RS20050934A

RS20050934A - Antitela specifična za sklerostin i metode za povećanje mineralizacije kostiju

Info

Publication number: RS20050934A
Application number: YUP-2005/0934A
Authority: RS
Inventors: David Winkler; John Latham; Jiye Shi
Original assignee: Celltech R. & D. Inc.,
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2004-06-15
Publication date: 2008-04-04
Also published as: US9011856B2; ZA200600388B; US20200231664A1; US20240209075A1; US20090117118A1; EP1636270B1; NO345763B1; US20050106683A1; NZ544618A; CN1835974A; ES2586401T3; CA2529623A1; US20130064829A1; AU2004262640A1; US11702468B2; US20110195453A1; AU2004262640B2; US20150191537A1; EA200600038A1; US7381409B2

Abstract

Obezbeđene su kompozicije i metode koje se odnose na antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujuće proteine. Ove metode i kompozicije odnose se na promenu mineralne gustine putem ometanja interakcije između TGF-beta vezujućeg proteina sklerostina i člana TGF-beta superfamilije, posebno morfogenog proteina kosti. Povećanje mineralne gustine kosti nalazi primenu u bolestima i stanjima u kojima je mala mineralna gustina glavna karakteristika, kao što je osteopenija, osteoporoza i frakture kostiju.

Description

ANTITELA SPECIFIČNA ZA SKLEROSTIN (SCLEROSTIN) I METODE ZA

POVEĆANJE MINERALIZACIJE KOSTIJU

TEHNIČKA OBLAST

Ovaj pronalazak odnosi se generalno na farmaceutske proizvode i metode i još specifičnije na metode i sklerostin (sclerostin)-zavisna antitela koja su pogodna za povećanje sadržaja minerala u kosti. Ovakve kompozicije i metode mogu se koristiti za tretiranje različitih stanja uključujući na primer, osteopeniju, osteoporozu, frakture i druge poremećaje u kojima je glavno obeležje bolesti niska gustina minerala kostiju.

ISTORIJAT PRONALASKA

Tokom života jedne individue dešavaju se dve ili tri različite faze promena mase kostiju( videtiRiggs,West J. Med.154:63-77 (1991). Prva faza se odigrava i kod muškaraca i kod žena i dešava se do postizanja maksimuma koštane mase. Prva faza se postiže kroz linearan rast endohondralne pločica za rast i radijalan rast usled stope periostealne apozicije. Druga faza počinje oko 30 godine za trabekularnu kost (ravne kosti kao što su pršljenovi i pelvis tj. karlična kost) i oko 40. godine za kortikalne kosti (na primer, duge

kosti koje se nalaze u udovima) i nastavlja se do starosti. Ovu fazu karakteriše spori gubitak kostiju i odigrava se i kod muškaraca i kod žena. Kod žena se takođe odigrava i treća faza gubitka kostiju najverovatnije usled nedostatka estrogena u postmenopauzi. Samo tokom ove faze žene mogu izgubiti dodatnih 10% od koštane mase kortikalne kosti i 25% od trabekularnih prostora( videtiRiggs, gore pomenuto).

Gubitak mineralnog sadržaja kostiju biti uzrokovan različitim stanjima i može rezultovati u značajnim medicinskim problemima. Na primer, osteoporoza je oslabljujuća bolest kod ljudi i karakteriše je značajno smanjenje mase skeletnih mišića i mineralne gustine, strukturno razaranje kostiju, uključujući degradaciju mikroarhitekture kostiju i odgovarajuće povećanje lomljivosti kostiju i suspektnost na frakturu kod obolelih osoba. Osteoporozi kod ljudi prethodi klinička osteopenija (mineralna gustina kosti koja je veća od standardne devijacije, ali je manja nego 2.5 standardne devijacije ispod srednje vrednosti za kost mladog adulta)), stanje koje se javlja kod otprilike 25 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama. Dodatno 6-7 miliona pacijenata u Sjedinjenim Američkim Državama je dijagnostifikovano sa kliničkom osteoporozom (definisana kao sadržaj minerala u kosti koji je 2.5 standardne devijacije ispod one za zrelu kost mladog adulta). Osteoporoza je jedna od najskupljih bolesti za zdravstveni sistem i košta nekoliko desetina milijardi dolara godišnje u Sjedinjenim Američkim Državama. Pored troškova vezanih za zdravstveni sistem, dugotrajna kućna nega i gubitak radnih dana takođe doprinose finansijskim i socijalnim troškovima vezanim za ovu bolest. Širom sveta, oko 75 miliona ljudi nosi rizik za razvijanje osteoporoze.

Frekvenca osteoporoze u ljudskoj populaciji povećava se sa godinama. Među belcima, osteoporoza je pređominantna kod žena koje u Sjedinjenim Američkim Državama sačinjavaju 80% u grupi koja predstavlja pacijente sa osteoporozom. Povećana fragilnost i suspektnost na frakturu skeletne kosti kod starijih je pogoršana sa povećanim rizikom od slučajnih padova u ovoj populaciji. Više od 1.5 miliona fraktura kostiju povezanih sa osteoporozom prijavi se svake godine u Sjedinjenim Američkim Državama. Frakture kukova, zglobova i kičme među najčešćim su povredama povezanim sa osteoporozom. Frakture kuka su posebno nezgodne i skupe za pacijenta i za žene su u korelaciji sa visokim stopama mortaliteta i morbiditeta.

Iako se osteoporoza smatra kao povećanje rizika frakture usled smanjenja koštane mase, nijedan od trenutno dostupnih tretmana za poremećaje skeleta ne može da u značajnoj meri poveća gustinu kostiju kod adulta. Jako zapažanje među stručnjacima je da su neophodni lekovi koji bi mogli da povećaju gustinu kostiju kod adulta koji su rizični za osteopeniju i osteoporozu, posebno kostiju zglobova i kičmenog stuba.

Sadašnje strategije za prevenciju osteoporoze pojedincima mogu ponuditi neke pogodnosti ali ne mogu obezbediti rešenje za bolest. Strategije uključuju umeravanje fizičke aktivnosti sa početkom poznih godina (posebno aktivnosti pri kojima se nosi teret), obezbeđivanje adekvatnog nivoa kalcij uma u ishrani i izbegavanju konzumiranja proizvoda koji sadrže alkohol ili duvan. Za pacijente sa kliničkom osteopenijom ili osteoporozom, sadašnji terapeutski lekovi i strategije koji preovladavaju su usmerene ka redukciji daljeg gubitka koštane mase putem inhibicije procesa absorbcije kostiju, prirodnog aspekta procesa ponovnog oblikovanja kostiju koji se konstitutivno odigrava.

Na primer, estrogen se sada prepisuje da bi se usporio gubitak kostiju. Međutim, postoje neke kontraverzije o tome da li pacijenti imaju dugoročne koristi i da li estrogen ima bilo kakav efekat na pacijente preko 75 godina starosti. Takođe, veruje se da upotreba estrogena povećava rizik od raka dojke i edometrijuma. Kalcitonin, osteokalcin sa vitaminom K ili visoke doze kalcijuma u ishrani, sa ili bez vitamina D, takođe su predloženi za žene u post menopauzi. Visoke doze kalcijuma međutim, mogu da daju neprijatne gastrointestinalne sporedne pojave i zato se moraju konstantno nadgledati koncentracije kalcijuma u serumu i urinu (na primer, Khosla and Rigss,Mayo Clin. Proc.70:978-982, 1995).

Drugi terapeutski pristupi osteoporozi uključuju bisfosfonate (na primer, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronate, neridinate, skelid, bonefos), paratireoidni hormon, kalcilitike, calcimimetike (na primer, cinakalcet), statine, anaboličke steroide, soli lantanuma i stroncijuma i natrij um fluorid. Ovakvi terapeutici, međutim, često su povezani sa neželjenim propratnim efektima (na primer, kalcitonin i steroidi mogu prouzrokovati mučninu i izazvati imunorekciju, b izofosfonati i natrij um fluorid mogu sprečiti zarašćivanje preloma, iako se gustina kostiju umereno povećava) koji mogu mogu da spreče njihovu efikasnu upotrebu( videtiKhosla and Rigss, već navedeni).

Ni jedna od trenutno praktikovanih terapeutskih strategija za tretiranje stanja povezanih sa prekomernom ili nedovoljnom mineralizacijom, kao što je osteoporoza ili drugi poremećaji koje karakteriše gubitak mineralizacije kostiju, uključuje lek koji menja koštanu masu (odnosno povećava ili smanjuje na statistički značajan način). Posebno, nijedna trenutna strategija terapeutski ne stimuliše ili povećava rast nove koštane mase. Ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije i metode koji se mogu koristiti za povećavanje mineralizacije kostiju i koji se zato mogu koristiti za tretiranje različitih stanja u kojima je poželjno povećanje koštane mase. Ovaj pronalazak takođe pruža i druge srodne prednosti.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

Ukratko, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein, sklerostin (SOST) i obezbeđuje imunogene koji obuhvataju SOST peptide izvedene iz regiona SOST koji interaguje sa članom TGF-beta superfamilije, kao što je morfogeni protein kosti. U jednom ostvarenju pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se vezuje specifično za SOST polipeptid, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvenci prikazanu u GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79), i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tip II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82). U posebnom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, vezuje se specifično za polipetid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2-6, 12-15, 21. 22. 25, 26, 47, 48, 49 ili 50, i u drugom posebnom ostvarenju antitelo se specifično vezuje za polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5, 6 ili 14.

U jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinske sekvence od SEQ ID NO: 2-19, 21-28 ili 47-50, naznačeno time da se antitelo specifično vezuje za SOST polipeptid za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid (prikazan u bilo kojoj sekvenci GenBank koja je ovde obezbeđena), i naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa II BMP je sposobno da se veže za BMP tip II receptorski polipeptid (prikazan u bilo kojoj sekvenci GenBank koja je ovde obezbeđena). U određenim poželjnim ostvarenjima, antitelo se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinske sekvence od SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 ili 18.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se vezuje specifično za SOST polipeptid i koji oslabljuje formiranje SOST homodimera, naznačeno time da SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68 i naznačeno time da se antitelo vezuje za polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 29-31, 33-36, 41-43 ili 51-54.

U drugom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinske sekvence od SEQ ID NO:29-46, 51, 52, 53 ili 54, naznačeno time da se antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena vezuje specifično za SOST polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, i naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera.

U određenom posebnom ostvarenju pronalaska, antitelo je poliklonalno antitelo. U drugom ostvarenju, antitelo je monoklonalno antitelo, koje je mišije, humano, pacovsko ili od hrčka antitelo. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje hibridoma ćeliju ili domaćinsku ćeliju koja je sposobna da proizvodi monoklonalno antitelo. U drugom ostvarenju pronalaska, antitelo je humanizovano antitelo ili himerno antitelo. Pronalazak dalje obezbeđuje domaćinsku ćeliju koja proizvodi humanizovano ili himerno antitelo. U određenim ostvarenjima fragment antitela za vezivanje antigena je F(ab')2, Fab', Fab, Fd ili Fv fragment. Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo koje je jednolančano antitelo i obezbeđuje domaćinsku ćeliju koja je sposobna da eksprimira jednolančano antitelo. U drugom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži takvo antitelo i fiziološki prihvatljiv nosač.

Pronalazak obezbeđuje imunogen koji obuhvata peptid koji sadrži 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, gde SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. 20, 58, 60, 62 ili 68, i naznačeno time da je peptid sposoban da u ne-humanoj životinji izazove antitelo koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid, naznačeno time da naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. NM 004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tip II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM 001204 (SEQ ID NO:82).

U drugom ostvarenju, imunogen sadrži peptid koji obuhvata najmanje 21 uzastopnu amino kiselinu i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove stvaranje antitela u ne-humanoj životinji koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koji kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid (prikazan u bilo kojoj sekvenci GenBank koja je ovde obezbeđena), i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tip II receptorski polipeptid (prikazan u bilo kojoj sekvenci GenBank koja je ovde obezbeđena).

U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje imunogen, koji sadrži peptid od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinske sekvence od SEQ ID NO: 2-19, 21-28, 47, 48, 49 ili 50, naznačeno time daje peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinjise antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji sadrži amino kiselinksu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82). U određenom ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje imunogen koji sadrži peptid od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinske sekvence od SEQ IDNO:5, 6, 10, 11, 14 ili 18.

Pronalazak takođe obezbeđuje imunogen koji sadrži peptid od najmanje 20 aminokiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NOs:29-46, 51, 52, 53 ili 54, naznačeno time daje peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68 i naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera. U drugom ostvarenju, imunogen obuhvata peptid koji sadrži 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, naznačeno time da SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koje oslabljuje formiranje SOST homodimera. U određenim ostvarenjima pronalazak obezbeđuje imunogen koji sadrži peptid koji sadrži najmanje 21 uzastopnu amino kiselinu i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, pomenuti polipeptid sadrži SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68 i naznačeno time da je peptid sposoban da u ne-humanoj životinji izazove stvaranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.

U određenim posebnim ostvarenjima, imunogeni koji su tema ovog pronalaska povezani su sa molekulom nosačem. U određenim ostvarenjima molekul nosač je polipeptidni nosač, i u određenom ostvarenju, polipeptidni nosač je hemocijanin iz kapičastog puža( Fissurelidae).

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metodu za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom koji sadrži peptid od 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih aminokiselina i ne više od 50 uzastopnih aminokiselina SOST polipeptida koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, koji je sposoban da u ne-humanoj životinji izazove stvaranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP); i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid, naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79), i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tip II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82). U drugom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom koji sadrži peptid od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje obuhvataju amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:2-19, 21-28, 47, 48, 49, ili 50, naznačeno time daje peptid sposoban da u ne-humanoj životinji izazove stvaranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP); i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa I BMP sposobno da se veže za BMP tip I receptorski polipeptid. U posebnom ostvarenju, imunogen obuhvata peptid od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje obuhvataju amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 ili 18.

U drugim poželjnim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom koji sadrži peptid od 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih amino kiselina ili najmanje 21 i ne više od 50 uzastopnih aminokiselina SOST polipeptida koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, koji je sposoban da u ne-humanoj životinji izazove stvaranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje je sposobno da oslabi formiranje SOST homodimera. U drugom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom koji sadrži najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrže amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 29-46, 51, 52, 53 ili 54, naznačeno time da je peptid sposoban da u ne-humanoj životinji izazove stvaranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje je sposobno da oslabljuje formiranje SOST homodimera.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metodu za identifikaciju antitela koje moduliše TGF-beta signalni put koja obuhvata kontaktiranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji ima sekvencu prikazanu u bilo koji od SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, sa najmanje jednim SOST peptidom koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2-19 ili 21-54, u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i detektovanje nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid i tako detektovanje prisustva antitela koje moduliše TGF-beta signalni put. U drugom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za identifikaciju antitela koje oslabljuje vezivanje BMP za SOST polipeptid, koje se sastoji od kontaktiranja (i) antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji obuhvata sekvencu prikazanu u bilo koji od SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, ili (ii) najmanje jedan SOST peptid koji obuhvata sekvencu od SEQ ID NO: 2-19 ili 21-28, ili 47-50, u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i detektovanje nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid, i tako detektovanje prisustva antitela koje oslabljuje vezivanje BMP za SOST polipeptid. U posebnom ostvarenju metode za identifikaciju antitela koje moduliše TGF-beta signalni put i za identifikaciju antitela koje oslabljuje vezivanje BMP za SOST polipeptid, SOST peptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 6, 10, 11,14 ili 18.

U drugom ostvarenju pronalazak obezbeđuje metodu za identifikaciju antitela koja oslabljuju formiranje SOST homodimera, koje se sastoji od kontaktiranja (i) antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu

prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, sa (ii) najmanje jednim SOST peptidom koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29-46 ili 51-54 u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i detektovanje nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid, i tako detektovanje prisustva antitela koje oslabljuju formiranje SOST homodimera.

U drugom ostvarenju pronalazak obezbeđuje metodu za identifikaciju antitela koja povećava mineralni sadržaj kosti, koja obuhvata kontaktiranje (i) antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68 sa (ii) najmanje jednim SOST peptidom koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29-46 ili 51-54 u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i detektovanje nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid i time detektovanje prisustva antitela koje povećava mineralni sadržaj kosti. U posebnom ostvarenju, peptid sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, 6, 10, 11, 14 ili 18.

U određenim posebnim ostvarenjima za identifikaciju antitela koje moduliše TGF-beta signalni put, za identifikovanje antitela koje oslabljuje vezivanje BMP za SOST polipeptid, za identifikaciju antitela koje oslabljuje formiranje SOST homodimera ili za identifikovanje antitela koje povećava mineralni sadržaj kosti, antitelo je prisutno biološkom uzorku ili je antitelo prečišćeno antitelo. U određenim ostvarenjima prečišćeno antitelo je poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo ili fragment bilo kog od ovih antitela za vezivanje antigena.

Ova i sva druga ostvarenja ovog pronalaska postaće očigledna nakon upućivanja reference na detaljan opis i priložene crteže. Sve reference koje su otkrivene su ovde ugrađene referencama u svojoj potpunosti kao što je i svaka pojedinačno.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1 predstavlja upoređivanje (ravnanjem-alignment) regiona koji sadrže karakteristični cisteinski-čvor u SOST polipeptidu sa njegovim najbližim homolozima. Tri disulfidne veze koje formiraju cisteinski-čvor su ilustrovane neisprekidanom linijom. Ekstra disulfidna veza, prikazana isprekidanom linijom, je jedinstvena za ovu familiju, koja povezuje dva vrha (3-šnale u 3D strukturi. Polipeptidi koji su prikazani su SOST: skleroztin (SEQ ID NO:95); CGHB: Humani hronični gonadotropin p (SEQ ID NO:96); FSHB: beta subjedinica hormona koji stimuliše folikul (SEQ ID NO:97); TSHB prekursor beta lanca tirotropina (SEQ ID NO:98); VWF: Von Willebrand faktor (SEQ ID NO:99); MUC2: prekursor humanog mucina 2 (SEQ ID NO: 100); CERI: Cerebrus 1(homolog Xenopus laevis)(SEQ ID NO:101); DRM: "gremlin" (SEQ ID NO: 102); DAN: (SEQ ID NO: 103); CTGF: prekursor faktora rasta vezivnog tkiva (SEQ ID NO: 104); NOV: NovH (prekomerno eksprimirani gen za proteinski homolog nefroblastoma (SEQ ID NO: 105); CYR6: (SEQ ID NO: 106);

Slika 2 ilustruje 3D model regiona srži SOST (SOST srž).

Slika 3 predstavlja 3D model regiona srži SOST homodimera.

Slika 4A i B obezbeđuje poređenje amino kiselinskih sekvenci Noggin iz pet različitih životinja: čoveka (NOGG HUMAN, SEQ ID NO: 107); kokoške (NOGG_CHICK, SEQ ID NO: 108); Afričke "clawed" žabe (NOGG_XENLA, SEQ ID NO: 109); NOGG FUGRU, SEQ ID NO:l 10); i Zebra ribice (NOGG ZEBRA, SEQ ID NO:l 11); i SOST čoveka (SOST_HUMAN, SEQ ID NO:l), pacova (SOST_RAT, SEQ ID NO:20); i miša (SOST Mouse, SEQ ID NO:l 12).

Slika 5 prikazuje strukturu kompleksa Noggin/BMP-7. BMP homodimer je prikazan na donjem delu slike u površinskom modelu. Noggin homodimer je prikazan na vrhu BMP dimera u nacrtanom modusu. Kružići ističu N-terminalni vezujući region, region srži i vezujući deo (linker) između N-kraja i regiona srži.

Slika 6 pokazuje 3D model potencijalnog fragmenta za vezivanje BMP koji je lociran na N-terminalnom regionu SOST. BMP dimer je prikazan u površinskom modusu i potencijalni BMP-vezujući fragment je prikazan u modusu štapa. Fenilalaninski ostatak koji se uklapa u hidrofobni džep na BMP je takođe obeležen.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za SOST polipeptid i metode za upotrebu ovakvih antitela. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje SOST polipeptidne imunogene koji se mogu koristiti za dobijanje i analizu ovih antitela. Antitela mogu biti korisna u blokiranju ili oslabljuju vezivanja SOST polipeptida, koji

je TGF-beta vezujući protein, za ligand, posebno za morfogeni protein kosti i mogu takođe da blokiraju ili oslabljuju vezivanja SOST polipeptida za jedan ili više drugih liganda.

Pronalazak se odnosi delimično na iznenađujuće otkriće, u okviru polipeptidne sekvence sklerostina, specifičnih kratkih polipeptidnih sekvenci koje specifično prepoznaju anti-sklerostin antitela koja su sposobna da kompetitivno inhibiraju vezivanje sklerozitskih polipeptida za BMP, pri čemu se ovakvo sklerostin-BMP vezivanje u drugom slučaju odigrava preko mesta za vezivanje receptora tipa I BMP i/ili preko mesta za vezivanje receptora tipa II BMP. Molekul kao što je antitelo koje inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za jedan ili više članova TGF-beta familije proteina, uključujući na primer molekul koji omogućava aktivaciju člana TGF-

beta familije ili BMP ili omogućava vezivanje članova TGF-beta familije uključujući jednog ili više BMP za njihove odgovarajuće receptore uklanjanjem ili sprečavanjem člana TGF-beta da se veže za TGF-vezujući protein.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje peptide i polipeptide imunogene koji, neočekivano,

mogu da se koriste za dobij anje i/ili identifikaciju antitela ili njihovih fragmenata koja su sposobna da inhibiraju, sprečavaju ili oslabljuju (na primer, statistički značajno snižavanje) vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina SOST za jedan ili više BMP. Primeri peptidnih imunogena mogu da sadrže 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20-25, 21-50, 26-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70 ili 71-75 uzatopnih amino kiselina sklerostin polipeptida kao što je ovde obezbeđeno (ili njihove varijante), takvi peptidi sadrže, na primer, amino

kiselinske sekvence, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2-19, 21-53 i 54. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje peptide i polipeptide imunogene koji mogu da se koriste za dobijanje i/ili identifikaciju antitela ili njihovih fragmenata koja su sposobna da inhibiraju, sprečavaju ili oslabljuju formiranje SOST homodimera. Antitela iz ovog pronalaska su korisna za povećavanje mineralnog sadržaja i mineralne gustine kosti i tako poboljšavaju mnogobrojna stanja koja rezultiraju u gubitku mineralnog sadržaja, uključujući na primer, bolest, genetsku predispoziciju, nezgode koje rezultiraju u gubitku upotrebe kosti (na primer, usled frakture), terapeutike koji imaju uticaj na resorbciju kosti ili koji ubijaju ćelije koje formiraju kost i normalno starenje.

Sklerosteozis

Sklerosteozis je bolest koja se odnosi na nenormalnu mineralnu gustinu kosti kod ljudi. Sklerosteozis je izraz koji je primenio Hansen (Hansen, H. G.,Sklerosteoseu: Opitzet.

al,eds. Hanbuch der Kinderheilkunde, (Berlin: Springer 1967) 351-355) za poremećaj sličan van Buchem-ovoj hiperosteozi "coricalis generalisata" ali se verovatno razlikuje po radiološkom izgledu promena kostiju i po prisustvu asimetrične kutanozne sindaktilije kažiprsta i srednjeg prsta u mnogim slučajevima. Za sklerosteozis se danas zna da je autozomalni polu dominantni poremećaj koga karakteriše široko rasprostranjene sklerotske lezije kosti kod adulta. Ovo stanje je progresivno. Sklerosteozis takođe ima i razvojni aspekt koji je povezan sa sindaktilijom (dva ili više

prsta srasla zajedno). Sklerosteozis Sindrom je povezan sa velikom saturom i mnoge obolele osobe dostižu visinu od šest fita ili više. Dodatno, vilica osobe sa ovim obolenjem može bit 1 do 6 puta veća nego kod normalne individue i mineralna gustina kostiju može biti 1 do 4 puta iznad normalnih vrednosti (na primer, u poređenju sa blizancem koji nije zahvaćen bolešću).

Sklerosteozis Sindrom se javlja primarno kod Afrikanaca (Afrikaaners) Holanđana koji su potomci osoba iz Južne Afrike. Otprilike 1 na 140 osoba u Afričkoj populaciji je nosilac mutiranog gena (heterozigot). Mutacija pokazuje 100% penetrabilnost. Anegdotski izveštaji ukazuju na povećanu mineralnu gustrinu kostiju koja je primećena kod hetrerozigota ali oni nemaju nikakve druge povezane patologije (na primer, sindaktiliju ili prekomerno veliku lobanju).

Kod pacijenata sa sklerosteozom nije zabeležena nikakva nenormalnost na hipofizno-hipotalamusnoj osi. Posebno, kod obolelih osoba ne odigrava se prekomerna proizvodnja hormona rasta i kortizona i nivoi seksualnih hormona su normalni. Markeri preokreta kosti (kao alkalna fosfataza specifična za osteoblaste, osteokalcin, prokolagen C propeptid tipa 1 (PICP) i ukupna alkalna fosfataza( videtiComier,Curr. Opin. In Rheu.7:243 (1995) ukazuje na to da je hiperosteoblastična aktivnost povezana sa bolešću ali se zapaža normalna do slabo smanjena aktivnost osteoklasta kada se meri markerima resorbcije kosti (piridinolin, deoksipiridinolin, N-telopeptid, urinarni hidroksiprolin, tartarat-rezistentna kisela fosfataza plazme i galaktozil hidroksilin plazme( videtiComier, već naveden)).

Sklerosteozis karakteriše kontinualna taloženje kosti u skeletu tokom života obolelih osoba. Kod homozigota kontinualna deposition minerala kosti dovodi do prekomernog rasta kosti u delovima skeleta gde ne postoje mehanoreceptori (na primer, lobanja, vilica, kranijum). Kod homozigota sa sklerosteozisom prekomerni rast kostiju lobanje dovodi do kranijalnoe kompresije i na kraju do smrti usled prekomernog hidrostatičkog pritiska na moždano stablo. Generalizovana i difuzna sklerosteozis se detektuje u svim drugim delovima skeleta. Kortikalne površine dugih kostiju su veoma zadebljane što dovodi do značajnog povećanja jačine kosti. Trabekularne veze su povećane u debljinu, što zauzvrat povećava jačinu trabekularne kosti. Sklerotične kosti izgledaju najčešće tamnim na X-zracima.

Lokalizovana je retka genetska mutacija koja je odgovorna za Sklerosteozis Sindrom i to u regionu humanog hromozoma 17. Gen u okviru ovog regiona kodira novog člana TGF-beta familije vezujućih proteina( videti,na primer, U.S. Patent Nos. 6,395,511, 6,489,445 i 6,495,736; Brunkow et. al.,Am. Hum. Genet.68:577-89 (2001)). Terapeutici povezani sa promenom ili modulisanjem nivoa sklerostina mogu tako biti korisni u tretiranju stanja i bolesti koja su povezana sa nenormalnim razvojem kosti ili propadanjem. Kao što je detaljnije opisano dalje u tesktu, antitela koja se specifično vezuju za ovaj TGF-beta vezujući protein, sklerostin (takođe ovde se navodi kao Beer ili SOST), mogu se koristiti za povećanje mineralnog sadržaja i tako u tretiranju, sprečavanju, usporavanje progresije ili poboljšavanje simptoma brojnih bolesti.

TGF- beta superfamilija

Među značajnim molekulima na koje se ovde upućuje uključenje bilo koji poznati ili novi član superfamilije Transformišućih faktora rasta beta (TGF-beta) koja uključuje morfogeni protein kosti (BMP). Takođe u TGF-beta superfamiliju su uključeni TGF-beta receptori, koje bi trebalo shvatiti kao jedan ili više receptora koji su specifični za određeni član TGF-beta superfamilije (uključujući BMP-ove) i TGF-beta vezujuće proteine, koje bi trebalo shvatiti da se odnose na jedan ili više polipeptida sa specifičnim afinitetom vezivanja za određenog člana ili grupu članova TGF-beta superfamilije (uključuući BMP-ove). Specifični primer TGF-beta vezujućeg proteina uključuje sklerostin ili SOST. Polinukleotidne sekvence koje kodiraju SOST i SOST varijante u različitim životinjama, uključujući ljude, ovde su obezbeđeni u SEQ ID Nos: 55, 56, 57, 59, 61, 63, 65 i 67 i 69 (kodirane polipeptidne sekvence obezbeđene su ovde u SEQ ID Nos: 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 i 70, respektivno).( Videti,na primer U.S. Patent Nos. 6,395,511, 6,489,445 i 6,495,736.Videti,takođe, na primer, Balemans et. al, 2002Dev. Biol.250:231, Schmitt et al, 1999J. Orthopaed. Res.17:269; Khalil, 1999.Microbes Infect.1:1255; Mivazono et al., 1993Growth Factors8:11, von Bubnoff et al., 2001Dev. Biol.239:1; Koli et al., 2001Microsc. Res. Tech.52:354; Ebara et al., 2002Spim27(16 Suppl. 1):S10; Bondestam, 2002,Ligands & Signaling Components of the Transforming Growth Factor ( 3 Family,Helsinki Universitv Biomedical Dissertation No. 17).

