RU2647571C1 - Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного - Google Patents
Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного Download PDFInfo
- Publication number
- RU2647571C1 RU2647571C1 RU2017130132A RU2017130132A RU2647571C1 RU 2647571 C1 RU2647571 C1 RU 2647571C1 RU 2017130132 A RU2017130132 A RU 2017130132A RU 2017130132 A RU2017130132 A RU 2017130132A RU 2647571 C1 RU2647571 C1 RU 2647571C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sclerostin
- protein
- target
- bone
- vertebrate
- Prior art date
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000019307 Sclerostin Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000037182 bone density Effects 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 101100421899 Mus musculus Sost gene Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 5
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101000702766 Mus musculus Sclerostin Proteins 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 3
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 3
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 3
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 3
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 3
- 101001043594 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 102100021926 Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 3
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 3
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 2
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002617 bone density conservation agent Substances 0.000 description 2
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 229940122361 Bisphosphonate Drugs 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710099518 Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 208000008924 Femoral Fractures Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000011327 Increased bone mineral density Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 101100455225 Oryza sativa subsp. japonica LPR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004286 Osteochondrodysplasias Diseases 0.000 description 1
- 201000000023 Osteosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000037340 Rare genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101150098533 SOST gene Proteins 0.000 description 1
- 201000010096 SOST-related sclerosing bone dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 229940087674 Sclerostin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000000123 anti-resoprtive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000011444 antiresorptive therapy Methods 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012669 compression test Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- -1 nitrogen-containing bisphosphonates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010258 osteoblastogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001097 osteosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010048734 sclerotin Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и иммунобиологии. Описан способ получения рекомбинантного белка склеростина позвоночного животного. Конструируют векторную конструкцию, обеспечивающую стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli. Выращивают клетки штамма Е. coli, экспрессирующие ген склеростина. Очищают белок склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента. Затем отмывают и выделяют целевой продукт. При этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование. Для этого в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс с получением конструкции, содержащей последовательность, кодирующую слитый белок целевого склеростина и шести гистидинов. Также описан способ повышения костной массы позвоночного животного, особенного млекопитающего и человека. Двукратно, с интервалом в 20 суток, проводят иммунизацию целевым рекомбинантным белком склеростином в дозе 0,1-100 мкг склеростина на один килограмм массы тела позвоночного животного. При этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить плотность костной ткани. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине для лечения остеопороза у позвоночных животных и человека. Таким образом, заявленная группа изобретений расширяет арсенал средств, используемых для исследования и лечения остеопороза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр., 2 ил.
Description
Область применения
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а конкретно к рекомбинантному белку склеростина, способу его получения, а также способу повышения костной массы позвоночного животного, особенно млекопитающего. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине для лечения остепороза у позвоночных животных, в том числе млекопитающих и человека. Таким образом, заявленная группа изобретений расширяет арсенал средств, используемых для исследования и лечения остеопороза.
Известный уровень
Среди костных заболеваний наиболее распространенным и драматичным по последствиям остается остеопороз (ОП). С клинических позиций развитие ОП определяется многочисленными факторами: возрастом, массой тела, наступлением менопаузы, приемом глюкокортикоидов и других препаратов, влияющих на костный метаболизм, сопутствующими заболеваниями, и др. На тканевом уровне эти факторы приводят к дисбалансу остеокласт-опосредованной костной резорбции и остеобласт-опосредованного формирования костной ткани с нарушением нормального гомеостаза костной системы и как следствие - к потерям костной массы. Современные концепции фармакологического лечения ОП направлены на ограничение остеокласт-опосредованной костной резорбции. Наиболее изученными и распространенными препаратами являются азотсодержащие бисфосфонаты, которые индуцируют апоптоз остеокластов. Активность остеокластов ограничивают также кальцитонин, эстрогены, селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, а также новый утвержденный антирезорбтивный препарат деносумаб, представляющий собой гуманизированное антитело против рецептора активатора нуклеарного фактора κB (NF-κB), который функционирует как ингибитор образования остеокластов. В США, Канаде, России и некоторых странах Европы разрешен к применению анаболический препарат - паратироидный гормон - терипаратид, который пока в единственном числе выступает в качестве противовеса многочисленным антирезорбтивным препаратам. Однако последние экспериментальные и клинические исследования указывают на то, что данная ситуация должна коренным образом измениться в ближайшем будущем. Это связано в первую очень с открытием белков-ингибиторов, регулирующих костный гомеостаз. Среди таких белков наибольшее внимание привлекает склеростин [Дыдыкина И.С., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма костной ткани. Науч.-практич. ревматол. 2013;3(51): 296-301]. Склеростин является эндогенным ингибитором канонического Wnt/β-катенин-сигнального пути. В его присутствии предшественники остеобластов не подвергаются воздействию Wnt-сигнала, в результате процесс дифференциации остеобластов приостанавливается. Wnt-сигнальный путь прямо влияет на процессы формирования и регенерации костной ткани, а модуляция этого пути может оказаться полезной для лечения ОП и других костных заболеваний [Drake М., Farr J.N. Inhibitors of sclerostin; emerging concepts. Curr. Opin. Rheumatol. 2014;26(40):45-52, Lewieski E.M. Role of sclerostin in bone and cartilage and its potential as a therapeutic target in bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2014;2(6):48-57]. Изучение ряда редких генетических заболеваний, в частности остеосклерозирующих, позволило выявить участие Wnt-сигнального пути в регуляции формирования костной ткани [Дыдыкина И.С., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма костной ткани. Науч.-практич. ревматол. 2013;3(51):296-301]. С другой стороны, склеростин, который продуцируется остеоцитами, ограничивает процесс формирования костной ткани во избежание избыточного окостенения. Например, при генетически детерминированных заболеваниях костной ткани, проявляющихся избыточным окостенением (остеосклероз, болезнь ван Бухема), установлен дефект гена SOST, локализующегося в хромосоме 17q12-21 и отвечающего за экспрессию склеростина [Garnero P. Sclerostin - a specific biochemical marker of osteocyte function. Lyon, 2011. 20 р.]. В соответствии с современной концепцией лечения ОП антирезорбтивные агенты служат препаратами первой линии для уменьшения риска переломов костей у пациентов с ОП, а препараты анаболического действия обычно рекомендуются только при выраженном/тяжелом ОП. Однако при потере костной массы микроструктура кости (микроархитектоника) не может быть восстановлена только за счет влияния на функцию остеокластов. Таким образом, будущая технология лечения ОП будет направлена на реверсию ОП за счет максимального увеличения плотности костной ткани и сохранения микроархитектоники на начальной стадии, а достигнутые результаты будут поддерживаться за счет антирезорбтивной терапии, применяемой на второй стадии.
Сегодня известно, что склеростин представляет собой циркулирующий ингибитор сигнального пути Wnt, который продуцируется остеоцитами и подавляет функцию рецептор - связывающего протеина LPR5. Антитела, направленные против склеростина, обладают анаболическими свойствами. Склеростин-нейтрализующие моноклональные антитела блокируют остеоцит-продуцированный склеростин, который является антагонистом Wnt-сигнального пути и предотвращает связывание Wnt и корецептора LRP5/6. Связанный/блокированный склеростин позволяет связаться Wnt с комплексом LRP5/6, тем самым стимулируя активность Wnt/β-катенин сигнального пути в остеобластах, что приводит в конечном итоге к увеличению их остеосинтетической активности и повышению костеобразования.
За последние годы появилось огромное количество работ о ведущей роли Wnt/β-катенин-сигнального пути в дифференциации остеобластов, пролиферации, и, в конечном счете, в формировании новой костной ткани [Ke H.Z., Richards W.G., Li X., et al.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases. Endocr Rev. 2012;5(33):747-83, Kim J.H., Liu X., Wang J., et al. Wnt signaling in bone formation and its therapeutic potential for bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2013;1(5):13-31, Moester M.J., Papapoulos S.E., 
C.W., et al. Sclerostin: current knowledge and future perspectives. Calcif. Tissue Int. 2010;2(87):99-107]. Как множество подобных регулирующих сетей, Wnt-регуляция модулируется комплексом агонистов и антагонистов, соотносительное действие которых определяет, будет ли Wnt-сигнальный путь стимулироваться или же ингибироваться. Склеростин идентифицирован только десять лет назад как гликопротеин, продуцирующийся остеоцитами, способный блокировать связывание Wnt и корецептора LRP5/6. У людей с гетерозиготной мутацией, приводящей к инактивации одной копии гена склеростина, сывороточные уровни склеростина приблизительно наполовину ниже нормы, но темпы формирования костной ткани значительно увеличены. Эти результаты позволили предположить, что снижение уровня склеростина может быть новым направлением в регуляции костной массы, что послужило активизации исследований по созданию и апробированию новых анаболических агентов. Открытие склеростина и установление его биологической роли как негативного регулятора остеобластогенеза вызвало большой интерес к склеростину как к перспективной мишени для разработки нового терапевтического подхода к лечению ОП [Willams В. Insights into the mechanism od sclerostin action in regulating bone mass accrual. J. Bone Miner. Res. 2014;1(29):24-8]. Ha сегодняшний день уже созданы гуманизированные моноклональные антитела к склеростину, действие которых было апробировано на грызунах и обезьянах [ЕА 201491286, ЕА 201000559, ЕА 200702402, ЕА 200600037]. При этом был получен убедительный положительный эффект, и в настоящее время их изучение активно продолжается [Drake М., Farr J.N. Inhibitors of sclerostin; emerging concepts. Curr. Opin. Rheumatol. 2014;26(40):45-52].
Многочисленные экспериментальные исследования, проведенные буквально за последние 10 лет с использованием различных моделей заболеваний костной ткани, убедительно демонстрируют, что ингибирование склеростина с помощью моноклональных антител положительно влияет на структуру костной ткани, повышает ее плотность, а также улучшает сращение переломов на моделях мышей и крыс [Agholme F., Macias В., Hamang М., et al.Efficacy of a sclerostin antibody compared to a low dose of PTH on metaphyseal bone healing. Orthop. Res. 2014;3(32):471-76, Hamann C., Rauner M., 
Y., et al. Sclerostin antibody treatment improves bone mass, bone strength, and bone defect regeneration in rats with type 2 diabetes mellitus. J. Bone Miner. Res. 2013;3(28):627-38, Li C.Y., Tan H.L., Barrero M., et al. Sclerostin antibody treatment enhances fracture healing and increases bone mass and strength in non-fractured bones in an adult rat closed femoral fracture model. J. Bone Miner. Res. 2010;1(25):S129]. Кроме того, с помощью томографического и гистоморфометрического исследований продемонстрировано дозозависимое анаболическое действие на костную ткань склеростин-нейтрализирующих моноклональных антител при подкожном введении овариэктомированным макакам с повышением образования плотности костной ткани в трабекулярной, эндо-интракортикальной и периостальной тканях без негативного влияния на качество костного матрикса [Ominsky M.S., Vlasseros F., Jolette J., et al. Two doses of sclerostin antibody in cynomolgus monkeys increases bone formation, bone mineral density, and bone strength. J. Bone Miner. Res. 2010;5(25):948-59, Ross R.D., Edwards L.H., Acerbo A.S., et al. Bone Matrix Quality After Sclerostin Antibody Treatment. J. Bone Miner. Res. 2014;7(29):1597-607]. При этом прочность костей оценивают с помощью тестов на компрессию тел III и IV поясничных позвонков. Интересно также, что гистоморфометрические исследования у грызунов и обезьян демонстрируют, что лечение ингибиторами склеростина повышает моделирование костеобразования, а не собственно ремоделирование (в ответ на костную резорбцию) [Ominsky M.S., Niu Q.-T., Li Ch., et al. Tissue Level Mechanisms Responsible for the Increase in Bone Formation and Bone Volume by Sclerostin Antibody. J. Bone Miner. Res. 2014;6(29):1424-30]. Следует отметить, что данный механизм отличается от эффектов гормона терипаратида, при котором оба процесса - формирование и резорбция - возрастают. Антисклеростин-терапия также продемонстрировала благотворное влияние на процесс сращения костей у грызунов с ускорением репарации, повышением прочности кости и увеличением плотности костной мозоли [Agholme F., Macias В., Hamang М., et al.Efficacy of a sclerostin antibody compared to a low dose of PTH on metaphyseal bone healing. Orthop. Res. 2014;3(32):471-76,18]. Следует подчеркнуть, что терапия антителами к склеростину повышает плотность и прочность новообразованной костной ткани, [Ominsky M., Samadfan R., Jolette J., et al.Sclerostin monoclonal antibody stimulates bone formation and improves the strength and density of the fracture callus and lumbar spine in a primate fibular osteotomy model. J. Bone Miner. Res. 2009;1(25):S.89-S90].
С декабря 2006 по июль 2007 г. в США проведено рандомизированное контролируемое двойное слепое исследование моноклональных антител к склеростину («ромосозумаб», Амген), которые вводились однократно, при этом участники были разделены на когорты, получающие различные дозы исследуемого препарата [Padhi D., Jang G., Stouch В., et al.Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011;1(26):19-26]. Участники получали терапевтическое антитело или плацебо - подкожно или внутривенно. По сравнению с плацебо однократное подкожное введение антитела повысило минеральную плотность костной ткани (МПКТ) в поясничных позвонках и бедренной кости во всех опытных группах. Повышение МПКТ было дозозависимым. Большинство побочных эффектов, по мнению исследователей, были умеренными [Padhi D., Jang G., Stouch В., et al.Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011;1(26):19-26].
Однако применение антительной терапии против ОП имеет проблему введения в организм больших количеств эндогенного рекомбинантного антитела от 3-х (ромосозумаб, «Амген», США) до 6-ти (блосозумаб, «Эли Лилли», США) граммов в год, и сопутствующие осложнения, характерные для препаратов терапевтических моноклональных антител.
Таким образом, несомненна необходимость разработки альтернативного подхода, основанного на синтезе аутоантител против белка-мишени, в создании безопасной в применении профилактической вакцины против остеопороза, лечебные свойства которой будут равноценны по свойствам уже имеющимся препаратам на основе экзогенных антител, а сопутствующие побочные эффекты существенно снижены.
В уровне техники не были выявлены решения, аналогичные заявляемому. Однако использование фрагмента склеростина в качестве иммуногена известно из ЕА 200600038. Данное решение является ближайшим аналогом заявляемой группы изобретений.
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в создании рекомбинантного иммунологически активного склеростина, обладающего достаточной иммуногенностью для образования антител к склеростину, который может быть использован для терапии, в том числе смоделированного ОП. Другая задача изобретения заключается в создании инъекционной формы иммуногенной композиции на основе указанного белка и в разработке способа повышения плотности костной ткани.
Изобретение относится к способу получения целевого рекомбинантного белка склеротина позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающему конструирование векторной конструкции, обеспечивающей стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli, выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген склеростина, очистку белка склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента, последующую отмывку и выделение целевого продукта, при этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование, в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс, в результате чего получают конструкцию, содержащую последовательности, кодирующие целевой ген склеростина и последовательность из шести гистидинов в виде слитного белка.
Также изобретение относится к способу повышения костной массы позвоночного животного, в том числе млекопитающего и человека, включающему двукратное, с интервалом в 14 суток, проведение подкожных инъекций целевым рекомбинантным белком склеростином, полученным вышеуказанным способом, в дозе 0,1-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела позвоночного животного и человека, при этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить костную массу.
Техническим результатом, достигаемым при реализации заявленных изобретений, помимо расширения арсенала средств, применяемых для изучения и лечения остеопороза, является снижение побочных эффектов сопутствующих применению препаратов экзогенных антител при сохранении уровня лечебных свойств.
Примеры
Пример 1. Получение рекомбинантного склеростина мыши
Аминокислотная последовательность белка склеростина видоспецифична, поэтому для каждого вида должен быть синтезирован и модифицирован соответствующий ген с уникальной последовательностью.
Вначале осуществляют получение гена склеростина мыши с последующим его клонированием. Ген склеростина мыши получали химико-ферментативным методом. Был спланирован олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, фланкированный сайтами BamHI и Kpn2I, оптимизированный для экспрессии в E. coli. Затем осуществляли получение плазмиды рССТ - в вектор pQE13 (QIAGEN, США) по сайтам BamHI и Kpn2I был вставлен спланированный олигонуклеотидный дуплекс, в результате чего была получена конструкция, содержащая последовательности, кодирующие ген склеростина мыши и последовательность из шести гистидинов для аффинной очистки целевого белка SEQ ID NO 1 в виде слитного белка.
Пример 2. Получение штамма E. Coli - продуцента рекомбинантного антигена склеростина мыши
Для получения штамма E. coli - продуцента рекомбинантного белка склеростина мыши клетки E. coli M15 трансформировали плазмидой рССТ. Для наработки целевого белка клетках E. coli M15 в культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма E. coli M15 [рССТ], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой массе для рекомбинантного белка склеростина мыши 13,9 кДа. Уровень синтеза белков в E. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок склеростина мыши синтезируется в клетках E.coli в нерастворимой форме в виде телец включения.
Пример 3. Очистка рекомбинантного белка склеростина мыши
Для получения рекомбинантного белка склеростина клеточную культуру штамма E. coli М15 [рССТ] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5500g в течение 15 минут.
Биомассу с рекомбинантным склеростином ресуспендировали в буфере 20 м MTris-HCl рН 8.0+50 мМ NaCl в соотношении 1:10. Добавляли к суспензии клеток лизоцим до концентрации 25 мкг/мл, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора во льду в течение 2 мин. Осаждали нерастворимую фракцию телец включения центрифугированием 15000g 15 мин 4°С. Осадок ресуспендировали в буфере 20 мM Tris 8.0+50 мМ NaCl+0.1% Тритон Х-100 в соотношении 1:10 для отмывки мембранных белков и липидных компонентов клетки от тел включения (ТВ). Осаждали нерастворимую фракцию 15000g 15 мин 4°С. Повторяли отмывку ТВ дважды. Затем таким же образом дважды отмывали осадок в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+50 мМ NaCl либо в воде, чтобы отмыть Тритон Х-100. Отмытые ТВ ресуспендировали 1:4 в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+50 мМ NaCl. Солюбилизировали в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz в соотношении 1:10. Нерастворившиеся компоненты отделяли ЦФ 15000g 15 мин 4°С. Далее проводили хроматографическую очистку на сорбенте WB40Ni (Bio Works, Sweden). Колонку с сорбентом WB40Ni (BioWorks, Sweden) объемом 7 мл уравновешивали буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz. Лизат ТВ наносили на скорости потока 1 мл/мин. После нанесения проводили отмывку сорбента от неспецифики буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz, затем буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+25 мМ Iz. Элюцию целевого белка проводили буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины +250 мМ NaCl+400 мМ Iz. Пик, соответствующий целевому белку, собирали и анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Степень чистоты препарата составляла не менее 95%. Полученные фракции белка диализовали против физраствора.
Пример 4. Приготовление иммуногенной композиции белка склеростина мыши и гидроокиси алюминия
В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат, содержащий рекомбинантный белок склеростина мыши, суспендировали в растворе гидроокиси алюминия в равном объеме.
Пример 5. Влияние иммунизации склеростином на увеличение плотности костной ткани мышей.
Биологическая активность полученной иммуногенной композиции была исследована путем подкожных инъекций дважды с интервалом 20 суток в дозе 0,1-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела мыши.
Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного склеростина мыши с помощью нарабатываемых аутоантител.
Исследование влияния иммунизации склеростином на увеличение плотности костной ткани самок мышей проводили на модели ОП, вызванного овариоэктомией. В эксперименте 8-месячные самки мышей линии Balb/c(21 голова) были случайным образом распределены на 3 группы (по 7 голов): ложнооперированные (группа №1), овариоэктомированные мыши с инъекциями физ.раствора (группа №2), овариоэктомированные мыши с инъекциями склеростином (дважды по 5 мкг подкожно с интервалом 14 суток) (группа №3).
Перед проведением хирургических процедур животных выдерживали на голодной диете для облегчения перенесения наркоза. Для введения животных в общий наркоз проводили интраперитониальную инъекцию смеси анестетиков «Золетил 100» (Virbac С.А., Франция) в дозировке 30 мг/кг веса и «Рометар» (Bioveta, Чехия) в дозировке 10 мг/кг веса. Для предотвращения иссушения роговицы глаз на них наносили «Normlgel» (
Health Care AB, Швеция). Все хирургические процедуры проводили в ламинарном боксе с соблюдением правил асептики и антисептики. Животных фиксировали в лежачем положении на спине на хирургическом столике для грызунов, оборудованном нагревательным элементом для обеспечения поддержания во время операции постоянной температуры тела на уровне 36°С (Rigalli et al., 2009). Хирургическое поле освобождали от шерсти, обрабатывали кожным антисептиком, после чего в нижней части живота проводили лапаротомию длиной 2-3 см, открывая доступ к матке. Далее матку сдвигали в сторону и накладывали 2 лигатуры - между яичниками и маткой и на артерии яичника. Затем яичники удаляли, ткани послойно ушивали атравматическим шовным материалом. Опыты по иммунизации животных проводили через месяц после операции. В группе №1 (ложнооперированные животные) осуществляли только хирургический доступ к яичникам без их последующего удаления и иммунизации препаратом. Инъекции физ.раствора либо иммуногенной композицией склеростина (группы №2 и 3) проводили дважды: через 30 и 45 суток после овариоэктомии. Компьютерную томографию осуществляли in vivo на томографе SkyScan 1176 (Bruker, США) сразу после проведения операции, через 60 суток после операции и перед эвтаназией (120 дней после операции).
Исследование плотности костной ткани диафизарной части бедренных костей обеих задних лап животных проводили с помощью микрокомпьютерной томографии. Сканирование осуществляли с алюминиевым фильтром 0,5 мм, напряжением 60 кВ, силой тока 575 мА и разрешением 35 мкм с последующим анализом плотности костной ткани (BMD, bonemineraldensity). Реконструкция полученных изображений проводилась в программе NRecon (v.1.6.9.8). В качестве настроек реконструкции были выбраны: Postalignment - «300», Smoothing - «3», Ringartefactcorrection - «14», Beam-hardening - «18%». После проведения реконструкции полученные 3D-модели бедренных костей были исследованы с помощью программного обеспечения CTAn (v.1.16) (Bruker, США). Анализу подвергался губчатый матрикс диафизарной части бедренной кости, при этом кортикальный матрикс был удален программно. Плотность костной ткани определялась с помощью калибровочных фантомов с плотностью 0,25 и 0,75 г/мм2.
Статистический анализ результатов исследования проводился на программе Statistica 12.0 (Statsoft, США) с помощью непараметрических критериев Краскела-Уоллиса и Фридмана (р<0,01).
Результаты исследования влияния инъекций склеростина на плотность костной ткани мышей приведены на фиг. 1. При исследовании динамики изменений плотности костной ткани бедренных костей ложнооперированных животных (группа №1) не наблюдалось достоверных изменений плотности костной ткани на протяжении всего периода наблюдения. В группе №2 на сроке 2 и 3 (60 и 120 дней после операции) наблюдалась отрицательная динамика изменения плотности костной ткани (р<0,01). В группе №3 на сроке 2 было установлено снижение плотности костной ткани, при этом к 60 суткам после операции (срок 3) проходило возращение значений плотности костной ткани к первоначальному уровню. При сравнении групп между собой наблюдалось достоверное отличие между группами №2 и 3 по сравнению с группой №1 на сроке 2, а также отличие у групп №1 и 2 между собой на сроке 3. Достоверных отличий на сроке 3 между группой №1 ложнооперированных мышей и опытной группой №3 с овариоэктимированными мышами, которым проводили инъекции склеростина, не было выявлено, что свидетельствует о положительном влиянии инъекций склеростина на восстановление плотности костной ткани при остеопорозе.
Другим важным количественным параметром, характеризующим степень развития остеопороза, является толщина трабекул губчатой кости. Определение этого параметра проводится также на участке кости, лишенном кортикальной части, с помощью 3D-анализа бинаризованных изображений. При этом бинаризация проводится таким образом, чтобы получаемые 3D-изображения, соответствующие микроархитектуре исследуемого участка, были лишены нежелательных программных шумов и артефактов. Результатом анализа является усредненное значение толщины трабекул исследуемого участка, которое может быть использовано при количественном сравнении степени развития остеопороза в разных экспериментальных группах.
При исследовании динамики изменений структуры губчатой части бедренных костей ложнооперированных животных (группа №1) не наблюдалось достоверных изменений толщины трабекул губчатой кости (фиг. 2) и плотности костной ткани на протяжении всего периода наблюдения (фиг. 1).
В группе №2 на сроке 2 и 3 (30 и 60 недель после операции) наблюдалось уменьшение толщины трабекул губчатой кости и плотности костной ткани (р<0,01). При этом в группе №3 значения показателей толщины трабекул губчатой кости и плотности костной ткани, сниженные на сроке 2, возвращались к первоначальному уровню к 60 суткам после операции (срок 3).
Для увеличения плотности костной ткани возможно проведение третьей и последующих иммунизаций через каждые 3 месяца после повторной инъекции.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Результаты исследования влияния инъекций склеростина на плотность костной ткани мышей.
Фиг. 2. Результаты исследования влияния инъекций иммуногенной композиции на основе склеростина на толщину трабекул губчатой костной ткани.
* - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой №1 (р<0,01)
Claims (3)
1. Способ получения целевого рекомбинантного белка склеростина позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающий конструирование векторной конструкции, обеспечивающей стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli, выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген склеростина, очистку белка склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента, последующую отмывку и выделение целевого продукта, при этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование, в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс с получением конструкции, содержащей последовательность, кодирующую слитый белок целевоого склеростина и шести гистидинов.
2. Способ повышения костной массы позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающий двукратное, с интервалом в 20 суток, проведение иммунизации целевым рекомбинантным белком склеростином, полученным способом по п. 1, в дозе 0,1-100 мкг склеростина на один килограмм массы тела позвоночного животного, при этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить плотность костной ткани.
3. Способ по п. 2, включающий проведение третьей и последующих иммунизаций через каждые 3 месяца после повторной инъекции.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130132A RU2647571C1 (ru) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130132A RU2647571C1 (ru) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2647571C1 true RU2647571C1 (ru) | 2018-03-16 |
Family
ID=61629354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017130132A RU2647571C1 (ru) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2647571C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200600038A1 (ru) * | 2003-06-16 | 2006-06-30 | Селлтек Ар Энд Ди, Инк. | Антитела, специфические в отношении склеростина, и способы увеличения минерализации кости |
-
2017
- 2017-08-25 RU RU2017130132A patent/RU2647571C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200600038A1 (ru) * | 2003-06-16 | 2006-06-30 | Селлтек Ар Энд Ди, Инк. | Антитела, специфические в отношении склеростина, и способы увеличения минерализации кости |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| UZ 4548 C (ЮСБ ФАРМА С.А. (BE) ЭМДЖЕН ИНК. (US)), 31.08.2012. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hu et al. | The roles of vascular endothelial growth factor in bone repair and regeneration | |
| Siddiqui et al. | Physiological bone remodeling: systemic regulation and growth factor involvement | |
| US20230322878A1 (en) | Compounds for inducing tissue formation and uses thereof | |
| Feng et al. | Systemic administration of sclerostin monoclonal antibody accelerates fracture healing in the femoral osteotomy model of young rats | |
| JPH09509825A (ja) | 骨細胞を刺激するための方法および組成物 | |
| JP2022031954A (ja) | 組織形成誘導用化合物及びその使用 | |
| JP2022046727A (ja) | 組織形成誘導用化合物及びその使用 | |
| JP2018531281A6 (ja) | 組織形成誘導用化合物及びその使用 | |
| US20220267394A1 (en) | Compounds for inducing tissue formation and uses thereof | |
| Nozaki et al. | Timing of the administration of suramin treatment after muscle injury | |
| Schumacher et al. | Periosteal insulin-like growth factor I and bone formation Changes during tibial lengthening in rabbits | |
| JP7145503B2 (ja) | 腫瘍細胞を非腫瘍細胞に変換するための医薬的連合体及びその使用 | |
| JP2021138720A (ja) | 腫瘍細胞を非腫瘍細胞に変換するための医薬的連合体及びその使用 | |
| IL258131B2 (en) | A drug combination that includes at least one compound that binds growth factor receptors for use in the treatment, prevention or diagnosis of neoplastic disease | |
| RU2647571C1 (ru) | Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного | |
| Ren et al. | Effects of rhBMP-2/7 heterodimer and RADA16 hydrogel scaffold on bone formation during rabbit mandibular distraction | |
| Zhang et al. | Mechanism of low-intensity pulse ultrasound combined with Rhodiola to promote bone formation in spinal fusion | |
| Uslu et al. | The effect of femoral nerve block on fracture healing via expressions of growth factors and β-catenin | |
| IL286670B2 (en) | Compounds for inducing tissue formation and their uses | |
| Reid | Plenary Talk Abstracts | |
| Hamade | Enhanced bone formation during distraction osteogenesis in FGFR3 deficient mice | |
| Muratli et al. | Bosentan, a non-specific endothelin antagonist, stimulates fracture healing | |
| Albishi | Inhibition of Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (FGFR3) signalling to accelerate bone formation during distraction osteogenesis of mice tibiae |