[go: up one dir, main page]

EA015166B1 - Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител - Google Patents

Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител Download PDF

Info

Publication number
EA015166B1
EA015166B1 EA200600038A EA200600038A EA015166B1 EA 015166 B1 EA015166 B1 EA 015166B1 EA 200600038 A EA200600038 A EA 200600038A EA 200600038 A EA200600038 A EA 200600038A EA 015166 B1 EA015166 B1 EA 015166B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
binding
beta
bmp
polypeptide
Prior art date
Application number
EA200600038A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600038A1 (ru
Inventor
Дейвид Дж. Уинклер
Джийе Ши
Джон Лейтем
Original Assignee
Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк. filed Critical Ю-Си-Би Мэньюфэкчуринг, Инк.
Publication of EA200600038A1 publication Critical patent/EA200600038A1/ru
Publication of EA015166B1 publication Critical patent/EA015166B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Обеспечены композиции и способы, имеющие отношение к антителам, которые специфически связываются с TGF-бета-связывающими белками. Эти способы и композиции имеют отношение к изменению минеральной плотности кости путем нарушения взаимодействия между TGF-бета-связывающим белком склеростином и членом TGF-бета-суперсемейства, в частности, костным морфогенетическим белком. Увеличение минеральной плотности кости имеет применение при заболеваниях и состояниях, в которых низкая минеральная плотность кости характеризуется для такого состояния, как остеопения, остеопороз и переломы кости.

Description

Данное изобретение относится, в общем, к фармацевтическим продуктам и способам и, более конкретно, к способам и специфичным в отношении склеротина антителам, пригодным для увеличения минерального содержания кости. Такие композиции и способы могут быть использованы для лечения большого разнообразия состояний, в том числе, например, остеопении, остеопороза, переломов и других нарушений, в которых отличительным признаком заболевания является низкая минеральная плотность кости.
Уровень техники
Две или три отличающиеся фазы изменений костной массы встречаются на протяжении жизни индивидуума (см. \УеЧ 1. Меб. 154:63-77, 1991). Первая фаза имеет место как у мужчин, так и у женщин и протекает для приобретения максимальной костной массы. Эта первая фаза достигается посредством линейного роста хрящевых пластинок роста и радиального роста вследствие скорости периостеального присоединения новых слоев (утолщения надкостницы). Вторая фаза начинается в возрасте около 30 лет для губчатой кости (плоских костей, таких как позвонки и таз) и в возрасте около 40 лет для кортикального слоя кости (например, длинных костей, находящихся в конечностях) и продолжается до старости. Эта фаза характеризуется медленным разрежением кости и встречается как у мужчин, так и у женщин. У женщин встречается также третья фаза разрежения кости, наиболее вероятно, обусловленная постклимактерической недостаточностью эстрогена. Во время только этой фазы женщины могут терять дополнительные 10% костной массы из кортикального слоя кости и 25% из губчатого компартмента (см. К1дд5, 5ирта).
Потеря минерального содержания кости может быть обусловлена большим разнообразием состояний и может быть результатом существенных медицинских проблем. Например, остеопороз является истощающим заболеванием у людей, характеризующимся заметными уменьшениями скелетной костной массы и минеральной плотности, структурным разрушением кости, включающим деградацию микроархитектуры кости и соответствующие увеличения хрупкости кости и подверженности к перелому у пораженных индивидуумов. Остеопорозу у людей предшествует клиническая остеопения (минеральная плотность костей, которая более чем на одно стандартное отклонение, но менее чем на 2,5 стандартных отклонений ниже средней величины для кости молодого взрослого человека), состояние, обнаруживаемое у приблизительно 25 миллионов людей в Соединенных Штатах. Другие 7-8 миллионов пациентов в Соединенных Штатах диагностированы как имеющие клинический остеопороз (определяемый как минеральное содержание кости, которое более чем на 2,5 стандартных отклонений ниже минерального содержания кости зрелой кости молодого взрослого человека). Остеопороз является одним из требующих наибольших расходов заболеваний для системы здравоохранения, стоящим десятков миллиардов долларов ежегодно в Соединенных Штатах. Кроме связанных с медико-санитарной помощью расходов долгосрочное врачебное обслуживание и потерянные рабочие дни увеличивают финансовую и социальную стоимость этого заболевания. Во всем мире приблизительно 75 миллионов людей находятся при риске остеопороза.
Частота встречаемости остеопороза у населения увеличивается с возрастом и среди членов ИндоЕвропейской группы населения остеопороз является преобладающим у женщин (которые составляют 80% пула пациентов с остеопорозом в Соединенных Штатах). Увеличенная хрупкость и подверженность к перелому скелетных костей у пожилых людей усугубляется увеличением риска случайных падений в этой популяции. Более 1,5 миллионов связанных с остеопорозом переломов костей сообщаются каждый год в Соединенных Штатах. Переломы тазобедренных суставов, кистей и позвонков находятся среди наиболее частых повреждений, связанных с остеопорозом. Переломы тазобедренных суставов, в частности, являются крайне неудобными и дорогими для пациента, а для женщин коррелируют с высокими коэффициентами смертности и болезненности.
Хотя остеопороз определяется как увеличение риска перелома вследствие уменьшения костной массы, ни одно из доступных в настоящее время лечений для скелетных нарушений, по существу, не может увеличивать плотность кости у взрослых. Все врачи хорошо понимают, что необходимы лекарственные средства, которые могли бы увеличивать плотность костей у взрослых, в частности костей кисти, позвоночника и тазобедренного сустава, которые находятся при риске в случае остеопении и остеопороза.
Существующие стратегии для предупреждения остеопороза могут предоставить некоторую пользу для индивидуумов, но не могут гарантировать освобождение от этого заболевания. Эти стратегии включают снижение физической активности (в частности, активностей, приводящих к увеличению массы) с достижением старости, включение достаточного количества кальция в пищевой рацион и избегание потребления продуктов, содержащих алкоголь или табак. Для пациентов, обнаруживающих клиническую остеопению или остеопороз, все существующие терапевтические лекарственные средства и стратегии направлены на уменьшение дополнительной потери костной массы ингибированием процесса резорбции костей, природного компонента процесса ремоделирования, который встречается конститутивно.
Например, в настоящее время для замедления потери костной массы прописывают эстроген. Однако, имеется некоторая полемика относительно того, имеется ли долгосрочная польза для пациентов и имеется ли какой-то эффект вообще в случае пациентов в возрасте более 75 лет. Кроме того, считается,
- 1 015166 что применение эстрогена увеличивает риск рака молочной железы и эндометрия. Кальцитонин, остеокальцин с витамином К или высокие дозы пищевого кальция, с витамином К или без витамина К также предлагаются для постклимактерических женщин. Однако высокие дозы кальция могут часто иметь неприятные побочные желудочно-кишечные эффекты, и постоянно должен проводиться мониторинг уровней кальция в сыворотке и моче (см. К11ок1а аиб Κί§88, Мауо С1ш. Ргос. 70:978-982, 1995).
Другие терапевтические вещества, которые были предложены, включают бисфосфонаты (например, Розатах™, Ас!опе1™, Βοηνίνα™. ΖοιηοΙα™. олпадронат, неридронат, скелид, бонефос), паратиреоидный гормон, кальцилитики, кальцимиметики (например, цинакальцет), статины, анаболические стероиды, соли лантана и стронция и фторид натрия. Однако такие терапевтическиие вещества имеют нежелательные, побочные действия (например, кальцитонин и стероиды могут вызывать тошноту и провоцировать иммунную реакцию, бисфосфонаты и фторид натрия могут ингибировать репарацию переломов, даже при умеренном увеличении плотности костей), которые могут предотвращать их применение (см. К1юз1а апб Ктддз, зирга).
Ни одна практикуемая в настоящее время терапевтическая стратегия для лечения состояния, связанного с избыточной или недостаточной минерализацией кости, такого как остеопороз или другие заболевания, характеризующиеся потерей минерализации кости, не включает лекарственное средство, которое изменяет (т.е. увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) костную массу. В частности, ни одна существующая стратегия не стимулирует или не усиливает терапевтически рост новой костной массы. Данное изобретение обеспечивает композиции и способы, которые могут быть использованы для увеличения минерализации кости и, следовательно, могут быть использованы для лечения широкого разнообразия состояний, при которых желательным является увеличение костной массы. Кроме того, данное изобретение обеспечивает другие, связанные с этим преимущества.
Сущность изобретения
Вкратце, данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с ТОРбета-связывающим белком, склеростином (8О8Т), и обеспечивает иммуногены, содержащие пептиды 8О8Т, произведенные из районов 8О8Т, которые взаимодействуют с членом ТОР-бета-суперсемейства, таким как костный морфогенетический белок. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается специфически с полипептидом 8О8Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 8О8Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (и) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асс. №№ ЯМ_004329 (8Е0 ГО ЫО:71); Ό89675 (8Е0 ГО ЫО:72); \\1 001203 (8ЕО ГО ЫО:73); 875359 (8ЕО ГО ЫО:74); \\1 030849 (8ЕО ГО ЫО:75); Ό38082 (8ЕО ГО ЫО:76); №_001194 (8ЕО ГО ЫО:77); ВАА19765 (8ЕО ГО ЫО:78) или ААВ33865 (8ЕО ГО N0:79), и где сайт связывания рецептора типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора Типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОепВапк Асе. №№ И25110 (8ЕО ГО ЫО:80); ММ_033346 (8ЕО ГО ЫО:81); Ζ48923 (8ЕО ГО ЫО:83); САА88759 (8ЕО ГО ЫО:84) или ЫМ_001204 (8Е0 ГО ЫО:82). В конкретном варианте осуществления данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются специфически с полипептидом, который включает аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ЫО:2-6, 12-15, 21, 22, 25, 26, 47, 48, 49 или 50, и в других конкретных вариантах осуществления это антитело связывается специфически с полипептидом, который включает аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:5, 6 или 14.
В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые продуцируются иммунизацией животного, не являющегося человеком, пептидом по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, который включает аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:2-19, 21-28 или 47-50, где это антитело связывается специфически с полипептидом 8О8Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ЫО:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 8О8Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР (представленным в любой из последовательностей ОепВапк, обеспеченных здесь), и где сайт связывания рецептора типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа II ВМР (представленным в любой из последовательностей ОепВапк, обеспеченных здесь). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело продуцируется иммунизацией животного, не являющегося человеком, пептидом по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, который включает аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ЫО:5, 6, 10, 11, 14 или 18.
Данное изобретение обеспечивает дополнительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются специфически с полипептидом 8О8Т и которые нарушают образование гомодимера 8О8Т, где этот полипептид 8О8Т включает аминокислотную последовательность, представленную в
- 2 015166
8ЕО ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где это антитело связывается с полипептидом, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:29-31,33-36, 41-43 или 51-54.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые получают иммунизацией животного, не являющегося человеком, пептидом из по меньшей мере 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:29-46, 51, 52, 53 или 54, где это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются специфически с полипептидом 808Т, который включает аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где это антитело нарушает образование гомодимера 808Т.
В некоторых конкретных вариантах осуществления данного изобретения это антитело является поликлональным антителом. В других вариантах осуществления это антитело является моноклональным антителом, которое является моноклональным антителом мыши, человека, крысы или хомячка. Данное изобретение обеспечивает также гибридомную клетку или клетку-хозяина, которая способна продуцировать моноклональное антитело. В других вариантах осуществления данного изобретения это антитело является гуманизированным антителом или химерным антителом. Данное изобретение обеспечивает дополнительно клетку-хозяина, которая продуцирует гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела является фрагментом Е(аЬ')2, ЕаЬ', ЕаЬ, Ей или Εν. Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое является одноцепочечным антителом, и обеспечивает клетку-хозяина, которая способна экспрессировать это одноцепочечное антитело. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую такие антитела и физиологически приемлемый носитель.
Данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид, включающий 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОеиВаик Асе. №№ N0004329 (8ЕО ГО N0:71); Ό89675 (8Е0) ГО N0:72); NМ_001203 (8ЕЕ) ГО N0:73); 875359 (8ЕЕ) ГО N0:74); N0030849 (8ЕЕ) ГО N0:75); Ό38082 (8ЕЕ) ГО N0:76); N0001194 (8ЕЕ) ГО N0:77); ВАА19765 (8Е0 ГО N0:78) или ААВ33865 (8Е0 ГО N0:79), и где сайт связывания рецептора типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОеиВаик Асе. №№ И25110 (8Е0 ГО N0:80); N0033346 (8ЕЕ) ГО N0:81); Ζ48923 (8ЕЕ) ГО N0:83); САА88759 (8ЕЕ) ГО N0:84) или N0001204 (8ЕЕ) ГО N0:82).
В другом варианте осуществления иммуноген содержит пептид, включающий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое конкурентно ингибирует связывание этого полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР (представленным в любой из последовательностей ОеиВаик, обеспеченных здесь), и где сайт связывания рецептора типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа II ВМР (представленным в любой из последовательностей ОеиВаик, обеспеченных здесь).
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид из по меньшей мере 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:2-19, 21-28, 47, 48, 49 или 50, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (ί) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОеиВаик Асе. №№ N4 004329 (8ЕЕ) ГО N0:71); Ό89675 (8ЕЕ) ГО N0:72); N0001203 (8 ЕС) ГО N0:73); 875359 (8 ЕС) ГО N0:74); N0030849 (8 ЕС) ГО N0:75); Ό38082 (8 ЕС) ГО N0:76); №_001194 (8ЕС) ГО N0:77); ВАА19765 (8ЕС) ГО N0:78) или ААВ33865 (8ЕС) ГО N0:79), и где сайт связывания рецептора типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОеиВаик Асе. №№ И25110 (8Е0 ГО N0:80); N0033346 (8 ЕС) ГО N0:81); Ζ48923 (8 ЕС) ГО N0:83); САА88759 (8 ЕС) ГО N0:84) или NМ_001204 (8Е0 ГО N0:82). В конкретном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает
- 3 015166 иммуноген, включающий пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:5, 6, 10, 11, 14 или 18.
Данное изобретение обеспечивает иммуноген, содержащий пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:29-46, 51, 52, 53 или 54, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где это антитело нарушает образование гомодимера 808Т. В другом варианте осуществления иммуноген содержит пептид, включающий 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое нарушает образование гомодимера 808Т. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает иммуноген, который содержит пептид, включающий по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, включающего 8Е0 ГО N0: 1, 20, 58, 60, 62 или 68, и где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое нарушает образование гомодимера 808Т.
В некоторых конкретных вариантах осуществления иммуногены рассматриваемого изобретения связаны с молекулой-носителем. В некоторых вариантах осуществления молекула-носитель является полипептидом-носителем и, в конкретных вариантах осуществления, этот полипептид-носитель является гемоцианином фиссуреллы.
Данное изобретение обеспечивает также способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, содержащим пептид из 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот или по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, имеющего последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, который способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (1) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОеиВаик Асе. №№ N0004329 (8Е0 ГО N0:71); Ό89675 (8Е0 ГО N0:72); ЫМ 001203 (8ЕО ГО N0:73); 875359 (8ЕО ГО N0:74); N0030849 (8ЕО ГО N0:75); Ό38082 (8ЕО ГО N0:76); N0001194 (8ЕО ГО N0:77); ВАА19765 (8ЕО ГО N0:78) или ААВ33865 (8ЕО ГО N0:79), и где сайт связывания рецептора типа II ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа II ВМР, включающим аминокислотную последовательность, представленную в ОеиВаик Асе. №№ И25110 (8ЕО ГО N0:80); N0033346 (8ЕО ГО N0:81); Ζ48923 (8ЕО ГО N0:83); САА88759 (8ЕО ГО N0:84) или N0001204 (8Е0 ГО N0:82). В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, включающим пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2-19, 21-28, 47, 48 или 50, где этот пептид способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т, включающим аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, где это антитело конкурентно ингибирует связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним из сайтов: (1) сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и (ίί) сайтом связывания рецептора типа II ВМР, где сайт связывания рецептора типа I ВМР способен связываться с полипептидом рецептора типа I ВМР. В конкретном варианте осуществления этот иммуноген содержит пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:5, 6, 10, 11, 14 или 18.
В других предпочтительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, включающим пептид из 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных аминокислот или по меньшей мере 21 последовательную аминокислоту и не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 808Т, имеющего последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, который способен индуцировать в животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Т и которое способно нарушать образование гомодимера 808Т. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Т, предусматривающий иммунизацию животного, не являющегося человеком, иммуногеном, включающим пептид по меньшей мере из 20 аминокислот и не более чем 75 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:29-46, 51, 52, 53 или 54, где этот пептид способен индуцировать в
- 4 015166 животном, не являющемся человеком, антитело, которое связывается специфически с полипептидом 808Τ и нарушает образование гомодимера 8Θ8Τ.
Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ΤΟΕ-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом 8Θ8Τ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в любой из 8ЕО ΙΌ N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, по меньшей мере с одним пептидом 8Θ8Τ, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2-19 или 21-54, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид 808Τ; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид 808Τ и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ΤΟΕ-бета. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ идентификации антитела, которое нарушает связывание ВМР с полипептидом 808Τ, предусматривающий контактирование (ί) антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность, представленную любой из 8Е0 ΙΌ N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, с (ίί) по меньшей мере одним пептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2-19, 21-28 или 47-50, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид 808Τ; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид 808Τ и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое нарушает связывание ВМР с полипептидом 808Τ. В конкретных вариантах осуществления обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ΤΟΕ-бета, и идентификации антитела, которое нарушает связывание ВМР с полипептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:5, 6, 10, 11, 14 или 18.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ идентификации антитела, которое нарушает образование гомодимера 808Τ, предусматривающий контактирование (ί) антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в любой из 8Е0 ΙΌ N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, с (ίί) по меньшей мере одним пептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:29-46 или 51-54, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид 808Τ; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид 808Τ и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое нарушает образование гомодимера 808Τ.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ идентификации антитела, которое увеличивает минеральное содержание кости, предусматривающий контактирование (ί) антитела, которое специфически связывается с полипептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность, представленную в любой из 8Е0 ΙΌ N0:1, 20, 58, 60, 62 или 68, с (ίί) по меньшей мере одним пептидом 808Τ, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2-19 или 21-54, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело/пептид 808Τ; и детектирование уровня комплекса антитело/пептид 808Τ и посредством этого детектирование присутствия антитела, которое увеличивает минеральное содержание кости. В конкретном варианте осуществления этот пептид включает аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:5, 6, 10, 11, 14 или 18.
В некоторых конкретных вариантах осуществления для идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ΤΟΕ-бета, для идентификации антитела, которое нарушает связывание ВМР с полипептидом 808Τ, или для идентификации антитела, которое нарушает образование гомодимера 808Τ, для идентификации антитела, которое увеличивает минеральное содержание кости, это антитело присутствует в биологической пробе, или это антитело является очищенным антителом. В некоторых вариантах осуществления это очищенное антитело является поликлональным антителом, моноклональным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом или антигенсвязывающим фрагментом любого из этих антител.
Эти и другие аспекты данного изобретения будут очевидными после ссылки на следующее подробное описание и сопутствующие фигуры. Все ссылки, описанные здесь, включены тем самым в качестве ссылок в их полном виде, как если бы каждая была включена индивидуально.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 представляет выравнивание района, содержащего характерный цистиновый узел, полипептида 808Τ и его ближайших гомологов. Три дисульфидные связи, которые образуют цистиновый узел, проиллюстрированы жирными линиями. Дополнительная дисульфидная связь, показанная пунктирной линией, является уникальной для этого семейства и соединяет концы двух β-шпилек в этой 3Όструктуре. Изображенные полипептиды являются: 808Τ: склеростин (8Е0 ΙΌ N0:95); СОНВ: Хорионический Гонадотропин β человека (8Е0 ΙΌ N0:96); Е8НВ: бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона (8Е0 ΙΌ N0:97); Τ8ΗΕ: предшественник бета-цепи тиротропина (8Е0 ΙΌ N0:98); У\УЕ: фактор фон Виллебранда (8Е0 ΙΌ N0:99); МИС2: предшественник муцина 2 человека (8Е0 ΙΌ N0:100); СЕ К1: СсгЬсп.15 1 (гомолог Хепорик Ιαονίδ) (8Е0 ΙΌ N0:101); ЭВМ: дтет1ш (8Е0 ΙΌ N0:102); ЭЛ№ (8Е0 ΙΌ N0:103); СТОЕ: предшественник фактора роста соединительной ткани (8Е0 ΙΌ N0:104); N0V: №уН
- 5 015166 (гомолог белка сверхэкспрессируемого гена нефробластомы) (8ЕС ГО N0:105); СУК6: (8ЕС ГО N0:106).
Фиг. 2 иллюстрирует ЛЭ-модель внутреннего района (кора) 808Т (808Т_Соте).
Фиг. 3 представляет 30-модель внутреннего района (кора) гомодимера 8О8Т.
Фиг. 4А и 4В представляют выравнивание аминокислотных последовательностей Ν裏ίη из пяти различных животных: человека (Ν066_ΗυΜΑΝ (8ЕС ГО N0:107); курицы (Ν0ΟΟ_ΟΗΙΟΚ. 8 ЕС ГО N0:108); Африканской шпорцевой лягушки (Ν066_ΧΕΝΕΑ. 8ЕС ГО N0:109); Ν066_Ευ6Κυ. 8ЕС ГО N0:110); и полосатой перцины (Х0СС/ЕВНА. 8ЕС ГО N0:111); и 808Т человека (808Т ΗυΜΑΗ 8ЕС ГО N0:1). крысы (808Т_ВАТ. 8ЕС ГО N0:20) и мыши (808Т_Моике. 8ЕС ГО N0:112).
Фиг. 5 иллюстрирует структуру комплекса Ходщп/ВМР-7. Гомодимер ВМР показан на нижней части этой фигуры поверхностным способом. Гомодимер №ддш показан на верхней части димера ВМР в виде огрубленного изображения. Круги очерчивают ^концевой связывающий район. внутренний (коровый) район и линкер между ^концевым и коровым районами.
Фиг. 6 изображает 30-модель потенциального ВМР-связывающего фрагмента. локализованного в ^концевом районе 808Т. Димер ВМР показан поверхностным способом. а потенциальный ВМРсвязывающий фрагмент показан способом послеизображения. Отмечен остаток фенилаланина. соответствующий гидрофобному карману на поверхности ВМР.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение обеспечивает антитела. которые специфически связываются с полипептидом 808Т. и способы применения таких антител. Данное изобретение обеспечивает также иммуногены полипептида 808Т. которые могут быть использованы для генерирования и анализа этих антител. Эти антитела могут быть применимы для блокирования или нарушения связывания полипептида 808Т. который является ТСЕ-бета-связывающим белком. с лигандом. в частности костным морфогенетическим белком. и могут также блокировать или нарушать связывание полипептида 808Т с одним или несколькими другими лигандами.
Данное изобретение относится частично к неожиданному открытию в последовательности полипептида склеростина специфических коротких пептидных последовательностей. которые специфически узнаются антителами против склеростина. способными конкурентно ингибировать связывание полипептидов склеростина с ВМР. где такое связывание склеростин-ВМР в другом случае происходило бы через сайт связывания рецептора типа I ВМР и/или сайт связывания рецептора типа II ВМР. Должно быть понятно. что такая молекула. как антитело. которая ингибирует связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами ТСЕ-бета-семейства белков. в том числе. одним или несколькими костными морфогенетическими белками (ВМР). включает. например. молекулу. которая делает возможным активацию члена ТСЕ-бета-семейства или ВМР или делает возможным связывание членов ТСЕбета-семейства. в том числе. одного или нескольких ВМР. с их соответствующими рецепторами посредством удаления члена ТСЕ-бета-семейства или предотвращения связывания члена ТСЕ-бета-семейства с ТСЕ-бета-связывающим белком.
Данное изобретение обеспечивает также пептидные или полипептидные иммуногены. которые. неожиданно. могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител и/или их фрагментов. которые способны ингибировать. предотвращать или нарушать (например. уменьшать статистически значимым образом) связывание ТСЕ-бета-связывающего белка 808Т с одним или несколькими ВМР. Примерные пептидные иммуногены могут включать 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 20-25. 21-50. 26-30. 31-40. 41-50. 51-60. 61-70 или 71-75 последовательных аминокислот полипептида склеростина. обеспеченного здесь (или его варианта). причем такие пептиды включают. например. аминокислотные последовательности. представленные в 8 ЕС ГО N0:2-19. 21-53 и 54. Данное изобретение обеспечивает также пептидные и полипептидные иммуногены. которые могут быть использованы для генерирования и/или идентификации антител и их фрагментов. которые способны ингибировать. предотвращать или нарушать образование гомодимеров 808Т. Антитела данного изобретения применимы для увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости. для облегчения таким образом многочисленных состояний. которые приводят в потере минерального содержания кости. включающих. например. заболевание. генетическую предрасположенность. несчастные случаи. которые приводят к прекращению использования кости (например. вследствие перелома). применение терапевтических веществ. которые влияют на резорбцию кости. или которые убивают костеобразующие клетки. и нормальное старение.
Склеростеоз
Склеростеоз является заболеванием. связанным с атипичной минеральной плотностью кости у людей. Склеростеоз является термином. который применялся Напкеп (Напкеп. Н.С.. 8к1ето81еоке. ίη: 0ρίΐζ. Η.; δοϊιιηίάΐ. Е.. НапбЬиек бет Кшбегкейкипбе. Ветйп: 8ртшдет (рий.) 6 1967. Рр. 351-355) в отношении нарушения. сходного с синдромом ван Бухема генерализованного кортикального гиперостоза. но. возможно. отличающегося радиологическим изображением изменений костей и присутствием асиммметричной кожной синдактилии указательного и среднего пальцев во многих случаях. В настоящее время известно. что склеростеоз является аутосомным полудоминантным нарушением. которое характеризуется широко диссеминированными склеротическими повреждениями кости у взрослого человека. Это состояние является прогрессирующим. Склеростеоз имеет также связанный с развитием аспект. который
- 6 015166 связан с синдактилией (два или более пальцев слиты вместе). Синдром склеростеоза ассоциирован с высоким ростом и многие пораженные индивидуумы достигают высоты шесть или более футов. Минеральное содержание кости гомозигот может быть в 1-6 раз большим, чем наблюдаемое у нормальных индивидуумов, и минеральная плотность кости может быть в 1-4 раза выше нормальных величин (например, из непораженных сибсов).
Синдром склеростеоза встречается прежде всего у африканцев нидерланского происхождения в Южной Африке. Приблизительно 1/140 индивидуумов в населении Африки являются носителями этого мутированного гена (гетерозиготами). Эта мутация обнаруживает 100% пенетрантность. Имеются невероятные сообщения об увеличенной минеральной плотности кости в гетерозиготах без ассоциированных патологий (синдактилии или разрастания черепа).
Отсутствие аномалии системы гипофиз-гипоталамус наблюдали у пациентов со склеростеозом. В частности, по-видимому, нет сверхпродуцирования гормона роста и кортизона и половые гормоны являются нормальными у пораженных индивидуумов. Однако маркеры обновления кости, такие как остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С типа 1 (Р1СР) и общая щелочная фосфатаза; (см. Согшет, С, Сигг. Θρίη. ίη Вкеи. 7:243, 1995) показывают, что имеется гиперостеобластическая активность, ассоциированная с этим заболеванием, но имеется нормальная - слегка уменьшенная активность остеокластов, как измерено с использованием маркеров резорбции кости (пиридинолина, дезоксипиридинолина, Ν-телопептида, гидроксипролина мочи, тартрат-устойчивых кислых фосфатаз плазмы и галактолилгидроксилизина (см. Согшет, кирга)).
Склеростеоз характеризуется непрерывным депонированием минералов кости по всему скелету во время времени жизни пораженных индивидуумов. В гомозиготах непрерывное депонирование минералов кости приводит к разрастанию кости в зонах скелета, в которых отсутствуют механорецепторы (череп, подбородок, мозговой череп). В гомозиготах со склеростеозом разрастание костей черепа приводит к сдавливанию черепа и со временем к смерти вследствие избыточного гидростатического давления на ствол мозга. Во всех других частях скелета имеется генерализованный или диффузный склероз. Кортикальные зоны длинных (трубчатых) костей сильно утолщаются, приводя к существенному увеличению прочности кости. Губчатые соединения увеличиваются по толщине, что, в свою очередь, увеличивает прочность губчатой кости. Склеротические кости, по-видимому, являются непрозрачными для рентгеновских лучей.
Редкая генетическая мутация, которая является ответственной за синдром склеростеоза, была обнаружена районе в хромосомы 17 человека. Ген в этом районе кодирует новый член семейства ТОР-бетасвязывающих белков (см., например, Патенты США с номерами 6395511, 6489445 и 6495736; Вгипко\\· е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе1. 68:577-89 (2001)). Таким образом, терапевтические средства, связанные с изменением или модуляцией уровня склеростина, могут быть полезными в лечении состояний и заболеваний, связанных с атипичным развитием или разрушением кости. Как описано более подробно ниже, антитела, которые специфически связываются с ТСР-бета-связывающим белком, склеростином (также называемым здесь Веег или 8О8Т), могут быть использованы для увеличения минерального содержания кости и, следовательно, лечения, предупреждения, замедления прогрессирования или ослабления симптомов ряда заболеваний.
ТОР-бета-суперсемейство.
Важные молекулы, на которые здесь делается ссылка, включают любой известный член или новые члены суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (ТОР-бета), которое включает костные морфогенетические белки (ВМР). В ТОР-бета-суперсемейство включены также ТОР-бета-рецепторы, которые, как должно быть понятно, являются одним или несколькими рецепторами, которые являются специфическими в отношении конкретного члена ТОР-бета-суперсемейства (в том числе ВМР), и ТОРбета-связывающие белки, которые, как должно быть понятно, являются одним или несколькими полипептидами со специфической связывающей аффинностью в отношении конкретного члена или субпопуляции членов ТОР-бета-суперсемейства (в том числе ВМР). Конкретный пример ТОР-бетасвязывающего белка включает склеростин или 8О8Т. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие 8О8Т и варианты 8О8Т в различных животных, в том числе человеке, обеспечены здесь в 8ЕО ГО NО:55, 56, 57, 59, 61, 63, 65 и 67 и 69 (кодируемые полипептидные последовательности обеспечены в 8ЕО ГО NО:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 и 70, соответственно). (См., например, Патенты США с номерами 6395511; 6489445 и 6495736. См. также Ва1етапк е! а1., 2002 Эет. Вю1. 250-231; 8сктй! е! а1. 1999 1. Ог!кораеб. Век. 17:269; Кка111, 1999 МюгоЬек 1пГес!. 1:1255; М|уахопо е! а1., 1993 ОтоМк Рас!огк 8:11; νοη ВиЬпоГГ е! а1., 2001 Эет. Вю1. 239:1; Кой е! а1., 2001 М1сгокс. Век. Теск. 52:354; ЕЬага е! а1., 2002 8рше 27(16 8ирр1. 1):810; Вопбек!ат, 2002, Бщапбк апб 8щпа1шд Сотропеп!к оГ ТгапкГогтшд ОгоМк Рас!ог β Ратйу, Не1кшк1 Ипщегкйу Вютебюа1 Эщкейабопк №. 17).
Суперсемейство ТОР-бета содержит различные факторы роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательности как на вторичном, так и на третичном уровнях. Это семейство белков проявляет широкий спектр биологических реакций, которые влияют на большое разнообразие типов клеток. Многие из членов семейства ТОР-бета имеют важные функции во время эмбрионального развития в процессе приобретения упорядоченного распределения и спецификации ткани. У взрослых
- 7 015166 членов этого семейства участвуют, например, в заживлении ран, репарации и ремоделировании кости и в модуляции иммунной системы. Кроме полипептидов ТСЕ-бета это суперсемейство включает костные морфогенетические белки (ВМР), активины, ингибины, факторы роста и дифференцировки (СИЕ) и нейротрофические факторы глиального происхождения (СЭИЕ). Первичная классификация установлена посредством общих признаков последовательности, которые относят конкретный белок к общему подсемейству. Дополнительное расслоение в этом подсемействе является возможным вследствие более строгой консервации последовательности между членами меньших групп. В некоторых случаях, например, в случае ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7, идентичность аминокислот может быть такой высокой, как 75%, среди членов этой меньшей группы. Этот уровень идентичности позволяет единственной реперезентативной последовательности иллюстрировать ключевые биохимические элементы данной подгруппы, которые выделяют ее из других членов большего семейства.
Кристаллическая структура ТСЕ-бета2 была определена. Общая укладка ТСЕ-бета2-мономера содержит стабильную, компактную цистеиновую подобную узлу структуру, образованную тремя дисульфидными мостиками. Димеризация, стабилизированная одним дисульфидным мостиком, является антипараллельной.
Члены ТСЕ-бета-семейства передают сигналы посредством индукции образования гетероолигомерных комплексов рецепторов типа I и типа II. Трансдукция сигналов ТСЕ-бета включает эти два отличающиеся подсемейства трансмембранных серин/треонинкиназных рецепторов, типа I и типа II. Были идентифицированы по меньшей мере семь рецепторов типа I и пять рецепторов типа II (см. Ка^аЬа!а е! а1., СуЮкше Сто^1й Еас!от Веу. 9:49-61 (1998); М|уахопо е! а1., Αάν. Iттиηο1. 75:115-57 (2000). Каждый член ТСЕ-бета-семейства связывается с характерной комбинацией рецепторов типа I и типа II, оба из которых являются необходимыми для передачи сигнала. В существующей модели активации рецептора ТСЕ-бета ТСЕ-бета-лиганд сначала связывается с рецептором типа II (ТЬВ-И), который затем рекрутирует рецептор типа I (ТЬКП) для образования тройного комплекса лиганд/тип Бтип II. Рецептор типа I не может связывать лиганд в отсутствие ТЬРП. Затем ТЬВ-П фосфорилирует ТЬВ-[ преимущественно в домене, богатом остатками глицина и серина (С8-домене), в расположенном рядом с мембраной районе и тем самым активирует ТЬЯ-Т Затем эта активированная киназа рецептора типа I фосфорилирует конкретные члены 8шай-семейства белков, которые перемещаются в ядро, где они модулируют транскрипцию специфических генов.
Костные морфогенетические белки (ВМР): ключевые регуляторные белки минеральной плотности кости
Главным успехом в понимании формировании кости была идентификация костных морфогенетических белков (ВМР), также известных как остеогенные белки (ОР), которые регулируют дифференцировку хряща и кости ίη νί\Ό. ВМР/ОР индуцируют дифференцировку кости через каскад событий, при помощи которых мезенхимальные стволовые клетки дифференцируются в хондроциты, которые образуют структуру хряща, которая реабзорбируется и заменяется костной тканью (см. Ва1етапк е! а1., Эе\'. Вю1. 250:231-50 (2002)). Таким образом, этот процесс включает образование хряща, гипертрофию и кальцификацию хряща, васкулярную инвазию, дифференцировку остеобластов и образование кости. Как описано выше, ВМР/ОР (ВМР 2-14 и остеогенные белки 1 и 2 (ОР-1 и ОР-2) (см., например, СепВапк Р12643 (ВМР-2); СепВапк Р12645 (ВМР3); СепВапк Р55107 (ВМР-3Ь, фактор 10 роста/дифференцировки) (СЭЕ10)); СепВапк Р12644 (ВМР4); СепВапк Р22003 (ВМР5); СепВапк Р22004 (ВМР6); СепВапк Р18075 (ВМР7); СепВапк Р34820 (ВМР8); СепВапк О9кК05 (ВМР9); СепВапк 095393 (ВМР10); СепВапк 095390 (ВМР11, предшественник фактора 11 роста/дифференцировки (СЭЕ-11)); СепВапк 095972 (ВМР15)) являются членами суперсемейства ТСЕ-бета. Поразительное эволюционное сохранение между членами подсемейства ВМР/ОР предполагает, что они являются решающими в нормальном развитии и функционировании животных. Кроме постфетального хондрогенеза и остеогенеза ВМР/ОР играют множественные роли в скелетогенезе, в том числе, в развитии черепно-лицевых и зубных тканей. Различные члены ВМР-семейства имеют также биологические активности в различных других типах клеток, в том числе моноцитах, эпителиальных клетках, мезенхимальных клетках и нервных клетках. ВМР регулируют пролиферацию и дифференцировку, хемотаксис и апоптоз, а также регулируют фундаментальные роли, например, левой-правой асимметрии, нейрогенеза, паттернинга мезодермы и эмбрионального развития и органогенеза ряда органов, в том числе почки, кишечника, легкого, зубов, конечностей, амниона и яичка (см. Ва1етапк, кирга).
ВМР синтезируются в виде больших белков-предшественников. После димеризации ВМР протеолитически расщепляются в клетке с образованием карбоксиконцевых зрелых белков, которые затем секретируются из клетки. ВМР, подобно другим членам семейства ТСЕ-бета, инициируют трансдукцию сигнала связыванием кооперативно с серин/треонинкиназными рецепторами как типа I, так и типа II. Рецепторы типа I, в отношении которых ВМР могут действовать в качестве лигандов, включают ВМРВ!Л (также известный как ЛЬК-3), ВМРК.4В (также известный как ЛЬК-6), ЛЬК-1 и ЛЬК-2 (также известный как ЛсЖП). Из рецепторов типа II, ВМР связываются с рецептором ВМР типа II (ВМРК.-П), активином типа II (Лс1К-И) и активином типа ПВ (Лс1К-ПВ). (См. Ва1етапк е! а1., кирга и ссылки в этой работе). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность поли
- 8 015166 пептидов рецептора типа I ВМР обеспечены в базе данных ОепВапк. например ОепВапк ΝΜ_004329 (8ЕО ΙΌ N0:71. кодируемая 8Ер ГО N0:85); Ό89675 (8 НО ГО N0:72. кодируемая 8ЕО ГО N0:86); ΝΜ_001203 (8ЕО ΙΌ N0:73. кодируемая 8ЕО ГО N0:87); 875359 (8ЕО ГО N0:74. кодируемая 8ЕО ГО N0:88); NΜ_030849 (8ЕО ГО N0:75. кодируемая 8ЕО ГО N0:89) и Ό38082 (8ЕО ГО N0:76. кодируемая 8Е0 ГО N0:90). Другие полипептидные последовательности рецепторов типа I обеспечены в базе данных ОепВапк. например №_001194 (8 НО ГО N0:77); ВАА19765 (8 НО ГО N0:78) и ААВ33865 (8 НО ГО N0:79). Полинуклеотидные последовательности и кодируемая аминокислотная последовательность полипептидов рецептора типа II ВМР обеспечены в базе данных ОепВапк. например И25110 (8Е0 ГО N0:80. кодируемая 8ЕО ГО N0:91); МИ_033346 (8ЕО ГО N0:81. кодируемая 8ЕО ГО N0:92); МИ_001204 (8ЕО ГО N0:82. кодируемая 8ЕО ГО N0:93) и Ζ48923 (8ЕО ГО N0:83. кодируемая 8ЕО ГО N0:94). Дополнительные полипептидные последовательности рецепторов типа II также обеспечены в базе данных ОепВапк. например САА88759 (8Е0 ГО N0:84).
ВМР. сходные с другими имеющими цистиновый узел белками. образуют гомодимерную структуру (8сйеийег е! а1.. 1. Мо1. Вю1. 287:103-15 (1999)). В соответствии с анализом эволюционного прослеживания. выполненного на семействе ВМР/ТОЕ-β. сайт связывания рецептора типа I ВМР и сайт связывания рецептора типа II ВМР были картированы на поверхности структуры ВМР (1пш8 е! а1.. Рто!еш Епд. 13:839-47 (2000)). Местоположение сайта связывания рецептора типа I на ВМР было позднее подтверждено рентгеновской структурой комплекса ВМР-2/рецептор Щ ВМР (N^ске1 е! а1.. 1. 1о1п( 8игд. Ат. 83А(8ирр1 1(Р11)):87-814 (2001)). Предсказанный сайт связывания рецептора типа II хорошо согласуется с рентгеновской структурой комплекса ТОЕ-в3/рецептор типа II ТОЕ-β (Наг! е! а1.. №1. 8(гис1. Вю1. 9:203208 (2002)). который имеет большое сходство с системой ВМР/рецептор ПА ВМР.
Подсемейства ВМР и активина подвергаются значительной посттрансляционной регуляции ТОЕбета-связывающими белками. Существует сложная система внеклеточной регуляции. посредством которой синтезируется и экспортируется высокоаффинный антагонист. и затем он образует комплексы селективно с ВМР или активинами для разрушения их биологической активности (8ιηί11ι Тгепбк Оепе!. 15:3-6 (1999)). Ряд таких ТОЕ-бета-связывающих белков были идентифицированы и. на основе дивергенции последовательности. эти антагонисты. по-видимому. эволюционировали независимо вследствие отсутствия сохранения первичной последовательности. У позвоночных антагонисты включают ноггин. хордин. хордин-подобный белок. фоллистатин. Е8РР. семейство белков 0А№СегЬеи.18 и склеростин (808Т) (см. Ва1ешап8 е<1 а1.. кирга и ссылки в этой работе). Механизм антагонизма. по-видимому. отличается для различных антагонистов (1етига е! а1.. (1998) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 95 9337-9342).
Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на антагонисте ВМР ноогине были также картированы. Ноггин связывается с ВМР с высокой аффинностью (^иптегшап е! а1.. 1996). Исследование структуры комплекса ноггин/ВМР-7 выявили связывающие взаимодействия между этими двумя белками (Огорре е! а1.. №1Шге 420:636-42 (2000)). Наложение структуры ноггин-ВМР-7 на модель комплекса передачи сигнала ВМР показала. что связывание ноггина эффективно маскирует обе пары связывающих эпитопов (т.е. сайтов связывания рецепторов типа I и типа II ВМР) на ВМР-7. Последовательности богатого цистеином каркаса ноггина предшествует №концевой сегмент из приблизительно 20 аминокислотных остатков. который называют зажимом (клипом) (остатки 28-48). Сайт связывания рецептора типа I закрыт №концевой частью домена-зажима ноггина. а сайт связывания рецептора типа II закрыт карбокси-концевой частью этого домена-зажима. Две β-цепи во внутреннем (коровом) районе вблизи С-конца ноггина также контактируют с ВМР-7 при сайте связывания рецептора типа II. Этот способ связывания позволяет димеру ноггина эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (два сайта связывания рецептора типа I и два сайта связывания рецептора типа II) на димере ВМР.
Полипептиды склеростина и кодирующие полинуклеотиды
Антагонист ВМР склеростин (патенты США с номерами 6395511. 6489455 и 6495736; см. также 8Е0 ГО N0:1. 20. 58. 60. 62. 64. 66. 68 и 70) имеет почти идентичный цистеиновый (дисульфидный) каркас при сравнении с белками Нитап ЭА№ Нитап Огеткп и Нитап СегЬегик и 8СОЕ (Патент США № 5780263). но почти не имеют гомологии на уровне нуклеотидов (в отношении предшествующей информации см. в основном Нки е! а1.. Мо1. Се11 1:673-683 (1998)). Следует также понимать. что склеростин включает варианты этого ТОЕ-бета-связывающего белка.
В данном контексте вариантный полинуклеотид ТОЕ-бета-связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты. которая кодирует полипептид. имеющий аминокислотную последовательность. которая является модификацией (инсерцией. делецией или заменой одного или нескольких нуклеотидов) 8Е0 ГО N0:55-57. 59. 61. 63. 65. 67 или 69. Такие варианты включают природно встречающиеся полиморфизмы или аллельные варианты полинуклеотидов. кодирующих ТОЕ-бета-связывающие белки. а также синтетические полинуклеотиды. которые кодируют консервативные аминокислотные замены этих последовательностей аминокислот. Различные критерии. известные специалистам с квалификацией в данной области. показывают. являются ли аминокислоты в конкретном положении в пептиде или полипептиде подобными. Например. подобной аминокислотой или консервативной аминокислотной заменой является замена. в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком. имеющим
- 9 015166 сходную боковую цепь, причем сходные аминокислоты включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, гистидин); неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); бетаразветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Пролин, который, как считается, более трудно классифицировать, имеет общие свойства с аминокислотами, которые имеют алифатические боковые цепи (например, Ьеи, Уа1, 11е и А1а). В некоторых обстоятельствах, замена глутамином глутаминой кислоты или аспарагином аспарагиновой кислоты может рассматриваться как сходная замена вследствие того, что глутамин и аспарагин являются амидными производными глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно.
Дополнительными вариантными формами полинуклеотида, кодирующего ТОР-бета-связывающий белок, являются молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат замены, инсерции или делеции одного или нескольких нуклеотидов описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Вариантные или мутантные гены ТОР-бета-связывающего белка могут быть сконструированы или идентифицированы таким образом, что измененная версия ТОР-бета-связывающего белка конкурирует с ТОР-бетасвязывающим белком дикого типа. Такое конкурирование предпочтительно блокировало бы активность ТОР-бета-связывающего белка дикого типа и, следовательно, приводило бы к увеличенной плотности кости.
Выделенный полинуклеотид является молекулой нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом или олигонуклеотидом), которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, который не является частью природного окружения. Например, молекула ДНК, которая кодирует ТОР-бета-связывающий белок, которая была выделена из геномной ДНК эукариотической клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы ДНК является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Выделенной молекулой нуклеиновой кислоты может быть ДНК, кДНК, РНК или молекула, состоящая, по меньшей мере, частично из аналогов нуклеиновых кислот.
Вариантные полинуклеотиды ТОР-бета-связывающих белков могут быть идентифицированы определением, гибридизуется ли эти полинуклеотиды с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО N0:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69, при жестких условиях. Кроме того, вариантные полинуклеотиды ТОР-бета-связывающего белка кодируют белок, имеющий цистеиновый скелет молекулы. Вариантные полинуклеотиды ТОР-бета-связывающего белка могут быть также идентифицированы сравнением последовательностей. В данном контексте две аминокислотные последовательности имеют 100% идентичность последовательности, если аминокислотные остатки этих двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Подобным образом, две нуклеотидные последовательности имеют 100% идентичность нуклеотидной последовательности, если нуклеотидные остатки этих двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнения последовательностей могут выполняться с использованием стандартных программ программного обеспечения, таких как программы, включенные в компьютерный комплект биоинформатики ΕΑ8ΕΚ.ΟΕΝΕ, который производится ΌΝΑ^Α^. (Маб1воп, ΧνΝοοηδίη). или алгоритм ВЬАЗТ, доступный на сайте ΝΟΒΙ \геЬ (|1п1егпе1|<:1Шр:\\л\лг.псЬгп1т.ш11.доу>). Другие способы сравнения двух или более нуклеотидных или аминокислотных последовательностей определением оптимального выравнивания хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Регивкт апб Регивкц Т1е 1п1егпе1 апб Не №\ν Вю1оду: Тоо1в Гог Оепотк апб Мо1еси1аг Вевеагск (А8М Ргевв, 1пс. 1997), νυ е! а1., (ебв.), 'ЧпГогтаПоп §ирегЫдктау апб Сотри!ег ОаГаЬавев оГ №.1с1ею Аабв апб Рго!ешв, ш МеШобв ш Оепе В1о!есйпо1оду, радев 123-151 (СК.С Ргевв, 1пс. 1997) и В1вкор (еб.), Ошбе 1о Нитап Оепоте Сотрибпд, 2пб Ебйюп (Асабетк Ргевв, 1пс. 1998).
Вариантный ТОР-бета-связывающий белок должен иметь по меньшей мере 50% идентичность аминокислотной последовательности относительно 8Ε0 ГО N0:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 и 68 и предпочтительно идентичность, большую чем 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Альтернативно, варианты ТОР-бетасвязывающих белков могут быть идентифицированы по наличию по меньшей мере 70% идентичности нуклеотидной последовательности относительно 8Ε0 ГО N0:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69. Кроме того, данное изобретение предусматривает варианты полинуклеотидов ТОР-бета-связывающих белков, имеющие 75, 80, 85, 90 или 95% идентичность относительно 8Ε0 ГО N0:55 или 57. Независимо от конкретного способа, используемого для идентификации вариантного полинуклеотида ТОР-бетасвязывающего белка или варианта ТОР-бета-связывающего белка, такой вариант может быть функционально охарактеризован, например, его способностью связываться с выбранным членом ТОР-бетасемейства белков и/или ингибировать передачу сигнала выбранного члена ТОР-бета-семейства белков или его способностью связываться специфически с антителом против ТОР-бета-связывающего белка.
В контексте данного изобретения функциональный фрагмент полинуклеотида ТОР-бета
- 10 015166 связывающего белка обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептида ТСЕ-бета-связывающего белка, которая или (1) обладает описанной здесь функциональной активностью, или (2) специфически связывается с антителом против ТСЕ-бета-связывающего белка. Например, функциональный фрагмент полинуклеотида, кодирующего ТСЕ-бета-связывающий белок, описанный здесь, включает часть нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0:55-57, 59, 61, 63, 65, 76 или 69.
Выделенный полипептид обозначает полипептид, который удален из его природного окружения. Например, природно встречающийся белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех совместно существующих веществ в природной системе, таких как углевод, липид, нуклеиновые кислоты или белковые загрязнители, ассоциированные с этим полипептидом в природе. Предпочтительно такие выделенные полипептиды являются по меньшей мере на приблизительно 90% чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% чистыми и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% чистыми.
Антитела, специфические для ТСГ-бета-связывающих белков
Данное изобретение обеспечивает антитела, которые специфически связываются с 808Т, а также обеспечивает иммуногены полипептида 808Т, которые могут быть использованы для генерирования и анализа этих антител, а также обеспечивает способы применения таких антител. Антитела данного изобретения, описанные здесь, специфически связываются с полипептидом 808Т и посредством этого блокируют или ингибируют связывание ВМР с полипептидом 808Т, т.е. предотвращают или нарушают взаимодействие между ВМР и 808Т. Эффект блокирования этого взаимодействия заключается в изменении (увеличении или уменьшении статистически значимым образом) минеральной плотности кости, предпочтительно увеличении минеральной плотности кости.
Полипептиды или пептиды, применимые для иммунизации и/или анализа 808Т-специфических антител, могут быть также выбраны посредством анализа первичной, вторичной и третичной структуры ТСЕ-бета-связывающего белка в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области и описанными здесь, для определения аминокислотных последовательностей, которые с большей вероятностью будут генерировать антигенный ответ у животного-хозяина. См., например, ΝονοΙπν. Мо1. 1ттипо1. 28:201-207 (1991); Вег/оЕкку, 8с1еисе 229:923-40 (1985)). Моделирование и результаты рентгеновской кристаллографии могут быть также использованы для предсказания и/или идентификации, какие части или районы ТСЕ-бета-связывающего белка взаимодействуют с какими частями лиганда ТСЕ-бета-связывающего белка, такого как ВМР. Могут быть сконструированы и получены пептидные иммуногены ТСЕ-бета-связывающего белка, которые включают аминокислотные последовательности в частях или районах взаимодействия или окружают части или районы взаимодействия. Эти антитела могут быть использованы для блокирования или нарушения связывания ТСЕ-бета-связывающего белка с тем же самым лигандом и могут также блокировать или нарушать связывание ТСЕ-бетасвязывающего белка с одним или несколькими другими лигандами.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предусматриваемые данным изобретением, включают антитела, которые способны специфически связываться с 808Т и конкурентно ингибировать связывание ТСЕ-бета-полипептида, такого ВМР, с 808Т. Например, антитела, предусматриваемые данным изобретением, конкурентно ингибируют связывание полипептида 808Т с сайтом рецептора типа I ВМР на ВМР или с сайтом связывания рецептора типа II ВМР на ВМР или могут конкурентно ингибировать связывание 808Т со связывающими сайтами как рецептора типа I, так и рецептора типа II на ВМР. Не желая связывать себя теорией, авторы изобретения считают, что, когда антитело против 808Т конкурентно ингибирует связывание сайтов связывания типа I и/или типа II полипептида ВМР с 808Т, блокируя таким образом антагонистическую активность 808Т, сайты связывания рецептора на ВМР являются доступными для связывания рецепторов типа I и типа II, с увеличением посредством этого минерализации кости. Связывающее взаимодействие ТСЕ-бета-связывающего белка, такого как 808Т и ТСЕ-бетаполипептид, такой как ВМР, обычно имеет место, когда эта пара лигандов образует гомодимер. Таким образом, вместо или в дополнение к использованию антитела, специфического для 808Т, для блокирования, нарушения или предотвращения связывания 808Т с ВМР посредством конкурентного ингибирования связывания 808Т с ВМР, 808Т-специфическое антитело может быть использовано для блокирования или нарушения образования гомодимера 808Т.
В качестве примера, один димер Νο^ίη человека, который является антагонистом ВМР, который способен связываться с ВМР с высокой аффинностью (21ттеттаи е1 а1., кирга), выделяли в комплексе с одним димером ВМР-7 человека и анализировали мультивалентной аномальной дифракцией (МАО) (Сгорре е1 а1., №Шге 420:636-42 (2002)). Как обсуждается здесь, это исследование выявило, что димер Ν裏ίη может эффективно блокировать все сайты связывания рецепторов (сайты связывания рецепторов типа I и типа II) на димере ВМР. Определение местоположения аминокислот Νο^ίη, которые контактируют с ВМР-7, может быть использовано в моделировании взаимодействия между другими ТСЕ-бетасвязывающими белками, такими как склеростин (808Т) и ВМР, и, следовательно, это будет способствовать конструированию пептидов, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов для генерирования антител, которые блокируют или нарушают такое взаимодействие.
В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий
- 11 015166 фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом 808Т, конкурентно ингибируют связывание полипептида 808Т по меньшей мере с одним или обоими из сайтов: сайтом связывания рецептора типа I костного морфогенетического белка (ВМР) и сайтом связывания рецептора типа II ВМР, которые расположены на ВМР. Эпитопы на 808Т, с которыми связываются эти антитела, могут включать в себя или быть включены в смежные аминокислотные последовательности, которые расположены в Ν-конце полипептида 808Т (аминокислоты в положениях приблизительно 1-56 8Е0 ΙΌ N0:1). Эти полипептиды могут также включать последовательность короткого линкерного пептида, который соединяет этот Νконцевой район с внутренним районом, например полипептиды, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:47 (человека) и 8Е0 ΙΌ N0:48 (крысы). Более короткие репрезентативные Ν-концевые пептидные последовательности 808Т человека (например, 8Е0 ΙΩ N0:1) включают 8Е0 ΙΩ N0:2-6, а репрезентативные пептидные последовательности 808Т крысы (например, 8Е0 ΙΌ N0:20) включают 8Е0 ΙΌ N0:12-15.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидом 808Т и блокируют или конкурентно ингибируют связывание полипептида 808Т с ВМР, например, блокированием или ингибированием связывания аминокислот ВМР, соответствующих одному или нескольким из сайтов связывания рецепторов типа Ι и типа ΙΙ, могут также специфически связываться с пептидами, которые включают аминокислотную последовательность, соответствующую внутреннему (коровому) району 808Т (аминокислоты в положениях приблизительно 57-146 8Е0 ΙΌ N0:1). Полипептиды, которые включают этот внутренний район, могут также включать дополнительные аминокислоты, простирающиеся на любом или на обоих Юконце и С-конце, например, для включения остатков цистеина, которые могут быть полезными для конъюгирования этого полипептида с молекулой-носителем. Репрезентативные внутренние полипептиды 808Т человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:49 и 8Е0 ΙΌ N0:50, соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные внутренние пептидные последовательности 808Т человека представлены в 8Е0 ΙΌ N0:21-24, а репрезентативные внутренние последовательности 808Т крысы представлены в 8Е0 ΙΌ N0:25-28.