TGF-beta superfamilija sadrži različite faktore rasta koji dele zajedničke sekvencne elemente i strukturne motive i na sekundarnom i na tercijarnom nivou. Ova proteinska familija pokazuje širok spektar bioloških odgovora koji utiču na veliki broj različitih tipova ćelija. Mnogi članovi TGF-beta familije imaju važne funkcije u formiranju obrasca i tkivne specifikacije tokom embrionalnog razvića. Kod adulta članovi TGF-beta familija učestvuju na primer u procesu zarastanja rane, popravci kostiju i remodelovanju kostiju i u modulaciji imunog sistema. Pored TGF-beta polipeptida, superfamilija uključuje BMP-ove, aktivine, inhibine, faktore rasta i diferencijacije (GDF) i neutrofične faktore izvedene iz glije (GDNF). Primarna klasifikacija je zasnovana na opštim osobinama sekvenci koje pohranjuju specifični protein u opštu podfamiliju. Dodatna stratifikacija u okviru podfamilije moguća je na osnovu striktnije konzerviranosti sekvence kod članova manjih grupa. U određenim slučajevima, kao što su BMP-5, BMP-6 i BMP-7, procenat identičnosti amino kiselina može biti visok čak i do 75% među članovima manje grupe. Ovaj nivo identičnosti omogućava da jedna reprezentativna sekvenca ilustruje ključne biohemijske elemente pod-grupe koja ih odvaja od drugih članova veće familije.

Kristalna struktura TGF-beta2 je određena. Opšta savijenost TGF-beta 2 monomera sadrži stabilne, kompaktne, cisteinu slične, čvoru slične strukture formirane sa tri disulfidna mosta. Dimerizacija koja je stabilizovana jednim disulfidnim mostom je antiparalelna.

Članovi TGF-beta familije signalizuju putem indukcije stvaranja hetero-oligomernih receptorskih kompleksa. Transdukcija TGF-beta signala uključuje dve različite podfamilije transmembranskih serin/treonin kinaznih receptora, tipa I i tipa II. Najmanje sedam receptora tipa I i pet receptora tipa II je identifikovano (videti Kavvabata et al.,Cytokine Growth Factor Rev.9:49-61 (1998); Mivazono et al.,Adv. Immunol.75:115-57 (2000). Svaki član TGF-beta familije vezuje se za karakterističnu kombinaciju

receptora tipa I i tipa II i oba su neophodna za signalizaciju. U sadašnjem modelu aktivacije TGF-beta receptora, TGF-beta ligand se prvo vezuje za receptor tipa II (TbR-II), koji zatim regrutuje receptor tipa I (TbR-I) da bi se formirao ligand/tip I/tipII tercijarni kompleks. Receptor tipa I ne može da se veže za ligand u odsustvu TbR-II. TbR-II zatim fosforiliše TbR-I predominantno u domenu koji je bogat glicinskim i serinskim ostacima (GS domen) u bliskom membranskom regionu, i tako aktivira TbR-I. Aktiviran receptor I kinaze zatim fosforiliše određene članove Smad familije proteina koji se premeštaju u jedro gde modulišu transkripciju specifičnih gena.

Morfogeni proteini kosti ( bone morphogenic proteins, BMP) :

ključni regulatorni proteini mineralne gustine kosti

Glavni napredak u razumevanju procesa formiranja kosti bila je identifikacija BMP-ova, takođe poznatih kao osteogeni proteini (OP) koji regulišuin vivodiferencijaciju hrskavice i kostiju. BMP/OP indukuju diferencijaciju endohodralne kosti preko kaskade događaja u kojima se mezenhimalne stem ćelije diferenciraju u hondrocite koje leže na hrskavičavoj strukturi koja se resorbuje i biva zamenjena sa koštanim tkivom (videti Balemans et al., Dev. Biol. 250:231-50 (2002)). Zato ovaj proces uključuje formiranje hrskavice, hipertrofiju i kalcifikaciju hrskavice, vaskularnu invaziju, diferencijaciju osteoblasta i formiranje kosti. Kao što je ovde opisano, BMP/OP-ovi (BMP-2-14, i osteogeni protein 1 i -2, OP-1 i OP-2),( videti,na primer, GenBank P12643 (BMP-2); GenBank P12645 (BMP3); GenBank P55107 (BMP-3b, 10 (GDF-10); GenBank P12644 (BMP4); GenBank P22003 (BMP5); GenBank P22004 (BMP6); GenBank P18075 (BMP7); GenBank P34820 (BMP8); GenBank Q9UK05 (BMP9); GenBank 095393 (BM10); GenBank 095390 (BM11, prekursor faktora 11 rasta/diferencijacije (GDF-11)); GenBank 095972 (BM15)) su članovi TGF-beta superfamilije. Zapanjujuća evolutivna konzerviranost među članovima BMP/OP pod familije navodi na to da su oni važni za normalni razvoj i funkcionisanje životinja. Pored postfetalne hondrogeneze i osteogeneze, BMP/OP imaju višestruke uloge u skeletogenezi, uključujući razvoj kraniofacijalnog i dentalnog tkiva. Različiti članovi BMP familije takođe imaju biološke aktivnosti u različitim drugim tipovima ćelija, uključujući monocite, epitelijalne ćelije, mezenhimalne ćelije i nervne ćelije. BMP regulišu ćelijsku proliferaciju i diferencijaciju, hemotaksiju i apoptozu i takođe kontrolišu fundamentalne procese, na primer levu-desnu asimetriju, neurogenezu, obrasca mezoderma i razvoj embriona i organogenezu brojnih organa uključujući bubreg, creva, pluća, zube, udove, amnion i testise (videti Balemans, već navedeno).

BMP-ovi se sintetišu kao veliki prekursorni proteini. Nakon dimerizacije, BMP se proteolitički seku u ćeliji i dobijaju se karboksi-terminalni zreli proteini koji se zatim sekretuju iz ćelije. BMP kao i drugi čalnovi TGF-beta familije, iniciraju signalnu transdukciju vezivanjem kooperativno i za tip I i tip II serin/treonin kinazne receptore. Receptori tipa I za koje BMP mogu da deluju kao Ugandi uključuju BMPR-IA (takođe poznat kao ALK-3), BMPR-IB (takođe poznat kao ALK-6), ALK-1 i ALK-2 (takođe poznat kao ActR-I). Od receptora tipa II, BMP-ovi se vezuju za receptor tipa II BMP-a (BMPR-II), aktivin tipa II (ActR-II) i aktivin tipa IIB (ActR-IIB).( VidetiBalemans et. al., već navedeni, i reference citirane ovde). Polunukleotidne sekvence i kodirane amine kiselinske sekvence polipeptida receptora tipa I BMP obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank, na primer, GeneBank NM 004329 (SEQ ID NO:71 kodiran sa SEQ ID NO:85); D89675 (SEQ ID NO:72 kodiran sa SEQ ID NO:86); NM 001203 (SEQ ID NO:73 kodiran sa SEQ ID NO:87); S75359 (SEQ ID NO:74 kodiran sa SEQ ID NO:88); NM 030849 (SEQ ID NO:75 kodiran sa SEQ ID NO:89); D38082 (SEQ ID NO:76 kodiran sa SEQ ID NO:90). Druge polipeptidne sekvence receptora tipa I obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank i uključuju na primer, NP 001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79). Polinukleotidne sekvence i kodirane amino kiselinske sekvence polipeptida receptora tipa II obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank i uključuju na primer, U25110 (SEQ IDNO:80 kodiran sa SEQ IDNO:91); NM 033346 (SEQ ID NO:81 kodiran sa SEQ ID NO:92); NM_001204 (SEQ ID NO:82 kodiran sa SEQ ID NO:93); Z48923 (SEQ ID NO:83 kodiran sa SEQ ID NO:94). Dodatne polipeptidne sekvence receptora tipa I obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank, na primer CAA88759 (SEQ ID NO:84).

BMP-ovi, slično kao i drugi cistein-čvor proteini formiraju homodimernu strukturu (Scheufler et. al.,J. Mol. Biol.287:103-15 (1999)). Na osnovu analize evolutivnog traganja (evolutionarv trače) koja je sprovedena na BMP/TGF-P familiji, vezujuće mesto receptor tipa I BMP i vezujuće mesto receptor tipa II su mapirani na površini BMP strukture (Innis et al.,Protein Eng.13:839-47 (2000)). Lokacija vezujućeg mesta receptora tipa I BMP-a je kasnije potvrđena pomoću X-zraka sa BMP-2/BMP receptor IA kompleksom (Nickel et. al.,J. Joint Surg. Am.83A(Suppl l(Pt 1)):S7-S14 (2001)). Predloženo vezujuće mesto receptora tipa II je u skladu sa strukturom dobijenom X-zracima TGF-p3/TGF-p receptora tipa II kompleksa (Hart et al.,Nat. Struct. Biol.9:203-208 (2002)), koji je veoma sličan sa BMP/BMP receptorskim sistemom tipa IIA.

BMP i aktivinske podfamilije su podložne značajnoj post-translacionoj regulaciji od strane TGF-beta proteina. Postoji složen ekstracelularni kontrolni sistem, gde se sintetiše antagonist sa visokim afinitetom i zatim se eksportuje, nakon čega selektivno formira kompleks sa BMP-ovima ili aktivinima da bi poremetio njihovu biološku ulogu (Smith,Trends Genet.15:3-6 (1999)). Identifikovanje veliki broj ovakvih TGF-beta vezujućih proteina i na osnovu divergencije sekvenci izgleda da su antagonisti nezavisno evoluirali jer im nedostaje konzerviranost primarne sekvence. Kod kičmenjaka, antagonisti uključuju "noggin," hordin, sličan hordinu, folistatin, FSRP, DAN/Cerberus proteinsku familiju i sklerostin (SOST)( videtiBalemans et. al., već naveden i reference citirane ovde). Mehanizam antagonizma izgleda da se razlikuje za različite antagoniste (Lemura et al, (1998)Proc. Natl. Acad. Sci USA95:9337-9342).

Vezujuća mesta receptora tipa I i II na BMP antagonist "noggin" takođe su mapirana. Noggin se vezuje za BMP-ovima sa visokim afinitetom (Zimmerman et al., 1996). Studija noggin/BMP-7 kompleksne strukture otkrila je povezujuće interakcije između dva proteina (Groppe et al.,Nature420:636-42 (2002)). Superpozicija noggin-BMP-7 strukture na model BMP signalnog kompleksa pokazala je da noggin vezivanje efektivno maskira parove vezujućih epitopa (to jest vezujuća mesta receptora tipa I i tipa II na BMP) na BMP-7. Sekvencama potke-osnove (scaffold-nehistonska proteinska osnova) bogatim cisteinom u noggin prethodi N-terminalni segment od oko 20 amino kiselinskih ostataka koji su označeni kao spojnica (clip) (ostaci 28-48). Receptor-vezujuće mesto tipa I je zatvoren N-terminalnim delom domena spojnice Noggin-a, i mesto vezivanja receptora tipa II je zatvoren karboksilnim teminalnim delom clip domena. Dva P-lanca u regionu srži blizu C-terminusa noggin-a takođe kontaktira BMP-7 kod vezujućeg mesta receptora tipa II. Način vezivanja omogućava Noggin dimeru da efikasno blokira sva vezujuća mesta na receptorima (dva vezujuća mesta na tipu I i dva vezujuća mesta na tipu II receptora) na BMP dimeru.

Sklerostin polipeptidi i kodirajući polinukleotidi

BMP antagonist sklerostin (U.S. Patent Nos. 67,395,511, 6,489,455 i 6,495,736; videti takođe SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 i 70), poseduje skoro identičan cisteinskui (disulfidnu) potku-osnovu kada se uporedi sa humanom DNK, humanom germinativnom linijom i humanim Cerberus-om, i SCGF (U.S. Patent 5,780,263) ali nema skoro niskakvu homologiju na nukleotidnom nivou (za istorijatvideti generalnoNsuet. al, Mol. Cell1:673-683 (1998)). Trebalo bi razumeti da sklerostin uključuje varijante ovog TGF-beta vezujućeg proteina (na primer, SEQ ID Nos. 60 i 62). Kao što se ovde koristi, polinukleotidne varijante TGF-beta vezujućih proteina odnose se na nukleinsko kiselinske molekule koji kodiraju polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu koja predstavljaju modifikaciju (inserciju, deleciju ili zamenu jednog ili više nukleotida) sa SEQ ID NOs: 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 ili 69. Ovakve varijante uključuju prirodne polimorfizme ili alelske varijante polinukleotidnih varijanti TGF-beta vezujućeg proteina kao i sintetičke polinukleotide koji kodiraju konzervativne amino kiselinske zamene ovih amino kiselinskih sekvenci. Naučnicima su poznati različiti kriterij umi koji ukazuju na to da li su amino kiseline na određenoj poziciji u peptidu ili polipeptidu slične. Na primer, slična amino kiselina ili konzervativna amino kiselinska zamena je ona kod koje je amino kiselinski ostatak zamenjen sa amino kiselinskim ostatkom koji ima slični bočni lanac, koji uključuje amino kiseline sa baznim bočnim lancem (na primer lizin, arginin, histidin); kiseli bočni lanci (na primer asparaginska kiselina, glutamiska kiselina); nenaelektrisane polarne bočne lance (na primer, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirpsin, cistein, histidin); nepolarne bočne lance (na primer alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan); beta-razgranate bočne lance (na primer treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (na primer tirozin, fenilalanin, triptofan). Prolin koji se smatra najtežim za klasifikaciju, deli osobine amino kiselina koje imaju alfatične bočne lance (na primer Leu, Val, Ile, i Ala). U određenim okolnostima, zamena glutamina sa glutaminskom kiselinom ili asparagina sa asparaginskom kiselinom, mogu se smatrati sličnim zamenama, zato što su glutamin i asparagin amidni derivati glutaminske kiseline i asparaginske kiseline.

Dodatne varijante formi polinukleotida koji kodira TGF-beta vezujući protein su nukleinsko kiselinski molekuli koji sadrže zamene, insercije ili delecije jednog ili više nukleotida koji se mogu naći u okviru nukleotidnih sekvenci koje su ovde opisane. Varijanta ili mutant TGF-beta vezujućeg proteina može se konstruisati ili identifikovati tako da promenjena verzija TGF-beta vezujućeg proteina kompetira sa divljim tipom (prirodnim) TGF-beta vezujućeg proteina. Ovakva kompeticija bi poželjno blokirala aktivnost divljeg tipa (prirodnog) TGF-beta vezujućeg proteina i ovo bi dovelo do povećane gustine kosti.

Izolovani polinukleotid je molekul nukleinske kiseline (polinukleotid ili oligonukleotid) koji nije integrisan u genomsku DNK organizma. Polinukleotid se smatra izolovanim, na primer, ako je kloniran u vektor koji nije deo prirodnog okruženja. Na primer DNK molekul koji kodira TGF-beta vezujući protein koji je odvojen od genomske DNK eukariotske ćelije je izolovan molekul DNK. Drugi primer izolovanog molekula nukleinske kiseline je hemijski sintetisan molekul nukleinske kiseline koji nije integrisan u genom organizma. Izolovani molekul nukleinske kiseline može biti DNK, cDNK, RNK ili sastavljen delimično od od analoga nukleinskih kiselina.

Varijante polinukleotida TGF-beta vezujućeg proteina mogu biti identifikovani određivanjem da li polinukleotidi hibridizuju sa molekulom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu SEQ ID NOs: 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 ili 69, pod restriktivnim uslovima. Pored toga, varijante polinukleotida TGF-beta vezujućeg proteina mogu takođe biti identifikovani poređenjem sekvenci. Kao što se ovde koristi, dve amino kiselinske sekvence imaju "100% identične amino kiselinske sekvence" ako su amino kiselinski ostaci dve amino kiselinske sekvence isti kada se poredaju i međusobno uporede sa maksimalnom međusobnom korespondencijom. Slično, dve nukleotidne sekvence imaju "100% identičnost u nukleotidnoj sekvenci" ako su nukleotidi dve nukleotidne sekvence iste kada se poredaju i međusobno uporede sa maksimalnim međusobnim podudaranjem. Poređenje sekvenci može da se izvede primenom programskih paketa kao što su oni obezbeđeni u LASERGENE bioinformatičkom kompjuterskom okruženju, koji proizvodi DNASTAR (Madison, Wisconsin) ili BLAST programskog algoritma koji je dostupan sa NCBI web site-a ([Internet]

<http:www.ncbi.nlm.nih.gov>). Druge metode za poređenje dve ili više nukleotidnih ili amino kiselinskih sekvenci putem određivanja optimalnog poređenja (alignment) su dobro poznate naučnicima iz ove oblasti( videti,na primer, Peruški and Peruški,The Internet and the New Biology: Tools far Genomic and Molecular Research(ASM Press, Inc. 1997), Wu et al., (eds), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," uMethods in Gene Biotechnologv,strane 123-151 (CRC Press, Inc. 1977) i Bishop (ed.),Guide to Human Genome Computing,2nd Edition (Academic Press, Inc. 1988)).

Varijanta TGF-beta vezujućeg proteina trebala bi da ima najmanje 50% amino kiselinsku identičnost sa SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62, 64 i 68 i poželjno veću od 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti. Alternativno, varijante TGF-beta vezujućeg proteina mogu biti identifikovane tako što imaju najmanje 70% nukleotidne identičnosti sa SEQ ID NOs: 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 ili 69. Osim toga, ovaj pronalazak razmatra polinukleotidne varijante TGF-beta vezujućeg proteina koji poseduje više od 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sa SEQ ID NO:55 ili 57. Bez obzira na određenu metodu koja se koristi u identifikaciji polinukleotidne varijante TGF-beta vezujućeg proteina ili varijante TGF-beta vezujućeg proteina, kao varijanta koja funkcionalno može biti karakterisana sa, na primer svojom sposobnošću da se vežu za i/ili inhibiraju signalizaciju odabranog člana TGF-beta familije proteina ili na osnovu svoje sposobnosti da se specifično vežu za anti-TGF-beta vezujući-protein antitelo.

U okviru konteksa ovog pronalaska, "funkcionalni fragment" TGF-beta vezujućeg proteinskog polinukleotida odnosi se na molekul nukleinske kiseline koja kodira deo TGF-beta vezujućeg proteinskog polinukleotida tako da ili (1) poseduje funkcionalnu aktivnost kao što je opisano ovde ili (2) specifično se vezuje za anti-TGF-beta vezujući-protein antitelo. Na primer, funkcionalni fragment TGF-beta vezujućeg-proteina koji kodira polinukleotid opisan ovde sadrži deo nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 55-57, 59,61,63, 65,67 ili 69.

"Izolovani polipeptid" ovde se odnosi na polipeptid koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Na primer, prirodni protein je izolovan ako je odvojen od dela ili potpuno od postojećih materijala u prirodnom sistemu, kao od ugljenih hidrata, lipida, nukleinskih kiselina ili proteinskih nečistoća koje su povezane sa polipeptidom u prirodi. Poželjno,

ovako izolovani polipeptidi su najmanje 90% čisti, još poželjnije najmanje oko 95% čisti i najpoželjnije oko 99% čisti.

Antitela specifična za TGF- beta vezujuće proteine

Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za SOST i takođe obezbeđuje SOST polipeptidne imunogene koji se mogu koristiti za dobijanje i analize antitela i takođe obezbeđuje metode za upotrebu takvih antitela. Antitela iz ovog pronalaska kao što su ovde opisana, specifično se vezuju za SOST polipeptid i tako blokiraju ili inhibiraju vezivanje BMP za SOST polipeptid, to jest, sprečava se ili oslabljuje interakcija između BMP i SOST. Efekat blokiranja ovih interakcija je promena (povećanje ili smanjenje na statistički značajan način) mineralne gustine kosti, poželjno da se poveća mineralna gustina kosti.

Polipeptidi ili peptidi upotrebljivi za imunizaciju i/ili analizu SOST specifičnih antitela mogu se takođe odabrati analizom primarne, sekundarne, tercijarne ili kvarterne strukture TGF-beta vezujućeg proteina na osnovu metoda poznatih onima koji se bave naukom i ovde opisanih, u cilju određivanja amino kiselinskih sekvenci koje će verovatnije generisati antigenio odgovor u domaćinskoj životinji.Videti,na primer, Novotnv,Mol. Immunol.28:201-207 (1991); Berzofsky,Science229:932-40 (1985)). Podaci dobij eni od modelovanja i kristalografije x-zracima mogu se takođe upotrebiti za predviđanje i/ili identifikaciju onih delova ili regiona TGF-beta vezujućeg-proteina koji interaguju onim delovima liganda TGF-beta vezujućeg-proteina, kao što je BMP. Peptidni imunogeni TGF-beta vezujućeg-proteina mogu se dizajnirati i pripremiti tako da uključe amino kiselinske sekvence u okviru ili one koje okružuju delove ili regione koji učestvuju u interakciji. Ova antitela mogu biti korisna za blokiranje ili oslabljivanje vezivanje TGF-beta vezujućeg-proteina za isti ligand i mogu takođe da blokiraju ili oslabljuju vezivanje TGF-beta vezujućeg-proteina za jedan ili više drugih liganda.

Antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti razmatrani u ovom pronalasku, uključuju antitela koja su sposobna da se specifično vežu za SOST i kompetitivno inhibiraju vezivanje TGF-beta polipeptida, kao što je BMP za SOST. Na primer, antitela razmatrana u ovom pronalasku kompetitivno inhibiraju vezivanje SOST polipeptida za BMP mesto na receptom tipa I na BMP, ili za BMP mesto na receptom tipa II ili mogu kompetitivno da inhibiraju vezivanje SOST i za mesta za vezivanje na receptom tipa I i tipa II na BMP. Bez želje da se ograniči samo na teoriju, kada anti-SOST antitelo kompetitivno inhibira vezivanje vezujućih mesta na receptorima tipa I i tipa II na BMP polipeptidu za SOST i tako blokira antagoniostičku aktivnost SOST, mesta za vezivanje receptora na BMP su dostupna da se vežu za receptore tipa I i tipa II i tako povećavaju mineralizaciju kosti. Interakcije vezivanja između TGF-beta vezujućeg-proteina kao što je SOST i TGF-beta polipeptida kao što je BMP, generalno se odigravaju kada svaki od parova loganda formira homodimer. Zato umesto ili pored toga što se koristi antitelo specifično za SOST da bi se blokiralo, oslabilo ili sprečilo vezivanje SOST za BMP putem kompetitivne inhibicije vezivanja SOST za BMP, SOST specifično antitelo može se koristiti za blokiranje ili oslabljivanje formiranja SOST homodimera.

Kao primer navodimo jedan dimer humanog Noggin-a, koji je BMP antagonist koji ima sposobnost da veže BMP sa visokim afinitetom (Zimmerman at al., gore naveden), koji je izolovan u kompleksu sa jednim dimerom humanog BMP-7 i analiziran pomoću "multiwavelenght anomalous diffraction (MAD, anomalija difrakcije višestrukih talasnih dužina) (Groppe et. al.,Nature420:636-42 (2002)). Kao što je ovde diskutovano, ova studija je otkrila da Noggin dimer može efikasno da blokira sva mesta za vezivanje receptora (dva vezujuća mesta na receptom tipa I i dva na receptom tipa II) na BMP dimeru. Lokacija amino kiselina u Noggin koje kontaktiraju BMP-7 može biti korisna u modelovanju interakcije između drugih TGF-beta vezujućih proteina, kao što je skleroztin (SOST) i BMP-ova i tako pomaže dizajniranje peptida koji se mogu koristiti kao imunogeni da bi se dobila antitela koja blokiraju ili oslabljuju ovakvu interakciju.

U jednom ostvarenju ovog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za SOST polipeptid, kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedan ili oba morfogena proteina kosti (BMP) mesta za vezivanje receptora tipa I i BMP mesta za vezivanje receptora tipa II koji su locirani na BMP. Epitopi na SOST za koja se vezuju ova antitela mogu uključiti ili biti uključeni u okvim susednih amino kiselinskih sekvenci i koje su locirane na n terminusu SOST polipeptida (amino kiseline na približnim pozicijama 1-56 SEQ ID NO:l). Polipeptidi mogu takođe uključiti kratku povezujuću (linker) peptidnu sekvencu koja povezuje N-terminalni region sa regionom sadrži, na primer, polipeptide kao što je obezbeđeno u SEQ ID NO:47 (čovek) i SEQ ID NO:48 (pacov). Kraće reprezentativne N-terminalne peptidne sekvence humanog SOST (na primer SEQ ID NO.T) uključuju SEQ ID NOS:2-6 i reprezentativni SOST pacova (na primer, SEQ ID NO:20) peptidne sekvence uključuju SEQ ID NO: 12-15.

Antitela koja se specifično vezuju za SOST polipeptid i blokiraju ili kompetitivno inhibiraju vezivanje SOST polipeptida za BMP, na primer blokiranjem ili inhibiranjem vezivanja za amino kiseline u BMP koje odgovaraju jednom ili više receptorskih vezujućih mesta tipa I i tipa II, mogu takođe da se specifično vežu za peptide koji obuhvataju amino kiselinsku sekvencu koja odgovara regionu srži SOST (amino kiseline na približnim pozicijama 57-146 SEQ ID NO:l). Polipeptidi koji obuhvataju region srži mogu takođe sadržati dodatne amino kiseline koje se pružaju na jednom ili oba, N-terminusu i C-terminusu, na primer, da uključe cisteinske ostatke koji mogu biti korisni za konjugiranje polipeptida sa molekulom nosačem. Reprezentativni polipeptidi srži humanog i pacovskog SOST, na primer, obuhvataju amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:49 i SEQ ID NO:50. Ovakva antitela mogu takođe vezati kraće polipeptidne sekvence. Reprezentativnie humane SOST peptidne sekvence srži obezbeđene su u SEQ ID NO:21-24 i reprezentativne pacovske SOST peptidne sekvence srži obezbeđene su u SEQ ID NO:25-28.

U drugom ostvarenju, antitela koja se specifično vezuju za SOST polipeptid oslabljuju

(inhibiraju, sprečavaju ili blokiraju, na primer smanjenje na statistički značajan način)

formiranje SOST homodimera. Pošto interakcije između SOST i BMP mogu uključiti homodimer SOST i homodimer BMP, antitelo koje sprečava ili oslabljuje formiranje homodimera SOST može tako menjati mineralnu gustinu kosti, poželjno povećati mineralnu gustinu kosti. U jednom ostvarenju, antitela koja se vezuju za region srži SOST sprečavaju formiranje homodimera. Ovakva antitela takođe mogu da se vežu za peptide koji obuhvataju susedne amino kiselinske sekvence koje odgovaraju regionu srži, na primer, SEQ ID NO: 29, 30 i 53 (SOST čoveka) i SEQ ID Nos:31 i 54 (SOST pacova). Antitela koja se vezuju za epitop koji se nalazi na C-terminusnom regionu SOST polipeptida (na približnim amino kiselinskim pozicijama 147-190 ili SEQ ID NO:l ili 20) mogu takođe oslabiti formiranje homodimera. Reprezentativni C-

terminalni polipeptidi humanog i pacovskog SOST, na primer, sadrže amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 51 i SEQ ID NO: 52. Ovakva antitela mogu takođe

da se vežu za kraće polipeptidne sekvence. Reprezentativne humane SOST C-terminalne peptidne sekvence obezbeđene su u SEQ ID NO.33-36 i reprezentativne pacovske SOST C-terminalne peptidne sekvence obezbeđene su u SEQ ID NO:41-43.

