[go: up one dir, main page]

MD3551221T2 - Noi receptori de celule T și imunoterapie cu utilizarea acestora - Google Patents

Noi receptori de celule T și imunoterapie cu utilizarea acestora

Info

Publication number
MD3551221T2
MD3551221T2 MDE20191170T MDE20191170T MD3551221T2 MD 3551221 T2 MD3551221 T2 MD 3551221T2 MD E20191170 T MDE20191170 T MD E20191170T MD E20191170 T MDE20191170 T MD E20191170T MD 3551221 T2 MD3551221 T2 MD 3551221T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
seq
tcr
antigen recognition
cancer
amino acid
Prior art date
Application number
MDE20191170T
Other languages
English (en)
Inventor
Leonie Alten
Sebastian Bunk
Dominik Maurer
Claudia Wagner
Original Assignee
Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102016123847.3A external-priority patent/DE102016123847B3/de
Application filed by Immatics Biotechnologies Gmbh filed Critical Immatics Biotechnologies Gmbh
Publication of MD3551221T2 publication Critical patent/MD3551221T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K40/4268—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K40/4269—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie se referă la construcţii de recunoaştere a antigenului împotriva antigenilor asociat tumorii (MAGEA1). Invenţia furnizează în special molecule noi bazate pe receptori de celule T (TCR) care sunt selective şi specifice pentru antigenul exprimat de tumoare al invenţiei. TCR-ul invenţiei şi fragmentele de legare la TAA derivate din acestea sunt utile pentru diagnosticarea, tratarea şi prevenirea bolilor canceroase care exprimă TAA. Mai sunt furnizaţi acizi nucleici care codifică construcţiile care recunosc antigenul în conformitate cu invenţia, vectori care cuprind aceşti acizi nucleici, celule recombinante care exprimă construcţiile care recunosc antigenul şi compoziţii farmaceutice care cuprind compuşii invenţiei.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI
Prezenta invenţie se referă la construcţii de recunoaştere a antigenului împotriva peptidei MAGEA1-003 derivată din antigenul asociat tumorii (TAA). Invenţia furnizează în special molecule noi bazate pe receptori de celule T (TCR) care sunt selective şi specifice pentru TAA-ul invenţiei. TCR-ul invenţiei şi fragmentele de legare la TAA derivate din acestea sunt utile pentru diagnosticarea, tratarea şi prevenirea bolilor canceroase care exprimă TAA. Mai sunt furnizaţi acizi nucleici care codifică construcţiile care recunosc antigenul în conformitate cu invenţia, vectori care cuprind aceşti acizi nucleici, celule recombinante care exprimă construcţiile care recunosc antigenul şi compoziţii farmaceutice care cuprind compuşii invenţiei.
DESCRIERE
S-a constatat că genele antigenului melanomului (MAGE-A) sunt exprimate într-o varietate de tumori de origine histologică diferită. Proteinele codificate de genele MAGE sunt antigeni de respingere a tumorilor, care pot induce limfocite T citotoxice specifice (CTL) care au capacitatea de a recunoaşte şi distruge celulele canceroase. Genele şi proteinele MAGE reprezintă astfel o ţintă preferenţială pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru combaterea cancerului prin imunoterapie. Proteinele MAGE-A constituie o subfamilie de antigeni de cancer testicular care sunt exprimate în principal, dar nu exclusiv, în linia germinală. Cu toate acestea, ele sunt, de asemenea, exprimate în diverse tipuri de cancer la om, unde sunt asociate şi pot determina malignitatea. Această exprimare specifică a antigenilor MAGE în tumori şi nu în ţesutul normal sănătos din jur face ca această familie de antigeni să fie foarte interesantă pentru transferul adoptiv ţintit de celule T. Cu toate acestea, până în prezent nu se cunoaşte nicio terapie imunologică satisfăcătoare din cauza lipsei de anticorpi specifici şi foarte avizi sau de receptori de celule T care să vizeze antigenul MAGE.
Imunoterapia bazată pe celule T ţinteşte epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumorii, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Aceşti antigeni asociaţi tumorii (TAA) pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcripţie etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, reglate în sens crescător în celulele respectivei tumori.
Elementele specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod selectiv celule tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi aminoacidice derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP-uri) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).
Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Complexele de peptidă şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de receptor de celule T (TCR) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR-ul adecvat. Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii şi a receptorilor de celule T corespunzători este importantă în dezvoltarea de imunoterapii antitumorale, cum ar fi vaccinurile şi terapiile celulare.
În cazul reacţiilor imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR). Prin urmare, TAA-urile sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale şi terapii celulare.
Aproximativ 90% dintre celulele T din sângele periferic exprimă un TCR format dintr-o polipeptidă α şi o polipeptidă β. În afară de celulele T αβ, un mic procentaj de celule T (aproximativ 5% din numărul total de celule T) s-au dovedit că exprimă un TCR format dintr-o polipeptidă γ şi o polipeptidă δ. Celulele T γδ se găsesc în abundenţă maximă în mucoasa intestinală, în cadrul unei populaţii de limfocite cunoscute sub numele de limfocite intraepiteliale (IEL). Moleculele antigenice care activează celulele γδ T sunt încă foarte puţin cunoscute. Cu toate acestea, celulele γδ T nu sunt restricţionate la MHC şi par să fie capabile să recunoască proteine întregi, mai degrabă decât să aibă nevoie de peptide pentru a fi prezentate de molecule MHC pe celule prezentatoare de antigen, deşi unele recunosc moleculele MHC de clasă IB. Celulele T Vγ9/Vδ2 umane, care constituie principala populaţie de celule γδ T din sângele periferic, sunt unice prin faptul că răspund în mod specific şi rapid la un mic metabolit microbian non-peptidic, HMB-PP, un precursor de izopentenil pirofosfat.
Lanţurile receptorului antigenului de celule T al unei clone de celulă T sunt compuse fiecare dintr-o combinaţie unică de domenii denumite variabile (V), [de diversitate (D),] de îmbinare (J) şi constante (C).. În fiecare clonă de celulă T, combinaţia domeniilor V, D şi J ale lanţurilor alfa şi beta sau ale lanţurilor delta şi gama participă la recunoaşterea antigenului într-un mod care este caracteristic în mod unic pentru acea clonă de celulă T şi defineşte un situs de legare unic, cunoscut şi sub numele de idiotip al clonei de celulă T. În schimb, domeniul C nu participă la legarea antigenului.
Un TCR este o proteină heterodimerică de suprafaţă celulară din superfamilia imunoglobulinei, care este asociată cu proteine invariante ale complexului CD3 implicate în medierea transducţiei semnalului. TCR-urile există în formele αβ şi γδ, care sunt similare din punct de vedere structural, dar au locaţii anatomice şi, probabil, funcţii destul de distincte. Porţiunea extracelulară a heterodimerilor nativi αβTCR şi γδTCR conţine fiecare două polipeptide, fiecare dintre acestea având un domeniu constant proximal membranar şi un domeniu variabil distal membranar. Fiecare dintre domeniile constante şi variabile include o legătură disulfurică intra-lanţ. Domeniile variabile conţin bucle extrem de polimorfe analoge regiunilor de determinare a complementarităţii (CDR-uri) ale anticorpilor. Utilizarea terapiei genice cu TCR-uri depăşeşte o serie de obstacole actuale. Terapia permite echiparea celulelor T proprii ale pacienţilor cu specificităţi dorite şi generarea unui număr suficient de celule T într-o perioadă scurtă de timp, evitându-se epuizarea lor. TCR-ul va fi transdus în celule T cu memorie centrală sau celule T cu caracteristici ale celulelor stem, fapt care pot asigura persistenţă şi funcţionare mai bune la transfer. Celulele T modificate cu TCR vor fi perfuzate pacienţilor cu cancer care sunt limfopenici prin chimioterapie sau iradiere, permiţând grefarea eficientă, dar inhibând supresia imunitară.
Deşi s-au făcut progrese în dezvoltarea de medicamente cu orientare moleculară pentru terapia cancerului, rămâne o necesitate în domeniu de a se dezvolta noi agenţi anticancer care ţintesc în mod specific molecule foarte specifice celulelor canceroase. Prezenta descriere răspunde acestei nevoi prin furnizarea de noi TCR-uri MAGEA1, construcţii TCR recombinante respective, acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă care se leagă în mod specific de epitopul (epitopii) TAA, aşa cum sunt prezentate; şi metode de utilizare a acestor molecule în tratarea cancerului. În contextul invenţiei, termenul TAA se referă în special la următoarele proteine preferate, şi anume proteinele MAGEA1, fragmente ale acestora, în special peptide antigenice prezentate de HLA şi, de preferinţă, asociate cu o tulburare proliferativă. Peptida antigenică a invenţiei este peptida MAGEA1-003, având secvenţa de aminoacizi prezentată în SEQ ID NO: 133 din Tabelul 2 de mai jos.
Invenţia este prezentată în setul de revendicări anexat.
Construcţii de recunoaştere a antigenului
Într-un prim aspect, invenţia furnizează o construcţie de recunoaştere a antigenului care se leagă în mod specific şi/sau selectiv la o peptidă antigenică MAGEA1 din SEQ ID NO: 133 atunci când antigenul respectiv este prezentat de HLA, în care construcţia de recunoaştere a antigenului respectiv cuprinde secvenţele de regiuni determinante complementare (CDR) CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 şi SEQ ID NO: 51 şi secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 şi, respectiv, SEQ ID NO: 57, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde secvenţele de aminoacizi CDR respective cu cel mult un aminoacid modificat, în care aminoacidul modificat este de preferinţă primul sau ultimul aminoacid al CDR respective, iar modificarea este o substituţie conservativă, şi în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului nu se leagă selectiv de niciuna dintre peptidele SEQ ID NO: 143-152 atunci când este prezentată de HLA.
Este descrisă în continuare, dar nu face parte din invenţie, o construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinzând cel puţin o regiune determinantă complementară (CDR) 3 având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau, de preferinţă, 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă de aminoacizi selectată din SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 şi 117.
Este descrisă în continuare, dar nu face parte din invenţie, o construcţie de recunoaştere a antigenului care se leagă în mod specific de un complex TAA-peptidă-moleculă HLA, în care peptida TAA cuprinde sau, alternativ, constă într-o variantă a TAA care este de cel puţin 66%, preferabil de cel puţin 77%, şi, mai preferabil, cel puţin 88% omologă (de preferinţă, cel puţin 77% sau cel puţin 88% identică) cu secvenţa de aminoacizi a TAA din invenţie, în care varianta respectivă se leagă de o moleculă HLA de clasă I sau de clasă II şi/sau induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida respectivă sau o sare a acesteia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care peptida respectivă nu este polipeptida de bază de lungime completă.
În sensul prezentului document, termenii „identic» sau „identitate» procentuală, atunci când sunt utilizaţi în contextul a două sau mai multe secvenţe de acid nucleic sau de proteine/polipipeptide, se referă la două sau mai multe secvenţe sau subsecvenţe care sunt identice sau care au (sau au cel puţin) un procentaj specificat de reziduuri de aminoacizi sau nucleotide care sunt identice (de exemplu, la, sau cel puţin, aproximativ 60% identitate, de preferinţă la, sau cel puţin 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% sau 94% identitate şi, mai preferabil, la, sau cel puţin, aproximativ 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau o identitate mai mare pe o regiune specificată - de preferinţă pe secvenţele lor de lungime completă - , atunci când sunt comparate şi aliniate pentru o corespondenţă maximă pe fereastra de comparaţie sau regiunea desemnată), aşa cum este măsurată cu ajutorul unor algoritmi de comparare a secvenţelor sau prin aliniere manuală şi inspecţie vizuală (a se vedea, de exemplu, site-ul web al NCBI). Într-o formă particulară de concretizare, de exemplu atunci când se compară secvenţa proteică sau de acid nucleic a unei construcţii de recunoaştere a antigenului din invenţie cu o altă proteină/genă, identitatea procentuală poate fi determinată prin căutările Blast susţinute la Human Olfactory Data Explorer (de exemplu, https://genome.weizmann.ac.il/cgi-bin/horde/blastHorde.pl); în special pentru identitatea aminoacizilor, cele care utilizează BLASTP 2.2.28+ cu următorii parametri: Matrice: BLOSUM62; Penalizări de decalaj: Existenţă: 11, Extensie: 1; Prag de cuvinte vecine: 11; Fereastră pentru potriviri multiple: 40.
În contextul prezentei invenţii, trebuie să se înţeleagă că orice concretizări la care se face referire drept „cuprinzând» anumite caracteristici ale invenţiei, trebuie să se înţeleagă că includ, în unele concretizări mai preferate, descrierea mai restrânsă de „constând din» sau „constând în esenţă din» aceleaşi caracteristici ale prezentei invenţii.
Construcţia de recunoaştere a antigenului cuprinde, de asemenea, o secvenţă de domeniu CDR1 şi o secvenţă de domeniu CDR2. În domeniul variabil, CDR1 şi CDR2 se găsesc în regiunea variabilă (V) a unui lanţ polipeptidic, iar CDR3 include o parte din regiunile V, toate cu regiuni de diversitate (D) şi de îmbinare (J). CDR3 este cel mai variabil şi principalul CDR responsabil pentru recunoaşterea specifică şi selectivă a unui antigen.
TCR-urile heterodimerice alfa-beta native au un lanţ alfa şi un lanţ beta. Fiecare lanţ cuprinde regiuni variabile, de îmbinare şi constante, iar lanţul beta conţine, de asemenea, o regiune de diversitate scurtă între regiunea variabilă şi regiunea de îmbinare, însă această regiune de diversitate este adesea considerată ca făcând parte din regiunea de îmbinare. Fiecare regiune variabilă cuprinde trei CDR-uri (regiuni determinante de complementaritate) încorporate într-o secvenţă-cadru, una fiind regiunea hipervariabilă numită CDR3. Există mai multe tipuri de regiuni variabile ale lanţului alfa (Vα) şi mai multe tipuri de regiuni variabile ale lanţului beta (Vβ) distinse prin cadrul lor, secvenţele CDR1 şi CDR2, şi printr-o secvenţă CDR3 definită parţial. Tipurile Vα sunt desemnate în nomenclatura IMGT printr-un număr TRAV unic, iar tipurile Vβ sunt menţionate printr-un număr TRBV unic. Pentru mai multe informaţii despre genele anticorpilor de imunoglobulină şi TCR, consultaţi international ImMunoGeneTics information system®, Lefranc M-P et al. (Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22; şi http://www.imgt.org/).
Prin urmare, într-o concretizare suplimentară, construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia cuprinde secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 într-o combinaţie furnizată în Tabelul 1 de mai jos, care arată alela respectivă a lanţului variabil împreună cu secvenţa CDR3. De preferinţă, o construcţie de recunoaştere a antigenului din invenţie cuprinde secvenţele CRR1-CDR3 respective din regiunea variabilă TCR R37P1C9 a TCR R37P1C9 din invenţie (vezi Tabelul 1 de mai jos şi secţiunea de exemple).
Termenul „specificitate» sau „specificitate a antigenului» sau „specific pentru» un antigen dat, aşa cum este utilizat în prezentul document, înseamnă posibilitatea de legare specifică a construcţiei de recunoaştere a antigenului la antigenul menţionat, preferabil un antigen TAA, mai preferabil cu aviditate ridicată, atunci când antigenul respectiv este prezentat de HLA, preferabil de HLA A2. De exemplu, un TCR, drept construcţie de recunoaştere a antigenului, poate fi considerat a avea „specificitate antigenică» pentru TAA dacă celulele T care exprimă TCR-ul secretă cel puţin 200 pg/ml sau mai mult (de exemplu, 250 pg/ml sau mai mult, 300 pg/ml sau mai mult, 400 pg/ml sau mai mult, 500 pg/ml sau mai mult, 600 pg/ml sau mai mult, 700 pg/ml sau mai mult, 1000 pg/ml sau mai mult, 2000 pg/ml sau mai mult, 2500 pg/ml sau mai mult, 5000 pg/ml sau mai mult) de interferon γ (IFN-γ) la co-cultură cu celule-ţintă HLA A2-pozitive pulsate cu o concentraţie mică de antigen TAA, cum ar fi epitopii TAA şi antigenii furnizaţi mai jos în prezentul document (de exemplu, aproximativ 10-11 mol/l, 10-10 mol/l, 10-9 mol/l, 10-8 mol/l, 10-7 mol/l, 10-6 mol/l, 10-5 mol/l). Alternativ sau suplimentar, un TCR poate fi considerat a avea „specificitate antigenică» pentru TAA dacă celulele T care exprimă TCR-ul secretă cel puţin de două ori mai mult IFN-γ decât nivelul de fond netransdus de IFN-γ la co-cultură cu celule-ţintă pulsate cu o concentraţie scăzută de antigeni TAA. O astfel de „specificitate» descrisă mai sus poate fi - de exemplu - analizată cu un ELISA.
