HuMAt" miševa, koji sadrže minilokus humanog imunoglobulinskog gena koji kodira nerearanžirane sekvence humanog teškog (jx i y) iklakog lanca imunoglobulina zajedno sa ciljanim mutacijama kojim se aktiviraju endogeni u iklokusi (Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856 - 859). Shodno tome, kod miševa koji pokazuju smanjenu ekspresiju mišijih IgM iliklanaca u odgovoru na imunizaciju, uvedeni humani transgeni teški i laki lanac podležu procesu prekopčavanja klasa i procesu somatske mutacije kako bi se dobila visoko afinitetna humana IgGkmonoklonska antitela (Lonberg et al., gore navedeno; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann, N.Y. Acad. Sci. 764: 536). Proizvodnja HuMab miševa je detaljno opisana u Tavlor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287 - 6295; Chen et al., 1993, International Immunologv 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912 - 2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856 - 859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacologv 113: 49 - 101; Taylr et al., 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg& Huszar, 1995, Internat. Rev. Immunol. 13: 65 - 93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536 - 546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851, koje su ovde inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Videti dalje, U.S. patente 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; ;5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; svi podneti od Lonberg & Kay, kao i U.S. patente broj 5,545,807 podnet od Surani et al., međunarodne patentne prijave WO 93/1227, izdata 24 juna 1993; WO 92/22646, izdata decembra '92; i WO 92/03918, izdata u martu 1992, koje su ovde inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Alternativno, za proizvodnju humanih anti-IL-lRl antitela mogu da se koriste HCo7 i HCol2 sojevi trangenih miševa koji su opisani u primerima ispod. ;Poželjno, potpuno humana monoklonska antitela specifična za IL-1R1 se dobijaju na sledeći način. Transgeni miševi koji sadrže humane imunoglobulinske gene se imunizuju sa IL-1R1 antigenom od interesa. Dobijaju se limfne ćelije (kao što su T-ćelije) poreklom iz miševa, koje eksprimiraju antitela. Tako prikupljene ćelije se fuzionišu sa mijeloidnom ćelijskom linijom kako bi se dobile besmrtne ćelijske linije hibridoma, a potom se te ćelijske linije hibridoma ispituju i selekcioniraju kako bi se identifikovale one ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela koja su speacifična za antigen od interesa. U određenim rešenjima, obezbeđen je postupak za proizvodnju ćelijske linije hibridoma koja proizvodi antitela specifična za IL-1R1. ;U poželjnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku se dobijaju od strane hibridomskih ćelijskih linija. U ovim rešenjima, antitela, prema predmetnom pronalasku, se vezuju za IL-1R1 sa konstantom disocijacije (Ka) čija se vrednost kreće između 4 pM i lOOpM. U određenim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, antitela se vezuju za IL-1R1 sa Kdkoja je manja od oko 20 pM. U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku, se vezuju za treći domen IL-1R1. Na Slici 17 prikazane su nukleotidne i aminokislinske sekvence trećeg domena humanog i pacovskog IL-1R1. ;U poželjnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su IgGl, IgG2, ili IgG4 izotipa, pri čemu je najpoželjniji IgG2 izotip. U poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, antitela sadrže humaneklake lance i humane IgGl, IgG2 ili IgG4 teške lance. U određenim rešenjima, varijabilni regioni antitela su ligirani sa konstantnim regionima koji se razlikuju od konstantnog regiona IgGl, IgG2 ili IgG4 izotipa. U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su klonirana za ekspresiju u ćelijama sisara. ;U određenim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije u teškom i lakom lancu anti-IL-lRl antitela (kao i odgovarajuće modifikacije kodirajućih nukleotida) omogućavaju proizvodnju anti-IL-lRl antitela sa funkcionalnim hemijskim karakteristikama, koje su slične anti-IL-lRl antitelu. Nasuprot tome zančajna modifikacija funkcionalnih i/ili hemijskih karakteristika anti-IL-lRl antitela, mogu da se postignu izborom supstitucija aminokiselinskih sekvenci teškog i lakog lanca koje se značajno razlikuju po svom efektu na održavanje: (a) strikture molekulskog skeleta u području supstitucije, tako što dovode do promene naborane ili heliksne konformacije, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu ili (c) većeg dela bočnog lanca. ;Na primer, "konzervativna aminokiselinska supstitucija" obuhvata supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka sa ne nativnim ostatkom, tako da efekat na polarnost il ina naelektrisanje aminokiselinkskog ostatka na tom položaju ne postoji ili je mali. Dalje, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu takođe može biti supstituisan alaninom, što je prethodno opisano kod "alaninske mutageneze" (Wells, 1991, Methods Enzvmol. 202: 390; urednik J.J. Langone, Academic Press, London). ;Željene aminokiselinske supstitucije (konzervativne ili ne-konzervativne) mogu biti određene od strane stručnjaka u onom trenutku kada su takve supstitucije potrebne. U određenim rešenjima aminokiselinske supstitucije mogu da se koriste za identifikaciju važnih ostataka anti-IL-lRl antitela, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta anti-IL-lRl antitela koja su ovde opisana. ;U alternativnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku, mogu da se eksprimiraju u ćelijskim linijama koje se razlikuju od hibridomskih ćelijskih linija. U ostalim rešenjima, sekvence koje kodiraju određeno antitelo, mogu da se koriste za transformaciju odgovarajućih ćelija domaćina sisara. Shodno ovim rešenjima transformacija može da se izvede korišćenjem bilo kog postupka za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virusnu partikulu (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili uključujući postupke transfekcije koji su poznati u struci. Navedeni postupci su opisani u U.S. patentima 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 i 4,959,455 (koji su ovde u potpunosti uključeni po referenci u bilo koju svrhu da se koriste). Generalno, postupak transformacije koji se koristi može da zavisi od ćelije domaćina koja treba da bude transformirana, postupci za uvođenje heterologih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznate u struci i obuhvataju bez ograničenja, tranfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, tranfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroforaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozome, i direktno mikroinjektiranje DNK u jedro. ;Prema određenim rešenjima postupaka, prema predmetnom pronalasku, molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, varijabilnog regiona teškog lanca, konstantnog regiona lakog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca, anti-IL-lRl antitela, prema predmetnom pronalasku se ubacuje u odgovarajući vektor ekspresije korišćenjem standardnih tehnika ligacije. U poželjnom rešenju, konstantni region teškog lanca ili lakog lanca IL-1R1 antitela se dodaje na C- terminal odgovarajućeg varijabilnog regiona, a potom se ligira u vektor ekspresije. Vektor je tipično izabran kako bi bio funkcionalan u odgovarajućij ćeliji domaćinu koja se koristi (tj. vektor je kompatibilan sa mašinerijom ćelije domaćina, tako da može da dođe do amplifikacije gena i/ili ekspresije tog gena). Radi revijskog pregleda vektora ekspresije videti, Goeddel (urednik), 1990, Meth. Enzvmol. Vol. 185, Academic Press, N.Y. ;Tipično, vektori ekspresije koji se koriste u bilo kojoj ćeliji domaćinu asadrže sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence koje se kolektivno označavaju kao "bočne sekvence" u određenim rešenjima tipično obuhvataju jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promoter, jednu ili više pojačivačkih sekvenci, mesto početka replikacije, sekvencu za terminaciju transkripcije, kompletnu intronsku sekvencu koja sadrži donorsko i akceptorsko mesto isecanja, sekvencu koja kodira vodeću sekvencu za sekreciju polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, sekvencu za poliadenilaciju, poli-veznički region za inserciju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba da bude eksprimiran i element selektibilnog markera. Svaka od navedenih sekvenci se diskutuje u tekstu koji sledi. ;Opciono, vektor može da sadrži sekvencu koja kodira "oznaku", tj., oligonukleotidni molekul koji je lociran na 5' ili 3' kraju kodirajuće sekvence za IL-1R1 polipeptid; pri čemu oligonukleotidna sekvenca kodira poli-His (kao što je hexa-His) ili drugu "oznaku" kao što su FLAG, HA (hemaglutinin inflenca virusa), ilimycza koje postoje komercijalno dostupna antitele. Navedena oznaka je tipično fuzionisana sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili detekciju IL-1R1 antitela. Afinitetno prečišćavanje može da se postigne, npr., upotrebom hromatografije na koloni korišćenjem antitela kao afinitetnog matriksa. Opciono, oznaka nakon toga može da bude uklonjena, iz prečišćenog IL-1R1 polipeptida na različite načine kao što je korišćenje određenih peptidaza za cepanje oznake. ;Bočne sekvence mogu biti homologe (tj., poreklom iz iste vrste i/ili soja kao što je ćelija domaćin), heterologi (poreklom izvrste koja se razlikuje od vrste ćelija domaćina ili njegovog soja), hibridne (tj., kombinacija bočnih sekvenci iz više od jednog izvora) sintetske ili nativne. Tako, izvor bočne sekvence može biti bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bio koji kičmenjak ili beskičmenjak ili bilokoja biljka uz uslov da je bočna sekvenca funkcionalna u i da može biti aktivirana od strane mašinerije ćelije domaćina. ;Bočne sekvence koje su korisne u vektorima prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju na bilo koj iod pozmatih postupaka u struci. Tipično, bočne sekvence koje su ovde korisne, prethodno su identifikovane mapiranjem i/ili razgradnjom restrikcionim endonukleazama , tako da mogu biti izolovane iz odgovarajućeg tkivnog izvora, korišćenjem odgovarajućih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, pune nukleotidne sekvence bočnih sekvenci mogu biti već poznate. Tako, bočna sekvenca može biti sintetisana korišćenjem postupaka koji su ovde opisani za sintezu ili kloniranje nukleinskih kiselina. ;Kada je celokupna ili samo deo bočne sekvence poznat, tada bočna sekvenca može da se dobije korišćenjem lančane reakcije polimeraza (PCR) i/ili pretragom genomskih biblioteka sa odgovarajućom probom, kao što su oligonukleotid i/ili fragment bočne sekvence iz iste ili druge vrste. Kada je bočna sekvenca nepoznata, fragment DNK koji sadrži bočnu sekvencu može biti izolovan iz većeg dela DNK, koji može da sadrži npr., kodirajuću sekvencu ili čak drugi gen ili druge gene. Izolacija može da se izvede, razlaganjem restriktivnim endonukleazama kako bi se dobio odgovarajući DNK fragment a nakon toga sledi izolacija korišćenjem prečišćavanja na agaroza gelu, korišćenjem hromatografije na Qiagen<®>koloni (Chatsworth, CA) ili korišćenjem drugih postupaka koji su poznati iskusnom stručnjaku. Izbor odgovarajućih enzima za postizanje navedenog je jasan prosečno obrazovanom stručnjaku. ;Mesto početka replikacije je tipično deo onih prokariotskih vektora ekspresije koji se dobijajau komercijalno, a mesto početka replikacije pomaže u amplifikaciji vektora u ćeliji domaćinu. Ukoliko vektor po izboru ne sadrži mesto početka replikacije, ono može biti hemijski sintetizovano na osnovu poznate sekvence, a potom ligirano u vektor, na primer, mesto početka replikacije za plazmid pBR322 (New England Biolabs, Beverlv, MA) je pogodno za većinu gram negativnih bakterija, a mesto početka replikacije različitih virusa (npr., SV40, polioma virus, adenovirus, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), ili papiloma viruse kao šti su HPV ili BPV) je korisno za kloniranje vektora u sisarskim ćelijama. Generalno, mesto početka replikacije, kao komponenta nije potrebno za ekspresione vektore sisarskog porekla (na primer., SV40 mesto početka replikacije se često koristi samo zato što sadrži rani virusni promoter). ;Sekvenca ze terminaciju transkripcije je tipično locirana na 3' kraju, kodirajućeg regiona za polipeptid i služi ta okončavanje transkripcije. Obično sekvenca za terminaciju transkripcije u prokariotskim ćelijama jeste fragment bogat G-C parovima nakon koga sledi poli-T sekvenca. Ova sekvenca se lako klonira iz genomske biblioteke ili čak može i komercijalno da se nabavi kao deo vektor, ali takođe može biti lako sintetisana korišćenjem postupaka za sintezu nukleinske kiseline, kao što su oni koji su ovde opisani. ;Gen za selektibilni marker kodira protein, koji je potreban za preživljavanje i rast ćelije domaćina kada se on uzgaja na selektivnoj podlozi. Tipični geni za selekcioni marker kodiraju proteine koji: (a) ispoljavaju rezistenciju prema antibioticima ili drugim toksinima, npr., prema ampicilinu, tetraciklinu ili kanamicinu za prokariotske ćelije domaćine; (b) komplementiraju auksotrofne deficijencije ćelije ili (c) obezbeđuju kritično važne hranljive sastojke koji se ne nalaze u kompleksnim ili definisanim podlogama. Poželjni selektibilni markeri su gen za kanamicinsku rezistenciju, gen za ampicilinsku rezistenciju i gen za tetraciklinsku rezistenciju. Gen za neomicinsku rezistenciju takođe može da se koristi za selekciju i kod prokariotskih i kod eukariotskih ćelija domaćina. ;Za amplifikaciju gena koji će biti eksprimiran mogu da se koriste i drugi selektibilni geni. Amplifikacija je proces u kome geni za čijim proteinima postoji povećana potreba i koji su tipični za rast ili preživljavanje ćelije bivaju generalno ponovljeni u vidu tandemskih sekvenci u okviru hromozoma sukcesivnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri odgovarajućih selektibilnih markera za sisarske ćelije obuhvataju dihidrofolat reduktazu (DHFR) i timidin kinazu bez promotera. Transformanti sisarskih ćelija se izlažu uslovima selekcionog pritiska u kojima su samo poželjni transformanti jedinstveno adaptirani da prežive zahvaljujući selektibilnom genu koji je prisutan u vektoru. Selekcioni pritisak se ostvaruje kultivacijom transformiranih ćelija u uslovima u kojima se koncentracija sredstva za selekciju u podlozi sukcesivno povećava, što dovodi do amplifikacije i selektibilnog gena i DNK koja kodira drugi gen, kao što je gen za IL-1R1 polipeptid, koji se nalazi u vektoru, kao posledica ovoga, usled amplifikacije DNK dolazi do povećanja sinteze polipeptida kao što je i IL-1R1 polipeptid. ;Mesto vezivanja ribozoma je obično potrebno za inicijaciju translacije sa iRNK i ono je predstavljeno Shine-Dalgarno sekvencom (prokarioti) ili Kozak sekvencom (eukarioti). Ovaj element je tipično lociran na 3' kraju u odnosu na promoter i na 5' kraju u odnosu na kodirajuću sekvencu polipeptida koji treba da bude eksprimiran. ;U nekim slučajevima, kao u slučaju kada je poželjna glikolizacija u ekspresionom sistemu eukariotske ćelije domaćinu, moguće je manipulisati različitim pre- ili pro-sekvencama kako bi se pospešila glikozilacija ili kako bi se povećao prinos. NA primer moguće je izmeniti mesto cepanja pomoću peptidaze odgovarajućeg signalnog peptida ili je moguće dodati pro- sekvence, što takođe može da utiče na glikozilaciju. Konačni proteinski proizvod može da poseduje na -1 položaju (u odnosu na prvu mainokiselinu zrelog proteina) jednu ili više dodatnih aminokiselina, neposredno nakon ekspresije, koje ne moraju u potpunosti da budu uklonjene. Na primer, konačnui proteinski proizvod može da poseduje jedan ili dva aminokiselinska ostatka koja se nalaze na mestu cepanja peptidazom i koji su prikačeni za amino- terminal. Alternativno, korišćenje nekih mesta cepanja enzimom može da dovede do pojave lako okrnjene verzije željenog polipeptida, ukoliko enzim vrši ceoanje na odgovarajućem području u okviru zrelog polipeptida. ;Ekspresioni i klonirajući vektori prema predmetnom pronalasku tipično sadrže promoter koji može biti prepoznat od strane organizma domaćina, a koji je operativno povezan za moelkul koji kodira anti-IL-lRl antitelo. Promoteri predstavljaju sekvence sa kojih se ne vrši transkripcija i sa kojih su locirane uzvodno (tj. na 5' kraju) u odnosu na start kodon strukturnog gena (generalno na oko 10 do 1000 bp u odnosu na start kodon) i kontroliše transkripciju navedenog strukturnog gena. Promoteri se konvencionalno grupišu jednu od dve klase: inducibilni promoteri i konstitutivni promoteri. Inducibilni promoteri dovode do povećanja transkripcije sa DNK koja se nalazi pod njihovom kontrolom u odgovoru na neke promene u uslovima kultivacije, kao što su prisustvo ili odsustvo hranljive supstance ili promene u temperaturi. Konstitutivni promoteri sa druge strane dovode do kontinualne proizvodnje produkata gena; tj., imaju malu ili nemaju nikakvu kontrolu nad ekspresijom gena. Veliki broj promotera koji su prepoznati od strane brojnih potencialnih ćelija domaćina, su dobro poznati u struci. Odgovarajući promoter je operativno povezan sa DNK koja kodira teški lanac ili laki lanac u okviru anti-IL-lRl antitela, prema predmetnom pronalasku, a dobij a se uklanjanjem promotera iz izvora DNK, digestijom restrikcionim enzimima i insercijom sekvence željenog promotera u vektor za ekspresiju. ;Odgovarajući promoteri koji se koriste kod gljivica su takođe dobro poznati u struci. Sa promoterima gljivica se poželjno koriste pojačivači za gljivice. Odgovarajući promoteri koji se koriste kod sisarskih ćelija domaćian su dobro poznati i obuhvataju, bez ograničenja one koji su dobijeni iz genoma virusa kao što su polioma virus, pileći poks virus, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičiji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirusi, hepatits-B virus i naj poželjniji je Simian Virus 40 (SV40). Drugi pogodni promoteri za sisarske ćelije obuhvataju heterologe sisarske promotere, npr., promotere proteina toplotnog udara i promoter za aktin. ;Dodatni promoteri koji mogu biti od koristi obuhvataju, bez ograničenja: rani promoter SV40 (Bernoist & Chambon, 1981, Nature 290 : 304 - 10); CMV promoter; promoter koji se nalazi u 3' dugoj terminalnoj repetitivnoj sekvenci Rous sarkoma virusa (Yamamoto et al., 1980, Cell 22 : 787 - 97); promoter herpes timidin kinaze (Wagner et al., 1981, Proc. natl. Acad. Sci. USA 78 : 1444 - 45); regulatorne sekvence iz gena za metalotionin (Brinster et al., 1982, Nature 296 : 39 - 42); prokariotske ekspresione vektore, kao stoje promoter p-laktamaze (Villa - Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 3727 - 31); ili tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 21 - 25). Takođe, od interesa su sledeći animalni kontrolni regioni transkripcije, koji pokazuju tkivnu specifičnost i koji se koriste kod transgenih životinja: kontrolni region gena za ekstazu I koji je aktivan u ćelijama pankreasnih acinusa (Swift et al., 1984, Cell 38 : 639 - 