MD3500593T2 - Receptori de celule T și imunoterapie cu utilizarea acestora - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la construcţii de recunoaştere antigenică împotriva antigenilor COL6A3. Invenţia furnizează în special molecule noi bazate pe receptori de celule T (TCR) care sunt selective şi specifice pentru antigenul COL6A3 exprimat în tumori. TCR-ul în conformitate cu invenţia şi fragmentele de legare la antigenul COL6A3 derivate din acestea sunt utile pentru diagnosticarea, tratarea şi prevenirea bolilor canceroase care exprimă COL6A3. Mai sunt furnizaţi acizi nucleici care codifică construcţiile care recunosc antigenul în conformitate cu invenţia, vectori care cuprind aceşti acizi nucleici, celule recombinante care exprimă construcţiile care recunosc antigenul şi compoziţii farmaceutice care cuprind compuşii invenţiei.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la construcţii de recunoaştere antigenică împotriva antigenilor COL6A3. Invenţia furnizează în special molecule noi bazate pe receptori de celule T (TCR) care sunt selective şi specifice pentru antigenul COL6A3 exprimat în tumori. TCR-ul în conformitate cu invenţia şi fragmentele de legare la antigenul COL6A3 derivate din acestea sunt utile pentru diagnosticarea, tratarea şi prevenirea bolilor canceroase care exprimă COL6A3. Mai sunt furnizaţi acizi nucleici care codifică construcţiile care recunosc antigenul în conformitate cu invenţia, vectori care cuprind aceşti acizi nucleici, celule recombinante care exprimă construcţiile care recunosc antigenul şi compoziţii farmaceutice care cuprind compuşii invenţiei.

DESCRIERE

Colagenii sunt o superfamilie de proteine care joacă un rol în menţinerea integrităţii diferitelor ţesuturi. Colagenii sunt proteine ale matricei extracelulare şi au un domeniu triplu elicoidal ca element structural comun. Colagenul VI este o componentă structurală majoră a microfibrilelor. Unitatea structurală de bază a colagenului VI este un heterotrimer al lanţurilor de colagen alfa l(VI), alfa 2(VI) şi alfa 3(VI). Lanţurile alfa l(VI) şi alfa 2(VI) sunt codificate de genele COL6A1 şi, respectiv, COL6A2. Proteina codificată de gena COL6A3 este subunitatea alfa 3 a colagenului de tip VI (lanţul de colagen alfa 3(VI)) (Bertini et al., 2002 Eur. J. Paediatr. Neurol 6:193-8). Exprimarea genei COL6A3 s-a dovedit anterior a fi asociată cu progresia cancerului de glandă mamară şi a fost crescută în cancerul de colon (Smith MJ, et al. «Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification» British journal of cancer. 2009;100:1452-1464; Tilman G et al «Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells» Mol Cancer. 2007;6:80) şi ca marker de prognostic al carcinomului colorectal (Qiao J et al. «Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics» Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30): 29929-29946). Gena COL6A3 este localizată în 2q37 în genomul uman şi conţine 44 de exoni. Proteina COL6A3 are 3177 de aminoacizi şi conţine 12 domenii de factor Von Willebrand de tip A (vWA), un domeniu de fibronectină de tip 3 şi un domeniu al familiei BPTI/Kunitz de inhibitori ai serinei proteazei (KU). WO 2011/113819 A2 descrie epitopi peptidici citotoxici ai celulelor T (CTL) asociaţi tumorii, cum ar fi peptidele antigenice COL6A3, şi TCR-uri care recunosc epitopii peptidici menţionaţi.

Imunoterapia bazată pe celule T ţinteşte epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumorii, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Aceşti antigeni asociaţi tumorii (TAA) pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcripţie etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, reglate în sens crescător în celulele respectivei tumori.

Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi aminoacidice derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP-uri) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).

Un TCR este o proteină heterodimerică de suprafaţă celulară din superfamilia imunoglobulinei, care este asociată cu proteine invariante ale complexului CD3 implicate în medierea transducţiei semnalului. TCR-urile există în formele αβ şi γδ, care sunt similare din punct de vedere structural, dar au locaţii anatomice şi, probabil, funcţii destul de distincte. Porţiunea extracelulară a ββTCR heterodimeric nativ constă din două polipeptide, fiecare dintre acestea având un domeniu constant proximal membranei şi un domeniu variabil distal membranei. Fiecare dintre domeniile constante şi variabile include o legătură disulfurică intra-lanţ. Domeniile variabile conţin bucle extrem de polimorfe analoge regiunilor de determinanre a complementarităţii (CDR-uri) ale anticorpilor. Utilizarea terapiei genice cu TCR-uri depăşeşte o serie de obstacole actuale. Terapia permite echiparea celulelor T proprii ale pacienţilor cu specificităţi dorite şi generarea unui număr suficient de celule T într-o perioadă scurtă de timp, evitându-se epuizarea lor. TCR-ul va fi transdus în celule T cu memorie centrală sau celule T cu caracteristici ale celulelor stem, fapt care pot asigura persistenţă şi funcţionare mai bune la transfer. Celulele T modificate cu TCR vor fi perfuzate pacienţilor cu cancer care sunt limfopenici prin chimioterapie sau iradiere, permiţând grefarea eficientă, dar inhibând supresia imunitară.

Deşi s-au făcut progrese în dezvoltarea de medicamente cu orientare moleculară pentru terapia cancerului, rămâne o necesitate în domeniu de a se dezvolta noi agenţi anticancer care ţintesc în mod specific molecule foarte specifice celulelor canceroase. Prezenta descriere răspunde acestei nevoi prin furnizarea de noi TCR-uri COL6A3, construcţii TCR recombinante respective, acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă care se leagă în mod specific de epitopul (epitopii) COL6A3, aşa cum sunt prezentate; şi metode de utilizare a acestor molecule în tratarea cancerului.

Obiectul invenţiei este rezolvat într-un prim aspect printr-o construcţie de recunoaştere a antigenului, aşa cum este definit în revendicările însoţitoare.

Antigenul care recunoaşte construcţia cuprinde o secvenţă de domeniuCDR1, una CDR2 şi una CDR3. În domeniul variabil, CDR1 şi CDR2 se găsesc în regiunea variabilă (V) a unui lanţ polipeptidic, iar CDR3 include o parte din regiunile V, toate cu regiuni de diversitate (D) şi de îmbinare (J). CDR3 este cel mai variabil şi principalul CDR responsabil pentru recunoaşterea specifică şi selectivă a unui antigen. Secvenţele CDR1 şi CDR2 pot fi selectate dintr-o secvenţă CDR a unei alele cu lanţ variabil uman.

TCR-urile heterodimerice alfa-beta native au un lanţ alfa şi un lanţ beta. Fiecare lanţ cuprinde regiuni variabile, de îmbinare şi constante, iar lanţul beta conţine, de asemenea, o regiune de diversitate scurtă între regiunea variabilă şi regiunea de îmbinare, însă această regiune de diversitate este adesea considerată ca făcând parte din regiunea de îmbinare. Fiecare regiune variabilă cuprinde trei CDR-uri (regiuni determinante de complementaritate) încorporate într-o secvenţă-cadru, una fiind regiunea hipervariabilă numită CDR3. Există mai multe tipuri de regiuni variabile ale lanţului alfa (Vα) şi mai multe tipuri de regiuni variabile ale lanţului beta (Vβ) distinse prin cadrul lor, secvenţele CDR1 şi CDR2, şi printr-o secvenţă CDR3 definită parţial. Tipurile Vα sunt desemnate în nomenclatura IMGT printr-un număr TRAV unic, iar tipurile Vβ sunt menţionate printr-un număr TRBV unic.

Prin urmare, construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia cuprinde secvenţe CDR1, CDR2 şi CDR3 într-o combinaţie furnizată în Tabelul 1 de mai jos, care afişează alela respectivă a lanţului variabil împreună cu secvenţa CDR3. Prin urmare, sunt preferate construcţiile care recunosc antigenul care cuprind, toate cele trei secvenţe CDR - CDR1, CDR2 şi CDR3. De preferinţă, o construcţie de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia cuprinde secvenţele CDR1-CDR3 respective ale unei regiuni variabile TCR individuale a invenţiei descrise în prezentul document.

Termenul „specificitate» sau „specificitate a antigenului» sau „specific pentru» un antigen dat, aşa cum este utilizat în prezentul document, înseamnă posibilitatea de legare specifică a construcţiei de recunoaştere a antigenului la antigenul menţionat, preferabil un antigen COL6A3, mai preferabil cu aviditate ridicată, atunci când antigenul respectiv este de HLA, preferabil HLA A2. De exemplu, un TCR, drept construcţie de recunoaştere a antigenului, poate fi considerat a avea „specificitate antigenică» pentru antigeni COL6A3 dacă celulele T care exprimă TCR-ul şi sunt contactate cu un HLA prezentator de COL6A3 secretă cel puţin aproximativ 200 pg/ml sau mai mult (de exemplu, 250 pg/ml sau mai mult, 300 pg/ml sau mai mult, 400 pg/ml sau mai mult, 500 pg/ml sau mai mult, 600 pg/ml sau mai mult, 700 pg/ml sau mai mult, 1000 pg/ml sau mai mult, 2000 pg/ml sau mai mult, 2500 pg/ml sau mai mult, 5000 pg/ml sau mai mult) de interferon γ (IFN-γ) la co-cultură cu celule-ţintă pulsate cu o concentraţie mică de antigen COL6A3, cum ar fi epitopii COL6A3 şi antigenii furnizaţi mai jos în prezentul document (de exemplu, aproximativ 10-11 mol/l, 10-10 mol/l, 10-9 mol/l, 10-8 mol/l, 10-7 mol/l, 10-6 mol/l, 10-5 mol/l). Alternativ sau suplimentar, un TCR poate fi considerat a avea „specificitate antigenică» pentru COL6A3 dacă celulele T care exprimă TCR-ul secretă cel puţin de două ori mai mult IFN-γ decât nivelul de fond netransdus de IFN-γ la co-cultură cu celule-ţintă pulsate cu o concentraţie scăzută de antigeni COL6A3. O astfel de „specificitate» descrisă mai sus poate fi - de exemplu - analizată cu un ELISA.

Construcţia care recunoaşte antigenul se leagă în mod selectiv la un antigen COL6A3 având secvenţa aminoacidică arătată în SEQ ID NO: 58.

Termenul „selectivitate» sau „recunoaştere/legare selectivă» se referă la proprietatea unei construcţii de recunoaştere a antigenului, cum ar fi un TCR sau anticorp, de a recunoaşte sau de a se lega selectiv preferabil doar la un singur epitop specific şi, preferabil, nu prezintă sau nu prezintă substanţial reactivitate încrucişată cu un alt epitop. Preferabil, „selectivitate» sau „recunoaştere/legare selectivă» înseamnă că construcţia de recunoaştere a antigenului (de exemplu, un TCR) recunoaşte sau se leagă selectiv preferabil doar la un singur epitop specific şi, preferabil, nu prezintă sau nu prezintă substanţial reactivitate încrucişată cu un alt epitop, unde epitopul respectiv este unic pentru o proteină, astfel încât construcţia de recunoaştere a antigenului să nu prezinte sau să nu prezinte substanţial reactivitate încrucişată cu un alt epitop şi o altă proteină.

Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia este preferabil selectat dintr-un anticorp sau un derivat ori un fragment al acestuia sau un receptor de celule T (TCR) ori un derivat sau un fragment al acestuia. Un derivat sau fragment al unui anticorp sau TCR în conformitate cu invenţia va păstra capacitatea de legare/recunoaştere a antigenului a moleculei-părinte, în special specificitatea şi/sau selectivitatea acesteia, după cum sa explicat mai sus. O astfel de funcţionalitate de legare poate fi reţinută prin prezenţa unei regiuni CDR3 aşa cum este definită în prezentul document.

Într-o concretizare a invenţiei, TCR-urile inovatoare sunt capabile să recunoască antigeni COL6A3 într-o manieră dependentă de clasa I a complexului major de histocompatibilitate (MHC). Termenul „manieră dependentă de MHC de clasă I», aşa cum este utilizat aici, înseamnă că TCR-ul determină un răspuns imun la legarea la antigeni COL6A3 în contextul unei molecule MHC de clasă I. Molecula MHC de clasă I poate fi orice moleculă MHC de clasă I cunoscută în domeniu, de exemplu, molecula HLA-A. Într-o concretizare preferată a invenţiei, molecula MHC de clasă I este o moleculă HLA-A2.

Invenţia furnizează atât construcţii de recunoaştere a antigenului cu lanţ unic, cât şi construcţii de recunoaştere a lanţului dublu.

Invenţia oferă în special un TCR drept construcţie de recunoaştere a antigenului sau un fragment ori un derivat al acestuia. TCR-ul este de preferinţă de tip uman, care este înţeles ca fiind generat dintr-un locus TCR uman şi, prin urmare, cuprinzând secvenţe TCR umane. Mai mult, TCR-ul în conformitate cu invenţia poate fi caracterizat prin faptul că este de origine umană şi recunoaşte în mod specific un antigen COL6A3.

O altă concretizare a invenţiei furnizează suplimentar sau alternativ construcţia de recunoaştere a antigenului din invenţie, care induce un răspuns imun, preferabil în care răspunsul imun este caracterizat printr-o creştere a nivelurilor de interferon (IFN) γ.

TCR-urile în conformitate cu invenţia pot fi furnizate sub formă de construcţii cu lanţ unic sau, alternativ, cu lanţ dublu compuse atât din lanţul α şi β, cât şi din lanţul γ şi δ.

Construcţia care recunoaşte antigenul descrisă în prezentul document pot cuprinde un lanţ TCR α sau γ; şi/sau un lanţ TCR β sau δ; în care lanţul TCR α sau γ cuprinde un CDR3 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 3, 15 şi 27 şi/sau în care lanţul TCR β sau δ cuprinde un CDR3 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 9, 21 şi 33.

Cel mai preferabil, în unele concretizări suplimentare, în care descrierea se referă la construcţii care recunosc antigenul cuprinzând una, două sau toate regiunile CDR1 la CDR3 ale lanţurilor TCR descrise (a se vedea Tabelul 1), astfel de construcţii care recunosc antigenul pot fi preferate, care cuprind secvenţa CDR respectivă având trei, două şi, preferabil, doar un resturi aminoacidic modificat. Un rest aminoacidic modificat poate fi selectat dintr-o inserţie, o deleţie sau o substituţie de aminoacizi. Cel mai preferabil este ca cei trei, doi, preferabil un rest aminoacidic modificat să fie primul sau ultimul rest aminoacidic din secvenţa CDR respectivă. Dacă modificarea este o substituţie, atunci este preferabil în unele concretizări ca substituţia să fie o substituţie conservatoare de aminoacizi.

În cazul în care construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia este compusă din cel puţin două lanţuri de aminoacizi, cum ar fi un TCR cu lanţ dublu sau un fragment de legare a antigenului acestuia, constructul de recunoaştere a antigenului poate cuprinde într-un prim lanţ polipeptidic secvenţa de aminoacizi în conformitate cu SEQ ID NO: 3 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 9, sau, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 15 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 21, sau, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 27 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 33. Oricare dintre TCR-urile cu lanţ dublu menţionate anterior sau fragmente de legare la antigen ale acestora sunt TCR-uri preferate în conformitate cu prezenta invenţie. În unele concretizări, CDR3-ul TCR-ului cu lanţ dublu al invenţiei poate avea mutaţie. Mutaţiile secvenţelor CDR3 ale SEQ ID NO: 9-28 furnizate de mai sus includ, de preferinţă, o substituţie, o deleţie, o adăugare sau o inserţie de cel mult trei, preferabil două şi cel mai preferabil nu mai mult de un rest aminoacidic. În unele concretizări, primul lanţ polipeptidic poate fi un lanţ TCR α sau γ, iar al doilea lanţ polipeptidic poate fi un lanţ TCR β sau δ. Este preferată combinaţia unui TCR αβ sau γδ.

TCR-ul, sau fragmentul de legare la antigen al acestuia este, în unele concretizări, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β sau un lanţ γ şi δ. Un astfel de TCR cu lanţ dublu cuprinde în fiecare lanţ regiuni variabile, iar regiunile variabile cuprind fiecare câte o secvenţă CDR1, o secvenţă CDR2 şi o secvenţă CDR3. TCR-urile cuprind secvenţele CDR1 la CDR3, aşa cum sunt cuprinse în secvenţa de aminoacizi cu lanţ variabil din SEQ ID NO: 4 şi SEQ ID NO: 10 (R4P1D10) sau SEQ ID NO: 16 şi SEQ ID NO: 22 (R4P3F9) sau SEQ ID NO: 28 şi SEQ ID NO: 34 (R4P3H3).

Unele concretizări ale invenţiei se referă la un TCR sau un fragment al acestuia, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β, în care TCR-ul menţionat cuprinde secvenţele de regiune variabilă având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 98%, 99% sau, de preferinţă, 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 4 şi, respectiv, 10 sau 16 şi, respectiv, 22 sau 28 şi, respectiv, 34.

TCR-urile inovatoare pot cuprinde în plus o regiune constantă derivată de la orice specie adecvată, cum ar fi orice mamifer, de exemplu, om, şobolan, maimuţă, iepure, măgar sau şoarece. Într-o concretizare a invenţiei, TCR-urile inovatoare cuprind în plus o regiune constantă umană. În unele concretizări preferate, regiunea constantă a TCR în conformitate cu invenţia poate fi uşor modificată, de exemplu, prin introducerea de secvenţe heterologe, preferabil secvenţe murine, care pot creşte exprimarea şi stabilitatea TCR.

Unele concretizări ale invenţiei se referă la un TCR sau un fragment al acestuia, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β, în care TCR-ul menţionat cuprinde regiunea constantă având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 98%, 99% sau, de preferinţă, 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 5 şi, respectiv, 11 sau 17 şi, respectiv, 23 sau 29 şi, respectiv, 35.

Lanţul TCR α sau γ descris în prezentul document poate cuprinde în plus un CDR1 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 1, 13 şi 25; şi/sau un CDR2 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 2, 14 şi 26.

Lanţul TCR β sau δ poate cuprinde în plus un CDR1 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 7, 19 şi 31; şi/sau un CDR2 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 8, 20 şi 32.

Construcţia de recunoaştere a antigenului poate cuprinde într-o altă concretizare un fragment de legare a unui TCR şi unde respectivul fragment de legare cuprinde de la CDR1 la CDR3 selectate din secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 1, 2, 3 sau 7, 8, 9 ori 13, 14, 15 sau 19, 20, 21 ori 25, 26, 27 sau 31, 32, 33.

În alte concretizări ale invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului, aşa cum este descrisă mai sus în prezentul document, este un TCR sau un fragment al acestuia compus din cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care secvenţa de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 1-3 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 7-9; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 13-15 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 19-21; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 25-27 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 31-33.

În alte concretizări ale invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului, aşa cum este descrisă anterior în prezentul document, este un TCR, sau un fragment al acestuia, cuprinzând cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care secvenţa de lanţ TCR α menţionată include o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică din SEQ ID NO: 4, şi în care respectiva secvenţă de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică din SEQ ID NO: 10; sau în care respectiva secvenţă de lanţ TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică din SEQ ID NO: 16 şi în care respectiva secvenţă de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică din SEQ ID NO: 22; sau în care respectiva secvenţă de lanţ TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică din SEQ ID NO: 28 şi în care respectiva secvenţă de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică din SEQ ID NO: 34.

În alte concretizări ale invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului, aşa cum este descrisă anterior în prezentul document, este un TCR sau un fragment al acestuia, cuprinzând în plus o regiune constantă TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23, 29 şi 35, preferabil în care TCR-ul este compus din cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care secvenţa de lanţ TCR α cuprinde o regiune constantă având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 5, 17 şi 29.

Sunt descrise, de asemenea, construcţii de recunoaştere a antigenului, aşa cum sunt descrise anterior în prezentul document, cuprinzând un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 6 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 12. Invenţia furnizează, de asemenea, TCR-uri cuprinzând un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 18 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 24. În alte concretizări, invenţia furnizează construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 30 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO: 36.

Aşa cum este utilizat în prezentul document, termenul „murin» sau „uman», atunci când se referă la o construcţie de recunoaştere a antigenului, ori un TCR sau orice componentă a unui TCR descrisă în prezentul document (de exemplu, regiunea de determinare a complementarităţii (CDR), regiunea variabilă, regiunea constantă, lanţul α şi/sau lanţul β) înseamnă un TCR (sau o componentă a acestuia) care este derivat de la şoarece sau, respectiv, un locus TCR nerearanjat de om.

Într-o concretizare a invenţiei, sunt furnizate TCR-uri himerice, în care lanţurile TCR au inclus secvenţe de la mai multe specii. Preferabil, un TCR în conformitate cu invenţia poate cuprinde un lanţ α cuprinzând o regiune variabilă umană a unui lanţ α şi, de exemplu, o regiune constantă murină a unui lanţ TCR α murin.

Într-una dintre concretizări, TCR-ul din invenţie este un TCR uman cuprinzând regiuni variabile umane în conformitate cu variantele de mai sus şi regiuni constante umane.

TCR-ul din invenţie poate fi furnizat ca un TCR cu lanţ unic (scTCR). Un scTCR poate cuprinde o polipeptidă a unei regiuni variabile a unui prim lanţ TCR (de exemplu, un lanţ alfa) şi o polipeptidă a unui întreg lanţ TCR (de lungime completă) (de exemplu, un lanţ beta) sau viceversa. Mai mult, scTCR-ul poate cuprinde opţional unul sau mai mulţi linkeri care unesc cele două sau mai multe polipeptide împreună. Linkerul poate fi, de exemplu, o peptidă, care uneşte două lanţuri simple, aşa cum este descris în prezentul document. De asemenea, este furnizat un astfel de scTCR al invenţiei care este fuzionat cu o citokină umană, cum ar fi IL-2, IL-7 sau IL-15.

Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia poate fi furnizat şi sub forma unui complex multimeric cuprinzând cel puţin două molecule scTCR, în care moleculele scTCR menţionate sunt fiecare fuzionate la cel puţin un fragment de biotină şi în care scTCR-urile respective sunt interconectate prin interacţiune biotină-streptavidină pentru a se permite formarea complexului multimeric menţionat. Abordări similare pentru generarea TCR-ului multimeric sunt, de asemenea, posibile şi incluse în această descriere. De asemenea, sunt furnizate complexe multimerice de ordin superior cuprinzând mai mult de două scTCR-uri în conformitate cu invenţia.

Un TCR este un fragment având cel puţin un domeniu variabil TCR alfa sau gamma şi/sau TCR beta sau delta. În general, acestea cuprind atât un domeniu variabil TCR alfa, cât şi un domeniu variabil TCR beta. Ele pot fi heterodimeri αβ sau pot fi în format cu lanţ unic. Pentru utilizare în terapia adoptivă, un TCR heterodimeric αβ poate fi, de exemplu, transfectat ca lanţuri de lungime completă având atât domenii citoplasmatice, cât şi domenii transmembranare. Dacă se doreşte, poate fi prezentă o legătură disulfurică introdusă între resturile domeniilor constante respective.

Într-o concretizare preferată, construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR uman sau un fragment ori un derivat al acestuia. Un TCR uman sau un fragment ori un derivat al acestuia este un TCR, care cuprinde peste 50% din secvenţa TCR umană corespunzătoare. Preferabil, doar o mică parte a secvenţei TCR este de origine artificială sau derivată de la alte specii. Se cunoaşte, totuşi, că TCR-urile himerice, de exemplu derivate din origine umană cu secvenţe murine în domenii constante, sunt avantajoase. În mod special preferate sunt, prin urmare, TCR-uri în conformitate cu prezenta invenţie care conţin secvenţe murine în partea extracelulară a domeniilor lor constante.

Astfel, este preferabil, de asemenea, ca o construcţie de recunoaştere a antigenului inovatoare să fie capabilă să-şi recunoască antigenul într-un mod dependent de antigenul leucocitar uman (HLA), de preferinţă într-un mod dependent de HLA-A02. În contextul prezentei invenţii, termenul „mod dependent de HLA» înseamnă că o construcţie de recunoaştere a antigenului se leagă de antigen numai în cazul în care peptida antigenică este prezentată de HLA-ul menţionat.

Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia, într-un exemplu de concretizare, induce de preferinţă un răspuns imun, preferabil în care răspunsul imun este caracterizat prin creşterea nivelurilor de interferon (IFN) γ.

De asemenea, în prezentul document este descrisă o polipeptidă care cuprinde o porţiune funcţională a oricăruia dintre TCR-uri (sau variante funcţionale ale acestora) descrise în prezentul document, de exemplu, pentru oricare dintre TCR-urile selectate dintre R4P1D10, R4P3F9 şi R4P3H3, aşa cum se specifică în secţiunea de exemple şi Tabelul 1. Termenul „polipeptidă», aşa cum este utilizat în prezentul document, include oligopeptide şi se referă la un singur lanţ aminoacidic conectat prin una sau mai multe legături peptidice. În ceea ce priveşte polipeptidele, porţiunea funcţională poate fi orice porţiune care conţine aminoacizi adiacenţi ai TCR-ului (sau ai variantei funcţionale a acestuia) din care face parte, cu condiţia ca porţiunea funcţională să se lege în mod specific la un antigen COL6A3, preferabil aşa cum este descris în prezentul document în Tabelul 2 şi peptidele A1-A9 (SEQ ID NO: 59-67). Termenul „porţiune funcţională», atunci când este utilizat referitor la un TCR (sau o variantă funcţională a acestuia), se referă la orice parte sau fragment al TCR-ului (sau al variantei funcţionale a acestuia) în conformitate cu invenţia, care parte sau fragment păstrează activitatea biologică a TCR-ului (sau a variantei funcţionale a acestuia) din care face parte (TCR-ul părinte sau varianta funcţională părinte a acestuia). Porţiunile funcţionale cuprind, de exemplu, acele părţi ale unui TCR (sau ale variantei funcţionale a acestuia) care păstrează capacitatea de a se lega în mod specific la un antigen COL6A3 (într-un mod dependent de HLA-A2) sau de a detecta, a trata sau a preveni cancerul într-o măsură similară, în aceeaşi măsură sau într-o măsură mai mare, ca TCR părinte (sau varianta funcţională a acestuia). Referitor la TCR-ul părinte (sau varianta funcţională a acestuia), porţiunea funcţională poate cuprinde, de exemplu, aproximativ 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% sau mai mult din secvenţele variabile ale TCR-ului părinte (sau ale variantei funcţionale a acestuia).

Porţiunea funcţională poate cuprinde aminoacizi suplimentari la capătul amino sau carboxi al porţiunii ori la ambele capete, în care aminoacizii suplimentari nu se găsesc în secvenţa aminoacidică a TCR-ului părinte sau a variantei funcţionale a acestuia. De dorit, aminoacizii suplimentari nu interferează cu funcţia biologică a porţiunii funcţionale, de exemplu, legându-se în mod specific de antigeni COL6A3 şi/sau având capacitatea de a detecta cancerul, de a trata sau preveni cancerul, etc. Mai de dorit, aminoacizii suplimentari sporesc activitatea biologică în comparaţie cu activitatea biologică a TCR-ului părinte sau a variantei funcţionale a acestuia.

Polipeptida poate cuprinde o porţiune funcţională a uneia sau ambelor lanţuri α şi β ale TCR-urilor sau variante funcţionale ale acestora în conformitate cu invenţia, cum ar fi o porţiune funcţională care cuprinde unul dintre mai multe CDR1, CDR2 şi (preferabil) CDR3 ale regiunii (regiunilor) variabile a(le) lanţului α şi/sau ale lanţului β al unui TCR sau a al unei variante funcţionale a acestuia în conformitate cu invenţia. Polipeptida poate cuprinde o porţiune funcţională care cuprinde secvenţa aminoacidică de SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27 şi 33 (CDR3 al regiunilor variabile ale TCR-ului în conformitate cu invenţia) sau o combinaţie a acestora. Polipeptida poate cuprinde, de exemplu, regiunea variabilă a TCR-ului inovator sau varianta funcţională a acestuia cuprinzând o combinaţie a regiunilor CDR prezentate mai sus. În acest sens, polipeptida poate cuprinde secvenţa aminoacidică a oricăreia dintre SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28 şi 34 (regiunile variabile ale unui lanţ α sau β al TCR-ului în conformitate cu invenţia).

În unele cazuri, construcţia din invenţie poate cuprinde unul sau două lanţuri polipeptidice cuprinzând o secvenţă în conformitate cu oricare dintre SEQ ID NO: 1-36 (secvenţe CDR, regiuni constante şi variabile şi secvenţe de lungime completă) sau fragmente funcţionale ale acestora şi cuprind în plus alte secvenţe aminoacidice, de exemplu, o secvenţă de aminoacizi care codifică o imunoglobulină sau o porţiune a acesteia; atunci proteina inovatoare poate fi o proteină de fuziune. În acest sens, invenţia furnizează, de asemenea, o proteină de fuziune care cuprinde cel puţin una dintre polipeptidele inovatoare descrise în prezentul document împreună cu cel puţin o altă polipeptidă. Cealaltă polipeptidă poate exista ca polipeptidă separată a proteinei de fuziune sau poate exista ca polipeptidă care este exprimată în cadru (în tandem) cu una dintre polipeptidele inovatoare descrise în prezentul document. Cealaltă polipeptidă poate include orice moleculă peptidică sau proteinacee ori o porţiune a acesteia, incluzând, dar fără a se limita la o imunoglobulină, CD3, CD4, CD8, o moleculă MHC, o moleculă CD1, de exemplu, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d etc.

Proteina de fuziune poate cuprinde una sau mai multe copii ale polipeptidei din invenţie şi/sau una sau mai multe copii ale celeilalte polipeptide. De exemplu, proteina de fuziune poate cuprinde 1, 2, 3, 4, 5 sau mai multe copii ale polipeptidei inovatoare şi/sau ale celeilalte polipeptide. Metodele adecvate de producere a proteinelor de fuziune sunt cunoscute în domeniu şi includ, de exemplu, metode recombinante. În unele concretizări ale invenţiei, TCR-urile (şi porţiunile funcţionale şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele şi proteinele din invenţie pot fi exprimate ca o singură proteină cuprinzând o peptidă linker care leagă lanţul α şi lanţul β şi care leagă lanţul γ şi lanţul δ. În acest sens, TCR-urile (şi variantele funcţionale şi porţiunile funcţionale ale acestora), polipeptidele şi proteinele în conformitate cu invenţia cuprind secvenţele aminoacidice ale regiunilor variabile ale TCR-ului în conformitate cu invenţia şi pot cuprinde în plus o peptidă linker. Peptida linker poate facilita în mod avantajos exprimarea unui TCR recombinant (incluzând porţiuni funcţionale şi variante funcţionale ale acestora), a unei polipeptide recombinante şi/sau a unei proteine recombinante într-o celulă-gazdă. Peptida linker poate cuprinde orice secvenţă aminoacidică adecvată. Secvenţele linker pentru construcţii TCR cu lanţ unic sunt bine cunoscute în domeniu. O astfel de construcţie cu lanţ unic poate cuprinde în plus una sau două secvenţe de domeniu constant. La exprimarea construcţiei incluzând peptida linker de către o celulă-gazdă, peptida linker poate fi, de asemenea, clivată, rezultând lanţuri α şi β separate şi lanţuri γ şi δ separate.

Aşa cum s-a menţionat deja mai sus, funcţionalitatea de legare a TCR-ului în conformitate cu invenţia poate fi furnizată în cadrul unui anticorp. Termenul „anticorp», în diferitele sale forme gramaticale, este utilizat în prezentul document pentru a se referi la molecule de imunoglobulină şi porţiuni active imunologic de molecule de imunoglobulină, adică molecule care conţin un situs de legare la antigen sau un paratop. Astfel de molecule sunt, de asemenea, denumite „fragmente de legare la antigen» ale moleculelor de imunoglobulină. Invenţia furnizează şi un anticorp sau o porţiune de legare la antigen a acestuia care se leagă în mod specific la antigenii descrişi în prezentul document. Anticorpul poate fi orice tip de imunoglobulină cunoscut în domeniu. De exemplu, anticorpul poate fi de orice izotip, de exemplu, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM etc. Anticorpul poate fi monoclonal sau policlonal. Anticorpul poate fi un anticorp natural, de exemplu, un anticorp izolat şi/sau purificat de la un mamifer, de exemplu, şoarece, iepure, capră, cal, găină, hamster, om etc. Alternativ, anticorpul poate fi un anticorp proiectat, de exemplu, un anticorp umanizat sau un anticorp himeric. Anticorpul poate fi sub formă monomerică sau polimerică.

De asemenea, în prezentul document sunt descrise porţiuni de legare la antigen ale oricăruia dintre anticorpii descrişi în prezentul document. Porţiunea de legare la antigen poate fi orice porţiune care are cel puţin un situs de legare la antigen, cum ar fi Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, diacorpi şi triacorpi. Se poate genera un fragment de anticorp cu fragment de regiune variabilă cu un singur lanţ (sFv), care constă dintr-un fragment Fab trunchiat cuprinzând domeniul variabil (V) al unui lanţ greu de anticorp legat la un domeniu V al unui lanţ uşor de anticorp printr-o peptidă sintetică, folosindu-se tehnici de rutină de tehnologie cu ADN recombinant. În mod similar, pot fi preparate fragmente de regiune variabilă stabilizate cu disulfură (dsFv) prin tehnologie cu ADN recombinant; cu toate acestea, fragmentele de anticorp din invenţie nu se limitează la aceste tipuri exemplare de fragmente de anticorp. De asemenea, anticorpul sau porţiunea de legare la antigen a acestuia poate fi modificată pentru a cuprinde un marcaj detectabil, cum ar fi, de exemplu, un radioizotop, un fluorofor (de exemplu, izotiocianat de fluoresceină (FITC), ficoeritrină (PE)), o enzimă (de exemplu, fosfatază alcalină, peroxidază de hrean) şi particule de elemente (de exemplu, particule de aur). În unele cazuri, secvenţa TCR CDR3 poate fi uşor modificată, dar de preferinţă cu nu mai mult de 3 resturi aminoacidice, preferabil doar două şi cel mai preferabil o singură poziţie de aminoacid, în comparaţie cu secvenţele CDR3 furnizate în SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27 şi 33. De preferinţă, anticorpii cuprind CDR3, de preferinţă toate regiunile CDR1 până la CDR3 în combinaţie, aşa cum este indicat pentru TCR-ul invenţiei în Tabelul 1.

Metode adecvate de fabricare a anticorpilor sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, metodele standard de hibridom sunt descrise în, de exemplu, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), and C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (201 1)). Alternatively, other methods, such as EBV-hybridoma methods (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), and Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)), iar sisteme de exprimare a vectorilor bacteriofagi (vezi, de exemplu, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) sunt cunoscute în domeniu. De asemenea, metodele de producere a anticorpilor la animale neumane sunt descrise, de exemplu, în brevetele SUA cu numerele 5.545.806, 5.569.825 şi 5.714.352 şi în cererea de brevet SUA cu numărul 2002/0197266.

Unele concretizări ale invenţiei se referă, de asemenea, la TCR-uri sau la fragmente funcţionale şi polipeptide ale acestora care sunt TCR-uri solubile. În sensul prezentului document, termenul „receptor de celule T solubil» se referă la variantele trunchiate heterodimerice ale TCR-urilor native, care cuprind porţiuni extracelulare ale lanţului α şi lanţului β ale TCR-ului, legate printr-o legătură disulfidică, dar cărora le lipsesc domeniile transmembranar şi citosolic ale proteinei native. Termenii „secvenţă a lanţului α al receptorului de celule T solubil şi secvenţă a lanţului β al receptorului de celule T solubilă» se referă la secvenţele lanţului α şi lanţului β ale TCR care nu au domeniile transmembranar şi citosolic. Secvenţa (aminoacid sau acid nucleic) a lanţului α şi a lanţurilor β ale TCR-ului solubil poate fi identică cu secvenţele corespunzătoare dintr-un TCR nativ sau poate cuprinde secvenţe variante ale lanţului α şi ale lanţului β ale TCR solubil, în comparaţie cu secvenţele corespunzătoare ale TCR-ului nativ. Termenul „receptor de celule T solubil», aşa cum este utilizat în prezentul document, cuprinde TCR-uri solubile cu secvenţe de lanţ α şi lanţ β ale TCR-urilor solubile, variante sau non-variante. Variaţiile pot fi în regiunile variabile sau constante ale secvenţelor lanţului α şi lanţului β ale TCR-ului solubil şi pot include, fără a se limita la acestea, mutaţii de deleţie, inserţie şi substituţie de aminoacizi, precum şi modificări ale secvenţei de acid nucleic, care nu modifică secvenţa de aminoacizi. TCR-ul solubil al invenţiei păstrează în orice caz funcţionalitatea de legare a moleculelor lor părinte.

Problema de mai sus este rezolvată în continuare printr-un acid nucleic care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului din invenţie. Acidul nucleic, de preferinţă, (a) are o catenă care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului conform invenţiei; (b) are o catenă complementară catenei de la (a); sau (c) are o catenă care se hibridizează în condiţii stricte cu o moleculă descrisă la (a) sau (b). Condiţiile stricte sunt cunoscute de către specialiştii în domeniu, în special din Sambrook et al, „Molecular Cloning». În plus, acidul nucleic are, în mod opţional, secvenţe suplimentare, care sunt necesare pentru exprimarea secvenţei de acid nucleic corespunzătoare proteinei, în special pentru exprimarea într-o celulă de mamifer/umană. Acidul nucleic utilizat poate fi conţinut într-un vector adecvat pentru a permite exprimarea secvenţei de acid nucleic corespunzătoare peptidei într-o celulă. Cu toate acestea, acizii nucleici pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a transforma o celulă prezentatoare de antigen, care poate să nu se limiteze la celulele prezentatoare de antigen clasice, cum ar fi celulele dendritice, astfel încât acestea să producă ele însele proteinele corespunzătoare pe suprafaţa lor celulară.

Prin „acid nucleic», aşa cum este utilizat în prezentul document, se înţelege „polinucleotidă», „oligonucleotidă» şi „moleculă de acid nucleic» şi, în general, un polimer de ADN sau ARN, care poate fi monocatenar sau bicatenar, sintetizat sau obţinut (de exemplu, izolat şi/sau purificat) din surse naturale, care poate conţine nucleotide naturale, nenaturale sau modificate şi care poate conţine o legătură internucleotidică naturală, nenaturală sau modificată, cum ar fi o legătură fosfoamidat sau o legătură fosforotioioat, în locul fosfodiesterului care se găseşte între nucleotidele unei oligonucleotide nemodificate.

De preferinţă, acizii nucleici în conformitate cu invenţia sunt recombinanţi. În sensul prezentului document, termenul „recombinat» se referă la (i) moleculele care sunt construite în afara celulelor vii prin alăturarea unor segmente de acid nucleic natural sau sintetic la molecule de acid nucleic care se pot replica într-o celulă vie sau (ii) moleculele care rezultă din replicarea celor descrise la punctul (i) de mai sus. În scopul prezentului document, replicarea poate fi o replicare in vitro sau o replicare in vivo. Acidul nucleic poate cuprinde orice secvenţă de nucleotide care codifică oricare dintre TCR-uri, polipeptide sau proteine, sau porţiuni funcţionale sau variante funcţionale ale acestora descrise în prezentul document.

Mai mult, invenţia oferă un vector care cuprinde un acid nucleic în conformitate cu invenţia, aşa cum este descris mai sus. Este de dorit ca vectorul să fie un vector de exprimare sau un vector de exprimare recombinant. Termenul „vector de exprimare recombinant» se referă, în contextul prezentei invenţii, la o construcţie de acid nucleic care permite exprimarea unui ARNm, a unei proteine sau a unei polipeptide într-o celulă-gazdă adecvată. Vectorul de exprimare recombinant al invenţiei poate fi orice vector de exprimare recombinant adecvat şi poate fi utilizat pentru a transforma sau transfecta orice gazdă adecvată. Printre vectorii adecvaţi se numără cei concepuţi pentru propagare şi expansiune sau pentru exprimare sau ambele, cum ar fi plasmidele şi viruşii. Exemple de vectori de exprimare animali includ pEUK-Cl, pMAM şi pMAMneo. De preferinţă, vectorul de exprimare recombinant este un vector viral, de exemplu, un vector retroviral. Vectorul de exprimare recombinant cuprinde secvenţe de reglare, cum ar fi codonii de iniţiere şi terminare a transcripţiei şi a translaţiei, care sunt specifice tipului de celulă-gazdă (de exemplu, bacterie, ciupercă, plantă sau animal), în care urmează să fie introdus vectorul şi în care se poate realiza exprimarea acidului nucleic al invenţiei. În plus, vectorul invenţiei poate include una sau mai multe gene marker, care permit selectarea gazdelor transformate sau transfectate. Vectorul de exprimare recombinant poate cuprinde un promotor nativ sau normativ legat în mod operaţional de secvenţa nucleotidică care codifică construcţiile invenţiei sau de secvenţa nucleotidică, care este complementară sau care se hibridizează cu secvenţa nucleotidică care codifică construcţiile invenţiei. Selecţia de promotori include, de exemplu, promotori puternici, slabi, inductibili, specifici pentru ţesut şi specifici pentru dezvoltare. Promotorul poate fi un promotor neviral sau un promotor viral. Vectorii de exprimare recombinanţi din invenţie pot fi concepuţi fie pentru exprimare tranzitorie, fie pentru expimare stabilă, fie pentru ambele. De asemenea, vectorii de exprimare recombinanţi pot fi realizaţi pentru exprimare constitutivă sau pentru exprimare inductibilă.

Invenţia se referă, de asemenea, la o celulă-gazdă care cuprinde o construcţie de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia. În mod specific, celula-gazdă a invenţiei cuprinde un acid nucleic sau un vector, aşa cum este descris mai sus. Celula-gazdă poate fi o celulă eucariotă, de exemplu, o plantă, un animal, o ciupercă sau o algă, sau poate fi o celulă procariotă, de exemplu, o bacterie sau un protozoar. Celula-gazdă poate fi o celulă cultivată sau o celulă primară, adică o celulă izolată direct dintr-un organism, de exemplu, un om. Celula-gazdă poate fi o celulă aderentă sau o celulă în suspensie, adică o celulă care creşte în suspensie. În scopul producerii unui TCR, a unei polipeptide sau a unei proteine recombinate, celula-gazdă este de preferinţă o celulă de mamifer. Cel mai preferabil, celula-gazdă este o celulă umană. Deşi celula-gazdă poate fi de orice tip de celulă, poate proveni din orice tip de ţesut şi poate fi în orice stadiu de dezvoltare, celula-gazdă este, de preferinţă, o leucocită din sângele periferic (PBL) sau o celulă mononucleară din sângele periferic (PBMC). Cel mai preferabil, celula-gazdă este o celulă T. Celula T poate fi orice celulă T, cum ar fi o celulă T cultivată, de exemplu, o celulă T primară, sau o celulă T dintr-o linie de celule T cultivate, de exemplu, Jurkat, SupT1 etc. ori celulă T obţinută de la un mamifer, de preferinţă o celulă T sau un precursor de celulă T de la un pacient uman. În cazul în care este obţinută de la un mamifer, celula T poate fi obţinută din numeroase surse, inclusiv, dar fără a se limita la sânge, măduvă osoasă, ganglioni limfatici, timus sau alte ţesuturi sau fluide. Celulele T pot fi, de asemenea, îmbogăţite sau purificate. Preferabil, celula T este o celulă umană. Mai preferabil, celula T este o celulă T izolată de la un om. Celula T poate fi orice tip de celulă T şi poate fi în orice stadiu de dezvoltare, inclusiv, dar fără a se limita la celule T CD4-pozitive şi/sau CD8-pozitive, celule T helper CD4-pozitive, de exemplu, celule Th1 şi Th2, celule T CD8-pozitive (de exemplu, celule T citotoxice), celule infiltrate în tumori (TIL-uri), celule T cu memorie, celule T naive şi altele asemenea. Preferabil, celula T este o celulă T CD8-pozitivă sau o celulă T CD4-pozitivă.

Preferabil, celula-gazdă în conformitate cu invenţia este un limfocit, de preferinţă un limfocit T, cum ar fi o celulă T CD4-pozitivă sau CD8-pozitivă. Celula-gazdă este, de asemenea, de preferinţă, o celulă T reactivă la tumori, specifică pentru celulele tumorale care exprimă COL6A3.

Un alt aspect al prezentei invenţii se referă la construcţiile de recunoaştere a antigenului, la acizii nucleici, la vectori, la compoziţiile farmaceutice şi/sau la celula-gazdă ale invenţiei pentru utilizare în medicină. Utilizarea în medicină, într-o concretizare preferată, include utilizarea în diagnosticarea, prevenirea şi/sau tratarea unei boli tumorale, cum ar fi o boală tumorală malignă sau benignă. Boala tumorală este, de exemplu, o boală tumorală caracterizată prin exprimarea COL6A3, într-un cancer sau într-o celulă tumorală a respectivei boli tumorale.

În ceea ce priveşte aplicaţiile medicale menţionate mai sus ale construcţiilor de recunoaştere a antigenului şi a altor materiale derivate din acestea, cancerul care trebuie tratat şi/sau diagnosticat poate fi orice cancer, inclusiv oricare dintre cancer limfocitic acut, leucemie mieloidă acută, rabdomiosarcom alveolar, cancer osos, cancer cerebral, cancer de glandă mamară, cancer anal, de canal anal sau anorectal, cancer ocular, cancer de cale biliară intrahepatică, cancer de articulaţii, cancer de gât, de vezică biliară sau de pleură, cancer de nas, de cavitate nazală sau de ureche medie, cancer de cavitate bucală, cancer vaginal, cancer vulvar, leucemie limfocitară cronică, cancer mieloid cronic, cancer de colon, cancer esofagian, cancer de col uterin, tumoră carcinoidă gastrointestinală, gliom, limfom Hodgkin, cancer hipofaringian , cancer de rinichi, cancer laringian, cancer hepatic, cancer pulmonar, mezoteliom malign, melanom, mielom multiplu, cancer nazofaringian, limfom non-Hodgkin, cancer orofaringian, cancer ovarian, cancer penian, cancer de pancreas, de peritoneu, de oment şi cancer mezenteric, cancer faringian, cancer de prostată, cancer rectal, cancer renal, cancer de piele, cancer de intestin subţire, cancer de ţesuturi moi, cancer de stomac, cancer testicular, cancer tiroidian, cancer uterin, cancer de ureter şi cancer de vezică urinară. Un cancer preferat este cancerul de col uterin, cancerul orofaringian, cancerul anal, cancerul canalului anal, cancerul anorectal, cancerul vaginal, cancerul vulvar sau cancerul penian. Un cancer deosebit de preferat este un cancer COL6A3-pozitiv, inclusiv cancerul gastrointestinal şi cancerul gastric.

Construcţiile, proteinele, anticorpii TCR, polipeptidele şi acizii nucleici ai invenţiei sunt în special destinate utilizării în imunoterapie, de preferinţă, în terapia adoptivă cu celule T. Administrarea compuşilor invenţiei poate implica, de exemplu, perfuzarea de celule T ale invenţiei în pacientul respectiv. De preferinţă, aceste celule T sunt celule T autologe ale pacientului şi sunt transduse in vitro cu un acid nucleic sau o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta invenţie.

WO 2016/011210 descrie celule modificate pentru terapie adoptivă, inclusiv celule NK şi celule T, compoziţii care conţin aceste celule şi metode de administrare a acestora la subiecţi. Celulele pot conţine receptori antigenici modificaţi genetic care se leagă în mod specific de antigeni, cum ar fi receptorii himerici de antigen (CAR) şi receptorii costimulatori.

Obiectivul invenţiei este rezolvat, de asemenea, printr-o metodă de fabricare a unei linii celulare care exprimă o construcţie care recunoaşte antigenul specific COL6A3, care cuprinde

a. Furnizarea unei celule-gazdă adecvate, b. Furnizarea unei construcţii genetice care cuprinde o secvenţă codificatoare care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului conform invenţiei prezentate în prezentul document, c. Introducerea în respectiva celulă-gazdă adecvată a respectivei construcţii genetice şi d. Exprimarea construcţiei genetice de către respectiva celulă-gazdă adecvată.

Metoda poate cuprinde, de asemenea, o etapă de prezentare la suprafaţa celulară a construcţiei de recunoaştere a antigenului respectiv pe celula-gazdă adecvată.

În alte forme de realizare preferate, construcţia genetică este o construcţie de exprimare care cuprinde o secvenţă promotoare legată în mod operaţional de respectiva secvenţă de codificare.

De preferinţă, respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului este de origine mamiferă, de preferinţă de origine umană. Celula-gazdă preferată potrivită pentru utilizare în metoda invenţiei este o celulă de mamifer, cum ar fi o celulă umană, în special un limfocit T uman. Celulele T destinate utilizării în cadrul invenţiei sunt descrise în detaliu mai sus.

Invenţia cuprinde, de asemenea, forme de realizare în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR modificat, în care modificarea respectivă constă în adăugarea de domenii funcţionale, cum ar fi un marcaj sau o substanţă activă din punct de vedere terapeutic. În plus, sunt incluse TCR-uri care au domenii alternative, cum ar fi un domeniu alternativ de ancorare în membrană în locul regiunii transmembranare endogene.

Este de dorit ca sistemul de transfectare pentru introducerea construcţiei genetice în respectiva celulă-gazdă adecvată să fie un sistem de vectori retrovirali. Astfel de sisteme sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu.

De asemenea, prezenta invenţie cuprinde, într-una dintre concretizări, etapa suplimentară a metodei de izolare şi purificare a construcţiei de recunoaştere a antigenului din celulă şi, opţional, reconstituirea fragmentelor de construcţie de recunoaştere a antigenului translatate într-o celulă T.

De asemenea, este prezentată aici o celulă T obţinută sau care poate fi obţinută printr-o metodă de producere a unui receptor de celule T (TCR), care este specific pentru celulele tumorale şi are o aviditate ridicată, aşa cum este descris mai sus. O astfel de celulă T este în funcţie de celula-gazdă utilizată în metoda invenţiei, de exemplu, o celulă T umană sau non-umană, de preferinţă un TCR uman.

TCR-urile, polipeptidele, proteinele (inclusiv variantele funcţionale ale acestora), acizii nucleici, vectorii de exprimare recombinanţi, celulele-gazdă (inclusiv populaţiile acestora) şi anticorpii (inclusiv porţiunile de legare la antigen ale acestora) pot fi izolaţi şi/sau purificaţi. Termenul „izolat», astfel cum este utilizat în prezentul document, înseamnă că a fost îndepărtat din mediul său natural. Termenul „purificat», astfel cum este utilizat în prezentul document, înseamnă că a crescut în puritate, unde „puritate» este un termen relativ şi nu trebuie interpretat în mod necesar ca puritate absolută. De exemplu, puritatea poate fi de cel puţin aproximativ 50%, poate fi mai mare de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% sau poate fi de 100%.

Construcţiile de recunoaştere a antigenului, TCR-urile, polipeptidele, proteinele (inclusiv variantele funcţionale ale acestora), acizii nucleici, vectorii de exprimare recombinanţi, celulele-gazdă (inclusiv populaţiile acestora) şi anticorpii (inclusiv porţiunile de legare la antigen din acestea), toate acestea fiind denumite în continuare în mod colectiv „materiale TCR», pot fi formulate într-o compoziţie, cum ar fi o compoziţie farmaceutică. În acest sens, este prezentată o compoziţie farmaceutică care cuprinde oricare dintre construcţiile de recunoaştere a antigenului, TCR-urile, polipeptidele, proteinele, porţiunile funcţionale, variantele funcţionale, acizii nucleici, vectorii de exprimare, celulele-gazdă (inclusiv populaţiile acestora) şi anticorpii (inclusiv porţiunile de legare la antigen) descrise în prezentul document şi un purtător, excipient şi/sau stabilizator acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Compoziţiile farmaceutice care conţin oricare dintre materialele TCR pot cuprinde mai mult de un material TCR, de exemplu, o polipeptidă şi un acid nucleic, sau două sau mai multe TCR-uri diferite (inclusiv porţiuni funcţionale şi variante funcţionale ale acestora). Alternativ, compoziţia farmaceutică poate cuprinde un material TCR în combinaţie cu alt (alţi) agent (agenţi) sau medicament(e) farmaceutic activ(e), cum ar fi agenţii chimioterapeutici, de exemplu, asparaginază, busulfan, carboplatină, cisplatină, daunorubicin, doxorubicină, fluorouracil, gemcitabină, hidroxiuree, metotrexat, paclitaxel, rituximab, vinblastină, vincristină etc. De preferinţă, purtătorul este un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În ceea ce priveşte compoziţiile farmaceutice, purtătorul poate fi oricare dintre cei utilizaţi în mod convenţional pentru materialul TCR în cauză. Astfel de purtători acceptaţi din punct de vedere farmaceutic sunt bine cunoscuţi de specialiştii în domeniu şi sunt uşor disponibili publicului. Este de preferat ca purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic să fie unul care nu are efecte secundare dăunătoare sau toxicitate în condiţiile de utilizare.

Astfel, este furnizată, de asemenea, o compoziţie farmaceutică, care cuprinde oricare dintre produsele descrise aici ale invenţiei şi materialele TCR ale invenţiei, în special orice proteine, acizi nucleici sau celule-gazdă. Într-o concretizare preferată, compoziţia farmaceutică este destinată imunoterapiei, de preferinţă terapiei celulare adoptive.

De preferinţă, materialul TCR este administrat prin injectare, de exemplu, intravenos. Atunci când materialul TCR este o celulă-gazdă care exprimă TCR-ul din invenţie (sau o variantă funcţională a acestuia), purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic pentru celulele pentru injectare poate include orice purtător izotonic, cum ar fi, de exemplu, soluţie salină normală (aproximativ 0,5 %). 90% p/v de NaCl în apă, aproximativ 300 mOsm/l NaCl în apă sau aproximativ 9,0 g NaCl pe litru de apă), soluţie de electrolit NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), aproximativ 5% dextroză în apă sau lactat Ringer. Într-o concretizare, purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic este suplimentat cu albumină serică umană.

Cantitatea sau doza (de exemplu, numărul de celule atunci când materialul TCR constă din una sau mai multe celule) de material TCR administrat poate fi suficientă pentru a afecta, de exemplu, un răspuns terapeutic sau profilactic, la subiect sau la animal într-un interval de timp rezonabil. De exemplu, doza de material TCR ar trebui să fie suficientă pentru a se lega de un antigen de cancer sau pentru a detecta, trata sau preveni cancerul într-o perioadă de aproximativ 2 ore sau mai mult, de exemplu, între 12 şi 24 de ore sau mai mult, de la momentul administrării. În anumite concretizări, perioada de timp poate fi chiar mai lungă. Doza va fi determinată de eficacitatea materialului TCR respectiv şi de starea animalului (de exemplu, a omului), precum şi de greutatea corporală a animalului (de exemplu, a omului) care urmează să fie tratat.

Se are în vedere faptul că compoziţiile farmaceutice, TCR-urile (inclusiv variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele, proteinele, acizii nucleici, vectorii de expresie recombinantă, celulele-gazdă sau populaţiile de celule pot fi utilizate în metodele de tratare sau de prevenire a cancerului sau a premalignităţii COL6A3-pozitive. Se consideră că TCR-urile (şi variantele funcţionale ale acestora) se leagă în mod specific de antigenul COL6A3, astfel încât TCR-ul (sau polipeptida sau proteina înrudită din invenţie şi variantele funcţionale ale acesteia), atunci când este exprimată de o celulă, este capabilă să medieze un răspuns imunitar împotriva unei celule-ţintă care exprimă antigeni COL6A3. În acest sens, este prezentată o metodă de tratare sau de prevenire a unei afecţiuni, în special a cancerului, la un mamifer, care constă în administrarea mamiferului respectiv a oricăreia dintre compoziţiile farmaceutice, construcţiile de recunoaştere a antigenului, în special TCR-uri (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele sau proteinele descrise aici, a oricărui acid nucleic sau vector de exprimare recombinant care cuprinde o secvenţă de nucleotide care codifică oricare dintre TCR-uri (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele, proteinele descrise în prezentul document sau orice celulă-gazdă sau populaţie de celule-gazdă care cuprinde un vector recombinant, care codifică oricare dintre construcţiile invenţiei (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele sau proteinele descrise în prezentul document, într-o cantitate eficace pentru a trata sau preveni afecţiunea la mamifer, în care afecţiunea este cancerul, de preferinţă cancerul COL6A3-pozitiv.

Exemple de purtători sau diluanţi acceptabili din punct de vedere farmaceutic utile în prezenta invenţie includ stabilizatori precum SPGA, carbohidraţi (de exemplu, sorbitol, manitol, amidon, zaharoză, glucoză, dextran), proteine precum albumina sau cazeina, agenţi care conţin proteine precum serul bovin sau laptele degresat şi tampoane (de exemplu, tampon fosfat).

Termenii „a trata» şi „a preveni», precum şi cuvintele derivate din aceştia, aşa cum sunt utilizate în prezentul document, nu implică în mod necesar un tratament sau o prevenire 100% sau completă. Mai degrabă, există diferite grade de tratament sau de prevenire pe care o persoană cu experienţă obişnuită în domeniu le recunoaşte ca având un potenţial beneficiu sau efect terapeutic. În acest sens, metodele din invenţie pot furniza orice cantitate de orice nivel de tratament sau de prevenire a unei afecţiuni la un mamifer. În plus, tratamentul sau prevenirea asigurată prin metoda din invenţie poate include tratarea sau prevenirea uneia sau mai multor afecţiuni sau simptome ale afecţiunii, de exemplu, cancerul, care este tratată sau prevenită. De exemplu, tratamentul sau prevenirea poate include promovarea regresiei unei tumori. De asemenea, în sensul prezentului document, „prevenirea» poate cuprinde întârzierea apariţiei afecţiunii sau a unui simptom sau a unei afecţiuni a acestuia.

De asemenea, este prezentată aici o metodă de tratare a cancerului care cuprinde administrarea unui TCR, a unui acid nucleic sau a unei celule-gazdă din prezenta descriere în combinaţie cu cel puţin un agent chimioterapeutic şi/sau radioterapie.

De asemenea, este prezentată aici o metodă de tratare a cancerului la un subiect care are nevoie de aceasta, care cuprinde:

a) izolarea unei celule de la respectivul subiect;

b) transformarea celulei cu cel puţin un vector care codifică o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta invenţie pentru a produce o celulă transformată;

c) extinderea celulei transformate pentru a produce o pluralitate de celule transformate; şi

d) administrarea pluralităţii de celule transformate la respectivul subiect.

De asemenea, este prezentată aici o metodă de tratare a cancerului la un subiect care are nevoie de aceasta, care cuprinde:

a) izolarea unei celule de la un donator sănătos;

b) transformarea celulei cu un vector care codifică o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta invenţie pentru a produce o celulă transformată;

c) extinderea celulei transformate pentru a produce o pluralitate de celule transformate; şi

d) administrarea pluralităţii de celule transformate la respectivul subiect.

De asemenea, este prezentată aici o metodă de detectare a cancerului într-o probă biologică, care cuprinde:

a) punerea în contact a probei biologice cu o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta descriere;

b) detectarea legării construcţiei de recunoaştere a antigenului la proba biologică.

Metoda de detectare a cancerului poate fi efectuată in vitro, in vivo sau in situ.

De asemenea, este prezentată aici o metodă de detectare a prezenţei unei afecţiuni la un mamifer. Metoda cuprinde (i) punerea în contact a unei probe care cuprinde una sau mai multe celule de la mamifer cu oricare dintre TCR-uri (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptide, proteine, acizi nucleici, vectori de exprimare recombinanţi, celule-gazdă, populaţii de celule, anticorpi sau porţiuni de legare la antigen din aceştia ori compoziţii farmaceutice descrise în prezentul document, formând astfel un complex, şi detectarea complexului, în care detectarea complexului indică prezenţa afecţiunii la mamifer, în care afecţiunea este cancerul, cum ar fi o tumoare malignă COL6A3-pozitivă.

În ceea ce priveşte metoda de detectare a unei afecţiuni la un mamifer, proba de celule poate fi o probă care cuprinde celule întregi, lizate ale acestora sau o fracţiune din lizate de celule întregi, de exemplu, o fracţiune nucleară sau citoplasmatică, o fracţiune de proteine întregi sau o fracţiune de acid nucleic.

În scopul metodei de detectare, contactul poate avea loc in vitro sau in vivo în ceea ce priveşte mamiferul. De preferinţă, punerea în contact se face in vitro.

De asemenea, detectarea complexului poate avea loc prin orice număr de moduri cunoscute în domeniu. De exemplu, construcţiile de recunoaştere a antigenului (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele, proteinele, acizii nucleici, vectorii de exprimare recombinanţi, celulele-gazdă, populaţiile de celule, sau anticorpii ori TCR-urile sau porţiunile de legare la antigen din acestea, descrise în prezentul document, pot fi marcate cu un marcaj detectabil, cum ar fi, de exemplu, un radioizotop, un fluorofor (de exemplu izotiocianat de fluoresceină (FITC), ficoeritrină (PE)), o enzimă (de exemplu, fosfatază alcalină, peroxidază de hrean) şi particule de elemente (de exemplu, particule de aur).

În scopul metodelor, în care se administrează celule-gazdă sau populaţii de celule, celulele pot fi celule alogene sau autologe pentru mamifer. De preferinţă, celulele sunt autologe pentru mamifer.

În ceea ce priveşte aplicaţiile medicale menţionate mai sus ale materialului TCR, cancerul care trebuie tratat şi/sau diagnosticat poate fi orice cancer, inclusiv oricare dintre cancer limfocitic acut, leucemie mieloidă acută, rabdomiosarcom alveolar, cancer osos, cancer cerebral, cancer de glandă mamară, cancer anal, de canal anal sau anorectal, cancer ocular, cancer de cale biliară intrahepatică, cancer de articulaţii, cancer de gât, de vezică biliară sau de pleură, cancer de nas, de cavitate nazală sau de ureche medie, cancer de cavitate bucală, cancer vaginal, cancer vulvar, leucemie limfocitară cronică, cancer mieloid cronic, cancer de colon, cancer esofagian, cancer de col uterin, tumoră carcinoidă gastrointestinală, gliom, limfom Hodgkin, cancer hipofaringian , cancer de rinichi, cancer laringian, cancer hepatic, cancer pulmonar, mezoteliom malign, melanom, mielom multiplu, cancer nazofaringian, limfom non-Hodgkin, cancer orofaringian, cancer ovarian, cancer penian, cancer de pancreas, de peritoneu, de oment şi cancer mezenteric, cancer faringian, cancer de prostată, cancer rectal, cancer renal, cancer de piele, cancer de intestin subţire, cancer de ţesuturi moi, cancer de stomac, cancer testicular, cancer tiroidian, cancer uterin, cancer de ureter şi cancer de vezică urinară. Un cancer preferat este cancerul de col uterin, cancerul orofaringian, cancerul anal, cancerul canalului anal, cancerul anorectal, cancerul vaginal, cancerul vulvar sau cancerul penian. Un cancer deosebit de preferat este un cancer COL6A3-pozitiv, cum ar fi cancerul gastrointestinal sau cancerul gastric.

În general, în prezentul document este prezentată o metodă de tratare a unui subiect care suferă de o tumoare sau de o boală tumorală, care cuprinde administrarea de construcţii de recunoaştere a antigenului, acizi nucleici, vectori, compoziţii farmaceutice şi/sau celule-gazdă, astfel cum sunt prezentate în prezenta invenţie. De preferinţă, subiectul este un subiect care are nevoie de un astfel de tratament. În concretizările preferate, subiectul este un mamifer, de preferinţă un pacient uman, care suferă de o tumoare sau o boală tumorală care este COL6A3-pozitivă.

Prezenta invenţie va fi descrisă în continuare în exemplele de mai jos, cu referire la figurile şi secvenţele care însoţesc prezenta invenţie, cu toate acestea, fără a fi limitată la acestea. În figuri şi secvenţe:

Figura 1: Eliberarea de IFNγ (axa din stânga) şi coloraţia tetramerică HLA-A*02/COL6A3-002 (axa din dreapta) a celulelor T CD8+ primare umane de la un donator electroporat cu ARN de lanţ alfa şi, respectiv, beta al TCR-ului R4P1D10 (Tabelul 1), după co-incubarea cu celule-ţintă K562-A2 (vezi Hirano N. et al; Blood. 2006 Feb 15;107(4):1528-36) încărcate cu peptida COL6A3-002 (SEQ ID NO:58), diverse variante de substituţie COL6A3-002 cu alanină sau glicină în poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 59-67) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 68).

Figura 2: Eliberarea de IFNγ (axa din stânga) şi colorarea tetramerului HLA-A*02/COL6A3-002 (axa din dreapta) a celulelor T CD8+ primare umane de la un donator electroporat cu ARN de lanţ alfa şi, respectiv, de lanţ beta al TCR-ului R4P1D10 (Tabelul 1), după co-incubarea cu celule-ţintă K562-A2 încărcate cu peptida COL6A3-002 (SEQ ID NO: 58), peptida omologă, dar fără legătură, AGRN-001, CLASP-001, COL6A1-001, COL6A2-001, COL6A3-006, COL6A3-008, COL6A3-014, VWA2-001, VWF-001 (SEQ ID NO: 49-57) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 68). Celulele T CD8+ numai electroporate (Numai E) servesc drept control.

Figura 3: Colorarea tetramerilor HLA-A*02/COL6A3-002 şi, respectiv, a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 din celulele J.RT3-T3.5 electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R4P1D10 sau al TCR-ului de control 1G4 specific NYESO1-001 (Tabelul 1). Celulele J.RT3-T3.5 electroporate simulat servesc drept control.

Figura 4: Colorarea tetramerilor HLA-A*02/COL6A3-002 şi, respectiv, a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 din celulele SUP-T1 electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R4P1D10 sau al TCR-ului de control 1G4 specific NYESO1-001 (Tabelul 1). Celulele SUP-T1 electroporate simulat servesc drept control.

Figura 5: Colorarea tetramerilor HLA-A*02/COL6A3-002 şi, respectiv, a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 din celulele T CD8+ primare umane de la un donator electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R4P1D10 sau al TCR-ului de control 1G4 specific NYESO1-001 (Tabelul 1). Celulele T CD8+ electroporate simulat servesc drept control.

Figura 6: Eliberarea de IFNγ a celulelor T CD8+ primare umane de la un donator electroporat cu ARN de lanţ alfa şi, respectiv, de lanţ beta al TCR-ului R4P3F9 (Tabelul 1), după co-incubarea cu celule-ţintă K562-A2 încărcate cu peptida COL6A3-002 (SEQ ID NO: 58), diferite variante de substituţie cu alanină sau glicină COL6A3-002 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 9-67) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 68).

Figura 7: Eliberarea de IFNγ a celulelor T CD8+ primare umane de la un donator electroporat cu ARN de lanţ alfa şi, respectiv, de lanţ beta al TCR-ului R4P3F9 (Tabelul 1), după co-incubarea cu celule-ţintă K562-A2 încărcate cu peptida COL6A3-002 (SEQ ID NO: 58), peptida omologă, dar fără legătură, AGRN-001, CLASP-001, COL6A1-001, COL6A2-001, COL6A3-006, COL6A3-008, COL6A3-014, VWA2-001, VWF-001 (SEQ ID NO: 49-57) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 68). Celulele T CD8+ electroporate simulat (Numai E ) servesc drept control.

Figura 8: Colorarea tetramerilor HLA-A*02/COL6A3-002 şi, respectiv, a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 din celulele J.RT3-T3.5 electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R4P3F9 sau al TCR-ului de control 1G4 specific NYESO1-001 (Tabelul 1). Celulele J.RT3-T3.5 electroporate simulat servesc drept control.

Figura 9: Colorarea tetramerilor HLA-A*02/COL6A3-002 şi, respectiv, a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 din celulele SUP-T1 electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R4P3F9 sau al TCR-ului de control 1G4 specific NYESO1-001 (Tabelul 1). Celulele SUP-T1 electroporate simulat servesc drept control.

Figura 10: Eliberarea de IFNγ a celulelor T CD8+ primare umane de la un donator electroporat cu ARN de lanţ alfa şi, respectiv, de lanţ beta al TCR-ului R4P3H3 (Tabelul 1), după co-incubarea cu celule-ţintă K562-A2 încărcate cu peptida COL6A3-002 (SEQ ID NO: 58), diferite variante de substituţie cu alanină sau glicină COL6A3-002 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 9-67) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 68).

Figura 11: Eliberarea de IFNγ a celulelor T CD8+ primare umane de la un donator electroporat cu ARN de lanţ alfa şi, respectiv, de lanţ beta al TCR-ului R4P3H3 (Tabelul 1), după co-incubarea cu celule-ţintă K562-A2 încărcate cu peptida COL6A3-002 (SEQ ID NO: 58), peptida omologă, dar fără legătură, AGRN-001, CLASP-001, COL6A1-001, COL6A2-001, COL6A3-006, COL6A3-008, COL6A3-014, VWA2-001, VWF-001 (SEQ ID NO: 49-57) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 68). Celulele T CD8+ electroporate simulat (Numai E ) servesc drept control.

Figura 12: Colorarea tetramerilor HLA-A*02/COL6A3-002 şi, respectiv, a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 din celulele SUP-T1 electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R4P3H3 sau al TCR-ului de control 1G4 specific NYESO1-001 (Tabelul 1). Celulele SUP-T1 electroporate simulat servesc drept control.

Tabelul 1: Secvenţe TCR ale invenţiei

SEQ ID NO: TCR Lanţ Regiune Secvenţă 1 R4P1D10 alfa CDR1 DRGSQS 2 R4P1D10 alfa CDR2 IY 3 R4P1D10 alfa CDR3 CAVNFHDKIIF 4 R4P1D10 alfa domeniu variabil MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVN 5 R4P1D10 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 6 R4P1D10 alfa lungime completă MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVNFHDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 7 R4P1D10 beta CDR1 SGDLS 8 R4P1D10 beta CDR2 YYNGEE 9 R4P1D10 beta CDR3 CASSVASAYGYTF 10 R4P1D10 beta domeniu variabil MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSV 11 R4P1D10 beta domeniu constant EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 12 R4P1D10 beta lungime completă MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVASAYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 13 R4P3F9 alfa CDR1 DRGSQS 14 R4P3F9 alfa CDR2 IY 15 R4P3F9 alfa CDR3 CAAYSGAGSYQLTF 16 R4P3F9 alfa domeniu variabil MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCA 17 R4P3F9 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 18 R4P3F9 alfa lungime completă MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 19 R4P3F9 beta CDR1 SGDLS 20 R4P3F9 beta CDR2 YYNGEE 21 R4P3F9 beta CDR3 CASSVESSYGYTF 22 R4P3F9 beta domeniu variabil MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSV 23 R4P3F9 beta domeniu constant EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 24 R4P3F9 beta lungime completă MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 25 R4P3H3 alfa CDR1 DRGSQS 26 R4P3H3 alfa CDR2 IY 27 R4P3H3 alfa CDR3 CAVKAGNQFYF 28 R4P3H3 alfa domeniu variabil MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAV 29 R4P3H3 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 30 R4P3H3 alfa lungime completă MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKAGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 31 R4P3H3 beta CDR1 SGHVS 32 R4P3H3 beta CDR2 FQNEAQ 33 R4P3H3 beta CDR3 CASSLLTSGGDNEQFF 34 R4P3H3 beta domeniu variabil MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSL 35 R4P3H3 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 36 R4P3H3 beta lungime completă MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSLLTSGGDNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 37 1G4 alfa CDR1 DSAIYN 38 1G4 alfa CDR2 IQS 39 1G4 alfa CDR3 CAVRPTSGGSYIPTF 40 1G4 alfa domeniu variabil METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVR 41 1G4 alfa domeniu constant YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 42 1G4 alfa lungime completă METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 43 1G4 beta CDR1 MNHEY 44 1G4 beta CDR2 SVGAGI 45 1G4 beta CDR3 CASSYVGNTGELFF 46 1G4 beta domeniu variabil MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSY 47 1G4 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 48 1G4 beta lungime completă MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

Tabelul 2: Secvenţe peptidice

Cod peptidă Secvenţă SEQ ID NO: AGRN-001 ALLDGRVQL 49 CLASP1-001 RLLDGAFKL 50 COL6A1-001 ILLDGSASV 51 COL6A2-001 FLLDGSERL 52 COL6A3-006 FLFDGSANLV 53 COL6A3-008 FLFDGSANL 54 COL6A3-014 FLLDGSEGV 55 VWA2-001 FLLDGSNSV 56 VWF-001 FLLDGSSRL 57 COL6A3-002 FLLDGSANV 58 A1 ALLDGSANV 59 A2 FALDGSANV 60 A3 FLADGSANV 61 A4 FLLAGSANV 62 A5 FLLDASANV 63 A6 FLLDGAANV 64 A7 FLLDGSGNV 65 A8 FLLDGSAAV 66 A9 FLLDGSANA 67 NYESO1-001 SLLMWITQV 68

EXEMPLE

Într-un aspect, se utilizează medii alo-reactive pentru a evita auto-toleranţa şi pentru a produce celule T cu o aviditate mai mare în comparaţie cu celulele T derivate din medii autologe, adică de la pacienţi. Exemple de astfel de setări includ generarea in vitro de celule T reactive alo-HLA, specifice peptidelor (Sadovnikova et al. 1998; Savage et al. 2004; Wilde et al. 2012) şi imunizarea şoarecilor transgenici pentru MHC uman sau TCR uman (Stanislawski et al. 2001; Li et al. 2010).

Pentru a izola celule T cu aviditate ridicată din mediul alo-reactiv, se utilizează PBMC-uri de la donatori sănătoşi HLA-A*02-negativi, după obţinerea consimţământului informat. Monomerii de clasă I HLA-A*02 biotinilaţi recombinanţi şi tetramerii fluorescenţi A2 care conţin COL6A3-002 sunt obţinuţi de la MBLI (Woburn, MA). PBMC-urile sunt incubate cu anti-CD20SA diluat în soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 1 oră la temperatura camerei, spălate şi incubate cu monomerii HLA-A*02/COL6A3-002 biotinilaţi timp de 30 de minute la temperatura camerei, spălate şi plasate la 3x106 celule/godeu în plăci cu 24 de godeuri în RPMI cu 10% ser AB uman. Interleukina 7 (IL-7; R&D Systems, Minneapolis, MN) a fost adăugată în ziua 1 la 10 ng/ml, iar IL-2 (Chiron, Harefield, Regatul Unit) a fost adăugată la 10 U/ml în ziua 4. Pe o perioadă de 5 săptămâni, celulele au fost restimulate săptămânal cu PBMC-uri proaspete, amestecate cu celule respondente într-un raport de 1:1 şi plasate la 3x106/godeu în plăci cu 24 de godeuri.

Pentru a se obţine celule T cu aviditate crescută, aproximativ 106 PBMC-uri cu tetramer-ficoeritrină (PE) HLA-A*02/COL6A3-002 (obţinut de la MBLI) au fost incubate timp de 30 de minute la 37°C, urmat de izotiocianat de fluoresceină (FITC) anti-CD8/alofizocianină (APC) timp de 20 de minute la 4°C, urmat de sortare celulară activată prin fluorescenţă. Celulele tetramer-pozitive sortate au fost expandate în plăci cu 24 de godeuri folosindu-se, pentru fiecare godeu, 2x105 celule sortate, 2x106 PBMC-uri A2-negative iradiate ca celule de nutriţie, 2x104 granule CD3/CD28/ml (Dynal, Oslo, Norvegia) şi IL-2 (1000 U/ml). Celulele T cu aviditate ridicată, astfel obţinute, au fost apoi folosite pentru a identifica şi izola TCR-uri folosindu-se tehnici cunoscute în domeniu, cum ar fi tehnica monocelulară 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). ADN-urile TCR non-redundante au fost apoi analizate pentru determinarea secvenţelor de aminoacizi/ADN şi clonarea în vectori de exprimare.

Trei TCR-uri specifice COL6A3-002 (R4P1D10, R4P3F9 şi R4P3H3, vezi Tabelul 2), fiecare codificând lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta specifice tumorilor, au fost izolate şi amplificate din celulele T ale donatorilor sănătoşi. Celulele de la donatori sănătoşi au fost stimulate in vitro conform unei metode descrise anterior. (Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15;171(10):4974-8). Prezentarea peptidelor COL6A3 a fost realizată aşa cum a fost descris anterior (Hirano N. et al; Blood. 2006 Feb 15;107(4):1528-36). Celulele specifice ţintei au fost sortate monocelular utilizându-se multimeri HLA-A*02 şi apoi au fost utilizate pentru izolarea ulterioară a TCR-urilor. Secvenţele TCR au fost izolate prin 5' RACE prin metode standard descrise, de exemplu, în „Molecular Cloning, a laboratory manual, fourth edition» de Green şi Sambrook. Regiunile variabile alfa şi beta ale TCR-urilor R4P1D10, R4P3F9 şi R4P3H3 au fost secvenţiate şi clonate pentru o caracterizare funcţională ulterioară. R4P1D10 şi R4P3H3 provin de la donatori HLA-A*02 pozitivi, iar R4P3F9 provine de la un donator HLA-A*02 negativ (context alo-reactiv).

Tabelul 3: Afinitatea SPR a TCR-urilor COL6A3-002 şi NYESO1-001

TCR Constanta de disociere la echilibru (KD) pentru complexul HLA-A02/COL6A3-002 în µM Constanta de disociere la echilibru (KD) pentru complexul HLA-A02/NYESO1-001 în µM R4P1D10 16 fără legare R4P3F9 62 fără legare R4P3H3 102 fără legare 1G4 fără legare 7

Exemplul 1: R4P1D10 receptor de celule T

Lanţurile alfa şi beta ale TCR R4P1D10 au fost clonate aşa cum s-a descris anterior, de exemplu, aşa cum este descris în U.S. 8.519.00. TCR-ul R4P1D10 este restricţionat faţă de COL6A3-002 HLA-A2-prezentat (vezi Tabelul 3 de mai sus).

Tabelul 4: Caracteristici ale lanţului alfa R4P1D10:

Start Stop Descriere Secvenţă 1 21 Segment L (TRAV12-2) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ (SEQ ID NO: 69) 1 113 Lanţ V (TRAV12-2) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVN 48 53 CDR1 DRGSQS 71 72 CDR2 IY 110 120 CDR3 CAVNFHDKIIF 116 130 Segment J (TRAJ30) DKIIFGKGTRLHILP 131 272 Regiune constantă (TRAC) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

Tabelul 5: Caracteristici ale lanţului beta R4P1D10:

Start Stop Descriere Secvenţă 1 19 Segment L (TRBV9) MGFRLLCCVAFCLLGAGPV (SEQ ID NO: 70) 1 114 Lanţ V (TRBV9) MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSV 46 50 CDR1 SGDLS 68 73 CDR2 YYNGEE 110 122 CDR3 CASSVASAYGYTF 118 131 Lanţ J (TRBJ1-2) YGYTFGSGTRLTVV 132 308 Regiune constantă (TRBC1) EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF

R4P1D10 recunoaşte în mod specific COL6A3-002, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ şi, respectiv, tetrameri HLA-A*02 de legare, încărcate fie cu peptida COL6A3-002, fie cu variante de substituţie cu alanină şi glicină ale COL6A3-002 (figura 1) sau cu diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu COL6A3-002 (Figura 2). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ.

Reexprimarea R4P1D10 conduce la legarea selectivă a tetramerului HLA-A*02/COL6A3-002, dar nu şi a tetramerului HLA-A*02/NYESO1-001 în celulele Jurkat J.RT3-T3.5 (Figira 3), celulele SUP-T1 (Figura 4) şi în celulele T CD8+ primare umane (Figura 5). Pentru fiecare tip de celule, reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.

Analiza de legare SPR (Surface Plasmon Resonance) pentru R4P1D10, exprimat ca TCR solubil în conformitate cu o metodă descrisă anterior (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov;8(11):2418-23), şi complexul HLA-A*02/COL6A3-002 relevă o afinitate de KD =102 µM (Tabelul 3). Datele de legare SPR pentru 1G4 TCR şi HLA-A*02/NYESO1-001 sunt utilizate drept control.

Exemplul 2: Receptor de celule T R4P3F9

Lanţurile alfa şi beta ale TCR R4P3F9 au fost clonate aşa cum s-a descris anterior, de exemplu, aşa cum este descris în U.S. 8.519.00. TCR-ul R4P3F9 este restricţionat faţă de COL6A3-002 HLA-A2-prezentat (vezi Tabelul 3 de mai sus).

Tabelul 6: Caracteristici ale lanţului alfa R4P3F9

Start Stop Descriere Secvenţă 1 21 Segment L (TRAV12-2) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ (SEQ ID NO: 71) 1 111 Lanţ V (TRAV12-2) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCA 48 53 CDR1 DRGSQS 71 72 CDR2 IY 110 123 CDR3 CAAYSGAGSYQLTF 113 133 Segment J (TRAJ28) YSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP 134 274 Regiune constantă (TRAC) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

Tabelul 7: Caracteristici ale lanţului beta R4P3F9

Start Stop Descriere Secvenţă 1 19 Segment L (TRBV9) MGFRLLCCVAFCLLGAGPV (SEQ ID NO: 72) 1 114 Lanţ V (TRBV9) MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSV 46 50 CDR1 SGDLS 68 73 CDR2 YYNGEE 110 122 CDR3 CASSVESSYGYTF 118 131 Lanţ J (TRBJ1-2) YGYTFGSGTRLTVV 132 308 Regiune constantă (TRBC1) EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF

R4P3F9 recunoaşte în mod specific COL6A3-002, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+, respectiv, încărcate fie cu peptida COL6A3-002, fie cu variante de substituţie cu alanină şi glicină ale COL6A3-002 (Figura 6), fie cu diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu COL6A3-002 (Figura 7). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ.

Reexprimarea R4P3F9 conduce la legarea selectivă a tetramerului HLA-A*02/COL6A3-002, dar nu şi a tetramerului HLA-A*02/NYESO1-001 în celulele Jurkat J.RT3-T3.5 (Figura 8) şi în celulele SUP-T1 (Figura 9). Pentru fiecare tip de celule, reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.

Analiza de legare SPR pentru R4P3F9, exprimat ca TCR solubil în conformitate cu o metodă descrisă anterior (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov;8(11):2418-23), şi complexul HLA-A*02/COL6A3-002 relevă o afinitate de KD =62 µM (Tabelul 3). Datele de legare SPR pentru 1G4 TCR şi HLA-A*02/NYESO1-001 sunt utilizate drept control.

Exemplul 3: Receptor de celule T R4P3H3

Lanţurile alfa şi beta ale TCR R4P3H3 au fost clonate aşa cum s-a descris anterior, de exemplu, aşa cum este descris în U.S. 8.519.00, care este încorporat prin prezenta prin referinţă în întregime. TCR-ul R4P3H3H3 este restricţionat faţă de COL6A3-002 HLA-A2-prezentat (vezi Tabelul 3 de mai sus).

Tabelul 8: Caracteristici ale lanţului alfa R4P3H3

Start Stop Descriere Secvenţă 1 21 Segment L (TRAV12-2) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ (SEQ ID NO: 73) 1 112 Lanţ V (TRAV12-2) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAV 48 53 CDR1 DRGSQS 71 72 CDR2 IY 110 120 CDR3 CAVKAGNQFYF 115 130 Segment J (TRAJ49) GNQFYFGTGTSLTVIP 131 271 Regiune constantă (TRAC) NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

Tabelul 9: Caracteristici ale lanţului beta R4P3H3

Start Stop Descriere Secvenţă 1 19 Segment L (TRBV7-8) MGTRLLCWVVLGFLGTDHT (SEQ ID NO: 74) 1 115 Lanţ V (TRBV7-8) MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSL 46 50 CDR1 SGHVS 68 73 CDR2 FQNEAQ 111 126 CDR3 CASSLLTSGGDNEQFF 122 135 Lanţ J (TRBJ2-1) NEQFFGPGTRLTVL 136 314 Regiune constantă (TRBC2) EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

R4P3H3 recunoaşte în mod specific COL6A3-002, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+, respectiv, încărcate fie cu peptida COL6A3-002, fie cu variante de substituţie cu alanină şi glicină ale COL6A3-002 (figura 10) sau cu diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu COL6A3-002 (Figura 11). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ.

Reexprimarea R4P3H3 conduce la legarea selectivă a tetramerului HLA-A*02/COL6A3-002, dar nu şi a tetramerului HLA-A*02/NYESO1-001 în celulele SUP-T1 (Figura 12). Reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.

Analiza de legare SPR pentru R4P3H3, exprimat ca TCR solubil în conformitate cu o metodă descrisă anterior (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov;8(11):2418-23), şi complexul HLA-A*02/COL6A3-002 relevă o afinitate de KD =102 µM (Tabelul 3). Datele de legare SPR pentru 1G4 TCR şi HLA-A*02/NYESO1-001 sunt utilizate drept control.

Claims (15)

1. O construcţie de recunoaştere a antigenului care se leagă în mod specific şi/sau selectiv de o peptidă antigenică COL6A3 având secvenţa de aminoacizi prezentată în SEQ ID NO: 58, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde regiunile determinante complementare (CDR) (i) secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 şi, respectiv, SEQ ID NO: 3 şi secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 şi, respectiv, SEQ ID NO: 9 sau (ii) secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 şi, respectiv, SEQ ID NO: 15 şi secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 şi, respectiv, SEQ ID NO: 21 sau (iii) secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 şi, respectiv, SEQ ID NO: 27 şi secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 şi, respectiv, SEQ ID NO: 33; în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde secvenţele respective de aminoacizi CDR cu cel mult unul, doi sau trei aminoacizi modificaţi, în care aminoacidul modificat este selectat dintre o inserţie, o deleţie sau o substituţie de aminoacizi.

2. O construcţie de recunoaştere a antigenului care cuprinde un receptor de celule T (TCR) sau un fragment al acestuia care se leagă în mod specific şi/sau selectiv de o peptidă antigenică COL6A3 având secvenţa de aminoacizi prezentată în SEQ ID NO: 58, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde regiunile determinante complementare (CDR) (i) secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 şi SEQ ID NO: 3 şi secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 7 şi SEQ ID NO: 9 sau (ii) secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 13 şi SEQ ID NO: 15 şi secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 19 şi SEQ ID NO: 21 sau (iii) secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 25 şi SEQ ID NO: 27 şi secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 31 şi SEQ ID NO: 33; în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde secvenţele respective de aminoacizi CDR cu cel mult unul, doi sau trei aminoacizi modificaţi, în care aminoacidul modificat este selectat dintre o inserţie, o deleţie sau o substituţie de aminoacizi.

3. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu Revendicarea 2, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului mai cuprinde CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 2 şi CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 8 sau CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 14 şi CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 20 sau CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 26 şi CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 32.

4. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu una dintre Revendicările 1 sau 3, în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un anticorp, un derivat sau un fragment al acestuia, sau un receptor de celule T (TCR), un derivat sau un fragment al acestuia; sau construcţia de recunoaştere a antigenului din Revendicarea 2, în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR, un derivat sau un fragment al acestuia.

5. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu Revendicarea 4, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului este un TCR cu un singur lanţ (scTCR).

6. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-5, care este un TCR sau un fragment al acestuia compus dintr-o regiune de lanţ variabil TCR alfa şi o regiune de lanţ variabil TCR beta, (i) în care regiunea de lanţ variabil TCR alfa menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 4 sau o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 50% identitate cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 4 şi în care regiunea de lanţ variabil TCR alfa cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 din SEQ ID NO: 1, 2 şi 3 şi în care regiunea de lanţ variabil TCR beta menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 10 sau o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 50% cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 10 şi în care regiunea lanţului variabil TCR beta cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 din SEQ ID NO: 7, 8 şi 9 sau (ii) în care regiunea de lanţ variabil TCR alfa menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 16 sau o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 50% identitate cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 16 şi în care regiunea de lanţ variabil TCR alfa cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 din SEQ ID NO: 13, 14 şi 15 şi în care regiunea de lanţ variabil TCR beta menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 22 sau o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 50% cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 22 şi în care regiunea lanţului variabil TCR beta cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 din SEQ ID NO: 19, 20 şi 21 sau (iii) în care regiunea de lanţ variabil TCR alfa menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 28 sau o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 50% identitate cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 28 şi în care regiunea de lanţ variabil TCR alfa cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 din SEQ ID NO: 25, 26 şi 27 şi în care regiunea de lanţ variabil TCR beta menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 34 sau o secvenţă de aminoacizi care are o identitate de cel puţin 50% cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 34 şi în care regiunea lanţului variabil TCR beta cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 din SEQ ID NO: 31, 32 şi 33.

7. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-5, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului este un TCR şi respectivul TCR cuprinde un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β sau un lanţ γ şi un lanţ δ.

8. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-7, în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR sau un fragment al acestuia, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β, în care TCR-ul mai cuprinde regiunea constantă care are o identitate de secvenţă de cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% cu o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 5 şi 11, lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 17 şi 23 şi lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 29 şi 35.

9. Un acid nucleic care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului conform uneia dintre Revendicările 1-8.

10. Un vector cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu Revendicarea 9.

11. O celulă-gazdă care cuprinde o construcţie de recunoaştere a antigenului în conformitate cu una dintre Revendicările 1-8 sau un acid nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau un vector în conformitate cu Revendicarea 10; în mod opţional, celula-gazdă este un limfocit, de preferinţă un limfocit T sau un progenitor de limfocite T, mai preferabil o celulă T CD4-pozitivă sau CD8-pozitivă.

12. O compoziţie farmaceutică care cuprinde construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8 sau acidul nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau vectorul în conformitate cu Revendicarea 10 sau celula-gazdă în conformitate cu Revendicarea 11 şi un suport, stabilizator şi/sau excipient acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

13. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu una dintre Revendicările 1-8 sau un acid nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau un vector în conformitate cu Revendicarea 10 sau o celulă-gazdă în conformitate cu Revendicarea 11 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 12 pentru utilizare în medicină, opţional pentru utilizare în diagnosticarea, prevenirea şi/sau tratarea unei boli proliferative.

14. O metodă de fabricare a unei linii celulare care exprimă o construcţie care recunoaşte antigenul specific COL6A3, care cuprinde a. furnizarea unei celule-gazdă adecvate, b. furnizarea unei construcţii genetice care cuprinde o secvenţă codificatoare care codifică construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8, c. introducerea în respectiva celulă-gazdă adecvată a respectivei construcţii genetice, d. exprimarea construcţiei genetice de către respectiva celulă-gazdă adecvată.

15. Metoda în conformitate cu Revendicarea 14, care mai cuprinde izolarea şi purificarea construcţiei de recunoaştere a antigenului din celula-gazdă adecvată şi, opţional, reconstituirea construcţiei de recunoaştere a antigenului într-o celulă T.