Într-o altă formă de concretizare alternativă sau suplimentară a invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului se leagă selectiv de o peptidă antigenică derivată din TAA; de preferinţă, în care peptida antigenică TAA este un epitop sau o peptidă proteică având o secvenţă de aminoacizi prezentată în SEQ ID NO: 133, sau o variantă a acesteia, în care varianta este o deleţie, adăugare, inserţie sau substituţie de aminoacizi de cel mult trei, preferabil două şi, cel mai preferabil, cel mult o poziţie de aminoacid. În unele concretizări, construcţia de recunoaştere a antigenului din invenţie se leagă selectiv de oricare dintre peptidele MAGEA1-003 modificate prezentate în SEQ ID NO: 132-142 şi 154În unele forme de realizare, construcţia de recunoaştere a antigenului din invenţie se leagă selectiv de oricare dintre peptidele MAGEA1-003 modificate prezentate în SEQ ID NO:162. Construcţia de recunoaştere a antigenului a invenţiei nu se leagă selectiv de niciuna dintre peptidele prezentate în SEQ ID NO: 143-152.
Termenul „selectivitate» sau „recunoaştere/legare selectivă» se referă la proprietatea unei construcţii de recunoaştere a antigenului, cum ar fi un TCR sau anticorp, de a recunoaşte sau de a se lega selectiv preferabil doar la un singur epitop specific şi, preferabil, nu prezintă sau nu prezintă substanţial reactivitate încrucişată cu un alt epitop. Preferabil, „selectivitate» sau „recunoaştere/legare selectivă» înseamnă că construcţia de recunoaştere a antigenului (de exemplu, un TCR) recunoaşte sau se leagă selectiv preferabil doar la un singur epitop specific şi, preferabil, nu prezintă sau nu prezintă substanţial reactivitate încrucişată cu un alt epitop, unde epitopul respectiv este unic pentru o proteină, astfel încât construcţia de recunoaştere a antigenului să nu prezinte sau să nu prezinte substanţial reactivitate încrucişată cu un alt epitop şi o altă proteină.
Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia este preferabil selectat dintr-un anticorp sau un derivat ori un fragment al acestuia sau un receptor de celule T (TCR) ori un derivat sau un fragment al acestuia. Un derivat sau fragment al unui anticorp sau TCR în conformitate cu invenţia va păstra, preferabil, capacitatea de legare/recunoaştere a antigenului a moleculei-părinte, în special specificitatea şi/sau selectivitatea acesteia, după cum sa explicat mai sus. O astfel de funcţionalitate de legare poate fi reţinută prin prezenţa unei regiuni CDR3 aşa cum este definită în prezentul document.
TCR-urile inovatoare sunt capabile să recunoască antigeni TAA într-o manieră dependentă de clasa I a complexului major de histocompatibilitate (MHC). Termenul „manieră dependentă de MHC de clasă I», aşa cum este utilizat aici, înseamnă că TCR-ul determină un răspuns imun la legarea la antigeni TAA în contextul unei molecule MHC de clasă I. Molecula MHC de clasă I poate fi orice moleculă MHC de clasă I cunoscută în domeniu, de exemplu, molecula HLA-A. Într-o concretizare preferată a invenţiei, molecula MHC de clasă I este o moleculă HLA-A2.
Invenţia furnizează atât construcţii de recunoaştere a antigenului cu lanţ unic, cât şi construcţii de recunoaştere a lanţului dublu.
Într-o concretizare, domeniul variabil TCR alfa are cel puţin o mutaţie în raport cu un domeniu TCR alfa al TCR R37P1C9 prezentat în Tabelul 1; şi/sau domeniul variabil TCR beta are cel puţin o mutaţie în raport cu un domeniu TCR alfa al TCR R37P1C9 prezentat în Tabelul 1. În altă concretizare, un TCR cuprinzând cel puţin o mutaţie în domeniul variabil TCR alfa şi/sau domeniul variabil TCR beta are o afinitate de legare pentru, şi/sau o semiviaţă de legare pentru, un complex de molecule peptidă-HLA care este cel puţin dublu faţă de un TCR cuprinzând domeniul TCR alfa fără mutaţie şi/sau domeniul variabil TCR beta fără mutaţie.
Lanţurile TCR alfa din prezenta descriere pot cuprinde, de asemenea, un domeniu transmembranar TCR alfa şi/sau un domeniu intracelular TCR alfa. Lanţurile TCR beta prezenta descriere pot cuprinde, de asemenea, un domeniu transmembranar TCR beta/sau un domeniu intracelular TCR beta
Invenţia oferă în special un TCR drept construcţie de recunoaştere a antigenului sau un fragment ori un derivat al acestuia. TCR-ul este de preferinţă de tip uman, care este înţeles ca fiind generat dintr-un locus TCR uman şi, prin urmare, cuprinzând secvenţe TCR umane. Mai mult, TCR-ul în conformitate cu invenţia poate fi caracterizat prin faptul că este de origine umană şi recunoaşte în mod specific un antigen TAA al invenţiei.
O altă concretizare a invenţiei furnizează suplimentar sau alternativ construcţia de recunoaştere a antigenului descrisă mai sus, care induce un răspuns imun, preferabil în care răspunsul imun este caracterizat printr-o creştere a nivelurilor de interferon (IFN) γ.
TCR-urile în conformitate cu invenţia pot fi furnizate sub formă de construcţii cu lanţ unic α sau β ori γ şi δ, molecule sau, alternativ, cu lanţ dublu compuse din lanţul α şi β sau din lanţul γ şi δ.
Construcţia de recunoaştere a antigenului din invenţie poate cuprinde un lanţ TCR α sau γ; şi/sau un lanţ TCR β sau δ; în care lanţul TCR α sau γ cuprinde secvenţe CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 şi, respectiv, SEQ ID NO: 51 şi/sau în care lanţul TCR β sau δ cuprinde secvenţe CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 şi, respectiv, SEQ ID NO: 57.
Construcţiile de recunoaştere a antigenului care cuprind regiunile CDR1-CDR3 ale lanţurilor TCR ale TCR-ului R37P1C9 din prezentul document (vezi Tabelul 1), cuprind secvenţa CDR respectivă a invenţiei cu cel mult un rest de aminoacid modificat, în care modificarea este o substituţie conservativă. Cel mai preferabil este ca acel rest aminoacidic modificat să fie primul sau ultimul rest aminoacidic din secvenţa CDR respectivă.
În cazul în care construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia este compusă din cel puţin două lanţuri de aminoacizi, cum ar fi un TCR cu lanţ dublu sau un fragment de legare a antigenului acestuia, constructul de recunoaştere a antigenului poate cuprinde într-un prim lanţ polipeptidic secvenţa de aminoacizi în conformitate cu SEQ ID NO: 51 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 57.
Sunt descrise, dar nu fac parte din invenţie, construcţii de recunoaştere a antigenului compuse din cel puţin două lanţuri de aminoacizi, cum ar fi un TCR cu lanţ dublu sau un fragment de legare de antigen al acestuia, care cuprinde într-un prim lanţ polipeptidic secvenţa de aminoacizi conform SEQ ID NO: 3 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 9, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 15 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 21, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 27 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 33, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 39 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 45, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 63 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 69, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 75 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 81, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 87 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 93, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 99 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 105, sau, într-un prim lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 111 şi, într-un al doilea lanţ polipeptidic, secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO: 117. În unele concretizări, CDR3-ul TCR-ului cu lanţ dublu al invenţiei poate cuprinde o substituţie conservatoare. Mutaţiile secvenţelor CDR3 ale SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 şi 117 furnizate de mai sus includ, de preferinţă, o substituţie, o deleţie, o adăugare sau o inserţie de cel mult trei, preferabil nu mai mult de două şi cel mai preferabil nu mai mult de un rest aminoacidic. În unele concretizări, primul lanţ polipeptidic poate fi un lanţ TCR α sau γ, iar al doilea lanţ polipeptidic poate fi un lanţ TCR β sau δ. Este preferată combinaţia unui TCR αβ sau γδ.
TCR-ul, sau fragmentul de legare la antigen al acestuia este, în unele concretizări, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β sau un lanţ γ şi δ. Un astfel de TCR cu lanţ dublu cuprinde în fiecare lanţ regiuni variabile, iar regiunile variabile cuprind fiecare câte o secvenţă CDR1, o secvenţă CDR2 şi o secvenţă CDR3. TCR-urile invenţiei cuprind secvenţele CDR1-CDR3, aşa cum sunt cuprinse în secvenţa de aminoacizi cu lanţ variabil din SEQ ID NO: 52 şi SEQ ID NO: 58 (R37P1C9). Sunt descrise, dar nu fac parte din invenţie, TCR-uri care cuprind secvenţele CDR1-CDR3, aşa cum sunt cuprinse în secvenţa de aminoacizi a lanţului variabil din SEQ ID NO: 4 şi SEQ ID NO: 10 (R26P1A9) sau SEQ ID NO: 16 şi SEQ ID NO: 22 (R26P2A6) sau SEQ ID NO: 28 şi SEQ ID NO: 34 (R26P3H1) sau SEQ ID NO: 40 şi SEQ ID NO: 46 (R35P3A4) sau SEQ ID NO: 64 şi SEQ ID NO: 70 (R37P1H1) sau SEQ ID NO: 76 şi SEQ ID NO: 82 (R42P3A9) sau SEQ ID NO: 88 şi SEQ ID NO: 94 (R43P3F2) sau SEQ ID NO: 100 şi SEQ ID NO: 106 (R43P3G5) sau SEQ ID NO: 112 şi SEQ ID NO: 118 (R59P2E7).
Unele concretizări ale invenţiei se referă la un TCR sau un fragment al acestuia, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β, în care TCR-ul menţionat cuprinde secvenţele de regiune variabilă având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 98%, 99% sau, de preferinţă, 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 52 şi, respectiv, 58. Este descris în continuare un TCR sau un fragment al acestuia, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β, în care TCR-ul respectiv cuprinde secvenţe ale regiunii variabile care au cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau, preferabil, 100% identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi selectată din lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 4 şi, respectiv, 10, sau 16 şi, respectiv, 22; sau 28 şi, respectiv, 34; sau 40 şi, respectiv, 46; sau 64 şi, respectiv, 70; sau 76 şi, respectiv, 82; sau 88 şi, respectiv, 94; sau 100 şi, respectiv, 106; sau 112 şi, respectiv, 118.
TCR-urile inovatoare pot cuprinde în plus o regiune constantă derivată de la orice specie adecvată, cum ar fi orice mamifer, de exemplu, om, şobolan, maimuţă, iepure, măgar sau şoarece. Într-o concretizare a invenţiei, TCR-urile inovatoare cuprind în plus o regiune constantă umană. În unele concretizări preferate, regiunea constantă a TCR în conformitate cu invenţia poate fi uşor modificată, de exemplu, prin introducerea de secvenţe heterologe, preferabil secvenţe murine, care pot creşte exprimarea şi stabilitatea TCR.
Unele concretizări ale invenţiei se referă la un TCR sau un fragment al acestuia, compus dintr-un lanţ TCR α şi un lanţ TCR β, în care TCR-ul menţionat cuprinde regiunea constantă având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 98%, 99% sau, de preferinţă, 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din lanţul α şi β conform SEQ ID NO: 5 şi, respectiv, 11; sau 17 şi, respectiv, 23; sau 29 şi, respectiv, 35; sau 41 şi, respectiv, 47; sau, 53 şi, respectiv, 59; sau 65 şi, respectiv, 71; sau 77 şi, respectiv, 83; sau 89 şi, respectiv, 95; sau 101 şi, respectiv, 107; sau 113 şi, respectiv, 119.
Construcţia de recunoaştere a antigenului poate cuprinde într-o altă concretizare un fragment de legare a unui TCR şi unde respectivul fragment de legare cuprinde CDR1- CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 49, 50, 51 sau 55, 56, 57.
În alte concretizări ale invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului, aşa cum este descrisă altundeva în prezentul document, este un TCR sau un fragment al acestuia compus din cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care secvenţa de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 49-51 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 55-57. Este descris, dar nu face parte din invenţie, un TCR sau un fragment al acestuia compus din cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, care secvenţa de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 1-3 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 7-9; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 13-15 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 19-21; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 25-27 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 31-33; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 37-39 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 43-45; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 61-63 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 67-69; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 73-75 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 79-81; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 85-87 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 91-93; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 97-99 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 103-105; sau în care secvenţa menţionată de lanţ TCR α cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 109-111 şi secvenţa menţionată de lanţ TCR β cuprinde secvenţele de la CDR1 la CDR3 având secvenţele aminoacidice de SEQ ID NO: 115-117.
În alte concretizări ale invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului, aşa cum este descrisă mai sus în prezentul document, este un TCR sau un fragment al acestuia cuprinzând cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care secvenţa respectivă de lanţ TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică a SEQ ID NO: 52 şi unde secvenţa de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa aminoacidică a SEQ ID NO: 58. Este descris, dar nu face parte din invenţie, un TCR sau un fragment al acestuia, care cuprinde cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care respectiva secvenţă de lanţ TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 4, şi în care respectiva secvenţă de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 10; sau în care respectiva secvenţă de lanţ TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 16, şi în care respectiva secvenţă de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 22; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 28 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 34; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 40 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 46; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 64 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 70; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 76 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 82; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 88 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 94; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 100 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 106; sau în care respectiva secvenţă a lanţului TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 112 şi în care respectiva secvenţă a lanţului TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 118.
În alte concretizări ale invenţiei, construcţia de recunoaştere a antigenului, aşa cum este descrisă anterior în prezentul document, este un TCR sau un fragment al acestuia, cuprinzând în plus o regiune constantă TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO:5, 11, 17, 23, 29,35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113 şi 119, preferabil în care TCR-ul este compus din cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care secvenţa de lanţ TCR α cuprinde o regiune constantă având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu o secvenţă aminoacidică selectată din SEQ ID NO:5, 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101 şi 113.
În alte concretizări, invenţia furnizează construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:54 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:60.
Sunt descrise, de asemenea, construcţii de recunoaştere a antigenului, aşa cum sunt descrise anterior în prezentul document, cuprinzând un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:6 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:12. Mai sunt descrise TCR-uri cuprinzând un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:18 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:24. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:30 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:36. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:42 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:48. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:66 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:72. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:78 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:84. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:90 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:96. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere a antigenului care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:102 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:108. Mai sunt descrise construcţii de recunoaştere care sunt TCR-uri şi cuprind un prim lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:114 şi un al doilea lanţ TCR având cel puţin 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă cu secvenţa aminoacidică selectată din SEQ ID NO:120.
Aşa cum este utilizat în prezentul document, termenul „murin» sau „uman», atunci când se referă la o construcţie de recunoaştere a antigenului, ori un TCR sau orice componentă a unui TCR descrisă în prezentul document (de exemplu, regiunea de determinare a complementarităţii (CDR), regiunea variabilă, regiunea constantă, lanţul α şi/sau lanţul β) înseamnă un TCR (sau o componentă a acestuia) care este derivat de la şoarece sau, respectiv, un locus TCR nerearanjat de om.
Într-o concretizare a invenţiei, sunt furnizate TCR-uri himerice, în care lanţurile TCR au inclus secvenţe de la mai multe specii. Preferabil, un TCR în conformitate cu invenţia poate cuprinde un lanţ α cuprinzând o regiune variabilă umană a unui lanţ α şi, de exemplu, o regiune constantă murină a unui lanţ TCR α murin.
Într-una dintre concretizări, TCR-ul din invenţie este un TCR uman cuprinzând regiuni variabile umane în conformitate cu variantele de mai sus şi regiuni constante umane.
În unele concretizări, construcţia de recunoaştere a antigenului este murinizată sau umanizată. Aceşti termeni sunt utilizaţi atunci când secvenţe de aminoacizi de la o specie străină sunt introduse într-o construcţie a invenţiei.
TCR-ul din invenţie poate fi furnizat ca un TCR cu lanţ unic (scTCR). Un scTCR poate cuprinde o polipeptidă a unei regiuni variabile a unui prim lanţ TCR (de exemplu, un lanţ alfa) şi o polipeptidă a unui întreg lanţ TCR (de lungime completă) (de exemplu, un lanţ beta) sau viceversa. Mai mult, scTCR-ul poate cuprinde opţional unul sau mai mulţi linkeri care unesc cele două sau mai multe polipeptide împreună. Linkerul poate fi, de exemplu, o peptidă, care uneşte două lanţuri simple, aşa cum este descris în prezentul document. De asemenea, este furnizat un astfel de scTCR al invenţiei care este fuzionat cu o citokină umană, cum ar fi IL-2, IL-7 sau IL-15.
Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia poate fi furnizat şi sub forma unui complex multimeric cuprinzând cel puţin două molecule scTCR, în care moleculele scTCR menţionate sunt fiecare fuzionate la cel puţin un fragment de biotină sau altă moleculă de interconectare/linker şi în care scTCR-urile respective sunt interconectate prin interacţiune biotină-streptavidină pentru a se permite formarea complexului multimeric menţionat. Abordări similare cunoscute în domeniu pentru generarea TCR-ului multimeric sunt, de asemenea, posibile şi incluse în această descriere. De asemenea, sunt furnizate complexe multimerice de ordin superior cuprinzând mai mult de două scTCR-uri în conformitate cu invenţia.
În sensul prezentei invenţii, un TCR este un fragment având cel puţin un domeniu variabil TCR alfa sau gamma şi/sau TCR beta sau delta. În general, acestea cuprind atât un domeniu variabil TCR alfa, cât şi un domeniu variabil TCR beta sau, alternativ, atât un domeniu variabil TCR gamma, cât şi un domeniu variabil TCR delta. Ele pot fi heterodimeri αβ/γδ sau pot fi în format cu lanţ unic. Pentru utilizare în terapia adoptivă, un TCR heterodimeric αβ sau γδ poate fi, de exemplu, transfectat ca lanţuri de lungime completă având atât domenii citoplasmatice, cât şi domenii transmembranare. Dacă se doreşte, poate fi prezentă o legătură disulfurică introdusă între resturile domeniilor constante respective.
Într-o concretizare preferată, construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR uman sau un fragment ori un derivat al acestuia. Un TCR uman sau un fragment ori un derivat al acestuia este un TCR, care cuprinde peste 50% din secvenţa TCR umană corespunzătoare. Preferabil, doar o mică parte a secvenţei TCR este de origine artificială sau derivată de la alte specii. Se cunoaşte, totuşi, că TCR-urile himerice, de exemplu derivate din origine umană cu secvenţe murine în domenii constante, sunt avantajoase. În mod special preferate sunt, prin urmare, TCR-uri în conformitate cu prezenta invenţie care conţin secvenţe murine în partea extracelulară a domeniilor lor constante.
Astfel, este preferabil, de asemenea, ca o construcţie de recunoaştere a antigenului inovatoare să fie capabilă să-şi recunoască antigenul într-un mod dependent de antigenul leucocitar uman (HLA), de preferinţă într-un mod dependent de HLA-A02. În contextul prezentei invenţii, termenul „mod dependent de HLA» înseamnă că o construcţie de recunoaştere a antigenului se leagă de antigen numai în cazul în care peptida antigenică este prezentată de HLA-ul menţionat.
Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia, într-un exemplu de concretizare, induce de preferinţă un răspuns imun, preferabil în care răspunsul imun este caracterizat prin creşterea nivelurilor de interferon (IFN) γ.
De asemenea, invenţia furnizează o polipeptidă care cuprinde o porţiune funcţională a TCR-ului R37P1C9 (sau variante funcţionale ale acestuia) descrisă în prezentul document. Este descrisă, dar nu face parte din invenţie, o polipeptidă care cuprinde o porţiune funcţională a oricăruia dintre TCR-urile (sau variantele funcţionale ale acestora) descrise în prezentul document, de exemplu, a oricăruia dintre TCR-urile selectate dintre R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 şi R59P2E7, aşa cum sunt prezentate în secţiunea de exemple şi în Tabelul 1. Termenul „polipeptidă», aşa cum este utilizat în prezentul document, include oligopeptide şi se referă la un singur lanţ aminoacidic conectat prin una sau mai multe legături peptidice. În ceea ce priveşte polipeptidele din invenţie, porţiunea funcţională poate fi orice porţiune care conţine aminoacizi adiacenţi ai TCR-ului (sau ai variantei funcţionale a acestuia) din care face parte, cu condiţia ca porţiunea funcţională să se lege în mod specific la un antigen TAA, preferabil aşa cum este descris în Tabelul 2, şi peptidele MAGEA1-003_A1-MAGEA1-003_A9 (SEQ ID NO: 134-142) şi MAGEA1-003_T1-MAGEA1-003_T9 (SEQ ID NO: 154-162). Termenul „porţiune funcţională», atunci când este utilizat referitor la un TCR (sau o variantă funcţională a acestuia), se referă la orice parte sau fragment al TCR-ului (sau al variantei funcţionale a acestuia) în conformitate cu invenţia, care parte sau fragment păstrează activitatea biologică a TCR-ului (sau a variantei funcţionale a acestuia) din care face parte (TCR-ul părinte sau varianta funcţională părinte a acestuia). Porţiunile funcţionale cuprind, de exemplu, acele părţi ale unui TCR (sau ale variantei funcţionale a acestuia) care păstrează capacitatea de a se lega în mod specific la un antigen TAA (într-un mod dependent de HLA) sau de a detecta, a trata sau a preveni cancerul într-o măsură similară, în aceeaşi măsură sau într-o măsură mai mare, ca TCR părinte (sau varianta funcţională a acestuia). Referitor la TCR-ul părinte (sau varianta funcţională a acestuia), porţiunea funcţională poate cuprinde, de exemplu, aproximativ 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% sau mai mult din secvenţele variabile ale TCR-ului părinte (sau ale variantei funcţionale a acestuia).
Porţiunea funcţională poate cuprinde aminoacizi suplimentari la capătul amino sau carboxi al porţiunii ori la ambele capete, în care aminoacizii suplimentari nu se găsesc în secvenţa aminoacidică a TCR-ului părinte sau a variantei funcţionale a acestuia. De dorit, aminoacizii suplimentari nu interferează cu funcţia biologică a porţiunii funcţionale, de exemplu, legându-se în mod specific de antigeni TAA şi/sau având capacitatea de a detecta cancerul, de a trata sau preveni cancerul, etc. Mai de dorit, aminoacizii suplimentari sporesc activitatea biologică în comparaţie cu activitatea biologică a TCR-ului părinte sau a variantei funcţionale a acestuia.
Polipeptida poate cuprinde o porţiune funcţională a uneia sau ambelor lanţuri α şi β ale TCR-urilor sau variante funcţionale ale acestora în conformitate cu invenţia, cum ar fi o porţiune funcţională care cuprinde CDR1, CDR2 şi CDR3 ale regiunii (regiunilor) variabile a(le) lanţului α şi/sau ale lanţului β al unui TCR R37P1C9 sau a unei variante funcţionale a acestuia. Într-o concretizare a invenţiei, polipeptida poate cuprinde o porţiune funcţională care cuprinde secvenţa aminoacidică de SEQ ID NO: 51 şi 57 (CDR3 din regiunile variabile ale TCR-ului R37P1C9 din invenţie). În acest sens, polipeptida poate cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 52 şi/sau 58 (regiunile variabile ale unui lanţ α sau β al TCR-ului R37P1C9 din invenţie).
În unele cazuri, construcţia din invenţie poate cuprinde, de asemenea, alte secvenţe de aminoacizi, de exemplu, o secvenţă de aminoacizi care codifică o imunoglobulină sau o parte a acesteia, atunci proteina din invenţie poate fi o proteină de fuziune. În acest sens, invenţia furnizează, de asemenea, o proteină de fuziune care cuprinde cel puţin una dintre polipeptidele inovatoare descrise în prezentul document împreună cu cel puţin o altă polipeptidă. Cealaltă polipeptidă poate exista ca polipeptidă separată a proteinei de fuziune sau poate exista ca polipeptidă care este exprimată în cadru (în tandem) cu una dintre polipeptidele inovatoare descrise în prezentul document. Cealaltă polipeptidă poate include orice moleculă peptidică sau proteinacee ori o porţiune a acesteia, incluzând, dar fără a se limita la o imunoglobulină, CD3, CD4, CD8, o moleculă MHC, o moleculă CD1, de exemplu, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d etc.
Proteina de fuziune poate cuprinde una sau mai multe copii ale polipeptidei din invenţie şi/sau una sau mai multe copii ale celeilalte polipeptide. De exemplu, proteina de fuziune poate cuprinde 1, 2, 3, 4, 5 sau mai multe copii ale polipeptidei inovatoare şi/sau ale celeilalte polipeptide. Metodele adecvate de producere a proteinelor de fuziune sunt cunoscute în domeniu şi includ, de exemplu, metode recombinante. În unele concretizări ale invenţiei, TCR-urile (şi porţiunile funcţionale şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele şi proteinele din invenţie pot fi exprimate ca o singură proteină cuprinzând o peptidă linker care leagă lanţul α şi lanţul β şi care leagă lanţul γ şi lanţul δ. În acest sens, TCR-urile (şi variantele funcţionale şi porţiunile funcţionale ale acestora), polipeptidele şi proteinele în conformitate cu invenţia cuprind secvenţele aminoacidice ale regiunilor variabile ale TCR-ului în conformitate cu invenţia şi pot cuprinde în plus o peptidă linker. Peptida linker poate facilita în mod avantajos exprimarea unui TCR recombinant (incluzând porţiuni funcţionale şi variante funcţionale ale acestora), a unei polipeptide recombinante şi/sau a unei proteine recombinante într-o celulă-gazdă. Peptida linker poate cuprinde orice secvenţă aminoacidică adecvată. Secvenţele linker pentru construcţii TCR cu lanţ unic sunt bine cunoscute în domeniu. O astfel de construcţie cu lanţ unic poate cuprinde în plus una sau două secvenţe de domeniu constant. La exprimarea construcţiei incluzând peptida linker de către o celulă-gazdă, peptida linker poate fi, de asemenea, clivată, rezultând lanţuri α şi β separate şi lanţuri γ şi δ separate.
TCR-ul din invenţie poate fi modificat pentru a se evita o separare greşită a lanţurilor TCR. Termenul de „împerechere greşită» se referă la împerecherea incorectă între un lanţ TCR al unei transgene TCR α/γ sau β/δ din invenţie şi un lanţ TCR α/γ, respectiv β/δ endogen, şi are ca rezultat o exprimare diluată la suprafaţa celulară a heterodimerului TCRαβ/γ/δ transgenic, ceea ce reduce aviditatea funcţională a celulelor T modificate. Preferabil, Q la poziţia 44 în domeniul variabil TCR, conform numerotării IMGT, este înlocuit cu un alt aminoacid în unul sau în ambele lanţuri ale TCR-ului din invenţie. Substituţia este preferabil selectată din grupul format din R, D, E, K, I, W şi V.
Aşa cum s-a menţionat deja mai sus, funcţionalitatea de legare a TCR-ului în conformitate cu invenţia poate fi furnizată în cadrul unui anticorp. De exemplu, secvenţele CDR ale TCR-ului din invenţie, incluzând eventual 3, 2 sau 1 rest suplimentar de cadru N şi/sau C terminal, pot fi grefate direct într-o secvenţă variabilă de lanţ greu/uşor al unui anticorp. Termenul „anticorp», în diferitele sale forme gramaticale, este utilizat în prezentul document pentru a se referi la molecule de imunoglobulină şi porţiuni active imunologic de molecule de imunoglobulină, adică molecule care conţin un situs de legare la antigen sau un paratop. Astfel de molecule sunt, de asemenea, denumite „fragmente de legare la antigen» ale moleculelor de imunoglobulină. Invenţia furnizează şi un anticorp sau o porţiune de legare la antigen a acestuia care se leagă în mod specific la antigenii descrişi în prezentul document. Anticorpul poate fi orice tip de imunoglobulină cunoscut în domeniu. De exemplu, anticorpul poate fi de orice izotip, de exemplu, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM etc. Anticorpul poate fi monoclonal sau policlonal. Anticorpul poate fi un anticorp natural, de exemplu, un anticorp izolat şi/sau purificat de la un mamifer, de exemplu, şoarece, iepure, capră, cal, găină, hamster, om etc. Alternativ, anticorpul poate fi un anticorp proiectat, de exemplu, un anticorp umanizat sau un anticorp himeric. Anticorpul poate fi sub formă monomerică sau polimerică.
Termenul „anticorp» include, fără a se limita la acestea, forme de imunoglobuline modificate genetic sau în alt mod, cum ar fi intracorpi, anticorpi himerici, anticorpi complet umani, anticorpi umanizaţi (de exemplu, generaţi prin „grefare CDR»), fragmente de anticorpi şi anticorpi heteroconjugaţi (de exemplu, anticorpi bispecifici, diacorpi, tricorpi, tetracorpi etc.). Termenul „anticorp» include cis-diacorpii şi minicorpii. Astfel, fiecare dintre concretizările furnizate în prezentul document în ceea ce priveşte „anticorpii» sau „construcţiile similare anticorpilor» sunt, de asemenea, concepute ca fiind anticorpi bispecifici, diacorpi, fragmente scFv, construcţii de receptori de anticorpi himerici (CAR), concretizări de diacorpi şi/sau minicorpi, cu excepţia cazului în care se indică în mod explicit altfel. Termenul „anticorp» include o polipeptidă din familia imunoglobulinelor sau o polipeptidă care cuprinde fragmente ale unei imunoglobuline care este capabilă să se lege în mod necovalent, reversibil şi specific de un antigen corespunzător, de preferinţă de TAA-ul invenţie, aşa cum este descris în prezentul document. Un exemplu de unitate structurală de anticorp cuprinde un tetramer. În unele concretizări, un anticorp de lungime completă poate fi compus din două perechi identice de lanţuri polipeptidice, fiecare pereche având un lanţ „uşor» şi un lanţ „greu» (conectate printr-o legătură disulfurică). Structura anticorpilor şi izotipurile sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu (de exemplu, din Janeway's Immunobiology, 9th edition, 2016).
Genele imunoglobulinelor recunoscute ale mamiferelor includ genele de regiune constantă kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon şi miu, precum şi nenumăratele gene de regiune variabilă ale imunoglobulinelor (pentru mai multe informaţii despre genele imunoglobulinelor, vezi international Im-MunoGeneTics information system®, Lefranc M-P et al., Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22; şi http://www.imgt.org/). Pentru lanţurile de lungime completă, lanţurile uşoare sunt clasificate ca fiind fie kappa, fie lambda. Pentru lanţurile complete, lanţurile grele sunt clasificate ca fiind gamma, miu, alfa, delta sau epsilon, care, la rândul lor, definesc clasele de imunoglobuline - IgG, IgM, IgA, IgD şi, respectiv, IgE. Extremitatea N-terminală a fiecărui lanţ defineşte o regiune variabilă de aproximativ 100 până la 110 sau mai mulţi aminoacizi, responsabilă în principal de recunoaşterea antigenului. Termenii de lanţ uşor variabil (VL) şi lanţ greu variabil (VH) se referă la aceste regiuni ale lanţurilor uşoare şi, respectiv, grele. În sensul prezentei invenţii, un „anticorp» cuprinde toate variantele de anticorpi şi fragmente ale acestora. Astfel, în domeniul de aplicare a acestui concept intră anticorpii de lungime completă, anticorpii himerici, anticorpii umanizaţi, anticorpii cu un singur lanţ (scFv), Fab, Fab' şi versiunile multimerice ale acestor fragmente (de exemplu, F(ab')2) cu aceeaşi, în esenţă aceeaşi sau similară, specificitate de legare. În unele concretizări, anticorpul se leagă în mod specific de o peptidă TAA a invenţiei. Construcţiile preferate de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia includ un lanţ greu de anticorpi, de preferinţă domeniul variabil al acestuia sau un fragment de legare la antigen al acestuia, şi/sau un lanţ uşor de anticorpi, de preferinţă domeniul variabil al acestuia sau un fragment de legare la antigen al acestuia. În mod similar, pot fi preparate fragmente de regiune variabilă stabilizate cu disulfură (dsFv) prin tehnologie cu ADN recombinant; cu toate acestea, fragmentele de anticorp din invenţie nu se limitează la aceste tipuri exemplare de fragmente de anticorp. De asemenea, anticorpul sau porţiunea de legare la antigen a acestuia poate fi modificată pentru a cuprinde un marcaj detectabil, cum ar fi, de exemplu, un radioizotop, un fluorofor (de exemplu, izotiocianat de fluoresceină (FITC), ficoeritrină (PE)), o enzimă (de exemplu, fosfatază alcalină, peroxidază de hrean) şi particule de elemente (de exemplu, particule de aur). În unele cazuri, secvenţa TCR CDR3 poate fi uşor modificată, dar de preferinţă cu nu mai mult de 3 resturi aminoacidice, preferabil doar două şi cel mai preferabil o singură poziţie de aminoacid, în comparaţie cu secvenţele CDR3 furnizate în SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 şi 117. Preferabil, anticorpii cuprind CDR3, preferabil toate regiunile CDR1-CDR3 în combinaţie, aşa cum este indicat pentru TCR-ul invenţiei în Tabelul 1, în fiecare caz în mod independent, opţional, cu cel mult trei sau două, preferabil una, substituţii, inserţii şi/sau deleţii de aminoacizi în comparaţie cu aceste secvenţe.
