PT939763E

PT939763E - Recombinação dirigida de adn medida por troca

Info

Publication number: PT939763E
Application number: PT97917548T
Authority: PT
Inventors: Aya Jakobovits
Original assignee: Japan Tobacco Inc; Amgen Fremont Inc
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2006-12-29
Also published as: JP3789486B2; ES2270456T3; US5714352A; DE69736486D1; US6395515B1; CA2248543A1; US5985615A; AU714915B2; CA2248543C; DK0939763T3; KR100514560B1; JP2000511768A; EP0939763A1; AU2583997A; US20030190751A1; EP1714971A2; WO1997034912A1; KR20000064714A; EP0939763A4; DE69736486T2

Description

ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ DESCRIÇÃO "Recombinação dirigida de ADN mediada por troca"

Campo da invenção A presente invenção refere-se no geral a métodos e composições para utilização em tecnologia de ADN recombinante, em particular em métodos para a manipulação de sequências de ADN que codificam para anticorpos, proteínas ou suas porções.

Antecedentes da invenção A unidade estrutural básica de imunoglobulina (Ig) nos sistemas vertebrados é composta por duas cadeias polipeptídicas "leves" idênticas (de aproximadamente 23 kDa) e duas cadeias "pesadas" idênticas (de aproximadamente 53 a 70 kDa) . As quatro cadeias estão ligadas por ligações dissulfureto numa configuração em "Y" e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas por ligações dissulfureto covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas de células B, ou outros tipos de células.

Na Figura 1 é apresentado um esquema da estrutura geral de um anticorpo. As cadeias leve e pesada são, cada uma, compostas por uma região variável na extremidade N-terminal e uma região constante na extremidade C-terminal. Na cadeia leve, a região variável (designada por "VLJL") é composta por uma região variável (VL) ligada através da região ligante (JL) à região constante (CL). Na cadeia pesada, a região variável (VhDhJh) é composta por uma região variável (VH) ligada através de uma combinação da região de diversidade (DH) e da região ligante (JH) à região constante (CH) . As regiões VLJL e VHDHJH das cadeias leve e pesada, respectivamente, estão associadas nas pontas do Y para formar a porção de ligação ao antigénio do anticorpo e determinar a especificidade de ligação ao antigénio. A região (CH) define o isotipo do anticorpo, i.e., a sua classe ou subclasse. Os anticorpos de diferentes isotipos diferem significativamente nas suas funções efectoras, tais como a capacidade de activar o complemento, ligar-se a 2 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ receptores específicos (e.g. receptores de Fc) presentes numa grande variedade de tipos de células, atravessar barreiras mucosas e placentares e formar polímeros da molécula básica de IgG de quatro cadeias.

Os anticorpos são classificados em "classes" de acordo com o tipo de CH utilizada na molécula de imunoglobulina (IgM, IgG, IgD, IgE, ou IgA) . Há pelo menos cinco tipos de genes CH (Cp, Cy, Cô, C8 e Ca) e algumas espécies (incluindo humanos) têm múltiplos subtipos de CH (e.g., Cyi, Cy2, Cy3 e Cy4 em humanos). Há um total de nove genes Ch no genoma haplóide dos humanos, oito no ratinho e rato, e menos alguns em muitas outras espécies. Pelo contrário, há normalmente apenas dois tipos de regiões constantes de cadeia leve (CL) , capa (K) e lambda (λ) e apenas uma destas regiões constantes está presente numa única proteína de cadeia leve (i.e., há apenas uma região constante de cadeia leve possível para cada VlJl produzido). Cada classe de cadeia pesada pode ser associada com qualquer uma das classes de cadeia leve (e.g., uma região CHy pode estar presente no mesmo anticorpo, quer como cadeia leve K ou λ) , embora as regiões constantes das cadeias pesada e leve numa classe particular não variem com a especificidade para o antigénio (e.g., um anticorpo IgG tem sempre uma região constante de cadeia pesada Cy, independentemente da especificidade para o antigénio do anticorpo).

Cada uma das regiões V, D, J, e C das cadeias pesada e leve são codificadas por sequências genómicas distintas. A diversidade dos anticorpos é criada por recombinação entre os diferentes segmentos de genes de VH, DH, e JH na cadeia pesada e os segmentos de gene de VL e JL na cadeia leve. A recombinação dos diferentes genes de VH, DH e Jh é realizada por recombinação do ADN durante a diferenciação de células B. Em resumo, a sequência de cadeia pesada recombina-se primeiro para produzir um complexo DhJh e em seguida um segundo fenómeno de recombinação produz um complexo VhDhJh· Produz-se uma cadeia pesada funcional por transcrição seguida de splicing da molécula transcrita de ARN. A produção de uma cadeia pesada funcional desencadeia a recombinação nas sequências de cadeia leve para produzir uma região VlJl 3 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ rearranjada que por sua vez forma uma região VLJLCL funcional, i.e., a cadeia leve funcional.

Durante a diferenciação de células B, a progénie de uma única célula B pode trocar o isotipo de imunoglobulina expresso de IgM para IgG, ou outra classe de imunoglobulina, sem alterar a especificidade para o antigénio determinada pela região variável. Este fenómeno conhecido como troca de classe de imunoglobulina é acompanhado por rearranjo de ADN que ocorre entre regiões de troca (S) localizadas 5' em relação a cada gene de CH (excepto para Cy) (revisto em Honjo (1983) Annu. Rev. Immunol. 1:499-528, e Shimizu & Honjo (1984) Cell 36:801-803). A recombinação S-S leva o exão VhPhJh para a proximidade do gene CH a ser expresso, por eliminação dos genes CH intervenientes, localizados no mesmo cromossoma. O mecanismo de troca de classes é dirigido por citóquinas (Mills et al. (1995) J. Immunol. 155:3021-3036). As regiões de troca variam em tamanho de 1 kb (Se) a 10 kb (Syi) e são compostas por repetições dispostas umas a seguir às outras que variam quer em comprimento, quer em sequência (Gritzmacher (1989) Crit. Rev. Immunol. 9:173-200). Foram caracterizadas várias regiões de troca, incluindo as regiões de troca Sp, Se, Sa, sy3, syl, Sy2b e sy2a de murídeo e as regiões de troca Sp humanas (Mills et al. (1995) supra; Nikaido et al. (1981)

Nature 292:845-8; Marcu et al. (1982) Nature 298:87-89; Takahashi et al. (1982) Cell 29:671-9; Mills et al. (1990)

Nucleic Acids Res. 18:7305-16; Nikaido et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:7322-29; Stanton et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:5993-6006; Gritzmacher (1989) supra; Davis et al. (1980)

Science 209:1360; Obata et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:2437-41; Kataoka et al. (1981) Cell 23:357; Mowatt et al. (1986) J. Immunol. 136:2674-83; Szurek et al. (1985) J.

Immunol. 135:620-6; e Wu et al. (1984) EMBO J. 3:2033-40).

As observações de que uma única célula B pode expressar mais do que um isotipo em simultâneo na sua superfície não é explicada pelo mecanismo de troca de classes, uma vez que a recombinação S-S é limitada à recombinação intracromossómica e resulta na eliminação do gene CH modificado. Foi descrito um segundo mecanismo, designado por trans-splicing, em que duas moléculas transcritas produzidas a partir de diferentes cromossomas são ligadas para formar uma única molécula 4 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ transcrita contínua (Shimizu et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1385-1393). Verificou-se que os ratinhos transgénicos que transportam um gene μ de cadeia pesada VHDHJH expressável, rearranjado, integrado fora do locus de IgH de ratinho produzem ARNm com a região VHDHTH do transgene correctamente organizada por splicing na região CH endógena. Tal como com a recombinação S-S, a frequência do trans-splicing é baixa e os factores que regulam ambos os mecanismos não são bem compreendidos. 0 valor e potencial dos anticorpos como reagentes de diagnóstico e terapêuticos são reconhecidos desde há muito tempo na arte. Infelizmente, este campo tem sido bloqueado pelos processos lentos e tediosos necessários para produzir quantidades elevadas de um anticorpo com a especificidade desejada. As técnicas de fusão celular clássicas permitiram a produção eficiente de anticorpos monoclonais por fusão de células B que produzem o anticorpo com uma linha celular imortalizada. A linha celular resultante é designada por linha celular de hibridoma. No entanto, a maioria destes anticorpos monoclonais são produzidos em sistemas de murídeo e são reconhecidos como proteínas "estranhas" pelo sistema imunitário humano. Assim, o sistema imunitário do paciente desencadeia uma resposta contra os anticorpos que resulta na neutralização e eliminação dos anticorpos e/ou em efeitos secundários potencialmente graves, associados com a resposta imunitária anti-anticorpo.

Uma abordagem a este problema tem sido desenvolver anticorpos monoclonais humanos ou "humanizados", que não são tão facilmente "reconhecidos" como epítopos estranhos e evitam uma resposta imunitária anti-anticorpo no paciente.

As aplicações de anticorpos monoclonais produzidos por hibridomas de células B humanas tem um potencial promissor no tratamento de cancro, infecções microbianas e virais, imunodeficiências de células B associadas com uma produção de anticorpos anormalmente baixa, doenças auto-imunes, inflamação, rejeição de transplantes e outros distúrbios do sistema imunitário e outras doenças. No entanto, vários obstáculos continuam a impedir o desenvolvimento destes anticorpos monoclonais humanos. Por exemplo, muitos antigénios 5 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ de tumor humanos podem não ser imunogénicos em humanos e, assim, poderá ser difícil isolar células B humanas que produzem anticorpos contra antigénios humanos.

As tentativas para resolver os problemas associados com anticorpos para agentes terapêuticos humanos têm utilizado técnicas de ADN recombinante. A maioria destes esforços tem-se focado na produção de anticorpos quiméricos com uma região CH humana e regiões de combinação (variáveis) com o antigénio, não humanas (e.g. de murídeo). Estes anticorpos quiméricos são geralmente produzidos por clonagem da região variável e/ou constante do anticorpo desejada, combinação das sequências clonadas numa única construção que codifica para todo ou para uma porção de um anticorpo quimérico funcional tendo as regiões variável e constante desejadas, introduzindo a construção numa célula capaz de expressar anticorpos e seleccionando as células que expressam o anticorpo quimérico de forma estável. Alternativamente, o anticorpo quimérico é produzido por clonagem da região variável ou região constante desejada, introduzindo a construção numa célula produtora de anticorpos e seleccionando as células produtoras de anticorpos quiméricos que resultam da recombinação homóloga entre a região variável desejada e a região variável endógena, ou a região constante desejada e a região constante endógena. Exemplos de técnicas que se baseiam em técnicas de ADN recombinante, tais como as descritas acima para produzir anticorpos quiméricos, estão descritas na publicação PCT N° WO 86/01533 (Neuberger et ai.), e nas patentes U.S. Nos 4816567 (Cabilly et al.) e 5202238 (Fell et ai.). Estes métodos requerem a transferência de ADN de uma célula para outra, removendo-a assim do seu locus natural, e requerem portanto a manipulação cuidadosa do ADN in vitro para assegurar que a construção final que codifica para o anticorpo é funcional (e.g., é capaz de transcrição e tradução do produto de gene desejado). Há uma necessidade clara neste campo de um método para a produção de uma proteína ou anticorpo desejado que não necessite de múltiplos passos de clonagem, seja mais eficiente que a recombinação homóloga convencional e possa ser realizado em células de hibridoma. 6 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a um método para substituir uma sequência de ADN por outra utilizando regiões de troca (S) derivadas de um gene de imunoglobulina (Ig) . 0 método da invenção permite que quaisquer dois pedaços de ADN sejam "trocados", ou que um pedaço de ADN exógeno seja inserido num sitio que contém uma região S natural ou artificial. Assim, o método da invenção permite que ocorra a recombinação directa e elimina muitos dos passos de clonagem necessários nos métodos de ADN recombinante actuais.

No método da invenção, a recombinação dirigida é realizada entre uma construção dirigida para um alvo e um locus alvo. A construção de ácido nucleico dirigida para um alvo compreende: a) uma única região de troca; b) um promotor heterólogo em relação à região de troca, em que o promotor está ligado operativamente a, e 5' em relação à região de troca; e c) uma sequência modificadora heteróloga, ligada operativamente a, e 3' em relação à região de troca, em que a sequência modificadora codifica para uma região constante de uma cadeia pesada de anticorpo humano, em que a região constante é seleccionada de entre Cy, Cp, Ca, Cô e Ce.

Por exemplo, um ADN exógeno que codifica para a região constante ou variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo pode ser trocado com a região constante ou variável de uma sequência endógena para criar uma sequência que codifica para um anticorpo com uma região constante ou variável diferente. Num sentido mais amplo, o método da invenção é amplamente aplicável para manipular sequências de ADN para a produção de uma proteína ou componente proteico desejado, incluindo a produção de anticorpos quiméricos com uma região variável desejada ligada a um polipéptido não-anticorpo (e.g. um marcador polipeptídico detectável, ou um polipéptido com uma actividade desejada) 7 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Num aspecto, a invenção refere-se a um método para a recombinação mediada por troca, em que o método compreende os passos de: a) introduzir uma construção dirigida para um alvo numa célula B ou hibridoma de célula B, em que a construção dirigida para um alvo compreende uma região de troca da construção dirigida para um alvo e um promotor (Pi) ligado operativamente a, e 5' em relação à região de troca da construção dirigida para um alvo, e em que a célula compreende um locus alvo compreendendo uma região de troca do locus alvo, uma sequência alvo adjacente a, e 3' em relação à região de troca do locus alvo e um promotor (P2) posicionado operativamente dentro do locus alvo, para se obter a transcrição da região de troca do locus alvo e da sequência alvo; e b) cultivar a célula para permitir a transcrição do locus alvo e da construção dirigida para um alvo, promovendo desse modo a recombinação entre a região de troca do locus alvo e a região de troca da construção dirigida para um alvo; e c) seleccionar uma célula compreendendo um locus alvo modificado compreendendo o promotor Ρχ da construção dirigida para um alvo, uma região de troca e a sequência alvo. em que Ρχ, a região de troca e a sequência alvo estão ligadas operativamente e em que a sequência alvo está sob o controlo de Ρχ.

Noutra concretização, a construção dirigida para um alvo (Ρχ-Sx-M) é composta por um promotor (Ρχ) , uma região de troca (Sx) e uma sequência modificadora (M), e o locus alvo (P2-S2-T) é composto por um promotor (P2) , uma região de troca (S2) que ocorre naturalmente ou inserida artificialmente e uma sequência alvo (T) . A recombinação S-S dirigida entre regiões S-S resulta em duas sequências de produto de recombinação possíveis, uma tendo o promotor Ρχ da construção dirigida para um alvo, uma região de troca contendo sequências de ADN de uma ou ambas as regiões Sx e S2 e a sequência T (Px-Sx/S2-T) e uma segunda sequência tendo um promotor P2, uma região de troca contendo sequências de ADN de uma ou ambas as regiões Sx e S2 e a sequência M (Px-Sx/S2-M) . Nesta concretização, as células 8 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ que expressam a sequência M são seleccionadas por métodos conhecidos na arte, incluindo análise de transferência Southern ou Northern.

Numa terceira concretização, a construção dirigida para um alvo (Pi-Z-Si-M) é composta por um promotor (Pi) , sequências de ADN 5' em relação à região de troca (Z), a região de troca (Si) e uma sequência modificadora (M) . 0 locus alvo (P2-S2-T) é composto por um promotor (P2) , uma região de troca (S2) que ocorre naturalmente ou inserida artificialmente e uma sequência alvo (T). A recombinação S-S dirigida entre as regiões de troca resulta numa sequência de ADN com o promotor Pi da construção dirigida para um alvo, as sequências de ADN de Z, uma região de troca contendo sequências de ADN de uma ou ambas as regiões de troca e a sequência T ou M (Pi-Z-Si/S2-T ou P1-Z-S1/S2-M). 0 locus alvo é uma sequência de ADN com uma região de troca e pode ser uma sequência que ocorre naturalmente, nativa (e.g. um locus de Ig de uma célula produtora de anticorpos), um locus Ig rearranjado, ou uma sequência de ADN produzida de forma recombinante, inserida artificialmente num sitio desejado. 0 locus alvo pode ser, ou um elemento extracromossómico, ou um elemento cromossómico integrado de forma estável. De preferência, o locus alvo codifica para um gene de cadeia pesada de anticorpo. A construção dirigida para um alvo é, ou um elemento extracromossómico, ou um elemento cromossómico integrado de forma estável. Quando o locus alvo é um gene de cadeia pesada de anticorpo, a sequência modificadora da construção dirigida para um alvo codifica de preferência para uma região constante de cadeia pesada diferente ou modificada, ou uma sequência não-anticorpo de interesse (e.g., um marcador polipeptídico detectável, uma enzima, uma toxina ou um factor de crescimento). A invenção proporciona um método para modificar uma sequência de ADN por recombinação S-S dirigida. A invenção permite que a recombinação do ADN seja dirigida para qualquer sitio que contenha uma região de troca que ocorre naturalmente, ou uma região de troca sintética, incluindo um sitio no qual foi inserida artificialmente uma região S. 9 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ A invenção proporciona um método para substituir ou modificar uma primeira sequência de ADN (uma sequência alvo) com uma segunda sequência de ADN (uma sequência modificadora) sem a necessidade de isolar a sequência de nucleótidos que contém a sequência alvo, excisando a sequência alvo e ligando a sequência modificadora no lugar da sequência alvo. A invenção também proporciona um método para substituir porções de sequências que codificam para um polipéptido com uma sequência de aminoácidos heteróloga, em que o polipéptido é composto por dois componentes distintos (e.g. um componente N-terminal e um componente C-terminal) que, por exemplo, conferem ao péptido caracteristicas funcionais ou estruturais distintas (e.g. ligação ao ligando ou ligação à célula). Por exemplo, a invenção permite a substituição quer da porção N-terminal com uma sequência que codifica para aminoácidos heteróloga, diferente, ou a porção C-terminal com uma sequência que codifica para aminoácidos heteróloga, diferente. A recombinação dirigida mediada por troca permite que a recombinação ocorra numa região específica, pré-seleccionada, com uma eficiência aumentada em relação ao mecanismo que ocorre naturalmente, que é limitado à cadeia pesada da imunoglobulina. 0 método da invenção remove a recombinação mediada por troca das limitações do seu meio ambiente regulador normal, permitindo que a recombinação seja controlada como necessário com, por exemplo, a utilização de promotores constitutivos ou indutíveis. A capacidade de realizar recombinação dirigida mediada por S in vitro evita a manipulação de ADN tediosa e morosa utilizando as técnicas de ADN recombinante convencionais, proporcionando ao mesmo tempo um método altamente eficiente para inserir uma sequência de ADN. Por exemplo, o método permite que a porção de marcador detectável das proteínas de fusão (e.g. β-galactosidase) seja facilmente trocada por uma sequência de aminoácidos diferente (e.g. fosfatase alcalina).

Numa aplicação específica do método da invenção, a recombinação S-S dirigida é utilizada para substituir a região constante de um gene de cadeia pesada de anticorpo com uma região constante diferente ou modificada, sem a necessidade de manipulação extensiva do gene de cadeia pesada de anticorpo. 10 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Além disso, ο método da invenção permite que o gene do anticorpo seja mantido no seu locus nativo.

Estes e outro objectos, vantagens e características da presente invenção serão evidentes para os peritos na arte, por leitura dos detalhes das composições, componentes da composição, métodos e passos do método da invenção, como descrito a seguir.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 é um esquema que mostra a estrutura básica de imunoglobulina. A Figura 3B é um esquema que mostra os componentes básicos de uma construção dirigida para um alvo, consistindo de um promotor (Pi) , região de troca (Si) e sequências modificadoras. A Figura 3D é um esquema que mostra os componentes básicos de uma construção dirigida para um alvo que consiste de um promotor (Pi) , sequências de ADN posicionadas 3' em relação ao promotor e 5' em relação à região de troca (Z) , região de troca (S i) e sequências modificadoras, que pode incluir componentes adicionais, tais como um gene marcador seleccionável e/ou um gene de amplificação. A Figura 4B é um esquema que ilustra a recombinação mediada por troca entre a construção dirigida para um alvo Pi-Si-M e o locus alvo P2-S2-T. A Figura 5 é um esquema de uma construção dirigida para um alvo da invenção (pTSW-1.4) que tem todo o locus γ2 humano de 23 kb (elementos de controlo 5', exão I, regiões de troca, sequências codificantes, exões de membrana e secretores, pplyA), sequência potenciadora 3' de ratinho, cassete de promotor/potenciador de CMV e marcador seleccionável de higromicina de SV2. A Figura 6 é um esquema de uma construção dirigida para um alvo da invenção (pTSW-1.9) com os elementos como descrito 11 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ na legenda da Figura 5, com a cassete promotor/potenciador de CMV na orientação oposta à de pTSW-1.4. A Figura 7 é um esguema de uma construção dirigida para um alvo da invenção (pTSW-2) tendo um fragmento BamHI de 12 kb clonado a partir do clone da linha germinativa γ2 humana de 23 kb (incluindo regiões de troca e a fase de leitura aberta de γ2 humana; o exão I e elementos de controlo 5' não estão incluídos), cassete promotor/potenciador de CMV gue fornece um sitio dador de splicing e marcador seleccionável de higromicina de SV2; o potenciador 3' de ratinho não está incluído. A Figura 8 é um esguema de uma construção dirigida para um alvo da invenção (pTSW-3.1) tendo 10 kb do fragmento de troca genómico γι de ratinho HindIII-EcoRI, clonado (os elementos de controlo 5', exão I e seguências de troca γΐ de ratinho), cassete de promotor de CMV (cassete de promotor de SFFV na série pTSW-3.2), clone genómico da fase de leitura aberta de J2 humana e aceitador de splicing, marcador seleccionável de higromicina SV2 e opcionalmente, a seguência potenciadora 3' de ratinho. A Figura 9 é um esquema de uma construção dirigida para um alvo da invenção (pTSW-3.lBglII) tendo 7,9 kb do fragmento de troca genómico γΐ de ratinho BglII-EcoRI (exão I e sequências de troca γΐ de ratinho; elementos de controlo 5' não incluídos), cassete de promotor de CMV (cassete de promotor de SFFV na série pTSW-3.2), clone genómico da fase de leitura aberta de γ2 humana e aceitador de splicing, marcador seleccionável de higromicina SV2 e, opcionalmente, a sequência potenciadora 3' de ratinho.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Deve ter-se em conta que, tal como utilizado neste pedido e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referências plurais, salvo se o contexto claramente indicar de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "uma sequência de ADN" inclui uma pluralidade de sequências de ADN e diferentes tipos de sequências de ADN. 12 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o significado que é normalmente entendido por um perito na arte a quem se dirige esta invenção. Embora se posam utilizar na prática ou teste da presente invenção muitos materiais ou métodos semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. As publicações discutidas acima são proporcionadas apenas para sua revelação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui deve ser entendido como uma admissão de que o inventor não está autorizado a antecipar esta revelação por motivos de invenção anterior.

DEFINIÇÕES 0 termo "artificial", tal como aqui utilizado, com "construção artificial" ou "região de troca artificial" e semelhantes, refere-se a um material natural isolado ou que não ocorre naturalmente, e.g. uma sequência de nucleótidos fabricada por intervenção humana, e.g. fundindo sequências naturais umas às outras, ou sintetizando quimicamente sequências naturais isoladas. 0 termo "região de troca" significa uma sequência de nucleótidos composta por sequências repetidas dispostas umas a seguir às outras que ocorrem na natureza 5' em relação à região constante de cadeia pesada de imunoglobulina e que funcionam na troca de classes intracromossómica, i.e. recombinação de sequências de ADN que codificam para porções específicas das regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina. Exemplos de sequências de regiões de troca específicas estão descritos em Mills et al. (1995) J. Immunol. 155:3021-3036 aqui incorporado especificamente como referência. "Região de troca" inclui quer sequências de troca de tamanho total de sequências de imunoglobulina nativas, quer sequências de nucleótidos recombinantes e sintéticas que são modificadas (e.g. contêm substituições, adições, mutações de nucleótidos e/ou outras modificações) em relação à região de troca da imunoglobulina nativa, com a condição de que a região de troca retém a sua função de facilitar a recombinação quando transcrita. 13 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Os termos "recombinação mediada por troca" ou "recombinação S-S dirigida" são utilizados de forma permutável para designar recombinação de ADN intercromossómica, intracromossómica ou extracromossómica facilitada por uma região de troca. Por exemplo, a recombinação S-S resulta da interacção de 1) uma primeira região de troca posicionada 3' em relação a um promotor (construção dirigida para um alvo) e 2) uma segunda região de troca posicionada 3' em relação a um promotor e 5' em relação a uma sequência de ADN (locus alvo) . Após activação da transcrição da primeira e segunda regiões de troca, ocorre recombinação entre as regiões de troca, resultando numa alteração da sequência de ADN do locus alvo. A recombinação S-S dirigida da invenção resulta na interacção entre sequências de ADN em dois cromossomas diferentes, no mesmo cromossoma, entre um cromossoma e um elemento extracromossómico, ou entre dois elementos extracromossómicos. 0 termo "construção dirigida para vim alvo" significa uma construção de ácido nucleico que é introduzida numa célula para originar recombinação S-S dirigida numa região de troca natural ou artificial. Uma construção dirigida para um alvo compreende no mínimo: 1) uma região de troca e 2) um promotor ligado operativamente a, e 5' em relação à região de troca. Opcionalmente, a construção dirigida para um alvo compreende ainda 3) uma sequência modificadora ligada operativamente a, e 3' em relação à região de troca. A construção dirigida para um alvo pode também compreender 4) uma ou mais sequências de ADN entre a região de troca e o promotor. Dependendo da construção dirigida para um alvo efectiva, utilizada, o ARNm resultante irá codificar para a região de troca, ou a região de troca e a sequência modificadora, ou a região de troca e as sequências de ADN entre a região de troca e/ou uma sequência modificadora. 0 termo "locus alvo" significa uma sequência de ácido nucleico que compreende no mínimo 1) uma região de troca, 2) uma sequência alvo adjacente a, e 3' em relação à região de troca e 3) um promotor posicionado operativamente no locus alvo para proporcionar a transcrição da região de troca e sequência alvo como um ou mais ARNm traduzíveis. 0 locus alvo pode conter também uma sequência de ADN adicional, posicionada adjacente a, e 5' em relação à região de troca; nestas 14 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ construções, ο promotor proporciona a transcrição da sequência de ADN adicional, a região de troca e a sequência alvo como um ou mais ARNm traduziveis. Os "loci alvo" podem, ou ocorrer naturalmente (e.g. um gene de imunoglobulina composto por uma região VDJ rearranjada, posicionada 5' em relação a uma região de troca e o gene CH) ou produzido de forma recombinante ou sintética e pode estar localizado no cromossoma ou extracromossomicamente. Um exemplo de sequência alvo compreende uma sequência promotora posicionada operativamente 5' em relação a uma região de troca, posicionada operativamente 5' em relação a uma sequência codificante que é, de preferência, uma sequência que codifica para uma região constante de um anticorpo humano. 0 termo "sequência alvo" significa a sequência de ácido nucleico adjacente a uma região de troca em que ocorre recombinação S-S dirigida. Numa concretização do método da invenção, uma sequência alvo é substituída pela sequência modificadora após recombinação mediada por troca. As "sequências alvo" podem ser sequências que ocorrem naturalmente, endógenas em relação a uma sequência cromossómica ou sequências recombinantes (i.e. uma sequência produzida utilizando manipulação genética recombinante) presentes como um elemento extracromossómica (e.g. um vector) ou como um elemento integrado de forma estável numa sequência cromossómica. As sequências alvo são adjacentes a uma região de troca que pode ser uma região de troca que ocorre naturalmente, ou pode ser uma região de troca inserida 5' em relação a uma sequência alvo desejada, por tecnologia de ADN recombinante. Exemplos de sequências alvo são diferentes da sequência modificadora e incluem sequências que codificam para uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de um isotipo, subtipo e/ou origem particular. 0 termo "locus de imunoglobulina (Ig)" significa uma sequência de nucleótidos que codifica para toda, ou uma porção da região constante e/ou região variável de uma molécula de anticorpo, incluindo todas ou porções das sequências reguladoras que controlam a expressão de uma molécula de anticorpo a partir do seu locus, ou os seus processos. Os genes de cadeia pesada nos loci de Ig incluem, mas não se limitam a todas ou uma porção das regiões VH, DH, JH e regiões 15 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ constantes, bem como as regiões de troca, sequências intrónicas e sequências flanqueadoras associadas com, ou adjacentes ao gene de cadeia pesada. Os loci de Ig para cadeias leves incluem, mas não se limitam a, regiões VL, JL e regiões constantes de ambos os alelos capa e lambda, sequências intrónicas e sequências flanqueadoras associadas com, ou adjacentes ao gene de cadeia leve. 0 termo "locus alvo modificado" significa uma molécula de ácido nucleico modificada por recombinação de ADN mediada por troca, de modo que a sequência alvo modificada é composta no mínimo por uma região de troca composta por sequências de troca derivadas da região de troca do locus alvo não modificado, ou de ambos, o locus alvo não modificado e a construção dirigida para um alvo. Numa concretização da invenção, o locus alvo modificado também é composto pelo promotor da sequência alvo não modificada, a primeira sequência de ADN da sequência alvo não modificada (quando presente no locus alvo original) e a sequência modificadora da construção dirigida para um alvo. A activação da transcrição pelo promotor resulta na transcrição da primeira sequência de ADN, a região de troca e a sequência modificadora num ou mais ARNm traduzíveis. 0 termo "promotor" significa uma sequência de nucleótidos que, quando ligada operativamente a uma sequência de ADN de interesse, promove a transcrição dessa sequência de ADN. 0 termo "marcador polipeptídico detectável" significa uma sequência de aminoácidos que, quando ligada de forma covalente a outra sequência de aminoácidos, proporciona uma sequência heteróloga que pode ser facilmente detectada. Por exemplo, o polipéptido pode ser detectado por ligação de um anticorpo especifico para um polipéptido, por meio de uma actividade enzimática do polipéptido, ou por reacção do polipéptido com um reagente químico. Exemplos de marcadores polipeptídicos detectáveis incluem β-galactosidase, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano, porções destas enzimas enzimaticamente activas ou qualquer sequência de aminoácidos que é imunodetectável e heteróloga em relação à sequência de aminoácidos com a qual está associada. 16 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Recombinação S-S dirigida (geral) Ο método de recombinação dirigida mediada por regiões de troca utiliza regiões de troca (e.g. as isoladas e derivadas de um locus de imunoglobulina) para facilitar a recombinação numa seguência de ácido nucleico especifica. A seguência de ácido nucleico à gual a recombinação S-S se dirige contém uma região S e é designada por "locus alvo", enquanto que a sequência de ácido nucleico introduzida que contém uma sequência de região S é designada por "construção dirigida para um alvo". A transcrição de cada região S permite que ocorra a recombinação S-S entre as duas regiões de ADN pré-seleccionadas. A presença de um promotor seleccionado proporciona a transcrição constitutiva ou indutivel, aumentando desse modo a frequência da ocorrência de recombinação S-S.

Os componentes básicos de um locus alvo exemplo adequado para utilização na invenção são ilustrados na Figura 2A. Os componentes minimos do locus alvo são (de 5' para 3'): 1) um promotor (P2 em que a seta indica a direcção da transcrição) , 2) uma região de troca (S2) e 3) uma sequência alvo (T) .

Alternativamente, o locus alvo pode também conter uma sequência de ADN adicional posicionada 3' em relação ao promotor e 5' em relação à região de troca (Y) (Figura 2B) . Independentemente da sua composição, os componentes do locus alvo estão posicionados de um modo que o promotor activa a transcrição da sequência de ADN 5' (opcional), região de troca e sequência alvo (opcional). 0 locus alvo pode ser uma sequência cromossómica que ocorre naturalmente, endógena (e.g. um locus de cadeia pesada de Ig, em que a sequência de ADN 5' é um gene VHDHJH e a sequência alvo é um gene CH) , ou uma sequência construída artificialmente (i.e., uma sequência produzida de forma recombinante, ou uma sequência sintetizada) que está presente quer como um elemento extracromossómico (e.g. um vector ou plasmídeo) , ou como um integrante cromossómico estável.

Os componentes básicos de um exemplo de construção dirigida para um alvo para utilização na invenção estão ilustrados nas Figuras 3A-3D. Os componentes mínimos da construção dirigida para um alvo são (de 5' para 3' ) : 1) um 17 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ promotor (Pi em que a seta indica a direcção da transcrição) e 2) uma região de troca (S) (Figura 3A). A construção dirigida para um alvo pode conter adicionalmente 3) uma sequência modificadora 3' em relação a S (Figura 3B) e/ou 4) uma ou mais sequências de ADN 5' em relação a S (Figura 3C) . Adicionalmente, a construção dirigida para um alvo pode incluir um marcador seleccionável (Figura 3D) . Os componentes da construção dirigida para um alvo estão posicionados de um modo que o promotor activa a transcrição das regiões de troca e sequência modificadora. A construção dirigida para um alvo é normalmente uma sequência de ácido nucleico produzida de forma recombinante ou sintética e pode ser utilizada no método da invenção, quer como um elemento extracromossómico (e.g. um plasmídeo ou vector), quer como integrante cromossómico estável. Exemplos de sequências modificadoras incluem o gene CH para utilização na troca de isotipo (i.e. substituição do gene Ch do locus alvo com um gene CH de um isotipo ou subtipo diferente). 0 mecanismo preciso através do qual a recombinação mediada por S intracromossómica (também designada por recombinação S-S) ocorre no fenómeno de troca de classes não é totalmente compreendido (para uma revisão sobre este assunto, veja-se Coffman et al., 1993, Adv. Immunol. 54:229-71). Sem estar cingido a nenhuma teoria especifica, a recombinação mediada por S que ocorre naturalmente é desencadeada pela transcrição simultânea de duas regiões de troca intracromossómicas (Xu & Stavnezer (1990) Develop. Immunol. 1:11-17; Rothman et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:1672-1679; Jung et al. (1993) Science 159:984-987). Por exemplo, numa célula que produz anticorpos IgM, o gene de cadeia pesada de IgM (que inclui uma região VHDHJH, uma região de troca (Sp) e um gene Cp) é transcrito e traduzido de forma constitutiva. A troca de classes (e.g., para produção de IgG) ocorre quando uma segunda região de troca (e.g., Sy) é transcrita. Pensa-se que a transcrição de uma segunda região de troca é regulada por elementos de controlo associados com cada uma das regiões de troca do locus Ch. Cada um destes elementos de controlo é activado por uma combinação diferente de sinais celulares (i.e., um ou mais sinais celulares) normalmente associados com citóquinas que podem ser activadas, por exemplo numa infecção microbiana ou inflamação (e.g., citóquinas tais como 18 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ interleucinas, interferões e factor de necrose de tumor). Por sua vez, a produção de sinais celulares está associada com tipos específicos de infecções e inflamação. Assim, um tipo específico de infecção ou inflamação resulta em: 1) produção de uma combinação específica de sinais celulares que por sua vez determinam 2) qual dos elementos de controlo da região de troca é activado e, como resultado, 3) que região de troca é transcrita para promover a recombinação da sua região CH associada com as regiões Sp e Cp transcritas de forma constitutiva, para produzir um isotipo de anticorpo específico, diferente (Coffman et al., 1993, supra). A presente invenção utiliza regiões de troca para proporcionar um método para dirigir a recombinação para sítios de interesse pré-seleccionados, de um modo que não é controlado pelos mecanismos de regulação celular normais, descritos acima. Como ilustrado nas Figuras 4A-4C, a recombinação S-S dirigida da presente invenção utiliza uma construção dirigida para um alvo contendo uma região de troca (Si) e um promotor (Pi) e um locus alvo contendo uma região de troca (S2) e uma sequência alvo (T) sob o controlo de um promotor (P2) para facilitar a recombinação específica do sítio de troca mediada pelas duas regiões de troca activadas na transcrição. 0 produto de recombinação resultante irá conter no mínimo uma região de troca com sequências de uma ou ambas as regiões de troca, e.g. Si ou Si/S2. Quando a construção dirigida para um alvo contém um promotor P1 e Si, o produto de recombinação desejado irá consistir do promotor Pi, da região de troca e da sequência alvo, agora sob o controlo de Pi, em vez de P2 (Figura 4A) . 0 produto de recombinação desejado é reconhecido de vários modos conhecidos na arte, incluindo PCR. Quando Pi é um promotor indutível, uma célula que contém o produto de recombinação desejado pode ser reconhecida por indução da transcrição. Quando a construção dirigida para um alvo consiste de Pi, Si e uma sequência modificadora, o produto de recombinação desejado irá consistir do promotor P2, da região de troca e da sequência modificadora que substitui a sequência alvo (Figura 4B). A região de troca pode conter sequências de uma ou ambas as regiões de troca, e.g., Si ou Si/S2. Quando a sequência modificadora codifica para uma proteína ou péptido, o produto de recombinação desejado pode ser reconhecido por síntese do produto desejado. 19 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Quando a construção dirigida para um alvo consiste de Pi, as sequências de ADN 5' em relação a Si e Si, o produto de recombinação desejado contém Pi e as sequências de ADN 5' em relação à região Si inseridas no locus alvo (Figura 4C) . 0 produto de recombinação desejado pode ser identificado de uma variedade de formas, incluindo detecção por PCR da presença das sequências de ADN 5' e/ou Pi, ou por tecnologias de imunodetecção.

Adicionalmente, a construção dirigida para um alvo pode ser utilizada para inserir um pedaço de ADN 3' em relação a um locus alvo contido num cromossoma especifico. Nesta concretização, a construção dirigida para um alvo transporta sequências homólogas que permitem a inserção no cromossoma seleccionado por recombinação homóloga. 0 cromossoma modificado resultante contém um ADN da construção dirigida para um alvo num sitio 3' em relação ao locus alvo. Esta concretização é útil para indução de recombinação mediada por S intracromossómica.

Regiões de troca A troca de classes (ou troca de isotipo) resulta quando os linfócitos B que expressam inicialmente IgM trocam o seu isotipo de cadeia pesada para IgG, IgA, ou IgE aquando da maturação. A troca de isotipo resulta de um fenómeno de recombinação de ADN de eliminação, em que a região constante 0μ da cadeia pesada, inicialmente localizada a jusante da região VhDhJh é substituída por regiões constantes CJ, Ca, ou Ce (Rabbitts et al. (1980) Nature 283:351; Davis et al. (1980) supra; Kataoka et al. (1981) supra.

Foram caracterizadas várias regiões de troca, incluindo Sp, Se, Soí, Sy3, SYl, Sy2b e SY2a e a região de troca Sp humana, tal como Sp e Sy4 (Mills et al. (1995) J. Immunol. 155:3021-3036, aqui incorporado especificamente como referência). A região Sp de murídeo tem cerca de 3 kb e pode ser dividida numa região 3' com sequências de [ (GAGCT) nGGGGT] m, em que n = 1-7 e m = 150 (Nikaido et al. (1981) supra), e uma região 5' em que estes dois pentâmeros estão entremeados com a sequência do pentâmero (C/T)AGGTTG (Marcu et al. (1982) supra). O locus Sp humano é ligeiramente diferente na medida em que a 20 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ sequência de heptâmero está distribuída ao longo da região (Takahashi et al. (1982) supra; Mills et al. (1990) supra).

Embora outras regiões de troca contenham padrões mais complexos de sequência repetida, todas as sequências de troca contêm cópias múltiplas das sequências pentaméricas GAGCT e GGGGT (Nikaido et al. (1982) supra; Stanton et al. (1982) supra). Os pentâmeros ACCAG, GCAGC, e TGAGC também são normalmente encontrados em regiões de troca (Gritzmacher (1989) supra). Além disso, a repetição heptamérica (C/T)AGGTTG está presente em abundância em sequências de regiões de troca e é encontrada próximo de muitos, mas não todos, os sítios de recombinação de troca que foram caracterizados em pi asmacitomas e hibridomas (Marcu et al. (1982) supra) .

Os loci S£ e Sa de murídeo contêm sequências de 40 pb e 80 pb, respectivamente, que estão repetidas, dispostas umas a seguir às outras. Estas sequências são homólogas a Sp, em especial em áreas das repetições que contêm o pentâmero GAGCT. Ambas as regiões Sy de humano e murídeo são muito menos homólogas a Sp do que as regiões S8 e Sa. A homologia das regiões Sy de murídeo com Sp diminui com o aumento da distância 3' em relação à região variável (SY3>SYi>SY2b>SY2a) · As regiões Sy de murídeo são compostas por repetições dispostas umas a seguir às outras de 49 pb ou 52 pb (SY2a) , dentro das quais são normalmente encontradas as sequências pentaméricas TGGGG, GCAGC e ACCAG (Kataoka et al. (1981) supra; Mowatt et al. (1986) supra; Nikaido et ai. (1982) supra, Nikaido et al. (1981) supra; Stanton et al. (1982) supra; Szurek et al. (1985) supra; Wu et al. (1984) supra).

As regiões de troca adequadas para utilização na invenção podem ser sequências que ocorrem naturalmente, e.g. uma região de troca clonada directamente a partir de um locus de Ig, de preferência a partir de um locus de Ig de murídeo ou humano. Alternativamente, a região de troca pode ser uma sequência produzida de forma sintética ou recombinante. As regiões de troca recombinantes podem ter a mesma sequência que uma região de troca que ocorre naturalmente, nativa, ou podem ser modificadas (e.g. contêm substituições, adições, mutações de nucleótidos e/ou outras modificações) em relação a uma região de troca nativa, com a condição de que a região de troca 21 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ mantenha a sua função de facilitar a recombinação. As regiões de troca recombinantes podem ser concebidas de modo a terem uma sequência de nucleótidos mínima necessária para a recombinação mediada por troca, ao mesmo nível (ou inferior, mas aceitável) que uma região de troca nativa, ou a um nível potenciado, relativamente à recombinação promovida por uma região de troca do tipo selvagem. A recombinação mediada por troca da presente invenção proporciona uma eficiência melhorada de recombinação S-S em relação ao mecanismo que ocorre naturalmente, bem como proporciona um método de produzir uma proteína desejada com uma vasta aplicação. Isto é conseguido, em parte, com a utilização de promotores que proporcionam a transcrição constitutiva ou indutível da construção dirigida para um alvo, do locus alvo ou de ambos, a construção dirigida para um alvo e o locus alvo. A eficiência melhorada do método de recombinação mediada por troca da invenção proporciona uma frequência de recombinação a um nível mais elevado do que aquele que ocorre naturalmente, isto é uma eficiência melhorada em 1% a 100%; mais preferencialmente, uma melhoria de 20% a 100% e mais preferencialmente uma melhoria de 50% a 100%.

Construções dirigidas para um alvo

Como discutido acima, as construções dirigidas para um alvo da invenção são compostas no mínimo por: 1) uma região de troca e 2) um promotor ligado operativamente a, e 5' em relação à região de troca. Outros componentes opcionais da construção dirigida para um alvo incluem 3) uma sequência modificadora ligada operativamente a, e 3' em relação à região de troca, incluindo proteínas, marcadores seleccionáveis e/ou elementos de controlo e/ou 4) sequências de ADN 3' em relação ao promotor e 5' em relação à região de troca. A activação na transcrição do promotor resulta na produção de um ou mais ARNm traduzíveis. O promotor da construção dirigida para um alvo 0 promotor da construção dirigida para um alvo é seleccionado de acordo com o tipo de célula em que a recombinação S-S dirigida será realizada (e. g. uma célula 22 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ eucariota ou procariota, normalmente uma célula eucariota). Uma vez que a recombinação S-S dirigida é dependente da transcrição das regiões de troca da construção dirigida para um alvo e do locus alvo, o promotor da construção dirigida para um alvo pode ser um promotor constitutivo ou indutivel. Os promotores constitutivos e constitutivos fortes adequados para a expressão de ADN em células procariotas ou eucariotas são bem conhecidos na arte. Quando a célula onde se pretende que ocorra a recombinação S-S é uma célula eucariota, o promotor pode ser o promotor da cadeia pesada de Ig ou um promotor virai, tal como um promotor de CMV, SV40, vírus de sarcoma de Moloney de murídeo (MMLV) e vírus formador de focos de baço (SFFV) ou um promotor indutivel, tal como MMTV e oí-inibina. A sequência modificadora A sequência modificadora pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que é adequada para substituir uma sequência alvo num locus alvo. Por exemplo, a sequência modificadora pode ser composta por uma sequência de nucleótidos que codifica para um produto de tradução, para substituir toda ou uma porção da sequência alvo. Por exemplo, quando a sequência alvo é um gene CH, a sequência modificadora pode ser um gene CH nativo diferente, um gene CH modificado (e.g. que codifica para uma função efectora alterada em relação ao gene CH do tipo selvagem), ou uma região constante de cadeia leve nativa ou modificada. Alternativamente, a sequência modificadora pode codificar para um polipéptido derivado de não-anticorpo que confere uma função ao polipéptido codificado pela sequência alvo modificada. Por exemplo, a sequência modificadora pode codificar para uma toxina, hormona, factor de crescimento ou suas porções. A sequência modificadora pode também codificar para um ligante para proporcionar ligações covalentes ou não covalentes entre outros (e.g., modificados de modo semelhante) produtos de gene de cadeia pesada ou polipéptidos não-anticorpo (e.g. toxinas, factores de crescimento, hormonas ou outro polipéptidos biologicamente importante ou outras moléculas). Ainda outro exemplo de uma sequência modificadora é uma sequência de nucleótidos que codifica para um marcador ou sinal polipeptídico detectável, e.g. β-galactosidase, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano ou um polipéptido 23 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ imunodetectável ao qual um anticorpo se pode ligar para facilitar a detecção e/ou o isolamento de polipéptidos (e.g. por cromatografia de imunoafinidade).

Alternativamente, ou em adição, a sequência modificadora pode conter sequências reguladoras (e.g. um promotor, elemento potenciador, um intrão ou um sitio de ligação ao ribossoma) que pode ser utilizado ou para introduzir sequências reguladoras numa posição 3' em relação a uma região de troca, ou para substituir sequências reguladoras já presentes na sequência alvo. Por exemplo, pode-se utilizar recombinação mediada por troca para substituir um promotor fraco com um promotor forte num locus alvo, em que o promotor fraco está posicionado 3' ou 5' em relação à região de troca do ao locus alvo. Exemplos de sequências reguladoras de interesse particular na modificação de um locus de Ig incluem uma sequência potenciadora de cadeia pesada, uma sequência potenciadora de cadeia capa, ou um promotor derivado de MMLV, vírus de sarcoma de Rous (RSV) ou SFFV. A construção dirigida para um alvo também pode conter um gene de amplificação que permite que o locus alvo modificado seja um produto mediado por troca, amplificado. Há vários genes de amplificação adequados conhecidos na arte e úteis na invenção, por exemplo, o gene que codifica para di-hidrofolato-redutase (DHFR). A sequência modificadora é seleccionada de acordo com uma variedade de factores, incluindo a sequência alvo a ser modificada e/ou a utilização de diagnóstico ou terapêutica pretendida para o produto de recombinação resultante.

Sequências adicionais presentes 3' em relação ao promotor e 5' em relação à região de troca A construção dirigida para um alvo pode conter uma sequência de ADN que pode ser transcrita e traduzida, adicional, posicionada operativamente entre o promotor e a região de troca do locus alvo. Esta sequência adicional pode codificar para uma porção N-terminal do polipéptido codificado pelo locus alvo. Por exemplo, a construção dirigida para um alvo pode codificar para um polipéptido VhDhJh desejado. Por 24 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ recombinação mediada por troca dirigida com um locus alvo que codifica para um locus de cadeia pesada de Ig tendo o gene CH desejado e a sequência alvo, o produto de recombinação contém a região VHDHJH desejada e a região codificante de CH desejada, com a região de troca posicionada entre elas.

Outros componentes A construção dirigida para um alvo pode basear-se numa variedade de vectores que são bem conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente (e.g. vectores pBR322, pACYC e vectores virais). "Vectores" inclui qualquer molécula de ADN ou ARN (com auto-replicação ou não) que pode ser utilizada para transformar ou transfectar uma célula desejada. A construção dirigida para um alvo pode incluir outros componentes, tais como um marcador seleccionável, para facilitar a pesquisa e selecção de células que contêm a construção dirigida para um alvo como um elemento extracromossómico ou integrado no cromossoma e/ou para seleccionar células que foram submetidas com sucesso a recombinação S-S, e.g. um marcador seleccionável associado com uma sequência modificadora que é recombinada no locus alvo em adição à sequência modificadora. Os genes marcadores seleccionáveis adequados incluem genes que codificam para um marcador detectável (e.g., β-galactosidase) ou genes de resistência a drogas, e.g. resistência a higromicina (hyg), guanosina-fosforiltransferase (gpt) , resistência a neomicina (neo), di-hidrofolato-redutase (DHFR), resistência a puromicina (spt) e a ampicilina (Amp). A construção pode também incluir uma origem de replicação para a replicação estável da construção numa célula bacteriana (de preferência, uma origem de replicação de um número elevado de cópias), um sinal de localização nuclear ou outros elementos que facilitam a produção da construção de ADN, a proteína codificada por esta, ou ambas. Para expressão eucariótica a construção pode também ter um gene de amplificação que pode aumentar os níveis de expressão do ADN de interesse, em particular quando o ADN de interesse é um ADNc (e.g. não contém intrões da sequência que ocorre naturalmente). Pode-se utilizar qualquer um de uma variedade de genes de amplificação conhecidos na arte, incluindo DHFR. 25 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Alvo para utilização com construções dirigidas para um alvo

Como discutido acima, um locus alvo adequado para utilização no método da invenção é composto no mínimo por: 1) uma região de troca, 2) uma sequência de ADN alvo adjacente a, e 3' em relação à região de troca e 3) um promotor posicionado operativamente na construção para proporcionar a transcrição da região de troca e sequência alvo como uma molécula de ARNm. 0 locus alvo pode também conter uma sequência de ADN adicional posicionada adjacente a, e 5' em relação à região de troca; nestas construções, o promotor proporciona a transcrição da sequência de ADN adicional, a região de troca e a sequência alvo como um ou mais ARNm traduzíveis.

Em geral, os loci alvo adequados para utilização com as construções dirigidas para um alvo da invenção podem ser qualquer sequência contendo troca em que a região de troca é transcrita e pode facilitar a recombinação mediada por troca. 0 locus alvo pode ser qualquer sequência cromossómica endógena, nativa que contém uma região de troca (e.g. um locus de cadeia pesada de Ig) . Alternativamente, o locus alvo pode ser uma sequência produzida de forma recombinante, artificialmente, presente quer como elemento extracromossómico (e.g. um vector ou plasmídeo), ou como um elemento integrado no cromossoma. Numa concretização específica da invenção, quando é desejável inserir uma porção de uma construção dirigida para um alvo 3' em relação a um locus alvo no mesmo cromossoma, a construção dirigida para um alvo transporta sequências homólogas que dirigem a recombinação num sítio 3' em relação a um locus alvo. A recombinação mediada por S irá então ocorrer intracromossomicamente, permitindo assim a indução controlada da recombinação intracromossómica. 0 promotor 0 promotor do locus alvo (P2) pode ser o promotor que está presente na sequência de locus alvo e/ou na sequência alvo que ocorre naturalmente, nativa, ou um promotor que é heterólogo em relação à sequência de locus alvo e/ou à sequência alvo. 26 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Uma vez que a recombinação S-S está associada com a transcrição da região de troca, o promotor do locus alvo proporciona de preferência, pelo menos uma expressão de nível baixo, mais preferencialmente uma expressão constitutiva e ainda mais preferencialmente, proporciona níveis elevados de expressão constitutiva do locus alvo, especificamente do ADN que codifica para a região de troca. Quando o promotor associado com o locus alvo proporciona níveis inadequados ou níveis indesejavelmente baixos de transcrição da região de troca, o promotor do locus alvo nativo pode ser modificado ou substituído com um promotor diferente, utilizando recombinação mediada por S ou outros métodos recombinantes bem conhecidos na arte, e.g., clonagem, recombinação homóloga).

Sequências adicionais presentes 3' em relação ao promotor e 5' em relação à região de troca

Como discutido acima, o locus alvo pode conter uma sequência de ADN adicional, que pode ser transcrita e traduzida, posicionada operativamente entre o promotor e a região de troca do locus alvo. Por exemplo, sequências adicionais podem codificar para uma porção N-terminal do polipéptido e o locus alvo contém uma sequência alvo que codifica para a porção C-terminal de um polipéptido. Após recombinação dirigida mediada por troca, o locus alvo modificado irá conter ambas, porções de terminal N e C do polipéptido.

Outros componentes 0 locus alvo pode incluir componentes adicionais para facilitar a replicação em células procariotas ou eucariotas, integração da construção num cromossoma eucariota e marcadores para auxiliar na selecção de e/ou pesquisa de células que contêm a construção (e.g. os marcadores detectáveis e genes de resistência a drogas discutidos acima para a construção dirigida para um alvo). Para expressão eucariótica, a construção deverá conter adicionalmente, de preferência, uma sequência de poliadenilação posicionada 3' em relação ao gene a ser expresso. A sequência de sinal de poliadenilação pode ser seleccionada a partir de qualquer uma de uma variedade de sequências de sinal de poliadenilação conhecidas na arte. De 27 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ preferência, a sequência de sinal de poliadenilação é a sequência de sinal de poliadenilação precoce de SV40. A expressão do locus alvo também pode ser aumentada por inclusão de sequências intrónicas, como discutido acima para a construção dirigida para um alvo.

Um exemplo de locus alvo recombinante da invenção é composto por (de 5' para 3'): 1) um promotor, 2) um primeiro sitio de clonagem múltiplo para inserção de uma sequência de ADN 5' em relação à região de troca, 3) uma região de troca e 4) um segundo sitio de clonagem múltiplo para inserção de uma sequência de ADN alvo. Por exemplo, quando o locus alvo é um gene de cadeia pesada de Ig recombinante, uma sequência de ADN VhDhJh é inserida 5' em relação à região de troca, no primeiro sitio de clonagem múltiplo e a sequência alvo é uma região CH inserida no segundo sitio de clonagem.

Linhas celulares adequadas para utilização com o método da invenção

Qualquer linha celular de mamifero capaz de expressar o locus alvo de interesse é adequada para utilização na presente invenção. Por exemplo, quando o locus alvo é um gene de cadeia pesada de Ig, a linha celular é qualquer célula de mamifero capaz de expressar um anticorpo funcional. De particular interesse é a utilização do método de recombinação mediada por troca da invenção, para facilitar a troca de classes em células que produzem anticorpos ou células com potencial para produzir anticorpos (e.g. células estaminais). Por exemplo, a linha celular pode ser, e.g., uma linha celular de hibridoma que expressa anticorpos humanos, uma célula estaminal embrionária (e.g. uma célula estaminal embrionária de murideo), uma linha celular de hibridoma produzida a partir de células B de um animal transgénico (e.g., um ratinho transgénico) ou qualquer outra célula (normalmente uma célula de mamifero) capaz de expressar pelo menos uma porção funcional de um locus de cadeia pesada de Ig, ou pelo menos uma porção funcional de um locus de cadeia leve de Ig. Um exemplo de uma linha celular útil no método da invenção é uma linha celular de hibridoma que expressa anticorpo humanos derivados de células B do Xenomouse (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13 e pedido de patente PCT N° de publicação 28 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ WO 94/02602, sendo ambos aqui incorporados como referência). O Xenomouse transporta segmentos grandes dos loci de cadeia pesada e cadeia K humanas integrados na sua linha germinativa e contém também alelos de cadeia pesada e cadeia leve capa de ratinho funcionalmente inactivados. O Xenomouse produz células B que expressam a cadeia pesada humana (hp) e cadeia leve K humana (mK) , ou hp e cadeia leve lambda (ιηλ) de ratinho. A co-expressão de hK e ιτιλ não ocorre, uma vez que a expressão de uma cadeia leve exclui por completo a expressão da outra (Green et al. (1994) supra). Por imunização, o Xenomouse produz um repertório amplo, tipo adulto de Ig humana e origina anticorpos monoclonais humanos específicos do antigénio. O Xenomouse permite a produção de hibridomas de ratinho produzindo anticorpos monoclonais humanos específicos para o antigénio. Os métodos para produzir linhas celulares de hibridoma são bem conhecidos na arte (veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . Os métodos para produzir linhas celulares que expressam anticorpos "humanizados" são também bem conhecidos na arte (veja-se, por exemplo, publicações PCT Nos WO 94/02602 e WO 91/10741).

Quando a linha celular é uma linha linfóide produtora de anticorpos, a linha celular pode expressar o anticorpo quer a partir de uma sequência genómica, uma sequência modificada, uma sequência heteróloga (e.g., uma sequência de Ig de outra espécie), uma sequência heteróloga modificada, ou uma sequência quimérica (e.g., composta quer de sequências Ig de murídeo, quer humanas). Assim, a linha celular pode ser, por exemplo, uma linha celular de hibridoma de murídeo que produz ou um anticorpo de murídeo, ou humano, ou quimérico. A linha celular de hibridoma pode produzir anticorpos humanos, por exemplo, por expressão de genes Ig humanos. Numa concretização, a célula é uma célula linfóide de murídeo que produz um anticorpo humano por expressão de genes Ig humanos. Numa variação da concretização, o gene de região constante da sequência genómica é um gene de região constante humana (hCH) ; e.g. um gene hCH da classe mu (hCHp) e a sequência modificadora é uma região constante humana da classe gama (hCHY) . 29 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ Métodos que utilizam recombinação mediada por troca A recombinação mediada por troca utilizando a construção(ões) da invenção pode ser realizada de uma variedade de modos. Por exemplo 1) o locus alvo pode ocorrer naturalmente (localizado no cromossoma) e a construção dirigida para um alvo pode ser utilizada quer como elemento extracromossómico, quer integrado no cromossoma, ou 2) o locus alvo pode ser uma sequência que ocorre naturalmente ou é produzida de forma recombinante que ou está presente como elemento extracromossómico, ou integrado no cromossoma e a construção dirigida para um alvo pode ser utilizada quer como elemento extracromossómico, quer integrado no cromossoma. Quando a construção dirigida para um alvo e o locus alvo estão ambos integrados no cromossoma, eles estão integrados no mesmo, ou em cromossomas diferentes.

Recombinação mediada por troca utilizando um locus alvo cromossómico e uma construção dirigida para um alvo integrada num cromossoma

Nesta concretização, a linha celular utilizada para realizar a recombinação dirigida mediada por troca ou 1) contém um locus alvo que ocorre naturalmente, endógeno, ou 2) contém um locus alvo recombinante integrado no cromossoma. Os métodos para introduzir ADN numa célula hospedeira e seleccionar integrantes cromossómicos estáveis contendo uma sequência de ADN de interesse especifica são bem conhecidos na arte (veja-se, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; aqui incorporado como referência em relação a métodos e composições para técnicas de ADN recombinante para se obter uma célula transformada contendo um ADN de interesse integrado de forma estável, e a expressão do ADN de interesse). A construção dirigida para um alvo pode ser linearizada, e.g. por digestão com endonuclease (s) de restrição e o ADN linear pode ser introduzido na célula hospedeira utilizando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na arte (e.g., electroporação, micro-injecção, fusão de lipossomas, fusões de membranas de glóbulos vermelhos (ghosts), fusão de 30 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ protoplastos, fusão de células de levedura ou qualquer outro método conhecido na arte (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., supra) . O vector linear é então integrado no genoma da célula, ao acaso ou especificamente, por recombinação homóloga dirigida e os integrantes estáveis são seleccionados, por exemplo, por expressão de um marcador seleccionável associado com a construção dirigida para um alvo, ou por expressão da sequência modificadora na construção dirigida para um alvo. A recombinação dirigida mediada por troca é realizada por transcrição simultânea das regiões de troca no locus alvo e no vector dirigido para um alvo. As células que contêm o produto da recombinação, por exemplo, o locus alvo modificado, são identificadas e seleccionadas por expressão do produto do gene do locus alvo modificado (e.g. por reacção ELISA ou separação de células activada por fluorescência (FACS)).

Recombinação mediada por troca utilizando um locus alvo cromossómico e uma construção dirigida para um alvo extracromossómico

Nesta concretização do método da invenção, a construção dirigida para um alvo é introduzida numa célula que contém um locus alvo integrado no cromossoma, por métodos bem conhecidos na arte (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Ao contrário do método imediatamente acima, a construção dirigida para um alvo é mantida como um elemento extracromossómico durante um tempo suficiente para a transcrição da região de troca da construção dirigida para um alvo e recombinação com a região de troca do locus alvo, transcricionalmente activa. As células que contêm o produto de recombinação desejado, e.g., um locus alvo modificado, podem ser identificadas e seleccionadas como descrito acima, e.g., selecção para expressão de um marcador seleccionável associado com a sequência alvo integrada, ou detecção de células que expressam o produto do gene do locus alvo modificado, desejado.

Pesquisa e selecção A detecção de sequências recombinadas de forma adequada pode ser conseguida de uma variedade de formas, dependendo da natureza do produto de recombinação desejado. Por exemplo, 31 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ quando a sequência modificadora associada com um marcador seleccionável é recombinada no locus alvo com a sequência modificadora, uma pesquisa inicial irá seleccionar as células que expressam o marcador. Uma segunda pesquisa pode ser utilizada para determinar se as células resistentes a droga expressam o locus alvo modificado de forma adequada. 0 método utilizado para a segunda pesquisa irá variar com a natureza da sequência modificadora inserida no locus alvo. A sequência modificadora pode ser detectada por transferência Southern utilizando uma porção da sequência modificadora como sonda, ou por reacção em cadeia com polimerase (PCR) utilizando iniciadores de amplificação derivados das regiões modificadoras e modificadas. As células que têm uma sequência modificadora integrada de forma adequada também podem ser identificadas detectando a expressão de um produto do locus alvo modificado funcional, e.g., imunodetecção da nova região Ch num locus de cadeia pesada de anticorpo modificado. Alternativamente, o produto de expressão do locus alvo modificado pode ser detectado utilizando um bioteste para testar uma função efectora particular conferida pela sequência modificadora. Por exemplo, a expressão da sequência modificadora que codifica para uma molécula biologicamente activa, tal como uma enzima, toxina, factor de crescimento ou outros péptidos, é testada para essa actividade biológica particular.

Quando o locus alvo é um gene de Ig, o produto do locus alvo modificado também pode ser testado quanto ao reconhecimento adequado de antigénio ou ligando, através de quaisquer métodos de pesquisa imunológicos convencionais conhecidos na arte, e.g., ELISA, FACS, testes de citotoxicidade celular dependente de anticorpos ou testes de imunoprecipitação (veja-se, por exemplo, Harlow e Lane, supra) .

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são apresentados para proporcionar aos peritos na arte uma revelação e descrição completas do modo de produzir e utilizar várias construções e realizar os vários métodos da presente invenção e não pretendem limitar o âmbito do que os inventores consideram a sua invenção. Salvo 32 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ indicação em contrário, as partes são partes em peso, a temperatura é em graus centígrados e a pressão é à, ou próximo da pressão atmosférica. Foram feitos esforços para assegurar a precisão em relação aos números utilizados (e.g. comprimento de sequências de ADN, pesos moleculares, quantidades, componentes particulares, etc.) mas deverão ser tidos em conta alguns desvios. EXEMPLO 1. Construção dirigida para um alvo para recombinação mediada por troca (pTSW-1.4 e pTSW-1.9)

Todos os vectores produzidos basearam-se num plasmídeo pACYC177 (NEB) de um número baixo de cópias. 0 vector pTSW-1.4 foi produzido a partir do plasmídeo plbYACÔNot contendo um fragmento genómico de EcoRI de 23 kb da região de troca γ2 humana total, isolado de uma biblioteca genómica de placenta humana. Este fragmento continha 2 kb de sequências codificantes, 12 kb de sequências a montante incluindo o exão I e a região de troca γ2 e 9 kb de sequências a jusante (Flanagan & Rabbitts (1982) Nature 300:709-713). Este plasmídeo também contém o potenciador 3' de ratinho (Dariavach et ai. (1991) Eur. J. Immunol. 21:1499-1504). O vector foi modificado para conter um marcador seleccionável de higromicina e uma cassete promotor-potenciador de CMV humano, que incluía na sua extremidade 3' sequências de terminador procariotas (descritas a seguir). As sequências de terminador procariotas foram utilizadas para impedir que moléculas transcritas procariotas fortuitas pudessem activar as sequências de troca e desse modo desestabilizá-las durante a clonagem em bactérias (Mowatt & Dunnick (1986) J. Immunology 136:2674-2683). Foi confirmado que estas sequências têm muito pouco efeito na transcrição eucariótica. O gene de higromicina dirigido pelo promotor de SV40 (Giordano & McAllister (1990) Gene 88:285-288) foi clonado como um fragmento HindIII-BamHI de 1,7 kb a partir do plasmídeo pUC219.TG76 e inserido em sítios de HindIII e BamHI em pACYC177, para produzir o plasmídeo pACYC.hyg. O terminador foi sintetizado como GCAT- GCCCGCGG-GAATAGGCGGGCTTTTTTNNNGCCGCGGCTCGA (SEQ ID NO:1), com sítios Sphl flanqueadores e um sítio Xhol interno na extremidade 3', para fins de clonagem. Esta sequência foi clonada no sítio 33 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

Sphl do plasmídeo pIKl.lCat, a jusante das sequências promotor-potenciador de CMV humano. A cassete de expressão de CMV, juntamente com as sequências de terminador, foi clonada como um fragmento HindIII-Xhol de 900 pb, que foi colocado nos sitios de HindIII e Xhol no plasmídeo pACYC.hyg descrito acima, para produzir pACYC.hyg.CMVt, em que a orientação de transcrição do CMV é oposta à do gene de higromicina. O fragmento de 2,6 kb contendo, quer cassetes de higromicina, quer de terminador de CMV, foi excisado de pACYC.hyg.CMVt por digestão com BamHI e Xhol. Ambas as extremidades deste fragmento foram convertidas em sítios Notl utilizando ligantes e o fragmento foi clonado no sítio Notl único no plasmídeo plbYACÔNot contendo sequências de γ2 humanas de 23 kb e potenciador 3' de ratinho. O plasmídeo pTSW-1.4 (Figura 5) foi produzido com orientação de transcrição de CMV na mesma direcção que a das sequências codificantes de γ2 humana. O plasmídeo pTSW-1.9 (Figura 6) foi produzido com orientação de transcrição de CMV oposta à de sequências codificantes de γ2 humana.

Um exemplo de construção dirigida para um alvo da invenção, designado por pTSW-1.4 é apresentado na Figura 5. O pTSW-1.4 é construído para utilização na substituição mediada por troca de um gene constante de cadeia pesada de Ig por um gene constante de cadeia pesada de IgG2 humana (hCHy2) . A construção pTSW-1.4 contém um promotor de CMV ligado operativamente, na orientação 5' para 3' , à região de cadeia pesada de IgG2 humana (aproximadamente 23 kb) que inclui o exão I de cadeia pesada de IgG2 e as suas sequências flanqueadoras 5' , a região de troca de IgG2 humana, o gene hCHy2 humano completo e sequências que flanqueiam a região de cadeia pesada de IgG2. A região hCHy2 está ligada a um potenciador de murídeo posicionado adjacente a, e 3' em relação ao gene de hCHy2. O promotor de CMV é um promotor constitutivo forte. Podem-se utilizar outros promotores constitutivos em vez do promotor de CMV (e.g., SSFV, MMLV, MCV, RSV, SV40, etc.). Ambas as regiões hCHy2 foram clonadas e sequenciadas (Mills et al. (1995) supra). O potenciador 3' de 34 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ murídeo também é bem conhecido na arte (Dariavach et al. (1991) supra). EXEMPLO 2. Construção dirigida para um alvo para recombinação mediada por troca (pTSW-2)

Para produzir o plasmídeo pTSW-2, clonou-se um fragmento de BamHI de 13 kb a partir do fragmento genómico de EcoRI de γ2 humano de 23 kb no plasmideo plbYACÔNot, como descrito no Exemplo 1, seguido de reacção de preenchimento parcial com Klenow para produzir extremidades de fragmentos compatíveis com Xhol. Este clone foi inserido no sítio Xhol único no plasmídeo pACYC.hyg.CMVt que também foi parcialmente preenchido com Klenow, para tornar o sítio compatível com BamHI. Seleccionou-se a orientação correcta do clone, na qual a orientação de transcrição de sequências codificantes de y2 humana é a mesma que a do promotor de CMV.

Outro exemplo de construção dirigida para um alvo da invenção, designado por pTSW-2, é apresentado na Figura 7. Tal como o pTSW-1.4, o pTSW-2 é construído para utilização na substituição mediada por troca de um gene constante de cadeia pesada de Ig com um gene constante de cadeia pesada de IgG2 humana (hCHy2) . A construção pTSW-2 é preparada utilizando um promotor de CMV ligado operativamente à, e na orientação 5' para 3', região de cadeia pesada de IgG2 humana (aproximadamente 13 kb) , incluindo a região de troca de IgG2 humana e 200 pb de sequências flanqueadoras 5' da região de troca e fase de leitura aberta de γ2 humana. Algumas das sequências flanqueadoras presentes em pTSW-1.4 não estão presentes em pTSW-2. A construção pTSW-2 também contém o marcador seleccionável SV2hyg e um terminador de transcrição procariota (para estabilizar a região de troca). A construção pTSW-2 pode ser preparada com, ou sem um potenciador de murídeo posicionado 3' em relação ao gene hCHy2. EXEMPLO 3. Construção dirigida para um alvo para recombinação mediada por troca (pTSW-3.1)

Para produzir o plasmídeo pTSW-3.1 (Figura 8), clonaram-se sequências codificantes de γ2 humana de 2 kb por PCR a partir de plbYACÔNot como um fragmento Xhol-Sall 35 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ (Exemplo 1). Este fragmento foi clonado no sítio Xhol único no plasmídeo pACYC.hyg.CMVt, 3' em relação às seguências de terminador. As seguências de troca yl de ratinho foram excisadas como um fragmento HindIII-EcoRI de 10 kb a partir do plasmídeo p-gamma-l/EH10.0 (Mowatt & Dunnick (1986) supra), e as extremidades foram convertidas em Xhol e Sall, respectivamente. O plasmídeo modificado foi clonado 5' em relação à região y2 humana através do sítio Xhol único em pACYC.hyg.CMVt. O plasmídeo pTSW-3.ldBglII (Figura 9) foi produzido de forma semelhante a pTSW-3.1, excepto que se incluiu uma sequência de troca γΐ de ratinho BglII-EcoRI de 7,9 kb. O pTSW-3.2 foi construído como descrito para pTSW-3.1, excepto que a cassete promotor-potenciador de CMV foi substituída pelo promotor do vírus formador de foco de baço (SSFV).

Os plasmídeos pTSW-3 continham sítios únicos Notl e MluI (convertidos por um ligante a partir do sítio BamHI único). A HindIII é utilizada para linearizar e clonar o potenciador 3' .

Outro exemplo de construção dirigida para um alvo da invenção, designada por pTSW-3.1 é apresentado na Figura 8. Tal como o pTSW-1.4 e TSW-2, o pTSW-3.1 é construído para utilização na substituição mediada por troca de um gene constante de cadeia pesada de Ig, por um gene constante de cadeia pesada de IgG2 humana (hCHY2). A construção pTSW-3.1 é preparada utilizando um promotor de CMV ligado operativamente a, e na direcção 5' para 3', uma região de troca de γΐ de murídeo que pode conter também o exão I de yl de ratinho e sequências flanqueadoras e uma sequência codificante de hCHYi, hCHy2 ou hCHy4 constante, genómica, humana que inclui o ponto de ramificação flanqueador 5' e aceitador de splicing. A construção pTSW-3.1 pode conter também opcionalmente um elemento de controlo de yl de murídeo (mlYi) posicionado adjacente a, e 5' em relação à sequência mSYi · Alternativamente, a região de troca humana do gene yl (hSYi) e as suas sequências flanqueadoras 5', tais como o exão I (hIYi) podem ser utilizadas em vez de mIYi e mSYi. Em construções que não contêm o exão I, é proporcionado um sítio dador de 36 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ splicing 3' em relação às sequências promotoras. A construção pTSW-3.1 pode também conter opcionalmente um potenciador 3' de murídeo posicionado adjacente a, e a jusante do gene de hCHY e/ou um terminador de transcrição eucariota posicionado 3' em relação a, e adjacente ao gene de hCHY. Cada um dos elementos da construção pTSW-3 é bem conhecido na arte (SY4, Sp de ratinho, Mills et al. (1991) supra; SYi de ratinho, Mowatt &

Dunnick (1986) supra; SJ humano, Mills et al. (1995) supra; potenciador 3' de ratinho, Dariavach et al. (1991) supra). A construção pTSW-3.1 também contém o marcador seleccionável SV2y2hyg e um sítio de linearização de HindIII. Podem-se utilizar outros marcadores seleccionáveis, por exemplo, piromicina. EXEMPLO 4. Recombinação mediada por troca numa linha celular de hibridoma

Como discutido acima, um dos problemas associados com a produção de anticorpos monoclonais humanos é o de a linha celular imortal fundida com as células B humanas ser proveniente de murídeo. Isto pode resultar num fenómeno de recombinação em que o anticorpo resultante tem uma região variável humana (cadeias leves humanas e região variável de cadeia pesada humana (hVHDHJH) ) , mas tem uma região constante de cadeia pesada de murídeo (mCHY) (veja-se Figura 8) . A recombinação mediada por troca é utilizada para substituir o gene mCHY com um gene de região constante de cadeia pesada humana (hCHY) .

Produz-se uma linha celular de hibridoma que expressa um anticorpo IgG monoclonal contra antigénios, incluindo antigénios humanos, tendo uma região variável de cadeia pesada humana (hVHDHJH) e uma região constante de cadeia pesada de murídeo (mCHY) utilizando métodos bem conhecidos na arte (por exemplo, veja-se Green et al. (1994) supra). Uma construção dirigida para um alvo contendo um promotor ligado operativamente a uma região de troca e o gene hCHY é construída como descrito acima. Qualquer dos vectores exemplo descritos nos exemplos acima (pTSW-1.4, pTSW-2, ou pTSW-3.1) é adequado para utilização neste método. A construção é linearizada e a construção linear é introduzida na célula de 37 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ hibridoma, por exemplo, por electroporação, lipofecção, ou outros métodos conhecidos na arte. As células de hibridoma transfectadas contendo integrantes estáveis da construção são seleccionadas quanto à sua capacidade para crescer em higromicina. As células resistentes a higromicina são então posteriormente cultivadas para permitir a transcrição da construção dirigida para um alvo a partir do promotor de CMV e o fenómeno de recombinação mediada por troca resultante. As culturas de células individuais de hibridoma são então pesquisadas quanto à expressão de hCHy2 por amplificação da mensagem do anticorpo recombinado, ou utilizando um anticorpo anti-IgG2 humana num teste ELISA sanduíche, ou isolado por separação FACS. EXEMPLO 5. Recombinação mediada por troca num ratinho transgénico que produz anticorpos humanos A recombinação mediada por troca pode ser realizada num ratinho transgénico in vivo, como se segue. 0 vector dirigido para um alvo é introduzido como um transgene num ratinho que produz anticorpos humanos e os anticorpos recombinados, produzidos pelas células B de ratinho ou os seus hibridomas derivados, são pesquisados como descrito. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Abgenix, Inc.

Japan Tobacco, Inc. <120> Recombinação dirigida de AND mediada por troca <130> AHB/FP5726534 <140> EP 97917548.6 <141> 1997-03-19 <150> PCT/US97/04380 <151> 1997-03-19 <150> US 08/619,109 <151> 1996-03-20 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 38 ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ

<210> 1 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Terminador <220> <221> misc_feature <222> (31)..(33) <223> n = a ou g ou c ou t. <400> 1 gcatgcccgc gggaataggc gggctttttt nnngccgcgg ctcga 45

Lisboa,

Claims

ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Construção de ácido nucleico artificial dirigida para um alvo, compreendendo: a) uma única região de troca; b) um promotor heterólogo em relação à região de troca, em gue o promotor está ligado operativamente, e a 5' , à região de troca; e c) uma seguência modificadora heteróloga, ligada operativamente, e 3', à região de troca, em gue a seguência modificadora codifica para uma região constante de uma cadeia pesada de anticorpo humano, em que a região constante é seleccionada de entre Cy, Cp, Ca, CÔ e Ce.
2. Construção dirigida para um alvo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também uma sequência de ADN adicional posicionada a 5' da região de troca e a 3' do promotor.
3. Construção dirigida para um alvo de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor heterólogo é um promotor constitutivo.
4. Construção reivindicação 1, em indutivel. dirigida para um alvo de acordo com a que o promotor heterólogo é um promotor
5. Construção dirigida para um alvo de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor é seleccionado de entre um promotor de citomegalovirus, um promotor do vírus formador de focos no baço (SFFV), um promotor do vírus de sarcoma de Rous, um promotor de SV40 e um promotor do vírus Moloney de murídeo.
6. Método para a recombinação dirigida mediada por troca, em que o método compreende os passos de: a) introduzir uma construção dirigida para um alvo numa célula B ou num hibridoma de célula B, em que a construção dirigida para um alvo compreende uma região de troca da construção dirigida para um alvo e um promotor (Pi) ligado operativamente, e 5' , da região de troca da construção dirigida para um alvo, e ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ 2/5 em que a célula compreende um locus alvo compreendendo uma região de troca de um locus alvo, uma sequência alvo adjacente, e a 3', da região de troca do locus alvo e um promotor (P2) posicionado operativamente dentro do locus alvo, para se obter a transcrição da região de troca do locus alvo e da sequência alvo; e b) cultivar a célula para permitir a transcrição do locus alvo e da construção dirigida para um alvo, promovendo desse modo a recombinação entre a região de troca do locus alvo e a região de troca da construção dirigida para um alvo; e c) seleccionar uma célula compreendendo um locus alvo modificado compreendendo o promotor Pi da construção dirigida para um alvo, uma região de troca e a sequência alvo, em que Pi, a região de troca e a sequência alvo estão ligadas operativamente e em que a sequência alvo está sob o controlo de Pi.
7. Método para a recombinação dirigida mediada por troca, em que o método compreende os passos de: a) introduzir uma construção dirigida para um alvo numa célula B ou num hibridoma de célula B, em que a construção dirigida para um alvo compreende uma região de troca da construção dirigida para um alvo e um promotor (Pi) ligado operativamente, e a 5', da região de troca da construção dirigida para um alvo e uma sequência modificadora ligada operativamente, e a 3', da região de troca da construção dirigida para um alvo, em que a célula compreende um locus alvo compreendendo uma região de troca de um locus alvo, uma sequência alvo adjacente, e a 3' , da região de troca do locus alvo e um promotor (P2) posicionado operativamente dentro do locus alvo, para se obter a transcrição da região de troca do locus alvo e da sequência alvo; e b) cultivar a célula para permitir a transcrição do locus alvo e da construção dirigida para um alvo, promovendo desse modo a recombinação entre a região de troca do locus alvo e a região de troca da construção dirigida para um alvo; e ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ 3/5 c) seleccionar uma célula compreendendo um locus alvo modificado compreendendo o promotor P2 da construção dirigida para um alvo, uma região de troca e a sequência modificadora, em que P2, a região de troca e a sequência modificadora, estão ligadas operativamente.
8. Método para produzir um anticorpo por recombinação mediada por troca, em que o método compreende os passos de: a) introduzir uma construção dirigida para um alvo numa célula B ou num hibridoma de célula B, em que a construção dirigida para um alvo compreende uma região de troca da construção dirigida para um alvo (Si) , um promotor da construção dirigida para um alvo ligado operativamente, e a 5', da região de troca da construção dirigida para um alvo e uma sequência modificadora ligada operativamente, e a 3', da região de troca da construção dirigida para um alvo, e em que a célula expressa uma cadeia pesada de anticorpo e em que a cadeia pesada de anticorpo expressa pela célula é codificada por um locus de cadeia pesada de anticorpo compreendendo um promotor do locus de cadeia pesada, uma região variável de cadeia pesada de anticorpo ligada operativamente, e a 3' , do promotor, uma região de troca (S2) adjacente, e a 3' , da região variável e uma região constante de cadeia pesada de anticorpo adjacente, e a 3' , da região de troca, b) cultivar a célula para permitir a expressão do anticorpo e a transcrição da construção dirigida para um alvo, em que a recombinação mediada por troca entre as referidas Si e S2 é promovida e em que a referida região constante de cadeia pesada de anticorpo é substituída pela sequência modificadora da construção dirigida para um alvo; e c) seleccionar uma célula compreendendo um locus de cadeia pesada modificado, em que o locus de cadeia pesada modificado compreende o promotor do locus de cadeia pesada, a região variável de cadeia pesada de anticorpo, uma região de troca e a sequência modificadora da construção dirigida para um alvo, em que o promotor do locus de cadeia pesada, a região variável de cadeia pesada, a região de troca e a sequência modificadora estão ligados operativamente. ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ 4/5
9. Método para produzir uma cadeia pesada de anticorpo modificada por recombinação mediada por troca, em que o método compreende os passos de: a) introduzir uma construção dirigida para um alvo numa célula B isolada ou num hibridoma de célula B que facilita a recombinação mediada por troca, em que a construção dirigida para um alvo compreende, por ordem de 5' para 3' e ligados operativamente, um promotor da construção dirigida para um alvo, uma sequência de região variável de cadeia pesada de anticorpo da construção dirigida para um alvo e uma região de troca (S i) e em que uma cadeia pesada de anticorpo expressa pela célula é codificada por um locus alvo de cadeia pesada de anticorpo, compreendendo, por ordem de 5' para 3' e ligados operativamente, um promotor do locus alvo, uma região variável de cadeia pesada de anticorpo do locus alvo, uma região de troca (S2) e uma região constante de cadeia pesada de anticorpo; b) cultivar a célula para permitir a transcrição da construção dirigida para um alvo, em que a recombinação mediada por troca entre as referidas Si e S2 é promovida; e c) seleccionar uma célula compreendendo um locus alvo modificado que compreende, por ordem de 5' para 3' e ligados operativamente, o promotor da construção dirigida para um alvo, a região variável de cadeia pesada da construção dirigida para um alvo, uma região de troca e a região constante de cadeia pesada de anticorpo do locus alvo; em que é produzida uma cadeia pesada de anticorpo modificada.
10. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a construção dirigida para um alvo e o locus alvo estão integrados no cromossoma.
11. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o locus alvo codifica para uma cadeia pesada de anticorpo.
12. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o locus alvo compreende ainda uma sequência não alvo posicionada entre o promotor do locus alvo e a região de troca do locus alvo. ΕΡ Ο 939 763 /ΡΤ 5/5
13. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a construção dirigida para um alvo é linearizada antes da referida introdução e uma célula que contém um integrante estável da construção dirigida para um alvo é seleccionado antes da referida cultura, para permitir a transcrição do locus alvo.
14. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a construção dirigida para um alvo é extracromossómica.
15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a recombinação entre a primeira região de troca e a segunda região de troca está associada com a eliminação do ácido nucleico localizado entre as referidas primeira e segunda regiões de troca.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a sequência não alvo codifica para uma região variável de cadeia pesada de anticorpo humano e a sequência alvo codifica para uma região constante de cadeia pesada de anticorpo de murideo.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a sequência modificadora da construção dirigida para um alvo codifica para uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano.
18. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o locus alvo codifica para uma cadeia pesada de anticorpo de murideo e a sequência modificadora da construção dirigida para um alvo codifica para uma região constante de cadeia pesada de anticorpo humano. Lisboa,