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PT92640B - Processo para a preparacao de oligonucleotidos sinteticos que se ligam especificamente em sitios pretendidos de moleculas de adn duplex formando uma estrutura triplex colinear - Google Patents

Processo para a preparacao de oligonucleotidos sinteticos que se ligam especificamente em sitios pretendidos de moleculas de adn duplex formando uma estrutura triplex colinear Download PDF

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PT92640B
PT92640B PT92640A PT9264089A PT92640B PT 92640 B PT92640 B PT 92640B PT 92640 A PT92640 A PT 92640A PT 9264089 A PT9264089 A PT 9264089A PT 92640 B PT92640 B PT 92640B
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synthetic oligonucleotide
synthetic
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Inventor
Michael Edward Hogan
Donald Joseph Kessler
Original Assignee
Baylor College Medicine
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Publication date
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Description

Este Pedido de Depósito é uma continuação em parte do Pedido J de Depósito Americana copendente com o n9. de série 257 359,
I depositado em 20 de Dezembro de 1958.
il ‘ Esta invenção foi auxiliado em parte através de uma concessão h ou subvenção do National Institute of Eealth.
Campo Técnico da Invenção
A presente invenção refere—se, na generalidade, à preparação
BAD ORIGINAL
I de oligonucleótidos sintéticos que se ligam em sítios pretendidos de moléculas de ADS duplex formando uma estrutura triplex colinear. A invenção refere-se também a oligonucleótidos sintéticos que se ligam à cadeia de purina de uma molécula de AD3T duplex. Outro objectivo da presente invenção refere-se ainda a um processo para regular e inibir o crescimento celular através da administração de uma oligonucleótido sintético, que é capaz de se ligar a uma molécula de ABfí duplex para formar uma estrutura trijiex colinear.
ISTOR1AL DA INVENÇÃO
Há já algum tempo cue é conhecido o facto de que o polinucleó ;j tido polydt se liga ao polydA-polydt duplex para formar uma estrutura triplex colinear (Arnott, S â Selsing E. (1974) J. 1'olec. Biol. 88, 509). A estrutura desta molécula triplex foi ' deduzida a partir de análises de defracção de fibra por raio X e foi determinada como sendo uma estrutura triplex colinear (Arnott, S. & ^elsig E. (1974) J. Holec. Biol. 88, 509). A
I í cadeia polydT está ligada numa orientação paralela à cadeia it d>? polydA de estrutura duplex sublinhada. A estrutura triplex ii polydf - polydA - polydT é estabilizada pela base Hoogstein
T-A que emparelha entre A na estrutura duplex e a terceira cadeia do polydl. Tal interacção coloca necessariamente a ι
terceira cadeia, denominada um ligando, no recesso maior do duplex subordinado. 0 sítio de ligação no recesso maior é tamj bém referido como a sequência pretendida.
ί Similarmente, tem sido mostrado que o polydC ligar-se-à pela 1' formação triplex à esírutuna duclex polydC—polydC provavelmente por emparelhamento C-G na recessão em hellx maior do du! plex subordinado, (Riley λ'., 1'ailing B. & Chamherlin K. (1966)
í τ
ί “ J. ?7olec. 3iol. 20, 359). Este padrão de associação parece ser idêntico ao padrão de formação do triplet G-G-C observado nos cristais tARN (Cantor C. & Schimmal ?., (1988) Biophysical Chemistry Vol. I, p. 192-195).
i
I
As estruturas triplex de forma polydA—polydA-polydT e polydC-polydC—polydC têm sido também detectadas (Broitman S., Im !D.D. of Fresco J.R. (1987) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84»
5120 e Lee J.S., Johoson D.A. & Morgan A.R. (1979) Nael. Aciΐ ds Residues 6, 3073). Têm sido também observadas outras esií truturas triplex mistas polydcT-polydGA-polyCT. (Parseuth D.
et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85, 1849 e iloser II. il S. & Dervon P.B. (1987) Science 238, 645). Betes complexos, no entanto, provaram ser fracos apenas ocorrendo a um pH ácido.
i ! Foram sintetizados isómeros oligonucleótidos desoxiribo parati lelos que se ligam em orientação (Uoser H.E.&· Dervon P.B. j (1987) Science 238, 645-650 e Rajagopol P. & Feigon J. (1989) j Nature 339, 637-640). Nos exemplos em que os sítios de ligaíí ção eram simétricos e podiam ter-se formado estruturas trii; plex paralelas ou antiparalelas (OligodT que se liga a um oli ii god/i-oligodT duplex pretendido), a estrutura triplex obtida formou-se em orientação paralela (Boser Β.Ξ. & Dervon P.B.
j! (1987) Science 238, 645-650 e Parseuth D. et al. (1988) PUAS : 85, 1349-1353), como foi deduzido a partir de análises de dil[ | fraeção por raio-X de estrutura triplex polydT-polydA-polydT.
Estudos realizados com oligonucleótidos que compreendem um alfa anómero, não natural, de una subunidade nucleótida, revelaram que se pode formar uma estrutura triplex antiparale! la. (Parseuth D. et al. (1988) PMAS 85, 1349-1353). No entani to, desde que as unidades alfa desoxiribunucleótido do ADN estejam propriamente invertidas em relação às beta subunidades naturais, forma-se uma estrutura triplex antiparalela a bad OWQ’nM-
s
ípartir de alfa oligonucleótidos seguida necessariamente pela iobservação de formação de uma estrutura triplex paralela pel ^beta oligonucleótidoe naturais. Por exemplo, os oligonucleójtidos alfa desoxi formam preferencialmente estruturas paraiellas em detrimento das estruturas em hélice u’atson-Crick antiI paralelas, com uma cadeia complementar do isómero beta ADN.
Tem-se demonstrado que um oligonueleótido de ADÍÍ pode llgar-se por meio de uma estrutura triplex a um sítio pretendido da molécula de ADN duplex numa região controlo do gene; pelo que suprime a iniciação da transcrição (Cooney et al. ... (1988), Science 241, 456). Beta foi uma observação importante, pois as moléculas de ADN duplex alvo não eram sequências de irepetição simples.
A presente invenção desenvolve um novo processo para a preparação de oligonucleótidos sintéticos, que se ligarão estrita e especificamente a uma molécula de ADN duplex alvo. Quando o alvo serve como uma proteína regulatória, o processo pode ser usado para preparar oligonucleótidos sintéticos, os quais podem ser usados como uma classe de moléculas de uma droga para manipular selectivamente a expressão de genes individuais.
SUL1ARIO DA INVENÇÃO
C objecto da presente invenção é um processo para a preparação de oligonucleótidos sintéticos que se ligam a moléculas de ADN duplex.
Um outro objectivo da presente invenção ê preparação de oligonucleótidos sintéticos um processo para que formam estrutu-
BAD ORIGINAL
ras triplex com ADN.
Um objectivo adicional à presente invençSo é um oligonucleétido sintético, que forma uma estrutura triplex colinear com uma sequência pretendida numa molécula de AL?» duplex.
Um outro objectivo da presente invenção é uma provisão de um oligonucleétido sintético que inibe o crescimento das células.
Um outro objectivo da presente Invenção é a obtenção de um oligonucleétido sintético que inibe o crescimento de um patogénico.
Um objectivo adicional da presente invenção é um processo para alterar o teor em proteína estrutural do tecido epidermal para o tratamento de maturação e coagulação do sangue.
Um outro objectivo da presente invenção é um processo para inibir a expressão de genes por alteração permanente das sequências de ADN.
Logo, na realização dos objectivos acima descritos, desenvolve-se, de acordo com um aspecto da presente invenção, um processo para a preparação de un oligonucleétido sintético que se liga a uma sequência pretendida numa molécula de ADN duplex, que forma uma estrutura triplex colinear ligando-se à recessão maior, compreendendo o referido processo as fases seguintes: explorar-se o ADU genémico duplex e se identificarem sequência de nucleótidos pretendidos maiores do que cerca de 20 nucleótidos que possuem cerca de pelo menos 65 1 de bases purina ou cerca de pelo menos 65 / de bases de pirimidina; e sintetizar-se os oligonucleótidos sintéticos referidos complementarnente à mencionada sequência pretendida identificada possuindo o referido oligonucleétido sintético um resíduo G (guaniua) quando a localização complementar no ADN duplex tem um par de bases (GC guanina/citosina), e tendo uma
BAD ORIGINAL
-ÍT (ribotimidina) quando a localização complementar no ADN dujplex tem um par de base AT (adenosina-ribotinidina). Em realização específica o oligonucleótido sintético pode ser escolhido entre o grupo que consiste num oligonucleótido orientado no sentido 5’ para 3’ e que se liga paralelamente a cerca de pelo r.enos 65 /' da purina da cadeia, ou um oligonucleótido orientado no sentido de 3’ para 5’ e que se liga antiparalelamente a cerca de, pelo menos, 65 a da purina da cadeia, i
Um outro aspecto da presente invenção é o facto do oligonu;cleótido sintético formar uma estrutura triplex colinear com uma sequência pretendida num ADN duplex, quando a mencionada sequência pretendida é constituída ou por cerca de pelo menos 65 / de bases de purina ou cerca de pelo menos 65 % de bases Jde pirimidina, que compreende, uma sequência de nucleótidos icom pelo menos cerca de 20 nucleótidos; que inclui resíduos Jl G e T, em que G é usada quando a localização complementar e o i| ADN duplex possuem um par de bases GC e T é usada quando a lo·|callzação complementar no ADN duplex é um par de bases AT; e | a mencionada sequência é escolhida entre o grupo, que consisj te num oligonucleótido orientado no sentido 5* para 3’ e liI ga-se paralelamente a cerca de pelo menos 65 % da purina da i cadeia de sequência de AD2I duplex pretendida, e um oligonui cleótido orientado no sentido 3’ para 5* e liga-se anti-paralelamente a cerca de pelo menos 65 f da purina da base na seii jl quência do ADN duplex pretendida.