SOST polipeptidi i peptidi ovde otkriveni za koje se mogu specifično vezati antitela su

korisni kao imunogeni. Ovi imunogen iuovog pronalaska mogu se koristiti za imunizovanje životinje da bi se dobio humoralni imuni odgovor koji rezultuje u proizvodnji antitela koja se specifično vezuju za vezivno mesto receptora tipa I ili tipa II

ili oba koji su locirani na BMP uključuju peptide dobijene od N-terminalnog regiona SOST ili mogu da spreče formiranje SOST homodimera.

Ovakvi SOST polipeptidi i peptididi koji su korisni kao imunogeni, mogu takođe biti korišćeni u metodama za pregledavanje uzoraka koji sadrže antitela, na primer uzoraka prečišćenih antitela, antiseruma ili supernatanta ćelijskih kultura ili bilo kog drugog biološkog uzorka koji može da sadrži jedno ili više antitela specifičnih za SOST. Ovi peptidi mogu se takođe koristiti u metodama za identifikovanje i selekciju iz biološkog uzorka jedne ili više B ćelija koje proizvode antitelo koje se specifično vezuju za SOST

(na primer esej za formiranje plaka i slični). B ćelije se mogu zatim koristiti kao izvor SOST specifičnog polinukleotida koji kodira antitelo, koji se može klonirati i/ili modifikovati tehnikama rekombinantne molekularne biologije poznatim u nauci i ovde opisanim.

"Biološki uzorak" koji se ovde koristi, odnosi se u nekim ostvarenjima na uzorak koji sadrži najmanje jedno antitelo specifično za SOST polipeptid i biološki uzorak može biti obezbeđen iz uzorka krvi (iz koga se mogu pripremiti serum ili plazma), uzorka biopsije, eksplanta tkiva, kulture organa ili bilo kog drugog tkiva ili ćelijskog preparata iz subjekta ili biološkog izvora. Uzorak se dalje može odnositi na tkivo ili ćelijski preparat u kome je poremećen morfološki integritet ili fizičko stanje, na primer disekcijom, disocijacijom, solubilizacijom, frakcionacijom, homogenizacijom, biohemijskom ili hemijskom ekstrakcijom, pretvaranjem u prah liofilizacijom, sonifikacijom ili na bilo koji drugi način preradom uzorka dobijenog iz subjekta ili biološkog izvora. Subjekat ili biološki izvor može biti humana ili ne-humana životinja, primarna ćelijska kultura (na primer B ćelije imunizovanein vitro),ili ćelijska linija adaptirana na kulturu, uključujući ali bez limitiranja na njih, genetski konstruisane ćelijske linije koje mogu sadržati hromozomalno integrisane ili epizomalne rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina, besmrtne ili sklone besmrtnosti ćelijske linije, hibridne somatske ćelijske linije, diferencirane ćelijske linije ili one koje se mogu diferencirati, transformabilne ćelijske linije i slične.

SOS peptidni imunogeni mogu takođe biti pripremljeni sintezom serije peptida koji, u

totalu, predstavljaju kompletnu polipeptdinu sekvencu SOST polipeptida i gde svaka ima zajednički deo SOST amino kiselinske sekvence sa drugim peptidom u seriji. Preklapajući delovi poželjno bi trebalo da budu najmanje četiri amino kiseline i još poželjnije 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kiselina. Svaki peptid se može koristiti za imunizaciju životinje, serum koji se sakupi iz životinje i testira u eseju da bi se identifikovalo koja životinja proizvodi antitela koja oslabljuju ili blokiraju vezivanje SOST za TGF-beta protein. Antitela se zatim pripremaju iz ovako identifikovanih imunizovanih životinja na osnovu metoda poznatih u nauci i ovde opisanih.

Peptidid, polipeptidid i drugi ne-peptidni molekuli koji se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein, kao što je SOST, razmatrani su u ovom pronalasku. Kao što se ovde koristi, za molekul se kaže da "se specifično vezuje" za TGF-beta vezujući protein ako na detektabilnom nivou reaguje sa TGF-beta vezujućim proteinom, ali ne reaguje detektabilno sa peptidima i polipeptidima koji sadrže nesrodnu sekvencu ili sekvencom različitog TGF-beta vezujućeg proteina. Poželjni molekuli uključuju antitela, koja mogu biti na primer poliklonalna, monoklonalna, jednolančana, himerna, anti-idiopatična ili CDR-ugrađeni imunoglobulini ili njihovi fragmenti, kao proteolitičkim putem dobijeni ili rekombinantnom tehnologijom proizvedeni imunoglobulinski F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd fragmenti.

Posebno pogodna su anti-TGF-beta vezujući-protein antitela koja "specifično vezuju" TGF-beta vezujući protein sa SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 ili 68, ali ne vezuju druge TGF-beta vezujuće proteine kao što su Dan, Cerberus, SCGF ili Gremlin. Shvaćeno je da se antitela specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein ili za specifičnog člana TGF-beta familije ako se vezuju sa Kavećim od ili jednakim 10<4>M"', još poželjnije većim od ili jednakim sa otprilike 10<5>M"', još poželjnije većim od ili jednakim sa otprilike 106M"još uvek poželjnije većim od ili jednakim sa otprilike 107 'M"1 , još uvek poželjnije većim od ili jednakim sa otprilike 10 8 M" 1 i ne vezuje se za druge TGF-beta vezujuće proteine. Afinitet antitela za svoj srodan antigen je takođe često izraženo kao konstanta disocijacije Kdi anti-SOST antitelo se specifično vezuje za člana TGF-beta familije ako se vezuje sa Kdmanjom ili jednakom od lO^M, poželjnije sa manjim ili jednakim 10"5M, još poželjnije sa manjom ili jednakom od 10" M, još uvek poželjnije sa manjom ili jednakom od 10"<7>M i još poželjnije sa manjom ili jednakom od 10" M. Dalje, antitela iz ovog pronalaska preferencijalno blokiraju, oslabljuju, ili inhibiraju (na primer statistički značajno smanjuju) vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije.

Afinitet antitela ili vezujućeg partnera kao i nivo do koga antitelo inhibira vezivanje može se jednostavno odrediti od strane običnog naučnika pomoću konvencionalnih tehnika, na primer onih opisanih od strane Scatchard et. al.( Ann. N. Y. Acad. Aci.51:660-672, (1949)) ili pomoću površinske "plasmon" rezonance (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Za površinsku "plasmon" rezonancu, ciljni molekuli su imobilisani na čvrstoj fazi i izloženi ligandima na mobilnoj fazi koji se kreću kroz protočnu ćeliju. Ako se dogodi vezivanje liganda za imobilisan cilj, menja se lokalni refraktorni indeks, što odvodi do promene SPR ugla, koja se može posmatrati u stvarnom vremenu putem detektovanja promena intenziteta reflektovane svetlosti. Stope promene SPR signala mogu se analizirati da bi se dobile očigledne konstante stope za asocijacione i disocijacione faze vezujuće reakcije. Odnos ovih vrednosti daje očiglednu ekvilibrijumsku konstantu (afinitet)( videti,takođe, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).

Antitelo na osnovu ovog pronalaska može pripadati imunoglobulinskoj klasi, na primer IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA. Može se dobiti iz ili izvesti iz životinje, na primer, živine (na primer kokoška) ili sisara, koji uključuju ali nisu njima limitirani, miša, pacova, hrčka, zeca ili druge glodare, kravu, konja, ovcu, kozu, kamilu, čoveka ili drugog primata. Antitelo može biti (internalising) unutrašnje antitelo.

Metode koje su dobro poznate u nauci mogu se koristiti za dobijanje antitela, poliklonalnih antiseruma ili monoklonalnih antitela koja su specifična za TGF-beta vezujući protein kao što je SOST. Antitela takođe mogu biti proizvedena kao genetski konstruisani imunoglobulini (Ig) ili Ig fragmenti koji su dizajnirani da imaju poželjne osobine. Na primer, ilustracije radi i ne zbog ograničenja, antitela mogu uključiti rekombinantni IgG koji je himerni fuzioni protein koji ima najmanje jedan domen varijabilnog regiona (V) od prve sisarske vrste i najmanje jedan domen konstantnog regiona od druge udaljene sisarske vrste. Najčešće, himerno antitelo ima mišije sekvence varijabilnog regiona i humane sekvence konstantnog regiona. Ovakav mišiji/humani himerni imunoglobulin može biti "humanizovan" usađivanjem regiona za određivanje komplementarnosti (CDR, Complementarv Determining regions) izvedenih iz mišijeg antitela koji obezbedjuju specifičnost vezivanja za antigen, u V region regiona okosnice dobijenog iz čoveka i konstantne regione dobijene iz čoveka. Fragmenti ovih molekula mogu se dobiti proteolitičkim sečenjem ili opcionalno, proteolitičkim sečenjem, nakon čega sledi blaga redukcija disulfidnih veza i alkilacija. Alternativno ovakvi fragmenti mogu se takođe dobiti tehnikama rekombinantnog genetičkog inženjerstva.

Određena poželjna ostvarenja su ona antitela koja inhibiraju ili blokiraju aktivnost TGF-beta vezujućeg proteina uin vitroeseju, kao što je ovde opisano. Osobine vezivanja antitela za TGF-beta vezujući protein mogu biti generalno procenjene pomoću metoda imunodetekcije uključujući na primer, esej imunoabsorbcije povezan sa enzimom (ELISA), imunoprecipitaciju, "imunoblotting", elektroforezu nasuprot struje, radioimunoeseje, "dot blot" eseje, eseje inhibicije i kompeticije i slične koji se mogu jednostavno izvesti od strane običnih naučnika( videti,takođe, U.S. Patent Nos. 4,376,110 i 4,486,530; HarIow et. al.,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv (1988)). Imunogen može biti obuhvaćen ćelijama koje eksprimiraju TGF-beta vezujući protein kao što je SOST polipeptid, prečišćen ili delimično prečišćen SOST polipeptid, ili njihove varijante ili fragmenti (to jest peptidi) ili peptidi dobijeni iz SOST polipeptida. Ovakvi peptidi mogu se dobiti proteolitičkim sečenjem većeg polipeptida, rekombinantnom molekularnom metodologijom ili se mogu hemijski sintetisati. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju SOST polipeptid ovde su obezbeđene, tako da stručnjaci iz ove oblasti mogu rutinski da pripreme SOST polipeptid za upotrebu kao imunogena. Peptidi mogu biti hemijski sintetisani metodama koje su ovde opisane i poznate u nauci. Alternativno, peptidi se mogu generisati proteilitičkim sečenjem SOST polipeptida i pojedinačni peptidi mogu biti izolovani metodama poznatim u nauci kao što su elektroforeza na poliakrilamidnim gelovima ili mnogobrojne tečne hromatografije ili druge metode za separaciju. Peptidi korisni kao imunogeni mogu imati amino kiselinsku sekvencu sa najmanje 4 ili 5 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptidne amino kiselinske sekvence kao što su one opisane ovde u pronalasku, i poželjno ima 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 ili 20 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida. Određeni poželjni peptidni imunogeni sadrže najmanje 6 i ne više od 12 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptidne sekvence, i drugi poželjni peptidni imunogeni sadrže najmanje 20, ali ne više od 75 uzastopnih amino kiselina i drugi poželjni peptidni imunogeni sadrže najmanje 21 ali ne više od 50 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida. Drugi poželjni peptidni imunogeni sadrže 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50 ili celi broj amino kiselina između i uključujući 21 i 100 uzastopnih amino kiselina i između 100 i 190 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptidne sekvence.

Polikionalna antitela koja se specifično vezuju za SOST mogu se pripremiti pomoću ovde opisanih metoda koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti( videti,na primer, Green et al., "Production of Polvclonal Antisera," uImmunochemical Protocols(Manson, ed.), strane 1-5 (Humana Press 1992); Harlovv et. al.,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv (1988); Williams et. al., "Expression of foreign proteins inE. coliusing plasmid vectors and purification of specific polvclonal antibodies," uDNA Cloning2: Expression Systems, 2nd Edition, G\ ovtxet al. (eds.) strana 15 (Oxford Universitv Press 1995)). Antitela za TGF-beta vezujući protein mogu se dobiti, na primer, imunizacijom životinje sa TGF-beta vezujućim proteinskim produktom ekspresionog vektora, ili imunizacijom sa izolovanim TGF-beta vezujućim proteinom ili njegovim peptidnim fragmentom, kao što je ovde opisano. Iako se poliklonalan antitela tipično "dižu" u životinjama kao što su pacovi, zečevi, koze, krave, ili ovce, anti- TGF-beta vezujući protein antitelo iz ovog pronalaska može se dobiti iz subhumanog primata. Opšte tehnike za "podizanje"

(stvaranje) dijagnostički i terapeutski korisnih antitela u babunima mogu se naći na primer u WO 91/11465 (1991) i u Losman et. al.,Int. J. Cancer46:310, 1990.

Priprema imunogena za injektranje u životinje može uključiti kovalentno vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina (ili njegove varijante ili fragmenta) za drugi imunogeni protein, na primer proteinski nosač kao što je hemocijanin kapičastog puža (KLH) ili serum albumin govečeta (BSA) ili slični. Polipeptidni ili peptidni imunogen može uključiti jednu ili više dodatnih amino kiselina na ili N-terminalnom ili C-terminalnom kraju koje olakšavaju konjugacionu proceduru (na primer dodavanje cisteina da bi se olakšala konjugacija peptida sa KLH). Drugi amino kiselinski ostaci u okviru polipeptida ili peptida mogu se zameniti da bi se sprečila konjugacija na određenoj amino kiselinskoj poziciji asa polipeptidnim nosačem (na primer zamenom serinskog ostatka sa cisteinom na unutrašnjim pozicijama polipeptida/peptida) ili se mogu zameniti da bi se olakšala rastvorljivost ili pojačala imunogenost.

TGF-beta vezujući proteiski peptid, polipeptid ili ćelije koje eksprimiraju TGF-beta vezujući protein, mogu se koristiti kao imunogen i mogu biti emulzifikovani u adjuvantu, na primer Freund-ov kompletan ili nekompletan adjuvant ili Ribi Adjuvant Svstem (Corixa Corporation, Seatlle, WA).Videti,na primer, Harlovv et. al., već naveden. Imunogen može biti injektiran u životinju različitim putevima, uključujući intraperitonalno, intramuskularno, intraokularno, intradermalno ili subkutanozno (potkožno). U osnovi, posle prve injekcije, životinje primaju jednu ili više "booster" (za pojačavanje) imunizacija na osnovu poželjnog rasporeda koji može varirati u zavisnosti od, između ostalog, antigena, adjuvanta (ako postoji) i/ili od određene životinjske vrste. Imuni odgovor se može posmatrati periodičnim puštanjem krvi životinje i pripremom i analizom seruma u imunoeseju, kao što je ELISA ili Ouchterlony-jev difuzioni esej ili slični, kako bi se odredio specifični titar antitela. Kada se jednom ustanovi adekvatan titar antitela, životinje se mogu podvrgnuti peridoičnom ispuštanju krvi da bi se akumulirali poliklonalni antiserumi ili mogu biti potpuno oslobodjeni krvi. Polikionalna antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein ili peptid mogu se zatim prečistiti iz takvih antiseruma, na primer afinitativnom hromatografijom pomoću proteina A. Alternativno, afinitativna hromatografija se može izvesti, naznačeno time da je TGF-beta vezujući protein ili peptid ili antitelo specifično za konstantni region Ig određene imunizovane životinjske vrste imobilisan na pogodnu čvrstu potporu.

Antitela za upotrebu u pronalasku uključuju monoklonalna antitela koja se pripremaju konvencionalnom imunizacijom i procedurama za ćelijsku fuziju kao što je ovde opisano i poznato u nauci. Monoklonalna anti -TGF-beta vezujući protein antitela mogu se generisati pomoću različitih tehnika. Monoklonalna antitela koja se vezuju za specifične antigene mpgu se dobiti metodama koje stručnjaci iz nauke poznaju( videti,na primer, Kohler et. al.,Nature256:495, 1975; Coligan et al. (eds),Current Protocols in Immunology,1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); U.S. Patent Nos. RE32,011, 4,902,614, 4,543,439 i 4,411,993;Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimesion in Biological Analyses,Plenum Press, Kennett, McKearn i Bechtol (eds.)

(1980); iAntibodies: A Laboratory Manual,Harlovv i Lane (eds)., Cold Springs Harbor Laboratory Press (1988); Pricksley et al, "Production of monoclonal antibodies against proteins expresses inE. coli",uDNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al. (eds), strana 93 (Oxford University Press 1995)). Fragmenti antitela mogu se dobiti iz njih pomoću bilo koje pogodne standardne tehnike kao što je proteolitičko sečenje, ili opcionalno, proteolitičkim sečenjem (na primer upotrebom papaina ili pepsina) nakon čega sledi redukcija disulfidnih veza i alkilacija. Alternativno, ovakvi fragmenti takođe mogu biti generisani tehnikama rekombinantnog genetičkog inženjerstva.

Ukrartko, monoklonalna antitela mogu se dobiti injektiranjem životinje, na primer pacova, hrčka ili poželjno miša, sa imunogenom koji sadrži TGF-beta vezujući proteinski genski produkt ili njegov peptdini fragment, na osnovu metoda poznatih u nauci i metoda koje su ovde opisane. Prisustvo proizvodnje specifičnih antitela može se nadgledati nakon inicijalnog injektiranja (injekcije se mogu dostavljati bilo kojim od mnogobrojnih puteva kao što je ovde opisano da bi se generisala polikionalna antitela) i/ili nakon "booster" injekcije dobijanjem uzorka seruma i detektovanjem prisustva antitela koje se vezuje za TGF-beta vezujući protein ili peptid, upotrebom bilo koje metode imunodetekcije poznate u nauci i koje su ovde opisane. Iz životinja koje proizvode antitela koja se vezuju za TGF-beta vezujući protein, uklanjaju se limfoidne ćelije, najčešće ćelije iz slezine ili limfnih čvorova, da bi se dobili B-limfociti. B-limfociti se zatim fuzionišu sa fuzionim partnerom mijeloma ćelijom koja je senzitivirana lekom, poželjno onom koja je singenična sa imunizovanom životinjom i koja opcionalno ima druge poželjne osobine (na primer, nesposobnost ekspresije endogenog Ig genskog proizvoda, na primer, P3X63 - Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580); NsO, SP20) da bi se proizvele hibridome koje predstavljaju besmrtne eukariotske ćelijske linije. Ćelije limfoida (na primer slezine) i ćelije mijeloma mogu se kombinovati u periodu od nekoliko minuta sa membranskim agensom koji potpomaže srvaranje fuzije, kao što je polietilen glikol ili nejonski deterdžent i zatim se u niskoj gustini zasejavaju na selektivni medijum koji podržava rast hibridoma ćelija, a ne podržava rast nefuzionisanih ćelija mijeloma. Poželjni selektivni medijum je HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin). Nakon dovoljno dugog vremenskog perioda, obično oko jedne do dve nedelje, vide se kolonije ćelija. Izoluju se pojedinačne kolonije i antitela koja se proizvode u ćelijama mogu se testirati na aktivnost vezivanja za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment, pomoću bilo kog imunoeseja koji je poznat u nauci i koji je ovde opisan. Poželjne su hibridome koje proizvode monoklonalna antitela sa visokim afinitetom i specifičnošću za TGF-beta vezujući protein. Hibridome koje proizvode monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment se zato razmatraju u ovom pronalasku. Hibridome se kloniraju (na primer kloniranjem ograničenim razblaženjem ili izolacijom plaka sa mekog agara) i odabiraju i selektuju pozitivni klonovi koji proizvode antitelo specifično za antigen. Poželjna su antitela koja blokiraju, inhibiraju ili oslabljuju vezivanje za TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije.

Monoklonalna antitela iz kultura hibridoma mogu se izolovati iz supernatanata kultura hibridoma. Alternativni metod za proizvodnju mišijeg monoklonalnog antitela je injektiranje hibridoma ćelija u peritonealnu šupljinu sinergenskog miša, na primer miša koji je tretiran (na primer "pristane-primed"-tretiran sa "pristane") da bi se olakšalo formiranje "ascites" tečnosti (hidroperitoneum-akumulirana tečnost u peritonelnoj duplji), koja sadrži monoklonalno antitelo. Ovakve tehnike izolacije uključuju afinitativnu hromatografiju sa Protein-A sefarozom, hromatografiju isključivanja na osnovu veličine i jonsko-izmenjivačku hromatografiju( videti,na primer, Coligan - na stranama 2.7.1-2.7.12 i stranama 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," uMethods in Molecular Biologv, Vol. 10,strane 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Monoklonalna antitela mogu biti prečišćena putem afinitativne hromatografije pomoću odgovarajućeg liganda odabranog na osnovu određenih osobina antitela (na primer izotipa lakog ili teškog lanca, specifičnosti vezivanja itd.). Primeri pogodnih liganda, imobilisanih na čvrstoj potpori, uključuju Protein A, Protein G, anti-konstantni region antitela (lakog lanac ili teškog lanca), anti-idiopatsko antitelo i za TGF-beta vezujući protein ili njegov fragment ili varijanta.

Dodatno, anti- TGF-beta vezujući protein antitelo iz ovog pronalaska može biti humano monoklonalno antitelo. Humana monoklonalna antitela mogu biti generisana bilo kojom od mnogobrojnih tehnika sa kojima će oni koji se bave naukom biti familijarni. Ovakve metode uključuju, ali bez ograničenja, transformaciju humanih ćelija periferne krvi (na primer sadrže B limfocite) Epstein Barr virusom (EBV),in vitroimunizaciju humanih B ćelija, fuziju ćelija slezine iz imunizovanih transgenih miševa koji nose insertovane humane imunoglobulinske gene, izolaciju humanih fagnih biblioteka V regiona imunoglobulina ili druge procedure poznate u nauci koje se baziraju na ovde opisanom otrkriću. Na primer, humana monoklonalan antitela mogu se dobiti iz transgenih miševa koji su konstruisani da proizvode specifična humana antitela kao odgovor na izazov sa antigenom. Metode za dobijanje humanih antitela iz transgenih miševa opisane su na primer u Green et. al.,Nature Genet.7:13, 1994; Lonberg et al.,Nature368:856, 1994; Tavlor et al.,Int. Immun.6:579, 1994; U.S. Patent No. 5,877,397; Bruggemann et al., 1997Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58; Jakobovits et. al., 1995Ann. N. Y. Acad. Sci.764:525-35. U ovoj tehnici elementi humanih lokusa za teški i laki lanac se unose u soj miša koji je izveden iz embrionskih stem ćelijskih linija koje sadrže ciljana oštećenja u endogenim lokusima za teški i laki lanac.( Videtitakođe Bruggemann et al.,Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58 (1997)). Na primer, humani imunoglobulinski transgeni mogu biti mini-genski konstrukti ili translokusi na kvaščevim veštačkim hromozomima, koji podležu B-ćelijski-specifičnim DNK rearanžmanima i hipermutaciji u mišijem limfoidnom tkivu. Humana monoklonalna antitela mogu se dobiti imunizacijom transgenih miševa koji zatim mogu proizvesti humana antitela specifična za antigen. Limfoidne ćelije iz imunizovanih transgenih miševa mogu se koristiti za proizvodnju humanih hibridoma koje eskretuju antitela na osnovu metoda koje su ovde opisane. Poliklonalni serumi koji sadrže humana antitela mogu se dobiti iz krvi imunizovanih životinja.

Još jedna metoda za generisanje humanih monoklonalnih antitela specifičnih za TGF-beta vezujući protein uključuje prevođenje u besmrtno stanje humanih ćelija periferne krvi putem EBV transformacije.Videti,takođe, U.S: Patent No. 4,464,456. Ovakva besmrtna B ćelijska linija (ili limfoblastoidna ćelijska linija) koja proizvodi monoklono antitelo koje se specifično vezuje za TGF-beta vezujući protein (ili njegovu varijantu ili fragment) može se identifikovati metodama imunodetekcije koje su ovde obezbeđene, na primer ELISA testom i zatim izolovati standardnim tehnikama kloniranja. Stabilnost limfoblastoidne ćelijske linije koja proizvodi anti- TGF-beta vezujući protein antitelo može se poboljšati fuzionisanjem transformisane ćelijske linije sa mišijim mijelomom da bi se dobila mišija-humana hibridna ćelijska linija, na osnovu metoda poznatih u nauci( videti,takođe,Glasky et.al.,Hybridoma8:377-89 (1989)). Još jedna metoda za generisanje humanih monoklonalnih antitela jein vitroimunizacija, koja uključuje povezivanje humanih B ćelija slezine sa antigenom, nako čega sledi fuzija vezanih (primed) B ćelija sa heterohibridnim fuzionim partnerom.Videti,takođe,Boerner et al.,1991 J. Immunol.147:86-95.

U određenim ostvarenjima, B ćelija koja proizvodi anti-SOST antitelo je odabrana i klonirani su varijabilni regioni lakog lanca i teškog lanca iz B ćelije, na osnovu tehnika molekularne biologije poznatih u nauci (WO 92/02551; US patent 5,627,052; Babcook et al.,Proc. Natl. Acad Sci. USA93:7843-48 (1996) i koje su ovde opisane. Poželjne B ćelije iz imunizovane životinje izolovane su iz slezine limfnog čvora ili uzorka periferne krvi, odabiranjem ćelije koja proizvodi antitelo koje se specifično vezuje za SOST. B ćelije mogu takođe biti izolovane iz čoveka, na primer iz uzorka periferne krvi. Metode za detektovanje pojedinačnih B ćelija koje proizvode antitelo sa željenom specifičnošću poznate su u nauci, na primer formiranje plaka, odabiranje ćelija koje su aktivirane fluorescenciojm,in vitrostimulacijom, nakon čega sledi detekcija specifičnog antitela i slični. Metode za odabiranje B ćelija koje proizvode specifično antitelo uključuju na primer, pripremu suspenzije pojedinačne ćelije B ćelija u mekom agaru koji sadrži SOST ili njegov peptidni fragment. Vezivanje specifičnog antitela koje se proivodi od strane B ćelije za antigen rezultuje u formiranju kompleksa, koji može da se vidi kao

imunoprecipitat. Nakon što se odaberu B ćelije koje proizvode specifično antitelo, specifični geni za antitelo mogu se klonirati izolovanjem i umnožavanjem DNK ili iRNK na osnovu metoda poznatih u nauci i koje su ovde opisane.

Za određene potrebe, fragmenti antitela na anti-TGF-beta vezujući protein mogu biti poželjni. Fragmenti antitela F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd, zadržavaju mesto za vezivanje antigena od celog antitela i zato se vezuju za isti epitop. Ovi antigen-vezujući fragmenti izvedeni iz antitela mogu se dobiti, na primer proteolitičkom hidrolizom antitela, na primer digestijom sa pepsinom ili papainom čitavih atitela na osnovu konvencionalnih metoda. Kao ilustracija, fragmenti antitela mogu se proizvesti enzimatskim sečenjem antitela sa pepsinom pri čemi se dobija 5S fragment označen kao F(ab')2. Ovaj fragment može se dalje šeći pomoću tiol redukujućeg agensa da bi se proizveo 3.5S Fab' monovalcntni fragment. Opcionalno, reakcija sečenja može se izvesti upotrebom grupa za blokiranje za sulfhidrilne grupe, što rezultuje u sečenju dizulfidnih veza. Kao alternativa, enzimatsko sečenje pomoću popaina proizvodi direktno dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment. Ove metode su opisane na primer od strane Goldenberg, U.S. patent No. 4,331,647, Nisonoff et al.,Arch. Biochem. Biophys.89:230, 1960; Porter,Biochem J.75.T19, 1959; Edelman et al., uMethods in Enzymology7:422 (Academic Press 1967); i Coligan na stranama 2.8.1-2.8.10 i 2.10.-2.10.4. Druge metode za sečenje antitela, kao što je odvajanje teških lanaca da bi se formirali monovalentni fragmenti lakih-teških lanaca (Fd), dalje sečenje fargmenata ili druge enzimske, hemijske ili genetičke tehnike, takođe se mogu koristiti, sve dok se fragmenti vezuju za antigen koji prepoznaje intaktno antitelo

Fragment antitela može takođe biti sintetički ili genetski konstruisan protein koji deluje kao antitelo zato što se vezuje za specifičan antigen i formira kompleks. Na primer, fragmenti antitela uključuju izolovane fragmente koji se sastoje od varijabilnog regiona lakog lanca, "Fv" fragmentata koji se sastoje od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, rekombinantnih jednolančanih polipeptidnih molekula u kojima su varijabilni regioni lakih i teških lanaca spojeni peptidnim spojem (linker) (scFv proteini) i minimalne jedinice prepoznavanja koji se sastoje od amino kiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region. Antitelo iz ovog pronalaska poželjno sadrže najmanje jedan domen varijabilnog regiona. Domen varijabilnog regiona može biti bilo koje veličine ili amino kiselinskog sastava i generalno će sadržati najmanje jednu hipervarijabilnu amino kiselinsku sekvencu odgovornu za vezivanje antigena i koja je smeštena do ili u fazi sa jednom ili više sekvenci okosnica. U opštim uslovima domen varijabilnog (V) regiona može biti bilo koji pogodan aranžman imunoglobulinskih teških (Vh) i/ili lakih (VL) lanaca varijabilnih domena. Zato, na primer, domen V regiona može biti monomer i Vhili Vldomen koji je sposoban za nezavisno vezivanje antigena sa prihvatljivim afinitetom. Alternativno, domen V regiona može biti dimer i sadržati Vh-Vh, Vh-Vlili VL-Vldimere. Poželjno, dimerni V region sadrži najmanje jedan VHi najmanje jedan VLlanac koji su ne-kovalentno povezani (ovde i od sada označeni kao Fv). Ako je potrebno, lanci mogu biti kovalentno vezani ili direktno na primer preko disulfidne veze između dva varijabilna domena ili preko spoja (linkera) na primer peptidnog spoja (linker) da bi se formirao jednolančani Fv (scFv).

Domen varijabilnog regiona može biti bilo koji prirodni varijabilni region ili njegova konstruisna verzija. Pod konstruisanom verzijom misli se na domen varijabilnog regiona koji je kreiran upotrebom tehnika konstruisanja i rekombinantne DNK. Ovakve napravljene verzije uključuju one kreirane na primer, od varijabilnog regiona specifičnog antitela putem insercije, delecija ili promena u ili promena na amino kiselinskoj sekvenci specifičnog antitela. Posebni primeri uključuju konstruisane domene varijabilnih regiona koji sadrže makar jedan CDR (region za određivanje komplementarnosti) i opcionalno jednu ili više amino kiselinski sekvenci regiona okosnice od prvog antitela i ostatak domena varijabilnog regiona od drugog antitela.

Domen varijabilnog regiona može biti kovalentno vezan na C-terminalnoj amino kiselini za najmanje jedan drugi domen antitela ili njegov fragment. Zato, na primer, Vhdomen koji je prisutan u domenu varijabilnog regiona može biti povezan sa imunoglobulinskim ChI domenom ili njegovim fragmentom. Slično tome VL domen može biti povezan sa Ckdomenom ili njegovim fragmentom. Na ovaj način, na primer, antitelo može biti Fab fragment, naznačeno time da domen za vezivanje antigena sadrži povezane Vhi Vldomene kovalentno vezane na njihovim C-terminusima sa CHI i Ckdomenom. CHI domen može biti produžen sa dodatnim amino kiselinama, na primer da bi se obezbedio region zgloba (hinge) ili deo domena regiona zgloba kao što se nalazi u Fab' fragmentu, ili da bi se obezbedili dalji domeni, kao što su domeni antitela CH2 i CH3.

Druga forma fragmenta antitela je peptid koji sadrži jedan region za određivanje kompelmentarnosti (CDR). CDR peptidi ("minimalne jedinice prepoznavanja") mogu se dobiti konstruisanjem polinukleotida koji kodiraju CDR antitela od interesa. Ovakvi polinuklcotidi se pripremaju na primer, upotrebom lančane reakcije polimeraze, da bi se sintetisao varijabilni region pomoću iRNK ćelija koje proizvode antitelo kao matriceVideti,na primer, Larrick et al.,Methods: A Companion to Methods in Enzymology2.106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipualtion of Monoclonal Antibodies," uMonoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application,Ritter et al.

(eds.), strana 166 (Cambridge University Press 1995); i Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," uMnoclonal Antibodies: Principles and Applications,Birch et al., (eds), strana 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995).

Alternativno, antitelo moeže biti rakombinantno ili konstruisano antitelo dobijeno tehnikama rekombinantne DNK koje uključuju manipulaciju i ponovnu ekspresiju DNK kodirajućeh varijabilnih i/ili konstantnih regiona antitela. Ovakva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz DNK biblioteka uključujući na primer fagne biblioteke antitela( videtiChisvvell and McCafferty,Tibtech.10:80-84 (1992) ili se može po želji lako sintetisati. Standardne procedure molekularne biologije i/ili hernije mogu se koristiti radi sekvenciranja i manipulacije DNK, na primer, da bi se uneli kodoni u cilju kreiranja cisteinskih ostataka ili da bi se modifikovale, dodale, deletirale amino kiseline ili domeni, ako je potrebno.

Himerna antitela, specifična za TGF-beta vezujući protein i koja uključuju humanizovana antitela, mogu takođe biti generisana na osnovu ovog pronalaska. Himerno antitelo ima najmanje jedan domen konstantnog regiona izveden iz prve sisarske vrste i najmanje jedan domen varijabilnog regiona izveden iz druge različite sisarske vrste( videti,takođe, Morrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA,81:6851-55

(1984)). U poželjnim ostvarenjima himerno antitelo se može konstruisati kloniranjem polinukleotidne sekvence koja kodira najmanje jedan domen varijabilnog regiona izveden iz ne-humanog monoklonalnog antitela, kao što je varijabilni region izveden iz mišijeg, pacovskog ili od hrčka monoklonalnog antitela, u vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan humani konstantni region( videti,takođe, Shin et. al.,Methods in Enzymol.178:459-76; Walls et al.,Nucleic Acids Res.21:2921-29 (1993)). Dajemo kao primer, da se polinukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca mišijeg monoklonalnog antitela može ubaciti u vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sekvencu konstantnog regiona humanog kapa lakog lanca. Polinukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca monoklonalnog antitela može se klonirati u odvojeni vektor, "in frame" (u fazi) sa sekvencama koje kodiraju konstantni region humanog IgG, na primer konstantni region humanog IgGl. Odabrani posebni humani konstantni region može zavisiti od efektorne funkcije koje se žele za određeno antitelo (na primer, fiksiranje komplementa, vezivanje za određeni Fc receptor, itd.). Poželjno, konstruisani vektori biće transfektovani u eukariotske ćelije za stabilnu ekspresiju himernog antitela. Druga metoda poznata u nauci za generisanje himernih antitela je homologa rekombinacija (na primer, U.S.

Patent No. 5,482,856).

Ne-humano/humano himerno antitelo može se dalje konstruisati genetički da bi se dobilo "humanizovano" antitelo. Ovakvo humanizovano antitelo može da sadrži mnoštvo CDR-ova izvedenih iz imunoglobulina ne-humane sisarske vrste, najmanje jedan humani region okosnice (framework) i najmanje jedan konstantan region humanog imunoglobulina. Korisne strategije za dizajniranje humanizovanih antitela mogu uključiti, na primer, u cilju ilustracije a ne ograničenja, identifikaciju humanih varijabilnih regiona okosnice, koji su najviše homologi sa ne-humanim regionima okosnice himernog antitela. Bez namere da se vezujemo teorijom, ovakva strategija može da poveća verovatnoću da će humanizovano antitelo zadržati specifični afinitet vezivanja za TGF-beta vezujući protein, koji u nekim poželjnim ostvarenjima može biti u značajnoj meri isti afinitet za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment, i u određenim poželjnim ostvarenjima može biti veći afinitet za TGF-beta vezujući protein.Videti,na primer, Jones et al., 1986Nature321:522-25; Riechmann et al. 1988Nature332:323-27. Zato dizajniranje ovakvog humanizovanog antitela može uključiti određivanje konformacija CDR petlje i strukturnih determinanti ne-humanih varijabilnih regiona, na primer kompjuterskim modelovanjem i zatim poređenjem CDR petlji i determinanti sa poznatim humanim CDR strukturama petlji i determinanti.Videti,na primer, Padlan et al., 1995FASEB9:133-39; Chothia et al., 1989Nature,342:377-383. Kompjutersko modelovanje se takođe može koristiti za poređenje humanih strukturnih matrica odabranih na osnovu homologije sekvenci sa ne-humanim varijabilnim regionima.Videti,na primer, Bajorath et al., 1995Ther. Immunol.2:95-103; EP-0578515A3. Ako humanizacija ne-humanih CDR-ova rezultira u smanjenju afiniteta vezivanja, kompjutersko modelovanje može pomoći u identifikaciji specifičnih amino kiselinskih ostataka koji se mogu promeniti mutagenezom usmerenom na mesto (site directed) ili drugim tehnikama mutageneze da bi se delimično, kompletno ili supra-optimalno (to jest povećanje na nivo koji je veći od onog kod ne-humanizovanog antitela) restaurirao afinitet. Oni koji se bave naukom su familijarizovani sa ovim tehnikama i lako će shvatiti mnogobrojne varijacije i modifikacije koje se mogu primeniti na ove strategije dizajniranja.

Jedna ovakva metoda za pripremu humanizovanog antitela se zove površinsko premazivanje (veneerging). Kao što se ovde koristi, "površinsko premazani FR-ovi" i "rekombinantno površinsko premazani FR-ovi" odnose se na selektivnu zamenu FR ostataka iz, na primer glodarskog V regiona lakog ili teškog lanca, sa humanim FR ostacima, u cilju obezbeđivanja ksenogenih molekula koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje zadržava u najvećoj meri pakovanje strukture prirodnog (native) FR polipeptida. Tehnike površinskog premazivanja su bazirane na razumevanju da su karakteristike vezivanja liganda antigen-vezujućeg mesta određene primarno strukturom i relativnom dispozicijom CDR grupa teškog i lakog lanca u okviru antigen-vezujuće površine. Davies et al.,Ann. Rev. Biochem.59:439-73, 1990. Usled toga, specifičnost vezivanja antigena može se sačuvati u humanizovanom antitelu, naznačeno time da se oprezno održavaju CDR strukture, njihove međusobne interakcije i njihove interakcije sa ostatkom domena V regiona. Upotrebom tehnika površinskog premazivanja, spoljašnji (na primer dostupni rastvaraču) FR ostaci koji su lako dostupni imunom sistemu, selektivno se zamenjuju sa humanim ostacima da bi se obezbedo hibridni molekul koji obuhvata ili slabo imunogenu ili u najvećoj meri ne-imunogenu premazanu površinu površinu.

Proces površinskog premazivanja čini upotrebu dostupnih podataka o sekvencama za humane varijabilne domene antitela opisane od strane Kabat et al., uSequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), dopunjeni u KABAT bazi podataka i drugim dostupnim SAD ili stranim bazama podataka (i nuklenskih kiselina i proteina). Dostupnost rastvaračima amino kiselina V regiona može se izvesti iz poznate trodimenzionalne strukture za humane i misije fragmente antitela. Inicijalno, FR-ovi varijabilnih domena molekula antitela od interesa se porede sa odgovarajućim FR sekvencama humanih varijabilnih domena dobijenih od gore navedenih izora. Najviše homologi humani V regioni se zatim porede ostatak po ostatak sa odgovarajućim mišijim amino kiselinama. Ostaci u mišijem FR koji se razlikuju od humanih odgovarajućih ostataka se zamenjuju sa ostacima prisutnim u humanoj polovini pomoću rekombinantnih tehnika koje su poznate u nauci. Zamena ostataka se izvodi samo u polovinama koje su najmanje delimično izložene (dostupne rastvaraču) i radi se oprezno pri zameni amino kiselinskih ostataka koji mogu imati značajni efekat na tercijarnu strukturu doemna V regiona, kao što su prolin, glicin i naelektrisane amino kiseline.

Na ovaj način, dobijena površinski premazana antigen-vezujuća mesta se dizajniraju da bi zadržala glodarske CDR ostatke, ostatke značajno blizu CDR-ova, ostatke identifikovane kao ukopane ili u najvećoj meri ukopane (nedostupne rastvaraču), ostatke za koje se veruje da učestvuju u ne-kovalentnim (na primer elektrostatičkim i hidrofobnima) kontaktima između doemna lakih i teških lanaca i ostatke iz konzerviranih strukturnih regiona FR-ova za koje se veruje da utiču na "kanonsku" tercijarnu strukturu CDR petlji. Ovi kriterijumi za dizajniranje se zatim koriste za pripremu rekombinantnih nukleinskih sekvenci koje kombinuju FR-ove koji se mogu upotrebiti za transfekciju sisarskih ćelija za ekspresiju rekombinantnih humanih antitela koja pokazuju antigensku specifičnost molekula antitela glodara.

Dodatna metoda za odabiranje antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment je izlaganje faga (phage displav).Videti,na primer, Winter et al., 1994Annu. Rev. Immunol.12:433-55; Burton et al., 1994Adv. Immunol.57:191-280. Humane ili mišije kombinatorne genske biblioteke varijabilnog regiona imunoglobulina mogu se kreirati u fagnim vektorima koji se pregledaju da bi se odabrali Ig fragmenti (Fab, Fv, sFv ili njihovi multimeri) koji se vezuju specifično za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment.Videti,na primer, U.S. Patent No. 5,223,409; Huse et al., 1989Science246:1275-81; Sastrv et al.,Proc. Natl. AcadSci. USA86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al,Strategies in Molecular Biology3:1-9 (1990=; Kang et al., 1991Proc. Natl. AcadSci. USA88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992,J. Molec. Biol.227:381-388; Schlebusch et al., 1997Hybridoma16:47-52 i reference citirane ovde. Na primer, biblioteka koja sadrži mnoštvo polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente varijabilnog regiona Ig mogu se ubaciti u genom filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili njegova varijanta, u fazi sa sekvencom koja kodira protein omotača faga. Fuzioni protein može biti fuzioni protein omotača sa domenom varijabilnog regiona lakog lanca i/ili sa domenom varijabilnog regiona teškog lanca. Na osnovu određenih ostvarenja, imunoglobulinski Fab fragmenti mogu se takođe izložiti na čestici faga[ videti,na primer U.S. Patent No. 5,698,426).

cDNK ekspresione biblioteke teškog i lakog lanca imunoglobulina mogu se takođe pripemiti u lambda fagu, na primer, upotrebom XImmunoZap™(H) i A,ImmunoZap™(L) vektora (Stratagene, La Jojja, California). Ukratko, iRNK se izoluje iz populacije BV ćelija i koristi za kreiranje cDNK ekspresione biblioteke teškog i lakog lanca imunoglobulina u AimmunoZap™(H) i A.ImmunoZap™(L) vektorima. Ovi vektori se mogu pregledati pojedinačno ili ko-eksprimirani da bi se formirali Fab fragmenti ili antitela( videtiHuse et. al., već navedeni;videtitakođe Sastrv et. al., već naveden). Pozitivne plake se zatim mogu prevesti u ne-litički plazmid koji omogućava visok nivo ekspresije fragmenata monoklonalnog antitela uE. coli.

Slično, delovi ili fragmenti, kao što su Fab i Fv fragmenti antitela mogu se takođe konstruisati upotrebom konvencionalne enzimatskc digestijc ili tehnika rekombinantne

DNK, da bi sc ugradili varijabilni regioni gena koji kodiraju antitelo specifično za TGF-beta vezujući protein. U okviru jednog ostvarenja, u hibridomi varijabilni regioni gena koji eksprimira monoklonalno antitelo od interesa se umnožavaju pomoću nukleotidnih prajmera. Ovi prajmeri mogu biti sintetisani od strane naučnika ili mogu biti kupljeni od komercijalno dostupnih izvora.( Videti,na primer, Stratagene (La Jolla, California), koji prodaje prajmere za misije i humane varijabilne regione uključujući između ostalog, prajmere za VHa, VHb, VHc, VHd, CHi, VLi CLregione). Ovi prajmeri mogu biti upotrebljeni za umnožavanje varijabilnih regiona teških i lakih lanaca koji se zatim mogu ubaciti u vektore kao što su ImmunoZAP™ H ili ImmunoZAP™ L (Stratagene). Ovi se vektori zatim mogu ubaciti u E. coli, kvasac ili na sisarima bazirane sisteme za ekspresiju. Velika količina jednolančanog proteina koji sadrži fuziju VHi Vldomena može se proizvesti pomoću ovih metoda( videtiBird et. al.,Science242:423-426, 1988). Pored toga, ovakve tehnike se mogu koristiti za humanizovanje ne-humanog V regiona antitela bez promene specifičnosti vezivanja antitela.

U određenim posebnim ostvarenjima pronalaska, kombinatorne fagne biblioteke mogu se takođe koristiti za humanizaciju ne-humanih varijabilnih regiona.Videti,na primer, Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:22611-18; Rader et al., 1998Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:8910-15. Fagna biblioteka se može pregledati da bi se odabrao fragment varijabilnog regiona Ig od interesa pomoću metoda imunodetekcije poznatih u nauci i koje su ovde opisane i DNK sekvence ubačenog imunoglobulinksog gena u fagu odabrane na taj način mogu se odrediti standardnim tehnikama.Videti,Sambrook et al., 2001Molecular Cloning: A Lahoratory Manual,Cold Spring Harbor Press. Odabrana Ig-kodirajuća sekvenca može se zatim klonirati u drugu pogodan vektor za ekspresiju Ig fragmenta ili opcionalno se može klonirati u vektor koji sadrži konstantne regione Ig, za ekspresiju celih imunoglobulinskih lanaca.

U određenim drugim ostvarenjima ovaj pronalazak razmatra SOST specifična antitela koja su multimerni fragmenti antitela. Korisne metodologije su otkrivene generalno, na primer u Havden et al., 1997,Curr. Opin. Immunol.9:201-12; Coloma et al, 1997Nat. Biotechnol.15:159-63. Na primer, multimerni fargmenti antitela mogu se kreirati tehnikama sa fazima da bi se formirala miniantitela (U.S. Patent No. 5,910,573) ili (Holliger et al., 1997,Cancer Immunol. Immunother.45:128-130).

U određenim ostvarenjima pronalaska, antitelo specifično za SOST, može biti antitelo koje se eksprimira kao intracelularni protein. Ovakva intracelularna antitela se nazivaju i intratela i mogu sadržati Fab fragment ili poželjno scFv fragment( videti,na primer, Lecefert et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:4764-49 (2001). Regioni okosnice koji okružuju CDR regione mogu biti modifikovani da bi se poboljšali nivoi ekspresije i rastvorljivost intratela u intracelularnom redukujućem okruženju( videti,na primer, Worn et al.,J. Biol. Chem.275:2795-803 (2000). Intratelo može biti usmereno na određenu ćelijsku lokaciju ili organelu, na primer konstruisanjem vektora koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilne regione intratela koji mogu biti operativno fuzionisani sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira određeni ciljni antigen u ćeliji( videti,na primer, Graus-Porta et al.Mol. Cell. Biol.15:1182-91 (1995); Lener et al, .,Eur. J. Biochem.267:1196-205 (2000)). Intratelo može biti ubačeno u ćeliju putem različitih tehnika dostupnim naučnicima uključujući preko vektora za gensku terapiju ili lipidne mešavine (na primer Provectin™ proizveden od strane Imgenex Corporation, San Diego, CA) ili na osnovu metoda fotohemijske internalizacije.

Ubacivanje amino kiselinskih mutacija u molekul imunoglobulina specifičnog za TGF-beta vezujući protein može biti korisno radi povećanja specifičnosti ili afiniteta za TGF-beta vezujući protein ili da bi se promenila efektorna funkcija. Imunoglobulini sa višim afinitetom za TGF-beta vezujući protein mogu biti generisani putem mutageneze usmerene na mesto određenih ostataka, trodimenzionalno molekularno modelovanje pomoću kompjutera može se upotrebiti radi identifikovanja amino kiselinskih ostataka koji treba da se promene u cilju poboljšanja afiniteta za TGF-beta vezujući protein.Videti,na primer, Mountain et al., 1992,Biotechnol. Genet. Eng. Rev.10:1-142. Alternativno, kombinatorne biblioteke CDR-ova mogu biti generisane u Ml3 fagu i pregledane za imunoglobulinske fragmente sa poboljšanim afinitetom.Videti,na primer, Glaser et al., 1992,J. Immunol.149:3903-3913; Barbas et al., 1994Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:3908-13; U.S. Patent No. 5,792,456.

Efektorne funkcije mogu biti promenjene putem mutageneze usmerene na mesto (site-directed).Videti,na primer, Duncan et al., 1988Nature332:563-64; Morgan et al., 1995Immunology86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997Biotechnigues23:830-34. Na primer, mutacija mesta za glikozilaciju na Fc delu imunoglobulina može da promeni sposobnost imunoglobulina da fiksira komplement.Videti,na primer, Wright et al., 1997.Trends Biotechnol.15:26-32. Druge mutacije u domenima konstatnog regiona mogu promeniti sposobnost imunoglobulina da fiksira komplement ili da utiču na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela.Videti,na primer, Duncan et al., 1988Nature332:563-64; Morgan et al., 1995Immunology86:319-24; Sensel et al., 1997Mol. Immunol.34:1019-29.

Na osnovu određenih ostvarenja, ne-humani, humani ili humanizovani varijabilni regioni teškog i lakog lanca bilo kog molekula Ig koji je ovde opisan mogu biti konstruisani kao jednolančani Fv (scFv) polipeptidni fragmenti (jednolančana antitela).Videti,na primer, Bird et al., 1988Science242:423-426; Huston et al., 1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883. Multifunkcionalni scFv fuzioni proteini mogu biti generisani povezivanjem polinukleotidne sekvence koja kodira scFv polipeptid u fazi sa najmanje jednom polinukleotidnom sekvencom koja kodira neki od mnogih poznatih efektornih proteina. Ove metode su poznate u nauci i otkrivene su, na primer u EP-B1-0318554, U.S. Patent No. 5,132,403, U.S. Patent No. 5,091,513 i U.S. Patent No. 5,476,786. Kao primer, efektorni proteini mogu da obuhvate sekvence konstantnih regiona imunoglobulina.Videti,na primer, Hollenbaugh et al., 1995J. Immunol. Methods188:1-7. Drugi promeri efektornih proteina su enzimi. U ne-limitirajućiem primeru ovakav enzim može da obezbedi biološku aktivnost za terapeutske svrhe( videti,na primer, Siemers et al., 1997Bioconjug. Chem.8:510-19) ili može obezbediti detektabilnu aktivnost, kao što je konverzija katalizovana peroksidazom rena bilo kog od brojnih poznatih substrata u detektabilni proizvod za dijagnodtičke upotrebe. Još neki primeri scFv fuzionih proteina uključuju Ig-toksin fuzije ili imunotoksine, naznačeno time daje scFv polipeptid povezan sa toksinom.

scFv ili bilo koji fragment antitela koji je ovde opisan može u određenim ostvarenjima biti fuzionisan sa peptidnim ili polipeptidnim domenima koji dozvoljavaju detekciju specifičnog vezivanja između fuzionog proteina i antigena (na primer TGF-beta vezujući protein). Na primer, domen fuzionog polipeptida može biti afinitativni "tag"

(obeleživač) polipeptid za detekciju vezivanja scFv fuzionog proteina za TGF-beta vezujući protein pomoću različitih tehnika sa kojima će naučnici iz ove oblasti biti

familijarni. Primeri "tag" (obeleživač) polipeptida, uključuju avidin, streptavidin ili His (na primer polihistidin). Tehnike detekcije mogu takođe uključiti na primer, vezivanje fuzionog proteina sa avidinom ili streptavidinom za biotin ili za sekvence koje oponašaju biotin( videti,na primer, Luo et al., 1998J. Biotechnol.65:225 i reference citirane ovde), direktnu kovalentnu modifikaciju fuzionog proteina sa detektabilnim delom (polovinom) (na primer polovina za obeležavanje), nekovalentno vezivanje fuzionog proteina sa specifično obeleženim reporter molekulom, enzimatsku modifikaciju detektabilnog supstrata od strane fuzionog proteina koji uključuje deo koji poseduje enzimatsku aktivnost ili imobilizaciju (kovalentnu ili nekovalentnu) fuzionog proteina na potpori čvrste faze. Drugi korisni afinitativni polipeptidi za konstruisanje scFv fuzionih proteina mogu uključiti streptavidin fuzione proteine, kao što je otkriveno u WO 89/03422, U:S: 5,489,528, U:S: 5,672,691, WO 93/24631, U:S: 5,168,049, U:S: 5,272,254; avidin fuzione proteine( videti,na primer, EP 511,747); enzim kao glutation-S-transferaza; i protein A polipeptidStaphylococcus aureus.

Polinukleotidi koji kodiraju antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za TGF-beta vezujući protein, kao što je ovde opisano, mogu biti propagirani i eksprimirani na osnovu bilo koje od mnogih dobro poznatih procedura za isecanje, ligaciju, transformaciju i transfekciju upotrebom mnogobrojnih poznatih vektora. Zato, u određenim ostvarenjima ekspresija fragmenta antitela može biti poželjna u prokariotskom domaćinu kao što je Escherichia coli( videti,na primer, Pluckthun et al., 1989Methods Enzymol.178:497-515). U određenim drugim ostvarenjima ekspresija antitela ili fragmenta antitela može biti poželjna u eukariotskoj domaćinskoj ćeliji uključujući kvasac (na primer,Soccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombeiPichia pastoris),životinjskim ćelijama (uključujući sisarske ćelije) ili biljnim ćelijama. Primeri pogodnih životinjskih ćelija uključuju, ali bez ograničavanja, mijeloma (kao mišija NSO linija), COS, CHO ili hibridoma ćelije. Primeri biljnih ćelija uključuju ćelije duvana, kukuruza, soje i pirinča.

Jedan ili više replikativnih vektora koji sadrže DNK koja kodira varijabilni i/ili konstantni region, mogu se pripremiti i koristiti za transformaciju odgovarajuće ćelijske linije, na primer mijeloma ćelijske linije koja nije proizvođač, kao što je mišija NSO linija ili bakterija kao E. coli, u kojima će se odigrati proizvodnja antitela. U cilju dobijanja efikasne transkripcije (prepisivanje) i translacije (prevođenje), DNK sekvenca u svakom vektoru trabela bi da uključu odgovarajuće regulatorne sekvence, posebno promotorsku i vodeću (lider) sekvencu koje su operativno povezane sa sekvencom varijabilnog domena. Posebne metode za proizvodnju antitela na ovaj način generalno su dobro poznate i rutinski se koriste. Na primer osnovne procedure molekularne biologije opisane su u Maniatis et al.,( Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed., Cold Springs Harbor Laboratorv, New York, 1989;videtitakođe Maniatis et al., 3rd ed., Cold Springs Harbor Laboratorv, Nevv York, (2001)). DNK sekvenciranje može se izvršiti na način opisan u Sanger et al., (PNAS 74:5463, (1977) i Amersham International plc sequencing handbook i mutageneza usmerena na mesto može se obaviti u skladu sa metodama poznatim u nauci (Kramer et al.,Nucleic Acids Res.12:9441, (1984); KunkelProc. Natl. Acad. Sci. USA82:488-92 (1985); Kunkel et al.,Methods in Enzymol.154:367-82 (1987); Anglian Biotechnologv Ltd. Handbook). Dodatno, brojni radovi opisuju tehnike pogodne za pripremu antitela putem manipulacije sa DNK, kreiranjem ekspresionih vektora i transformisanjem odgovarajućih ćelija (Mountain A and Adair, J Rin Biotechnology and geneticEngineering Reviews(ed. Tombs, MP, J_0, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK); International Patent Specification No. WO 91/09967).

U određenim ostvarenjima, antitelo na osnovu pronalaska može da ima jedan ili više efektornih ili reporter molekula vezanih za sebe. Reporter molekul može biti detektabilni deo (polovina) ili obeležje kao enzim, citotoksični agens ili drugi reporter molekul, uključujući boju, radionuklid (radionuclid), luninescentnu grupu, ili biotin, ili slične. TGF-beta vezujući porte TGF-beta vezujući protein-specifični imunoglobulin ili njegov fragment može biti radioaktivno obeležen za dijagnostičke ili terapeutske primene. Tehnike radio-obeležavanja antitela poznate su u nauci.Videti,na primer, Adams 1998In vivo12:11-21; Hiltunen 1993Acta Oncol.32:831-9. Terapeutske primene opisane su detaljnije u tekstu koji sledi i mogu uključiti upotrebu TGF-beta vezujući protein - specifičnih antitela (ili njihovih fragmenata) u konjunkciji sa drugim terapeutskim agensima. Efektorni ili reporter molekuli mogu biti vezani za antitelo preko bilo kog bočnog lanca amino kiseline, terminalne amino kiseline ili ugljovodonične funkcionalne grupe locirane u antitelu, pri čemu mora biti obezbeđeno da vezivanje ili proces vezivanja ne utiče nepovoljno na osobine vezivanja tako da je korisnost molekula poništena. Određene funkcionalne grupe uključuju na primer, bilo koju slobodnu amino, imino, tiol, hodroksi ili aldehidnu grupu. Vezivanje antitela i efektorskog i/ili reporter molekula može se ostvariti preko ovakvih grupa i odgovarajuće funkcionalne grupe u efektorskom ili reporter molekulu. Povezivanje može biti direktno ili indirektno preko grupa za povezivanje ili stvaranje mesta.

Efektorni molekuli uključuju na primer, antineoplastične agense, toksine (kao enzimatski aktivne toksine bakterijskog porekla (kaoPseudomonas aeruginosaegzotoksin A) ili biljnog porekla i njihove fragmente (na primer, ricinus i njegove fragmente, biljni gelonin, briodin izBrionia dioicaili slično.Videti,na primer, Thrush et al., 1996Annu. Rev. Immunol.14:49-71; Frankel et al., 1996Cancer Res.56:926-32). Dodatni efektorni molekuli uključuju biološki aktivne proteine (na primer enzime), nukleinske kiseline i njihove fragmente, prirodne i sintetičke polimere, na primer, polisaharide i polialkilne polimere kao što je poli(etilen glikol) i njegovi derivati, radionuklide, posebno radiojodid i helirane metale. Pogodne reporter grupe uključuju helirane metale, fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti detektovana NMR-om ili ESR spektrometrijom. Posebno korisne efektorne grupe su kalcihemicin i njegovi derivati( videti,na primer, South African Patent Specification Nos. 85/8794, 88/8127 i 90/2839).

Brojni drugi toksini uključujući hemoterapeutske agense, anti-mitotičke agense, antibiotike, inducere apoptoze (ili "apoptogene"videti,na primer, Green i Reed,1998, Science281:1309-1312) ili slične, poznati su onima koji se bave naukom, i primeri koji su ovde obezbeđeni nalaze se ilustracije radi bez namere da ograničavaju opseg ili duh pronalaska. Određeni neoplastični agensi uključuju citotoksične i citostatične agense, na primer aliklirajuće agense, kao što su azotni "mustards" (senf)

(na primer, hlorambucil, melfalan, mehloretamin, ciklofosfamid ili uracil "mustard") i njihove derivate, trietilenfosforamid, trietlienetiofosfor-amid, busulfan ili cispaltin; antimetabolite kao metotreksat, fluoruracil, floksuridin, citarabin, merkaptopurin, tioguanin, fluorsirćetna kiselina ili fluor-limunska kiselina, antibiotici, kao bleomicini (na primer bleomicin sulfat) doksorubicin, daunorubicin, mitomicini (na primer mitomicin C), aktinomicini (na primer daktinomicin) plikamicin, kalihemicin i njegovi derivati ili esperamicin i njegovi derivati; mitotičke inhibitore kao etopside, vinstriktin

ili vinblastin i njihove derivate; alkaloidekao elipticin; poliole kao taksicin I ili taksicin II; hormone kao andorgene (na primer, demostanolon ili testolakton), progestine (na primer megestrol acetat ili medroksiprogesteron acetat), estrogene (na primer dimetilstilbestrol difosfat, poliestradiol fosfat ili estramustin fosfat) ili antiestrogene (na primer tamoksifen); antrakinone, kao mitoksantron, uree, kao hidroksiurea; hidrazine kao prokarbazin; ili imidazole kao dekarbazin.

Helirani metali korisni kao efektorni molekuli uključuju helate di- ili tripozitivnih metala koji sadrže koordinantni broj od 2 do 8. Posebni primeri ovakvih metala uključuju tehnetijum (Tc), renijum (Re), kobalt (Co), bakar (Cu), zlato (Au), srebro (Ag), olovo (Pb), bizmut (Bi), indijum (in), galijum (Ga), itrijum (Y), terbijum (Tb), gadolinijum (Gd) i skandijum (Sc). Deneralno poželjno je da je metal radionuklid. Posebni radionuklidi uključuju 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, l95Au, 199Au,,<10>Ag,<203>Pb,<206>Bi,<207>Bi,<m>In,<67>Ga.<68>Ga,<88>Y,<90>Y,<160>Tb,<l53>Gd i<47>Sc. Helirani metal može biti na primer jedan od gore navedenih metala heliranih sa bilo kojim pogodnim poliadenilatnih helirajućim agensom, na primer acikličnim ili cikličnim poliaminima, polietrima (na primer krunski etri ili njihovi derivati), poliamidima, porfirinima, i karvocikličnim derivatima. Generalno, tip helirajućeg agensa zavisiće od metala koji se koristi. Jedna posebno korisna grupa helirajućih egansa u konjugatima na osnovu pronalaska, međutim, sadrži dietilentriaminpenta sirćetnu kiselinu i njene derivate i makrociklične amine, na primer ciklične tri-aza i tetraza- derivate (na primer, kao što je opisano u International Patent Specification No. WO 92/22583); i poliamide, posebno deseferioksamin i njegove derivate.

Kada se tiolna grupa koristi u antitelu kao mesto spajanja, efektorni molekul može biti spojen na osnovu reakcije koja se odigrava sa tiol-reaktivnom grupom koja je prisutna u efektornom ili reporter molekulu. Primeri ovakvih grupa uključuju a-halokarboksličnu kiselinu ili etar, kao što je jodoacetamid, imid, kao malemid, vinilsulfon ili isulfid. Ove i druge procedure povezivanja su generalno i detaljnije opisane u International Patent Specification No. WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/01476.

Pronalazak takođe razmatra stvaranje anti-idiotipskih antitela koja prepoznaju antitelo (ili njegov antigen vezujući deo) koji se specifično vezuju za SOST polipeptid koji je ovde obezbeđen ili njegovu varijantu ili fragment. Anti-idiotipska antitela mogu biti stvorena kao polikionalna antitela ili monoklonalna antitela metodama koje su opisane ovde, korišćenjem anti-TGF-beta vezujući protein antitela (ili njegovog antigen vezujućed fragmenta) kao imunogena. Anti-idiotipska antitela ili njihovi fragmenti mogu takođe biti generisani bilo kojim metodama rekombinantnog genetičkog inženjerstva koje su gore opisane ili selekcijom pomoću izlaganja faga. Anti-idiotipska antitela mogu reagovati sa antigen vezujućim mestom anti-SOST antitela tako da je vezivanje antitela za SOST polipeptid kompetitivno inhibirano. Alternativno, anti-idiotipsko antitelo, kao što je ovde obezbeđeno, ne mora kompetitivno da inhibira vezivanje anti-TGF-beta vezujući protein antitela za TGF-beta vezu jući protein.

U određenim ostvarenjima pronalaska, antitelo koje se specifično vezuje za SOST može se koristiti za detektovanje ekspresije SOST polipeptida. U određenim posebnim ostvarenjima, jedno antitelo ili panel antitela može se izložiti ćelijama koje eksprimiraju SOST polipeptid i ekspresija SOST polipeptida se može odrediti detekcijom, upotrebom drugog SOST specifičnog antitela koje se vezuje za različiti epitop u odnosu na antitelo ili antitela koja su prvo korišćena u eseju.

ESEJI ZA SELEKCIJU AGENASA KOJI POVEĆAVAJU GUSTINU KOSTI

Kao što je diskutovano prethodno u tekstu, ovaj pronalazak obezbeđuje metode za selekciju i/ili izolaciju agenasa koji su sposobni da povećaju gustinu kosti. U određenim poželjnim ostvarenjima, agens je antitelo koje se specifično vezuje za SOST (TGF-beta vezujući protein) ili njegovu varijantu ili fragment. Na primer, u okviru jednog ostvarenja ovog pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje da li je agens sposoban da poveća mineralnu gustinu kosti i koje obuhvataju korake (a) kontaktiranja ili mešanja kandidatnog agensa sa TGF-beta vezujućim proteinom i članom TGF-beta familije proteina i (b) određivanja da li kandidatni agens stimuliše signalizaciju od strane TGF-beta familije proteina, ili oslabljuje ili inhibira vezivanje TGF-beta vezujući protein za jedan ili više članova TGF-beta familije proteina. U okviru određenih ostvarenja, agens pojačava sposobnost TGF-beta da funkcioniše kao pozitivni regulator diferencijacije mezemnhimalnih ćelija.

U poželjnom ostvarenju pronalaska, obezbeđena je metoda za identifikovanje antitela koje moduliše TGF-beta signalni put koji obuhvata kontaktiranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid sa SOST peptidom, uključujući ali bez ograničenja, peptide koji su ovde otkriveni, u uslovima i vremenskom periodu koji su dovoljni da se dozvoli formiranje antitelo plus (+) SOST (antitelo/SOST) kompleksa i zatim detektuje nivo (na primer kvantifikovanje količine) SOST/antitelo kompleksa, da bi se odredilo prisustvo antitela koje moduliše TGF-beta signalni put. Metoda se može izvesti pomoću SPR ili pomoću bilo kog broja imunoeseja poznatih u nauci koji su ovde opisani, uključujući ELISA, "immunoblot" analizu ili slične. TGF-beta signalni put obuhvata signalni put u kome se BMP vezuje za receptor tipa I i tipa II na ćeliji da bi se stimulisao ili indukovao put koji moduliše mineralni sadržaj kosti. Ovakvo antitelo može biti identiflkovano upotrebom metoda opisanih ovde, da bi se detektovalo antitelo sa SOST specifičnim peptidima.

Metode koje su predmet pronalaska takođe se mogu koristiti za identifikaciju antitela koja oslabljuju, inhibiraju (uključujući kompetitivno inhibiranje) ili sprečavaju vezivanje BMP za SOST polipeptid putem detektovanja da li se antitelo vezuje za SOST peptide koji su locirani u regionima ili delovima regiona na SOST za koje se BMP vezuje, kao što su peptidi na amino terminalno kraju SOST i peptidi koji uključuju amino terminalne amino kiselinske ostatke i deo regiona srži (srž za pristajanje) SOST (na primer SEQ ID NOs:2-19, 21-28 i 47-50). Metode iz ovog pronalaska mogu se takođe koristiti za identifikaciju antitela koje oslabljuje, sprečava ili inhibira formiranje SOST homodimera. Ovakvo antitelo koje se specifično vezuje za SOST može biti identiflkovano putem detektovanja vezivanja antitela za peptide koji su izvedeni iz srži karboksi terminalnog regiona SOST (na primer SEQ ID NOs:29-46 i 51-54).

U okviru drugih ostvarenja pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje da li je agens sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti i obuhvataju korake (a) kontaktiranja kandidatnog agensa sa ćelijom koja eksprimira TGF-beta vezujućim proteini (b) određivanja da Ii ekspresija TGF-beta vezujućeg proteina u izloženim ćelijama smanjuje ili da Ii se smanjuje aktivnost TGF-beta vezujućeg proteina i samim tim se određuje da li je jedinjenje sposobno da poveća mineralni sadržaj kosti. U okviru jednog ostvarenja, ćelije mogu uključiti spontano transformisanu ili netransformisanu humanu kost poreklom iz koštane biopsije ili pacovske osteoblaste kosti.

Imunoeseji se mogu koristiti za detektovanje i kvantifikaciju ekspresije TGF-beta vezujućeg proteina i uključuju na primer Imuno-elektroforezu nasuprot smera struje (CIEP, Countercurrent Immuno-Electrophoresis), radioimunoeseje, radioimunoprecipitacije, ELISA (esej imunoabsorbcije povezan sa enzimom), eseje "immunoblot" kao što je tačkasti "blot" esej i "Western blot " esej, eseje inhibicije ili kompeticije i sendvič eseje( videtiU.S. Patent Nos. 4,376,110 i 4,486,530;videti,takođeAntibodies: A Laboratory Manual,već naveden). Ovakvi imunoeseji mogu koristiti antitelo koje je specifično za TGF-beta vezujući protein kao ovde opisana anti-sklerostin antitela ili mogu koristiti antitelo koje je specifično za reporter molekul koji je pričvršćen za TGF-beta vezujući protein. Nivo ekspresije polipeptida može se takođe odrediti kvantifikovanjem količine TGF-beta vezujućeg proteina koje se vezuje za ligand TGF-beta vezujućeg proteina. U cilju primera navodimo da se vezivanje sklerostina za BMP u uzorku može detektovati površinskom "plasmon" rezonancom. Alternativno, može se detektovati nivo ekspresije iRNK koja kodira specifičan TGF-beta vezujući protein.

U drugim ostvarenjima, antitelo specifično za SOST može se koristiti u metodi, kao što je esej kompeticije, u kome se kandidatni agensi pregledaju da bi se identifikovao agens koji će kompetirati sa antitelom za vezivanje za TGF-beta vezujući protein. Interakcija između antitela i TGF-beta vezujućeg proteina može se odrediti upotrebom metoda imunoeseja poznatih u nauci i koje su ovde opisane.

U cilju primera navodimo to da se član familije TGF-beta superfamilije, kao što je TGF-beta vezujući protein ili član TGF-beta superfamilije koji je ligand TGF-beta vezujućeg proteina, prvo vezuje za čvrstu fazu, nakon čega sledi dodavanje kandidatnog agensa. Ligand člana TGF-beta superfamilije koji je vezan za čvrstu fazu dodaje se zajedno ili se dodaje u sledećem koraku, zatim se čvrsta faza ispira i određuje se količina liganda koji se vezao za člana familije i koji ukazuje na to da li kandidatni agens blokira vezivanje liganda za člana TGF-beta familije. Alternativno, lignad člana TGF-beta superfamilije može biti vezan za čvrstu fazu, član TGF-beta superfamilije se može dodati istovremeno sa dodatkom kandidatnog molekula ili u sledećem koraku. Količina liganda koja se vezuje za člana TGF-beta superfamilije može se meriti obeležavanjem liganda sa detektabilnim molekulom na osnovu metoda poznatih u nauci i metoda koje su ovde opisane. Alternativno, vezivanje liganda za člana TGF-beta superfamilije može se meriti dodavanjem jednog ili više detektujućih molekula, kao što je antitelo ili njegov fragment, koje se specifično vezuje za ligand i kvantifikovanjem količine molekula koji se veže za ligand. Agensi koji su pogodni za upotrebu u povećanju mineralnog sadržaja kosti, kao što je ovde opisano, su oni agensi koji smanjuju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za njegov ligand, koji je član TGF-beta superfamilije na statistički značajan način.

U okviru drugih ostvarenja pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje toga da li je agens sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti i obuhvataju (a) kontaktiranje kandidatnog agensa sa TGF-beta vezujućim proteinom i selektovanim članom TGF-beta proteinske familije i (b) određivanje da li selektovani agens pojačava signalizaciju ("up" reguliše") TGF-beta proteinske familije ili inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. U okviru određenih ostvarenja, molekul pojačava sposobnost člana TGF-beta familije da funkcioniše kao pozitivni regulator diferencijacije mezenhimskih ćelija.

Slično gore opisanim metodama, različite metode se mogu koristiti za procenu stimulacije člana TGF-beta familije sa test jedinjenjem, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za SOST. Jedna ovakva reprezentativna metoda( videti takođe,Durham et al.,Endo.136:1374-1380) obuhvata vezivanje člana TGF-beta familije kao što je BMP (na primer BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7) za čvrstu fazu u koncentarciji koja je ekvivalentna njegovoj Kd. Konstanta disocijacije (Kd) meože se odrediti na osnovu metoda za merenje konstanti stope vezivanja poznatih u nauci, kao što je površinska "plasmon" rezonanca upotrebom BIAcore instrumenta na osnovu tehnika poznatih u nauci i koje su opisane od strane proizvođača (Biosensor, Piscataway, NJ). Kolekcija antagonističkih kandidatnih agenasa se zatim dodaje u fiksnim koncentracijama (tipično 20 uM za kolekcije malih organskih molekula (izolovani mali organski molekul kao što se ovde koristi znači da je molekul više od 90% čist što je utvrđeno na osnovu metoda koje su dobro poznate u nauci (na primer NMR, tačka topljenja) i 1 uM za kandidatna antitela). Agens se matra antagonistom ovih interakcija kada agens inhibira vezivanje BMP za SOST, što znači da je primećeno smanjenje u nivou vezivanja za najmanje 40%, 50% ili 60% i još poželjnije 80% ili 90%, kada se uporedi sa nivoom BMP vezivanja za SOST koji se beleži u odsustvu agensa. Ovakav agens može biti dalje procenjen kao potencijalni inhibitor na bazi studija titracije na osnovu kojih se određuje konstanta inhibicije i njen uticaj na afinitet vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina. Takođe se mogu izvesti kontrolni eseji poređenja specifičnosti da bi se utvrdio selektivni profil za identifikovanog antagonistu na osnovu studija u kojima su korišćeni eseji koji zavise od akcije t.j delovanja BMP ligada (na primer studije kompeticije BMP/BMP receptora).

U okviru drugih dodatnih ostvarenja, obezbeđene su metode za određivanje da li je kandidatni agens sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti, koje obuhvataju korak određivanja da li kandidatni agens inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za kost ili njegov analog. Kao što se ovde koristi, treba razumeti da se kost ili njegov analog odnose na hidroksiapatit ili površinu koja je sastavljena od praškaste forme kosti, smrvljene kosti ili intaktne kosti. Slično ovde opisanim metodama, mogu se koristiti različite metode za procenu inhibicije TGF-beta vezujućeg proteina lokalizacije za matriks kosti( videti,na primer, Nicolas et al.,Calcif. Tissue Int.47:206-12 (1995)).

Dok se metode koje su ovde opisane odnose na pojedinačni kandidatni agens, ovaj pronalazak ne bi trebao da bude tako ograničavajući. Kao što je ovde opisano, kandidatni agensi mogu biti mali organski molekuli, ili mogu biti antitela, ili njihovi fragementi, ili drugi peptidi ili polipeptidi. Antitela ili njihovi fragementi mogu biti identifikovani pregledanjem biblioteka antitela ili fragmenata antitela ili mogu biti pripremljeni metodama koje su ovde opisane. Zato pomenute metode mogu dalje da sadrže korak izolacije agensa koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije.

U jednom ostvarenju pronalaska, antitelo ili njegov antigen vezujući-fragement koji se specifično vezuju za SOST polipeptid sposobni su za kompetitivnu inhibiciju vezivanja člana TGF-beta familije za SOST polipeptid. Sposobnost antitela ili fragmenta antitela da oslabi ili blokira vezivanje člana TGF-beta familije, kao što je BMP za SOST, može se odrediti na osnovu bilo kojih ovde opisanih metoda. Antitelo ili fragment antitela koje se specifično vezuje za SOST može da oslabljuje, blokira ili spreči vezivanje člana TGF-beta familije za SOST putem oslabljivanja formiranja SOST homodimera. Antitelo koje se specifično vezuje za SOST, može se takođe koristiti za identifikovanje aktivnosti SOST putem inhibiranja ili oslabljuju SOST vezivanje za BMP. Alternativno, antitelo ili njegov fragment, može se ubaciti u esej baziran na ćelijama ili u životinjski model u kome SOST ima definisanu aktivnost, da bi se odredilo da li antitelo menja ovu aktivnost (povećava ili smanjuje na statistički značajan način). Antitelo ili njegov fragment, koje se specifično vezuje za SOST, može se koristiti za proučavanje efekta takvog antitela u putu signalne transdukcije i tako se može modulisati (stimulisati ili inhibirati) signalni put. Poželjno, vezivanje antitela za SOST rezultuje u stimulaciji ili indukciji signalnog puta.

PRODUKCIJA PROTEINA

Polipeptidi koji su ovde opisani uključuju TGF vezujući protein sklerostin i njegove varijante, i antitela i njihove fragmente koji se specifično vezuju za sklerostin. Polinukleotidi koji kodiraju ove polipeptide uključuju derivate koji su u značajnoj meri slični polinukleotidima (i kada je primereno, proteinima - uključujući peptide i polipeptide koji su kodirani polinukleotidima i njihovim derivatima). Kao što se ovde koristi, nukleotidna sekvenca se smatra da je "u značajnoj meri slična" ako (a) je nukleotidna sekvenca izvedena iz kodirajućeg regiona ovde opisanih polinukleotida i uključuje na primer, delove sekvence ili alelske varijante sekvenci o kojima se raspravlja u tekstu iznad, ili alternativno kodira molekul koji inhibira vezivanje TGF - beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije; (b) je polinukleotid sposoban da hibridizuje sa polinukleotidom koji je ovde obezbeđen u umerenim, jako i izuzetno jako striktnim uslovima( videtiSambrookMolecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed., Cold Spring Harbor Press, NY, 2001); i/ili (c) je polinukleotidna sekvenca izrođena u odnosu na sekvence za određenu amino kiselinu polinukleotidnim sekvencama koje su opisane u (a) ili (b). Dalje, ovde otkriveni molekul nukleinske kiseline uključuje i komplementarne i nekomplementarne sekvence, s' tim da sekvence na drugi način zadovoljavaju kriterijume koji su ovde postavljeni. U kontekstu ovog pronalaska, visoko restriktivni uslovi znače standardne uslove za hibridizaciju (na primer 5XSSPE, 0,5% SDS na 55-60°C ili ekvivalent; 5xSSPE (lxSSPE =180 mM natrijum hlorid; 10 mM natrijum fosfat; 1 mM EDTA (pll 7.7); 5xDenhard-ov rastvor (100 x Denhard-ov = 2% (w/v) serum albumin govečeta, 2% (vv/v) fikol, 2 % (w/v) polivinilpirolidon); i 0.5% SDS). Pranja nakon hibridizacije su visoko restriktivna i tipično se izvode u 0.5xSSC (lxSSC = 150 mM natrijum hlorid, 15 mM trinatrijum citrat) ili u 0.5xSSPE na55-60°C.

Polinukleotidi koji kodiraju SOSt mogu biti izolovani iz genomske ili cDNK biblioteke

iz ćelija u biološkom uzorku, tkivima, ćelijskim linijama i mogu se pripremiti upotrebom različitih tehnika( videti,na primer Sambrook, već naveden). Na primer, polinukleotid može biti umnožen lančanom reakcijom polimeraze (PCR) pomoću sekvencno specifičnih prajmera koji su dizajnirani na bazi ovde obezbeđenih sekvenci i koji mogu biti kupljeni ili sintetisani. Polinukleotidi mogu takođe biti dobijeni pregledanjem cDNK biblioteka pomoću sekvencno specifičnih proba i prajmera. Opšte metode za pregledavanje biblioteka putem PCR-a obezbeđene su od strane, na primer Yu et al., "Use of the Polimerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," uMethods

in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Potocols: Current Methods and Applications,

White (ed.) strane 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Dodatno, tehnike za upotrebu PCR-a za izolaciju srodnih gena opisane su od strane, na primer, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polvmerase Chain Reaction to Clone Gene Famoly Members," uMethods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications,White (ed.), strane 317-337 (Humana Press, Inc. 1993).

Sekvenca cDNK TGF-beta vezujućeg proteina ili genomskog fragmenta TGF-beta vezujućeg proteina može se odrediti upotrebom standardnih metoda. Dalje, identifikacija genomskih fragmenata koji sadrže promotor ili regulatorni element TGF-beta vezujućeg proteina može se postići upotrebom dobro ustanovljenih tehnika, kao što je deleciona analiza( videti, generalno,Ausubel (1995)).

Kao alternativa, polinukleotid koji kodira TGF-beta vezujući protein može se dobiti sintetisanjem DNK molekula pomoću međusobno "priming" (mogu se međusobno spojiti) dugih oliginukleotida i nukleotidnih sekvenci koje su ovde opisane( videti,na primer, Ausubel (1995) na stranama 8-8 do 8-9). Ako se PCR primeni u metodi moguće je sintetisati molekule DNK od najmanje dve kilobaze u dužini (Adang et al.,Plant molec. Biol.21:1131, 1993; Bambot et al.,PCR Methods and Applications2:266, 1993; Dillon et al., "Use of Polvmerase Chain Reaction for Rapid Construction of Svnthetic Genes," uMethods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications,White (ed.), strane 263-268 (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al.,PCR Methods Appl.4:299,1995).

Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju TGF-beta vezujući protein mogu se dobiti pregledavanjem različitih genomskih ili cDNK biblioteka sa polinukleotidnim probama koje imaju nukleotidne sekvence bazirane na SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 i 69 korišćenjem metoda koje su ovde opisane. Polinukleotidne varijante TGF-beta vezujućeg proteina takođe se mogu sintetički konstruisati. Na primer, molekul nukleinske kiseline može se dizajnirati tako da kodira polipeptid koji ima konzervativnu amino kiselinsku promenu, kada se uporedi sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NOs: 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 ili 70. To znači da se mogu dobiti varijante koje imaju jednu ili više amino kiselinskih zamena SEQ ID NOs: 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 ili 70, u kojima je alkil amino kiselina zamenjena sa alkil amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina; aromatična amino kiselina zamenjena sa aromatičnom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina; amino kiselina koja sadrži sumpor zamenjena sa amino kiselinom koja sadrži sumpor u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina; amino kiselina koja sadrži hidroksi grupu zamenjena sa amino kiselinom koja sadrži hidroksi grupu u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina; kisela amino kiselina zamenjena sa kiselom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina; bazna amino kiselina zamenjena sa baznom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina; ili dibazna monokarbokslina amino kiselina zamenjena sa dibaznom monokarbokslinom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina.

Među čestim amino kiselinama, na primer, konzervativna amino kiselinska zamena se ilustruje zamenom između amino kiselina u okviru svake od sledećih grupa: (1) glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin (sadrže bočni lanac sa nepolarnom alkil grupom); (2) fenilalanin, tirozin i triptofan (sadrže aromatični bočni lanac); (3) serin itreonin (bočni lanac sa hidroksilnom grupom); (4) aspartat i glutamat (bočni lanac sa karboksinom kiselinskom grupom); (5) glutamin i asparagin (bočni lanac sa amidnom grupom); i (6) lizin, arginin i histidin (bočni lanac saamino grupom). U pravljenu ovakvih zamena, važno je, naravno tamo gde je moguće, zadržati cisteinsku okosnicu podvučenu na slici 1.

Konzervativne amino kiselinske zamene u SOST mogu se uneti zamenom nukleotida sa nukleotidima pomenutim u bilo kom SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 ili 69. Ovakve konzervativne amino kiselinske varijante mogu se dobiti, na primer, mutagenezom usmerenom sa oliginukleotidom, mutagenezom skeniranja povezujuće sekvence, mutagenezom pomoću lančane reakcije polimeraze i sličnih( videtiAusubel

(1995) na stranama 8-10 do 8-22; i McPherson (ed),Directed Mutagenesis: A Practical Approach(IRL Press 1991)). Funkcionalna aktivnost ovakvih varijanti može se odrediti upotrebom standardnih metoda i eseja koji su ovde opisani. Alternativno, varijanta polipeptida TGF-beta vezujućeg proteina zadržava sposobnost da se specifično veže za anti-SOST antitela.

Rutinske delecione analize molekula nukleinskih kiselina mogu se izvesti da bi se dobili "funkcionalni fragmenti" molekula nukleinske kiseline koja kodira polipeptid TGF-beta vezujućeg proteina. U cilju izlustracije navodimo da DNK molekuli koji imaju bilo koju nukleotidnu sekvencu od SEQ ID NO:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 ili 69 mogu biti isečene sa Bal31 nukleazom da bi se dobila serija "nested" ugnjezđenih delecija. Fragmenti se zatim ubacuju u ekspresione vektore u odgovarajućem smeru okvira čitanja i eksprimirani polipeptidi se izoluju i testira im se njihova aktivnost ili se testira njihova sposobnost da se vežu za anti- TGF-beta vezujući protein antitela. Jedna alternativa sečenju sa egzonukleazom je upotreba mutageneze sa usmerenim oligonukleotidom da bi se ubacile delecije ili stop kodoni, da bi se specifirala proizvodnja željenog fragmenta. Alternativno, određeni fragmenti polipeptida koji kodira TGF-beta vezujući protein, mogu biti sintetisani pomoću lančane reakcije polimeraze. Pored eseja i metoda koje su ovde otkrivene, standardne tehnike za funkcionalnu analizu proteina opisane su u, na primer, Treuter et al.,Molec. Gen. Genet.240:113, 1993; Content et al., "Expression and preliminarv deletion analvsis of the 42kDa 2-5A svnthetase induced by human interferon," uBiological Interferon System, Proceedings of ISIR- TNO Meeting on Interferon Systems,Cantell (ed.), strane 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," uControl of Animal Cell Proliferation, Vol. 1,Bovnton et al., (eds.) strane 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al.,J. Biol. Chem.270:29270, 1995; Fukunaga et al.,J. Biol. Chem.270:25291, 1995; Yamaguchi et al.,Biochem. Pharmacol.50:1295,1995; i Meisel et al., Plant Molec. Biol.30:1, 1996.

Struktura polipeptida koji su kodirani od strane molekula nukleinskih kiselina koje su ovde opisane mogu se predvideti na osnovu primarnih translacionih (prevođenje) proizvoda pomoću "plot" funkcije hidrofobnosti od na primer, P/C Gene ili Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mountain View, California), ili na osnovu metoda opisanih od straneKvte i Doolittle(./. Mol. Biol.157:105-132, 1982). Polipeptidi mogu biti pripremljeni u obliku kiselih ili baznih soli, ili u neutralnoj formi. Pored toga, pojedinačni amino kiselinski ostaci mogu biti modifikovani putem oksidacije ili redukcije. Dalje, različite zamene, delecije ili adicije mogu se izvršiti na amino kiselinskim ili nukleo kiselinskim sekvencama, čiji je ukupan efekat zadržavanje ili dalje pojačavanje ili smanjenje biološke aktivnosti mutantnog ili divljeg (prirodnog) proteina. Poželjno, varijanta SOST ili njegov fragment zadržava ili ima pojačanu sposobnost vezivanja za SOST specifično antitelo. Takođe, usled izrođenosti genetičkog koda, na primer, nukleotidne sekvence koje kodiraju istu amino kiselinsku sekvencu mogu znatno da variraju.

Drugi derivati proteina koji su ovde obezbeđeni uključuju konjugate proteina sa drugim proteinima ili polipeptidima. Ovo se može postići na primer, putem sinteze N-terminalnih ili C-terminalnih proteina koji se mogu dodati da bi se olakšalo prečišćavanje ili identifikacija proteina( videtiU.S. Patent No. 4,851,341,videti takođe,Horp et al.,Bio/ Technology6:1204, 1988). Alternativno, fuzioni protein kao FLAG®/TGF-beta vezujući protein može se konstruisati u cilju pomaganja pri identifikaciji, ekspresiji i analizi proteina.

Proteini koji su ovde opisani mogu se konstruisati pomoću različitih tehnika koje su ovde opisane. Dalje, mutacije se mogu uneti u određene lokuse putem sinteze oligonukleotida koji sadrže mutantnu sekvencu i koji su okruženi restriktivnim mestima, što omogućava ligaciju fragmenata nativne sekvence. Nakon ligacije dobijena rekonstruisana sekvenca kodira derivat koji ima poželjnu amino kiselinsku inserciju, zamenu ili deleciju.

Alternativno, procedure mutageneze usmerene na mesto (ili specifične za segment) usmerene oligonukleotidom, mogu se primeniti da bi se obezbedio promenjeni oliginukleotid koji ima određene kodone koji su izmenjeni na osnovu zamene, delecije ili insercije. Metode koje mogu služiti kao primeri za pravljenje izmena koje su prikazane gore u tekstu otkrivene su u Walder et al.,( Gene42:133, 1986); Bauer\( Gene37:73, 1985); Craik( BioTechnigues,Januarv 1985, 12-19); Smith et al.,( Genetic Engineering: Principles and Methods,Plenum Press, 1981); i Sambrook et al., (već naveden). Deletirani ili skraćeni derivati proteina (na primer solubilni ekstracelularni deo) mogu takođe biti konstruisani upotrebom pogodnih restrikcionih endonukleaznih mesta u blizini željene delecije. Nakon restrikcije, delovi koji štrče mogu biti popunjeni i DNK religirana. Primeri metoda za pravljenje promena koje su prikazane gore u tekstu otkrivene su u Sambrook et al.,( Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3d Ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press. (2001).

Mutacije koje su napravljene u molekulima nukleinskih kiselina poželjno imaju sačuvan okvir čitanja kodirajućih sekvenci. Dalje, mutacije neće poželjno kreirati komplemenrtarne regione koji kada se prepišu mogu da hobridizuju i doprinesu stavranju sekundarne oRNK strukture, kao što su ukosnice ili petlje, koje bi mogle nepovoljno da utiču na translaciju iRNK. Iako mestro mutacije može biti unapred određeno, nije potrebno da je priroda mutacijeper seunapred određena. Na primer, u cilju selekcije optimuma karakteristika mutanta na datom mestu, slučajna mutageneza se može sprovesti na ciljnom kodonu i eksprimirani mutanti se mogu pregledati na dobijanje, gubitak ili zadržavanje biološke aktivnosti. Alternativno, mutacije mogu biti ubačene na određene lokuse sintezom oliginukleotida koji sadrže mutantnu sekvencu, koji su okruženi restrikcionim mestima koji omogućavaju ligaciju fragmenata nativne sekvence. Nakon ligacije, dobijena rekonstruisana sekvenca kodira derivat koji ima željenu amino kiselinsku inserciju, zamenu ili deleciju. Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju proteine iz ovog pronalaska mogu takođe biti onstruisani pomoću tehnika kao što je mutageneza pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) hemijske mutageneze (Drinkvvater i Klinedinst,PNAS83:3402-3406, 1986) prinudno pogrešno ugrađivanje nukleotida (na primer, Liao i WiceGene88:107-111, 1990) ili upotrebom nasumično mutirajućih oligonukleotida (Horvvitz et al.,Genome3:112-117, 1989).

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje manipulaciju i ekspresiju ovde obezbeđenih polinukleotida i polinukleotida koji kodiraju antitela koja su predmet pronalaska putem uzgajanja domaćiinskih ćelija koje sadrže vektor koji je sposoban da eksprimira ovakve polinukleotide. Ekspresioni vektor se odnosi na rekombinantni nukleo kiselinski konstrukt koji je sposoban da usmeri ekspresiju željenog proteina. Vektor može biti sastavljen od deoksiribonukleinske kiseline (DNK), sintetičke ili izvedene od cDNK, ribonukleinske kiseline (RNK ili od njihove kombinacije (na primer DNK-RNK himera)). cDNK polinukleotid se generalno shvata da znači DNK polinukleotid koji je pripremljen putem prepisivanja RNK molekula, kao što je iRNK. Ovi vektori ili vektorski konstrukti koji uključuju polinukleotidnu sekvencu koja kodira željeni protein poželjno su operativno povezani sa prigodnim transkripcionim ili translacionim regulatornim elementima. Pogodni regulatoni elemeti mogu biti izvedeni iz različitih izvora uključujući bakterijske, gljivične, viralne, sisarske, insektske ili biljne ćelije. Selekcija odgovarajućih regulatornih elemenata zavisi od odabrane ćelije domaćina i mogu lako biti izolovani od strane naučnika. Primeri regulatornih elemenata uključuju promotor transkripcije i pojačivač (enhancer) ili vezujuću sekvencu za RNK polimerazu, terminator transkripcije i sekvencu za vezivanje ribozoma, jedno ili više restrikcionih mesta, kao i jedan ili više selektivnih markera kao što je neomicin fosfotransferaza ili higromicin fosfotransferaza ili bilo koji drugi markeri koji su poznati u nauci. Dodatno, u zavisnosti od ćelije domaćina koji je odabran i vektora koji se koristi i drugih genetski elementi kao što su početak "origin" replikacije, dodatna restrikciona mesta u nukleinskoj kiselini, pojačivači (enhancers), sekvence koje obezbedjuju inducibilnost transkripcije i selektivni markeri, mogu takođe biti ugrađeni u velktore koji su ovde opisani.

Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koji od proteina koji je gore opisan, mogu lako biti eksprimirani u različitim prokariotskim i eukariotskim domaćinskim ćelijama uključujući bakterijske, sisarske, kvaščeve ili gljivične, viralne, insektske ili biljne ćelije. Metode za transformacuiju ovakvih ćelija koje se primenjuju da bi se eksprimirala strana DNK dobro su poznate u nauci( videti,na primer, Itakura et al., U.S. Patent No. 4,704,362; Hinnen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:1929-1933, 1978;Murray et al., U.S. Patent No. 4,801,542; Upshall et al., U.S. Patent No. 4,935,349; Hargen et al., U.S. Patent No. 4,784,950; Axel et al., U.S. Patent No. 4,399,216; Goeddel et al., U.S. Patent No. 4,766,075; i Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; za biljne ćelije videti Czako i Marton,Plant Physiol104:1067-1071, 1994; i Paszkovvski et al,Biotech.24:387-392, 1992).

Bakterijske domaćinske ćelije pogodne za izvođenje ovog pronalaska ulključujuE. coliBL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, KM38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 i ER1647( videti,na primer, Brown (Ed.),Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991));B. subtilis(BR151, YB886, MI119, MI 120 i BI70( videti,na primer, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," uDNA Cloning: A practical Approach,Glover (Ed.) (IRL Press 1985));Salmonella typhimurium;i različite vrste u okviru rodovaPseudomonas, StreptomicesiStaphylococcus,kao i mnoge druge bakterijske vrste koje su dobro poznate naučnicima koje se bave ovom oblašću nauke. Representativni primer bakterijske domaćinske ćelije uključujujeE. coliDH5ct (Stratagene, LaJolla, California).

Bakterijski ekspresioni vektori poželjno sadrže promotor koji funkcioniše u domaćinskoj ćeliji, jedan ili više fenotipskih selektivnih markera i bakterijski "origin"

(početak) replikacije. Reprezentativni promotori uključuju (3-laktamazu (penicilinazu) i laktozni promotorski sistem( videti,Chang et al.,Nature275:615, 1978) T7 RNK polimerazni promotor (Studier et al.,Meth. Enzymol.185:60-89, lambda promotor (Elvin et al.,Gene87:123-126, 1990),trppromotor (Nichols i Yanofsky,Meth. In Enzymology101:155, 1983), itacpromotor (Russell et al.,Gene20:231, 1982). Dodatni promotori uključuju promotore koji su sposobni da prepoznaju T4, T3, Sp6 i T7 polimeraze, Pri Plpromotore lambda bakteriofaga,recA,"heat schock" (toplotnog šoka),lacUV5, tac, Ipp- lacSpr, phoAilacZpromotoreE. coli,promotoreB. subtilis,promotore bakteriofagaBacillus, Streptomycespromotore,intpromotor bakteriofaga lambda,blapromotor pBR322 i CAT promotor gena za hloramfenikol acetil transferazu. Prokariotski promotori su objavlejni i opisani u Glick,J. Ind. Microbiol.1:277, 1987, Watson et al.,Molecular Biology of the Gene 4th Ed.(Benjamin Cummins 1987) i Ausubel et al., (1995). Reprezentativni selektivni markeri uključuju različite markere za rezistenciju na antibiotike kao što su geni za rezistenciju na kanamicin ili ampicilin. Mnogi plazmidi pogodni za transformaciju domaćinske ćelije dobro su poznati u nauci, i između ostalih uključuju pBR322( videtiBolivar et al.,Gene2:95, 1977), pUC plazmide pUC18, pUC19, pUC118, pUC119( videtiMessing,Meth. In Enzymology101:20-77,1983 i Vieira i Messing,Gene19:259-268, 1982) i pNH8A, pNH16a, pNH18a i Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, California).

Domaćinske ćelije gljiva i kvasaca pogodne za izvođenje ovog pronalaska obuhvataju, između ostalih,Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae,rodovePichiailiKluyveromycesi različite vrste rodaAspergillus(McKnight et al., U.S. Patent No. 4,935,349). Pogodni ekspresioni vektori za kvasac i gljive obuhvataju, između ostalih, Ycp50 (ATCC No. 37419) za kvasac i amdS vektor za kloniranje pV3 (TurnbulI,Bio/ Technology7:169, 1989), YRp7 (Struhl et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA76:1035-1039, 1978), Yepl3 (Broach et al.,Gene8:121-133, 1979), pJDB219 (Begges,Nature275:104-108, 1987) i njihove derivate.

Poželjni promotori za korišćenje u kvascu uključuju promotore iz glikolitičkih gena kvasca (Hitzeman, et al.,J. Biol. Chem.255:12073-12080, 1980); Albert i Kavvasaki,/. Mol. Appl. Genet.1:419-434, 1982) ili gene alkohol dehidrogenaze (Young et al., uGenetic Engineering of Microorganisms far Chemicals,Hollaender et al., (eds), strana 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer,Meth. Enzymol.101:192-201, 1983). Primeri promotora korisnih za vektore gljiva obuhvataju one dobijene od glikolitičkih genaAspergillus nidulans,kao što suadh3promotor (McKnight et al.,EMBO J.4:2093-2099, 1985). Ekspresione jedinice mogu takođe sadržati transkripcioni terminator. Primer pogodnog terminatora jeadh3terminator (McKnightet al., već naveden, 1985).

Kao i za bakterijske vektore, vektori kvasca će generalno uključiti selektivni marker koji može biti jedan od bilo kojih mnogobrojnih gena koji pokazuju dominantni fenotip za koji postoji fenotipski esej koji omogućava selekciju transformanata. Poželjni selektivni markeri su oni koji u domaćinu komplementiraju auksotrofiju. obezbeđuju razistenciju na antibiotik ili omogućavaju ćeliji da koristi specifične izvore ugljenika i uključujuLeu2(Broach et al., na istom mestu),ura3(Botstein et al.,Gene8:17, 1979) ilihis3(Struhl et al., na istom mestu). Još jedan pogodan selektabilni marker jecatgen, koji obezbeđuje razistenciju na hloramfenikol u ćelijama kvasca. Mnogi vektori za kloniranje u kvascu dizajnirani su i lako su dostupni. Ovi vektori uključuju Yip bazirane vektore kao što je Yip5, YRp vektore kao što jeYRpl7, Yep vektore kao što je Yepl3 i YCP vektore kao što je YCpl9. Onaj ko se bavi naukom razumeće daje širok dijapazon pogodnih vektora dostupan za ekspresiju u ćelijama kvasca.

Tehnike za tranformaciju gljiva dobro su poznati u literaturi i opisani su, na primer, u Beggs (na istom mestu), Hinnen et al.,( Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:1929-1933, 1978), Yelton et al.,( Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:1740-1747, 1984) i Russell( Nature301:167-169, 1983). Genotip domaćinske ćelije može da sadrži genetski defekt koji je komplementiran sa selektivnim markerom koji je prisutan na ekspresionom vektoru. Odabir određenog domaćina i selektivnog markera je na nivou opštih znanja u ovoj oblasti nauke.

Protokoli za transformaciju kvasca poznati su onima koji se bave naukom. Na primer transformacija se može lako izvesti ili pripremom sferoplasta kvasca sa DNK( videtiHinnen et al.,PNAS USA75:1929, 1978) ili tretmanom sa alkalnim solima kao što je LiCl( videtiItoh et al.,J. Bacteriology153:163, 1983). Tranformacija gljiva može se takođe izvršiti korišćenjem polietilen glikola kao što je opisao Cullen et al.,( Bio/ Technology5:369, 1987).

Viralni vektori uključuju one koji sadrže promotor koji usmerava ekspresiju izolovanog molekula nukleinske kiseline koja kodira željeni promotor kao što je gore opisano. Širok dijapazon promotora se može upotrebiti u okviru konteksta ovog pronalaska uključujući, na primer, promotore kao što su MoMLV LTR; RSV LTR (na primer, Gorman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:6777, 1982); Friend MuLV LTR adenovirusni promotor (Ohno et al.,Science265:781-784, 1994); neomicin fosforotransferazni promotor/pojačivač (enhancer); kasni promotor parvovirusa (Koering et al.,Hum. Gene Therap.5:457-463, 1994); Herpes TK prmotor( videti,na primer, McKnight,Cell31:355,1982); SV40 promotor (na primer, SV40 rani promotor (Benoist et al.,Nature290:304, 1981); pojačivač/promotor metalotionein Iia gena, mišji metalotionein I gen (Hamer et al.,J. Molec. Appl. Genet.1:273, 1982), promotor mišijeg virusa tumora dojke( videti,generalno Etcheverrv, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", inProtein Engineering: Principles and Practice,Cleland et al., (eds.), strane 163-181 (Jonh Wiley & Sons, Inc. 1996)); citomegalovirusni momentalni rani promotor i citomegavirusni momentalni kasni promotor. Alternativno, prokariotski promotor, kao što je baketiofagni T3 RNK polimerazni promotor, može se koristiti za kontrolu ekspresije gena za TGF-beta vezujući protein u sisarskim ćelijama, ako je prokariotski promotor regulisan eukariotskim promotorom (Zhou et al.,Mol. Cell. Biol.10:4529, 1990); Kaufman et al,

Nucleic Acids Res. 19:4485, 1991).

U okviru posebno poželjnih ostvarenja pronalaska, promotor je tkivno specifični promotor( videti,na primer, WO 91/02805; EP 0,415,731 i WO 90/07936). Reprezentativni primeri pogodnih tkivno sepcifičnih promotora uključuju neuralni specifični enolzani promotor, beta promotor faktora rasta izvedenog iz trombocita, promotor morfogenog proteina kosti, promotor humanog alfal-himerina, promotor sinapsina I i promotor sinapsina II: pored gore pomenutih promotora, drugi viralno specifični promotori (na primer retroviralni promotori (uključujući one gore pomenute kao i druge HIV promotore)), promotori specifični za hepatitis (žutica) herpes (na primer EBV) i za bakterije, gjlive ili parazite (na primer malariju) mogu se koristiti da bi se ciljala specifična ćelija ili tkivo koje je inficirano sa virusom, bakterijom, gljivom

ili parazitom.

Sisarske ćelije pogodne za izvođenje ovog pronalaska uključuju, među ostalim COS, CHO, SaOS, osteosarkome, KS483, MG-63, primarni osteoblaste i humane ili sisarske strome koštane srži. Dodatne sisarske domaćinske ćelije uključuju ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (Vero; ATCC CRL 1587), humane embrionske ćelije bubrega (293-HEK; ATCC CRL 1573), ćelije bubrega bebe hrčka (BHK-21; ATCC CRL 8544), (BHK-21; ATCC CRL 8544), ćelije bubrega psa (MDCK; ATCC CCL 34), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-K1; ATCC CCL61), ćelije hipofize pacova (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 ćelije (ATCC CCL2.2.), hepatoma ćelije pacova (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-transformisane ćelije bubrega majmuna (COS-1; ATCC CRL 1650) i embrionske ćelije miša (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Sisarski ekspresioni vektori koji se koriste u izvođenju ovog pronalaska uključiće promotor koji je sposoban da usmeri transkripciju kloniranog gena ili cDNK. Poželjni promotori uključuje viralne promotore i ćelijske promotore. Promotori specifični za kost, uključuju promotor za koštani "sialo"-protein (iz pljuvačne žljezde) i promotor za osteokalcin. Viralni promotori uključuju citomegavirusni momentalni rani promotor (Boshart et al.,Cell41:521-530, 1985), citomegavirusni momentalni kasni promotor, SV40 promotor (Subramani et al.,Mol. Cell. Biol.1:854-864, 1981), MMTV LTR, RSV LTR, metalotionein-1, adenovirus Ela. Ćelijski promotori uključuju misiji promotor metalotioneina-I (Palmiter et al., U.S. Patent No. 4,579,821), Vk. promotor miša (Bergman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:7041-7045, 1983; Grant et al.,Nucleic Acids Res.15:5496, 1987) i VHpromotor miša (Loh et al.,Cell33:85-93, 1983). Izbor promotora zavisiće, makar delimično, od nivoa ekspresije koja je potrebna ili od recipijentnte ćelije koja treba da se transformiše.

Ovakvi ekspresioni vektori mogu takođe da sadrže grupu mesta za obradu primarnog transkripta (splicing) smeštenih nizvodno od promotora i uzvodno od DNK sekvence koja kodira peptid ili protein od interesa. Poželjna mesta za obradu RNK mogu se dobiti od adenovirudsnih i/ili imunoglobulinskih gena. Takođe se u ekspresionim vektorima nalazi signal za poliadenilaciju koji je lociran nizvodno od kodirajuće sekvence od interesa. Pogodni poliadenilacioni signali uključuju rane ili kasne poliadenilacione signale iz SV40 (Kaufmann i Sharp, na istom mestu), poliadenilacioni signal iz adenovirusnog 5 E1B regiona i genski terminator humanog hormona rasta (DeNoto et al.,Nucleic Acids Res.9:3719-3730, 1981). Ekspresioni vektori mogu uključiti nekodirajuću viralnu lider, kao što je adenovirusni 2 trodelni lider, lociran između promotora i mesta za obradu RNK. Poželjni vektori mogu takođe uključiti pojačivačke sekvence kao što je SV40 pojačivač. Ekspresioni vektori mogu takođe da uključe sekvence koje kodiraju adenovirusne VA RNK. Pogodni ekspresioni vektori mogu se dobiti iz komercijalnih izvora (na primer, Stratagene, LaJoIla, California).

Vektorski konstrukti koji sadrže klonirane DNK sekvence mogu se uneti u gajene sisarske ćelije putem na primer, transfekcije posredovane lipozomom, transfekcije posredovane kalcijum fosfatom (Wigler et al.,Cell14:725, 1978; Corsaro i Pearson,Somatic Cell Genetics7:603, 1981; Graham i Van der Eb,Virology52:456, 1973), elektroporacije (Neumman et al.,EMBO J.1:841-845, 1982) ili transfekcije posredovane DEAE-dekstranom (Ausubel et al., (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.,NY, 1987); transfekcije posredovane terroviralnim, adenoviralnim ili protoplasnim fuzijama( videtiSambrook et al., već navedeni). Goli vektorski konstrukti mogu takođe biti uzeti od strane mišićnih ćelija ili drugih pogodnih ćelija nakon injektiranja u mišić sisara (ili druge životinje). Da bi se identifikovale ćelije koje su stabilno tranfektovane sa vektorom koji sadrži kloniranu DNK, generalno se ubacuje selektivni marker koji sadrži kloniranu DNK, selektivni marker se generalno ubacuje u ćeliju zajedno sa genom ili cDNK od interesa. Poželjni selektivni markeri za upotrebu u kultivisanim sisarskim ćelijama uključuju gene koji obezbeđuju rezistenciju na lekove, kao neomicin, higromicin i metotreksat. Selektivni marker može biti umnožen selektivni marker. Poželjni umnoženi selektivni markeri su DHFR gen i gen za rezistenciju na neomicin. Selektivni markeri su opisani od strane Thillv( Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers, Stoneham, Massachusetts).

Sisarske ćelije koje sadrže pogodan vektor se puštaju da rastu tokom vremenskog perioda, tipično 1-2 dana, da bi počeli da eksprimiraju DNK sekvence od interesa. Odabir lekova se zatim primenjuje da bi se selektovali za rast ćelija koje eksprimiraju selektivni marker na stabilan način. Za ćelije koje su transfektovane sa umnoženim selektabilnim markerom, koncentracije leka se mogu povećati kroz više koraka da bi se uradila selekcija na povećan broj kopija kloniranih sekvenci i tako se postiglo povećanje ekspresije. Ćelije koje eksprimiraju ubačene sekvence se selektuju i pregledaju na proizvodnju proteina od interesa u željenoj formi i na željenom nivou. Ćelije koje zadovoljavaju ove kriterijume se zatim mogu klonirati i podesiti za proizvodnju.

Brojne insektske domaćinske ćelije poznate u nauci mogu takođe biti korisni u ovom pronalasku. Na primer, mogu se koristiti bakulovirusi kao vektori za ekspresiju heterolognih DNK sekvenci u insektskim ćelijama (Atkinson et al,Pestic Sci.28:215-224 (1990)). Bakulovirusni sistem obezbeđuje efikasne načine za ubacivanje polinukleotida koji kodiraju TGF-beta vezujući protein u insektske ćelie. Pogodni vektori su bazirani naAutographa californicavišestrukom nuklearnom polihedroznom (polivhedrsois) virusu (AcMNPV), koji sadrži dobro poznate promotore kao što je promotor proteina 70 toplotnog šoka (hsp, heat shock protein) kodDrosophilia,momentalni-rani genski promotor nuklearnog polihedroznog (polivhedrsois) virusa( ie-1)Autographa califorminai odloženi rani39Kpromotor, bakulovirusni plO promotor i promotor metalotioneina kodDrosophilia.Pogodne insektske domaćinske ćelije uključuju ćelijske linije izvedene iz IPLB-S/-21, ćelijska linija jajnika lutkeSpodoptera frugiperdakao što je S/9 (ATCC CRC 1711), S/21AE i S/21 (Invitrogen Coproration; San Diego, CA), kao i Schneider-2 ćelije kodDrosophilia.Utvrđene tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina u bakulovirusnim sistemima obezbeđene su od strane Bailev et al., "Manipulation of Bacilovirus Vectors;" uMethods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expressions Protocols,Murrav (ed.), strane 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991); Patel et al., "The baculovirus expression system," uDNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al., (eds.), strane 205-244 (Oxford University Press 1995), Ausubel (1995) na stranama 16-37 do 16-57, by Richardson (ed.),Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995); i Lucknovv, "Insect Cell Expression Technology," uProtein engineering: Principles and Practice,Cleland et al., (eds.), strane 183-218 (John WILEY & SONS, INC. 1996).

Alternativno, brojne biljne domaćinske ćelije poznate su u nauci i mogu takođe biti korisne za ekspresiju polinukleotida na primer,Agobacterium rhizogenes(Sinkar et al.,J. Biosci. ( Bangalore)11:47-58, 1987). Ekspresioni vektori se takođe mogu ubaciti u biljne protoplaste, intaktna biljna tkiva ili izolovane biljne ćelije. Generalne metode za gajenje biljnih tkiva obezbeđena su na primer, od strane Miki et al., "Procedures for Introducing Foreigh DNA into Plants," uMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick et al., (eds.), strane 67-88 (CRC Press, 1993).

U okviru srodnih ostvarenja ovog pronalaska, proteini iz ovog pronalaska mogu biti eksprimirani u transgenim životinjama čije germinativne i somatske ćelije sadrže gen koji kodira željeni protein i koji je operativno povezan sa promotorom koji je efektivan u ekspresiji gena. Alternativno, na sličan način, transgene životinje mogu da se pripreme tako da im nedostaje željeni gen ("nokautiran" miš). Ovakvi transgeni mogu biti pripremljeni u različitim ne-humanim životinjama, uključujući miševe, pacove, zečeve, ovce, pse i svinje( videtiHamer et al.,Nature315:680-683, 1985, Palmiter et al.,Science222:809-814, 1983, Brinster et al.,Proc. Natl Acad. Sci.82:4438-4442, 1985, Palmiter i Brinster,Cell41:343-345, 1985, i U.S. Patent Nos. 5,175,383, 5,087,571, 4,736,866, 5,387,742, 5,347,075, 5,221,778 i 5,175,384. Ukratko, ekspresioni vektor, uključujući molekul nukleinske kiseline koji treba da se eksprimira zajedno sa kontrolnim sekvencama za ekspresiju koji su smešteni na odgovarajući način, unosi se u pronukleuse oplođenog jajeta, na primer putem mikroinjeciranja. Integracija injecirane DNK detektuje se tačkastom "blot" analizom DNK iz uzoraka tkiva. Poželjno je da se ubačena DNK ugradi u germinativnu liniju životinje tako sa se porenosi na potomstvo životinje. Tkivno- specifična ekspresija može se postići putem upotrebe tkivno-specifičnog promotora ili putem upotrebe inducibilnog promotora, kao što je promotor metalotioniein gena (Palmiter et al., 1983, već navedeno) koji omogućavaju regulisanu ekspresiju transgena.