В другом варианте осуществления антитела, которые специфически связываются с полипептидом 808Т, нарушают (ингибируют, предотвращают или блокируют, например, уменьшают статистически значимым образом) образование гомодимера 808Т. Поскольку взаимодействие между 808Т и ВМР может включать гомодимер 808Т и гомодимер ВМР, антитело, которое предотвращает или нарушает образование гомодимера 808Т, может посредством этого изменять минеральную плотность кости, предпочтительно увеличивать минеральную плотность кости. В одном варианте осуществления антитела, которые связываются с внутренним районом 808Т, предотвращают образование гомодимера. Такие антитела могут также связываться с пептидами, которые включают последовательности смежных аминокислот, соответствующие внутреннему району, например 8Е0 ΙΌ N0:29, 30 и 53 (808Т человека) и 8Е0 ΙΌ N0:31 и 54 (808Т крысы). Антитела, которые связываются с эпитопом, расположенным на С-концевом районе полипептида 808Т (приблизительно в положениях аминокислот 147-190 8Е0 ΙΌ N0:1 или 20), могут также нарушать образование гомодимера.
Репрезентативные С-концевые полипептиды 808Т человека и крысы, например, включают аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:51 и 8Е0 ΙΌ N0:52, соответственно. Такие антитела могут также связывать более короткие полипептидные последовательности. Репрезентативные С-концевые пептидные последовательности 808Т человека представлены в 8Е0 ΙΌ N0:33-36, а репрезентативные С-концевые пептидные последовательности 808Т крысы представлены в 8Е0 ΙΌ N0:41-43.
Описанные здесь полипептиды и пептиды 808Т, с которыми антитела могут специфически связываться, применимы в качестве иммуногенов. Эти иммуногены данного изобретения могут быть использованы для иммунизации животного для генерирования гуморального иммунного ответа, который приводит к продуцированию антител, которые специфически связываются с сайтом связывания рецептора типа Ι или типа ΙΙ или с обоими, расположенными на ВМР, и включают пептиды, произведенные из N концевого района 808Т, или которые могут предотвращать образование гомодимера 808Т.
Такие полипептиды и пептиды 808Т, которые применимы в качестве иммуногенов, могут быть также использованы в способах скрининга проб, содержащих антитела, например проб очищенных антител, антисывороток или супернатантов клеточных культур или любой другой биологической пробы, которая может содержать одно или несколько антител, специфических в отношении 808Т. Эти пептиды могут быть также использованы в способах идентификации и отбора из биологической пробы одной или нескольких В-клеток, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с 808Т (например, анализы образования бляшек и т.п.). Затем эти В-клетки используют в качестве источника кодирующего 808Т-специфическое антитело полинуклеотида, который может быть клонирован и/или модифицирован рекомбинантными способами молекулярной биологии, известными в данной области и описанными здесь.
Биологическая проба в данном контексте обозначает в некоторых вариантах осуществления пробу, содержащую по меньшей мере одно антитело, специфическое в отношении полипептида 808Т, и биологическая проба может быть обеспечена получением пробы крови (из которой могут быть получены сыворотка или плазма), образца биопсии, эксплантата ткани, культуры органа или любой другой ткани
- 12 015166 или препарата клеток из субъекта или биологического источника. Пробой может дополнительно называться препарат ткани или клеток, в котором морфологическая целостность или физическое состояние было разрушено, например, иссечением, диссоциацией, солюбилизацией, фракционированием, гомогенизацией, биохимической или химической экстракцией, измельчением в порошок, лиофилизацией, обработкой ультразвуком или любым другим способом для обработки пробы, полученной из субъекта или биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, не являющееся человеком, первичная культура клеток (например, В-клеток, иммунизированных ίη νίΐτο) или адаптированная к культуре клеточная линия, в том числе, но не только, генетически сконструированные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или иммортализируемые клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или дифференцируемые клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т.п.
Пептидные иммуногены δΟδΤ могут быть также получены синтезом серии пептидов, которые, в целом, представляют полную полипептидную последовательность полипептида δΟδΤ и каждый из которых имеет часть аминокислотной последовательности 8Θ8Τ, общую с другим пептидом в этой серии. Эта перекрывающаяся часть может состоять предпочтительно по меньшей мере из четырех аминокислот и более предпочтительно из 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот. Каждый пептид может быть использован для иммунизации животного, сыворотки собирают из этого животного и испытывают в анализе для идентификации, какое животное продуцирует антитела, которые нарушают или блокируют связывание 8Θ8Τ с ΤΟΡ-бета-белком. Затем получают антитела из таких идентифицированных иммунизированных животных в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь.
Пептиды, полипептиды и другие непептидные молекулы, которые специфически связываются с ΤΟΡ-бета-связывающим белком, таким как 8Θ8Τ, предусматриваются данным изобретением. В данном контексте, говорят, что молекула специфически связывается с ΤΟΡ-бета-связывающим белком, если она реагирует при детектируемом уровне с ΤΟΡ-бета-связывающим белком, но не реагирует детектируемо с пептидами и полипептидами, включающими неродственную последовательность или последовательность другого ΤΟΡ-бета-связывающего белка. Предпочтительные связывающие молекулы включают антитела, которые могут быть, например, поликлональными, моноклональными, одноцепочечными, химерными, антиидиотипическими или СЭЯ-привитыми иммуноглобулинами, или их фрагменты, такие как генерированные протеолитически или полученные рекомбинантно фрагменты Р(аЬ')2, РаЬ, РаЬ', Ρν и Ρ6 иммуноглобулина.
Особенно применимыми являются антитела против ΤΟΡ-бета-связывающего белка, которые специфически связывают ΤΟΡ-бета-связывающий белок 8ЕО ΙΌ N0:1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 или 68, но не другие ΤΟΡ-бета-связывающие белки, такие как Эап. СегЬегик, 5СОЕ или ОгешЛп. Предполагается, что антитела специфически связываются с ΤΟΡ-бета-связывающим белком или конкретным членом ΤΟΡбета-семейства, если они связываются с Ка, равной или большей чем 104 М-1, предпочтительно равной или большей чем 105 М-1, более предпочтительно равной или большей чем 106 М-1, еще более предпочтительно равной или большей чем 107 М-1, и даже еще более предпочтительно равной или большей чем 108 М-1, и действительно не связываются с другими ΤΟΡ-бета-связывающими белками. Аффинность антитела в отношении его родственного антигена выражают обычно в виде константы диссоциации Кс, и антиδΟδΤ-антитело специфически связывается с членом ΤΟΡ-бета-семейства, если оно связывается с Кс, равной или меньшей чем 10-4 М, более предпочтительно равной или меньшей чем 10-5 М, более предпочтительно равной или меньшей чем 10-6 М, даже более предпочтительно равной или меньшей чем 10-7 М и даже более предпочтительно равной или меньшей чем 10-8 М. Кроме того, антитела данного изобретения предпочтительно блокируют, нарушают или ингибируют (например, уменьшают со статистической значимостью) связывание ΤΟΡ-бета-связывающего белка с членом ΤΟΡ-бета-семейства.
Аффинность антитела или партнера связывания, а также ингибирование связывания могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области с использованием общепринятых способов, например, описанных 8са!сйатб е! а1. (Αηη. Ν.Υ. Асаб. δει. 51:660-672, 1949), или с использованием резонанса поверхностных плазмонов (δΡΚ; В1Асоге, Вюкепкот, Ркса!а^ау, N1). Для резонанса поверхностных плазмонов молекулы-мишени иммобилизуют на твердой фазе и подвергают действию лигандов в подвижной фазе, идущей вместе с потоком клеток. Если связывание лиганда с иммобилизованной мишенью имеет место, локальный показатель преломления изменяется, приводя к изменению угла δΡΚ, которое может быть подвергнуто мониторингу в реальном времени детектированием изменений в интенсивности отраженного света. Скорости изменения сигнала δΡΚ могут анализироваться для получения видимых констант скорости для фаз ассоциации и диссоциации реакции связывания. Отношение этих величин дает видимую константу равновесия (аффинность) (см., например, \7о1ГГ е! а1., Сапсег Яек. 53:2560-65 (1993)).
Антитело в соответствии с данным изобретением может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, например Ι§Ο, 1дЕ, 1дМ, Ι§Ό или 1дА. Оно может быть получено или произведено из животного, например домашней птицы (например, курицы) и млекопитающих, которые включают, но не ограничиваются ими, мышь, крысу, хомячка, кролика или другого грызуна, корову, лошадь, овцу, козу, верб
- 13 015166 люда, человека или другого примата. Это антитело может быть интернализующимся антителом.
Хорошо известные в данной области способы могут быть использованы для генерирования антител, поликлональных антисывороток или моноклональных антител, которые являются специфическими в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка, такого как 8О8Т. Антитела могут быть также получены в виде генетически сконструированных иммуноглобулинов (1д) или 1д-фрагментов, сконструированных таким образом, что они имеют желаемые свойства. Например, в качестве иллюстрации, а не для ограничения, антитела могут включать рекомбинантный 1дС, который является химерным слитым белком, имеющим по меньшей мере один домен вариабельной области (V) из первого вида млекопитающего и по меньшей мере один домен константной области из второго, отличающегося вида млекопитающего. Наиболее часто химерное антитело имеет последовательности вариабельной области мыши и последовательности константной области человека. Такой мышь/человек-химерный иммуноглобулин может быть гуманизирован пересадкой определяющих комплементарность районов (СЭЯ), происходящих из мышиного антитела, которые придают специфичность связывания в отношении антигена, в районы вариабельной области (V) человека и происходящие из человека константные области. Фрагменты этих молекул могут быть генерированы протеолитическим расщеплением или, необязательно, протеолитическим расщеплением с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также генерированы рекомбинантными способами генной инженерии.
Некоторые предпочтительные антитела являются антителами, которые ингибируют или блокируют активность ТСЕ-бета-связывающего белка в анализе ίη νίίτο, как описано здесь. Связывающие свойства антитела в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка могут быть, как правило, оценены с использованием способов иммунодетектирования, включающих, например, иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЬ18А), иммунопреципитацию, иммуноблоттинг, противоточный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, дот-блот-анализы, анализы ингибирования или конкуренции и т.п., которые могут легко выполняться специалистами с обычной квалификацией в данной области (см., например, Патенты США с номерами 4376110 и 4486530; Наг1о\\' с1 а1., АпИЬоб1ек: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога1огу, 1988)).
Иммуноген может состоять из клеток, экспрессирующих ТСЕ-бета-связывающий белок, такой как полипептид 8О8Т, очищенного или частично очищенного полипептида 8О8Т или его вариантов или фрагментов (т.е. пептидов) или пептидов, полученных из полипептида 8О8Т. Такие пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением большего полипептида, рекомбинантными молекулярными методологиями или могут быть синтезированы химически. Например, здесь обеспечены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид 8О8Т, так что лица с квалификацией в данной области могут рутинным образом получить полипептид 8О8Т для использования в качестве иммуногенов. Пептиды могут быть химически синтезированы способами, описанными здесь и известными в данной области. Альтернативно пептиды могут быть получены протеолитическим расщеплением полипептида 8О8Т, и индивидуальные пептиды могут быть выделены способами, известными в данной области, такими как электрофорез в полиакриламидном геле, или любым количеством из способов жидкостной хроматографии или других способов разделения. Пептиды, применимые в качестве иммуогенов, обычно могут иметь аминокислотные последовательности по меньшей мере из 4 или 5 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности полипептида 8О8Т, такой как описанные здесь, и предпочтительно имеют по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 или 20 последовательных аминокислот полипептида 8О8Т. Некоторые другие предпочтительные пептидные иммуногены включают по меньшей мере 6, но не более чем 12, последовательных аминокислот последовательности полипептида 8О8Т, другие предпочтительные пептидные иммуногены включают по меньшей мере 20, но не более чем 75, последовательных аминокислот, а другие предпочтительные пептидные иммуногены включают по меньшей мере 21, но не более чем 50 последовательных аминокислот полипептида 8О8Т. Другие предпочтительные пептидные иммуногены содержат 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50 или любое целое число аминокислот между 21 и 100, включительно, последовательными аминокислотами и между 100 и 190 последовательными аминокислотами последовательности полипептида 8О8Т.
Поликлональные антитела, которые связываются специфически с 8О8Т, могут быть получены с использованием способов, описанных здесь и хорошо известных специалистом с обычной квалификацией в данной области (см., например, Сгееп с1 а1., Ртобисбоп о! Ро1ус1опа1 Апбкета, ίη 1ттипо1од1са1 Рго1осо1к (Мапкоп, еб.), радек 1-5 (Нитапа Ргекк 1992); Наг1ои е1 а1., АпбЬоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬогаЮгу (1988); ХУППатк е1 а1., Ехртеккюп о! Гоге1дп ргоШпк ш Е. сой икшд р1акт1б νесΐο^к апб рипПсаЬоп о! кресШс ро1ус1опа1 апИЬоб1ек, ш ИИА С1ошпд 2: Ехртеккюп 8ук1етк, 2пб Еб1Поп, С1о\гег е1 а1. (ебк.), раде 15 (ОхГогб ипшеткйу Ргекк 1995)). Антитела к ТСЕ-бета-связывающему белку могут быть получены, например, иммунизацией животного продуктом ТСЕ-бета-связывающего белка экспрессирующего вектора или иммунизацией выделенным ТСЕ-бета-связывающим белком или его пептидным фрагментом, как описано здесь. Хотя поликлональные антитела обычно индуцируют в животных, таких как крысы, мыши, кролики, козы, крупный рогатый скот или овцы, антитело против ТСЕ-бета-связывающего белка данного изобретения может быть также получено из примата (не человека). Общие способы инду
- 14 015166 цирования диагностически и терапевтически применимых антител в павианах могут быть найдены, например, в \νϋ 91/11465 (1991) и в Ьоктап е! а1., 1п!. 1. Сапсег 46:310, 1990.
Приготовление иммуногена для инъекции в животных может включать ковалентное связывание ТСЕ-бета-связывающего белка (или его варианта или фрагмента) с другим иммуногенным белком, например белком-носителем, таким как гемоцианин фисуреллы (КЕН) или бычий сывороточный альбумин или т. п. Полипептидный или пептидный иммуноген может включать одну или несколько дополнительных аминокислот на Ν-конце или С-конце, которые облегчают процедуру конъюгации (например, добавление цистеина для облегчения конъюгации пептида с КЕН). Другие аминокислотные остатки в полипептиде или пептиде могут быть заменены для предотвращения конъюгации в конкретном положении аминокислоты с полипептидом-носителем (например, заменой остатком серина цистеина во внутренних положениях полипептида/пептида) или могут быть заменены для облегчения растворения или для повышения иммуногенности.
Пептид ТСЕ-бета-связывающего белка, полипептид или экспрессирующие ТСЕ-бета-связывающий белок клетки, подлежащие использованию в качестве иммуногена, могут быть эмульгированы в адъюванте, например полном или неполном адъюванте Фрейнда или системе адъюванта КгЫ (Сопха Согрогаΐίοη, 8еа!!1е, νΑ). См. также, например, Наг1о\у е! а1., кирга. Иммуноген может быть инъецирован в животное любым числом различных способов, в том числе, внутрибрюшинно, внутримышечно, интраокулярно, интрадермально или подкожно. Обычно после первой инъекции животные получают одну или несколько бустер-иммунизаций в соответствии с предпочтительной схемой, которая может варьироваться в соответствии, т!ег а11а, с антигеном, адъювантом (если его вводят) и/или конкретным видом животного. Иммунный ответ может быть подвергнут мониторингу периодическим взятием крови животного и получением и анализом сывороток в иммуноанализе, таком как ЕЬ18А или диффузионный анализ Оухтерлони или т.п., для определения титра специфических антител. После установления достаточного титра антитела у животных периодически берут кровь для накопления поликлональных антисывороток, или животные могут быть обескровлены. Поликлональные антитела, которые связываются специфически с ТСЕ-бета-связывающим белком или пептидом, могут быть затем очищены из таких антисывороток, например, аффинной хроматографией с использованием белка А. Альтернативно, может выполняться аффинная хроматография, где ТСЕ-бета-связывающий белок или пептид или антитело, специфическое в отношении константной области 1д конкретного иммунизированного вида животного, иммубилизовано на подходящем твердом носителе.
Антитела для применения в данном изобретении включают моноклональные антитела, которые получают общепринятыми процедурами иммунизации и слияния клеток, описанными здесь и известными в данной области. Моноклональные антитела против ТСЕ-бета-связывающего белка могут быть генерированы с использованием различных способов. Моноклональные антитела, которые связываются со специфическими антигенами, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области (см., например, КоЫег е! а1., №!иге 256:495, 1975; СоНдап е! а1., (ебк.), Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1оду, 1:2.5.1-2.6.7 ЦоЬп №11еу апб 8опк 1991); Патенты США с номерами ЕЕ32001, 4902614, 4543439 и 4411993; Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек, НуЬпботак: Α №\ν Оппепкюп т Вю1одюа1 Апа1укек, Р1епит Ргекк, Кеппе!, МсКеагп, апб Вес1!о1 (ебк.), 1980 и Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1ои апб Ьапе (ебк.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1988; Рюкк1еу е! а1., Ргобисбоп оГ топос1опа1 ап!1Ьоб1ек адатк! рго!етк ехргеккеб т Е. со11, ш ^NΑ С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб Ебйюп, С1оуег е! а1. (ебк.), раде 93 (ОхГогб Цшуегк1!у Ргекк 1995)). Фрагменты антител могут быть получены из антител с использованием любого подходящего стандартного способа, такого как протеолитическое расщепление, или, необязательно, протеолитическим расщеплением (например, при помощи папаина или пепсина) с последующим мягким восстановлением дисульфидных связей и алкилированием. Альтернативно, такие фрагменты могут быть также созданы рекомбинантными способами генной инженерии.
Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены инъекцией животного, такого как крыса, хомячок, или предпочтительно мышь, иммуногеном, включающим продукт гена ТСЕ-бетасвязывающего белка или его пептидный фрагмент, в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Присутствие продуцирования специфического антитела может быть подвергнуто мониторингу после начальной инъекции (инъекции могут выполняться любым из нескольких способов, описанных здесь для генерирования поликлональных антител) и/или после бустер-инъекции взятием пробы сыворотки и детектированием присутствия антитела, которое связывает ТСЕ-бетасвязывающий белок или пептид, с использованием любого из нескольких способов иммунодетектирования, известных в данной области и описанных здесь. Из животных, продуцирующих антитела, которые связываются с ТСЕ-бета-связывающим белком, извлекают лимфоидные клетки, наиболее часто клетки из селезенки или лимфатического узла, для получения В-лимфоцитов. Затем В-лимфоциты сливают с сенсибилизированными лекарственным средствами клетками миеломы в качестве партнера слияния, предпочтительно клетками, сингенными с иммунизированным животным и, необязательно, имеющими другие желательные свойства (например, неспособность экспрессировать эндогенные продукты гена 1д, например Р3Х63 - Ад 8.653 (АТСС №. СВЬ 1580); N80, 8Р20) для получения гибридом, которые являются иммортализованными линиями эукариотических клеток. Лимфоидные клетки (например, селезенки) и
- 15 015166 миеломные клетки могут быть объединены на несколько минут с агентом, усиливающим слияние мембран, таким как полиэтиленгликоль или неионогенный детергент, и затем посеяны при низкой плотности на селективной среде, которая поддерживает рост гибридомных клеток, но не неслитых миеломных клеток. Предпочтительной селективной средой является НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). После достаточного времени, обычно приблизительно одной недели - двух недель, наблюдают колонии клеток. Отдельные колонии выделяют, и антитела, продуцируемые этими клетками, могут быть испытаны на связывающую активность в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка, или его варианта или фрагмента, с использованием любого из различных иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь. Предпочтительными являются гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела с высокой аффинностью и специфичностью в отношении 808Т. Таким образом, данным изобретением обсуждаются гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, которые специфически связываются с ТОЕ-бета-связывающим белком или его вариантом или фрагментом. Эти гибридомы клонируют (например, клонированием с использованием лимитирующих разведений или выделения бляшек из мягкого агара) и положительные клоны, которые продуцируют антитело, специфическое в отношении антигена, отбирают и культивируют. Антитела, которые блокируют, ингибируют или нарушают связывание ТОЕбета-связывающего белка с членом ТОЕ-бета-семейства, являются предпочтительными.
Моноклональные антитела из гибридомных культур могут быть выделены из супернатантов гибридомных культур. Альтернативным способом получения мышиного моноклонального антитела является инъецирование этих гибридомных клеток в брюшную полость сингенной мыши, например мыши, которая была обработана (например, праймирована пристаном) для усиления образования асцитной жидкости, содержащей моноклональное антитело. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены различными хорошо установленными способами. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию с использованием Белок А-Сефарозы, гель-фильтрационную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, СоНдап на страницах 2.7.1-2.7.12 и на страницах 2.9.1-2.9.3; Вашек е! а1., РипПсабоп о£ Бптипод^ЬиКп О ЦдО), ίη МеШобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радек 79-104 (Тйе Нитапа Ргекк, Шс. 1992)). Моноклональные антитела могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием подходящего лиганда, выбранного на основе конкретных свойств антитела (например, изотипа тяжелой или легкой цепи, специфичности связывания и т.д.). Примеры подходящего лиганда, иммобилизованного на твердом носителе, включают белок А, белок О, антитело против константной области (легкой цепи или тяжелой цепи), антиидиотипическое антитело и ТОЕ-бета-связывающий белок или его фрагмент или вариант.
Кроме того, антитело против ТОЕ-бета-связывающего белка данного изобретения может быть моноклональным антителом человека. Моноклональные антитела человека могут быть генерированы любым числом способов, с которыми знакомы специалисты с обычной квалификацией в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, трансформацию клеток периферической крови (например, содержащих В-лимфоциты) вирусом Эпстейна-Барра (ЕВУ), ίη νίΙΐΌ иммунизацию В-клеток человека, слияние клеток селезенки из иммунизированных трансгенных мышей, несущих инсертированные гены иммуноглобулина человека, выделение из фаговых библиотек У-области иммуноглобулина человека или другие процедуры, известные в данной области и основанные на раскрытии данной заявки. Например, моноклональные антитела человека могут быть получены из трансгенных мышей, которые были получены с использованием генной инженерии для продуцирования специфических антител человека в ответ на введение антигена. Способы получения антител человека из трансгенных мышей описаны, например Огееп е! а1., №1иге Сепе!. 7:13, 1994; ЬопЬетд е! а1., №11иге 368:856, 1994; Тау1ог е! а1., Ш!. Iттиη. 6:579, 1994; патент США № 5877397; Вгиддетапп е! а1., 1997 Сигг. 0рш. Вю!есЬпо1. 8:455-58; 1акоЬоуйк е! а1., 1995 Апп. ΝΥ. Асаб. 8с1. 764:525-35. В этом способе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в линии мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат нацеленные разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. (См. также Вгиддетапп е! а1., Сигг. 0рт. Вю!есЬпо1. 8:455-58 (1997)). Например, трансгены, иммуноглобулина человека могут быть минигенными конструкциями или транс-локусами на искусственных хромосомах дрожжей, которые подвергаются специфической в отношении В-клеток реаранжировке ДНК и гипермутации в лимфоидной ткани мыши. Моноклональные антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей, которые затем могут продуцировать антитела человека, специфические в отношении этого антигена. Лимфоидные клетки иммунизированных трансгенных мышей могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих антитело человека, в соответствии с описанными здесь способами. Поликлональные сыворотки, содержащие антитела человека, могут быть также получены из крови этих иммунизированных животных.
Другой способ получения моноклональных антител, специфических в отношении ТОЕ-бетасвязывающего белка человека, включает иммортализацию клеток периферической крови человека трансформацией ЕВУ. См., например, патент США № 4464456. Такая иммортализованная линия Вклеток (или линия лимфобластоидных клеток), продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически связывается с ТОЕ-бета-связывающим белком (или его вариантом или фрагментом), может быть идентифицирована обеспеченными здесь способами иммунодетектирования, например ЕЫ8А, и
- 16 015166 затем выделена стандартными способами клонирования. Стабильность лимфобластоидной клеточной линии, продуцирующей антитело против ΤΟΕ-бета-связывающего белка, может быть улучшена слиянием этой трансформированной клеточной линии с мышиной миеломой с получением гибридной мышьчеловек клеточной линии в соответствии со способами, известными в данной области (см., например, С1акку е1 а1., НуЬпбоша 8:377-89 (1989)). Еще одним способом генерирования моноклональных антител человека является иммунизация ίη νίίτο, которая включает праймирование В-клеток селезенки человека антигеном с последующим слиянием праймированных В-клеток с гетерогибридным партнером слияния. См., например, Воегпег е1 а1., 1991, 1. Iттиηο1. 147:86-95.
В некоторых вариантах осуществления отбирают В-клетку, которая продуцирует антитело против 808Τ, и вариабельные области легкой и тяжелой цепей клонируют из этой В-клетки в соответствии со способами молекулярной биологии, известными в данной области (\У0 92/02551; патент США 5627052; ВаЬсоок е1 а1., Ргос. Асаб. 8с1. И8А 93:7843-48 (1996)) и описанными здесь. Предпочтительно Вклетки из иммунизированного животного выделяют из селезенки, лимфатического узла или пробы периферической крови с использованием отбора клетки, которая продуцирует антитело, которое специфически связывается с 808Τ. В-клетки могут быть также выделены из людей, например из пробы периферической крови. Способы детектирования отдельных В-клеток, которые продуцируют антитело с желаемой специфичностью, хорошо известны в данной области, например способ образования бляшек, клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции, стимуляция ίη мбго с последующим детектированием специфического антитела и т.п. Способы отбора продуцирующих специфическое антитело В-клеток включают, например, получение суспензии отдельных В-клеток в мягком агаре, который содержит 808Τ или его пептидный фрагмент. Связывание специфического антитела, продуцируемого В-клеткой в ответ на антиген, приводит к образованию комплекса, который может быть видимым в виде иммунопреципитата. После отбора В-клеток, продуцирующих специфическое антитело, гены этого специфического антитела могут быть клонированы выделением и амплификацией ДНК или мРНК в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь.
Для конкретных применений могут быть желательными фрагменты антител против ΤΟΕ-бетасвязывающего белка. Фрагменты антител, Εφ№)2, ΕаЬ, ΕаЬ', Εν, Ес. Ε6, сохраняют антигенсвязывающий сайт целого антитела и, следовательно, связываются с тем же самым эпитопом. Эти антигенсвязывающие фрагменты, произведенные из антитела, могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом этого антитела, например расщеплением пепсином или папаином целых антител в соответствии с общепринятыми способами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены ферментативным расщеплением антител пепсином с получением фрагмента 58, названного Г(аЬ')2. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием восстанавливающего тиолы агента с получением моновалентных фрагментов 3,58 ΕаЬ'. Необязательно, реакцию расщепления можно выполнять с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые происходят из расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с использованием папаина дает два моновалентных ΕаЬ-фрагмента и непосредственно Εс-фрагмент. Эти способы описаны, например, Οο1беηЬе^д, патент США № 4331647, №копоГГ е1 а1., Атсй. Вюсет. Вюрйук. 89:230, 1960; Ройет, Вюсйет. 1. 73:119, 1959; Ебе1тап е1 а1., ίη Мебюбк ίη Епхуто1оду 1:422 (Асабетк Ргекк 1967) и Сойдап страницы 2.8.1-2.8.10 и 2.10-2.10.4. Другие способы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких цепей (Ε6), дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, могут быть также использованы, пока эти фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.
Фрагмент антитела может быть также любым синтетическим или генетически сконструированным белком, который действует подобно антителу, т. е. связывается со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антитела включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельной области легкой цепи, Εν''-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (ксΕν-белки) и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный район. Антитело данного изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере один домен вариабельной области. Этот домен вариабельной области может иметь любой размер или аминокислотный состав и будет обычно содержать по меньшей мере одну гипервариабельную аминокислотную последовательность, ответственную за связывание антигена, которая является смежной или находится в рамке считывания с одной или несколькими каркасными последовательностями. В общем, домен вариабельной области (V) может быть любым подходящим расположением вариабельных доменов тяжелой (νΗ) и/или легкой (УД цепей иммуноглобулина. Таким образом, например, домен ν-области может быть мономерным и может быть νΗ- или VI-доменом, который способен независимо связывать антиген с приемлемой аффинностью. Альтернативно, домен ν-области может быть димерным и содержать димеры νΗ-νΗ, νΗ-ν2 или ν2-ν2. Предпочтительно, димер ν-области содержит по меньшей мере одну цепь νΗ и по меньшей мере одну цепь ν^ которые нековалентно ассоциированы (далее называемые Εν). Если желательно, эти цепи могут быть ковалентно связаны либо непосредственно, либо, например, через дисульфидную связь между дву
- 17 015166 мя вариабельными доменами, или через линкер, например пептидный линкер, с образованием одноцепочечной цепи Еу (ксЕу).
Домен вариабельной области может быть любым встречающимся в природе вариабельным доменом или его сконструированной версией. Под сконструированной версией имеют в виду домен вариабельной области, который был создан с использованием рекомбинантных способов генной инженерии ДНК. Такие сконструированные версии включают версии, созданные, например, из вариабельной области специфического антитела посредством инсерций, делеций или изменений в аминокислотных последовательностях этого специфического антитела. Конкретные примеры включают сконструированные домены вариабельной области, содержащие по меньшей мере один СОК. и необязательно одну или более аминокислот каркасной области из первого антитела и остальной домен вариабельной области из второго антитела.
Домен вариабельной области может быть ковалентно присоединен при С-концевой аминокислоте по меньшей мере к одному другому домену антитела или его фрагменту. Так, например, Ун-домен, который присутствует в домене вариабельной области, может быть связан с Сн 1-доменом иммуноглобулина или его фрагментом. Подобным образом, Уъ-домен может быть связан с Ск-доменом или его фрагментом. Таким образом, например, это антитело может быть ЕаЬ-фрагментом, в котором антигенсвязывающий домен содержит ассоциированные УН- и Уъ-домены, ковалентно связанные при их С-концах с Сн1- и Ск-доменом, соответственно. Сн1-домен может быть удлинен дополнительными аминокислотами, например, для обеспечения шарнирной области или части домена шарнирной области, как обнаружено в ЕаЬ'-фрагменте, или для обеспечения дополнительных доменов, таких как домены Сн2 и Сн3.
Другой формой фрагмента антитела является пептид, включающий единственный определяющий комплементарность район (СОК). СЭК-пептиды (минимальные узнающие единицы) могут быть получены конструированием полинуклеотидов, которые кодируют СОК представляющего интерес антитела. Такие полинуклеотиды получают, например, с использованием полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области с использованием мРНК антитело-продуцирующих клеток в качестве матрицы (см., например, Ьатск е! а1., Ме!1юбк: А Сотрапюп ίο Ме!1юбк ίη Еηζутο1οду 2:106, 1991; ί.’οιΐΓ^η;·ι\·Ьиск, Сепейс Машри1а1юп οί Мοηοс1οηа1 Αηΐώο^κ, ίη Мοηοс1οηа1 ΑηίΛο^κ: Ргобис1юп, Епдшееппд апб С11п1са1 АррНса1юпк, К1йете1 а1. (ебк.), раде 166 (СатЬпбде Ишуеткйу Ргекк 1995) и \Уагб е! а1., Сепейс Маη^ри1аί^οη апб Ехртеккюп οί Αηΐ^Ьοб^ек, ίη Мοηοс1οηа1 Αηί^Ьοб^ек: Рппс1р1ек апб АррШа^^, В1тсй е! а1., (ебк.), раде 137 (^11еу-Ь1кк, Шс. 1995)).
Альтернативно, антитело может быть рекомбинантным или сконструированным антителом, полученным с использованием способов рекомбинантных ДНК, включающих манипуляцию и повторную экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и/или константные области антитела. Такая ДНК известна и/или является легко доступной из библиотек ДНК, в том числе, например, библиотек фаг-антитело (см. С.’1ик\уе11 апб МсСайейу, Т1Ыесй. 10:80-84 (1992)), или, если желательно, может быть синтезирована. Стандартные процедуры молекулярной биологии и/или химии могут быть использованы для секвенирования и манипуляции этой ДНК, например, для введения кодонов для создания остатков цистеина или для модификации, добавления или делеции других аминокислот или доменов, если это желательно.
Химерные антитела, специфические в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка, которые включают гуманизированные антитела, могут быть также генерированы в соответствии с данным изобретением. Химерное антитело имеет по меньшей мере один домен константной области, полученный из первого вида млекопитающего, и по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из второго, отличающегося вида млекопитающего (см., например, Мο^^^кοη е! а1., Ргос. №И. Асаб. δα. И8А 81:685155 (1984)). В предпочтительных вариантах осуществления химерное антитело может быть сконструировано клонированием полинуклеотидной последовательности, которая кодирует по меньшей мере один домен вариабельной области, полученный из моноклонального антитела не человека, такой как вариабельная область, полученная из моноклонального антитела мыши, крысы или хомячка, в вектор, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну константную область человека (см., например, 8Ып е! а1., Ме!1юбк Еηζутο1. 178:459-76 (1989); ^а11к е! а1., ШсШс Ас1бк Кек. 21:2921-29 (1993)). В качестве примера, полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела, может быть встроена в вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность константной области легкой цепи каппа. В отдельном векторе полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, может быть клонирована в рамке считывания с последовательностями, кодирующими константную область ЦС человека, например константную область 1дС1 человека. Конкретная выбранная константная область человека может зависеть от эффекторных функций, желаемых для конкретного антитела (например, фиксация (связывание) комплемента, связывание с конкретным Ес-рецептором и т.д.). Предпочтительно, сконструированные векторы будут трансфицироваться в эукариотические клетки для стабильной экспрессии этого химерного антитела. Другим способом, известным в данной области, для генерирования химерных антител является гомологичная рекомбинация (например, патент США № 5482856).
Химерное антитело не человек/человек может быть дополнительно генетически сконструировано
- 18 015166 для создания гуманизированного антитела. Такое гуманизированное антитело может содержать множество СЭР. полученных из иммуноглобулина вида млекопитающего, не являющегося человеком, по меньшей мере одну вариабельную каркасную область и по меньшей мере одну константную область иммуноглобулина человека. Применимые стратегии для конструирования гуманизированных антител могут включать, например, для иллюстрации, а не для ограничения, идентификацию вариабельных каркасных областей человека, которые являются наиболее гомологичными относительно каркасных областей не человека химерного антитела. Не желая связывать себя теорией, авторы считают, что такая стратегия может увеличивать вероятность того, что это гуманизированное антитело будет сохранять специфическую связывающую аффинность в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка, которая в некоторых предпочтительных вариантах осуществления может быть по существу такой же аффинностью в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка или его варианта или фрагмента, а в некоторых вариантах осуществления может быть более высокой аффинностью в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка. См., например, 1оие8 е! а1., 1986 №1игс 321:522-25; КлесЕтаип е! а1., 1988 №11иге 332:323-27. Таким образом, конструирование такого гуманизированного антитела может включать определение конформаций петель СОЕ и структурных детерминант вариабельных областей не человека, например компьютерным моделированием, и затем сравнение петель и детерминант СОЕ с известными структурами петель и детерминантами СОК человека. См., например, Раб1ап е! а1., 1995 ЕА8ЕВ 9:133-39; СНобиа е! а1., 1989 Юинге, 342:377-383. Компьютерное моделирование может быть также использовано для сравнения структурных шаблонов человека, выбранных по гомологии последовательности, с вариабельными областями не человека. См., например, Ва)ога111 е! а1., 1995 ТНег. Iттиηο1. 2:95-103; ЕР-0578515-А3. Если гуманизация этих СОК не человека приводит к уменьшению аффинности связывания, компьютерное моделирование может способствовать идентификации специфических аминокислотных остатков, которые могли бы быть изменены способами сайт-направленного или иного мутагенеза для частичного, полного или супраоптимального (т.е. увеличение до уровня, большего, чем уровень негуманизированного антитела) восстановления аффинности. Специалисты с обычной квалификацией в данной области знакомы с этими способами и смогут легко понять многочисленные вариации и модификации в отношении таких стратегий конструирования.
Один подобный способ получения гуманизированного антитела называют облицовкой. В данном контексте термины облицованные ЕЕ и рекомбинантно облицованные ЕЕ относятся к селективной замене остатков ЕЕ, например, из У-области тяжелой или легкой цепи грызуна, остатками ЕЕ человека для обеспечения ксеногенной молекулы, содержащей антигенсвязывающий сайт, который сохраняет по существу всю структуру укладки нативного полипептида ЕЕ. Способы облицовки основаны на понимании того, что характеристики связывания лиганда антигенсвязывающего сайта определяются прежде всего структурой и относительным расположением наборов СОЕ тяжелой и легкой цепей на антигенсвязывающей поверхности. Эа/ех е! а1., Апп. Ееу. ВюсНеш. 59:439-73, 1990.
Таким образом, антигенсвязывающая специфичность может быть сохранена в гуманизированном антителе только при тщательном поддержании структур СОЕ, их взаимодействия друг с другом и их взаимодействия с остальными доменами вариабельной (V) области. С использованием способов облицовки ЕЕ-остатки наружной части (например, доступные для растворителя), с которыми легко сталкивается иммунная система, селективно заменяют остатками человека для обеспечения гибридной молекулы, которая содержит либо слабо иммуногенную, либо, по существу, неиммуногенную облицованную поверхность.
Способ облицовки использует доступные данные о последовательности вариабельных областей антитела человека, собранные КаЬа! е! а1., ίη 8ес.|иепсе5 о£ РгсИенъ о£ [ттипо1од1са1 Шегек!, 4'1' еб, (и.8. Пер!. о£ НеаНН апб НитаЬ 8егуюе5, и.8. Соуегптеп! Ргтбпд 0йюе, 1987), усовершенствования в отношении базы данных КаЬа! и других и.8. и иностранных баз данных (как нуклеиновых кислот, так и белков). Доступность для растворителя аминокислот У-области может быть расшифрована из известной трехмерной структуры фрагментов антител человека и мыши. Сначала ЕЕ этих вариабельных доменов представляющей интерес молекулы антитела сравнивают с соответствующими ЕЕ-последовательностями вариабельных областей человека, полученных из вышеуказанных источников. Затем наиболее гомологичные У-области человека сравнивают остаток за остатком с соответствующими мышиными аминокислотами. Остатки в мышиных ЕЕ, которые отличаются от копии человека, заменяют остатками, присутствующими в соответствующей области человека, с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных в данной области. Переключение остатка проводят только с частями, которые, по меньшей мере, частично являются экспонированными (доступными для растворителя), и соблюдают осторожность в замене аминокислотных остатков, которые могут иметь значимое влияние на третичную структуру доменов У-области, таких как пролин, глицин и заряженные аминокислоты.
Таким образом, полученные облицованные антигенсвязывающие сайты конструируют для сохранения СПЕ-остатков грызунов, остатков, по существу, примыкающих к СПИ, остатков, идентифицированных как скрытые или в основном скрытые (недоступные для растворителя), остатков, которые, как считается, участвуют в нековалентных (например, электростатических или гидрофобных) контактах между доменами тяжелых и легких цепей, и остатков из консервативных структурных областей ЕЕ, кото
- 19 015166 рые, как считается, влияют на канонические третичные структуры петель СОЯ. Затем эти критерии конструирования используют для получения рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, которые объединяют СОЯ как тяжелой, так и легкой цепи антигенсвязывающего сайта в РЯ, похожие на РЯ человека, которые могут быть использованы для трансфекции клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител человека, которые проявляют антигенную специфичность молекулы антитела грызуна.
Дополнительным способом отбора антител, которые специфически связываются с ТОР-бетасвязывающим белком или его вариантом или фрагментом, является фаговый дисплей. См., например, ХУйНег е! а1., 1994 Аппи. Яеу. Iттиηο1. 12:433-55; Вийоп е! а1., 1994 Абу. Iттиηο1. 57:191-280. Комбинаторные библиотеки генов вариабельной области иммуноглобулина человека и мыши могут быть созданы в векторах-фагах, которые могут быть подвергнуты скринингу для отбора 1д-фрагментов (РаЬ, Ру, зРу или их мультимеров), которые связываются специфически с ТОР-бета-связывающим белком или его вариантом или фрагментом. См., например, Патент США № 5223409; Низе е! а1., 1989 8с1епсе 246:12751281; Ь. 8аз!гу е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А 86:5728-5732 (1989); АШпд-Меез е! а1., 8!та!ед1ез ш Мо1еси1аг Вбо§у 3:1-9 (1990); Капд е! а1., 1991 Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 88:4363-66; НоодепЬоот е! а1., 1992 1. Мо1ес. Вю1. 227:381-388; 8сЬ1еЬизЬ е! а1., 1997 НуЬпбота 16:47-52 и ссылки в них. Например, библиотека, содержащая множество полинуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты вариабельной облести 1д, может быть встроена в геном нитевидного бактериофага, такого как М13, или его варианта, в рамке считывания с последовательностью, кодирующей белок оболочки фага. Слитым белком может быть слияние белка оболочки с доменом вариабельной области легкой цепи и/или с доменом вариабельной области тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам осуществления РаЬ-фрагменты иммуноглобулина могут быть также представлены на частице фага (см., например, патент США № 5698426).
Экспрессионные библиотеки кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина могут быть также приготовлены в фаге лямбда, например, с использованием векторов А1ттиηοΖар™(Н) и А1ттипоΖ;ψ™(Ε) (8!га!адепе, Ьа 1о11а, СаШотша). Вкратце, мРНК выделяют из популяции В-клеток и используют для создания экспрессионных библиотек кДНК тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина в векторах А1ттиηοΖар(Н) и А1ттиηοΖар(^). Эти векторы могут быть подвергнуты скринингу индивидуально или ко-экспрессированы для образования РаЬ-фрагментов или антител (см. Низе е! а1., зирга; см. также 8аз!ту е! а1., зирга). Затем положительные бляшки могут быть превращены в нелитическую плазмиду, кторая делает возможным высокий уровень экспрессии фрагментов моноклональных антител из Е. сой.
Подобным образом, части или фрагменты, такие как РаЬ- и Ру-фрагменты, антител могут быть также сконструированы с использованием общепринятого ферментативного расщепления или способов рекомбинантных ДНК для включения вариабельных областей гена, который кодирует антитело, специфическое в отношении ТОР-бета-связывающего белка. В одном варианте осуществления эти гены, которые кодируют вариабельную область из гибридомы, продуцирующей представляющее интерес моноклональное антитело, амплифицируют с использованием нуклеотидных праймеров. Эти праймеры могут быть синтезированы специалистом с обычной квалификацией в данной области или могут быть куплены из коммерчески доступных источников. (См., например, 8!га!адепе (Ьа 1о11а, Са1йотша), которая продает праймеры для вариабельных областей иммуноглобулина мыши и человека, среди прочих, праймеры для областей УНа, УНЬ, УНс, УНб, СН1, Уь и Сь). Эти праймеры могут быть использованы для амплификации вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, которые затем могут быть встроены в векторы, такие как IттиηοΖАР™ Н или IттиηοΖАР™ Ь (8!га!адепе), соответственно. Затем эти векторы могут быть введены в Е. сой, дрожжи или системы на основе млекопитающего для экспрессии. С использованием этих способов могут быть получены большие количества одноцепочечного белка, содержащего слияние доменов УН и Уь (см. Вйб е! а1., 8с1епсе 242:423-426, 1988). Кроме того, такие способы могут быть использованы для гуманизации У-области животного, не являющегося человеком, без изменения, связывающей специфичности этого антитела.
В некоторых конкретных вариантах осуществления данного изобретения комбинаторные фаговые библиотеки могут быть также использованы для гуманизации вариабельных областей не человека. См., например, Яозок е! а1., 1996 1. Вю1. С1ет. 271:22611-18; Яабег е! а1., 1998, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 95:8910-15. Фаговая библиотека может быть подвергнута скринингу для отбора представляющей интерес вариабельной области 1д с использованием способов иммунодетектирования, известных в данной области и описанных здесь, и таким образом может быть отобрана ДНК-последовательность встроенного в фаг гена иммуноглобулина с использованием стандартных способов. См. 8атЬгоок е! а1., 2001 Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог Ргезз. Затем выбранная 1д-кодирующая последовательность может быть клонирована в другой подходящий вектор для экспрессии этого 1д-фрагмента или, необязательно, может быть клонирована в вектор, включающий константные области 1д, для экспрессии полных цепей иммуноглобулина.
В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение предусматривает 8О8Тспецифические антитела, которые являются мультимерными фрагментами антител. Применимые мето
- 20 015166 дологии описаны в общем, например, в Науйеп е! а1., 1997, Сигг Орт. Iттиηо1. 9:201-12; Со1ота е! а1., 1997 №1. Вю!ес1то1. 15:159-63). Например, мультимерные фрагменты антител могут быть получены фаговыми способами с образованием миниантител (патент США № 5910573) или диантител (НоШдет е! а1., 1997, Сапсег Iттиηо1. [ттппо!кег. 45:128-130).
В некоторых вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении 8О8Т, может быть антителом, которое экспрессируется в виде внутриклеточного белка. Такие внутриклеточные антитела называют также интрателами, и они могут содержать ЕаЬ-фрагмент или предпочтительно содержать ксЕт-фрагмент (см., например, БесегГ е! а1., Ргос. Ыа!1. Асай. δα. ϋδΆ 98:4764-49 (2001). Каркасные области, фланкирующие СЭЯ-районы, могут быть модифицированы для улучшения уровней экспрессии и растворимости интратела в интрацеллюлярной стесненной среде (см., например, \Уогп е! а1., 1. Вю1. СИет. 275:2795-803 (2000). Интратело может быть направлено в конкретные клеточные местоположение или органеллу, например, конструированием вектора, который содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области интратела, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует конкретный антиген-мишень в этой клетке (см., например, Стаик-Ройа е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 15:1182-91 (1995); Ьепет е! а1., Еиг. 1. Вюсйет. 267:1196205 (2000)). Интратело может быть введено в клетку различными способами, доступными для квалифицированного специалиста, в том числе с использованием вектора генотерапии или липидной смеси (например, Ртотесйп™, изготовляемого Епдепех СогрогаЕоп. 8ап Э1едо, СА), или в соответствии с фотохимическими способами интернализации.
Введение аминокислотных мутаций в молекулу иммуноглобулина, специфического в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка, может быть полезным для увеличения специфичности или аффинности ТСЕ-бета-связывающего белка или изменения эффекторной функции. Иммуноглобины с более высокой аффинностью в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка могут быть генерированы сайт-направленным мутагенезом конкретных остатков. Трехмерное молекулярное моделирование при помощи компьютера может быть использовано для идентификации аминокислотных остатков, которые должны быть изменены для улучшения аффинности в отношении ТСЕ-бета-связывающего белка. См., например, Моип!ат е! а1., 1992, Вю!есЬпо1. Сепе!, Епд, Яет. 10: 1-142. Альтернативно, комбинаторные библиотеки СЭЯ могут быть генерированы в фаге М13 и подвергнуты скринингу на фрагменты иммуноглобулина с улучшенной аффинностью. См., например, С1акег е! а1., 1992, 1. Iттиηо1. 149:3903-3913; ВагЬак е! а1., 1994 Ргос. Ыа!1. Асай. 8οΐ. И8А 91:3809-13; Патент США № 5792456.
Эффекторные функции могут быть также изменены сайт-направленным мутагенезом. См., например, Эппсам е! а1., 1988 Ыа!иге 332:563-64; Могдап е! а1., 1995 Iттиηо1оду 86:319-24; Ед11!ейагхейе11Копйп е! а1., 1997 Вю!ес11пк.|иек 23:830-34. Например, мутация сайта гликозилирования на Ес-части иммуноглобулина может изменять способность этого иммуноглобулина фиксировать комплемент. См., например, \Упд11! е! а1., 1997 Тгепйк Вю!ес11по1. 15:26-32. Другие мутации в доменах константной области могут изменять способность иммуноглобулинов фиксировать комплемент или осуществлять антителозависимую клеточную цитотоксичность. См., например, Эипсап е! а1., 1988 №1!иге 332:563-64; Могдап е! а1., 1995 Iттиηо1оду 86:319-24; 8епке1 е! а1., 1997 Мо1. Iттиηо1. 34:1019-29.
Согласно некоторым вариантах осуществления вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, не человека, человека или гуманизированные, любой из описанных здесь 1д-молекул могут быть сконструированы в виде одноцепочечных Ет (ксЕт)-фрагментов (одноцепочечных антител). См., например, Вий е! а1., 1988 8аепсе 242:423-426; Ник!оп е! а1., 1988, Ргос. ЫаЙ. Асай. δα. И8А 85:5879-5883. Мультифункциональные ксЕт-слитые белки могут быть генерированы связыванием полинуклеотидной последовательности, кодирующей ксЕт-полипептид, в рамке считывания по меньшей мере с одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей любой из различных известных эффекторных белков. Эти способы известны в данной области и описаны, например, в ЕР-В1-0318554, патенте США № 5132405, патенте США № 5091513 и патенте США № 5476786. В качестве примера, эффекторные белки могут включать последовательности константной области иммуноглобулина. См., например, Но11епЬаидИ е! а1., 1995 1. Тттипо1. Ме!1ойк 188:1-7. Другими примерами эффекторных белков являются ферменты. В качестве неограничивающего примера, такой фермент может обеспечивать биологическую активность для терапевтических целей (см., например, 81ететк е! а1., 1997 Вюсопщд. СИет. 8:510-19) или могут обеспечивать детектируемую активность, такую как катализируемое пероксидазой хрена превращение любого из хорошо известных субстратов в детектируемый продукт, для диагностических целей. Другие примеры слитых ксЕт-белков включают слияния 1д-токсина или иммунотоксинов, в которых ксЕт-полипептид слит с токсином.
ксЕт-фрагмент или любой описанный здесь фрагмент антитела может, в некоторых вариантах осуществления, быть слит с пептидным или полипептидным доменом, который делает возможным детектирование специфического связывания между этим слитым белком и антигеном (например, ТСЕ-бетасвязывающим белком). Например, домен слитого полипептида может быть полипептидом аффинной метки для детектирования связывания слитого ксЕт-белка с ТСЕ-бета-связывающим белком любым из различных способов, которые известны специалисту с квалификацией в данной области. Примеры пептидной метки включают авидин, стрептавидин или Н1к (например, полигистидин). Способы детектиро
- 21 015166 вания могут также включать, например, связывание слитого с авидином или стрептавидином белка с последовательностью биотина или миметика биотина (см., например, Ьио е! а1., 1998 1. Вю!есЬпо1. 65:225 и ссылки в этой статье), прямую ковалентную модификацию слитого белка детектируемой частью (например, метящей частью), нековалентное связывание слитого белка со специфически меченой репортерной молекулой, ферментативную модификацию детектируемого субстрата слитым белком, которая включает часть, имеющую ферментативную активность, или иммобилизацию (ковалентную или нековалентную) слитого белка на подложке из твердой фазы. Другие применимые аффинные полипептиды для конструирования слитых ксЕу-белков могут включать слитые со стрептавидином белки, описанные, например, в АО 89/03422, патенты США с номерами 5489528, 5672691, АО 93/24631, патенты США 5168049, 5272254; слитые с авидином белки (см., например, ЕР 511747); фермент, такой как глутатион-5трансфераза; и полипептид белка А 8!арйу1ососсик аитеик.
Полинуклеотиды, кодирующие антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с ТОЕ-бета-связывающим белком, описанным здесь, могут быть размножены и экспрессированы в соответствии с любой из различных хорошо известных процедур разрезания, лигирования, трансформации и трансфекции нуклеиновых кислот с использованием любого количества известных экспрессирующих векторов. Так, в некоторых вариантах осуществления экспрессия фрагмента антитела может быть предпочтительной в прокариотическом хозяине, таком как ЕксйейсЫа сой (см., например, Р1иск!йип е! а1., 1989 Ме1йобк Епхушо1. 176:497-515). В некоторых других вариантах осуществления может быть предпочтительной экспрессия антитела или его фрагмента в эукариотической клетке-хозяине, в том числе в дрожжах (например, 8ассйатотусек сетеуШае, 8сЫ7окассйатотусек рошЬе и РкЫа рак!ойк), клетках животных (в том числе клетках млекопитающих) или клетках растений. Примеры подходящих клеток животных включают, но не ограничиваются ими, миелому (например, мышиную клеточную линию N80), клетки СО8, СНО или гибридомные клетки. Примеры клеток растений включают клетки табака, кукурузы, сои и риса.
Один или несколько реплицируемых экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую вариабельную и/или константную область, могут быть получены и использованы для трансформации подходящей клеточной линии, например непродуцирующей линии клеток миеломы, такой как мышиная линия МО, или бактериальной линии, такой как Е. сой, в которых будет происходить продуцирование этого антитела. Для получения эффективной транскрипции и трансляции ДНК-последовательность в каждом векторе должна включать подходящие регуляторные последовательности, в частности промоторную и лидерную последовательность, функционально связанные с последовательностью вариабельного домена. Конкретные способы получения антител таким путем обычно хорошо известны и рутинно используются. Например, основные процедуры молекулярной биологии описаны Машайк е! а1., (Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2'1. еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬотаГогу, №е\т Уотк, 1989, см. также Машайк е!. а1., 3пб. еб., Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотаГогу, №е\т Уотк, (2001)); секвенирование ДНК может выполняться, как описано 8апдег е! а1. (Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 74: 5463, (1977)) и Атеткйат 1п1етпайопа1 р1с кедиепсш^ йапбЬоок; сайт-направленный мутагенез может проводиться в соответствии со способами, известными в данной области техники (Кгатег е! а1., №ис1е1с Ас1бк Кек. 12:9441, (1984); 1йе Апдйап Вю!есйпо1оду Ыб йапбЬоок; Кипке1 Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 82:488-92 (1985); Кипке1 е! а1., Ме1йобк ш Епхуто1. 154:367-82 (1987). Кроме того, многочисленные публикации описывают способы, подходящие для получения антител манипуляцией ДНК, создание экспрессирующих векторов и трансформацию подходящих клеток, например, как описано в обзоре Моип1аш А апб Абай, 1 К ш Вю!есйпо1оду апб Оепейс Епдшеейпд Ве\зе\ук (еб. ТотЬк, М Р, 10, Сйар!ет 1, 1992, 1п!егсер!, Апбоует, ИК) и в Международной заявке на патент АО 91/09967.