II •ί Nas realizações preferidas, o oligonucleótido sintético pode ter pelo menos un resíduo T substituído por X,I e derivados , halogenados de X e de I. Além disso, pelo nenos um resíduo ’| C pode ser substituído por um derivado halogenado de G.
Jj Realizações adicionais compreendes substituições no oligonucleótido sintético. Por exemplo, a base pode ser substituída na posição, da furanose 2* por um grupo volumoso não carregado
BAD ORIGINAL
e a cadeia principal do oligonucleótido sintético pode ser um análogo de fosfodiéster que não é facilmente hidrolizado por nuclea3es celulares. Adicionalmente, pode ser fixado um grupo encadeador na extremidade 3' e/ou 5’ do oligonucleótido sintético. Este encadeador desenvolve um processo para ligar grupos de modificação ao oligonucleótido sintético. Cs grupos de modificação podem ser intercaladores, moléculas que se lilam ao recesso, aminas catiónicas e polipéptidos catiónicos.
Um outro aspecto da presente invenção é um processo para iniί bir o crescimento de células, que compreende a fase de admijinistração de oligonucleótidos sintéticos em quantidade suficiente para aumentar células e ligarem-se às sequências pretendidas, na qual a mencionada sequência pretendida está poísicionada no domínio do ΑΊΠ adjacente à origem da transcrição do ΛΒΝ. Esta técnica pode ser usada para inibir o cresciJmento de células do cancro e patogénicas. Numa realizaçao ! preferida, esta técnica é usada para inibir o vírus NIV—I, li· ígando um oligonucleótido sintético à região LTR virai.
j Um outro aspecto da presente invenção é um processo para alte· H rar as proporções relativas do teor de proteína estrutural do 'j tecido epidermal por melo da administração do oligonucleótido 'sintético numa quantidade suficiente para obter o aumento ce[lular e para se ligar à sequência pretendida para genes colagéneos.
!Cutros e oosteriores objectivos e vantagens tornar-se—ao apaί rentes a partir da descrição que se segue das realizações da invenção preferidas presentemente dadas a propósito de desi vendar a invenção quando tomadas conjuntamente com os esquemas que a acocpanham.
I lBad °R'Qinal
-?BREVE DESCRIÇÃO DOS ESQUEMAS
I
A Figura IA apresenta a morfologia da superfície de uma estrutura triplex. Trata-se de um esboço gerado por um computador da estrutura pretendida do ADN duplex e apresentei uma forma canónica B e a forma em hélice. No caso de se ligar um ligando oligonucleótido, a sequência pretendida experimenta uma : transição da forma B para a forma A, o que cria um aumento de profundura na recessão maior em hélice (Lf). Numa estrutura :i triplex colinear, o oligonucleótido envolve-se na estrutura sob a forma de hélice A pretendida ocupando a recessão maior.
A ligação do recesso foi realçada, apresentado-se para tal ii o oligonucleótido de ligação como uma a bstraeção semelhante ΐ a fitas.
[ ' A Figura IB apresenta a orientação da cadeia numa estrutura ! triplex colinear. 0 ligando oligonucleótido liga-se à sequên;! cia pretendida duplex numa orientação paralela em relação à t cadeia de orientação (mais rica em purina).
A Figura 2 apresenta o modelo do hidrogénio do oligonucleótido que se liga à sequência duplex pretendida: um resíduo G j para um par de bases GC e T para οε pares de base A?. A Figui ra 2A é um esboço simulado por computador do modelo de hidroi.l génio preferido, que forma a ligação entre o resíduo G no 11j! gando e resíduo G no par de bases GC, no sítio correspondente í na cadeia de orientação da sequência duplex pretendida. A asI sociação T-A? é idêntica ao par de bases l.oogstein clássicos, ! no qual a associação G-GC é essencialmente co-relativa à guanina e envolve para a ligação Có. Cunhas sólidas definem o sítio onde tal secção transversal é afixada através de uma i estrutura triolex à secção transversal correspondente acima li ' dela.
: ι
Cunhas abertas definem o sítio no qual tal secção trasversal
BAD ORIGINAL £ ·· !é afixada através de uma estrutura triplex à secção transverjsal abaixo correspondente. £ também importante reconhecer-se que o modelo favorável da formação de ligação entre o resíduo G e o par de bases GC, ou entre o resíduo T e o par de bases (AT) (setas) não pode ser imitado por qualquer outra sequência da associação base-base a p'i neutro (0 resíduo C pode substituir G sob condições ácidas).
Os esquemas 2C e 2Ώ são sequências-padrão de ligação correspondentes, que resultam quando o resíduo G de um par de bases !j GC ou um resíduo A de um par de bases AT ocorre com uma oriHentação transversal à cadeia de orientação da sequência duplex pretendida. Neste caso, as regras de selectividade das .sequências de oligonucleótidas são as mesmas (isto é, um rei síduo G no par de bases GC, um resíduo T para o par de bases AT), no entanto, a ligação do resíduo G ocorre de a Νθ e |ío resíduo T liga-se no par líoogstein invertido”, consequeni temente a orientação paralela conjunta do ligando de ligação | e a sequência de orientação da sequência pretendida.
iA Pigura 3 apresenta um processo de aperfeiçoamento da sejquência padrão do hidrogénio do oligonucleótido que se liga ,:à sequência duplex pretendida: xantina liga-se aos sítios com |! pares de bases AT. Λ estimulação gerada pelo computador é apresentada na Pigura 3 como na Pigura 2, excepto que é aprej| sentado o efeito da substituição da xantina (X) por um resííi duo T. Tal como se vê, tanto na ligação de Ή oogstein” (3A e j 3B) como na ligação .oogstein Invertido (3C e 3D), os resíι duos X e T ligam-se equivalentemente a um par de bases AT sub·· ilinhado. A maior diferença entre os dois é que o resíduo X ;é praticamente idêntico aos resíduos G que podem bloqueá-lo ί num ligando oligonucleótido, no que se refere à forma e taίmanho base e no que concerne à orientação dos seus componenj tes fosfodiéster no sítio de ligação do oligonucleótido. A modelação prevê que tal aumento de continuidade dos oligonuBAD ORIGINAL
-eleótidos aumenta a afinidade de ligação e a especificidade do sito de todos os oligonucleótidos em que o resíduo T é substituído por X.
IA Figura 4 desvenda a família de encadeadores de fosfodiéster alterados compatíveis com a estrutura triplex colinear. Alguns dos homólogos do fosfato estão presentes na cadeia principal de um oligonucleótido. Para cada caso s3o citados exemplos que podem ser preparados através de uma simples modificação des processos em fase sólida, assistidos por computador padrão. Os exemplos A-C são ligações tiofosfato, E ê metilifosfonato, F é fosforamidite e G é fosfotriéster.
A Figura 5 representa a formação de oligonucleótidos híbridos ípor meio de acoplamento através da ligação amina 5*. Neste ícaso, é descrita a ligação hexilamina. Esta ligação pode ser fixada no último resíduo de um oligonucleótido usando para ll tal a mesma fosforamidite química usada para polimerizar as ibases de ADN. Após purificação do oligonucleótido modificado i
pelo encadeador, podem ser adicionados os grupos que reagem
Iselectivamente com um alquilo-anino primário. Estes grupos incluem o derivado isotiocianato da eosina (EITO) ou a 9-amino acridina (ΛΙΤ), ou ua imenso número de outras pequenas moléculas. Processos químicos essencialmente idênticos são adequados para a fixação de um grupo tiol no extremo 5*.
À Figura 6 representa a inibição do virus HIV—I do ARNm em função da dose revelada pelo oligonucleótido mediado pelas estruturas triplex do ADN. Células U937/IHV-1 /Ã7CC CRL 1593» American ?ype Culture Collection, Rockville, FD), infectadas com uma espécie prototipo de HIV-1: a !ITLV-IIIB β cultivadas sob condições tais que mais de 90 £ das células mantiverao-se disponíveis e continham o virus HIV-1 do ARNm tal como se revelou por hibridização in situ com uma amostra marcada com para o L7R do yirus EIV-l, (NEP 200, Dupont, Wilmington,
BAD ORIGINAL A
DE)7 foram incubadas com cada um dos oligonucleótidos a conI centrações de 0, 2, ó, 10 e 20 ^uK. Adicionaram-se oligonucleótidos aos sobrenadantes em cultura no início da incubação e repetiu-se nova adição 2 horas depois.
As células foram colhidas 4 horas depois da incubação, e lavadas com P3S antes de se remover todo o ARN celular usando-se ! para tal ARNzol (Cima/blotecx Laboratoris International, Inc.L
I
Priendswood, TX). Foram preparadas diluições 2x em série a partir de cada preparaçao de ARN (iniciando-se a uma concentração de 2,5^1^ de ARN) e foram aplicadas quantidades iguais para duplicar as menbranas de nylon usando para tal um aparelho de mancha de fendas (Biorad). Uma mancha foi ensaiada com um fragmento env de Fcori-íihal radiomarcada do virus HIV-1 | que contém o plasmídeo pARV-7/2, enquanto outras foram ensaiaídas com ADNc radlomarcado para a β-actina. As autoradiografias ! resultantes foram então analisadas por densiometria. As onil·' dades da densidade indicadas na ordenada expressam a proporção [ (env-densidade de amostra) / (actina-densidade de amostra).
I Δ representa HIV29 par, □ representa HIV31 anti, e representa o isómero HIV29 fortuito.
; A Figura 7 mostra a persistência do efeito dos oligonucleótidos sotre o .HIV infectado de células da linha H9 ?· 0 virus hHIV-1 infectou células V937 e estas foram cultivadas durante li ;! 12 a 72 horas após a última adição do HIV31 anti. 0 oligonu! cleótido foi então adicionado no início da cultura e 2 horas depois para manter uma concentração final de 10 yUH. As células foram colhidas a tempos abaixo indicados. 0 valor de ARN ρ celular total foi colhido o aplicado para duplicar as menbranas de nylon em diluições de série com um aparelho de manchar jl fendas. Poi ensaiado uma réplica com o HIV-1 env do ADNc e [ outra com o ADNc para a ^-actina. As unidades de densidade j (ordenada) são expressas como a proporção do env para as leituras densiométricas de (9-actina. 0 símbolo D representa
BAD ORIGINAL fl
ΜΙΥ31 anti e o símbolo O representa o controlo.
A Figura 8 representa a inibição do ARN virai por parte do jHIV29 par em células 19 infectadas. As análises densiométriicas mostram uma diminuição da mensagem virai específica. As céulas H9, infectadas com o KTLV IIIB foram tratadas com o olígomero (5 yUí·') de duas em duas horas. Foram colhidas células ao fim de quatro e de doze horas, lavadas com FBS, e foi extraído todo o ARN celular. As barras listadas representam í; o tratamento do olígomero e as barras lisas representam os controlos.
ií Os esquemas não são necessariamente considerados para escalas
Certas realizações da invenção podem ser exageradas em escala ί ou mostradas de forma esquemática para interesse da clareza e 'consciencialização da própria invenção.
iIdfscrição detalhada da ikvesçXo il
I' 3 prontamente evidente para um perito na técnica que podem se 'feitas várias substituições e modificações na invenção aqui desvendada, sem que se saia do âmbito e espírito da invenção.
• 0 termo oligonucleótidos sintéticos, tal como aqui é usado, ! está definido como uma molécula que compreende dois ou mais ídesoxiribonucleótidos ou ribonucleótidos, de preferência mais do que dez. 0 seu tamanho exacto depende de vários factores, incluindo a sua especificidade e afinidade de ligação.
í ίQuando se refere a bases, o termo inclui tanto ácidos desoxiribonucieicos como a ácidos ribonucleicos. São usadas as seguintes abreviaturas: A refere-se a adenina bem como aos jseus derivados de desoxiribose, T refere-se a timina bem como aos seus derivados de desoxiribose, G refere-se a guaBAD ORIGINAL fl
nina bem como aos seus derivados de desoxiribose, X refere-se a xantina bem como aos seus derivados de desoxiribose d I refere-se à ionosina.
. 0 recesso maior refere-se a um dos recessos ao loníro da su— !
perfície exterior da hélice do AON que se formou pois a cadeia principal fosfato-açúcar extende-se mais para lá do eixo ido que as bases. 0 recesso maior é importante para ligar as moléculas reguladoras às sequências de ADN específicas.
Foi estabelecido um conjunto de técnicas para arquitecturar i;
oligonucleótidos ADN ou ARN que se ligam ao AD?; pretendido por formação de uma estrutura triplex colinear. Uma realização da presente invenção é um processo para produção de oligni! nucleótidos sintéticos que se ligam a uma sequência alvo na estrutura duplex de ADN formando uma estrutura triplex coliJj near ao ligar-se ao recesso maior, compreendendo o referido i processo as fases de: explorar o ADN genómico duplex e ee ! identificarem sequências de nucleótidos pretendidos com mais S; de 20 nucleótidos, possuindo as referidas sequências pretendidas ou cerca de pelo menos 65 de bases de purina ou cerca de pelo menos 65 / de bases de pirimidina, complementares à : sequência pretendida identificada, possuindo o referido olij; gonucleótido um resíduo G quando a localização complementar na estrutura duplex do ADN possui um par de bases GC, possuin! do um resíduo T quando a localização complementar na estrutura duplex do ADN possui um par de bases Al. Nas realizaçêes ! específicas o oligonucleótido sintético é escolhido entre o • grupo que consiste num oligonucleótid; orientado no sentido
3’ para 5* e ligando-ee antiparalelamente a cerca de pelo me: nos 65 λ de purina de cadeia e um oligonucleotido orientado ' no sentido de 51 para 3’ e ligando-se paralelamente a pelo | menos 65 ΐ da purina da cadeia. C oligonucleótido resultante ;| pode ser sintetizado em quantidades grama por meio de processos de síntese de oligonucleótidos em fase sólida.
^BAD ORIGINAL $
A técnica de oligonucleótidos de localização específica está (dividida em três partes:
I. projecto da sequência base do oligonucleótido.
II. Análise da estrutura duplex pretendida.
I
III. KodifIcação química secundária do oligonucleótido. j
I ί I. Projecto da sequência base do oligonucleótido.
Após se identificar a sequência pretendida de ADN coe uma função biológica de interesse, deve escolher-se o comprimento do oligonucleótido. Por exemplo, um oligonucleótido com 27 .bases de comprimento é requerido para se ligar a uma preten(dida estrutura duplex de ADN com 27 pares de bases. Sob condições óptimas, a estabilidade do oligonucleótido-interacção ida estrutura duplex de ADN geraImente aumenta contínuamente I com o comprimento do oligonucleótido. Numa realização prefe(rida é usado um oligonucleótido com um comprimento que varia ; no intervalo compreendido entre 20 e 40 bases. Cs ol igonucleó·· tidos compreendidos neste intervalo formam normalmente consitantes de dissociação úteis para a sua sequência específica ido ADN pretendida. As constantes citadas situam-se no inter— 9 —8 ( valo de cerca de 10 a 10 molar.
Os oligonucleótidos, cujo comprimento é inferior a 2C bases, desenvolvem ligações nais fracas e menos específicas à sequência pretendida e são, ccnsequentemente, menos úteis.
Os oligonucleótidos que se ligam a sequências de AD” duplex são estabilizados ligando-se às purinas na estrutura duplex sublinhada. Uma vez identificada uma sequência ADN pretendida, a cadeia mais rica em porina da área pretendida é definida como uma cadeia de orientação” do sítio pretendido. Um
Um ligando do oligonucleótido foi designado para ligar ou paralela ou antiparalelamente 1 cadeia de orientação. A estabiilidade da ligação depende do tamanho do oligonucleótido e Ιοί calização no genoma. Por vezes o paralelo é mais estável do que o anti-paralelo, enquanto por vezes o inverso é verdade, ou então são igualmente estáveis. Na realização preferida, o processo de construção de uma sequência detalhada de um ligando oligonucleótido envolve a colocação de um resíduo T no oligonucleótido quando ocorre um par de bases AT na sequência ί duplex pretendida, e colocando um resíduo G do oligonuclêótido quando ocorre um par de base GG na sequência duplex do í ADN pretendida.
Exemplos de orientação dos dadores e aceitadores do vínculo ;'j baseados na estrutura deste oligonucleótido são apresentados jj nas figuras 2 e 3.
j b’ma outra realização da presente invenção inclui um oligonu! cleótido sintético para formação de uma estrutura triplex co! linear com uma sequência pretendida numa estrutura duplex j I i quando a referida sequência pretendida ou é de cerca de pelo ΐ menos 55 de bases de purinas ou cerca de pelo menos 55 ? de ; bases de pirimidina, que compreendem, uma sequência de nucleó.! tido que inclui os resíduo Ge?, na qual G é usado quando a i localização complementar na sequência ADN duplex é um par de I bases GG e o resíduo ? é usado quando a localização complemenjj tar na sequência duplex do ADN é um par de bases A?; e a rej ferida sequência é escolhida de entre o grupo que consiste ί nua oligonucleótido orientado no sentido de 3’ para 5’ e 11,1 ga-se antiparalelamente a cerca de pelo menos 55 a de purina de cadeia s num oligonucleótido orientado no sentido de 5’ para 3’ e liga-se paraleiamente a cerca de pelo menos 65 λ de í| purina da cadeia na sequência pretendida de ADN duplex. No entanto podem ser produzidas moléculas que possuam uma ou ma bases que não cedem neste relacionamento, a afinidade de li— bad original $
gação e a especificidada do sítio destes oligonucleótidos alterados poderão ser reduzidos. Consequentemente a potência biológica destas moléculas será inferior à dos ligando oligonucleótidos que possuem as relações G/GG e Τ/ΛΤ.
Abaixo representa-se um esquema que demonstra uma sequência l pretendida, e os ligandos oligonucleótidos que forem designa-j dos pela técnicas de projecto abaixo descritas.
Sequência pretendida (35 bp) *-GGGAAT2GGGCGGGTAA2T?CGGGA7AGGCGGTAA-3’ »-C0CTTAACCCGCCCAT2AAACGCCTATCCGCCATT-5’
Oligonucleótido Sintético Paralelo
5»-nGGITTTGGGGGGGTTTT7SGGGGTT'xCCSGGTT?-3' (par)
Oligonucleótido Sintético Ati-paralelo
3'-GGGTTTTGGGGGGG7TTTTTGGGGT7TGGGGGTT7-5’ (anti)
Se o oligonucleótido sintético for construído com um encadeador fosfodiéster padrão, a sua afinidade de ligação para a sequência pretendida deverá ser da ordem 10 V. sob condições salinas fisiológicas, concentração do ião divalente e temperatura. Desde que a constante de dissociação para o oligonucleótido que se liga a uma população de sequências de ADN fortuito é aproximadamente de 10para um oligonucleótido de 35 bases, a afinidade do oligonucleótido sintético para a se— quência pretendida será aproximadamente IO*' vezes maior do que para a sequência de ADN fortuito sob as mesmas condições.
II. Análise da estrutura duplex pretendida.
bad ORIGINAL
Se se seguirem estas técnicas para se produzir um digonucleótido sintético, qualquer sequência de ADN duplex de cerca de pelo menos 65 £ de purina poderá formar una estrutura triplex ! estável.
Numa região ADN, no entanto, o teor dos resíduos A+T não são uma consideração significativa, as sequências ADN duplex que apenas possuem purinas na cadeia modelo formam complexos que regra geral são caracterizados pela estabilidade aumentada.
Se definirmos ”n como o número de bases na cadeia padrão que são purina e definirmos (1-n) como o número de bases de pirimidina na cadeia padrão, então a constante de dissociação aproximada pode ser prevista a partir da seguinte fórmula semi- empírica:
K = exp“^*4n + (°.2(l-n)/RT27
Ssi.41 fórmula assume condições próximas às fisiológicas in vitro, que é de 0,05 7 TRIS/HCl, lrgCl2 5 espermina 3mD, pH 9,2; 37°C. Dstas condições constituem a operação padrão usadc no processo de projecto.
~sta relação prevê que um oligonucleótido designado para ligar uma sequência pretendida com um comprimento de 35 bases que contém apenas bases de purina na sua cadeia padrão formará uma estrutura triplex, na qual o oligonucleótido se liga con uma constante de dissociação padrão de cerca de lxlO ”sta constante de dissociação será no entanto alterada, quando a pirímidina está na cadeia modelo. Na representação esquemática onde a cadeia modelo compreende pirimidina, a cons_Q tante de dissociação é de 3x10 7.
Dsta relação é consistente tendo em conta a observação de que a energia livre da formação triplex parece aumentar em propoi>
: ção à rotação da interacção oligonuclcótido-sequência pretendida e a observação de que a energia de ligação de ura resíduo G para ura par de bases GC ou ura resíduo T no par de bases AT é dependente da orientação dos pares de bases relativa ao modelo padrão.
ι
A origem molecular deste efeito pode ser observado na Figura
2. Ξ evidente que quando o pa aJío modelo sublinhado compreende uraa série de purinas, as bases na terceira cadeia comple— [ raentar forma um agrupamento em pilha contínuo. Por outro lado, ii colocando uma pirimidina no padrão modelo inverten-se o par ;i de bases. Logo, apesar de a ligação de hidrogénio ainda ocorrer com orientação da cadeia paralela, está associada com uma deslocação em linha transversal pela terceira cadeia no reces[ so maior. Logo para o par de bases AT ou GC, aproximadamente
0,4 Kcal de energia livre para ligação favorável num sítio de i purina no modelo, mas apenas aproximadamente 0,2 Kcal quando i a terceira cadeia se liga a um sítio em que ocorreu uma in[ versão de purina para pirimidina.
I ;; III. Podificação Química Secundária do Cligonucleótido ' I ί A. Ura perito na técnica reconhecerá que uma variedade de técnicas sintéticas estão disponíveis. Na realização prefeíj rida os oligonucleótidos são sintetizados pelo processo fosforamidite, originando portanto oligómeros de ácidos desoxiribonucleicos padrão.
ί·
A modelação molecular sugere que a substituição da cadeia í principal fosfodiéster não-hidrolisável no oligonucleótido ou nos sítios eleitos aumentará a estabilidade da estrutu! ra triplex resultante. Os análogos de fosfodiéster são h mais resistentes para atacar por meio de nucleases celulares. Exemplos de cadeias principais de fosfodiésteres nãoj -hidrolisáveis são fcsíorotioato, fosforcselenoato. fosfa-
to de metilo, fosfotriéster e o alfa enantlómero do fosfodiéster que ocorre naturalmente. As cadeias de tiofosfato e fosfonato de metilo são apresentadas na Figura 4. Estes derivados não hdrdisáveis das sequências oligonucleótidos propostas poder, ser produzidas, com pequena alteração da especificidade do ADN pretendida.
A modificação da cadeia principal desenvolve um instrumento prático para harmonizar a estabilidade dos ligandos oligonucleótidos dentro da célula viva. Dor exemplo, os oligonucleótidos que contêm c encadeador fosfodiéster natural são degradados durante o decorrer de 1 a 2 horas en células eucarióticas, enquanto os derivados não hidrolisáveis parecem ser estáveis indefinidamente.
B. Os híbridos dos oligonucleótidos desenvolvem um outro processo para alterar as caracteristicas dos oligonucleótidos sintéticos. Cs encadeadores podem ser ligados às extremidades 5* e/ou 3* do oligonueleótido sintético. Os encadeadores que se ligam à extremidade 5’ são nor ilmente escolhidos de entre o grupo constituído por um análoge da base com uma amina primária fixada ao plano de base através de uma cadeia alquilo, um análogo de base com um grupo sulfldrilo fixado ao plano da base através de uma cadeia alquilo, uma amina de cadeia longa directamente acoplada ao grupo hidroxilo 5’ do oligonueleótido e um tiol de cadeia longa directamente acoplada ao grupo hidre^xilo 5* do oligonueleótido. 0 encadeador da extremidade 3’ é normalmente um análogo da base com uma amina primária fixada ao plano de base através de uma cadeia alquilo ou um análogo da base com um sulfldrilo f ix tdo ao pia·} no da base através de uma cadeia alquilo. A fixação de uma cadeia de amina primária ao extremo não deve alterar o oligonueleótido que se liga ao ADN duplex pretendido.
i
Após o encadeador ter sido ligado ao oligonucleótido sinrtético uma variedade de grupos de codificação pode ser ligada ao oligonucleótido sintético. As moléculas que podem ser ligadas compreendem intercaladores moléculas que se ligam ao recesso, aminas catiónicas ou polipeptidos catiónicos. Cs grupos de modificação podem ser escolhidos pela sua capacidade para danificar o ADM. Por exemplo, o grupo de modificação pode incluir oxidantes catalíticos tais como o quelato ferno-ZDTA, mostardas de azoto, alquiladores, reticuladores fotoquímicos, tais como psoralina, sintetizadores fotoquímicos de oxigénio elementar, tais como a eosina, azul de metileno, laranja de acridina e 9-amina acridina e reagentes de dano fotoquímlco directo tal como o etidium e vários derivados do poreno.
Por exemplo uma ligação amino como a fornecida por 1'illigem (ver Pigura 5) funciona perfeitamente. Mo entanto, o acoplamento terminal de qualquer género parece ser Igualmente equivalente. Uma vez sintetizado com um encadeador amino, os oligonucleótidos modificados podem ser ligados a qualquer reagente que seja específico para uma anina primária, por exemplo um agrupamento succinidato ou lsotiocianato.
huma realização uma ligação amino, é usada para fixar o corante de intercalamento 9-acridina isotlo.cianato para formar oligonucleótidos de estrutura triplex. A afinidade de ligação da sequência duplex do oligcnucleótido-corante híbrido é aproximadamente ICC x superior a afinidade de ligação do oligonucleótido. Outras realizações incluem a fixação do isotiocianato de eosina para oligonucleótidos. Desde que o isotiocianato de eosina quebre a hélice de ADN sob radiação, este oligonucleótido quando irradiado contra a hélice no sítio da ligação.
^AD ORIGINAL
Este oligonucleótido híbrido é útil para identificar o sítio de ligação do oligonucleótido, tanto in vivo, como in vitro e pode ser usado potencialmente como um instrumento terapêutico para destruição pretendida do gene selectiva.
A reactividade fotoquímica é também alcançada pela fixação de derivados de psoralina para oligonucleótidos através da ligação 5*. A psoralina liga-se covalenterente ao ADN após irradiação, e como uma consequência é um agente citotóxico potente. Logo, a reactividade fotoquímica, com a sensibilidade do oligonucleótido desenvolve um instrumento para dirigir a lesão de psoralina tóxica ao sítio pretendido do oligonucleótido.
acoplamento do oligonucleótido sirilar para obter reactividade química tóxica pretendida em relação às sequências de ADM específicas. Exemplos de oxidantes catalíticos incluem os quelatos de metais de transição e nuciea— ses.
A reactividade fotoquímica e/ou os agentes químicos tóxicos podem ser usados para inibir permanentemente a expres são do gene.
Em adição à reactividade química, as modificações dos oligonucleótidos alteram a proporção do aumento celular das moléculas de oligonucleótidos híbridos. 0 processo de aumento é rápido, mas fracamente compreendido. A modificação terminal desenvolve uma téc .ica útil para modificai a especificidade do tipo de células, farmaco—cinética, permeabilidade nuclear, e taxa de aumento celular absoluto para os ligandos oligonucleótidos.
í c.
Análogos da base modificados desenvolvem outros meios
ί η · ' . 3 ί y-/· ί
para alterar as características dos oligonucleótidos sintéticos. Ho entanto uma pirimidina é preferida ex detrimento de uma pirimidina, em que 7. é idêntico ao resíduo ϊ no que diz respeito à sua capacidade para formar ligações de hidrogénio. A modelação molecular mostrou que a substituição de X por um resíduo 2 nas técnicas de padrãc dos oligonucleótidos anteriores, resulta numa estrutura triplex modificada que é mais estável. Λ estabilidade aumentada deve-se principalmente ao aumento do tamanho da cadeia e ao aumento da simetria da cadeia principal de fosfodiéster no ligando. Exemplos de substituintes da base para o resíduo T são X, I e X e I halogenados. 0 resíduo G pode ser substituído por G halogenado. Além disso, a posição furanose 2* na base pode ter uma substituição com um grupo volumoso não-carregado. Exemplos de grupoe volumosos não carregados incluem alquilos ramificados, açúcares e açúcares ramificados. Huma realização preferida é substituída pelo menos uma base.
A modelação molecular sugere que o padrão dos oligcnucle tidos produza ligandos com uma afinidade e especificidadè pretendidas que exceda mesmo a da interacção do anticorpo antigénio—E;oncclonal específico.
Os oligonucleótidos sintéticos têm sido projectados para a região de controlo de tanscrição do proto-oncogene CmyC humano, para a sequência de regulação do colagéneo Ic<, para se ligar ao segmento da caixa TATA do gene actinaq de galinhas, e para se ligar a uma sequência de aumento na região do gene mais recente do virus HIV-1 humano.
Uma outra realização da presente invenção é um processo para a inibição do crescimento de células, que compreende a fase de .administração de um oligonucleótido sintético em quantidade suficiente para aumento celular e para se 'bad original i
ligar à sequência pretendida, em que a sequência pretendida citada é posicionada no domínio ADN adjacente à transcrição do ARN original. 0 oligonucleótido sintético é como acima se descreveu na descrição do processo design.
levantamento nas células é rápido para estes oligonucleótidos sintéticos e podem ser alterados com modificações e substituições apropriadas.
Similarmente a ligação pode ser alterada por trocas apropriadas ao3 oligonucleótidos sintéticos. A inibição do crescimento de células pode ser usada no tratamento de células cancerosas. As adições do oligonucleótido específico inibirão selectivamente o crescimento de células. Por exemplo os oligonucleótidos sintéticos para os genes 0-NyC podem ser usados para inibir o crescimento de algumas células cancerosas. Exemplos de olignonucleótidos sintéticos que inibem a expressão C-LíyC incluem:
3TGGTGTGTGGGTTTTGTGGGGGGTGGGGGGTTTTTTTTGGGTGGG-5 * e/ou »—TGTGGTGGGGTGGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG—51 e/ou ’—TTTGGTGTGGGGGTGGGGGTTTTGTTTTTTGT—3’ e/ou
3*-GGTTGGGGIGGGTGGGGTGGGTGGGGT-5’ e/ou
5f-GGTTGGGG?GGGTGGGGTCGGTGGGGT—3’ e seus fragmentos e análogos.
Uma outra realização inclui um processo de inibição de crescimento de patogenes que compreendem a fase de administração de um oligonucleótido sintético em quantidade suficiente para levantamento celular e ligar-se à sequência pretendida, na qual a referida sequência se liga no domínio do ácido nuclei— co adjacente à origem da transcrição do ADN. Por exemplo o virus HIV—1 pode ser inibido com um oligonucleótido sintético que se liga selectivamente à região virai LTR. Os exemplos
BAD ORIGINAL
específicos deste oligonucleótido sintético podem incluir:
3'-GTTTTTGGGTGTTGTGGGTGTGTGTGGTT-5 * e/ou
5’-TGGGTGGGG?GGGGIGGGGGGGTGTGGGGTGIGGGG7G—3’ e seus fragmentos e análogos.
Uma realização adicional inclui um processo de manipulação do teor de proteína estrutural do tecido da epiderme que compreende a fase de administração de um oligonucleótido sintético numa quantidade suficiente para levantamento celular e para se ligar à sequência pretendida. Este processo inclui a inibição de vários enzimas e proteínas de regulação na casa. Por exemplo, a proporção da síntese do gene 1«· cologéneo pode ser alterada pelo uso:
*-TGGGTTGGGTGGTGGTGGGGGTGTGGTTTGGTTGTGGGTT TTT-5’ e/ou
3*—GTGGGTTGGGTGGTGGTGGGGGTGTGGTTTGG—5 * e seus fragmentos e análogos como oligonucleótidos sintéticos.
Similarmente o gene colagenase pode ser inibido usando para tal:
5»-GGTTGGGGTTGGTGTGTTTTTTTGTGTGGGTG-3» e/ou
5*—TTGTGGTTGTTTTTTTGGTTGTGTGTGT—3, e seus análogos e fragmentos.
Os exemplos que se seguem são oferecidos como ilustração e não é nossa intenção limitar a invenção de qualquer forma. Os oli gonucleótidos sintéticos descritos nos exemplos podem incluir qualquer das substituições discutidas anteriormente. Podem ser adicionados cadeia principal, base, encadeadores e grupos de modificação. Estas substituições aumentarão a afinidade, a estabilidade química, e as propriedades de levantamento celular dos tratamentos dos oligonuieótidos específicos.
id
-EXEMPLO 1 ί
I
A. Um processo para a detenção do crescimento de tecido canceroso no Homem, por meio de intervenção no Programa de Expressão do Gene C-UyC.
A evidência disponível sugere que uma família de tumores, que inclui o linfoma de Burkitt e outros, partilham uma lesão genética comum, que se revela como a superprodução constitutiva do ARNm C-KyC e sua proteína C-UyC correspondente. Como ía proteína C-myC tem mostrado ser um elemento crítico no conítrolo do crescimento de células, crê-se que pode existir uma ' relação causal directa entre a superprodução da proteína
C-myC e o crescimento do cancro incontrolado de tais células.
jTanto em células cancerosas como normais, o gene C-myC possui várias sequências pretendidas na sua sequência flanco 5* que satisfaz os critérios do padrão dos oligonucleótidos sintéticos. Num programa de desenvolvimento da droga, são usadas estas sequências pretendidas e outras como modelo para dirigir I o padrão oligonucleótido. 0 objectivo destes oligonucLeótidos ί é o de Inibir selectivamente a transcrição do C-myC, consequentemente reprimindo o crescimento descontrolado de tumores ( com lesões de C—myC.
i!
i; Três sequências pretendidas representativas na região de con[i trolo de transcrição do gene C-myC são as apresentadas abaixo ι A. TARGET; THE TATA POX POR THE C-iíYC GENE ADN duplex pretendido
5TCCTCTCTCGCTAATCTCCGCCCACCGGCCCTTTATAATGCGAGGG—3· ♦—AGGAGAGAGCGATTAGAGGCGGGTGGCCGGGAAATATTACGCTCCC—5’
SSQUSNCIA DO OLIGONUCLEOTIDO SINTÉTICO ’-TGGTGTGTGGGTTTTGTGGGGGGTGGGGGGGTTTTTTTTGGGTGGG-5' !
!s. Sequência Pretendida; Sítio de ligaçao activador da Transcrição-Sítio de ligação a que se liga a proteína principal.
Níveis elevados inapropriados da expressão do gene C-myC eej tão fortemente associados con a incidência de uma variedade p de tumores humanos. Os oligonucleótidos de estrutura triplex foram aqui designados para reprimir selectivamente a expresJsão do gene C-myc em tais tumores, logo retardando o crescimento do tumor.
I h
ί j (1) ADN duplex pretendido |j -153 -99 í 5•-TCTCCTCCCCACCTTCCCCACCCTCCCCACGCTCCCCATAAGCGCCCCTCCCGGG-3’
I ι ί ι; 3 ’—AGAGGAGGGGTGGAAGGGGTGGGAGGGGTGGGAGGGGTATTCGCGGGGAGGGCCG—5 *
Olignonucleótido sintético anti-paralelo
J 5»-GTGGTGGGGTGGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGGGT-3 (GT37 anti) !í (2) ADN duplex pretendido
I
-153 -118 ! 5 «-TCTCCTCCCCACCTTCCCCACCCTCCCCACCCTCCC-3* ! 3 *-ACAGGAGGGGTGGAAGGGGTGGGAGGGGTGGGAGGG- 5’ t
í
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
- 3 »-TGTGGTGGGGTGGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-5* (3) ADN duplex pretendido ! -142 -115 ·—CCTTCCCCACCCTCCCCACCCTCCCCA-3’ ‘ 3•—GGAAGGGGTGGGAGGGGTGGGAGGGGT—5 *
SequSncia do oligonucleótido sintético paralelo ! 3*-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGGGT-5* (par) í I f Oligonucleótido sintético anti-paralelo d
Ί í 5·—GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGGGT—3* (anti) i
íj A estrutura duplex de 27 pares de bases (bp) possui 74 de pares de base GC e 89 % de purina na cadeia de oriertaç ão. C Kdiss (6 x 10’7lí) é o mesmo, tanto para a ligação com orienjl í' tação paralela, como para a anti-paralela.
ji ij C. Sequência Pretendida: Sequência entre a caixa TAT A e o sítio activador numa sequência altamente conservada entre a família do gene C—myc dos vertebrados.
!!
I ADN duplex pretendido Ί -87 -56 '1 5 •-AAAGCAGAGGGCGTGGGGAAAAGAAAAAAGA-31
3LTTTCGTCTCCCGCACCCCCTTTTCTTTTTTCT-5’
Sequência do oligonucleótido sintético i 5’-TTTGGTGTGGGGGTGGGGGTTTTGTTTTTTGT—3'
jA função semelhante destes sítios, a posição relativa à oriigem da transcrição do ARN e a sequência do oligonucleótido que podem ser usados como um tratamento específico C-nyc são !
apresentados. Um perito na técnica reconhecerá prontamente que como genética molecular do gene C-nyc é elucidado em maior detalhe, a lista de sequências pretendida na região flanco 5* que se expandirá pela aplicação dos critérios de padrão acima apresentados.
Os oligonucleótidos sintéticos A e B interactuam especifica1 i lmente na estrutura duplex pretendida para inibir o crescimenI to do tumor, por meio de repressão específica da transcrição. 10 processo específico de inibição do oligonucleótido C é desconhecido.
Um perito na técnica reconhecerá prontaaente que os oligonucleótidos para outros genes envolvidos cm tumores humanos podem ser similarmente arquitecturados. A técnica apenas está limitada pelos dados da sequência molecular disponível.
EXEMPLO 2 :ι Um processo para o manuseamento do teor da proteína estrutuii ral dos tecidos da Epiderme, tendo como objectivo alterar a íapa rência do tecido e cura de lesões.
·; As proteínas estruturais que definem as propriedades mecâni cas da pele são bem conhecidas. A estrutura molecular das proteínas de colagéneo e elastina e suas proteaees correspondenijtes, colagenase e elastase, têm sido estudadas intensamente.
I L
Estas proteínas e3tão sob o controlo de um programa elaborado de regulação, que parece mudar durante o processo de cura de i
lesões e como um resultado do processo de envelhecimento. A estrutura molecular é suficienteaente definida para conside-
Irar tratamentos baseados sob a intervenção de gene específico !no padrão de síntese de proteínas estruturais e/ou na degradação enzimática.
I
Os dados sugerem que a mudança das propriedades mecânicas da pele que acompanham o envelhecimento (rugas, etc) deve-se em I parte a uma alteração específica da idade com abundância re- !
jlativa doe colagéneos e doutras proteínas estruturais. A interferência com a síntese e/ou degradação selectiva destas ii proteínas por tratamento com drogas pode restabelecer a dlsHribuição que se aproxima à dos tecidos mais jovens, logo os efeitos de envelhecimento podem eer parcialmente invertidos.
);
Um programa de padrão de olignonucleótidos sintéticos, baseado no manuseamento da síntese do colagéneo I na pele humana jé descrito abaixo. Alterando as concentrações relativas da
Ί i proteína, a estrutura e as propriedades mecânicas da pele poI;
ίdem ser alteradas. Logo o oligonucleótido sintético pode ser í usado como um agente terapêutico para alterar o processo de I envelhecimento da pele ou para alterar o processo de cura de lesões. Um perito na técnica reconhecerá prontamente que os conceitos podem ser extendldos a outros colagéneos, para ouJtras proteínas da pele e para as suas proteases complementaí res baseado na disponibilidade dos dados genéticos necessá— !j rios.
ií ι As sequências pretendidas representativas na região de controlo de t ranscrição do gene colagéneo alfa 1 (I) humano, a fun; ção seuelhante desses sítios, a sua posição relativa para a \ origem da transcr1ção do ARN, e a sequência do oligonucleóti— ;do sintético designado por tratamento específico de colagéneo desenvolve, a lista de sequências pretendidas na região de flanco 51 será expandida.
A. Sequência Pretendida: A caixa CAT para o gene colagéneo
β
ADN duplex pretendido
-168
-124
5-TCCCTTCCCTCCTCCTCCCCCTCTCCATICCAACTCCCAAATT—3» »-AGGGAAGGGAGGAGGAGGGGGAGAGG?AAGGTTGAGGGTTTAA-5»
Sequência do olignonucleótido sintético i 3 ’—TGGGTTGGGTGGTGGTGGGGGTGTGGTITGGTTGTGGGTTTTT—5'
Ϊ
I
B. Sequência Pretendida: Aumentador para o gene do colagéneo
ADN duplex pretendido
-294
-264 «-CCCTACCCACTGGTTAGCgCACGCCATTCT-3’
3•-GGGATGGGTGAÇÇAATCGGGTGCGGTAAGA-5'
Sequência do oligonucleótido sintético »-GGGTTGGGTGTGGTTTGGGGTGGGGTTTGG-5 *
C. Sequência Pretendida: Segmento de polipurina altamente conservado que ocorre próximo de —200 em todos os colagéneoa
ADN duplex pretendida
-177 -13 5 t-CTâcCT?CC0TCCTCCTCCCCCTCTCCATTJC-3’ *-GAGGGAAGGGAGGAGGAGGGGGAGAGGTAAGG—5» >equência do olignonucleótido sintético
3‘-GTGGGTTGGGTGGTGGTGGGGGTGTGGTTTGG—5’
/)
Os oligonucleótidos sintéticos A e B Inibem a sintese de proteínas colagéneo do tipo I. C processo inclui a repressão específica da transcrição do ARN do colagéneo. 0 processo de inibição do oligonucleótido sintético C é desconhecido. 0 efe to sob a síntese de proteínas das proteínas da pele pode ser visto pela adição de quantidades suficientes do olignonucleótido sintético para levantamento em fibroblastos humanos cultivados.
Posteriormente, duas sequências pretendidas representativas são descritas na região do controlo da transcrição do gene do colagéneo humano, a função destes sítios, a sua posição relativa para a origem da transcrição de ARN, e a sequência do oligonucleótido designou um tratamento específico de colagéneo.
A genética molecular do gene colagénase desenvolve uma lista de sequências pretendidas na região flanco 5* que se expandirá.
L. Sequência Pretendida: A caixa TATA para o gene de colagenase
ADN duplex pretendido
-48 -16 '-GGAAGGGCAAGGACTCTATATATACAGAGGGAG-3·
3’-CCTTCCCGTTCCTGAGATATATATGTCTCCCTC-5’
Sequência do oligonucleótido sintético »-GGTTGGGGTTGGTGTGTTTTTTTTGTGTGGGIG-3'
E. Sequência Pretendida: 0 aumentador induzível para o gene da colagenase. Confere resposta do promotor do tumor TPA
ADN duplex pretendido
-91 -64
*—AAGAGGATGTTASAAAGCATGAGTCAGA—3’ '-TTCTCCTACAAIATTTCGIAÇTCAGTCT-S1
Sequência do oligonucleótido sintético *-TTGTGGTTGTTTTTTTGGTTGTGTGTGX—3 * i
oligonucleótido sintético D inibe a síntese da proteína colagenase. 0 processo inclui a repressão específica da transI crição ARN de colagenase. 0 oligonucleótido sintético causa ; perda de sensibilidade do TPA, e uma repressão subsequente da Jsíntese de colagenase em presença de promotores, tais como ijTPA. Este processo inclui a repressão específica de transcrií ção do ARN colagenase. A interacção de oligonucleótidos sinté·· ticos causa um aumento dos níveis de proteína colagéneo na célula, bem como diminuem os níveis da colagenase. 0 efeito clínico do aumento causa uma alteração útil das propriedades mecânicas da face. Os efeitos podem ser observados pela adição de quantidades suficientes de oligonucleótido para aumenito celular para os fibroblastos humanos cultivados.
ίί
Um perito na técnica apreciará prontamente que estes conceitos possam ser extendidos a outros genes que são conhecidos | para se envolverem no desenvolvimento da pele, reparando e eni velhecendo e apenas se limita pelos dados genéticos moleculares disponíveis.