Proteini između ostalog, mogu biti izolovani putem gajenja podobnog domaćina i vektorskih sistema da bi se proizveli rekombinantni translacioni proizvodi iz ovog pronalaska. Supernatanti iz ovih ćelijskih linija ili proteinskih inkluzionih tela ili celih ćelija iz kojih se protein ne sekretuje u suprenatant, mogu se zatim tretirati različitim procedurama za prečišćavanje u cilju izolovanja željenih proteina. Na primer, suprenatant može prvo da se koncentruje pomoću komercijalno dostupnih filtera za koncentrisanje proteina, kao što je Amicon ili Millipore Pellicon jedinicca za filtriranje. Nakon koncentrisanja koncentrat se može naneti na pogodan matriks za prečišćavanje kao što je afinitativni matriks, na primer, specifično telo vezano za pogodnu potporu. Alternativno, nionske ili katjonske kuglice za razmenu ili matice za isključivanje na osnovu veličine (size-exclusion) mogu se upotrebiti za prečišćavanje proteina. Kao sledeća alternativa za dalje prečišćavanje proteina može se koristiti jedan ili više koraka reverzno fazne tečne hromatografije visoke performance (RP-HPLC). Druge metode izolovanja proteina iz ovog pronalaska dobro su poznate u nauci. Čistoća izolovanog proteina ili polipeptida može se odrediiti putem SDS-PAGE analize za kojom sledi Coomassie blue bojenje ili bojenje sa srebrom.

Opšte metode za ekspresiju i izolovanje stranog proteina koji je proizveden u sisarskom ćelijskom sistemu obezbeđene su od strane, na primer, Etcheverrv, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," uProtein Engineering: Principles and Practice,Cleland et al. (eds), strane 163 (Wiley-Liss, Ine, 1996). Standardne tehnike za izolovanje proteina proizvedenog u bakterijskom sistemu obezbeđena je od strane na primer, Grisshammeret al,"Purification of over-produced proteins fromE. colicells," uDNA Cloining 2: Expression Systems, 2nd Edition,Gloveret al.(eds), strane 59-92 (Oxford Universitv Press 1995). Uspostavljene metode za izolovanje rekombinantnih proteina iz bakulovirusnog sistema opisao je Richardson (ed.), uBacilovirus Expression Protocols(Humana Press, Inc., 1995).

Još uopštenije, TGF-beta vezujući protein može biti izolovan standardnim tehnikama kao što je afinitativna hromatografija, hromatografija isključivanja po veličini, jonsko izmenjivačka hromatografija, HPLC i slični. Dodatne varijacije u izolaciji i prečišćavanju TGF-beta vezujućeg proteina mogu se osmisliti od strane naučnog kadra. Na primer, TGF-beta vezujući protein antitela, dobijena kao što je ovde opisano, mogu se upotrebiti za izolovanje velikih količina proteina putem afinitativnog prečišćavanja. Prečišćavanje antitela iz ovog pronalaska ovde je dalje opisano.

DETEKTABILNA OBELEŽJA

Detektabilno obeležje (oznaka) je molekul ili atom koji može biti konjugiran sa polipeptidom (uključujući antitelo ili njegov fragment) ili polinukleotidom da bi se proizveo molekul koji je koristan za dijagnozu. Primeri detektabilnih obeležja uključuju helatore, fotoaktivne agense, radioizotope, fluorescentne agense, paramagnetne jone, enzime i druge delove za obeležavanje. TGF-beta vezujući protein ili kandidatni molekuli koji su gore opisani, mogu biti obeleženi sa različitim jedinjenjima uključujući na primer, fluorescentne molekule, toksine i radionuklide. Reprezentativni primeri fluorescentnih molekula uključuju fluorescin, proteinePhycobilli,kao fikoeritrin, rodamin, Teksas crveno i luciferazu. Reprezentativni primeri toksina uključuju ricinus, abrin toksin difterije, kolera toksin, gelonin, "pokevveed"( Phytolaccd)antiviralni protein tritin, toksinShigellai egzotoksin APseudomonas- a.Reprezentativni primeri radionuklida uključuju Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111,1-123,1-125,1-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212, i Bi-212. Pored toga, antitela koja su gore opisana mogu takođe biti obeležena ili konjugovana sa jednim partnerom iz para vezanih liganda. Reprezentativni primeri uključuju avidin-biotin, streptavidin-biotin i riboflavin-riboflavin vezujući protein.

Metode za konjugaciju ili obeležavanje ovde opisanih molekula sa reprezantativnim obeležjima prikazane gore mogu se jednostavno izvesti od strane običnog naučnika( videti,Trichothecene Antobodv Conjugate, U.S. Patent No. 4,744,981; Antibodv Conjugate, U.S. Patent No. 5,106,951; Fluorogenic Materials and Labeling Tecniques, U.S. Patent No. 4,018,884; Metal Radionucleotide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapv, U.S. Patent No. 4,897,255; i Metal Radionucleiotide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, U.S. Patent No. 4,988,496;( videti takođeInman,Methods In Enzymology,Vol. 34,Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B,Jakobv i Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974;Videti takođeWilchek i Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalitical Applications,"Anal.

Biochem. 171:1- 32, 1988).

Imunokonjugat je kompozicija koja sadrži antitelo, kao što je anti-TGF-beta vezujući protein antitelo, ili njegov deo antitela i detektabilno obeležje. Poželjno, deo imuno konj ugata koji predstavlja antitelo vezuje se za svoj srodni antigen sa istim ili malo redukovanim afinitetom nakon konjugacije kao i pre konjugacije.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

Kao što je gore navedeno, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje različite farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan od gore opisanih molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije zajedno sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim nosačem ekscipijentom ili rastvaračem. Bilo koji pogodni nosač poznat onima koji se bave naukom može da se upotrebi u farmaceutskim kompozicijama iz ovog pronalska. Nosači za terapeutsku upotrebu dobro su poznati i opisani su na primer u,Remintons Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). Generalno, ovi nosači bi trebalo da su netoksični za recipijente u dozama i koncentracijama koje se primenjuju. Obično priprema ovakvih kompozicija obuhvata kombinovanje terapeutskog agensa sa puferima; antioksidanse kao askorbinsku kiselinu, polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine; amino kiseline; ugljene hidrate uključujući maltozu, glukozu, saharozu ili dekstrine; helirajuće agense kao EDTA; glutation; i druge stabilizatore i ekscipijente. Neutralni fiziološki puferski rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa nespecifičnim serum albuminom predstavljaju primer rastvarača. Alternativno, kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti formulisane kao liofilizati.

Generalno, tip nosača se selektuje na osnovu načina dostavljanja. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane za bilo koji pogodan način dostavljanja uključujući na primer, lokalno, oralno, nazalno, rektalno, vaginalno, podjezično ili parenteralno dostavljanje, uključujući potkožno, intravenozno, intramuskularno, intrasternalno, intrakavitalno, intramuskularno intrametalno, intrauretalno injektiranje ili infuziju. Farmaceutska kompozicija (na primer za oralno dostavljanje ili dostavljanje putem injektiranja) može biti u formi tečnosti (na primer eliksir, sirup, rastvor, emulzija ili suspenzija). Tečna farmaceutska kompozicija može da uključu na primer, jedan od sledećih: sterilne rastvarače kao što je voda za injektiranje. slani rastvor, posebno fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, fiksirana ulja koja mogu da služe kao rastvarač ili razblaživački medijum, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge rastvarače; antibakterijske agense, antioksidanse; helirajuće agense; pufere kao acetate, citrate ili fosfate ili agense za podešavanje toničnosti kao natrijum hlorid ili dekstrozu. Parenteralni preparat može biti smešten u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili vajle (bočice) za višestruke doze koje su od stakla ili plastike. Upotreba fiziološkog rastvora je poželjna i poželjno je daje injektabilna farmaceutska kompozicija sterilna.

Kompozicije koje su ovde opisane mogu biti formulisane za odloženo oslobađanje (to jest, formulacija kao što je kapsula ili spužva koje imaju efekte laganog otpuštanja jedinjenja nakon dostavljanja). Ovakve kompozicije mogu generalno biti pripremljene pomoću dobro poznate tehnologije i mogu biti dostavljene putem na primer oralne, rektalne ili potkožne implementacije ili implementacijom na željeno ciljno mesto. Formulacije sa odloženim oslobađanjem mogu da sadrže membranu koja kontroliše stepcn otpuštanja. Nosači za upotrebu u okviru formulacija su biokompatibilni i mogu biti biodegradabilni; poželjno je da formulacija obezbeđuje relativno konstantan nivo oslobađanja aktivne komponente. Količina aktivnog jedinjenja koja se sadrži u okviru formulacije sa odloženim oslobađanjem zavisi od mesta implementacije, stope i očekivanog trajanja oslobađanja i prirode stanja koje treba da se tretira ili spreči. Ilustrativni nosači korisni u ovom smislu uključuju mikročestice poli(laktid-ko-glikolid), poliakrilata, lateksa, škroba, celuloze, dekstrana i sličnih. Drugi ilustrativni nosači sa odloženim oslobađanjem uključuju supramolekularne biovektore, koji sadrže ne-tečnu hidrofilnu srž (na primer unakrsno povezan polisaharid ili oligosaharid) i opcionalno spoljašnji sloj koji sadrži amfifiličnojedinjenje, kao stoje fosfolipid( videti,na primer, U.S. Patent No. 5,151.254 i PCT Applikacije WO 94/20078, WO/94/23701 i WO 96/06638).

U drugom ilustrativnom ostvarenju, biodegradabilne mikrosfere (na primer poliacetat poliglikolat), upotrebljavaju se kao nosači za kompozicije iz ovog pronalaska. Pogodne biodegradabilne mikrosfere otkrivene su na primer, u U.S. Patent Nos. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,407,609 i 5,942,252. Modifikovani nosač sistem proteina srži hepatitisa B, kao što je onaj opisan u WO/99 40934 i reference citirane ovde, biće takođe koristan za mnoge primene. Još jedan ilustrativni nosački/dostavljački sistem koristi nosač koji sadrži posebne protein komplekse, kao što su oni opisani u U.S. Patent No. 5,928,647, koji je u sposoban da indukuje I-restriktivne odgovore citotoksičnih T limfocita u domaćinu.

U još jednom ilustrativnom ostvarenju, kalcijum fosfatne čestice srži su upotrebljene kao nosači ili kao matrice za kontrolisano oslobađanje za kompozicije iz ovog pronalaska. Primeri kalcijum fosfatnih čestica opisane su na primer u objavljenoj patentnoj prijavi br. WO/0046147.

Za farmaceutske kompozicije koje sadrže polinukleotid koji kodira anti SOST antitelo i/ili modulišući agens (tako da se polipeptid i/ili modulišući agens generišein situ),polinukleotid može biti prisutan u okviru bilo kog sistema za dostavu koji je poznat onima koji se bave naukom, uključujući nukleinsku kiselinu i bakterijske, viralne i sisarske ekspresione sisteme. Tehnike za ugrađivanje DNK u ovakve ekspresione sisteme dobro su poznati onima koji se bave naukom. DNK može takođe biti "gola," kao što je opisano na primer od strane Ulmer et al.,Science 259:1745-1749,1993 i obrađeno u revijskom radu Cohen,Science259:1691-1692, 1993. Uzimanje gole DNK može biti povećano oblaganjem DNK na biodegradibilne kuglice, koje se efikasno transportuju u ćelije.

Razvoj pogodnog doziranja i režima tretiranja za upotrebu odgovarajućih kompozicija koje su ovde opisane u različitim režimima tretiranja, uključujući na primer oralno, parenteralno, intravenozno, intranazalno i intramuskularno dostavljanje i formulisanje, dobro je poznato u nauci i neki delovi su ukratko prokomentarisani dalje u tekstu, u cilju opšte ilustracije.

U određenim primenama, farmaceutske kompozicije koje su ovde otkrivene mogu se dostaviti putem oralnog dostavljanja u životinju. Kao takve, ove kompozicije mogu biti formulisane u inertnom rastvaraču ili sa asimilativnim jestivim nosačem, ili mogu biti zatvorene u želatinske kapsule sa tvrdom ili mekanom školjkom, ili mogu biti komprimovane u tablete, ili mogu biti ugrađene direktno sa hranom koja se koristi u ishrani.

Pod određenim okolnostima biće poželjno da se farmaceutska kompozicija koja je ovde otkrivena dostavi parenteralno, intravenozno, intramuskularno ili čak intraperitonealno. Ovakvi pristupi dobro su poznati u nauci onima koji se bave ovom oblašću i neki su dalje opisani na primer u U.S. Patent No. 5,543,158; U.S. Patent No. 5,641,515 i U.S. Patent No. 5,399,363. U određenim ostvarenjima rastvori aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljeni kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli u vodi, i pogodno pomešani sa surfaktantom (površinska aktivna supstanca), kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije mogu takođe biti pripremljene u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim mešavinama i u uljima. U normalnim uslovima čuvanja i upotrebe preparati će generalno sadržati prezervativ za sprečavanje rasta mikroorganizama.

Ilustrativne farmaceutske forme pogodne za upotrebu injektiranjem uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne pudere za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija (na primer, videti U.S. Patent No. 5,466,468). U svim slučajevima forma mora biti sterilna i mora biti tečna do nivoa da postoji laka upotreba šprica. Mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti prezervirana od kontaminišućih akcija mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži na primer, vodu, etanol, poliol (na primer glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slične) njihove pogodne mešavine i/ili biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost mora biti održana, npr., upotrebom oblaganja na primer, kao što je oblaganje sa lecitinom, sa održavanjem željene veličine čestice u slučaju disperzije i/ili putem korišćenja surfaktanta. Prevencija delovanja mikroorganizama može biti olakšana različitim antibakterijskim i antigljivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorbutanolom, fenolom, sorbičnom kiselinom, timerosalom i sličnim. U mnogim slučajevima biće poželjno uključivanje izotoničnih agenasa npr. šećera ili natrijum hlorida. Produžena absorbcija injektabilnih kompozicija može biti ostvaren upotrebom kompozicija agenasa koji odlažu absorbciju, na primer, aluminijum stearat i želatin.

U jednom ostvarenju, za parenteralno dostavljanje u vodenom rastvoru, rastvor bi trebao biti puferisan kako treba ako je to neophodno i tečni rastvarač treba prvo učiniti izotoničnim sa dovoljnom količinom slanog rastvora ili glukoze. Ovi određeni vodeni rastvori posebno su pogodni za intravenozno, intramuskularno i intraperitonealno dostavljanje. U tom povezivanju, sterilni tečni medijum koji se može koristiti biće poznat naučnicima u svetlu ovog otkrića. Na primer, jedna doza može biti rastvorena u 1 ml NaCl rastvora i ili dodata u 1000 ml hipodermoklizične tečnosti ili injektirana na predviđenom mestu za infuziju( videti,na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038 i 1570-1580). Neke varijacije u doziranju naravno će se desiti u zavisnosti od stanja subjekta koji se tretira. Takođe, za humano dostavljanje, preparati će naravno zadovoljiti zahteve da su sterilni, pirogenetski i zadovoljiće standarde sigurnosti i čistoće koji su postavljeni od strane FDA Office of Biologics procedura.

U drugom ostvarenju pronalaska, kompozicije koje su ovde otkrivene mogu biti formulisane u neutralnoj formi ili u obliku soli. Ilustrativne farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli koje se dodaju kiselinama (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje su formirane sa neorganskim solima kao što su hidrohlorna ili fosforna kiselina ili organske kiseline kao sirćetna, okslana, tartarna, mandelična i slične. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe biti izvedene iz neorganskih baza kao što su natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid i organskih baza kao izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slični. Nakon formulisanja rastvori će biti dostavljeni na način koji je kompatibilan sa doziranjem formulacije i u onim količinama koje su teraputski efektivne.

Nosači dalje mogu sadržati bilo koji rastvarač, disperzioni medijum, transportere, oblagače, diluente, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense sa vremenskim odlaganjem, pufere, rastvore nosača, suspenzije koloide i slične. Upotreba ovakvih medij uma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u nauci. Kao što je i svaki konvencionalni medijum ili agens inkompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova potreba u terapeutskim kompozicijama je razmatrana. Izraz "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekularne entitete i kompozicije koje ne proizvode alergijsku ili sličnu neželjenu reakciju kada se dostavi čoveku.

U određenim ostvarenjima lipozomi, nanokapsule, mikročestice, lipidne čestice, vezikule i slični, upotrebljavaju se za unošenje kompozicija iz ovog pronalaska u pogodne domaćinske ćelije/organizme. Posebno, kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti formulisane za dostavu ili inkapsulirane u lipidnu česticu, lipozom, vezikulu, nanosferu ili nanočesticu ili slične. Alterantivno, kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti vezane ili kovalentno ili ne-kovalentno, za površinu takvih nosača transportera.

Formiranje i upotreba lipozoma i lipozomu sličnih preparata kao potencijalnih nosača leka poznata je onima koji se bave naukom( videti,na primer, Lasic,Trends Biotechnol.16( 7) 307- 21, 1998; Takakaura,Nippon RinshoJ5(3):691-95, 1998; Chandran et al.,IndianJ. Exp. Biol.55(8):801-09, 1997; Margalit,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.72(2-3):233-61, 1995; U.S. Patent No. 5,567,434; U.S. Patent No. 5,552,157; U.S. Patent No.5,565,213; U.S. Patent No.5,738,868 i U.S. Patent No. 5,795,587, svaki ponaosob u potpunosti ugrađen ovde sa referencom). Lipozomi su uspešno upotrebljavani sa brojnim ćelijskim tipovima koji su normalno teški za transfekciju drugim procedurama uključujući suspenzije T ćelija, kulture primarnih hepatocita i PC 12 ćelije (Renneisen et. al,J. Biol. Chem. 265( 27) : 16337-42,1990; Muller et al.,DNA Cell Biol.P(3):221-29, 1990). Dodatno, lipozomi su oslobođeni ograničenja dužine DNK, što je inače karakteristično za sisteme za dostavu koji se baziraju na virusima. Lipozomi su efektivno korišćeni za unošenje gena, različitih lekova, radioterapeutskih agenasa, enzima, virusa, transkripcionih faktora, alosteričnih efektora i sličnih, u različite gajene ćelijske linije i životinje. Dalje, upotreba lipozoma izgleda da nije povezana za autoimunim odgovorima ili neočekivanom toksičnošću nakon dostave sistema. U određenim ostvarenjima, lipozomi su formirani od fosfolipida koji su raspršeni u vodenom medij umu i spontano formiraju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (nazivaju se i multilamelarne vezikule (MLV)).

Alternativno, u drugim ostvarenjima, pronalazak za farmaceutski prihvatljive nanokapsule, obezbeđuje formulacije kompozicija iz ovog pronalaska. Nanokapsule mogu generalno da u sebi sadrže jedinjenja na stabilan i reproducibilan način( videti,na primer, Quintanar-Guerrero et al.,Drug Dev. Ind. Pharm.2-^(12): 1113-28, 1998). Da bi se izbegli efekti veličine usled polimernog pretrpavanja, ovakve ultrafine čestice (veličine oko q 1 uM) mogu biti dizajnirane pomoću polimera koji mogu da se degradujuin vivo.Ovakve čestice mogu biti napravljene kao što je opisano od strane Couvreur et al.,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.5( 1) : 1-20, 1988; zur Muhlen et al.,Eur. J. Pharm. Biopharm. 45( 2) : 149-55,1998; Zambaux et al.,J. Controlled ReleaseJ6>(l-3):31-40, 1998, U.S. Patent No. 5,145,684.

Dodatno, farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti smeštene u okviru kontejnera, zajedno sa materijalom za pakovanje koji obezbeđuje instrukcije koje se odnose na upotrebu ovakvih farmaceutskih kompozicija. Generalno, ovakve instrukcije uključiće definisanu formulu koja opisuje koncentraciju reagensa, kao i u određenim ostvarenjima relativne količine ekscipijentskih sastojaka ili rastvarača (na primer voda, slani rastvos ili PBS) koji mogu biti neophodni za rekonstituciju farmaceutske kompozicije.

METODE TRETIRANJA

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metode za povećanje mineralnog sadržaja kosti i mineralne gustine kosti. Ukratko, brojna stanja rezultuju u gubitku mineralnog sadržaja kosti, uključujući na primer bolest, genetsku predispoziciju, nesrećne slučajeve koji rezultuju u odsustvu upotrebe kosti (na primer usled frakture), terapeutike koji utiču na resorbciju kosti ili koji ubijaju ćelije koje formiraju kost i normalno starenje. Kroz upotrebu ovde opisanih molekula koji inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije, ovakva stanja mogu se tretirati ili sprečiti. Kao što se ovde koristi, mineralni sadržaj kosti se povećao kada se mineralni sadržaj kosti povećao na statistički značajan način na odabranom mestu.

Širok dijapazon stanja koja rezultuju u gubitku mineralnog sadržaja kosti može biti tretiran sa molekulima koji su ovde opisani. Pacijenti sa ovakvim stanjima mogu biti identifikovani kroz kliničku dijagnostiku upotrebom dobro poznatih tehnika( videti,na primer, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Reprezentativni primeri bolesti koje mogu biti tretirane uključuju displazije, naznačeno time daje rast ili razvoj kosti nenormalan. Reprezentativni primeri ovakvih stanja uključuju ehondroplaziju, kleidokranijalnu diostozu, enhondromatozu, multipne nasledne egzotoze, neurofibromatoze, osteogenesis imperfecta, osteoporozu, osteopoikilozu, sklerotične lezije, frakture, periodontalnu bolest, pseudoartrozis i piogenični osteomijelitis.

Druga stanja koja mogu biti tretirana ili sprečena uključuju širok dijapazon uzroka osteopenije (to jest, stanje koje uzrokuje veće od jedne standardne devijacije mineralnog sadržaja ili gustine ispod vrha (peak) mineralnog sadržaja skeleta u mladosti). Reprezentativni primeri ovakvih stanja uključuju anemična stanja, stanja izazvana steroidima, stanja izazvanih heparinom, poremećaja koštane srži, skorbut, neuhranjenost, nedostatak kalcijuma, idiopatska osteoporoza, kongenitalna osteopenija ili osteoporoza, alkoholizam, hronična bolest jetre, senilnost, stanje postmenopauze, oligomenoreja, hipogonadizam, imobilizacija ili prekid upotrebe, sindrom refleksne simpatetične distrofije, tranzijentna regionalna osteoporoza i osteomalacija.

U okviru ostvarenja iz ovog pronalaska, mineralni sadržaj kosti ili gustina mogu biti povećani dostavljanjem toplokrvnoj životinji terapeutski efektivne količine molekula koji inhibira SOST polipeptid da se veže za člana TGF-beta familije. Primeri toplokrvnih životinja koje se mogu tretirati uključuju i kičmenjake i sisare, uključujući na primer, ljude, konje, krave, svinje, ovce, pse, mačke, pacove i miševe, reprezentativni primeri terapeutskih molekula uključuju ribozime, gene za ribozime, antisens oligonukleotide i antitela koja su ovde opsiana.

U okviru drugih ostvarenja ovog pronalaska obezbeđene su metode za povećanje gustine kosti koje obuhvataju korake ubacivanja u ćelije koje naseljavaju kost, vektora koji usmerava ekspresiju molekula koji inhibira vezivanje SOST za člana TGF-beta familije i dostavljanja ćelija koje sadrže vektor u toplokrvnu životinju. Ukratko, ćelije koje naseljavaju kost mogu se dobiti direktno iz kosti pacijenta (na primer ćelije dobijene iz koštane srži kao CD34+, osteoblaste, osteocite i slične) iz periferne krvi ili iz kultura. Reprezentativni primeri pogodnih vektora uključuju viralne vektore kao herpes viralne vektore (na primer., U.S. Patent No. 5,288,641); anedovirusne vektore (na primer, WO 94/26914, WO 93/9191; Kolls et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA9i(l):215-219, 1994; Kass-Eiseler et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90(24): 11498-502, 1993; Guzman et al.,Circulation55(6)2838-48, 1993; Guzman et al.,Cir. Res.75(6): 1202-1207; Zabner et al.,Cell75(2)207-216, 1993; Li et al.,Hum. Gene Ther.4(4):403-409, 1993; Caillaud et et al.,Eur. J. Neurosci.5(10):1287-1291, 1993; Vincent et al.,Nt. Genet.5(2): 130-134, 1993; Jaffe et al.,Nat Genet.7(5):371-378, 1992; i Levrero et al.,Gene 101( 2) : 195-202,1991); adeno-združene viralne vektore (WO 95/13365; Flotte et al.,PNAS90(22):10613-10617, 1993); bakulovirusne vektore; parvovirusne vektore (Koering et al.,Hum. Gene Therap.5:457-463, 1994); "pox" virusne vektore (Panicali i Paoletti,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:4927-4931, 1982; i Ozaki et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.193(2):653-660, 1993), i retroviruse( na primer,EP 0,415,731; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 91/25234; U.S. Patent No. 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218). Viralni vektori mogu takođe biti konstruisani tako da sadrže mešavinu različitih elemenata (na primer, promotore, sekvence omotača i slične) iz različitih virusa ili iz ne-viralnih izvora. U okviru različitih ostvarenja, ili sami viralni vektor, ili viralna čestica koja sadrži viralni vektor može se koristiti u metodama i kompozicijama koje su dole opisane.

U okviru ostvarenja pronalaska, molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju molekul koji inhibira vezivanje SOST polipeptida za člana TGF-beta familije mogu biti dostavljeni putem različitih tehnika uključujući na primer, dostavljanje "asialoosomucoid" (ASOR) konjugovanog sa poi-L-lizinskim DNK kompleksima (Cristano et al.,PNAS92122-92126, 1993); DNK povezana za ubijeni adenovirus (Curiel et al.,Hum. Gene. Ther. 3( 2) : 147-154,1992); citofektinom - posredovano ubacivanje (DMRIE-DOPE, Vical, California); direktno injektiranje DNK (Ascadi et al.,Nature352:815-818, 1991); DNK ligand (Wu et al,J. Biol. Chem.264:16985-16987, 1989); lipofekcija (Felgner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA54:7413-7417, 1989); lipozomi (Pickering et al.,Circ.59(1): 13-21, 1994; i Wang et al.,PNAS54:7851-7855, 1987); bombardovanje mikroprojektilima (Williams et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA55:2726-2730, 1991); i direktno dostavljanje nukleinske kiseline koja kodira sam protein ili samog (Vile i Hart,Cancer Res.5J:3860-3864, 1993) ili korišćenjem PEG-nukleinsko kiselinskih kompleksa.

Određivanje povećanog mineralnog sadržaja kosti mode biti urađeno direktno upotrebom X-zraka (na primer absorotpmetrija dvojnom energijom X-zraka ili "DEXA") ili interferencijim preko "turnover" markera kosti kao što je alkalna fosfataza specifična za osteoblast, osteokalcin, C propeptid prokolagena tipa 1 PICP i ukupna alkalna fosfataza(v/<ie//Comier, Curr. Opin. In Rheu.7:243 (1955)) ili sa markerima za resorbciju kosti uključujući ali bez ograničenja, piridinolin, deoksipiridinolin, N-telopeptid, urinarni hidroksiprolin, plazma teratrat-rezistentne kisele fosfataze i galaktozil hidroksilizin( videtiComier, na istom mestu). Količina koštane mase može takođe biti izračunata na osnovu telesne težine ili upotrebom drugih metoda (videtiGuinness-Hey, Metab. Bone. Dis. Relat. Res.5:177-1811, 1984).

Kao što će biti očigledno onima koji se bave naukom, količina i frekvencija dostavljanja zavisiće naravno od faktora kao što su priroda i težina indikacija koje se tretiraju, željenog odgovora, stanja pacijenta i tako dalje. Tipično, kompozicije mogu biti dostavljene putem različitih tehnika kao što je pomenuto gore u tekstu.

Primeri koji slede služe za ilustraciju i nisu ograničavajući

PRIMERI

PRIMER 1

MODELOVANJE REGIONA SRŽI (ĆORE) SKLEROSTLNA

Tehnike prepoznavanja homologije (na primer, PSI-BLAST (Alschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-402 (1997)), FUGUE (Shi et al.,J. Mol. Bio.310:243-57 (2001)) preporučuju da region srži SOS (SOST_Core tj SOSTSrž) zauzima strukturu cistinskog-čvora. FUGUE je senzitivan metod za detekciju homologije između sekvenci i struktura. Humani horionski gonadoptrin P (hCG-P), za koji je poznata eksperimentalno determinisana 3D struktura, identifikovanje sa FUGUE (Shi et al.,već naveden)kao najbliži homolog SOST Srž. Zato, hCG-p je upotrebljen kao strukturna matrica da se izgrade 3D modeli za SOST_Srž.

Ravnanje i poređenje SOST_Srž i njegovih bliskih homologa prikazano je na slici 1. Među homolozima prikazanim u poređenju, samo hCG-P (CGHB) ima poznatu 3D strukturu. Identičnost sekvence između SOST_Srž i hCG-p bila je približno 25%. Osam CIS ostataka je konzervirano u okviru familije, što naglašava sveukupnu strukturnu sličnost između SOST Srž i hCG-p. Tri para cisetina (1-5, 3-7, 4-8) formirala su disulfidne veze (prikazane kao pune linije na slici 1) u "čvor" konfiguraciju, koja je karakteristična za cisteinsku čvor strukturu (upakovanost). Ekstra disulfidna veza (2-6) prikazana tačkasto na slici 1, bila je jedinstvena za ovu familiju i razlikovala je familiju proteina od drugih cistein-čvor familja (na primer TGF-[3, BMP).

SOST_Srž je modeliran primenom PDB (Berman et al.,Acta Crystalograph. D. Biol. Crjstallogr.58(Pt 6 Ptl):899-907 (2002) ulaz 1HCN, 3D struktura hCG-P (Wu et al.,Structure2:545-58 (1994)), kao strukturna matrica. Modeli su proračunati sa MODELER-om (Sali & Blundell,J. Mol. Biol.234:779-815 (1993)). Prikaz najboljeg modela prikazanje na Slici 2.

Najveći broj cistein-čvor proteina formira dimere jer im nedostaje hidrofobna srž u monomeru (Scheufler et al., već naveden; Schlunegger i Grutter,J. Mol. Biol.231:445-58 (1993)); Wu et al., već naveden). Izgleda da SOST sledi ovo pravilo i formira homodimer da bi povećao stabilnost. Konstruisanje modela za dimerizovan SOST Srž regiona predstavljalo je izazov jer (1) sličnost sekvenci između SOST Srž i hCG-P je bila nisaka (25%); (2) umesto homodimera, hCG-P je formirala heterodimer sa hCG-a; i (3) broj različitih relativnih konformacija monomera je zapažena u dimerizovanom cisetin-srž proteinima iz različitih famlija (na primer, PDGF, TGF-P, Neurotrofin, IL-17F, gonadotropin), što ukazuje na to da bi konformacija dimera SOST mogla da odstupa znatno od heterodimerne konformacije hCG-a/p. U konstruisanju modela, hCG-a je zamenjne sa hCG-P iz heterodimerne strukture (1HCN) pomoću tehnika strukturne superimpozicije kombinovanih sa ručnim podešavanjem, i zatim je model homodimera SOST_Srž izgrađen na osnovu pseudo hCG-P homodimerne strukture. Finalni model je prikazan na slici 3.

PRIMER 2

MODELOVANJE SOST-BMP INTERAKCIJE

Primer opisuje proteinsko modelovanje vezujućih mesta receptora tipa I i tipa II na BMP koja su uključena u interakciju između BMP i SOST.

Studije kompeticije su pokazale da SOST kompetira sa oba, i receptorom tipa I i receptorom tipa II za vezivanje za BMP. U ELISA-baziranom testu kompeticije BMP-6 je selektivno interagovao sa površinom obloženom sklerostinom (300 ng/bunarčiću) sa visokim afinitetom (Kd=3.4 nM). Rastuće konecentracije BMP receptora IA (FC fuzioni konstrukt) kompetirale su sa sklerostinom za vezivanje za BMP-6 (11 nM)

(IC5o=114 nM). Desetostruki molarni višak BMP receptora je dovoljan sa se redukuje vezivanje sklerostina za BMP-6 za otprilike 50%. Ova kompeticija biće zabeležena sa BMP receptor II-FC fuzionim proteinom (IC50=36 nM) i DAN (IC50=43 nM). Specifičnost eseja je pokazana odsustvom kompeticije za vezivanje za BMP-6 između sklerostina i rActivin R1B-FC fuzionog proteina, člana familija TGF-P receptora koji se nije vezao za BMP.

Vezujuća mesta receptora tipa I i tipa II na BMP polipeptidu su mapirana i prostorno su razdvojena (Scheufler et al., već naveden; Innis et al., već naveden, Nickel et al., već naveden; Hart et al., već naveden). Noggin, još jedan BMP antagonist koji se vezuje za BMP sa visokim afinitetom, kontaktira BMP i na vezujućem mestu receptora tipa I i tipa II preko N-terminalnog dela Noggin-a (Groppe et al., već naveden). Dva p-lanca u regionu srži blizu C-terminusa takođe kontaktiraju BMP na vezujućem mestu receprora tipa II.

Ručno podešavajuće poređenje Noggin i SOST ukazalo je na to sa dva polipeptdia dele sekvencnu sličnost između N-terminalnih delova proteina i između regiona srži. Poređenje amino kiselinskih sekvenci prikazano je na slici 4. Cisteinski ostaci koji formiraju karakterističnu cis-čvor strukturu bili su konzenrvirani između Noggin i SOST. Sveukupna identičnost sekvenci bila je 24% i identičnost sekvenci u okviru N-terminalnog vezujućeg regiona (pozicije poređenja 1-45) bila je 33%. Dva ostatka u Noggin N-terminalnom vezujućem regionu, uglavnom Leu (L) na poziciji poređenja 21 i Glu (E) na poziciji 23 su primećeni da igraju važne uloge u vezivanju za BMP (Groppe et al., već naveden). Oba ostatka su konzervirana takođe i u SOST. Sličnost sekvenci u okviru regiona srži (pozicije poređenja 131-228) bile su oko 20%, ali cis-čvor potka-osnova je bilao zadržana i dovoljan broj ključnih ostataka je konzerviran i podržavao je homologiju između Noggin i SOST.

Noggin struktura je upoređena sa SOST da bi se razumelo kako dva SOST monomera dimerzijuju. Kao što je prikazano na slici 5, Noggin struktura predlaže da linker (povezivač) između N-terminalnog regiona i regiona srži ne samo da igra ulogu upovezivanju ova dva regiona, već formira takođe deo dimerizacionog interfejsa između Noggin monomera. Jedna glavna razlika između Noggin i SOST je daje linker između N-terminalnog regiona i regiona srži znatno kraći u SOST. C-terminalni region SOST možda igra ulogu u SOST dimerizaciji. Sekvenca Noggin se završava u regionu srži, dok SOST ima ekstra C-terminalni region. U Noggin strukturi disulfidna veza povezuje C-terminuse Noggin monomera. Zato, C-terminalni region SOST započinje bliže interfejsu dva monomera i mogao bi da doprinosi dimerizaciji. Dodatno, predikcija sekundarne strukture pokazuje da neki delovi C-terminalnog regiona SOST imaju tendenciju da formiraju helikse. Region SOST može biti odgovoran za dimerizacionu aktivnost, verovatno preko heliks-heliks pakovanja, koje oponašaju funkciju dužeg linkera u Noggin. Još jedna razlika između strukture Noggin i SOST je amino kiselinska insercija u regionu sržu SOST na pozicijama poređenja 169-185 (videti sliku 4). Ova insercija je produžila p-ukosnicu koja je usmerena ka interfejsu dimerizacije u Noggin strukturi (prikazano na slici 5 kao region petlje u sredini monomera i iznad C-terminalnog Cis ostatka). Produžena p-ukosnica doprinosi SOST dimerizaciji.

PRIMER 3

DIZAJNIRANJE I PRIPREMA SOST PETIDNIH IMUNOGENA

Ovaj primer opisuje dizajniranje SOST peptidnih imunogena koji se koriste za imunizaciju životinja i generisanje antitela koja blokiraju interakcije između BMP i SOST i sprečavaju formiranje SOST monomera.

BMP vezujući fragmenti

Sveukupna sličnost između SOST i noggin i sličnost između N-terminalnih regiona dva polipeptida ukazuje na to da SOST može da interaguje sa BMP na sličan način kao i sa Noggin. To znači da N-terminalni region SOST može da interaguje sa oba mesta za vezivanje i receptora tipa I i tipa II na BMP i deo regiona srži (amino kiselinska pozicija u poređenju 190-220 na slici 4) može da interaguje sa mestom za vezivanje receptora tip II tako da antitela specifična za ove SOST regione mogu da blokiraju ili oslabe vezivanje BMP za SOST.

Amino kiselinske sekvence ovih SOST polipeptdnih fragmenata za pacovski i humani SOST obezbeđeni su kao što sledi.

SOST_N_Linker: N-terminalni region (uključuje kratak linker (povezivač) koji povezuje sa regionom srži)

SOST_CORE_BIND (SOST SRŽ VEZIVANJE): Deo regiona srži koje verovatno kontaktira BMP na njegovom mestu za vezivanje receptora tipa II (produženo malo na oba kraja da bi uključio CIS ostatak sidra (anchors)):

Fragmenti dimerizacije SOST

C-terminalni region SOST verovatno je uključen u formiranje SOST homodimera (videti primer 2). Produžena p-ukosnica može takođe da igra ulogu u formiranju homodimera. Antitela koja se specifično vezuju za ovakve regione mogu da spreče ili oslabljuju dimerizaciju SOST monomera, koji zauzvrat mogu da se umešaju u interakciju između SOST i BMP. Polipeptidni fragemnti u pacovu i ćoveku koji odgovaraju ovim regionima su sledeći.

SOST_C: C-terminalni region

SOST_Core_Dimer: Deo regiona srži koji je verovatno umešan u SOST dimerizaciju (produžen malo na oba kraja da bi uključio CIS ostatak sidra (anchors)):

Fragment za vezivanje BMP na SOST N- terminusu

Ključni N-terminalni vezujući region SOST (pozicije poređenja 1-35 na slici 4) je modelovan na bazi strukture Noggin/BMP-7 kompleksa (Protein Data Bank Entry No:lM4U) i poređenje amino kiselinske sekvence (videti sliku 4) da bi se iddentifikovali amino kiselinski ostaci na SOST N-terminusu koji verovatno interaguju sa BMP. Model SOST je prikazan na slici 6. U komparativnom modelu, fenilalanin (Phe, F) na poziciji poređenja 8 (videti strelicu i tekst uz nju) u SOST sekvenci projektuje se u hidrofobni džep na površini BMP dimera. Ista osobina "čvor-u-rupi" primećena je u strukturi BMP i receptor I kompleksa (Nickel et al., već naveden), gde Phe 85 receptor takođe se uklapa i isti džep, što predstavlja ključnu osobinu u prepoznavanju Ligand-tip I receptora za članove familije TGFp (uključujući na primer, TGF(3 familiju, BMP familiju i slične). Na osnovu ovog modela, prolin (Pro) usmerena zavojnica (turn) takođe je konzervirana, i omogućava da se N-terminalni vezujući fragment proteže duž površine BMP dimera, putujući od mesta za vezivanje receptora tipa I, do mesta za vezivanje receptora tip II na drugoj strani kompleksa. Takođe je konzervirana druga Pro-usmerena zavojnica, blizu karboksi kraja vezujućeg fragmenta, koja povezuje linker (povezivački) region. Produženi kontakti zimeđu SOST i BMP su evidentni na slici 6.

Peptidni imunogeni

Peptidi su dizajnirani da obuhvate SOST N-terminalni region koji je predviđen za mesto kontaktiranja sa BMP proteinima. Peptidne sekvence su predstavljene dalje u tekstu. Za imunizaciju životinja, peptidne sekvence su dizajnirane da se preklapaju i dodat je dodatni cistein na C-terminalnom kraju da bi se olakšalo unakrsno povezivanje sa KLH. Peptidi su zatim upotrebljeni za imunizaciju. Peptidne sekvence imunogena u sledeće: Sledeći peptidi su dizajnirani da sadrže amino kiselinski deo regiona srži za koji je predviđeno da pravi kontakt sa BMP proteinima. Cistein je dodat na C-terminalni kraj svakog peptida za konjugaciju sa KLH i konjugovani peptidi su upotrebljeni za imunizaciju. U N-terminalnom peptidu dela za pristajanje u srži (Docking-Core N-Teminal Peptide) unutrašnji cistein je zamenjen u serin da bi se izbegla dupla konjugacija sa KLH.

Za Humani SOS:

Amino kiselinska sekvenca bez dodatih cis ostataka:

Docking Ćore N-terminal Peptid (Pristajanje Srž N-terminalni Peptid):

Docking_Core_Cterm_Peptid:

Docking_Core_N-term_Peptid:

Docking_Core_Cterm_Peptid:

Za SOS pacova:

Amino kiselinska sekvenca bez dodatih ili zamenjenih cis ostataka:

Docking CoreN-terminaln Peptid:

DockingCoreCtermPeptid:

Peptidni imunogeni sa dodatom i substituisanom Cis:

Docking Ćore N-terminal Peptid:

Docking_Core_Cterm_Peptid:

Dva regiona u okviru SOST koji potencijalno interaguju i formiraju SOST homodimere uključuju amino kiseline sa SOST regionom srži koji nisu prisutni u Noggin. Humani SOST peptididi koji su dizajnirani da imaju ovu sekvencu imali su C-terminalni ilu N-terminalni cis koji je konjugiran sa KLH. Za pacovski SOST peptid, cistein je dodat na karboksi terminus sekvence (SEQ ID NO:31). KLH konjugirani peptidi su upotrebljeni za imunizaciju.

Drugi regionu okviru SOST koji potencijalno interaguje i formira SOST homodimere uključuje C-terminalni region. peptidni imunogeni su dizajnirani da uključe amino kiselinske sekvence u okviru ovog regiona (vodeti dalje u tekstu). Za konjugaciju sa KLH, cisteinski ostatak je dodat na C-terminalni kraj i konjugovani peptidi su upotrebljeni za imunizaciju.

PRIMER 4

ESEJ ZA DETEKCIJU VEZIVANJA ANTITELA ZA

TGF-BETA VEZUJUĆI PROTEIN

Ovaj primer opisuje esej za detekciju vezivanja liganda, na primer, antitela ili njegovog fragmenta za sklerostin.

FLAG®-slerostin fuzioni protein je pripremljen na osnovu protokola obezbeđenog od strane proizvođača (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i kao što je opisano u U.S. Patent No. 6,395,511. Svaki bunarčić mikrotitar ploče sa 96 bunarčića je obložen sa anti-FLAG® monoklonalnim antitelom (Sigma Aldrich) i zatim blokirano sa 10% BSA u PBS. Fuzioni protein (20 ng) dodat je u 100 ul PBS/0.2% BSA i absorbovan je na ploči sa 96 bunarčića tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Proteinski rastvor je uklonjen i bunarčići su isprani da bi se uklonio nevezani fuzioni protein. BMP, na primer, BMP-4, BMP-5, BMP-6 ili BMP-7, je rasvoren u PBS/0.2% BSA i dodat u svaki bunarčić u koncentracijama u opsegu od 10 pM do 500nM. Posle inkubacije od 2 sata na sobnoj temperaturi, rastvor za vezivanje je uklonjen i ploča je tri puta oprana sa 200 ul zapreminama PBS/0,2% BSA. Vezivanje BMP za sklerostin je detektovano upotrebom poliklonalnog antiseruma ili monoklonalnog antitela specifičnog za BMP i odgovarajueg enzim-konjugovanog drugog koraka reagensa na osnovu standardnih ELISA tehnika( videti,na primer, Ausubel et al.,Current Protocols in Mol. Biol.Vol 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). Specifično vezivanje je proračunato oduzimanjem ne-specifičnog vezivanja od ukupnog vezivanja i analizirano upotrebom LIGAND programa (Munson i Podband,Anal. Biochem.107:220-39 (1980)).

Vezivanje sklerostina za BMP takođe je detektovano detekcijom fluorescencije homogenim razdvajanjem vremena (Mellor et al.,J. Biomol. Screening3:91-99 (1998). polinukleotidna sekvenca koja kodira sklerostin je operativno povezana sa humanim konstantnim regionom imunoglobulina u rekombinantnom nukleo kiselinskom konstruktu i eksprimiran kao humani Fc-sklerostin fuzioni protein na osnovu metoda koje su poznate u nauci i ovde opisane. Ova dva fuziona proteina inkubirana su zajedno i sproveden je esej kao što je opisano od strane Mellor et al.

PRIMER 5

ESEJ ZA PREGLEDANJE ANTITELA KOJA INHIBIRAJU

VEZIVANJE ČLANOVA TGF-BETA FAMILIJE ZA TGF-BETA

VEZUJUĆI PROTEIN

Ovaj primer opisuje metodu za detektovanje antitela koje inhibira vezivanje člana TGF-beta familije za sklerostin. ELISA se izvodi u suštini kao što je opisano u primeru 4 osim što je BMP koncentracija držana fiksiranom na njegovoj Kd (determinisano na primer putem BIAcore analize). Pored toda, antitelo ili bibliotekai ili kolekcija antitela dodata je u bunerčiće u koncentraciji od 1 uM. Antitela su inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa BMP i sklerostinom, uklonjen je rastvor i vezani BMP je kvantifikovan kao što je opisano (videti primer 4). Antitela koja inhibiraju 40% od primećenog BMP vezivanja u odsusutvu antitela smatraju se kao antagonosti ovih interakcija. Antitela se dalje procenjuju kao potencijalni inhibitori primenom studija titriranja da bi se odredila njihova konstanta inhibicije i njihov efekat na afinitet vezivanja za TGF-beta vezujući protein. Kontrolni eseji za poređenje specifičnosti takoeđ se mogu sprovesti da bi se utvrdio selektivni profil za identifikovani antagonist upotrebom eseja koji zavise od akcije BMP liganda (na primer, studija kompeticije BMP/BMP receptora).

PRIMER 6

INHIBICIJA LOKALIZACIJE TGF-BETA VEZUJUĆEG

PROTEINA ZA KOŠTANI MATRIKS

Procena inhibicije lokalizaije za koštani matriks (hidroksiapatit) je izvedena pomoću modifikacija metode od Nicolas{ Calcif. Tissue Int.57:206-12 (1995)). Ukratko<l25>I-obeležen TGF-beta vezujući protein je pripremljen kao što je opisao Nicolas (već naveden). Hidroksiapatit je dodat u svaki bunarčić na mikortitarskoj ploči sa 96 bunarčića koja je opremljena sa polipropilenskom filtracionom membranom (Polvfiltroninc, Weymuth MA). TGF-beta vezujući protein razblažen u 0.2% abuminu u PBS puferu je zatim dodat u bunarčiće. Absorbovan TGF-beta vezujući protein je eluiran u 0.3 M NaOH i zatim kvantifikovan.

Antitelo ili drugi agens koji inhibira ili oslabljuju vezivanje sklerostin TGF-beta vezujućeg proteina za hidroksiapatit identiflkovano je inkubiranjem TGF-beta vezujućeg proteina sa antitelom i nanošenjem mešavine na matriks kao što je gore opisano. Matriks je 3 puta ispran sa 0.2% albuminom u PBS puferu. Absorbovan sklerostin je eluiran u 0.3 M NaOH i zatim kvantifikovan. Antitelo koje inhibira nivo vezivanja sklerostina za hidroksiapatit za najmanje 40% kada se uporedi sa nivoom vezivanja koje se detektije u odsustvu antitela se smatra za inhibitora koštane lokalizacije. Ovakvo antitelo se dalje karakteriše u studijama odgovora na dozu da bi se odredila njegova konstanta inhibicije i efekat na afinitet vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina.

Iz svega gore navedenog, iako su specifična ostvarenja pronalaska ovde opisana ilustracije radi, različite modofikacije se mogu primeniti bez odstupanja od duha i polja pronalaska. Na osnovu toga, pronalazak nije ograničen osim sa patentnim prijavama.

Claims

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se vezujespecifično za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvenci prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP 001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79), i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82).

2. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, na osnovu patentnog zahteva 1 naznačeno time da se antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena vezuje specifično za polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 21,22,25,26,47,48,49 i 50.

3. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 i 50.

4. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, na osnovu patentnog zahteva 3 naznačeno time da se antitelo vezuje specifično za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:1,20, 58, 60, 62 ili 68.

5. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, na osnovu patentnog zahteva 4 naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvenci prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM 030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79) i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM 033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82).

6. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrži amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 i 50, naznačeno time da se antitelo vezuje specifično za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68 i naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvenci prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP 001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79) i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM 001204 (SEQ ID NO:82).

7. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koji oslabljuje formiranje SOST homodimera, naznačeno time da SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68.

8. Antitelo iz patentnog zahteva 7 naznačeno time da se antitelo vezuje za polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 41, 42, 43, 51, 52, 53 i 54.

9. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrži amino kiselinsku sekvencu odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 i 54.

10. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, na osnovu patentnog zahteva 9 naznačeno time da se antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena vezuje specifično za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68.

11. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena na osnovu patentnog zahteva 10, naznačeno time da antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, oslabljuje formiranje SOST homodimera.

12. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se proizvodi imunizacijom ne-humane životinje sa peptidom od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koje sadrži amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 i 54, naznačeno time da se antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, vezuje specifično za SOST polipeptid, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 58, 60, 62 ili 68 i naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera.

13. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time daje antitelo poliklonalno antitelo.

14. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time daje antitelo monoklonalno antitelo.

15. Antitelo iz patentnih zahteva 14, naznačeno time daje monoklonalno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od mišijeg monoklonalnog antitela, humanog monoklonalnog antitela, pacovskog monoklonalnog antitela i monoklonalnog antitela hrčka.

16. Hibridoma ćelija koja proizvodi antitelo iz patentnog zahteva 14.

17. Domaćinska ćelija koja je sposobna da eksprimira antitelo iz patentnog zahteva 14.

18. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time daje antitelo humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

19. Domaćinska ćelija koja je sposobna da eksprimira antitelo iz patentnog zahteva 18.

20. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time daje fragment za vezivanje antigena odabran iz grupe koja se sastoji od F(ab')2, Fab', Fab, Fd ili Fv.

21. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, koje sadrži jednolančano antitelo.

22. Domaćinska ćelija koja je sposobna da eksprimira antitelo iz patentnog zahteva 21.

23. Kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 1-12 i fiziološki prihvatljiv nosač.

24. Imunogen koji sadrži peptid koji obuhvata 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se vezuje specifično za SOST polipeptid i koje kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM 030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79) i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID N0:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82).

25. Imunogen koji sadrži peptid koji obuhvata najmanje 21 uzastopnu amino kiselinu i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time daje peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koji kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79) i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82).

26. Imunogen koji sadrži peptid od najmanje 21 uzastopne amino kiseline i ne više od 75 uzastopnih amino kiselina koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 i 50.

27. Imunogen na osnovu patentnog zahteva 26, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se vezuje specifično za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. 20, 58, 60, 62 ili 68.

28. Imunogen na osnovu patentnog zahteva 27 naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP 001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79) i naznačeno time da je mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM 033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NMJ301204 (SEQ ID NO:82).

29. Imunogen koji sadrži peptid od najmanje 20 amino kiselina i nc više od 75 amino kiselina koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 i 50, naznačeno time daje peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koji kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP 001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82).

30. Imunogen koji sadrži peptid od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44,45,46,51,52,53 i 54.

31. Imunogen na osnovu patentnog zahteva 30, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se vezuje specifično za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. 20, 58, 60, 62 ili 68.

32. Imunogen na osnovu patentnog zahteva 31, naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera.

33. Imunogen koji sadrži peptid od najmanje 20 amino kiselina i ne više od 75 amino kiselina koji sadrži amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 i 54, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, i naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera.

34. Imunogen koji sadrži peptid koji obuhvata 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se vezuje specifično za SOST polipeptid i koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.

35. Imunogen koji sadrži peptid koji obuhvata najmanje 21 uzastopnu amino kiselinu i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, naznačeno time da je peptid sposoban da izazove stvaranje u ne-humanoj životinji antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.

36. Imunogen iz bilo kog od patentnih zahteva 24-35, naznačeno time daje peptid povezan sa molekulom nosačem.

37. Imunogen iz patentnog zahteva 36, naznačeno time da je molekul nosač polipeptidni nosač.

38. Imunogen iz patentnog zahteva 37, naznačeno time da je polipeptidni nosač hemocijanin kapičastog puža.

39. Metoda za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom na osnovu jenog od patentnih zahteva 24-29 naznačeno time da (a) SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68; (b) antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od: (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (bone morphogenic protein - BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP; (c) mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da se veže za BMP tipa I receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO:71); D89675 (SEQ ID NO:72); NM_001203 (SEQ ID NO:73); S75359 (SEQ ID NO:74); NM_030849 (SEQ ID NO:75); D38082 (SEQ ID NO:76); NP_001194 (SEQ ID NO:77); BAA19765 (SEQ ID NO:78); ili AAB33865 (SEQ ID NO:79); i (d) mesto za vezivanje receptora tipa II BMP je sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:80); NM_033346 (SEQ ID NO:81); Z48923 (SEQ ID NO:83); CAA88759 (SEQ ID NO:84); ili NM_001204 (SEQ ID NO:82).

40. Metoda za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom na osnovu jenog od patentnih zahteva 30-35, naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera.

41. Metoda za identifikaciju antitela koje moduliše TGF-beta signalni put, koja obuhvata: (a) kontaktiranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji ima sekvencu prikazanu u bilo kojoj od SEQ ID NOs:l, 20, 58, 60, 62 ili 68, sa najmanje jednim SOST peptidom koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2-19 ili 21-54, u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i (b) detektovanje nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid i tako detektovanje prisustva antitela koje moduliše TGF-beta signalni put.

42. Metoda za identifikaciju antitela koje oslabljuje vezivanje BMP za SOST polipeptid, koja se sastoji od: (a) kontaktiranja (i) antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, sa (ii) najmanje jednim SOST peptidom koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od NO: 2-19 ili 21-28 ili 47-50 u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i (b) detektovanja nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid i tako detektovanje prisustva antitela koje oslabljuje formiranje SOST homodimera 43. Metoda za identifikaciju antitela koja oslabljuje formiranje SOST homodimera koja se sastoji od: (c) kontaktiranja (i) antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68, sa (ii) najmanje jednim SOST peptidom koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29-46 ili 51-54 u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i (d) detektovanja nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid i tako detektovanje prisustva antitela koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.

43. Metoda za identifikaciju antitela koja povećava mineralni sadržaj kosti, koja obuhvata: (a) kontaktiranje (i) antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kom SEQ ID NO: 1, 20, 58, 60, 62 ili 68 sa (ii) najmanje jednim SOST peptidom koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29-46 ili 51-54 u uslovima i tokom vremena dovoljnog da se omogući formiranje kompleksa antitelo/SOST peptid; i (b) detektovanje nivoa kompleksa antitelo/SOST peptid i tako detektovanje prisustva antitela koje povećava mineralni sadržaj kosti.

44. Metoda na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 41-44 naznačeno time da je antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od antitela koje je prisutno u biološkom uzorku i prečišćenog antitela.

45. Metoda na osnovu patentnog zahteva 45, naznačeno time da je prečišćeno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od poliklonalnog antitela, monoklonallnog antitela, himernog antitela, humanizovanog antitela i antigen-vezujućeg fragmenta antitela.

46. Antitelo na osnovu patentnog zahteva 2, naznačeno time da polipeptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ IDNO: 5, 6 i 14.

47. Antitelo na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 3-6, naznačeno time da peptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 i 18.

48. Imunogen na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 26-29, naznačeno time da peptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 i 18.

49. Metoda za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom na osnovu patentnog zahteva 49, naznačeno time da SOST polipeptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:l, 20, 28, 60, 62 ili 68.

50. Metoda iz bilo kog od patentnih zahteva 41, 42 i 44, naznačeno time da SOST peptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, 6, 10, 11, 14 i 18.