RS20060044A

RS20060044A - Smeše oligosaharida izvedene od heparina, njihovo dobijanje i farmaceutski preparati koji sadrže ove smeše

Info

Publication number: RS20060044A
Application number: YUP-2006/0044A
Authority: RS
Inventors: Christian Viskov; Volker Laux; Pierre Mourier
Original assignee: Aventis Pharma S.A.,
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-22
Publication date: 2008-06-05
Also published as: TWI369208B; HK1094806A1; ZA200600657B; PT1651677E; AU2004259111A1; MY136769A; PE20050246A1; WO2005010051A2; MEP11608A; IL173206A; AR045917A1; HN2004000250A; CA2533555A1; GT200400145A; WO2005010051A3; RU2006105384A; RU2346005C2; MXPA06000336A; BRPI0412850A; TW200522970A

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na smeše oligosaharida dobijenih iz heparina, molekulske mase od 1,800 do 2,400 da1tona, okarakterisane visokom aXa aktivnošću i bez alla aktivnosti.Predmetni pronalazak se takođe odnosi na njhiov metod dobijanja i na farmaceutske preparate koji sadrže ove smeše.

Description

SMEŠE OLIGOSAHARIDA IZVEDENE OD.HEPARINA, NJIHOVO DOBIJANJE I FARMACEUTSKI PREPARATI KOJI SADRŽE OVE

SMEŠE

U ovom izumu se radi o oligosaharidima dobijenim iz heparina, srednjih molekulskih masa od 1800 do 2400 daltona, koje karakteriše jaka anti-Xa aktivnost (aXa) i odsustvo anti Ha (alla) aktivnosti, o postupku njihovog dobijanja i farmaceutskim preparatima koji ih sadrže.

Heparin je smeša sulfatisanih mukopolisaharida, animalnog porekla, koji se koristi zbog svojih antikoagulativnih i antitrombotskih osobina.

Pa ipak, heparin ima nedostatke koji ograničavaju uslove njegove primene. Naročito, njegova značajna antikoagulantna aktivnost (alla) može da dovede do hemoragija (Seminari u Thrombosis i Hemostasis, vol 5 sup. 3 (1999)).

Heparini male molekulske mase, dobijeni naročito baznom depolimerizacijom estara heparina, koji se sada prodaju kao Enoksaparin, takođe pokazuju i znatnu aTTa aktivnost

Nedavno su opisani heparini vrlo male molekulske mase u prethodnim radovima. Na primer, u patentu US 6 384 021, proizvodi pokazuju anti Xa aktivnost između 100 i 120 IU/mg i anti-IIa aktivnost između 2 i 8 IU/mg. U međunarodnoj prijavi WO 02/08295 i WO 2004/033503, proizvodi imaju anti-Xa aktivnosti, koje su uglavnom između 100 i 190 IU/mg za anti-IIa aktivnosti manjih od 5 IU/mg. Međutim, nijedan od ovih heparina male molekulske mase efektivno nema anti Xa aktivnost veću od 190 IU/mg , dok u isto vreme nemaju, ili praktično nemaju anti Ha aktivnost (IU = International Unit, tj. Međunarodna jedinica).

Izraz "nemaju praktično anti Ha aktivnost" (drugim recima, koji praktično ne pokazuju anti Ha aktivnost) označava aktivnost manju od 0,2 IU/mg.

Jedan od predmeta ovog izuma su smeše oligosaharida sa vrlo selektivnom aktivnošću prema aktiviranom faktoru X (faktor Xa), dok u isto vreme nemaju, ili nemaju bitnu anti Ha aktivnost.

Predmet ovog izuma su, dakle, smeše oligosaharida, opšte strukture polisaharida koji ulaze u sastav heparina i koji imaju sledeće karakteristike: - Imaju srednju molekulsku masu od 1800 do 2400 daltona, anti-Xa aktivnost od 190 do 450 IU/mg, i nemaju, ili praktično nemaju anti Ha aktivnost, oligosaharidi koji čine smeše sadrže 2 do 26 šećernih jedinica , imaju jednu jedinicu 4,5-nezasićene uronske kiseline 2-O-sulfata najednom

od svojih krajeva,

i sadrže heksasaharid sledeće formule:

u obliku soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala.

Heksasaharid Alla-IIs-Is koji se nalazi u smeši opisanoj u ovom izumu je sekvencija koja ima veliki afinitet za ATIII i odlikuje se aXa aktivnošću većom od 740 IU/mg.

Kao so alkalnog ili zemnoalkalnog metala najpoželjnije su soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma i magnezijuma.

Srednja molekulska masa se određuje tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom, korišćenjem dve kolone u seriji, kao, na primer, one koje se prodaju pod imenom TSK G3000 XL i TSK G2000 XL. Detekcija se izvodi refraktometrijom. Za eluiranje se koristi litijum nitrat, pri protoku 0,6 ml/min. Sistem je kalibrisan standardima dobijenim frakcionisanjem Enoksaparina hromatografijom na gelu od agaroze i poliakrilamida (IBF) Ovo dobijanje se ostvaruje tehnikom koju su opisali Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ili D.A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Rezultati se izračunavaju pomoću programa GPC6 (Perkin Elmer).

Aktivnost anti-Xa se meri amidolitičkom medodom sa hromogenim supstratom kao stoje opisano u Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977). Probe su izvođene prema metodu opisanom u monografiji o heparinima male molekulske mase, prema važećoj evropskoj farmakopeji, osim sto je pufer za rekonstituciju, albumin u tris-NaCl-nom puferu, pH 7,4, zamenjen Polietilen glikolom 6000(PEG 6000).

Anti Xa aktivnost se meri u odnosu na Heparin vrlo male molekulske mase (HTBPM, od Heparine depolimerizacija Tres Bas Poids Molćculaire), koji meri od 140 do 180 U/mg (suve težine). Aktivnost standarda HTBPM se meri relativno, u odnosu na međunarodni etalon heparina male molekulske mase.

Ovaj standard HTBPM se dobija prema uputstvima patentne prijave WO WO 02/08 295 i, naročito, WO 2004/033503. Aktivnost standarda HTBPM se meri u odnosu na međunarodni etalon heparina male molekulske mase

Anti Ha aktivnost se meri amidolitičkim metodom sa hromogenim supstratom prema metodu opisanom u monografiji o heparinima male molekulske mase, u važećoj evropskoj farmakopei. Aktivnosti alla se mere sa standardom Heparina vrlo male molekulske mase (HTBPM), čija je merena aktivnost 2,1 IU/mg. Aktivnost standarda HTBPM se meri u odnosu na internacionalni etalon heparina male molekulske mase

U najpoželjnijem obliku, smeša oligosaharida prema ovom izumu sadrži 20 % do 100 % frakcije heksasaharida. Najčešće, ova smeša sadrži od 30 % do 60 % frakcije heksasaharida.

Uz to, smeše prema ovom izumu sadrže 20 % do 70 % heksasaharida Alla-IIs-ls u frakciji heksasaharida smeše oligosaharida. Najčešće, frakcija heksasaharida sadrži 25 % do 50 % frakcije Alla-IIs-Is.

Procenat frakcije heksasaharida može se analitički odrediti tečnom hromatografijom pod pod visokim pritiskom na kolonama TSK G3000 XL i TSK G2000 XL ili preparativnim odvajanjem frakcije heksasaharida

U tom slučaju se smeša hromatografiše na kolonama ispunjenim gelom tipa agaroznog poliakrilamida. Smeša se eluira rastvorom natrijumbikarbonata. Poželjno je da rastvor natrijumbikarbonata bude od 0,1 mol/l do 1 mol/l. Najbolje je da se separacija obavi pri koncentraciji 1 mol/l. Detekcija se vrši UV-spektrometrijom (254 nm). Posle frakcionisanja, frakcija heksasaharida u rastvoru natrijumbikarbonata se neutrališe glacijalnom sirćetnom kiselinom. Rastvor se zatim koncentruje pod sniženim pritiskom tok se ne dobije koncentracija acetata veća od 30 %, težinskih. Frakcija heksasaharida se taloži dodavanjem 3 do 5 zapremina metanola. Frakcija heksasaharida se izdvaja filtrovanjem preko sinterovanog stakla n° 3. Dobijena smeša heksasaharida može se analizirati pomoću HPLC (Tečna hromatografija visoke rezolucije) da se odredi količina heksasaharida Alla-IIs-Is. Heksasaharid AIIa-IIsTs može se izolovati prcparativnom HPLC hromatografijom ili afinitivnom hromatografijom na koloni od antitrombin III sefaroze, prema metodu koji se koristi u struci (M. Hook, I. Bjork, .1. Hopwood i U. Lindahl,F. E. B. S letters,vol 656(1) (1976)).

Smeše tobijene ovim izumom imaju srednje molekulske mase između 1900 i 2200 daltona, najčešće, od 1950 to 2150 daltona.