'1 5XBIPL0 3
Um processo para reprimir o crescimento do virus HIV-1 humano por meio do oligonucleótido que se liga aos sítios pretendidos no UIV-1 LTR.
-0 virus HIV-1 é conhecido por ser o agente causador do síndroma de imunodeíiciência adquerida (SIDA). A repetição terSminal longa do viras HTV-1 é conhecido por possuir vários segjmentos de AD? na região virai LTR que é requerida para iniciajção da transcrição num hospedeiro de células T humana. Os oligonucleótidos sintéticos reprimem selectivamente a síntese de ARNm do HIV-1 numa célula humana hospedeira, por ceio de I formulação triplex sob sequências pretendidas no LTR virai. A repressão de uma síntese de ARN resultou na redução da proporção do crescimento do virus. Tal facto pode resultar no re— ρ fardamento do processo de infecção ou a repressão da transii| ção a partir da latência para o crescimento virulento. A maioria dos sítios no LTR compreenderá sítios pretendidos para a ίintervenção da droga (oligonucleótido). Não existe ADN perdi•I do na pequena região LTR altamente conservada.
μ |f Sequências pretendida representativas na região controlo da il transcrição do LTR HIV-1 humano, a função semelhante destes •f sítios, a sua posição relativa para a origem de transcrição ; do ARN, e a sequência do oligonucleótido designada como um tratamento específico HIV-1 são apresentados abaixo.
! À medida que a genética molecular do HIV-1 se desenvolve, a i lista de sequências pretendidas dentro do LTR e em qualquer sítio expandir-ee-à.
Sj i Em todos os casos, são descritos 03 isómeros paralelos e ani| ti—paralelos. A razão é que, apesar de um ou outro apresentar j sempre a melhor afinidade de ligação in vitro, a eficácia de cada um deles deve ser ensaiada in vivo, para se tomar uma ι
•ί decisão final.
1 I
Sj A Sequência Pretendida: 0 extremo 5’ do domínio LTR do HIV-1
Λ 35
-5 .<(' ~ ·~ · L- de Purina) paralelo
A. ADN duplex pretendido (25 bp, 92 7
I
-470 -446 ι
j 5’-AAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGG—3·
».TTTTCTTTTCCCCCCTGACCTTCCC-5’ 'Sequência do oligonueleótido sintético i
5TTTTGTT2TGGGGGG2GTGGTTGGG—5* (CIVIpar)
Sequência do oligonueleótido sintético anti-paralelo b’-TITIGTTTTGGCGGGTGTGGTTGGG-5’ (HlVlanti) ; I
I 3. Sequência Pretendida: Um segmento do domínio regulatório ! do HIV-1 negativo, com similiaridade em relação ao domínio i homólogo no gene 2 interleucina.
: i
I;
!j (33bp, 88 % Purina) ADN duplex pretendida
-293 -261 i
5•-AGAGAAGGTAGAAGAGGCCAATGAAGGAGAGAA-3 *
3•-TCTCITCCATCTTCTCCGGTIACITCCTCTCII-S’ !
Sequência do oligonueleótido sintético paralelo
I |5^102011001201102000021101100201011-31 (HIV2par) ί
;Sequência do oligonueleótido sintético anti-paralelo
I *-TGTGTTGG2TGTTGTGGGGTTTG2TGGTGTGTT-5 · (IIIV2anti) ί
ι
C. Sítio preentido: Um sítio próximo do centro do LTR ADN duplex pretendido (25 bp, 88 7 purina) dd
I —229 -205 '9327 9351 i
’-GGGATGGAGGACGCGGAGAAAGAAG-3’ '3 •-CCCTACCTCCTGCGCCTCTTTCTTC-5’ (Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
5AGGGITGGTGGTGGGGGTGTTTG?TG-3* (HIY3par) h
!Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo (' 3 *-GGGTTGGTGGTGGGGGTGTTTGTTG-5 ’ (HTV3antiA
I | jD. Çftio Pretendido) l|
Ί ;Sítio de ligação para o activador de transcrição da linha-Spl
I ( (1) (36 bp, 78 purina) ADN duplex pretendido
-80 -51 í
I 5‘-AGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGATCTGGGGAGTGGCG—3' i
3’—TCCCTCCGCACCGGACCCVCCCTGACCCCTCACCGC—5’ • Sequência do oligonucleótido sintético paralelo ! 5 *—TGGGTGGGGTGGGGTGGGGGGGTGTGGGGTGTGGGG—3· (;íIV4par) ou (HIV36par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
3’—TGGGTGGGGTGGGGTGGGGGGGTGTGCCCTCTGGGG—5* (HIV4anti) ou (HIY3óantl)
HIV4 par funciona também se a base TG for adicionada à ex— β
[tremidade 3’ para produzir HIV38 par
E. Sequência Pretendida: Sítio de ligação para a região activadora da transcrição (tar); a metade a jusante do fulcro do sítio (tar
ADN duplex pretendido (29-31bp, 72 % purina) [-16 +13 [5 *-CTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTÇTGGTTAG—3 * ί ι [j 3 «-GAAAAACGGACATGACCCAGAGAGACCAATC-5 *
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo [ 3*-GTTTTTGGGTGTTGTGGGTG?GTGTGGTT-5* (HIV29par) i
I [ Sequência do olignonucleótido sintético anti-paralelo *-GTTTTTGGGTGTTGIGGGTGTGTGTGGTITG— 3 * (HIV31anti.) ιOs oligonucleótidos, HIV29 par e ΗΓ731 anti, foram produzidos |como previamente aqui se descreveu. C HIV31 anti também funji cicna se duas bases 7G forem removidas a partir do extremo 3* [ A mobilidade relativa e análises de impressão de ambos os nu[í cleótidos mostram ligar-se com elevada afinidade para sequênij
I cias provirais pretendidas, in vitro.
As células V937 infectadas com HIV-1, uma linha monocitóide, [foram tratadas com até 20 /uP com ou HIV29 par, HIV31 anti, ou um isómero fortuito de IIIV29 com afinidade in vitro não de[tectável para a sequência pretendida. A inibição significati— [ va de produção ARN virai, como se mostra pela diminuição nas ί concentrações relativas do env como em comparação para o ARNm : de β-actina, foi alcançada a uma dosagem de 10 ^uM também do oligonucleótido ( <0,01, tes.t emparelhado, Figura 5). Nao
BAD ORIGINAL fí
foi observada supressão adicional a 20 . 0 isónero fortuito do HIV29 não Inibiu a síntese de ARNm virai, nesmo à concentração de 20 fil·, qu confirma a especificidade da supressão alcançada com HTV29.
Descobrimos que quando as cáulas V937/HIY-1 foram incubadas num meio que continha 0,6 uY HIV29par marcado com ?, as células foram capazes de sequestrar rapidamente o olígomero em j concentrações que excediam as do meio. Assumindo um volume >médio de células de 350 fL determinou-se que a concentração intracelular aumentou de 2,4 após 10 minutos para um plateau de cerca de 6 yuLí após 2 horas. Os oligonucleótidos possuíram um efeito prolongado na transcrição do HIV-1 em que dois tratamentos, espaçados por duas horas, inibiu a síntese do ARNm virai durante até 72 horas (Figura 7). Outros estados revelaram o efeito da sequência tar de oligonucleótidos específicos nas células T infectadas. 0 HIV29 par foi usado para tratar células K9 ? infectadas com o virus HIV. Tratamentos de 2 em 2 horas com 5 yUl! suprimiram a síntese do ARNm nas células da linha H9 T infectadas com o virus HIV—1 na 23. e 12ô. hora.
Consequentemente, a evidência mostra que os oligonucleótidos designados para se ligarem com o recesso maior de hélice ao ARN, que formam estruturas triplexee com as sequências gene específicas na região tar do provirus HIV-1 são prontamente removidas pelas células infectadas com o HIV-1 e suprimem selectivamente a síntese do ARNm do HIV sem supressão concomitante do ARNm para a p-actina, que se expressou nestas células. Com inibição da síntese do ARNm virai, a translação das proteínas codificadas com o virus é também suprimida. A inibição do ARN virai depende da dose do oligonucleótido adicionado; a inibição máxima ocorreu a concentrações > 10 /UH. Os oligonucleótidos designados para se ligarem às sequências específicas no ADN duplex e formarem uma estrutura triplex coli
inear com as sequências pretendidas, desenvolvem um agente efijciente e altamente eficaz para regulação da expressão do gene, tais agentes desenvolvem uma nova classe de agentes quimioterapêuticos designados racionalmente para controlar a replicação do vírus e outros processos dependem de produção de ARMo novo.
Cs oligonucleótidos sintéticos de A a λ inibirão a síntese do ARNm do UIV-1, e desta forma o crescimento virai. 0 processo |j inclui a regressão específica da transcrição do ARN a-partir í do L7R virai.
f Um perito na técnica reconhecerá prontamente que estes concei-» J tos podem ser extendidos a outros genes que são conhecidos co·» mo estando envolvidos no processo de infecção pelo qual o virus HIV-1 e outras viroses actuam.