Metode adecvate de fabricare a anticorpilor sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, metodele standard de hibridom sunt descrise în, de exemplu, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), and C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (201 1)). Alternatively, other methods, such as EBV-hybridoma methods (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), and Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)), iar sisteme de exprimare a vectorilor bacteriofagi (vezi, de exemplu, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) sunt cunoscute în domeniu. De asemenea, metodele de producere a anticorpilor la animale neumane sunt descrise, de exemplu, în brevetele SUA cu numerele 5.545.806, 5.569.825 şi 5.714.352 şi în cererea de brevet SUA cu numărul 2002/0197266.
Unele concretizări ale invenţiei se referă, de asemenea, la TCR-uri sau la fragmente funcţionale şi polipeptide ale acestora care sunt TCR-uri solubile. În sensul prezentului document, termenul „receptor de celule T solubil» se referă la variantele trunchiate heterodimerice ale TCR-urilor native, care cuprind porţiuni extracelulare ale lanţului α şi lanţului β ale TCR-ului, legate printr-o legătură disulfidică, dar cărora le lipsesc domeniile transmembranar şi citosolic ale proteinei native. Termenii „secvenţă a lanţului α al receptorului de celule T solubil şi secvenţă a lanţului β al receptorului de celule T solubilă» se referă la secvenţele lanţului α şi lanţului β ale TCR care nu au domeniile transmembranar şi citosolic. Secvenţa (aminoacid sau acid nucleic) a lanţului α şi a lanţurilor β ale TCR-ului solubil poate fi identică cu secvenţele corespunzătoare dintr-un TCR nativ sau poate cuprinde secvenţe variante ale lanţului α şi ale lanţului β ale TCR solubil, în comparaţie cu secvenţele corespunzătoare ale TCR-ului nativ. Termenul „receptor de celule T solubil», aşa cum este utilizat în prezentul document, cuprinde TCR-uri solubile cu secvenţe de lanţ α şi lanţ β ale TCR-urilor solubile, variante sau non-variante. Variaţiile pot fi în regiunile variabile sau constante ale secvenţelor lanţului α şi lanţului β ale TCR-ului solubil şi pot include, fără a se limita la acestea, mutaţii de deleţie, inserţie şi substituţie de aminoacizi, precum şi modificări ale secvenţei de acid nucleic, care nu modifică secvenţa de aminoacizi. TCR-ul solubil al invenţiei păstrează în orice caz funcţionalitatea de legare a moleculelor lor părinte.
Problema de mai sus este rezolvată în continuare printr-un acid nucleic care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului din invenţie sau oricare dintre construcţiile proteice sau polipeptidice menţionate mai sus. Preferabil, acidul nucleic (a) are o catenă care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului conform invenţiei; (b) are o catenă complementară catenei de la (a); sau (c) are o catenă care se hibridizează în condiţii stricte cu o moleculă descrisă la (a) sau (b). Condiţiile stricte sunt cunoscute de către specialiştii în domeniu, în special din Sambrook et al., „Molecular Cloning». În plus, acidul nucleic are, în mod opţional, secvenţe suplimentare, care sunt necesare pentru exprimarea secvenţei de acid nucleic corespunzătoare proteinei, în special pentru exprimarea într-o celulă de mamifer/umană. Acidul nucleic utilizat poate fi conţinut într-un vector adecvat pentru a permite exprimarea secvenţei de acid nucleic corespunzătoare peptidei într-o celulă. Cu toate acestea, acizii nucleici pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a transforma o celulă prezentatoare de antigen, care poate să nu se limiteze la celulele prezentatoare de antigen clasice, cum ar fi celulele dendritice, astfel încât acestea să producă ele însele proteinele corespunzătoare pe suprafaţa lor celulară.
În unele concretizări, polipeptidele din construcţiile de recunoaştere a antigenului pot fi codificate de acizi nucleici şi exprimate in vivo sau in vitro. Astfel, în unele concretizări, este furnizat un acid nucleic care codifică o construcţie de recunoaştere a antigenului. În unele concretizări, acidul nucleic codifică o parte sau un monomer al unei construcţii de recunoaştere a antigenului din cadrul invenţiei (de exemplu, unul dintre cele două lanţuri ale unui TCR al invenţiei) şi/sau un alt acid nucleic codifică o altă parte sau un alt monomer al unei construcţii de recunoaştere a antigenului din cadrul invenţiei (de exemplu, celălalt dintre cele două lanţuri ale TCR-ului). În unele concretizări, acidul nucleic codifică două sau mai multe lanţuri polipeptidice de construcţie de recunoaştere a antigenului, de exemplu, cel puţin 2 lanţuri TCR. Acizii nucleici care codifică mai multe lanţuri de construcţii care recunosc antigeni pot include situsuri de clivaj al acidului nucleic între cel puţin două secvenţe de lanţuri, pot codifica situsul de început de transcripţie sau de translaţie între două sau mai multe secvenţe de lanţuri şi/sau pot codifica situsuri-ţintă proteolitice între două sau mai multe lanţuri de construcţii care recunosc antigeni.
Prin „acid nucleic», aşa cum este utilizat în prezentul document, se înţelege „polinucleotidă», „oligonucleotidă» şi „moleculă de acid nucleic» şi, în general, un polimer de ADN sau ARN, care poate fi monocatenar sau bicatenar, sintetizat sau obţinut (de exemplu, izolat şi/sau purificat) din surse naturale, care poate conţine nucleotide naturale, nenaturale sau modificate şi care poate conţine o legătură internucleotidică naturală, nenaturală sau modificată, cum ar fi o legătură fosfoamidat sau o legătură fosforotioioat, în locul fosfodiesterului care se găseşte între nucleotidele unei oligonucleotide nemodificate.
De preferinţă, acizii nucleici în conformitate cu invenţia sunt recombinanţi. În sensul prezentului document, termenul „recombinat» se referă la (i) moleculele care sunt construite în afara celulelor vii prin alăturarea unor segmente de acid nucleic natural sau sintetic la molecule de acid nucleic care se pot replica într-o celulă vie sau (ii) moleculele care rezultă din replicarea celor descrise la punctul (i) de mai sus. În scopul prezentului document, replicarea poate fi o replicare in vitro sau o replicare in vivo. Acidul nucleic poate cuprinde orice secvenţă de nucleotide care codifică oricare dintre TCR-uri, polipeptide sau proteine, sau porţiuni funcţionale sau variante funcţionale ale acestora descrise în prezentul document.
Mai mult, invenţia oferă un vector care cuprinde un acid nucleic în conformitate cu invenţia, aşa cum este descris mai sus. Este de dorit ca vectorul să fie un vector de exprimare sau un vector de exprimare recombinant. Termenul „vector de exprimare recombinant» se referă, în contextul prezentei invenţii, la o construcţie de acid nucleic care permite exprimarea unui ARNm, a unei proteine sau a unei polipeptide într-o celulă-gazdă adecvată. Vectorul de exprimare recombinant al invenţiei poate fi orice vector de exprimare recombinant adecvat şi poate fi utilizat pentru a transforma sau a transfecta orice gazdă adecvată. Printre vectorii adecvaţi se numără cei concepuţi pentru propagare şi expansiune sau pentru exprimare sau ambele, cum ar fi plasmidele şi viruşii. Exemple de vectori de exprimare animali includ pEUK-Cl, pMAM şi pMAMneo. De preferinţă, vectorul de exprimare recombinant este un vector viral, de exemplu, un vector retroviral. Vectorul de exprimare recombinant cuprinde secvenţe de reglare, cum ar fi codonii de iniţiere şi terminare a transcripţiei şi a translaţiei, care sunt specifice tipului de celulă-gazdă (de exemplu, bacterie, ciupercă, plantă sau animal), în care urmează să fie introdus vectorul şi în care se poate realiza exprimarea acidului nucleic al invenţiei. În plus, vectorul invenţiei poate include una sau mai multe gene marker, care permit selectarea gazdelor transformate sau transfectate. Vectorul de exprimare recombinant poate cuprinde un promotor nativ sau normativ legat în mod operaţional de secvenţa nucleotidică care codifică construcţiile invenţiei sau de secvenţa nucleotidică, care este complementară sau care se hibridizează cu secvenţa nucleotidică care codifică construcţiile invenţiei. Selecţia de promotori include, de exemplu, promotori puternici, slabi, inductibili, specifici pentru ţesut şi specifici pentru dezvoltare. Promotorul poate fi un promotor neviral sau un promotor viral. Vectorii de exprimare recombinanţi din invenţie pot fi concepuţi fie pentru exprimare tranzitorie, fie pentru exprimare stabilă, fie pentru ambele. De asemenea, vectorii de exprimare recombinanţi pot fi realizaţi pentru exprimare constitutivă sau pentru exprimare inductibilă.
Invenţia se referă, de asemenea, la o celulă-gazdă care cuprinde o construcţie de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia. În mod specific, celula-gazdă a invenţiei cuprinde un acid nucleic sau un vector, aşa cum este descris mai sus. Celula-gazdă poate fi o celulă eucariotă, de exemplu, o plantă, un animal, o ciupercă sau o algă, sau poate fi o celulă procariotă, de exemplu, o bacterie sau un protozoar. Celula-gazdă poate fi o celulă cultivată sau o celulă primară, adică o celulă izolată direct dintr-un organism, de exemplu, un om. Celula-gazdă poate fi o celulă aderentă sau o celulă în suspensie, adică o celulă care creşte în suspensie. În scopul producerii unui TCR, a unei polipeptide sau a unei proteine recombinate, celula-gazdă este de preferinţă o celulă de mamifer. Cel mai preferabil, celula-gazdă este o celulă umană. Deşi celula-gazdă poate fi de orice tip de celulă, poate proveni din orice tip de ţesut şi poate fi în orice stadiu de dezvoltare, celula-gazdă este, de preferinţă, o leucocită din sângele periferic (PBL) sau o celulă mononucleară din sângele periferic (PBMC). Cel mai preferabil, celula-gazdă este o celulă T. Celula T poate fi orice celulă T, cum ar fi o celulă T cultivată, de exemplu, o celulă T primară, sau o celulă T dintr-o linie de celule T cultivate, de exemplu, Jurkat, SupT1 etc. ori celulă T obţinută de la un mamifer, de preferinţă o celulă T sau un precursor de celulă T de la un pacient uman. În cazul în care este obţinută de la un mamifer, celula T poate fi obţinută din numeroase surse, inclusiv, dar fără a se limita la sânge, măduvă osoasă, ganglioni limfatici, timus sau alte ţesuturi sau fluide. Celulele T pot fi, de asemenea, îmbogăţite sau purificate. Preferabil, celula T este o celulă umană. Mai preferabil, celula T este o celulă T izolată de la un om. Celula T poate fi orice tip de celulă T şi poate fi în orice stadiu de dezvoltare, inclusiv, dar fără a se limita la celule T CD4-pozitive şi/sau CD8-pozitive, celule T helper CD4-pozitive, de exemplu, celule Th1 şi Th2, celule T CD8-pozitive (de exemplu, celule T citotoxice), celule infiltrate în tumori (TIL-uri), celule T cu memorie, celule T naive şi altele asemenea. Preferabil, celula T este o celulă T CD8-pozitivă sau o celulă T CD4-pozitivă.
Preferabil, celula-gazdă în conformitate cu invenţia este un limfocit, de preferinţă un limfocit T, cum ar fi o celulă T CD4-pozitivă sau CD8-pozitivă. Celula-gazdă este, de asemenea, preferabil, o celulă T reactivă la tumori, specifică pentru celule tumorale care exprimă TAA.
Obiectivul invenţiei este rezolvat, de asemenea, printr-o metodă de fabricare a unei construcţii de recunoaştere a antigenului specific TAA-ului sau a unei linii celulare care exprimă o construcţie de recunoaştere a antigenului specific TAA-ului, care cuprinde
a. Furnizarea unei celule-gazdă adecvate, b. Furnizarea unei construcţii genetice care cuprinde o secvenţă codificatoare care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului conform invenţiei prezentate în prezentul document, c. Introducerea în respectiva celulă-gazdă adecvată a respectivei construcţii genetice şi d. Exprimarea construcţiei genetice de către respectiva celulă-gazdă adecvată.
Metoda poate cuprinde, de asemenea, o etapă de prezentare la suprafaţa celulară a construcţiei de recunoaştere a antigenului respectiv pe celula-gazdă adecvată.
În alte forme de realizare preferate, construcţia genetică este o construcţie de exprimare care cuprinde o secvenţă promotoare legată în mod operaţional de respectiva secvenţă de codificare.
De preferinţă, respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului este de origine mamiferă, de preferinţă de origine umană. Celula-gazdă preferată potrivită pentru utilizare în metoda invenţiei este o celulă de mamifer, cum ar fi o celulă umană, în special un limfocit T uman. Celulele T destinate utilizării în cadrul invenţiei sunt descrise în detaliu mai sus.
Invenţia cuprinde, de asemenea, forme de realizare în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR modificat, în care modificarea respectivă constă în adăugarea de domenii funcţionale, cum ar fi un marcaj sau o substanţă activă din punct de vedere terapeutic. În plus, sunt incluse TCR-uri care au domenii alternative, cum ar fi un domeniu alternativ de ancorare în membrană în locul regiunii transmembranare endogene.
Este de dorit ca sistemul de transfectare pentru introducerea construcţiei genetice în respectiva celulă-gazdă adecvată să fie un sistem de vectori retrovirali. Astfel de sisteme sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu.
De asemenea, prezenta invenţie cuprinde, într-una dintre concretizări, etapa suplimentară a metodei de izolare şi purificare a construcţiei de recunoaştere a antigenului din celulă şi, opţional, reconstituirea fragmentelor de construcţie de recunoaştere a antigenului translatate într-o celulă T.
Într-un aspect alternativ al invenţiei, o celulă T obţinută sau care poate fi obţinută printr-o metodă de producere a unui receptor de celule T (TCR), care este specific pentru celulele tumorale şi are o aviditate ridicată, aşa cum este descris mai sus. O astfel de celulă T este în funcţie de celula-gazdă utilizată în metoda invenţiei, de exemplu, o celulă T umană sau non-umană, de preferinţă un TCR uman.
Termenul „izolat», aşa cum este utilizat în prezentul document în contextul unei polipeptide, cum ar fi o construcţie de recunoaştere a antigenului (de exemplu, un anticorp), se referă la o polipeptidă care este purificată de proteine sau polipeptide ori de alţi contaminanţi care ar putea interfera cu utilizarea sa terapeutică, diagnostică, profilactică, de cercetare sau de altă natură. O construcţie de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia poate fi o construcţie de legare a antigenului recombinantă, sintetică sau modificată (nenaturală). Termenul „izolat», aşa cum este utilizat în prezentul document în contextul unui acid nucleic sau al unor celule, se referă la un acid nucleic sau la celule care sunt purificate de ADN, ARN, proteine sau polipeptide sau de alţi contaminanţi (cum ar fi alte celule) care ar putea interfera cu utilizarea sa terapeutică, diagnostică, profilactică, de cercetare sau de altă natură, sau se referă la un acid nucleic recombinant, sintetic sau modificat (nenatural). În acest context, o proteină/polipeptidă sau un acid nucleic „recombinant» este un acid nucleic obţinut prin tehnici de recombinare. Metodele şi tehnicile de producere a acizilor nucleici şi a proteinelor recombinante sunt bine cunoscute în domeniu.
Metode de tratament şi boli
Trimiterile la metodele de tratament din paragrafele următoare ale prezentei descrieri trebuie interpretate ca trimiteri la compuşii, compoziţiile farmaceutice şi medicamentele din prezenta invenţie destinate utilizării într-o metodă de tratare a corpului uman (sau animal) prin terapie.
Un alt aspect al prezentei invenţii se referă la construcţiile de recunoaştere a antigenului descrise în prezentul document, la acizii nucleici, la vectori, la compoziţiile farmaceutice şi/sau la celula-gazdă ale invenţiei pentru utilizare în medicină. Utilizarea în medicină, într-o concretizare preferată, include utilizarea în diagnosticarea, prevenirea şi/sau tratarea unei boli tumorale, cum ar fi o boală tumorală malignă sau benignă. Boala tumorală este, de exemplu, o boală tumorală caracterizată prin exprimarea TAA, într-un cancer sau într-o celulă tumorală a respectivei boli tumorale.
În ceea ce priveşte aplicaţiile medicale menţionate mai sus ale construcţiilor de recunoaştere a antigenului şi ale altor materiale derivate din acestea, aparţinând acestora sau codificându-le, în conformitate cu prezenta descriere, bolile care urmează să fie tratate şi/sau diagnosticate pot fi orice afecţiune proliferativă, de preferinţă caracterizată prin exprimarea secvenţei TAA sau a epitopului TAA din invenţie, de exemplu orice cancer, inclusiv oricare dintre cancer limfocitic acut, leucemie mieloidă acută, rabdomiosarcom alveolar, cancer osos, cancer cerebral, cancer de glandă mamară, cancer anal, de canal anal sau anorectal, cancer ocular, cancer de cale biliară intrahepatică, cancer de articulaţii, cancer de gât, de vezică biliară sau de pleură, cancer de nas, de cavitate nazală sau de ureche medie, cancer de cavitate bucală, cancer vaginal, cancer vulvar, leucemie limfocitară cronică, cancer mieloid cronic, cancer de colon, cancer esofagian, cancer de col uterin, tumoră carcinoidă gastrointestinală, gliom, limfom Hodgkin, cancer hipofaringian , cancer de rinichi, cancer laringian, cancer hepatic, cancer pulmonar, mezoteliom malign, melanom, mielom multiplu, cancer nazofaringian, limfom non-Hodgkin, cancer orofaringian, cancer ovarian, cancer penian, cancer de pancreas, de peritoneu, de oment şi cancer mezenteric, cancer faringian, cancer de prostată, cancer rectal, cancer renal, cancer de piele, cancer de intestin subţire, cancer de ţesuturi moi, cancer de stomac, cancer testicular, cancer tiroidian, cancer uterin, cancer de ureter şi cancer de vezică urinară. Un cancer preferat este cancerul de col uterin, cancerul orofaringian, cancerul anal, cancerul canalului anal, cancerul anorectal, cancerul vaginal, cancerul vulvar sau cancerul penian. Un cancer preferat în mod special este un cancer TAA-pozitiv, inclusiv, preferabil, melanomul, cancerul gastrointestinal şi cancerul gastric.
Construcţiile, proteinele, anticorpii TCR, polipeptidele şi acizii nucleici ai invenţiei sunt în special destinate utilizării în imunoterapie, de preferinţă, în terapia adoptivă cu celule T. Administrarea compuşilor invenţiei poate implica, de exemplu, perfuzarea de celule T ale invenţiei în pacientul respectiv. De preferinţă, aceste celule T sunt celule T autologe ale pacientului şi sunt transduse in vitro cu un acid nucleic sau o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta invenţie.
Construcţiile de recunoaştere a antigenului din invenţie, TCR-urile, polipeptidele, proteinele (inclusiv variantele funcţionale ale acestora), acizii nucleici, vectorii de exprimare recombinanţi, celulele-gazdă (inclusiv populaţiile acestora) şi anticorpii (inclusiv porţiunile de legare la antigen din acestea), toate acestea fiind denumite în continuare în mod colectiv „materiale TCR din invenţie», pot fi formulate într-o compoziţie, cum ar fi o compoziţie farmaceutică. În acest sens, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde oricare dintre construcţiile de recunoaştere a antigenului, TCR-urile, polipeptidele, proteinele, porţiunile funcţionale, variantele funcţionale, acizii nucleici, vectorii de exprimare, celulele-gazdă (inclusiv populaţiile acestora) şi anticorpii (inclusiv porţiunile de legare la antigen) descrise în prezentul document şi un purtător, excipient şi/sau stabilizator acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Compoziţiile farmaceutice din invenţie care conţin oricare dintre materialele TCR din invenţie pot cuprinde mai mult de un material TCR din invenţie, de exemplu, o polipeptidă şi un acid nucleic, sau două sau mai multe TCR-uri diferite (inclusiv porţiuni funcţionale şi variante funcţionale ale acestora). Alternativ, compoziţia farmaceutică poate cuprinde un material TCR din invenţie în combinaţie cu alt (alţi) agent (agenţi) sau medicament(e) farmaceutic activ(e), cum ar fi agenţii chimioterapeutici, de exemplu, asparaginază, busulfan, carboplatină, cisplatină, daunorubicin, doxorubicină, fluorouracil, gemcitabină, hidroxiuree, metotrexat, paclitaxel, rituximab, vinblastină, vincristină etc. Preferabil, purtătorul este un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În ceea ce priveşte compoziţiile farmaceutice, purtătorul poate fi oricare dintre cei utilizaţi în mod convenţional pentru materialul TCR din invenţie în cauză. Astfel de purtători acceptaţi din punct de vedere farmaceutic sunt bine cunoscuţi de specialiştii în domeniu şi sunt uşor disponibili publicului. Este de preferat ca purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic să fie unul care nu are efecte secundare dăunătoare sau toxicitate în condiţiile de utilizare.
Astfel, este furnizată, de asemenea, o compoziţie farmaceutică, care cuprinde oricare dintre produsele descrise aici ale invenţiei şi materialele TCR ale invenţiei, în special orice proteine, acizi nucleici sau celule-gazdă. Într-o concretizare preferată, compoziţia farmaceutică este destinată imunoterapiei, de preferinţă terapiei celulare adoptive.
Preferabil, materialul TCR din invenţie este administrat prin injectare, de exemplu, intravenos. Atunci când materialul TCR din invenţie este o celulă-gazdă care exprimă TCR-ul din invenţie (sau o variantă funcţională a acestuia), purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic pentru celulele pentru injectare poate include orice purtător izotonic, cum ar fi, de exemplu, soluţie salină normală (aproximativ 0,5 %). 90% m/v de NaCl în apă, aproximativ 300 mOsm/l NaCl în apă sau aproximativ 9,0 g NaCl pe litru de apă), soluţie de electrolit NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), aproximativ 5% dextroză în apă sau lactat Ringer. Într-o concretizare, purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic este suplimentat cu albumină serică umană.
În scopul invenţiei, cantitatea sau doza (de exemplu, numărul de celule atunci când materialul TCR din invenţie constă din una sau mai multe celule) de material TCR din invenţie administrat poate fi suficientă pentru a afecta, de exemplu, un răspuns terapeutic sau profilactic, la subiect sau la animal într-un interval de timp rezonabil. De exemplu, doza de material TCR din invenţie ar trebui să fie suficientă pentru a se lega de un antigen de cancer sau pentru a detecta, trata sau preveni cancerul într-o perioadă de aproximativ 2 ore sau mai mult, de exemplu, între 12 şi 24 de ore sau mai mult, de la momentul administrării. În anumite concretizări, perioada de timp poate fi chiar mai lungă. Doza va fi determinată de eficacitatea materialului TCR din invenţie respectiv şi de starea animalului (de exemplu, a omului), precum şi de greutatea corporală a animalului (de exemplu, a omului) care urmează să fie tratat.
Se are în vedere faptul că compoziţiile farmaceutice din invenţie, construcţiile de recunoaştere a antigenului, TCR-urile (inclusiv variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele, proteinele, acizii nucleici, vectorii de expresie recombinantă, celulele-gazdă sau populaţiile de celule pot fi utilizate în metodele de tratare sau de prevenire a cancerului sau a premalignităţii TAA-pozitive. Se consideră că TCR-urile din invenţie (şi variantele funcţionale ale acestora) se leagă în mod specific de TAA-ul din invenţie, astfel încât TCR-ul (sau polipeptida sau proteina înrudită din invenţie şi variantele funcţionale ale acesteia), atunci când este exprimată de sau pe o celulă, cum ar fi o celulă T, este capabilă să medieze un răspuns imunitar împotriva unei celule-ţintă care exprimă TAA-ul din invenţie, preferabil care prezintă peptide TAA prin intermediul MHC-ului de clasă II sau II pe suprafaţa respectivei celule-ţintă. În acest sens, invenţia furnizează o metodă de tratare sau de prevenire a unei afecţiuni, în special a cancerului, la un mamifer, care constă în administrarea mamiferului respectiv a oricăreia dintre compoziţiile farmaceutice, construcţiile de recunoaştere a antigenului, în special TCR-uri (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele sau proteinele descrise în prezentul document, orice acid nucleic sau vector de exprimare recombinant care cuprinde o secvenţă de nucleotide care codifică oricare dintre TCR-uri (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele, proteinele descrise în prezentul document sau orice celulă-gazdă sau populaţie de celule-gazdă care cuprinde un acid nucleic sau un vector recombinant, care codifică oricare dintre construcţiile invenţiei (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele sau proteinele descrise în prezentul document, într-o cantitate eficace pentru a trata sau preveni afecţiunea la mamifer, în care afecţiunea este, preferabil, cancerul, cum ar fi un cancer care exprimă TAA-ul din invenţie.
Exemple de purtători sau diluanţi acceptabili din punct de vedere farmaceutic utili în prezenta invenţie includ stabilizatori precum SPGA, carbohidraţi (de exemplu, sorbitol, manitol, amidon, zaharoză, glucoză, dextran), proteine precum albumina sau cazeina, agenţi care conţin proteine precum serul bovin sau laptele degresat şi tampoane (de exemplu, tampon fosfat).
Termenii „a trata» şi „a preveni», precum şi cuvintele derivate din aceştia, aşa cum sunt utilizate în prezentul document, nu implică în mod necesar un tratament sau o prevenire 100% sau completă. Mai degrabă, există diferite grade de tratament sau de prevenire pe care o persoană cu experienţă obişnuită în domeniu le recunoaşte ca având un potenţial beneficiu sau efect terapeutic. În acest sens, metodele din invenţie pot furniza orice cantitate de orice nivel de tratament sau de prevenire a unei afecţiuni la un mamifer. În plus, tratamentul sau prevenirea asigurată prin metoda din invenţie poate include tratarea sau prevenirea uneia sau mai multor afecţiuni sau simptome ale afecţiunii, de exemplu, cancerul, care este tratată sau prevenită. De exemplu, tratamentul sau prevenirea poate include promovarea regresiei unei tumori. De asemenea, în sensul prezentului document, „prevenirea» poate cuprinde întârzierea apariţiei afecţiunii sau a unui simptom sau a unei afecţiuni a acestuia.
Este descrisă o metodă de tratare a cancerului care cuprinde administrarea unui TCR, a unui acid nucleic sau a unei celule-gazdă din prezenta descriere în combinaţie cu cel puţin un agent chimioterapeutic şi/sau radioterapie.
Mai este prezentată o metodă de detectare a unei proteine TAA sau a unui complex MHC şi a proteinei TAA (epitopul proteic al TAA-ului) într-o probă (biologică) - cum ar fi una obţinută de la un subiect sau pacient - care constă în punerea în contact a probei cu o construcţie de recunoaştere a antigenului care se leagă în mod specific de respectiva peptidă TAA sau de complexul peptidă TAA/MHC şi detectarea legăturii dintre respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului şi respectiva peptidă TAA sau complexul peptidă TAA/MHC. În unele concretizări, construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR sau un anticorp, ori construcţii similare, sau, preferabil, construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu invenţia descrisă în prezentul document. În unele concretizări, proba (biologică) este o probă de tumoare sau de cancer (cum ar fi una dintre cele descrise în altă parte în prezentul document), de exemplu, o probă care cuprinde celule tumorale sau canceroase.
De asemenea, este prezentată o metodă de tratare a cancerului la un subiect care are nevoie de aceasta, care cuprinde:
a) izolarea unei celule de la respectivul subiect;
b) transformarea celulei cu cel puţin un vector care codifică o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta invenţie pentru a produce o celulă transformată;
c) extinderea celulei transformate pentru a produce o pluralitate de celule transformate; şi
d) administrarea pluralităţii de celule transformate la respectivul subiect.
De asemenea, este prezentată o metodă de tratare a cancerului la un subiect care are nevoie de aceasta, care cuprinde:
a) izolarea unei celule de la un donator sănătos;
b) transformarea celulei cu un vector care codifică o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta invenţie pentru a produce o celulă transformată;
c) extinderea celulei transformate pentru a produce o pluralitate de celule transformate; şi
d) administrarea pluralităţii de celule transformate la respectivul subiect.
De asemenea, este furnizată o metodă in vitro de detectare a cancerului într-o probă biologică, care cuprinde:
a) punerea în contact a probei biologice cu o construcţie de recunoaştere a antigenului din prezenta descriere;
b) detectarea legării construcţiei de recunoaştere a antigenului la proba biologică.
De asemenea, este furnizată o metodă de detectare a prezenţei unei afecţiuni la un mamifer. Metoda cuprinde (i) punerea în contact a unei probe care cuprinde una sau mai multe celule de la mamifer cu oricare dintre TCR-urile din invenţie (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptide, proteine, acizi nucleici, vectori de exprimare recombinanţi, celule-gazdă, populaţii de celule, anticorpi sau porţiuni de legare la antigen din aceştia ori compoziţii farmaceutice descrise în prezentul document, formând astfel un complex, şi detectarea complexului, în care detectarea complexului indică prezenţa afecţiunii la mamifer, în care afecţiunea este cancerul, cum ar fi o tumoare malignă ca exprimă TAA-ul.
În ceea ce priveşte metoda de detectare din invenţie a unei afecţiuni la un mamifer, proba de celule poate fi o probă care cuprinde celule întregi, lizate ale acestora sau o fracţiune din lizate de celule întregi, de exemplu, o fracţiune nucleară sau citoplasmatică, o fracţiune de proteine întregi sau o fracţiune de acid nucleic.
În scopul metodei de detectare din invenţie, contactul poate avea loc in vitro în ceea ce priveşte mamiferul.
De asemenea, detectarea complexului poate avea loc prin orice număr de moduri cunoscute în domeniu. De exemplu, construcţiile de recunoaştere a antigenului din invenţie (şi variantele funcţionale ale acestora), polipeptidele, proteinele, acizii nucleici, vectorii de exprimare recombinanţi, celulele-gazdă, populaţiile de celule, sau anticorpii ori TCR-urile sau porţiunile de legare la antigen din acestea, descrise în prezentul document, pot fi marcate cu un marcaj detectabil, cum ar fi, de exemplu, un radioizotop, un fluorofor (de exemplu izotiocianat de fluoresceină (FITC), ficoeritrină (PE)), o enzimă (de exemplu, fosfatază alcalină, peroxidază de hrean) şi particule de elemente (de exemplu, particule de aur).
În scopul metodelor din invenţie, în care se administrează celule-gazdă sau populaţii de celule, celulele pot fi celule alogene sau autologe pentru mamifer. De preferinţă, celulele sunt autologe pentru mamifer.
În ceea ce priveşte aplicaţiile medicale menţionate mai sus ale materialului TCR din invenţie, cancerul care trebuie tratat şi/sau diagnosticat poate fi orice cancer, inclusiv oricare dintre cancer limfocitic acut, leucemie mieloidă acută, rabdomiosarcom alveolar, cancer osos, cancer cerebral, cancer de glandă mamară, cancer anal, de canal anal sau anorectal, cancer ocular, cancer de cale biliară intrahepatică, cancer de articulaţii, cancer de gât, de vezică biliară sau de pleură, cancer de nas, de cavitate nazală sau de ureche medie, cancer de cavitate bucală, cancer vaginal, cancer vulvar, leucemie limfocitară cronică, cancer mieloid cronic, cancer de colon, cancer esofagian, cancer de col uterin, tumoră carcinoidă gastrointestinală, gliom, limfom Hodgkin, cancer hipofaringian , cancer de rinichi, cancer laringian, cancer hepatic, cancer pulmonar, mezoteliom malign, melanom, mielom multiplu, cancer nazofaringian, limfom non-Hodgkin, cancer orofaringian, cancer ovarian, cancer penian, cancer de pancreas, de peritoneu, de oment şi cancer mezenteric, cancer faringian, cancer de prostată, cancer rectal, cancer renal, cancer de piele, cancer de intestin subţire, cancer de ţesuturi moi, cancer de stomac, cancer testicular, cancer tiroidian, cancer uterin, cancer de ureter şi cancer de vezică urinară. Un cancer preferat este cancerul de col uterin, cancerul orofaringian, cancerul anal, cancerul canalului anal, cancerul anorectal, cancerul vaginal, cancerul vulvar sau cancerul penian. Un cancer preferat în special este un cancer TAA-pozitiv, cum ar fi cancerul de piele sau, preferabil, melanomul, cancerul gastrointestinal ori cancerul gastric.
În general, invenţia furnizează construcţii de recunoaştere a antigenului, acizi nucleici, vectori, compoziţii farmaceutice şi/sau celule-gazdă, aşa cum sunt prezentate în prezenta invenţie, pentru utilizare în tratamentul unei tumori sau al unei boli tumorale la un subiect. Preferabil, subiectul este un subiect care are nevoie de un astfel de tratament. În concretizările preferate, subiectul este un mamifer, de preferinţă un pacient uman, care suferă de o tumoare sau o boală tumorală care este TAA-pozitivă.
Prezenta invenţie va fi descrisă în continuare în exemplele de mai jos, cu referire la figurile şi secvenţele care însoţesc prezenta invenţie, cu toate acestea, fără a fi limitată la acestea. În figuri şi secvenţe:
Figura 1: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R26P1A9 (SEQ ID NO: 1-12) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 2: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R26P2A6 (SEQ ID NO: 13-24) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 3: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R26P3H1 (SEQ ID NO: 25-36) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 4: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R35P3A4 (SEQ ID NO: 37-48) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 5: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R37P1C9 (SEQ ID NO: 49-60) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 6: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R37P1H1 (SEQ ID NO: 61-72) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 7: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R42P3A9 (SEQ ID NO: 73-84) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 8: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R43P3F2 (SEQ ID NO: 85-96) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 9: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R43P3G5 (SEQ ID NO: 97-108) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 10: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R59P2E7 (SEQ ID NO: 109-120) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu alanină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 134-142) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 11: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R26P1A9 (SEQ ID NO: 1-12) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 12: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R26P2A6 (SEQ ID NO: 13-24) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 13: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R26P3H1 (SEQ ID NO: 25-36) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 14: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R35P3A4 (SEQ ID NO: 37-48) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 15: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R37P1C9 (SEQ ID NO: 49-60) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 16: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R37P1H1 (SEQ ID NO: 61-72) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 17: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R42P3A9 (SEQ ID NO: 73-84) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 18: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R43P3F2 (SEQ ID NO: 85-96) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 19: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R43P3G5 (SEQ ID NO: 97-108) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 20: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R59P2E7 (SEQ ID NO: 109-120) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau cu peptida omologă, dar fără legătură, TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) sau RASAL2-002 (SEQ ID NO:152) ori peptidă de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0004) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0005) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 21: Colorare cu tetramer HLA-A*02/MAGEA1-003 sau, respectiv, tetramer HLA-A*02/NYESO1-001 a celulelor T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R26P2A6 şi, respectiv, R26P3H1. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN al TCR-ului 1G4 care se leagă în mod specific de complexul HLA-A*02/NYESO1-001 şi celule T CD8+ electroporate simulat.
Figura 22: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R26P1A9 (SEQ ID NO: 1-12) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 23: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R26P2A6 (SEQ ID NO: 13-24) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 24: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R26P3H1 (SEQ ID NO: 25-36) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 25: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R35P3A4 (SEQ ID NO: 37-48) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 26: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R37P1C9 (SEQ ID NO: 49-60) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 27: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R37P1H1 (SEQ ID NO: 61-72) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la un singur donator. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate.
Figura 28: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R42P3A9 (SEQ ID NO: 73-84) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la un singur donator. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate.
Figura 29: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R43P3F2 (SEQ ID NO: 85-96) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 30: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R43P3G5 (SEQ ID NO: 97-108) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 31: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi de lanţ beta al TCR-ului R59P2E7 (SEQ ID NO: 109-120) după co-incubarea cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptidă MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) sau diferite variante de substituţie cu treonină MAGEA1-003 la poziţiile 1-9 din (SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 154-162) sau peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori diferiţi. Drept controale au fost folosite celule T CD8+ electroporate cu ARN singure sau în co-incubare cu celule-ţintă neîncărcate. Donatorul 1 (TCRA-0006) este prezentat pe axa Y din stânga, iar donatorul 2 (TCRA-0007) pe axa Y din dreapta, respectiv.
Figura 32: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-urilor R35P3A4 (SEQ ID NO: 37-48), R37P1C9 (SEQ ID NO: 49-60) şi R43P3G5 (SEQ ID NO: 97-108) după co-incubare cu diferite linii de celule tumorale. U266B1 şi UACC-257 prezintă ţinta, KMM-1, NCI-H2023, L-1236, MCF-7 şi A-375 nu prezintă ţinta. Drept controale au fost folosite celule-ţintă T2 încărcate cu MAGEA1-003 sau cu peptida de control NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153) şi celule T CD8+ electroporate cu ARN.
Figura 33: Eliberarea de IFNγ din celule T după transducţia lentivirală cu diferite construcţii care conţin lanţurile alfa şi beta ale TCR-urilor R35P3A4 (SEQ ID NO: 37-48; construcţii R35D, R35G), R37P1C9 (SEQ ID NO: 49-60; construcţii R37D, R37G) şi R43P3G5 (SEQ ID NO: 97-108; construcţii R43A, R43H) după co-incubare cu diferite celule primare şi tipuri de celule derivate din iPSC. Drept controale au fost folosite U266B1 şi UACC-257 şi celulele T singure.
Tip de celulă Abreviere sursă Fibroblaste dermice umane normale NHDF Celule primare Celule musculare netede ale arterei coronare umane HCASMC Celule primare Celule musculare netede traheale umane HTSMC Celule primare Celule epiteliale renale umane HREpC Celule primare Cardiomiocite umane HCM Celule primare Celule endoteliale microvasculare cardiace umane HCMEC Celule primare Hepatocite iCell 2.0 - Celule derivate din iPSC Astrocite iCell - Celule derivate din iPSC Neuroni iCell - Celule derivate din iPSC
Figura 34: Eliberare de IFNγ din celule T după transducţie lentivirală cu diferite construcţii care conţin lanţul alfa şi beta al TCR R37P1C9 pentru evaluarea recunoaşterii mediate de LV-R37D a MAGEA1-003 procesat şi prezentat endogen. (A) Au fost cultivate celule T de la trei donatori sănătoşi, netransduse (NT) sau transduse cu LV-R37D împreună cu 3 linii celulare tumorale diferite. Producţie de IFN-γ cu linii celulare tumorale HLA-A*02+ care exprimă endogen MAGEA1 (UACC257 şi U266B1) sau care nu prezintă la suprafaţă (KMM1). Sunt indicate ţintele E:T. (B) Producţie de IFN-γ cu celule T2 pulsate cu peptide MAGEA1 diluate serial Co-culturile au fost stabilite la un raport E:T de 4:1 (60.000 de celule T; 15.000 de celule T2). Media şi deviaţia standard a IFN-ɣ eliberat după 20 de ore din trei replici (donatori) sunt prezentate ca măsurători duplicate prin ELISA.
Figura 35: Test de potenţă care evaluează activitatea citolitică a celulelor T transduse lentiviral care exprimă TCR-ul R37P1C9 (construcţia R37D) împotriva celulelor tumorale MAGEA1+. Răspuns citotoxic al celulelor T LV-R37D transduse şi netransduse (NT) măsurat împotriva (A) celulelor tumorale U138MG MAGEA1+ (HLA-A*02+), (B) U138MG MAGEA1- (HLA-A*02+) sau (C) celulelor tumorale U2-OS MAGEA1+ (HLA-A*02+). Testele au fost efectuate la diferite rapoarte E:T (A şi B) sau la un raport E:T de 10:1 (C) într-un test de citotoxicitate bazat pe microscopie de fluorescenţă timp de 96 de ore. Rezultatele sunt prezentate ca medie ±SD din 3 replici. NT = netransdus. Pentru graficele A şi B, valoarea % distrugere = (suprafaţa sub curbă a probei experimentale cu celule T / suprafaţa sub curbă a ţintelor tumorale singure) * 100, unde suprafaţa sub curbă este calculată din măsurătorile de creştere longitudinală, aşa cum se arată în graficul C; valorile negative ale valorii % distrugere sunt setate la 0.
Figura 36: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R26P1A9 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM. Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori sănătoşi diferiţi.
Figura 37: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R26P2A6 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM. Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori sănătoşi diferiţi.
Figura 38: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R35P3A4 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM.
Figura 39: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R37P1C9 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM. Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori sănătoşi diferiţi.
Figura 40: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R37P1H1 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM.
Figura 41: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R42P3A9 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM.
Figura 42: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R43P3F2 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM. Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori sănătoşi diferiţi.
Figura 43: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R43P3G5 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM. Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori sănătoşi diferiţi.
Figura 44: Eliberare de IFNγ din celule T CD8+ electroporate cu ARN de lanţ alfa şi beta al TCR-ului R59P2E7 (Tabelul 1) după co-incubare cu celule-ţintă T2 încărcate cu peptida MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) în diferite concentraţii de încărcare a peptidei de la 10 µM la 10 pM. Datele privind eliberarea de IFNγ au fost obţinute cu celule T CD8+ derivate de la doi donatori sănătoşi diferiţi.
Tabelul 1: Secvenţe TCR ale invenţiei
SEQ ID NO: TCR Lanţ Regiune Secvenţă 1 R26P1A9 alfa CDR1 TSINN 2 R26P1A9 alfa CDR2 IRS 3 R26P1A9 alfa CDR3 CLIGASGSRLTF 4 R26P1A9 alfa domeniu variabil METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCLIGASGSRLTFGEGTQLTVNP 5 R26P1A9 alfa domeniu constant DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 6 R26P1A9 alfa lungime completă METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCLIGASGSRLTFGEGTQLTVNPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 7 R26P1A9 beta CDR1 SGHDY 8 R26P1A9 beta CDR2 FNNNVP 9 R26P1A9 beta CDR3 CASSYFGWNEKLFF 10 R26P1A9 beta domeniu variabil MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSYFGWNEKLFFGSGTQLSVL 11 R26P1A9 beta domeniu constant EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 12 R26P1A9 beta lungime completă MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSYFGWNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 13 R26P2A6 alfa CDR1 NSAFQY 14 R26P2A6 alfa CDR2 TY 15 R26P2A6 alfa CDR3 CAMSDVSGGYNKLIF 16 R26P2A6 alfa domeniu variabil MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSDVSGGYNKLIFGAGTRLAVHP 17 R26P2A6 alfa domeniu constant YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 18 R26P2A6 alfa lungime completă MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSDVSGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 19 R26P2A6 beta CDR1 MNHEY 20 R26P2A6 beta CDR2 SMNVEV 21 R26P2A6 beta CDR3 CASTTPDGTDEQFF 22 R26P2A6 beta domeniu variabil MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASTTPDGTDEQFFGPGTRLTVL 23 R26P2A6 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 24 R26P2A6 beta lungime completă MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASTTPDGTDEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 25 R26P3H1 alfa CDR1 VSGNPY 26 R26P3H1 alfa CDR2 YITG 27 R26P3H1 alfa CDR3 CAVRDMNRDDKIIF 28 R26P3H1 alfa domeniu variabil MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDMNRDDKIIFGKGTRLHILP 29 R26P3H1 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 30 R26P3H1 alfa lungime completă MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDMNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 31 R26P3H1 beta CDR1 LNHDA 32 R26P3H1 beta CDR2 SQIVND 33 R26P3H1 beta CDR3 CASSRAEGGEQYF 34 R26P3H1 beta domeniu variabil MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSRAEGGEQYFGPGTRLTVT 35 R26P3H1 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 36 R26P3H1 beta lungime completă MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSRAEGGEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 37 R35P3A4 alfa CDR1 DSASNY 38 R35P3A4 alfa CDR2 IRS 39 R35P3A4 alfa CDR3 CAASPTGGYNKLIF 40 R35P3A4 alfa domeniu variabil MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASPTGGYNKLIFGAGTRLAVHP 41 R35P3A4 alfa domeniu constant YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 42 R35P3A4 alfa lungime completă MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASPTGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 43 R35P3A4 beta CDR1 MNHEY 44 R35P3A4 beta CDR2 SVGAGI 45 R35P3A4 beta CDR3 CASSLGGASQEQYF 46 R35P3A4 beta domeniu variabil MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSLGGASQEQYFGPGTRLTVT 47 R35P3A4 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 48 R35P3A4 beta lungime completă MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSLGGASQEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 49 R37P1C9 alfa CDR1 TISGTDY 50 R37P1C9 alfa CDR2 G 51 R37P1C9 alfa CDR3 CILFNFNKFYF 52 R37P1C9 alfa domeniu variabil MKLVTSITVLLSLGIMGDAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYIHWYRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMASLAIAEDRKSSTLILHRATLRDAAVYYCILFNFNKFYFGSGTKLNVKP 53 R37P1C9 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 54 R37P1C9 alfa lungime completă MKLVTSITVLLSLGIMGDAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYIHWYRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMASLAIAEDRKSSTLILHRATLRDAAVYYCILFNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 55 R37P1C9 beta CDR1 LNHNV 56 R37P1C9 beta CDR2 YYDKDF 57 R37P1C9 beta CDR3 CATSSGETNEKLFF 58 R37P1C9 beta domeniu variabil MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSSGETNEKLFFGSGTQLSVL 59 R37P1C9 beta domeniu constant EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 60 R37P1C9 beta lungime completă MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSSGETNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 61 R37P1H1 alfa CDR1 TSESNYY 62 R37P1H1 alfa CDR2 QEAY 63 R37P1H1 alfa CDR3 CAFGYSGGGADGLTF 64 R37P1H1 alfa domeniu variabil MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESNYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCAFGYSGGGADGLTFGKGTHLIIQP 65 R37P1H1 alfa domeniu constant YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 66 R37P1H1 alfa lungime completă MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESNYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCAFGYSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 67 R37P1H1 beta CDR1 SGHDT 68 R37P1H1 beta CDR2 YYEEEE 69 R37P1H1 beta CDR3 CASSNEGQGWEAEAFF 70 R37P1H1 beta domeniu variabil MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSNEGQGWEAEAFFGQGTRLTVV 71 R37P1H1 beta domeniu constant EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 72 R37P1H1 beta lungime completă MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSNEGQGWEAEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 73 R42P3A9 alfa CDR1 DSVNN 74 R42P3A9 alfa CDR2 I 75 R42P3A9 alfa CDR3 CAVHNFNKFYF 76 R42P3A9 alfa domeniu variabil MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQWFHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVHNFNKFYFGSGTKLNVKP 77 R42P3A9 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 78 R42P3A9 alfa lungime completă MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQWFHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVHNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 79 R42P3A9 beta CDR1 PRHDT 80 R42P3A9 beta CDR2 FYEKMQ 81 R42P3A9 beta CDR3 CASSLLGQGYNEQFF 82 R42P3A9 beta domeniu variabil MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLLGQGYNEQFFGPGTRLTVL 83 R42P3A9 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 84 R42P3A9 beta lungime completă MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLLGQGYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 85 R43P3F2 alfa CDR1 TRDTTYY 86 R43P3F2 alfa CDR2 RNSF 87 R43P3F2 alfa CDR3 CALSNNNAGNMLTF 88 R43P3F2 alfa domeniu variabil MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSNNNAGNMLTFGGGTRLMVKP 89 R43P3F2 alfa domeniu constant HIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 90 R43P3F2 alfa lungime completă MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSNNNAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 91 R43P3F2 beta CDR1 PRHDT 92 R43P3F2 beta CDR2 FYEKMQ 93 R43P3F2 beta CDR3 CASSPTGTSGYNEQFF 94 R43P3F2 beta domeniu variabil MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSPTGTSGYNEQFFGPGTRLTVL 95 R43P3F2 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 96 R43P3F2 beta lungime completă MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSPTGTSGYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 97 R43P3G5 alfa CDR1 SSNFYA 98 R43P3G5 alfa CDR2 MTL 99 R43P3G5 alfa CDR3 CALNRDDKIIF 100 R43P3G5 alfa domeniu variabil MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALNRDDKIIFGKGTRLHILP 101 R43P3G5 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 102 R43P3G5 alfa lungime completă MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 103 R43P3G5 beta CDR1 MDHEN 104 R43P3G5 beta CDR2 SYDVKM 105 R43P3G5 beta CDR3 CASRLPSRTYEQYF 106 R43P3G5 beta domeniu variabil MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASRLPSRTYEQYFGPGTRLTVT 107 R43P3G5 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 108 R43P3G5 beta lungime completă MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASRLPSRTYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 109 R59P2E7 alfa CDR1 DSAIYN 110 R59P2E7 alfa CDR2 IQS 111 R59P2E7 alfa CDR3 CAVNSDYKLSF 112 R59P2E7 alfa domeniu variabil METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVNSDYKLSFGAGTTVTVRA 113 R59P2E7 alfa domeniu constant NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 114 R59P2E7 alfa lungime completă METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVNSDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 115 R59P2E7 beta CDR1 PHRDT 116 R59P2E7 beta CDR2 FYEKMQ 117 R59P2E7 beta CDR3 CASSLGLGTGDYGYTF 118 R59P2E7 beta domeniu variabil MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLGLGTGDYGYTFGSGTRLTVV 119 R59P2E7 beta domeniu constant EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 120 R59P2E7 beta lungime completă MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLGLGTGDYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 121 1G4 alfa CDR1 DSAIYN 122 1G4 alfa CDR2 IQS 123 1G4 alfa CDR3 CAVRPTSGGSYIPTF 124 1G4 alfa domeniu variabil METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHP 125 1G4 alfa domeniu constant YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 126 1G4 alfa lungime completă METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 127 1G4 beta CDR1 MNHEY 128 1G4 beta CDR2 SVGAGI 129 1G4 beta CDR3 CASSYVGNTGELFF 130 1G4 beta domeniu variabil MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL 131 1G4 beta domeniu constant EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 132 1G4 beta lungime completă MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
Tabelul 2: Secvenţe peptidice ale invenţiei
Cod peptidă Secvenţă SEQ ID NO: MAGEA1-003 KVLEYVIKV 133 MAGEA1-003_A1 AVLEYVIKV 134 MAGEA1-003_A2 KALEYVIKV 135 MAGEA1-003_A3 KVAEYVIKV 136 MAGEA1-003_A4 KVLAYVIKV 137 MAGEA1-003_A5 KVLEAVIKV 138 MAGEA1-003_A6 KVLEYAIKV 139 MAGEA1-003_A7 KVLEYVAKV 140 MAGEA1-003_A8 KVLEYVIAV 141 MAGEA1-003_A9 KVLEYVIKA 142 TMEM175-001 ILLPYVSKV 143 EPAS-001 KALEGFIAV 144 PTRF-001 KLLEKVRKV 145 GALNTL4-001 KLTEYVDKV 146 PSME2-001 KVLERVNAV 147 KIAA103-002 KVLNKVITV 148 NSD1-001 KVQEQVHKV 149 TBC1D9-002 LLLPDVIKV 150 TMTC4-001 NVLEIVQKV 151 RASAL2-002 SVLEPVISV 152 NYESO1-001 SLLMWITQV 153 MAGEA1-003_T1 TVLEYVIKV 154 MAGEA1-003_T2 KTLEYVIKV 155 MAGEA1-003_T3 KVTEYVIKV 156 MAGEA1-003_T4 KVLTYVIKV 157 MAGEA1-003_T5 KVLETVIKV 158 MAGEA1-003_T6 KVLEYTIKV 159 MAGEA1-003_T7 KVLEYVTKV 160 MAGEA1-003_T8 KVLEYVITV 161 MAGEA1-003_T9 KVLEYVIKT 162
EXEMPLE
Zece TCR-uri specifice MAGEA1-003 (R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1C9, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 şi R59P2E7, vezi Tabelul 1), fiecare codificând lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta specifice tumorilor, au fost izolate şi amplificate din celulele T ale donatorilor sănătoşi. Celulele provenite de la donatori sănătoşi au fost stimulate in vitro în conformitate cu o metodă descrisă anterior (Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15;171(10):4974-8), iar celulele cu ţintă specifică au fost sortate monocelular folosindu-se multimeri HLA-A*02 şi apoi utilizate pentru izolarea ulterioară a TCR-urilor. Secvenţele TCR au fost izolate prin 5' RACE prin metode standard descrise, de exemplu, în „Molecular Cloning, a laboratory manual, fourth edition» de Green şi Sambrook. Regiunile variabile alfa şi beta ale TCR-urilor R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5, R59P2E7, 35P3A4, R37P1C9 şi R37P1H1 au fost secvenţiate, iar construcţiile de exprimare au fost generate prin sinteză genetică pentru o caracterizare funcţională ulterioară.
R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 şi R59P2E7 provin de la un donator HLA-A*02 negativ (cadru aloreactiv), iar R35P3A4, R37P1C9 şi R37P1H1 provin de la un donator HLA-A*02 pozitiv.
TCR-urile de interes au fost exprimate în celule T umane prin transducţie, de exemplu, prin electroporare cu ARNm sau prin transducţie lentivirală. Pentru transducţia lentivirală, PBMC-urile au fost decongelate şi lăsate să se repauzeze peste noapte, apoi activate folosindu-se anticorpi imobilizaţi. Celulele activate au fost transduse utilizându-se un vector lentiviral care codifică TCR-ul specific MAGEA1 şi expandate în prezenţa citokinelor. Celulele T au fost recoltate şi concentrate prin centrifugare, apoi crioprezervate.
Celulele T au fost evaluate pentru eliberarea de IFN-γ după co-cultură cu diferite celule-ţintă, cum ar fi celule T2 încărcate cu diferite peptide, precum şi linii celulare tumorale şi celule primare din ţesuturi sănătoase. Datele de activare a celulelor T sunt prezentate în niveluri absolute de IFNγ sau în mod de substracţie a fundalului, după cum este indicat mai jos.
Eficacitatea celulelor T CD8+ care exprimă TCR-uri R35P3A4, R37P1C9 şi R43P3G5 a fost determinată, de exemplu, prin studii de activare a celulelor T (eliberare de IFNγ) sau prin teste de distrugere folosindu-se diferite linii de celule tumorale ca celule-ţintă. Caracterizarea profilului de siguranţă al TCR-urilor de interes a fost abordată prin testarea activării potenţiale a celulelor T care exprimă TCR-uri în urma co-culturii cu tipuri de celule primare izolate din ţesuturi sănătoase şi cu tipuri de celule derivate din celule stem pluripotente induse (iPSC) de la donatori HLA-A*02-pozitivi (Figura 33). Tipurile de celule au fost selectate în aşa fel încât să acopere organe critice precum creierul, inima şi ficatul şi diferite tipuri de celule, precum epiteliul, endoteliul sau muşchiul neted. Liniile de celule tumorale au fost analizate una lângă alta drept controale pozitive şi negative.
Metoda de substracţie a fundalului pentru eliberarea de IFNγ:
Mediebg (TCRoi; co) = [medie(TCRoi; co)-medie(TCRoi; numai efector)]-[medie(simulacru; co)-medie(simulacru; numai efector)]
A fost calculată valoarea SDbg respectivă:
SDbg (TCRoi; co) = [SD(TCRoi; co) 2 + SD(TCRoi; numai efector) 2 + SD(simulacru; co) 2 + SD(simulacru; numai efector) 2]^[1/2]
TCRoi = celule efectoare care exprimă TCR-ul de interes
Simulacru = celule efectoare fără exprimare exogenă a TCR-ului
Co = celule efectoare co-cultivate cu celule-ţintă
Numai efector = celule efectoare care nu au fost co-cultivate
Medie(bg) = eliberare de IFNγ medie (substracţie de fundal) SD(bg) = deviaţie standard (substracţie de fundal)
Exemplul 1: Receptor de celule T R26P1A9
TCR-ul R26P1A9 (SEQ ID NO: 1-12) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 11). R26P1A9 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 1 şi Figura 22). TCR-ul R26P1A9 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 11). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul R26P1A9 are un EC50 de 6 nM (Figura 36).
Exemplul 2: Receptor de celule T R26P2A6
TCR-ul R26P2A6 (SEQ ID NO: 13-24) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 12). R26P2A6 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 2 şi Figura 23). TCR-ul R26P2A6 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 12). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul R26P2A9 are un EC50 de 100 nM (Figura 37).
Exemplul 3: Receptor de celule T R26P3H1
TCR-ul R26P3H1 (SEQ ID NO: 25-36) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 13). R26P3H1 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 3 şi Figura 24). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 13). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 16 nM.
Exemplul 4: Receptor de celule T R35P3A4
TCR-ul R35P3A4 (SEQ ID NO:37-48) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO:133) (vezi Figura 14 de mai sus). R35P3A4 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule ţintă HLA-A*02+ şi, respectiv, leagă tetrameri HLA-A*02 încărcaţi fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 4 şi Figura 25). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 14). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 16 nM (Figura 38) şi o afinitate de 29 µM.
Pentru celulele T CD8+ care exprimă TCR R35P3A4, nu a fost observată nicio activare la co-cultura cu tipuri de celule HLA-A*02-pozitive din ţesuturi sănătoase (vezi Figura 33), în timp ce a existat o activitate faţă de liniile de celule tumorale UACC-257 şi U266B1 care exprimă HLA-A*02 şi MAGEA1 ca genă-sursă pentru peptida MAGEA1-003 (Figura 32 şi Figura 33). Un model corespunzător de reactivitate a fost observat cu celule T CD8+ care exprimă TCR-ul 1G4 de control NYESO1-specific, cu reactivitate faţă de liniile de celule tumorale HLA-A*02-pozitive care exprimă NYESO1, dar nu şi faţă de panelul indicat de celule de ţesut sănătos.
Activarea celulelor T în urma co-culturii cu linii celulare care exprimă HLA-A*02 şi MAGEA1 reflectă recunoaşterea pHLA (peptidă prezentată pe antigenul leucocitelor umane) exprimat şi prezentat endogen de către TCR-urile R35P3A4.
Exemplul 5: Receptor de celule T R37P1C9
TCR-ul R37P1C9 (SEQ ID NO: 49-60) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 15). R37P1C9 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 5 şi Figura 26). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 15). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 13 nM (Figura 34B şi Figura 39) şi o afinitate de 29 µM.
Reexprimarea R37P1C9 în celulele T CD8+ primare umane duce la legarea selectivă a tetramerilor HLA-A*02/MAGEA1-003, dar nu şi a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 (Figura 21). Reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.
Pentru celulele T CD8+ care exprimă TCR R37P1C9, nu a fost observată nicio activare la co-cultura cu tipuri de celule HLA-A*02-pozitive din ţesuturi sănătoase (vezi Figura 33), în timp ce a existat o activitate faţă de liniile de celule tumorale UACC-257 şi U266B1 care exprimă HLA-A*02 şi MAGEA1 ca genă-sursă pentru peptida MAGEA1-003 (Figura 32 şi Figura 33). Un model corespunzător de reactivitate a fost observat cu celule T CD8+ care exprimă TCR-ul 1G4 de control NYESO1-specific, cu reactivitate faţă de liniile de celule tumorale HLA-A*02-pozitive care exprimă NYESO1, dar nu şi faţă de panelul indicat de celule de ţesut sănătos.
Activarea celulelor T în urma co-culturii cu linii celulare care exprimă HLA-A*02 şi MAGEA1 reflectă recunoaşterea pHLA ţintă exprimat endogenic şi prezentat de TCR-ul R37P1C9, independent de metoda de livrare a genei, de exemplu electroporare ARNm, transducţie lentivirală etc. (Figura 32 şi Figura 34).
Exemplul 6: Receptor de celule T R37P1H1
TCR-ul R37P1H1 (SEQ ID NO: 61-72) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 16). R37P1H1 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 6 şi Figura 27). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 16). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 26 nM (Figura 40).
Reexprimarea R37P1H1 în celulele T CD8+ primare umane duce la legarea selectivă a tetramerilor HLA-A*02/MAGEA1-003, dar nu şi a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 (Figura 21). Reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.
Exemplul 7: Receptor de celule T R42P3A9
TCR-ul R42P3A9 (SEQ ID NO: 73-84) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 17). R42P3A9 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 7 şi Figura 28). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 17). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 823 nM (Figura 41).
Exemplul 8: Receptor de celule T R43P3F2
TCR-ul R42P3F2 (SEQ ID NO: 85-96) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 18). R42P3F2 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 8 şi Figura 29). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 18). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 1,7 nM (Figura 42).
Exemplul 9: Receptor de celule T R43P3G5
TCR-ul R43P3G5 (SEQ ID NO: 97-108) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 19). R43P3G5 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 9 şi Figura 30). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 19). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 6,6 nM (Figura 43) şi o afinitate de 38 µM.
Reexprimarea R43P3G5 în celulele T CD8+ primare umane duce la legarea selectivă a tetramerilor HLA-A*02/MAGEA1-003, dar nu şi a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 (Figura 21). Reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.
Pentru celulele T CD8+ care exprimă TCR R43P3G5, nu a fost observată nicio activare la co-cultura cu tipuri de celule HLA-A*02-pozitive din ţesuturi sănătoase (vezi Figura 33), în timp ce a existat o activitate faţă de liniile de celule tumorale UACC-257 şi U266B1 care exprimă HLA-A*02 şi MAGEA1 ca genă-sursă pentru peptida MAGEA1-003 (Figura 32 şi Figura 33). Un model corespunzător de reactivitate a fost observat cu celule T CD8+ care exprimă TCR-ul 1G4 de control NYESO1-specific, cu reactivitate faţă de liniile de celule tumorale HLA-A*02-pozitive care exprimă NYESO1, dar nu şi faţă de panelul indicat de celule de ţesut sănătos. Activarea celulelor T în urma co-culturii cu linii celulare care exprimă HLA-A*02 şi MAGEA1 reflectă recunoaşterea pHLA-ţintă exprimat şi prezentat endogen de către TCR-ul R43P3G5.
Exemplul 10: Receptor de celule T R59P2E7
TCR-ul R59P2E7 (SEQ ID NO: 109-120) este restricţionat faţă de MAGEA1-003 prezentat de HLA-A*02 (SEQ ID NO: 133) (vezi Figura 20). R59P2E7 recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, deoarece celulele T CD8+ primare umane care reexprimă acest TCR eliberează IFNγ la co-incubarea cu celule-ţintă HLA-A*02+ încărcate fie cu peptida MAGEA1-003, fie cu variante de substituţie cu alanină şi treonină ale MAGEA1-003 (Figura 10 şi Figura 31). Acest TCR recunoaşte în mod specific MAGEA1-003, dar nu şi diferite peptide care prezintă un grad ridicat de similaritate de secvenţă cu MAGEA1-003 (Figura 20). Peptida NYESO1-001 este utilizată drept control negativ. TCR-ul are un EC50 de 386 nM (Figura 44).
Reexprimarea R59P2E7 în celulele T CD8+ primare umane duce la legarea selectivă a tetramerilor HLA-A*02/MAGEA1-003, dar nu şi a tetramerilor HLA-A*02/NYESO1-001 (Figura 21). Reexprimarea TCR 1G4 specific NYESO1-001 şi exprimarea simulată sunt folosite drept control.

Claims (19)

1. O construcţie de recunoaştere a antigenului care se leagă în mod specific şi/sau selectiv la o peptidă antigenică MAGEA1 din SEQ ID NO: 133 atunci când antigenul respectiv este prezentat de HLA, în care construcţia de recunoaştere a antigenului respectiv cuprinde secvenţele de regiuni determinante complementare (CDR) CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 şi SEQ ID NO: 51 şi secvenţele CDR1, CDR2 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 şi, respectiv, SEQ ID NO: 57, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde secvenţele de aminoacizi CDR respective cu cel mult un aminoacid modificat, în care aminoacidul modificat este de preferinţă primul sau ultimul aminoacid al CDR respective, iar modificarea este o substituţie conservativă, şi în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului nu se leagă selectiv de niciuna dintre peptidele SEQ ID NO: 143-152.
2. O construcţie de recunoaştere a antigenului care se leagă în mod specific şi/sau selectiv la o peptidă antigenică MAGEA1 din SEQ ID NO: 133 atunci când antigenul respectiv este prezentat de HLA, în care construcţia de recunoaştere a antigenului respectiv este un receptor de celule T (TCR) sau un fragment al acestuia şi cuprinde secvenţele de regiuni determinante complementare (CDR) CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 49 şi, respectiv, SEQ ID NO: 51 şi secvenţele CDR1 şi CDR3 care au secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 55 şi, respectiv, SEQ ID NO: 57, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului cuprinde secvenţele de aminoacizi CDR respective cu cel mult un aminoacid modificat, în care aminoacidul modificat este de preferinţă primul sau ultimul aminoacid al CDR respective, iar modificarea este o substituţie conservativă, şi în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului nu se leagă selectiv de niciuna dintre peptidele SEQ ID NO: 143-152.
3. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu Revendicarea 2, în care respectiva construcţie de recunoaştere a antigenului mai cuprinde CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 50 şi CDR2 având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 56.
4. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un anticorp sau un derivat ori un fragment al acestuia sau un receptor de celule T (TCR) αβ sau un derivat ori un fragment al acestuia sau un TCR γδ sau un derivat ori un fragment al acestuia.
5. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu Revendicarea 4, în care respectivul anticorp este un anticorp bispecific.
6. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu Revendicarea 2 sau 4, în care respectivul TCR este un TCR cu un singur lanţ (scTCR) şi/sau un TCR solubil.
7. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-6 care cuprinde o regiune de lanţ variabil TCR având o identitate de secvenţă de cel puţin 90%, preferabil 95%, cu o secvenţă de aminoacizi selectată din SEQ ID NO: 52 şi 58.
8. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-7, în care construcţia de recunoaştere a antigenului este un TCR sau un fragment al acestuia care cuprinde cel puţin o secvenţă de lanţ TCR α şi o secvenţă de lanţ TCR β, în care respectiva secvenţă de lanţ TCR α cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 52 şi în care respectiva secvenţă de lanţ TCR β cuprinde o secvenţă de regiune variabilă având secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 58.
9. Un acid nucleic care codifică pentru o construcţie de recunoaştere a antigenului conform uneia dintre Revendicările 1-8.
10. Un vector cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu Revendicarea 9.
11. O celulă-gazdă care cuprinde o construcţie de recunoaştere a antigenului în conformitate cu una dintre Revendicările 1-8 sau un acid nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau un vector în conformitate cu Revendicarea 10; în mod opţional, celula-gazdă este un limfocit, de preferinţă un limfocit T sau un progenitor de limfocite T, mai preferabil o celulă T CD4-pozitivă sau CD8-pozitivă.
12. O compoziţie farmaceutică care cuprinde construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8 sau acidul nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau vectorul în conformitate cu Revendicarea 10 sau celula-gazdă în conformitate cu Revendicarea 11 şi un suport, stabilizator şi/sau excipient acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
13. Construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8 sau un acid nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau vectorul în conformitate cu Revendicarea 10 sau celula-gazdă în conformitate cu Revendicarea 11 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 12 pentru utilizare în medicină, opţional pentru utilizare în diagnosticarea, prevenirea şi/sau tratarea unei boli proliferative.
14. Construcţia de recunoaştere a antigenului, acidul nucleic, vectorul sau celula-gazdă ori compoziţia farmaceutică pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 13, în care boala proliferativă este cancerul, cum ar fi cancerul pulmonar non-microcelular, cancerul pulmonar microcelular, cancerul renal, cancerul cerebral, cancerul gastric, cancerul colorectal, cancerul hepatocelular, cancerul capului şi gâtului, cancerul pancreatic, cancerul de prostată, leucemia, cancerul de glandă mamară, carcinomul cu celule Merkel, melanomul, cancerul ovarian, cancerul vezicii urinare, cancerul uterin, cancerul vezicii biliare şi al căilor biliare, cancerul esofagian sau o combinaţie a acestora.
15. Construcţia de recunoaştere a antigenului, acidul nucleic, vectorul sau celula-gazdă ori compoziţia farmaceutică pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 13 sau 14, în care construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8 sau acidul nucleic în conformitate cu Revendicarea 9 sau vectorul în conformitate cu Revendicarea 10 sau celula-gazdă în conformitate cu Revendicarea 11 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 12 este un compus imunoterapeutic.
16. Construcţia de recunoaştere a antigenului, acidul nucleic, vectorul sau celula-gazdă ori compoziţia farmaceutică pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre Revendicările 13-15, în care utilizarea respectivă cuprinde un transfer adoptiv de celule imune la pacientul care are nevoie de tratament, cum ar fi un transfer de celule T heterologe sau autologe.
17. O metodă de fabricare a unei linii celulare care exprimă o construcţie de recunoaştere a antigenul specifică MAGEA1, care cuprinde a) furnizarea unei celule-gazdă adecvate, b) furnizarea unei construcţii genetice care cuprinde o secvenţă codificatoare care codifică construcţia de recunoaştere a antigenului în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8, c) introducerea în respectiva celulă-gazdă adecvată a respectivei construcţii genetice, d) exprimarea construcţiei genetice de către respectiva celulă-gazdă adecvată.
18. Metoda în conformitate cu Revendicarea 17, care mai cuprinde izolarea şi purificarea construcţiei de recunoaştere a antigenului din celula-gazdă adecvată şi, opţional, reconstituirea construcţiei de recunoaştere a antigenului într-o celulă T.
19. O metodă in vitro de detectare a cancerului într-o probă biologică, care cuprinde: e) punerea în contact a probei biologice cu construcţia de recunoaştere a antigenului din oricare dintre Revendicările 1-8 şi f) detectarea legării construcţiei de recunoaştere a antigenului la proba biologică.
MDE20191170T 2016-12-08 2017-12-07 Noi receptori de celule T și imunoterapie cu utilizarea acestora MD3551221T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662431588P 2016-12-08 2016-12-08
DE102016123847.3A DE102016123847B3 (de) 2016-12-08 2016-12-08 Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie
PCT/EP2017/081800 WO2018104438A1 (en) 2016-12-08 2017-12-07 Novel t cell receptors and immune therapy using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3551221T2 true MD3551221T2 (ro) 2022-04-30

Family

ID=60990744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20191170T MD3551221T2 (ro) 2016-12-08 2017-12-07 Noi receptori de celule T și imunoterapie cu utilizarea acestora

Country Status (24)

Country Link
US (3) US10702609B2 (ro)
EP (1) EP4032544A3 (ro)
JP (3) JP7016543B2 (ro)
KR (3) KR20220038511A (ro)
AU (1) AU2024227729A1 (ro)
CL (2) CL2019001535A1 (ro)
CO (1) CO2019006914A2 (ro)
CY (1) CY1124997T1 (ro)
DK (1) DK3551221T3 (ro)
ES (1) ES2916092T3 (ro)
HR (1) HRP20220131T8 (ro)
HU (1) HUE058957T2 (ro)
IL (1) IL267129A (ro)
LT (1) LT3551221T (ro)
MD (1) MD3551221T2 (ro)
MX (1) MX2022015821A (ro)
MY (1) MY192819A (ro)
NZ (1) NZ754365A (ro)
PH (1) PH12019501241A1 (ro)
PL (1) PL3551221T3 (ro)
PT (1) PT3551221T (ro)
RS (1) RS62865B1 (ro)
SI (1) SI3551221T1 (ro)
TW (1) TWI803910B (ro)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012104843A1 (en) 2011-02-06 2012-08-09 Yeda Research And Development Co.Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Affinity maturated t cell receptors and use thereof
WO2016145578A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Syz Cell Therapy Co. Methods of cancer treatment using activated t cells
GB201520570D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
DE102016123847B3 (de) * 2016-12-08 2018-04-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie
MY192819A (en) * 2016-12-08 2022-09-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel t cell receptors and immune therapy using the same
WO2019183924A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Syz Cell Therapy Co. Improved multiple antigen specific cell therapy methods
WO2019196088A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Syz Cell Therapy Co. Methods of obtaining tumor-specific t cell receptors
PH12021552979A1 (en) 2019-05-27 2023-10-09 Immatics Us Inc Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
MX2022010461A (es) 2020-02-24 2022-12-13 Immatics Us Inc Metodos para expandir linfocitos t para el tratamiento de cancer y neoplasias malignas asociadas.
US20220056411A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Immatics US, Inc. Methods for isolating cd8+ selected t cells
DE102021100038A1 (de) 2020-12-31 2022-06-30 Immatics US, Inc. Modifizierte cd8-polypeptide, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
WO2022147029A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Immatics US, Inc. Cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
WO2023044488A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Immatics US, Inc. Monocyte depletion of t cells populations for t-cell therapy
CN118525037A (zh) * 2021-10-29 2024-08-20 侯亚非 识别ctnnb1中s37f突变的t细胞受体及其应用
US20230142468A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Immatics US, Inc. Methods for generating cell spheroids
EP4463549A2 (en) 2022-01-14 2024-11-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
EP4463548A1 (en) 2022-01-14 2024-11-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
EP4514834A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
JP2025516189A (ja) 2022-04-28 2025-05-27 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． 膜結合型ｉｌ－１５、ｃｄ８ポリペプチド、細胞、組成物、およびそれらの使用方法
US20240066127A1 (en) 2022-04-28 2024-02-29 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
EP4519418A1 (en) 2022-05-05 2025-03-12 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
CN120239746A (zh) 2022-09-19 2025-07-01 图恩疗法股份有限公司 用于调节t细胞功能的组合物、系统和方法
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
WO2025029835A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating il-2 gene expression
US20250134931A1 (en) 2023-11-01 2025-05-01 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
CN117624340B (zh) * 2024-01-23 2024-04-30 北京臻知医学科技有限责任公司 识别人乙型肝炎病毒（hbv）抗原的t细胞受体（tcr）及其用途

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US20020150891A1 (en) 1994-09-19 2002-10-17 Leroy E. Hood Diagnostic and therapeutic compositions and methods which utilize the t cell receptor beta gene region
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
JP2004511425A (ja) 2000-02-08 2004-04-15 ザ　ペン　ステート　リサーチ　ファウンデーション 免疫療法に使用されるインターロイキン１３受容体サブユニットアルファー２
CA2743669C (en) * 2008-11-24 2018-10-16 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) High affinity t cell receptor and use thereof
CN103124740B (zh) 2010-09-21 2015-09-02 美国卫生和人力服务部 抗-ssx-2t细胞受体和相关材料及使用方法
SI2755997T1 (sl) * 2011-09-15 2018-11-30 The United States of America, as represented by Secretary, Department of Health and Human Services, Office of Technology Transfer, National Institutes of Health T-celični receptorji, ki prepoznajo HLA-A1- ali HLA-CW7-omejeni mage
EP3747899A3 (en) 2013-01-29 2021-02-24 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) High avidity binding molecules recognizing mage-a1
CA2906587C (en) 2013-03-13 2023-02-14 Health Research, Inc. Compositions and methods for use of recombinant t cell receptors for direct recognition of tumor antigen
WO2014201021A2 (en) 2013-06-10 2014-12-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for reducing immunosupression by tumor cells
US10202640B2 (en) * 2014-05-07 2019-02-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell analysis of T cells using high-throughput multiplex amplification and deep sequencing
MX2017000646A (es) 2014-07-15 2017-04-27 Juno Therapeutics Inc Celulas geneticamente modificadas para terapia celular adoptiva.
AU2015338958A1 (en) 2014-10-31 2017-05-11 Baylor College Of Medicine Survivin specific T-cell receptor targeting tumor but not T cells
US20220280564A1 (en) 2014-11-21 2022-09-08 Immatics US, Inc. Methods for expanding t cells for the treatment of cancer and related malignancies
CN105316362B (zh) 2015-08-19 2020-03-17 暨南大学 一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法
CA3010416A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Health Research, Inc. Compositions and libraries comprising recombinant t-cell receptors and methods of using recombinant t-cell receptors
KR20180111870A (ko) 2016-02-25 2018-10-11 셀 메디카 스위처란트 아게 Pd-l1에 대한 결합 성분
GB201604492D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
CN106749620B (zh) 2016-03-29 2020-09-25 广东香雪精准医疗技术有限公司 识别mage-a1抗原短肽的t细胞受体
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US11732020B2 (en) * 2016-06-17 2023-08-22 Medigene Immunotherapies Gmbh T cell receptors and uses thereof
DE102016123847B3 (de) * 2016-12-08 2018-04-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie
MY192819A (en) * 2016-12-08 2022-09-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel t cell receptors and immune therapy using the same
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
US11702459B2 (en) 2017-03-07 2023-07-18 Universität Basel MR1 restricted T cell receptors for cancer immunotherapy
BR112019018863A8 (pt) * 2017-03-15 2023-05-02 Hutchinson Fred Cancer Res Tcrs de alta afinidade específicos para mage-a1 e usos dos mesmos
JP7391015B2 (ja) * 2017-09-29 2023-12-04 アメリカ合衆国 Ｐ５３がん特異的変異に対して抗原特異性を有するｔ細胞を単離する方法
US11939365B2 (en) 2017-09-29 2024-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing mutated P53
JP7470640B2 (ja) 2018-02-09 2024-04-18 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． Ｔ細胞を製造する方法
DE102018108612A1 (de) 2018-03-21 2019-09-26 Immatics US, Inc. Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen
GB201804724D0 (en) 2018-03-23 2018-05-09 Univ Oslo Hf Method of diagnosing cceliac disease
EP3784255B1 (en) 2018-04-19 2025-09-17 Board of Regents, The University of Texas System T cell receptors with mage-b2 specificity and uses thereof
EA202091977A1 (ru) 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
CN112673018A (zh) 2018-09-12 2021-04-16 巴塞尔大学 用于癌症免疫疗法的mr1限制性t细胞受体
KR20210093908A (ko) 2018-10-23 2021-07-28 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ny-eso-1 t 세포 수용체 및 이의 사용 방법
GB201817821D0 (en) 2018-10-31 2018-12-19 Ospedale San Raffaele Srl TCR and peptides
GB2596461B (en) 2019-02-20 2023-09-27 Fred Hutchinson Cancer Center Binding proteins specific for RAS neoantigens and uses thereof
JP2022522802A (ja) 2019-03-01 2022-04-20 グリットストーン バイオ， インコーポレイテッド Ｔ細胞受容体の選択
AU2020231107A1 (en) 2019-03-04 2021-09-30 University Health Network T cell receptors and methods of use thereof
KR20210149251A (ko) 2019-03-08 2021-12-08 옵시디안 테라퓨틱스, 인크. 조율가능한 조절을 위한 인간 탄산 무수화효소 2 조성물 및 방법
US12448430B2 (en) 2019-03-11 2025-10-21 Fred Hutchinson Cancer Center High avidity WT1 T cell receptors and uses thereof
US20200297768A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Immatics US, Inc. Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
US20200318068A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Immatics US, Inc. Use of retinoic acid in t-cell manufacturing
WO2020227091A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Gigamune, Inc. Engineered cells expressing anti-tumor t cell receptors and methods of use thereof
PH12021552979A1 (en) 2019-05-27 2023-10-09 Immatics Us Inc Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
US20200384028A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Sorting with counter selection using sequence similar peptides
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
US12480958B2 (en) 2019-08-13 2025-11-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the characterization of peptide:MHC binding polypeptides
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
US20220056411A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Immatics US, Inc. Methods for isolating cd8+ selected t cells
US12234473B2 (en) 2020-12-31 2025-02-25 Immatics US, Inc. CD8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT3551221T (pt) 2022-01-18
RS62865B1 (sr) 2022-02-28
HUE058957T2 (hu) 2022-10-28
PL3551221T3 (pl) 2022-02-28
TWI803910B (zh) 2023-06-01
US20200254106A1 (en) 2020-08-13
JP7016543B2 (ja) 2022-02-07
US11998607B2 (en) 2024-06-04
JP2022068152A (ja) 2022-05-09
US20190321478A1 (en) 2019-10-24
KR20220038511A (ko) 2022-03-28
SI3551221T1 (sl) 2022-04-29
LT3551221T (lt) 2022-02-10
KR20210109657A (ko) 2021-09-06
ES2916092T3 (es) 2022-06-28
CO2019006914A2 (es) 2019-07-10
MY192819A (en) 2022-09-12
JP2024153696A (ja) 2024-10-29
JP2020500523A (ja) 2020-01-16
KR20240007775A (ko) 2024-01-16
CL2021002997A1 (es) 2022-08-12
IL267129A (en) 2019-10-31
NZ754365A (en) 2022-02-25
DK3551221T3 (da) 2022-01-24
HRP20220131T1 (hr) 2022-04-15
HRP20220131T8 (hr) 2022-06-24
US10702609B2 (en) 2020-07-07
PH12019501241A1 (en) 2019-12-11
EP4032544A2 (en) 2022-07-27
EP4032544A3 (en) 2022-12-21
KR102375218B1 (ko) 2022-03-17
US20240285779A1 (en) 2024-08-29
CY1124997T1 (el) 2023-01-05
MX2022015821A (es) 2023-01-24
TW202216753A (zh) 2022-05-01
AU2024227729A1 (en) 2024-11-21
CL2019001535A1 (es) 2019-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240285779A1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
US11111286B2 (en) T cell receptors and immune therapy using the same against PRAME positive cancers
US20250154246A1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
US10874731B2 (en) T cell receptors and immune therapy using the same
ES2986840T3 (es) Receptores de células T y terapia inmunológica utilizando los mismos contra cánceres positivos para PRAME
US20180164315A1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
JP7787119B2 (ja) Ｐｒａｍｅ陽性がんに対するｔ細胞受容体およびそれを用いた免疫療法
MD3500593T2 (ro) Receptori de celule T și imunoterapie cu utilizarea acestora
HK40078003A (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
HK40014640B (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
HK40014640A (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees