PT97500B

PT97500B - Processo de producao de lipossomas e de preparados farmaceuticos contendo aqueles lipossomas

Info

Publication number: PT97500B
Application number: PT97500A
Authority: PT
Inventors: Hansjorg Eibl; Clemens Unger; Petra Kaufmann-Kolle
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1998-08-31
Also published as: ATE107503T1; AU7770291A; WO1991016880A1; DE59102030D1; IE62548B1; EP0526531B1; IE911427A1; DK0526531T3; EP0526531A1; DE4013632A1; PT97500A; AU643282B2; CA2081119A1; JPH05506661A; ES2056648T3

Description

MENoRIO.....DF3CR.1T.IVA presente invento diz respeito a lipossomas com urna carga positiva excedente gue podem ser utilizados como suporte para as substâncias activas, no tratamento de doenças do fígado..

Os lipossomas são corpos globulares formados por uma ou várias camadas duplas de lípidos © com um espaço interior aquoso (1 í povesicuias)As vesículas deste tipo podem ser produzidas através de uma fina dispersão de fosfolípidos (por exemplo» lecit i n a ) e m m e i o s a q u o s o s..

>

Bangham et.......al», J» Mol» Biol» 13 (1965.) 238-252, fizeram a observação de gue os fosfolípidos formam, em presença de água, superestruturas- Dependendo de parâmetros fisicos como, por exemplo, pressão, temperatura e concentração iónica, desenvolvem-se micelas, lipossomas unilamelares ou multilamelares, ou também simples camadas duplas de lípidos (ver Liposomes: From physícal structure to therapeutic application (1981), Kníght» C„G„ (Ed„), Flsevier, North Holland Biomedical Press, capitulo 2: H» Eibl, Phospholipid synthesis, 19-50; capítulo 3: F« Szoka e D. Papahadjopoulos, Eiposomes: Preparatíon and characterization, 51-104)Os lipossomas pequenos e unilamelares sâo corpos globulares com um diâmetro de 20 a 200 nm (ver Barenholtz et......al.-» FEB8 Lett- 99 (1979) 210-214)- 0 seu volume interior está cheio de água, isolado do exterior pela camada dupla, de lípidos- Conforme o seu grau de lipofília ou hidrofilia, as substâncias activas podem ser incluídas na camada dupla de lípidos ou no espaço interior aquoso dos lipossomas, sendo transportadas e distribuídas no organismo através dos líquidos do corpoDevido à sua estrutura, os lipossomas servem, na bioquímica e na biologia molecular, como modelos de membranas- Além disso, foram publicados durante os últimos anos, numerosos artigos sobre as propriedades dos lipossomas e a sua utilização como veículos para substâncias farmacêuticas (ver, por exemplo, H- Schreiner e M- Raeder-Sehikorr, Pharmazie In unserer Zeit 11 (1982) 97-108)» Ensaios em animais, publicados até à data, mostram em geral, que

515 (31 1261

-4o fígado e o baço dominam em relação aos outros orgãos, no que diz respeito à absorção de lipossomas. Ao fim de uma hora, encontram-se no fígado cerca de 8¾ dos lipossomas e, após 24 horas. .15¾. No entanto, as diferenças relativas à distribuição nos órgãos e ao enriquecimento nos órgãos„ entre os lipossomas neutros e os que têm uma carga excedente negativa de 10¾, são pequenas .

A possível utilização de lipossomas. na Medicina, visa essencialmente o tratamento selectivo de doenças. Pretende-se aumentar os efeitos desejados da substancia activa incluída nos lipossomas, diminuindo, em contrapartida, os efeitos nâo desejados (melhoramento do índice terapêutico). Esta concepção e convincente no que diz. respeito a um tratamento de uma doença isolada, que se restringe a um só orgão determinado, tendo as doenças do figado, neste caso, uma importância particular. A medida que as substâncias activas incluídas atingirem exclusivamente o fígado, o tratamento do orgão afectado será muito específico. Os dois exemplos seguintes do domínio da Medicina interna pormenorização esta concepção, apontando para a importância pratica deste princípio:

&.xomp.l o... .1:.....d.gen.ç.a.s...m.a.l.i.g.n.as.....dg..,, fígado.

No desenvolvimento de metástases de tumores malignos, o fígado pode representar o local principal deste desenvolvimento, por exemplo, no caso de cancro da mama ou de tumores do aparelho digestivo. No entanto, o figado pode também ser o único órgão da formação de metástases, por exemplo após uma operação ao cancro do intestino grosso, tendo como consequência, mais tarde, a formação de metástases no figado. Em contraposição, os carcinomas primários de célula do fígado limitam-se exclusivamente ao fígado.

Exemplo.....2: .....doengas.....inf .lama to ri as.... dg.....fígado

Com os interferoes (Ifn), dispomos, pela primeira vez. de um grupo de substâncias que promete ter êxito no tratamento da hepatite crónica provocada por vírus. É de esperar que a inclusão de Ifn em lipossomas e o seu transporte quantitativo para o interior

cio fígado afectado reduza consideravelmente os efeitos secundários específicos cio Ifn, Além disso, ê provável que os intervalos entre os momentos cia administração cie ifri se prolonguem, sendo possível reduzir a aplicação cie 4 vezes por semana para uma vez por somaria,

U presente invento propôs-se, portanto,, a tarefa de pór a disposição lipossomas capazes de resolver o problema acima exposto de um transporte de substâncias activas para um órgão especifico, e tornando possível obter um melhoramento do índice terapêutico das substancias activas incluidas nos lipossomas.,

J

Este problema resolve-se através do presente invento,.

objecto do presente invento sáo novas estruturas de lipossomas caracterizadas por conterem, pelo menos, 1% mol de um composto que apresenta uma carga positiva excedente, da fórmula geral (I)

CH₂ “ Q Ri

I

CH - 0 - R₂!

(CH - 0 - R)_n

I ch₂ - r₃ (I) na qual R^ significa alcoílo ou alquilo, cada um com 1.4 a 1.8 átomos de carbono, oleollo ou oleílo,

R₂ tem o mesmo significado que Rj (não sendo R^, necessariamente igual a R₂) e, além disso, PNN

CH₃I +

PHN

- - p-o-ch₂-ch₂-n-ch₂-ch₂-n-ch₃ o” ch₃ ch₃

515 (31 1261 ou Gly

U

Gly ~ ~e~CHo-CHo~A+, na qual A pode significar -NHy+, -NH^CHz+,

Z- Z, \J 4.. ·£

-NH(CH₃J₂+, ou N(CH₃.)₃+,

R-z significa -O-Ri , -O-PNN, -O-fâly, NHv+, NHoCH_x+, ΝΗ(ΟΗ₃)?+ ou N ( CH₃ J ₃ t- ,

R tem um dos significados que foram indicados para R-j Fí^ ^{ou R}3e n significa um numero inteiro de 0 a 3, de preferencia o, com a condição da molécula conter um dos grupos mencionados com carga positiva.,

Da DE-A-27 52 553, conhecem-se compostos do tipo dos fosfolípidos, e processos para o seu fabrico, os quais apresentam uma estrutura idêntica à da fórmula (I) acima indicada, na qual um dos resíduos R, R_L, R₂, ou R₃ compreende PNN.,

Surpreendentemente, verificou-se recentemente, que lipossomas que consistem em misturas de lípidos com um teor de, pelo menos, 3% mol de um composto da fórmula geral (I) apresentam um comportamento de veículos específicos para substancias farmacêuticas para determinados orgãos- Os lipossomas de acordo com o invento contêm, de preferencia, 1 a 30% mol, sobretudo 5 a 15% mol, de um composto da fórmula geral (I), podendo conter os lipossomas também misturas de um ou vários compostos da fórmula geral (I),

A tabela 1, seguinte, mostra que o teor no sangue de C^Hj-inuliria, relativamente a lipossomas de acordo com o invento, que contêm um composto com uma carga positiva excedente da fórmula geral (I), marcados com [³H]-inulina, se reduziu após uma hora a menos de 1%, Em contrapartida, encontra-se no fígado uma percentagem extraordinariamente elevada de [^óH]~inulina: ao fim de uma hora 67%, após 24 horas 54%, e após 72 horas ainda 45%, Em orgãos como os pulmões, rins, coração e cérebro, não é possível detectar iriulina. Até no baço, que, fazendo parte do sistema da fagocitose, normalmente absorve os lipossomas bastante bem, nao

515

G1 1261 ·7· se detectam lipossomas. Isto resulta, nitidamente, da tabela 2 seguinte, a qual representa as quantidades de L^ÓH-inulina absorvidas peio sangue, fígado e baço, por grama de peso fresco.

.1. abei.a l

Comparação da absorção de [^Hj-inulina, apos inclusão em lipossomas de carga superficial diferente, e apos aplicação de L^UH.]~ -inuiina livre.

I... í pi dos Tempo (mol/mol) (horas)

Sangue Fígado baço (em % da quantidade aplicada)

PPGPC/Chol 1 / 40 24

U*I,W,'.WAU**WA w* IAWUMWA WMVMkW. WASWWAWA WA W*W*WWl Wn W*Wl»W*W«»W.VA1 W,,MW»Vri»m

PPGPC/PPGPG/Chol 1 64 7 / 10 / 40 24 8 16

0 11

PPQPC/N⁺/Chol 1 /10/ 40 24

67 2 0 54 0 0 45 0

[’^Η]inulina livre 1 24

0,6 0 0

0 0

A distribuição nos órgãos estã indicada em percentagens da quantidade de inulina aplicada. Dentro de uma ampla área de dosagem (até 1 mmol por kg de peso corporal), a absorção de L³Hj-inulina, em ratinhos NMR-I, torna-se quase linear. Após uma hora, já não há inulina livre na circulação sanguínea, sendo totalmente eliminada através dos rins. As várias abreviaturas significam; Std. ~ hora; PPGPC ~ l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina; Chol. - colesterina;PPGPfâ ~ 1,2-dipalmitoí1-sn-glícero-3-fosfo-sn~l~glicerina, sob forma do sal de Na⁺; N⁺ ~ um lípido de carga positiva, de cadeia dupla, da fórmula geral (I).

/2 5l5

(31 1261

-81 abe) a....2

Comparação da absorção de C^Hj-inulina, apos inclusão em lipossomas, em percentagens por kg de peso fresco. Todas as outras indicações correspondem às da Tabela 1.

Lípidos (moI/mo1)	Tempo (horas)	Sangue (em % da g de pes	Fígado q uan tidade ap1i cad; ;o fresco)	Baço i em
........ ' .......-......~........ · '··	---- -'· ~·· ·-— --	------- ... -----------------	.. .... .... .... _ ........ .. ....	*....... ···
PPOPL/Lhoi	1	26	8	19
60 / 40	24	2	15	38
PPGPC/PPGPG/Chol	1	35	6	11.
50 /10 /40	24	4	13	18
PPGPC/N⁺/Chol	1	0	37	11
50 /10/ 40	2.4	0	31	0
C^sH]-inulina livre 1	0,6	0	0
	24	0	0	0

Os valores indicados nas tabelas 1 e 2 anteriores mostram gue e possível obter, com os lipossomas de estrutura lipófila de cadeia dupla de acordo com o invento, os quais contêm um composto com uma carga excedente positiva da fórmula geral (1), um enriquecimento da substância activa exclusivamente no fígado» Este facto surpreendente pode ser aproveitado para a terapia de doenças do.fígado»

Um outro objecto do presente invento é, por isso, um preparado farmacêutico para o tratamento de doenças do fígado contendo uma ou várias substâncias activas contra doenças do fígado, incluídas em lipossomas, caracterizado por conter, pelo menos, 1% mol, de preferência 1 a 30% mol, e sobretudo 5 a 15% mol, de compostos que apresentam uma carga positiva excedente, da fórmula geral precedente (1), na qual R_±, R₂, R₃, R e n têm os significados acima indicados» 0 limite superior da quantidade de substàn72 SIS GI 1261

« cia activa incluída é dado peia solubilidade da substancia activa em água, no que diz respeito a fármacos solúveis em água.

Um outro objecto & também a utilização de um composto da formula geral (I) para a produção de um produto farmacêutico para o tratamento de doenças do fígado, produto esse que contem uma ou várias substâncias activas contra doenças na zona do fígado, incluídas em lipossomas, contendo os lipossomas peio menos .1Λ mo) de um composto· de fórmula

Os lipidos de acordo com o invento, da fórmula geral (I), que podem ser utilizados para a produção de lipossomas de acordo com o invento para enriquecimento no fígado, podem ser classificados om três grupos::

A) estruturas do tipo dos fosfolípidos contendo o radical PNN, que não existe na natureza;

B) ésteres de glicína e glicéridos, que podem ser constituídos completamente por componentes naturais e que contêm o radical Gly, e

C) hidrocloreto de díacil- ou díalquil-w-amino, de preferência hidrocloretos de diacil- ou dialquil-1,2-propanodi.ol-3-amino, nos quais Rg tem os significados acima indicados relativamente à fórmula geral (X), salvo -0~R^, -O-PNN e O-Gly.

Os lipidos preferidos sao;

lipidos A; l,2-MM~sn-fâ-3-PNN, 1,2~PP~sn~G~3~PNN, l,2~SS~sn~G-3-PNN, l,2-TeTe-sn-G-3-PNN, l,2-HeHe~sn~G~3~PNN e 2,2-0c0c-sn~G-3-PNN; ou os respectivos fosfolípidos à base de 1,3-diacil- ou dialquil-gliceróis como produtos de partida.

Lipidos B; compostos da fórmula (I), nos guais R·^ e R₂ significam um radical acima indicado para R_x, particularmente Μ, P, S, Te, He, Oc, como se índica, no grupo A, oleílo e/ou oleoílo, e onde Rg representa o radical Gly, e nos quais R^ e Ps₂ significam, de preferência, radicais iguais; assim como os compostos derivados dos produtos de partida, os respectivos 1,3-diacil- ou 1,3-dialquil-gliceróis, da fórmula (I), onde Rj e Rg têm o significado acima indicado para R^ e onde R₂ significa o radical. Gly;

515 fâl 1261 lípides C: ésteres e éteres de 1,2-di-hidroxipropilamina, incluindo as formas metiladas da fórmula geral (1), onde R^ e Fl·» tém os significados acima indicados para os lípidos B, n « 0, c R>, tem o significado indicado acima para a formula geral (1), salvo -0-Rp --0--PNN e -O-Gly»

Us lípidos da fórmula geral (I) sâo bem conhecidos e podem ser sintetizados, por analogia com os lípidos conhecidos com uma estrutura semelhante, com utilização de reacções em principio con hecidas..

Os lípidos do grupo de lípidos A podem ser produzidos, por exemplo, de acordo com os processos indicados na OE-A-27 52 553 para compostos deste géneroOs compostos do grupo de lípidos B podem ser obtidos peia acilação de um derivado de glicerol apropriadamente substituido (por exemplo, de 1,2-dialcoí1o-sn-glicerol) com um glicerol substituído por meio de um grupo protector, de preferência com N-a-Z-gl icerol., eliminação do grupo protector, sobretudo clivagem catalítica do grupo protector Z e, eventualmente, metilação subsequente do grupo amino»

Para a produção dos compostos do grupo de lípidos C são, primeiramente, sintetizados, partindo de 3~halogeno~l,2-propa.nodiol, de preferência de 3-bromo~l,2-propanodiol, os respectivos

1,2-diésteres ou diéteres, o que pode ser realizado de acordo com métodos de esterificação ou eterificação em principio conhecidos; os derivados de 1,2-dialquilo ou diacilo assim obtidos sâo produzidos, a seguir, pela transformação com amoníaco ou com hidrocloreto de F^-meti lamino, de Ν,Ν-dimetilamino ou de N,N,N-trímetilamino, respectivamente»

Nos processos de produção acima indicados para os compostos da fórmula geral (I), aplicam-se, de preferência, os métodos gerais que se indicam nos exemplos para a produção de compostos de acordo com o invento, sob as condições de reacção indicadas»

/2 blb Sl 1261

Para a produção dos lipossomas com uma carga positiva excedente de acordo com o invento, os componentes individuais dos « d 4« lipossomas, por exemplo PPDPC, Chol e Ν , representando N um ou vários lípidos da formula geral (I) de acordo com o invento, são dissolvidos num solvente apropriado, de preferência sob aquecimento, para se obter uma mistura homogenea dos componentes. □ solvente e removido no vacuo e a película finamente dispersa do lipido e misturada com uma solução tampão aquosa (como solução tampão aquosa podem servir todas as soluções fisiologicamente utilizáveis), ή seguir rnantem-se a mistura, agitando-a suavemente, cerca de 1 hora, a uma temperatura que é, etn geral, 5“C superior à temperatura de transformação principal dos lípidos, por exemplo a cerca de 50^QC.

A suspensão de lípidos pré-aquecida coloca-se a seguir na câmara de pressão de uma French-Press” (da empresa Amico, Silver Spring, Estados Unidos). A French-Press consiste nutria prensa, hidráulica e numa câmara de pressão em aço, estandardizada, com um volume de enchimento máximo de 40 ml» Depois de se fechar a caniara de preesáo₃ a pressão é aumentada para 1_P38 x 1.0^ kPa (20 000 psi) e a suspensão de lipossomas é forçada, sob pressão constante, através duma saída estreita» Este processo repete-se, pelo menos, três vezes» Após uma centrifugação da dispersão de lipossomas (Sorvall RC-5B: S^C, 30 minutos e 27 000 g), a solução sobrenadante é separada do sedimento» Ela contém os lipossomas que estão a partir de agora à disposição para as diversas aplicações e investigações, por exemplo para a produção de um preparado farmacêutico de acordo com o invento (lipossomas contendo substâncias activas)» Os lipossomas de acordo com o invento podem ser produzidos também através de outros processos»

Um objecto do presente invento é, por isso, também um processo para a produção de lipossomas de acordo com o invento que contêm, pelo menos, 3% mol de um composto que apresenta uma carga positiva excedente, da fórmula gerai (I), no qual R^, R2» ^3» R ^en tem os significados acima indicados, caracterizado por se aplicar, pelo menos, 3% mol de um composto da fórmula geral (I), .juntamente com os outros componentes lípossómicos, numa

515 tíl 1261

-12~ quantidade que dá, em conjunto com o composto da fórmula geral (i), loot mol.,

Os compostos da formula geral (I) de acordo com o invento são aplicados neste caso, de preferência, numa quantidade de 1 a 3% mol, sobretudo de 5 a 15% mol (totalidade dos lipossomas

100% mol),.

Para a produção de um preparado farmacêutico contendo uma ou varias substâncias aetivas, incluídas nos lipossomas de acordo com o invento (produção dos lipossomas que contêm substancias aetivas)., procede-se de maneira seguintes para se efectuar a inclusão de substâncias insolúveis em água, a substância activa é dissolvida, juntamente com os lipidos, em cloreto de metileno ou clorofórmio; a seguir procede-se de acordo com o processo acima descrito para a produção dos lipossomas vazios de acordo com o invento.

Para se efectuar a inclusão de substâncias solúveis em água, mistura-se, como acima descrito para a produção dos lípossomas vazios, a película de lipídos com uma solução tampão que contém agora, no entanto» a substância activa solúvel em água. A seguir procede-se como acima descrito para a produção dos lipossomas vazios. Após a centrifugação, a solução sobrenadante também contém, além dos lipossomas cheios, a substância activa solúvel em água que não foi incluída. Esta parte livre da substância activa pode ser separada da parte que está incluída nos lipossomas através da cromatografia sobre gel (ver Liposomess From physical structure to therapeutic applicatíon (1981), l.c.). De preferência, efectua-se a concentração dos lipossomas através de ultraf iltração (empresas Amicori ou Sartorius). Convém realizar, antes da utilização dos lipossomas, uma filtração com filtros de membranas, em condições estéreis (empresa Sartorius, porosidade de 0,2 μ.).