В некоторых вариантах осуществления антитело в соответствии с данным изобретением может иметь одну или несколько эффекторных или репортерных молекул, присоединенных к нему. Репортерной молекулой может быть детектируемая часть или метка, такая как фермент, цитотоксичный агент или другая репортерная молекула, в том числе, краситель, радионуклид, люминесцентная группа, флуоресцентная группа или биотин или т.п. Специфические в отношении ТОЕ-бета-связывающего белка иммуноглобулин или его фрагмент могут быть радиоактивно помечены для диагностических или терапевтических применений. Способы радиоактивного мечения антител известны в данной области. См., например, Абатк 1998 1п У1уо 12:11-21; НШипеп 1993 Ас!а Опсо1. 32:831-9. Терапевтические применения описаны более подробно ниже и могут включать использование специфического в отношении ТОЕ-бетасвязывающего белка антитела (или его фрагмента) вместе с другими терапевтическими агентами. Эффекторная или репортерная молекулы могут быть присоединены к антителу через любую доступную боковую цепь аминокислоты, концевую аминокислоту или через углеводную функциональную группу, расположенную в этом антителе, когда она присутствует, при условии, что это присоединение или процесс присоединения не оказывает неблагоприятного влияния на связывающие свойства и применимость этой молекулы. Конкретные функциональные группы включают, например, любую свободную амино-, имино-, тиол-, гидрокси-, карбоксильную или альдегидную группу. Соединение антитела и эффекторной и/или репортерной молекулы (молекул) может быть достигнуто через такие группы и подходящую функциональную группу в этих эффекторных или репортерных молекулах. Эта связь может быть прямой
- 22 015166 или непрямой через спейсерные или мостиковые группы.
Эффекторные молекулы включают. например. противоопухолевые агенты. токсины (такие как ферментативно активные токсины бактериального (например. экзотоксин А Ркеиботопак аегидтока) или растительного происхождения и их фрагменты (например. рицин и его фрагменты; гелонин растений. бриодин из Вгуоша бююа. или т.п. См.. например. ТНгикН е1 а1.. 1996 Аппи. Кеу. 1ттипо1. 14: 49-71; Егапке1 е1 а1.. 1996 Сапсег Кек. 56:926-32). Дополнительные эффекторные молекулы включают биологически активные белки (например. ферменты). нуклеиновые кислоты и их фрагменты; встречающиеся в природе и синтетические полимеры. например полисахариды и полиалкиленовые полимеры. такие как поли(этиленгликоль). и их производные. радионуклиды. в частности радиоиодид; и хелатированные металлы. Подходящие репортерные группы включают хелатированные металлы. флуоресцентные соединения или соединения. которые могут быть детектированы при помощи ЯМР или ЭПР-спектроскопии. Особенно применимыми эффекторными группами являются калихаемицин и его производные (см.. например. 8ои111 АГпсап Ра1еп1 8рес1йсайопк 85/8794. 88/8127 и 90/2839).
Многочисленные другие токсины. в том числе химиотерапевтические агенты. антимитотические агенты. антибиотики. индукторы апоптоза (или апоптогены. см.. например. Сгееп апб Кееб. 1998. 8с1епсе 281:1309-1312) или т.п. известны лицам. знакомым с данной областью. и примеры. обеспеченные здесь. предназначены для иллюстрации без ограничения объема и идеи данного изобретения. Конкретные противоопухолевые агенты включают цитотоксические и цитостатические агенты. например алкилирующие агенты. такие как азотные аналоги горчичного газа (например. хлорамбуцил. мелфалан. мехлорэтамин. циклофосфамид или урацилиприт) и их производные. триэтиленфосфорамид. триэтилентиофосфорамид. бусульфан или цисплатин; антиметаболиты. такие как метотрексат. фторурацил. флоксуридин. цитарабин. меркаптопурин. тиогуанин. фторуксусная кислота или фторлимонная кислота. антибиотики. такие как блеомицины (например. блеомицина сульфат). доксорубицин. даунорубицин. митомицины (например. митомицин С). актиномицины (например. дактиномицин). пликамицин. калихаемицин и его производные. или эсперамицин и его производные; митотические ингибиторы. такие как этопозид. винкристин или винбластин и их производные; алкалоиды. такие как эллиптицин; полиолы. такие как таксицин-1 или таксицин-ΙΙ; гормоны. такие как андрогены (например. дромостанолон или тестолактон). прогестины (например. мегестрола ацетат или медроксипрогестерона ацетат). эстрогены (например. диметилстилбестрола дифосфат. полиэстрадиола фосфат или эстрамустина фосфат) или антиэстрогены (например. тамоксифен); антрахиноны. такие как митоксантрон. мочевины. такие как гидроксимочевина; гидразины. такие как прокарбазин; или имидазолы. такие как дакарбазин.
Хелатированные металлы. применимые в качестве эффекторных молекул. включают хелаты ди- или триположительных металлов. имеющих координационное число от 2 до 8. включительно. Конкретные примеры таких металлов включают технеций (Тс). рений (Ке). кобальт (Со). медь (Си). золото (Аи). серебро (Ад). свинец (РЬ). висмут (В1). индий (1п). галлий (Са). иттрий (Υ). тербий (ТЬ) гадолиний (Сб) и скандий (8с). Обычно этот металл предпочтительно является радионуклидом. Конкретные радионуклиды включают 99тТс. 186Ке. 188Ке. 58Со. 60Со. 67Си. 195Аи. 199Аи. 110Ад. 203РЬ. 206В1. 207В1. 1п. 67Са. 68Са. 88Υ. 90Υ. 160ТЬ. 153Сб и 478с. Хелатированным металлом может быть. например. один из вышеуказанных типов металла. хелатированных любым подходящим полидентатным хелатообразующим агентом. например ациклическими или циклическими полиаминами. простыми полиэфирами (например. кроун-эфирами и их производными); полиамидами; порфиринами и карбоциклическими производными. Обычно. тип хелатообразующего агента будет зависеть от используемого металла. Однако одной особенно применимой группой хелатообразующих агентов в конъюгатах по данному изобретению являются ациклические и циклические полиамины. особенно полиаминокарбоновые кислоты. например диэтилентриаминпентауксусная кислота и ее производные. и макроциклические амины. такие как циклические триазасоединения и тетраазапроизводные (например. описанные в Международной заявке на патент Х0 92/22583) и полиамиды. в частности дезферриоксамин и его производные.
При использовании тиоловой группы в антителе в качестве точки присоединения эфекторная молекула может быть присоединена посредством реакции с тиоловой реактивной группой. присутствующей в эффекторной или репортерной молекуле. Примеры таких групп включают α-галогенкарбоновую кислоту или эфир. такой как иодацетамид. имид. такой как малеимид. винилсульфон или дисульфид. Эти и другие подходящие процедуры связывания описаны в общем виде и более конкретно в международных заявках на патент Х0 93/06231. Х0 92/22583. Х0 90/091195 и Х0 89/01476.
Данное изобретение предусматривает также генерирование антиидиотипических антител. которые узнают антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент). которое специфически связывается с полипептидом 808Т. обеспеченным здесь. или его вариантом или фрагментом. Антиидиотипические антитела могут быть генерированы в виде поликлональных антител или моноклональных антител способами. описанными здесь. с использованием антитела против ТСЕ-бета-связывающего белка (или его антигенсвязывающего фрагмента) в качестве иммуногена. Антиидиотипические антитела или их фрагменты могут быть также генерированы любым из рекомбинантных способов генной инженерии. описанных выше. или отбором с использованием фагового дисплея. Антиидиотипическое антитело может реагировать с антигенсвязывающим сайтом анти-808Т-антитела таким образом. что связывание этого антитела с по
- 23 015166 липептидом 8О8Т конкурентно ингибируется. Альтернативно, антиидиотипическое антитело, обеспеченное здесь, может не ингибировать конкурентно связывание антитела против ТОР-бета-связывающего белка с ТОР-бета-связывающим белком.
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело, которое специфически связывается с 8О8Т, может быть использовано для детектирования экспрессии полипептида 8О8Т. В некоторых конкретных вариантах осуществления одно антитело или панель антител могут быть экспонированы клеткам, которые экспрессируют полипептид 8О8Т, и экспрессия полипептида 8О8Т может быть определена детектированием с использованием другого 8О8Т-специфического антитела, которое связывается с другим эпитопом, чем антитело или антитела, используемые сначала в этом анализе.
Анализы для отбора агентов, которые увеличивают плотность кости
Как обсуждалось выше, данное изобретение обеспечивает способы отбора и/или выделения агентов, которые способны увеличивать плотность кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления этот агент является антителом, которое специфически связывается с 8О8Т (ТОР-бетасвязывающим белком) или его вариантом или фрагментом. Например, в одном аспекте данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) контактирования или смешивания кандидатного агента с ТОР-бетасвязывающим белком и членом белков ТОР-бета-семейства, (Ь) определения, стимулирует ли этот кандидатный агент передачу сигнала ТОР-бета-семейством белков или нарушает или ингибирует связывание ТОР-бета-связывающего белка с одним или несколькими членами ТОР-бета-семейства белков. В некоторых вариантах осуществления этот агент усиливает способность ТОР-бета функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения обеспечен способ идентификации антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ТОР-бета, предусматривающий контактирование антитела, которое специфически связывается с полипептидом 8О8Т, с пептидом 8О8Т, в том числе, но не только, с описанными здесь пептидами, при условиях и в течение времени, достаточных для создания возможности образования комплекса антитело плюс (+) 8О8Т (антитело/8О8Т), и затем детектирование уровня (например, определения количества) комплекса 8О8Т/антитело для определения присутствия антитела, которое модулирует путь передачи сигнала ТОР-бета. Этот способ может выполняться с использованием 8РВ или любого числа других иммуноанализов, известных в данной области и описанных здесь, в том числе ЕЫ8А, иммуноблоттинга или т.п. Путь передачи сигнала ТОР-бета включает путь передачи сигнала, при помощи которого ВМР связывается с рецептором типа I и рецептором типа II на клетке для стимуляции или индукции пути, который модулирует минеральное содержание кости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с 8О8Т, стимулирует или усиливает путь для увеличения минерального содержания кости. Такое антитело может быть идентифицировано с использованием описанных здесь способов для детектирования связывания антитела с 8О8Т-специфическими пептидами.
Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антител, которые нарушают, ингибируют (в том числе конкурентно ингибируют) или предотвращают связывание ЕМР с полипептидом 8О8Т, детектированием, связывается ли антитело с пептидами 8О8Т, которые находятся в районах или частях районов на 8О8Т, с которыми связывается ВМР, таких как пептиды на аминоконцевой стороне 8О8Т, и пептиды, которые включают амино-концевые аминокислотные остатки и часть внутреннего района (боскшд соге) 8О8Т (например, 8Е0 ΙΌ NО:2-19, 21-28 и 47-50). Способы данного изобретения могут быть также использованы для идентификации антитела, которое нарушает, предотвращает или ингибирует образование гомодимеров 8О8Т. Такое антитело, которое связывается специфически с 8О8Т, может быть идентифицировано детектированием связывания этого антитела с пептидами, которые произведены из внутренней части или карбокси-концевого района 8О8Т (например, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:29-46 и 51-54).
В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) контактирования кандидатного агента с клетками, которые экспрессируют ТОР-бета-связывающий белок, и (Ь) определения, уменьшается ли экспрессия ТОР-бета-связывающего белка в экспонированных клетках или уменьшается ли активность ТОР-бета-связывающего белка, и определения посредством этого, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. В одном варианте осуществления клетки могут включать спонтанно трансформированные или нетрансформированные клетки нормальной кости человека из биопсии человека или остеобластов теменной кости крысы.
Для детектирования и количественного определения экспрессии ТОР-бета-связывающего белка могут быть использованы иммуноанализы, например противоточный иммуно-электрофорез (С1ЕР), радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А), иммуноблот-анализы, такие как дот-блот-анализы и Вестерн-блоты, анализы ингибирования или конкурентные анализы и сэндвич-анализы (см. патенты США с номерами 4376110 и 4486530; см. также Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬота!оту Мапиа1, кирга). Такие иммуноанализы могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении ТОР-бета-связывающего белка, такое как описанные здесь антитела про
- 24 015166 тив склеростина, или могут использовать антитело, которое является специфическим в отношении репортерной молекулы, которая присоединена к ТОЕ-бета-связывающему белку. Уровень экспрессии полипептида может быть также определен определением количества ТОЕ-бета-связывающего белка, которое связывается с лигандом ТОЕ-бета-связывающего белка. Например, связывание склеростина в пробе с ВМР может быть детектировано с использованием резонанса поверхностных плазмонов (8РЯ). Альтернативно, может быть количественно определен уровень экспрессии мРНК, кодирующей специфический ТОЕ-бета-связывающий белок.
В других вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении 808Т, может быть использовано в таком способе, как конкурентный анализ, в котором кандидатные агенты подвергают скринингу для идентификации агента, который будет конкурировать с антителом за связывание с ТОЕ-бетасвязывающим белком. Взаимодействие между антителом и ТОЕ-бета-белком может быть определено с использованием способов иммуноанализа, известных в данной области и описанных здесь.
В качестве примера член семейства ТОЕ-бета-суперсемейства, такой как ТОЕ-бета-связывающий белок, или член ТОЕ-бета-суперсемейства, который является лигандом ТОЕ-бета-связывающего белка, сначала связывают с твердой фазой с последующим добавлением кандидатного агента. Лиганд члена ТОЕ-бета-суперсемейства, связанного с твердой фазой, добавляют одновременно или добавляют в последующей стадии, твердую фазу промывают и определяют количество лиганда, которое связано с членом этого семейства, которое указывает, блокирует ли этот кандидатный агент связывание лиганда с ТОЕ-бета-членом. Альтернативно, лиганд члена ТОЕ-бета-суперсемейства может быть присоединен к твердой фазе, а член ТОЕ-бета-суперсемейства может быть добавлен одновременно или последовательно с добавлением кандидатной молекулы. Количество лиганда, которое связывается с членом ТОЕ-бетасуперсемейства, может быть измерено мечением лиганда детектируемой молекулой в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Альтернативно, связывание лиганда с членом ТОЕ-бета-суперсемейства может быть измерено добавлением одной или нескольких детектирующих молекул, таких как антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с лигандом, и определением количества молекулы, которая связывается с лигандом. Агентами, которые пригодны для применения в увеличении минерального содержания кости, описанного здесь, являются агенты, которые уменьшают связывание ТОЕ-бета-связывающего белка с его лигандом, который является членом ТОЕ-бета-суперсемейства, статистически значимым образом.
В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадии (а) контактирования кандидатного агента с клетками, которые экспрессируют ТОЕ-бета-белок, и (Ь) определения, изменяется ли активность ТОЕ-бета-связывающего белка из экспонированных клеток, и определения посредством этого, способно ли это соединение увеличивать минеральное содержание кости. Подобно описанным здесь способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки изменений в экспрессии ТОЕ-бета-связывающего белка при подвергании клетки, продуцирующей ТОЕ-бетасвязывающий белок, действию выбранного тест-соединения.
В другом варианте осуществления данного изобретения обеспечены способы для определения, способен ли агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие (а) контактирование кандидатного агента с ТОЕ-бета-связывающим белком и выбранным членом ТОЕ-бета-семейства белков и (Ь) определение, увеличивает ли выбранный агент передачу сигнала ТОЕ-бета-семейства белков или ингибирует ли связывание ТОЕ-бета-связывающего белка с членом ТОЕ-бета-семейства. В некоторых вариантах осуществления эта молекула усиливает способность члена ТОЕ-бета-семейства функционировать в качестве положительного регулятора дифференцировки мезенхимальных клеток.
Подобно вышеописанным способам большое разнообразие способов может быть использовано для оценки стимуляции члена ТОЕ-бета-семейства тест-соединением, таким как антитело, которое специфически связывается с 808Т. Один такой репрезентативный способ (см. также ЭшНат е! а1., Еийо. 136:1374-1380) предусматривает присоединение члена ТОЕ-бета-семейства, такого как ВМР (например, ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7) к твердой фазе при концентрации, эквивалентной его Кс. Константа диссоциации (Кс) может быть определена в соответствии со способами измерения констант скорости связывания, известными в данной области, такими как резонанс поверхностных плазмонов с использованием прибора Вюсоге, в соответствии со способами, известными в данной области техники описанным производителем (Вюкеиког, Р18са!а^ау, N1). Коллекцию кандидатных агентов-антагонистов добавляют затем при фиксированной концентрации (обычно 20 мкМ в случае коллекций малых органических молекул (выделенная органическая малая молекула обозначает в данном контексте, что эта молекула является более чем на 90% чистой, как определено способами, хорошо известными в данной области (например, ЯМР, точка плавления) и 1 мкМ для кандидатных антител). Агент считается антагонистом этого взаимодействия, когда этот агент ингибирует связывание ВМР с 808Т, т.е. наблюдают уменьшение уровня связывания по меньшей мере на 40%, предпочтительно 50 или 60%, и более предпочтительно на 80 или 90% по сравнению с уровнем связывания ВМР с 808Т, который наблюдают в отсутствие этого агента. Такой агент может быть оценен дополнительно в качестве потенциального ингибитора на основе исследований с титрованием, в соответствии с которыми определяют его константу ингибирования и его
- 25 015166 влияние на аффинность связывания ΤΟΡ-бета-связывающего белка. Могут также проводиться контрольные анализы сравнимой специфичности для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста посредством исследований с использованием анализов, зависимых от действия лиганда ВМР (например, конкурентное исследование с использованием ВМР/ВМР-рецептора).
В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы определения, способен ли кандидатный агент увеличивать минеральное содержание кости, предусматривающие стадию определения, ингибирует ли кандидатный агент связывание ΤΟΡ-бета-связывающего белка с костью или ее аналогом. В данном контексте должно быть понятно, что выражение кость или ее аналог относится к гидроксиапатиту или поверхности, состоящей из порошкообразной формы кости, измельченной кости или интактной кости. Подобно вышеописанным способам, большое разнообразие способов может быть использовано для оценки ингибирования локализации ΤΟΡ-бета-связывающего белка в костном матриксе (см., например, №со1ак е! а1., Са1с1£. Иззие Ιηΐ. 47:206-12 (1995)).
Хотя описанные здесь способы могут относиться к анализу индивидуального кандидатного агента, данное изобретение не должно ограничиваться таким образом. В частности, агент может содержаться в смеси кандидатных анентов. Как описано здесь, кандидатные агенты могут быть малыми органическими молекулами или могут быть антителами или их фрагментами или другими пептидами или полипептидами. Антитела или фрагменты могут быть идентифицированы скринингом библиотеки антител или фрагментов антител или получены описанными здесь способами. Таким образом, описанные способы могут дополнительно включать стадию выделения агента, который ингибирует связывание ΤΟΡ-бетасвязывающего белка с членом ΤΟΡ-бета-семейства.
В одном варианте осуществления данного изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом δ0δΤ, способны конкурентно ингибировать связывание члена ΤΟΡ-бета-семейства с полипептидом δΟδΤ. Способность антитела или фрагмента антитела нарушать или блокировать связывание члена ΤΟΡ-бета-семейства, такого как ВМР, с δΟδΤ может быть определена в соответствии с любым из описанных здесь способов. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с δΟδΤ, могут нарушать, блокировать или предотвращать связывание члена ΤΟΡ-бета-семейства с δΟδΤ нарушением образования гомодимеров склеростина. Антитело, которое специфически связывается с δΟδΤ, может быть также использовано для идентификации активности δΟδΤ по ингибированию или нарушению связывания δΟδΤ с ВМР. Альтернативно, это антитело или его фрагмент могут быть включены в анализ на основе клеток или в модель животного, в которых δΟδΤ имеет определенную активность, для определения, изменяет ли антитело (увеличивает или уменьшает статистически значимым образом) эту активность. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с δΟδΤ, могут быть использованы для испытания действия такого антитела в пути передачи сигнала и посредством этого модуляции (стимуляции или ингибирования) этого пути передачи сигнала. Предпочтительно, связывание антитела с δΟδΤ приводит к стимуляции или индукции пути передачи сигнала.
Получеие белков
Описанные здесь полипептиды включают ΤΟΡ-бета-связывающий белок склеростин и его варианты и антитела или их фрагменты, которые специфически связываются со склеростином. Полинуклеотиды, которые кодируют эти полипептиды, включают производные полинуклеотидов, которые являются по существу сходными с этими полинуклеотидами (и, при необходимости, с белками, в том числе пептидами и полипептидами, которые кодируются этими полинуклеотидами и их производными). В данном контексте, считается, что нуклеотидная последовательность является по существу сходной, если (а) эта нуклеотидная последовательность получена из кодирующего района описанных здесь полинуклеотидов и включает, например, части этой последовательности или аллельные вариации обсуждаемых выше последовательностей, или альтернативно, кодирует молекулу, которая ингибирует связывание ΤΟΡ-бетасвязывающего белка с членом ΤΟΡ-бета-семейства; (Ь) этот полинуклеотид способен гибридизоваться с обеспеченным здесь полинуклеотидом при умеренной, высокой или очень высокой жесткости (см. δатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг Οοηίη§: А ЬаЬога!огу Маша! 3η6 еб., Со1б δρππ§ НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, ΝΥ, 2001); и/или (с) эти полинуклеотидные последовательности являются вырожденными относительно последовательностей кодонов для конкретной аминокислоты полинуклеотидных последовательностей, описанных в (а) или (Ь). Далее, описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты включает как комплементарные, так и некомплементарные последовательности, при условии, что эти последовательности в остальном удовлетворяют приведенным здесь критериям. В контексте данного изобретения высокая жесткость означает стандартные условия гибридизации (например, 5хδδΡЕ, 0,5% ДСН при 55-65°С или эквивалентные условия, 5хδδΡЕ (1xδδΡЕ = 180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА (рН 7,7), 5х раствор Денхардта (100 х раствор Денхардта = 2% (масса/объем) бычий сывороточный альбумин, 2% (масса/объем) Фиколл, 2% (масса/объем) поливинилпирролидон) и 0,5% ДСН). Постгибридизационные промывки при высокой жесткости обычно выполняют в 0,5хδδС (1хδδС = 150 мМ хлорид натрия, 15 мМ тринатрийцитрат) или в 0,5 х δδΡЕ при 55-60°С.
Полинуклеотиды, кодирующие δΟδΤ, могут быть выделены из геномных или кДНК-библиотек, из
- 26 015166 клеток в биологической пробе. ткани или клеточных линиях и получены с использованием различных способов (см.. например. 8атЬгоок. кирга). Например. полинуклеотид может быть амплифицирован из кДНК. полученной из подходящей клетки или ткани. Эти полинуклеотиды могут быть амплифицированы полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием последовательность-специфических зондов. которые сконструированы на основе обеспеченных здесь последовательностей и которые могут быть куплены или синтезированы. Полинуклеотиды могут быть также получены скринингом кДНК-библиотек или библиотек геномных ДНК с использованием последовательность-специфических зондов и праймеров. Общие способы для скрининга библиотек с использованием ПЦР описаны. например. Уи е! а1.. Ике о£ !1е Ро1утегаке СЬахп Кеасбоп !о 8сгееп Р1аде ШЬгапек. т МеШобк Ш Мо1еси1аг Вю1оду. уо1. 15: РСК Рго!осо1к: Сиггеп! МеШобк апб АррКсабопк. \У1и!е (еб.). радек 211-215 (Нитапа Ргекк. Шс. 1993). Кроме того. способы использования ПЦР для выделения родственных генов описаны. например. Ргек!оп. Ике о£ Оедепега!е 0Ндогшс1ео!1бе Рптегк апб !1е Ро1утегаке Скат КеасРоп !о С1опе Оепе Еатбу МетЬегк. т Ме!1обк т Мо1еси1аг Вю1оду. уо1. 15: РСК Рго!осо1к: Сиггеп! Ме!1обк апб АррНсакопк. \С1и!е (еб.). радек 317-337 (Нитапа Ргекк. Шс. 1993).
Последовательность кДНК ТОЕ-бета-связывающего белка или геномного фрагмента ТОЕ-бетасвязывающего белка может быть определена с использованием стандартных способов. Кроме того. идентификация геномных фрагментов. содержащих промотор или регуляторный элемент ТОЕ-бетасвязывающего белка. может выполняться с использованием хорошо известных способов. таких как делеционный анализ (см.. в общем. АикиЬе1 (1995)).
В качестве альтернативы. полинуклеотид. кодирующий ТОЕ-бета-связывающий белок. может быть получен синтезом молекул ДНК с использованием взаимно праймирующих длинных олигонуклеотидов и нуклеотидных последовательностей. описанных здесь (см.. например. АикиЬе1 (1995). радек 8-8 -8-9). При использовании ПЦР в этом способе возможен синтез молекул ДНК с длиной по меньшей мере две т.п.н. (Абапд е! а1.. Р1ап! Мо1ес. Вю1. 21:1131. 1993; ВатЬо! е! а1.. РСК МеШобк апб АррНсаЕопк 2:266. 1993; ЭШоп е! а1.. Ике о£ !1е Ро1утегаке Скат Кеасбоп £ог !1е Кар1б Сопк!гис!юп о£ 8упШебс Оепек. Ш Ме!1обк ш Мо1еси1аг Вю1оду. Уо1. 15: РСК Рго!осо1к: Сиггеп! Ме!1обк апб Аррксабопк. \С1и!е (еб.). радек 263-268. (Нитапа Ргекк. Шс. 1993); Но1о\\'ас1и.1к е! а1.. РСК МеШобк Арр1. 4:299. 1995).
Молекулы нуклеиновых кислот. кодирующие вариантный ТОЕ-бета-связывающий белок. могут быть получены скринингом различных кДНК-библиотек или геномных библиотек полинуклеотидными зондами. имеющими нуклеотидные последовательности на основе 8ЕО ГО N0:55-57. 59. 61. 63. 65. 67 и
69. с использованием процедур. описанных здесь. Варианты полинуклеотидов ТОЕ-бета-связывающих белков могут быть также сконструированы синтетически. Например. может быть сконструирована молекула нуклеиновой кислоты. которая кодирует полипептид. имеющий консервативную аминокислотную замену. по сравнению с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:1. 20. 58. 60. 62. 64. 66. 68 или
70. То есть. могут быть получены варианты. которые содержат одну или несколько аминокислотных замен 8Е0 ГО N0:1. 20. 58. 60. 62. 64. 66. 68 или 70. в которых алкиламинокислотой заменена алкиламинокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка. ароматической аминокислотой заменена ароматическая аминокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бетасвязывающего белка. серусодержащей аминокислотой заменена серусодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка. гидроксисодержащей аминокислотой заменена гидроксисодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бетасвязывающего белка. кислотной аминокислотой заменена кислотная аминокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка. основной аминокислотой заменена основная аминокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка или двухосновной монокарбоновой аминокислотой заменена двухосновная монокарбоновая аминокислота в аминокислотной последовательности ТОЕ-бета-связывающего белка.
Среди обычных аминокислот. например. консервативная аминокислотная замена иллюстрируется заменой среди аминокислот в каждой из следующих групп: (1) глицин. аланин. валин. лейцин и изолейцин (неполярная содержащая алкильную группу боковая цепь); (2) фенилаланин. тирозин и триптофан (ароматическая боковая цепь); (3) серин и треонин (содержащая гидроксигруппу боковая цепь; (4) аспартат и глутамат (содержащая карбоксильную группу боковая цепь); (5) глутамин и аспарагин (содержащая амидную группу боковая цепь) и (6) лизин. аргинин и гистидин (содержащая аминогруппу боковая цепь). В выполнении таких замен важно. когда это возможно. сохранять цистеиновый скелет. показанный на фиг. 1.
Консервативные аминокислотные изменения в 808Т могут быть введены заменой другими нуклеотидами нуклеотидов. указанных в любой из 8Е0 ГО N0:55-57. 59. 61. 63. 65. 67 или 69. Такие варианты консервативных аминокислот могут быть получены. например. олигонуклеотид-направленным мутагенезом. линкер-сканирующим мутагенезом. мутагенезом с использованием полимеразной цепной реакции и т.п. (см. АикиЬе1 (1995). радек 8-10 - 8-22; МсРИегкоп (еб.). Э|гес!еб Ми!адепек: А Ргасбса1 АрргоасИ ЦКЬ Ргекк 1991)). Функциональная активность таких вариантов может быть определена с использованием стандартных способов и анализов. описанных здесь. Альтернативно. вариантный полипептид ТОЕ-бетасвязывающего белка может сохранять способность специфически связывать антитела против 808Т.
- 27 015166
Рутинные делеционные анализы молекул нуклеиновых кислот могут выполняться для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид ТСЕбета-связывающего белка. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:55-57, 59, 61, 63, 65, 67 или 69, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131 с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты встраивают в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и испытывают на активность или на способность связывать антитела против ТСЕ-бета-связывающего белка. Одной альтернативой экзонуклеазному расщеплению является использование олигонуклеотиднаправленного мутагенеза для введения делеций или стоп-кодонов для спецификации получения желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты полинуклеотида, кодирующего ТСЕ-бетасвязывающий белок, могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции. Кроме описанных здесь анализов и способов, стандартные способы функционального анализа белков описаны, например, Тгеи!ег е! а1., Мо1ес. Сеп. Сепе!. 240:113, 1993; Соп!еп! е! а1., Ехргеккюп апб ргеНттагу бе1е!юп апа1ук1к оГ !Не 42 кЭа 2-5А куп!Не!аке тбисеб Ьу Нитап т!егГегоп, т Вю1одюа1 1п!егГегоп 8ук!етк, Ргосеебтдк оГ Ι8ΙΚ-ΊΝ0 Меебпд оп 1п!егГегоп 8ук!етк, Сап!е1 (еб.), радек 65-72 (№)НоГГ 1987); НегксНтап, ТНе ЕСЕ Кесер!ог, ш Соп!го1 оГ Ашта1 Се11 РгоНГегабоп, Уо1. 1, Воуп!оп е! а1., (ебк.) радек 169-199 (Асабетю Ргекк 1985); СоитаШеаи е! а1., 1. Вю1. СНет. 270:29270, 1995; Еикипада е! а1., 1. Вю1. СНет. 270:25291, 1995; УатадисЫ е! а1., ВюсНет. РНагтасо1. 50:1295, 1995; Ме1ке1 е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 30:1, 1996.
Структура полипептидов, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот, описанными здесь, может быть предсказана из первичных продуктов трансляции с использованием функции графика гидрофобности, например, Р/С Сепе ог 1п!еШдепе!юк 8ш!е (1п!еШдепебск, Моип!ат У1еи, СаНГогта) или в соответствии со способами, описанными Ку!е апб ОооШНе (1. Мо1. Вю1. 157:105-132, 1982). Полипептиды могут быть получены в форме кислотных или основных солей или в нейтральной форме. Кроме того, индивидуальные аминокислотные остатки могут быть модифицированы окислением или восстановлением. Кроме того, могут быть произведены различные замены, делеции или добавления в отношении аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот, общий эффект которых заключается в сохранении или дополнительном увеличении или уменьшении биологической активности мутантного белка или белка дикого типа. Предпочтительно вариант 8О8Т или его фрагмент сохраняет или имеет увеличенную способность связываться с 8О8Т-специфическим антителом. Кроме того, вследствие вырожденности генетического кода, например, может быть значительное варьирование в нуклеотидных последовательностях, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность.
Другие производные описанных здесь белков включают конъюгаты этих белков с другими белками или полипептидами. Это может выполняться, например, синтезом слитых на Ν-конце или на С-конце белков, которые могут быть добавлены для облегчения очистки или идентификации белков (см. Патент США № 4851341, см. также Норр е! а1., Вю/ТесНпо1оду 6:1204, 1988). Альтернативно, слитые белки, такие как ЕЬАС®/ТСЕ-бета-связывающий белок, могут быть сконструированы для помощи в идентификации, экспрессии и анализе этого белка.
Описанные здесь белки могут быть сконструированы с использованием большого разнообразия описанных здесь способов. Далее, могут быть введены мутации в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, которые позволяет лигировать ее с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее желаемую инсерцию, замену или делецию аминокислоты.
Альтернативно, могут быть использованы олигонуклеотид-направленные сайт-специфические (или сегмент-специфические) мутагенезы для обеспечения измененного полинуклеотида, имеющего конкретные кодоны, измененные в соответствии с заменой, делецией или инсерцией. Примерные способы получения таких изменений, изложенных выше, описаны \νη№Γ е! а1., (Сепе 42:133, 1986); Ваиег е! а1., (Сепе 37:73, 1985); Сга1к (ВюТесНтциек, 1апиагу 1985, 12-19); 8шйН е! а1., (Сепебс Епдтееппд: Рппс1р1ек апб Ме!Нобк, Р1епит Ргекк, 1981); и 8атЬгоок е! а1. (кирга). Делеционные или укороченные производные белков (например, растворимая внеклеточная часть) могут быть также сконструированы с использованием сайтов подходящих рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), рядом с желаемой делецией. После рестрикции выступы могут быть заполнены и эта ДНК может быть повторно лигирована. Примерные способы получения изменений, изложенных выше, описаны 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3пб еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, ΝΥ, 2001).
Мутации, которые производят в молекулах нуклеиновых кислот данного изобретения, предпочтительно сохраняют рамку считывания кодирующих последовательностей. Кроме того, эти мутации предпочтительно не будут создавать комплементарных районов, которые при транскрипции могли бы гибридизоваться с образованием вторичных мРНК-структур, таких как петли или шпильки, которые могут неблагоприятно влиять на трансляцию этой мРНК. Хотя сайт мутации может быть заданным, необходимо, предварительно определить мутацию рег ке. Например, для выбора оптимальных характеристик мутантов в конкретном сайте может быть проведен случайный мутагенез в кодоне-мишени, и экспрессирован
- 28 015166 ные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на увеличение и потерю или сохранение биологической активности. Альтернативно, мутации могут вводиться в конкретных локусах синтезом олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими проводить лигирование фрагментов этой нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует производное, имеющее инсерцию, замену или делецию желаемой аминокислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки данного изобретения, могут быть также сконструированы такими способами, как ПЦР-мутагенез, химический мутагенез (ЭппЫШег апб К1шебшв!, РNΑ8 83:3202-3406, 1986), принудительными ошибочными включениями нуклеотидов (например, Мао апб V^βе Оепе 88:107-111, 1990) или использованием случайным образом мутагенизированных олигонуклеотидов (НогиПх е! а1., Оепоте 3:112-117, 1989).
Данное изобретение обеспечивает также манипуляцию и экспрессию обеспеченных здесь полинуклеотидов и полинуклеотидов, кодирующих антитела данного изобретения, культивированием клетокхозяев, содержащих вектор, способный экспрессировать такие полинуклеотиды. Экспрессирующим вектором называют рекомбинантую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая способна направлять экспрессию желаемого белка. Этот вектор может состоять из дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), синтетических или полученных из кДНК, рибонуклеиновых кислот (РНК) или комбинации этих двух компонентов (например, химера ДНК-РНК). Полинуклеотид кДНК обычно обозначает полинуклеотид ДНК, полученный транскрибированием молекулы РНК, такой как мРНК. Эти векторы или векторные конструкции, которые включают полинуклеотидную последовательность, кодирующую желаемый белок, предпочтительно функционально связаны с подходящими регуляторными элементами транскрипции и трансляции. Подходящие регуляторные элементы могут быть произведены из различных источников, в том числе бактериальных, грибных, вирусных генов, генов млекопитающих, насекомых или растений. Выбор подходящих регуляторных элементов зависит от выбранной клетки-хозяина и может быть легко выполнен лицом с обычной квалификацией в данной области. Примеры регуляторных элементов включают промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, терминатор транскрипции и последовательность связывания рибосом, в том числе сигнал инициации трансляции. Необязательно, этот вектор может включать последовательность полиаденилирования, один или несколько сайтов рестрикции, а также один или несколько селектируемых маркеров, таких как неомицинфосфотрансфераза или гигромицинфосфотрансфераза или любой другой маркер, известный в данной области. Дополнительно, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, другие генетические элементы, такие как сайт инициации репликации, дополнительные сайты рестрикции нуклеиновых кислот, энхансеры, последовательности, придающие индуцибельность транскрипции, и селектируемые маркеры, могут быть также включены в описанные здесь векторы.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой из вышеописанных белков, могут быть легко экспрессированы в большом разнообразии прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, в том числе бактериальных клетках, клетках млекопитающих, дрожжевых или других грибных клетках, вирусных клетках, клетках насекомых или клетках растений. Способы трансформации или трансфекции таких клеток для экспрессии чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см., например, Пакша е! а1., патент США № 4704362; Ншпеп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 75:1929-1933, 1978; Миггау е! а1., патент США № 4801542; ИрвкаП е! а1., патент США № 4935349; Надеп е! а1., патент США № 4784950; Ахе1 е! а1., патент США № 4399216; Ооеббе1 е! а1., патент США № 4766075 и ЗашЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3пб еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргевв, 2001; в отношении клеток растений см. Схако апб МаЛоп, Р1ап! Рйувю1. 104:1067-1071, 1994; и Равхко\гвк| е! а1., Вю!еск. 24:387-392, 1992).
Бактериальные клетки-хозяева, подходящие для проведения данного изобретения, включают Е. сой Β^21(^Ε3), 151.21(1)1:.3)])% в8, Β^21(^Ε3)р^увΕ, 1)111, ΌΗ4Ι, 1)1% ΌΗ5Ι, ЭН51Р', ЭН51МСК, 1)111015, ЭН10В/р3, ЭН118, С600, НВ101, ДМ105, ДМ109, 1М110, К38, КК1, Υ1088, Υ1089, С8Н18, ΕΚ1451 и ΕΚ1647 (см., например, Вго\гп (Ε6.), Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬЕах (Асабетк Ргевв 1991)); ВасШив виЫШв (ВК151, ΥΒ886, М1119, М1120 и В170 см., например, Нагбу, ВасШив С1ошпд МеШобв, ш ^NΑ С1ошпд: А Ргасйса1 Арргоасй, О1оуег (Ε6.) (1КЬ Ргевв 1985)); 8а1топе11а (урНшшпит и различные виды в родах Рвеиботопав, 8!гер!отусев и 8!арйу1ососсив, а также многие другие виды бактерий, хорошо известные специалисту с обычной квалификацией в данной области. Репрезентативный пример бактериальной клетки-хозяина включает Е. сой ЭН5а (ЗйШадепе, Ьа 1о11а, СайЕогша).
Бактериальные экспрессирующие векторы предпочтительно содержат промотор, который функционирует в клетке-хозяине, один или несколько селектируемых фенотипических маркеров и бактериальный сайт инициации репликации. Репрезентативные промоторы включают систему промотора βлактамазы (пенициллиназы) и лактозы (см. СНапд е! а1., №Шге 275:615, 1978), промотор РНКполимеразы Т7 (8!ибкг е! а1., МеШ. Ни/уток 185:60-89, 1990), промотор лямбда (Έ1νίπ е! а1., Оепе 87:123126, 1990), промотор 1гр (№сйо1в апб Υаиоίвку, Ме!1. ш йпхутокду 101:155, 1983) и промотор !ас (Кивве1 е! а1., Оепе 20:231, 1982). Дополнительные промоторы включают промоторы, способные узнавать полимеразы Т4, ТЗ, 8р6 и Т7, промоторы РК и Ръ бактериофага лямбда, промоторы гесА, белка теплового шо
- 29 015166 ка, Εί-κυν^Ύ !ас, 1рр-1ас8рг, рбоА и 1ас2 Е. соб, промоторы В. киЬббк, промоторы бактериофагов ВасШик, 8бер1отусек, промотор т! бактериофага лямбда, промотор Ь1а рВЯ322 и промотор САТ гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы были описаны в обзоре Сбск, 1. 1пб. МкгоЬюЕ 1:277, 1987, Уа!коп е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о! !бе Сепе, 4‘ь Еб. (Веп_)атт Ситттк 1987) и АикиЬе1 е! а1. (1995). Репрезентативные селектируемые маркеры включают различные маркеры устойчивости к антибиотикам, такие как гены устойчивости к канамицину или ампициллину. Многие плазмиды, подходящие для трансформации клеток-хозяев, хорошо известны в данной области, в том числе, среди других, рВЯ322 (см. Во1Шаг е! а1., Сепе 2:95, 1977), плазмиды рИС18, рИС19, рИС118, рИС119 (см. Мекктд, Ме!б. т Епхуто1оду 101:20-77, 1983 и ^еба апб Мекктд, Сепе 19:259-268, 1982) и рЫН8А, рЫН16а, рЫН18а и рВ1иексг1р1 М13 (81га1адепе, Ьа 1о11а, СабГогша).
Дрожжевые и грибные клетки-хозяева для проведения данного изобретения включают, среди прочих, 8ассбаготусек ротЬе, 8ассбаготусек се^еν^к^ае, роды РюЫа или К1иуνе^οтусек и различные виды рода АкрегдШик (МсКшдб! е! а1., патент США № 4935349). Подходящие экспрессирующие векторы для дрожжей и грибов включают, среди прочих, УСр50 (АТСС Ыо. 37419) для дрожжей и атб8клонирующий вектор рV8 (ТигпЬи11, Вю/!есЬпо1оду 7:169, 1989), УКр7 (8ΐπ.ι1ι1 е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. И8А 76:1035-1039, 1978), УЕр13 (ВгоасЬ е! а1., Сепе 8:121-133, 1979), рГОВ249 и рГОВ219 (Веддк, Ыа!иге 275:104-108, 1978) и их производные.
Предпочтительные промоторы для применения в дрожжах включают промоторы из гликолитических генов дрожжей (Нбхетап е! а1., 1. Вю1. СЬет. 255:12073-12080, 1980; А1Ьег апб 1<а\уакакг 1. Мо1. Арр1. Сепе!. 1:419-434, 1982) или гены алкогольдегидрогеназы (Уоипд е! а1., т Сепебс Епдтееппд о! М1сгоогдатктк !ог СЬетюа1к, Но11аепбег е! а1., (ебк.), р. 355, Р1епит, №\ν Уогк, 1982; Аттегег, Ме!Ь. Епхуто1. 101:192-201, 1983). Примеры применимых промоторов для грибных векторов включают промоторы, произведенные из гликолитических генов АкрегдШик шби1апк, например промотор абЬ3 (Мс Кшдб! е! а1., ЕМВО 1. 4:2093-2099, 1985). Экспрессионная единица может также включать терминатор транскрипции. Примером подходящего терминатора является терминатор абЬ3 (Мс Кшдб! е! а1., кирга, 1985).
Как и в случае бактериальных векторов, дрожжевые векторы будут обычно включать селектируемый маркер, которым может быть один из любого числа генов, которые проявляют доминантный фенотип, для которого существует фенотипический анализ, позволяющий выбрать трансформанты.
Предпочтительными селектируемыми маркерами являются маркеры, которые дополняют ауксотрофию клетки-хозаяина, обеспечивают устойчивость к антибиотику или позволяют клетке использовать конкретные источники углерода, и включают 1еи2 (ВгоасЬ е! а1., 1Ь1б.), ига3 (Во!к!ет е! а1., Сепе 8:17, 1979) или Ь1к3 (8!гиЬ1 е! а1., 1Ь1б.). Другим подходящим селектируемым маркером является ген са!, который придает устойчивость к хлорамфениколу дрожжевым клеткам. Многие клонирующие векторы дрожжей были сконструированы и являются легко доступными. Эти векторы включают векторы на основе У1р, такие как ΥΙ5, векторы УКр, такие как ΥΚ.17, векторы УЕр, такие как УЕр13, и векторы УСр, такие как УСр19. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что большое разнообразие подходящих векторов являются доступными для экспрессии в клетках дрожжей.
Способы трансформации грибов хорошо известны в литературе и были описаны, например, Веддк (1Ь1б.), Ншпеп е! а1., (Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. И8А 75:1929-1933, 1978), Уе1!оп е! а1., (Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. И8А 81:1740-1747, 1984) и Кикке1 (ЫаШге 301:167-169, 1983). Генотип клетки-хозяина может содержать генетический дефект, который комплементируется селектируемым маркером, присутствующим на экспрессирующем векторе. Выбор конкретного хозяина и селектируемого маркера находятся в пределах уровня обычной квалификации в данной области.
Протоколы для трансформации дрожжей также хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Например, трансформация может легко выполняться либо получением сферопластов дрожжей с ДНК (см. Нтпеп е! а1., РNΑδ ^А 75:1929, 1978), либо обработкой щелочными солями, такими как Ь1С1 (см. 1!оЬ е! а1., 1. Вас!епо1оду 153:163, 1983). Трансформация грибов может также проводиться с использованием полиэтиленгликоля, как описано Си11еп е! а1., (Вю/ТесЬпо1оду 5:369, 1987).
Вирусные векторы включают векторы, которые содержат промотор, который управляет экспрессией выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует желаемый белок, как описано выше. Большое разнообразие промоторов может быть использовано в контексте данного изобретения, в том числе, например, такие промоторы, как МоМЕ-ν ЬТЯ, Κδν ЬТЯ, (например, Согтап е!. а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. И8А 79:6777, 1982), Ебепб Ми^ ЬТЯ, аденовирусный промотор (ОЬпо е! а1., δ^ι^ 265:781784, 1994), промотор/энхансер неомицинфосфотрансферазы, поздний промотор парвовируса (Коеппд е! а1., Нит. Сепе ТЬегар. 5:457-463, 1994), ТК-промотор герпесвируса (см., например, МсКшдб!, Се11 31:355, 1982); промотор δν40 (например, ранний промотор δν40 (Вепо1к! е! а1., Ыа!иге 290:304, 1981); энхансер/промотор гена металлотионеина I (Натег е! а1., 1. Мо1ес. Арр1. Сепе!. 1:273, 1982); промотор вируса опухоли молочной железы мыши (см., в общем, Е!сЬеνеπу, Ехргеккюп о! Епдшеегеб Рго!етк т Матта11ап Себ Си1!иге, ш Рго!еш Епдтееппд: Рппар1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк.), радек 163-181 (1оЬп \УПеу апб δοηк, 1пс 1996)); немедленно ранний промотор цитомегаловируса и немедленно поздний промотор цитомегаловируса. Альтернативно, прокариотический промотор, такой как промотор РНК
- 30 015166 полимеразы бактериофага Т3, может быть использован для регуляции экспрессии гена ТОЕ-бетасвязывающего белка в клетках млекопитающих, если этот прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором 01юи е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 10:4529, 1990; КаиГтап е! а1., №с1. Ас1бк Век. 19:4485, 1991).
В особенно предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения промотором является тканеспецифический промотор (см., например, \¥0 91/02805; ЕР 0415731 и \У0 90/07936). Репрезентативные примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают специфический для нервных клеток промотор енолазы, промотор тромбоцитарного фактора роста бета, промотор костного морфогенетического белка, промотор альфа1-химерина человека, промотор синапсина I и промотор синапсина II. Кроме вышеуказанных промоторов, другие, вирус-специфическиие промоторы (например, ретровирусные промоторы (в том числе указанный выше, а также другие, например, ВИЧ-промоторы), промоторы гепатита, герпеса (например, ЕВУ) и специфические в отношении бактерий, грибов или паразитов (например, малярийные) промоторы, могут быть использованы для нацеливания на специфическую клетку или ткань при инфицировании вирусом, бактерией, грибом или паразитом.
Клетки млекопитающих, подходящие для проведения данного изобретения, включают, среди прочих, клетки С08, СН0, 8а08, остеосаркомы, К8483, МО-63, первичные остеобласты и клетки стромы костного мозга человека или млекопитающего. Дополнительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки почки Африканской зеленой мартышки (Уего; АТСС СКЕ 1587), клетки почки эмбриона человека (293-НЕК; АТСС СКЕ 1573), клетки почки хомячка (ЬаЬу йатк!ег) (ВНК-21; АТСС СКЕ 8544), клетки почки собачьих (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичников Китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССЬ61), клетки гипофиза крысы (ОН1; АТСС ССЬ82), клетки НеЬа 83 (АТСС СКЪ 2,2), клетки гематомы крысы (Н-Ч-П-Е, АТСС СКЕ 1548), клетки почки обезьяны, трансформированные 8У40 (С08-1; АТСС СКЕ 1650) и эмбриональные клетки мышиных (МН-3Т3; АТСС СКЕ 1658).
Экспрессирующие векторы млекопитающих для применения в проведении данного изобретения будут включать промотор, способный управлять транскрипцией клонированного гена или кДНК. Предпочтительные промоторы включают вирусные промоторы и клеточные промоторы. Специфические для кости промоторы включают промотор сиалопротеина кости и промотор для остеокальцина. Вирусные промоторы включают немедленно ранний промотор цитомегаловируса (Вокйай е! а1., Се11 41:521-530, 1985), немедленно поздний промотор цитомегаловируса, промотор 8У40 (8иЬгаташ е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 1:854-864, 1981), ММТУ ЬТК, К8У ЬТК, промотор металлотионеина-1, Е1а адновируса. Клеточные промоторы включают промотор мышиного металлотионеина-1 (Ра1тйег е! а1., патент США № 4579821), промотор Ук мыши (Вегдтап е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 81:7041-7045, 1983; Огап! е! а1., №с1ею Ас1бк Кек. 15:5496, 1987) и промотор УН мыши (ЬоЬ е! а1., Се11 33:85-93, 1983). Выбор промотора будет зависеть, по меньшей мере частично, от желаемого уровня экспрессии или от трансфицируемой реципиентной клеточной линии.
Такие экспрессирующие векторы могут содержать также ряд сайтов сплайсинга РНК, расположенных справа от промотора и слева от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес пептид или белок. Предпочтительные сайты сплайсинга РНК могут быть получены из генов аденовируса и/или иммуноглобулина. В этих экспрессирующих векторах содержится также сигнал полиаденилирования, расположенный справа от представляющей интерес кодирующей последовательности. Подходящие сигналы полиаденилирования включают ранние и поздние сигналы полиаденилирования из 8У40 (КаиГтап апб 8йагр, 1Ь1б.), сигнал полиаденилирования из района Е1В аденовируса 5 и терминатор гена гормона роста человека (Эе№1о е! а1., №с1ею Ас1бк Кек. 9:3719-3730, 1981). Экспрессирующие векторы могут включать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую как состоящий из трех частей лидер аденовируса 2, расположенный между промотором и сайтами сплайсинга РНК. Предпочтительные векторы могут также включать энхансерные последовательности, такие как энхансер 8У40. Экспрессирующие векторы могут также включать последовательности, кодирующие РНК аденовируса УА.
Подходящие экспрессирующие векторы могут быть получены из коммерческих источников (например, 8!га!адепе, Ьа 1о11а, СайГогша).
Векторные конструкции, содержащие клонированные ДНК-последовательности, могут быть введены в культивируемые клетки млекопитающего, например, опосредованной липосомами трансфекцией, опосредованной фосфатом кальция трансфекцией (^1д1ег е! а!, Се11 14:725, 1978; Согкаго апб Реагкоп, 8отабс Се11 Оепейск 7:603, 1981; Огайат апб Уап бег ЕЬ, У1го1оду 52:456, 1973), электропорацией (№итапп е! а1., ЕМВ0 1. 1:841-845, 1982) или опосредованной ДЭАЭ-декстраном трансфекцией (АикиЬе1 е! а1., (ебк.), Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Шйп ^йеу апб 8опк, Шс., ΚΥ, 1987); ретровирусной, аденовирусной и опосредованной слиянием протопластов трансфекцией (см. 8атЬгоок е! а1., кирга). Голые векторные конструкции могут также поглощаться мышечными клетками или другими подходящими клетками после инъекции в мышцу млекопитающего (или другого животного). Для идентификации клеток, которые были стабильно трансфицированы вектором, включающим клонированную ДНК, селектируемый маркер обычно вводят в эти клетки вместе с представляющими интерес геном или кДНК. Предпочтительные селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих
- 31 015166 включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемым маркером может быть амплифицируемый селектируемый маркер. Предпочтительными амплифицируемыми селектируемыми маркерами являются ген ΌΗΕΚ и ген устойчивости к неомицину. Селектируемые маркеры обсуждаются в обзоре Τ1ιί11.ν (Маштакам Се11 Τес11по1оду, ВиНептоПН РиЬНкЬегк, 8!опеЬат, Маккасбикебк).
Клеткам млекопитающих, включающим подходящий вектор, дают расти в течение некоторого периода времени, обычно 1 день-2 дня, до начала экспрессии представляющей интерес ДНКпоследовательности. Затем отбор с использованием лекарственного средства используют для отбора на рост клеток, которые стабильно экспрессируют селектируемый маркер. Для клеток, которые были трансфицированы амплифицируемым, селектируемым маркером, концентрация лекарственного средства может быть увеличена ступенчатым образом для отбора на увеличенную копийность клонированных последовательностей, с увеличением посредством этого уровней экспрессии. Клетки, экспрессирующие введенные последовательности, отбирают и подвергают скринингу на продуцирование представляющего интерес белка в желаемой форме или при желаемом уровне. Затем, клетки, которые удовлетворяют этим критериям, клонируют и используют для увеличения масштаба для продуцирования.
Многочисленные клетки-хозяева насекомых, известные в данной области техники, могут быть также применимы в данном изобретении. Например, применение бакуловирусов в качестве векторов для экспрессии гетерологичных ДНК-последовательностей в клетках насекомых обсуждаются в обзоре А!кшкоп е1 а1. (Рекбс. 8ск 28:215-224, 1990). Бакуловирусная система обеспечивает эффективное средство введения клонированных генов ΤΟΕ-бета-связывающих белков в клетки насекомых. Подходящие экспрессирующие векторы основаны на вирусе множественного ядерного полиэдроза Аи!одгарЬа сабГотшса (АсМПРУ) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка 70 теплового шока (Ькр) ОтокорЬба, промотор немедленно раннего гена вируса множественного ядерного полиэдроза Аи!одгарЬа сабГотшса (1е-1) и задержанный ранний промотор 39К, промотор бакуловируса р10 и промотор металлотионеина ОтокорЬба. Подходящие клетки-хозяева насекомых включают клеточные линии, полученные из ГРЬВ-8Г-21, клеточную линию пупального яичника 8робор!ега Ггид1регба, такую как 8Г9 (АТСС СВЬ 1711), 8Г21АЕ и 8Г21 ЧпуЦгодеп Сотротабоп; 8ап П1едо, СА), а также клетки ОтокорЬба 8сбпе1бет-2. Установленные способы для получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах обеспечены Вабеу е1 а1., Машри1абоп оГ ВасЫотйнк VесЮ^к. ш МеШобк Ш Мо1еси1аг Вю1оду, ^1ише 7: Οеηе Τπ-ιι·^Гег апб Ехртеккюп Рго!осо1к, Миггау (еб.), Радек 147-168 (Τίκ Читана Ргекк, Шс. 1991), Ра!е1 е1 а1., (Τίκ ЬасЫоубик ехртеккюп кук!ет, ш ЭХА С1ошпд 2: Ехртеккюп 8ук!етк, 2пб ЕбШоп, С1отег е1 а1., (ебк.), радек 205-244 (0хГогб ипШеткйу Ргекк 1995), АикиЬе1 (1995), радек 16-37-16-57, Ктсбатбкоп (еб.), Васи1о\Ш.1к Ехртеккюп Рго!осо1к (Τ№ Читана Ргекк, Шс. 1995), и Ьискпоте, (Шкес! Се11 Ехртеккюп ΤесЬηο1οду, Ш Рго!еШ Епдтееппд: Рйпар1ек апб Ртасбсе, С1е1апб е! а1., (ебк.), радек 183-218 (1обп ^беу апб 8опк, Шс. 1996).
Альтернативно, многочисленные векторы и клетки-хозяева растений известны в данной области и могут быть также использованы для экспрессии полинуклеотидов, например, АдтоЬас!ейиш гЫходепек (8Шкат е! а1., 1. Вюкск (Вапда1оге) 11:47-58, 1987). Экспрессирующие векторы могут также вводиться в протопласты растений, ткани интактных растений или в выделенные клетки растений. Общие способы культивирования тканей растений обеспечены, например, М1к1 е! а1., Ргосебигек Гог Ш!гобисшд Еоге1дп ОНА 1п!о Р1ап!к, ш МеШобк Ш Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду апб Вю!есЬпо1оду, ОКск е! а1. (ебк.), радек 67-88 (СВС Ргекк, 1993).
В родственных аспектах данного изобретения белки данного изобретения могут экспрессироваться в трансгенном животном, зародышевые клетки и соматические клетки которого содержат ген, который кодирует желаемый белок и который функционально связан с промотором, эффективным для экспрессии этого гена. Альтернативно, подобным образом могут быть получены трансгенные животные, которые лишены желаемого гена (например, мыши с нокаутом гена). Такие трансгенные животные могут быть получены в различных животных, не являющихся людьми, в том числе мышах, крысах, кроликах, овцах, собаках, козах и свиньях (см. ^ттет е! а1., №Ш1ге 315:680-683, 1985, Ра1тйет е! а1., 8с1епсе 222:809-814, 1983, Вппк!ег е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 82:4438-4442, 1985, Ра1тбет апб Вппк!ег, Се11 41:343-345, 1985, и патенты США с номерами 5175383, 5087571, 4736866, 5387742, 5347075, 5221778 и 5175384). Вкратце, экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты, подлежащую экспрессии, вместе с подходящим образом расположенными регуляторными последовательностями экспрессии, вводят в пронуклеусы оплодотворенных яиц, например, микроинъекцией. Интеграцию инъецированной ДНК детектируют блот-анализом ДНК из проб ткани. Предпочтительно, чтобы введенная ДНК была включена в зародышевую линию животного таким образом, что она передается потомству этого животного. Тканеспецифическая экспрессия может достигаться посредством использования тканеспецифического промотора или посредством использования индуцируемого промотора, такого как промотор металлотионеина (Ра1тйет е! а1., 1983, кирга), который делает возможной регулируемую экспрессию этого трансгена. Белки могут быть выделены, среди других способов, культивированием подходящих систем хозяина и вектора для продуцирования рекомбинантных продуктов трансляции данного изобретения. Супернатанты из таких клеточных линий или белковых тел включений или целых клеток, из которых этот белок не секретируется в супернатант, могут быть затем обработаны различными процедурами очи
- 32 015166 стки для выделения желаемого белка. Например, супернатант может быть сначала сконцентрирован с использованием коммерчески доступных фильтров для концентрирования белков, таких как ультрафильтрационное устройство Аткоп или М1Шроге РеШсоп. После концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящий матрикс для очистки, такой как, например, аффинный матрикс, например, специфическое антитело, связанное с подходящим носителем. Альтернативно, для очистки этого белка могут быть использованы анионо- или катионообменные смолы. В качестве следующей альтернативы, одна или несколько стадий обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФВЖХ) могут быть использованы для дополнительной очистки этого белка. Другие способы выделения белков данного изобретения хорошо известны в данной области. Чистота выделенного белка или полипептида может быть определена анализом с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси синим или окрашиванием серебром.
Общие способы экспрессии и извлечения чужеродного белка, продуцируемого системой клеток млекопитающего, обеспечена, например, Екйетепу, Ехргеккюп оГ Епдтеегеб РгсЛетк ш Маттайап Се11 Си1!иге, т Рго!еш Епдшееппд: Рппс1р1ек апб Ргасйсе, С1е1апб е! а1/, (ебк.), радек 163 (ХУВеу-Ыкк, 1пс. 1пс 1996). Стандартные способы извлечения белка, продуцируемого бактериальной системой, обеспечены, например, Опккйаттег е! а1., РипГкайоп оГ отег-ргобисеб рго!ешк Ггот Е. сой се11к, ш ΩΝΛ С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб Ебйюп, О1отег е! а1., (ебк.), радек 59-92 (ОхГогб иштегкйу Ргекк). Установленные способы для выделения рекомбинантных белков из системы бакуловируса описаны Вкйагбкоп (еб.), ВасЫотйик Ехргеккюп Рго!осо1к (Тйе Нитапа Ргекк, 1пс., 1995).
Более конкретно, ТОР-бета-связывающий белок может быть выделен стандартными способами, такими как аффинная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, ионообменная хроматография, ВЖХ и т.п. Дополнительные варьирования в выделении и очистке ТОР-бета-связывающего белка могут быть придуманы специалистами с квалификацией в данной области. Например, антитела против ТОРбета-связывающего белка, полученные, как описано здесь, могут быть использованы для выделения больших количеств белка иммуноаффинной очисткой. Очистка антител данного изобретения дополнительно описана здесь.
Детектируемые метки
Детектируемая метка является молекулой или атомом, которые могут быть конъюгированы с полипептидом (в том числе антителом или его фрагментом) или полинуклеотидом для получения молекулы, применимой для диагностики. Примеры детектируемых меток включают хелаторы, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы, ферменты и другие маркерные молекулярные частицы. ТОР-бета-связывающий белок или антитело, которое специфически связывается с ТОР-бета-связывающим белком, или кандидатные молекулы, описанные выше, могут быть помечены различными соединениями, в том числе, например, флуоресцентными молекулами, токсинами и радионуклидами. Репрезентативные примеры флуоресцентных молекул включают флуоресцеин, белки РйусоЬШ, такие как фикоэритрин, родамин, Техасский красный и люцифераза. Репрезентативные примеры токсинов включают рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, антивирусный белок фитолакки американской, тритин, токсин 8Ыде11а и экзотоксин А Ркеиботопак. Рерпезентативные примеры радионуклидов включают Си-64, Оа-67, Оа-68, Ζγ-89, Ви-97, Тс-99т, Вй-105, Рб-109, 1п-111, Ι-123, Ι-125, Ι-131, Ве-186, Ве-188, Аи-198, Аи-199, РЬ-203, А!-211, РЬ-212 и В1-212. Кроме того, описанные выше антитела могут быть также помечены или конъюгированы с одним партнером пары связывания лиганда. Репрезентативные примеры включают авидин-биотин, стрептавидин-биотин и рибофлавинрибофлавинсвязывающий белок.
Способы конъюгирования или мечения описанных здесь молекул репрезентативными метками, указанными выше, могут быть легко выполнены специалистом с обычной квалификацией в данной области (см. ТгкйоШесепе АпБЬобу Соп)ида!е, Патент США № 4744081; АпБЬобу Соп)ида!е, Патент США № 5106951; Р1иогодешс Ма!епа1к апб ЬаЬеНпд Тесйшццек, Патент США № 4018884; Ме!а1 ВабюписНбе ЬаЬе1еб Рго!етк Гог Э1адшк1к апб Тйегару, Патент США № 4897255; и Ме!а1 Вабюписйбе Сйе1а!шд Сотроипбк Гог Еирготеб Сйе1а!юп Кшейск, Патент США № 4988496; см., также Iηтаη, Ме!йобк Ш Епхуто1оду, Уо1. 34, АГйпйу Тесйшциек, Епхуте РипГкаБоп: Рай В, 1акоЬу апб ХУПсйек (ебк.), Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, р. 30, 1974; см. также ХУПсйек апб Вауег, Тйе Ат1бт-Вюйп Сотр1ех ш Вюапа1уйса1 Аррйса!юпк, Апа1. Вюсйет. 171:1-32, 1988). Иммуноконъюгат является композицией, содержащей антитело, такое как антитело против ТОР-бета-связывающего белка, или фрагмент антитела, и детектируемую метку. Предпочтительно, часть антитела этого иммуноконъюгата специфически связывается с родственным антителу антигеном с той же самой или слегка уменьшенной связывающей аффинностью после конъюгации, чем перед конъюгацией.
Фармацевтические композиции
Как отмечалось выше, данное изобретение обеспечивает также различные фармацевтические композиции, содержащие одну из вышеуказанных молекул, которая ингибирует связывание ТОР-бетасвязывающего белка с членом ТОР-бета-семейства, вместе с фармацевтически или физиологически приемлемыми носителем, эксципиентом или разбавителем. Любой подходящий носитель, известный специалистам с обычной квалификацией в данной области, может быть использован в фармацевтических
- 33 015166 композициях данного изобретения. Носители для терапевтического применения хорошо известны и описаны, например, в РеттдЮпА Рйагтасеийса1 8с1епсе5, Маск РиЬйзЫпд, Со. (А.К. Оеппаго ей. (1985)). Обычно, такие носители должны быть нетоксичными в отношении реципиентов при используемых дозах и концентрациях. Обычно получение таких композиций влечет за собой объединение терапевтического агента с буферами; антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, низкомолекулярными (менее, чем 10 остатков) полипептидами, белками, аминокислотами, углеводами, в том числе, глюкозой, мальтозой, сахарозой или декстринами, хелатообразующими агентами, такими как ЭДТА, глутатионом и другими стабилизаторами и эксципиентами. Примером подходящих растворителей являются нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином. Альтернативно, композиции данного изобретения могут быть приготовлены в виде лиофилизата.
Обычно тип носителя выбирают на основании способа введения. Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть приготовлены для введения различными способами введения, в том числе, например, местного, перорального, назального, внутриоболочечного, ректального, вагинального, сублингвального или парентерального введения, в том числе, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной, внутриполостной, внутриканальной или интрауретральной инъекцией или инфузией. Фармацевтическая композиция (например, пероральное введение или доставка инъекцией) может быть в форме жидкости (например, элексира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии). Жидкая фармацевтическая композиция может включать, например, один или более из следующих компонентов: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический солевой раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты; антиоксиданты, хелатообразующие агенты; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительным является применение физиологического солевого раствора, и инъецируемая фармацевтическая композиция является предпочтительно стерильной.
Описанные здесь композиции могут быть приготовлены для пролонгированного высвобождения (т.е. композиция, такая как капсула или тампон, которые выполняют медленное высвобождение соединения после введения). Такие композиции могут быть обычно приготовлены с использованием хорошо известной технологии и введены, например, перорально, ректально или имплантацией под кожу или имплантацией в желаемом месте-мишени. Формы пролонгированного высвобождения могут содержать агент, диспергированный в матриксе-носителе и/или включающийся в резервуаре, окруженном регулирующей скорость высвобождения мембраной. Носители для применения с такими композициями являются биосовместимыми и могут быть также биодеградируемыми; предпочтительно эта композиция обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. Количество активного соединения, содержащегося в композиции пролонгированного высвобождения, зависит от места трансплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и характера состояния, подлежащего лечению или предотвращению. Иллюстративные носители, применимые в этой связи, включают микрочастицы поли(сополимера лактида и гликолида), полиакрилата, латекса, крахмала, целлюлозы, декстрана и т.п. Другие иллюстративные носители задержанного высвобождения включают супрамолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкую гидрофильную внутреннюю часть (например, сшитый полисахарид или олигосахарид) и, необязательно, наружный слой, включающий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и заявки РСТ \0 94/20078, \\'0 94/23701 и \0 96/06638).
В другом иллюстративном варианте осуществления используют биодеградируемые микросферы (например, полилактат-полигликолат) в качестве носителей для композиций этого изобретения. Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США с номерами 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883; 5853763; 5814344; 5407609 и 5942252. Системы носителя из модифицированного корового белка вируса гепатита В, такие как описанные в заявке \0 99/40934 и процитированных в ней ссылках, также будут применимы для многих приложений. Другая иллюстративная система носителя/доставки использует носитель, включающий состоящие из частиц белковые комплексы, такие как описанные в патенте США № 5928647, которые способны индуцировать в хозяине ответы в виде цитотоксических Т-лимфоцитов, рестриктированных по классу I.
В другом иллюстративном варианте осуществления используют коровые (внутренние) частицы фосфата кальция в качестве носителей или в качестве матриксов регулируемого высвобождения для композиций данного изобретения. Примеры частиц из фосфата кальция описаны, например, в опубликованной заявке на патент \0 00/46147.
Для фармацевтических композиций, содержащих полинуклеотид, кодирующий антитело против 808Т и/или модулирующий агент (такой как полипептид, и/или модулирующий агент, генерируемые ш 81!и), этот полинуклеотид может присутствовать в любой из различных систем доставки, известных спе
- 34 015166 циалистам с обычной квалификацией в данной области, в том числе, в нуклеиновой кислоте и бактериальных, вирусных системах экспрессии и системе экспрессии млекопитающего. Способы включения ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Эта ДНК может быть также голой, как описано, например, в И1тег е! а1., δ^ι^ 259:17451749, 1993 и обсуждается в обзоре СоНеи δ^ι^ 259:1691-1692, 1993. Поглощение голой ДНК может быть увеличено нанесением в виде покрытия этой ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки.
Развитие подходящих схем введения доз и лечения для использования конкретных композиций, описанных здесь, в различных схемах лечения, включающих, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и соответствующую композицию, хорошо известно в данной области, некоторые из них вкратце обсуждаются ниже для целей иллюстрации.
В некоторых применениях, описанные здесь фармацевтические композиции могут доставляться посредством перорального введения животному. В этом случае, эти композиции могут быть приготовлены с инертным разбавителем или с ассимилируемым годным в пищу носителем, или они могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть включены непосредственно в пищевой продукт рациона.
В некоторых обстоятельствах будет желательной доставка фармацевтических композиций, описанных здесь, парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже внутрибрюшинно. Такие подходы хорошо известны квалифицированному работнику, некоторые из которых дополнительно обсуждаются, например, в патентах США с номерами 5543158; 5641515 и 5399363. В некоторых вариантах осуществления могут быть приготовлены растворы активных соединений в виде свободного основания или фармацевтически приемлемых солей в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Могут быть также приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях или в маслах. При обычных условиях хранения и использования эти препараты обычно будут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Иллюстративные фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий (например, см. Патент США № 5466468). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы она могла легко вводиться с использованием шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Должная текучесть может поддерживаться, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и/или использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может облегчаться различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимерозалом и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть получена применением в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
В одном варианте осуществления для парентерального введения в водном растворе этот раствор должен быть подходящим образом забуферен, если это необходимо, и жидкий растворитель сначала должен быть сделан изотоническим с использованием достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы являются особенно подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи, стерильная водная среда, которая может быть использована, будет известна специалистам с квалификацией в данной области в свете данного описания. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора №1С1 и либо добавлена к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо введена в предлагаемом месте инфузии (см., например, Кети·!^^ Рйагтасеийса1 δ^ι^δ, 15'1' еб., рр. 1035-1038 апб 1570-1580). Некоторое варьирование дозы будет, необязательно, иметь место в зависимости от состояния проходящего лечение субъекта. Кроме того, для введения человеку препараты должны, конечно, удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, требуемым службой биологических стандартов Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (ΡΌΑ).
В другом варианте осуществления данного изобретения описанные здесь композиции могут быть приготовлены в нейтральной форме или в форме соли. Иллюстративные фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная кислоты и т. п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция
- 35 015166 или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После приготовления растворы должны вводиться способом, совместимым с данной дозовой формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным.
Носители могут дополнительно содержать любой из перечисленных и все перечисленные растворители, дисперсионные среды, носители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, буферы, растворы носителей, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какие-либо общепринятые среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом, рассматривается их применение в терапевтических композициях. В эти композиции могут быть также включены дополнительные активные ингредиенты. Выражение фармацевтически приемлемые относится к молекулярным частицам и композициям, которые не производят аллергической или сходной вредной реакции при введении человеку.
В некоторых вариантах осуществления липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, липидные частицы, пузырьки (везикулы) и т.п. используют для введения композиций данного изобретения в подходящие клетки/организмы-хозяева. В частности, композиции данного изобретения могут быть приготовлены для доставки инкапсулированными либо в липидной частице, липосоме, везикуле, наносфере, либо наночастице или т. п. Альтернативно композиции данного изобретения могут быть связаны, ковалентно или нековалентно, с поверхностью таких носителей.
Образование и применение липосомы и липосома-подобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств обычно известно специалистам с квалификацией в данной области (см., например, Ьакк, Тгепбк В^есЬм! 16(7):307-21, 1998; Такакига, N^ррοη ΕμΙο 56(3):691-95, 1998; СБапбгап е! а1., !пб1ап 1. Ехр. Вю1. 35(8):801-09, 1997; МагдаШ, Сгй. Кеу. Т1ег. Эгид Сатег 8ук!. 12(23):233-61, 1995; Патент США № 5567434; Патент США № 5552157; Патент США № 5565213; Патент США № 5738868 и Патент США № 5795587, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки в его полном виде). Липосомы успешно использовали с рядом типов клеток, которые обычно трудно трансфицировать другими процедурами, в том числе с суспензиями Т-клеток, культурами первичных гепатоцитов и клетками РС 12 (Кеппе1кеп е! а1., 1. Вю1. С1ет. 265(27): 16337-42, 1990; Ми11ег е! а1., ^NΑ Се11 Вю1. 9(3):221-29, 1990). Кроме того, липосомы свободны от ограничений длины ДНК, которые являются типичными для систем доставки на основе вирусов. Липосомы использовали эффективно для введения генов, различных лекарственных средств, радиотерапевтических агентов, ферментов, вирусов, факторов транскрипции, аллостерических эффекторов и т. п. в различные культивируемые клеточные линии и в различных животных. Кроме того, применение липосом, по-видимому, не связано с аутоиммунными реакциями или неприемлемой токсичностью после системной доставки. В некоторых вариантах осуществления липосомы образуют из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют мультиламеллярные концентрические бислойные везикулы (также называемые мультиламеллярными везикулами (МЬУ).
Альтернативно, в других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает такие фармацевтически приемлемые формы композиций данного изобретения, как нанокапсулы. Нанокапсулы могут обычно захватывать соединения стабильным и воспроизводимым образом (см., например, Ошп!апагСиеггего е! а1., Эгид Эеу. Шб. РНагт. 24(12):1113-28, 1998). Во избежание побочных эффектов вследствие избыточной внутриклеточной нагрузки полимерами могут быть сконструированы ультратонкие частицы (с размерами около 0,1 мкм) с использованием полимеров, способных деградироваться ίη νίνο. Такие частицы могут быть приготовлены, как описано, например, ΟουνΓΟϋΓ е! а1., Сп!. Кеу. Т1ег. Эгид Сатег 8ук!. 5(1):1-20, 1988; /иг МиЫеп е! а1., Еиг. 1. РБагт. ВюрБагт. 45(2):149-55, 1998; 2атЬаих е! а1., 1. Οοη1го11еб Ке1еаке 50(1-3):31-40, 1998 и Патенте США № 5145684.
Кроме того, фармацевтические композиции данного изобретения могут быть помещены в контейнеры вместе с упаковочным материалом, который обеспечивает инструкции в отношении применения таких фармацевтических композиций. Обычно такие инструкции будут включать реальное выражение, описывающее концентрацию реагентов, а также в некоторых вариантах осуществления относительные количества ингредиентов эксципиента или разбавителей (например, воды, солевого раствора или ФСБ), которые могут быть необходимыми для воссоздания этой фармацевтической композиции.
Способы лечения
Данное изобретение обеспечивает также способы увеличения минерального содержания и минеральной плотности кости. Вкратце, многочисленные состояния приводят к потере минерального содержания кости, в том числе, например, болезнь, генетическое предрасположение, несчастные случаи, которые приводят к прекращению использования кости (например, вследствие перелома), терапевтические средства, которые влияют на резорбцию кости или которые убивают костеобразующие клетки, и нормальное старение. Посредством использования описанных здесь молекул, которые ингибируют связывание ТСЕ-бета-связывающего белка с членом ТСЕ-бета-семейства, такие состояния могут лечиться или предотвращаться. В данном контексте должно быть понятно, что минеральное содержание кости считается увеличившимся, если минеральное содержание кости увеличилось статистически значимым образом в выбранном участке.
- 36 015166
Большое разнообразие состояний. которые приводят к потере минерального содержания кости. может лечиться описанными здесь молекулами. Пациенты с такими состояниями могут быть идентифицированы посредством клинического диагноза с использованием хорошо известных способов (см.. например. Наткоп'к Ргшар1ек оГ 1п!ета1 Мебкше. МсСга^-НШ. 1пс.). Репрезентативные примеры заболеваний. которые могут лечиться. включают дисплазии. в которых имеется атипичный рост или развитие кости. Репрезентативные примеры таких состояний включают ахондроплазию. ключично-черепной дизостоз. энхондроматоз. фиброзную дисплазию. болезнь Гоше. гипофосфатемический рахит. синдром Марфана. множественные костно-хрящевые экзостозы. нейрофиброматоз. несовершенный остеогенез. остеопетроз. остеопойкилоз. склеротические повреждения. переломы. периодонтальное заболевание. псевдоартроз и пиогенный остеомиелит.
Другие состояния. которые могут лечиться или предотвращаться. включают большое разнообразие причин остеопении (т.е. состояния. которое вызывает более чем одно стандартное отклонение минерального содержания кости или плотности ниже максимума минерального содержания скелета в молодости). Репрезентативные примеры таких состояний включают анемические состояния. состояния. обусловленные стероидами. состояния. обусловленные гепарином. нарушения костного мозга. цингу. недостаточность питания. недостаточность кальция. идиопатический остеопороз. врожденную остеопению или остеопороз. алкоголизм. хроническую болезнь печени. старость. постклимактерическое состояние. олигоменорею. аменорею. беременность. сахарный диабет. гипертиреоз. болезнь Кушинга. акромегалию. гипогонадизм. иммобилизацию или неиспользование. синдром рефлекторно-симпатической дистрофии. транзиторный регионарный остеопороз и остеомаляцию.
В одном варианте осуществления данного изобретения минеральное содержание или плотность кости может увеличиваться введением теплокровному животному терапевтически эффективного количества молекулы. которая ингибирует связывание полипептида 808Т с членом ТСЕ-бета-семейства. Примеры теплокровных животных. которые могут лечиться. включают как позвоночных. так и млекопитающих. в том числе. например. людей. лошадей. коров. свиней. овец. собак. кошек. крыс и мышей. Репрезентативные примеры терапевтических молекул включают рибозимы. гены рибозимов. антисмысловые олигонуклеотиды и антитела. описанные здесь.
В других вариантах осуществления данного изобретения обеспечены способы увеличения плотности кости. предусматривающие стадии введения в клетки. которые направляются домой - в кость. вектора. который управляет экспрессией молекулы. ингибирующей связывание полипептида 808Т с членом ТСЕ-бета-семейства. и введения векторсодержащих клеток теплокровному животному. Вкратце. клетки. которые направляются домой - в кость. могут быть получены непосредственно из кости пациентов (например. клетки. полученные из костного мозга. такие как ΟΌ34+. остеобласты. остеоциты и т.п.) из периферической крови или из культур. Репрезентативные примеры подходящих векторов включают вирусные векторы. такие как герпесвирусные векторы (например. Патент США № 5288641). аденовирусные векторы (например. Х0 94/26914. Х0 93/9191; Ко11к е! а1.. Р^8 91(1):215-219. 1994; Какк-Е1к1ег е! а1.. Р^8 90(24): 11498-502. 1993; Спптап е! а1.. С1гси1айоп 88(6):2838-48. 1993; Спутан е! а1.. С1г. Кек. 73(6): 1202-1207. 1993; 2аЬпег е! а1.. Се11 75(2):207-216. 1993; Ь1 е! а1.. Нит Сепе Тйег. 4(4):403-409. 1993; Сай1аиб е! а1.. Еиг. 1. №игока. 5(10:1287-1291. 1993; Ушсеп! е! а1.. №11. Сепе!. 5(2): 130-134. 1993; ЧаГГе е! а1.. №11. Сепе!. 1(5):372-378. 1992; и Ьеугего е! а1.. Сепе 101 (2): 195-202. 1991). аденоассоциированные вирусные векторы (Х0 95/13365; Е1ойе е! а1.. РNΑ8 90(22): 10613-10617. 1993). бакуловирусные векторы. парвовирусные векторы (Коеппд е! а1.. Нит. Сепе Тйегар. 5:457-463. 1994). поксвирусные векторы (Ратса11 апб Рао1ейи. РNΑ8 79:4927-4931. 1982 и 0ζη1<ί е! а1.. ВюсНет. ВюрНук. Кек. Сотт. 193(2):653-660. 1993) и ретровирусы (например. ЕР 0415731; Х0 90/07936; Х0 91/0285. Х0 94/03622; Х0 93/25698; Х0 93/25234; Патент США № 5219740; Х0 93/11230; Х0 93/10218). Могут быть также сконструированы вирусные векторы. которые содержат смесь различных элементов (например. промоторов. последовательностей оболочки и т.п.) из различных вирусов или невирусных источников. В различных вариантах осуществления либо сам вирусный вектор. либо вирусная частица. которая содержит этот вирусный вектор. могут быть использованы в описанных ниже способах и композициях.
В других вариантах осуществления данного изобретения молекулы нуклеиновых кислот. которые кодируют молекулу. которая ингибирует связывание полипептида 808Т с членом ТСЕ-бета-семейства. могут вводиться различными способами. в том числе. например. введением асиалоозомукоида (А80К). конъюгированного с комплексами поли-Ь-лизин-ДНК (Сйк!апо е! а1.. РNΑ8 92122-92126. 1993). ДНК. связанной с убитым аденовирусом (Сийе1 е! а1.. Нит. Сепе ТЕег. 3(2):147-154. 1992). цитофектинопосредованным введением (ОМК1Е-00РЕ. У1са1. СаНГогша). прямой инъекцией ДНК (АскабЧ е! а1.. №!иге 352:815-818. 1991); ДНК-лиганда (Хи е! а1.. 1. оГ Вю1. СЕет. 264:16985-16987. 1989); липофекцией (ЕеЧдпег е! а1.. Ргос. №6. Асаб. 8ск и8А 84:7413-7417. 1989); липосомами (Рюкеппд е! а1.. Сагс. 89(1):1321. 1994; и Хапд е! а1.. РNΑ8 84:7851-7855. 1987); бомбардировкой микроснарядами (ХиШатк е! а1.. РNΑ8 88:2726-2730. 1991) и прямой доставкой нуклеиновых кислот. которые кодируют сам этот белок. отдельно (Уйе апб Най. Сапсег Кек. 53:3860-3864. 1993) или с использованием комплексов ПЭГнуклеиновая кислота.
Определение увеличенного минерального содержания кости может выполняться непосредственно с
- 37 015166 использования рентгеновских лучей (например, Оиа1 Епегду Х-гау АЬкогр!оте!гу или ΌΕΧΑ) или опосредованно на основе маркеров обновления кости (таких как остеобласт-специфическая щелочная фосфатаза, остеокальцин, пропептид проколлагена С' типа 1 (РГСР) и общая щелочная фосфатаза; см. Согшег, Сигг. 0рш. ш ЕНеи. 7:243, 1995) или с использованием маркеров резорбции кости, (в том числе пиридинолина, дезоксипиридинолина, Ютелопептида, гидроксипролина мочи, тартрат-резистентных кислых фосфатаз и галактозилгидроксилизина плазмы; (см. Согшег, кирга). Количество массы кости может быть также рассчитано из масс тела или другими способами (см. Сишпекк-Неу, Ме!аЬ. Вопе Όίκ. Ее1а!. Еек. 5:177-181, 1984).
Как будет очевидно специалисту с квалификацией в данной области, количество и частота введения будет зависеть, конечно, от таких факторов, как характер и тяжесть показания, подлежещего лечению, желаемой реакции, состояния пациента и т. д. Обычно эти композиции могут вводиться различными способами, как отмечалось выше.
Следующие примеры предоставлены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
Примеры
Пример 1. Моделирование внутреннего района (кора) склеростина.
Способы узнавания гомологии (например, Р8РВВА8Т (А1!ксНи1 е! а1., ШсШс Ас1бк Еек. 25:3389-402 (1997)), ЕИСИЕ (8Ы е! а1., 1. Мо1. Вю1. 310:243-57 (2001)) предполагали, что внутренний район (кор) 808Т (808Т_Соге) принимает укладку цистинового узла. ЕИСИЕ является чувствительным способом для детектирования гомологии между последовательностями и структурами. Хорионический гонадотропин β человека (НСС-β), для которого известна экспериментально определенная 30-структура, идентифицировали при помощи ЕИСИЕ (8Н е! а1., кирга) как самый близкий гомолог 808Т_Соге. Таким образом, НСС-β использовали в качестве структурного шаблона для построения 30-моделей для 808Т_Соге.
Выравнивание 808Т_Соге и его близких гомологов показано на фиг. 1. Среди гомологов, показанных в этом выравнивании, только НСС-β (ССНВ) имел известную 30-структуру. Идентичность последовательности между 808Т_Соге и НСС-β была приблизительно 25%. Восемь остатков СУ8 были консервативными во всем семействе, подчеркивая общее структурное сходство между 808Т_Соге и НСС-β. Три пары цистинов (1-5, 3-7, 4-8) образовывали дисульфидные связи (показанные жирными линиями на фигуре 1) в конфигурации узла, которая была характерной для укладки цистинового узла. Дополнительная дисульфидная связь (2-6), показанная пунктирной линией на фигуре 1, была уникальной для этого семейства и отличала это семейство белков от других семейств с цистиновым узлом (например, ТСЕ-β, ВМР).
808Т_Соге моделировали с использованием РОВ (Вегтап е! а1., Ас!а Сгук!а11одг. ϋ. Вю1. Сгук!а11одг. 58(Р! 6 Р!1):899-907 (2002)), вход 1НСН 3О-структура НСС-β (№и е! а1., 8!гис!иге 2:545-58 (1994)), в качестве структурного шаблона. Модели рассчитывали с использованием программы М0ОЕИЕЕ (8а11 апб В1ипбе11, 1. Мо1. Вю1. 234:779-815 (1993)). Снимок наилучшей модели показан на фигуре 2.
Большинство белков с цистиновыми узлами образуют димеры вследствие отсутствия гидрофобного кора в мономере (8сНеиПег е! а1., кирга; 8сЫипеддег апб Сгийег, 1. Мо1. Вю1. 231:445-58 (1993)); \Уи е! а1., кирга). 808Т, по-видимому, подчиняется тому же самому правилу и образует гомодимер для увеличения его стабильности. Конструирование модели для димеризованного района 808Т_Соге представляло несколько трудностей, которые было бы важно преодолеть, так как (1) сходство последовательности между 808Т_Соге и НСС-β было низким (25%); (2) вместо гомодимера, НСС-β образовывал гетеродимер с НССα; и (3) ряд различных родственных конформаций мономеров наблюдали в димеризованных белках с цистиновыми узлами из различных семейств (например, РОСЕ, ТСЕ-β, нейротрофин, Ш-ПЕ, гонадотропин), что предполагало, что димерная конформация 808Т могла бы значимо отклоняться от гетеродимерной конформации НСС-α/β. При конструировании этой модели НСС-α заменяли НСС-β из гетеродимерной структуры (1НСЮ), с использованием способов структурного наложения, комбинированных с мануальной коррекцией, и затем строили модель гомодимера 808Т_Соге в соответствии с этой псевдоструктурой гомодимера НСС-β. Окончательная модель представлена на фигуре 3.
Пример 2. Моделирование взаимодействия 808Т-ВМР.
Этот пример описывает белковое моделирование сайтов связывания рецепторов типа Ι и типа ΙΙ на ВМР, которые участвуют во взаимодействии между ВМР и 808Т.
Конкурентные исследования продемонстрировали, что 808Т конкурировал с рецепторами как типа Ι, так и типа ΙΙ за связывание с ВМР. В конкурентном анализе на основе ЕЫ8А ВМР-6 селективно взаимодействовал с покрытой склеростином последовательностью (300 нг на лунку) с высокой аффинностью (Кс = 3,4 нМ). Увеличивающиеся количества рецептора ВМР (Ес-слитой конструкции) конкурировали со склеростином за связывание с ВМР-6 (11 нМ) (ΙΟ50 = 114 нМ). 10-кратный молярный избыток этого рецептора ВМР был достаточным для уменьшения связывания склеростина с ВМР-6 приблизительно на 50%. Эту конкуренцию наблюдали также со слитым белком ВМР-рецептор ΙΙ-Ес (ΙΟ50 = 36 нМ) и ^ΑN (ΙΟ50 = 43 нМ). Специфичность этого анализа была показана отсутствием конкуренции за связывание ВМР-6 между склеростином и слитым белком гАсйуш Е1В-Ес, членом семейства рецепторов ТСЕ-β, который не связывал ВМР.
- 38 015166
Сайты связывания рецепторов типа I и типа II на полипептиде ВМР были картированы и пространственно разделены (8сйеиДег е! а1., зирга; Iηη^з е! а1., зирга; №ске1 е!. а1., зирга; Наг! е! а1., зирга). Модд1п, другой антагонист ВМР, который связывается с ВМР с высокой активностью, контактирует с ВМР при обоих сайтах связывания рецептора типа I и рецептора типа II через Ы-концевую часть Ыоддт (Огорре е! а1., зирга). Две β-цепи в районе кора вблизи С-конца также контактируют с ВМР при сайте связывания рецептора типа II.
Мануально доведенное выравнивание Моддт и 8О8Т показало, что эти два полипептида имеют сходство последовательности между М-концевыми частями этих белков и между районами внутренней части (кора). Выравнивание аминокислотных последовательностей представлено на фигуре 4. Остатки цистеина, которые образуют характерный цистиновый узел, были консервативными между Ноддт и 8О8Т. Общая идентичность последовательностей была 24%, а идентичность последовательностей в N концевом связывающем районе (положения 1-45 выравнивания) была 33%. Сообщалось, что два остатка в Н-концевом связывающем районе Нодд1п, а именно Ьеи (Ь) в положении 21 выравнивания и О1и (Е) в положении 23, играют важную роль в связывании ВМР (Огорре е! а1., зирга). Оба остатка были также консервативными в 8О8Т. Сходство последовательности в районе кора (положения 131-228 выравнивания) было приблизительно 20%, но каркас суз-узла сохранялся и достаточное количество ключевых остатков были консервативными, подтверждая гомологию между Ходдт и 8О8Т.
Структуру Коддт сравнивали с 8О8Т также для выяснения, каким образом димеризуются два мономера 8О8Т. Как показано на фигуре 5, структура №дщп предполагала, что линкер между К-концевым районом и районом кора не только играл роль в соединении этих двух районов, но также образовывал часть границы раздела димеризации между двумя мономерами Ходёт. Одним большим различием между Ходди! и 8О8Т было то, что линкер между N-концевым районом и районом кора был гораздо более коротким в 8О8Т.
С-концевой район 8О8Т может играть роль в димеризации 8О8Т. Последовательность №дщп заканчивалась районом кора, тогда как 8О8Т имел дополнительный С-концевой район. В структуре Ходдт дисульфидная связь соединяла С-концы двух мономеров Nοдд^η. Таким образом, С-концевой район 8О8Т начинался близко к границе раздела двух мономеров и мог способствовать димеризации. Кроме того, предсказание вторичной структуры показало, что некоторые части С-концевого района 8О8Т имели тенденцию образования спиралей. Этот район в 8О8Т может быть ответственным за активность димеризации, возможно, через упаковку спираль-спираль, которая имитировала функцию более длинного линкера в Nοдд^η. Другим различием между структурой Nοдд^η и 8О8Т была инсерция аминокислоты в районе кора 8О8Т в положениях 169-185 выравнивания (см. фигуру 4). Эта инсерция удлиняла βшпильку, которая была направлена к поверхности раздела димеризации в структуре Nοдд^η (показано на фигуре 5 в виде района петли в середине этих мономеров и выше С-концевого остатка Суз). Эта удлиненная β-шпилька могла также способствовать димеризации 8О8Т.
Пример 3. Конструирование и получение пептидных иммуногенов 8О8Т.
Этот пример описывает конструирование пептидных иммуногенов 8О8Т, которые используют для иммунизации животных и генерирования антител, которые блокируют взаимодействия между ВМР и 8О8Т и предотвращают образование димеров мономеров 8О8Т.
Связывающие ВМР фрагменты.
Общее сходство между 8О8Т и Ходди! и сходство между N-концевыми районами этих двух полипептидов предполагают, что 8О8Т может взаимодействовать с ВМР подобно взаимодействию Ходди!. То есть, ^концевой район 8О8Т может взаимодействовать с сайтами связывания рецептора как типа I, так и типа II на ВМР, а часть района внутренней части (кора) (положения аминокислот 190-220 в выравнивании на фигуре 4) может взаимодействовать с сайтом связывания рецептора типа II таким образом, что антитела, специфические для этих районов 8О8Т, могут блокировать или нарушать связывание ВМР с 8О8Т.
Аминокислотные последовательности этих полипептидных фрагментов 8О8Т для 8О8Т крысы и человека являются следующими.
8О8Т_N_^^ηке^: ^концевой район (включает короткий линкер, который соединяется с районом кора).
Человек: 06М0АРК\ПА¥Е11РЕЕ6Е¥РЕРРРЕЕЕ\\К¥М\ЯАЕ\6ЯЯРРННРРЕ¥КПУ8Е¥8 (8 ЕР) ГО ^:47).
Крыса: 06М0АРК\ПА¥Е11Р6ЕЯЕ¥РЕРРОЕЕЕ\\О¥М\ЯАЕ\66ЯРРННР¥т'КПУ8Е¥8 (8ЕР) ГО ]\Ю:48).
8О8Т_Соге_В1пб: Часть района кора, которая, вероятно, контактирует с ВМР при его сайте связывания рецептора типа II (слегка удлиненная на обоих концах для включения якорей захвата остатка СУ8):
Человек: С1Р1)Я¥1Я\ОЯ\4ЯЕСРР1Р1ЕР\Р1ЯШКУЯЕУА8С (8ЕР) ГО 1\Ю:49).
Крыса: С1Р1)И¥1Я\ОИ\4ЯЕСРР1Р1ААРИ8ИКУИЕУА8С (8ЕР) ГО ]\Ю:50).
- 39 015166
Фрагменты димеризации 8О8Т.
С-концевой район 8О8Т, вероятно, участвует в образовании гомодимеров 8О8Т (см. пример 2). Удлиненная β-шпилька может также играть роль в образовании гомодимера. Антитела, которые специфически связываются с такими районами, могут предотвращать или нарушать димеризацию мономеров 8О8Т, что, в свою очередь, может подавлять взаимодействие между 8О8Т и ВМР. Полипептидные фрагменты в 8О8Т крысы и человека, соответствующие этим районам, являются следующими.
8О8Т_С: С-концевой район.
Человек: ^ТЯЕНN^8Е^К^ЕСТЕААЯР^КСЯКРЯРЯАЯ8АКАN^АЕ^ЕNАΥ (8Е^ ГО КО:51). Крыса: ^ТЯЕНN^8Е^К^ЕСРЕТАЯР^КСЯКРЯРЯАЯСАКАN^АЕ^ЕNАΥ (8Е^ ГО КО:52). 8О8Т_Соге_Э1тег: часть района кора, которая, вероятно, участвует в димеризации 8О8Т (слегка удлиненная на обоих концах для включения якорей захвата остатка СΥ8):
Человек: ССРАЯ^^РNАIСЯСК^^ЯР8СР^ЕЯС (8Е^ ГО Ш:53).
Крыса: ССРАЯЬЕРКАЮЯУК^^ЯРКСРПЕЯС (8Е^ ГО КО:54).
Связывающий ВМР фрагмент на Ν-конце 8О8Т.
Ключевой Ν-концевой связывающий район 8О8Т (положения 1-35 выравнивания на фигуре 4) моделировали на основе структуры комплекса М)дд1п/ВМР-7 (вход № 1М4И Банка данных белков) и выравнивания аминокислотных последовательностей (см. фигуру 4) для идентификации аминокислотных остатков Ν-конца 8О8Т, которые, вероятно, взаимодействуют с ВМР. Модель 8О8Т представлена на фигуре 6. В этой сравнительной модели, фенилаланин (РИе, Е) в положении 8 выравнивания (см. стрелку и сопутствующий текст) в последовательности 8О8Т выступает в гидрофобный карман на поверхности ВМР-димера. Тот же самый признак выпуклость-в-углубление наблюдали в структуре комплекса ВМР и рецептора типа I (№ске1 е! а1., кирга), где Р1е85 этого рецептора соответствует тому же самому карману, что является ключевым признаком узнавания лиганд-рецептор типа I для членов ТСЕ-бетасуперсемейства (включающего, например, ТСЕ-бета-семейство, ВМР-семейство и т.п.). Согласно этой модели консервативным является также управляемый пролином (Рго) виток, который позволяет Νконцевому связывающему фрагменту проходить вдоль поверхности ВМР-димера, перемещаясь от сайта связывания рецептора типа I к сайту связывания рецептора типа II на другой стороне этого комплекса. Консервативным является также другой управляемый пролином (Рго) виток вблизи карбокси-конца связывающего фрагмента, который затем соединяется с районом линкера. Сильные контакты между 8О8Т и ВМР являются очевидными на фиг. 6.
Пептидные иммуногены.
Были сконструированы пептиды для включения Ν-концевого района 8О8Т, который, как было предсказано, осуществляет контакт с ВМР-белками. Эти пептидные последовательности представлены ниже. Для иммунизации животных эти пептидные последовательности были сконструированы так, что они являются перекрывающимися, и был добавлен дополнительный цистеин к С-концу для облегчения сшивания с КЬН. Затем эти пептиды использовали для иммунизации. Пептидные последовательности этих иммуногенов являются следующими:
8О8Т человека:
ΟΟΜΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΕΙ-ΟΕΥ (ЗЕО Ю N0:2)
ΤΕΙΙΡΕΙ_(3ΕΥΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝ (ЗЕО Ю N0:3)
ΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝΚΤΜΝΚΑΕΝ(3<3 (ЗЕО Ю N0:4)
ΚΤΜΝΚΑΕΝ06ΡΡΡΗΗΡΡΕΤΚ (ЗЕО Ю N0:5) ΚΡΡΗΗΡΡΕΤΚϋν3ΕΥ3 (ЗЕО Ю N0:6) Пептиды 8ОЗТ человека с дополнительным Суз: 00νν0ΑΡΚΝ0ΑΤΕ1ΙΡΕ10ΕΥ-0 (ЗЕО Ю N0:7) ΤΕΙΙΡΕ1_(3ΕΥΡΕΡΡΡΕΙ_ΕΝΝ-0 (ЗЕО Ю N0:8) ΡΕΡΡΡΕ1_ΕΝΝΚΤΜΝΚΑΕΝ00-0 (ЗЕО Ю N0:9) ΚΤΜΝΠΑΕΝΟΟΠΡΡΗΗΡΡΕΤΚ-С (ЗЕО Ю N0:10) ΠΡΡΗΗΡΡΕΤΚϋν8ΕΥ3-0 (ЗЕО Ю N0:11) 808Т крысы:
ΟΟννΟΑΡΚΝΟΑΤΕΙΙΡΟΙΠΕΥΡΕΡΡ (ЗЕО Ю N0:12)
ΡΕΡΡΟΕί,ΕΝΝΟΤΜΝΡΑΕΝΟΟ (ЗЕО Ю N0:13) ΕΝΟΟΚΡΡΗΗΡΥΟΤΚθν3ΕΥ8 (ЗЕО Ю N0:14) ΤΕΙΙΡ6Ι-ΚΕΥΡΕΡΡ0ΕΙ-ΕΝΝ (ЗЕО Ю N0:15) Пептиды ЗОЗТ крысы с дополнительным Суз: 06νν0ΑΕΚΝ0ΑΤΕΙΙΡ(31_ΡΕΥΡΕΡΡ-0 (ЗЕО Ю N0:16) ΡΕΡΡΟΕΙΕΝΝΟΤΜΝΡΑΕΝΟΟ-С (ЗЕО Ю N0:17) ΕΝ06ΡΡΡΗΗΡΥϋΤΚ0ν3ΕΥ3-0 (ЗЕО Ю N0:18) ΤΕΙΙΡΟΙΡΕΥΡΕΡΡΟΕί-ΕΝΝ-Ο (ЗЕО Ю N0:19)
- 40 015166
Следующие пептиды были сконструированы таким образом, что они содержат аминокислотную часть района кора, которая, согласно предсказанию, осуществляет контакт с ВМР-белками. Цистеин добавляли на С-конце каждого пептида для конъюгации с КЬН, и эти конъюгированные пептиды использовали для иммунизации. В Эосктд Соге №!егтта1 Рерббе внутренний цистеин заменяли на серин во избежание двойной конъюгации с КЬН.
Для 8О8Т человека:
Аминокислотная последовательность без добавленных остатков Сук:
Ооск1пд_Соге_М4егпипа1_Рер(1с1е: ΙΡϋΡΥΡΑΟΡνΟΙΙΟΡΟΟΕΑΡ (8ΕΩ Ю
N0:21)
Ооск1пд_Соге_С-1егт1'па1_Рер11с1е: 01_1_СР60ЕАРКАКК7К1Л/А8 (8ΕΘ Ю
N0:22)
Аминокислотная последовательность с добавленными остатками Сук:
Ооск1пд_Соге^-1егт1па1_Рер11с1е: ΙΡ0ΡΥΡΑ0Ρν0Ι_1_0Ρ06ΕΑΡ-0 (8Е0 Ю
N0:23)
Ооск1пд_Соге_С-1егт1па1_Рер11с1е: ОкЬСРОСЕАРРАРКУРкУАЗ-С (8Е0 Ю
N0:24)
Для 8О8Т крысы:
Аминокислотная последовательность без добавленных или замененных остатков Сук:
Ооск1пд_Соге_^1егт1па1_Рер11с1е: ΙΡϋΙ4ΥΚΑ0Ρν0Ι±0Ρ(36 (8Е0 Ю N0:25) □оск1пд_Соге_С-1егт1па1_Рерйс1е: Ρ00ΑΑΡΡ8ΚΚνκΐ_νΑ3 (8Е0 Ю N0:26) Пептидные иммуногены с добавленными или замененными остатками Суэ: Ооск1пд_Соге_№1егт|'па1_Рер11с1е: ΙΡ0ΚΥΚΑΟΕ*νθΙ_Ι_8Ρ6Ο-0 (8Е0 Ю N0:27) Ооск1пд_Соге_С-1епп1па1_Рер11с1е: Ρ(36ΑΑΡΕ3ΚΚνΡΐνΑ8-0 (8Е0 Ю N0:28)
Два района в 8О8Т, которые потенциально взаимодействуют с образованием гомодимеров 8О8Т, включают аминокислоты с районом кора 8О8Т, которые не присутствуют в ^ддт. Пептиды 8О8Т человека, сконструированные таким образом, что они содержат эту последовательность, имели С-концевой Сук или Ν-концевой Сук, который был конъюгирован с КЬН. Для пептида 8О8Т крысы цистеин добавляли к карбокси-концу последовательности (8Е^ ГО N0:31). Конъюгированные с КЬН пептиды использовали для иммунизации.
Для 8О8Т человека:
ΟΟΡΑΡΙ_Ι_ΡΝΑΙΟΡ(3ΚννννΡΡ8 (8Е0 Ю N0:29)
ΙΟΡΟΚννννΡΡδΟΡϋΕΡΟ (8Е0 Ю N0:30)
Для 8О8Т крысы:
ΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΟΡΟΡΡ (8Е0 Ю N0:31)
Пептид 8О8Т крысы с добавленным цистеином
ΡΝΑΙΟΡνκννννΡΡΝΟΡΟΕΡ-Ο (8Е0 Ю N0:32)
Второй район в 8О8Т, который потенциально взаимодействует с образованием гомодимеров 8О8Т, включает С-концевой район. Пептидные иммуногены конструировали таким образом, чтобы они включали аминокислотные последовательности в этом районе (см. ниже). Для конъюгации с КЬН добавляли остаток цистеина к С-концевой стороне, и эти конъюгированные пептиды использовали для иммунизации.
Для 8О8Т человека:
ΚΡΙ_ΤΡΕΗΝΟδ ΕΙ_ΚϋΡΟΤΕΑΑ (8ΕΩ Ю N0:33)
ЕЬКОРбТЕАА РРОКСРКРРР (8ΕΘ Ю N0:34)
ΡΡΩΚΟΡΚΡΡΡ ΡΑΡ8ΑΚΑΝΩΑ (8Е0 Ю N0:35)
ΡΑΚ8ΑΚΑΝΩΑ ΕίΕΝΑΥ (8ΕΩ Ю N0:36)
Пептидные иммуногены с Сук, добавленным на С-конце:
ΚΚίΤΡΕΗΝΩδ ЕЬКОЕОТЕАА-С (8Е0 Ю N0:37)
ЕЬКОЕбТЕАА ΡΡΩΚΟΡΚΡΡΡ-С (8ΕΩ Ю N0:38)
ΡΡΩΚΟΡΚΡΚΡ ΡΑΚ8ΑΚΑΝΩΑ-Ω (8Е0 Ю N0:39)
ΡΑΚ8ΑΚΑΝΩΑ ΕΙ_ΕΝΑΥ-0 (8ΕΩ Ю N0:40)
Для 8О8Т крысы:
ΚΡΙΤΡΡΗΝΩ8ΕΙΚ0ΡΩΡΕΤΑΚΡΩ (8ΕΩ Ю N0:41)
ΚΩΡΚΡΡΡΚΑΡΩΑΚΑΝΩΑΕΙΕΝΑΥ (8ΕΩ Ю N0:42) δΕίΚΟΕΩΡΕΤΑΚΡΩΚΟΗΚΡΡΡΡΑΡ (8ΕΩ Ю N0:43)
Пептидные иммуногены с Сук, добавленным на С-конце:
- 41 015166
ΚΕΦΤΚΕΗΝΟδΕίΚΟΕΟΡΕΤΑΚΡΟ-Ο (8ΕΟ Ю N0:44)
ΚΟΡΚΡΚΡΡΑΡΟΑΚΑΝΟΑΕΙΕΝΑΥ-С (5ΕΟ Ю N0:45)
8Е1_КОЕ6РЕТАКРОКСЗРКРРРРАР-С (8Е0 Ю N0:46)
Пример 4. Анализ для детектирования связывания антител с ТОЕ-бета связывающим белком.
Этот пример описывает анализ для детектирования связывания лиганда, например антитела или фрагмента антитела, со склеростином.
Слитый белок ЕБАО®-склеростин получали в соответствии с протоколами, обеспеченными изготовителем (81дта АШпсЕ, 8ΐ. Бошз, МО), и как описано в патенте США № 6395511. Каждую лунку 96луночного микротитрационного планшета покрывают моноклональным антителом против ЕБАО® (81дта АШпсЕ) и затем блокируют 10% БСА в ФСБ. Слитый белок (20 нг) добавляют к 100 мкл ФСБ/0,2% БСА и адсорбируют на 96-луночном планшете в течение 60 мин при комнатной температуре. Этот раствор белка удаляют и лунки промывают для удаления несвязанного слитого белка. ВМР, например ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 или ВМР-7, разводят в ФСБ/0,2% БСА и добавляют в каждую лунку при концентрациях в диапазоне 10 пМ-500 нМ. После инкубирования в течение 2 ч при комнатной температуре этот раствор для связывания удаляют и планшет промывают три раза 200 мкл ФСБ/0,2% БСА. Связывание ВМР со склеростином детектируют с использованием поликлональной сыворотки или моноклонального антитела, специфических в отношении ВМР, и подходящего фермент-конъюгированного реагента второй стадии в соответствии со стандартными способами ЕБ18А (см., например, АизиЬе1 еб а1., Сиггеп! Рго1осо1з 1п Мо1 Вю1. Уо1 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). Специфическое связывание рассчитывают вычитанием неспецифического связывания из общего связывания и анализируют с использованием программы Б1ОА№О (Мипкоп апб РобЬагб, Апа1. ВюсЕет. 107:220-39 (1980)).
Связывание склеростина с ВМР детектируют также гомогенным детектированием с разделенной во времени флуоресценцией (Ме11ог е! а1., I Вюто1. 8сгеептд, 3:91-99 (1998)). Полинуклеотидную последовательность, кодирующую склеростин, функционально связывают с константной областью иммуноглобулина человека в рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты и экспрессируют в виде слитого белка Ес человека-склеростин в соответствии со способами, известными в данной области и описанными здесь. Подобным образом, лиганд ВМР конструируют и экспрессируют в виде слитого белка ВМРмышиный Ес. Эти два слитых белка инкубируют вместе и анализ проводят, как описано Ме11ог еб а1.
Пример 5. Анализ-скрининг на антитела, которые ингибируют связывание членов ТОЕ-бетасемейства с ТОЕ-связывающим белком.
Этот пример описывает способ для детектирования антитела, которое ингибирует связывание члена ТОЕ-бета-семейства со склеростином. ЕБ18А выполняют, по существу, как описано в примере 4, за исключением того, что концентрацию ВМР поддерживают фиксированной при ее К) (определенной, например, анализом В1Асоге). Кроме того, антитело или библиотеку или коллекцию антител добавляют в лунки до концентрации 1 мкМ. Антитела инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с ВМР и склеростином, раствор удаляют и связанный ВМР определяют количественно, как описано (см. пример 4). Антитела, которые ингибируют 40% связывания ВМР, наблюдаемого в отсутствие антитела, считают антагонистами этого взаимодействия. Эти антитела дополнительно оценивают в качестве потенциальных ингибиторов выполнением исследований с титрованием для определения их констант ингибирования и их действия на связывающую аффинность ТОЕ-бета-связывающего белка. Анализы контролей сравнимой специфичности могут быть также проведены для установления профиля селективности для идентифицированного антагониста с использованием анализов, зависимых от действия лиганда ВМР (например, конкурентного исследования с использованием ВМР/ВМР-рецептора).
Пример 6. Ингибирование локализации ТОЕ-бета-связывающего белка в матриксе кости.
Оценку ингибирования локализации в матриксе кости (гидроксиапатите) проводят с использованием модификаций в отношении способа Николаса (№1со1аз, Са1с1£ Т18зие 114. 57:206-12, 1995). Вкратце, 1251меченый ТОЕ-бета-связывающий белок получают, как описано №1со1аз (зирга). В каждую лунку 96луночного планшета, снабженную полипропиленовой фильтрующей мембраной (Ро1уй11тотс, АеутоиШ МА), добавляют гидроксиапатит. ТОЕ-бета-связывающий белок, разведенный в 0,2% альбумине в ФСБ, затем добавляют в лунки. Лунки, содержащие матрикс, промывают 3 раза 0,2%) альбумином в ФСБбуфере.
Адсорбированный ТОЕ-бета-связывающий белок элюируют с использованием 0,3 М №аОН и затем определяют количественно.
Антитело или другой агент, которые ингибируют или нарушают связывание ТОЕ-бетасвязывающего белка склеростина с гидроксиапатитом, идентифицируют посредством инкубирования ТОЕ-бета-связывающего белка с этим антителом и нанесением этой смеси на матрикс, описанный выше. Матрикс промывают 3 раза 0,2% альбумином в ФСБ. Адсорбированный склеростин элюируют с использованием 0,3 М №аОН и затем определяют количественно. Антитело, которое ингибирует связывание склеростина с гидроксиапатитом по меньшей мере на 40% по сравнению с уровнем связывания, наблюдаемого в отсутствие антитела, считают ингибитором локализации в кости. Такое антитело дополнительно характеризуют посредством исследований доза-ответ для определения его константы ингибирования
- 42 015166 и его влияния на связывающую аффинность ТОЕ-бета-связывающего белка.
На основании вышеизложенного, хотя конкретные варианты осуществления данного изобретения были описаны для целей иллюстрации, различные модификации могут быть произведены без отклонения от идеи и объема данного изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, за исключением прилагаемой формулы изобретения.
8ЕС)кТЛСЕ Ы8ТГЫО <110> М1пк1ег, ϋηνίά <3.
ЗЫ, Луе
ЬаСйат, бойп <120> ΑΝΤΙΒ00ΙΕ3 ЗРЕС1Р1С РОЕ ЗСЬЕКОЗИЫ ΑΝϋ ΜΕΤΗΟΌ3 ГОК ΙΝ0ΚΕΆ3ΙΝ0 ΒΟΝΕ ΜΙΝΕΚΑΗΖΑΤΙΟΝ <130> 60117-127 <140>
<141> 2004-06-15 <150> иЗ 60/478,977 <151> 2003-06-16 <160> 112 <170> РазкЗЕ<2 £ог Ηίηάον/з Уегзиоп 4.0 <210> 1 <211> 190 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400? 1
<31п <31у Тгр <31п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг <31и Не 11е Рго <31и
1 5 10 15
Ьеи С1у С1и Туг Рго <31и Рго Рго Рго <31и Ьеи 01и Азп Азп Ьуз ТЬг
20 25 30
Мес Азп Агд А1а <31и Азп (31у <31у Агд Рго Рго Нйз Низ Рго РЬе <31и
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег С1 и Туг Зег Суз Агд <31и Ьеи ΗΪ3 РЬе ТЬг Агд
50 55 60
Туг Уа1 ТЬг Азр <31у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг С1 и Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Суз Зег С1у <31п Суз С1у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е
85 90 95
<31у Агд <31у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег <31у Рго Азр РЬе Агд Суз 11е
100 105 110
Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п Агд Уа1 <31п Ьеи Ьеи Суз Рго (31у <31у
115 120 125
(31и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз
130 135 140
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп <31 п Зег <31и Ьеи Ьуз Азр РЬе <31у
14 5 150 155 160
ТЬг <31и А1а А1а Агд Рго (31п Ьуз С1у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а
165 170 175
Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп О1п А1а (31и Ьеи С1и Азп А1а Туг
130 185 190
<210> 2
<211> 20
<212> РКТ
- 43 015166 <213 > Ното зархепз <400> 2
О1п О1у Тгр С1п А1а РЬе Ьуз Азп
1 Ьеи С1у О1и Туг 5
20
<210> 3
<211> 20
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 3
ТЬг О1и Не Не Рго О1и Ьеи О1у
1 5
Ьеи О1и Азп Азп
20
<210> 4
<211> 20
<212> РНТ
<213> Ното зархепз
<400> 4
Рго О1и Рго Рго Рго О1и Ьеи О1и
1 5
О1и Азп 01у С1у
20
<210> 5
<211> 20
<212> РКТ
<213> Ното ! эартепз
<400> 5
Ьуз ТЬг МеС Азп Агд А1а О1и АЗП
1 5
РЬе С1и ТЬг Ьуз
20
<210> 6
<211> 16
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 6
Агд Рго Рго Нхз Нхз Рго РЬе С1и
1 5
Азр А1а ТЬг О1и Не Не Рго О1и 10 15
О1и Туг Рго О1и Рго Рго Рго С1и
15
Азп Азп Ьуз ТЬг МеС Азп Агд А1а
15
С1у О1у Агд Рго Рго Нхз Нхз Рго
15
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег О1и Туг Зег
15 <210> 7 <211> 21 <212> РКТ
- 44 015166 <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <22'0>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫбе £гадтеп£ «1СЬ аббхЫопа! сузЬебпе аббеб <400> 7
С1п С1у Тгр С1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг О1и Не 11е Рго С1и 15 Ю 15
Ьеи С1у <31и Туг Суз <210> 8 <211> 21 <212> РКТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫбе £гадтеп£ шЛЬ аббхЫопа! сузЕехпе аббеб <400> 8
ТЬг (31и 11е 11е Рго С1и Ьеи С1у С1и Туг Рго С1и Рго Рго Рго С1и
5 10 15
Ьеи О1и Азп Азп Суз <210> 9 <211> 21 <212> РКТ <213> АгЬ1£1С1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Нитап ЗОЗТ рер£1бе £гадтепЬ здтсЬ аббхЫопа! сузЬебпе аббеб <400> 9
Рго О1и Рго Рго Рго (31и Ьеи О1и Азп Азп Ьуз ТЬг МеС Азп Агд А1а 1 5 Ю 15 <31и Азп <31у С1у Суз .
<210> 10 <211> 21 <212> РКТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫбе £гадтеп£ «1СЬ аббхСхопа!
сузсехпе аббеб <400> 10
Ьуз ТЬг МеС. Азп Агд А1а О1и Азп О1у О1у Агд Рго Рго ΗΪ3 Н1з Рго
10 15
РЬе <31и ТЬг Ьуз Суз
- 45 015166 <210> 11 <211> 17 <212 > РКТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Нитап ЗОЗТ рерЫбе £гадтеп£ ибек аббхЫопа!
сузсехпе аббеб <400> 11
Агд Рго Рго ΗΪ3 ΗΪ3 Рго РЬе 1 5
Суз
<210> 12 <211> 24 <212> РКТ <213> КаССиз погуедхсиз <400> 12
С1п С1у Тгр С1п А1а РЬе Ьуз
5
Ьеи Агд С1и Туг Рго С1и Рго
Азп Азр А1а ТЬг С1и Не 10
Рго
11е
Рго 01 у <210> 13 <211> 20 <212> РКТ <213> Касеиз тогуедбсиз <400> 13
Рго С1и Рго Рго С1п (31и Ьеи С1и Азп Азп С1п ТЬг МеС Азп Агд А1а п 5 10 15
С1и Азп С1у (31у <210> 14 <211> 20 .
<212> РКТ <213> КаЬЬиз погуедхсиз <400> 14
С1и Азп С1у (31у Агд Рго Рго Н1з Н1з Рго Туг Азр ТЫ Ьуз Азр Уа1 ю ,г
Зег <31и Туг Зег <210> 15 <211> 20 <212> РКТ
- 46 015166 <213> КаЕСиз погуедхсиз <400> 15
ТНг С1и Не 11е Рго <31у Ьеи Агд 01и Туг Рго 01 и Рго Рго С1п 01и 1 5 10 15
Ьеи <31и Азп Азп '
<210> 16 <211> 25 <212> РКТ <213> АгЫ£хсха1 Зедиепсе <220>
<223> КаС ЗОЗТ рерсхбе £гадтеп£ νζΐύΗ аббхСхопа1 сузсехпе асНеб <400> 16
О1п С1у Тгр О1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг <31и Не Не Рго О1у 15 10 15
Ьеи Агд С1и Туг Рго 01 и Рго Рго Суз
25 <210> 17 <211> 21 <212> РКТ <213> АгСх£хсха1 Зедиепсе <220>
<223> КаС ЗОЗТ рерСхбе £гадтепс νχΗι асИхЕхопа! сузбехпе асМеб <400> 17
Рго О1и Рго Рго О1п О1и Ьеи О1и Азп Азп <31п ТНг Ме£ Азп Агд А1а
5 10 15 <31и Азп С1у О1у Суз <210> 18 <211> 21 <212> РКТ <213> АгСх£хсха1 Зедиепсе <220>
<223> Ка£ ЗОЗТ рербхбе £гадтепс νζϊύΐι абс!х£1опа1 сузбехпе абсЗеб <400> 18
С1и Азп С1у СЯу Агд Рго Рго Нхз Нхз Рго Туг Азр ТЬг Ьуз Азр Уа1 15 10 15
Зег 01и Туг Зег Суз <210> 19
- 47 015166 <211> 21 <212> РКТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Кас ЗОЗТ рерсббе £гадтепс «хСЬ абсНЫопа! сузоейпе аббеб <400> 19
ТЬг (31и Не 11е Рго <31у Ьеи Агд <31и Туг Рго С1и Рго Рго <31п С1и 15 10 15
Ьеи <31и Азп Азп Суз <210> 20 <211> 190 <212> РКТ <213 > КаССиз погуедхсиз <400> 20
(31п С1у Тгр С1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг Сби 1бе 11е Рго Сбу
1 5 10 15
Ьеи Агд С1и Туг Рго Сби Рго Рго <31 п Сби Ьеи Сби Азп Азп Сбп ТЬг
20 25 30
Мес Азп Агд А1а Сби АЗП <31у Сбу Агд Рго Рго Нбз ΗΪ3 Рго Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег Сби Туг Зег Суз Агд Оби Ьеи ΗΪ3 Туг ТЬг Агд
50 55 60
РЬе Уа1 ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз Рго Уаб ТЬг Сби Ьеи
65 70 75 80
Уа1 Суз Зег <31у С1п Суз <31у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е
85 90 95
С1у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп Сбу Рго Азр РЬе Агд Суз 11е
100 105 110
Рго Азр Агд Туг Агд А1а Сбп Агд Уаб Сбп Ьеи Ьеи Суз Рго Сбу Сбу
115 120 125
А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уаб Агд Ьеи Уаб А1а Зег Суз Ьуз Суз
130 135 14 0
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп Сбп Зег Сби Ьеи Ьуз Азр РЬе Сбу
145 150 155 160
Рго СЯи ТЬг А1а Агд Рго Сбп Ьуз Сбу Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а
165 170 175
Агд С1у А1а Ьуз А1а Анп <31п А1а Сби Ьеи Сби Азп Аба Туг
180 185 190
<210> 21 <211> 20 <212> РКТ <213> Ното зартепз <400> 21
11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1 <31п Ьеи Ьеи Суз Рго (31у 15 10 15 <31у С1и А1а Рго
- 48 015166 <210> 22 <211> 20 <212> РКТ ' <213 > Ното зарбепз <400> 22 (31п Ьеи Ьеи Суз Рго О1у С1у О1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд 15 10 15
Ьеи Уа1 А1а Зег <210> 23 <211> 21 ' <212> РКТ <213> АгС.1£1С1а1 Зес[иепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерНбе £гадтепс νζϊύ.Η абб1С1опа1 сузсегпе аббеб <400> 23
Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а О1п Агд Уа1 С1п Ьеи Ьеи Суз Рго О1у 1 5 10 15 <31 у С1и А1а Рго Суз <210> 24 <211> 21 <212> РКТ <213> АгС1£1С1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерСхбе £гадтеп£ ’.-АеЬ. абб±1:1опа1 сузсехпе аббеб <400> 24
С1п Ьеи Ьеи Суз Рго <31у О1у О1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд
5 10 15
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз <210> 25 <211> 17 <212> РКТ <213 > КаССиз Ыог-уедтсиз <400> 25
11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п Агд Уа1 С1п Ьеи Ьеи Суз Рго <31у
5 10 15
С1у <210> 26
- 49 015166 <211> 16 <212 > РКТ <213 > ЯаСЕиз погуедбсиз <400> 26
Рго О1у О1у А1а А1а Рго Агд 5ег
5
Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег
15 <210> 27 <211> 18 <212> РКТ <213> АгС1£1С1а1 Зедиепсе <220>
<223 > Кас ЗОЗТ рерЫбе £гадтепс аббеб <400> 27
Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п
5
С1у Суз «ΐιϊι аббПИопа! сузСебпе
Агд Уа1 <31п Ьеи Ьеи Зег Рго <31 у 10 15 <210> 28 <211> 17 <212> РКТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Кап ЗОЗТ рерЫбе £гадтеп£ аббеб <400> 28
Рго <31 у <31у А1а А1а Рго Агд Зег
5
Суз мбсИ. абббСъопа! сузСехпе
Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег 10 15 <210> 29 <211> 20 <212> РКТ <213> Ното зарбепз <400> 29
Суз С1у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго
5
Тгр Агд Рго Зег
Азп А1а 11е <31у Агд <31у Ьуз Тгр
15 <210> 30 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното зархепз
- 50 015166 <400> 30
Не <31у Агд С1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег С1у Рго Азр РЬе Агд Суз
10 15 <210> 31 .
<211> 18 <212> РЕТ <213> Кассиз погуедхсиз <400> 31
Рго Азп А1а 11е <31 у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп <31у Рго Азр 15 10 15
РЬе Агд <210> 32 <211> 19 <212 > РНТ · <213> АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Кае ЗОЗТ рерсхбе £гадтеп.С «хСЬ адсПСхопа! сузсехпе аЛЗеб <400> 32
Рго Азп А1а 11е <31у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп (31у Рго Азр
5 10 15
РЬе Агд Суз <210> 33 <211> 20 <212> РНТ <213> Ното зархепз <400> 33
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нхз Азп <31п Зег <31и Ьеи Ьуз Азр РЬе <31у 15 10 15
ТЬг <31и А1а А1а <210> 34 <211> 20 <212> РНТ <213> Ното зархепз <400> 34
С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе О1у ТЬг С1и А1а А1а Агд Рго (31п Ьуз С1у Агд 1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Рго <210> 35
- 51 015166
<211> 20
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 35
Агд Рго <31п Ьуз С1у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз
1 5 10 15
А1а Азп С1п А1а
20
<210> 36 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 36
Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп <31п А1а С1и Ьеи <31и Азп А1а Туг
5 10 15 <210> 37 <211> 21 <212> РКТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫбе £гадтеп£ мЬЬЬ абб1Ыопа1 сузСеЬпе аббеб <400> 37
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе НЬз Азп С1п Зег (31и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у
5 10 15
ТЬг С1и А1а А1а Суз <210> 38 <211> 21 <212> РКТ <213> АгСЬЕЬсЬа! Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рер£1бе £гадтеп£ «ЬЬЬ абб1£1опа1 сузСеЬпе аббеб <400> 38 (31и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у ТЬг <31и А1а А1а Агд Рго С1п Ьуз С1у Агд
5 10 15
Ьуз Рго Агд Рго Суз <210> 39 <211> 21 <212> РКТ <213> АгС1£Ьс1а1 Зедиепсе
- 52 015166 <220>
<223 > Нитап 503Т рерсгбе Егадтепк νί-кЬ абб1Ыопа1 судкегле аббеб <400> 39
Агд Рго Θΐη Ьуз С1у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз 1 . 5 10 15
А1а Азп 01л А1а Суз <210> 40 <211> 17 .
<212> РИТ <213> ΑΓύΐίίσΐβΙ Зедиепсе <220>
<223> Нитап ЗОЗТ рерЫЧе £гадтепк ъНкЬ аскИк1опа1 сузкегпе аЧЧеб <400> 40
Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп
1 Суз 5
<210> 41
<211> 23
<212> РКТ
<213> Каккиз погуедгсиз
<400> 41
Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Ηί3 Азп
1 5
Рго С1и ТЬг А1а Агд Рго СЧп
20
<210> 42
<211> 23
<212> РИТ
<213> Каккиг ί погуедхсиз
<400> 42
Ьуз <31у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд
1 5
А1а С1и Ьеи (31и Азп А1а Туг
20
<210> 43
<211> 24
<212> РКТ
<213> Наккиз , погуедхсиз
<400> 43
Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у Рго
Θΐη А1а <31 и Ьеи (31и Азп А1а Туг 10 15
С1п Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у
15
А1а Агд <31у А1а Ьуз А1а Азп <31п
15
С1и ТЬг А1а Агд Рго С1п Ьуз С1у
- 53 015166 .5 10 15
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд <210> 44 <211> 24 <212> РЕТ <213> АгЫ£1С1а1 Зедиепсе <220>
<223> КаС ЗОЗТ рерСхбе £гадтепс νίϋΗ айсНШопа! сузПебпе аббеб <400> 44
Ьуз Агд Ьеи ТНг Агд РЬе Н13 Азп С1п Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РНе <31у 15 10 15
Рго С1 и ТНг А1а Агд Рго О1п Суз <210> 45 <211> 24 <212> РЕТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223 > ЕаЬ ЗОЗТ рерсгбе £гадтеп£ 'лдИ аббхЫопаЬ сузСетпе аббеб <400> 45
Ьуз С1у Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд С1у А1а Ьуз А1а Азп СЯп
1 5 10 15
А1а С1и Ьеи С1и Азп А1а Туг Суз
20
<210> 46 ’ <211> 25 <212> РЕТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>
<223> ЕаЬ ЗОЗТ рерСхбе £гадтепь νί£Η абббЫопаЬ сузСегпе аббеб
<400 > 46
Зег О1и Ьеи Ьуз Азр РНе О1у Рго С1и ТНг А1а Агд Рго О1п Ьуз О1у
1 5 10 15
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Суз
20 25
<210> 47 <211> 56 <212> РЕТ <213> Ното зартепз
- 54 015166
<400> 47
С1п С1у Тгр О1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг О1и Не Не Рго О1и
1 5 10 15
Ьеи О1у О1и Туг Рго О1и Рго Рго Рго О1и Ьеи 01 и Азп Азп Ьуз ТЬг
20 25 30
МеС Азп Агд А1а О1и Азп С1у О1у Агд Рго Рго ΗΪ3 Н1з Рго РЬе 01и
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег О1и Туг Зег
50 55
01 п С1у Тгр О1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр А1а ТЬг С1и Не Не Рго О1у
1 5 10 15
Ьеи Агд С1и Туг Рго С1и Рго Рго 01п С1и Ьеи О1и Азп Азп О1п ТЬг
20 25 30
МеЕ Азп Агд А1а С1и Азп О1у О1у Агд Рго Рго Нхз ΗΪ3 Рго Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег О1и Туг Зег
50 55
Азр Агд Туг Агд А1а О1п Агд Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Рго
5 10 15
А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз
20 25 30
<210> 50 <211> 32 <212> РКТ <213> КаСХиз погуёдьсиз <400> 50
Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а 01 п Агд Уа1 01п Ьеи Ьеи Суз Рго
1 5 10 15
С1у О1у А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз
20 25 30
<210> 51 <211> 44 <212> РКТ <213 > Ното зартепз <400> 51
Ьеи ТЬг Агд РЬе Н1з Азп О1п Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у ТЬг О1и
1 5 10
А1а А1а Агд Рго <31п Ьуз <31у Агд Ьуз Рго Агд Рго
20 25
А1а Ьуз А1а Азп С1п А1а С1и Ьеи <31и Азп А1а Туг
35 40
Ьеи ТЬг Агд РЬе Н1з Азп С1п Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у Рго (31и
1 5 10 15
ТЬг А1а Агд Рго С1п Ьуз С1у Агд Ьуз РГО Агд Рго Агд А1а Агд (31у
20 25 30
А1а Ьуз А1а Азп С1п А1а С1и Ьеи (31 и Азп А1а Туг
35 40
Суз (31у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е С1у Агд <31у Ьуз Тгр
1 5 10 15
Тгр Агд Рго Зег (31у Рго Азр РЬе Агд Суз
20 25
Суз (31у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е <31у Агд Уа1 Ьуз Тгр
1 5 10 15
Тгр Агд Рго Азп (31у Рго Азр РЬе Агд Суз
20 25
- 56 015166
СсдСдсаадС дсаадсдссС сасссдсССс сасаассадС ассдаддссд сСсддссдса даадддссдд дссаассадд ссдадсСдда даасдссСас аадссдсддс сддадсСсаа сссдсдссСд ддасССсддд дадсдссааа
480
540
570 <210>
<211>
<212>
<213>
570
ΩΝΑ
КаССиз погуедхсиз <400> саддддСддс ссададссСс адассссссс сассасассс дСдСдсСсдд СддСддсдсс дСдсадсСдс СсдСдсаадС ссСдадассд дссаассадд аадссССсаа сСсаддаасС ассаСссССа дсССсдсдас дссадСдсдд сдаасддасс СдСдссссдд дсаадсдссС сдсддссдса сддадсСдда дааСдаСдсс ададаасаас Сдасассааа сдасддсссд ссссдсдсдд сдасССссдс сддсдсддсд сасссдсссс даадддСсдс даасдссСас асадааасса садассаСда дасдСдСссд СдссдсадСд сСдсСдссса СдсаСсссдд ссдсдсСсдс сасаассадС аадссдсддс
СсссдддасС ассдддссда адСасадсСд ссаадссддС асдссаСсдд аСсдсСассд дсааддСдсд сддадсСсаа сссдсдсссд садададсас даасддаддс ссдсдадсСд сассдадССд дедедсдаад сдсдсадсдд СсСддСддсс ддасССсдда дддадссааа
120
180
240
300
360
420
480
540
570 <210> <211> <212> <213>
2301 ΩΝΑ Ното зархепз <400> ададсссдсд СддсссСдСд ддСддсаддс адссСссасс сСссссасса СсасссдсСа дсСссддсса ддсдассСад адсСдсСдСд дсаадСдсаа аддссдсСсд ассаддссда дссссддссс ассссассдс аСсссдддсд дадддааССд ССдсСддссс адддадсддС сссССдсасс саасСдСада СасасааССс саддаСсссд сададдСдад сааддСсасС сааасадааа СссСддаада сссСссаСсС ддСдддаддд асссаСадсс ссССдсаддс сассдссССс сСасСддаад СсСсдСсСдс дССсаадааС ддадсСддад ссссСССдад сдСдассдаС дСдсддсссд Сдддсссдас ссссддСддс дсдссСсасс дссдсадаад дсСддадаас Сдаасссдсд аааСдссСдс ссддсааддс ададСсасад сасССсадад дСдддадсдд СсдсСдссса СдСддСССсС
СссССсддда ссСсааСССс аддадассас ададададад СссадааССс ааааааадса адссасдссд сааадаааСа аСадаааСса аСдССССааа ссдадддадс Сдсссассас дсддсдсдсс сСдсСддСас даСдссасдд аасаасаада ассааадасд дддссдСдсс дсдсдссСдс ССссдсСдса даддсдссдс сдсССссаса ддссддаадс дссСасСада ссссасаССС аасссадддс сссссСсадс асасСдадсс даддсадааа дааадСссад Ссадааадсс адСссСддсС
СддсаСаСда адааададад ададССдСда аададСсСаС сССсссадсс асаСсаСсса саСссдсссс дСсассССсс адссаСсаса Ссасддасас ссссссСддс асасадссСС ааассаСссс ссаСдаассд СдСссдадСа дсадсдссаа Сдсссаасдс Сссссдассд дсдсдсдсаа ассадСсдда сдсддссссд дсссдсссдс сСдСссСсСд а9ддддсСда ссдссадсСд асдсадсссс сддаадсасс ддасСддССа СдаддсдСдс сСдссасСаа сасСССдСаа ССссааддас адааСдааСд СдсСсСсССс ССаСддсСда сддссссссс ССддддСада аасССсссаа даададаадС аасСсасада аСССсСдссС
120
180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860
- 57 015166
СсССасаСдС дсСдСасаСа ааСсаЬССсс СССааасада СЬссасдсдд аЬССаССЬЬс ааСаСЬдсЬС асааСдааСс даСддсаСаС СдсСдадааа адасаассЬс адсасаСдас дасССдСсса СсасСЬаадС СаСдааьСаа аСдассдааа сЬСасасСаа сСдсададса ССасСССсСд аСаСдааадс саадааСдаа СаСССаСдса садСсСдССс д аадааЬаСЬа ССдддддааа аасСасаадС 1920 СааЬадсСдс сасссааааа ЬсЬССССдаа 1980 ЬдЬадссьес ааССдьсааа аааааааадр 2 040 сСдсаддасС ддСсдССССС ЬСддсааССс 2100 адСадСддье ССЬааададЬ СаадСЬасаС 2160 ааадСЬЬЬЬс ССдСададаа ЬдасааЬдСЬ 2220 ССссададСс сададасаСС дССааСааад 2280 2301 <210> 58 <211> 213 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 58
МеС О1п Ьеи Рго Ьеи А1а Ьеи Суз Ьеи Уа1 Суз Ьеи Ьеи Уа1 Нхз ТЬг
1 5 10 15
А1а РЬе Агд Уа1 Уа1 01 и О1у <31п С1у Тгр С1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг <31 и Не 11е Рго О1и Ьеи О1у <31и Туг Рго С1и Рго Рго Рго
35 40 4 5
<31x1 Ьеи <31 и Азп Азп Ьуз ТЬг МеС Азп Агд А1а 01 и Азп О1у 01 у Агд
50 55 60
Рго Рго Нхз Нхз Рго РЬе <31и ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег С1и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд О1и Ьеи Нхз РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр 01 у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг О1и Ьеи Уа1 Суз Зег О1у С1п Суз С1у Рго А1а
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не О1у Агд С1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
<31у Рго Азр РЬе Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1
130 135 14 0
О1п Ьеи Ьеи Суз Рго О1у О1у О1и А1а Рго Агд А1а Ах'д Ьуз Уа1 Агд
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нхз Азп О1п
165 170 175
Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе О1у ТЬг О1и А1а А1а Агд Рго 01п Ьуз О1у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп 01П А1а О1и
195 200 2 05
Ьеи С1и Азп А1а Туг
210
<210> 59 <211> 2301 <212> ЬЫА <213> Ното зархепз <400> 59 ададссрдСд СддсссСдСд ддсддсаддс адссСссасс ссссссасса СсасссдсСа дсСссддсса сСасСддаад ссесассСдс дСЬсаадааС ддадсСддад ссссСседад сдСдассдас дСдсддсссд дСддсдСдсс сСдсСддСас даСдссасдд аасаасаада ассааадасд дддссдСдсс дсдсдссЬдс сСссСсрддс СддСассаСд садсСсссас 60 асасадссбЬ ссдсдьадрд дадддссадд 120 аааСсаСссд сдадсСсдда дадРассссд 180 ссаСдаассд ддсддадаас ддадддсддс 240
СдСссдадСа садсСдссдс дадсСдсасЬ 300 дсадсдссаа дссддЬсасс дадесддсдс 360
Сдсссаасдс саСсддссдс ддсаадСддС 420
- 58 015166 ддсдассСад адсСдсСдСд дсаадСдсаа аддссдсСсд ассаддссда дссссддссс аСССсаССдС аСсссдддсд дадддааССд ССдсСддСсс адддадсддс сссССдсасс саасСдСада СасасааССс СаддаСсСсд сададдсдад сааддСсасС сааасадааа Ссссддаада сссСссаСсС ддСдддаддд асссаСадсс ссССдсаддс сассдссССс СсССасаСдС дсСдСасаСа ааСсаСССсс СССааасада ССссасдСдд асссассссс ааСаССд'сСС асааСдааСс
Сдддсссдас СсссддЬддС дсдссСсасс дссдсадаад дсСддадаас Сдаасссдсд аааСдссСдс ссддсааддс ададСсасад сасССсадад дсдддадсдд СсдсСдссса сдсддссссс СссССсддда аддадасСаС ададададад СссадааССс ааааааадса адсСаСдсСд сааадаааСа аСадаааСса аСдССССааа ссдадддадс Сдсссассас даСддсаСаС СдсСдадааа адасаассСс адсасаСдас дасССдСсса СсасССаадС СаСдааССаа аСдассдааа
ССссдсСдса даддсдссдс сдсССссаса ддссддаадс дссСасСада ссссасаСкС аасссадддс сссссСсадс асасСдадсс даддсадааа дааадСссад Ссадааадсс адСссСддсС ссСсааСССс СддсаСаСда адааададад ададССдкда аададсссас сССсссадсс асаСсассса саСссдсссс дСсассССсс адссаСсаса Ссасддасас сССасасСаа сСдсададса ССасСССсСд аСаСдааадс саадааСдаа ЬаСССасдса садСсСдССс 9
Сссссдассд дсдсдсдсаа ассадксдда сдсддссссд дсссдсссдс ссдСссСсСд адддддсСда ссдссадсСд асдсадсссс СддаадсаСС ддасСддССа СдаддсдСдс ссдссассаа сасСССдСаа ССссааддас адааСдааСд СдсСсСсССс ссасддссда СддсССсссс ССддддСада аасССсссаа даададаадс аасСсасада асссссдссс аадааСаССа Саасадссдс сдсадссссс сСдсаддасС адСадСддСС ааадСССССс ССссададСс сСассдсдсд ддсдсдсссд дсСсааддас сдсссддадс дссссСсссс сдсдСддССС дассССссад аддддСссса дссСсСдддд ССсассдссс адааадссдд ссададсаса сссдссдсдс ааСдадддСд СссадСдссС садссдсасс Сдасадссаа саСаСССасд ддаСдСССдд аааддададд ад аде аде ас даааддССса ссадсасаСс адаааасадс ССдддддааа сасссааааа ааССдССааа ддксдССССС СССааададС ссдсададаа сададасаСС садсдсдСдс 480 дрддссСсдс 540 ССсдддассд 600 дссааадсса 660 ассддсдддс 720 даССдСССаС 780 дсссСдадда 840 еддддсаддд 900 ссдссСассС 960 ьддддсссса 1020 асаадасссс 1080 адасСддддд 1140 аассССдаас 1200 даддедддаа 1260 СССдааСддд 1320 даССсадСдс 1380 адаСдааааа 1440 дсСдасааас 1500 сСасссссас 1560 дСссдадддк 162Ό сссссссссд 1680 аддасаседд 1740 ссССССдада 1800 ССсССасСдс 1860 аасСасаадС 1920 сесссссдаа 1980 аааааааадС 2040 ССддсааССс 2100 СаадССасаС 2160 СдасааСдСС 2220 дССааСааад 2280 2301 <210> 60 <211> 213 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 60
Мер О1п Ьеи Рго Ьеи А1а Ьеи Суз Ьеи Не Суз Ьеи Ьеи Уа1 Н1з Ткг
1 5 10 15
А1а Рке Агд Уа1 Уа1 О1и О1у 01 п С1у Тгр О1п А1а Рке Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг С1 и Не 11е Агд С1и Ьеи О1у О1и Туг Рго О1и Рго Рго Рго
35 40 45
С1и Ьеи О1и Азп Азп Ьуз Ткг Мес Азп Агд А1а О1и Азп О1у О1у Агд
50 55 60
Рго Рго НЬз ΗΪ3 Рго Рке (31и Ткг Ьуз Азр Уа1 Зег С1и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд О1и Ьеи Нхз Рке Ткг Агд Туг Уа1 Ткг Азр 01у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 Ткг С1и Ьеи Уа1 Суз Зег О1у О1п Суз О1у Рго А1а
100 105 но
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не С1у Агд О1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
(31у Рго Азр Рке Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а О1п Агд Уа1
130 135 14 0
αΐη Ьеи Ьеи Суз Рго О1у О1у О1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд
- 59 015166
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп О1п
165 170 175
Зег О1и Ьеи Ьуз Азр РНе О1у ТЬг 01 и А1а А1а Агд Рго О1п Ьуз О1у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп О1п А1а О1и
195 200 205
Ьеи О1и Азп А1а Туг
210
<210> 61 .
<211> 2301 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400> 61 ададссСдСд СддсссСдЬд ддсддсаддс адссСссасс сСссссасса Ссасссдсса дсессддсса ддсдассСад адсПдсСдСд дсаадрдсаа аддссдсСсд ассаддссда дссссддссс аССРсаседС аЬсссдддсд дадддааССд РРдсСддСсс адддадсддс сссеедсасс саасСдСада СасасааРСс СаддаСсСсд сададдсдад сааддьсасе сааасадааа СссСддаада сссСссаесе дд^дддаддд асссаеадсс ссССдсаддс сассдссССс ЕсССасаСдС дседЬасаСа ааесаееесс ьееааасада ЬЬссасдЬдд аеьеаеееес аараЬЬдсЬР асааЬдааес сСасСддаад СсСсдСсСдс дССсаадаае ддадседдад ссссССРдад сдСдассдаС дедсддсссд бдддсссдас ЕсссддРддС дсдссСсасс дссдсадаад дсСддадаас едаасссдсд аааСдссСдс ссддсааддс ададСсасад сасЬРсадад дсдддадсдд Ьсдссдссса идеддссьсс ессехсддда аддадасСаС. ададададад ессадааССс ааааааадра адссасдоьд сааадаааеа аЬадаааРса аСдССССааа ссдадддадс Сдсссассас даСддсаСае ЬдсСдадааа адасаассСс адсасаедас дасССдСсса есасееаадр Саедааееаа аЬдассдааа дЬддсдСдсс седседдеас даРдссасдд аасаасаада ассааадасд дддссдСдсс дсдсдссСдс ССссдсСдса даддсдссдс сдсеессаса ддссддаадс дссеасСада ссссасаССС аасссадддс сссссСсадс асассдадсс даддсадааа дааадессад Ссадааадсс адЬссСддсР ссесааееес РддсаСаСда адааададад ададССдЬда аададСсРае сЬСсссадсс асаРсабсса саЬссдсссс десассеесс адссаСсаса есасддасас сССасасеаа сЬдсададса ЬСасЬСЬсЬд аеаСдааадс саадааЬдаа СаРСИаЬдса сад&сСдеес д сСссРсСддс асасадссее аааСсаСссд ссаРдаассд СдЬссдадСа дсадсдссаа едсссаасдс Рссссдассд дсдсдсдсаа ассадСсдда сдсддссссд дсссдсссдс осдссссссд адддддссда ссдссадсСд асдсадсссс еддаадсаСЬ ддаесддсса Сдаддсдрдс седссасСаа сасСеЬдСаа РСссааддас адааСдааЬд РдсСсСсСРс РСаСддсСда ьддсессссс ЬСддддСада аасеесссаа даададааде аасРсасада аеееседссе аадааСаееа еааеадсСдс РдСадСЁРРС сЬдсаддасе адЬадЬддее ааадееееес СЬссададЬс
СддСассаСд садсСсссас 60 ссдСдСадСд дадддссадд 120 сдадсесдда дадЬассссд 180 ддсддадаас ддадддсддс 240 садсСдссдс дадсСдсасе 300 дссддесасс дадосддсдс 360 сассддссдс ддсаадедде 420 сеассдсдсд садсдсдедс 480 ддСдсдссСд дсддссесде 540 дсесааддас ССсдддассд 600 сдсссддадс дссааадсса 660 дссссСсссс ассддсдддс 720 сдсдСддССС даСНдССеаС 780 даосе {'.осад дсссСдадда 840 аддддессса сддддсаддд 900 дссесе.дддд ссдссеассе 960 ССсассдссс еддддрьееа 1020 адааадесдд аьаадаьесс 1080 ссададсаса адассддддд 1140 сеедседсдр аассеедаас 1200 ааедадддрд даддсдддаа 1260 Сссадедссе еесдаасддд 1320 садеедсаСС даессадедс 1380 Сдасадссаа адасдааааа 1440 саРаеееасд дсСдасааас 1500 ддасдесхдд сСассСссас 1560 аааддададд дСссдадддС 1620 ададсадсае сссесссссд 1680 даааддсеса аддасаседд 1740 ссадсасаСс ссеееедада 1800 адаааасадс ССсССасСдс 1860 еедддддааа аасСасааде 1920 сасссааааа СсЬееьедаа 1980 ааеедеЬааа ааааааааде 2040 ддСсдеееее седдсааьес 2100 еееааададЬ СаадЬЬасае 2160 еедеададаа едасааьдее 2220 сададасаЬС дееааЬааад 2280 2301 <210> 62
- 60 015166 <211> 213 <212> РЕТ <213> Ногао заргепз <400> 62
Мек 1 О1п Ьеи Рго Ьеи 5 А1а Ьеи Суз Ьеи Уа1 10 Суз Ьеи Ьеи Уа1 Низ 15 Ткг
А1а Рке Агд Уа1 Уа1 С1и <31у О1п С1у Тгр <31п А1а Рке Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а Ткг <31и Не 11е Агд (31и Ьеи С1у (31и Туг Рго <31и Рго Рго Рго
35 40 45
О1и Ьеи О1и Азп Азп Ьуз Ткг Мек Азп Агд А1а <31и Азп С1у (31у Агд
50 55 60
Рго Рго ΗΪ3 ΗΪ3 Рго Рке О1и Ткг Ьуз Азр Уа1 Зег С1и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд О1и Ьеи ΗΪ3 Рке Ткг Агд Туг Уа1 Ткг Азр <31у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 Ткг С1и Ьеи Уа1 Суз Зег (31у <31 п Суз <31у Рго А1а
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго АЗП А1а 11е (31у Агд С1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
<31у Рго Азр Рке Агд Суз 11е Рго Азр Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1
130 135 140
О1п Ьеи Ьеи Суз Рго 01у <31у О1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи Ткг Агд Рке ΗΪ3 Азп О1п
165 170 175
Зег <31и Ьеи Ьуз Азр Рке <31у Ткг <31и А1а А1а Агд Рго <31п Ьуз <31у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд Зег А1а Ьуз А1а Азп С1п А1а (31и
195 200 205
Ьеи С1и Азп А1а Туг
210
<210> 63 <211> 642 <212 > ΟΝΑ <213> Сегсориккесиз рудегуккгиз <400> 63 акдсадсксс дкддадддсс ддададкасс аакддадддс сдададскдс ассдадккдд сдсддсаадк дсдсадсдкд скддкддсск даскксддкс ддддссааад саскддссск аддддкддса ссдадссксс ддссЬсссса аскксасссд Сдкдскссдд ддкддсдссс Сдсадскдск сдкдсаадкд ссдаддссдс ссааксаддс дкдксккдкс ддсскксаад ассддадскд ссассссккк скасдкдасс ссадкдсддс дадкдддссс дкдксссддк саадсдсскс Ьсддссдсад сдадскддад
Ьдсскдскдд аакдакдсса дадаасааса дадассааад дакдддссдк ссддсасдсс дасккссдск ддкдссдсдс асссдскксс аадддссдда аасдсскаск касасдсадс сддаааксак адассакдаа асдкдкссда дссдсадсдс кдскдсссаа дсакссссда сдсдсдсдсд асаассадСс адссдсддсс ад сккссдкдка 60 ссссдадскс 120 ссдддсддад 130 дкасадскдс 240 саадссадкс 300 сдссаксддс 360 ссдскассдс 420 сааддкдсдс 480 ддадсксаад 540 ссдсдсссдд 600 642 <210> 64 <211> 213 <212> РКТ <213> Сегсорхккесиз рудегуккгиз
- 61 015166 <400> 64
Мее <31п Ьеи Рго Ьеи А1а Ьеи Суз Ьеи Уа1 Суз Ьеи Ьеи Уа1 НЬз А1а
1 5 10 15
А1а РЬе Агд Уа1 Уа1 <31и <31у <31п <31 у Тгр <31п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг <31 и 11е Не Рго (31и Ьеи <31у <31и Туг Рго С!1и Рго Рго Рго
35 40 45
С1и Ьеи <31и Азп Азп Ьуз ТЬг Мее Азп Агд А1а <31и Азп <31у <31у Агд
50 55 60
Рго Рго ΗΪ3 ΗΪ3 Рго РЬе <31и ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег СИи Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд (31и Ьеи ΗΪ3 РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр (31у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг <31и Ьеи Уа1 Суз Зег <31у <31п Суз <31у Рго А1а
100 105 но
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не (31у Агд <31у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Зег
115 120 125
С1у Рго Азр РЬе Агд Суз Не РГО Азр Агд Туг Агд АЬа <31п Агд Уа1
130 135 140
αΐη Ьеи Ьеи Суз Рго С1у С1у А1а А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1 Агд
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе Нхз Азп <31п·
165 170 175
Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе (31у Рго (31и А1а А1а Агд Рго <31п Ьуз <31у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд <31у А1а Ьуз А1а Азп <31п А1а <31и
195 200 205
Ьеи С1и Азп А1а Туг
210
<210> 65 <211> 638 <212 > ΟΝΑ <213> Миз тизси1из <400> 63 .
аедсадсссе сасеадсссс дСдссСсаСс едссеасеед Сдсасдседс сееседедсе 60 дСддадддсс аддддеддса адссСесадд ааедаедсса сададдСсае сссадддсее 120 ддададеасс ссдадссесс есседадаас аассадасса едаассдддс ддадааедда 180 ддсадассес сссассаесс сеаСдасдсс аааддедеде ссдадЬасад седссдсдад 240 седсасеаса сссдсеессе дасадасддс ссаедссдса дсдссаадсс ддСсассдад 300 ееддедбдсС ссддссадед сддссссдсд сддсСдседс ссаасдссае сдддсдсдед 360 аадеддсддс дсссдаасдд ассддаееСс сдсСдсаЬсс сддаСсдсеа ссдсдсдсад 420 сдддедсадс едсСдСдссс сдддддсдсд дсдссдсдсе сдсдсаадде дсдеседдСд 480 дссСсдедса адСдсаадсд ссесасссдс сессасаасс адСсддадсё сааддасССс 540 дддссддада ссдсдсддсс дсадааддде сдсаадссдс ддсссддсдс ссддддадсс 600 ааадссаасс аддсддадсе ддадаасдсс СасСадад 638 <210> 66 <211> 211 <212> РК.Т <213> Миз тизси1из <400> 66
МеС <31п Рго Зег Ьеи А1а Рго Суз Ьеи Не Суз Ьеи Ьеи Уа1 ΗΪ3 А1а
1 5 10 15
А1а РЬе Суз А1а Уа1 <31и <31у (31п <31у Тгр (31п А1а РЬе Агд Азп Азр
- 62 015166
20 25 30
А1а ТЬг 01 и Уа1 11е Рго <31у Ьеи 01у <31и Туг Рго С1и Рго Рго Рго
35 40 45
С1и Азп Азп О1п ТЬг МеС Азп Агд А1а С1и Азп <31у С1у Агд Рго Рго
50 55 60
Н13 Нбз Рго Туг Азр А1а Ьуз Азр Уа1 Зег С1и Туг Зег Суз Агд С1и
65 70 75 80
Ьеи ΗΪ3 Туг ТЬг Агд РЬе Ьеи ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз
85 90 95
Рго Уа1 ТЬг С1и Ьеи Уа1 Суз Зег С1у С1п Суз С1у Рго А1а Агд Ьеи
100 105 но
Ьеи Рго Азп А1а 11е О1у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп σι у Рго
115 120 125
Азр РЬе Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а О1п Агд Уа1 σΐη Ьеи
130 135 140
Ьеи Суз Рго С1у (31у А1а А1а РГО Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1
145 150 155 160
А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп О1п Зег О1и
165 170 175
Ьеи Ьуз Азр РЬе О1у Рго О1и ТЬг А1а Агд Рго С1п Ьуз С1у Агд Ьуз
180 185 190
Рго Агд Рго С1у А1а Агд С1у А1а Ьуз А1а Азп С1п А1а С1и Ьеи О1и
195 200 2 05
Азп А1а Туг
210 <210> 67 <211> 674 <212> ЬИА <213> КаЬСиз пог^/едхсиз <400> 67 даддассдад ссСдссСдсС адааЬдаЕдс Сададаасаа аСдасассаа ссдасддссс дссссдсдсд ссдасЕЬссд дсддсдсддс ЬсасссдсЫ: адаадддСсд адаасдссЬа сдсссЬЬссС ЕдЬасаСдса сасадаааЬс ссадассаЬд адасдСдСсс дЬдссдсадЬ дс£дс£дссс сСдсаСсссд дссдсдсСсд ссасаассад саадссдсдд сСад ссЬСсЬддса дссСЬсдСЬд абсссдддас аассдддссд дадСасадсС дссаадссдд аасдссаЬсд даСсдсбасс сдсааддедс ЬсддадсЬса ссссдсдссс ссаСдсадсС. седЬддадад Ьсадададса адаасддадд дссдсдадсО ЬсассдадЬС ддсдсдСдаа дсдсдсадсд дСсСддСддс аддасЬЬсдд ддддадссаа с£сас(:адсс ссаддддСдд сссададссС садасссссс дсасСасасс ддЬдЬдсЬсд дЬддСддсдс ддсдсадссд сЬсдСдсаад ассЬдадасс адссаассад ссССдссСЬд саадссЫзса ссСсаддаас сассаСссье сдсСЬсдСда ддссадЬдсд ссдаасддас сСдСдссссд Сдсаадсдсс дсдсддссдс дсддадсЬдд
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
674 <210> 68 <211> 213 <212> РКТ <213> КаССиз по^едхсиз <400> 68
Ме£ 1 С1п Ьеи Зег Ьеи А1а 5 Рго Суз Ьеи А1а Суз 10 Ьеи Ьеи Уа1 Нхз 15 А1а
А1а РЬе Уа1 А1а Уа1 С1и Зег С1п О1у Тгр С1п А1а РЬе Ьуз Азп Азр
20 25 30
А1а ТЬг О1и 11е 11е Рго С1у Ьеи Агд 01и Туг Рго С1и Рго Рго σΐη
35 40 45
- 63 015166
С1и Ьеи С1и Азп Азп О1п ТНг Мер Азп Агд А1а <31и 60 Азп С1у С1у Агд
50 55
Рго Рго ΗΪΒ ΗΪ8 Рго Туг Азр ТЬг Ьуз Азр Уа1 Зег О1и Туг Зег Суз
65 70 75 80
Агд <31и Ьеи ΗΪ3 Туг ТЬг Агд РЬе Уа1 ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд Зег
85 90 95
А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг 01 и Ьеи Уа1 Суз Зег <31у О1п Суз О1у Рго А1а
100 105 110
Агд Ьеи Ьеи Рго Азп АГа 11е О1у Агд Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп
115 120 125
О1у Рго Азр РЬе Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п Агд Уа1
130 135 140
(31П Ьеи Ьеи Суз Рго О1у С1у А1а А1а Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд
145 150 155 160
Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп (31п
165 170 175
Зег С1и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у Рго С1и ТЬг А1а Агд Рго αΐη Ьуз С1у
180 185 190
Агд Ьуз Рго Агд Рго Агд А1а Агд С1у А1а Ьуз А1а Азп С1П А1а С1и
195 200 2 05
Ьеи С1и Азп А1а Туг 210 <210> 69 <211> 532 <212> ΟΝΑ <213> Воз Рогиз <400> 69 адааРдаРдс Рдаасаасаа адассааада ардддссдрд сддсдсдссР асРРссдсРд дсдсддсдсс сРсдсРРсса сдддссддаа сасадаааРс дассаРдаас сдссрссдад ссдсадсдсс дсрдсссаас сарссссдас дсдсдсдсдс саассадрсс дсРдсддссс аРссссдадс сдддсддада РасадсРдсс аадссддЬса дссаРсддсс сдсРассдсд ааддрдсдсс дадсрсаадд сдсдсссддд рдддсдадРа асддадддад дддадсРдса ссдадсрддр дсддсаадрд сдсадсдддр ьддьддссрс асРРсдддсс дсассааадс ссссдадссР ассРссссас сРРсасссдс дрдсСсдддс дрддсдссса дсадсРдРРд дрдсаадрдс сдаддссдсд садссдддсс сРдссададс сассссРРРд РасдРдассд садрдсддсс адсдддсссд ЬдРссРддсд аадсдссрса сддссдсааа да
120
180
240
300
360
420
480
532 <210> 70 <211> 176 <212> РКТ <213> ВОЗ Рогиз <400> 70
Азп Азр 1 А1а ТНг С1и 5 11е 11е Рго С1и Ьеи 10 С1у О1и Туг Рго О1и 15 Рго
Ьеи Рго С1и Ьеи Азп Азп Ьуз ТЬг Меь Азп Агд А1а О1и Азп С1у 01у
20 25 30
Агд Рго Рго ΗΪ3 ΗΪ3 Рго РЬе С1 и ТЬг Ьуз Азр А1а Зег О1и Туг Зег
35 40 4 5
Суз Агд С1и Ьеи Нхз РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр 01у Рго Суз Агд
50 55 60
Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг О1и Ьеи Уа1 Суз Зег О1у СЯп Суз С1у Рго
65 70 75 80
А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а 11е О1у Агд О1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго
85 90 95
- 64 015166
Зег С1у Рго Азр 100 РЬе Агд Суз Не Рго Азр 105 Агд Туг Агд АХа 110 ,С1п Агд
Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у С1у А1а А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1
115 120 125
Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд Ьеи ТЬг Агд РЬе ΗΪ3 Азп
13 0 135 14 0
СХп Зег 01 и Ьеи Ьуз Азр РЬе С1у Рго С1и А1а А1а Агд. Рго О1п ТЬг
145 150 155 160
С1у Агд Ьуз Ьеи Агд Рго Агд А1а Агд СХу ТЬг Ьуз А1а Зег Агд А1а
165 170 175
<210> 71 <211> 532 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз
<400> 71
МеС ТЬг <31 п Ьеи Туг Не Туг Не Агд Ьеи Ьеи С1у АХа Туг Ьеи РЬе
1 5 10 15
Не 11е Зег Агд Уа1 <31п С1у СХп Азп Ьеи Азр Зег Мес Ьеи ΗΪ3 С1у
20 25 30
ТЬг С1у МеС Ьуз Зег Азр Зег Азр 01П Ьуз Ьуз Зег СХи Азп С1у Уа1
35 40 4 5
ТЬг Ьеи А1а Рго С1и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
С1у ΗΪ3 Суз Рго Азр Азр А1а Не Азп Азп ТЬг Суз Не ТЬг Азп СХу
65 70 75 80
Н13 Суз РЬе А1а 11е Не С1и С1и Азр Азр С1П С1у СХи ТЬг ТЬг Ьеи
85 90 95
А1а Зег С1у Суз МеС Ьуз Туг С1и СХу Зег Азр РЬе СХп Суз Ьуз Азр
100 105 но
Зег Рго Ьуз А1а С1п Ьеи Агд Агд ТЬг Не С1и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
Ьеи Суз Азп С1п Туг Ьеи С1п Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не С1у
130 135 14 0
Рго РЬе РЬе Азр С1у Зег Не Агд Тгр Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи 11е Зег МеС
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз Не Не А1а МеС Не Не РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз ΗΪ3 Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд Агд Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи С1и (31п Азр С1и А1а РЬе Не Рго Уа1 С1у С1и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи 11е Азр <31п Зег <31п Зег Зег С1у Зег О1у Зег С1у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 (31п Агд ТЬг Не А1а Ьуз С1п Не С1п МеС Уа1 Агд С1п УаХ
225 230 235 240
С1у Ьуз (31у Агд Туг С1у С1и Уа1 Тгр Мес С1у Ьуз Тгр Агд С1у С1и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РИе РЬе ТЬг ТЬг С1и С1и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд С1и ТЬг <31и 11е Туг О1п ТЬг Уа1 Ьеи МеС Агд ΗΪ3 С1и Азп Не
275 280 285
Ьеи О1у РЬе 11е А1а А1а Азр Не Ьуз О1у ТЬг С1у Зег Тгр ТЬг С1п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг ΗΪ3 СХи Азп С1у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
- 65 015166
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а 335 Туг
325 330
Зег А1а А1а Суз С1у Ьеи Суз Η13 Ьеи Н1з ТЬг О1и Не Туг С1у ТЬг
340 345 350
О1п О1у Ьуз Рго А1а Не А1а ΗΪ3 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп 11е
355 360 365
Ьеи Не Ьуз Ьуз Азп <31у Зег Суз Суз 11е А1а Азр Ьеи О1у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТНг Азп 01 и Уа1 Азр Уа1 Рго Ьеи Азп ТЬг
335 390 395 400
Агд Уа1 О1у ТЬг Ьуз Агд Туг Мек А1а Рго О1и Уа1 Ьеи Азр О1и Зег
405 410 415
Ьеи Азп Ьуз Азп ΗΪ3 РЬе <31п Рго Туг Не Мек А1а Азр Не Туг Зег
420 425 430
РЬе О1у Ьеи Не Не Тгр О1и Мек А1а Агд Агд Суз Не ТЬг О1у О1у
435 440 445
Не Уа1 О1и О1и Туг <31п Ьеи Рго Туг Туг Азп Мек Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг О1и Азр Мек Агд О1и Уа1 Уа1 Суз Уа1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго Не Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр О1и Суз Ьеи Агд А1а Уа1
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи Мек Зег <31 и Суз Тгр А1а ΗΪ8 Азп Рго А1а Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТНг А1а Ьеи Агд Не Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз Мек Уа1 О1и Зег О1п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз Не
530
<210> 72 <211> 502 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 72
Мек Ьеи Ьеи Агд Зег А1а 01у Ьуз Ьеи Азп Уа1 О1у ТЬг Ьуз Ьуз О1и
1 5 10 15
Азр С1у 01 и Зег ТЬг А1а Рго ТЬг Рго Агд Рго Ьуз Уа1 Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз Н1з Ηί3 ΗΪ3 Суз Рго О1и Азр Зег Уа1 Азп Азп Не Суз Зег
35 40 45
ТЬг Азр 01 у Туг Суз РЬе ТЬг Мек Не О1и 01 и Азр Азр Зег О1у Ьеи
50 55 60
Рго Уа1 Уа1 ТЬг Зег О1у Суз Ьеи О1у Ьеи О1и О1у Зег Азр Рйе О1п
65 70 75 80
Суз Агд Азр ТЬг Рго Не Рго Низ 01 п Агд Агд Зег Не 01и Суз Суз
85 90 95
ТЬг О1и Агд Азп 01 и Суз Азп Ьуз Азр Ьеи ΗΪ3 Рго ТЬг Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе Уа1 Азр С1у Рго Не ΗΪ3 ΗΪ3 Агд А1а Ьеи
115 120 125
Ьеи Не Зег Уа1 ТЬг Уа1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи 11е Не Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд О1п О1и ТЬг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
Не О1у Ьеи О1и О1п Азр 01и ТЬг Туг Не Рго Рго О1у 01и Зег Ьеи
165 170 175
- 66 015166
Агд Азр Ьеи 11е 180 <31 и <31п Зег <31п Зег. Зег (31у Зег <31у Зег С1у Ьеи
185 190
Рго Ьеи Ьеи Уа1 <31п Агд ТЬг Не А1а Ьуз (31 п Не <31п МеС Уа1 Ьуз
195 200 205
ст Не <31у Ьуз О1у Агд Туг (31у (31и Уа1 Тгр Мер <31у Ьуз Тгр Агд
210 215 220
С1у <31и Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЫ ТЬг <31и <31и А1а Зег
225 230 235 240
Тгр РЬе Агд С1и ТЬг (31 и 11е Туг <31п ТЬг Уа1 Ьеи МеС Агд Ηί3 С1и
245 250 255
Азп Не Ьеи С1у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз <31у ТЬг <31у Зег Тгр
260 265 270
ТЬг <31п Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг Н13 <31и Азп (31у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ТЬг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег Мес Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
АХа Туг Зег Зег Уа1 Зег О1у Ьеи Суз ΗΪ3 Ьеи ΗΪ3 ТЬг С1и Не РЬе
305 310 315 320
Зег ТЬг <31п <31у Ьуз Рго АХа Не А1а ΗΪ3 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп Не Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп (31у ТЬг Суз Суз Не А1а Азр Ьеи СХу
340 345 350
Ьеи А1а Уа1 Ьуз РЬе Не Зег Азр ТЫ Азп (31и Уа1 Азр Не Рго Рго
355 360 365
Азп ТЬг Агд Уа1 <31у ТЬг Ьуз Агд Туг МеС Рго Рго <31и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
<31и Зег Ьеи Азп Агд АЗП ΗΪ3 РЬе (ЗХп Зег Туг 11е МеС А1а Азр МеС
385 390 395 400
Туг Зег РЬе <31у Ьеи Не Ьеи Тгр <31и Уа1 А1а Агд Агд Суз УаХ Зег
405 410 415
О1у <31у Не Уа1 <31и (31и Туг <31п Ьеи Рго Туг ΗΪ3 Азр Ьеи Уа1 Рго
420 425 430
Зег Азр Рго Зег Туг <31и Азр МеС Агд <31и Не Уа1 Суз Не Ьуз Ьуз
435 440 445
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр <31и Суз Ьеи Агд
450 455 460
<31п МеС <31 у Ьуз Ьеи Мес Тпг <31и Суз Тгр А1а ΗΪ3 Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеС Зег <31и
485 490 495
Зег С1п Азр Не Ьуз Ьеи
500
<210> 73 <211> 502 <212> РКТ <213> Ното зархепз
<400> 73
Мес Ьеи Ьеи Агд Зег А1а С1у Ьуз Ьеи Азп Уа1 С1у ТЬг Ьуз Ьуз 01и
1 5 10 15
Азр С1у С1и Зег ТЬг А1а Рго ТЫ Рго Агд Рго Ьуз УаХ Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз ΗΪ3 ΗΪ3 Ηί3 Суз Рго <31и Азр Зег Уа1 Азп Азп Не Суз Зег
35 40 45
ТЬг Азр О1у Туг Суз РЬе ТЬг МеС Не <31и <31и Азр Азр Зег С1у Ьеи
50 55 60
- 67 015166
Рго УаЬ УаЬ ТЬг Зег СЬу Суз Ьеи ОЬу Ьеи ОЬи 01 у Зег Азр РЬе ОЬп
65 70 75 80
Суз Агд Азр ТЬг Рго ЬЬе Рго Η13 С1п Агд Агд Зег 11е ОЬи Суз Суз
85 90 95
ТЬг ОЬи Агд Азп ОЬи Суз Азп Ьуз Азр Ьеи ΗΪ8 Рго ТЬг Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе УаЬ Азр ОЬу Рго ЬЬе НЬз НЬэ Агд АЬа Ьеи
115 120 125
Ьеи Не Зег УаЬ ТЬг УаЬ Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи УаЬ Ьеи ЬЬе ЬЬе Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд ОЬп ОЬи ТЬг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
Не СЬу Ьеи С1и ОЬп Азр ОЬи ТЬг Туг Не Рго Рго ОЬу СЬи Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи ЬЬе ОЬи СЬп Зег ОЬп Зег Зег ОЬу Зег ОЬу Зег ОЬу Ьеи
180 185 190
Рго Ьеи Ьеи УаЬ ОЬп Агд ТЬг ЬЬе А1а Ьуз ОЬп ЬЬе СЬп МеС УаЬ Ьуз
195 200 205
СЬп Не ОЬу Ьуз ОЬу Агд Туг СЬу ОЬи УаЬ Тгр МеС СЬу Ьуз Тгр Агд
210 215 220
ОЬу ОЬи Ьуз УаЬ А1а УаЬ Ьуз УаЬ РЬе РЬе ТЬг ТЬг ОЬи О1и АЬа Зег
225 230 235 240
Тгр РЬе Агд ОЬи ТЬг ОЬи ЬЬе Туг ОЬп ТЬг УаЬ Ьеи Мес Агд НЬз ОЬи
245 250 255
Азп 11е Ьеи СЬу РЬе ЬЬе А1а А1а Азр ЬЬе Ьуз 01 у ТЬг СЬу Зег Тгр
260 265 270
ТЬг ОЬп Ьеи Туг Ьеи ЬЬе ТЬг Азр Туг НЬз ОЬи Азп СЬу Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ТЬг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег МеС Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег УаЬ Зег СЬу Ьеи Суз НЬз Ьеи Н13 ТЬг ОЬи 1Ье РЬе
305 310 315 320
Зег ТЬг ОЬп СЬу Ьуз Рго А1а ЬЬе А1а ΗΪ8 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп 1Ье Ьеи УаЬ Ьуз Ьуз Азп ОЬу ТЬг Суз Суз ЬЬе АЬа Азр Ьеи ОЬу
340 345 350
Ьеи А1а УаЬ Ьуз РЬе ЬЬе Зег Азр ТЬг Азп ОЬи УаЬ Азр ЬЬе Рго Рго
355 360 365
Азп ТЬг Агд УаЬ ОЬу ТЬг Ьуз Агд Туг МеС Рго Рго ОЬи УаЬ Ьеи Азр
370 375 380
ОЬи Зег Ьеи Азп Агд Азп ΗΪ3 РЬе ОЬп Зег Туг Не МеС АЬа Азр МеС
385 390 395 400
Туг Зег РЬе СЬу Ьеи ЬЬе Ьеи Тгр ОЬи УаЬ АЬа Агд Агд Суз УаЬ Зег
405 410 415
ОЬу ОЬу 11е УаЬ ОЬи ОЬи Туг С1п Ьеи Рго Туг Ηίβ Азр Ьеи УаЬ Рго
420 42 5 430
Зег Азр Рго Зег Туг ОЬи Азр МеС Агд ОЬи ЬЬе УаЬ Суз ЬЬе Ьуз Ьуз
435 440 445
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр ОЬи Суз Ьеи Агд
450 455 460
ОЬп МеС ОЬу Ьуз Ьеи МеС ТЬг ОЬи Суз Тгр АЬа ΗΪ3 Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг АЬа Ьеи Агд УаЬ Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеС Зег ОЬи
485 490 495
Зег СЬп Азр ЬЬе Ьуз Ьеи
500
- 68 015166 <210> 74 <211> 532 <212> РКТ <213> КаССиз зр <400> 74
МеС ТЬг О1п Ьеи Туг ТЬг Туг 11е Агд Ьеи Ьеи С1у 10 А1а Суз Ьеи 15 РЬе
1 5
Не 11е Зег Нхз Уа1 <31п С1у С1П Азп Ьеи Азр Зег МеЬ Ьеи Нхз О1у
20 25 30
ТЫ О1у МеЬ Ьуз Зег Азр Уа1 Азр О1п Ьуз Ьуз Рго О1и Азп О1у Уа1
35 40 4 5
ТЬг Ьеи А1а Рго С1и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
О1у Нхз Суз Рго Азр Азр А1а Не Азп АЗП ТЬг Суз Не ТЬг Азп О1у
65 70 75 80
Ηί3 Суз РЬе А1а 11е 11е 01и 01 и Азр Азр О1п О1у 01 и ТЬг ТЬг Ьеи
85 90 95
ТЬг Зег 01у Суз МеЬ Ьуз Туг О1и О1у Зег Азр РЬе О1п Суз Ьуз Азр
100 105 но
Зег Рго Ьуз А1а О1п Ьеи Агд Агд ТЬг Не О1и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
Ьеи Суз Азп 01п Туг Ьеи <31п Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не О1у
130 135 140
Рго РЬе РЬе Азр О1у Зег Уа1 Агд Тгр Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Зег Меь
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз 11е Уа1 А1а МеЬ Не Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз НХЗ Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд 01у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи С1и 01п Азр С1и А1а РЬе Не Рго Уа1 О1у О1и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи 11е Азр О1п Зег (31п Зег Зег О1у Зег О1у Зег О1у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 С1п Агд ТЬг 11е А1а Ьуз О1п 11е О1п МеЬ Уа1 Агд 01п Уа1
225 230 235 240
С1у Ьуз О1у Агд Туг О1у О1и Уа1 Тгр МеЬ О1у Ьуз Тгр Агд О1у С1и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг О1и О1и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд 01 и ТЬг О1и Не Туг 01п ТЬг Уа1 Ьеи МеЬ Агд Нхз 01 и Азп 11е
275 280 285
Ьеи 01у РЬе 11е А1а А1а Азр Не Ьуз О1у ТЬг О1у Зег Тгр ТЬг О1п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг Нхз 01 и Азп О1у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз О1у Ьеи Суз Нхз Ьеи Нхз ТЬг О1и Не Туг О1у ТЬг
340 345 350
01 η О1у Ьуз Рго А1а 11е А1а Нхз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп Не
355 360 3 65
Ьеи 11е Ьуз Ьуз Азп О1у Зег Суз Суз Не А1а Азр Ьеи О1у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп О1и Уа1 Азр Не Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 <31у ТЬг Агд Агд Туг МеЬ А1а Рго О1и Уа1 Ьеи Азр О1и Зег
405 410 415
- 69 015166
Ьеи Зег Ьуз Азп Нбз РЬе Сбп Рго Туг 425 1бе МеС Аба Азр 1бе 430 Туг Зег
420
РЬе Сбу Ьеи Не 1бе Тгр Сби Мес Аба Агд Агд Суз 1бе ТЬг Сбу Сбу
435 440 445
11е Уаб Сби Оби Туг Сбп Ьеи Рго Туг Туг Аэп МеС Уаб Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг Сби Азр МеС Агд Сби Уаб Уаб Суз Уаб Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго 11е Уаб Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр Сби Суз Ьеи Агд Аба Уаб
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи МеС Зег Сби Суз Тгр Аба Нбз Азп Рго Аба Зег Агд Ьеи
500 505 560
ТЬг Аба Ьеи Агд 1бе Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи Аба Ьуз МеС Уаб Оби Зег Сбп
515 520 525
Азр Уаб Ьуз 1бе
530
<210> 75 <211> 532 <212> РКТ <213> КаССиз погуедбсиз
<400> 75
МеС ТЬг Сбп Ьеи Туг ТЬг Туг 1бе Агд Ьеи Ьеи Сбу Аба Суз Ьеи РЬе
1 5 10 15
1бе 1бе Зег Нбз Уаб Сбп Сбу Сбп Азп Ьеи Азр Зег Мес Ьеи Нбз Сбу
20 25 30
ТЬг Сбу МеС Ьуз Зег Азр Уаб Азр Сбп Ьуз Ьуз Рго Сби Азп Сбу Уаб
35 40 45
ТЬг Ьеи Аба Рго Сби Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
Сбу Нбз Суз Рго Азр Азр Аба 1бе Азп Азп ТЬг Суз Не ТЬг Азп Сбу
65 70 75 80
Нбз Суз РЬе Аба Не 1бе Сби Сби Азр Азр Сбп Сбу Оби ТЬг ТЬг Ьеи
85- 90 95
ТЬг Зег Сбу Суз МеС Ьуз Туг Сби Сбу Зег Азр РЬе Сбп Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз Аба Сбп Ьеи Агд Агд ТЬг Не Сби Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 12 0 125
Ьеи Суз Азп Сбп Туг Ьеи Сбп Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Уаб Уаб 1бе Сбу
130 135 14 0
Рго РЬе РЬе Азр Обу Зег Уаб Агд Тгр Ьеи Аба Уаб Ьеи 1бе Зег МеС
145 150 155 160
Аба Уаб Суз 1бе Уаб Аба МеС Не Уаб РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз Нбз Туг Суз Ьуз Зег 1бе Зег Зег Агд Сбу Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи Сби Сбп Азр Сби Аба РЬе Не Рго Уаб Сбу Сби Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи 1бе Азр Сбп Зег Сбп Зег Зег Сбу Зег Сбу Зег Сбу Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уаб Сбп Агд ТЬг Не Аба Ьуз Сбп 1бе Сбп МеС Уаб Агд Сбп Уаб
225 230 235 240
Сбу Ьуз Сбу Агд Туг Сбу Сби Уаб Тгр МеС Сбу Ьуз Тгр Агд Сбу Оби
245 250 255
Ьуз Уаб Аба Уаб Ьуз Уаб РЬе РЬе ТЬг ТЬг Сби Сби Аба Зег Тгр РЬе
260 265 270
- 70 015166
Агд 01и ТЬг О1и Не Туг О1п ТЬг Уа1 Ьеи Мее Агд ΗΪ3 О1и Азп Не
275 280 285
Ьеи О1у РЬе Не А1а А1а Азр 11е Ьуз О1у ТЬг О1у Зег Тгр ТЬг О1п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг ΗΪ3 О1и Азп О1у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз О1у Ьеи Суз Шз Ьеи ΗΪ3 ТЬг О1и Не Туг О1у ТЬг
340 345 350
О1п О1у Ьуз Рго А1а 11е А1а ΗΪ3 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз АЗП Не
355 360 365
Ьеи Не Ьуз Ьуз Азп 01у Зег Суз Суз Не А1а Азр Ьеи 01у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп О1и Уа1 Азр Не Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 01у ТЬг Агд Агд Туг Мее А1а Рго 01и Уа1 Ьеи Азр О1и Зег
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп ΗΪ3 РЬе О1п Рго Туг Не Мее А1а Азр Не Туг Зег
420 425 430
РЬе С1у Ьеи 11е Не Тгр О1и Мее А1а Агд Агд, Суз Не ТЬг О1у О1у
435 440 445
Не Уа1 О1и О1и Туг О1п Ьеи Рго Туг Туг Азп Мее Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг О1и Азр Мее Агд О1и Уа1 Уа1 Суз Уа1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго Не Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр О1и Суз Ьеи Агд А1а Уа1
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи Мее Зег 01 и Суз Тгр А1а Н1з Азп Рго А1а Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТЬг А1а Ьеи Агд Не Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз Мее νβΐ О1и Зег О1п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз 11е
530
<210> 7δ <211> 532 <212> РКТ <213> Каееиз погуедгсиз
<400> 76
Мее ТЬг О1п Ьеи Туг ТЬг Туг Не Агд Ьеи Ьеи О1у А1а Суз Ьеи РЬе
1 5 10 15
Не Не Зег ΗΪ3 Уа1 01 п О1у О1п Азп Ьеи Азр Зег Мее Ьеи ΗΪ3 О1у
20 25 30
ТЬг О1у Мее Ьуз Зег Азр Уа1 Азр 01п Ьуз Ьуз Рго С1и Азп 01 у Уа1
35 40 45
ТЬг Ьеи А1а Рго О1и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
О1у ΗΪ3 Суа Рго Азр Азр А1а Не Азп Азп ТЬг Су 8 Не ТЬг Азп О1у
65 70 75 80
Ηί3 Суз РЬе А1а Не Не О1и О1и Азр Азр С1п О1у О1и ТЬг ТЬг Ьеи
85 90 95
ТЬг Зег С1у Суз Мее Ьуз Туг О1и С1у Зег Азр РЬе О1п Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а О1п Ьеи Агд Агд ТЬг Не 01 и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
- 71 015166
Ьеи Суз Азп <31п Туг Ьеи С1п Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не <31у
130 135 140
Рго РЬе РЬе Азр О1у Зег Уа1 Агд Тгр Ьеи А1а 57а 1 Ьеи Не Зег МеС
145 150 155 160
А1а 57а 1 Суз Не Уа1 А1а Мес Не Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 175
Ьуз Нхз Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд <31 у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи О1и О1п Азр О1и А1а РЬе Не Рго 57а 1 <31 у <31 и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи Не Азр <31п Зег <31п Зег Зег <31 у Зег <31у Зег <31у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
Ьеи Уа1 С1п Агд ТЬг Не А1а Ьуз (31 п Не <31п МеС 57а 1 Агд 01п 57а 1
225 230 235 240
(31у Ьуз С1у Агд Туг <31 у <31и 57а 1 Тгр МеС <31у Ьуз Тгр Агд С1у <31и
245 250 255
Ьуз 57а 1 А1а 57а1 Ьуз 57а 1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг <31и <31и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд С1и ТЬг С1и Не Туг С1п ТЬг 57а 1 Ьеи МеС Агд Нхз (31и Азп Не
275 280 285
Ьеи О1у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз <31у ТЬг <31у Зег Тгр ТЬг <31п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг Нхз С1и Азп (31у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз <31у Ьеи Суз Нхз Ьеи Нхз ТЬг <31и Не Туг <31у ТЬг
340 345 350
С1п <31у Ьуз Рго А1а Не А1а Нхз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп Не
355 360 365
Ьеи Не Ьуз Ьуз Азп <31у Зег Суз Суз Не А1а Азр Ьеи <31у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп <31и 57а 1 Азр Не Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 <31у ТЬг Агд Агд Туг МеС А1а Рго <31и 57а 1 Ьеи Азр <31и Зег
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп Нхз РЬе О1п Рго Туг Не МеС А1а Азр 11е Туг Зег
420 425 430
РЬе <31у Ьеи Не Не Тгр С1и МеС А1а Агд Агд Суз Не ТЬг <31у <31у
435 440 445
Не 57а1 <31 и С1и Туг (31п Ьеи Рго Туг Туг Азп МеС Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг <31и Азр МеС Агд О1и 57а 1 57а 1 Суз 57а 1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго Не 57а 1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр (31и Суз Ьеи Агд А1а 57а 1
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи МеС Зег О1и Суз Тгр А1а Нхз Азп Рго А1а Зег Агд Ьеи
500 505 510
ТЬг А1а Ьеи Агд Не Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеС 57а 1 С1и Зег (31п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз Не
530 <210> 77 <211> 502 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 77
Мек 1 Ьеи Ьеи Агд Зег 5 А1а 31у Ьуз Ьеи Азп Уа1 10 31у Ткг Ьуз Ьуз 15 (31и
Азр 31у 31 и Зег Ткг А1а Рго Ткг Рго Агд Рго Ьуз Уа1 Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз ΗΪ3 Η13 ΗΪ3 Суз Рго (31и Азр Зег Уа1 Азп Азп Не Суз Зег
35 40 45
Ткг Азр 01у Туг Суз Рке ТЬг Мек Не (31и (31и Азр Азр Зег (31 у Ьеи
50 55 60
Рго Уа1 Уа1 Ткг Зег <31 у Суз Ьеи (31 у Ьеи 31и О1у Зег Азр Рке (31п
65 70 75 80
Суз Агд Азр Ткг Рго Не Рго ΗΪ3 <31п Агд Агд Зег Не О1и Суз Суз
85 90 95
Ткг 31и Агд Азп 31и Суз Азп Ьуз Азр Ьеи Η13 Рго Ткг Ьеи Рго Рго
100 105 110
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр Рке Уа1 Азр <31 у Рго Не ΗΪ3 ΗΪ8 Агд А1а Ьеи
115 120 125
Ьеи Не Зег Уа1 Ткг Уа1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Не Не Ьеи
130 135 140
Рке Суз Туг Рке Агд Туг Ьуз Агд <31п <31и Ткг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
Не 31у Ьеи 31и 31п Азр (31и Ткг Туг Не Рго Рго С11у <31и Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи Не 31и <31 п Зег <31п Зег Зег <31у Зег <31у Зег (31у Ьеи
180 185 190
Рго Ьеи Ьеи Уа1 31п Агд Ткг Не А1а Ьуз <31п Не С1п Мек Уа1 Ьуз
195 200 205
<31п Не 31у Ьуз 31у Агд Туг С1у <31и νβΐ Тгр Мек С11у Ьуз Тгр Агд
1 л τι е
хи ζ,υ ώώυ
С1у <31и Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 Рке Рке Ткг ТЬг С1и <31и А1а Зег
225 230 235 240
Тгр Рке Агд 31и Ткг (31 и Не Туг <31п Ткг Уа1 Ьеи Мек Агд ΗΪ3 <31и
245 250 255
Азп Не Ьеи (31у Рке Не А1а А1а Азр Не Ьуз 31у Ткг С1у Зег Тгр
260 265 270
Ткг 31п Ьеи Туг Ьеи Не Ткг Азр Туг ΗΪ8 31и Азп С1у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег Ткг Ткг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег Мек Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег Уа1 Зег С1у Ьеи Суз Нхз Ьеи ΗΪ5 Ткг (31и Не Рке
305 310 315 320
Зег Ткг 31п 31у Ьуз Рго А1а Не А1а Н13 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
Азп Не Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп <31у Ткг Суз Суз Не А1а Азр Ьеи (31у
340 345 350
Ьеи А1а Уа1 Ьуз Рке Не Зег Азр Ткг Азп <31и Уа1 Азр Не Рго Рго
355 360 365
Азп Ткг Агд Уа1 31у Ткг Ьуз Агд Туг Мек Рго Рго <31и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
31 и Зег Ьеи Азп Агд Азп ΗΪ3 Рке 31 п Зег Туг Не Мек А1а Азр Мек
385 390 395 400
Туг Зег Рке 31у Ьеи Не Ьеи Тгр <31и Уа1 А1а Агд Агд Суз Уа1 Зег
405 410 415
31 у 31у Не Уа1 С1и <31и Туг <31п Ьеи Рго Туг Н13 Азр Ьеи Уа1 Рго
420 425 430
Зег Азр Рго Зег Туг (31и Азр Мек Агд <31и 11е Уа1 Суз Не Ьуз Ьуз
435 440 445
- 73 015166
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп 455 Агд Тгр Зег Зег Азр 460 С1и Суз Ьеи Агд
450
О1п Мее О1у Ьуз Ьеи Мее ТЬг О1и Суз Тгр А1а Нхз Азп Рго А1а Зег
465 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеС Зег О1и
485 490 495
Зег О1п Азр 11е Ьуз Ьеи
500
<210> 78 <211> 502 <212> РКТ <213> Ното зархепэ
<400> 78
Мее Ьеи Ьеи Агд Зег А1а 01у Ьуз Ьеи Азп Уа1 О1у ТЬг Ьуз Ьуз О1и
1 5 10 15
Азр <31у <31и Зег ТЬг А1а Рго ТЬг Рго Агд Рго Ьуз Уа1 Ьеи Агд Суз
20 25 30
Ьуз Суз НХЗ Нхз Нхз Суз Рго 01и Азр Зег Уа1 Азп Азп Не Суз Зег
35 40 45
ТЬг Азр О1у Туг Суз РЬе ТЬг МеС Не 01 и О1и Азр Азр Зег О1у Ьеи
50 55 60
Рго Уа1 Уа1 ТЬг Зег О1у Суз Ьеи О1у Ьеи О1и С1у Зег Азр РЬе 01п
65 70 75 80
Суз Агд Азр ТЬг Рго Не РГО НХЗ О1п Агд Агд Зег Не О1и Суз Суз
85 90 95
ТЬг <31и Агд Азп 01 и Суз Азп Ьуз Азр Ьеи Нхз Рго ТЬг Ьеи Рго Рго
100 105 но
Ьеи Ьуз Азп Агд Азр РЬе Уа1 Азр О1у Рго Не Нхз Н18 Агд А1а Ьеи
115 120 125
Ьеи 11е Зег Уа1 ТЬг Уа1 Суз Зег Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Не Не Ьеи
130 135 140
РЬе Суз Туг РЬе Агд Туг Ьуз Агд О1п О1и ТЬг Агд Рго Агд Туг Зег
145 150 155 160
Не О1у Ьеи О1и <31п Азр С1и ТЬг Туг Не Рго Рго О1у О1и Зег Ьеи
165 170 175
Агд Азр Ьеи Не О1и С1п Зег О1п Зег Зег О1у Зег О1у Зег О1у Ьеи
180 185 190
Рго Ьеи Ьеи Уа1 Οίη Агд ТЬг Не А1а Ьуз О1п Не О1п Мес Уа1 Ьуз
195 200 2 05
О1п Не С1у Ьуз О1у Агд Туг О1у О1и Уа1 Тгр МеЬ О1у Ьуз Тгр Агд
210 215 220
О1у С1и Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг С1и О1и А1а Зег
225 230 235 240
Тгр РЬе Агд С1и ТЬг 01 и Не Туг 01п ТЬг Уа1 Ьеи МеС Агд Нхз О1и
245 250 255
Азп Не Ьеи О1у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз О1у ТЬг О1у Зег Тгр
260 265 270
ТЬг О1п Ьеи Туг Ьеи Не ТЬг Азр Туг ΗΪ3 О1и Азп О1у Зег Ьеи Туг
275 280 285
Азр Туг Ьеи Ьуз Зег ТЬг ТЬг Ьеи Азр А1а Ьуз Зег Мес Ьеи Ьуз Ьеи
290 295 300
А1а Туг Зег Зег Уа1 Зег О1у Ьеи Суз Нхз Ьеи Нхз ТЬг 01 и Не РЬе
305 310 315 320
Зег ТЬг С1п О1у Ьуз Рго А1а Не А1а Нхз Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз
325 330 335
- 74 015166
Азп 11е Ьеи Уа1 Ьуз Ьуз Азп <31у ТЬг Суз Суз 11е А1а Азр 350 Ьеи О1у
340 345
Ьеи А1а Уа1 Ьуз РЬе 11е Зег Азр ТЬг Азп 01 и Уа1 Азр Не Рго Рго
355 360 365
Азп ТЬг Агд Уа1 О1у ТЬг Ьуз Агд Туг МеС Рго Рго 01 и Уа1 Ьеи Азр
370 375 380
О1и Зег Ьеи Азп Агд Азп ΗΪ3 РЬе 01п Зег Туг Не МеС А1а Азр МеС
385 390 395 400
Туг Зег РЬе О1у Ьеи Не Ьеи Тгр О1и Уа1 А1а Агд Агд Суз Уа1 Зег
405 410 415
01у О1у Не Уа1 О1и 01 и Туг 01п Ьеи Рго Туг Нхз Азр Ьеи Уа1 Рго
420 425 430
Зег Азр Рго Зег Туг О1и Азр МеС Агд О1и Не Уа1 С:уз 11е Ьуз Ьуз
435 440 445
Ьеи Агд Рго Зег РЬе Рго Азп Агд Тгр Зег Зег Азр С1и Суз Ьеи Агд
450 455 460
О1п Мер О1у Ьуз Ьеи МеС ТЬг О1и Суз Тгр А1а Нхз Азп Рго А1а Зег
4 65 470 475 480
Агд Ьеи ТЬг А1а Ьеи Агд Уа1 Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз МеС Зег С1и
485 490 495
Зег С1п Азр 11е Ьуз Ьеи
500
<210> 79 <211> 532 <212> РКТ <213> КаССиз зр.
<400> 79
МеС ТЬг О1п Ьеи Туг ТЬг Туг Не Агд Ьеи Ьеи О1у А1а Суз Ьеи РЬе
1 5 10 15
Не Не Зег Нхз Уа1 С1п С1у О1п Азп Ьеи Азр Зег МеС Ьеи Нхз О1у
20 25 30
ТЬг О1у МеС Ьуз Зег Азр Уа1 Азр С1п Ьуз Ьуз Рго О1и Азп О1у Уа1
35 40 45
ТЬг Ьеи А1а Рго О1и Азр ТЬг Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьуз Суз Туг Суз Зег
50 55 60
О1у Нхз Суз Рго Азр Азр А1а Не Азп Азп ТЬг Суз Не ТЬг Азп 01у
65 70 75 80
ΗΪ3 Суз РЬе А1а Не 11е О1и С1и Азр Азр О1п О1у С1и ТЬг ТЬг Ьеи
85 90 95
ТЬг Зег О1у Суз МеС Ьуз Туг О1и С1у Зег Азр РЬе О1п Суз Ьуз Азр
100 105 110
Зег Рго Ьуз А1а О1п Ьеи Агд Агд ТЬг Не О1и Суз Суз Агд ТЬг Азп
115 120 125
Ьеи Суз Азп О1п Туг Ьеи С1п Рго ТЬг Ьеи Рго Рго Уа1 Уа1 Не О1у
130 135 140
Рго РЬе РЬе Азр О1у Зег Уа1 Агд Тгр Ьеи А1а Уа1 Ьеи 11е Зег МеС
145 150 155 160
А1а Уа1 Суз Не Уа1 А1а МеС Не Уа1 РЬе Зег Зег Суз РЬе Суз Туг
165 170 17 5
Ьуз Η13 Туг Суз Ьуз Зег Не Зег Зег Агд 01 у Агд Туг Азп Агд Азр
180 185 190
Ьеи С1и О1П Азр С1и А1а РЬе Не Рго Уа1 О1у О1и Зег Ьеи Ьуз Азр
195 200 205
Ьеи 11е Азр О1п Зег 01 п Зег Зег О1у Зег О1у Зег О1у Ьеи Рго Ьеи
210 215 220
- 75 015166
Ьеи Уа1 О1п Агд ТЬг Не А1а Ьуз О1п Не 01 п Мер Уа1 Агд О1п Уа1
225 230 235 240
01у Ьуз 01 у Агд Туг О1у О1и Уа1 Тгр МеР С1у Ьуз Тгр Агд О1у С1и
245 250 255
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе РЬе ТЬг ТЬг 01и О1и А1а Зег Тгр РЬе
260 265 270
Агд О1и ТЬг С1и 11е Туг <31п ТЬг Уа1 Ьеи Мер Агд ΗΪ8 О1и Азп Не
275 280 285
Ьеи О1у РЬе Не А1а А1а Азр Не Ьуз <31у ТЬг О1у Зег Тгр ТЬг О1п
290 295 300
Ьеи Туг Ьеи 11е ТЬг Азр Туг ΗΪ3 <31и АЗП О1у Зег Ьеи Туг Азр РЬе
305 310 315 320
Ьеи Ьуз Суз А1а ТЬг Ьеи Азр ТЬг Агд А1а Ьеи Ьеи Ьуэ Ьеи А1а Туг
325 330 335
Зег А1а А1а Суз <31у Ьеи Суз ΗΪ3 Ьеи ΗΪ3 ТЬг О1и 11е Туг О1у ТЬг
340 345 350
О1п О1у Ьуз Рго А1а 11е А1а ΗΪ3 Агд Азр Ьеи Ьуз Зег Ьуз Азп Не
355 360 365
Ьеи 11е Ьуз Ьуз Азп О1у Зег Суз Суз 11е А1а Азр Ьеи О1у Ьеи А1а
370 375 380
Уа1 Ьуз РЬе Азп Зег Азр ТЬг Азп С1и Уа1 Азр 11е Рго Ьеи Азп ТЬг
385 390 395 400
Агд Уа1 О1у ТЬг Агд Агд Туг Мер А1а Рго О1и Уа1 Ьеи Азр О1и Зег
405 410 415
Ьеи Зег Ьуз Азп ΗΪ3 РЬе С1П Рго Туг Не Мер А1а Азр Не Туг Зег
420 425 430
РЬе О1у Ьеи 11е 11е Тгр 01и Мер А1а Агд Агд Суз Не ТЬг О1у С1у
435 440 445
Не Уа1 <31 и О1и Туг О1п Ьеи Рго Туг Туг Азп Мер Уа1 Рго Зег Азр
450 455 460
Рго Зег Туг (31и Азр МеР Агд <31 и Уа1 Уа1 Суз Уа1 Ьуз Агд Ьеи Агд
465 470 475 480
Рго Не Уа1 Зег Азп Агд Тгр Азп Зег Азр О1и Суз Ьеи Агд А1а Уа1
485 490 495
Ьеи Ьуз Ьеи Мер Зег О1и Суз Тгр А1а ΗΪ3 Азп Рго АХа Зег Агд. Ьеи
500 505 510
ТЬг А1а Ьеи Агд Не Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз мер Уа1 О1и Зег О1п
515 520 525
Азр Уа1 Ьуз 11е
530
<210> 80 <211> 530 <212> РКТ
<213 > Ното зархепз
<400> 80 МеР ТЬг Зег Зег Ьеи О1п Агд Рго Тгр Агд Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 15
ТЬг 11е Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег О1п Азп С1п 01 и Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг О1п 01п Азр Ьеи О1у 11е О1у О1и
35 40 45
Зег Агд 11е Зег ΗΪ8 О1и Азп О1у ТЬг Не Ьеи Суз Зег Ьуз 01у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг О1у Ьеи Тгр О1и Ьуэ Зег Ьуз О1у Азр Не Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
- 76 015166
Ьуз <31п СЬу Суз Тгр Зег 85 НЬз 11е СЬу Азр 90 Рго СЬп СЬи Суз НЬз 95 Туг
СЬи СЬи Суз УаЬ УаЬ ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег 1Ье СЬп Азп СЬу ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп УаЬ Азп РЬе ТЬг
115 120 125
СЬи Азп РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго НЬз Зег
130 135 14 0
РЬе Азп Агд Азр СЬи ТЬг 1Ье 11е 11е АЬа Ьеи АЬа Зег УаЬ Зег УаЬ
14 5 150 155 160
Ьеи А1а УаЬ Ьеи Пе УаЬ АЬа Ьеи Суз РЬе СЬу Туг Агд Мек Ьеи ТЬг
Ь65 170 175
С1у Азр Агд Ьуз СЬп СЬу Ьеи ΗΪ3 Зег Мек Азп Мек Мек СЬи АЬа АЬа
180 185 190
А1а Зег СЬи Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи СЬи Ьеи
195 200 205
11е СЬу Агд СЬу Агд Туг' СЬу АЬа УаЬ Туг Ьуз СЬу Зег Ьеи Азр СЬи
210 215 220
Агд Рго УаЬ АЬа УаЬ Ьуз УаЬ РЬе Зег РЬе АЬа Азп Агд СЬп Азп РЬе
225 230 235 240
1Ье Азп СЬи Ьуз Азп 1Ье Туг Агд УаЬ Рго Ьеи Мек СЬи НЬз Азр Азп
245 250 255
11е АЬа Агд РЬе 1Ье УаЬ СЬу Азр СЬи Агд УаЬ ТЬг АЬа Азр СЬу Агд
260 265 270
Мек СЬи Туг Ьеи Ьеи УаЬ Мек СЬи Туг Туг Рго Азп СЬу Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи НЬз ТЬг Зег Азр Тгр УаЬ Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
АЬа ΗΪ3 Зег УаЬ ТЬг Агд СЬу Ьеи АЬа Туг Ьеи НЬз ТЬг СЬи Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд СЬу Азр НЬз Туг Ьуз Рго АЬа 1Ье Зег НЬз Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп УаЬ Ьеи УаЬ Ьуз Азп Азр СЬу ТЬг Суз УаЬ ЬЬе Зег Азр РЬе
340 345 350
СЬу Ьеи Зег Мек Агд Ьеи ТЬг СЬу Азп Агд Ьеи УаЬ Агд Рго СЬу СЬи
355 360 365
СЬи Азр Азп АЬа АЬа 11е Зег СЬи УаЬ СЬу ТЬг 1Ье Агд Туг Мек АЬа
370 375 380
Рго СЬи УаЬ Ьеи СЬи СЬу АЬа УаЬ Азп Ьеи Агд Азр Суз СЬи Зег АЬа
385 390 395 400
Ьеи Ьуз С1п УаЬ Азр Мек Туг АЬа Ьеи СЬу Ьеи ЬЬе Туг Тгр СЬи ЬЬе
405 410 415
РЬе Мек Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго СЬу СЬи Зег УаЬ Рго СЬи Туг
420 425 430
С1п Мек АЬа РЬе СЬп ТЬг СЬи УаЬ СЬу Азп НЬз Рго ТЬг РЬе СЬи Азр
435 440 445
Мек СЬп УаЬ Ьеи УаЬ Зег Агд СЬи Ьуз СЬп Агд Рго Ьуз РЬе Рго СЬи
450 455 460
АЬа Тгр Ьуз СЬи Азп Зег Ьеи АЬа УаЬ Агд Зег Ьеи Ьуз СЬи ТЬг 1Ье
465 470 475 480
СЬи Азр Суз Тгр Азр СЬп Азр АЬа СЬи АЬа Агд Ьеи ТЬг АЬа СЬп Суз
485 490 495
А1а СЬи 01 и Агд Мек АЬа СЬи Ьеи Мек Мек ЬЬе Тгр СЬи Агд Азп Ьуз
500 505 510
8ег УаЬ Зег Рго ТЬг УаЬ Азп Рго Мек Зег ТЬг АЬа Мек СЬп Азп СЬи
515 520 525
Агд Агд
530
- 77 015166 <210> 81 <211> 530 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 81
Мер 1 ТЬг Зег Зег Ьеи О1п 5 Агд Рго Тгр Агд 10 Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго 15 Тгр
ТЬг Не Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег О1п Азп О1п 01 и Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг О1п <31п Азр Ьеи С1у Не 01 у О1и
35 40 45
Зег Агд Не Зег Нхз О1и Азп О1у ТЬг Не Ьеи Суз Зег Ьуз О1у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг О1у Ьеи Тгр О1и Ьуз Зег Ьуз О1у Азр 11е Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
Ьуз О1п 01 у Суз Тгр Зег НХЗ Не О1у Азр Рго О1п СЯи Суз Нхз Туг
85 90 95
С1и. О1и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго РГО Зег Не С1п Азп 01 у ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп Уа1 Азп РЬе ТЬг
115 120 125
О1и АЗП РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Нхз Зег
13 0 135 14 0
РЬе Азп Агд Азр О1и ТЬг Не Не Не А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи 11е Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе О1у Туг Агд Мес Ьеи ТЬг
165 170 175
<31у Азр Агд Ьуз С1п О1у Ьеи НХЗ Зег Мер Азп Мер Мер С1и А1а А1а
180 185 190
А1а Зег 01 и Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр АЗП Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи 01 и Ьеи
195 200 205
11е О1у Агд О1у Агд Туг О1у А1а Уа1 Туг Ьуз <31у Зег Ьеи Авр О1и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд 01 п Азп РЬе
225 230 235 240
Не Азп 01 и Ьуз Азп Не Туг Агд Уа1 Рго Ьеи Мер О1и Нхз Азр Азп
245 250 255
11е А1а Агд РЬе Не Уа1 О1у Азр О1и Агд Уа1 ТЬг А1а Азр О1у Агд
260 265 270
МеС О1и Туг Ьеи Ьеи Уа1 МеЬ 01и Туг Туг Рго Азп С1у Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Нхз ТЬг Зег Азр Тгр Уа1 Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
А1а ΗΪ3 Зег Уа1 ТЬг Агд О1у Ьеи А1а Туг Ьеи Нхз ТЬг С1и Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд С1у Азр Нхз Туг Ьуз Рго А1а Не Зег Нхз Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Азп Азр О1у ТЬг Суз Уа1 11е Зег Азр РЬе
340 345 350
С1у Ьеи Зег Мер Агд Ьеи ТЬг О1у Азп Агд Ьеи Уа1 Агд Рго 01 у О1и
355 360 365
О1и Азр Азп А1а А1а 11е Зег О1и Уа1 О1у ТЬг 11е Агд Туг Мер А1а
370 375 380
Рго О1и Уа1 Ьеи О1и О1у А1а Уа1 Азп Ьеи Агд Азр Суз 01и Зег А1а
385 390 395 400
- 78 015166
Ьеи Ьуз С1п Уа1 Азр 405 Мее Туг А1а Ьеи О1у 410 Ьеи 11е Туг Тгр 01 и 415 11е
РЬе МеЬ Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго О1у О1и Зег Уа1 Рго О1и Туг
420 425 430
01 η МеС А1а РЬе О1п ТЬг О1и Уа1 О1у Азп ΗΪ3 Рго ТЬг РЬе С1 и Азр
435 440 445
МеЬ О1п Уа1 Ьеи Уа1 Зег Агд О1и Ьуз О1п Агд Рго Ьуз РЬе Рго О1и
450 455 460
А1а Тгр Ьуз О1и Азп Зег Ьеи А1а Уа1 Агд Зег Ьеи Ьуз О1и ТЬг 11е
465 470 475 480
О1и Азр Суз Тгр Азр <31п Азр А1а О1и А1а Агд Ьеи ТЬг А1а О1п Суз
485 490 495
А1а С1и О1и Агд МеЬ А1а О1и Ьеи Мее Мее 11е Тгр О1и Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уа1 Зег Рго ТЬг Уа1 Азп Рго Мее Зег ТЬг А1а Мее О1п Азп О1и
515 520 525
Агд Агд
530
<210> 82 <211> 1038 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 82
Мее ТЬг Зег Зег Ьеи О1п Агд Рго Тгр Агд Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 15
ТЬг 11е Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег О1п Азп О1п 01 и Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг 01 п О1п Азр Ьеи О1у Не С1у О1и
35 40 45
Зег Агд Не Зег Нхз О1и Азп О1у ТЬг 11е Ьеи Суз Зег Ьуз О1у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг О1у Ьеи Тгр О1и Ьуз Зег Ьуз О1у Азр Не Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
Ьуз О1п О1у Суз Тгр Зег ΗΪ8 Не 01 у Азр Рго О1п О1и Суэ Нх8 Туг
85 90 95
О1и О1и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Не 01п Азп О1у ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп Уа1 Азп РЬе ТЬг
115 120 125
О1и Азп РЬе Рго РГО Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Н1з Зег
130 135 140
РЬе Азп Агд Азр О1и ТЬг Не Не Не А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи 11е Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе О1у Туг Агд МеЬ Ьеи ТЬг
165 170 175
О1у Азр Агд Ьуз О1п О1у Ьеи Нхз Зег МеЬ Азп МеЬ МеЬ О1и А1а А1а
180 185 190
А1а Зег 01 и Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи 01и Ьеи
195 200 205
Не 01у Агд О1у Агд Туг О1у А1а Уа1 Туг Ьуз 01у Зег Ьеи Азр О1и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд 01п Азп РЬе
225 230 235 240
Не Азп О1и Ьуз Азп Не Туг Агд Уа1 Рго Ьеи МеЬ О1и ΗΪ3 Азр Азп
245 250 255
- 79 015166
11е Аба Агд РЬе 1бе Уаб Сбу Азр Сби 265 Агд Уаб ТЬг Аба Азр 270 Сбу Агд
260
МеС Сби Туг Ьеи Ьеи Уаб МеС Сби Туг Туг Рго Азп Сбу Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Нбз ТЬг Зег Азр Тгр Уаб Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
Аба Нбз Зег Уаб ТЬг Агд Сбу Ьеи Аба Туг Ьеи Нбз ТЬг Сби Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд Сбу Азр Нбз Туг Ьуз Рго Аба 1бе Зег Нбз Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд АЗП Уаб Ьеи Уаб Ьуз Азп Азр Сбу ТЬг Суз Уаб ббе Зег Азр РЬе
340 345 350
Сбу Ьеи Зег МеС Агд Ьеи ТЬг Сбу Азп Агд Ьеи Уаб Агд Рго Сбу Оби
355 360 365
Сби Азр Азп Аба Аба Не Зег Оби Уаб Сбу ТЬг 1бе Агд Туг МеС Аба
370 375 380
Рго Оби Уаб Ьеи Сби Сбу Аба Уаб Азп Ьеи Агд Азр Суз Сби Зег Аба
385 390 395 400
Ьеи Ьуз Сбп Уаб Азр МеС Туг Аба Ьеи Сбу Ьеи ббе Туг Тгр Сби ббе
405 410 415
РЬе МеС Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго Сбу Сби Зег Уаб Рго Оби Туг
420 425 430
Сбп МеС Аба РЬе Сбп ТЬг Сби Уаб Сбу Азп Нбз Рго ТЬг РЬе Сби Азр
435 440 445
МеС Сбп Уаб Ьеи Уаб Зег Агд Сби Ьуз Сбп Агд Рго Ьуз РЬе Рго Сби
450 455 460
Аба Тгр Ьуз Сби Азп Зег Ьеи Аба Уаб Агд Зег Ьеи Ьуз Сби ТЬг ббе
465 470 475 480
Сби Азр Суз Тгр Азр Сбп Азр Аба Сби Аба Агд Ьеи ТЬг Аба Сбп Суз
485 490 495
Аба Сби Сби Агд МеС Аба Сби Ьеи МеС МеС Не Тгр Оби Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уаб Зег Рго ТЬг Уаб Азп Рго МеС Зег ТЬг Аба Мес С1п Азп Сби
515 520 525
Агд Азп Ьеи Зег Нбз Азп Агд Агд Уаб Рго Ьуз Не Сбу Рго Туг Рго
530 535 540
Азр Туг Зег Зег Зег Зег Туг Не Сби Азр Зег ббе Нбз Нбз ТЬг Азр
545 550 555 560
Зег 1бе Уаб Ьуз Азп 1бе Зег Зег Сби Нбз Зег МеС Зег Зег ТЬг Рго
565 570 575
Ьеи ТЬг 1бе Сбу Сби Ьуз Азп Агд Азп Зег Не Азп Туг Сби Агд Сбп
580 585 590
Сбп Аба Сбп Аба Агд 1бе Рго Зег Рго Оби ТЬг Зег Уаб ТЬг Зег Ьеи
595 600 605
Зег ТЬг Азп ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг Азп ТЬг ТЬг Сбу Ьеи ТЬг Рго Зег ТЬг
610 615 620
Сбу МеС ТЬг ТЬг ббе Зег Оби МеС Рго Туг Рго Азр Сби ТЬг Азп Ьеи
625 630 635 640
Нбз ТЬг ТЬг Азп Уаб Аба Сбп Зег Не Сбу Рго ТЬг Рго Уаб Суз Ьеи
645 650 655
Сбп Ьеи ТЬг Сби Сби Азр Ьеи Сби ТЬг Азп Ьуз Ьеи Азр Рго Ьуз Сби
660 665 670
Уаб Азр Ьуз Азп Ьеи Ьуз Сби Зег Зег Азр Сби Азп Ьеи МеС Оби Нбз
675 680 685
Зег Ьеи Ьуз Сбп РЬе Зег Сбу Рго Азр Рго Ьеи Зег Зег ТЬг Зег Зег
690 695 700
Зег Ьеи Ьеи Туг Рго Ьеи ббе Ьуз Ьеи Аба Уаб Сби Аба ТЬг Сбу Сбп
705 710 715 720
- 80 015166
СХп Азр Рке Ткг СХп Ткг А1а Азп СЯу 725 СХп 730 А1а Суз Ьеи Не Рго 735 Азр
УаХ Ьеи Рго Ткг СЯп 11е Туг Рго Ьеи Рго Ьуз СХп <31п Азп Ьеи Рго
740 745 750
Ьуз Агд Рго Ткг Зег Ьеи Рго Ьеи Азп Ткг Ьуз Азп Зег ТЬг Ьуз СХи
755 760 765
Рго Агд Ьеи Ьуз Рке СХу Зег Ьуз ΗΪ3 Ьуз Зег Азп Ъеи Ьуз С1п Уа1
770 775 780
С1и Ткг СХу УаХ А1а Ьуз МеЬ Азп Ткг Не Азп А1а АХа СХи Рго Η13
785 790 795 800
УаХ УаХ Ткг УаХ Ткг Мер Азп СХу УаХ А1а (Яу Агд Азп Н13 Зег УаХ
805 810 815
Азп Зег ΗΪ3 А1а А1а ТЬг Ткг С1п Туг А1а Азп СХу ТЫ УаХ Ьеи Зег
820 825 830
СХу СХп Ткг ТЬг Азп 11е Уа1 Ткг Нхз Агд А1а СХп СЯи МеС Ьеи СХп
835 840 84 5
Азп СЯп Рке Пе (Яу СХи Азр Ткг Агд Ьеи Азп 11е Азп Зег Зег Рго
850 855 860
Азр СХи Ηϊ3 СЯи Рго Ьеи Ьеи Агд Агд СХи СХп СЯп АХа С1у Η13 Азр
865 870 875 880
СХи С1у Уа1 Ьеи Азр Агд Ьеи Уа1 Азр Агд Агд СХи Агд Рго Ьеи С1и
885 890 895
СХу СХу Агд Ткг Азп Зег Азп Азп Азп Азп Зег Азп Рго Суз Зег СЯи
900 905 910
СХп Азр УаХ Ьеи А1а СХп С1у УаХ Рго Зег Ткг А1а А.1а Азр Рго СХу
915 920 925
Рго Зег Ьуз Рго Агд Агд А1а <31 п Агд Рго Азп Зег Ьеи Азр Ьеи Зег
930 935 94 0
А1а Ткг Азп УаХ Ьеи Азр СХу Зег Зег 11е СХп Не СХу СХи Зег Ткг
945 950 955 960
С1п Азр СХу Ьуз Зег СХу Зег СХу 01 и Ьуз 11е Ьуз Ьуз Агд УаХ Ьуз
965 970 975
ТЬг Рго Туг Зег Ьеи Ьуз Агд Тгр Агд Рго Зег Ткг Тгр. УаХ Не Зег
980 985 990
Ткг С1и Зег Ьеи Азр Суз СХи УаХ Азп Азп Азп С1у Зег АЗП Агд А1а
995 1000 1005
УаХ ΗΪ3 Зег Ьуз Зег Зег Ткг А1а УаХ Туг Ьеи АХа СХи СЯу СЯу ТЫ
1010 1015 1020
А1а Ткг Ткг МеС УаХ Зег Ьуз Азр Не С1у МеС Азп Суз Ьеи
1025 1030 1035
<210> 83 <211> 1038 <212> РКТ <213> Ното заргепз
<400> 83
МеС Ткг Зег Зег Ьеи СЯп Агд Рго Тгр Агд Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 Х5
Ткг Не Ьеи Ьеи УаХ Зег Ткг АХа А1а А1а Зег СЯп Азп СХп СХи Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг 01п С1п Азр Ьеи СХу Не СХу СХи
35 40 4 5
Зег Агд Не Зег Ηίβ СЯи Азп СЯу Ткг Не Ьеи Суз Зег Ьуз СХу Зег
50 55 60
Ткг Суз Туг СХу Ьеи Тгр СЯи Ьуз Зег Ьуз СХу Азр 1Хе Азп Ьеи УаХ
65 70 75 80
Ьуз (31η С1 у Суз Тгр Зег 85 ΗΪ3 Не О1у Азр 90 Рго О1п 01 и Суз Н1з 95 Туг
01и С1и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Не ОХп Азп О1у ТЬг
100 105 110
Туг Агд РИе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп Уа1 Азп РЬе ТЬг
115 120 125
01и Азп РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Η13 Зег
130 135 140
Рке Азп Агд Азр С1 и ТЬг Не Не 11е А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи 11е Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе С1у Туг Агд Мес Ьеи ТЬг
165 170 175
С1у Азр Агд Ьуз СХп О1у Ьеи ΗΪ3 Зег МеС Азп МеС МеС О1и А1а А1а
180 185 190
АХа Зег ОХи Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи 01 и Ьеи
195 200 205
Не О1у Агд <31у Агд Туг О1у А1а Уа1 Туг Ьуз О1у Зег Ьеи Азр О1и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд О1п Азп РЬе
225 230 235 240
Не АЗП О1и Ьуз Азп Не Туг Агд Уа1 Рго Ьеи МеС О1и НХз Азр АЗП
245 250 255
Не А1а Агд РЬе Не Уа1 С1у Азр ОХи Агд Уа1 ТЬг А1а Азр О1у Агд
260 265 270
МеС <31и Туг Ьеи Ьеи Уа1 МеС С1и Туг Туг Рго Азп О1у Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Наз ТЬг Зег Азр Тгр Уа1 Зег Зег Суз Агд Ьеи
290 295 300
А1а НХз Зег Уа1 ТЬг Агд 01у Ьеи А1а Туг Ьеи ΗΪ3 ТЬг О1и Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд О1у Азр Н1з Туг Ьуз Рго А1а Не Зег ΗΪ3 Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Азп Азр О1у ТЬг Суз Уа1 Не Зег Азр РЬе
340 345 350
О1у Ьеи Зег МеС Агд Ьеи ТЬг О1у Азп Агд Ьеи Уа1 Агд Рго С1у О1и
355 360 365
О1и Азр Азп А1а А1а Не Зег 01 и Уа1 О1у ТЬг Не Агд Туг МеС А1а
370 375 380
Рго О1и УаХ Ьеи О1и С1у А1а Уа1 Азп Ьеи Агд Азр Суз О1и Зег А1а
385 390 395 400
Ьеи Ьуз О1п Уа1 Азр МеС Туг А1а Ьеи О1у Ьеи Не Туг Тгр О1и Не
405 410 415
РЬе МеС Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго О1у О1и Зег Уа1 Рго О1и Туг
420 425 430
О1п МеС А1а РЬе С1п ТЬг С1и Уа1 С1у Азп Н1з Рго ТЬг РЬе 01 и Азр
435 440 445
МеС О1п Уа1 Ьеи УаХ Зег Агд С1 и Ьуз ОХп Агд Рго Ьуз РЬе Рго 01 и
450 455 460
А1а Тгр Ьуз СХи Азп Зег Ьеи А1а Уа1 Агд Зег Ьеи Ьуз 01 и ТИг 11е
465 470 475 480
О1и Азр Суз Тгр Азр С1п Азр А1а О1и А1а Агд Ьеи ТЬг А1а О1п Суз
485 490 495
А1а О1и О1и Агд Мес А1а С1и Ьеи Мес МеС Не Тгр О1и Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег Уа1 Зег Рго ТЬг Уа1 Азп Рго МеС Зег ТЬг А1а МеС О1п Азп О1и
515 520 525
Агд Азп Ьеи Зег Шз Азп Агд Агд Уа1 Рго Ьуз Не О1у Рго Туг Рго
530 535 540
- 82 015166
Азр Туг Зег Зег Зег Зег Туг 11е С1и Азр Зег 11е ΗΪ3 ΗΪ3 Ткг Азр
545 550 555 560
Зег 11е Уа1 Ьуз Азп 11е Зег Зег О1и Н13 Зег Мек Зег Зег Ткг Рго
565 570 575
Ьеи Ткг 11е О1у О1и Ьуз Азп Агд Азп Зег 11е Азп Туг <31и Агд С1п
580 585 590
С1п А1а 01 п А1а Агд 11е Рго Зег Рго О1и Ткг Зег Уа1 Ткг Зег Ьеи
595 600 605
Зег Ткг Азп Ткг Ткг Ткг Ткг Азп Ткг Ткг О1у Ьеи Ткг Рго Зег Ткг
610 615 620
С1у Мер Ткг Ткг 11е Зег О1и МеС Рго Туг Рго Азр <31и Ткг Азп Ьеи
625 630 635 640
ΗΪ3 Ткг Ткг Азп Уа1 А1а С1п Зег 11е О1у Рго Ткг Рго Уа1 Суз Ьеи
645 650 655
(31п Ьеи Ткг О1и О1и Азр Ьеи 01и Ткг Азп Ьуз Ьеи Азр Рго Ьуз (31и
660 665 670
Уа1 Азр Ьуз Азп Ьеи Ьуз 01и Зег Зег Азр <31и Азп Ьеи МеС (31и Нйз
675 680 685
Зег Ьеи Ьуз 01п Рке Зег 01у Рго Азр Рго Ьеи Зег Зег Ткг Зег Зег
690 695 700
Зег Ьеи Ьеи Туг Рго Ьеи 11е Ьуз Ьеи А1а Уа1 <31и А1а Ткг (31у О1п
705 710 715 720
<31п Азр Рке Ткг О1п Ткг А1а Азп О1у О1п А1а Суз Ьеи 11е Рго Азр
725 730 735
Уа1 Ьеи Рго Ткг О1п 11е Туг Рго Ьеи Рго Ьуз О1п (Э1п Азп Ьеи Рго
740 745 750
Ьуз Агд Рго Ткг Зег Ьеи Рго Ьеи Аэп Ткг Ьуз Азп Зег Ткг Ьуз С1и
755 760 765
Рго Агд Ьеи Ьуз Рке 01у Зег Ьуз Низ Ьуз Зег Азп Ьеи Ьуз (31п Уа1
770 775 780
С1и Ткг 01у Уа1 А1а Ьуз Мер Азп Ткг 11е Азп А1а А1а (31и Рго Ηϊθ
785 790 795 800
Уа1 Уа1 Ткг Уа1 Ткг МеС Азп О1у Уа1 А1а О1у Агд АЗП ΗΪ3 Зег Уа1
805 810 815
Азп Зег ΗΪ3 А1а А1а Ткг Ткг О1П Туг А1а Азп Агд Ткг Уа1 Ьеи Зег
820 825 830
<31у О1п Ткг Ткг Азп 11е Уа1 Ткг Η13 Агд А1а С1п <31и МеЬ Ьеи (31п
835 840 845
Азп О1п Рке 11е О1у О1и Азр Ткг Агд Ьеи Азп 11е Азп Зег Зег Рго
850 855 860
Азр 01 и ΗΪ3 О1и Рго Ьеи Ьеи Агд Агд О1и <31п <31п А1а 01у ΗΪ3 Азр
865 870 875 880
О1и О1у Уа1 Ьеи Азр Агд Ьеи Уа1 Азр Агд Агд С1и Агд Рго Ьеи С1и
885 890 895
С1у <31у Агд Ткг Азп Зег Азп Азп Азп Азп Зег Азп Рго Суз Зег (31и
900 905 910
01 п Азр Уа1 Ьеи А1а 01 п О1у Уа1 Рго Зег Ткг А1а А1а Азр Рго (31у
915 920 925
Рго Зег Ьуз Рго Агд Агд А1а О1П Агд Рго Азп Зег Ьеи Азр Ьеи Зег
930 935 940
А1а Ткг Азп Уа1 Ьеи Азр О1у Зег Зег 11е <31п 11е О1у О1и Зег Ткг
945 950 955 960
01 п Азр С1у Ьуз Зег 01у Зег С1у О1и Ьуз 11е Ьуз Ьуз Агд Уа1 Ьуз
965 970 975
Ткг Рго Туг Зег Ьеи Ьуз Агд Тгр Агд Рго Зег Ткг Тгр Уа1 Не Зег
980 985 990
Ткг 01и Зег Ьеи Азр Суз С1и Уа1 Азп Азп Азп (31 у Зег Азп Агд А1а
995 1000 1005
- 83 015166
Уа1 Нхз Зег Ьуз Зег 1010
А1а ТЬг ТЬг МеС Уа1
1025
Зег Т1хг А1а Уа1 1015
Зег Ьуз Азр 11е
1030
Туг Ьеи А1а <31и <31у <31у ТЬг 1020 (31у МеС Азп Суз Ьеи
1035 <210> 84 <211> 1038 <212> РКТ <213> Ното зархепз
<400> 84
МеС ТЬг Зег Зег Ьеи <31 п Агд Рго Тгр Агд Уа1 Рго Тгр Ьеи Рго Тгр
1 5 10 15
ТЬг 11е Ьеи Ьеи Уа1 Зег ТЬг А1а А1а А1а Зег <31п Азп <31п <31и Агд
20 25 30
Ьеи Суз А1а РЬе Ьуз Азр Рго Туг (31п <31п Азр Ьеи <31у Не <31у С1и
35 40 45
Зег Агд 11е Зег Нхз <31и Азп <31у ТЬг Не Ьеи Суз Зег Ьуз С1у Зег
50 55 60
ТЬг Суз Туг <31у Ьеи Тгр <31и Ьуз Зег Ьуз О1у Азр Не Азп Ьеи Уа1
65 70 75 80
Ьуз <31п С1у Суз Тгр Зег Нхз 11е <31у Азр РГО С1п <31и Суз ΗΪ3 Туг
85 90 95
<31и <31и Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго Рго Зег Не С1п Азп (31у ТЬг
100 105 110
Туг Агд РЬе Суз Суз Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Суз Азп ν»ι Азп РЬе ТЬг
115 120 125
О1и Азп РЬе Рго Рго Рго Азр ТЬг ТЬг Рго Ьеи Зег Рго Рго Нхз Зег
130 135 140
РЬе Азп Агд Азр С1и ТЬг 11е Не 11е А1а Ьеи А1а Зег Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Ьеи А1а Уа1 Ьеи Не Уа1 А1а Ьеи Суз РЬе (31у Туг Агд МеС Ьеи ТЬг
165 170 175
<31у Азр Агд Ьуз <31п <31у Ьеи Нхз Зег МеС Азп МеС МеС (31и А1а А1а
180 185 190
А1а Зег <31 и Рго Зег Ьеи Азр Ьеи Азр Азп Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи (31 и Ьеи
195 200 2 05
Не С1у Агд (31у Агд Туг (31у А1а Уа1 Туг Ьуз С1у Зег Ьеи Азр С1и
210 215 220
Агд Рго Уа1 А1а Уа1 Ьуз Уа1 РЬе Зег РЬе А1а Азп Агд С1п АЗП РЬе
225 230 235 240
Не Азп С1и Ьуз Азп Не Туг Агд Уа1 Рго Ьеи МеС <31и Нхз Азр Азп
245 250 255
Не А1а Агд РЬе Не Уа1 <31у Азр <31и Агд Уа1 ТЬг А1а Азр (31у Агд
260 265 270
МеС (31и Туг Ьеи Ьеи Уа1 МеС (31и Туг Туг Рго Азп <31у Зег Ьеи Суз
275 280 285
Ьуз Туг Ьеи Зег Ьеи Нхз ТЬг Зег Азр Тгр Уа1 Зег 5ег Суз Агд Ьеи
290 295 300
А1а Нхз Зег Уа1 ТЬг Агд С1у Ьеи А1а Туг Ьеи Нхз ТЬг О1и Ьеи Рго
305 310 315 320
Агд <31у Азр Нхз Туг Ьуз Рго А1а Не Зег Нхз Агд Азр Ьеи Азп Зег
325 330 335
Агд Азп Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Азп Азр <31у ТЬг Суз Уа1 Не Зег Азр РЬе
340 345 350
<31у Ьеи Зег МеС Агд Ьеи ТЬг <31у Азп Агд Ьеи Уа1 Агд Рго <31 у <31и
355 360 3 65
- 84 015166
01и Азр Азп А1а А1а 11е Зег С1и Уа1 375 С1у ТЬг Не 380 Агд Туг МеС А1а
370
Рго О1и Уа1 Ьеи О1и О1у А1а Уа1 Азп Ьеи Агд Азр Суз О1и Зег А1а
385 390 395 400
Ьеи Ьуз О1п Уа1 Азр Мее Туг А1а Ьеи 01у Ьеи 11е Туг Тгр 01 и Не
405 410 415
РЬе Мее Агд Суз ТЬг Азр Ьеи РЬе Рго 01у О1и Зег Уа1 Рго О1и Туг
420 425 430
О1п Мее А1а РЬе О1п ТЬг О1и Уа1 01у Азп ΗΪ3 Рго ТЫ РЬе О1и Азр
435 440 445
Мее О1п Уа1 Ьеи Уа1 Зег Агд 01 и Ьуз О1п Агд Рго 1>уэ РЬе Рго О1и
450 455 460
А1а Тгр Ьуз О1и АЗП Зег Ьеи А1а Уа1 Агд Зег Ьеи Ьуз 01 и ТЬг Не
465 470 475 480
О1и Азр Суз Тгр Азр О1п Азр А1а 01и А1а Агд Ьеи ТЫ А1а 01п Суз
485 490 495
А1а 01 и О1и Агд Мее А1а С1и Ьеи Мее Мее Не Тгр О1и Агд Азп Ьуз
500 505 510
Зег 17а 1 Зег Рго ТЫ Уа1 Азп Рго Мее Зег ТЬг А1а Мее О1п Азп 01 и
515 520 525
Агд Азп Ьеи Зег нбз Азп Агд Агд Уа1 РГО Ьуз Не О1у Рго Туг Рго
530 535 540
Азр Туг Зег Зег Зег Зег Туг Не 01и Азр Зег Не ΗΪ8 ΗΪ3 ТЬг Азр
545 550 555 560
Зег Не Уа1 Ьуз Азп Не Зег Зег 01и Ηί3 Зег Мее Зег Зег ТЫ Рго
565 570 575
Ьеи ТЬг Не О1у О1и Ьуз Азп Агд Азп Зег Не Азп Туг 01и Агд О1п
580 585 590
О1п А1а 01 п А1а Агд Не Рго Зег Рго О1и ТЫ Зег Уа1 ТЬг Зег Ьеи
595 600 605
Зег ТЬг Азп ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг Азп ТЬг ТЬг 01 у Ьеи ТЫ Рго Зег ТЬг
610 615 620
О1у Мее ТЬг ТЬг Не Зег О1и Мее Рго Туг Рго Азр О1и ТЬг Азп Ьеи
625 630 635 640
Ηί3 ТЫ ТЬг Азп Уа1 А1а О1п Зег Не О1у Рго ТЬг Рго Уа1 Суз Ьеи
645 650 655
01п Ьеи ТЬг О1и О1и Азр Ьеи 01и ТЬг АЗП Ьуз Ьеи Азр Рго Ьуз 01и
660 665 670
Уа1 Азр Ьуз Азп Ьеи Ьуз О1и Зег Зег Азр О1и Азп Ьеи Мее О1и ΗΪ8
675 680 685
Зег Ьеи Ьуз О1п РЬе Зег О1у Рго Азр Рго Ьеи Зег Зег ТЬг Зег Зег
690 695 700
Зег Ьеи Ьеи Туг Рго Ьеи Не Ьуэ Ьеи А1а Уа1 О1и А1а ТЬг О1у О1п
705 710 715 720
О1п Азр РЬе ТЬг О1п ТЫ А1а Азп О1у О1п А1а Суз Ьеи Не Рго Азр
725 730 735
Уа1 Ьеи Рго ТЬг О1П Не Туг Рго Ьеи Рго Ьуз С1п О1п Азп Ьеи Рго
740 745 750
Ьуз Агд Рго ТЫ Зег Ьеи РГО Ьеи Азп ТЬг Ьуз Азп Зег ТЬг Ьуз 01и
755 760 765
Рго Агд Ьеи Ьуз РЬе О1у Зег Ьуз Н13 Ьуз Зег Азп Ьеи Ьуз 01 п Уа1
770 775 780
О1и ТЬг О1у Уа1 А1а Ьуз Мее Азп ТЬг Не Азп А1а А1а О1и Рго ΗΪ3
785 790 795 800
Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 ТЫ Мее Азп О1у Уа1 А1а О1у Агд Азп Н13 Зег Уа1
805 810 815
Азп Зег ΗΪ3 А1а А1а ТЫ ТЬг О1п Туг А1а Азп Агд ТЫ Уа1 Ьеи Зег
820 825 830
- 85 015166
ОЬу ОЬп ТЬг ТЬг Азп ЬЬе УаЬ ТЬг НЬз Агд АЬа ОЬп ОЬи МеС Ьеи СЬп
835 840 845
Азп ОЬп РЬе ЬЬе ОЬу ОЬи Азр ТЫ Агд Ьеи Азп Не Азп Зег Зег Рго
850 855 860
Азр ОЬи НЬз ОЬи Рго Ьеи Ьеи Агд Агд ОЬи ОЬп ОЬп АЬа ОЬу НЬз Азр
865 870 875 880
СЬи СЬу УаЬ Ьеи Азр Агд Ьеи УаЬ Азр Агд Агд ОЬи Агд Рго Ьеи ОЬи
885 890 895
СЬу СЬу Агд ТЬг Азп Зег Азп Азп Азп Азп Зег Азп Рго Суз Зег ОЬи
900 905 910
ОЬп Азр УаЬ Ьеи АЬа ОЬп ОЬу УаЬ Рго Зег ТЫ АЬа АЬа Азр Рго ОЬу
915 920 925
Рго Зег Ьуз Рго Агд Агд АЬа ОЬп Агд Рго Азп Зег Ьеи Азр Ьеи Зег
930 935 940
А1а ТЬг Азп УаЬ Ьеи Азр ОЬу Зег Зег 11е ОЬп 11е ОЬу ОЬи Зег ТЫ
945 950 955 960
СЬп Азр ОЬу Ьуз Зег СЬу Зег ОЬу ОЬи Ьуз ЬЬе Ьуз Ьуз Агд УаЬ Ьуз
965 970 975
ТЬг Рго Туг Зег Ьеи Ьуз Агд Тгр Агд Рго Зег ТЬг Тгр УаЬ 11е Зег
980 985 990
ТЬг СЬи Зег Ьеи Азр Суз С1и УаЬ Азп АЗП Азп СЬу Зег Азп Агд АЬа
995 1000 1005
УаЬ НЬз Зег Ьуз Зег Зег ТЬг АЬа Уа1 Туг Ьеи АЬа ОЬи ОЬу ОЬу ТЫ
1010 1015 1020
АЬа ТЬг ТЬг МеС УаЬ Зег Ьуз Азр 11е ОЬу МеЬ Азп Суз Ьеи
1025 1030 1035
<210> 85 <211> 2932 <212> ΟΝΑ <213> Ното зарЬепз <400> 85 дсЬссдсдсс дадддсСдда ддаьдсдССс ссСддддСсс ддасСЬаЬда аааСаЬдсае60 садЬЬСааСа сСдСсССдда аСЬсаСдада СддаадсаСа ддЬсааадсС дСЫддадаа120 ааСсадаадС асад&ССЬаС сЬадссасаЬ сЬЬддаддад ЬсдЬаадааа дсадСдддад180
СЬдаадЬсаС СдСсаадСдс ССдсдаСсСС ССасаадааа аСсСсасСда аСдаСадСса240
ЫЬаааЫдд СдаадСадса адассааССа СЬаааддСда садСасасад дааасаССас300 ааСЬдаасаа СдасСсадсС аСасаСССас аЬсадаССаС СдддадссСа СССдЫсаСс360 аЫЬсСсдЬд ССсааддаса дааЬсЬддаС адСаСдсЫс аСддсасЬдд даСдаааЬса420 дасьссдасс адааааадСс адаааасдда дСаассССад сассададда ЬассЫдссЬ480
ЫгЬССааадС дсСаССдсСс адддсасСдС ссадаСдаСд сСаССааСаа сасаСдсаСа540 асСааСддас аССдсЬЬСдс саСсаСадаа даадаСдасс адддадааас сасаССадсС600
СсадддидСа СдаааСаСда аддаСссдаС ССьсадСдса аадасисСсс аааадессад660 ссасдссдда сааСадааЬд ЫдСсддасс ааСЬЬаЬдСа ассадСаСЫ дсаасссаса720 срдсссссСд ЬЬдСсаСадд СссдССЬССС дасддсадса ССсдаЬддсС ддЬСЬСдсСс780 аСЬСсСаСдд сСдСсЬдсае ааССдсЬаСд аЬсаСсЫсС ссадсСдсСЬ СЬдССасааа840 саССаССдса ададсаЬсСс аадсадасдС сдССасааСс дСдаСССдда асаддаЬдаа900 дсаЬЬЬаССс садсьддада аСсасСаааа дассЬСаСЬд ассадЬсаса аадССсЬддС960 адСдддрсСд дасСассЬЬС аССддССсад сдаасСаЬЬд ссааасадаС СсадаСддСс1020 сддсаадССд дСаааддссд аСаСддадаа дСаЬддаСдд дсаааСддсд Ьддсдааааа1080 дСддсддСда аадСаССсСС СассасСдаа даадссадсс ддСССсдада аасадаааСс1140
СассааасСд СдсСааСдсд ссаСдаааас аСасССддСС СсаСадсддс адасасеааа1200 ддЬасаддСС ссСддасЬса дсСсСаСЬСд аЬЬасСдаСЬ ассапдаааа СддаСсСсСс1260
СаСдасССсс СдаааСдСдс СасасСддас ассададссс СдсССаааСС ддсССаССса1320 дсСдссьдСд дСсСдСдсса ссСдсасаса даааССЬаСд дсассса.адд ааадсссдса1380 аЬЬдсСсаСс дадассСааа дадсааааас аСссСсаСса адаааааСдд дадССдсЬдс1440
- 86 015166 аккдскдасс ккдаакасса аасааааасс кдддадакдд касаасакдд сдкккдсддс аадскаакдк аадаадасдс. сддаддадаа кддаакаадд каакаккааа ккскккакак кккккакдаа скдааккдсс садсададак касскккдка дкккдксскд кскдскдсса дссддкддкк дссакккаск дакдссаадд ссаккккккк скаккдссак кдакадсаак аадддаадкк.
кдддссккдс ддд^дддсас асккссадсс сксдксдккд кассдадкда сааккдкдкс садаакдскд ккдссаадак аскскадаск акдккааскк ссккксадка акддасадск скдсаксаад кдкксакааа ддадааакад ааасадсска кдкссккадк кккдааккад ккдкдсккка ккдсаадкда ссаааадаад кдкддккакк даассакдск дкаадкдсск акккакаккк кдккаааккс сааасдскас скасаксакд каксасадда кссдксакас кааксддкдд ддсссасаак ддккдааксс дсаадааскд ддккексада сксккаккад ккаккккааа аскксааксс аеддкдеккк аекккдеекк кадакдакда дакдкдкдкд аадаааакаа аааакдсаак дакадскксс кккааадсак акккккдкеа касааадааа акаассакдк кдкдкакаак аасадкдаса акддсксссд дскдасакск дддакедкдд даадакакде аасадкдакд ссадссксса саадакдкаа кккккассса сксккксккс дакасаадск кдкддккккк кдаккадкдк скдкдааадс ккасскдада кдкдкккддд кдкскссакд кккакакдеа акскдассаа ссассадскк скдкаааккк сддааадсак дсасккскка кскакаккск дкдекккакк сааакдаадк аадкдекдда асадскксдд аадаакасса дкдаддккдк аакдкекаед дасксасадс ааакскдакд кддсакдддк аскасдкдкк дддаасккск •дакдеекккк скссадксаа еккаадаада сакксадккс акаскдскка сасакдсасд кдсасаддаа дакксдссаа каккккккаа ддаскдкккк сскскссааа ккдаадкдаа ккакксксад кдсаааксас кдакдкдссс сдааадсскд сскааксакк аккдесакак дкдкдксааа адсадккккд аккдадаакк дккааассак ддааккадад сасаддскдс ааасасккса кккаадкддд дскскдддка кааакдадсд дкккдкаккс ккккакдака ссдддакксс дакаккддкд ксксакасаа сакдааадск сскксаасса дккддадекк кксскдсакк кааеккккаа сс
1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2932 <210> 86 <211> 1575 <212> ϋΝΆ <213> Ното зар1епз <400> 86 дсаааскксс ааададдакд сассассакк асдакдакад дааддсксад кдскдсасад аасададакк кдкадкккде ассадасскс кссскдадад скддкссааа какддддаад ассасададд сакдааааса ккдкасскаа ассскадасд ккасасасад адкаааааса дккаааккка ааасдскака касаксакдд дкаксаддад сссксккакд аассддкдда дсксасаакс ксададкссс ккдакаасак дкдададкас дкссадаада аададдакда акккксадкд аааддаасда ккдккдакдд ксккддксск дакасадсак аеккааккда ддаскакадс кккддакддд аадссадскд ккккдддккк ксасадаска скаааксаак ааакекккад ккскддкдаа ккадкдакас кдсскссада скдасакдка дкакадкдда аддасакдад дсадкдакда скдсаксаад аддасаккаа деккккдеда адсссссасс сксадксаас скскдддккд ксдддасаск акдкаакааа асскакасас каксакакка Ьдддккадаа дсадксксад каадсадакк ааадкддедк дкксададад саккдскдса ксакдаааак дскдаадкка касксааддс дааааакдда ааакдаадкк адкдккддас кадккккддс адаакассад ддадаккдкд дкдкекаадд дскдасадсс аскскдакад адкдеаддаа ссссдкссаа аакакккдеа сскдкддкса сссакксскс дасскасасс сасадддскк ккккдккаск саддакдааа адсксаддаа садакддкда ддсдаааадд асадааакак дакаксааад ддкксссккк дсскаскскк ааассадсаа аеккдекдка дасакассас дададеккда сксакссккк сккссккакс кдеаксаада садакдддаа скдедддкка дададдаааа ааккааакдк аддкеккдед дсасадасдд сккскддккд аксааадаад скасаскдсс касккакакс кссддкакаа сккасакксс дкддаксадд аасадаккдд кадскдкдаа аксадасадк ддасадддкс акдаккакск скдксадкдд ккдсссаксд ккдскдасск скаасасксд асадааакса эддаддккде акдасскадк адккасдссс аасксакдас адаааасаск дкаадсакск дддсассаад 60 ккдкааакде 120 акаккдкккс 180 сскаддаска 240 аксааккдаа 300 кссаккдааа 360 кдкдаскдкс 420 аадасаадаа 480 ксскддадаа 540 сскссскскд 600 ааааддксдс 660 адкдккекке 720 дккдакдадд 780 скддасссад 840 даадкссасс 900 еккакдкеак 960 адакскдааа 1020 дддсскддск 1080 адккддсасс 1140 сккссадкск 1200 каддадакдк 1260 дсссадкдас 1320 сксаккссса 1380 адаакдекдд 1440 кдссаааакд 1500 скдсадааад 1560
- 87 015166 ссаасаддСа сссСС 1575 <210> 87 <211> 2032 <212> ϋΝΑ <213> Ното зархепз <400> 87 сдсддддсдс ддадСсддсд дддссСсдсд ддасдсдддс адСдсддада ссдсддсдсС60 даддасдсдд дадссдддад сдсасдсдсд дддЬддадСЬ садссЬасСс СССсЬСадаЬ120 дСдаааддаа аддаадаСса СССсаСдссС СдССдаСааа ддССсадаср ьсСдсСдаСС180 саЬаассаСС СддсСсСдад сСаСдасаад ададдаааса аааадЬСааа сССасаадсс240
СдссаСаадС дадаадсааа сСЬссСЬдаС аасаСдсССС СдсдаадСдс аддааааССа300 ааЬдЬдддса ссаадааада ддаСддСдад адСасадссс ссассссссд ЬссаааддСс360
ССдсдССдСа ааЬдссасса ссаССдСсса даадасСсад ЬсаасааСаС ьСдсадсаса420 дасддаСаСС дСЬЬсасдаС даСадаадад даСдасЬсЬд ддСЬдссЬдЬ ддСсасСЬсС480 ддССдссСад дасСадаадд сСсадаСССС садСдссддд асасСсссаЬ Ссс&саСсаа540 адаадаесаа ССдааСдсед сасадааадд аасдааСдСа аСааадассС асасссСаса600 сСдссСссаь Сдааааасад адассссдсс даСддассра ьасассасад ддсСЬСасСС660 аСаесСдСда сЬдСсЬдСад СССдсСсСЬд дСссСЬаЬса СаССаССЬСд ЬСасСЬссдд720
СаСаааадас аадааассад ассСсдаСас адсаСЬдддС Садаасадда СдааасССас780 аЬСссЬссСд дадааСсссС дададасССа аЬСдадсадС. сСсададсЬс аддаадЬдда840
СсаддссЬсс сСсСдсСддС ссаааддасС аЬадсСаадс адаСЬсадаЬ ддЬдааасад900 аССддаааад дСсдсеаЬдд ддаадеЬЬдд аСдддааадЬ ддсдСддсда аааддСадсЬ960 д&дааадСде СсСЬсассас ададдаадсс адсСддССса дададасада ааСаЬаСсад1020 асадСдСЬда СдаддсаСда ааасаСЬХЬд ддЬСЬсаССд ссдсадаЬас сааадддаса1080 дддСссСдда сссадЬСдЬа ссЬааСсаса дасСаСсаЬд ааааСддЬЬс ссЬССаСдаС1140
ЬаСсЬдаадЬ ссассасссС ада сд с Саа а СсааСдсСда адССадссСа сСсССсСдСс1200 адСддсССас дСсаСССаса сасадаааСс СССадСасСс ааддсааасс адсааССдсс1260 саСсдадаСс СдаааадСаа ааасаССсСд дСдаадаааа аСддаасССд сСдСаССдсС1320 дассСдддсс СддсСдССаа аСССаССадС даСасааасд аадссдасас ассассСаас1380 асСсдадССд дсассааасд сСаСаСдссС ссадаадСдС Сддасдадад сССдаасада1440 ааСсасССсс адссссасас саСддсСдас аСдСаСадСС ССддссСсаС ссСССдддад1500 дССдсСадда даСдСдСаСс аддаддСаСа дСддаадааС ассадсССсс ССаСсаСдас1560 сСадСдссса дСдассссСс ССаСдаддас аСдадддада ССдсдСдсаС саадаадССа1620 сдссссСсаС Ссссааассд дСддадсадС даСдадСдСс СааддсадаС дддаааасСс1680 аСдасадааС дсСдддсСса сааСссСдса СсааддсСда садсссСдсд ддССаадааа1740 асасССдсса аааСдСсада дСсссаддас аССааасСсС даСаддадад даааадСаад1800 саСсСсСдса дааадссаас аддСасСсСС сСдСССдСдд дсададсааа адасаСсааа1860
СаадсаСсса садСасаадс сССдаасаСс дСссСдсССс ссадСдддСС садассСсас1920 сСССсаддда дсдассСддд сааадасада даадсСссса дааддадада ССдаСссдСд1980
СсСдСССдСа ддсддадааа ссдССдддСа асССдССсаа даСаСдаСдс аС2032 <210> 88 <211> 3167 <212> ΟΝΑ <213 > ЕаССиз зр.
<400> 88 дааССсаСда даСддаааса СаддСсааад сСдСССддад аааССддаас СасадССССа 60 СсСадссаса СсСсСдадаа дСсСдаадаа адсадсаддс дааадСсаСС дСсаадСдаС 120 СССдССсССс СдСааддааа ссСсдССсад СааддссдСС СасССсадСд ааасадсадд 180 ассадСааСс ааддСддссс ддасаддаса сдСдсдааСС ддасааСдас СсадсСаСас 240 асССасаСса даССасСддд адссСдСсСд сссасеассс сСсасдССса адддсадааС 300 сСадаСадСа СдсСссаСдд СасСддСаСд аааСсадасд Сддассадаа даадссддаа 360 ааСддадСда сдССадсасс. ададдасасс ССассСССсС СааааСдсСа ССдсСсадда 420 сасСдсссад аСдасдсСаС СааСаасаса СдсаСаасса аСддссаССд сСССдссаСС 480 аСадаадаад аСдаСсаддд адааассасд ССаасССсСд ддСдСаСдаа дСаСдааддс 540
- 88 015166
ЬсСдаССССс ааСдсаадда ССсассаааа дсссадсЬас дсаддасааС адааСдССдЬ 600 сддассааСС СдЬдсаасса аСаСССдсад ссСасасСдс ссссьдьсде Сасаддссса 660 ЫсСССдаСд дсадсдЬссд аСддсЬддсС дСдсСсаСсС сСаСддсСдС сСдСаССдСс 720 дссаСдаСсд ЬсЬЬсСссад сСд.сССсСдЬ СасааасаСЬ асСдСаадад СаСсСсаадс 780 ададдСсдСС асаассдСда сССддаасад даЬдаадсаС ЬСаССссадС аддадааСса 840 сЬдааадасс ЬдаССдасса дСсасааадс СсСддСадСд даСсСддаСС ассСССаССд 900 дСЬсадсдаа сСаССдссаа асадаСЬсад аСддССсддс аддССддСаа аддссддСаЬ 960 ддадаадЬаС ддаСдддСаа аЬддсдСддС дааааадСдд сСдСсааадС аССССССасс 1020 асЬдаадаад сСадсСддЬС Сададаааса даааСсСасс адасддСдСС ааСдсдЬсаС 1080 дааааСаСас ССддССССаС адсЬдсадас аСЬаааддса ссддЫссСд дасСсадсСд 1140 ЬаСССдаССа сСдаССасса ЬдадааЬддд СсСсЬсЬаСд асССссСдаа аСдСдссасс 1200 сСддасасса дадсссЬасС саадССадсС СаССсСдсСд ссСдСддСсС дЬдссассСс 1260 сасасадааа ССЬаСддсас дсааддсаад ссСдсааСЬд сСсаСсдада ссСдаададс 1320 ааааасаСсс ССаССаадаа аааСддСадС СдсСдСаЬСд ссдассСддд ссЬадсСдСС 1380 аави&сааса. уб.сассвуууС ууусз-ссауу 1440 сддсасаедд сСссадаадЬ дсСддасдад адссСдадСа аааассаЫЬ ссадсссСас 1500 аСсаСддсьд асаЬсСасад сССЬддССЬд аСсаССЬддд адаЬддсссд СсдсСдСаЬЬ1560 асаддаддаа СсдЬддадда аЬаЬсааЬСа ссаЬаСЬаса асаСддСдсс СадСдассса1620
СсСЬаСдаад асаСдсдСда ддСсдСдСдС дСдааасдсС СдсддссааС сдСсСсСаас1680 сдсЬддааса дСдаСдааЬд Ссььсдадсс дЬССЬдаадс СдаСдЬсада аЬдсСдддсс1740 саСааСссад саЬссад.асЬ сасадсЬССд адааСсаада адасдсСсдс ааадаСддЬС1800 дааСсссадд аСдСааадаС ССдасаааса дЬЬССдадаа адааСГ.Сада сЬдсаадааа1860
ЬСсасссдад даадддСдда дСЬадсаЬдд асСаддаСдС сддсССддЬС ьссадасСсС1920 сСссЬсСаса СсЬСсасадд сСдсСаасад СааасСЬСса ддасСсЬдса дааСдсаддд1980
ССддадсССс адасаСадда сССсадасаС дсСдССсССС дсдСаСддас адсСССдСЬС2040
СаааСдСддд сССССдаСдс сЬЬССЬддСЬ ЬССаСдааСЬ дсаЬсаадас ЬссааСссСд2100 аСаадаадСс СсСддСсааа сСсЬддССас СсасСаСссС дСссаГ.ааад СддЬдсСССс2160
Сдгдааадсс ССааддаааС СадЬдадсСс адсададаСд дадаааддса СаСССдсссС2220 сСасададаа ааСаСсСдСс СдСдССсСдс сЬседеааас адссСддасС аСдаСсСсСЬ2280
СдддаСдсСд ссСддССдаЬ даЬддСдсаС саСдссСсСд аСаСдсаСас садасЫссС2340 сСдсСдссаС дддсССасаа дасаадааСд ЬдааддССдс асаддасддЬ аСЫздСддсс2400 адСддССЬаа аСаедсааЬа СсСааСсдас аССсдссааС сСсаСаааад ссаСсСассС2460
СдСаасСдаа дСаасСЬсСс СассаасССС аСЬСССадса СааСадЬЬдЬ аааддссааа2520 сЬасдПаСаа адЬдСссаСа дасСсдаасЬ дССЬСссЬсс адСсассаСС ьСдССССссС2580
СССддСааЬС аЫЫСдССа СаСааССссС ссСаЬссада аСЬддсдсСс асСдСсССда2640 ассаЬасССС дааадаааСд ссЬссЬссЬд дадессдссС СасСдсаСсС даСсассаСд2700
СдсаСассСс СдаЬсаааСЬ сЬддадЬсСС едССсЬсддС: ассСсССааа аадддаааСС2760 дСдСаСсаСд ЬдЬадСдСдс ССЫзаЫССс ааааСсСЬса СадссСЬСаС СсСадссаЬЬ2820
ССЬассЬаса СасСсаЬСсЬ дЬасааааса дсСсасЬсдд ЬсЬсасддсЬ даСссСсадЬ2880 ддаааЬдаСС СааадЬадад сЬдСдСасда аСССсадааС СсаЬдСасЫ: ааааасССса2940 сасСаасасС ССасЬаадаС аЬСдСсСсаЬ аСсССССаСд аддаСдСсад сСдаССССса3000 аСдасСаСаа аСдСаСсЬСа дсСаСсСааа СсССЬЬдааа ССЬддССЬЬа ЬааСССсСдд3060
СсссСаасСС дСдаадасаа ададдсадаа дСасссадСс СассасаССС асасСдСаса3120
ССаЬСаааЬа ааааааСдСа СаСЬЬСаааа аааааааааа ааааааа3167 <210> 89 <211> 3167 <212> ОМА <213> КаССиз псигуедхсиз <400> 89 дааССсаСда даСддаааса СаддСсааад сСдСЬСддад аааСЬддаас СасадССССа 60 СсСадссаса ЬсЪссдадаа дЬсЬдаадаа адсадсаддС дааадСсаСС дСсаадСдае 120 ССЬдСЬсСЬс СдСааддааа ссСсдССсад СааддссдСС сасЬЬсадСд ааасадсадд 180 ассадСааСс ааддс ддс с с ддасаддаса сдСдсдааСС ддасааСдас СсадсСаСас 240 асССасаСса даССасСддд адссСдСсСд ССсаСсаССС сСсаСдССса адддсадааС 300 сСадаСадСа СдсСссаСдд СасСддСаСд аааСсадасд Сддассадаа даадссддаа 360 ааСддадСда сдССадсасс ададдасасс ССассссссс СааааСдсСа ССдсСсадда 420
- 89 015166 сасСдсссад аСадаадаад СсСдаССССс сддассааСС ССсСССдаСд дссаСдаСсд ададдСсдСС сСдааадасс дССсадсдаа ддадаадСаС асСдаадаад дааааСаСас СаСССдаССа сСддасасса сасасадааа ааааасассс аааССсааса сддСасаСдд аСсаСддсСд асаддаддаа СсССаСдаад сдсСддааса саСааСссад дааСсссадд ССсасссдад сСссСсСаса ССддадсССс СаааСдСддд аСаадаадсс СдСдааадсс сСасададаа СдддаСдсСд сСдсСдссаС адСддСССаа СдСаасСдаа сСаСдСаСаа СССддСааСС ассаСасССС СдсаСассСс дСдСаСсаСд СССассСаса ддаааСдаСС сасСаасасС аСдасСаСаа СсссСаасСС ССаССаааСа аСдасдсСаС аСдаСсаддд ааСдсаадда СдСдсаасса дсадсдСссд СсССсСссад асаассдСда СдаССдасса сСаССдссаа ддаСдддСаа сСадеСддСС ссддссссас сСдаССасса дадсссСасС сссасддсас ССаССаадаа дСдасасааа сСссадаадС асаСсСасад СсдСддадда асаСдсдСда дСдаСдааСд саСссадасС аСдСааадаС даадддСдда СсССсасадд адасаСадда сССССдаСдс СсСддСсааа ССааддаааС ааСаСсСдСс ссСддССдаС дддсССасаа аСаСдсааСа дСаасССсСс адСдСссаСа аСССССдССа дааадаааСд СдаСсаааСС СдСадСдСдс СасСсаССсС СааадСадад ССасСаадаС аСдСаСсССа дСдаадасаа ааааааСдСа
СааСаасаса адааассасд ССсассаааа аСаСССдсад аСддсСддсС сСдсССссдС сССддаасад дСсасааадс асадаССсад аСддсдСддС Сададаааса адссдсадас СдадааСддд саадССадсС дсааддсаад аааСддСадС СдаадССдас дсСддасдад ссссддсссд аСаСсааССа ддСсдСдСдС СсССсдадсс сасадсСССд ССдасаааса дССадсаСдд сСдсСаасад сССсадасаС ссссссддсс сСсСддССас СадСдадсСс СдСдССсСдС дасддсдсас дасаадаасд СсСааСсдас Сассаасссс дасссдаасс СаСааССссС ссСсССссСд сСддадСсСС ССССаССССс дСасааааса сСдСдСасда аССдСсСсаС дсСаСсСааа ададдсадаа СаССССаааа
СдсаСаасСа ССаасССсСд дсссадсСас ссСасасСдс дСдсСсаСсС СасаааеаСС даСдаадсаС СсСддСадСд аСддССсддс дааааадСдд даааСсСасс аССаааддса СсСсСсСаСд СаССсСдсСд ссСдсааССд СдсСдСаССд аСасссССда адссСдадСа аСсасССддд ссаСаССаса дСдааасдсС дССССдаадс адааСсаада дССССдадаа асСаддаСдС СааасСССса дсСдССсССС СССаСдаа'СС СсасСаСссС адсададаСд сСсСдСааас сасдсссссд СдааддССдс аССсдссааС аСССССадса дССССссСсс ссСаСссада дадСсСдссС СдССсСсддС ааааСсССса дсСсасСсдд аСССсадааС аСсССССаСд СсССССдааа дСасссадСс аааааааааа аСддссаССд ддСдСаСдаа дсаддасааС ссссСдСсдС сСаСддсСдС асСдСаадад ССаССссадС даСсСддаСС аддССддСаа сСдСсааадС адасддсдсс ссддССссСд асССссСдаа ссСдСддСсС сСсаСсдада сСдассСддд асассадддС аааассаССС адаСддсссд асаСддСдсс СдсддссааС СдаСдСсада адасдсСсдс адааСССада сддсССддСС ддасСсСдса дсдСаСддас дсаСсаадас дСссаСааад дадаааддса адссСддасС аСасдсаСас асаддасддС сСсаСаааад СааСадССдС адСсассаСС аССддсдсСс СасСдсаСсС ассСсССааа СадссСССаС СсСсасддсС СсаСдСаССС аддаСдСсад СССддССССа СассасаССС ааааааа сСССдссаСС дСаСдааддс адаасдссдс СаСаддссса сСдСаССдСс СаСсСсаадс аддадааСса ассСССаССд аддссддСаС аССССССасс ааСдсдСсаС дасСсадсСд аСдСдссасс дСдссассСс сссдаададс ссСадсСдСС дддсассадд ссадсссСас СсдсСдСаСС СадСдассса сдСсСсСаас аСдсСдддсс ааадасддсс сСдсаадааа СссадасСсС дааСдсаддд адсСССдССС СссааСссСд сддсдссссс СаСССдсссС аСдаСсСсСС садасССссС аСССдСддсс ссаСсСассС аааддссааа ССдССССссС асСдСсССда даСсассаСд аадддаааСС СсСадссаСС даСссСсадС ааааасССса сСдаССССса СааСССсСдд асасСдСаса
480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3167 <210> 90 <211> 3003 <212> ΟΝΑ <213> ЕаССиз пог^/едхсиз <400> 90 .
сдССсадСаа ддссдСССас ССсадСдааа садсаддасс адсаассаад дСддсссдда 60 саддасасдС дсдааССдда сааСдасСса дсСаСасасС СасаСсадаС СасСдддадс 120 сСдСсСдССс аСсаСССсСс аСдССсаадд дсадааСсСа даСадСаСдс СссаСддСас 180
СддСаСдааа СсадасдСдд ассадаадаа дссддааааС ддадСдасдС Садсассада 240 ддасассССа ссСССссСаа ааСдсСаССд сСсаддасас СдсссадаСд асдсСаССаа 300
- 90 015166 каасасакдс аассасдкка ассаааадсс кккдсадсск дскддскдкд сккскдккас ддаасаддак асааадскск дакксадакд дсдкддкдаа адааасадаа кдсадасакк даакдддкск дккадсСкак аддсаадсск кддкадккде адккдасака ддасдададс кддкккдакс ксааккасса едкдкдкдкд ксдадссдкк адекккдада асааасадкк адсакддаск скаасадкаа садасакдск кккддккккк кддккаскса кдадсксадс дккскдкскс ддкдсаксак аадаакдкда ааксдасакк сааскккакк ксдааскдкк ааккссксск скксскддад дадкекккдк какккксааа саааасадск кдкасдаакк дксксакакс акскааакск ддсадаадка ккк акааскаакд асккскдддк садскасдса асаскдсссс сксакскска ааасаккаск даадсаккка ддкадкддак дкксддсадд ааадкддскд акскассада аааддсассд скскакдаск кскдскдсск дсааккдскс кдкаккдекд сссккдааса скдадкаааа акккдддада каккасааса ааасдсккдс ккдаадскда аксаадаада ккдадааада аддакдкедд асккксадда дккекккдед акдааккдеа скаксскдкс ададакддад кдкааасадс дсскскдака аддккдсаса сдссаакскс кккадсакаа кксскссадк акссадаакк кскдссккас ксксддкасс акекксакад сасксддкск ксадааккса ккккакдадд кккдаааккк сссадкскас дссаккдскк дкакдаадка ддасаакада скдкедккак кддскдкскд дкаададкак ккссадкадд скддаккасс ккддкааадд ксааадкакк еддкдккаак дкксскддас ксскдааакд дкддкекдкд аксдадасск асскдддсск ссадддкддд ассаккксса кддсссдксд кддкдсскад ддссааксдк кдкеадаакд сдсксдсааа акккадаскд сккддккксс скскдсадаа какддасадс ксаадасксс сакааадкдд аааддсакак скддаскакд кдсакассад ддаеддкакк акаааадсса кадккдкааа сассаккккд ддсдсксаск кдсакскдак кеккааааад сскккаккск сасддскдак кдкакккааа акдксадскд ддккккакаа сасакккаса кдссаккака кдааддскск акдккдкедд аддсссаккс каккдксдсс сксаадсада адааксаскд кккаккддкк ссддкакдда ккккассаск дедкеакдаа ксадскдкак кдссассскд ссасскссас даададсааа адскдккааа сассаддсдд дссскасакс скдкаккаса кдасссакск скскаассдс скдддсссак дакддккдаа саадаааккс адаскскскс кдеадддккд кккдккккаа ааксскдака кдскккскдк ккдссскска акскскккдд аскксскскд кдкддссадк кскассккдк ддссаааска кккксскккк дксккдаасс сассакдкдс ддаааккдкд адссаккккк ссксадкдда ааскксасас акккксаакд кккскддксс скдкасакка даадаадакд дакккксаак ассаакккдк кккдакддса акдакедкек ддксдккаса ааадгшскда садсдааска даадкакдда даадаадска аакакаеккд ккдаккаскд дасассадад асадаааккк аасаксскка кксаасадкд касакддскс акддскдаса ддаддааксд какдаадаса кддаасадкд ааксеадсак ксссаддакд асссдаддаа скскасакск дадскксада акдкдддекк адаадкскск дааадсскка сададаааак дакдскдсск скдссакддд ддкккааака ааскдаадка кдкакааадк ддкааккакк акаекккдаа акасскскда каксакдкдк асскасакас аакдакккаа каасаеккка аскакааакд скаасккдкд ккааакаааа аксадддада 360 дсааддаккс 420 дсаассаака 480 дедкеедакд 540 кскссадскд 600 ассдкдаскк 660 ккдассадкс 720 ккдссаааса 780 кдддкааакд 840 дскддкккад 900 дккккакадс 960 аккассакда 1020 ссскасксаа 1080 акддсасдса 1140 ккаадааааа 1200 асасааакда 1260 садаадкдск 1320 кскасадскк 1380 кддаддаака 1440 кдедкдаддк 1500 акдаакдкек 1560 ссадасксас 1620 кааадакккд 1680 дддкддадкк 1740 ксасаддскд 1800 сакаддаекк 1860 ккдакдеекк 1920 ддксаааскс 1980 аддаааккад 2040 акскдкскдк 2100 ддккдакдак 2160 сккасаад.ас 2220 кдсаакакск 2280 асккскскас 2340 дкссакадас 2400 кккдккакак 2460 адааакдсск 2520 ксаааккскд 2580 адкдкдеккк 2640 ксаккскдка 2700 адкададскд 2760 скаадакакк 2820 каксккадск 2880 аадасааада 2940 ааакдкакак 3000 3003 <210> 91 <211> 2063 <212> ϋΝΑ <213> Ното зарЬепз <400> 91 дааккссддк дакдакдакд дкдакддкда кдакддкдак даддакдакд дкдакдакда 60 кдакддкдкк ддкдакддкк кккдеакекк ссакксакда аскаадкаск еккаккадкд 120 аакккекккк скккдссскс скдакксккд дскддсссад ддакдаекке сксдскдсад 180 сддссскддс дддкдссскд дскассакдд ассаксскдс кддксадсас кдсддскдск 240 ксдсадаакс аадаасддск акдкдедккк ааадакссдк аксадсаада ссккдддака 300
- 91 015166 ддСдададСа СаСддссссс сасаССддад СсааССсада СССасСдада сдадаСдада дссССаСдсС аасаСдаСдд дадсСдаССд дССдсСдСаа СасададСдс дСсасСдсад ССаСдсаадС СсСдССасСа ссСдсааССС СдСдССаССа ддддаддаад дСдсСадаад СаСдсСсССд дааСссдСас .даддаСаСдс ааадааааСа даСдсададд аСССдддааа аасдааедСа асдСдСдааа СдааСсдсСд садсасСдсС аддааСдаас СССааасаСд дааСсСсСса дддадаааСс аСссссаада аСддаасаСа аССССссасс сааСааСсаС ССддаСасад аддсадсадс дссдаддСсд аадСдССССс сСССдаСддааСддасдсаС аСССаадСсС даддасСддс сссаСсдада дСдасСССдд аСааСдсадс дадсСдСдаа дасСааСсСа сададСасса аддССсСсдС дссСддсадс сСсддсССас дааасаааСс ддСдадСсаа асСсссСаСС дасСдСдаад дСССассССд СдСсСдСдаа садаадаСдС
СдааааСддд ааааддддас дСдСсасСаС ссдСССсСдс СссСдасаса СдсСССддса аасдссдаса аСссдаассс аСаСддадса сСССдсааас асаСдасаас ддааСаСССд ссасасаадС ССаСсССсас СССааасадс ассдСссаСд саСаадсдад сССдадддас ССдддадаСа дасддсСССС дСсСадддаа даддСсасСс СдсасадСдС Сдсдадссса сасаадаСдд сСсССаадсд СсаасааСаа садааддадд аСдССССсаа ССа асааСаССаС аСаааСсССд даадааСдСд СдССдСадса асассасСса СсадСсСсСд ддадассдСа СсСсССдаСс дСаСаСааад сдСсадааСС аССдсссдсС с С ед С да Сдд дасСдддСаа асадааССас адааасдСсс аддсСдасСд дССддсасСа СдСдааХсад сссасдадас садасададд ааасададас ааддадасаа дсСдаддааа асадСсааСс саааСсадда дСддсдсссс Сддсадсаас сасСдсСаса дссСаСддад дсСсдааадд Саааасаадд СадСаасСас садаСССаСд дСссассСса СаССадсСдС аасааддСсС СадаСааСсС дсСссССдда ССаСсаасда ССаСадсСдд адСасСаСсс дсСсССдссд сасдаддада СадСдааааа даааСадасС СсадаеаСаС сСССдаааса деасадассС Ссддааасса ссаадССссс СсдаадасСд ддаСддссда сааСдессас СсаддСдааа СссассСддд адддсадССс ассаСддСдр СдаааССаСС
СадсассСдс 360 асдссддссс 420 сасСссСссс 480 СааСдСсаас 540 ССсаСССаас 600 СССдаСадСС 660 СсасадСаСд 720 дааасСдССд 780 СдадсдСсса 840 ааадаасаСС 900 адасдадада 960 сааСддаСсС 1020 СсССдсСсаС 1080 СсаССаСааа 1140 СдаСддаасс 1200 ддСдсдссса 1260 ддсассадаа 1320 адСадасаСд 1380 сССсссаддд 1440 СсссасСССС 1500 адаадссСдд 1560 ССдддассад 1620 асссасдасд 1680 СдсСаСдсад 1740 адаСсаадаа 1800 СсаСсСссас 1860 аССссаааСс 1920 сСааадаСаС 1980 ССССдсаСса 2040 2063 <210> 92 <211> 1964 <212> ΠΝΑ <213> Ното зархепз <400> 92 аСССсССССс ддсссСддсд сдсадааСса дсдададсад аСддссСССд асаССддада сааССсадаа ССасСдадаа дадаСдадас ссССаСдсСС асаСдаСдда адссдаССдд ССдсСдСааа асададСдсс СсасСдсада СаСдсаадСа сСдССасСад сСдсааСССс дСдССаССад ЭЗдаддаада СдсСадаадд
СССдсссСсс ддСдсссСдд адаасддсСа аассссссас ддадааасса Сссссаадад СддаасаСас ССССссассС ааСааСсаСС СддаСасада ддсадсадса ссдаддСсда адСдССССсс СССдаСддаа ЬддасдсаСд СССаадСсСс аддасСддсс ссаСсдадаС СдасСССдда СааСдсадсс адсСдСдаас
СдаССсССдд сСассаСдда СдСдсдСССа дааааСддда аааддддаса СдСсасСаСд сдСССсСдсС ссСдасасаа дсСССддсас аСдССдасад СссдаасссС СаСддадсад СССдсааасс саСдасааса дааСаСССдс сасасаадСд СаСсССсаса ССааасадса сСдСссаСда аСаадсдадд ССдадддасС сСддсссадд ссаСсссдсС аадаСссдСа сааСаССаСд СаааСсССдС аадааСдСдС дССдСадсас сассасСсад садСсСсСдС дадассдСаа сСсССдаСсС СаСаСааадд дСсадааССС ССдсссдсСС ССдСдаСдда асСдддСаад садааССасс даааСдСссС ддсСдасСдд. ССддсасСаС дСдааСсадс даСдасССсс ддСсадсасС Ссадсаадас сСсдаааддС аааасаадда адСаасСасс адаСССаСдС СссассСсаС аССадсСдСС асааддСсСС адаСааСсСд сСссССддаС Сассаасдаа СаСадССдда дСасСаСссс сСсССдссдС асдаддадас адСдаааааС ааасадассд садаСаСаСд СССдааасаа
СсдсСдсадс 60 дсддсСдссс 120 сССдддаСад 180 адсассСдсС 240 СдССддСсСс 300 асСссСсссС 360 ааСдСсаасС 420 СсаСССаасс 480 ССдаСадССд 540 сасадСаСда 600 ааасСдССдд 660 дадсдСссад 720 аадаасаССС 780 даСдададад 840 ааСддаСсСС 900 сССдсСсаСС 960 саССаСааас 1020 даСддаассС 1080 дСдсдсссад 1140 дсассадаад 1200 дСадасаСдС 1260
- 92 015166 аСдсСсССдд ааСссдСасс аддаСаедса аадааааСад аСдсададдс СССдддааад аСдаасдСад сдСдСдаааа дааСсдсСдд адсасСдсСд ддааСдаасС ССааасаСдс асСааСсСаС ададСассад ддССсСсдСд ссСддсадСд СсддсССасС ааасаааСсС дСдадСсаас сСссссаССс асСдСдаадС СССассССдс дСсСдСдааа адаадаСдСС
СдддадаСаС аСддсССССс СсСадддааа аддСсасСса дсасадСдсд дСдадсссаа асаадаСддс СсССаадсдд саасааСааС адааддаддс СдССССсаад СаааааСааа
ССаСдадаСд адасададдс аасададасс аддадасааС сСдаддааад садСсааСсс аааСсаддаС СддсдссссС ддсадСааса асСдсСасаа ссСаСддадС ааааааасСд
СасадассСс Сддаг<ассаС саадССссса сдаадасСдС даСддсСдаа ааСдСсСасС саддСдаааа ссассСдддС дддсг<дССса ссаСддСдСс даааССаССС СССР
ССсссадддд 1320 сссасССССд 1380 даадссСдда 1440
Сдддассадд 1500 сССаСдаСда 1560 дсСаСдсада 1620 даСсаадааа 1680 саСсСссасС 1740
ССссаааСсс 1800
СааадаСаСа 1860
СССдсаСсаС 1920 1964 <210> 93 <211> 3611 <212> ΏΝΑ <213> Ното зархепз <400> 93 сдссссссда ссСддаСаСС ддсСсссСдс ддсдааддаа ааадсСсСдс дддсаддаСс ССсссаСаСС сСдсадсддс дсСдсССсдс дддаСаддСд ассСдсСаСд СддСсСсаса ссСсссСсаа дСсаасСССа СССаассдад аСадССдссС адСаСдааса сСдССддадс сдСссадССд аасаСССаса дадададСса ддаСсСССаС дсСсаССсСд СаСааассСд ддаассСдСд сдсссадддд ссадаадСдс дасаСдСаСд ссаддддааС асССССдадд дссСддааад дассаддаСд аСдаСдаССС аСдсадааСд даССаССсСС ааСаСССссС ааССсааССа дСсассадсс ддсаСдасСа ссссддаСсд сссссдасас СССссссаса сссссссадс адсСаддСсс адСссасддд СсССССсССС ссСддсдддС адаассаада ададСадааС дссСССддда ССддадаСсс ССсадааСдд сСдадааССС аСдадасааС СаСдсСССдд СдаСддаддс СдаССддссд сСдСаааадС дадСдссССС сСдсадаСдд дсаадСаССС ССассададд сааСССссса ССаССадСда аддаадасаа Садааддадс сСсССддасС ссдСассада аСаСдсаддС ааааСадссС сададдсСсд дддааадааа аасдсаассС ссСссСсаСа сСдадсаССс асСаСдаасд СсСссассаа сСаСаСсСда ааСссссдсс сдСдааасСа дасаСдссСС сдсдадддад СсСсаСсадс ададаадасд дсссСссСда дсссСддсСа асддсСаСдС сСсСсаСдаа даааСсаааа ссаададСдС аасаСассдС СссассСссС ааСсаССдсС аСасадааСд адсадсаСсс аддСсдаСаС дССССссССС даСддаасаС асдсаСддаа аадСсСссас асСддсССас СсдадаСССа сСССддасСд СдсадссаСа СдСдаассСд ааСсСаССдд дСассадаСд СсСсдСдСсС ддсадСдадд дсССасСдса саааСсСдСд дСсасаСааС саССдаадас СаСдСссадс асадсаадса сасаасаасс даСдссаСас сСссдсассс сдадддаааС ссдСССддад адаааСдаад саСССдСссС адссСсссдд ССсССддсСд ссаСддасса дсдСССааад аасдддасаа ддддасаСаа сасСаСдаад ССсСдсСдСС дасасаасас ССддсаСсад С Сдасаддад даасссСсСс ддадсадСаС дсааассдСс дасаасаССд СаСССдсССд асаадСдасС сССсасасад аасадсадаа СссаСдаддс адсдаддССд адддасСдСд дадаСаСССа дсССССсада адддааааас СсасСсаадд садСдСдсСд адсссаасад аддсдСдСдс СсСаСссаСс асассСССда саадсСсдаа асааасасса ссадаСдааа сддаСаСдСС ааСССддддд ддссдсддса ддааСССссд сссааасСдС сСдСССсСсс дсссадддаС СссСдссддс асссдсасса СаССаСдсСс аСсССдСааа ааСдСдСадС дСадсасада сасСсадСсс СсСсСдСаСС ассдСаааса ССдассСада аСаааддсСс адааССССаС сссдсСССаС СдаСддадСа дддСаадсСс ааССассасд аСдСссСадС СдасСддааа дсасСаСсад ааСсадсССС СдадаСдСас сададдССдд ададасссаа адасааСсда аддаааддаС СсааСссааС саааааССдд аСасСдасад сСаСадддда Сссссадссс саддасСсас саааСсСдса
ССсСсссада аСССсССсСС ссссдСссда садсддсаСд аССдСдаСас дссддСсСас дасССссСсд садсасСдсд дсаадассСС даааддСадс асааддасдс аасСассасС СССаСдСааС ассСсаССса адсСдССССд аддСсССсас СааСсСдааа сССддаСдад саасдаааад адССддадас сСаСсссааС ССдссдСсСС аддадаСсаС даааааСдаС СадасСддСд аСаСаСддса дааасаадСа адассСсССс ааассаСссс дССсссадаа адасСдССдд ддсСдаасСС дСсСасСдсС СссССаСсса саСсдСдаад аааааассда СдааасаадС дссаадСасС СассасаааС
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340
- 93 015166 дЬСдсасадС ассаасаадс сЬсаСддадс адсЬЬдсЬЫ: садасЬдсаа сСссссаадс Ьсаасаааад дааасЬддад ассаедааЬд ЬаЬдссааСд даааЬдЬЬдс даЬдадсабд даЬсдСсСЬд аасаасадса дсадаЬссед дссасаааЬд ЬсаддаЬсад сдссссЬсса адСаасаддд дсЬасаасса аЬддадЬдаа аааасСдсСЬ сааЬЬдддсс Садасссааа асЬсСсЬЬаа асссасЬсаЬ аьддссаадс адсадаассС адссссддсЬ ССдссаадаЬ дСдСддсадд ддасадЬасЬ адааСсадЬЬ адссЬЬЬасС Ьддасаддад аСссаЬдЬЬс ддссаЬсааа СссЬддаЬдд дСдаааадае ссЬдддЬсаС садСЬсаССс ЬддЪдСсЬаа аеЬаСССЬЫ: Ь аассссьдьс адаадЬЬдаЬ асадЬЬсадС аааасЬЬдса аЬдсСЬдаЬЬ Ьсссаадада ааааСЬЬддс дааЬасааСс Ьадааассас аЬсЬддссаа ЬаЬЬддЬдад дадасдадад ддаасддсса адаасаадае дсссадаада садсадЬаЬа саадааасдЬ сЬссасЬдаа саааЬссаде адаСаСадда дсаЬсаЪСЬа
ЬдсСЬасадс аадаассСса ддсссадасс дЬадаадсаа ссСдаЬдССс ссСасЬадЬС адсаадсаса ааЬдсадсад адьдьсаась асаассааса дасасссддс саасаадсЬд сСадааддьд дЬЬсЬЬдсас дсасададдс садаЬаддЬд дЬдаааасЬс СсдсЬддасС асЬдсЬдЬСЬ аЬдаасЬдЬс аасаСдсада
Сдасадаада аддаггадсЬс сасЬдадсад сЬддасадса сдсссасеса ЬдссССЬдаа ааСсааасЫ: аассСсаЬдЪ сссаЬдсЬдс ЬадЬдасаса ЬдааЬаСЬаа дссабдаЬда дссдаасЬаа адддедьесс сЬааЕЬсЬсЬ адЬсг1асаса ссСаСЬсЬсС дСдаггдЬсаа ассЬЬдсада ЬдЬдаааЬдЬ адаЬдЬЬЬаа адасЬЬддаа ЬдаСдадааЬ ЬасЬадЬЬсЬ ддасЬСсаса даСсЬаЬссЬ сассаааааЬ дааасаадСс ддСдасадес сасаасссаа Ьадддсссаа ЬСссадЬссЬ аддЬдССсСд СЬссааСаас аадсасадса ддаСсЬЬСса адаЬддсааа Ьаадсд.дЬдд сааЬааСддс аддаддсасС ЬЬЬсаадссЬ аааЬаааааа
2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3611 <210> 94 <211> 3871 <212> ΏΝΑ <213> Ното зархепз <400> 94 ддсссссдса сЬасдаддда сССссдССЬд дададаааЬд адссаСЬЬдЬ асдадссЬсс ьдаеьсььдд сЬассаЬдда СдСдсдЬСЬа дааааЬддда аааддддаса ЬдЬсасЬаЬд сдЬЬЬсСдсС ссЬдасасаа дссеьддсаь аедеьдасад ЬссдаасссС ЬаЬддадсад ЬЬЬдсааасс саСдасааса дааеаЬЬЬдс сасасаадЬд ЬаЬсЬЬсаса ЬСааасадса ссдессаЬда аСаадсдадд ЬЬдадддасЬ С.дддадаЬа1: аЬддсЬЫЮс ссссддасаи ааСааСЬЬдд дадддссдсд аадддааЬЬЬ ссЬЬЬсааас сддсЬдЬЬЬс сЬддсссадд ссаЬссСдсЬ аадаЬссдЬа сааСаЬЬаЬд ЬаааЬсЬСдС аадааЬдЬдЬ дЬСдЬадсас сассасЬсад садСсЬсЬдЬ дадассдЬаа сЬсССдаСсЬ ЬаСаСааадд дЬсадааСЬЬ ССдсссдсЬГ: ЬЬдЬдаЬдда асЬдддСаад садааЬЬасс даааЬдЬссЬ ддсЬдасСдд ЬЬддсасЬаЬ дЬдааЬсадс СЬаСдадаЬд адасададдЬ дссссссссс дддаСБСсСС дсассссдЬс сЬдсадсддс ЬдЬаЬЬдЬда ЬссдссддЬс даЬдасЬЬсс ддСсадсасС Ьсадсаадас сЬсдаааддЬ аааасаадда адЬаасСасс адаЬЬЬаСдС Сссассьсаь аЬЬадсЬдЬЬ асааддЬсЫ: адаьааСсСд сЬссЬЬддаЬ ЬаЬсаасдаа Ьаьадссдда дСасСаЬссс сСсСЬдссдЬ асдаддадаЬ адЬдаааааЬ аааСадасЬд садаЬаСаЬд СЬЬдааасаа Ьасадассес ЬддааассаС адасссддаЬ сЬЬддсЬссс сдаддсдаад аЬдааадсЬс Ьасдддсадд СасЬСсссаЬ ЬсдсЬдсадс дсддсЬдсЬЬ сЬСдддаСад адсассЬдсЬ ЬдЬЬддЬсЬс асСссСсссЬ ааСдСсаасЬ СсаСЬЬаасс ЬСдаСадьед сасадЬаЬда ааасСдСЬдд дадсдессад аадаасаЬЬЬ дасдададад ааеддаСсЫ: сЬЬдсЬсаСЬ саЬЬаЬааас даСддаассЬ дСдсдсссад дсассадаад дСадасаЬдЬ ССсссадддд сссасЬЬЬЬд асссссссда ЬдсЬЬЬсссс даассссссс СдсадсСадд аЬсадСссас аССЬсЬЬЬЬс ддсссСддсд сдсадааЬса дСдададЬад аеддссЬЬСд асаЬЬддада сааЫсадаа ЬСасЬдадаа дадаСдадас ссССаЬдсЫ: асаЬдаЬдда адсСдаЬЬдд ЬЬдсЬдСааа асададЕдсс СсасСдсада СаЬдсаадЬа сЬдЬЬасЬад сЬдсааЬСЬс дСдЬЬаЬЬад дддаддаада СдсЬадаадд аСдсЬсССдд ааСссдСасс аддакаЬдса
Сассдсдааа асадасаСас аЬссдсдадд СссЬсЬсаЬс дддададаад ЫгЬдсссЬсс ддЬдсссЬдд адаасддсЬа ааСсСсЬсаС ддадаааЬса Ьссссаадад СддаасаЬас ЬЫзЬссассЬ аасааьсаьс ЬддаСасада ддсадсадса ссдаддСсда адСдЬЬЬЬсс ЬЫздаЬддаа СддасдсаЬд ЬЫгаадСсСс аддасЬддсЬ ссаЬсдадаЬ ЬдасЬЬЬдда ЬааЬдсадсс адсСдСдаас асЬааСсЬаЬ ададЬассад ддСЬсЬсдЬд
120
180 240 300 360 420 480 540 600 660.
720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740
- 94 015166
РсРадддааа аддРсасРса дсасадрдЬд дрдадсссаа ааРаддсдРд дасРсРаРсс адсасассРР дсасаадсРс ассасаааса РасссадаРд дРсРдсРРас даРаадаасс адрддсссад дсадрадаад аРРссРдаРд адассРасРа ддсадсаадс аРсааРдсад сасадРдРРа сааасаасса даддасассс дадсаасаад ссасРадаад даРдРРсРРд ададсасада аРасадаРад сдрдрдаааа дааРсдсРдд адсасРдсРд ддаардааср РРааасаРдс дрддаддард дарррдрддр ссдаРссРаР адддсаддсР аРададаРда аасададасс аддадасаар срдаддааад садРсааРсс РдссаааааР аРсаРасРда рдасРаРадд дааРссссад ссасаддаср ааасаааРсР адсРдасада Рсааддааад асссасРдад саасРддаса РРсРдссРас дРРРдссРРР асааарсааа садаассРса асрсссардс асарадрдас ддсРдааРаР сРддссаРда дрддссдаас сасадддрдр ддссРааРРс дрдадрсаас сРсссРаРРс асрдрдаадр РРРассРРдс дрсрдрдааа адаадаРдРР дддсРсадаа адддаадсад сссассРсРР даддсаасда РдРааРРРсР саадРРссса сдаадасрдр дарддсрдаа ааРдРсРасР РддРссРРаР садсарсдрд ддааааааас сссРдаааса сасдссаадр дсаРассаса адаадасРРд сРсРдаРдад садРасРадР дсаддасРРс РсадаРсраР даасассааа сРРдааасаа рдрддрдаса Рдссасаасс асаРадддсс РааРРссадР рдааддрдрр РааРРссааР Рссаадсаса РсРддаРсРР асаадарддс РсРРаадсдд саасааРааР адааддаддс рдррррсаад Рассдддсдд РдсадассРд РаРдддРдса садддрдадс дрдддаддрр РРссддааРР даадссРдда Рдддассадд сРРаРдаРда дсРаРдсада ссадаРРаРР аадааРаРРР сдаааррсаа адрдрсасса асРддсаРда аардррдсас дааассааса ааРсРсаРдд РсРадсРРдс асасадасРд ссРсРсссса ааРРсаасаа дРсдааасРд дрсассарда сааРаРдсса саадааардр ссРдаРдадс сРддаРсдРс аасаасааса дсадсадаРс Рсадссасаа аааРсаддаР рддсдсссср ддсадРааса асРдсРасаа ссРаРддадР ддрдасадда ддсРддссдс дРссссРссР садссрсасс сааасаадад с аадааааРад аРдсададдс РРРдддааад аРдаасдсаа сРРссРссРс ссрсрдадса РРаасРаРда дссРсРссас сРасРаРаРс адрсааррдд адсрадассс адсасРсРсР рррасссаср саааРддсса адсадсадаа аададссссд дадррдссаа аРддРдРддс аРаддасадР РдсадааРса аРдадссРРР ррдрддасад дсааРссаРд сРдддссаРс аРдРссРдда саддрдаааа ссассРдддР дддсадРРса ссарддрдрс даааРРаРРР дададсдрса аРддссрсРс аддссРсссР РсРРссРадР РдддсРддад ссРддсадРд 1800 РсддсРРасР 1860 ааасаааРсР 1920 ссрдрсасар 1980 аРасаРРдаа 2040 РРсраРдРсс 2100 асдасадсаа 2160 саасасааса 2220 РдадаРдсса 2280 дссаасссср 2340 аааадаадРР 2400 РааасадРРс 2460 саРаааасРР 2520 адсардрррд 2580 ссРРсссаад 2640 дсРааааРРР 2700 даРдааРаса 2760 аддРадааас 2820 асрарсрддс 2880 дРРРаРРддР 2940 асРдадасда 3000 дадддаасдд 3060 РРсадаасаа 3120 ааадсссада 3180 рддсадсадр 3240 даРсаадааа 3300 сарсрссаср 3360 РРссаааРсс 3420 РааадаРаРа 3480 РРРдсаРсаР 3540 дсддсаадсР 3600 ссрдадссср 3660 сРддддРссс 3720 ссрдадддрд 3780 ссаадддааа 3840 3871 <210> 95 <211> 88 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 95
Суз Агд С1и Ьеи Н13 РЬе ТЬг Агд Туг Уа1 ТЬг Азр С1у Рго Суз Агд
1 5 10 15
Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТЬг <31и Ьеи Уа1 Суз Зег О1у С1п Суз С1у Рго
20 25 30
А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не <31у Агд С1у Ьуз Тгр Тгр Агд Рго
35 40 45
Зег <31у Рго Азр РЬе Агд Суз Не Рго Азр Агд Туг Агд А1а С1п Агд
50 55 60
Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Рго С1у С1у С1и А1а Рго Агд А1а Агд Ьуз Уа1
65 70 75 80
Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз
85
<210> 96
- 95 015166 <211> 82 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 96
Суз Агд Рго Не Азп А1а ТЬг Ьеи А1а УаХ <31и Ьуз СХи СХу Суз Рго
1 5 10 15
Уа1 Суз Не ТЬг Уа1 Азп ТЫ ТЬг 11е Суз А1а С1у Туг Суз Рго ТЬг
20 25 30
МеС ТЬг Агд Уа1 Ьеи С1п СХу УаХ Ьеи Рго А1а Ьеи Рго СХп УаХ УаХ
35 40 45
Суз Азп Туг Агд Азр Уа1 Агд РЬе СХи Зег Х1е Агд Ьеи Рго СХу Суз
50 55 60
Рго Агд С1у Уа1 Азп Рго Уа1 УаХ Зег Туг А1а УаХ А1а Ьеи Зег Суз
65 70 75 80
С1п Суз
<210> 97 <211> 82 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 97
Суз СХи Ьеи ТЫ Азп Не ТЬг 1Хе АХа 1Хе С1и Ьуз СХи СХи Суз Агд
1 5 10 15
РЬе Суз 1Хе Зег 1Хе Азп ТЬг ТЬг Тгр Суз А1а СХу Туг Суз Туг ТЬг
20 25 30
Агд Азр Ьеи УаХ Туг Ьуз Азр Рго АХа Агд Рго Ьуз Не СХп Ьуз ТЬг
35 40 45
Суз ТЬг РЬе Ьуз СХи Ьеи УаХ Туг СХи ТЬг УаХ Агд Уа1 Рго СХу Суз
50 55 60
АХа Н1з Η13 АХа Азр Зег Ьеи Туг ТЬг Туг Рго Уа1 АХа ТЬг СХп Суз
65 70 75 80
ΗΪ3 Суз
<210> 98
<211> 84
<212> РКТ
<213> Ното зархепз
<400> 98
Суз Не Рго ТЬг СХи Туг ТЬг Мер Н13 Не СХи Агд Агд СХи Суз А1а
1 5 10 15
Туг Суз Ьеи ТЬг Не Азп ТЬг ТЬг Не Суз АХа СХу Туг Суз МеС ТЬг
20 25 30
Агд Азр Не Азп СХу Ьуз Ьеи РЬе Ьеи Рго Ьуз Туг АХа Ьеи Зег СХп
35 40 4 5
Азр Уа1 Суз ТЬг Туг Агд Азр РЬе Не Туг Агд ты УаХ СХи Не Рго
50 55 60
СХу Суз Рго Ьеи ΗΪ3 УаХ А1а Рго Туг РЬе Зег Туг Рго УаХ А1а Ьеи
65 70 75 80
Зег Суз Ьуз Суз
- 96 015166 <210> 99 <211> 83 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 99
Суз Азп Азр 11е Ткг А1а Агд Ьеи
1 5
Ьуз Зег С1и Уа1 (31и Уа1 Азр 11е
20
Зег Ьуз А1а Мек Туг Зег 11е Азр
35 40
Зег Суз Суз Зег Рго Ткг Агд Ткг
50 55
Суз Ткг Азп С1у Зег Уа1 Уа1 Туг
65 70
Суз Ьуз Суз
С1п Туг 10 уа! Ьуз Уа1 <31у Зег 15 Суз
Н13 25 Туг Суз С1п <31у Ьуз 30 Суз А1а
11е Азп Азр Уа1 О1п 45 Азр <31 п Суз
<31 и Рго Мек <31 п 60 Уа1 А1а Ьеи ΗΪ3
ΗΪ3 О1и Уа1 75 Ьеи Азп А1а Мек 01и 80
<210> 100 <211> 80 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 100
Суз Зег Ткг Уа1 Рго Уа1 Ткг Ткг <31и Уа1 Зег Туг А1а <31у Суз Ткг
1 5 10 15
х»уЭ тЬ 1 Т Мл!· Ά пл Г!-1л ГЧ »<-1 С’л·^ Л. т Г»Л я » пи л ТГ-. Ί
хнх ν аи. хд их 1’1с и ПО АХ XXX О ьЭСА чдху О ΌΧ у X 1АХ £ 1ХС V САХ
20 25 30
Мек Туг Зег А1а Ьуз А1а С1п А1а Ьеи Азр Нхз Зег Суз Зег Суз Суз
35 40 4 5
Ьуз <31и <31и Ьуз Ткг Зег С1п Агд С1и Уа1 Уа1 Ьеи Зег Суз Рго Азп
50 55 60
<31у 31у Зег Ьеи Ткг Н13 Ткг Туг ТЬг ΗΪ8 Не <31 и Зег Суз <31 п Суз
70 75 80 <210> 101 <211> 80 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 101
Суз Агд Ткг Уа1 Рго Рке Зег С1п Ткг Не Ткг НХЗ <31и С1у Суз С1и
1 5 10 15
Ьуз Уа1 Уа1 Уа1 <31п Азп Азп Ьеи Суз Рке (31у Ьуз Суз <31у Зег Уа1
20 25 30
Нхз Рке Рго <31у А1а А1а <31п Нхз Зег Нхз Ткг Зег Суз Зег Нхз Суз
35 40 4 5
Ьеи Рго А1а Ьуз Рке Ткг Ткг Мек Нхз Ьеи Рго Ьеи Азп Суз Ткг С1и
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 11е Ьуз Уа1 Уа1 Мек Ьеи Уа1 (31и <3.1и Суз <31п Суз
65 70 75 80
<210> 102
- 97 015166 <211> 85 <212> РКТ <213 > Ното зархепз <400> 102
Суз Ьуз ТНг С1п Рго Ьеи Ьуз С1п ТНг 11е Нхз С1и О1и С1у Суз Азп
1 5 10 15
Зег Агд ТНг 11е 11е Азп Агд РНе Суз Туг О1у О1п Суз Азп Зег РНе
20 25 30
Туг 11е Рго Агд ΗΪ3 11е Агд Ьуз С1и 01и О1у Зег РНе αΐη Зег Суз
35 40 45
Зег РЬе Суз Ьуз Рго Ьуз Ьуз РНе ТНг ТНг Мес МеС Уа1 ТНг Ьеи Азп
50 55 60
Суз Рго 01 и Ьеи σΐη Рго Рго ТНг Ьуз Ьуз Ьуз Агд Уа1 ТНг Агд Уа1
65 70 75 80
Ьуз С1п Суз Агд Суз
85
<210> 103 <211> 86 <212> РКТ <213> Ното ! зархепз
<400> 103
Суз С1и А1а Ьуз Азп Не ТНг С1п Не Уа1 С1у Нхз Зег (31у Суз (31и
1 5 10 15
А1а Ьуз Зег 11е σΐη Азп Агд А1а Суз Ьеи С1у С1п Суз РНе Зег Туг
20 25 30
Зег Уа1 Рго Азп ТНг РНе Рго О1п Зег ТНг (31 и Зег Ьеи Уа1 Нхз Суз
35 40 45
Азр Зег Суз МеС Рго А1а σΐη Зег МеС Тгр <31и Не Уа1 ТНг Ьеи С1и
50 55 60
Суз Рго <31у Нхз С1и О1и Уа1 Рго Агд Уа1 Азр Ьуз Ьеи Уа1 О1и Ьуз
65 70 75 80
Не Ьеи ΗΪ3 Суз Зег Суз
85
<210> 104
<211> 70
<212> РКТ
<213> Ното I зархез
<400> 104
Суз Не Агд ТНг Рго Ьуз Не Зег Ьуз Рго Не Ьуз РНе О1и Ьеи Зег
1 5 10 15
(31у Суз ТНг Зег МеС Ьуз ТНг Туг Агд А1а Ьуз РНе Суз С1у Уа1 Суз
20 25 30
ТНг Азр (31у Агд Суз Суз ТНг Рго Нхз Агд ТНг ТНг ТНг Ьеи Рго Уа1
35 40 45
(31и РНе Ьуз Суз Рго Азр О1у С1и Уа1 Мес Ьуз Ьуз Азп Мес МеС РНе
55 60
11е Ьуз ТНг Суз А1а Суз
70 <210> 105
- 98 015166 <211> 70 <212 > РКТ <213> Ното зарйепз <400> 105
Суз Ьеи Агд Ткг Ьуз Ьуз Зег Ьеи Ьуз А1а Не Нйз Ьеи Сйп Рке Ьуз
1 5 10 15
Азп Суз Ткг Зег Ьеи Нйз Ткг Туг Ьуз Рго Агд Рке Суз Сйу Уай Суз
20 25 30
Зег Азр Сйу Агд Суз Суз Ткг Рго Нйз Азп Ткг Ьуз Ткг Не Сйп Айа
35 40 45
С1и Рке <31 п Суз Зег Рго Сйу Сйп Не Уай Ьуз Ьуз Рго Уай Мес Уай
50 55 60
Не С1у Ткг Суз Ткг Суз
65 70
<210> 106 <211> 70 <212> РКТ <213> Ното зарйепз <400> 106
Суз Зег Ьуз Ткг Ьуз Ьуз Зег Рго Сйи Рго Уай Агд Рке Ткг Туг Айа
1 5 10 15
Сйу Суз Ьеи Зег Уай Ьуз Ьуз Туг Агд Рго Ьуз Туг Суз Сйу Зег Суз
20 25 30
Уай Азр Сйу Агд Суз Суз Ткг Рго Сйп Ьеи Ткг Агд Ткг Уай Ьуз МеС
35 40 45
Агд Рке Агд Суз Сйи Азр Сйу Сйи Ткг Рке Зег Ьуз Азп Уай МеС МеС
50 55 60
11е Сйп Зег Суз Ьуз Суз
65 70
<210> 107 <211> 205 <212> РКТ <213> Ното зарйепз
<400> 107
Сйп Нйз Туг Ьеи Нйз Не Агд Рго А1а Рго Зег Азр Азп Ьеи Рго Ьеи
1 5 10 15
Уай Азр Ьеи 11е Сйи Нйз Рго Азр Рго Не Рке Азр Рго Ьуз Сйи Ьуз
20 25 30
Азр Ьеи Азп Сйи Ткг Ьеи Ьеи Агд Зег Ьеи Ьеи Сйу Сйу Нйз Туг Азр
35 40 45
Рго Сйу Рке МеС Айа Ткг Зег Рго Рго Сйи Азр Агд Рго Сйу Сйу Сйу
50 55 60
Сйу Сйу Айа Айа Сйу Сйу Айа Сйи Азр Ьеи Айа Сйи Ьеи Азр <31 п Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Агд Сйп Агд Рго Зег Сйу Айа МеЬ Рго Зег Сйи Не Ьуз Сйу Ьеи
85 90 95
Сйи Рке Зег Сйи Сйу Ьеи Айа С1п Сйу Ьуз Ьуз Сйп Агд Ьеи Зег Ьуз
100 105 110
Ьуз Ьеи Агд Агд Ьуз Ьеи Сйп МеС Тгр Ьеи Тгр Зег Сйп Ткг Рке Суз
115 120 1.25
Рго Уай Ьеи Туг Айа Тгр Азп Азр Ьеи Сйу Зег Агд Рке Тгр Рго Агд
- 99 015166
130 135 140
Туг Уа1 Ьуз Уа1 С1у Зег Суз РНе Зег Ьуз Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго
145 150 155 160
С1и С1у МеС Уа1 Суз Ьуз Рго Зег Ьуз Зег Уа1 НХз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
165 170 175
Агд Тгр Агд Суз С1п Агд Агд С1у С1у С1п Агд Суз СХу Тгр Не Рго
180 185 190
11е С1п Туг Рго Не Не Зег С1и Суз Ьуз Суз Зег Суз
195 200 205
<210> 108 <211> 197 <212> РКТ <213> Са11из да11из <400> 108
С1п НХз Туг Ьеи НХз Не Агд Рго А1а Рго Зег Азр Азп Ьеи Рго Ьеи
1 5 10 15
Уа1 Азр Ьеи 11е С1и Н13 Рго Азр Рго Не РЬе Азр Рго Ьуз С1и Ьуз
20 25 30
Азр Ьеи Азп С1и ТЫ Ьеи Ьеи Агд Зег Ьеи Мес С1у СХу НХз РЬе Азр
35 40 45
Рго Азп РЬе МеС А1а МеС Зег Ьеи Рго С1и Азр Агд Ьеи С1у Уа1 Азр
50 55 60
Азр Ьеи А1а С1и Ьеи Азр Ьеи Ьеи Ьеи Агд <31п Агд Рго Зег С1у А1а
65 70 75 80
МеС Рго С1у СХи Не Ьуз С1у Ьеи СХи РЬе Туг Азр СХу Ьеи С1п Рго
85 90 95
О1у Ьуз Ьуз Н1з Агд Ьеи Зег Ьуз Ьуз Ьеи Агд Агд ЬУ3 Ьеи С1п МеС
100 105 110
Тгр Ьеи Тгр Зег О1п ТЬг РЬе Суз Рго Уа1 Ьеи Туг ТЬг Тгр Азп Азр
115 120 125
Ьеи С1у Зег Агд РЬе Тгр Рго Агд Туг УаХ Ьуз Уа1 СХу Зег Суз Туг
130 135 140
Зег Ьуз Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго (31 и С1у МеС Уа1 Суз Ьуз Рго А1а
145 150 155 160
Ьуз Зег Уа1 НХз Ьеи ТЬг Не Ьеи Агд Тгр Агд Суз СХп Агд Агд С1у
165 170 175
СХу (31п Агд Суз ТЬг Тгр Не Рго Не (31п Туг Рго Не Не А1а С1и
180 185 190
Суз Ьуз Суз Зег Суз
195
<210> 109 <211> 196 <212> РКТ <213> Хепориз Μβνίβ
<400> 109
С1п ΗΪ8 Туг Ьеи НХз Не Агд Рго А1а Рго Зег С1и Азп Ьеи Рго Ьеи
1 5 10 15
Уа1 Азр Ьеи Не С1и НХз Рго Азр Рго Не Туг Азр Рго Ьуз С1и Ьуз
20 25 30
Азр Ьеи Азп СХи ТЬг Ьеи Ьеи Агд ТЬг Ьеи МеС Уа1 С1у Н1з РЬе Азр
35 40 45
Рго Азп РЬе МеС А1а ТЬг Не Ьеи Рго С1и С1и Агд Ьеи С1у Уа1 С1и
- 100 015166
50 55 60
Азр Ьеи <31 у <31и Ьеи Азр Ьеи Ьеи Ьеи. Агд С1п Ьуз Рго Зег <31у А1а
65 70 75 80
Мее Рго А1а О1и Не Ьуз О1у Ьеи <31и РЬе Туг <31и <31у Ьеи <31п Зег
85 90 95
Ьуз Ьуз Шз Агд Ьеи Зег Ьуз Ьуз Ьеи Агд Агд Ьуз Ьеи <31п Мее Тгр
100 105 но
Ьеи Тгр Зег С1п ТНг РНе Суз Рго Уа1 Ьеи Туг ТНг Тгр Азп Азр Ьеи
115 120 125
<31у ТНг Агд РЬе Тгр Рго Агд Туг Уа1 Ьуз Уа1 <31у Зег Суз Туг Зег
130 135 140
Ьуз Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго С1и <31 у Мее Уа1 Суз Ьуз А1а А1а Ьуз
145 150 155 160
Зег Мее Н13 Ьеи ТНг Не Ьеи Агд Тгр Агд Суз <31п Агд Агд Уа1 <31п
165 170 175
С1п Ьуз Суз А1а Тгр Не ТНг Не <31п Туг Рго Уа1 Не Зег <31и Суз
180 185 190
Ьуз Суз Зег Суз
195
<210> НО <211> 195 <212> РКТ <213> ТакНиди гиЬгхрез
<400> 110
<31п Рго Туг Туг Ьеи Ьеи Агд Рго Не Рго Зег Азр Зег Ьеи Рго Не
1 5 10 15
Уа1 <31и Ьеи Ьуз (31и Азр Рго <31у Рго Уа1 РЬе Азр Рго Ьуз <31и Агд
20 25 30
Азр Ьеи Азп С1и ТЬг <31и Ьеи Ьуз Зег Уа1 Ьеи <31у Азр РНе Азр Зег
35 40 45
Агд РЬе Ьеи Зег Уа1 Ьеи Рго Рго А1а С1и Азр С31у ΗΪ3 А1а С1у Азп
50 55 60
Азр <31и Ьеи Азр Азр РЬе Азр А1а <31п Агд Тгр <31у С1у А1а Ьеи Рго
65* 70 75 80
Ьуз (31 и Не Агд А1а Уа1 Азр РНе Азр А1а Рго С1п Ьеи С1у Ьуз Ьуз
85 90 95
Ηί3 Ьуз Рго Зег Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз Агд Агд Ьеи <31п <3.1п Тгр Ьеи Тгр
100 105 но
А1а Туг Зег РЬе Суз Рго Ьеи А1а Н1з А1а Тгр ТНг Азр Ьеи 01у Зег
115 120 125
Агд РЬе Тгр РГО Агд РЬе Уа1 Агд А1а С1у Зег Суз Ьеи Зег Ьуз Агд
130 135 14 0
Зег Суз Зег Уа1 Рго <31 и <31у Мее ТНг Суз Ьуз Рго А1а ТНг Зег ТНг
145 150 155 160
Н13 Ьеи ТНг Не Ьеи Агд Тгр Агд Суз Уа1 <31п Агд Ьуз Уа1 <31у Ьеи
165 170 175
Ьуз Суз А1а Тгр Не Рго Мее (31п Туг Рго Уа1 Не ТНг Азр Суз Ьуз
180 185 190
Суз Зег Суз
195
<210> 111 <211> 196 <212> РКТ
- 101 015166 <213> Ьапхо гегЬо <400> 111
<31п Нхз Туг Туг Ьеи Ьеи Агд Рго Не Рго Зег Азр Зег Ьеи Рго Не
1 5 10 15
Уа1 <31и Ьеи Ьуз <31и Азр Рго Азр Рго Уа1 Ьеи Азр Рго Ьуз <31 и Агд
20 25 30
Азр Ьеи Азп <31и ТНг <31и Ьеи Агд А1а Не Ьеи <31 у Зег ΗΪ3 РНе <31и
35 40 45
<31п Азп РЬе Мес Зег Не Азп Рго Рго (31и Азр Ьуз Н13 А1а (31 у <31п
50 55 60
Азр <31и Ьеи Азп С31и Зег (31и Ьеи МеС Ьуз С1п Агд Рго Азп <31 у Не
65 70 75 80
мес Рго Ьуз С1и Пе Ьуз А1а МеС <31 и РНе Азр Не с;1п Н13 <31у Ьуз
85 90 95
Ьуз НЬз Ьуз Рго Зег Ьуз Ьуз Ьеи Агд Агд Агд Ьеи <31п Ьеи Тгр Ьеи
100 105 110
Тгр Зег Туг ТНг РНе Суз Рго Уа1 Уа1 Н13 ТНг Тгр СЯп Азр Ьеи <31у
115 120 125
Азп Агд РНе Тгр Рго Агд Туг Ьеи Ьуз Уа1 <31у Зег Суз Туг Азп Ьуз
130 135 14 0
Агд Зег Суз Зег Уа1 Рго <31и <31у МеС Уа1 Суз Ьуз Рго Рго Ьуз Зег
145 150 155 160
Зег НЬз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Агд Тгр Агд Суз Уа1 <31п Агд Ьуз <31у <31у
165 170 175
Ьеи Ьуз Суз А1а Тгр 11е Рго Уа1 <31п Туг Рго Уа1 Не Зег (31и Суз
180 185 190
Ьуз Суз Зег Суз
195
<210> 112 <211> 188 <212> ΡΒΤ <213> Миз шизси1из <400> 112
С1п <31у Тгр 51 п А1а РНе Агд Азп Авр А1а ТНг С1 и Уа1 Не Рго С1у
1 5 10 15
Ьеи <31у <31и Туг Рго <31и Рго Рго Рго (31и Азп Азп <Э1п ТНг МеС Азп
20 25 30
Агд А1а <31и Азп <31у С1у Агд Рго Рго Нтз Н13 Рго Туг Азр А1а Ьуз
35 40 45
(31у Уа1 Зег <31и Туг Зег Суз Агд (31 и Ьеи ΗΪ3 Туг ТНг Агд РНе Ьеи
50 55 60
ТНг Азр <31у Рго Суз Агд Зег А1а Ьуз Рго Уа1 ТНг (31и Ьеи Уа1 Суз
65 70 75 80
Зег <31 у <31п Суз <31у Рго А1а Агд Ьеи Ьеи Рго Азп А1а Не <31у Агд
85 90 95
Уа1 Ьуз Тгр Тгр Агд Рго Азп (31у Рго Азр РНе Агд Суз Не Рго Азр
100 105 110
Агд Туг Агд А1а <31п Агд Уа1 <31п Ьеи Ьеи Суз Рго <31у С1у А1а А1а
115 120 125
Рго Агд Зег Агд Ьуз Уа1 Агд Ьеи Уа1 А1а Зег Суз Ьуз Суз Ьуз Агд
130 135 140
Ьеи ТНг Агд РНе Нтз Азп <31п Зег (31 и Ьеи Ьуз Азр РНе <31у Рго (31и
145 150 155 160
ТНг А1а Агд Рго (31п Ьуз (31у Агд Ьуз Рго Агд Рго С1у А1а Агд <31у
175
165 170
А1а Ьуз А1а Азп. С1п А1а С1и Ьеи <31и Азп А1а Тух*

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуноген, представляющий собой фрагмент полипептида склеростина, имеющего 8Е0 ΙΌ N0: 1, 20, 58, 60, 62 или 68, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислот и не более чем 75 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина, где фрагмент включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 49 и 50, и где фрагмент способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  2. 2. Иммуноген по п.1, где фрагмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 21, 22, 23, 24 и 49.
  3. 3. Иммуноген по п.1 или 2, представляющий собой фрагмент не более чем из 50 последовательных
    - 102 015166 аминокислот полипептида склеростина.
  4. 4. Иммуноген, представляющий собой пептид по меньшей мере из 4 последовательных аминокислот последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 49 и 50, где указанный пептид содержит не более чем 75 аминокислот полипептида склеростина и способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  5. 5. Иммуноген, представляющий собой фрагмент полипептида склеростина, имеющего 8Е0 ГО N0: 1, 20, 58, 60, 62 или 68, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислот и не более чем 75 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина, где указанный фрагмент включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 29, 30, 31, 32, 53 и 54, и где указанный фрагмент способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  6. 6. Иммуноген по п.5, представляющий собой фрагмент не более чем из 50 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина.
  7. 7. Иммуноген по п.5 или 6, где указанный фрагмент включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 29, 30 и 53.
  8. 8. Иммуноген, представляющий собой пептид по меньшей мере из 4 последовательных аминокислот последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 29, 30, 53 и 54, где указанный пептид содержит не более чем 75 аминокислот полипептида склеростина и способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  9. 9. Иммуноген, представляющий собой фрагмент полипептида склеростина, имеющего 8Е0 ГО N0: 1, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислот и не более чем 75 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина, где фрагмент включает в себя 8Е0 ГО N0: 53 и где указанный фрагмент способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  10. 10. Иммуноген, представляющий собой фрагмент полипептида склеростина, имеющего 8Е0 ГО N0: 1, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислот и не более чем 75 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина, где указанный фрагмент включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 29 и 30, и способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  11. 11. Иммуноген по п.9 или 10, включающий фрагмент не более чем из 50 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина.
  12. 12. Иммуноген, представляющий собой пептид по меньшей мере из 4 последовательных аминокислот последовательности 8Е0 ГО N0: 53, где указанный пептид содержит не более чем 75 аминокислот полипептида склеростина и способен индуцировать антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина.
  13. 13. Иммуноген по любому из пп.7-10 и 12, представляющий собой пептид по меньшей мере из 4 последовательных аминокислот последовательности 8Е0 ГО N0: 22.
  14. 14. Иммуноген по любому из пп.7-10 и 12, представляющий собой пептид по меньшей мере из 4 последовательных аминокислот последовательности 8Е0 ГО N0: 33.
  15. 15. Композиция, включающая иммуноген по любому из пп.9-12.
  16. 16. Композиция по п.15, дополнительно включающая второй иммуноген, содержащий фрагмент полипептида склеростина последовательности 8Е0 ГО N0: 1, включающей не более чем 75 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 4 последовательные аминокислоты последовательности 8Е0 ГО N0: 22.
  17. 17. Композиция по п.15, дополнительно включающая второй иммуноген, содержащий фрагмент полипептида склеростина последовательности 8Е0 ГО N0: 1, включающей не более чем 75 последовательных аминокислот указанного полипептида склеростина, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 4 последовательные аминокислоты последовательности 8Е0 ГО N0: 33.
EA200600038A 2003-06-16 2004-06-15 Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител EA015166B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47897703P 2003-06-16 2003-06-16
PCT/US2004/018912 WO2005014650A2 (en) 2003-06-16 2004-06-15 Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600038A1 EA200600038A1 (ru) 2006-06-30
EA015166B1 true EA015166B1 (ru) 2011-06-30

Family

ID=34135049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600038A EA015166B1 (ru) 2003-06-16 2004-06-15 Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител

Country Status (17)

Country Link
US (12) US7381409B2 (ru)
EP (1) EP1636270B1 (ru)
JP (2) JP4688802B2 (ru)
KR (1) KR101210187B1 (ru)
CN (1) CN1835974A (ru)
AU (1) AU2004262640B2 (ru)
BR (1) BRPI0411552A (ru)
CA (1) CA2529623A1 (ru)
EA (1) EA015166B1 (ru)
ES (1) ES2586401T3 (ru)
IL (1) IL172598A0 (ru)
ME (1) MEP2808A (ru)
NO (1) NO345763B1 (ru)
NZ (1) NZ544618A (ru)
RS (1) RS20050934A (ru)
WO (1) WO2005014650A2 (ru)
ZA (1) ZA200600388B (ru)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101469329B (zh) * 1998-11-27 2012-10-24 达尔文发现有限公司 增加骨矿化的组合物和方法
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US7799523B2 (en) 2002-04-03 2010-09-21 Celltech R & D, Inc. Association of polymorphisms in the SOST gene region with bone mineral density
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
AU2003276430A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
CN1835974A (zh) 2003-06-16 2006-09-20 细胞技术研究与发展公司 对硬化素特异的抗体和用于增加骨矿化的方法
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
AU2005266875B2 (en) 2004-07-23 2012-07-26 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides, methods and compositions
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
AU2012238247B2 (en) * 2005-05-03 2016-06-16 Amgen, Inc. Sclerostin binding agents
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
EP2097450A2 (en) * 2006-11-10 2009-09-09 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
EP2094731A2 (en) * 2006-11-10 2009-09-02 UCB Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
PL3345607T3 (pl) 2006-12-29 2023-01-09 Ossifi-Mab Llc Sposoby modyfikowania wzrostu kości poprzez podanie antagonisty lub agonisty sost lub wise
CN101835485B (zh) 2007-02-01 2016-10-26 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途
TW201940502A (zh) 2007-02-02 2019-10-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
JP5574711B2 (ja) 2007-02-09 2014-08-20 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 癌患者における骨成長を促進するためのアクチビン−ａｃｔｒｉｉａアンタゴニストおよびその使用
PT2131860E (pt) 2007-03-20 2014-03-04 Lilly Co Eli Anticorpos antiesclerostina
PT2336329E (pt) 2007-06-01 2012-12-24 Omt Inc Composições e métodos para inibição de genes de imunoglobulina endógena e produção de anticorpos transgénicos humanos idiotípicos
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
EP3243524A1 (en) 2007-09-18 2017-11-15 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
US20110044978A1 (en) * 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture
US8071914B2 (en) * 2007-12-26 2011-12-06 Noboru Oshima Heating apparatus
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
WO2010019261A1 (en) 2008-08-14 2010-02-18 Acceleron Pharma Inc. Use of gdf traps to increase red blood cell levels
EP2387412A4 (en) 2009-01-13 2013-04-03 Acceleron Pharma Inc PROCESS FOR INCREASING THE ADIPONECTIN MIRROR
EP3384964B1 (en) 2009-03-30 2020-03-25 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
US8178488B2 (en) 2009-06-08 2012-05-15 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
BRPI1010704B1 (pt) 2009-06-12 2021-12-14 Acceleron Pharma Inc Polipeptídeo recombinante, proteína de fusão recombinante, preparação farmacêutica e uso da mesma
JP6267425B2 (ja) 2009-11-17 2018-01-24 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するａｃｔｒｉｉｂタンパク質およびその改変体およびその使用
JP2013523153A (ja) 2010-04-07 2013-06-17 アッヴィ・インコーポレイテッド ＴＮＦ−α結合タンパク質
MX2012012050A (es) 2010-04-16 2012-11-22 Novartis Ag Metodos y composiciones para mejorar la oseointegracion de implantes.
SMT202000095T1 (it) 2010-05-14 2020-03-13 Amgen Inc Formulazioni di anticorpi anti-sclerostina ad alta concentrazione
WO2011147193A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 The University Of Hong Kong High-affinity nucleic acid aptamers against sclerostin protein
US9493541B2 (en) * 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
WO2011159826A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hcv ns5b protease mutants
US20140308242A1 (en) 2010-10-21 2014-10-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
CN104800844A (zh) 2010-11-05 2015-07-29 诺华有限公司 使用il-17拮抗剂治疗类风湿性关节炎的方法
AU2011326586A1 (en) 2010-11-08 2013-05-30 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIA binding agents and uses thereof
EP2681242B1 (en) 2011-03-01 2018-01-24 Amgen Inc. Sclerostin and dkk-1 bispecific binding agents
MX338078B (es) 2011-03-25 2016-04-01 Amgen Inc Cristales de anticuerpos anti-esclerostina y formulaciones de los mismos.
SMT202000494T1 (it) 2011-04-19 2020-11-10 Amgen Inc Metodo per il trattamento dell'osteoporosi
US20140056912A1 (en) 2011-04-29 2014-02-27 Novartis Ag Methods of treating squamous cell carcinoma
LT2739311T (lt) 2011-08-04 2018-06-11 Amgen Inc. Kaulų tarpų defektų gydymo būdas
SG11201401796SA (en) 2011-10-24 2014-10-30 Abbvie Inc Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
UY34409A (es) 2011-10-24 2013-05-31 Abbvie Inc Inmunoenlazadores dirigidos contra el tnf
TW201323440A (zh) 2011-10-24 2013-06-16 Abbvie Inc 抗骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）之免疫結合物
WO2013101451A1 (en) 2011-12-28 2013-07-04 Amgen Inc. Method of treating alvelor bone loss through the use of anti-sclerostin antibodies
CN104619342A (zh) 2012-07-05 2015-05-13 Ucb医药有限公司 骨疾病的治疗
WO2014015217A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
MX380164B (es) 2013-05-03 2025-03-12 Selecta Biosciences Inc Uso de una macromolécula terapéutica y una composición que comprende nanoportadores sintéticos que se unen a inmunosupresores para reducir la hipersensibilidad tipo i y tipo iv en un sujeto.
CN103550785B (zh) * 2013-10-30 2016-05-18 清华大学深圳研究生院 TGF-β受体结合蛋白-1的用途
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
AP2017009674A0 (en) 2014-06-13 2017-01-31 Acceleron Pharma Inc Methods and compositions for treating ulcers
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
JP2018501307A (ja) 2014-12-03 2018-01-18 セルジーン コーポレイション アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト及び貧血を治療するための使用
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
SI3269735T1 (sl) 2015-03-13 2020-12-31 Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. Protitelo proti sklerostinu, antigen-vezavni fragment in medicinska uporaba le-tega
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
GB201609235D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Univ Cape Town Production of a horseradish peroxidase-IGG fusion protein
GB201610044D0 (en) * 2016-06-08 2016-07-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
KR20190037261A (ko) 2016-08-08 2019-04-05 암젠 인크 항-스클레로스틴 항체를 사용한 결합 조직 부착 개선 방법
KR20220051269A (ko) 2016-12-21 2022-04-26 메레오 바이오파마 3 리미티드 불완전 골형성증 치료에서의 항-스클레로스틴 항체의 용도
JP2020502218A (ja) 2016-12-21 2020-01-23 メレオ バイオファーマ ３ リミテッド 骨形成不全症の処置における抗スクレロスチン抗体の使用
KR102777514B1 (ko) 2017-01-19 2025-03-06 옴니에이비 오퍼레이션스, 인코포레이티드 다중 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 설치류 기원의 인간 항체
WO2018169811A1 (en) 2017-03-11 2018-09-20 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant
RU2647571C1 (ru) * 2017-08-25 2018-03-16 Владимир Глебович Лунин Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного
CN108101984B (zh) * 2017-12-18 2019-10-15 中国人民解放军总医院 骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途
CN111712573B (zh) * 2018-02-12 2023-10-20 安沛治疗有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途
IL316596A (en) 2018-03-30 2024-12-01 Amgen Inc C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
JP7425041B2 (ja) 2018-08-10 2024-01-30 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体医薬製剤を作製する方法
US20220275073A1 (en) 2019-08-12 2022-09-01 Amgen Inc. Anti-Sclerostin Antibody Formulations
CN113214479B (zh) * 2021-05-08 2022-03-18 四川大学 一种矿化防龋材料及其制备方法
TW202510908A (zh) 2023-07-19 2025-03-16 美商安進公司 用於治療性蛋白質配製物的緩衝液製備方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032773A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4427115A (en) 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
JP2624470B2 (ja) 1984-10-02 1997-06-25 バイオジェン インコーポレイテッド ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
US5272254A (en) 1984-10-02 1993-12-21 Biogen Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
SG64329A1 (en) 1984-11-16 1999-04-27 American Cyanamid Co Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US6024983A (en) 1986-10-24 2000-02-15 Southern Research Institute Composition for delivering bioactive agents for immune response and its preparation
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB8723661D0 (en) 1987-10-08 1987-11-11 British Bio Technology Synthetic gene
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
ATE112172T1 (de) 1987-10-30 1994-10-15 American Cyanamid Co Targetformer von antitumor-methyltrithioagenzien.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
WO1990013361A1 (en) 1989-05-04 1990-11-15 Southern Research Institute Improved encapsulation process and products therefrom
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
CA2094608A1 (en) 1990-10-22 1992-04-23 John D. Taylor Dna construct for providing rna therapy
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
HU218140B (hu) * 1991-04-25 2000-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humán interleukin-6-receptorral szembeni átalakított humán antitest
DE4135543A1 (de) 1991-10-28 1993-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes core-streptavidin
EP0578515A3 (en) 1992-05-26 1995-05-10 Bristol Myers Squibb Co Humanized monoclonal antibodies.
WO1993024631A1 (en) 1992-05-29 1993-12-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company PRODUCTION OF STREPTAVIDIN FROM $i(BACILLUS SUBTILIS)
ATE180407T1 (de) 1993-01-11 1999-06-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Induktion der antworten zytotoxischer t- lymphozyten
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
CA2164505A1 (en) 1993-06-07 1994-12-22 Phillip W. Berman Hiv envelope polypeptides
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
CA2187902A1 (en) 1994-04-29 1995-11-09 Peter Ten Dijke Morphogenic protein-specific cell surface receptors and uses therefor
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
CA2220912A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Gregg A. Hastings Human ccn-like growth factor
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
KR20000015893A (ko) 1996-05-22 2000-03-15 댄 마이클 특이적으로 암세포를 검출하는 항원 결합 단편, 상기 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 및 암의 예방 및 검출에 사용되는 이들의 용도
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
WO1998046588A2 (en) 1997-04-11 1998-10-22 Neorx Corporation Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies
ATE386802T1 (de) 1997-06-12 2008-03-15 Novartis Int Pharm Ltd Künstliche antikörperpolypeptide
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
EP1367124A1 (en) 1997-08-01 2003-12-03 Genset 5' ests for secreted proteins expressed in muscle and other mesodermal tissues
US6815201B2 (en) 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
CA2320488C (en) 1998-02-12 2007-03-06 Immune Complex, Corporation Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives
GB9818881D0 (en) * 1998-08-28 1998-10-21 Glaxo Group Ltd Compounds
US6544485B1 (en) 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
IL144084A0 (en) 1999-02-03 2002-05-23 Biosante Pharmaceuticals Inc Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
EP1683811B1 (en) * 1999-06-09 2009-08-19 Genentech, Inc. Methods for the diagnosis of tumors
JP4141095B2 (ja) 1999-10-29 2008-08-27 三洋電機株式会社 半導体装置とその製造方法
EP1266000A1 (en) 2000-03-02 2002-12-18 Amgen Inc. Chordin-like-2 molecules and uses thereof
US20020106650A1 (en) 2000-06-01 2002-08-08 Paszty Christopher J. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
AU2001272482A1 (en) 2000-06-19 2002-01-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Osteolevin gene polymorphisms
CA2632702A1 (en) 2000-09-01 2002-03-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
ATE442862T2 (de) 2000-10-12 2009-10-15 Genentech Inc Niederviskose konzentrierte proteinformulierungen
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
DE10145772A1 (de) 2001-09-17 2003-04-10 Bayer Cropscience Ag DELTA·1·-Pyrroline
JP4467304B2 (ja) 2001-12-06 2010-05-26 バイオコントロール システムズ，インコーポレイティド サンプル収集および試験システム
US20030186915A1 (en) 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
EP1575481A4 (en) 2002-03-01 2010-01-06 Celltech R & D Inc PROCESS FOR INCREASING OR REDUCING THE BONE DENSITY
US7799523B2 (en) 2002-04-03 2010-09-21 Celltech R & D, Inc. Association of polymorphisms in the SOST gene region with bone mineral density
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
US7758876B2 (en) 2002-11-01 2010-07-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory CpG oligonucleotides
US7642238B2 (en) * 2002-12-05 2010-01-05 Shaughnessy John D Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US20040141875A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
WO2004082608A2 (en) 2003-03-14 2004-09-30 Celltech R & D, Inc. Ligands for tgf-beta binding proteins and uses thereof
CU23403A1 (es) 2003-04-23 2009-08-04 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido n-glicolil gm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores
CN1835974A (zh) * 2003-06-16 2006-09-20 细胞技术研究与发展公司 对硬化素特异的抗体和用于增加骨矿化的方法
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
EP2094731A2 (en) 2006-11-10 2009-09-02 UCB Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
EP2097450A2 (en) * 2006-11-10 2009-09-09 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
PL3345607T3 (pl) 2006-12-29 2023-01-09 Ossifi-Mab Llc Sposoby modyfikowania wzrostu kości poprzez podanie antagonisty lub agonisty sost lub wise
JP2010526766A (ja) 2007-02-02 2010-08-05 ノバルティス アーゲー 骨関連障害を処置するためのスクレロスチン結合パートナーのモジュレーター
PT2131860E (pt) 2007-03-20 2014-03-04 Lilly Co Eli Anticorpos antiesclerostina
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
EP2567709B1 (en) 2007-11-02 2017-12-27 Novartis AG Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6)
US20110044978A1 (en) * 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000032773A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Darwin Discovery Ltd. Compositions and methods for increasing bone mineralization

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUNKOW M. E. ET AL.: "BONE DYSPLASIA SCLEROSTEOSIS RESULTS FROM LOSS OF THE SOST GENE PRODUCT, A NOVEL CYSTINE KNON-CONTAINING PROTEIN" AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS, CHICAGO, IL, US, vol. 68, no. 3, 2001, pages 577-589, XP001052847 ISSN: 0002-9297 cited in the application abstract page 577, column 1, paragraph 1 - page 578, column 1, paragraph 2 page 580, column 1, paragraph 2 - column 2, paragraph 2 *
KUSU NAOKI ET AL.: "Sclerostin is a novel secreted osteoclast-derived bone morphogenetic protein antagonist with unique ligand specificity." JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 278, no. 26, 17 April 2003 (2003-04-17), pages 24113-24117, XP002309504 ISSN: 0021-9258 abstract page 24113, column 2, paragraph 2 page 24114, column 1, paragraph 4 page 24115, column 1, paragraph 4 - column 2, paragraph 3 page 24117, column 1, paragraph 2 - column 2, paragraph 2 *
LATHAM J A: "The biochemical and cellular characterization of sclerostin, the causative gene for sclerosteosis" CALCIFIED TISSUE INTERNATIONAL, ABSTRACT I-10, vol. 70, no. 4, April 2002 (2002-04), page 244, XP001204068 & 29TH EUROPEAN SYMPOSIUM ON CALCIFIED TISSUES; ZAGREB, CROATIA; MAY 25-29, 2002 ISSN: 0171-967X abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
NO345763B1 (no) 2021-07-19
US20110206678A1 (en) 2011-08-25
ES2586401T3 (es) 2016-10-14
US7381409B2 (en) 2008-06-03
WO2005014650A3 (en) 2005-07-28
JP4688802B2 (ja) 2011-05-25
US20150191537A1 (en) 2015-07-09
AU2004262640A1 (en) 2005-02-17
JP2007537130A (ja) 2007-12-20
KR101210187B1 (ko) 2012-12-07
CA2529623A1 (en) 2005-02-17
US20130064830A1 (en) 2013-03-14
EP1636270B1 (en) 2016-07-20
US11702468B2 (en) 2023-07-18
US8992911B2 (en) 2015-03-31
RS20050934A (sr) 2008-04-04
US20180072801A1 (en) 2018-03-15
US20050106683A1 (en) 2005-05-19
US20110195453A1 (en) 2011-08-11
US20200231664A1 (en) 2020-07-23
US9657095B2 (en) 2017-05-23
BRPI0411552A (pt) 2006-08-01
NZ544618A (en) 2009-02-28
US8563271B2 (en) 2013-10-22
WO2005014650A2 (en) 2005-02-17
US20130064829A1 (en) 2013-03-14
US20090117118A1 (en) 2009-05-07
MEP2808A (xx) 2010-02-10
EA200600038A1 (ru) 2006-06-30
CN1835974A (zh) 2006-09-20
US20110206677A1 (en) 2011-08-25
US20240209075A1 (en) 2024-06-27
JP2011105729A (ja) 2011-06-02
KR20060035622A (ko) 2006-04-26
AU2004262640B2 (en) 2010-12-23
US7868134B2 (en) 2011-01-11
US20120321636A1 (en) 2012-12-20
EP1636270A2 (en) 2006-03-22
ZA200600388B (en) 2008-06-25
NO20060236L (no) 2006-03-14
IL172598A0 (en) 2006-04-10
US9011856B2 (en) 2015-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015166B1 (ru) Иммуногенные пептиды склеростина (sost), индуцирующие образование специфических антител
EA022991B1 (ru) Антитело к склеростину и его применение
EA015105B1 (ru) Антагонисты активина - actriia и их применение для стимулирования роста кости
MX2013010011A (es) Agentes de unión biespecífica.
TW201713361A (zh) 進行性骨化性纖維發育不良之治療
SG182001A1 (en) Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
HK1088907B (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization
MXPA05013797A (en) Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
HK1189900A (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU