PT1651677E

PT1651677E - Misturas de oligossacarídeos derivados de heparina, sua preparação e as composições farmacêuticas que os contêm

Info

Publication number: PT1651677E
Application number: PT04785991T
Authority: PT
Inventors: Christian Viskov; Pierre Mourier; Volker Laux
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-22
Publication date: 2011-02-08
Also published as: EP1651677A2; MXPA06000336A; TW200522970A; KR20060059974A; JP2006528614A; IL173206A; PE20050246A1; NZ544717A; SI1651677T1; GT200400145A; AU2004259111A1; AR045917A1; RU2006105384A; UA89356C2; CN1852926A; ES2355827T3; CY1111165T1; DE602004030015D1; CN1852926B; WO2005010051A3

Description

DESCRIÇÃO "MISTURAS DE OLIGOSSACARÍDEOS DERIVADOS DE HEPARINA, SUA PREPARAÇÃO E AS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM" A presente invenção refere-se a misturas de oligossacarideos derivados de heparina tendo um peso molecular médio de 1800 a 2400 Daltons, caracterizadas por uma forte actividade anti-Xa (aXa) e uma ausência de actividade anti-IIa (alia), seu processo de preparação e as composições farmacêuticas que os contêm. A heparina é uma mistura de mucopolissacarídeos sulfatados de origem animal utilizada, nomeadamente, pelas suas propriedades anticoagulantes e antitrombóticas.

No entanto, a heparina apresenta inconvenientes que limitam as condições da sua utilização. Em particular, a sua importante actividade anticoagulante (alia) pode provocar hemorragias. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 5 sup. 3 (1999)).

Heparinas de baixo peso molecular, obtidas nomeadamente por despolimerização básica de ésteres de heparina e actualmente comercializadas tal como a Enoxaparina apresentam igualmente uma importante actividade alia.

Mais recentemente, heparinas de pesos moleculares muito baixos foram descritas na técnica anterior. Por exemplo, na patente US6384021 os produtos apresentam uma actividade anti-Xa compreendida entre 100 e 120 Ul/mg, uma actividade anti-IIa 1 compreendida entre 2 e 8 Ul/mg. Nos pedidos internacionais WO02/08295 e WO2004/033503 os produtos apresentam actividades anti-Xa compreendidas, nomeadamente, entre 100 e 190 Ul/mg para actividades anti-IIa inferiores a 5 Ul/mg. No entanto, nenhuma dessas heparinas de peso molecular muito baixo apresenta efectivamente uma actividade anti-Xa superior a 190 Ul/mg apresentando também uma actividade anti-IIa nula ou praticamente nula (UI = Unidade Internacional).

Entende-se por actividade anti-IIa praticamente nula (ou dito de outra forma, apresentando praticamente nenhuma actividade anti-IIa) uma actividade inferior a 0,2 Ul/mg. A invenção tem por objecto misturas de oligossacarídeos que possuem uma actividade muito selectiva perante o factor X activado (factor Xa) e, em simultâneo, apresentando nenhuma, ou praticamente nenhuma, actividade anti-IIa.

Assim, a presente invenção tem por objecto misturas de oligossacarídeos que possuem a estrutura geral dos polissacarídeos constituintes da heparina e apresentam as seguintes características: têm um peso molecular médio de 1800 a 2400 Daltons, uma actividade anti-Xa compreendida entre 190 Ul/mg e 450 Ul/mg e uma actividade anti-IIa inferior a 0,2 Ul/mg. os oligossacarídeos constituintes das misturas contêm de 2 a 16 unidades sacarídicas, 2 têm uma unidade ácido urónico-4,5 insaturado 2-0-sulfato numa das suas extremidades, e contêm o hexassacarideo da seguinte fórmula:

Sis sob a forma de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso . 0 hexassacarideo AlIa-IIs_-Is contido na mistura de oligossacarideos descrito na presente invenção é uma sequência com grande afinidade para a ATUI e é caracterizado por uma actividade aXa superior a 740 Ul/mg.

Como sal de metal alcalino ou alcalino-terroso, são preferidos os sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio.

O peso molecular médio é determinado por cromatografia líquida de elevada pressão utilizando duas colunas em série, por exemplo, as comercializadas sob o nome de TSK G3000 XL e TSK 3 G2000 XL. A detecção é realizada por refractometria. 0 eluente utilizado é nitrato de litio e o fluxo é de 0,6 mL/min. O sistema é calibrado com padrões preparados por fraccionamento da Enoxaparina por cromatografia em gel de agarose-poliacrilamida (IBF). Esta preparação é realizada de acordo com a técnica descrita por Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ou D.A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Os resultados são calculados com o auxilio do software GPC6 (Perkin Elmer). A actividade anti-Xa é determinada pelo método amidolitico num substrato cromogénico de acordo com o principio descrito por Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977). As dosagens são realizadas de acordo com o método descrito na monografia das heparinas de baixo peso molecular da farmacopeia europeia em vigor, com a excepção do tampão de reconstituição: a albumina no tampão Tris-NaCl pH 7,4 é substituída por Polietilenoglicol 6000 (PEG 6000). A determinação da actividade anti-Xa é realizada em relação a uma heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) padrão com um título de 140 a 180 U/mg (a seco) . A actividade da HTBPM padrão é determinada em relação à norma internacional padrão de heparina de baixo peso molecular.

Esta HTBPM padrão foi preparada de acordo com o ensinamento dos pedidos de patente WO02/08295 e, nomeadamente, W02004/033503. A actividade de HTBPM padrão é determinada em relação à norma internacional padrão de heparina de baixo peso molecular. A actividade anti-IIa é determinada pelo método amidolitico num substrato cromogénico de acordo com o método descrito na monografia das heparinas de baixo peso molecular da farmacopeia 4 europeia em vigor. A determinação das actividades alia é realizada em relação a um padrão de heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) de actividade determinada a 2,1 ui/mg. A actividade da HTBPM padrão é determinada em relação à norma internacional padrão de heparina de baixo peso molecular.

De acordo com um modo preferido, a mistura de oligossacarideos de acordo com a invenção contém de 20 a 100% de uma fracção hexassacarideo. Em particular, essa mistura contém de 30 a 60% de fracção hexassacarideo.

Além disso, as misturas de acordo com a invenção contêm de 20 a 70% do hexassacarideo AlIa-IIs_-Is na fracção hexassacarideo da mistura de oligossacarideos. Em particular, esta fracção AlIa-IIs-Is está presente na fracção hexassacarideo numa grandeza de 25 a 50%. A percentagem da fracção hexassacarideo pode ser determinada de modo analítico por cromatografia líquida de elevada pressão em colunas TSK G3000 XL e TSK G2000 XL ou então por separação preparativa da fracção hexassacarideo.

Neste caso, a mistura é submetida a cromatografia em colunas preenchidas com gel do tipo poliacrilamida agarose. A mistura é eluída com uma solução de hidrogenocarbonato de sódio. De um modo preferido, a solução de hidrogenocarbonato de sódio é uma solução de 0,1 mol/L a 1 mol/L. De um modo ainda mais preferido, a separação é realizada a uma concentração de 1 mol/L. A detecção é realizada por espectrometria UV (254 nm) . Após fraccionamento, a fracção hexassacarideo em solução no hidrogenocarbonato de sódio é neutralizada com ácido acético 5 glacial. Em seguida, a solução é concentrada sob pressão reduzida de modo a obter uma concentração em acetato de sódio superior a 30% em peso. A fracção de hexassacarideo é precipitada por adição de 3 a 5 volumes de metanol. A fracção de hexassacarideos é recuperada por filtração em vidro sinterizado n° 3. A mistura de hexassacarideos obtida pode ser analisada por Cromatografia Liquida de Alta Pressão (CLHP) para determinar o teor em hexassacarideo AlIa-IIs-Is. O hexassacarideo AlIa-IIs-Is pode ser isolado por cromatografia CLHP preparativa ou por cromatografia de afinidade em coluna antitrombina III sepharose de acordo com as técnicas utilizadas pelo perito na matéria (M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood e U. Lindahl, F.E. B.S letters, vol 656(1) (1976)).

De um modo preferido, as misturas de acordo com a invenção têm um peso molecular médio compreendido entre 1900 e 2200 Daltons e, em particular, de 1950 a 2150 Daltons.

De acordo com um modo preferido, a mistura de oligossacarideos de acordo com a invenção é caracterizada por apresentar uma actividade anti-Xa compreendida entre 190 υι/mg e 410 Ul/mg e uma actividade anti-IIa nula ou praticamente nula. Mais particularmente, a actividade anti-Xa está compreendida entre 200 e 300 UI.

Assim, a invenção tem por objecto, muito em particular, as misturas que apresentam as seguintes caracteristicas: um peso molecular médio compreendido entre 1950 a 2150 Daltons. 6 uma actividade anti-Xa compreendida entre 190 Ul/mg e 410 Ul/mg e uma actividade anti-lla inferior a 0,2 Ul/mg. contêm de 30 a 60% de fracção hexassacarídeo contendo de 25 a 55% de fracção AlIa-IIs_-Is. A actividade das misturas de oligossacarideo de acordo com a invenção é obtida por meio de um processo muito particular que é exposto a seguir. É bem conhecido pelo perito na técnica que as caracteristicas fisico-quimicas das misturas de polissacarideos bem como a actividade resultantes estão relacionadas com o processo de obtenção (J. Med Chem 33(6) 1639-2093 (1990)) .

As misturas de oligossacarideos de acordo com a invenção são preparadas por despolimerização de um sal de amónio quaternário do éster benzilico de uma heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) em meio orgânico, sendo esta própria (HTBPM) preparada de acordo com o ensinamento dos pedidos de patentes W002/08295 e WO2004/033503. Trata-se, de um modo geral, de re-despolimerizar uma heparina de peso molecular muito baixo que, a própria, foi obtida de modo especifico por despolimerização da heparina esterificada na presença de uma base forte, de um modo preferido em diclorometano, e na presença de uma percentagem de água inferior a 3%.

As HTPBM utilizadas como matéria-prima nesta invenção foram preparadas, em particular, de acordo com os processos descritos nos pedidos de patentes WO02/08295 e WO2004/033503.

As HTBPM utilizadas, a titulo de produto de partida têm, nomeadamente, uma actividade aXa superior a 140 Ul/mg, uma 7 actividade alia inferior a 5 Ul/mg e pesos moleculares médios compreendidos entre 2000 e 3000 Daltons. A determinação das actividades aXa é realizada em relação a uma HTBPM padrão de actividade determinada a 158 UI/mg. A actividade da HTBPM padrão é determinada em relação à norma internacional padrão de heparina de baixo peso molecular.

As HTPBM de partida obtidas de acordo com o processo tal como descrito acima são re-despolimerizadas com uma base orgânica forte, de pka de um modo preferido superior a 20 (propriedades de um modo preferido parecidas à família dos fosfazenos definidos, por exemplo, por R. Schwesinger et al.r Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987) ou R.

Schwesinger et al., Angew. Chem. 105, 1420 (1993)). Em seguida, transforma-se o sal de amónio quaternário do éster benzílico da HTBPM despolimerizada em sal de sódio, saponifica-se os ésteres residuais e, eventualmente, purifica-se o produto obtido. O seguinte esquema ilustra a presente invenção:

Gf&yísjx

arbpm Η 20 ΤΑ

Etapa a

Cloreto de benzetónio W») n= X+Y+Z (taxa de sulfatação global do dissacarideo médio) X= Taxa de sulfatação do sítio, o complemento é representado pelo radical H Y= Taxa de sulfatação do sítio, o complemento é representado pelo radical H Z= Taxa de sulfatação do sítio, o complemento é representado pelo radical COCH3 v

Etapa b .«aSjKojs Vfihrtfcfll^ o;Kyw sewyaK b= taxa de esterificação

Purificação Q·

Ó(S0,WJ» íwfSO^S^Jei b= taxa da esterificação

•Q Éster benzilico em bruto Éster benzílico puro, sal de sódio Éster benzilico puro, sal de sódio D^jls

Cloreto de benzetónio

Trans-salificação Etapa c

(W®©** rO|KVI})s r® j-o 0[$£ψίΡ MHíSOjMyíZ Éster benzílico puro, sal de benzetónio

Despolimerização

Saponiflcação NaOH 4 “C Etapa f1 Misturas de ollgossacarideos em bruto simmiterns

Etapa d e e

m»~3 Misturas de ollgossacarideos em bruto

IH >H

Assim, a invenção também tem por objectivo um processo de preparação das misturas de ollgossacarideos, tais como definidas acima, caracterizado por uma heparina de peso molecular muito baixo, tendo uma actividade aXa superior a 140 Ul/mg, uma actividade alia inferior a 5 UI/mg e um peso molecular médio compreendido entre 2000 e 3000 Daltons, ser submetida às seguintes reacções químicas: 9 a) Trans-salificação por acção de cloreto de benzetónio para obter o heparinato de benzetónio, b) Esterificação do heparinato de benzetónio, obtido por acção de cloreto de benzilo, e tratamento com uma solução alcoólica de acetato de sódio para obter o sal de sódio do éster benzilico da heparina de peso molecular muito baixo, c) Trans-salificação do éster benzilico obtido e obtenção do sal de amónio quaternário, de um modo preferido, em sal de benzetónio, de cetilpiridinio ou de cetiltrimetilamónio, d) Despolimerização com uma base orgânica forte, de pka de um modo preferido superior a 20, de modo a obter uma heparina de peso molecular muito baixo despolimerizada, e) Transformação do sal de amónio quaternário da heparina de peso molecular muito baixo despolimerizada em sal de sódio f) Saponificação dos ésteres residuais e, eventualmente, purificação.

Na presente invenção, utiliza-se, mais particularmente, a forte selectividade da base fosfazeno aquando da etapa de despolimerização (etapa d) por enriquecer de modo inesperado a mistura de oligossacarideos em sequências com afinidade para a ATUI. De um modo preferido, a relação em mol base forte/éster está compreendida entre 0,2 e 5 e, mais particularmente, entre 0,6 e 2. 10

Para uma selectividade óptima e uma preservação máxima das sequências com afinidade para a ATUI, é preferível trabalhar com teores em água inferiores a 0,3% quando se trabalha com 1 equivalente molar de base fosfazeno em relação ao sal de benzetónio de éster benzílico da HTBTM.

As bases da família dos fosfazenos são, de um modo preferido, as de fórmula: R2 R3 / i \ R4 /

N—RS na qual os radicais Ri a R7, idênticos ou diferentes, representam radicais alilo lineares, ramificados ou cíclicos contendo de 1 a 6 átomos de carbono podendo, se necessário, R3 e R4 formar, com o grupo -N-P-N- que os contém, um heterociclo de 6 ligações. Em particular, a invenção tem por objectivo o processo, tal como definido acima, caracterizado por a base utilizada aquando da etapa d) de despolimerização ser a 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-l,3,2-diaza-fosforina (nomenclatura oficial: 1,3,2-diazafosforin-2-amina, 2-[(1,1-dimetiletil)imino]-N,N-dietil-1,2,2,2,3,5,6-octa-hidro-1,3-dimetilo). A reacção da etapa de trans-salificação a) é realizada, de um modo preferido, por acção do cloreto de benzetónio em excesso, na HTBPM sódica, a uma temperatura próxima de 15 a 25 °C. De modo vantajoso, a relação molar sal/heparina sódica está compreendida entre 2,5 e 3,5. 11 A esterificação da etapa b) realiza-se, de um modo preferido, no seio de um solvente orgânico clorado (tal como o clorofórmio ou o diclorometano), a uma temperatura compreendida entre 25 e 45 °C e, de um modo preferido, entre 30 e 40 °C. O éster sob a forma de sal de sódio é então recuperado por precipitação com acetato de sódio a 10% em peso, num álcool, tal como o metanol. Utiliza-se, geralmente, 1 a 1,2 volume de álcool por volume de meio reaccional. A quantidade de cloreto de benzilo e o tempo reaccional são adaptados para obter uma taxa de esterif icação compreendida entre 40 e 100% e, de um modo preferido, entre 70 e 90%. De um modo preferido, utiliza-se 0,5 a 1,5 partes em peso do cloreto de benzilo para 1 parte em peso do sal de benzetónio da heparina. Também, de um modo preferido, o tempo reaccional estará compreendido entre 10 e 35 h.

Por consequência, o processo de acordo com a invenção realiza uma taxa de esterificação do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina compreendida entre 40 e 100% e, de um modo preferido, entre 70 e 90%. A transformação do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina despolimerizada em sal de sódio é realizada, geralmente, por tratamento do meio reaccional com uma solução alcoólica de acetato de sódio e, de um modo preferido, com uma solução a 10% de acetato de sódio em metanol (peso/volume), a uma temperatura compreendida entre 15 e 25 °C. O equivalente em peso de acetato adicionado é, de um modo preferido, 3 vezes superior ao peso de sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina utilizado em seguida na reacção de despolimerização. O sal de amónio quaternário do éster 12 benzílico da HTBPM obtido é, de um modo preferido, o sal de benzetónio, de cetilpiridínio ou de cetiltrimetilamónio. A trans-salificação da etapa c) realiza-se com um cloreto de amónio quaternário e, de um modo preferido, com cloreto de benzetónio, de cloreto de cetilpiridinio ou de cloreto de cetiltrimetilamónio, em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 10 e 25 °C. De um modo vantajoso, a relação em mol cloreto de amónio quaternário/sal de sódio do éster benzílico da heparina está compreendida entre 2,5 e 3,5. A saponificação realiza-se, geralmente, com um hidróxido de metal alcalino, tal como a soda, a potassa, o hidróxido de lítio, em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 0 e 20 °C e, de um modo preferido, 0 e 10 °C. Utilizar-se-á, de um modo geral, de 1 a 5 equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino. De um modo preferido, a saponificação será realizada na presença de 1 a 2 equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino. O produto final pode, eventualmente, ser purificado por qualquer método conhecido de purificação das heparinas despolimerizadas (por exemplo, documento EP0037319B1). De um modo preferido, purifica-se com peróxido de hidrogénio, em meio aquoso, a uma temperatura de 10 a 50 °C. De um modo preferido, esta operação será realizada entre 20 e 40 °C.

As misturas de acordo com a invenção, sob a forma de sal de sódio, podem ser transformadas num outro sal de um metal alcalino ou alcalino-terroso. Passa-se, eventualmente, de um sal ao outro utilizando o método descrito na patente FR7313580. 13 um forte A presente invenção permite, nomeadamente, enriquecimento em hexassacarídeo AlIa-IIs_-ls. Quando se re-despolimeriza uma heparina de baixo peso molecular pelo processo que a gerou, é bem conhecido pelo perito na técnica que a actividade anti-Xa do produto obtido decresce fortemente até ser nula. No caso em que se utilizam os processos que permitem a obtenção da Enoxaparina, da Fraxiparina, do Fragmin, do Innohep (ou Logiparin), do Normiflo, do Embolex (ou Sandoparin), do Fluxum (ou Minidalton), do Clivarin e do Hibor, pode observar-se esse fenómeno caso se re-despolimerize essas HBPM com o seu processo de origem. Isto é a consequência da fraca selectividade desses processos face à preservação dos sítios ATUI.

Na presente invenção, se se utiliza como matéria-prima uma HTBPM proveniente do processo de despolimerização fosfazeno, é exactamente o fenómeno inverso que se produz. A actividade aXa da mistura de oligossacarídeo aumenta e ultrapassa até a da heparina que serviu para preparar a HTBPM. Isto é a consequência provável da notável selectividade das bases fosfazenos na preservação das sequências com afinidade para a ATUI.

Esta característica do processo observa-se também através dos pesos moleculares médios da mistura de oligossacarídeos obtidos. A titulo de exemplo, quando se despolimeriza uma HTBPM de peso molecular médio de 2400 Daltons, obtém-se uma mistura de oligossacarídeos de peso molecular médio de 2000 Da. Constata-se que as sequências com afinidade para a ATUI (hexassacarídeos e octassacarideos) são preservadas da acção da base fosfazeno, o que leva à destruição e à eliminação das outras sequências, e consequentemente, um peso molecular médio que vai tender para o peso molecular médio da entidade não despolimerizável; ou seja o 14 hexassacarídeo AlIa-II_s-Is (1834 g/mol) . É de salientar que na etapa de despolimerização da heparina com uma base fosfazeno, passa-se de um peso molecular médio de cerca de 15000 Da a cerca de 2400 Da. A título de método alternativo, o processo de acordo com a invenção que permite aumentar a actividade e a selectividade para o factor Xa também é aplicável às heparinas de baixo peso molecular em geral. A título de exemplo, referir-se-á, por exemplo, a Enoxaparina, a Fraxiparina, o Fragmin, o Innohep (ou Logiparin), o Normiflo, o Embolex (ou Sandoparin), o Fluxum (ou Minidalton), o Clivarin e o Hibor. Também se pode tratar de determinadas heparinas de peso molecular muito baixo, tais como descritas nos documentos US6384021 (2000-4000 Da) ou W002/08295 (1500 a 3000 Da) tendo uma actividade anti-Xa que apresenta uma actividade anti-Xa inferior a 140 Ul/mg. (nomeadamente compreendida entre 100 e 140 Ul/mg).

Esta característica do processo traduz-se pela obtenção de actividades anti-Xa inesperadas no que se refere ao peso molecular médio das misturas de oligossacarídeos (190 Ul/mg < aXa < 450 Ul/mg; 1800 Da < PM < 2400 Da).

De acordo com um modo em particular da invenção, a selectividade perante o factor Xa das misturas de oligossacarídeos pode ser ainda aumentada eliminando as fracções dissacarídeos e tetrassacarídeos (fracções que não se ligam especificamente à ATUI) . Neste caso, a mistura é submetida a cromatografia em colunas preenchidas com gel do tipo poliacrilamida agarose ou um gel de poliacrilamida. A mistura é eluída com uma solução de hidrogenocarbonato de sódio. De um 15 modo preferido, a solução de hidrogenocarbonato de sódio é uma solução de 0,1 mol/L a 1 mol/L. De um modo ainda mais preferido, a separação é realizada a uma concentração de 1 mol/L. A detecção é realizada por espectrometria UV (254 nm) . Após eliminação das fracções dissacarideos e tetrassacarídeos, a mistura de oligossacarídeos em solução em hidrogenocarbonato de sódio é neutralizada com ácido acético glacial. Em seguida, a solução é concentrada sob pressão reduzida de modo a obter uma concentração em acetato de sódio superior a 20% em peso. A mistura de oligossacarídeos é precipitada por adição de 3 a 5 volumes de metanol. A mistura de oligossacarídeo com elevada afinidade é recuperada por filtração. Em caso de necessidade, pode ser purificada por dessalinização numa coluna apropriada. O exemplo 6 ilustra este método alternativo e permite obter heparinas de peso molecular muito baixo cuja actividade anti-Xa é superior a 400 Ul/mg.

Assim, a invenção também tem por objectivo um processo, tal como definido acima, de preparação de misturas de oligossacarídeos que possuem uma selectividade perante o factor Xa das misturas de oligossacarídeos aumentada caracterizada em que, além disso, se elimina as fracções dissacarideos e tetrassacarídeos por cromatografia, nomeadamente, em colunas preenchidas com gel do tipo poliacrilamida agarose.

As misturas de acordo com a invenção podem ser utilizadas a título de medicamentos.

As misturas de oligossacarídeos da presente invenção podem ser utilizadas como agentes antitrombóticos. Em particular, são úteis para o tratamento ou a prevenção das tromboses venosas e arteriais, da trombose venosa profunda, da embolia pulmonar, da 16 angina instável, do enfarte do miocárdio, da isquemia cardiaca, das doenças oclusivas das artérias periféricas e da fibrilhação auricular. Também são úteis na prevenção e no tratamento de proliferação das células musculares lisas, aterosclerose e arteriosclerose, para o tratamento e a prevenção do cancro pela modulação da angiogénese e dos factores de crescimento, e para o tratamento e a prevenção dos distúrbios diabéticos, tal como as retinopatias e nefropatias diabéticas. A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas contendo, como princípio activo, uma mistura de fórmula (I) eventualmente em associação com um ou vários excipientes inertes.

As composições farmacêuticas são, por exemplo, soluções injectáveis por via subcutânea ou intravenosa. Outras composições farmacêuticas de acordo com a invenção também são aplicadas por uma administração por via pulmonar (inalação) ou por via oral. A posologia pode variar em função da idade, do peso e do estado de saúde do doente. Para um adulto, está compreendida, em geral, entre 20 e 100 mg por dia por via intramuscular ou subcutânea.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção, no entanto, sem a limitar. 17

Preparação 1: Obtenção de uma heparina de peso molecular muito baixo de partida que apresenta uma actividade aXa igual a 158,8 IU/mg A heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) utilizada a título de produto de partida para o exemplo 1 é preparada de acordo com o pedido de patente W02004/033503 a partir de heparina de sódio realizando as etapas a a f, tais como definidas acima, sendo a etapa de despolimerização realizada na presença de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina, na presença de uma percentagem de água inferior a 0,6%.

Características da heparina de peso molecular muito baixo obtida

As características da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:

Peso molecular médio: 2400 Daltons Actividade anti-Xa: 158,8 Ul/mg Actividade anti-lla: 3,1 Ul/mg

Relação actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 51 18

Preparação 2: Obtenção de uma heparina de peso molecular muito baixo de partida que apresenta uma actividade aXa igual a 158 IU/mg A heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) utilizada a titulo de produto de partida para os exemplos 2, 3, 4, 5 é preparada de acordo com o pedido de patente W02004/033503 a partir de heparina de sódio realizando as etapas a a f tais como definidas acima, sendo a etapa de despolimerização realizada na presença de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l, 3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina, na presença de uma percentagem de água inferior a 0,6%.

Características da heparina de peso molecular muito baixo obtida

As características da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:

Peso molecular médio: 2450 Daltons Actividade anti-Xa: 158 Ul/mg Actividade anti-lla: 2,1 Ul/mg

Relação actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 75 19

Preparação 3: sal de benzetónio de HTBPM

Trans-salificação da HTBPM em sal de benzetónio (correspondente à etapa a) do processo): 12,53 g (20,7 mmol) de sal de sódio de HTBPM obtido de acordo com a preparação 1 são carregados num erlenmeyer A de 500 mL e solubilizados em 85 mL de água (solução amarela). 31,62 g (70,5 mmol) de cloreto de benzetónio são carregados num erlenmeyer B de 100 mL com 250 mL de água (solução incolor) . O conteúdo de B é vertido em A e a mistura é agitada cerca de 1 h à temperatura ambiente. Deixa-se sedimentar durante cerca de 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (250 mL). Agita-se durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (250 mL) . A mistura é agitada cerca de 15 minutos e filtrada. O bolo é lavado 3 vezes com 200 mL de água. O sólido bege húmido é enxaguado e seco a 80 °C durante cerca de 18 h em estufa sob pressão reduzida (6 kPa). Obtém-se 35,56 g de sal de benzetónio de HTBPM. O rendimento obtido é de 89%. 20

Preparação 4

Trans-salificação da HTBPM em sal de benzetónio (correspondente à etapa a) do processo): 17,93 g (30,2 mmol) de sal de sódio de HTBPM obtido de acordo com a preparação 2 são carregados num erlenmeyer A de 1 L e solubilizados em 120 mL de água (solução amarela). 45 g (0,1 mol) de cloreto de benzetónio são carregados num erlenmeyer B de 500 mL com 360 mL de água (solução incolor). O conteúdo de B é vertido em A e a mistura é agitada cerca de 1 h à temperatura ambiente. Deixa-se sedimentar durante cerca de 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (500 mL) . Agita-se durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (500 mL) . A mistura é agitada cerca de 15 minutos e filtrada. O bolo é lavado 3 vezes com 200 mL de água. O sólido bege húmido é enxaguado e seco a 80 °C durante cerca de 48 h em estufa sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 49,5 g de sal de benzetónio de HTBPM. O rendimento obtido é de 87%.

Exemplo 1:

Heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) obtida pelo processo de acordo com a invenção compreendendo uma etapa de 21 esterificação a 77% e uma etapa de despolimerização com uma base derivada de fosfazeno em meio anidro . Esterificação da HTBPM (etapa b do processo): 35,39 g (18,3 mmol) de sal de benzetónio de HTBPM obtido de acordo com a preparação 3 (com um teor em água de 0,20%) são solubilizados em 183,3 g de diclorometano seco e carregados num balão de três tubuladuras de 500 mL. 29,5 mL (25,7 mmol) de cloreto de benzilo são adicionados à temperatura de 30 °C. A taxa de esterificação é de 77% após cerca de 23 h de reacção a 30 °C. Após arrefecimento à temperatura ambiente (22±3 °C), a mistura reaccional é vertida em 490 mL de uma solução de acetato de sódio a 10% em metanol. A mistura é agitada durante cerca de lhe deixa-se sedimentar aproximadamente 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (250 mL) . Agita-se aproximadamente 30 minutos e deixa-se sedimentar cerca de 45 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (250 mL) . Deixa-se sedimentar cerca de 16 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (350 mL). Agita-se durante cerca de 5 minutos e a suspensão é filtrada. O bolo é lavado 2 vezes com 50 mL de metanol, enxaguado e seco a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h. Obtém-se 34,48 g de sal de sódio de éster benzílico de HTBPM em bruto com uma taxa de esterificação de 77%. 22 . Purificação do sal de sódio de éster benzilico de HTBPM (etapa b) do processo).

Os 34,48 g de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM em bruto são solubilizados em 350 mL de uma solução aquosa de NaCl a 10%. A solução é vertida em 1,57 L de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 40 minutos e deixa-se sedimentar durante cerca de 16 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (1,5 L) . Agita-se cerca de 1 h e deixa-se sedimentar durante cerca de 1,5 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (1,2 L) . Agita-se aproximadamente 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 3 vezes com 50 mL de metanol. O sólido húmido branco é enxaguado e seco a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h. Obtém-se 6,07 g de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM. O rendimento da esterificação é de 50%. . Trans-salificação do sal de sódio de éster benzilico de HTBPM em sal de benzetónio (etapa c) do processo): 6 g (9,14 mmol) de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM são solubilizados com 40 mL de água num erlenmeyer A de 250 mL.

Entretanto, 13,93 g (31 mmol) de cloreto de benzetónio são carregados com 110 mL de água num erlenmeyer B de 250 mL. O conteúdo de B é vertido em A. A suspensão é agitada cerca de 1 h à temperatura ambiente (22±3 °C) e deixada a sedimentar 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume 23 de água (140 mL). Agita-se durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (140 mL) . Agita-se aproximadamente 15 minutos e deixa-se sedimentar cerca de 30 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (140 mL). Agita-se cerca de 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 3 vezes com 50 mL de água, enxaguado e seco a 80 °C sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h. Obtém-se 17,43 g de sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM. O rendimento é de 100%. . Despolimerização do sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM em meio anidro: Teor em água não detectável < 0,01% (etapa d) do processo) 17,43 g (9,14 mmol) de HTBPM, de acordo com a preparação 2, são carregados num balão de três tubuladuras de 250 mL com 122 mL de diclorometano seco. 17,4 g de peneiros moleculares 4 Á são adicionados. O conjunto é agitado durante cerca de 18 h à temperatura ambiente (22±3 °C) sob atmosfera de árgon.

Os peneiros são separados da mistura por transferência da solução num balão de três tubuladuras de 250 mL. Adiciona-se 2,64 mL (9,14 mmol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l, 3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina e agita-se durante 24 h a 22±3 °C sob atmosfera de árgon. 24 . Transformação do sal de amónio quaternário em sal de sódio (etapa e) do processo)

Entretanto, 730 mL de uma solução metanólica de acetato de sódio a 10% é preparada num erlenmeyer de 2 L. 8,71 g de celite Hyflo supercel são adicionados à solução. A mistura reaccional é vertida na solução metanólica mantendo a temperatura a cerca de 4 °C. A suspensão é agitada durante cerca de 15 minutos a esta temperatura. Deixa-se sedimentar aproximadamente 45 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (450 mL) . Agita-se 15 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 45 minutos. O sobrenadante é novamente separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (420 mL) . Agita-se durante cerca de 15 minutos e filtra-se em vidro sinterizado n° 3. O bolo é lavado 2 vezes com 70 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 4,35 g de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio) em celite (8,71 g) . O rendimento é de 72,5%. . Saponificação do sal de sódio de HTBPM despolimerizada, em bruto, (etapa fl) do processo): 4,35 g (6,63 mmol) de HTBMP despolimerizada em bruto (sal de sódio) em celite é solubilizada em 46 mL de água e filtrada em vidro sinterizado n° 3. A celite é lavada com 2 porções de 30 mL de água. O filtrado é carregado num erlenmmeyer de 500 mL. Introduz-se 823 pL (9,94 mmol) de lixívia de soda caústica a 35% a uma temperatura próxima de 4 °C. Agita-se durante cerca de 3 h a esta temperatura. O meio é neutralizado por adição de uma 25 solução de HC1 a 1 N e adiciona-se 11,5 g de NaCl e 80 mL de metanol. Após aproximadamente 15 minutos de agitação, são adicionados 210 mL de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 1 h e deixada a sedimentar 30 minutos. O sobrenadante é separado, substituído pela mesma quantidade de metanol (230 mL). Agita-se durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar 30 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (210 mL) . Agita-se aproximadamente 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 2 vezes com 9 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa). Obtém-se 2,95 g de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento é de 73,7%. f) Purificação da HTBPM despolimerizada em bruto -sal de sódio- (etapa f2 do processo): 1,5 g de HTBMP despolimerizada em bruto, sal de sódio, são carregados num balão de três tubuladuras de 50 mL com 16 mL de água. A solução é aquecida durante cerca de 10 minutos a 40 °C. O pH é conduzido a cerca de 9,7 por adição de soda a 0,1 N. A solução é filtrada em membrana de 0,45 pm e são adicionados 84 pL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. A mistura é agitada 2 h à temperatura ambiente mantendo o pH constante a 9,7 ± 0,1 por adição de soda a 0,1 N. Em seguida, a mistura reaccional é neutralizada com HC1 a 0,1 N e são adicionados 2 g de NaCl. Após cerca de 10 minutos de agitação, a solução é filtrada em membrana de 0,45 pm. São vertidos 14 mL de metanol a uma temperatura próxima de 4 °C. A solução é agitada aproximadamente durante 15 minutos à temperatura ambiente. 26

Em seguida, são adicionados 36 mL de metanol e a suspensão é agitada durante cerca de 1 h. A agitação é então parada e deixa-se sedimentar durante cerca de 30 minutos. Em seguida, o sobrenadante é afastado e separado (40 mL) . Ao precipitado sedimentado, adicionam-se 40 mL de metanol e agita-se durante cerca de 10 minutos. Deixa-se re-sedimentar o precipitado aproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é afastado e separado (45 mL) . São adicionados 45 mL de metanol e, em seguida, o precipitado em suspensão é filtrado. Em seguida, o bolo branco obtido é lavado com 2 porções de 3 mL de metanol. O sólido húmido é enxaguado e seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após cerca de 18 horas de secagem, obtém-se 1,303 g de HTBPM despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 86,8%. g) Característica da htbpm despolimerizada assim obtida

Peso molecular médio: 1950 Daltons índice de polidispersibilidade: 1,1 Actividade anti-Xa: 283 U/mg Actividade alia: não detectável (< 0,2 U/mg)

Exemplo 2:

Heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) obtida pelo processo de acordo com a invenção compreendendo uma etapa de 27 esterificação a 49% e uma etapa de despolimerização com uma base derivada de fosfazeno em meio anidro . Esterificação da HTBPM (etapa b do processo): 13,29 g (7,6 mmol) de sal de benzetónio de HTBMP, obtido de acordo com a preparação 4, são solubilizados em 70, 43 g de diclorometano anidro e carregados num balão de três tubuladuras de 100 mL (O teor em água do meio reaccional é de 0,073%). São adicionados 12,3 mL (107 mmol) de cloreto de benzilo à temperatura de 30 °C. A taxa de esterificação é de 49% após cerca de 7 h de reacção a 30 °C. Após arrefecimento, a mistura reaccional é vertida em 160 mL de uma solução a 12% de acetato de sódio em metanol. A mistura é agitada 1 h à temperatura ambiente e deixada a sedimentar durante cerca de 16 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (100 mL). Agita-se cerca de 1 h e deixa-se sedimentar cerca de 1 h. O sobrenadante é novamente separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (100 mL) . Agita-se cerca de 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado com 2 x 40 mL de metanol, enxaguado e seco em estufa a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h. Obtém-se 3,90 g de sal de sódio de éster benzílico de HTBMP em bruto com uma taxa de esterificação de 49%. . Purificação do sal de sódio de éster benzílico de HTBPM (esterifiçado a 49%) (etapa b do processo). 3,90 g de sal de sódio de éster benzílico de HTBPM em bruto são solubilizados em 39 mL de uma solução aquosa de NaCl a 10%. 28 A solução é vertida em 176 mL de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar 2 h. A mistura é filtrada. 0 bolo é novamente colocado em suspensão em 175 mL de metanol e agitado durante 10 minutos. Filtra-se e o bolo é lavado com 2 porções de 10 mL de metanol. O sólido húmido branco é enxaguado, seco em estufa a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h. Obtém-se 2,62 g de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM. O rendimento global da fase de esterificação é de 57,3%. . Trans-salificação do éster benzilico de HTBPM em sal de benzetónio (etapa c) do processo): 2,62 g (4,37 mmol) de sal de sódio de éster benzilico de HTBMP são solubilizados em 20 mL de água (erlenmeyer «A») . Entretanto, 5,92 g (13,2 mmol) de cloreto de benzetónio são carregados com 60 mL de água num erlenmeyer «B». O conteúdo de «B» é vertido em «A». A suspensão é agitada durante cerca de 1 h à temperatura ambiente e deixada a sedimentar 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (70 mL) . Agita-se durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (70 mL) . Agita-se ainda cerca de 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado com 3 porções de 50 mL de água, enxaguado e seco em estufa a 80 °C sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h. Obtém-se 6,85 g de sal de benzetónio de éster benzilico de HTBMP. O rendimento é de 99%. O teor em água do sal de benzetónio é de 0,6%. 29 . Despolimerização do sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM: 6,80 g (4,3 mmol) de HTBPM são carregados num balão de três tubuladuras de 100 mL com 54 mL de diclorometano seco. A mistura é levada a 30 °C e agitada até dissolução completa. O teor em água estimado da mistura reaccional é de cerca de 0,05%. Adiciona-se 1,25 mL (4,3 mmol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-l,2,3-diaza-fosforina e agita-se 24 h a 30 °C sob atmosfera inerte.

Transformação do sal de amónio quaternário em sal de sódio (etapa e) do processo)

Entretanto, 270 mL de uma solução metanólica de acetato de sódio a 10% são preparados num erlenmeyer de 1 L. A mistura reaccional é vertida na solução metanólica mantendo a temperatura a cerca de 4 °C. A suspensão é agitada cerca de 1 h à temperatura ambiente. Deixa-se sedimentar durante 1 h. 0 sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (165 mL) . Agita-se cerca de 1 h e deixa-se sedimentar 1 h. O sobrenadante é novamente separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (170 mL). Agita-se durante cerca de 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado com 3 porções de 40 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h em estufa a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 2,29 g de sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto. O rendimento obtido é de 89%. 30 . Saponificação de sal de sódio de HTBPM em bruto (etapa fl do processo): 2,29 g (3,8 mmol) de sal de sódio de HTBMP despolimerizada em bruto são solubilizados em 23 mL de água. A solução é filtrada em membrana de 0,8 pm e carregada num balão de três tubuladuras de 100 mL. Introduz-se 575 pL (5,73 mmol) de lixivia de soda caústica a 30% a uma temperatura próxima de 3 °C.

Agita-se durante cerca de 2 h a esta temperatura. A metade da mistura reaccional é neutralizada por adição do ácido acético glacial e adiciona-se, em seguida, 367 mg de acetato de sódio sólido e 13 mL de metanol. A solução é agitada cerca de 15 minutos e são adicionados 65 mL de metanol. A suspensão obtida é agitada cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar cerca de 16 horas. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (36 mL). Agita-se ainda aproximadamente 30 minutos e deixa-se sedimentar cerca de 30 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (16 mL). Agita-se cerca de 15 minutos e filtra-se em membrana de 0,22 pm. O bolo é lavado com 2 vezes 5 mL de metanol, enxaguado e seco sob pressão reduzida (6 kPa) durante cerca de 18 h em estufa a 50 °C. Obtém-se 563 mg de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento é de 52,6%. 31

Purificação da HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio) precipitada com AcONa (etapa f2 do processo): 560 mg de HTBMP despolimerizada em bruto (sal de sódio) são carregados num balão de três tubuladuras de 10 mL com 5,6 mL de água. A solução acastanhada é levada 10 minutos a 40 °C. O pH é levado a 9,7 por adição de soda a 0,1 N. A solução é filtrada em membrana de 0,45 pm, são adicionados 28 pL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. A mistura é agitada 2 h à temperatura ambiente mantendo o pH constante a 9,5 ± 0,1 por adição de soda a 0,1 N. A mistura reaccional é neutralizada com HC1 a 0,1 N e são adicionados 620 mg de NaCl. Após 10 minutos de agitação, a solução é filtrada em membrana de 0,45 pm. São vertidos 4,35 mL de metanol a uma temperatura próxima de 4 °C. A solução é agitada 15 minutos à temperatura ambiente. São adicionados 11,2 mL de metanol. A suspensão é agitada 1 h. A agitação é então parada e deixa-se sedimentar durante 1 h. Em seguida, o sobrenadante é afastado e separado (13,5 mL). Ao precipitado sedimentado, adicionam-se 13,5 mL de metanol e agita-se durante 15 minutos. Deixa-se re-sedimentar o precipitado cerca de 30 minutos. O sobrenadante é afastado e separado (13 mL). São adicionados 13 mL de metanol e o precipitado em suspensão é então filtrado. Em seguida, o bolo branco obtido é lavado com 2 porções de 5 mL de metanol. O sólido húmido é enxaguado e seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtém-se 376 mg de HTBPM despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 67%. 32

Característica da HTBPM despolimerizada assim obtida

Actividade anti-Xa: 191 Ul/mg Peso molecular médio: 2100 Da

Exemplo 3:

Heparina de peso molecular muito baixo (HTBPM) obtida pelo processo de acordo com a invenção compreendendo uma etapa de esterificação a 73% e uma etapa de despolimerização com uma base derivada de fosfazeno em meio anidro . Esterificação da HTBPM (etapa b do processo): 13,7 g (7,3 mmol) de sal de benzetónio de HTBPM, obtido de acordo com a preparação 4, são solubilizados em 73, 67 g de diclorometano anidro e carregados num balão de três tubuladuras de 100 mL. (O teor em água do meio reaccional é doseado a 0,23%). São adicionados 13 mL (113 mmol) de cloreto de benzilo à temperatura de 30 °C. A taxa de esterificação é de 73% após cerca de 20 h de reacção a 30 °C. Após arrefecimento à temperatura ambiente, a mistura reaccional é vertida em 210 mL de uma solução a 12% de acetato de sódio em metanol. A mistura é agitada 30 minutos à temperatura ambiente e deixa-se sedimentar durante cerca de 1,5 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (140 mL) . Agita-se 15 minutos e a suspensão é filtrada. O bolo é lavado com 2 porções de 100 mL de metanol, enxaguado e seco aproximadamente 18 h em estufa a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa). Obtém-se 13,3 g de sal de sódio de 33 éster benzílico de HTBPM em bruto com uma taxa de esterificação de 73%. . Purificação do sal de sódio de éster benzílico de HTBPM (esterificada a 73%), (etapa b do processo).

Os 13,3 g de sal de sódio de éster benzílico de HTBPM, em bruto, são solubilizados em 133 mL de uma solução aquosa de NaCl a 10%. A solução é vertida em 600 mL de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (400 mL) . Agita-se durante cerca de 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 3 vezes com 100 mL de metanol. O sólido húmido branco é enxaguado e seco aproximadamente 18 h em estufa a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 2,33 g de sal de sódio de éster benzílico de HTBPM. O rendimento de esterificação é de 49,6%. . Trans-salificação do sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM (etapa c do processo): 2,27 g (3,53 mmol) de sal de sódio de éster benzílico de HTBPM são solubilizados com 15 mL de água num erlenmeyer «A» de 100 mL. Entretanto, 5,22 g (11,6 mmol) de cloreto de benzetónio são carregados com 55 mL de água num erlenmeyer «B» de 100 mL. O conteúdo de «B» é vertido em «A». A suspensão é agitada cerca de 1 h à temperatura ambiente e deixa-se sedimentar 34 aproximadamente 1 h. 0 sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (50 mL) . Agita-se cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (50 mL). Agita-se ainda 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado com 3 porções de 50 mL de água, enxaguado e seco durante cerca de 18 h em estufa a 80 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 5,67 g de sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM. O rendimento obtido é de 98%. O teor em água do produto obtido é de 1% . Despolimerização do sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM (etapa d do processo): 5,45 g (3,3 mmol) de HTBPM são carregados num balão de três tubuladuras de 100 mL com 40 mL de diclorometano seco. O teor em água estimado da mistura é de cerca de 0,1%. A mistura é levada a 30 °C. Adiciona-se 958 pL (3,3 mmol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-l,2,3-diaza-fosforina e agita-se 24 h a 30 °C sob atmosfera de árgon.

Entretanto, 200 mL de uma solução metanólica de acetato de sódio a 10% é preparada num erlenmeyer de 500 mL. A mistura reaccional é vertida na solução metanólica mantendo a temperatura a cerca de 4 °C. A suspensão é agitada durante cerca de 1 h à temperatura ambiente. Deixa-se sedimentar 35 aproximadamente 1 h. 0 sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (150 mL). Agita-se cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar cerca de 30 minutos. O sobrenadante é novamente separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (150 mL). Agita-se durante aproximadamente 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 3 vezes com 50 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 1,40 g de sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto. O rendimento obtido é de 65,8%. . Saponificação do sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto (etapa fl do processo): 1,40 g (2,18 mmol) de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio) são solubilizados em 14 mL de água. A solução é carregada num balão de três tubuladuras de 100 mL. A uma temperatura próxima de 4 °C, introduz-se 351 pL (3,5 mmol) de lixívia de soda caústica a 30%. Agita-se durante cerca de 2 h a esta temperatura. A solução é neutralizada por adição de ácido acético glacial (100%) . Em seguida, adiciona-se 7 g de acetato de sódio sólido e 130 mL de metanol. A suspensão é agitada 30 minutos e deixa-se sedimentar durante cerca de 1 hora. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (80 mL). Agita-se ainda cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 16 horas. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (80 mL). Agita-se cerca de 15 minutos e filtra-se em membrana de 0,45 pm. O bolo é lavado 2 vezes com 10 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 1,15 g (rendimento: 89,4%) de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio). 36 0 rendimento obtido é de 89,4%.

Purificação da HTBPM despolimerizada em bruto -sal de sódio- (etapa f2 do processo): 373 mg de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio) são carregados num balão de três tubuladuras de 10 mL com 3,7 mL de água. A solução é levada 10 minutos a 40 °C. O pH é conduzido a cerca de 9,5 por adição de soda a 1 N. A solução é filtrada em membrana de 0,45 pm e são adicionados 18 pL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. A mistura é agitada cerca de 2 h à temperatura ambiente mantendo o pH constante a 9,5 ± 0,1 por adição de soda a 0,1 N. A mistura reaccional é neutralizado com HC1 a 0,1 N e são adicionados 430 mg de NaCl. Após cerca de 10 minutos de agitação, a solução é filtrada em membrana de 0,45 pm. São vertidos3 mL de metanol a uma temperatura próxima de 4 °C. A solução é agitada 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, são adicionados 7,7 mL de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 1 h. A agitação é então parada e deixa-se sedimentar durante aproximadamente 40 minutos. Em seguida, o sobrenadante é afastado e separado (10 mL). Ao precipitado sedimentado, adiciona-se 10 mL de metanol e agita-se durante 15 minutos. Deixa-se re-sedimentar o precipitado cerca de 30 minutos. O sobrenadante é afastado e separado (10 mL). São adicionados 10 mL de metanol e o precipitado em suspensão é então filtrado em membrana de 0,45 pm. O bolo branco obtido é lavado com 4 porções de 5 mL de metanol. O sólido húmido é enxaguado e seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após cerca de 18 horas de secagem, obtém-se 199 mg de HTBPM despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 54%. 37

Característica da HTBPM despolimerizada assim obtida

Peso molecular médio: 2000 Daltons. índice de polidispersibilidade: 1,1 Actividade anti-Xa: 252 Ul/mg

Exemplo 4: HTBPM obtida pelo processo de acordo com a invenção compreendendo uma etapa de esterificação a 96% e uma etapa de despolimerização pelo bemp . Esterificação da HTBPM (etapa b) do processo) 14,45 g (7,7 mmol) de sal de benzetónio de HTBPM, obtido de acordo com a preparação 4, são solubilizados em 75, 79 g de diclorometano anidro e carregados num balão de três tubuladuras de 250 mL. (O teor em água do meio reaccional é de 0,20%). São adicionados 12,4 mL (108 mmol) de cloreto de benzilo à temperatura de 30 °C. A taxa de esterificação é de 96% após cerca de 26 h de reacção a 30 °C. Após arrefecimento à temperatura ambiente, a mistura reaccional é vertida em 180 mL de uma solução a 12% de acetato de sódio em metanol. A mistura é agitada cerca de 30 minutos à temperatura ambiente e deixa-se sedimentar aproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (150 mL) . Agita-se cerca de 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado com 2 porções de 100 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 38 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 3,67 g de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM, em bruto, com uma taxa de esterificação de 96%. . Purificação do sal de sódio de éster benzilico de HTBPM (esterificado a 96%) (etapa b) do processo):

Os 3,67 g de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM, em bruto, são solubilizados em 37 mL de uma solução aquosa de NaCl a 10% (3,7 g de NaCl em 37 mL de água) . A solução é vertida em 167 mL de metanol. A suspensão é agitada cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar durante aproximadamente 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de metanol (38 mL). Agita-se durante cerca de 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado com 2 vezes 30 mL de metanol. O sólido húmido branco é enxaguado, seco durante cerca de 18 h a 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 2,76 g de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM. O rendimento de esterificação é de 54,4%.

Trans-salificação do éster benzilico de HTBPM em sal de benzetónio (etapa c) do processo): 2,83 g (4,29 mmol) de sal de sódio de éster benzilico de HTBPM são solubilizados com 20 mL de água num erlenmeyer «A» de 100 mL. Entretanto, 6,35 g (14,2 mmol) de cloreto de benzetónio são carregados com 50 mL de água num erlenmeyer «B» de 100 mL. 39 0 conteúdo de «B» é vertido em «A». A suspensão é agitada cerca de 1 h à temperatura ambiente e deixa-se sedimentar aproximadamente 1 h. 0 sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (60 mL) . Agita-se durante cerca de 15 minutos e deixa-se sedimentar aproximadamente 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pelo mesmo volume de água (60 mL) . Agita-se ainda cerca de 5 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 4 vezes com 50 mL de água, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 80 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 7,0 g de sal de benzetónio de éster benzílico de htbpm. O rendimento é observado é de cerca de 100%. O teor em água é de 0,23%. . Despolimerização do sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM (etapa d) do processo): 3,6 7 g (2,3 mmol) de HTBPM são carregados num balão de três tubuladuras de 50 mL com 2 7 mL de diclorometano seco. A mistura é levada a 30 °C. Adiciona-se 676 pL (2,3 mmol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l, 3-dimetilper-hidro-l, 2,3-diaza-fosforina e agita-se 24 h a 30 °C.

Entretanto, 150 mL de uma solução metanólica de acetato de sódio a 10% são preparados num erlenmeyer de 250 mL. A mistura reaccional é vertida na solução metanólica mantendo a temperatura a cerca de 4 °C. A suspensão é agitada durante cerca 40 de 1 h à temperatura ambiente. Deixa-se sedimentar durante aproximadamente 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (100 mL) . Agita-se 30 minutos e deixa-se sedimentar 30 minutos. O sobrenadante é novamente separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (100 mL) . Agita-se 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 3 vezes com 40 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 966 mg de sal de sódio de HTBPM despolimerizada. O rendimento obtido é de 64%. . Saponificação do sal de sódio de éster benzílico de HTBPM (etapa fl do processo):

942 mg (1,43 mmol) de sal de sódio de HTBPM despolimerizada são solubilizados em 9,5 mL de água. A solução é carregada num balão de três tubuladuras de 100 mL. Introduz-se 236 pL (2,35 mmol) de lixívia de soda caústica a 30% a uma temperatura próxima de 4 °C. Agita-se durante cerca de 2 h a esta temperatura. A solução é neutralizada por adição de ácido acético glacial (100%). Em seguida, adiciona-se 4,5 g de acetato de sódio sólido e 85 mL de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar durante cerca de 1 hora. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (40 mL). Agita-se ainda durante cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar durante cerca de 16 horas. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (40 mL) . Agita-se durante cerca de 30 minutos e filtra-se em membrana de 0,45 pm. O bolo é lavado 2 vezes com 10 mL de metanol, enxaguado e seco durante cerca de 18 h a 50 °C 41 sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 776 mg de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio). 0 rendimento obtido é de 91,4%.

Purificação da HTBPM despolimerizada em bruto -sal de sódio- etapa f2 do processo: 758 mg de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio) são carregados num balão de três tubuladuras de 25 mL com 7,6 mL de água. A solução é levada 10 minutos a 40 °C. O pH é conduzido a cerca de 9,5 por adição de soda a 0,1 N. A solução é filtrada em membrana de 0,45 pm e são adicionados 38 pL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. A mistura é agitada durante cerca de 2 h à temperatura ambiente mantendo o pH constante a 9,5 ± 0,1 por adição de soda a 0,1 N. A mistura reaccional é neutralizada com HC1 a 1 N e são adicionados 880 mg de NaCl. Após cerca de 10 minutos de agitação, a solução é filtrada em membrana de 0,45 pm. São vertidos 6,2 mL de metanol a uma temperatura próxima de 4 °C. A solução é agitada aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionam-se 16 mL de metanol e a suspensão é agitada durante cerca de 1 h. A agitação é então parada e a suspensão é filtrada. O bolo é lavado com 2 porções de 15 mL de metanol. O sólido húmido é enxaguado e seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após aproximadamente 18 horas de secagem, obtém-se 490 mg de HTBPM despolimerizada pura (sal de sódio) . O rendimento obtido é de 65%. 42

Característica da HTBPM despolimerizada assim obtida

Peso molecular médio: 2000 Daltons índice de polidispersibilidade: 1,1 Actividade anti-Xa: 205 Ul/mg

Exemplo 5: HTBPM obtida pelo processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de esterificação a 96% e uma etapa de despolimerização pelo terc-Butilimino- tris(dimetilamino)fosforano . Despolimerização do sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM (etapa d) do processo): 3,67 g (2,3 mmol) de sal de benzetónio de éster benzílico de HTBPM, obtido de acordo com o exemplo 4 (esterifiçado a 96%), com um teor em água de 0,23%, são carregados num balão de três tubuladuras de 50 mL com 30 mL de diclorometano seco. A mistura é levada a 30 °C. Adiciona-se 595 pL (2,3 mmol) de terc-Butilimino-tris(dimetilamino)fosforano e agita-se 24 h a 30 °C. 43 . Transformação do sal de amónio quaternário em sal de sódio (etapa e) do processo)

Entretanto, 160 mL de uma solução metanólica de acetato de sódio a 10% são preparados num erlenmeyer de 250 mL. A mistura reaccional é vertida na solução metanólica mantendo a temperatura a cerca de 4 °C. A suspensão é agitada aproximadamente 1 h à temperatura ambiente. Deixa-se sedimentar durante cerca de 1 h. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (120 mL) . Agita-se cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar 30 minutos. O sobrenadante é novamente separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (125 mL). Agita-se durante cerca de 15 minutos e filtra-se. O bolo é lavado 3 vezes com 40 mL de metanol, enxaguado e seco cerca de 18 h a uma temperatura próxima de 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 982 mg de sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto. O rendimento obtido é de 65%. . Saponificação do sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto (passo fl do processo): 980 mg (1,49 mmol) de sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto são solubilizados em 10 mL de água. A solução é carregada num balão de três tubuladuras de 100 mL. Introduz-se 246 pL (2,45 mmol) de lixívia de soda caústica a 30% a uma temperatura próxima de 4 °C. Agita-se durante cerca de 2 h a esta temperatura. A solução é neutralizada por adição de ácido acético glacial (100%). Em seguida, adiciona-se 4,9 g de acetato de sódio sólido e 95 mL de metanol. A suspensão é agitada 30 minutos e deixa-se sedimentar durante cerca de 1 hora. 44 0 sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (60 mL) . Agita-se ainda cerca de 30 minutos e deixa-se sedimentar cerca de 16 horas. O sobrenadante é separado e substituído pela mesma quantidade de metanol (60 mL). Agita-se durante cerca de 30 minutos e filtra-se em membrana de 0,45 pm. O bolo é lavado 2 vezes com 10 mL de metanol, enxaguado e seco aproximadamente 18 h a 50 °C sob pressão reduzida (6 kPa) . Obtém-se 809 mg de sal de sódio de HTBPM despolimerizada em bruto. O rendimento da reacção é de 91,6%.

Purificação da HTBPM despolimerizada em bruto -sal de sódio- passo f2 do processo: 792 mg de HTBPM despolimerizada em bruto (sal de sódio) são carregados num balão de três tubuladuras de 25 mL com 8 mL de água. A solução é levada 10 minutos a 40 °C. O pH é conduzido a cerca de 9,5 por adição de soda a 0,1 N. A solução é filtrada em membrana de 0,45 pm, e são adicionados 39,6 pL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. A mistura é agitada 2 h à temperatura ambiente mantendo o pH constante a 9,5 ± 0,1 por adição de soda a 0,1 N. A mistura reaccional é neutralizada com HC1 a 1 N e são adicionados 1,04 g de NaCl. Após cerca de 10 minutos de agitação, a solução é filtrada em membrana de 0,45 pm. São vertidos 7,3 mL de metanol a uma temperatura próxima de 4 °C. A solução é agitada durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionam-se 18,8 mL de metanol e a suspensão é agitada durante cerca de 1 h. A agitação é então parada e filtra-se. O bolo é lavado com 3 porções de 15 mL de metanol. O sólido húmido é enxaguado e seco sob pressão reduzida 45 (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtém-se 538 mg de HTBPM despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 67,9%.

Característica da HTBPM despolimerizada assim obtida

Peso molecular médio: 2100 Daltons índice de polidispersibilidade: 1,1

Actividade anti-Xa: 209 Ul/mg

Exemplo 6: HTBPM obtida pelo processo de acordo com a invenção compreendendo uma etapa adicional de separação por cromatografia eliminando as fracções dissacarideos e tetrassacarideos A mistura de oligossacarídeos descrita no exemplo 1 (286 mg) é solubilizada em 20 mL de fase móvel (solução aquosa de bicarbonato de sódio a 0,2 mol/L). As condições cromatográficas são as seguintes:

Fase móvel: solução de bicarbonato de sódio a 0,2 mol/L

Fase estacionária: Gel biogel P6

Coluna: Comprimento 1 m, Diâmetro 5 cm.

Comprimento de onda de detecção: 240 nm.

As fracções superiores ou iguais a um hexassacarídeo são recolhidas e reunidas. São neutralizadas com ácido acético e concentradas até à obtenção de uma solução a 200 g/L de acetato de sódio. À solução obtida e sob agitação, adicionam-se 5 volumes de metanol. A suspensão é agitada durante cerca de 18 h, e filtrada em membrana de 0,45 pm. O bolo é seco durante cerca de 6 h a uma temperatura próxima de 40 °C sob pressão reduzida (6 kPa). O produto obtido é re-precipitado e dissolvido num mínimo de água e dessalinizado em coluna Sephadex G10. Após concentração das fracções dessalinizadas e liofilização, obtém-se 109 mg de produto. O rendimento é de 38%.

As características da mistura de oligossacarídeos assim obtida são as seguintes:

Actividade anti-Xa: 403 Ul/mg A percentagem dos oligossacarídeos é a seguinte:

Mw (Da) Poli dispersibilidade Di g. 15 Tetra o. 0 Hexa g. 15 Octa g, o Deca g, o >Deca o, "O 2150 1,0 0 0 53, 83 32,58 10,5 3,5 47

Actividade farmacológica dos compostos de acordo com a invenção:

Exemplos Peso molecular médio Actividade Anti Xa Actividade UI/mg Anti lia 1 1950 283 < 0,2 2 2100 191 0 3 2000 252 0 4 2000 205 0 5 2100 209 0 6 2150 403 0

Percentagem em hexassacarideo Δ IIa-IIs_-Is dos compostos de acordo com a invenção:

Exemplos Percentagem de fracção hexassacarideo Percentagem de hexassacarideo Δ Ila-Ils-Is na fracção hexassacarideo 1 31% 46% 2 30% 26% 3 33% 33,5% 4 32% 30,8% 5 31,5% 28, 7% 6 53,8% 46%

Lisboa, 1 de Fevereiro de 2011 48

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Misturas de oligossacarídeos que possuem a estrutura geral dos polissacarídeos constituintes da heparina e apresentam as seguintes caracteristicas: um peso molecular médio de 1800 a 2400 Daltons, determinado por cromatografia liquida de alta pressão utilizando duas colunas em série, uma actividade anti-Xa compreendida entre 190 Ul/mg e 450 Ul/mg, determinada em relação a um padrão de heparina de peso molecular muito baixo com um título de 140 a 180 U/mg, uma actividade anti-lla inferior a 0,2 Ul/mg, determinada pelo método amidolítico num substrato cromogénico de acordo com o método descrito na monografia das heparinas de baixo peso molecular da farmacopeia europeia, entendendo-se que os oligossacarídeos constituintes das misturas contêm de 2 a 16 unidades sacarídicas, têm uma unidade ácido urónico-4,5 insaturado 2-0-sulfato numa das suas extremidades, 1 e contêm o hexassacarídeo da seguinte fórmula:

lis sob a forma de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso .
2. Misturas de oligossacarídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por os sais de metal alcalino ou alcalino-terroso serem os sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio.
3. Misturas de oligossacarídeos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por conterem de 20 a 100% e, em particular, de 30 a 60%, de fracção hexassacarídeo.
4. Misturas de oligossacarídeos de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas por a fracção hexassacarídeo conter de 20 a 70% e, em particular, de 25 a 50%, do hexassacarídeo AlIa-IIs^-Is, tal como definido na reivindicação 1. 2
5. Misturas de oligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas por terem um peso molecular médio compreendido entre 1900 e 2200 e, em particular, de 1950 a 2150 Daltons.
6. Misturas de oligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por terem uma actividade anti-Xa compreendida entre 190 Ul/mg e 410 Ul/mg e, em particular, entre 200 e 300 UI, apresentando em simultâneo, uma actividade anti-lia inferior a 0,2 ui/mg.
7. Misturas de oligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadas por apresentarem as seguintes características: um peso molecular médio compreendido entre 1950 a 2150 Daltons, uma actividade anti-Xa compreendida entre 190 Ul/mg e 410 Ul/mg e uma actividade anti-IIa inferior a 0,2 Ul/mg, contêm de 30 a 60% de fracção hexassacarídeo contendo de 25 a 55% de fracção AlIa-IIs-Is.
8. Processo de preparação das misturas de oligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por uma heparina de peso molecular muito baixo tendo: 3 uma actividade anti-Xa superior a 140 Ul/mg, determinada em relação a um padrão de heparina de peso molecular muito baixo com um titulo de 140 a 180 U/mg, uma actividade anti-IIa inferior a 5 Ul/mg, determinada pelo método amidolítico num substrato cromogénico de acordo com o método descrito na monografia das heparinas de baixo peso molecular da farmacopeia europeia, e um peso molecular médio compreendido entre 2000 e 3000 Daltons, determinado por cromatografia liquida de alta pressão utilizando duas colunas em série, ser submetida às seguintes reacções químicas: a) Trans-salificação por acção de cloreto de benzetónio para obter o heparinato de benzetónio, b) Esterificação do heparinato de benzetónio obtido por acção de cloreto de benzilo, e tratamento com uma solução alcoólica de acetato de sódio para obter o sal de sódio do éster benzílico da heparina de peso molecular muito baixo c) Trans-salificação do éster benzílico obtido e obtenção do sal de amónio quaternário, d) Despolimerização com uma base orgânica forte, de pka de um modo preferido superior a 20, de modo a obter uma heparina de peso molecular muito baixo despolimerizada, 4 e) Transformação do sal de amónio quaternário da heparina de peso molecular muito baixo despolimerizada em sal de sódio f) Saponificação dos ésteres residuais e, eventualmente, purificação.
9· Processo de preparação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a relação base forte/éster utilizada na etapa de polimerização d) estar compreendida entre 0,2 e 5 e, de um modo preferido, entre 0,6 e 2.
10. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por a etapa de despolimerização d) se realizar com um derivado de fosfazeno como base.
11. Processo de preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a O \—1 caracterizado por a etapa de despolimerização d) se realizar com teores em água inferiores a 0,3% quando se procede com 1 equivalente molar de base fosfazeno em relação ao sal de benzetónio do éster benzilico da heparina de peso molecular muito baixo.
12. Processo de preparação de acordo com qualquer uma das reivindicação 8 a 11, caracterizado por as bases da familia dos fosfazenos utilizadas na etapa de despolimerização d) serem, de um modo preferido, as de fórmula: 5

na qual os radicais Rx a R7, idênticos ou diferentes, representam radicais alquilo lineares, ramificados ou ciclicos contendo de 1 a 6 átomos de carbono podendo, se necessário, R3 e R4 formar, com o grupo -N-P-N- que os contém, um heterociclo de 6 ligações.
13. Processo de preparação de acordo com qualquer uma das reivindicação 8 a 12, caracterizado por a base da família de fosfazenos utilizada na etapa de despolimerização ser a 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-l,3,2-diaza-fosforina.
14. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a taxa de esterificação do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina na etapa b) estar compreendida entre 40 e 100% e, de um modo preferido, entre 70 e 90%.
15. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a transformação do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina de peso molecular muito baixo, tal como preparada de acordo com a etapa b) do processo de acordo com a reivindicação 8, em sal de sódio, ser realizada por tratamento do meio reaccional com uma solução alcoólica de acetato de sódio a 6 10% de acetato de sódio em metanol (peso/volume), a uma temperatura compreendida entre 15 e 25 °C.
16. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o equivalente em peso de acetato de sódio adicionado na etapa de esterificação b) ser 3 vezes superior à massa de sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina utilizada na reacção de despolimerização.
Processo de preparação de acordo com a reivindicação 8 , das misturas de oligossacarideos, caracterizado por o sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina de peso molecular muito baixo, obtido na etapa c) ser, de um modo preferido, o sal de benzetónio, de cetilpiridinio ou de cetiltrimetilamónio.
18. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a saponificação (de acordo com a etapa f) se realizar com um hidróxido de metal alcalino, tais como a soda, a potassa, o hidróxido de litio, em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 0 e 20 °C e, de um modo preferido, 0 e 10 °C.
19. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se utilizar 1 a 5 equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino e, mais particularmente, de 1 a 2 equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino. 7
20. Processo de preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 19, das misturas de oligossacarídeos, tais como descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, possuindo uma selectividade perante o factor Xa aumentada, caracterizado por se eliminar as fracções dissacarideos e tetrassacarídeos por cromatografia, nomeadamente, em colunas preenchidas com gel do tipo poliacrilamida agarose.
21. Processo de preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicação 8 a 20, das misturas de oligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se utilizar, a título de produto de partida, uma heparina de baixo peso molecular, ou uma heparina de peso molecular muito baixo (1500 a 3000 Da) tendo uma actividade anti-Xa compreendida entre 100 e 140 Ul/mg em vez da heparina de peso molecular muito baixo, tal como definida na reivindicação 8.
22. Processo de preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 20, das misturas de oligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se utilizar, a titulo de produto de partida, uma heparina de peso molecular muito baixo (1500 a 4000 Da) tendo uma actividade anti-Xa compreendida entre 100 e 140 Ul/mg em vez da heparina de peso molecular muito baixo, tal como definida na reivindicação 8.
23. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a heparina de baixo peso molecular ser seleccionada de entre Enoxaparina, Fraxiparina, Fragmin, 8 Innohep (ou Logiparin), Normiflo, Embolex (ou Sandoparin), Fluxum (ou Minidalton), Clivarin e Hibor.
24. Medicamento caracterizado por compreender uma mistura de oligossacarideos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
25. Medicamento de acordo com a reivindicação 24 para o tratamento ou prevenção de tromboses venosas e arteriais, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, angina instável, enfarte do miocárdio, isquemia cardíaca, doenças oclusivas das artérias periféricas e fibrilhação auricular, proliferação das células musculares lisas, aterosclerose e arteriosclerose, cancro por modulação da angiogénese e dos factores de crescimento, bem como dos distúrbios diabéticos, tais como as retinopatias e nefropatias diabéticas.
26. Composição farmacêutica contendo, pelo menos, um medicamento, tal como definido na reivindicação 24, e um ou vários excipientes ou veículos ou aditivos farmaceuticamente inertes.
27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada por consistir numa solução injectável por via subcutânea ou intravenosa.
28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada por consistir numa formulação por inalação para a via pulmonar. 9
29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, caracterizada por consistir numa formulação para a via oral. Lisboa, 1 de Fevereiro de 2011 10