Um objecto do presente invento é, por isso, também um processo para a produção de um preparado farmacêutico que contem uma ou várias substâncias aetivas incluídas nos lipossomas de acordo

515 b I 1261

com o invento, proces •S* 45 c a r a c t e r i z a d ο ρ o r s e p r o c e der d e acordo com o processo para a produção dos lipossomas de acordo com · o invento que contém, peio menos, 3% mol de um composto da fórmula geral (I), por se dissolver, para efectuar a inclusão de substancias activas não solúveis em água, a substância activa juntamente com os lípidos e por se misturar, para efectuar a inclusão de substâncias activas solúveis em água, a película de lípidos com uma solução tampão aquosa que contem a substância activa solúvel em água.

As substâncias activas serão transportadas,, de preferência, para o fígado» Escolhem-se, de preferência, uma ou várias substâncias activas, por exemplo do grupo dos cítostaticos (hexade— c ί1f osfocolina, 1-octadeci1-2-meti1-r ac-g1i cer o-3-fosf oco1in a, 5~fluoro-uracilo, epírubicina, adriamícina, complexos cis de platina, novantrona), da classe das substâncias ímunomoduladoras (interferão a, MAF - factor de actívação de macrofagos (macrophage activating factor), substâncias de efeito antimicótico (anfotericina 13) e substâncias activas contra doenças provocadas por protozoários (malária, infecções provocadas por tripanossornas e leishmanias),

Os exemplos seguintes servirão para pormenorizar o invento sem o restringirem_

Se não se indicar outra, coisa, as quantidades e percentagens referem-se sempre ao peso, as temperaturas à escala de Celsius.,

Exemplos

Exemplos para a produção de compostos de acordo com o invento do grupo de lípidos A: procedimento geral:

para a produção dos compostos procede-se de modo a;

a) transformar de maneira em princípio conhecida, um composto da fórmula geral (I), na qual significa um grupo OH, (a seguir designado por composto da formula geral (II)) com POCl-^,

b) transformar o produto de reacção do passo a), de maneira em princípio conhecida, com um composto da fórmula (III)

515 .

Kl 1261 &—·ί.

-.14HO - Alk - Hal na qual Hal significa 01., Br ou I»

c) e transformar o produto de reacção do passo b) com um composto da formula geral. (IV)

CH·, <?

CH-, v,'

N - OH > - CH·-,·. — N —OH :<

(IV) ch₃

CH-z

Dos compostos da fórmula geral (111) preferem-se os bromados,

A reacção de cloreto de fosforilo com o composto da fórmula geral (II), no passo a), é realizada, de preferência, num solvente orgânico inerte» Solventes apropriados são, por exemplo, hidrocarbonetos halogenados como clorofórmio e tetracloreto de carbono, hidrocarbonetos aromáticos como benzeno ou tolueno, e hidrocarbonetos alifáticos como éter de petróleo ou outros semelhantes» Apropriados são também solventes orgânicos cíclicos como, por exemplo, o tetra-hidrofurano» Preferem-se, neste caso, o tricloroetileno ou o tetra-hídrofurano, porque os sais resultantes como, por exemplo, hidrocloreto de trietilamina, têm, nestes casos, uma solubilidade muito reduzida, de modo que precipitam e são de fácil separação por filtração» Convém realizar a reacção, se for possível, sob exclusão de humidade» As temperaturas apropriadas encontram-se entre -10” e 50”C, de preferência entre 10° e 30°C» Conforme as substâncias e os solventes utilizados aplicar-se-ão, em alguns casos, também temperaturas mais altas ou mais baixas»

A reacção realiza-se, de preferência, em presença de uma base orgânica inerte como, por exemplo, trietilamina, piridina ou quinolina»

É conveniente dissolver o cloreto de fosforilo no solvente inerte, adicionando a seguir a base» Depois disso, adícíona-se o convenientemente, também, dissolrealiza-se, de preferência, por reacções decorrem fácil e inequitemperatura, conforme o caso, de

515

GI 1261

c o m ρ ο ε to d a f o r m u 1. a geral. (11), vido num solvente inerte- isso instilação sob agitação- Com as vocamente, é possivel escolher a modo a que a reacção acabe imediatamente após a instilação, o que pode ser verificado facilmente por uma análise por cromatografia d e ca ma d a f i n a»

A fase b) decorre sem complicações no caso de se misturar o produto da fase a) com o composto da fórmula geral (111)- Mistura-se, de preferência, a mistura reaccional com uma solução do composto de fórmula geral (.111), em presença de uma base orgânica c o m ο, ρ o r e x e m ρ 1 o, tri e t i 1 a m I n a - Ar e a c ç á o é rea 11 z a d a, d e p r e ferência, a temperaturas entre 20 e 60 °C, com utilização de tetra-hidrofurano como solvente - Conforme as condições aplicadas, a duração da reacção é, em geral, entre cerca de 20 e 120 minutos.

Sob as condições preferidas precipita-se o hidro-halogerieto da base, sendo este separado logo a seguir. Para se obter o máximo de rendimento, o hidrocloreto é lavado a seguir, e o líquido de lavagem torna a adicionai—se à solução de reacção. Depois disso, o solvente ê eliminado- A seguir, o resíduo é, eventualmente, dissolvido em tetra-hidrofurano e hidrolisado permeio de uma solução aquosa ligeiramente alcalina, por exemplo de bicarbonato de sódio em água, mantendo-se o valor pH, de preferência, entre 5 e 7. Depois procede-se a uma extracção por meio de um solvente orgânico como, por exemplo, éter diisopropilico ou clorofórmio. Desta maneira sao obtidos os sais de sódio dos ácidos alquíIfosfatidícos, os quais podem ser facilmente recristali zadosA reacção da fase c), quer dizer a transformação do produto de fase b) por meio de aminobase, realiza-se, em geral, também em solventes polares como, por exemplo, clorofórmio, álcoois primários, secundários ou terciários, dimetilformamida, acetonitrilo, nitrometano ou água ou as suas misturas. A transformação pode ser realizada a qualquer temperatura entre o ponto de fusão e o ponto de ebulição do solvente utilizado, conforme a sensibilidade das

515 (U 1261 'Ί.β' substâncias de partida utilizadas- De preferência realiza-se a transformação a temperaturas entre a temperatura ambiente e o ponto de ebulição do solvente- Desta maneira, as transformações ficam geralmente completas, a 50^QC, após 2 a 8 horas. A seguir, o produto de reacção é isolado e pode ser recristalizado- Também e possível fazer uma purificação cromatográfica- Os rendimentos elevam-se, em geral, a mais de 50% do valor teórico, em relação ao digiicérido como produto de partida.

Os elevados rendimentos do produto desejado obtidos supreendem, dado que não se podia prever o decorrer sem dificuldades da reacção no sentido desejado, devido à presença de muitos grupos funcionais nos parceiros de reacção.

As fases a), b) e c) do processo acima indicadas são realizadas, de preferência, de maneira seguinte:

Fasea)

Misturam-se 10 ml de tricloroetileno e 6,6 g de POC1₃ (0,044 mol) em banho de gelo, a 0 a 5⁰C, com 0,04 rnol de um álcool da fórmula geral (II) dissolvido em 40 ml de tricloroetileno e 9 g de trietilamina- No caso do álcool ser um diacilglicerol, junta-se primeiro à mistura de acilação para evitar urna deslocação do acilo, 9 g de trietilamina em 10 ml de tricloroetileno, e imediatamente depois, o diacilglicerol em 30 ml de tricloroetileno. Para. a lavagem posterior utiliza-se 25 ml de tolueno. 0 banho de gelo é substituído por um banho a 20°C„ A reacção fica completa apõs 20 minutos, a 20°C.

F.s,se..„b)..

Adiciona-se, a 20°C, à mistura reaccional da fase a), 0,048 mol do composto (III) dissolvido, por exemplo, em 75 ml de tetra-hidrofurano e 13 g de trietilamina e utiliza-se 25 ml de tetra-hidrofurano para a lavagem posterior. A reacção fica completa após 20 minutos a 35°C. Faz-se uma filtração, lava-se em 50 ml de tolueno e coricentra-se. Faz-se uma hidrólise, pela adição de 30 ml de água gelada, 2 minutos depois 30 ml de acetato de sódio 1 M, e 2 minutos mais tarde, 90 ml de tetra-hidrofurano. A

515 Gil 1261

Ί7~

hidrólise fica completa ao fim de 12 horas resultado praticamente, apenas um unico produto.

Fase, c)

B. Dissolvem-se 0,04 mol do produto da fase b) (éster B-bromoetilico) em 90 ml de CHClg e misturam-se com 150 ml de isopropanol assim como com 200 ml de Ν,Ν,Ν,N-tetrametiletilenodiami- na a 40% em água.

Através do processo acima indicado são obtidos os compostos seguintes Nô. 1 a 8, abaixo descritos;;

J

1) c1oretc de 1,2-dImirístοι1-sn-g1icero-3-fosto-(N,N-dimetil-N-fN’,Ν’, N ’-trimeti1-etilamònio])-etilamón io, ^C40^H82^C1N2°8^p (785,5)

Detecção por comparação OC com o derivado de 1,2-dipalmitoílo (ver a substância 2)

2) cloreto de l,2-dipalmitoil-sn~glicero~3-fosfo~(N,N-dimetil~N-ΟΓ, N,N’-trimetil-etilamónio])-etilamónio, ^4₄Η₉₀01Ν₂0₈ ^Ρ (841,6) percentagem teórica: C, 62,79; H, 10,78; N, 3,33; P, 3,68 percentagem medida : 62,54; 10,71; 3,21; 3,67

3) cloreto de 1,2-diestearoíl-sn-glicero-3-fosfo-(Ν,Ν-dimetil-N~[N’,N^S,N’-trimetil-etilamónio])-etilamónio, ^C48^H98^C1N2°8^P (897,8)

Detecção por comparação DC com o derivado de 1,2-dipalmitoilo (ver a substância 2)

4) 1,2-dipalmitoíl-sn-glícero-3-fosfo-(N,N-dimetil-N~[Ν’,N’-dimeti 1-eti lamino]) -eti lamónio, ^C43^H87^N2°8^P (791,2) percentagem teórica: C, 65,28; H, 11,09; N, 3,54; P, 3,92 percentagem medida : 65,11; 11,02 3,47; 3,88

5) cloreto de 1,2-di-hexadecll-sn-glicero-3-fosfo~(N,N~dimeti1-N-fN’,Ν’,N’-trimeti1-etilamónio])-etilamónio,

515 (31 1261 •18 ^44^Η94^01Ν2⁰6^Ρ

Detecção por compa ração DC corri o derivado de 1. ,2-dípalmitoilo íver a substância 2)

6) cloreto de l,2-dioleil~rac-glicero-3-fosfo-(N,N~dimetil-N ~ [ N ’, N ’, N ’ - tri m etil-etila m i η o 3) - e t i 1 a rn o n i o, ^C48^H98^ClN2°6^P (865,8) percentagem teórica; C, 66,59; H, ±1,41; N, 3,24; P, 3,58 percentagem medida ; 66,41; 11,36; 3.19; 3.,45

7) cloreto de l,3-di-hexadecil-glicero-2-fosfo-(N,N-dímetí1-N[Ν’, N⁵, N ’ --1r imet i. 1 -et i 1 amón i. o 3) -et i 1 arnori io,

C 4 4 H 4 C1N 2 0 & i ·¹ ( tí 13,7 ) percentagem teórica; C, 64,95; H, 11,65; N, 3,44; P, 3,81 percentagem medida ; 64,“79; 11,59; 3,42; 3,69

8) cloreto de 1,3-dioleíl-rac-glicero-3-fosfo-(N,N-dimetil-N[Ν’ ,N’ ,N’~trimetilamino3)-etilamóriio) percentagem teórica; C, 66,59; H, 11,41; N, 3,24; P, 3,58 percentagem medida. ; 66,55; 11,40; 3,11 3,55

F.?.r.õ.du.Ç.ã.o. dos... compos tos... do.....grupo.....d.e.....lípidos.

Para o fabrico destes compostos esterificam-se os derivados de glicerol protegidos em N (N-Z ou N-BOCJ, em presença de DCC e dimetilaminopiridina, com diacilgliceróis ou dialquilgliceróis. Os grupos de protecção são eliminados cataliticamente através de hidrogénio (Pd/C para os derivados Z) ou sob condições ácidas (para os derivados 80C)» As aminas assim produzidas podem ser transformadas em derivados Ν,Ν-dimetilo ou N,N,N-trimetilo (para os derivados Ν,Ν-dimetilo; aldeído fórmico em presença de ácido fórmico; para os derivados Ν,Ν,Ν-trimetilo: através de permetilação por meio de sulfato dimetílico).

processo de fabrico é pormenorizado a seguir pelo exemplo da produção de um derivado de 1,2-dipalmitoíl-sn-3-glicerol: Acilação.;. dissolvem-se 1,2-dipalmitoí 1-sn-glicerona (0,1 mol) e N-a-Z-glicerol (0,12 rnol) em 200 ml de CH₂C1₂. A 20 a 25°C, adiciona-se gota a gota, sob agitação forte, uma solução de diciclo72 515 ΟΙ. 1261

•F 'tf»»

-19- - h e x i i c a r b o d i i m i d a (0,12 m o 1) e 4 - d i m e t ί 1 - a rn i η o p i r í d ϊ n a ( O, O 2 mol’! em 200 ml. de CH₂C1 ·;„·. A reacção acaba ao fim de 2 horas.. 0 resíduo (diciclo-hexxi-ureia) é filtrado e o filtrado é concentrado por centrifugação. 0 resíduo é submetido a uma cromatografia sobre silica-gel 60 (Merck 0,2 - 0,5). Como solventes obtiveram-se bons resultados com misturas de hexano/éter díisopropilico .1.0:1, 3:1, 2:1 e 1:1. 0 rendimento em hidrocloreto do ester de 1..2-dipalmitoil~sn-glicero-3-glicina eleva-se de 75 a 85¾. Éster d e 1, 2.....d 1 pa 1 m i t o i 1 - s n - gli c e r o - 3 - (N - <x - Ζ.1 - g l. i o i n a, ^C45^h/7^N08 f?dO,ili percentagem teórica: C, 71,11; M, 10,21: N, 1,84; 0, 16,84 percentagem medida : 70,99; 10,15; 1,78

S e ρ a r a ç âp.....ç a t a 1 .i t i c a.... dp.....grupo... de ....p rptecpâp ...Z.:..

Dissolve-se o éster de l,2~dipa.lmitail~sn-gIicero~3-(N~a~ -Z)-glicina (0,5 mol) em 400 ml de uma mistura de CHCl^/CHgOH/ /ácido acético glacial 300:80:20 (v/v). Após a adição de 5 g de catalisador- de Pd/C a 5%, agita-se em presença de H₂ até acabar a absorção de (absorção de cerca de 1,2 1 de H₂) - Faz-se uma extracção com água, libertando a fase de clorofórmio do solvente. 0 resíduo cristaliza-se após a adição de acetona. Os cristais são removidos por sucção e secos. Usando-se ;l,3~díací Iglíceróis como produto de partida, é possível obter derivados 1,3.

Ma produção dos compostos dialquilicos procede-se do mesmo modo. Os produtos de partida são, neste caso, os 1,2-dialquí1-gliceróis e 1,3-dialquil-gliceróis.

Meti lação.„do...„g.rupp_amino.:.

respectivo hidrocloreto do éster glicíníco (0,05 mol) é dissolvido em 400 ml de dioxano e 100 ml de aminoácido. Adiciona-se paraformaldeído (1 mol) e aquece-se durante 2 horas sob agitação e refluxo. 0 solvente é separado em vácuo e o resíduo precipitado com acetona. Obtém-se hidrocloreto do éster de 1,2-dipalmitoíl-sn~3-(N,M-dimetíl)-glicina, com um rendimento de cerca de 85 a 95%.

515 fâl 1261

Pe.rmet 1 lação.....cio.....grupo., amino ΰ respectivo hidrocloreto do éster gliciníco (0,05 mol) é dissolvido em 300 ml. de 2-propanol e 100 ml de CH^Cl^^ Mistura-se com sulfato dimeti lico (0,2 mol) e adiciona-se gota a gota, sob agitação, a 30 a 40°C, uma solução de K-^CQg (0,2 mol) em 200 ml de H<.0» Após a instilação continua-se a agitar, a 30°C, durante mais 60 minutos» Adicionam-se 500 ml de CMC 1 500 ml de agua e

O

600 rnl de CH^OH» Depois de forte agitação, elimina-se o solvente da fase de cloroformio e mistura-se o residuo com acetona» A massa cristalina branca è removida por sucção e seca. 0 rendimento em hidrocloreto do ester de l,2-dipalmitoii-sn-glícero-3~(N, N,N-trimetil-glicina eleva-se de 90 a 95%»

Os compostos NO» 9 a 14 indicados a seguir são produzidos de acordo com este processo»

9) éster de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-o-glicina, hidrocloreto» OgyHy^Ol NQ& 1.662,4) percentagem teórica: C, 67,09; H, 10,96; N, 2,12 percentagem medida ; 66,98; 10,93; 2,14 .10) éster de 1,2-dipalmitoíl~sri~glicero-3~N,N-dimetilglicina, hidrocloreto ^C39^H76^C1N06 C⁶⁹⁰’⁵) percentagem teórica: C, 67,84; H, 11,10; N, 2,03 percentagem medida : 67,71; 10,95; 2,02

11) éster de 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-N,N,N-trimetilglicina, cloreto,

C_4OH₇₈C1NO₆ (704,5) percentagem teórica: C, 68,19; H, 11,16; N, 1,99 percentagem medida : 68,07; 11,10; 1,87

12) éster de 1,2-di-hexadecíl-sn-glicero~3-N,N,N-trimetilglicina, cloreto ^C40^H82^C1N04 (⁶⁷⁶>6) percentagem teórica: C, 71,01; H, 12,22; N, 2,07 percentagem medida : 70,89; 12,14; 2,07

515 61 1261

-2113) ester de l„3-dioleil~glicero-2-N,N,N-trimetilglicina tO ,

_?,_k _ clore^C44^H86^ClN04 (728,6) percentagem teórica; C, 72,53; H, 11,90; N, 1,92 percentagem medida : 72,39; 11,85; 1,84

14) éster de 1,3-dio1eoi1-g1icero-2-Ν,Ν,N-1rimetilglicina, c1oreto, ^C44^HB2^C1N06 ' 756,594) percentagem teórica; C, 69,85; H, 10,93; N, 1,85 percentagem medida ; 69,78; 10,82; 1,81

P roces so....pa r a o f ab r i co.....decompostos do.....g.r u po.....de.....lípidos ;

Os lípidos são transformados, a partir de 3-bromo-l,2-propanodiol, por acilação, nos respectivos compostos diacílicos e a seguir aminados, Os respectivos compostos 1,3 são obtidos a partir de 1,3-diaci1-gliceróis, de modo em principio conhecido, em duas fases (mesilação, amínação), Compostos com cadeias éter obtêm-se, convenientemente, de modo em principio conhecido, através de 1,2-dialguil- ou 1,3-dialgui1-gliceróis; também neste caso realiza-se a reacção em duas fases, através de mesilação e aminação.

Para o fabrico dos derivados de 1,2-dipalmitoílo procede-se, por exemplo, de maneira seguinte;

Compostos.....dial çoi.l i.eps;.

Dissolvem-se 3-bromo~l,2~propanodíol (0,1 mol), ácido oleico (0,12 mol) e 4~dimetil~aminopiridina (0,02 rnol) em 200 ml de tetra-hidrofurano. A 10-20^0, adiciona-se gota a gota, sob forte agitação, uma solução de diciclo-hexilcarbodiimida (0,12 mol) em 200 ml de CH₂C1₂- A acilação fica completa ao fim de 2 horas. A diciclo-hexilureia formada é separada por filtração e o solvente é eliminado em vácuo. 0 produto é purificado por cromatografia (ver os compostos do grupo B, acilação). Obtém-se 3-bromo~dipal~ mitoí1-1,2-propanodiol com um rendimento de 85 a 95%.

^C35^H67^Br04 (631,821) percentagem teórica: C, 66,54; H, 10,69;

percentagem medida : 66,46; 10,61

515 GI 1261

Compostos arn:i ηados:

Aquece-se 3-bromo-d i pa1m i to i1-1

500 ml do uma mistura de solventes aquosa de amoníaco a 25%, 100;400:100

2-pr op an odiol (0,1 mo1) em - C H C1~_s / 2 - p r o p a n o 1 / s o 1 u ç a o (v/v) - durante 2.4 horas, a ’C solvente e eliminado em vácuo e o residuo é misturado oom

300 ml de CHClv. 300 ml de HCl 0,5 N e 400 ml. de metanol» Agita•w¹

-se bem e separa-se a fase inferior.. Apos a eliminação do solvente, faz-se uma cromatografia sobre sílica-gel 60 (Merck 0,2 -0,5)» Para a. cromatografia utilizam-se misturas de solventes: CHCl^/CH^OH/H^O 500:500:40 (v/v).. 0 rendimento em hidroçloreto de

1,2-dipalrni toi 1-1,2-p ropanodiol-3-arni no é cerca de 60%, em relação ao derivado 3-bromo,

Do mesmo modo realiza-se a produção dos hidrocloretos de N-metilamino, hidrocloretos de Ν , N-dimetilamino, cloretos de Ν,Ν,Ν,-trimetilamónio por aquecimento de 0,1 mol do composto de partida em 600 ml de uma mistura de CHCl^/2-propanol/solução aquosa de metilamina, dimetilamina ou trimetilamina a 40% 100:400:100 (v/v) durante 24 horas, a Sú^C. 0 tratamento posterior realiza-se como foi descrito para a transformação com amoníaco.

Mesta mistura de solventes podem ser transformadas também outras aminas nos respectivos lípidos com carga positiva, por exemplo dimetilaminoetanol, etc. (ver também a lista das substâncias preparadas).

De acordo com o processo acima indicado compostos MO. 15 a 22.

foram produzidos os

15) hidroçloreto de 1,2-dipalmitoíl-l,2-propariodiol-3-amino C₃₅H_?OC1MO₄ (604,4) percentagem teórica: C, 69,55; H, 11,67; M, 2,32 percentagem medida : 69,41; 11,63; 2,26

16) cloreto de l,2-dioleoil-l,2-propanodiol-3-M,M,N-trimetilamóri io ^C42^H8O^C1N04 (698,6)

515 GI 126.1

.....23percentagem teórica: C, 72,22; H, 11,54; N, 2,01 '' ’ percentagem medida : 72,03; 11,48; 1,89

17) c 1 o r e t o d e 1,2 - ci i-hexadecil -1, 2 - p r ο ρ a η o d i o 1 - 3 - N, N, N - t r i m e tilarnónio

C-«oHcnC 1 N0z> (618»5) percentagem teórica: C, 73,79; H, 13,04; N, 2.27 percentagem medida : 73,65; 13,01; 2,15

18) cloreto de 1,2-dίpa1mito i1-1,2-propaηodio1-3-N,N,N-tr imeti lamonlo | C₃₅H_y6ClN0₄ (646,5) percentagem teórica; C, 70,60; H, 11,85; N, 2,17 percentagem medida : 70,38; 11,76; 2,11

19) Η í d roo1o reto de 1,2-d i pa1m i to i1-1,2-propanod í ol-3-N,N-d i metilamino

C₃₇H₇₄C1NO₄ (632,5) percentagem teórica: C, 70,27; H, 11,79; N, 2,22 percentagem medida ; 70,21; 11,72; 2,19

20) cloreto de l,2~di-hexadecil-l,2~propanodiol~3~N,N~dimetíl-N-hidroxietilamónio ^C39^H82^C1N03 (648,5) percentagem teórica: C, 72,23; H, 12,75; N, 2,1.6 percentagem medida : 72,11; 12,66; 2,09

21) cloreto de 1,2-d ί o1eo i1-1,2-p ropaη od ί o1-3-N,N-d í meti1- N-hidroxietilamónio ^C43^H82^ClN05 (728,6) percentagem teórica: C, 70,89; H, 11,35; N, 1,92 percentagem medida : 70,64; 11,31; 1,89

22) cloreto de 1,2-dioleíl-l,2~propanodíol-3--N,N~dimetil-N~ -h i drox i eti1amõn i o ^C43^H86^C1N03 (700,6) percentagem teórica: C, 73,72; H, 1.2,37; N, 2,00 percentagem medida : 73,68; 1.2,25; 2,02

515

Gl 1261

-24Produção...de......1 ipossomas ....yazi os.....de...acordo...com. o ...invento;..

Produzem-se os lipossomas PPGPC/N⁺/Chol (50/10/40) de acordo cora o invento, indicados na tabela i.

Dissolvem-se PPGPC (5 mmol), cloreto de l,2-dí-hexadecil~ -rac-glicero-3-fosfo-(N,N-dimeti1~N~[N^β,Ν”,N*-trimetileti1-aminoj)-etilamônio (1 mmol) e colesterol (4 mmol) em 50 ml de CH^Cl^. ou 50 ml de CHCl^, com aquecimento, para se obter uma mistura homogénea dos três componentes.. 0 solvente é eliminado em vacuo e a película de lípidos finamente dispersos é misturada com 250 ml de solução tampão aquosa (podem ser utilizadas quaisquer soluções fisiologicamente utilizáveis)» A seguir, a mistura é mantida, sob rotação lenta, durante 60 minutos a 50’C (em geral, cerca de 5°C acima da temperatura de transformação principal dos lípidos)-

A suspensão de lípidos pré-aquecida coloca-se a seguir na câmara de pressão de uma French-Press (da empresa Amico, Silver Spring, Estados Unidos)» A French-Press consiste numa prensa hidráulica e numa câmara de pressão em aço, estandardizada, com um volume de enchimento máximo de 40 ml» Depois de se fechar a câmara de pressão, a pressão é aumentada para 1,38 x 10^ kPa (20 000 psi) e a suspensão de lipossomas é forçada, sob pressão constante, através duma saída estreita» Este processo repete-se, pelo menos, três vezes» Após uma centrifugação da dispersão de lipossomas (Sorvall RC-5B: 5°C, 30 minutos a 27 000 g), a solução sobrenadante é separada do sedimento» Ela contém os lipossomas que estão a partir de agora à disposição para as diversas experiências »

Produção de lipossomas de acordo com o invento que contêm uma substância activa, solúvel em ãgua, a ser transportada para o fígado»

Dissolvem-se PPGPC (5 mmol), cloreto de 1,2-di-hexadecil-rac-glicero-3-fosfo-(N,N~dimetil~CN’,N’„N’-trimetiletil-aminoj)-etilamónio (1 mmol) e colesterol (4 mmol) em 50 ml de CH₂C1₂ou 50 ml de CHC1₃, com aquecimento, para se obter uma mistura homogénea dos três componentes» 0 solvente é eliminado em vácuo e

72- 515 (31. Γ/6..1

X.

-25</ 6' ......

a película de lípidos finamente dispersos e misturada Com 250 ml de solução tampão aquosa (podem ser utilizadas quaisquer soluções fisiologicamente utilizáveis). A sequír, a mistura e mantida, sob rotação lenta, durante 60 minutos a 50 C (em geral, cerca de 5^VC acima da temperatura de transformação principal dos lípidos).

A suspensão de lípidos pre-aquecida coloca-se a seguir na câmara de pressão de uma Frerich-Press (da empresa Amico, Si. 1. ver Spring., Estados Unidos). A “F r ench-Pr ess consiste numa prensa hidráulica e numa câmara de pressão em aço, estandardizada, com um volume de enchimento máximo de 40 ml. Depois de se fechar a câmara de pressão, a pressão é aumentada para 1,38 x .10 kPa (20 000 psí) e a suspensão de lipossomas e forçada, sob pressão constante, através duma saida estreita. Este processo repete-se, pelo menos, três vezes. Apõs uma centrifugação da dispersão de lipossomas (Sorvall. RC-5B: 5°C, 30 minutos a 27 OCO g), a solução sobrenadante é separada do sedimento. Ela contém os lipossomas que estão a partir de agora â disposição para as diversas experiências.

A esta suspensão de lípidos são adicionados 50 ml de uma solução de cloreto de sódio 0,9¾ que contém MAF (factor de activação de rnacrófagos) numa concentração proteica de 70 pg/ml. Esta mistura é tratada, por analogia com a produção dos lipossomas vazios, na câmara de pressão. Após a centrifugação subsequente, a solução sobrenadarite é separada do sedimento e sujeita a uma cromatografia sobre gel de Sepharose C1-4B (LKB-Pharmacia, comprimento do leito de gel 70 cm). Através disso separa-se. nitidamente, o MAF nâo incluido nos lipossomas de acordo com o invento do MAF incluído. Este último necessita, devido ao tamanho dos lipossomas, de urn volume de eluição nitidamente mais reduzido do que o MAF não incluído (MW 30 000). Para a aplicação, os lipossomas são concentrados e filtrados sob condições estéreis.

Claims

1 - Processo para a produção de lipossomas» contendo, pelo menos, 1¾ mol de urn composto que apresenta uma carga positiva excedente, da fórmula geral (Ij

CH₂ - O - R_;i

I

CH - 0 - R₂

I (CH - 0 - R)_n1 ch₂ - r₃ na qual R_x significa alcoílo ou alquilo, possuindo, cada um, 14 a 18 átomos de carbono, oleoílo ou oleilo,

R₂ tem o mesmo significado que R_x (não sendo Rj, no entanto, necessariamente igual, a R₂) e, além disso, PNN

0 ch₃ ch₃ t I ⁺ t +

PRN ~ ” p-o~ch₂~ch₂~n~ch₂'~ch₂-n~ch₃ ! 1 ~ I

0” 0Η_Λ CfU ou Gly

Gly - -C-CH₂-CH₂“A+, na qual A pode significar ~NH₃+, ~NH₂CH₃+, -NH(CH₃)₂+, ou N(CH₃)₃+,

R₃ significa -O-R^, -O-PNN, -Ο-Gly, NH₃+, HH₂CH₃+, NH(CH₃)₂+ ou N(CH₃)₃t,

R tem um dos significados que foram indicados para R₂, R₂ ou R₃, e n significa um número inteiro de 0 a 3, com a condição da molécula conter um dos grupos com carga positiva, mencionados, caracterizado por se adicionar, pelo menos, 1% mol de um composto da fórmula geral (I), juntamente com outros componentes 1ipossómicos, numa quantidade que se eleva, no total, incluindo o ιί'ί 7'

GI 1261 /' /

- fes #'^:' composto da fórmula, geral (I), a 1,00% mol, a uma suspensão de lipidos, por se aquecer esta suspensão de lipidos, e por se s u b m e t e r , e m s e g u i d a, a s u s p e n s ã o d e '1 i ρ í d o s a s s i η ι p r é - a q u e c i d a,

compressão e centrifugação, de maneira a obter lipossomas. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1., ca racte r i zado r, na formula (1), n ser 0„ 3 - Processo de acordo com a reivindicação I ou 2, caracte-

rizado por se adicionarem J, a 30% mol de um composto da formula

I ' Γ lí CÍ de acordo com a reivindicação i ou 3, caracterizado por se adicionarem 5 a 15% mol de um composto da fórmula (I) .

5 - Processo de preparação de um preparado farmacêutico para o tratamento de doenças do fígado, contendo uma ou várias substâncias activas, incluídas em lipossomas, a serem transportadas para o fígado, contendo os lipossomas pelo menos, 1% mol de compostos que apresentam uma carga positiva excedente, da fórmula geral (I) apresentada na reivindicação 1, onde R_L, R₂, Rg e n têm o© significado© indicados na reivindicação 1, caracterizado por se proceder de acordo com a reivindicação 1, de modo a obterem-se lipossomas contendo, pelo menos, 1% mol de um composto de fórmula geral (I), e por se dissolver, com o fim de incluir substâncias activas não solúveis em ãgua, a substância activa juntamente com os lipidos, e por se misturar, com o fim de incluir substâncias solúveis em agua, a película de lipidos com uma solução tampão aquosa que contém a substância activa solúvel em água.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por na formula (1), n ser 0.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado por os lipossomas conterem 1. a 30% mol de um composto da fórmula (I).

72 515 ΚΙ 1261

-288 - Processo de acordo com uma das reivindicações 5 caracterizado por os lipossomas conterem 5 a 15«; mol d© um posto de formula (I).