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KR20060059974A - 헤파린 유도된 올리고사카라이드 혼합물, 이의 제조 방법및 당해 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

헤파린 유도된 올리고사카라이드 혼합물, 이의 제조 방법및 당해 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물 Download PDF

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KR20060059974A
KR20060059974A KR1020067001609A KR20067001609A KR20060059974A KR 20060059974 A KR20060059974 A KR 20060059974A KR 1020067001609 A KR1020067001609 A KR 1020067001609A KR 20067001609 A KR20067001609 A KR 20067001609A KR 20060059974 A KR20060059974 A KR 20060059974A
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아방티 파르마 소시에테 아노님
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Abstract

본 발명은 항-Xa(aXa) 활성이 크고 항-IIa(aIIa) 활성은 없음을 특징으로 하고, 평균 분자량이 1800 내지 2400달톤인, 헤파린으로부터 유도된 올리고사카라이드 혼합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이의 제조 방법 및 이들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
항-Xa, 항-IIa, 헤파린, 다당류, 올리고사카라이드

Description

헤파린 유도된 올리고사카라이드 혼합물, 이의 제조 방법 및 당해 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물{Heparin-derived oligosaccharide mixtures, preparation thereof and pharmaceutical compositions containing said mixtures}
본 발명은 항-Xa(aXa) 활성이 크고 항-IIa(aIIa) 활성은 없음을 특징으로 하는, 평균 분자량이 1800 내지 2400달톤인, 헤파린으로부터 유도된 올리고사카라이드 화합물, 이의 제조 방법 및 이들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
헤파린은 특히 이의 항응고 및 항혈전 특성을 위해 사용되는, 동물 기원의 황산화된 무코 다당류의 혼합물이다.
그러나, 헤파린은 이의 사용 조건을 제한하는 단점이 있다. 특히, 이의 실질적인 항응고 활성(aIIa)은 출혈을 유발할 수 있다[참조: Seminars, Thrombosis and Hemostasis, vol 5 sup. 3 (1999)].
통상 시판중인 특히 헤파린 에스테르의 염기성 해중합에 의해 수득되는 저분자량의 헤파린(예: 에녹사파린)은 또한 실질적인 aIIa 활성을 나타낸다.
보다 최근에, 매우 저분자량의 헤파린이 선행 기술 분야에 기술되었다. 예를 들면, 미국 특허 제6,384,021호에서, 생성물은 100 내지 120IU/㎎의 항-Xa 활성 및 2 내지 8IU/㎎의 항-IIa 활성을 보이고 있다. 국제 공개공보 제WO 02/08295호 및 제WO 2004/033503호에서, 생성물은 5IU/㎎ 미만의 항-IIa 활성에 대해 특히 100 내지 190IU/㎎의 항-Xa 활성을 갖는다. 그러나, 이들 매우 저분자량의 헤파린중 어떠한 것도 190IU/㎎ 이상의 항-Xa 활성을 효과적으로 갖지 못하는 동시에, 항-IIa 활성도 갖지 못하거나, 거의 갖지 못한다(IU = 국제 단위).
표현 "거의 항-IIa 활성이 없음"(환언하면, 거의 항-IIa 활성을 나타내지 않음)은 0.2IU/㎎ 미만의 활성을 의미한다.
본 발명의 한 목적은 활성화 인자 X(인자 Xa)에 대해 매우 선택적인 활성을 갖는 동시에, 전혀 또는 거의 항-IIa 활성이 없음을 나타내는 올리고사카라이드 혼합물이다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 헤파린의 구성성분 다당류의 일반적인 구조를 가지며, 하기의 특성을 갖는 올리고사카라이드 혼합물이다:
- 이들은 평균 분자량이 1800 내지 2400달톤이고, 항-Xa 활성은 190 내지 450IU/㎎이며, 항-IIa 활성은 없거나 거의 없고,
- 혼합물의 구성성분 올리고사카라이드는 2 내지 16개의 당 단위를 함유하며, 이들의 말단중 하나에 4,5-불포화 우론산 2-O-설페이트를 가지고, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염의 형태인 하기 화학식의 ΔIIa-IIs-Is의 육당류를 함유한다:
Figure 112006005260610-PCT00001
본 발명에 기술된 올리고사카라이드 혼합물에 함유된 육당류 ΔIIa-IIs-Is는 ATIII에 대해 높은 친화성을 갖는 서열이고, 740IU/㎎ 이상의 aXa 활성을 특징으로 한다.
바람직한 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 염이다.
평균 분자량은 일련의 두 칼럼, 예를 들면, 상표명 TSK G3000 XL 및 TSK G2000 XL하에 시판중인 것을 사용하는 고압 액체 크로마토크래피에 의해 측정한다. 검출은 굴절계에 의해 수행한다. 사용되는 용출제는 질산리튬이고, 유량은 0.6㎖/분이다. 시스템은 아가로즈-폴리아크릴아미드 겔(IBF) 상의 크로마토그래피에 의한 에녹사파린의 분별화에 의해 제조되는 표준물로 보정한다. 이 제조는 문헌[참조: Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) 또는 D.A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78)]에 기술된 기술에 따라 수행한다. 결과는 GPC6 소프트웨어(Perkin Elmer)를 사용하여 계산한다.
항-Xa 활성은 문헌[참조: Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977)]에 기술된 원리에 따라 색원성 기질상의 가아미도 분해법을 통해 측정한다. 검정 은 시행중인 유럽 약전의 저분자량 헤파린에 대한 모노그래프에 기술된 방법에 따라 수행하되, 단 재구성 완충액의 경우: 트리스-NaCl 완충액, pH 7.4중 알부민은 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG 6000)으로 대체한다. 항 Xa 활성은 140 내지 180IU/㎎(무수 중량)으로 측정되는 표준 매우 저분자량의 헤파린(VLMWH)에 대해 측정한다.
표준 VLMWH의 활성은 국제적인 저분자량 헤파린 표준에 대해 측정한다. 이 표준 VLMWH는 국제 공개공보 제WO 02/08 295호 및 특히, 제WO 2004/033503호의 교시에 따라 제조한다. 표준 VLMWH의 활성은 국제적인 저분자량 헤파린 표준에 대해 측정한다.
항-IIa 활성은 시행중인 유럽 약전의 저분자량 헤파린에 대한 모노그래프에 기술된 방법에 따라 색원성 기질상의 가아미도 분해법을 통해 측정한다. aIIa 활성은 측정된 활성이 2.1IU/㎎인 표준 매우 저분자량의 헤파린(VLMWH)에 대해 측정한다. 표준 VLMWH의 활성은 국제적인 저분자량 헤파린 표준에 대해 측정한다.
한 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 올리고사카라이드 혼합물은 20 내지 100%의 육당류 분획을 함유한다. 특히, 이 혼합물은 30 내지 60%의 육당류 분획을 함유한다.
더욱이, 본 발명에 따르는 혼합물은 올리고사카라이드 혼합물의 육당류 분획중 20 내지 70%의 육당류 ΔIIa-IIs-Is를 함유한다. 특히, 이 분획 ΔIIa-IIs-Is는 육당류 분획에 25 내지 50%의 비로 존재한다.
육당류 분획의 %는 TSK G3000 XL 및 TSK G2000 XL 칼럼 상의 고압 액체 크로 마토크래피에 의해 또는 육당류 분획의 예비 분리에 의해 분석적으로 측정할 수 있다.
이 경우에, 혼합물은 폴리아크릴아미드 아가로즈 형태의 겔로 충전된 칼럼 상에서 크로마토그래피한다. 혼합물은 탄산수소나트륨 용액으로 용출시킨다. 바람직하게는, 탄산수소나트륨 용액은 0.1 내지 1mol/ℓ의 용액이다. 보다 더 바람직하게는, 분리는 1mol/ℓ의 농도에서 수행한다. 검출은 UV 분광 광도법(254㎚)에 의해 수행한다. 분별화 후에, 탄산수소나트륨중 용액의 육당류 분획은 빙초산으로 중화시킨다. 그 다음에, 용액은 감압하에 농축시켜 30중량% 보다 큰 아세트산나트륨 농도를 수득한다. 육당류 분획은 3 내지 5 용적의 메탄올을 부가하여 침전시킨다. 육당류 분획은 3번 소결 펀넬을 통해 여과하여 회수한다. 수득된 육당류류 혼합물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 육당류 ΔIIa-IIs-Is의 이의 함량을 측정할 수 있다. 육당류 ΔIIa-IIs-Is는 당해 분야의 숙련가에 의해 사용되는 기술[참조: M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood and U. Lindahl, F.E.B.S letters, vol 656(1) (1976)]에 따라 예비 HPLC에 의해 또는 항트롬빈 III 세파로즈 칼럼 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 혼합물은 평균 분자량이 1900 내지 2200달톤이고, 특히 1950 내지 2150달톤이다.
한 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 올리고사카라이드 혼합물은 항-Xa 활성이 190 내지 410IU/㎎이며, 항-IIa 활성은 없거나 거의 없음을 특징으로 한다. 가장 특히, 항-Xa 활성은 200 내지 300IU이다.
따라서, 본 발명의 목적은 가장 특히, 하기의 특성을 갖는 혼합물이다:
- 1950 내지 2150달톤의 평균 분자량,
- 190 내지 410IU/㎎의 항-Xa 활성 및 없거나 거의 없는 항-IIa 활성,
- 25 내지 55%의 ΔIIa-IIs-Is 분획을 함유하는, 30 내지 60%의 육당류 분획을 함유함.
본 발명에 따르는 올리고사카라이드 혼합물의 활성은 하기에 기술되는 매우 특별한 공정에 의해 수득된다. 다당류 혼합물의 물리화학적 특성 및 이로부터 유도되는 활성이 제조 공정에 관련이 있음은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다[참조: J. Med. Chem. 33(6) 1639-2093 (1990)].
본 발명에 따르는 올리고사카라이드 혼합물은 유기 매질 속에서 매우 저분자량인 헤파린(VLMWH)의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 해중합에 의해 제조하며, 이(VLMWH) 자체는 국제 공개공보 제WO 02/08295호 및 제WO 2004/033503호의 교시에 따라 제조한다. 일반적으로, 특히 강산의 존재하에, 바람직하게는 디클로로메탄중, 3% 미만의 물 %의 존재하에 에스테르화 헤파린의 해중합에 의해 자체가 특히 수득되는 매우 저분자량인 헤파린을 다시 해중합시키는 것이 문제이다.
본 발명에서 출발 물질로서 사용되는 VLMWH는 특히 국제 공개공보 제WO 02/08295호 및 제WO 2004/033503호에 따라 제조한다.
특히 출발 물질로서 사용되는 VLMWH는 aXa 활성이 140IU/㎎보다 크고, aIIa 활성은 5IU/㎎ 미만이며, 평균 분자량은 2000 내지 3000달톤이다. aXa 활성은 측정된 활성이 158IU/㎎인 표준 VLMWH에 대해 측정한다. 표준 VLMWH의 활성은 국제 적인 저분자량 헤파린 표준에 대해 측정한다.
상기 기술된 바와 같은 공정에 따라 수득되는 출발 VLMWH는 pKa 값이 바람직하게는 20보다 큰 유기 강염기를 사용하여 다시-해중합시킨다[정의된 바람직한 포스파젠-계 관련 특성 참조: Schwesinger et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987) 또는 R. Schwesinger et al, Angew. Chem. 105, 1420 (1993)]. 이어서, 해중합된 VLMWH의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염은 나트륨 염으로 전환시키고, 잔류하는 에스테르는 비누화시키며, 수득된 생성물은 임의로 정제한다. 하기의 반응식은 본 발명을 나타낸 것이다:
Figure 112006005260610-PCT00002
따라서, 본 발명의 목적은 또한 상기 정의한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물의 제조 방법에 관한 것으로, 이때 aXa 활성이 140IU/㎎보다 크고, aIIa 활성은 5IU/㎎ 미만이며, 평균 분자량은 2000 내지 3000달톤인 매우 저분자량의 헤파린을 하기의 화학 반응에 적용시킨다:
a) 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의한 트랜스염화(transsalification)로 벤제토늄 헤파리네이트를 수득하고,
b) 벤질 클로라이드의 작용에 의해 수득되는 벤제토늄 헤파리네이트의 에스테르화 및 알콜성 아세트산나트륨 용액에 의한 처리로 매우 저분자량인 헤파린의 벤질 에스테르의 나트륨 염을 수득하며,
c) 수득된 벤질 에스테르의 트랜스염화 및 바람직하게는, 벤제토늄, 세틸피리디늄 또는 세틸트림베틸암모늄 염과 같은 4급 암모늄 염의 생성,
d) pKa 값이 바람직하게는 20보다 큰 유기 강염기에 의한 해중합으로 해중합된 매우 저분자량의 헤파린을 수득하며,
e) 해중합된 매우 저분자량 헤파린의 4급 암모늄 염을 나트륨 염으로 전환시키고,
f) 잔류하는 에스테르의 비누화 및 임의로 정제시킨다.
본 발명에서, 해중합 단계 도중[단계 d)] 포스파젠 염기의 높은 선택도는 가장 특히, 예상밖으로 ATIII에 대한 친화성과 함께 서열에서 올리고사카라이드 혼합물을 풍부하게 하는데 사용된다. 바람직하게는, 강한 염기/에스테르 몰 비가 0.2 내지 5이며, 보다 특히는 0.6 내지 2이다.
ATIII에 대한 친화성과 함께 서열의 최적의 선택도 및 최대 보존을 위하여, VLMWH의 벤질 에스테르, 벤제토늄 염에 대해 1몰 당량의 포스파젠 염기를 사용하여 작업하는 경우에, 0.3% 미만의 물 함량에서 작업하는 것이 바람직하다.
포스파젠 그룹의 염기는 바람직하게는 하기 화학식의 화합물이다:
Figure 112006005260610-PCT00003
상기 식에서,
라디칼 R1 내지 R7은 동일하거나 상이하며, 탄소수가 1 내지 6인 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 형의 알킬 라디칼을 나타내고,
R3 및 R4의 경우, 경우에 따라, 이들을 포함하는 -N-P-N- 그룹과 함께 6-원 헤테로사이클을 형성한다.
특히, 본 발명의 한 목적은 상기 정의한 바와 같은 방법이며, 이때 해중합 단계 d)에 사용되는 염기는 2-3급 부틸아미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린(공식 명칭: 1,3,2-디아자포스포린-2-아민, 2-[(1,1-디메틸에틸)이미노]-N,N-디에틸-1,2,2,2,3,5,6-옥타하이드로-1,3-디메틸)이다.
트랜스염화 단계 a)의 반응은 바람직하게는 15 내지 25℃ 범위의 온도에서 나트륨 VLMWH 상의 과량의 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의해 수행한다. 유용하게는, 염/나트륨 헤파린 몰 비는 2.5 내지 3.5이다.
에스테르화 단계 b)는 바람직하게는 25 내지 45℃ 및 바람직하게는, 30 내지 40℃의 온도에서 염소화된 유기 용매(예: 클로로포름 또는 디클로로메탄) 속에서 수행한다. 그 다음에, 나트륨 염의 형태인 에스테르는 알콜(예: 메탄올)중 아세트산나트륨 10중량%를 사용하여 침전시켜 회수한다. 반응 매질 용적당 알콜 1 내지 1.2용적이 일반적으로 사용된다. 벤질 클로라이드의 양 및 반응 시간은 40 내지 100%, 바람직하게는 70 내지 90%의 에스테르화도가 수득되도록 채택된다. 헤파린의 벤제토늄 염 1 중량부당 벤질 클로라이드 0.5 내지 1.5 중량부가 바람직하게는 사용된다. 유사하게는, 반응 시간은 바람직하게는 10 내지 35시간이다.
결과적으로, 본 발명에 따르는 공정은 40 내지 100%, 바람직하게는 70 내지 90%인 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 에스테르화도를 사용한다.
해중합된 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환은 일반적으로 반응 매질을 15 내지 25℃의 온도에서 알콜성 아세트산나트륨 용액으로, 바람직하게는 메탄올중 아세트산나트륨 10% 용액(중량/용적)으로 처리하여 수행한다.
부가되는 아세테이트의 중량 당량은 바람직하게는 해중합 반응에 계속해서 사용되는 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 질량보다 3배 크다. 수득되는 VLMWH의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염은 바람직하게는 벤제토늄, 세틸피리디늄 또는 세틸트리메틸암모늄 염이다.
트랜스염화 단계 c)는 수성 매질에서 10 내지 25℃의 온도에서 4급 염화암모늄을 사용하여, 바람직하게는 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 또는 세틸트리메틸암모늄 클로라이드를 사용하여 수행한다. 유용하게는, 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 염화암모늄/나트륨 염의 몰 비는 2.5 내지 3.5이다.
비누화는 일반적으로 수성 매질에서 0 내지 20℃, 바람직하게는 0 내지 10℃의 온도에서 알칼리 금속 하이드록사이드(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화리튬)를 사용하여 수행한다. 1 내지 5몰 당량의 알칼리 금속 하이드록사이드가 일반적으로 사용된다. 비누화는 바람직하게는 1 내지 2몰 당량의 알칼리 금속 하이드록사이드의 존재하에 수행한다.
최종 생성물은 임의로 해중합된 헤파린을 정제시키는 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다(예: EP 제0 037 319 B1호). 바람직하게는, 정제는 수성 매질에서 10 내지 50℃의 온도에서 과산화수소를 사용하여 수행한다. 이 작업은 바람직하게는 20 내지 40℃에서 수행한다.
나트륨 염 형태인 본 발명에 따르는 혼합물은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염으로 전환시킬 수 있다. 한 염을 다른 염으로 전환시키는 것은 임의로 프랑스 특허원 제73/13580호에 기술된 방법을 사용하여 수행한다.
본 발명은 특히, 고농축의 육당류 ΔIIa-IIs-Is를 허용한다. 저분자량 헤파린이 이를 생성하는 공정에 의해 다시 해중합되는 경우에, 수득된 생성물의 항-Xa 활성은 0이 될 때 까지 상당히 감소됨이 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 에녹사파린, 프락시파린, 프라그민, 이노헵(또는 로기파린), 노르미플로, 엠볼렉스(또는 산도파린), 플룩섬(또는 미니달톤), 클리바린 및 히보르를 수득하는 공정이 사용되는 경우에, 이 현상은 이들 LMWH가 이들의 본래 공정에 의해 다시 해중합되는 지를 관찰할 수 있다. 이는 ATIII 부위의 보존에 대한 이들 공정의 낮 은 선택도의 결과이다.
본 발명에서, 포스파젠 해중합 공정으로부터 유도되는 VLMWH가 출발 물질로서 사용된다면, 정확히 역 현상이 일어난다. 올리고사카라이드 혼합물의 aXa 활성은 증가되고, 심지어 VLMWH를 제조하는데 사용되는 헤파린의 것을 초과한다. 이는 ATIII에 대한 친화성과 함께 서열의 보존을 기본으로 하는 포스파젠의 주목할 만한 선택도의 가능한 결과이다.
공정의 이러한 특성은 또한 수득되는 올리고사카라이드 혼합물의 평균 분자량을 통해 관찰된다. 예로서, 평균 분자량이 2400달톤인 VLMWH가 해중합되는 경우에, 평균 분자량이 2000Da인 올리고사카라이드 혼합물이 수득된다. ATIII에 대한 친화성을 갖는 서열(육당류 및 팔당류)이 포스파젠 염기의 작용으로부터 보존되어, 다른 서열의 파괴 및 제거를 유도하고, 결과적으로 비-해중합성 그룹의 평균 분자량에 근접하는 평균 분자량은 육당류 ΔIIa-IIs-Is(1834g/mol)인 것으로 밝혀졌다. 포스파젠 염기에 의한 헤파린 해중합 단계에서, 평균 분자량은 약 15000 내지 약 2400Da으로 변한다.
대안적 방법으로서, 인자 Xa에 대한 활성 및 선택도를 증가시키기 위한 본 발명에 따르는 공정은 또한 일반적으로 저분자량 헤파린에 적용가능하다. 예로서, 예를 들면, 에녹사파린, 프락시파린, 프라그민, 이노헵(또는 로기파린), 노르미플로, 엠볼렉스(또는 산도파린), 플룩섬(또는 미니달톤), 클리바린 및 히보르를 언급할 수 있다. 이들은 또한 항-Xa 활성이 140IU/㎎ 미만(특히, 100 내지 400IU/㎎)인, 미국 특허 제6,384,021호(2000 내지 4000Da) 또는 국제 공개공보 제WO 02/08295호(1500 내지 3000Da)에 기술된 바와 같은 특정한 매우 저분자량의 헤파린일 수 있다.
이러한 공정의 특성은 올리고사카라이드 혼합물의 평균 분자량에 대한 예상밖의 항-Xa 활성(190IU/㎎ < aXa < 450IU/㎎; 1800Da < MW < 2400Da)의 생성에 의해 영향을 받는다.
본 발명의 한 특별한 양태에 따르면, 올리고사카라이드 혼합물의 인자 Xa에 대한 선택도는 이당류 및 사당류 분획(ATIII에 특별히 결합되지 않은 분획)을 제거함으로써 더욱 증가시킬 수 있다. 이 경우에, 혼합물은 폴리아크릴아미드 아가로즈 형태의 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔로 충전된 칼럼상에서 크로마토그래피한다. 혼합물은 탄산수소나트륨 용액으로 용출시킨다. 바람직하게는, 탄산수소나트륨 용액은 0.1 내지 1mol/ℓ의 용액이다. 보다 더 바람직하게는, 분리는 1mol/ℓ의 농도에서 수행한다. 검출은 UV 분광 광도법(254 ㎚)에 의해 수행한다. 이당류 및 사당류 분획의 제거 후에, 탄산수소나트륨중 용액의 올리고사카라이드 혼합물은 빙초산으로 중화시킨다. 그 다음에, 용액은 감압하에 농축시켜 20중량% 보다 큰 아세트산나트륨 농도를 수득한다. 올리고사카라이드 혼합물은 3 내지 5 용적의 메탄올을 부가하여 침전시킨다. 높은 친화성의 올리고사카라이드 혼합물은 여과에 의해 회수한다. 경우에 따라, 이는 적절한 칼럼상에서 탈염화하여 정제할 수 있다. 실시예 6은 이러한 대안적 방법을 나타낸 것이고, 항-Xa 활성이 400IU/㎎보다 큰 매우 저분자량의 헤파린이 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 또한 올리고사카라이드 혼합물의 인자 Xa에 대한 선택도가 증가된 올리고사카라이드 혼합물을 제조하기 위한 상기 정의한 바와 같은 방법에 있으며, 이때 이당류 및 사당류 분획은 또한 특히, 폴리아크릴아미드 아가로즈 형태의 겔로 충전된 칼럼상에서 크로마토그래피하여 제거한다.
본 발명에 따르는 혼합물은 의약품으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 올리고사카라이드 혼합물은 항혈전제로서 사용될 수 있다. 특히, 이들은 정맥 및 동맥 혈전증, 심정맥 혈전증, 폐 색전증, 불안정한 협심증, 심근경색, 심장 허혈증, 말초 동맥이 폐색성 질환 및 심방 세동의 치료 또는 예방에 유용하다. 이들은 또한 평활근 세포 증식, 아테롬성 경화증 및 세동맥 경화증의 예방 및 치료, 혈관 형성 및 성장 인자의 조절에 의한 암의 치료 및 예방과, 당뇨성 질환(예: 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신장병증)의 치료 및 예방에 유용하다.
본 발명은 또한 활성 기본으로서, 임의로 하나 이상의 불활성 부형제와 혼합된, 화학식 I의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은, 예를 들면, 피하 또는 정맥내 주사용 용액이다. 본 발명에 따르는 다른 약제학적 조성물이 폐 투여(흡입) 또는 경구 투여에 또한 사용된다.
용량은 환자의 연령, 체중 및 건강 상태의 함수로서 변할 수 있다. 성인의 경우, 일반적으로 근육내 또는 피하 투여인 경우에, 하루에 20 내지 100㎎이다.
하기의 실시예는 이를 제한함이 없이 본 발명을 기술하는 것이다.
실시예
제조 1: aXa 활성이 158.8IU/㎎인 출발 물질인 매우 저분자량의 헤파린의 제조
실시예 1에서 출발 물질로서 사용되는 매우 저분자량의 헤파린(VLMWH)은 상기 정의한 바와 같은 단계 a) 내지 f)를 수행함으로써 나트륨 헤파린으로부터 국제 공개공보 제WO 2004/033503호에 따라 제조하며, 해중합 단계는 0.6% 미만의 물 %의 존재하에 2-3급 부틸아미노-2-디에틸이미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린의 존재하에 수행한다.
수득된 매우 저분자량인 헤파린의 특성
이렇게 수득된 해중합 헤파린의 특성은 다음과 같다:
평균 분자량: 2400달톤
항-Xa 활성: 158.8IU/㎎
항-IIa 활성: 3.1IU/㎎
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 51
제조 2: aXa 활성이 158IU/㎎인 출발 물질인 매우 저분자량의 헤파린의 제조
실시예 2, 3, 4 및 5에 대한 출발 물질로서 사용되는 매우 저분자량의 헤파린(VLMWH)은 상기 정의한 바와 같은 단계 a) 내지 f)를 수행함으로써 나트륨 헤파린으로부터 국제 공개공보 제WO 2004/033503호에 따라 제조하며, 해중합 단계는 0.6% 미만의 물 %의 존재하에 2-3급 부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린의 존재하에 수행한다.
수득된 매우 저분자량인 헤파린의 특성
이렇게 수득된 해중합 헤파린의 특성은 다음과 같다:
평균 분자량: 2450달톤
항-Xa 활성: 158IU/㎎
항-IIa 활성: 2.1IU/㎎
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 75
제조 3: VLMWH, 벤제토늄 염
VLMWH의 벤제토늄 염으로의 트랜스염화[공정 단계 a)에 상응함]:
제조 1에 따라 수득된 VLMWH 나트륨 염 12.53g(20.7mmol)을 500㎖ 원뿔형 플라스크 A에 넣고, 물 85㎖에 용해시킨다(황색 용액).
벤제토늄 클로라이드 31.62g(70.5mmol)를 물 250㎖와 함께 100㎖ 원뿔형 플라스크 B에 넣는다(무색 용액).
B의 내용물을 A로 붓고, 혼합물을 실온에서 약 1시간 동안 교반한다. 생성된 혼합물을 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반하고, 대략 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(250㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 물 200㎖로 3회 세척한다. 습한 베이지색 고체를 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)의 오븐에서 약 18시간 동안 80℃에서 건조시킨다. VLMWH 벤제토늄 염 35.56g이 수득된다.
수득된 수율은 89%이다.
제조 4
VLMWH의 벤제토늄 염으로의 트랜스염화[공정 단계 a)에 상응함]:
제조 2에 따라 수득된 VLMWH 나트륨 염 17.93g(30.2mmol)을 1ℓ 원뿔형 플라스크 A에 넣고, 물 120㎖에 용해시킨다(황색 용액).
벤제토늄 클로라이드 45g(0.1mol)를 물 360㎖와 함께 500㎖ 원뿔형 플라스크 B에 넣는다(무색 용액).
B의 내용물을 A로 붓고, 혼합물을 실온에서 약 1시간 동안 교반한다. 생성된 혼합물을 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반하고, 대략 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(500㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(500㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 물 200㎖로 3회 세척한다. 습한 베이지색 고체를 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)의 오븐에서 약 48시간 동안 80℃에서 건조시킨다. VLMWH 벤제토늄 염 49.5g이 수득된다.
수득된 수율은 87%이다.
실시예 1
77% 에스테르화 단계 및 무수 매질중 포스파젠으로부터 유도된 염기에 의한 해중합 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 공정에 의해 수득된 매우 저분자량인 헤파린(VLMWH)
● VLMWH의 에스테르화[공정 단계 b)]:
제조 3에 따라 수득된 VLMWH 벤제토늄 염 35.39g(18.3mmol)(함수량 0.20%)을 무수 디클로로메탄 183.3g에 용해시키고, 500㎖ 3구 플라스크에 넣는다. 벤질 클로라이드 29.5㎖(25.7mmol)를 30℃의 온도에서 가한다. 에스테르화도는 30℃에서 약 23시간의 반응 후에 77%이다. 실온(22 ±3℃)으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 메탄올중 아세트산나트륨의 10% 용액 490㎖로 붓는다. 혼합물을 약 1시간 동안 교반한 다음, 대략 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(250㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 30분 동안 교반한 다음, 약 45분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(250㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(350㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 5분 동안 교반한 다음, 현탁액을 여과한다. 케이크를 메탄올 50㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃에서 건조시킨다. 에스테르화도가 77%인 조 VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 34.48g이 수득된다.
● VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염의 정제[공정 단계 b)]:
조 VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 34.48g을 10% NaCl 수용액 350㎖에 용해 시킨다. 용액을 메탄올 1.57ℓ로 붓는다. 현탁액을 약 40분 동안 교반한 다음, 약 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(1.5ℓ)로 대체한다. 이 혼합물을 약 1시간 동안 교반한 다음, 약 1.5시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(1.2ℓ)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 50㎖로 3회 세척한다. 습한 백색 고체를 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 6.07g이 수득된다.
에스테르화 수율은 50%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염의 벤제토늄 염으로의 트랜스염화[공정 단계 c)]:
VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 6g(9.14mmol)을 250㎖ 원뿔형 플라스크 A중 물 40㎖에 용해시킨다.
나란히, 벤제토늄 클로라이드 13.93g(31mmol)을 250㎖ 원뿔형 플라스크 B중 물 110㎖에 용해시킨다.
B의 내용물을 A로 붓는다. 현탁액을 실온(22 ±3℃)에서 약 1시간 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(140㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(140㎖)로 대체한 다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일 용적의 물(140㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 물 50㎖로 3회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 80℃에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염 17.43g이 수득된다.
수율은 100%이다.
● 무수 매질중 VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염의 해중합: 감지할 수 없는 함수량 < 0.01%[공정 단계 d)]:
제조 2에 따라 수득된 VLMWH 17.43g(9.14mmol)을 무수 디클로로메탄 122㎖와 함께 250㎖ 3구 플라스크에 넣는다. 4 Å 분자체 17.4g을 가한다. 혼합물을 아르곤 대기하에 실온(22 ±3℃)에서 약 18시간 동안 교반한다.
체는 용액을 250㎖ 3구 플라스크로 옮김으로써 혼합물로부터 분리한다. 2-3급 부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아조포스포린 2.64㎖(9.14mmol)를 가하고, 혼합물을 아르곤 대기하에 22 ±3℃에서 약 24시간 동안 교반한다.
● 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환[공정 단계 e)]:
나란히, 메탄올성 10% 아세트산나트륨 용액 730㎖를 2ℓ원뿔형 플라스크에서 제조한다. 하이플로 수퍼셀 셀라이트(Hyflo supercel Celite) 8.71g을 용액에 가 한다. 반응 혼합물을 메탄올성 용액으로 부으면서, 온도를 약 4℃에서 유지한다. 현탁액을 이 온도에서 약 15분 동안 교반한다. 혼합물을 실온에서 약 45분 동안 침강되도록 방치한 다음, 상등액을 폐기시키고, 동일한 용적의 메탄올(450㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 약 45분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 다시 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(420㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 3번 소결 펀넬을 통해 여과한다. 케이크를 메탄올 70㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 셀라이트(8.71g)중 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 4.35g이 수득된다.
수율은 72.5%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 비누화[공정 단계 f1)]:
셀라이트중 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 4.35g을 물 46㎖에 용해시킨 다음, 3번 소결 펀넬을 통해 여과한다. 셀라이트를 물 30㎖의 두 분획으로 세정한다. 여액을 500㎖ 원뿔형 플라스크로 가한다. 35% 수산화나트륨 용액 823㎕(9.94mmol)를 4℃의 범위인 온도에 도입시킨다. 이 혼합물을 이 온도에서 약 3시간 동안 교반한다. 매질은 1N HCl을 가한 다음, NaCl 11.5g 및 메탄올 80㎖를 가하여 중화시킨다. 대략 15분 동안 교반한 후에, 메탄올 210㎖를 가한다. 현탁액을 약 1시간 동안 교반한 다음, 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일한 용적의 메탄올(230㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반 한 다음, 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(210㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 9㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 2.95g이 수득된다.
수율은 73.7%이다.
f) 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 정제[공정 단계 f2)]:
조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 1.5g을 물 16㎖와 함께 50㎖ 3구 플라스크로 가한다. 용액을 약 10분 동안 40℃에서 유지한다. pH는 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 약 9.7로 만든다. 용액은 0.45㎛ 막을 통해 여과한 다음, 30% 과산화수소 수용액을 가한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하면서, 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 9.7 ±0.1로 일정하게 유지한다. 그 다음에, 반응 혼합물을 0.1N HCl로 중화시킨 다음, NaCl 2g을 가한다. 약 10분 동안 교반한 후에, 용액을 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 메탄올 14㎖를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 용액을 실온에서 대략 15분 동안 교반한다. 그 다음에, 메탄올 36㎖를 가하고, 현탁액을 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 멈추고, 혼합물은 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 그 다음에, 상등액을 용해시켜 폐기한다(40㎖). 메탄올 40㎖를 침강된 침전물에 가하고, 이 혼합물을 약 10분 동안 교반한다. 침전물은 대략 30분 동안 다시 침강되도록 방치한다. 상등액을 용해시켜 폐기한다(45㎖ ). 메탄올 45㎖를 가하고, 현탁액중 침전물은 여과한다. 수득된 백색 케이크는 메탄올 3㎖ 두 분획으로 세척한다. 습한 고체는 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 50℃ 범위의 온도에서 건조시킨다. 약 18시간 동안 건조시킨 후에, 순수한 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 1.303g이 수득된다.
수율은 86.8%이다.
g) 이렇게 수득된 해중합된 VLMWH의 특성
평균 분자량: 1950달톤
복잡분산성 지수: 1.1
항-Xa 활성: 283 U/㎎
aIIa 활성: 감지할 수 없음(< 0.2 U/㎎)
실시예 2
49% 에스테르화 단계 및 무수 매질중 포스파젠으로부터 유도된 염기에 의한 해중합 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 공정에 의해 수득된 매우 저분자량인 헤파린(VLMWH)
● VLMWH의 에스테르화[공정 단계 b)]:
제조 4에 따라 수득된 VLMWH 벤제토늄 염 13.29g(7.6mmol)을 무수 디클로로메탄 70.43g에 용해시키고, 100㎖ 3구 플라스크에 넣는다(반응 매질중 함수량은 0.073%임). 벤질 클로라이드 12.3㎖(107mmol)를 30℃의 온도에서 가한다. 에스테르화도는 30℃에서 약 7시간의 반응 후에 49%이다. 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 메탄올중 아세트산나트륨의 12% 용액 160㎖로 붓는다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 대략 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(100㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 1시간 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 다시 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(100㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 40㎖씩으로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃의 오븐에서 건조시킨다. 에스테르화도가 49%인 조 VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 3.90g이 수득된다.
● VLMWH 벤질 에스테르(49% 에스테르화됨) 나트륨 염의 정제[공정 단계 b)]:
조 VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 3.90g을 10% NaCl 수용액 39㎖에 용해시킨다. 용액을 메탄올 176㎖로 붓는다. 현탁액을 약 15분 동안 교반한 다음, 2시간 동안 침강되도록 방치한다. 혼합물을 여과한다. 케이크를 메탄올 175㎖에 다시 현탁시키고, 10분 동안 교반한다. 혼합물을 여과하고, 케이크를 메탄올 10㎖의 두 분획으로 세척한다. 습한 백색 고체를 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃의 오븐에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 2.62g이 수득된다.
에스테르화 단계의 전반적인 수율은 57.3%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르의 벤제토늄 염으로의 트랜스염화[공정 단계 c)]:
VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 2.62g(4.37mmol)을 물 20㎖에 용해시킨다(원뿔형 플라스크 "A"). 나란히, 벤제토늄 클로라이드 5.92g(1.2mmol)을 원뿔형 플라스크 "B"중 물 60㎖에 가한다.
"B"의 내용물을 "A"로 붓는다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(70㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(70㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 다시 약 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 물 50㎖로 3회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 80℃의 오븐에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르 벤제토늄 염 6.85g이 수득된다.
수율은 99%이다. 벤제토늄 염의 함수량은 0.6%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염의 해중합:
VLMWH 6.80g(4.3mmol)을 무수 디클로로메탄 54㎖와 함께 100㎖ 3구 플라스크에 넣는다. 혼합물을 30℃로 만든 다음, 용해가 완결될 때 까지 교반한다. 반응 혼합물의 예상되는 함수량은 약 0.05%이다. 2-3급 부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아조포스포린 1.25㎖(4.3mmol)를 가하고, 혼합물을 불활성 대기하에 30℃에서 24시간 동안 교반한다.
● 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환[공정 단계 e)]:
나란히, 메탄올성 10% 아세트산나트륨 용액 270㎖를 1ℓ원뿔형 플라스크에서 제조한다. 반응 혼합물을 메탄올성 용액으로 부으면서, 온도를 약 4℃에서 유지한다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한다. 이 혼합물을 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일한 용적의 메탄올(165㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 1시간 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 다시 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(170㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 40㎖의 세 분획으로 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃의 오븐에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 2.29g이 수득된다.
수득된 수율은 89%이다.
● 조질의 VLMWH, 나트륨 염의 비누화[공정 단계 f1)]:
조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 2.29g을 물 23㎖에 용해시킨다. 용액은 0.8㎛ 막을 통해 여과한 다음, 100㎖ 3구 플라스크로 가한다. 30% 수산화나트륨 용액 575㎕(5.73mmol)를 3℃의 범위인 온도에서 가한다. 혼합물을 이 온도에서 약 2시간 동안 교반한다. 반응 혼합물의 반은 빙초산을 가한 다음, 고체 아세트산나트륨 367㎎ 및 메탄올 13㎖를 가하여 중화시킨다. 용액을 약 15분 동안 교반한 다 음, 메탄올 65㎖를 가한다. 수득된 현탁액을 약 30분 동안 교반한 다음, 약 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(36㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 다시 약 30분 동안 교반한 다음, 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(16㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 0.22㎛의 막을 통해 여과한다. 케이크를 메탄올 5㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃의 오븐에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 563㎎이 수득된다.
수율은 52.6%이다.
● NaOAc와 함께 침전된 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염)의 정제[공정 단계 f2)]:
조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 560㎎을 물 5.6㎖와 함께 100㎖ 3구 플라스크로 가한다. 갈색 용액을 10분 동안 40℃에서 유지한다. pH는 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 9.7로 만든다. 용액은 0.45㎛ 막을 통해 여과한 다음, 30% 과산화수소 수용액 28㎕를 가한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하면서, 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 9.5 ±0.1로 일정하게 유지한다. 반응 혼합물을 0.1N HCl로 중화시킨 다음, NaCl 620㎎을 가한다. 10분 동안 교반한 후에, 용액을 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 메탄올 4.35㎖를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반한다. 메탄올 11.2㎖를 가한다. 현탁액을 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 멈추고, 혼합물은 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 그 다음에, 상등액을 용해시켜 폐기한다(13.5㎖). 메탄올 13.5㎖를 침강된 침전물에 가하고, 이 혼합물을 15분 동안 교반한다. 침전물은 대략 30분 동안 다시 침강되도록 방치한다. 상등액을 용해시켜 폐기한다(13㎖). 메탄올 13㎖를 가하고, 현탁액중 침전물은 여과한다. 수득된 백색 케이크는 메탄올 5㎖의 두 분획으로 세척한다. 습한 고체는 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 50℃ 범위의 온도에서 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후에, 순수한 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 376㎎이 수득된다. 수득된 수율은 67%이다.
● 이렇게 수득된 해중합 VLMWH의 특성
항-Xa 활성: 191IU/㎎
평균 분자량: 2100Da
실시예 3
73% 에스테르화 단계 및 무수 매질중 포스파젠으로부터 유도된 염기에 의한 해중합 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 공정에 의해 수득된 매우 저분자량인 헤파린(VLMWH)
● VLMWH의 에스테르화[공정 단계 b)]:
제조 4에 따라 수득된 VLMWH 벤제토늄 염 13.7g(7.3mmol)을 무수 디클로로메탄 73.67g에 용해시키고, 100㎖ 3구 플라스크에 넣는다(반응 매질중 함수량은 0.23%임). 벤질 클로라이드 13㎖(113mmol)를 30℃의 온도에서 가한다. 에스테르화도는 30℃에서 약 20시간 동안의 반응 후에 73%이다. 실온으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 메탄올중 아세트산나트륨의 12% 용액 210㎖로 붓는다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 약 1.5시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(140㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 현탁액을 여과한다. 케이크를 메탄올 100㎖의 두 분획으로 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃의 오븐에서 건조시킨다. 에스테르화도가 73%인 조 VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 13.3g이 수득된다.
● VLMWH 벤질 에스테르(73% 에스테르화됨) 나트륨 염의 정제[공정 단계 b)]:
조 VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 13.3g을 10% NaCl 수용액 133㎖에 용해시킨다. 용액을 메탄올 600㎖로 붓는다. 현탁액을 약 15분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(400㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 100㎖로 3회 세척한다. 습한 백색 고체를 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃의 오븐에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 2.33g이 수득된다.
에스테르화 수율은 49.6%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염의 트랜스염화[공정 단계 c)]:
VLMWH 벤질 에스테르 나트륨 염 2.27g(3.53mmol)을 100㎖ 원뿔형 플라스크 "A"중 물 15㎖에 용해시킨다. 나란히, 벤제토늄 클로라이드 5.22g(11.6mmol)을 100㎖ 원뿔형 플라스크 "B"중 물 55㎖에 가한다.
"B"의 내용물을 "A"로 붓는다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(50㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(50㎖)로 대체한다. 혼합물을 다시 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 물 50㎖의 세 분획으로 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 80℃의 오븐에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르 벤제토늄 염 5.67g이 수득된다.
수득된 수율은 98%이다. 수득된 생성물의 함수량은 1%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염의 해중합[공정 단계 d)]:
VLMWH 5.45g(3.3mmol)을 무수 디클로로메탄 40㎖와 함께 100㎖ 3구 플라스크에 넣는다. 혼합물의 예상되는 함수량은 약 0.1%이다. 혼합물을 30℃로 만든다. 2-3급 부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아조포스포린 928㎕(3.3mmol)를 가하고, 혼합물을 아르곤 대기하에 30℃에서 24시간 동안 교반한다.
● 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환[공정 단계 e)]:
나란히, 메탄올성 10% 아세트산나트륨 용액 200㎖를 500㎖ 원뿔형 플라스크에서 제조한다. 반응 혼합물을 메탄올성 용액으로 부으면서, 온도를 약 4℃에서 유지한다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한다. 이 혼합물을 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일한 용적의 메탄올(150㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 30분 동안 교반한 다음, 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 다시 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(150㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 50㎖로 3회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 1.40g이 수득된다.
수득된 수율은 65.8%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 비누화[공정 단계 f1)]:
조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 1.40g(2.18mmol)을 물 14㎖에 용해시킨다. 용액은 100㎖ 3구 환저 플라스크로 가한다. 30% 수산화나트륨 용액 351㎕(3.5mmol)를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 이 혼합물을 이 온도에서 약 2시간 동안 교반한다. 용액은 빙초산을 가하여 중화시킨다. 그 다음에, 고체 아세트산나트륨 7g 및 메탄올 130㎖를 가한다. 현탁액을 30분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(80㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 다시 30분 동안 교반한 다음, 약 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(80㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 0.45㎛의 막을 통해 여과한다. 케이크를 메탄올 10㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 1.15g(수율:89.4%)이 수득된다.
수득된 수율은 89.4%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 정제[공정 단계 f2)]:
조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 373㎎을 물 3.7㎖와 함께 10㎖ 3구 플라스크로 가한다. 용액을 10분 동안 40℃에서 유지한다. pH는 1N 수산화나트륨 용액을 가하여 9.5로 만든다. 용액은 0.45㎛ 막을 통해 여과한 다음, 30% 과산화수소 수용액 18㎕를 가한다. 혼합물을 실온에서 약 2시간 동안 교반하면서, 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 9.5 ±0.1로 일정하게 유지한다. 반응 혼합물을 0.1N HCl로 중화시킨 다음, NaCl 430㎎을 가한다. 약 10분 동안 교반한 후에, 용액을 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 메탄올 3㎖를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반한다. 그 다음에, 메탄올 7.7㎖를 가한다. 현탁액을 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 멈추고, 혼합물은 약 40분 동안 침강되도록 방치한다. 그 다음에, 상등액을 용해시켜 폐기한다(10㎖). 메탄올 10㎖를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 15분 동안 교반한다. 침전물은 대략 30분 동안 다시 침강되도록 방치한다. 상등액을 용해시켜 폐기한다(10㎖). 메탄올 10 ㎖를 가하고, 현탁액중 침전물은 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 수득된 백색 케이크는 메탄올 5㎖의 네 분획으로 세척한다. 습한 고체는 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 50℃ 범위의 온도에서 건조시킨다. 약 18시간 동안 건조시킨 후에, 순수한 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 199㎎이 수득된다. 수득된 수율은 54%이다.
● 이렇게 수득된 해중합 VLMWH의 특성
평균 분자량: 2000달톤
복잡분산성 지수: 1.1
항-Xa 활성: 252IU/㎎
실시예 4
96% 에스테르화 단계 및 BEMP에 의한 해중합 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 공정에 의해 수득된 VLMWH
● VLMWH의 에스테르화[공정 단계 b)]:
제조 4에 따라 수득된 VLMWH 벤제토늄 염 14.45g(7.7mmol)을 무수 디클로로메탄 75.79g에 용해시키고, 250㎖ 3구 플라스크에 넣는다(반응 매질중 함수량은 0.20%임). 벤질 클로라이드 12.4㎖(108mmol)를 30℃의 온도에서 가한다. 에스테르화도는 30℃에서 약 26시간 동안의 반응 후에 96%이다. 실온으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 메탄올중 아세트산나트륨의 12% 용액 180㎖로 붓는다. 혼합물 을 실온에서 약 30분 동안 교반한 다음, 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(150㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 100㎖의 두 분획으로 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃에서 건조시킨다. 에스테르화도가 96%인 조 VLMWH 벤질 에스테르, 나트륨 염 3.67g이 수득된다.
● VLMWH 벤질 에스테르(96% 에스테르화됨) 나트륨 염의 정제[공정 단계 b)]:
조 VLMWH 벤질 에스테르, 나트륨 염 3.67g을 10% NaCl 수용액 37㎖에 용해시킨다(물 37㎖중 NaCl 3.7g). 용액을 메탄올 167㎖로 붓는다. 현탁액을 약 15분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 메탄올(38㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 30㎖로 2회 세척한다. 습한 백색 고체를 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 40℃에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르, 나트륨 염 2.76g이 수득된다.
에스테르화 수율은 54.4%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르의 벤제토늄 염으로의 트랜스염화[공정 단계 c)]:
VLMWH 벤질 에스테르, 나트륨 염 2.83g(4.29mmol)을 100㎖ 원뿔형 플라스크 "A"중 물 20㎖에 용해시킨다. 나란히, 벤제토늄 클로라이드 6.35g(14.2mmol)을 100㎖ 원뿔형 플라스크 "B"중 물 50㎖에 가한다.
"B"의 내용물을 "A"로 붓는다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(50㎖)로 대체한다. 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(60㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일 용적의 물(60㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 다시 5분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 물 50㎖로 4회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 80℃에서 건조시킨다. VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염 7.0g이 수득된다.
수득된 수율은 약 100%이다. 함수량은 0.23%이다.
● VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염의 해중합[공정 단계 d)]:
VLMWH 3.67g(2.3mmol)을 무수 디클로로메탄 27㎖와 함께 50㎖ 3구 환저 플라스크에 넣는다. 혼합물을 30℃로 만든다. 2-3급 부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아조포스포린 676㎕(2.3mmol)를 가하고, 혼합물을 30℃에서 24시간 동안 교반한다.
● 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환[공정 단계 e)]:
나란히, 메탄올성 10% 아세트산나트륨 용액 150㎖를 250㎖ 원뿔형 플라스크 에서 제조한다. 반응 혼합물을 메탄올성 용액으로 부으면서, 온도를 약 4℃에서 유지한다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한다. 이 혼합물을 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일한 용적의 메탄올(100㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 30분 동안 교반한 다음, 약 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 다시 폐기시키고, 동일 용적의 메탄올(100㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 40㎖로 3회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 966㎎이 수득된다.
수득된 수율은 64%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH 벤질 에스테르, 나트륨 염의 비누화[공정 단계 f1)]:
해중합된 VLMWH 나트륨 염 942㎎(1.43mmol)을 물 9.5㎖에 용해시킨다. 용액은 100㎖ 3구 환저 플라스크로 가한다. 30% 수산화나트륨 용액 236㎕(2.35mmol)를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 이 혼합물을 실온에서 약 2시간 동안 교반한다. 용액은 빙초산(100%)을 가하여 중화시킨다. 그 다음에, 고체 아세트산나트륨 4.5g 및 메탄올 85㎖를 가한다. 현탁액을 약 30분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일한 양의 메탄올(40㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 다시 30분 동안 교반한 다음, 약 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일한 양의 메탄올(40㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 30 분 동안 교반한 다음, 0.45㎛의 막을 통해 여과한다. 케이크를 메탄올 10㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 776㎎이 수득된다.
수득된 수율은 91.4%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 정제[공정 단계 f2)]:
조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 758㎎을 물 7.6㎖와 함께 25㎖ 3구 플라스크로 가한다. 용액을 10분 동안 40℃에서 유지한다. pH는 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 약 9.5로 만든다. 용액은 0.45㎛ 막을 통해 여과한 다음, 30% 과산화수소 수용액 38㎕를 가한다. 혼합물을 실온에서 약 2시간 동안 교반하면서, 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 9.5 ±0.1로 일정하게 유지한다. 반응 혼합물을 1N HCl로 중화시킨 다음, NaCl 880㎎을 가한다. 약 10분 동안 교반한 후에, 용액을 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 메탄올 6.2㎖를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 용액을 실온에서 약 15분 동안 교반한다. 메탄올 16㎖를 가하고, 현탁액을 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 멈추고, 현탁액을 여과한다. 케이크는 메탄올 15㎖의 두 분획으로 세척한다. 습한 고체는 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 50℃ 범위의 온도에서 건조시킨다. 약 18시간 동안 건조시킨 후에, 순수한 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 490㎎이 수득된다. 수득된 수율은 65%이다.
● 이렇게 수득된 해중합 VLMWH의 특성
평균 분자량: 2000달톤
복잡분산성 지수: 1.1
항-Xa 활성: 205IU/㎎
실시예 5
96% 에스테르화 단계 및 3급 부틸이미노트리스(디메틸아미노)포스포란에 의한 해중합 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 공정에 의해 수득된 VLMWH
● VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염의 해중합[공정 단계 d)]:
함수량이 0.23%이고, 실시예 4에 따라 수득된 VLMWH 벤질 에스테르, 벤제토늄 염 3.67g(2.3mmol)(96% 에스테르화됨)을 무수 디클로로메탄 30㎖와 함께 50㎖ 3구 플라스크에 넣는다. 혼합물을 30℃로 만든다. 3급 부틸이미노트리스(디메틸아미노)포스포란 595㎕(2.3mmol)를 가하고, 혼합물을 30℃에서 24시간 동안 교반한다.
● 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환[공정 단계 e)]:
나란히, 메탄올성 10% 아세트산나트륨 용액 160㎖를 250㎖ 원뿔형 플라스크에서 제조한다. 반응 혼합물을 메탄올성 용액으로 부으면서, 온도를 약 4℃에서 유지한다. 현탁액을 실온에서 약 1시간 동안 교반한다. 이 혼합물을 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시킨 다음, 동일한 양의 메탄올(120㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 30분 동안 교반한 다음, 30분 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 다시 폐기시키고, 동일한 양의 메탄올(125㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 15분 동안 교반한 다음, 여과한다. 케이크를 메탄올 40㎖로 3회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃ 범위의 온도에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 982㎎이 수득된다. 수득된 수율은 65%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 비누화[공정 단계 f1)]:
조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 980㎎(1.49mmol)을 물 10㎖에 용해시킨다. 용액은 100㎖ 3구 환저 플라스크로 가한다. 30% 수산화나트륨 용액 246㎕(2.45mmol)를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 이 혼합물을 이 온도에서 약 2시간 동안 교반한다. 용액은 빙초산(100%)을 가하여 중화시킨다. 그 다음에, 고체 아세트산나트륨 4.9g 및 메탄올 95㎖를 가한다. 현탁액을 약 30분 동안 교반한 다음, 약 1시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일한 양의 메탄올(60㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 다시 30분 동안 교반한 다음, 약 16시간 동안 침강되도록 방치한다. 상등액을 폐기시키고, 동일한 양의 메탄올(60㎖)로 대체한다. 이 혼합물을 약 30분 동안 교반한 다음, 0.45㎛의 막을 통해 여과한다. 케이크를 메탄올 10㎖로 2회 세척하고, 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 약 18시간 동안 50℃에서 건조시킨다. 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염 809㎎이 수득된다.
반응 수율은 91.6%이다.
● 조질의 해중합된 VLMWH, 나트륨 염의 정제[공정 단계 f2)]:
조질의 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 792㎎을 물 8㎖와 함께 25㎖ 3구 플라스크로 가한다. 용액을 10분 동안 40℃에서 유지한다. pH는 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 약 9.5로 만든다. 용액은 0.45㎛ 막을 통해 여과한 다음, 30% 과산화수소 수용액 39.6㎕를 가한다. 혼합물을 실온에서 약 2시간 동안 교반하면서, 0.1N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 9.5 ±0.1로 일정하게 유지한다. 반응 혼합물을 1N HCl로 중화시킨 다음, NaCl 1.04g을 가한다. 약 10분 동안 교반한 후에, 용액을 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 메탄올 7.3㎖를 4℃의 범위인 온도에서 가한다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반한다. 메탄올 18.8㎖를 가하고, 현탁액을 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 멈추고, 현탁액을 여과한다. 케이크는 메탄올 15㎖의 세 분획으로 세척한다. 습한 고체는 흡인 배수시킨 다음, 감압하(6kPa)에 50℃ 범위의 온도에서 건조시킨다. 약 18시간 동안 건조시킨 후에, 순수한 해중합된 VLMWH(나트륨 염) 538㎎이 수득된다. 수득된 수율은 67.9%이다.
● 이렇게 수득된 해중합 VLMWH의 특성
평균 분자량: 2100달톤
복잡분산성 지수: 1.1
항-Xa 활성: 209IU/㎎
실시예 6
이당류 및 사당류 분획을 제거하기 위한 크로마토그래피에 의한 부가의 분리 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 공정에 의해 수득되는 VLMWH
실시예 1에 기술된 올리고사카라이드 혼합물(286㎎)을 이동상(농도가 0.2mol/ℓ인 중탄산나트륨 수용액) 20㎖에 용해시킨다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
- 이동상: 농도가 0.2mol/ℓ인 중탄산나트륨 용액
- 정지상: 바이오겔 P6 겔
- 칼럼: 길이 1m, 직경 5㎝
- 검출 파장: 240㎚
육당류보다 크거나 동일한 분획을 수거하여 합한다. 이들은 아세트산으로 중화시킨 다음, 200g/ℓ의 아세트산나트륨을 함유하는 용액이 수득될 때 까지 농축시킨다. 메탄올 5 용적을 교반하에 수득된 용액에 가한다. 현탁액을 약 18시간 동안 교반한 다음, 0.45㎛ 막을 통해 여과한다. 케이크는 감압하(6kPa)에 40℃ 범위의 온도에서 약 6시간 동안 건조시킨다. 수득된 생성물은 다시 침전시킨 다음, 최소량의 물에 용해시키고, 세파덱스 G10 칼럼상에서 탈염화 수율은 38%이다.
이렇게 수득된 올리고사카라이드 혼합물의 특성은 다음과 같다:
항-Xa 활성: 403IU/㎎
올리고사카라이드 %는 다음과 같다:
Mw(Da) 복잡분산성 이당류 % 사당류 % 육당류 % 팔당류 % 십당류 % > 십당류 %
2150 1.0 0 0 53.83 32.58 10.5 3.5
본 발명에 따르는 화합물의 약물학적 활성:
실시예 평균 분자량 항-Xa 활성 IU/㎎ 항-IIa 활성
1 1950 283 <0.2
2 2100 191 0
3 2000 252 0
4 2000 205 0
5 2100 209 0
6 2150 403 0
본 발명에 따르는 화합물중 육당류 ΔIIa-IIs-Is의 %:
실시예 육당류 분획의 % 육당류 분획중 육당류 ΔIIa-IIs-Is의 %
1 31% 46%
2 30% 26%
3 33% 33.5%
4 32% 30.8%
5 31.5% 28.7%
6 53.8% 46%

Claims (32)

  1. 헤파린의 구성성분 다당류의 일반적인 구조를 가지며, 평균 분자량이 1800 내지 2400달톤이고, 항-Xa(aXa) 활성이 190 내지 450IU/㎎이며, 항-IIa(aIIa) 활성은 없거나 거의 없고, 구성성분 올리고사카라이드는 2 내지 16개의 사카라이드 단위를 함유하며, 이들의 말단중 하나에 4,5-불포화 우론산 2-O-설페이트를 가지고, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염의 형태인 하기 화학식의 ΔIIa-IIs-Is의 육당류를 함유함을 특징으로 하는 올리고사카라이드 혼합물:
    Figure 112006005260610-PCT00004
  2. 제1항에 있어서, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염이 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 염인 올리고사카라이드 혼합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 20 내지 100%, 특히 30 내지 60%의 육당류 분획을 함유하는 올리고사카라이드 혼합물.
  4. 제3항에 있어서, 육당류 분획이 20 내지 70%, 특히 25 내지 50%의 제1항에서 정의한 바와 같은 육당류 ΔIIa-IIs-Is를 함유하는 올리고사카라이드 혼합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 평균 분자량이 1900 내지 2200달톤, 특히 1950 내지 2150달톤인 올리고사카라이드 혼합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 항-Xa 활성이 190 내지 410IU/㎎, 특히 200 내지 300IU/㎎인 동시에, 항-IIa 활성은 없거나 거의 없는 올리고사카라이드 혼합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 평균 분자량이 1950 내지 2150달톤이고, 항-Xa 활성은 190 내지 410IU/㎎이며, 항-IIa 활성은 없거나 거의 없고, 25 내지 55%의 ΔIIa-IIs-Is 분획을 함유하는, 30 내지 60%의 육당류 분획을 함유함을 특징으로 하는 올리고사카라이드 혼합물.
  8. aXa 활성이 140IU/㎎보다 크고, aIIa 활성이 5IU/㎎보다 크며, 평균 분자량이 2000 내지 3000달톤인 매우 저분자량의 헤파린을,
    a) 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의한 트랜스염화(transsalification)로 벤제토늄 헤파리네이트를 수득하고,
    b) 벤질 클로라이드의 작용에 의해 수득되는 벤제토늄 헤파리네이트의 에스 테르화 및 처리로 매우 저분자량인 헤파린의 벤질 에스테르의 나트륨 염을 수득하며,
    c) 수득된 벤질 에스테르를 트랜스염화시키고, 4급 암모늄 염을 생성하며,
    d) pKa 값이 바람직하게는 20보다 큰 유기 강염기에 의한 해중합으로 해중합된 매우 저분자량의 헤파린을 수득하고,
    e) 해중합된 매우 저분자량 헤파린의 4급 암모늄 염을 나트륨 염으로 전환시키며,
    f) 잔류하는 에스테르를 비누화하고, 임의로 정제시키는 화학 반응에 적용시키는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 중합 단계 d) 도중 사용되는 강염기/에스테르 몰 비가 0.2 내지 5, 바람직하게는 0.6 내지 2인 제조 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 해중합 단계 d)가 염기로서 포스파젠 유도체를 사용하여 수행되는 제조 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 해중합 단계 d)가, 공정이 매우 저분자량인 헤파린(VLMWH)의 벤질 에스테르, 벤제토늄 염에 대해 1몰 당량의 포스파젠 염기를 사용하여 수행되는 경우에 0.3% 미만의 함수량으로 수행되는 제조 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 해중합 단계 d) 도중 사용되는 포스파젠 그룹의 염기가 바람직하게는 하기 화학식의 화합물인 제조 방법.
    Figure 112006005260610-PCT00005
    상기 식에서,
    라디칼 R1 내지 R7은 동일하거나 상이하며, 탄소수가 1 내지 6인 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 형의 알킬 라디칼을 나타내고,
    R3 및 R4의 경우, 경우에 따라, 이들을 포함하는 -N-P-N- 그룹과 함께 6-원 헤테로사이클을 형성한다.
  13. 제8항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 해중합 단계에 사용되는 포스파젠 그룹의 염기가 2-3급 부틸아미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린인 제조 방법.
  14. 제8항에 있어서, 단계 b) 도중 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 에스테르화도가 40 내지 100%, 바람직하게는 70 내지 90%인 제조 방법.
  15. 제8항에 있어서, 제8항에서 청구한 바와 같은 공정의 단계 b)에 따라 제조되는 매우 저분자량인 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 나트륨 염으로의 전환이 반응 매질을 15 내지 25℃의 온도에서 알콜성 아세트산나트륨 용액으로, 바람직하게는 메탄올중 10% 아세트산나트륨 용액(중량/용적)으로 처리함으로써 수행되는 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 에스테르화 단계 b) 도중 부가되는 아세트산나트륨의 중량 당량이 해중합 반응에 사용되는 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 질량보다 3배 큰 제조 방법.
  17. 제8항에 있어서, 단계 c) 도중 수득된 매우 저분자량인 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염이 바람직하게는 벤제토늄, 세틸피리디늄 또는 세틸트리메틸암모늄 염인 제조 방법.
  18. 제8항에 있어서, 비누화[단계 f)에 따름]가 수성 매질에서 0 내지 20℃, 바람직하게는 0 내지 10℃의 온도에서 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화리튬과 같은 알칼리 금속 하이드록사이드를 사용하여 수행되는 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 1 내지 5몰 당량의 알칼리 금속 하이드록사이드, 보다 특히는 1 내지 2몰 당량의 알칼리 금속 하이드록사이드가 사용되는 제조 방법.
  20. 제8항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 혼합물의 인자 Xa에 대한 선택도가 증가되고, 이때 이당류 및 사당류 분획은 특히 폴리아크릴아미드 아가로즈 형태의 겔로 충전된 칼럼상에서 크로마토그래피로 또한 제거되는, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에서 기술한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물의 제조 방법.
  21. 제8항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 저분자량의 헤파린이 출발 물질로서 사용되거나, 제8항에서 정의한 바와 같은 매우 저분자량인 헤파린 대신에, 항-Xa 활성이 100 내지 140IU/㎎인 매우 저분자량의 헤파린(1500 내지 3000Da)이 사용되는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물의 제조 방법.
  22. 제8항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 항-Xa 활성이 100 내지 140IU/㎎인 매우 저분자량의 헤파린(1500 내지 4000Da)이 제8항에서 정의한 바와 같은 매우 저분자량인 헤파린 대신에 출발 물질로서 사용되는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물의 제조 방법.
  23. 제21항에 있어서, 저분자량의 헤파린이 에녹사파린, 프락시파린, 프라그민, 이노헵(또는 로기파린), 노르미플로, 엠볼렉스(또는 산도파린), 플룩섬(또는 미니 달톤), 클리바린 및 히보르로부터 선택되는 제조 방법.
  24. 제7항 내지 제23항 중의 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물.
  25. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물을 포함하는 의약품.
  26. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물을 포함하는 항혈전 활성을 갖는 의약품.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 정맥 및 동맥 혈전증, 심정맥 혈전증, 폐 색전증, 불안정한 협심증, 심근경색, 심장 허혈증, 말초 동맥이 폐색성 질환 및 심방 세동, 평활근 세포 증식, 아테롬성 경화증 및 세동맥 경화증, 혈관 형성 및 성장 인자의 조절에 의한 암과, 당뇨성 질환(예: 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신장병증)의 치료 및 예방을 위한 의약품.
  28. 제25항에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 의약품 및 하나 이상의 약제학적으로 불활성인 부형제 또는 비히클이나, 부가제를 함유하는 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 피하 또는 정맥내 주사용 용액으로 이루어진 약제학적 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 흡입용 폐 제형으로 이루어진 약제학적 조성물.
  31. 제28항에 있어서, 경구용 제형으로 이루어진 약제학적 조성물.
  32. 재구성 완충액이 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG 6000)인 색원성 기질상에서 가아미도 분해법이 사용되는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 올리고사카라이드 혼합물의 항-Xa 활성의 측정 방법.
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