RU2647571C1 - Recombinant white scelestine, method for producing recombinant protein of screrostin, method of increasing bone mass of vertebrate animal - Google Patents
Recombinant white scelestine, method for producing recombinant protein of screrostin, method of increasing bone mass of vertebrate animal Download PDFInfo
- Publication number
- RU2647571C1 RU2647571C1 RU2017130132A RU2017130132A RU2647571C1 RU 2647571 C1 RU2647571 C1 RU 2647571C1 RU 2017130132 A RU2017130132 A RU 2017130132A RU 2017130132 A RU2017130132 A RU 2017130132A RU 2647571 C1 RU2647571 C1 RU 2647571C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sclerostin
- protein
- target
- bone
- vertebrate
- Prior art date
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000019307 Sclerostin Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000037182 bone density Effects 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 101100421899 Mus musculus Sost gene Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 5
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101000702766 Mus musculus Sclerostin Proteins 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 3
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 3
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 3
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 3
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 3
- 101001043594 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 102100021926 Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 3
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 3
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 2
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002617 bone density conservation agent Substances 0.000 description 2
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 229940122361 Bisphosphonate Drugs 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710099518 Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 208000008924 Femoral Fractures Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000011327 Increased bone mineral density Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 101100455225 Oryza sativa subsp. japonica LPR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004286 Osteochondrodysplasias Diseases 0.000 description 1
- 201000000023 Osteosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000037340 Rare genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101150098533 SOST gene Proteins 0.000 description 1
- 201000010096 SOST-related sclerosing bone dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 229940087674 Sclerostin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000000123 anti-resoprtive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000011444 antiresorptive therapy Methods 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012669 compression test Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- -1 nitrogen-containing bisphosphonates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010258 osteoblastogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001097 osteosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010048734 sclerotin Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область примененияApplication area
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а конкретно к рекомбинантному белку склеростина, способу его получения, а также способу повышения костной массы позвоночного животного, особенно млекопитающего. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине для лечения остепороза у позвоночных животных, в том числе млекопитающих и человека. Таким образом, заявленная группа изобретений расширяет арсенал средств, используемых для исследования и лечения остеопороза.The invention relates to biotechnology and immunology, and in particular to a recombinant sclerostin protein, a method for its production, and also a method for increasing the bone mass of a vertebrate animal, especially a mammal. The invention can be used in veterinary medicine and for the treatment of osteoporosis in vertebrates, including mammals and humans. Thus, the claimed group of inventions expands the arsenal of tools used for the study and treatment of osteoporosis.
Известный уровеньKnown level
Среди костных заболеваний наиболее распространенным и драматичным по последствиям остается остеопороз (ОП). С клинических позиций развитие ОП определяется многочисленными факторами: возрастом, массой тела, наступлением менопаузы, приемом глюкокортикоидов и других препаратов, влияющих на костный метаболизм, сопутствующими заболеваниями, и др. На тканевом уровне эти факторы приводят к дисбалансу остеокласт-опосредованной костной резорбции и остеобласт-опосредованного формирования костной ткани с нарушением нормального гомеостаза костной системы и как следствие - к потерям костной массы. Современные концепции фармакологического лечения ОП направлены на ограничение остеокласт-опосредованной костной резорбции. Наиболее изученными и распространенными препаратами являются азотсодержащие бисфосфонаты, которые индуцируют апоптоз остеокластов. Активность остеокластов ограничивают также кальцитонин, эстрогены, селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, а также новый утвержденный антирезорбтивный препарат деносумаб, представляющий собой гуманизированное антитело против рецептора активатора нуклеарного фактора κB (NF-κB), который функционирует как ингибитор образования остеокластов. В США, Канаде, России и некоторых странах Европы разрешен к применению анаболический препарат - паратироидный гормон - терипаратид, который пока в единственном числе выступает в качестве противовеса многочисленным антирезорбтивным препаратам. Однако последние экспериментальные и клинические исследования указывают на то, что данная ситуация должна коренным образом измениться в ближайшем будущем. Это связано в первую очень с открытием белков-ингибиторов, регулирующих костный гомеостаз. Среди таких белков наибольшее внимание привлекает склеростин [Дыдыкина И.С., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма костной ткани. Науч.-практич. ревматол. 2013;3(51): 296-301]. Склеростин является эндогенным ингибитором канонического Wnt/β-катенин-сигнального пути. В его присутствии предшественники остеобластов не подвергаются воздействию Wnt-сигнала, в результате процесс дифференциации остеобластов приостанавливается. Wnt-сигнальный путь прямо влияет на процессы формирования и регенерации костной ткани, а модуляция этого пути может оказаться полезной для лечения ОП и других костных заболеваний [Drake М., Farr J.N. Inhibitors of sclerostin; emerging concepts. Curr. Opin. Rheumatol. 2014;26(40):45-52, Lewieski E.M. Role of sclerostin in bone and cartilage and its potential as a therapeutic target in bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2014;2(6):48-57]. Изучение ряда редких генетических заболеваний, в частности остеосклерозирующих, позволило выявить участие Wnt-сигнального пути в регуляции формирования костной ткани [Дыдыкина И.С., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма костной ткани. Науч.-практич. ревматол. 2013;3(51):296-301]. С другой стороны, склеростин, который продуцируется остеоцитами, ограничивает процесс формирования костной ткани во избежание избыточного окостенения. Например, при генетически детерминированных заболеваниях костной ткани, проявляющихся избыточным окостенением (остеосклероз, болезнь ван Бухема), установлен дефект гена SOST, локализующегося в хромосоме 17q12-21 и отвечающего за экспрессию склеростина [Garnero P. Sclerostin - a specific biochemical marker of osteocyte function. Lyon, 2011. 20 р.]. В соответствии с современной концепцией лечения ОП антирезорбтивные агенты служат препаратами первой линии для уменьшения риска переломов костей у пациентов с ОП, а препараты анаболического действия обычно рекомендуются только при выраженном/тяжелом ОП. Однако при потере костной массы микроструктура кости (микроархитектоника) не может быть восстановлена только за счет влияния на функцию остеокластов. Таким образом, будущая технология лечения ОП будет направлена на реверсию ОП за счет максимального увеличения плотности костной ткани и сохранения микроархитектоники на начальной стадии, а достигнутые результаты будут поддерживаться за счет антирезорбтивной терапии, применяемой на второй стадии.Among bone diseases, osteoporosis (OP) remains the most common and dramatic in its consequences. From a clinical point of view, the development of OP is determined by numerous factors: age, body weight, the onset of menopause, taking glucocorticoids and other drugs that affect bone metabolism, concomitant diseases, etc. At the tissue level, these factors lead to an imbalance of osteoclast-mediated bone resorption and osteoblast- indirect formation of bone tissue with a violation of normal homeostasis of the skeletal system and, as a result, loss of bone mass. Modern concepts of pharmacological treatment of OP are aimed at limiting osteoclast-mediated bone resorption. The most studied and common drugs are nitrogen-containing bisphosphonates, which induce apoptosis of osteoclasts. The activity of osteoclasts is also limited by calcitonin, estrogens, selective modulators of estrogen receptors, as well as the new approved antiresorptive drug denosumab, which is a humanized antibody against the κB nuclear factor activator receptor (NF-κB), which functions as an inhibitor of osteoclastic formation. In the USA, Canada, Russia and some countries of Europe, an anabolic drug - parathyroid hormone - teriparatide, which so far in the singular acts as a counterweight to numerous antiresorptive drugs, is approved for use. However, recent experimental and clinical studies indicate that this situation should fundamentally change in the near future. This is primarily connected with the discovery of inhibitor proteins that regulate bone homeostasis. Among these proteins, sclerostin attracts the most attention [Dydykina IS, Vetkova ES Sclerostin and its role in the regulation of bone metabolism. Scientific and practical rheumatol. 2013; 3 (51): 296-301]. Sclerostin is an endogenous inhibitor of the canonical Wnt / β-catenin signaling pathway. In his presence, the precursors of osteoblasts are not exposed to the Wnt signal; as a result, the process of differentiation of osteoblasts is suspended. Wnt-signaling pathway directly affects the processes of formation and regeneration of bone tissue, and modulation of this pathway may be useful for the treatment of OP and other bone diseases [Drake M., Farr J.N. Inhibitors of sclerostin; emerging concepts. Curr. Opin. Rheumatol. 2014; 26 (40): 45-52, Lewieski E.M. Role of sclerostin in bone and cartilage and its potential as a therapeutic target in bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2014; 2 (6): 48-57]. The study of a number of rare genetic diseases, in particular osteosclerosing, made it possible to identify the participation of the Wnt signaling pathway in the regulation of bone tissue formation [Dydykina IS, Vetkova ES Sclerostin and its role in the regulation of bone metabolism. Scientific and practical rheumatol. 2013; 3 (51): 296-301]. On the other hand, sclerostin, which is produced by osteocytes, limits the process of bone formation in order to avoid excessive ossification. For example, in genetically determined diseases of bone tissue, which are manifested by excessive ossification (osteosclerosis, Van Buchem disease), a defect in the SOST gene located on chromosome 17q12-21 and responsible for the expression of sclerosis has been established [Garnero P. Sclerostin - a specific biochemical marker of osteocyte function. Lyon, 2011. 20 p.]. In accordance with the modern concept of treatment of OP, antiresorptive agents serve as first-line drugs to reduce the risk of bone fractures in patients with OP, and anabolic drugs are usually recommended only for severe / severe OP. However, with bone loss, the microstructure of the bone (microarchitectonics) cannot be restored only due to the influence on the function of osteoclasts. Thus, the future technology of treatment of OP will be aimed at reversing the OP by maximizing bone density and preserving microarchitectonics at the initial stage, and the achieved results will be supported by antiresorptive therapy used in the second stage.
Сегодня известно, что склеростин представляет собой циркулирующий ингибитор сигнального пути Wnt, который продуцируется остеоцитами и подавляет функцию рецептор - связывающего протеина LPR5. Антитела, направленные против склеростина, обладают анаболическими свойствами. Склеростин-нейтрализующие моноклональные антитела блокируют остеоцит-продуцированный склеростин, который является антагонистом Wnt-сигнального пути и предотвращает связывание Wnt и корецептора LRP5/6. Связанный/блокированный склеростин позволяет связаться Wnt с комплексом LRP5/6, тем самым стимулируя активность Wnt/β-катенин сигнального пути в остеобластах, что приводит в конечном итоге к увеличению их остеосинтетической активности и повышению костеобразования.Today it is known that sclerostin is a circulating inhibitor of the Wnt signaling pathway, which is produced by osteocytes and inhibits the function of the receptor-binding protein LPR5. Antibodies against sclerostin have anabolic properties. Sclerostin-neutralizing monoclonal antibodies block osteocyte-produced sclerostin, which is an antagonist of the Wnt signaling pathway and prevents the binding of Wnt and the LRP5 / 6 coreceptor. Bound / blocked sclerostin allows Wnt to bind to the LRP5 / 6 complex, thereby stimulating the activity of the Wnt / β-catenin signaling pathway in osteoblasts, which ultimately leads to an increase in their osteosynthetic activity and an increase in bone formation.
За последние годы появилось огромное количество работ о ведущей роли Wnt/β-катенин-сигнального пути в дифференциации остеобластов, пролиферации, и, в конечном счете, в формировании новой костной ткани [Ke H.Z., Richards W.G., Li X., et al.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases. Endocr Rev. 2012;5(33):747-83, Kim J.H., Liu X., Wang J., et al. Wnt signaling in bone formation and its therapeutic potential for bone diseases. Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. 2013;1(5):13-31, Moester M.J., Papapoulos S.E.,
Многочисленные экспериментальные исследования, проведенные буквально за последние 10 лет с использованием различных моделей заболеваний костной ткани, убедительно демонстрируют, что ингибирование склеростина с помощью моноклональных антител положительно влияет на структуру костной ткани, повышает ее плотность, а также улучшает сращение переломов на моделях мышей и крыс [Agholme F., Macias В., Hamang М., et al.Efficacy of a sclerostin antibody compared to a low dose of PTH on metaphyseal bone healing. Orthop. Res. 2014;3(32):471-76, Hamann C., Rauner M.,
С декабря 2006 по июль 2007 г. в США проведено рандомизированное контролируемое двойное слепое исследование моноклональных антител к склеростину («ромосозумаб», Амген), которые вводились однократно, при этом участники были разделены на когорты, получающие различные дозы исследуемого препарата [Padhi D., Jang G., Stouch В., et al.Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011;1(26):19-26]. Участники получали терапевтическое антитело или плацебо - подкожно или внутривенно. По сравнению с плацебо однократное подкожное введение антитела повысило минеральную плотность костной ткани (МПКТ) в поясничных позвонках и бедренной кости во всех опытных группах. Повышение МПКТ было дозозависимым. Большинство побочных эффектов, по мнению исследователей, были умеренными [Padhi D., Jang G., Stouch В., et al.Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011;1(26):19-26].From December 2006 to July 2007, a randomized double-blind study of monoclonal antibodies to sclerostin (Romososumab, Amgen), which was administered once, was conducted in the USA, and the participants were divided into cohorts receiving different doses of the study drug [Padhi D., Jang G., Stouch B., et al. Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011; 1 (26): 19-26]. Participants received a therapeutic antibody or placebo subcutaneously or intravenously. Compared with placebo, a single subcutaneous administration of an antibody increased bone mineral density (BMD) in the lumbar vertebrae and femur in all experimental groups. An increase in BMD was dose dependent. Most of the side effects, according to the researchers, were mild [Padhi D., Jang G., Stouch B., et al. Single-dose, placebo-controlled, randomized study of AMG 785, a sclerostin monoclonal antibody. J. Bone Miner. Res. 2011; 1 (26): 19-26].
Однако применение антительной терапии против ОП имеет проблему введения в организм больших количеств эндогенного рекомбинантного антитела от 3-х (ромосозумаб, «Амген», США) до 6-ти (блосозумаб, «Эли Лилли», США) граммов в год, и сопутствующие осложнения, характерные для препаратов терапевтических моноклональных антител.However, the use of antibody therapy against OP has the problem of introducing large amounts of an endogenous recombinant antibody into the body from 3 grams (romososumab, Amgen, USA) to 6 grams (blososumab, Eli Lilly, USA) grams per year, and related complications specific for therapeutic monoclonal antibody preparations.
Таким образом, несомненна необходимость разработки альтернативного подхода, основанного на синтезе аутоантител против белка-мишени, в создании безопасной в применении профилактической вакцины против остеопороза, лечебные свойства которой будут равноценны по свойствам уже имеющимся препаратам на основе экзогенных антител, а сопутствующие побочные эффекты существенно снижены.Thus, there is no doubt the need to develop an alternative approach based on the synthesis of autoantibodies against the target protein in creating a safe prophylactic vaccine against osteoporosis, the therapeutic properties of which will be equivalent in properties to existing drugs based on exogenous antibodies, and the accompanying side effects are significantly reduced.
В уровне техники не были выявлены решения, аналогичные заявляемому. Однако использование фрагмента склеростина в качестве иммуногена известно из ЕА 200600038. Данное решение является ближайшим аналогом заявляемой группы изобретений.In the prior art have not been identified solutions similar to the claimed. However, the use of a sclerostin fragment as an immunogen is known from EA 200600038. This solution is the closest analogue of the claimed group of inventions.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Задача настоящего изобретения заключается в создании рекомбинантного иммунологически активного склеростина, обладающего достаточной иммуногенностью для образования антител к склеростину, который может быть использован для терапии, в том числе смоделированного ОП. Другая задача изобретения заключается в создании инъекционной формы иммуногенной композиции на основе указанного белка и в разработке способа повышения плотности костной ткани.The objective of the present invention is to provide a recombinant immunologically active sclerostin with sufficient immunogenicity to produce antibodies to sclerostin, which can be used for therapy, including simulated OP. Another object of the invention is to provide an injectable form of an immunogenic composition based on said protein and to develop a method for increasing bone density.
Изобретение относится к способу получения целевого рекомбинантного белка склеротина позвоночного животного, в том числе млекопитающего, включающему конструирование векторной конструкции, обеспечивающей стабильную репликацию и экспрессию целевого гена в клетках Е. coli, выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген склеростина, очистку белка склеростина из клеточных экстрактов штамма Е. coli с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии при использовании никельсодержащего сорбента, последующую отмывку и выделение целевого продукта, при этом для конструирования векторной конструкции вначале получают целевой ген склеростина и осуществляют его клонирование, в целевой ген по сайтам BamHI и Kpn2I вставляют спланированный олигонуклеотидный дуплекс, в результате чего получают конструкцию, содержащую последовательности, кодирующие целевой ген склеростина и последовательность из шести гистидинов в виде слитного белка.The invention relates to a method for producing the target recombinant sclerotin protein of a vertebrate animal, including a mammal, comprising constructing a vector construct that provides stable replication and expression of the target gene in E. coli cells, growing E. coli strain cells expressing the sclerostin gene, purification of sclerostin protein from cell extracts of E. coli strain using metal-chelate affinity chromatography using a nickel-containing sorbent, subsequent washing and isolation of the target product, and in order to construct the vector construct, the target sclerostin gene is first obtained and cloned, the planned oligonucleotide duplex is inserted into the target gene at the BamHI and Kpn2I sites, whereby a construct containing sequences encoding the target sclerostin gene and a sequence of six histidines in as a fusion protein.
Также изобретение относится к способу повышения костной массы позвоночного животного, в том числе млекопитающего и человека, включающему двукратное, с интервалом в 14 суток, проведение подкожных инъекций целевым рекомбинантным белком склеростином, полученным вышеуказанным способом, в дозе 0,1-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела позвоночного животного и человека, при этом используют целевой белок склеростина того же вида позвоночного животного, которому необходимо повысить костную массу.The invention also relates to a method for increasing the bone mass of a vertebrate animal, including a mammal and a human, including double, with an interval of 14 days, subcutaneous injection of the target recombinant sclerostin protein obtained by the above method in a dose of 0.1-100 μg of recombinant protein per one kilogram of the body weight of a vertebrate animal and a person, using the target sclerosin protein of the same type of vertebrate animal that needs to increase bone mass.
Техническим результатом, достигаемым при реализации заявленных изобретений, помимо расширения арсенала средств, применяемых для изучения и лечения остеопороза, является снижение побочных эффектов сопутствующих применению препаратов экзогенных антител при сохранении уровня лечебных свойств.The technical result achieved by the implementation of the claimed invention, in addition to expanding the arsenal of tools used to study and treat osteoporosis, is to reduce the side effects associated with the use of exogenous antibody preparations while maintaining the level of therapeutic properties.
ПримерыExamples
Пример 1. Получение рекомбинантного склеростина мышиExample 1. Obtaining recombinant mouse sclerosis
Аминокислотная последовательность белка склеростина видоспецифична, поэтому для каждого вида должен быть синтезирован и модифицирован соответствующий ген с уникальной последовательностью.The amino acid sequence of the sclerostin protein is species-specific, therefore, for each species, the corresponding gene with a unique sequence must be synthesized and modified.
Вначале осуществляют получение гена склеростина мыши с последующим его клонированием. Ген склеростина мыши получали химико-ферментативным методом. Был спланирован олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, фланкированный сайтами BamHI и Kpn2I, оптимизированный для экспрессии в E. coli. Затем осуществляли получение плазмиды рССТ - в вектор pQE13 (QIAGEN, США) по сайтам BamHI и Kpn2I был вставлен спланированный олигонуклеотидный дуплекс, в результате чего была получена конструкция, содержащая последовательности, кодирующие ген склеростина мыши и последовательность из шести гистидинов для аффинной очистки целевого белка SEQ ID NO 1 в виде слитного белка.First, the mouse sclerostin gene is obtained, followed by its cloning. The mouse sclerostin gene was obtained by the chemical-enzymatic method. An oligonucleotide duplex was designed that encodes the corresponding gene flanked by the BamHI and Kpn2I sites, optimized for expression in E. coli. Then, plasmid pCST was obtained — a planned oligonucleotide duplex was inserted into the pQE13 vector (QIAGEN, USA) at the BamHI and Kpn2I sites; as a result, a construct containing sequences encoding the mouse sclerostin gene and a sequence of six histidines for affinity purification of the target SEQ protein was obtained
Пример 2. Получение штамма E. Coli - продуцента рекомбинантного антигена склеростина мышиExample 2. Obtaining a strain of E. Coli - producer of recombinant mouse sclerostin antigen
Для получения штамма E. coli - продуцента рекомбинантного белка склеростина мыши клетки E. coli M15 трансформировали плазмидой рССТ. Для наработки целевого белка клетках E. coli M15 в культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма E. coli M15 [рССТ], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой массе для рекомбинантного белка склеростина мыши 13,9 кДа. Уровень синтеза белков в E. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок склеростина мыши синтезируется в клетках E.coli в нерастворимой форме в виде телец включения.To obtain a strain of E. coli, a producer of the recombinant mouse sclerostin protein, E. coli M15 cells were transformed with the plasmid pCST. To produce the target protein, E. coli M15 cells added 3 μl of a 0.1 M solution of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) to the culture and grown for 3 hours. When comparing the spectrum of proteins synthesized by cells of the E. coli M15 strain [pCST], the appearance of an additional protein band was detected. The molecular weight of the additional band corresponded to the expected mass for the recombinant mouse sclerostin protein of 13.9 kDa. The level of protein synthesis in E. coli was determined by comparing the staining intensity of the band of the recombinant protein with the band of the corresponding protein, the molecular weight standard. It was shown that the recombinant mouse sclerostin protein is synthesized in E. coli cells in an insoluble form in the form of inclusion bodies.
Пример 3. Очистка рекомбинантного белка склеростина мышиExample 3. Purification of Recombinant Mouse Sclerostin Protein
Для получения рекомбинантного белка склеростина клеточную культуру штамма E. coli М15 [рССТ] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5500g в течение 15 минут.To obtain a recombinant sclerostin protein, the cell culture of E. coli strain M15 [pCST] was grown in 1000 ml of LB medium with ampicillin (100 μg / ml) at 37 ° C to an optical density corresponding to 1 unit. absorption at a wavelength of 550 nm. 15 μl of a 0.1 M IPTG solution was added to the medium and grown for 3 hours. Cells were besieged by centrifugation at 5500g for 15 minutes.
Биомассу с рекомбинантным склеростином ресуспендировали в буфере 20 м MTris-HCl рН 8.0+50 мМ NaCl в соотношении 1:10. Добавляли к суспензии клеток лизоцим до концентрации 25 мкг/мл, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора во льду в течение 2 мин. Осаждали нерастворимую фракцию телец включения центрифугированием 15000g 15 мин 4°С. Осадок ресуспендировали в буфере 20 мM Tris 8.0+50 мМ NaCl+0.1% Тритон Х-100 в соотношении 1:10 для отмывки мембранных белков и липидных компонентов клетки от тел включения (ТВ). Осаждали нерастворимую фракцию 15000g 15 мин 4°С. Повторяли отмывку ТВ дважды. Затем таким же образом дважды отмывали осадок в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+50 мМ NaCl либо в воде, чтобы отмыть Тритон Х-100. Отмытые ТВ ресуспендировали 1:4 в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+50 мМ NaCl. Солюбилизировали в буфере 20 мM Tris-HCl pH 8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz в соотношении 1:10. Нерастворившиеся компоненты отделяли ЦФ 15000g 15 мин 4°С. Далее проводили хроматографическую очистку на сорбенте WB40Ni (Bio Works, Sweden). Колонку с сорбентом WB40Ni (BioWorks, Sweden) объемом 7 мл уравновешивали буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz. Лизат ТВ наносили на скорости потока 1 мл/мин. После нанесения проводили отмывку сорбента от неспецифики буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+5 мМ Iz, затем буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины + 250 мМ NaCl+25 мМ Iz. Элюцию целевого белка проводили буфером 20 мМ Tris8.0+8М мочевины +250 мМ NaCl+400 мМ Iz. Пик, соответствующий целевому белку, собирали и анализировали с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Степень чистоты препарата составляла не менее 95%. Полученные фракции белка диализовали против физраствора.Recombinant sclerostin biomass was resuspended in 20 m MTris-HCl buffer pH 8.0 + 50 mM NaCl in a ratio of 1:10. Lysozyme was added to the cell suspension to a concentration of 25 μg / ml, incubated for 30 min at room temperature and destroyed using an ultrasonic disintegrator in ice for 2 min. An insoluble fraction of inclusion bodies was precipitated by centrifugation at 15,000 g for 15 min 4 ° C. The pellet was resuspended in 20 mM Tris 8.0 + 50 mM NaCl + 0.1% Triton X-100 buffer at a ratio of 1:10 to wash membrane proteins and lipid components of the cell from inclusion bodies (TB). Precipitated insoluble fraction 15000g 15 min 4 ° C. Repeated washing the TV twice. Then, in the same way, the precipitate was washed twice in a buffer of 20 mM Tris-HCl pH 8.0 + 50 mM NaCl or in water to wash Triton X-100. The washed TBs were resuspended 1: 4 in 20 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 + 50 mM NaCl. Solubilized in a buffer of 20 mm Tris-HCl pH 8.0 + 8M urea + 250 mm NaCl + 5 mm Iz in a ratio of 1:10. Insoluble components separated CF 15000g 15 min 4 ° С. Next, chromatographic purification was performed on a WB40Ni sorbent (Bio Works, Sweden). A 7 ml WB40Ni sorbent column (BioWorks, Sweden) was equilibrated with 20 mM Tris8.0 + 8 M urea buffer + 250 mM NaCl + 5 mM Iz. Lysate TB was applied at a flow rate of 1 ml / min. After application, the sorbent was washed from nonspecific with 20 mM Tris8.0 + 8M urea buffer + 250 mM NaCl + 5 mM Iz, then 20 mM Tris8.0 + 8M urea buffer + 250 mM NaCl + 25 mM Iz. The target protein was eluted with 20 mM Tris8.0 + 8 M urea buffer + 250 mM NaCl + 400 mM Iz. The peak corresponding to the target protein was collected and analyzed by PAGE electrophoresis under denaturing conditions. The purity of the drug was at least 95%. The resulting protein fractions were dialyzed against saline.
Пример 4. Приготовление иммуногенной композиции белка склеростина мыши и гидроокиси алюминияExample 4. Preparation of an immunogenic composition of mouse sclerostin protein and aluminum hydroxide
В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат, содержащий рекомбинантный белок склеростина мыши, суспендировали в растворе гидроокиси алюминия в равном объеме.In a preferred embodiment of the invention, the preparation containing the recombinant mouse sclerostin protein is suspended in an equal volume of aluminum hydroxide solution.
Пример 5. Влияние иммунизации склеростином на увеличение плотности костной ткани мышей.Example 5. The effect of immunization with sclerostin on an increase in bone density of mice.
Биологическая активность полученной иммуногенной композиции была исследована путем подкожных инъекций дважды с интервалом 20 суток в дозе 0,1-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела мыши.The biological activity of the obtained immunogenic composition was studied by subcutaneous injection twice with an interval of 20 days at a dose of 0.1-100 μg of recombinant protein per kilogram of mouse body weight.
Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного склеростина мыши с помощью нарабатываемых аутоантител.The mechanism of action of the drug is based on the temporary blocking of the activity of endogenous sclerosis of the mouse using the generated autoantibodies.
Исследование влияния иммунизации склеростином на увеличение плотности костной ткани самок мышей проводили на модели ОП, вызванного овариоэктомией. В эксперименте 8-месячные самки мышей линии Balb/c(21 голова) были случайным образом распределены на 3 группы (по 7 голов): ложнооперированные (группа №1), овариоэктомированные мыши с инъекциями физ.раствора (группа №2), овариоэктомированные мыши с инъекциями склеростином (дважды по 5 мкг подкожно с интервалом 14 суток) (группа №3).A study of the effect of immunization with sclerostin on an increase in bone density of female mice was performed on a model of OP caused by ovariectomy. In the experiment, 8-month-old female Balb / c mice (21 heads) were randomly divided into 3 groups (7 goals each): mock operated (group No. 1), ovariectomized mice with injections of saline solution (group No. 2), ovariectomized mice with sclerostin injections (twice 5 μg subcutaneously with an interval of 14 days) (group No. 3).
Перед проведением хирургических процедур животных выдерживали на голодной диете для облегчения перенесения наркоза. Для введения животных в общий наркоз проводили интраперитониальную инъекцию смеси анестетиков «Золетил 100» (Virbac С.А., Франция) в дозировке 30 мг/кг веса и «Рометар» (Bioveta, Чехия) в дозировке 10 мг/кг веса. Для предотвращения иссушения роговицы глаз на них наносили «Normlgel» (
Исследование плотности костной ткани диафизарной части бедренных костей обеих задних лап животных проводили с помощью микрокомпьютерной томографии. Сканирование осуществляли с алюминиевым фильтром 0,5 мм, напряжением 60 кВ, силой тока 575 мА и разрешением 35 мкм с последующим анализом плотности костной ткани (BMD, bonemineraldensity). Реконструкция полученных изображений проводилась в программе NRecon (v.1.6.9.8). В качестве настроек реконструкции были выбраны: Postalignment - «300», Smoothing - «3», Ringartefactcorrection - «14», Beam-hardening - «18%». После проведения реконструкции полученные 3D-модели бедренных костей были исследованы с помощью программного обеспечения CTAn (v.1.16) (Bruker, США). Анализу подвергался губчатый матрикс диафизарной части бедренной кости, при этом кортикальный матрикс был удален программно. Плотность костной ткани определялась с помощью калибровочных фантомов с плотностью 0,25 и 0,75 г/мм2.The study of bone density of the diaphyseal part of the femurs of both hind legs of animals was performed using microcomputer tomography. Scanning was carried out with a 0.5 mm aluminum filter, a voltage of 60 kV, a current of 575 mA and a resolution of 35 μm, followed by analysis of bone density (BMD, bonemineraldensity). Reconstruction of the obtained images was carried out in the NRecon program (v.1.6.9.8). The reconstruction settings were: Postalignment - “300”, Smoothing - “3”, Ringartefactcorrection - “14”, Beam-hardening - “18%”. After the reconstruction, the obtained 3D models of the femur were examined using CTAn software (v.1.16) (Bruker, USA). The spongy matrix of the diaphyseal part of the femur was analyzed, while the cortical matrix was removed programmatically. The bone density was determined using calibration phantoms with a density of 0.25 and 0.75 g / mm 2 .
Статистический анализ результатов исследования проводился на программе Statistica 12.0 (Statsoft, США) с помощью непараметрических критериев Краскела-Уоллиса и Фридмана (р<0,01).Statistical analysis of the results of the study was carried out using the Statistica 12.0 program (Statsoft, USA) using the nonparametric Kruskal-Wallis and Friedman criteria (p <0.01).
Результаты исследования влияния инъекций склеростина на плотность костной ткани мышей приведены на фиг. 1. При исследовании динамики изменений плотности костной ткани бедренных костей ложнооперированных животных (группа №1) не наблюдалось достоверных изменений плотности костной ткани на протяжении всего периода наблюдения. В группе №2 на сроке 2 и 3 (60 и 120 дней после операции) наблюдалась отрицательная динамика изменения плотности костной ткани (р<0,01). В группе №3 на сроке 2 было установлено снижение плотности костной ткани, при этом к 60 суткам после операции (срок 3) проходило возращение значений плотности костной ткани к первоначальному уровню. При сравнении групп между собой наблюдалось достоверное отличие между группами №2 и 3 по сравнению с группой №1 на сроке 2, а также отличие у групп №1 и 2 между собой на сроке 3. Достоверных отличий на сроке 3 между группой №1 ложнооперированных мышей и опытной группой №3 с овариоэктимированными мышами, которым проводили инъекции склеростина, не было выявлено, что свидетельствует о положительном влиянии инъекций склеростина на восстановление плотности костной ткани при остеопорозе.The results of a study of the effect of sclerostin injections on the bone density of mice are shown in FIG. 1. In the study of the dynamics of changes in bone density of the femurs of false-operated animals (group No. 1), no significant changes in bone density were observed throughout the entire observation period. In group No. 2, at a period of 2 and 3 (60 and 120 days after surgery), a negative dynamics in changes in bone density was observed (p <0.01). In group No. 3 at the age of 2, a decrease in bone density was found, and by 60 days after the operation (term 3), the values of bone density returned to the initial level. When comparing the groups among themselves, there was a significant difference between groups No. 2 and 3 compared with group No. 1 at
Другим важным количественным параметром, характеризующим степень развития остеопороза, является толщина трабекул губчатой кости. Определение этого параметра проводится также на участке кости, лишенном кортикальной части, с помощью 3D-анализа бинаризованных изображений. При этом бинаризация проводится таким образом, чтобы получаемые 3D-изображения, соответствующие микроархитектуре исследуемого участка, были лишены нежелательных программных шумов и артефактов. Результатом анализа является усредненное значение толщины трабекул исследуемого участка, которое может быть использовано при количественном сравнении степени развития остеопороза в разных экспериментальных группах.Another important quantitative parameter characterizing the degree of development of osteoporosis is the thickness of the trabeculae of the trabecular bone. The determination of this parameter is also carried out on the bone site, deprived of the cortical part, using 3D analysis of binarized images. In this case, binarization is carried out in such a way that the resulting 3D images corresponding to the microarchitecture of the studied area are free from unwanted software noise and artifacts. The result of the analysis is the average value of the thickness of the trabeculae of the studied area, which can be used in a quantitative comparison of the degree of development of osteoporosis in different experimental groups.
При исследовании динамики изменений структуры губчатой части бедренных костей ложнооперированных животных (группа №1) не наблюдалось достоверных изменений толщины трабекул губчатой кости (фиг. 2) и плотности костной ткани на протяжении всего периода наблюдения (фиг. 1).In the study of the dynamics of changes in the structure of the cancellous bones of the femoral false-operated animals (group No. 1), there were no significant changes in the thickness of the trabeculae of the cancellous bone (Fig. 2) and bone density throughout the observation period (Fig. 1).
В группе №2 на сроке 2 и 3 (30 и 60 недель после операции) наблюдалось уменьшение толщины трабекул губчатой кости и плотности костной ткани (р<0,01). При этом в группе №3 значения показателей толщины трабекул губчатой кости и плотности костной ткани, сниженные на сроке 2, возвращались к первоначальному уровню к 60 суткам после операции (срок 3).In group No. 2, at a period of 2 and 3 (30 and 60 weeks after surgery), a decrease in the thickness of the trabeculae of the trabecular bone and bone density was observed (p <0.01). At the same time, in group No. 3, the values of the trabeculae of the trabecular bone thickness and bone density, reduced at 2, returned to their original level by 60 days after the operation (term 3).
Для увеличения плотности костной ткани возможно проведение третьей и последующих иммунизаций через каждые 3 месяца после повторной инъекции.To increase bone density, a third and subsequent immunizations are possible every 3 months after re-injection.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Фиг. 1. Результаты исследования влияния инъекций склеростина на плотность костной ткани мышей.FIG. 1. Results of a study on the effect of sclerostin injections on the bone density of mice.
Фиг. 2. Результаты исследования влияния инъекций иммуногенной композиции на основе склеростина на толщину трабекул губчатой костной ткани.FIG. 2. Results of a study of the effect of injections of an immunogenic composition based on sclerostin on the thickness of trabeculae of cancellous bone tissue.
* - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой №1 (р<0,01)* - significant differences compared with control group No. 1 (p <0.01)
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130132A RU2647571C1 (en) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Recombinant white scelestine, method for producing recombinant protein of screrostin, method of increasing bone mass of vertebrate animal |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130132A RU2647571C1 (en) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Recombinant white scelestine, method for producing recombinant protein of screrostin, method of increasing bone mass of vertebrate animal |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2647571C1 true RU2647571C1 (en) | 2018-03-16 |
Family
ID=61629354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017130132A RU2647571C1 (en) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | Recombinant white scelestine, method for producing recombinant protein of screrostin, method of increasing bone mass of vertebrate animal |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2647571C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200600038A1 (en) * | 2003-06-16 | 2006-06-30 | Селлтек Ар Энд Ди, Инк. | ANTIBODIES SPECIFIC FOR SKLEROSTIN, AND METHODS OF INCREASING BONE MINERALIZATION |
-
2017
- 2017-08-25 RU RU2017130132A patent/RU2647571C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200600038A1 (en) * | 2003-06-16 | 2006-06-30 | Селлтек Ар Энд Ди, Инк. | ANTIBODIES SPECIFIC FOR SKLEROSTIN, AND METHODS OF INCREASING BONE MINERALIZATION |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| UZ 4548 C (ЮСБ ФАРМА С.А. (BE) ЭМДЖЕН ИНК. (US)), 31.08.2012. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hu et al. | The roles of vascular endothelial growth factor in bone repair and regeneration | |
| US20230322878A1 (en) | Compounds for inducing tissue formation and uses thereof | |
| Feng et al. | Systemic administration of sclerostin monoclonal antibody accelerates fracture healing in the femoral osteotomy model of young rats | |
| JPH09509825A (en) | Methods and compositions for stimulating bone cells | |
| JP2022031954A (en) | Compounds for inducing tissue formation and uses thereof | |
| JP2022046727A (en) | Compounds for inducing histogenesis and their use | |
| JP2018531281A6 (en) | Tissue formation inducing compound and use thereof | |
| US20220267394A1 (en) | Compounds for inducing tissue formation and uses thereof | |
| Nozaki et al. | Timing of the administration of suramin treatment after muscle injury | |
| Schumacher et al. | Periosteal insulin-like growth factor I and bone formation Changes during tibial lengthening in rabbits | |
| JP7145503B2 (en) | Pharmaceutical conjugation and use thereof for converting tumor cells to non-tumor cells | |
| JP2021138720A (en) | Pharmaceutical associations and their use for converting tumor cells to non-tumor cells | |
| JP2018536623A (en) | Pharmaceutical association and use thereof for converting tumor cells to non-tumor cells | |
| RU2647571C1 (en) | Recombinant white scelestine, method for producing recombinant protein of screrostin, method of increasing bone mass of vertebrate animal | |
| Ren et al. | Effects of rhBMP-2/7 heterodimer and RADA16 hydrogel scaffold on bone formation during rabbit mandibular distraction | |
| US20250388633A1 (en) | Pharmaceutical association of growth factor receptor agonist and adhesion protein inhibitor for converting a neoplastic cell into a non-neoplastic cell and uses thereof | |
| Uslu et al. | The effect of femoral nerve block on fracture healing via expressions of growth factors and β-catenin | |
| IL286670B2 (en) | Compounds for inducing tissue formation and uses thereof | |
| Reid | Plenary Talk Abstracts | |
| Hamade | Enhanced bone formation during distraction osteogenesis in FGFR3 deficient mice | |
| Muratli et al. | Bosentan, a non-specific endothelin antagonist, stimulates fracture healing | |
| Albishi | Inhibition of Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (FGFR3) signalling to accelerate bone formation during distraction osteogenesis of mice tibiae |