U najpoželjnijem obliku, smeša oligosaharida prema ovom izumu odlikuje se time što ima anti Xa aktivnost između 190 IU/mg i 410 IU/mg i nema, ili praktično nema, anti-IIa aktivnost. Najčešće je anti-Xa aktivnost između 200 i 300

IU.

Predmet ovog izuma su, stoga, najčešće smeše sledećih karakteristika:

- srednje molekulske mase između 1950 i 2150 daltona

- anti-Xa aktivnost između 190 IU/mg i 410 IU/mg i nemanje, ili nemanje bitne, anti-IIa aktivnosti, - sadrže 30 to 60 % frakcije heksasaharida, koja sadrži od 25 % to 55 % frakcije AIIa-IIsTs.

Aktivnost smeše oligosaharida prema ovom izumu se dobija pomoću specifičnog procesa opisanog niže. Stručnjacima je dobro poznato da su fizikohemijske karakteristike smeše polisaharida i iz njih izvedena aktivnost povezane sa postupkom dobijanja (J. Med. Chem. 33(6) 1639-2093 (1990)).

Smeše oligosaharida prema ovom izumu dobij aj u se depolimerizacijom kvatername amonijumove soli benzil estra Heparina male molekulske mase

(HTBPM) u organskom medijumu. Ovaj (HTBPM) se dobija prema uputstvima zahteva patenta WO 02/08295 i WO 2004/033503. Najčešće se radi o ponovnoj depolimerizaciji heparina vrlo male molekulske mase, koji je, pak, specifično dobijen depolimerizacijom esterifikovanog heparina u prisustvu jake baze, prevashodno u dihlorometanu i u prisustvu manje od 3 % vode

Heparini male molekulske mase, koji se koriste kao početni materijal u ovom izumu, tobijeni su prema postupcima opisanim u zahtevima patenata WO 02/08295 i WO 2004/033503.

Početni HTBPM , koji se koriste kao početni materijal, imaju aXa aktivnost veću od 140 IU/mg, alla aktivnost manju od 5 IU/mg i srednje molekulske mase između 2000 i 3000 daltona. Aktivnosti aXa se mere prema standardu HTBPM, čija je merena aktivnost 158 IU/mg. Aktivnost standarda HTBPM se meri u odnosu na internacionalni etalon heparina male molekulske mase

Početni HTBPM, dobijeni opisanim postupcima, se ponovo depolimerizuju pomoću jake organske baze, poželjno pKa vrednosti veće od 20 (poželjne osobine familije fosfazena definisane su, na primer, u Schwesinger et al, Angevv. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987) ili R. Schvvesinger et al, Angevv. Chem. 105, 1420 (1993)). Zatim se kvaternarna amonijumova so benzil estra depolimerizovanog HTBPM prevodi u natrijumovu so, zaostali estri se saponifikuju i proizvod eventualno prečisti. Navedena reakciona šema ilustruje ovaj izum

n= X+Y+Z (ukupan stepen fulvatacije disaharida)

X= stepen sulfatacije mesta, ostatak je predstavljen H radikalom

Y= stepen sulfatacije mesta, ostatak je predstavljen H radikalom

Z= stepen sulfatacije mesta, ostatak je predstavljen COCH, radikalom

Predmet ovog izuma je, prema dome, takođe i postupak za dobijanje smeše oligosaharida, kakva je već definisana, u kojoj se heparin vrlo male molekulske mase, sa aXa aktivnošću većom od 140 IU/mg, alla aktivnošću manjom od 5 IU/mg i srednje molekulske mase između 2000 i 3000 daltona, podrvrgava sledećim hemijskim reakcijama: a) trans-salifikaciji delovanjem benzetonijum hlorida, da bi se dobio benzetonijum heparinat b) esterifikaciji benzetonijum heparinata dobijenog delovanjem benzil hlorida, i tretiranjem alkoholnim rastvorom natrij um acetata da bi se dobila

natrij umova so benzil estra heparina vrlo male molekulske mase,

c) Irans-salifikaciji dobijenog benzil estra i dobijanje kvaternarne amonijumove soli, najbolje kao benzetonijuma, cetilpiridinijuma ili

cetiltrimetil amonijuma

d) depolimerizaciji pomoću jake organske baze, poželjno pKa vrednosti veće od 20, da bi se dobio depolimerizovan heparin vrlo male molekulske mase e) konverziji kvaternarne amonijumove soli depolimerizovanog heparina u so natrij uma

f) saponifikaciji zaostalih estara i eventualnom prečišćavanju

U ovom izumu, velika selektivnost baze fosfazena u stupnju

depolimerizacije (stupanj d) se naročito koristi da bi se neuobičajeno obogatila, smeša oligosaharida sekvencijama sa afinitetom za ATIII. Poželjno je da molski odnos jaka baza/estar bude između 0,2 i 5, najbolje između 0,6 i 2.

Za optimalnu selektivnost i maksimalno očuvanje sekvencija sa afinitetom za ATIII, poželjno je raditi pri sadržaju vode manjem od 0,3 %, kada se radi sa 1 molskim ekvivalentom baze fosfazena u odnosu na benzil estar HTBPM, so benzetonijuma.

Baze familije fosfazena imaju uglavnom formulu

u kojoj radikali Rido R7isti ili različiti, predstavljaju linearne, razgranate ili ciklične alkil radikale sa 1 do 6 atoma ugljenika, uz mogućnost da R3i R4kada treba, formiraju sa-N-P-N-grupom koja ih nosi 6-člano heterociklično jedinjenje. Naročito je jedan od predmeta ovog izuma proces definisan gore, u kome je baza koja se koristi za stupanj depolimerizacije d) 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,3,2-diazafosforin (zvanična nomenkklatura: 1,3,2-diazafosforin-2-amin, 2-[(l,l-dimetiletil)imino]-N,N-dietil-l,2,2,2,3,5,6-oktahidro-l,3-dimetil).

Reakcija trans-salifikacije u stupnju a) pretežno se izvodi delovanjem viška benzetonijum hlorida na natrijumovu so HTBPM, na temperaturi u oblasti između 15 i 25°C. Pogodno je da molski odnos so/natrijum heparinat bude između 2,5 i 3,5.

Esterifikacija u fazi b) se uglavnom izvodi u nekom organskom rastvaraču sa hlorom (kao što su, hloroform, dihlorometan), na temperaturi između 25 i 45°C, a najbolje između 30 i 40°C. Estar, u obliku natrijumove soli, se zatim povrati taloženjem 10 %, (težinski), natrijum acetatom u alkoholu, kao što je metanol. Uglavnom se koriste 1 do 1,2 zapremine alkohola po jedinici zapremine reakcione smeše. Količina benzil hlorida i vreme reakcije se prilagođavaju tako da se dobije prinos esterifikacije između 40 % i 100 %, najčešće između 70 % i 90 %. Najčešće se koristi 0,5 do 1,5 težinskih delova benzil hlorida na 1 težinski deo benzetonijum soli heparina. Takođe, najbolje vreme reakcije biće između 10 i 35 h.

Znači, prema ovom izumu, proces koristi stepen esterifikacije kvaternarne amonijumove soli benzil estra heparina između 40 % i 100 %, najčešće između 70 i 90 %.

Konverzija kvaternarne amonijumove soli benzil estra depolimerizovanog heparina u so natrijuma, obično se izvodi tretiranjem reakcione smeše alkoholnim rastvorom natrijum acetata, uglavnom 10 % rastvorom natrijum acetata u metanolu (w/vol). na temperaturi između 15 i 25°C

Najbolje je da težinski ekvivalent dodatog acetata bude 3 puta veći od mase kvaternarne amonijumove soli benzil estra heparina koji se u sledećem stupnju koristi za depolimerizaciju. Najbolje je da kvaternarna amonijumova so benzil estra dobijenog HTBPM bude so benzetonijuma, cetilpiridinijuma ili cetiltrimetil amonijuma.

Trans-salifikacija u fazi c) se vrši pomoću nekog kvaternarnog amonijum hlorida, najbolje pomoću benzetonijum hlorida, cetil piridinijum hlorida ili cetiltrimetil amonijum hlorida, u vodenoj sredini, na temperaturi između 10 i 25°C. Korisno je da molski odnos kvaternarnog amonijum hloriđa/natrijumova so benzil estra heparina bude između 2 i 3.

Saponifikacija se obavlja, uglavnom, pomoću nekog hidroksida alkalnog metala, kao što su natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, litijum hidroksid, u vodenoj sredini, na temperaturi između 0 i 20°C, najbolje između 0 i 10°C. Najčešće se koriste od 1 do 5 molskih ekvivalenata hidroksida alkalnog metala. Saponifikacija se pretežno vrši u prisustvu 1 do 2 molska ekvivalenta hidroksida alkalnog metala.

Krajnji proizvod se može prečistiti bilo kojim poznatim metodom za prečišćavanje depolimerizovanih heparina (na primer, EP 0037319B1). Najpoželjnije je da se prečišćavanje izvrši korišćenjem vodonik peroksida, u vodenoj sredini, na temperaturi od 10 do 50°C Ovu operaciju je najbolje izvoditi između 20 i 40°C

Smeše prema ovom izumu , u obliku natrijumove soli, mogu da se transformišu u neku drugu so alkalnog ili zemnoalkalnog metala. Eventualno prevođenje iz jedne vrste soli u drugu vrši se korišćenjem metoda opisanog u patentu FR 73 13 580.

Ovaj izum naročito omogućuje veliko obogaćenje heksasaharidom Alla-IIs-Is. Stručnjacima je dobro poznato da će se, kada se heparin male molekulske mase ponovo depolimerizuje procesom kojim se i dobio, anti-Xa aktivnost dobijenog proizvoda znatno smanjiti i dostići nultu vrednost. U slučaju kada se dobijaju Enoxaparin, Fraxiparin, Fragmin, Innohep (ili Logiparin), Normiflo, Embollex (ili Sandoparin), Fluxum (ili Minidalton), Clivarin i Hibor ovaj fenomen se primećuje ako se ovi HTBPM ponovo depolimerizuju svojim prvobitnim procesom. To je posledica male selektivnosti ovih postupaka u odnosu na očuvanje ATIII mesta.

Prema ovom izumu, ako se HTBPM dobijen procesom depolimerizacije fosfazenom, koristi kao početni materijal, doći će do potpuno obnute pojave. aXa aktivnost smeše oligosaharida se povećava i, čak. prevazilazi aktivnost heparina koji je korišćen za dobijanje HTBPM To je, verovatno, posledica znatne selektivnosti baza fosfazena u očuvanju sekvencija sa afinitetom za ATIII.

Ova odlika procesa se takođe primećuje i po srednjim molekulskim masama u dobijenoj smeši oligosaharida. Ilustracije radi, kada se HTBPM srednje molekulske mase od 2400 daltona depolimerizuje dobija se smeša oligosaharida srednje molekulske mase 2000 Da. Nađeno je da su sekvencije sa afinitetom za ATIII (heksasaharidi i oktasaharidi) pošteđene dejstva baze fosfazena, što dovodi do destrukcije i eliminacije drugih sekvencija, pa stoga i do srednje molekulske mase koja teži vrednostima srednje molekulske mase vrsta koje se ne mogu depolimerizovati, tj. do heksasaharida Alla-IIs-Is (1834 g/mol). Treba istaći da se u fazi depolimerizacije heparina bazom fosfazena srednja molekulska masa menja od 15 000 Da do oko 2400 Da.

Kao alternativan metod, postupak ovog izuma, za povećanje aktivnosti i selektivnosti prema faktoru Xa, može se takođe primeniti uopšte na heparine male molekulske mase. Ilustracije radi, spomenućemo, na primer, Enoxaparin, Fraxiparin, Fragmin, Innohep (ili Logiparin), Normiflo, Embollex (ili Sandoparin), Fluxum (ili Minidalton), Clivarin i Hibor. To mogu biti i izvesni heparini vrlo male molekulske mase, kao stoje opisano u US 6 384 021 (2000-4000 Da) ili WO 02/08295 (1500 do 3000 Da), sa anti-Xa aktivnošću manjom od 140 IU/mg.

(naročito između 100 i 140 IU/mg).

Ova karakteristika procesa odražava se u dobijanju anti-Xa aktivnosti koje se ne očekuju u odnosu na srednje molekulske mase smeša oligosaharida (190 IU/mg

< aXa < 450 IU/mg; 1800 Da < MW < 2400 Da).

Na osnovu jednog određenog oblika ovog izuma, selektivnost prema faktoru Xa smeša oligosaharida može se dalje povećati uklanjanjem frakcije disaharida i tetrasaharida (frakcija koje ne vezuju specifično za ATIII). U tom slučaju, smeša se hromatografiše na kolonama ispunjenim gelom od poliakrilamida i agaroze ili poliakrilamidnim gelom. Smeša se eluira rastvorom natrijumbikarbonata. Poželjno je da rastvor natrijumbikarbonata bude od 0,1 mol/l do 1 mol/l. Još je bolje da se separacija obavi pri koncentraciji 1 mol/l. Detekcija se vrši UV-spektrometrijom (254 nm). Posle uklanjanja frakcija disaharida i tetrasaharida smeša oligosaharida se neutrališe glacijalnom sirćetnom kiselinom. Rastvor se zatim koncentruje pod sniženim pritiskom dok se ne dobije koncentracija natrijum acetata veća od 20 %, težinskih. Smeša oligosaharida se taloži dodavanjem 3 do 5 zapremina metanola. Smeša oligosaharida velikog afiniteta se dobija filtrovanjem. Po potrebi, ona se može prečistiti isoljavanjem na odgovarajućoj koloni. Primer 6 ilustruje ovaj alternativan metod i omogućuje dobijanje heparina vrlo male molekulske mase sa anti Xa aktivnošću većom od 400 IU/mg

Predmet ovog izuma je, dakle, i prethodno definisan proces dobijanja smeša oligosaharida sa povećanom selektivnošću za faktor Xa u smeši oligosaharida, iz koje su uklonjene frakcije disaharida i tetrasaharida takođe hromatografijom, na kolonama ispunjenim gelom poliakrilamida sa agarozom.

Smeše ovog izuma mogu se koristiti kao medicinski proizvodi.

Smeše oligosaharida ovog izuma mogu se koristili kao antitrombotski agensi. Naročito, oni se koriste za lečenje ili prevenciju venskih i arterijskih tromboza, trombozu dubinskih vena, plućne embolije, nestabilnu anginu, infarkt miokarda, kardijalnu ishemiju, okluzivna oboljenja perifernih arterija i atrijalnu fibrozu. Takođe su korisni i u prevenciji i tretiranju proliferacije ćelija glatkih mišića, ateroskleroze i arterioskleoze, za lečenje i prevenciju kancera modulisanjem angiogeneze i faktora rasta, i za lečenje i prevenciju poremećaja u dijabetesu, kao što su dijabetična retinopatije i nefropatija

Predmet ovog izuma su takođe i farmaceutski sastavi koji kao aktivni princip sadrže smešu formule (I), eventualno sa jednim ili više inertnih ekscipijenata.

Farmaceutski sastavi su, na primer, rastvori koji se mogu injecirati subkutano ili intravenozno. Prema ovom izumu, drugi farmaceutski preparati se takođe koriste za davanje preko pluća (inhalacija) ili oralno davanje

Doziranje može da varira, zavisno od starosnog doba, telesnc težine i zdravstvenog stanja pacijenta. Za odrasle, doza je uglavnom između 20 i 100 mg dnevno kada se daje intramuskularno ili subkutano.

Sledeći primeri ilustruju ovaj izum, ali ga nikako ne ograničavaju.

Način dobijanja 1: Dobijanje početnog heparina vrlo male molekulske mase sa aXa aktivnošću od 158,8 IU/mg

Heparin vrlo male molekulske mase (HTBPM), koji se koristi kao početni materijal u primeru 1, dobija se prema zahtevima patenta WO 2004/033503 od heparina natrijuma izvođenjem stupnjeva a do f kako su gore definisani, pri čemu se stupanj depolimerizacije izvodi u prisustvu 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,3,2-diazafosforina u prisustvu manje od 0,6% vode.

Karakteristike dobijenog heparina vrlo male molekulske mase

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće: Srednja molekulska masa: 2400 daltona

Anti-Xa aktivnost: 158,8 IU/mg

Anti-IIa aktivnost : 3,1 IU/mg

Odnos anti-Xa aktivnost/anti-IIa aktivnost: 51

Načindobijanja 2: Dobijanje početnog heparina vrlo male molekulske mase sa aXa aktivnošću od 158 IU/mg

Heparin vrlo male molekulske mase (HTBPM), koji se koristi kao početni materijal u primerima 2, 3, 4 i 5, dobija se prema zahtevima patenta WO 2004/033503 od heparina natrijuma izvođenjem stupnjevaa do/kakosu gore definisani, pri čemu se stupanj depolimerizacije izvodi u prisustvu 2-terc-butilimino-2-dietil-amino-1,3-dimetilperhidro-1,3,2-diazafosforina u prisustvu manje od 0,6 % vode.

Karakteristike dobijenog heparina vrlo male molekulske mase

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće: Srednja molekulska masa: 2450 daltona

Anti-Xa aktivnost: 158 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 2,1 IU/mg

Odnos anti-Xa aktivnost/anti-IIa aktivnost : 75

Način dobijanja 3: HTBPM, so benzetonijuma

Trans-salifikacija HTBPM u so benzetonijuma (što odgovara stupnju

a)postupka):

12,53 g (20,7 mmol) natrijumove soli HTBPM dobijene prema načinu

dobijanja 1, stavi se u erlenmajerA od 500 ml i rastvori u 85 ml vode (žuti rastvor).

31,62 g (70,5 mmol) benzetonijum hlorida stavi se u erlenmajer B sa 250 ml vode (bezbojan rastvor)

Sadržaj B se preruči u A i smeša se meša oko 1 sat na sobnoj temperaturi. Nastala smeša se ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (250 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (250 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i zatim filtruje. Kolač se zatim ispere 3 puta sa po 200 ml vode. Čvrsta bež supstancija se ocedi, a zatim osuši na temperaturi blizu 80°C, tokom 18 sati, u pećnici pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 35,56 g HTBPM soli benzetonijuma,.

Dobijeni prinos je 89 %.

Načindobijanja4

LTans-salifikacija HTBPM u so benzetonijuma (što odgovara stupnju a) procesa): 17,93 g (30,2 mmol) natrijumove soli HTBPM dobijene prema načinu dobijanja 2, stavi se u erlenmajerA od 1 1 i rastvori u 120 ml vode (žuti rastvor)

45 g (0,1 mol) benzetonijum hlorida stavi se u erlenmajer B od 500 ml sa 360 ml vode (bezbojan rastvor)

Sadržaj B se preruči u A i smeša se meša oko 1 sat na sobnoj temperaturi Nastala smeša se ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (500 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (500 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i zatim filtruje. Kolač se zatim ispere 3 puta sa po 200 ml vode. Čvrsta bež supstancija se ocedi, a zatim osuši na temperaturi blizu 80°C, tokom 48 sati, u pećnici pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 49,5 g HTBPM soli benzetonijuma,.

Dobijeni prinos je 87 %.

Primer 1

Heparin vrlo male molekulske mase (HTBPM), dobijen procesom ovog izuma koji sadrži stupanj esterifikacije od 77 % i stupanj depolimerizacije bazom izvedenom od fosfazena, u anhidrovanoj sredini.

EsterifikacijaHTBPM(stupanj b postupka):

35,39 g (18,3 mmol) HTBPM soli benzetonijuma. dobijene prema načinu dobijanja 3 (pri sadržaju vode od 0,2 %), rastvori se u 183,3 g suvog dihlorometana i stavi u trogrli balon od 500 ml. Doda se 29,5 ml (25,7 mmol) benzil hlorida na temperaturi od 30°C. Stepen esterifikacije je oko 77 % posle 23-časovne reakcije na 30°C. Posle hlađenja do sobne temperature (22±3°C), reakciona smeša se sipa u 490 ml 10% rastvora natrijum acetata u metanolu. Smeša se meša oko 1 sat, a zatim ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (250 ml). Smeša se meša oko 30 minuta i ostavi da se taloži oko 45 minuta. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (250 ml). Ova smeša se ostavi da se taloži oko 16 sati.

Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (350 ml). Smeša se meša oko 5 minuta i suspenzija se fdtruje. Kolač se zatim ispere 2 puta sa po 50 ml metanola, ocedi, a zatim osuši na 40°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 34,48 g sirove soli benzil estra HTBPM, sa stepenom esterifikacije od 77 %..

Prečišćavanje natrijumove soli benzil estraHTBPM(stupanj b procesa): 34,48 g sirove natrijumove soli benzil estra HTBPM rastvori se u 350 ml 10 % vodenog rastvora NaCl. U rastvor se sipa 1,57 1 metanola. Suspenzija se meša oko 40 minuta i ostavi da se taloži oko 16 sati. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (1,5 1). Smeša se meša oko 40 minuta i ostavi da se taloži oko 16 sati. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (1,5 1). Smeša se meša oko 1 sat i ostavi da se taloži oko 1,5 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (1,2 1). Smeša se meša oko 15 minuta i zatim se fdtruje.

Kolač se ispere 3 puta sa po 50 ml metanola. Čvrsta bela supstancija se ocedi, a zatim osuši na 40°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 6,07 g natrijumove soli benzil estra HTBPM.

Prinos esterifikacije je 50 %.

Trans-salifikacija natrijumove soli benzil estraHTBPMu so benzetonijuma (stupanj c) postupka): 6 g (9,14 mmol) natrijumove soli benzil estra HTBPM rastvori se u 40 ml vode u erlenmajeru A od 250 ml.

Uporedo sa tim, u erlenmajer B od 250 ml stavi se 13,93 g (31 mmol) benzetonijum hlorida u 110 ml vode.

Sadržaj B se sipa u A. Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi (22±3°C) oko 1 sat i zatim ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (140 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (140 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko30 minuta.. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (140 ml). Ova smeša se meša oko 5 minuta i zatim filtruje. Kolač se ispere 3 puta sa po 50 ml vode, ocedi, a zatim osuši na 80°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 17,43 g benzetonijumove soli benzil estra HTBPM

Prinos je 100 %.

Depolimerizacija benzetonij umove soli benzil estra HTBPM u anhidrovanom medijuinu: sadržaj vode ispod granice detekcije < 0,01% (stupanj d) procesa)

U trogrli balon od 250 ml stavi se 17,43 g (9,14 mmol) HTBPM dobijenog prema preparatu 2, sa 122 ml suvog dihlorometana. Doda se 17,4 g molekulskog sita 4 A. Smeša se meša oko 18 h, na sobnoj temperaturi (22±3°C), u atmosferi argona.

Molekulska sita se odvoje od smeše prenošenjem rastvora u trogrli balon od 250 ml. Doda se 2,64 ml (9,14 mmol) 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l ,3-dimetilperhidro-l,3,2-diazo- fosforina. i smeša se meša oko 24 h na 22±3°C, u atmosferi argona.

Konverzija kvaternarne amonijumo soli u natrijumovu so (stupanj e procesa)

Istovremeno, u erlenmajeru od 2 1 napravi se 730 ml 10 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Rastvoru se doda 8,71 g celita Hyflo supercel. Reakciona smeša se sipa u metanolni rastvor, uz održavanje temperature od 4°C Suspenzija se meša na ovoj temperaturi oko 15 minuta. Smeša se ostavi da se taloži oko 45 minuta na sobnoj temperaturi. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (450 ml). Ova smeša se meša 15 minuta i ostavi da se taloži oko 45 minuta. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola (420 ml) Ova smeša se meša oko 15 minuta i zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 70 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na 50°C, tokom 18 h, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 4,35 g sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) u Celitu (8,71 g).

Prinos je 72,5%.

Saponiiikacija sirovog depolimerizovanog HTBPM, natrijumova so (stupanj fl postupka):

4,35 g (6,53 mmol) sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) u Celitu rastvori se u 46 ml vode i zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Celit se ispere 2 puta sa po 30 ml vode. Filtrat se stavi u erlenmajer od 500 ml. Uvede se 823 ul (9,94 mmol) 35 % rastvora natrijum hidroksida na temperaturi oko 4°C. Na ovoj temperaturi se meša oko 3 sata. Medijum se neutrališe dodavanjem rastvora 1N HC1, posle čega se doda i 11,5 g NaCl i 80 ml metanola. Meša se oko 15 minuta i dodaje 210 ml metanola. Suspenzija se meša oko 1 sat i zatim ostavi da se taloži oko 30 minuta.. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (230 ml). Meša se oko 15 minuta i ostavi da se taloži 30 minuta. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola (210 ml). Ova smeša se meša oko 15 minuta i zatim filtruje. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 9 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na 50°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 2,95 g sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so). Prinos je 73,7 %. i) Prečišćavanje sirovog depolimerizovanogHTBPM,natrijumova so (stupanj t'2 procesa): U trogrli balon od 50 ml stavi se 1,5 g sirovog depolimerizovanog HTBPM, natrijumova so, sa 16 ml vode. Rastvor se održava na 40°C oko 10 minuta. pH se dovede na 9,7 dodavanjem rastvora 0,1 N natrijum hidroksida. Rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm i zatim se doda 84 pl 30 % vodenog rastvora vodonik peroksida. Smeša se meša 2 sata na sobnoj temperaturi, uz održavanje stalnog pH na 9.7 ± 0.1 dodavanjem 0,1N rastvora natrijum hidroksida. Reakciona smeša se zatim neutrališe pomoću 0,1 N HC1 i doda se 2 gNaCl. Posle mešanja tokom oko 10 minuta rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 um. Na temperaturi od oko 4°C doda se 14 ml metanola. Rastvor se meša oko 15 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se doda 36 ml metanola i suspenzija meša oko 1 sat. Tada se mešanje obustavlja i smeša se ostavi da se slegne tokom oko 30 minuta. Supernatant se tada odvadi i baci (40 ml), a na staloženi precipitat doda se 40 ml metanola i meša oko 30 minuta. Ostavi se da se sediment staloži tokom 30-ak minuta. Supernatant se odvadi i baci (45 ml), nalije se 45 ml metanola i talog u suspenziji profilitruje. Dobijeni beli kolač, se opere 2 puta sa po 3 ml metanola.. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši na oko 50°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 1,303 g čistog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so).

Dobijeni prinos je 86,8 %.

g) Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog HTBPM

Srednja molekulska masa: 1950 daltona

Indeks polidisperznosti: 1,1

Anti-Xa aktivnost: 283 IU/mg

alla aktivnost: ispod granice detekcije (<0,2 U/mg)

Primer 2

Heparin vrlo male molekulske mase (HTBPM), dobijen procesom ovog izuma koji podrazumeva stupanj esterifikacije od 49 % i stupanj depolimerizacije bazom izvedenom od fosfazena, u anhidrovanoj sredini.

. Esteritikacija HTBPM (stupanj b postupka):

13,29 g (7,6 mmol) HTBPM soli benzetonijuma, dobijenih prema načinu dobijanja 4, rastvori se u 70,43 g anhidrovanog dihlorometana i stavi u trogrli balon od 100 ml. (Sadržaj vode u reakcionoj sredini je 0,073 %). Doda se 12,3 ml (107 mmol) benzil hlorida na temperaturi od 30°C. Stepen esterifikacije je 49% posle 7-časovne reakcije na 30°C. Posle hlađenja, reakciona smeša se sipa u 160 ml 12 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Smeša se meša oko 1 sat na sobnoj temperaturi a zatim ostavi da se taloži oko 16 sati. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (100 ml). Smeša se meša oko 1 sat i ostavi da se taloži okol sat. Supernatant se ponovo odbaci i zameni istom zapreminom metanola (100 ml). Ova smeša se meša oko 5 minuta i suspenzija se filtruje. Kolač se zatim ispere 2 puta sa po 40 ml metanola, ocedi, a zatim osuši u pećnici na 40°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 3,90 g sirove natrijumove soli benzil estra HTBPM, sa stepenom esterifikacije od 49 %.

. Prečišćavanje natrijumove soli benzil estra HTBPM (esterifikovanog 49 %)

(stupanj b postupka)

3,90 g sirove natrijumove soli benzil estra HTBPM, rastvori se u 39 ml 10 % vodenog rastvora NaCl. Rastvor se sipa u 176 ml metanola. Suspenzija se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži 2 h. Smeša se filtruje. Kolač se suspenduje u 175 ml metanola i meša 10 minuta. Smeša se filtruje, a. kolač se opere 2 puta sa po 10 ml metanola. Bela čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši u pećnici na 40°C. tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 2,62 g natrijumove soli benzil estra HTBPM.

Ukupan prinos u fazi esterifikacije je 57,3 %.

Trans-salifikacija benzil estra HTBPM u so benzetonijuma (stupanj c postupka): 2,62 g (4,37 mmol) HTBPM natrijumove soli benzil estra HTBPM se rastvori u 20 ml vode (erlenmajer "A"). Za to vreme se u erlenmajer "B" stavi 5,92 g (13,2 mmol) benzetonijum hlorida u 60 ml vode. Sadržaj"B" se sipa u "A". Suspenzija se meša oko lh na sobnoj temperaturi i ostavi da se slegne 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (70 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži 1 sat. Supernatant se ponovo odbaci i zameni istom zapreminom vode (70 ml). Meša se još oko 5 minuta i filtruje. Kolač, se opere 3 puta sa po 50 ml vode, ocedi, a zatim osuši u pećnici na 80°C, tokom 18 sati. pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 6,85 g natrijumove soli benzil estra

HTBPM

Dobijeni prinos je 99 %. Sadržaj vode u soli benzetonijuma je 0,6 %.

. Depolimerizacija soli benzetonijuma benzil estra HTBPM

6,80 g (4,3 mmol) HTBPM se stavi u trogrli balon od 100 ml sa 54 ml suvog dihlorometana. Smeša se dovede na 30°C i meša dok se potpuno ne rastvori. Procenjeni sadržaj vode reakcione smeše je oko 0,05 %. Doda se 1,25 ml (4,3 mmol) 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,3,2-diaza- fosforina. i smeša se meša 24 h na 30°C, u inertnoj atmosferi.

. Transformacija kvaternarne amonijumove soli u so natrijuma (stupanj e postupka)

Za to vreme, u erlenmajeru od 1 1 napravi se 270 ml 10 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Reakciona smeša se sipa u metanolni rastvor, uz održavanje temperature od 4°C. Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi oko 1 sat. Smeša se ostavi da se taloži 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (165 ml). Ova smeša se meša lsat i ostavi da se taloži 1 sat.. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola (170 ml). Ova smeša se meša oko 15 minuta i filtruje. Dobijeni kolač se zatim opere 3 puta sa po 40 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši u pećnici na 50°C, tokom 18 h, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 2,29 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog

HTBPM

Prinos je 89%.

. Saponifikacija sirovog depolimerizovanog HTBPM, natrijumove soli (stupanj fl postupka): 2,29 g (3,8 mmol) sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) rastvori se u 23 ml vode. Rastvor se filtruje preko membrane od 0,8 pm i prenese u trogrli balon od 100 ml. Uvede se 575 pl (5,73 mmol) 30 % rastvora natrijum hidroksida na temperaturi oko 3°C. Na ovoj temperaturi se meša oko 2 sata.

Polovina medijuma se neutrališe dodavanjem rastvora glacijalne sirćetne kiseline, posle čega se doda 367 mg čvrstog natrijum acetata i 13 ml metanola. Meša se oko 15 minuta i dodaje 65 ml metanola. Dobijena suspenzija se meša oko 30 minuta i zatim ostavi da se taloži okol6 sati. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (36 ml). Meša se još oko 30 minuta i ostavi da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola (16 ml). Ova smeša se meša oko 15 minuta i filtruje preko membrane od 0,22 pm. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 5 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši u pećnici na 50°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 563 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so).

Prinos je 52,6 %.

Prečišćavanje sirove natrijumove soli depolimerizovanog HTBPM, staložene NaAcONa (stupanj f2 procesa): U trogrli balon od 10 ml stavi se 560 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM, natrijumova so, sa 5,6 ml vode. Braon rastvor se dovede na 40°C i održava na toj temperaturi 10 minuta. pH se dovede na 9,7 dodavanjem rastvora 0,1 N natrijum hidroksida. Rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm i zatim se doda 28 pl 30 % vodenog rastvora vodonik peroksida. Smeša se meša 2 sata na sobnoj temperaturi, uz održavanje stalnog pH na 9,5 ± 0,1 dodavanjem 0, IN rastvora natrijum hidroksida. Reakciona smeša se zatim neutrališe pomoću 0,1 N HC1 i doda se 620 mg NaCl. Posle 10 minuta mešanja rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Na temperaturi od oko 4°C doda se 4,35 ml metanola. Rastvor se meša oko 15 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se doda 11,2 ml metanola i suspenzija meša 1 sat. Tada se mešanje obustavlja i smeša se ostavi da se slegne tokom oko 1 sata. Supernatant se tada odvadi i baci (13,5 ml), a na staloženi precipitat doda se 13,5 ml metanola i meša 15 minuta. Ostavi se da se sediment ponovo staloži tokom 30-ak minuta. Supernatant se odvadi i baci (13 ml). Nalije se 13 ml metanola i talog u suspenziji profilitrujc. Dobijeni beli kolač, se zatim opere 2 puta sa po 5 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši na oko 50°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 376 mg čistog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so). Dobijeni prinos je 87 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog HTBPM

Anti -Xa aktivnost: 191 IU/mg

Srednja molekulska masa: 2100 daltona

Primer3

Heparin vrlo male molekulske mase (HTBPM), dobijen procesom ovog izuma koji sadrži stupanj esterifikacije od 73 % i stupanj depolimerizacije bazom izvedenom od fosfazena, u anhidrovanoj sredini.

.Esteritlkacija HTBPM (stupanj b postupka):

13,7 g (7,3 mmol) HTBPM soli benzetonijuma, dobijene prema načinu dobijanja 4 rastvori se u 73,67 g anhidrovanog dihlorometana i stavi u trogrli balon od 100 ml. (Određen sadržaj vode u reakcionoj smeši je 0,23 %). Doda se 13 ml (113 mmol) benzil hlorida na temperaturi od 30°C. Stepen esterifikacije je 73 % posle 20-časovne reakcije na 30°C. Posle hlađenja do sobne temperature reakciona smeša se sipa u 210 ml 12 % rastvora natrijum acetata u metanom. Smeša se meša 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim ostavi da se taloži oko 1,5 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (140 ml). Smeša se meša 15 minuta i filtruje. Kolač se zatim ispere 2 puta sa po 100 ml metanola, ocedi, a zatim osuši u pećnici na 40°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 13,3 g sirove soli benzil estra HTBPM, sa stepenom esterifikacije od 73 %..

. Prečišćavanje natrijumove soli benzil estra HTBPM (estrifikovane do 73 %)

(stupanj b postupka):

13,3 g sirove natrijumove soli benzil estra HTBPM rastvori se u 133 ml 10 % vodenog rastvora NaCl. Rastvor se sipa u 600 ml metanola. Suspenzija se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (400 ml). Smeša se meša oko 5 minuta i zatim se filtruje. Kolač sc ispere 3 puta sa po 100 ml metanola. Čvrsta bela supstancija se ocedi, a zatim osuši u pećnici na40°C, tokom 18 sati. pod sniženim pritiskom (6 kPa).

Dobija se 2,33 g natrijumove soli benzil estra HTBPM

Prinos esterifikacije je 49,6 %.

. Trans-salifikacija benzil estra HTBPM u so benzetonijuma (stupanj c postupka): 2,27 g 3,53 mmol) natrijumove soli benzil estra HTBPM rastvori se u 15 ml vode u erlenmajeru "A" od 100 ml. Uporedo sa tim, u erlenmajer "B" od 100 ml stavi se 5,22 g (11,6 mmol) benzetonijum hlorida u 55 ml vode.

Sadržaj "B" se sipa u "A". Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi oko 1 sat i zatim ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (50 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (50 ml). Smeša se meša još 5 minuta i filtruje. Kolač se ispere 3 puta sa po 50 ml vode, ocedi, a zatim osuši u pećnici na 80°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija sc 5,67 g benzetonijumove soli benzil estra HTBPM

Dobijeni prinos je 98 %. Sadržaj vode u dobijenom proizvodu je 1 %.

.Depolimerizacijabenzetonij umove soli benzil estra HTBPM (stupanj d postupka)

U trogrli balon od 100 ml stavi se 5,45 g (3,3 mmol) HTBPM sa 40 ml suvog dihlorometana..Određen sadržaj vode u smeši je 0,1 %. Smeša se dovede na 30°C. Doda se 958 pl (3,3 mmol) 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,3,2-diaza- fosforina. i meša 24 h na 30°C, u atmosferi argona..

. Konverzija kvaternarne amonijumo soli u natrijumovu so (stupanj e postupka)

Za to vreme, u erlenmajeru od 500 ml napravi se 200 ml 10 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Reakciona smeša se sipa u metanolni rastvor, uz

održavanje temperature na oko 4°C. Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi oko 1 sat. Smeša se ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (150 ml). Ova smeša se meša 30 minuta i ostavi da sc taloži oko 30 minuta. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola (150 ml). Ova smeša se meša oko 15 minuta i zatim filtruje. Dobijeni kolač se opere 3 puta sa po 50 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na 50°C, tokom 18 h, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 1,40 g natrijumove soli sirovog depolimerizovanog HTBPM Dobijeni prinos je 65,8 %.

Saponilikacija natrijumova soli sirovog depolimerizovanog HTBPM, (stupanj fl postupka): 1,40 g (2,18 mmol) sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) rastvori se u 14 ml vode. Rastvor se prenese u trogrli balon od 100 ml. Na temperaturi oko 4°C uvede se 351 pl (3,5 mmol) 30 % rastvora natrijum hidroksida Na ovoj temperaturi se meša oko 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline (100 %). Zatim se doda 7 g čvrtsog natrijum acetata i 130 ml metanola. Suspenzija se meša oko 30 minuta i ostavi da se taloži okol sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (80 ml). Meša se još oko 30 minuta i ostavi da se taloži oko 16 sati.. Supernatant se odbaci i zameni istom količinom metanola (80 ml). Meša se oko 15 minuta i zatim filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Dobijeni kolač se opere 2 puta sa po 10 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na 50°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 1,15 g (prinos : 89,4 %) sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so).

Dobijem prinos je 89,4 %.

Prečišćavanje sirovog depolimerizovanog HTBPM, natrijumova so (stupanj f2 procesa): U trogrli balon od 10 ml stavi se 373 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM. (natrijumova so), sa 3,7 ml vode. Rastvor se održava na 40°C 10 minuta. pH se dovede na 9,5 dodavanjem rastvora 1 N natrijum hidroksida. Rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm i zatim se doda 18 pl 30 % vodenog rastvora vodonik peroksida. Smeša se meša oko 2 sata na sobnoj temperaturi, uz održavanje stalnog pH na 9,5 ± 0,1 dodavanjem 0,1 N rastvora natrijum hidroksida. Reakciona smeša se zatim neutrališe pomoću 0,1 N HC1, zatim se doda 430 mg NaCl. Posle mešanja tokom oko 10 minuta, rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Na temperaturi od oko 4°C doda se 3 ml metanola. Rastvor se meša 15 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se doda 7,7 ml metanola i suspenzija meša oko 1 sat. Tada se mešanje obustavlja i smeša se ostavi da se slegne tokom oko 40 minuta. Supernatant se tada odvadi i baci (10 ml), a na staloženi precipitat doda se 10 ml metanola i meša 15 minuta. Ostavi se da se sediment ponovo staloži tokom 30-ak minuta. Supernatant se odvadi i baci (10 ml), nalije se lOml metanola i talog u suspenziji profilitruje kroz membranu od 0,45 pm. Dobijeni beli kolač, se opere 4 puta sa po 5 ml metanola.. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši na oko 50°C, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Posle sušenja od oko 18 sati, dobija se 199 mg čistog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so).

Dobijeni prinos je 54 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog HTBPM

Srednja molekulska masa 2000 daltona. Indeks polidisperznosti 1,1

Anti-Xa aktivnost: 252 IU/mg

Primer 4

HTBPM dobijen postupkom ovog izuma koji podrazumeva stupanj esterifikacije od 96 % i stupanj depolimerizacije pomoću BEMP

. Esteritikacija HTBPM (stupanj b postupka):

!4,45 g (7,7 mmol) HTBPM soli benzetonijuma, dobijena prema načinu dobijanja 4, rastvore se u 75,79 g anhidrovanog dihlorometana i stave u trogrli balon od 250 ml. (Sadržaj vode u reakcionoj sredini je 0,20 %). Doda se 12,4 ml (108 mmol) benzil hlorida na temperaturi od 30°C. Stepen esterifikacije je 96 % posle reakcije od 26 sati na 30°C. Posle hlađenja na sobnoj temperaturi, reakciona smeša se sipa u 180 ml 12 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Smeša se meša oko 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim ostavi da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (150 ml). Smeša se meša oko 5 minuta i zatim filtruje. Kolač se ispere 2 puta sa po 100 ml metanola, ocedi, a zatim osuši na 40°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 3,67 g sirove natrijumove soli benzil estra HTBPM, sa stepcnom esterifikacije od 96 %.

. Prečišćavanje natrijumove soli benzil estra HTBPM (esterifikovanog do 96 %) (stupanj b postupka)

3,67 g natrijumove soli benzil estra HTBPM, rastvori se u 37 ml 10 % vodenog rastvora NaCl (3,7 g NaCl u 37 ml vode). Rastvor se sipa u 167 ml metanola. Suspenzija se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko 1 h. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (38 ml). Meša se oko 5 minuta i suspenzija se filtruje. Kolač se opere 2 puta sa po 30 ml metanola. Bela čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši na 40°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 2,76 g natrijumove soli benzil estra HTBPM.

Prinos esterifikacije je 54,4 %.

. Trans-salifikacija benzil estra HTBPM u so benzetonijuma (stupanj c postupka): 2,83 g (4,29 mmol) natrijumove soli benzil estra HTBPM rastvori sc u 20 ml vode u erlenmajeru "A" od 100 ml. Uporedo sa tim, u erlenmajer "B" od 100 ml stavi se 6,35 g (14,2 mmol) benzetonijum hlorida u 50 ml vode.

Sadržaj "B" se sipa u "A". Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi oko 1 sat i zatim ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (60 ml). Smeša se meša oko 15 minuta i ostavi da se taloži oko I sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom vode (60 ml). Smeša se meša još oko 5 minuta i zatim fdtruje. Kolač se ispere 4 puta sa po 50 ml vode, ocedi, a zatim osuši na 80°C, tokom 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa).

Dobija se 7,0 g benzetonijumove soli benzil estra HTBPM

Prinos je 100 %. Sadržaj vode je 0,23 %.

. Depolimerizacija soli benzetonijuma benzil estra HTBPM (stupanj d postupka)

U trogrli balon od 50 ml stavi se 3,67 g (2,3 mmol) HTBPM sa 27 ml suvog dihlorometana. Smeša se dovede na 30°C. Doda se 676 pl (2,3 mmol) 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,3,2-diaza- fosforina. i meša 24 h na 30°C.

. Konverzija kvaternarne amonijurno soli u natrijumovu so (stupanj e postupka)

Za to vreme, u erlenmajeru od 250 ml napravi se 150 ml 10 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Reakciona smeša se sipa u metanolni rastvor, uz

održavanje temperature na oko 4°C. Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi oko 1 sat..Smeša se ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (100 ml). Ova smeša se meša 30 minuta i ostavi da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola

(100 ml). Ova smeša se meša oko 15 minuta i zatim fdtruje. Dobijeni kolač se opere 3 puta sa po 40 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na 50°C, tokom 18 h, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 966 mg natrijumove soli depolimerizovanog

HTBPM.

Dobijeni prinos je 64 %.

. Saponifikacija natrijumova soli benzil estra HTBPM (stupanj fl postupka): U trogrlom balonu od 25 ml 942 mg (1,43 mmol) sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) rastvori se u 9,5 ml vode. Rastvor se prenese u trogrli balon od 100 ml. Uvodi se 236 pl (2,35 mmol) 30 % natrijum hidroksida na temperaturi oko 4°C Na ovo temperaturi meša se oko 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline (100 %). Zatim se dodaje 4,5 g čvrstog natrijum acetata i 85 ml metanola. Suspenzja se mućka oko 30 minuta a zatim se ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom količinom metanola (40 ml). Meša se još oko 30 minuta i ostavi da se taloži oko 16 sati. Supernatant se odbaci i zameni istom količinom metanola (40 ml). Meša se oko 30 minuta i filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Kolač se opere 2 puta sa po 10 ml metanola, ocedi, a zatim suši oko 18 sati na oko 50°C, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 776 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so).

Dobijeni prinos je 91,4 %.

. Prečišćavanje natrijumove soli sirovog depolimerizovanog HTBPM - stupanj 12 postupka : U trogrli balon od 25 ml stavi se 758 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) sa 7,6 ml vode. Rastvor se dovede na 40°C i drži oko 10 minuta. pH se dovede na oko 9,5 dodatkom 0,1 N natrijum hidroksida. Rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm, a zatim se doda 38 pl 30 % vodenog rastvora vodonik peroksida. Smeša se meša oko 2 sata na sobnoj temperaturi, uz održavanje stalnog pH na 9,5 ± 0,1 dodavanjem 0,1 N natrijum hidroksida. Reakciona smeša se neutrališe 0,1 N HC1 i doda se 880 mg NaCl. Posle oko 10 minuta mešanja, rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Na temperaturi oko 4°C doda se 6,2 ml metanola. Rastvor se meša još oko 15 minuta na sobnoj temperaturi. Dodaje se 16 ml metanola i suspenzija meša oko 1 sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija se filtruje. Kolač se opere 2 puta sa po 15 ml metanola. Čvrsta supstancija se ocedi. a zatim suši na oko 50°C, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Posle sušenja od oko 1 8 sati. dobija se 490 mg čistog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so). Dobijeni prinos je 65 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog HTBPM

Srednja molekulska masa: 2000 daltona I

ndeks polidisperznosti 1,1

Anti-Xa aktivnost: 205 IU/mg

Primer 5

HTBPM dobijen postupkom ovog izuma koji podrazumeva stupanj esterifikacije od 96 % i stupanj depolimerizacije pomoću terc-Butilimino-tris(dimetilamino) fosforana

Depolimerizacija benzetonij umove soli benzil estra HTBPM (stupanj d postupka)

U trogrli balon od 50 ml stavi se 3,67 g (2,3 mmol) benzetonij umove soli benzil estra HTBPM, dobijenog prema Primeru 4 (esterifikovanog do 96 %), sa sadržajem vode od 0,23 %, i 30 ml suvog dihlorometana. Smeša se dovede na 30°C. Doda se 595 pl (2.3 mmol) terc-Butilimino-tris(dimetilamino) fosforana i meša 24 h na 30°C.

. Konverzija kvaternarne amonijumo soli u natrijumovu so (stupanj e) postupka)

Za to vreme, u erlenmajeru od 250 ml napravi se 160 ml 10 % rastvora natrijum acetata u metanolu. Reakciona smeša se sipa u metanolni rastvor, uz

održavanje temperature na oko 4°C. Suspenzija se meša na sobnoj temperaturi oko I sat..Smeša se ostavi da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (120 ml). Ova smeša se meša 30 minuta i ostavi da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se opet odbaci i zameni istom količinom metanola

(125 ml). Ova smeša se meša oko 15 minuta i zatim filtruje. Dobijeni kolač se opere 3 puta sa po 40 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na oko 50°C, tokom 18 h, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 982 mg natrijumove soli sirovog depolimerizovanog HTBPM. Dobijeni prinos je 65 %.

. Saponifikacija natrijumova soli sirovog depolimerizovanog HTBPM, (stupanj fl postupka) : ()80 mg (1,49 mmol) sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so) rastvori se u 10 ml vode. Rastvor se prenese u trogrli balon od 100 ml. Na temperaturi od oko 4°C uvede se 246 pl (2,45 mmol) 30 % rastvora natrijum hidroksida Na ovoj temperaturi se meša oko 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline (100 %). Zatim se doda 4,9 g čvrtsog natrijum acetata i 95 ml metanola. Suspenzija se meša oko 30 minuta i ostavi da se taloži okol sat. Supernatant se odbaci i zameni istom zapreminom metanola (60 ml). Meša se još oko 30 minuta i ostavi da se taloži oko 16 sati.. Supernatant se odbaci i zameni istom količinom metanola (60 ml). Meša se oko 30 minuta i zatim filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Dobijeni kolač se opere 2 puta sa po 10 ml metanola,.ocedi, a zatim osuši na 50°C, tokom oko 18 sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobija se 809 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so). Dobijeni prinos je 91,6 %. . Prečišćavanje sirovog depolimerizovanogHTBPM,natrijumova so - stupanj t'2 postupka : U trogrli balon od 25ml stavi se 792 mg sirovog depolimerizovanog HTBPM, (natrijumova so), sa 8 ml vode. Rastvor se održava na 40°C 10 minuta. pH se dovede na oko 9,5 dodavanjem rastvora 0,1 N natrijum hidroksida. Rastvor se filtruje kroz membranu od 0,45 pm i zatim se doda 39,6 pl 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Smeša se meša 2 sata na sobnoj temperaturi, uz održavanje stalnog pH na 9,5 ± 0,1 dodavanjem 0,1 N rastvora natrijum hidroksida. Reakciona smeša se zatim neutrališe pomoću 1 N HC1, zatim se doda 1,04 g NaCl. Posle mešanja tokom oko 10 minuta rastvor se fdtruje kroz membranu od 0,45 pm. Na temperaturi od oko 4°C doda se 7,3 ml metanola. Rastvor se meša 15 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se doda 18,8 ml metanola i suspenzija meša oko 1 sat. Tada se mešanje obustavlja i smeša se filtruje. Kolač se opere 3 puta sa po 15 ml metanola.. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši na oko 50°C, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Posle sušenja od oko 1 8 sati, dobija se 538 mg čistog depolimerizovanog HTBPM (natrijumova so).

Dobijeni prinos je 67,9 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanogHTBPM

Srednja molekulska masa: 2100 daltona I

ndeks polidisperznosti 1,1

Anti-Xa aktivnost: 209 IU/mg

Primer6

HTBPM dobijen postupkom ovog izuma, koji sadrži dodatni stupanj hromatografskog razdvajanja da bi se uklonile frakcije disaharida i tetrasaharida

Smeša oligosaharida opisana u Primeru 1 (286 mg) rastvori se u 20 ml mobilne faze 0,2 mol/l vodenog rastvora natrijum bikarbonata). Uslovi hromatografisanja su sledeći:

- Mobilna faza : 0,2 mol/l rastvora natrijum bikarbonata

Stacionarna faza : Gel biogel Predstavlja

- Kolona : visina 1 m, prečnik 5 cm

-Talasna dužina na kojoj se vrši detekcija : 240 nm

Frakcije veće od ili jednake heksasaharidima se sakupe i sastave. One se neutrališu sirćetnom kiselinom, a zatim koncentruju dok se ne dobije rastvor od 200 g/l natrijum acetata. Dobijenom rastvoru se doda, uz mućkanje, 5 zapremina metanola. Suspenzija se meša oko 18 sati, a zatim se filtruje kroz membranu od 0,45 pm. Kolač se osuši na oko 40°C, tokom oko 6sati, pod sniženim pritiskom (6 kPa). Dobijeni proizvod se ponovo taloži, a zatim rastvara u minimumu vode i oslobodi soli na koloni od Sephadex G10. Posle koncentrovanja odsoljenih frakcija i liotilizacije, dobija se 109 mg proizvoda. Prinos je 38 %.

Karakteristike tako dobijene smeše oligosaharida su sledeće :

Anti-Xa aktivnost: 403 IU/mg

Procenat oligosaharida je sledeći :

Farmakološka aktivnost jedinjenja ovog izuma :

Procenat heksasaharida A Ila-IIs-Is ujedinjenjima ovog izuma

Claims

1) Smeša sulfatisanih oligosaharida opšte strukture polisaharida koji ulaze u sastav heparina i koje imaju sledeće karakteristike: srednje molekulske mase od 1800 do 2400 daltona, aktivnost anti-Xa od 190 do 450 IU/mg, nemaju aktivnost anti-IIa ili je praktično nemaju podrazumeva se da sastojci smeše oligosaharida sadrže 2 do 21 saharidnih jedinica imaju jednu jedinicu 4,5-nezasićene uronske kiseline 2-O-sulfata najednom od svojih krajeva, sadrže heksasaharid Alla-IIs-Is formule:- u obliku soli alkalnog ili zemnoalkalnog metala.

2) Smeša oligosaharida prema zahtevu 1, naznačena time, što se odlikuje time što su soli alkalnog ili zemnoalkalnog metala soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma i magnezijuma.

3) Smeša oligosaharida prema zahtevima 1 ili 2, naznačena time, što sadrži frakciju heksasaharida koja čini 20 do 100 %, uglavnom 30 do 60 %, smeše oligosaharida.

4) Smeša oligosaharida prema zahtevu 3 , naznačena time, što u frakciji heksasaharida sadrži 20 do 70 %, uglavnom 25 do 50 %, heksasaharida Alla-IIs-Is kako je defmisano u zahtevu 1..

5) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačena time, što ima srednju molekulsku masu između 1900 i 220 daltona, najčešće od 1900 do 2200 daltona.

6) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačena time, što pokazuje anti-Xa aktivnost između 190 IU/mg i 410 IU/mg, najčešće između 200 i 300 Ul/mg, dok je anti Ha aktivnost aktivnost jednaka nuli, ili praktično jednaka nuli..

7) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 6,, naznačena time, što ima sledeće karakteristike : - srednje molekulske mase od 1950 do 2150 daltona, aktivnost anti-Xa od 190 do 410 IU/mg, nemaju aktivnost anti-IIa ili je praktično nemaju - sadrže frakciju heksasaharida od 30 do 60 %, u kojoj se nalazi 25 do 55 %, frakcije Alla-IIs-Is

8) Postupak dobijanja smeša oligosaharida prema bilo kom zahtevu od 1 do 7, naznačen time, što se Heparin vrlo male molekulske mase, koji ima aktivnost aXa veću od 140 IU/mg, anti-IIa aktivnost manju od 5 IU/mg i srednju molekulsku masu između 2000 i 3000 daltona, podvrgava sledećim hemijskim reakcijama : a) Trans-salifikaciji delovanjem benzetonijum hlorida, da bi se dobio benzetonijum heparinat b) Esterifikaciji benzetonijum heparinata, dobijenog delovanjem benzil hlorida, i postupku da se dobije natrijumova so benzil estra heparina vrlo male molekulske mase c) Trans-salifikaciji dobijenog benzil estra i dobijanje kvaternarne amonijumove soli d) Depolimerizaciji pomoću jake organske baze, poželjno pKa veće od 20, da bi se dobio depolimerizovan Heparin vrlo male molekulske mase e) Transformaciji kvaternerne amonijumove soli depolimerizovanog Heparina vrlo male molekulske mase u natrijumovu so f) Saponifikaciji zaostalih estara i eventualnom prečišćavanju

9) Postupak dobijanja prema zahtevu 8 , naznačen time, stoje molski odnos jaka baza/estar koji sc koristi u stupnju depolimerizacije d) između 0,2 i 5, najbolje između 0,6 i 2.

10) Postupak dobijanja prema zahtevu 8 ili 9 , naznačen time, što se stupanj depolimerizacije d) izvodi pomoću derivata fosfazena kao bazom.

11) Postupak dobijanja prema bilo kom zahtevu od 8 do 10, naznačen time, što se stupanj depolimerizacije d) izvodi pri sadržaju vode manjem od 0,3 % kada se radi sa 1 molskim ekvivalentom baze fosfazena u odnosu na so benzetonijuma benzil estra HTBPM

12) Postupak dobijanja prema prema bilo kom zahtevu od 8 do 11,, naznačena time, što su baze iz familije fosfazena, klorišćene za stupanj depolimerizacije d), uglavnom, baze formule: u kojoj radikali R]to R7, identični ili različiti, predstavljaju linearne ili razgranate alkil radikale sa 1 do 6 atoma ugljenika, uz mogućnost da R3i R4kada treba, formiraju sa -N-P-N-grupom, koja ih nosi, 6-člano heterociklično jedinjenje.

13) Postupak dobijanja prema prema bilo kom zahtevu od 8 do 12, naznačena time, što je baza iz familije fosfazena, korišćena u stupnju depolimerizacije, 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,3,2-diazafosforin

14) Postupak dobijanja prema zahtevu 8, naznačen time, što je prinos esterifikacije kvaternarne amonijumove soli benzil estra heparina u stupnju b) između 40 i 100 %, uglavnom između 70 i 90 %.

15) Postupak prema zahtevu 8 , naznačen time, što se prevođenje kvaternerne amonijum soli benzil estra heparina vrlo male molekulske mase, kao što se dobija u stupnju b) postupka prema zahtevu 8, u so natrij uma vrši tretiranjem reakcione smeše alkoholnim rastvorom natrijum acetata. najpoželjnije 10 % (w/v), rastvorom natrijum acetata u metanolu, na temperaturi između 15 i 25°C

16) Postupak prema zahtevu 15 , naznačen time, što je težinski ekvivalent natrijum acetata koji se dodaje u stupnju esterifikacije b) 3 puta veći od mase kvaternerne amonijum soli benzi! estra heparina koji učestvuje u reakciji depolimerizacije.

17) Postupak prema zahtevu 8 za dobijanje smeše oligosaharida , naznačen time, što je kvatemama amonijumova so benzil estra heparina vrlo male molekulske mase, dobijena u stupnju c) uglavnom so benzetonijuma, cetilpiridinijuma ili cetiltrimetil amonijuma.

18) Postupak prema zahtevu 8 , naznačen time, što se saponifikacija (prema stupnju f) obavlja hidroksidom nekog alkalnog metala, kao stoje natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, hidroksid litijuma, u vodenoj sredini, na temperaturi između 0 i 20°C, najbolje između 0 i 10°C.

19) Postupak dobijanja prema zahtevu 18, naznačen time, što se koristi 1 do 5 molskih ekvivalenata hidroksida alkalnih metala, najbolje 1 do 2 molska ekvivalenta hidroksida alkalnog metala.

20) Postupak prema bilo kom zahtevu od 8 do 19, za dobijanje smeša oligosaharida koje su opisane u bilo kom zahtevu od 1 do 5, i koje imaju povećanu selektivnost prema faktoru Xa smeše oligosaharida,, naznačen time, što odstranjuje frakcije disaharida i tetrasaharida hromatografijom, naročito na kolonama sa gelom tipa agaroznog poliakrilamida.

21) Postupak prema bilo kom zahtevu od 8 do20 za dobijanje smeša oligosaharida koje su opisane u bilo kom zahtevu od 1 do 7, naznačen time, što kao početni proizvod koristi Heparin male molekulske mase ili heparin vrlo male molekulske mase (1500 do 3000 daltona), koji ima anti Xa aktivnost između 100 i 140 IU/mg umesto Heparina vrlo male molekulske mase kako je definisan u zahtevu 8.

22) Postupak prema bilo kom zahtevu od 8 do20 za dobijanje smeša oligosaharida koje su opisane u bilo kom zahtevu od 1 do 7, naznačen time, što kao početni proizvod koristi heparin vrlo male molekulske mase (1500 do 3400 daltona), koji ima anti Xa aktivnost između 100 i 140 IU/mg umesto Heparina vrlo male molekulske mase kako je definisan u zahtevu 8.

23) Postupak dobijanja prema zahtevu 21 , naznačen time, što se za Heparin male molekulske mase uzima Enoxaparin, Fraxiparin, Fragmin, Innohep (ili Logiparin), Normiflo, Embollex (ili Sandoparin), Fluxum (ili Minidalton), Clivarin ili Hibor

24) Smeša oligosaharida kako je definisana bilo u kom zahtevu od 1 do 7 koja se može dobiti postupkom definisanim bilo u kom zahtevu od 7 do 23.

25) Smeša oligosaharida prema bilo kom zahtevu od 1 do 7, kao lek.

26) U svojstvu leka sa antitrombotskom aktivnošću smeše oligosaharida prema bilo kom zahtevu od 1 do 7.

27) Lekovi iz zahteva 25 ili 26 za lečenje ili prevenciju venskih i arterijskih tromboza, tromboze dubinskih vena, plućne embolije, nestabilne angine, infarkta miokarda, kardijalne ishemije, okluzivnih oboljenja perifernih arterija, atrijalne fibroze, proliferacije ćelija glatkih mišića, ateroskleroze i arterioskleoze, kancera modulisanjem angiogeneze i faktora rasta, kao i poremećaja u dijabetesu, kao što su dijabetične retinopatije i nefropatije

28) Farmaceutski preparat koji sadrži bar jedan lek kako je definisano u zahtevu 25 i jedan ili više farmaceutski inertnih vezivnih sredstava ili nosača ili aditiva.

29) Farmaceutski preparat prema zahtevu 28 , naznačen time, što se nalazi u rastvorima koji se mogu injecirati subkutano ili intravenozno.

30) Farmaceutski preparat prema zahtevu 28 , naznačen time, što se nalazi u formulaciji za inhaliranje, namenjenoj pulmonarnom davanju.

31) Farmaceutski preparat prema zahtevu 28 , naznačen time, što se nalaze u formulaciji namenjenoj oralnom davanju.

32) Metod za određivanje anti Xa aktivnosti smeša oligosaharida prema bilo kom zahtevu od 1 do 7, naznačen time, što se koristi amidolitički metod na hromogenom supstratu u kome je pufer za rekonstituciju Polietilen Glikol 6000 (PEG 6000).