46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399 - 409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7 : 425 - 515); kontrolni region insulinskog gena koji je aktivan u pankreasnim P ćelijama (Hanahan, 1985, Nature 315 : 115 - 22); kontrolni region imunoglobulinskog gena koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosscheld et al., 1984, Cell 38 : 647 - 58; Adames et al., 1985, Nature 318 : 533 - 38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 1436 - 44); kontrolni region virusa mišijeg tumora dojke koji je aktivan u testikularnim ćelijama, ćelijama dojke, limfoidnim i mast ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45 : 485 - 95); kontrolni region albuminskog gena koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 : 268 - 76); kontrolni region a-feto proteina koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5 : 1639 - 48; Hammer et al., 1987, Science 235 : 53 - 58); kontrolni region a-l-antitripsin gena koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1 : 161 - 71); kontrolni region p globina koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315 : 338 - 40; Kollias et al., 1986, Cell 46 : 89 - 94); kontrolni region gena baznog proteina mijelina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama mozga (Readhead et al., 1987, Cell 48 : 703 - 12); kontrolni region gena za miozinski laki lanac 2 koji je aktivan u skeletnom mišiću (Sani, 1985, Nature 314 : 283 - 86); i kontrolni region gena za oslobađajući hormon za gonadotropne hormone koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234 : 1372-78). ;Pojačavačka sekvenca može biti ubačena u vektor kako bi se povećala transkripcija sa DNK koja kodira laki ili teški lanac anti-IL-lRl antitela prema predmetnom pronalasku kod viših eukariota. Pojačavači su c/s-delujući elementi DNK, obično oko 10 - 300 bp dugi, koji deluju na promoter kako bi povećali ekspresiju. Pojačivači su relativno nezavisni od orijentacije i položaja. Nalaze se i na 5' i na 3' položajima u odnosu na transkripcionu jedinicu. Poznato je nekoliko pojačavačkh sekvenci poreklom iz gena sisara (npr., gena za globin, elastazu, albumin, a-fetoprotein i insulin). Tipično, međutim, koriste se pojačavači iz virusa. Primeri pojačavačkih elemenata za aktivaciju eukariotskih promotera koji su poznati u struci su pojačavač SV40, pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma i pojačivač adenovirusa. Iako pojačivač može da se nalazi u vektoru i na položaju 5' i na položaju 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu, tipično je lociran na 5' položaju u odnosu na promoter. ;Ekspresioni vektori prema predmetnom pronalasku mogu da se konstruišu iz početnog vektora, kao što je neki komercijalno dostupni vektor. Takvi vektori mogu, mada ne moraju, da sadrže sve željene bočne sekvence. Onda kada jedna ili više bočnih sekvenci koje su ovde opisane nije prisutno u vektoru, one se mogu individualno nabaviti i ligirati u vektor. Postupci koji se ovde koriste za dobijanje svake od bočnih sekvenci su dobro poznati stručnjacima. ;Pošto je vektor konstruisan i kada su na odgovarajuće mesto u vektoru ubačeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju laki lanac, teški lanac ili laki i teški lanac koji se nalaze u anti-IL-lRl antitelu, kompletni vektor može biti ubačen u odgovarajuću ćeliju - domaćina radi amplifikacije i/ili ekspresije polipeptida. Transformacija ekspresionog vektora za anti-IL-lRl antitelo u odabranoj ćeliji - domaćinu može da se postigne dobro poznatim postupcima uključujući transfekciju, infekciju, ko-precipitaciju sa kalcijum fosfatom, elektroporaciju, mikroinjekciju, lipofekciju, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, ili drugim poznatim tehnikama. Izabrani postupak je delimično zavistan od tipa ćelije - domaćina koja treba da se koristi. Ovi postupci i drugi odgovarajući postupci su dobro poznati iskusnom stručnjaku i opisani su, na primer, u Sambrook et al., navedeno iznad. ;Ćelija - domaćin, kada je kultivisana pod odgovarajućim uslovima, sintetiše anti-IL-1R1 antitela koja nakon toga mogu da se prikupe iz podloge kulture (ukoliko ih ćelija - domaćin sekretuje u podlogu) ili direktno iz ćelije - domaćina koja ih proizvodi (ukoliko ih ne sekretuje). Izbor odgovarajuće ćelije - domaćina zavisi od različitih činilaca, kao što su željeni nivoi ekspresije, polipeptidne modifikacije koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što su glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća sklapanja u biološki aktivni molekul. ;Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju, dobro su poznate u struci i obuhvataju, bez ograničenja, imortalizovane ćelijske linije koje su dostupne u Američkoj kolekciji tipskih kultura (ATCC), uključujući, bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije), HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK ćelije), ćelije bubrega majmuna (COS ćelije), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2) i brojne druge ćelijske linije. U određenim rešenjima, ćelijske linije mogu da se izaberu putem određivanja ćelijske linije sa visokim nivoima ekspresije koja konstitutivno proizvodi antitela sa svojstvom vezivanja za IL-1R1. U drugim rešenjima, takođe može biti izabrana ćelijska linija iz B ćelijske loze koja ne proizvodi svoja antitela, ali koja poseduje kapacitet za proizvodnju i sekreciju heterologih antitela (npr., mišije mijelomske ćelijske linije NSO i SP2/0). ;Antitela prema predmetnom pronalasku su korisna za detektovanje IL-1R1 u biološkim uzorcima i za identifikaciju ćelija ili tkiva koja proizvode IL-1R1 protein. Navedena antitela koja se vezuju za IL-1R1 i koja blokiraju interakciju ovog proteina sa drugim jedinjenjima koja se vezuju za ovaj protein koriste se u lečenju oboljenja koja su posredovana sa IL-1R1. U poželjnim rešenjima, anti-IL-lRl antitela mogu da blokiraju vezivanje IL-1R1 za IL-1 P ili IL-la, što može da dovede do prekidanja kaskade prevođenja signala koje je pokrenuto sa IL-1. ;Antitela prema predmetnom pronalasku koja se specifično vezuju za IL-1R1 mogu biti od koristi u lečenju oboljenja posredovanih sa IL-1, kao što je diskutovano u tekstu koji sledi. Navedena antitela mogu da se koriste u testovima vezivanja za detekciju vezivanja za IL-1R1, kao i za procenu sposobnosti jedinjenja da inhibiraju IL-1R1 da stvara komplekse sa IL-ip i IL-1R akcesornim proteinom (IL-IRAcP) ili sa IL-la i IL-IRacP. ;U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje medicinskih poremećaja koji su udruženi sa inflamatornim reakcijama koje su posredovane sa IL-1 ili sa imunoregulatornim reakcijama koje su posredovane sa IL-1. Postupci prema predmetnom pronalasku obuhvataju primenu anti-ILIRl antitela prema predmetnom pronalasku kod pojedinca koji je zahvaćen inflamatornom ili imunoregulatornom bolešću koja je posredovana sa IL-1. Kao što se ovde koriste, pojamovi "bolest", "oboljenje", "medicinsko stanje" ili "abnormalno stanje" se koriste naizmenično sa pojmom "medicinski poremećaj". ;U oderđenom rešenju, postupci prema predmetnom pronalasku obuhvataju primenu kod pacijenta anti-IL-lRl antitela prema predmetnom pronalasku, čime se sprečava vezivanje IL-1 za njegov površinski ćelijski receptor (IL-1R1). ;U cilju lečenja medicinskog poremećaja koji se karakteriše nenormalnom ili ekscesivnom ekspresijom IL-1 ili nenormalnom ili ekscesivnom aktivnošću IL-1 signalnog puta, kod pacijenta se primenjuje molekul koji sadrži antitelo specifično za IL-1R tipa I prema predmetnom pronalasku u količini i tokom vremena koji su dovoljni da dovedu do poboljšanja koje se održava makar jednog pokazatelja ozbiljnosti poremećaja. Smatra se da se poboljšanje "održava" ukoliko pacijent pokazuje poboljšanje u najmanje dva ispitivanja u razmaku od jedne do četiri nedelje. Stepen poboljšanja se određuje na osnovu znakova i simptoma, a mogu se koristiti i upitnici koje popunjav pacijent, kao što su upitnici o kvalitetu života. ;Različiti pokazatelji koji daju sliku ozbiljnosti oboljenja mogu da se koriste za određivanje da li su količina preparata i vreme tretmana adekvatni. Osnovna vrednost za izabrani pokazatelj ili pokazatelje se utvrđuje pregledom pacijenta pre primene prve doze antitela. Poželjno, osnovne vrednosti se određuju 60 dana pre primene prve doze. Ukoliko se IL-1R antitelo koristi za lečenje akutnih simptoma, kao što su, na primer, traumateske povrede (traumatska povreda kolena, moždani udar, povreda glave itd.), prva doza se primenjuje što je moguće pre nakon povrede ili pojave poremećaja. ;Poboljšanje se proizvodi ponavljanjem primene doze antitela sve dok se kod pacijenta ne manifestuje poboljšanje u odnosu na osnovnu vrednost koja je izabrana za pokazatelj. Kod tretiranja hroničnih stanja, ovaj stepen poboljšanja se ostvaruje ponavljanjem primene navedenog medikamenta u periodu od najmanje jednog meseca ili duže, npr., tokom dva ili tri meseca ili duže, ili neograničeno dugo. Za lečenje akutnih stanja, obično je dovoljan period od jednog do šest nedelja ili čak samo jedna doza medikamenta. ;Iako je stepen ozbiljnosti oboljenja pacijenta nakon tretmana obično blaži na osnovu jednog ili više pokazatelja, tretman može da se nastavi neograničeno dugo u istoj dozi ili u manjoj dozi ili sa manjom učestalosti primene. Ukoliko se tretman samnji ili prekine, naknadno može da se vrati na početni nivo, ako se sumptomi ponovo jave. ;Može da se koristi svaki način za terapijsku primenu antiteila koji je efikasan. Antitelo može da se injektira intra-artikularno, intravenski, intramuskularno, intralezionalno, intraperitonealno, intrakranijalno, inhalacijom ili subkutano, u vidu bolusa ili kontinuirane infuzije. Na primer, kod plućnih oboljenja mogu da se koriste intranazalni i inhalacioni postupci. Drugi pogodni načini primene obuhvataju primenu pilila, sirupa, bombona ili žvakaće gume, kao i topijskih preparata kao što su losioni, sprejevi, masti ili drugi pogodni načini primene. Primena inhalacijom je posebno pogodna kada se leče oboljenja koja su udružena sa plućnim poremećajima. ;U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, anti-IL-lRl antitelo prema predmetnom pronalasku može da se primeni jednom mesečno. U drugom rešenju, antitelo se primenjuje jednom na svake dve nedelje ili jednom nedeljno pri lečenju različitih medicinskih poremećaja koji su ovde opisani. U još jednom rešenju, antitelo se primenjuje najmanje dva puta nedeljno, a u drugom rešenju se primenjuje jednom dnevno. Odrasli pacijent je osoba koja ima 18 ili više godina. Ukoliko se injektira, efikasna količina za odrasle se nalazi u opsegu od 1 - 200 mg/m<2>, ili 1 - 40 mg/m<2>, ili oko 5-25 mg/m<2>. Alternativno, može da se primenjuje doza koja ne zavisi od telesne površine i ona se nalazi u opsegu od 2 - 400 mg/dozi, 2-100 mg/dozi, ili od 10-80 mg/dozi. Ukoliko doza treba da se primeni više od jednom nedeljno, primeri opsega doze su isti kao oni koji su već opisani ili su manji. U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, razna stanja koja su indikacije za primenu medikamenta i koja su opisana dole se tretiraju primenom preparata koji je prihvatljiv za injektiranje i koji sadrži antitelo za IL-1 receptor u dozi od 80 - 100 mg, ili alternativno, 80 mg/dozi. Doza se primenjuje ponavljano. Ukoliko se koristi način primene koji se razlikuje od injektiranja, doza se na odgovarajući način podešava shodno uobičajenoj medicinskoj praksi. Na primer, ukoliko je nalin primene inhalacija, doziranje može biti od 1 do 7 puta nedeljno u količini od 10 mg do 50 mg po dozi. ;U opoželjnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže terapijski efikasnu količinu jednog ili mnoštva antitela prema predmetnom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentom, nosiocem, solubilizerom, emulzifikatorom, konzervansom i/ili adjuvansom. Poželjno, prihvatljivi materijali za formulacije nisu toksični za recipijente u dozama i koncentracijama koje se koriste. U poželjnim rešenjima, obezbeđeni su farmaceutski pereparati koji sadrže trapijski efikasnu količinu anti-IL-lRl antitela. ;U određenim rešenjima, farmaceutski preparat može da sadrži formulacione materijale za modifikaciju, održavanje ili čuvanje, na primer, pH vrednosti, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, adsorpcije ili penetracije preparata. U takvim rešenjima, odgovarajući formulacioni materijali obuhvataju, bez ograničenja, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidantna sredstva (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit); pufere (kao što su boratni, bikarbonatni, Tris - HC1, citratni, fosfatni ili puferi drugih organskih kiselina); sredstva za bubrenje (kao što su manitol ili glicin); helirajuća sredstva (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za stvaranje komleksnih jedinjenja (kao što su kafein, polivinilpirolidon, p-ciklodekstrin ili hidroksipropil-P-ciklodekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serumski albumin, gelatin ili imunoglobuline); veštačke boje, arome i sredstva za razblaživanje; sredstva za emulgovanje; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske mase; katjone za formiranje soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što je benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselna ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za ovlaživanje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati, kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za pospešivanje stabilnosti (kao što su sukroza ili sorbitol); sredstva za uspostavljanje toniciteta (kao što su metalni halidi, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbito,); vehikulume za dopremanje; diluente; ekscipijente i/ili farmaceutske adjvante. Videt Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje (urednik A.R. Gennaro), 1990, Mack Publishing Companv. ;U određenim rešenjima, optimalni farmaceutski preparat se određuje od strane stručnjaka na osnovu, na primer, željenog načina primene, oblika za dopremanje i željene doze. Videti, na primer, "Remingtnon's Pharmaceutical Sciences", navedeno iznad. U određenim rešenjima, takvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu otpuštanjain vivoi brzinuin vivoklirensa antitela prema predmetnom pronalasku. ;U određenim rešenjima, primarni vehikulum ili nosilac u farmaceutskom preparatu po prirodi može biti voda ili supstanca koja se razlikuje od vode. Na primer, odgovarajući vehikulum ili nosilac može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, moguće sa dodacima drugih materijala koji su uobičajeni za pareneteralnu primenu. Neutralni puferovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom, može predstavljati dalje rešenje vehikuluma. U poželjnim rešenjima, farmaceutski preparati sadrže Tris pufer čija je pH vrednost oko 7,0 - 8,5, ili acetatni pufer čija je pH vrednost 4,0 - 5,5, koji dalje mogu da sadrže sorbitol ili za njega odgovarajuću zamenu. U određenim rešenjima, preparat koji sadrži anti-IL-lRl antitela može da se pripremi za skladištenje mešanjem izabranog preparata koji poseduje željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za pripremanje formulacije ("Remingtnon's Pharmaceutical Sciences", navedeno iznad) u obliku liofilizovane smeše ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim rešenjima, preparat koji sadrži anti-IL-lRl antitela mogu da budu formulisana kao liofilizat korišćenjem odgovarajućeg ekscipijenta, kao što je sukroza. ;Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu biti namenjeni za parenteralnu primenu leka. Alternativno, preparati mogu biti namenjeni za inhalaciju ili za primenu preko digestivnog trakta, npr., za oralnu upotrebu. Preparati takvih farmaceutski prihvatljivih preparat poznati su stručnjacima. ;Poželjno, komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za određeno mesto primene. U određenim rešenjima, puferi se koriste za održavanje fiziološke pH vrednosti preparata ili nešto niže pH vrednosti, tipično u opsegu pH vrednosti od oko 5 do oko 8. ;Kada se planira parenteralna primena, terapeutski preparat za upotebu prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđen u obliku u kome nema pirogena i koji je u obliku vodenog rastvora prihvatljivog za parenteralnu primenu, koji sadrži željena anti-IL-1R1 antitela u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj se nalaze anti-IL-lRl antitela, pri čemu je preparat formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, koji se čuva na odgovarajući način. U određenim rešenjima, preparat može da obuhvati formulaciju željenog molekula sa sredstvima kao što su injektibilne mikrosfere, biorazložive čestice, polimerna jedinjenja (kao što su poliaktinska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji mogu da obezbede kontrolisano i dugotrajno otpuštanje proizvoda koji može zatim biti dopremljen posredstvom depo injekcije. U određenim rešenjima, takođe može da se koristi hijaluronska kiselina, koja može da pospeši dugotrajno otpuštanje leka u cirkulaciju. U određenim rešenjima, za primenu željenog molekula antitela mogu da se koriste implantabilni uređaji za dopremanje leka. ;Farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku može biti formulisan za inhalaciju. U ovim rešenjima, anti-IL-lRl antitela su poželjno formulisana u vidu suvog praha za inhalaciju. U poželjnim rešenjima, inhalacioni rastvor koji sadrži anti-IL-lRl antitela može takođe biti formulisan sa propelantom za dopremanje u obliku aerosola. U određenim rešenjima, rastvori mogu biti nebulizovani. Primena preko parenhima pluća je dalje opisana u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO94/20069, koja je ovde uključena po referenci i koja opisuje dopremanje hemijski modifikovanih proteina do pluća. ;Takođe, obimom zaštite predmetnog pronalaska je obuhvaćena oralna primena formulacija. Anti-IL-lRl antitela koja se primenjuju na ovaj način mogu biti formulisana sa ili bez nosioca koji se uobičajeno koriste u formulisanju čvrstih doznih oblika, kao što su tablete i kaspule. U određenim rešenjima, kapsula može biti tako dizajnirana da otpušta aktivni deo formulacije u deo gastrointestinalnog trakta u kome je biološka raspoloživost najveća, a presistemska razgradnja najmanja. Dodatna sredstva mogu biti uključena u formulaciju, kako bi se pospešila apsorpcija anti-IL-lRl antitela. Takođe, mogu se koristiti diluenti, veštačke arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, sredstva za suspendovanje, sredstva za dezintegraciju tableta i veznici. ;Farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku je poželjno obezbeđen tako da sadrži efikasnu količinu jednog ili mnoštva anti-IL-lRl antitela, u smeši sa netoksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi ili nekom drugom pogodnom vehikulumu, mogu se pripremiti rastvori u obliku jediničnih doza. Pogodni ekscipijenti obuhvataju, bez ograničenja, inertne diluente, kao što su kalcij um karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktozu ili kalcijum fosfat; ili vezujuća sredstva, kao što su škrob, gelatin ili akacija; ili lubrikante, kao što su magnezij um stearat, stearinska kiselina ili talk. ;Dodatni farmaceutski preparati će biti jasni stručnjacima, uključujući formulacije koje obuhvataju anti-IL-lRl antitela u obliku formulacija sa odloženim ili kontrolisanim otpuštanjem leka. Stručnjacima su takođe poznate brojne druge tehnike za formulisanje preparata sa produženim ili kontrolisanim otpuštanjem, kao što su formulacije sa lipozomima kao nosiocima, biorazgradivim mikročesficama ili poroznim prelicama i depo injekcijama. Videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu br. W093/15722, koja je ovde inkorporirana po referenci i koja opisuje kontrolisano otpuštanje farmaceutskog preparata korišćenjem poroznih polimernih mikročestica. Preparati sa produženim otpuštanjem mogu da obuhvate polupropusne polimerne matrikse koji su različito oblikovani, npr. kao filmovi ili mikrokapsule. Matriksi za produženo otpuštanje mogu da sadrže poliestre, hidrogelove, poliaktide (U.S. patent br. 3,773,919 i Evropska patentna prijava br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i y-etil-L-glutamata (Sidman et al., Biopolvmers, 22 : 547 - 556 ;(1983)), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167 - 277 ;(1981) i Langer, Chem. Tech., 12 : 98 - 105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al., gore navedeno) ili poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (Evropska patentna prijava br. EP 133,988). Preparati sa produženim otpuštanjem mogu takođe da obuhvate lipozome, koji se mogu dobiti na bilo koji način koji je poznat u struci. Videti, na primer, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688 - 3692 (1985); Evropske patentne prijave br. EP 036,676, EP 088,046 i EP 143,949, koje su sve inkorporirane po referenci. ;Farmaceutski preparati koji se koriste zain vivoprimenu su tipično sterilni. Sterilizacija se vrši filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je preparat liofilizovan, strilizacija koja koristi ovaj postupak se može izvesti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Preparati za parenteralnu upotrebu se mogu uskladištiti u liofilizovanom obliku ili u obliku rastvora. Preparati za parenteralnu upotrebu se generalno postavljaju u kontejner koji poseduje sterilni pristupni deo, kao što su, na primer, vreća za intravenski rastvor ili bočica koja poseduje zaštitnik koji se može probiti iglom za hipodermalne injekcije. ;Onda kada je farmaceutski preparat formulisan, može se uskladištiti u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidriram ili liofilizovani prašak. Takve formulacije se mogu uskladištiti ili u obliku za neposrednu upotrebu ili u obliku (npr. liofiliziranom) koji se rekonstituiše neposredno pre upotrebe. ;Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju pojedinačne doze za primenu. Kompleti prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže prvi kontejner koji sadrži suvi protein i drugi kontejner koji poseduje vodenu formulaciju. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, kompleti sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom ili sa više komora (npr. špricevi sa tečnošću i lio-špricevi). ;Terapijski efikasna količina farmaceutskog preparata koji sadrži anti-IL-lRl antitela namenjena terpijskoj primeni, zavisi, na primer, od terapijskog konteksa i postavljenih ciljeva. Stručnjak shvata da odgovarajući nivoi doza za lečenje delimično zavise od molekula koji se primenjuje, indikacije za koju se koriste anti-IL-lRl antitela, puta primene, kao i veličine (telesne mase, površine tela i veličine organa) i/ili od stanja (starosne dobi i opšteg zdravstvenog stanja) pacijenta. U određenim rešenjima, lekar može da podešava dozu i modifikuje put primene, kako bi se dobio optimalni terapijski efekat. Tipične doze mogu da se nalaze u opsegu od oko 0,1 ug/kg, do oko 100 mg/kg, u zavisnosti od činilaca koji su prethodno pomenuti. U poželjnim rešenjima, doze se nalaze u opsegu od oko 0,1 ug/kg do oko 100 mg/kg; poželjnije od 1 ug/kg do oko 100 mg/kg; a još poželjnije od oko 5 ug/kg do oko 100 mg/kg. ;Učestalost doze zavisi od farmakokinetskih parametara određenog anti-IL-lRl antitela koje se koristi u formulaciji. Tipično, lekar primenjuje preparat sve dok se ne postigne doza koja ispoljava željeni efekat. Peparat se može primeniti u obliku pojedinačne doze, dve ili više doza (koje mogu, a ne moraju, da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom određenog vremena, ili u obliku kontinuirane infuzije putem uređaja za primenu koji se implantira ili katetera. Dalja podešavanja odgovarajućih doza rutinski vrše stručnjaci i to spada u okvir njihovih rutinskih zadataka. Odgovarajuće doze mogu biti procenjene na osnovu odgovarajućih podataka o odnosu doze i odgovora na dozu. ;Put primene farmaceutskog preparata je u skladu sa poznatim putevima primene, npr., to je oralni, intravenski, intraperitonealni, intracerebralni (intraparenhimski), intracerebroventrikularni, intramuskularni, intraokularni, intraarterijski, intraportalni ili intralezionalni put primene, zatim to je primena putem sistema za produženo otpuštanje i putem implantabilnih uređaja. U određenim rešenjima, preparati se mogu primeniti injekcijom u bolusu ili kontinuirano infuzijom ili pomoću implantabilnog uređaja. ;Preparat se takođe može primeniti lokalno, implantacijom membrane, sunđera ili drugog pogodnog materijala na koji je željeni molekul apsorbovan ili u kome je enkapsuliran. U određenim rešenjima, kada se koristi implatnabilni uređaj, on se može implantirati u bilo koje odgovarajuće tkivo ili organ, a primena željenog molekula se može postići putem difuzije, bolusa koji se otpušta u određeno vreme ili putem kontinuirane primene. ;Preparat takođe može da se primeni lokalno putem implantacije membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala u kome je željeni molekul apsorbovan ili enkapsuliran. U odreženim rešenjima, kada se koristi uređaj za implantaciju, uređaj može da se implantira u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a dopremanje željenog molekula može da se ostvari putem difuzije, programiranog otpuštanja bolusa ili kontinuirane primene. ;Takođe, može biti poželjno da se farmaceutski peparati koji sadrže anti-IL-lRl antitela prema predmetnom pronalasku upotrebeex vivo.U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji treba da se uklone iz pacijenta, izlažu se farmaceutskom preparatu koji sadrži farmaceutski preparat sa anti-IL-lRl antitelima, nakon čega se te ćelije, tkiva i/ili organi ponovo implantiraju u pacijenta. ;Posebno, anti-IL-lRl antitela mogu da se primene implantacijom određenih ćelija koje su dobijene genetskim inženjeringom, korišćenjem postupaka kao što su oni koji su opisani ovde, u cilju eksprimiranja i sekrecije određenog polipepetida. U određenim rešenjima, te ćelije mogu biti životinjske ili ljudske i mogu biti autologe, heterologe ili ksenogene. U određenim rešenjima, ćelije mogu biti imortalizovane. U drugim rešenjima, u cilju smanjivanja verovatnoće pojave imunološkog odgovora, ćelije mogu biti inkapsulirane, kako bi se izbegla infiltracija okolnih tkiva. U daljim rešenjima, materijali za enkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polupropusni polimerni omotači ili membrane koje omogućavaju otpuštanje proteinskih proizvoda, ali sprečavaju razaranje ćelija od strane pacijentovog imunog sistema ili od strane drugih oštećujućih činilaca iz okolnog tkiva. ;U određenim rešenjima predmetni pronalazak, dalje, obuhvata primenu anti-IL-lRl antitela ili farmaceutskog preparata prema predmetnom pronalasku, zajedno sa jednim ili više lekova koji se primenjuju kod istog pacijenta, pri čemu se svaki od lekova primenjuje prema režimu koji je odgovarajući za taj lek. Ovo obuhvata prethodni tretman, simultani tretman, sekcencijalni tretman i naizmenične režime. Primeri ovakvih lekova obuhvataju, bez ograničenja antivirusne lekove, antibiotike, analgetike, kortikosteroide, antagoniste inflamatornih citokina, antireumatske lekove koji modifikuju bolesta, kao i ne steroidne antiinflamatorne lekove. ;U drugim rešenjima, anti-IL-lRl antitelo ili farmaceutski preparat, prema predmetnom pronalasku, mogu da se primeni sa drugim inhibitorima citokina, uključujući i one koji antagonizuju, npr., RANKL, TGFP, INPy, IL-6 ili IL8 i TNF, posebno TNFa. U kombinaciji sa IL-6, antitelo, prema predmetnom pronalasku, može da se koristi za lečenje ili sprečavanje nastanka ponovne pojave epileptičnih napada, uključujući napade koji su indukovani antagonizmom sa GABAa , napade koji su udruženei sa iktalnim EEG epizodama i sa motornim limbičkim napadima, koji se javljaju tokom epileptičnog statusa. U kombinaciji sa inhibitorom INFy antitelo prema predmetnom pronalasku je korisno za lečenje idiopatske plućne fibroze i cistične fibroze. Kombinacija antitela za IL-1 receptor i inhibitora za RANKL, npr., RANKL antitela, korisna je za sprečavanje nastanka destrukcije kosti u različitim situacijama, uključujući bez ograničenja, različite reumatske poremećaje, osteoporozu, multipli mijelom i druge malignitete, koji mogu da dovedu do degeneracije kostiili je ova kombinacija korisna u antitumorskoj terapiji čiji je cilj sprečavanje nastanka metastaza u kostima ili sprečavanje nastanka destrukcije kosti, koja je udružena sa nošenjem proteze ili sa periodontitisom. Dodatno, antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se primene u kombinaciji sa inhibitorima IL-17, kao što su rastvorljive formeIL-17 receptora (kao što je IL-17R:Fc) ili kao što je IL-17 antitelo ili IL-17R antitelo, IL-18 vezujući protein, rastvorljivi oblici IL-18 receptora i IL-18 antitela, antitela protiv IL-18 receptora ili antitela protiv CD30 Uganda ili protiv CD4. ;Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupke za korišćenje anti-IL-lRl antitela ili farmacutskog preparata, prema predmetnom pronalasku, u lečenju ovde opisanih medicinskih poremećaja u kombinaviji sa inhibitorom TNF, poželjno sa TNFR:Fc (ENBREL<®>), kao i u bilo kojoj kombinaciji sa gore opisanim citokinima ili inhibitorima citokina, koji su aktivni saastojci u kombinovanim terapijama. Na primer, prema predmetnom pronalasku postupci kombinovane terapije mogu da se upotrebe za lečenje reumatoidnog artritisa, moždanog udara astme, psotijaze itd. ;Stanja koja se efikasno leče preimenom anti-IL-lRl antitela ili farmacutskog preparata prema predmetnom pronalasku obuhvataju plućne bolesti kao što su astma, hronična opstruktivna bolest pluća, plućna alveolna proteinoza, bleomicinom izazvana pneumopatija i fibroza, radijacijom izazvana plućna fibroza, cistična fibroza, nakupljanje kolagena u plućima i ARDS, od kojih svi mogu da se leče kombinacijom antitela za IL-1R1 i inhibitora za IL-4 i/ili inhibitora za IL-13, npr., sa IL-4R antitelom koje inhibira IL-13 i IL-4 aktivnost. Opisana antitela i farmaceutski preparati, prema predmetnom pronalasku su takođe korisni za lečenje, bronho pulmonarne displazije (BPD); hroničnih opstruktivnih bolesti pluća (npr., enfizema i hroničnog bronhitisa), kao i hronične fibrozne bolesti pluća, prevremeno rođene dece. Dodatno jedinjenja, preparati i kombinovane terapije prema predmetnom pronalasku se koriste za lečenje bolesti pluća nastalih sa dejstvom spoljašnje sredine, uključujući azbestozu, rudarsku pneumokoniozu, silikozu ili slična stanja koja su udružena sa dugotrajnom izloženošću finim česticama. U drugim aspektima predmetnog pronalaska, opisana jedinjenja preparati i kombinovane terapije se koriste za lečenje bronhijalne organizovane pneumonije, plućne fibroze, uključujući idiopatsku plućnu fibrozu i radijacijom izazvanu plućnu fibrozu; za lečenje plućne sarkoidoze, kao i alergija, uključujući alergijski vinitis, kontaktni dermatitis, topijski dermatitis, i astmu. ;Navedene kombinovane terapije su korisne za lečenje pacijenata koji boluju od različitih poremećaja kože, ukjlučujući bez ograničenja dermatitisherpetiformis (Duringova bolest, atopični dermatitis, kontaktni dermatitis, urtikariu (uključujući hroničnu idiopatsku urtikaru) kao i autoimune bulozne bolesti uključujući pemphigus vulgaris i bulozni pemfigoid. Druga oboljenja koja se mogu lečiti kombinacijom IL-1R1 antitela i inhibitora IL-4 i/ili IL-13 obuhvataju mijastemiju gravis, sarkoidozu, uključujući plućnu sarkoidozu, sklerodermu, reaktivni artritis, hiper-Ig sindrom, plućnu sklerozu i idiopatski hiperhipereosinofilni sindrom, kombinovana terapija se takođe koristi za lečenje alergijskih reakcija na lekove i kao adjuvantna terapija u imunoterapiji alergije. ;Antitela za IL-1 receptor i farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku su korisni za lečenje protozoalnih bolesti uključujući i malariju i šistozomijazu i za lečenje ervthema nodosum leprosum; za lečenje bakterijskog ili virusnog meningitisa, tuberkuloze, uključujući plućnu tuberkulozu, i pneumoniju koja je sekundarne u odnosu na bakterijske ili virusne pneumonije nakon infekcije influencom i infektivnom mononukleozom. ;Kardiovaskularni poremećaji i oštećenja se mogu lečiti i/ili se može sprečiti njihov nastanak upotrebom bilo kog ovde opisanog farmaceutskog preparata ili samog anti-IL-lRl antitela ili primenom kombinovane terapije sa drugim inhibitorima citokina. Kardiovaskularni poremećaji koji mogu da se leče obuhvatajuaneurizmu aorte, uključujući anurizmu abdominalne aorte, akutni koronarni sindrom, arteritis, vaskularnu okluziju, ukjlučujući okluziju celebralne arterije; komplikacije nakon premošćavanja koronarnih arterija; povredu uzrokovanu ishemijom/reperfuzijom; bolesti srca uključujući aterosklerozu srca, miokarditis, uključujući hronični autoimuni miokarditis i virusni miokarditis; sračanu insuficijenciju, uključujući hroničnu sračanu insuficijenciju, zastojnu sračanu insuficijenciju, kaheksiju u sračanoj insuficijenciji; infark miokarda, restenozu i/ili aterioslerozu nakon hirurške intervencije na srcu ili nakon balon angioplastike karotidnih arterija; tihu ishemiju miokarda, disfunkciju levog srca, komplikacije nakon implantacije uređaja za pomoć funkciji levog srca; Reinoov fenomen, tromboflebitis, vaskulitis, uključujući Kavasakijev vaskulitis, venookluzivnu bolest, arteritis džinovskih ćelija, Vegenerovu grenolomotozu; mentalnu konfuziju nakon operacija sa kardio pulmonalnim premošćavanjem i Henok-Šenlainov purpur. ;U određenim rešenjima, anti-IL-lRl antitela i farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za lečenje stanja sa hroničnim bolom kao što je hronični pelvični bol, uključujući sindrom hroničnog prostatitisa/ sindrom pervičnog bola, i post-herpetični bol. ;Takođe sa anti-IL-lRl antitelima ili farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku mogu da se leče poremećaji endokrinog sistema uključujući juvenilni dijabet (uključujući autoimuni dijabetes melitus i insulin-zavisne tipove dijabetesa) i dijabetes koji se javlja kod odraslih (uključujući od insulina nezavisni dijabetes i sa gojaznošću udruženei dijabetes). Navadeni tretmani obuhvataju i sekundarna stanja koja su udružena sa dijabetesom, kao što su dijabetična retinopatija, odbacivanje transplantiranog bubrega kod dijabetičara, gojaznošću posredovana insulinska rezistencija i renalna insuficijencija, koja sama po sebi može biti udružena sa proteinuriom i hipertenzijom. Jedinjenjim a, prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se leče i drugi endokrini poremećeji u koje spadaju policistična bolest jajnika sa X hromozomom povezana adrenoleukodistrofija, hipotireoidizam i tireoiditis, uključujući Hašimotov tireoiditis (tj., autoimuni tireoiditis) disfunkcija tireoidnih ćelija, uključujući eutireoidni sindrom. ;Stanja gastrointestinalnog sistema se mogu lečiti ili se može sprečiti njihov nastanak sa anti-IL-lRl antitelima ili sa farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku, ili sa kombinovanom terapijom. Pomenuta stanja obuhvataju selijačnu bolest, Hronovu bolest, ulcerativni holitis, idiopatsku gastroparezu, pankreatitis, uključujući hronični pankreatitis, akutni pankreatitis, inflamatornu bolest creva i ulcere, uključujući ulcere želudca i duodenuma. ;Premećaju genitourinarnog sistemase takođe mogu lečiti ili se njihov nastanak može sprečiti sa anti-IL-lRl antitelima ili sa farmaceutskim preparatima, prema predmetnom pronalasku. Takvi poremećaju obuhvataju glomerulonefritis, uključujući autoimuni glomerulonefritis, glomerulonefritis usled izlaganja toksinima, ili glomerulonefritis koji je sekundaran u odnosu na infekcije sa hemolitičkim steptokocima ili drugim infektivnim agensima. Takođe, uremijski sindrom i njegove kliničke komplikacije, (na primer, insuficijencija bubrega, uremija ili hipertrofična kardiomiopatija), uključujući uremijski sindrom koji je udružen sa izlaganjem toksinima iz spoljašnje sredine, lekovima ili sa drugim uzrocima, moguće je lečiti sa jedinjenjima, preparatima i kombinovanim terapijama prema predmetnom pronalasku. Komplikacije koje nastaju usled inflamacije žučne bešike i koje vode do izmene apsortivne funkcije takođe mogu da se leče ili njihov nastanak može da se spreči sa antitelima prema predmetnom pronalasku. U navedene komplikacije spadaju, holelitijaza (kamenac u žuči) i holidoholitiaza (kamenac u žučnom putu), kao i ponivna pojava holelitijaza i holedoholitiaze. Druga stanja koja se mogu lečiti sa jedinjenjima, preparatima i kombinovanim terapijama, prema predmetnom pronalasku jesu komplikacije hemodijalize, stanja prostate, uključujući benignu hipertrofiju prostate, nebakterijski prostatitis i hronični prostatitis. ;Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za korišćenje anti-IL-lRl antitela preparata i kombinovanih terapija prema predmetnom pronalasku za lečenje različitih hematoloških ili onkoloških poremećaja. Na primer, anti-IL-lRl antitela, sama ili u kombinaciji sa drugim inhibitorima citokina ili sa drugim aktivnim sastojcima koji su opisani gore, mogu da se koriste za lečenje različitih oblika kancera, uključujući akutnu mijelogenu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, nazofaringealni karcinom koji je pozitivan na Epštajn-Barov virus, gliom, kancer debelog creva, želudca, prostate, bubrežnih ćelija, vrata materice i jajnika, kancer pluća, sitnoćelijski i nesitno ćelijski kancer pluća, uključujući kaheksiju, umor, astemiju, paraneoplastični sindrom kaheksije i hiperkalcemiju, koji su udruženi sa kancerom. Takođe, navedenim sredstvima je moguće lečiti solidne tumore, uključujući sarkom, osteosarkom i karcinom kao što je adenokarcinom, npr., kancer dojke, kao i sklamocelularni karcinom. Dodatni kanceri koji se mogu na ovaj način lečiti obuhvataju kancer ezofagusa, kancer želudca, karcinom žučne bešike, leukemiju, uključujući kautnu mijelogenu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, mijeloidnu leukemiju, hroničnu ili akutnu limfoblastnu leukemiju, i leukemiju vlasastih ćelija. Jedinjenjima, preparatima i kombinovanim terapijama prema predmetnom pronalasku mogu se lečiti i drugi maligniteti sa invazivnim metastatskim potencijalom uključujući multipli mijelom. ;Dodatno, opisana anti-IL-lRl antitela mogu da se koriste za lečenje anemija i hematoloških poremećaja, uključujući hroničnu idiopatsku neutropeniju, anemiju hroničnih bolesti, aplastičnu anemiju, uključujući Fankonijevu aplastičnu anemiju; idopatsku trombocitopenijsku purpuru (ITP); trombotičnu trombocitopenijsku purpuru, mijelodisplastične sindrome, uključujući refraktornu anemiju, refrakternu anemiju udruženu sa prstenastim sideroblastima, refraktornu anemiju sa viškom blast ćelija, (refraktornu anemiju sa viškom blast ćelija u transformaciji); mijelofibrozu/ mijeloidnu metaplaziju i vaskulookluzivne krize u bolesti srpastih ćelija. ;Različita limfoproliferativna oboljenja se takođe mogu lečiti sa anti-IL-lRl antitelima prema predmetnom pronalasku, uključujući autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPS), hroničnu limfoblastnu leukemiju, leukemiju vlasastih ćelija, hroničnu limfatičnu leukemiju, limfom periferni h T-ćelija, limfom malih linfocita, limfom ćelija omotača, folikularni limfom, Burkitov limfom, linfom T-ćelija koje su pozitivne na Epštajn-Barov virus, kistiocitni limfom, Hočkinovu bolest, bifuzni agresivni limfom, akutne limfatične leukemije, T-gama limfoproliferativnu bolest, kutani B ćelijski limfom, kutani T ćelijski limfom (tj., mvcosis fungoides) i Sezarv sindrom. ;Sa antitelima prema predmetnom pronalasku mogu se lečiti nasledna stanja kao što su Gošeova bolest, Hantingtonova bolest, linearna IgA bolest i mišićna distrofija. ;Druga stanja koja se mogu lečiti i čiji se nastanak može sprečiti primenom opisanih antitela za II-1 receptor ili primenom farmaceutskih preparata prema predmetnom pronalasku obuhvataju ona stanja koja nastaju nakon povreda glave ili kičmene moždine, uključujući supduralni hematom usled traume glave. Povezano sa ovom terapijom preparati i kombinovane terapije koje su ovde opisane su korisne za sprečavanje nastanka kranijalnih neuroloških oštećenja i za sprečavanje nastanka i lečenje cervikogenih glavobolja. Ovde opisani preparati i kombinovane terapije su dalje pogodni za lečenje neuroloških neželjenih efekata koji su udruženi sa zračenjem mozga. ;Anti-IL-lRl antitela i farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku su takođe korisni za lečenje stanja jetre kao što je hepatitis, ukjlučujući akutni alkoholičarski hepatitis izazvan lekom ili virusima, hepatitis A, B i C, sklerozirajući holangitis, inflamaciju hepatičnog epitela sinusoida, i inflamaciju jetre usled nepoznatih uzroka. ;Poremećaji koji uključuju gubitak sluha, i koji su udruženi sa abnormalnom ekspresijom IL-1, takođe se mogu lečiti sa anti-IL-lRl antitelima ili sa farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku. Takvi poremećaji obuhvataju gubitak sluha koji je udružen sa khlearnim nervom za koji se smatra da rezultira od auto imunog procesa, tj., autoimuni gubitak sluha. Takođe, oštećenje srednjeg uha koje je često udruženo sa gubitkom sluha, Menijerov sindrom i holesteatoma, takođe mogu da se leče ili njihov nastanak može da se spreči sa anti-IL-lRl antitelima ili farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku. ;Ne-artritični poremećaji kosti i zglobova se takođe mogu legiti sa antitelima koja su ovde opisana. Ovde spadaju poremećeji osteoklasta koji vode do gubitka kosti, kao što su bez ograničenja osteoporoz, uključujući post-menopauznu osteoporozu, osteoartritis, periodontitis koji dovodi do klaćenja ili gubitka zuba i popuštanje proteza nakon zamene zgloba (generalno udružena sa inflamatornim odgovorom na deliće tkiva). Ovo poslednje navedeno stanje se takođe naziva "osteoliza usled ortopedskog implantata". Drugo stanje koje se može lečiti sa jedinjenjima, preparatima i kombinovanim terapijama prema predmetnom pronalasku, jeste disfunkcija temporo-mandibularnog zgloba (TMZ). ;Anti-IL-lRl antitela, ili farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za lečenje reumatskih poremećaja uključujući adutni i juvenalni reumatoidni artritisa; sklerodermu; sistemski eritematodni lupus; liht, osteoartritis; reumatsku polimijalgiju; seronegativne spondiloatropatije, uključujući ankislozirajući spondilitis i Rajkerovu bolest, psorijatični artritis i hronični artritis, u lajmskoj boleti. Antitela prema predmetnom pronalaskutakođe mogu da se koriste za lečenje inflamacije voljnih mišića i drugih mišića, uključujući stanje kao što su dermatomiozitis, miozitis sa inkluzionim telima, polimiozitis i limfangioleimiomatozu. ;Druga uptreba antitela i farmaceutskih preparata, prema predmetnom pronalasku jeste u lečenju i/ili sprečvanju nastanka primarne amiloidoze, ili sprečavanju nastanka sekundarne amiloidoze koja je karakteristika različitih stanja uključujući Alchajmerovu bolest, sekundarnu reaktivnu amiloidozu, Daunov sindrom i amiloidozu udruženu sa dijalizom. Takođe, sa antitelima i farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku mogu se lečiti nasleđeni sindromi periodične groznice, uključujući familijarnu mediteransku groznicu, hiperimunoglobulin-D groznicu i periodične sindrome koji su udruženi sa TNF-receptorom (TRAPS- TNF-receptor associated periodic svndromes). ;U drugim rešenjima antitela ili farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za lečenje poremećaja koji obuhvataju kožu ili mukozne membrane. Takvi poremećeji obuhvataju akantolitičke bolesti uključujući Darijerovu bolest, keratosis follicularis i pemphigus vulgaris. Dodatni poremećaji kože koji mogu da se leče pomoću antitela prema predmetnom pronalasku uključuju akne, acne rosacea, alopecia areata, aftozni stomatitis, bulozni pemfigoid, opekotine, ekcem, eritem, uključujuću ervthema multiforme i ervthema multiforme bullosum (Stiven-Jonsonov sindrom), inflamatornu bolest kože, lichen planus, buloznu bolest sa linearnim IgA (hronična bulozna dermatoza detinjstva), gubitak elastičnosti kože, površinski mukozni ulceri, ukjlučujući ulcere želudca, neutrofilni dermatitis (Svitov sindrom) dermatomiozitis, pitvriasis rubra pilaris, psorijazu, pvoderma gangrenosum, multicentričnu retikulohistio citozu i toksičnu epidermalnu nekrolizu. Druga stanja koja su udružena sa kožom a koja se ogu lečiti terapijama i kombinovanim terapijama prema predmetnom pronalasku uključuju dermatitis herpetiformis. ;Dodatni poremećaji koji mogu da se leče sa antitelima ili farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku obuhvataju oboljenje presadak-protiv-domaćina i komplikacije koje nastaju nakon transplantacije čvrstih organkao što su: srce, jetra, koža, bubreg, pluća (obliteracija disajnih puteva u transplantiranim plućima) ili nakon drugih transplantacija, ukjlučujući transplantaciju koštane srži. ;Poremećaji oko takođe mogu da se leče ili da se njihov nastanak spreči upotrebom opisanih anti-IL-lRl antitela ili farmaceutskih preparata prema predmetnom pronalasku i ovde spadaju reumatogeno odlubljivanje retine i inflamatorne bolesti oko uključujući inflamatornu bolest oko koja je udružena sa pušenjem i makularnom degeneracijom. ;Anti-IL-lRl antitela, ili farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku kao što su ovde opisani su korisni u lečenju poremećaja koji zahvataju ženski reproduktivni sistem. Primeri obuhvataju bez ograničenja višestruku neuspelu implantaciju/infertilitet; sindrom gubitka fetusa ili gubitak embriona (spontani pobačaj); trudnoće komplikovane preklampsijom ili eklampsijom, endometrioza, hronični cervicitis i prevremeni porođaj. ;Dodatno antitela ili farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku su korisni u lečenju i/ili sprečavanju nastanka išijasa, simptoma starenja, ozbiljnih reakcija na lekove (npr., IL-2 toksičnost ili bleomicinom izazvana pneumopatija i fibroza), ili su korisni u suplimiranju inflamatornog odgovora, tokom ili nakon tranfuzije aligenih eritrocita tokom hirirške intervencije na srcu ili neke druge hirurške intervencije ili u lečenju traumatske povrede ekstremiteta ili zgloba, kao što je traumatska povreda kolena. Različita druga medicinska stanja koja se mogu lečiti sa anti-IL-lRl antitelima ili farmaceutskim preparatima obuhvataju multiplusklerozu, Behterovljevu bolest, Sjegrenov sindrom, autoimunu hemolitičku anemiju, P-talasemiju; amiotrofičnu lateralnu sklerozu (Lou Gehrig-ova bolest); Parkinsonova bolest; i tenosenovitis nepoznatog uzroka kao i različite autoimune poremećaje ili oboljenja koja su udružena sa naslednim deficijencijama, uključujući mentalnu retardaciju povezanu sa X hromozomima. ;Dalje, anti-IL-lRl antitela ili farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku su takođe korisni u lečenju povreda CNS, uključujući efekte neurotoksičnih neurotransmitera, koji su otpušteni tokom ekscitacije u inflamaciji u CNS-u, a korisni su i za inhibiciju i sprečavanje nastanka razvoja glialnih ožiljaka na mestima povrede CNS-a. U vezi sa epilepsijom i sa lečenjem epileptičnih napada, navedena sredstva su korisna u smanjenju ozbiljnosti i broja anpada koji se ponovo javljaju i smanjenju ozbiljnosti štetnih efekata epileptičnih napada, u smanjenju gubitka neurona, neuronske degeniracije i glioze, koja je udružena sa epileptičnim napadima. ;Dodatne upotrebe antitela ili farmaceutskih preparata prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bez ograničenja, lečenje polineuropatije, i miopatije u kritičnoj bolesti (CIPNM), akutne polineuropatije, anoreksije, nervoze, Belove paralize, sindroma kroničnog umora, prenosive demencije uključujući Krojcfeld-Jakobovu bolest, demijelinizujuće neuropatije, Gijan-Bareovog sindroma, bolesti vertebralnog diskursa, sindroma zalivskog rata, hronične inflamatorne demijelinizujuće polineuropatije, mijastenije gravis, tihe cerebralne ishemije, poremećaja spavanja uključujući narkolepsiju i apneu u snu, hronične neuronske degeneracije i moždanog udara, uključujući cerebralne ishemijske bolesti. Dodatne uptrebe antitela, prema predmetnom pronalasku, obuhvataju anoreksiju i/ili anoreksična stanja, peritonitis, endotoksemiju i septički šok, stvaranje granuloma, toplotni udar, Čurg-Štrausov sindrom, hroničnu inflamaciju nakon akutnih infekcija, kao što su tuberkuloza i lepra, sistemsku sklerozu i stvaranje hipertrofičnog ožiljka. ;U drugim rešenjima, avidinski fuzioni proteini sadrže aminokiselinsku sekvencu jednog od IL-1R1 antitela prema predmetnom pronalasku i mogu da se konstruišu radi upotrebe u različite svrhe. Avidinski fuzioni proteini mogu da se dobiju, npr., korišćenjem sisarskog vektora ekspresije koji sadrži cDNK sekvencu koja kodira rekombinantni pileći avidin koji se nalazi odmah do višestrukog klonirajućeg mesta za inserciju specifičnog ciljnog gena fuzionog partnera. Vektor može da sadrži sekvencu avidina sa njenom endogenom signalnom sekvencom kako bi omogućio sekreciju diskretnih fuzionih genskih partnera, koji u prirodi ne sadrže signalne sekvence. Fuzioni proteina koji su eksprimirani od strane vektora poseduju oznaku sa proteinom avidina na N-terminalnom kraju fuzionog partnera. Ovde je opisana strategija fuzionisanja koja ima sposobnost da dovede do sekrecije proteina koji su normalno eksprimirani intracelelarno, kao što su geni az prevođenje signala ili nuklearni receptori hormona. ;Alternativno, može da se koristi vektor koji kodira avidin bez njegove endogene signalne sekvence, što će dovesti do nastanka obeležavanja fuzionog proteinskog partnera na C- terminalu. Fuzionisanje C-terminalnog avidina, takođe omogućava sekreciju proteina koja se zasniva na endogenoj signalnoj sekvenci fuzionog partnera. Takva strategija može da se primeni kako bi se omogućila korektna obrada proteina i njegovo sabijanje ili da bi se odredila validnost predložene signalne sekvence. Dodatno, vektor može da sadrži kratku nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu a koja deluje kao supstrat za cepanje specifičnim enzimom, između avidina i sekvenci fuzionih partnera. Takve sekvence koje mogu da se cepaju enzimom omogućavaju separaciju fuzionog partnera od avidina u cilju prečišćavanja ili u cilju otpuštanja samog proteina. ;Avidinski fuzioni proteina prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste, npr., u ispitivanju antitela, (funkcionalnoj karakterizaciji odredivanjusposobnosti antitela kao agoniste ili antagoniste, sredstva za neutralizaciju itd.,), u mapiranju epitopa ili u strategijama imunizacije. Fuzionisanje avidina sa ciljnim proteinom takođe može da se koristi u testovima farmakokinetike, efikasnosti ili u drugim standardnim testovima, koji su dizajnirani za ispitivanje prekliničkih uzoraka ili za ispitivanje uzoraka pacijenata u kliničkim ispitivanjima na prisustvo terapijskog antitela u krvi urinu ili u drugim uzorcima tkiva. Partneri za fuziju sa avidinom mogu da se pripreme kao sekvence pune dužine ili nepotpune dužine, kao specifični izolovani strukturni domeni ili kao himeričke sekvence sa drugim homolozima fuzionih partnera iz druge vrste. ;Avidinski fuzioni proteini mogu da se eksprimiraju korišćenjem bilo koje standardne tehnike uvođenja gena u ćeliju, kao što ej opisano ovde i kao što je opisano u struci. Proteini mogu da budu eksprimirani u 293 ćelijama ili CHO ćelijama korišćenjem transfekcije ćelija sa konstruktom avidinskog fuzionog proteina u rastvoru lipida kao što je Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). ;Kondicionirane podloge i/ili ćelijski lizati ćelija koje eksprimiraju fuzione proteine mogu da budu sakupljeni i da budu podvrgnuti test supstratu kao što su sa biotinom obložene polistirenske perlice ili sa biotinom obložene ELISA ploče. Prikupljanje kondicioniranih podloga i/ili ćelijskih lizata može da se izvede u onom trenutku koji omogućava opcionu ekspresiju fuzionog proteina. Ovaj vremenski trenutak može da se odredi eksperimentalno od strane stručnjaka, ali je to obično nakon 48 časova od transfekcije. Fuzioni proteini takođe mogu biti analizirani na ćelijskoj membrani ili intraćelijski na ekspresiju i funkcionalnost pri vezivanju poznatih liganada receptora ili antitela. ;Avidinski fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku mogu biti ispitani upotrebom bilo kog poznatog ili prethodno opisanog postupka koji koristi reakciju biotin-avidin. Ovi postupci obuhvataju, bez ograničenja, protočnu citometriju i tehnike fluoroscentnog snimanja/mikroskopije. Na primer, avidinski fuzioni preparati koji su eksprimirani u podlozi ili u ćelijskim ligatima mogu da se pomešaju sa biotinom obloženim perlicama i da se oblože sa fluorescentno obeleženim anti-avidinskim antitelom, kojim se pokazuje nivo ekspresije. Takođe, mogu da se primene fluorescentna antitela koja prepoznaju specifične fuzione proteinske partnere u multikolorimetrijskom testu. Dodatno, neobeležena antitela koja su specifična za fuziono-proteinskog partnera mogu da se primene simultano sa fluorescentno obeleženim antitelima, u testu kompetitivnog vezivanja. ;U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za mapiranje epitopa korišćenjem avidinskih fuzionih proteina. Primer postupka mapiranja epitopa prema predmetnom pronalasku je naveden u tekstu koji sledi, pri čemu se mapiraju epitopi za anti-IL-1R1 antitelo. Međutim stručnjak prepoznaje da takvi postupci mogu lako da se primene za mapiranje drugih epitopa i da nisu ograničenisamo na anti-IL-lRl antitela. Na primer, cDNK koja kodira pileći avidin (sa endogenom signalnom sekvencom) može da se spoji sa 5' krajem cDNK koja kodira protein od interesa (tj. protein koji može biti prepoznat pomoću antitela za koja je poželjno da se odredi taj epitop (može biti fuzionisan sa FLAG sekvencom za obeležavanje na 3' kraju). Sa FLAG obeleženi fuzioni geni mogu da se sklope u ekspresionom vektoru korišćenjem konvencionalnih molekularnih tehnika. Može da se stvori panel mutantnih proteina obeleženih sa avidinom-FLAG u kojima su određene aminokiseline supstituisane (npr., na odgovarajućim aminokiselinskim ostacima iz drugih životinjskih vrsta) korišćenjem konvencionalnih tehnika. Mutantni i proteini divljeg tipa mogu biti eksprimirani u ćelijama domaćinima a vezivanje proteina divljeg tipa ili mutanta sa antitelom od interesa može da se detektuje korišćenjem, npr., Western blot analize ili testa vezivanja sa perlicama kao što je opisano ovde. Stoga, epitop može biti definisan određivanjem supstitucija u mutantnim proteinima koje sprečavaju vezivanje za antitelo od interesa. ;Primeri;Sledeći primeri, ukjlučujući sprovedene eksperimente i dobijene rezultate su obezbeđeni radi ilustracije i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska. ;Primer 1:Dobijanjehumanihmonoklonskihantitelaprotiv receptora tipa1za ;interleukin-1 (IL-1R1);Transgeni HuMat miševi;Potpuno humana monoklonska antitela za IL-1R1 su dobijena korišćenjem Hco/ soja transgenih miševa koji eksprimiraju gene za humano antitelo. U svakom od ovih sojeva miševa, endogeni mišiji geni za kappa laki lanac je homozigotno oštećen kao što je opisano u Chen et al., 1993, EMBO J. 12: 811-820, a endogeni mišiji gen za teški lanac je homozigotno oštećen kao što je opisano u Primeru 1 međunarodne patentne prijave broj WO 01/09187 (koja je inkorporirana po referenci). Svaki od ovih sojeva miševa nosi transgen za humani kappa lanac Kco5, što je opisano u Fishvvild et al., 1996, Nature Biotechnologv 14: 845-851. Hco7 soj je nosilac transgena HCo7 za humani teški lanac kao što je opisano u U.S. patentima brojevi 5,545,806; 5,625,825 i 5,545,807 (koji su inkorporirani prema referenci). Hco7 soj se ovde označava kao HuMat miševi. ;HuMat imunizacije;Kako bi se dobila potpuno humana monoklonska antitela za IL-1 Rl, HuMat miševi su imunizovani sa prečišćenim rekombinantnim IL-1R1 koji je izveden iz insekata ili sisarskih ćelija (npr., CHO ćelija) kao sa antigenom. Generalne šeme imunizacije za HuMat miševe su opisane u Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859; Fiswild et al., gore navedeno i u međunarodnim patentnim prijavama WO 98/24884, (koje su u potpunosti ovde inkorporirane po referenci). U vreme prve infuzije antigena, miševi su bili starosne dobi od 6 do 16 nendelja. Za intraperitonealnu (i.p.) ili subkutanu (s.c.) imunizaciju HuMat miševa korišćen je prečišćeni rekombinantni preparat (25-50 (ig) IL-1R1 antigena (npr., koji je prečišćen iz transficiranih insekatskih ili sisarskih ćelija koje eksprimiraju IL-1R1). ;Imunizacije trangenih miševa su vršene korišćenjem antigena u kompletnom Freund-ovom adjuvansu u vidu dve injekcije, nakon čega je sledila i.p. imunizacija, nakon 2-4 nedelje (sve do ukupnog broja od 11 imunizacija) sa antigenom u kompletnom Freun-ovom adjuvansu. Za svaki antigen je imunizovano nekoliko desetina pacova. Sa IL-1R1 je ukupno imunizovano 149 miševa Hco7 soja. Imuni odgovor je praćen posmatranjem retroorbitalnog krvarenja. ;Kako bi se selekcionirali HuMat miševi koji vezuju antitela za IL-1R1, serumi imunizovanih miševa su testirani korišćenjem ELISA, kao što je opisano u Fiswild et al., gore navedeno. Ukratko, pločice za mikrocitaciju su obložene prečišćenim rekombinantnim IL-IRI iz inekatskih ili sisarskih ćelija u koncentraciji od 1-2 |ig/ml u PBS i 50 jal/polju je inkubirano na temperaturi od 4 °C tokom noći, a zatim su polja blokirana sa po 200 ul/polju 5% pilećeg seruma u PBS/Tvveen (o,o5 %). U svako od polja su dodata razblaženja plazme dobijene od IL-1R1 imunizovanih miševa, pa su ploče inkubirane tokom 1-2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/Tvveen, a zatim su inkubirane sa kozijim anti-humanim IgG poliklonskim reagensom specifičnim za Fc koji je konjugovan sa peroksidazom rena. ;(HRP - horseradish peroxidase) tokom jednog časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS/Tvveen inkubirane su sa kozijim anti-humanim IgG poliklonskim reagensom koji je specifičan za Fc i koji je konjugovan sa peroksidazom rena (HRP) tokom jednog časa na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, ploče su razvijene SaABTS supstratom (Sigma Chem Co., St. Louis, MO, kataloški brjo A-1888, 0,22 mg/ml) nakon čega su analizirane spektrofotometrijski na optičkoj gustini od 415-495. Miševi sa dovoljnim titrom anti-IL-lRl humanog imunoglobulina su korišćeni za proizvodnju monoklonskih antitela na način koji je opisan u tekstu koji sledi. ;Pobijanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela za IL- 1R1 ;Miševi su pripremljeni za proizvodnju monoklonskih antitela tako što su primili aktivirajaću dozu antigena, intravenski, dva dana pre žrtvovanja a potom su žrtvovani i uklonjene su im slezine. Mišiji splenociti su izolovani iz HuMat mišeca i fuzionisani su sa PEG sa misijom mijelomskom ćelijskom linijom, korišćenjem standardnih protokola, tipično izvedeno je 20 do 30 fuzija za svaki od antigena. ;Ukratko, suspenzije pijedinačnih ćelija limfocita slezine iz imunizovanih miševa su korišćeni za fuzijusa lAbroja P3X63-Ag8.653 sekretujućih mišijih mijelomskih ćelija (ATCC pristupni broj CRL 1580) ili sa SP2/0 nesekretujućim mišijim mijelomskim ćelijama (ATCC pristupni broj CLR 1581) sa 50% PEG (Sigma). Ćelije su postavljene na ploče za mikrocitaciju sa ravnim dnom , u koncentraciji od oko 1 x 10<5>po polju, nakon čega sledi inkubacija od oko 2 nedelje u selektivnoj podlozi koja sadrži 10% fetalni goveđi serum, 10% P388D1- (ATCC pristupni broj CRL TIB-63) kondicioniranu podlogu, 3-5% origen (IGEN) u DMEM (Mediatech, kataloški broj CRL 10013, sa visokim nivoom glukoze, L-glutamina i natrijum piruvata) i sa 5mM HEPES, o,o55 mM 2-merkaptofenolom, 50 mg/ml gentamicina i lx HAT (Sigma, kataloški broj CRL P-7185). Nakon 1-2 nedelje, ćelije su kultivisanu u podlozi u kojoj je HAT zamenjen sa HT. ;Nastali hibridomi su ispitivani na proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačna polja su ispitivana korišćenjem ELISA (gore opisano) na humana anti-IL-lRl monoklonska IgG antitela. Kada se javi ekstenzivni rast hibridoma, podloga se obično posmatra nakon 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitela se kultivišu na novim pločama, ponovo se ispituju i koliko su pozitivni na humani IgG anti-IL-lRl monoklonska antitela se subkloniraju najmanje dva puta, pomoću graničnog razblaživanja. Stabilni subklonovi se zatim kultivišu in vitro kako bi se dobile male količine antitela u podlozi tkivne kulture radi karakterizacije. ;Selkcija humanih monoklonskih antitela koja se vezuju za IL- 1R1 ;Za ispitivanje hibridoma za koje je pokazano da imaju pozitivnu reaktivnost sa IL-1R1 imunogenom je korišćen ELISA test kao što je opisano ranije. Hibridomi koji sekretuju monoklonsko antitelo koje se vezuje sa visokim afinitetom za IL-1R1 je subklonirano i dalje opisano. Po jedan klon iz svakog hibridoma, koji je zadržao reaktivnost roditeljskih ćelija (što je određeno putem ELISA) je izabran za stvaranje ćelijske banke od 5-10 pločica koje su uskladištene u tečnom azotu. ;Izotip-specifična ELISA je izvedena radi određivanja izotipa monoklonskih antitela koja su dobijena na ovde opisani način. U ovim eksperimentima, ploče za mikrotitraciju su obložene sa 50 ul/polju rastvora 1 mg/ml mišijeg anti-humanog kappa lakog lanca u PBS i inkubirane su na 4 °C tokom noći. Nakon blokiranja sa 5% prilećim serumom, ploče su ostavljene da reaguju sa supernatantom u kome se nalazi pojedinačno testirano monoklonsko antitelo i prečišćena izotipska kontrola. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 1 -2 časa. Zatim su ploče reagovale sa humanim IgGl, ili IgG2 ili IgG4- specifičnim kozijim anti-humanim poliklonskim antiserumom konjugovanim sa peroksidazom rena, nakon čega su ploče razvijene i analizirane kao što je opisano u tekstu koji sledi. ;Monoklonska antitela, koja su prečišćena iz supernatanta hibridoma koji su pokazali značajno vezivanje za IL-1R1 koje je određeno pomoću ELISA su dalje ispitivana na biološku aktivnost korišćenjem in vitro testova vezivanja i testova sa humanim hondrocitima i ćelijama pune krvi. Antitela koja su pokazala najbolju aktivnost su označena kao 15C4, 26F5, 27F2, 24E12 i 10H7. Antitela su podvrgnuta preliminarnom eksperimentu sortiranja epitopa. ELISA poloče su obložene sa humanim sIL-lRl (1+2+3 domen), sa humanim sIL-1R1 nepotpune dužeine (1+2 domen), sa pacovskim sIL-lRl, sa humanim sIL-lR tipa II i sa ovalbuminom (negativna kontrola). Vezivanje antitela je praćeno pomoću anti-humanog antitela konjugovanog sa peroksidazom rena koje je specifično za Fc fragment (Pierce Chem. Co., Rockford, IL). Rezultati su sažeto prikazani u Tabeli 2. Znak za štikliranje (V) u Tabeli 2 predstavlja pozitivan rezultat za vezivanje; "X" predstavlja negativan rezultat. Antitela 15C4, 26F5, 27F2 i 24E12 se vezuju samo sa IL-1R1 proteinom koji poseduje sva tri ekstraćelijska domena, što ukazuje da epitopi za svako od ovih antitela se nalaze u okviru trećeg domena. Antitelo 10H7 se vezuje i za ekstracelularni domen IL-1R1 pune dužine i takođe za protein nepotpune dužine, koji poseduje samo domene 1 i 2, što pokazuje da epitop za ovo antitelo leži unutar domena 1 ili 2. Ni jedno od testiranih antitela ne pokazuje ukrštenu reaktivnost sa hum,anim receptorom za IL-1 tipa II ili za pacovski IL-1R1. ;Primer 2: In vitro inhibicija stvaranja kompleksa od strane IL-1 receptora tipa I;upotrebom anti-IL-lRl antitela;Sposobnost natitela da inhibiraju ekstracelulamo vezivanje koje je neophodno z apokretanje IL-1 signalnog puta procenjivano je sa rekombinantnim proteinima u in vitro testu u kome vezivanje IL-1 za IL-1R, dovodi do stvaranja visoko afinitetnog veznog mesta za IL-IRAcP. Vezivanje IL-IRAcP za IL-1R koji je vezao IL-1 (označeno kao "stvaranje kompleksa") je mereno na sledeći način. Rekombinantni proteini su inkubirani u testu vezivanja u pločama za mikrotitraciju u odsustvu (kontrola) ili u prisustvi antitela. IC50vrednosti su izvedene iz poređenja kontrolnih vrednosti sa vrednostima dobij enim u prisustvu antitela u koncentracijama između 10 fM i luM. Ukratko test je izveden na sledeći način. Biološki usitnjeno IL-1R1 i perlice obložene streptavidinom (Dynal, Dvnabeads M-28) su suspendovani u pločama za mikrotitraciju. U odgovarajuća polja je dodato antitelo u serijskom razblaženju koje pokriva širok spektar koncentracija. Dodati su IL-la ili IL-1 (3 u koncentraciji od 1 nM, nakon čega je dodat IL-IRAcP koji je obeležen sa rutenijumom (dobijen sa NHS-oznakom (IGEN) prema protokolu proizvođača) u konačnoj koncentraciji od 5 nM. Nakon inkubacije tokom jednog časa na sobnoj temperaturi reakcija vezivanja je analizirana ili sa ORIGEN™ 1.5 ili sa M8 instrumentom (IGEN International Inc.). Vezivanje IL-IRAcP za IL-1R1 koji je vezao IL-1 je određeno detekcijom elektrohemiluminescencije koja je udružena sa IL-1R1 vezanim za perlice. Smanjenje signala koje je posledica kompeticije antitela ili sa IL-1 ili sa IL-IRAcP vezivanjem je izračunato kao procenat elektrohemiluminiscentnog signala za maksimalno vezivanje (bez kompeticije). Napravljene su krive odgovora na inhibiciju za svako od ovih tela u ovim testovima vezivanja, a IC50vrednosti su izvedene korišćenjem PRISM™ softvera. Rezultati inhibicije događaja koji su indukovani vezivanjem IL-ip su opisani u vidu grafikona na Slici 12. IC50vrednosti za inhibiciju stvaranja kompleksa su prikazane u tabeli ispod. Ova antitela sva se vezuju za treći domen IL-1R1, kao što je gore opisano. Antitelo 10H7 pripada klasi natitela koje se vezuje za konstrukt IL-1R kome nedostaje treći domen. 10H7 antitelo je manje potentni inhibitor vezivanja IL-IRAcP koje je pokrenuto sa IL-1 od antitela koja se vezuje za treći domen. Inhibicija stvaranja kompleksa pomoću antitela prema premetnom pronalasku je upoređena sa inhibicijom pomoću IL-lra. Antitela koja se vezuju za treći domen pokazuju slično ili blago povišenu sposobnost inhibicije stvaranja kompleksa u poređenju sa IL-lra inhibicijom. ;Slika 13 pokazuje sposobnost antitela 15C4 da inhibira stvaranje kompleksa IL-1R1/ IL-la/IL-IRAcP. IC50 vrednost za stvaranje kompleksa IL-1R1/ IL-la/IL-IRAcPje 43 pM. ;Primer 3: Anti-IL-lRl antitela inhibiraju vezivanje IL-ip i IL-lra za receptor;Sposobnost anti-IL-lRl antitela da inhibiraju vezivanje IL-1 p ili IL-lra za IL-1R1 je procenjivana u testu sa rekombinantnim proteinima. Reakciona smeša sadrži 0,1 mg/ml Dvnabeads M-280 Streptavidin (Dynal) i 1 nM biološki usitnjeni IL-1R1. Antitela su dodata u koncentraciji od 320 nM do 0,3 nM. Dodavanjem IL-lp (5 nM) i IL-lra (1 nM) koji su obeleženi sa rutenijumom, krenulo je vezivanje koje se nastavilo tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Nad reakcionim smešama je sprovedeno merenje kao što je gore navedeno korišćenjem ORIGEN ™ 1.5 ili M8 instrumenta (IGEN International Inc.). Kompeticija je proračunavana kao procenat ECL signala u odnosu na maksimalno vezivanje (bez kompeticije). Antitela 15C4, 26F5 i 27F2, najpotentnija antitela, blokiraju vezivanje liganda IL-ip za receptor, ali neinterferiraju značajnije sa vezivanjem IL-lra u poređenju sa IgG kontrolom. Nasuprot tome antitelo 24E12 se vezuje za receptor, ali ne blokira IL-lp ili IL-lra za receptor. Stoga, antitelo 24E12 predstavlja jedinstvenu klasu antitela koja se vezuju za treći domen koja se razlikuje od klase koju predstavljaju 15E4, 26E5 i 27F2 antitela. Antitelo 10H7 inhibira vezivanje i IL-1 p i IL-lra za receptor. Rezultati su prikazani na Slici 14. ;Primer 4: Testovi sa hondrocitima i punom humanom krvlju ;Primarni humani hondrociti (Cell Applications Inc., San Diego, CA) su kultivisani na pločama od 96 polja sa gustinom od 10000 ćelija/polju u DMEM podlozi koja sadrži 1% FBS i 1% Pen Strep (GIBCO). Ćelijama je omogućeno da se oporave tokom noći pre davanja anti-IL-1RI antitela u koncentracijama u opsegu od lOnM do 0,1 pM, tokom 20 minuta. Dodat je IL-ip u koncentraciji od 1 pM (~ECso) nakon čega su prikupljeni supernatanti kulture posle 16 časova inkubacije na temperaturi od 37 °C. Mereni su nivoi IL-6 u supernatantima korišćenjem ELISA (Pierce-Endogen, Rockford, IL, kataloški broj EH2IL-65) prema uputstvu proizvođača. Generisana je kriva odgovora na inhibiciju za svako antitelo prema predmetnom pronalasku u ovom testu na ćelijama, a IC50vrednosti su izvedene PRISM ™ softvera. Antitela 15C4, 26F5 i 27F2 su potentni inhibitori IL-1 signalnog puta u poređenju sa IL-lra (Slika 15A). Antitela 24E12 i 10H7 su značajno slabije potentna od 15C4 i 27F2 antitela (Slika 15B). IC50vrednosti za proizvodnju IL-6 u humanim hondrocitima, koja je indukovana sa IL-1 p su prikazane u Tabelama 4A i 4B (koje odgovaraju Slikama 15A i 15B respektivno). ;Anti-IL-lRl monoklonska antitela 15C4, 26F5 i 27F2 su prethodno inkubirana tokom 40-60 minuta sa punom humanom krvlju oja je dobijena od normalnih dobrovoljaca i koja se nalazi u vakutajnerima sa natrijum heparinom. Testovi su izvedeni na sldeći način: 100 ul sveže izolovane krvi je podeljeno na jednake delove i dodate u polja ploče od 96 polja. Dodato je po 50 ul antitela u RPMI podlozi koja sadrži 10 % humani AB serum. Dodat je IL-1P u koncentraciji od 30 pM (EC50). Supernatanti kulture su prikupljeni nakon 18 časova, a nivoi IL-6 u supernatantu su mereni korišćenjem ELISA. Kao kontrola, IL-1 ara je prethodno inkubiran tokom 40-60 minuta sa punom krvlju a proizvodnja IL-6 je merena na gore opisani način. Tri anti-IL-lRl antitela su blokirala IL-1 aktivnost sa potencijom koja se može uporediti sa potencijom IL-lra (Slika 16). Vrednosti IC50za inhibiciju IL-6 koja je indukovana sa IL-1 u humanoj punoj krvi su prikazane u Tabeli 5. ;Primer 5: Mutageneza i mapiranje epitopa;Za mesto specifična mutageneza (Altered Sites In Vitro Mutagenesis System, Promega, Madison, WI) IL-1R1 je korišćena za dobijanje panela mutiranih proteina (muteina) u kojima su pacovske aminokiseline supstituisane odgovarajućom humanom sekvencom. Konstruisano je 15 različitih mutiranih plazmida (videti brojevima označene prečeke na Slici 17). Plazmidi koji kodiraju ove supstituisane proteine i roditeljske IL-1R1 su prolazno transficirani u CHO ćelije. Kontrolni transfekanti su generisani kao negativne kontrole. Kondicionirana podloga (CM) za ove ćelije je koncentrovana za oko 20 puta, korišćenjem Centripep 10 kolone za koncentrovanje (Amicon). Ekspresija muteina je ispitivana korišćenjem SDS-PAGE i Western blot analize. 13 mutiranih proteina je eksprimirano u nivoima koji omogućavaju evaluaciju vezivanja antitela. Proteini su naneti na gel, podvrgnuti su elektroforezi i prebačeni su na membrane. Membrane su blokirane u 1% mleku u PBS, 0,1 % Tween-20, a zatim su inkubirane tokom jednog časa na sobnoj temperaturi sa anti-IL-1R1 antitelima 15C4, 24E12 i 27F2 u koncentraciji od 0,5 ug u PBS, 0,1 % Tween-20. Nakon ispiranja, membrane su inkubirane sa kozijim anti-humanim IgG-Fc-HRP. Signal je detektovan korišćenjem elktrohemiluminescencije (ECL) supstrata (Pierce Chem. Co., Rockford, IL). Humane specifične sekvence koje su kritične za vezivanje antitela su identifikovane kao one koje nakon supstitucije sa pacovskim sekvencama smanjuju ili eliminišu ECL signal. Prepoznavanje mutanata 1, 2, 4 i 10 od strane 15C4 antitela je umanjeno u poređenju sa upotrebom antitela 24E12 (Slika 18, gornji panel). Slično tome, oštećeno je i vezivanje antitela 27F2 za mutante 1, 2 i 4 (Slika 18, srednji panel). Antitelo 24E12 nije pokazalo značajnije vezivanje za mutante 12, 13, 14 i 15 (Slika 18, donji panel). ;Izolacijom i karakterizacija humanih anti-IL-lRl antitela su identifikovane tri različite klase kompetitvnih antitela (Slika 19). Najjači inhibitor biološke aktivnosti IL-1, što je pokazano biološkim testovima sa ćelijama su ona antitela, koja se vezuju za treći domen IL-IRI i koja sprečavaju vezivanje IL-1 p. Eksperimentima za mapitanje epitopa koji koriste panel mutantnih proteina, trećeg domena je pokazano da ova klasa antitela, u koja spadaju 15C4, 26F5 i 27F2, je specifična i da deli i da se preklapa, ali ne na identičan način za određenu konformaciju epitopa. Slike 20 i 21 ilustruju položaj 15C4 epitopa na terćem domenu IL-1 receptora, na trakastom dijagramu IL-1 receptora za koji je veza IL-lra (Schreuder et al., 1997, Nature 386: 194-200). Ostaci IL-1 receptora koji definišu vezivanje najpotentnije klase antitela ilustrovani su u sivoj boji. Ova antitela, su pokazala superiornu potenciju, tako da ovi epitopi definišu mesto za vezivanje antitela superiorne klase. Vezna mesta antitela 15C4 i 27F2 se preklapaju ali nisu identična što je određeno mutacionom analizom 15 različitih mesta u okviru IL-1R1 kako je opisano gore. Ova mesta su opisana na Slici 17 u vidu brojevima označenih prečki iznada proteinske sekvence. Kritična mesta interakcije izgleda da se nalaze unutar mutacije, na mestima 1 (LSDIA; sekvenca čiji je ID broj 41), 2 (VIDE; sekvenca čiji je ID broj 42), 4 (YSV) i 10 (TCFA; sekvenca čiji je ID broj 43). Vezna mesta antitela 15C4 i 27F2 su sadržana unutar mesta 1 i 2, jer supstitucija pacovskih ostataka sa humanim ostacima u bilo kom od ovih mesta sprečava vezivanje. Antitelo 27F2 se razlikuje od antitela 15C4 u tome što promene u mestu 4 potpuno blokiraju njegovo vezivanje dok se antitelo 15C4 vezuje sa smanjenom, ali ne i kompletno eliminisanom sposobnošću. Mutacija 10 takođe smanjuje vezivanje 15C4, ali ne ispoljava očiglednu interakciju sa veznim mestom za 27F2. Ispitivanje kristalne strukture otkriva, da ovi ostaci definišu dodirnu površinu trećeg domena koja je orijentisana ka prostoru koji zauzima vezani ligand (Slike 20 i 21) (Vigers et al., 1997, Nature 386: 1990-194). ;Druga klasa identifikovanih antitela, koju predstavlja antitelo 10H7 ne zahteva treći domen da bi se vezala, i za razliku od poželjne klase inhibira vezivanje IL-lra. Ova klasa je aktivna u biološkim testovima, ali je manje potentna u odnosu na poželjnu klasu antitela. ;Nasuprot jakoj inhibiciji IL-1 bioloških testova sa poželjnom dozom antitela, antitelo 24E12 nije efikasan inhibitor u ovim testovima. Antitelo 24E12 inhibira vezivanje IL-IRAcP sa IL-1R za koji je vezan IL-1. Epitop za ovu klasu antitela koji je definisan mutantima 12, 13, 14, i 15, se nalazi proksimalno u odnosu na transmembranski domen IL-1R1 i nalazi se u regionu koji nije direkto uključen u vezivanje, bilo IL-1 bilo IL-lra (Slika 22). ;Primer 6: Kloniranje teškog i lakog lanca anti-IL-lRl antitela;Kloniranje lakog lanca anti- IL- lRl 15C4 MAt;Laki lanci za tri hibridoma koji ekspimiraju monoklonska antitela koja vezuju a-IL-1R1, 15C4, 27F2 i 26F5, su klonirana u sisarski ćelijski ekspresioni vektor pDSRal9 (videti Međunarodnu patentnu prijavu br. WO 90/14363, koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi). Konstrukcija plazmida koji kodiraklaki lanac 15C4 je ovde eksplicitno opisana; kloniranje drugih vrsta lakog lanca je izvedeno korišćenjem sličnih postupaka. Varijabilni region a-IL-lRlklakog lanca je dobijen korišćenjem postupaka amplifikacije lančane reakcije polimeraze (PCR) iz prvog lanca cDNK dobijenog iz ukupne RNK a-IL-lRl hibridoma 15C4, koja je pripremljena upotrebom TRIzol<®>reagensa (Invitrogen). Prvi lanac cDNK je sintetisan upotrebom nasumičnog prajmera sa ekstenzionim adapterom (5' - GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT - 3'; sekvenca čiji je ID br. 44), a 5' RACE (Rapid Amplification of cDNK Ends - brza amplifikacija cDNK krajeva) je izvedena korišćenjem GeneRacer™ kompleta (Invitrogen). Za kompletni laki lanac, vodeći prajmer je bio prajmer u okviru GeneRacer™ (5' - GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA - 3'; sekvenca čiji je ID br.45), a reverzni prajmer je bio 5' - GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG - 3' (sekvenca čiji je ID br. 46). Proizvodi RACE su klonirani u pCR4-TOPO (Invitrogen), nakon čega suodređene DNK sekvence. Konsenzus DNK sekvenca k lanca 15C4 antitela je korišćena za dizajniranje prajmera za PCR amplifikaciju lanca antitela pune dužine. 5'kPCR prajmer kodira amino-terminal signalne sekvence, mesto zaXbalrestrikcioni enzim, kao i optimizovanu Kozak sekvencu (5' - CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GTC GCC ATC ACA ACT CAT TGG G - 3<*>; sekvenca čiji je ID br. 47). 3' prajmer kodira karboksi-terminal i terminacioni kodon, kao iSalirestrikciono mesto (5' - CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C - 3'; sekvenca čiji je ID br. 48).

5' a-IL-lRl 15C4kprajmerklanca (sekvenca čiji je ID br. 47):

Klonklanca a-IL-lRl 15C4 antitela pune dužine je dobijen korišćenjem pCR4:15C4kklona pomoću PCR amplifikacije sa 5' i 3'kprajmerima a-IL-lRl 15C4 antitela. PCR reakcijom je dobijen proizvod od 733 baznih parova koji kodira 233 aminokiselinskih ostataka (uključujući signalnu sekvencuklanca od 19 aminokiselina)klanca a-IL-lRl 15C4 antitela. PCR proizvod je prečišćen korišćenjem QIAquick PCR kompleta za prečišćavanje

(Qiagen kat. br. 28104), isečen je korišćenjemXbaliSali,izolovan je pomoću gela i prečišćen korišćenjem QIAquick kompltea za gel ekstrakciju (Qiagen kat. br. 28704). Ovaj PCR fragment koji sadrži kompletan a-IL-lRl 15C4klanac je potom ligiran u sisarski vektor za ekspresiju pDSRal 9. Ekspresionom klonuklanca 15C4 je zatim određena DNK sekvenca, kako bi se potvrdilo da kodira isti peptid koji je identifikovan u 15C4 hibridomu. Konačni ekspresioni vektor, pDSRal9:15C4kposeduje 5468 baznih parova i sadrži sedam funkcionalnih regiona koji su opisani u Tabeli 6.

Konstrukcija pDSR19:hIgGlCH

Ekspresioni plazmid pDSR19:pacovski varijabilni region / humani konstantni region IgGl (rVh/hChl) MAt je konstruisan kao rezultat ligacije tri dela sa Xbal i BsmBI prekinutog PCR proizvoda varijabilnog regiona pacovskog antitela, humanog konstantnog regiona (CHi, domen šarke i CH2i CH3domeni) deriviranog Sali cepanjem i izolacijom BsmBI i Sali fragmenta iz linearnog plazmida pDSRal9:hIgGl CH (Hindlll i BsmBI krajevi), kao i linearizovanog pDSRal9 sa Xbal i Sali krajeva (videti U.S. privremenu patentnu prijavu br. 60/370,407, podnetu 05.04.2002., "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies as Selective OPGL Pathway Inhibitors", koja je ovde inkorporirana po referenci). Krajnji ekspresioni vektor, pDSRal9: pacovski varijabilni region / humani konstantni region IgGl (rVj/hChl), poseduje 6158 baznih parova i sadrži 7 funkcionalnih regiona opisanih u Tabeli 7.

Linearni plazmid pDSRal9:hIgGlCHje dobijen cepanjem plazmida pDSR19:pacovski varijabilni region / humani konstantni region iGgl sa restrikcionimenzimima Xba\iBsmBI,čime je uklonjen pacovski varijabilni region, a proizvod je prečišćen korišćenjem QIAquick kompleta za gel ekstrakciju. Linearni plazmid pDSRal9:hIgGlCHkoji sadrži domen konstantnog regiona humanog IgGl os 1 kbp je korišćen za prihvatanje varijabilnih regiona aIL-R antitela koje je izvedeno iz hibridoma.

Kloniranje teškog lanca anti- IL- l- RI 15C4 MAt

Teški lanci za deset hibridoma koji eksprimiraju alL-RI vezujuća monoklonska antitela 15C4, 27F2 i 26F5 su klonirani u vektor za ekspresiju u sisarskoj ćeliji pDSRal9. Konstrukcija plazmida koji kodira teški lanac 15C4 je eksplicitno opisana; kloniranje drugih vrsta teškog lanca je izvedeno korišćenjem sličnih postupaka. Varijabilni region teškog lanca alL-lRl 15C4 antitela je dobijena korišćenjem postupaka PCR amplifikacije iz prvog lanca cDNK dobijenog iz ukupne RNK alL-lRI 15C4 hibridoma pripremljene korišćenjem TRIzol<®>reagensa. Prvi lanac cDNK je sintetizovan korišćenjem nasumičnog prajmera sa ekstenzionim adapterom (5' - GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT - 3'; sekvenca čiji je ID br. 44), a 5' RACE (Rapid Amplification of cDNK Ends - brza amplifikacija cDNK krajeva) je izvedena korišćenjem GeneRacer™ kompleta (Invitrogen). Za teški lanac parcijalne dužine, vodeći prajmer je bio prajmer u okviru GeneRacer™ (5' - GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA - 3'; sekvenca čiji je ID br. 45), a reverzni prajmer je bio 5' - TGA GGA CGC TGA CCA CAC G - 3' (sekvenca čiji je ID br. 52). Proizvodi RACE su klonirani u pCR4-TOPO (Invitrogen), nakon čega su određene DNK sekvence. Konsenzus DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 15C4 antitela je korišćena za dizajniranje prajmera za PCR amplifikaciju varijabilnog regiona teškog lanca. 5' PCR prajmer za teški lanac kodira amino-terminal signalne sekvence, mesto zaXba\restrikcioni enzim, kao i optimizovanu Kozak sekvencu (5' - CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GTC AAC CGC CAT CCT CG - 3'; sekvenca čiji je ID br. 53). 3' prajmer kodira karboksi-terminal varijabilnog regiona, uključujućiBsmBIrestrikciono mesto na vodećoj niti (5' - GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC - 3'; sekvenca čiji je ID br. 54).

5' a-IL-lRl 15C4 prajmer teškog lanca (sekvenca čiji je ID br. 53):

Konstrukcija ekspresionog klona teškog lanca anti- ILl- RI IgGl

Klon teškog lanca pune dužine alL-lRl 15C4 je dobijen iz klona teškog lanca pCR4:15C4 pomoću PCR amlifikacije sa 5' i 3' prajmerima za teški lanac alL-lRl 15C4. PCR-om je dobijen proizvod od 442 baznih parova koji kodira 137 aminokiselinskih ostataka (uključujući signalnu sekvencu teškog lanca od 19 aminokiselina) varijabilnog regiona teškog lanca alL-lRl 15C4. PCR proizvod je prečišćen korišćenjem QIAquick PCR kompleta za prečišćavanje, a potom je isečen korišćenjemXba\iBsmBI,izolovan je pomoću gela i prečišćen korišćenjem QIAquick kompleta za gel ekstrakciju. Ovaj fragment koji sadrži kompletan varijabilan region teškog lanca a-IL-lRl 15C4 je potom ligiran u sisarski vektor za ekspresiju pDSRal9:hIgGlCH. Ekspresionom klonu IgGl teškog lanca 15C4 je zatim određena DNK sekvenca, kako bi se potvrdilo da kodira isti peptid koji je identifikovan u 15C4 hibridomu. Konačni ekspresioni vektor, pDSRal9:15C4 IgGl teški lanac poseduje 6173 baznih parova i sadrži sedam funkcionalnih regiona koji su opisani u Tabeli 8.

Konstrukcija pDSR19:hIgG2CH

Ekspresioni plazmid pDSR19:humani varijabilni region / humani konstantni region IgG2 (hVh/hCh2) MAt je konstruisan kao rezultat ligacije tri dela sa Xbal i BsmBI prekinutog PCR proizvoda varijabilnog regiona humanog antitela, humanog konstantnog regiona IgG2 (CHi, domen šarke i CH2i CH3domeni) sa BsmBI i Sali krajevima i linearizovanog pDSRal9 sa Xbal i Sali krajevima. Krajnji ekspresioni vektor, pDSRal9:humani varijabilni region / humani konstantni region IgGl (hVh/hCh2) (videti U.S. privremenu patentnu prijavu br. 60/370,407, podnetu 05.04.2002., "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies as Selective OPGL Pathway Inhibitors", koja je ovde inkorporirana po referenci), poseduje 6164 baznih parova i sadrži 7 funkcionalnih regiona opisanih u Tabeli 9.

Linearni plazmid pDSRal9:hIgG2CH je dobijen cepanjem plazmida pDSR19:humani varijabilni region / humani konstantni region IgG2 sa restrikcionim enzimimaXbaliBsmBI,čime je uklonjen humani varijabilni region, a proizvod je prečišćen korišćenjem QIAquick kompleta za gel ekstrakciju. Linearni plazmid pDSRal9:hIgG2CH koji sadrži domen konstantnog regiona humanog IgG2 od 1 kbp je korišćen za prihvatanje varijabilnih regiona aIL-R antitela koje je izvedeno iz hibridoma.

Konstrukcija ekspresionog klona teškog lanca anti- ILl- RI IgG2

Fragment varijabilnog regiona teškog lanca alL-lRl 15C4 antitela, koji je opisan gore, ligiran je u sisarski vektor za ekspresiju pDSRal9:hIgG2CH. Ekspresionom klonu IgGl teškog lanca 15C4 je zatim određena DNK sekvenca, kako bi se potvrdilo da kodira isti peptid varijabilnog regiona teškog lanca koji je identifikovan u 15C4 hibridomu. Konačni ekspresioni vektor, pDSRal9:15C4 IgG2 teški lanac poseduje 6161 baznih parova i sadrži sedam funkcionalnih regiona koji su opisani u Tabeli 10.

Konstrukcija pDSR19:hIgGlCH

Ekspresioni plazmid pDSR19:humani varijabilni region / humani konstantni region IgG4 (hVh/hCh4) MAt je konstruisan kao rezultat ligacije tri dela sa Xbal i BsmBI prekinutog PCR proizvoda varijabilnog regiona humanog antitela, humanog konstantnog regiona IgG4 (CHi, domen šarke i CH2i CH3domeni) izolovanog na gelu i obrađenog sa BsmBI i Sali i linearizovanog plazmida pDSRal9 sa Xbal i Sali krajevima. Krajnji ekspresioni vektor, pDSRal9:humani varijabilni region / humani konstantni region IgG4 (hVh/hCh4) (videti U.S. privremenu patentnu prijavu br. 60/370,407, podnetu 05.04.2002., "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies as Selective OPGL Pathway Inhibitors", koja je ovde inkorporirana po referenci) poseduje 6167 baznih parova i sadrži 7 funkcionalnih regiona opisanih u Tabeli 11.

Linearni plazmid pDSRal9:hIgG4CH je dobijen cepanjem plazmida pDSR19:humani varijabilni region / humani konstantni region IgG4 sa restrikcionim enzimimaXbaliBsmBI,čime je uklonjen humani varijabilni region, a proizvod je prečišćen korišćenjem QIAquick kompleta za gel ekstrakciju. Linearni plazmid pDSRal9:hIgG4CHkoji sadrži domen konstantnog regiona humanog IgG4 od 1 kbp je korišćen za prihvatanje varijabilnih regiona aIL-R antitela koje je izvedeno iz hibridoma.

Konstrukcija ekspresionog klona teškog lanca anti- ILl- RI IgG4

Fragment varijabilnog regiona teškog lanca alL-lRl 15C4 antitela, koji je opisan gore, ligiran je u sisarski vektor za ekspresiju pDSRal9:hIgG4CH. Ekspresionom klonu IgG4 teškog lanca 15C4 je zatim određena DNK sekvenca, kako bi se potvrdilo da kodira isti peptid varijabilnog regiona teškog lanca koji je identifikovan u 15C4 hibridomu. Konačni ekspresioni vektor, pDSRal9:15C4 IgG2 teški lanac poseduje 6164 baznih parova i sadrži sedam funkcionalnih regiona koji su opisani u Tabeli 12.

Primer 7: Ekspresija anti-IL-lRl antitela u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO)

Rekombinantna anti-IL-lRl antitela se stvaraju u ćelijama jajnika kinsekog hrčka, specifično u CHO AM-l/D ćelijama, kao što je opisano u U.S. patentu br. 6,210,924 (inkorporiran po referenci). Ukratko, DNK sekvence koje kodiraju kompletne teške i lake lance svakog anti-IL-lRl antitela prema predmetnompronalasku se kloniraju u vektore ekspresije. CHO AM-1D ćelije su kotransficirane sa ekspresionim vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca i sa sekpresionim vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog lakog lanca odgovarajućeg anti-IL-lRl antitela. Na primer, pri dobijanju 26F5 antitela, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 38 i sa vektorom koji je posoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 20, 22 ili 24. Da bi se dobilo antitelo 26F2, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 38 i sa vektorom koji je posoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 26, 28 ili 30. Da bi se dobilo antitelo 15C4, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 40 i sa vektorom koji je posoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 32, 34 ili 36. U tabeli 13 su sažeto prikazani kompletni teški i laki lanci za različita IL-1R1 antitela. Oznaka "...IgG " opisuje sekvencu konstantnog regiona određenog antitela.

Stabilna ekspresija anti-IL-lRl antitela se postiže kotransfekcijom CHO AM-l/D ćelija koje su deficijentne za dihidrofolat reduktazu (DHFR") sa ekspresionim vektorima. Transfekcije se izvode korišćenjem standardnih tehnika (ko-precipitacija sa kalcijum fosfatom i DHFR selekcijom. Transficirane kolonije se izoluju i uzgajaju konfluentno na pločama od 24 polja. Kod antitela koja se dobiju iz transficiranih ćelija se ispituje sposobnost odgovarajućeg savijanja i neutralizacije. Izabiraju se klonovi koji prekomerno proizvode odgovarajuće savijena anti-IL-lRl antitela izotipa IgGl, IgG2 i IgG4, a antitela se prečišćavaju na dole opisani način.

Primer 8: Proizvodnja anti-IL-lRl antitela

Anti-IL-lRl antitela se dobijaju ekspresijom u klonskoj liniji CHO ćelija. Za svaki od ciklusa proizvodnje, ćelije iz jedne bočice se otapaju u podlozi kulture za ćelije bez seruma. Ćelije se inicijalno uzgajaju u T-sudu i serijski se ekspandiraju kroz niz posuda koje se rotiraju, sve dok se ne dobije dovoljno inokuluma da se kultiviše bio-reaktor od 20 1. Nakon uzgajanja od 5 - 10 dana, kultura se koristi za inokulaciju bio-reaktora od 300 1. Nakon dodatnih 5-10 dana, kultura se koristi za inokulaciju bio-reaktora od 2000 1. Proizvodnja se sprovodi u bio-reaktoru od 2000 1 u kome se nalazi masovona kultura, u kojoj se hranljivi sastojci koji sadrže koncentrovane komponente podloge dodaju u cilju održavanja ćelijskog rasta i vijabilnosti. Proizvodnja traje tokom otprilike dve nedelje, pri čemu se anti-IL-lRl konstitutivno proizvodi od strane ćelija i sekretuje u podlogu ćelijske kulture.

U reaktoru za proizvodnju se održava određen pH vrednosti, temperatura i određeni niovo rastvorenog kiseonika: pH verdnost se kontroliše gasovitim ugljen dioksidom i dodavanjem natrijum karbonata; rastvoreni kiseonik se kontroliše protocima vazduha, azota i kiseonika.

Na kraju procesa proizvodnje, ćelijska kaša se prenosi u centrifugu na diskoidnom postolju, a supernatant kulture se razdvaja od ćelija. Koncentrat se dalje čisti od krupnih ostataka pomoću dubinskog filtera, a potom i filtera sa porama od 0,2 um. Iščišćena kondicionirana podloga se zatim koncentruje ultrafiltracijom sa tangencijalnim protokom. Kondicionirana podloga se koncentruje 15 - 30 x. Dobijena koncentrovana kondicionirana podloga se zatim obrađuje prečišćavanjem ili se zamrzava da bi se prečišćavanje izvelo kasnije.

Primer 9: Mapiranje epitopa korišćenjem avidinskih fuzionih proteina

Da bi se dobili avididnski fuzioni proteini, cDNK koja kodira pileći avidin (sa endogenom signalnom sekvencom) se ligira sa 5' krajem cDNK koja kodira zrele ekstracelularne domene humanog ili cvnomolgus IL-1R1 koji je fuzionisan sa sekvencom za FLAG oznaku na 3' kraju. Geni za fuzione proteine sa FLAG oznakom se sklapaju u pALTERMAX vektoru korišćenjem konvencionalnih molekularnih tehnika. Aminokiselinska sekvenca avidin - humani IL-1R1 fuzionog proteina je prikazana na Slici 23 (sekvenca čiji je ID br. 59). Aminokiselinska sekvenca avidin - cvnomolgus IL-1R1 fuzionog proteina je prikazana na Slici 24 (sekvenca čiji je ID br. 60). Panel mutantnih avidin - cynoIL-lRl-FLAG proteina u kojima su humane aminokiseline supstituisane sa odgovarajućim cvnomolgus ostacima je dobijen korišćenjem Altered Sites II Mammalian In Vitro sistema za mutagenezu (Promega Corp.). Mutacije su ilustrovane na Slici 24.

Plazmidi koji kodiraju avidin-cynoIL-lR mutantne i proteine divljeg tipa, kao i avidin-huIL-lRl-FLAG protein su prolazno transficirani u 293T ćelije korišćenjem Cvtofectine reagensa za transfekciju (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Lažni transfektanti su korišćeni kao negativne kontrole. Western blot analizom i testovima vezivanja sa perlicama je ispitivano vezivanje anti-huIL-lRl monoklonskog antitela (MAt) za ove proteine korišćenjem kondicionirane podloge (CM) koja je prikupljena iz kulture transficiranih ćelija.

Za Western blot analizu, CM je razblažena 1 : 3 u neredukujućem SDS puferu za uzorke, kuvana je tokom 5-10 minuta i naneta na 10% Tris-glicin gelove. Nakon SDS-PAGE i Western transfera, membrane su blokirane sa 3% BSA / 1% ovalbuminom u PBS / 0,1% Tween-20 (PBST) i obojene su sa anti-huIL-lRl MAt. Kozije anti-humano IgG-Fc-HRP antitelo (Pierce Chemical Co.) koje je razblaženo 1 : 15000 u PBST je korišćeno za sekundarnu detekciju. Anti-FLAG detekcija je korišćena za normalizovanje nanošenja proteina. Slikanje i denzitometrija su izvođeni korišćenjem FluorChem 8000 digitalnog sistema za slikanje (Alpha Innotech Corp.). Intenziteti signala za anti-huIL-lRl MAt su normalizovani u odnosu navrednosti za anti-FLAG antitelo, kako bi se uzela u obzir varijacija u nanošenju proteina. Vezivanje antitela je prikazano kao procenat vezivanja za avidin - humani IL-1R1-FLAG.

Rezultati Western blot analize su prikazani na Slici 25. Slika 25B prikazuje denzitometrijsku analizu dupliranog seta Western blot eksperimenata. Humani ostaci koji su kritični za vezivanje antitela su oni koji ponovo uspostavljaju signal kada se supstituišu u cynoIL-lRl. Generalno, mutacije 1 i 2 (prikazane na Slici 24), same ili u kombinaciji, ponovo uspostavljaju vezivanje mnogih antitela (15C4/IgG2, 5B8, 1C2, 24H2, 16E9, 26E4 i 20G1), dok mutacije 10.1 i 10.2 to ne čine. Nijedno od ovih antitela se ne vezuje za cynoIl-lRl divljeg tipa. Dva antitela (27F2 i 19C8) se konzistentno vezuju za sve mutantne proteine, kao i za cyno-IL-lRl divljeg tipa. Ovo ukazuje da epitop 4 (ostaci Y279 - V281 cynoIL-lRl molekula), koji je identifikovan u pacovskim / humanim paralog protenima i koji je nepromenjen u cynomolgus IL-1R1, predstavlja dominantni epitop za ova antitela. Epitop 4 je prikazan masno, italikom i podvučeno u aminokiselinskoj sekvenci koja je prikazana na Slici 24.

U testovima vezivanja sa multipleks perlicama, avidinski fuzioni proteini su zarobljeni inkubacijom CM sa florescentnim perlicama obloženim biotinom, jedan komplet perlica po fuzionom proteinu (Beadlvte Multi-Biotin 10plex Bead Kit; Upstate Biotechnologies). Perlice su isprane i prikupljene u PBST, a potom u jednakom broju dodate u polja ploče od 96 polja sa filter dnom (Millipore Corp.). Antitela (anti-huIL-lRl MAt ili anti-FLAG MAt) su dodata u koncentraciji od 25 ug/ml i inkubirana su tokom 1 časa. Perlice su ponovo isprane, pa je za detekciju vezivanja antitela korišćeno anti-mišije IgG antitelo konjugovano sa fikoeritrinom i anti-humano IgG (Fab')2.Nakon 1 časa inkubaije, perlice su isprane i resuspendovane u PBST. Srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) su merene korišćenjem Luminex 100 (Luminex Corp.). Podaci su normalizovani korišćenjem MFI vrednosti za anti-FLAG MAt vezivanje, kako bi se u obzir uzela varijacija u nanošenju proteina. Vezivanje antitela je prikazano kao procenat vezivanja avidin-huIL-lRl-FLAG (Slika 26). Obrazac vezivanja anti-IL-1R1 antitela za avidin-cynoIL-lRl-FLAG proteine koji su mutirani sa humanim ostacima, kao i za cvnomolgus i humane IL-1R1 proteine divljeg tipa je konzistentan sa imunoblot analizom prikazanoj na Slici 25.

Treba napomenuti da napred navedeni opis naglašava određena specifična rešenja predmetnog pronalaska, a da su sve modifikacije ili alternative koje su ekvivalentne ovim rešenjima obuhvaćene duhom i obimom zaštite predmetnog pronalaska koi je definisan pridodatim patentnim zahtevima.

Claims

1. Izolovano humano antitelonaznačeno timešto se specifično vezuje za polipeptid iz sekvence čiji je ID br: 76.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto se dato antitelo specifično vezuje za treći domen receptora za interleukin 1 tipa 1 (IL-1R1).

3. Izolovano humano antitelo prema patentnim zahtevima 1 ili 2, ili antigen vezujući fragment takvog antitela,naznačeno timešto sadrži: a. okvirne regione humanog teškog lanca, CDR1 region teškog lanca, gde dati CDR1 region sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence čiji je ID br: 62, CDR2 region teškog lanca, gde dati CDR2 region sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence čiji je ID br: 65 i CDR3 region teškog lanca, gde dati CDR3 region sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence čiji je ID br: 68; i b. okvirne regione humanog lakog lanca, CDR1 region lakog lanca, gde dati CDR1 region sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence čiji je ID br: 70, CDR2 region lakog lanca, gde dati CDR2 region sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence čiji je ID br: 72 i CDR3 region lakog lanca, gde dati CDR3 region sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence čiji je ID br: 74.

4. Antitelo, ili antigen vezujući fragment takvog antitela, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3,naznačeno timešto dato antitelo sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAVSGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWV AAIWNDGENKHHAGSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGRYFDWLLFEYWGQGTLVTVSS i laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTK VEIK.

5. Postupak za mapiranje epitopa IL-1R1 kao antigena,naznačen timešto podrazumeva: (a) dobijanje grupe fuzionih proteina, gde svaki fuzioni protein sadrži (i) avidin i (ii) fragment IL-1R1; (b) ispitivanje grupe fuzionih proteina na vezivanje zajedno ili veći broj anti-IL-lRl antitela; (c) izolovanje fuzionih proteina u podlozi koja sadrži biotin, gde se avidin veže za biotin; i (d) analizu fuzionih proteina vezanih za anti-IL-lRl antitelo(a) kako bi se odredila mesta vezivanja na IL-1 Rl zaanti-ILIRl antitelo(a).