! SXEaRLO 4
I I II. ———— jÍ !! Um processo para alterar a transcrição da actina esquelética j da galinha , i : Uma sequência pretendida representativa na região controlo de ji transcrição do gene da cadeia principal da o(—actina da gali— !; nha, a função deste sítio, a sua posição relativa à origem !l da transcrição do ARN, e a sequência do oligonucleótido que ; poderá ser designado como um tratamento específico de actina, são abaixo apresentados. Como a genética molecular do gene de í actina desenvolve—se, a lista das sequências pretendidas na região de controlo de actina será apresentada:
Λ. Sequência Pretendida: A caixa TATA para o g^ne de cadeie. principal da alfa-actina
ORiGINAL
|ADN duplex pretendido
I j -30 -4 í
I5*-GATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGG-3' *—CTATTTTCCGAGGCCCCGGCCGCCGCC—5’
Sequência do oligonucleótido sintético »-GTTTTTTGGGTGGGGGGGGGGGGGGGG-3*
Esta molécula de oligonucleótido sintético inibe a síntese da proteína actina, pela repressão específica da transcrição do ARN. Zsta inibição pode ser atingida em mioblastos de galinhas cultivadas. Toda a galinha apresentará uma alteração na qualidade da actina e de outras proteínas musculares cuja síntese está fortemente acoplada à expressão da actina. 0 resultado prático desta alteração será uma alteração das propriedades da carne de galinha.
í Um perito na técnica apreciará prontamente que estes conceih tos possam ser extendidos a outros genes que são conhecidos : como estando envolvidos no crescimento e desenvolvimento musÍj cular, e está limitado por dados genéticos moleculares disSi poníveis.
ZXZPPLO 5
Receptor da cadela alfa 2 interleuclna
Sequência Pretendida: Região promotora trans
ADN duplex pretendido
BAD ORIGINAL £ β
ί
-273 -246 i 5 *-AACC-GCAGGGGAAPCPCCGPCPCGPPTP-3 *
I3’-PPGCCGPCGCCTPAGAGGGAGAGGAAAA-5' i
i
Oligonucleótido sintético paralelo
5’-TTGGGGTGGGGPTTGPGGGTCIGGPTPT-3' (IL2epar)
Oligonucleótido sintético anti-paralelo p 3 »-TTGGGGTGGGGTTTGTGGGTGTGGTTTT-5 ' (IL28anti)
I ;
i! Os 28 bp estão compreendidos em 54 / pares de bases G + C e é de 61 $ em purlna na cadeia de orientação. 0 Kdiss para a —7
P cadeia paralela é de 1,5 x 10 e o Kdiss para a anti-parale'! la é de 8 χ 10”7.
SXSEPLO 6
Η
Uca sequência para dispersar a formação de placas na doença de Alzheimers
I
J gene Procotor APP770 é a proteína precursora responsável η pela orodução da placa na doença de Alzheimers.
I ;
j A. Sequência Pretendida: fluxo inferior do sítio de caixa í PAPA
ADN duplex pretendido
P
P p-712 -679 »-AAAAACAAACAAAAAPAPAAGAAAGAAACAAAA-3' r—TTIPTGTPPGPPPPTATAPPCPIPCTTTGTPPP—5’ bad original
-! Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
5»_TTTTTGTTTGTTTTTTTTTTCTTTCTTTCTTTT-3· (A PPlpar)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo »-TTTTTG'íTTG?TTTTTTTT?CTTTCTTTC2i’TT-5 * (APPlanti)
B. Sequência pretendida: Desconhecida jj (ADN duplex pretendido) !í
-618 -590 i
I5·_TCCTGCGCCTTGCTCCTTTGGT2CGTTCT-3 *
I 3 *-AGGACGCGGAACGAGGΑΛACCAAGCAAGA-5· ί
hSequência do oligonucleótido sintético paralelo ί I
Ι3f—TGGIGGGGGTTGGIGGTTTGGITGGiTGT—5’ (APP2par) 'j Sequência dc oligonucleótido sintético anti-paralelo t 5*—TGGTGGGGGTTGGTGGTTTGGITGGTTG?—3 * (A??2anti) ί, C. Sequência Pretendida: Desconhecida , ADN duplex pretendido í· -477 -44C »-?TCTCATTCl’CT?CCAGAAACGCCTGCCCCACCTClCC-3 ‘ ' 3 »-AAGAGTAAGAGAAGGTCniC0GGACGGGGTGGATAGG-5 ’ ! Sequência do oligonucleótido sintético paralelo 3•-TTGTGTTTGlGTTGGTGTTTGGGGTGGGCGlGCTGTGG-õ’ (A??3par)
-Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
I j 5»-T?G?GTTTGIG?TGCTGTT?GGGGTGGGGGTGGTG?GG-3» (AP?3anti)
D. Sequência pretendida: Desconhecida
ADN duplex pretendido
-434 -407
I 5*-GAGAGAAAAAACGAAA?GCGGATAAAAA—3’ ; 3 »-CTCTCTTT?TTGCTT?ACGCCTATTTTT-5' !i ! ι
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo i
; 5,-GTGTGTTTTTTGGTTTTGGGGTTTTTTT-3* (APPapar) ! ι !
•ί Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
Í!
j[ 3 *—CTGTGTITTxTGGTTITGGGGTTTTTTT—5 * (A?P4anti) í;
ji D. Sequência Pretendida: Desconhecida ,'í
ADN duplex pretendido i -236 -252 ι
j 5’-CTCACCTTTCCCTGATCCTGCACCGTCCCTCTCCT—3’
3’-GAGTGGAAAGGGACTAGGACGTGGCAGGGAGAGGA-5*
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo !j 3»-GTGTGGTTTGGCTGTTGGTGGTGGGTGCGTGTGGT-5t (AP?5par) ίϊ ' Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo i
5'-GTGIGGTT?GGG?GT?GGTGG?GGGTGGG?G?GG2-3· (APP5anti)
P. Sequência Pretendida: Desconhecida
ADN duplex pretendido
-264 -230 ·—CCGTCCCTCTCCTGGCCCCAGACTCTCCCTCCC-31
I :3 »-GGCAGGGAGAGGACCGGGGICTGAGAGGGAGGG-5*
I
I
I ;Sequência do oligonucleótido sintético paralelo i;
S 3r-GGGTGGGTGTGGTGGGGGG2G2GTGTGGGTGGG-5* (APPôpar) Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo 5 *—GGGTGGGTGTGGTGGGGGG7GTGTG2GGGTGGG—3' (APPôanti)
G. Sequência Pretendida: Desconhecida
ADH duplex pretendido
-2CC -177
5♦-GGGGACCGGAGGGGGCGCGTGGGG-3’ r—CCCCTCGCCTCCCCCGOGCACCCC—5' jí Sequência do oligonucleótido sintético paraldo jl 5 ^0-00020000100000000010000-3 * (A?P7par) 'i Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo |j 3’-GC-C-GTGGGGTGGGGGGGGC aGGCG—5 ’ (APF7anti) i1
ÍI. Sequência Pretendida: Desconhecida jl ADN duplex pretendido f
j
5’—CTCGCCTGGCTCTGAGCCCCGCCCCCGCGCTC—3 * *-GAGCGGACCGAGACPCGGGGCGGCGGCGCGAG—5'
Sequência do oligonucleótido sintético «-GTGGGGTGGGTGTGTGGGGGGGGGGGGGCGTG-5’
Sequência do oligonucleótido sintético
5’-GTGGGGTGGGTGTG?GGGGGGGGGGGGGGG7G-3 f paralelo (APPSpar) anti-paralelo (APPSanti)
EXEMPLO 7 ( 0 Domínio Promotor PCPR j A expressão inaproprladamente d.evada do gene do factctrcresci— ii mento da epiderme (PGFR) tem sido implicada como crucial para o desenvolvimento de cancros e de várias doenças da pele (pso-(ríases). Os oligonucleótidos sintéticos abaixo referidos são designados para reprimir selectivamente a expressão do gene i, E?GR em tais doenças.
ij A. Sequência Pretendida: sítio de ligação ~P1 ! ADN duplex pretendido
-109 -83 »-TCCCGCCGAGTCCCCGCCTCGCCGCC-3’
I ΐ 3•-AGGCGGCTCAGGGGCGGAGCGGCGGG-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
BAD ORIGINAL · J
I Jtír
- 3 »-TGGGGGGTGTGGGGGCGTGGGGGGG-5’ (EGPRlpar)
I
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
5'-IGGGGGGTGTGGGGGGG2GGGGGGG-3’ (EGFRlanti)
3. Sequência Pretendida: Sítio de ligação SPl
S ADN duplex pretendido j |
-307 -281 j 5^TCCCTCCTCCTCCCGCCGTGCCTCCC-3’ i
:3•-AGGGAGGAGGAGGGCGGGACGGAGGG-5* í Sequência do oligonucleótido sintético paralelo r
·—TGGGTGGTGGTGGGGGGGTGGGTGGG—5 * (EGFR2par) ι Sequência do oligonucleótido sintético anti-parald.o !
I 5»-7GGGTGGTGGTGGGGGGGTGGGTGGG-3f (EG?R2anti) ί
j; C. Sequência Pretendida: Sítio de ligação SPl ij ii ADN duplex pretendido
-352 -317 j 5’-TTCTCCTCCTCCTCTGCTGCTCCCGATCCCTCCTCC—3 * : ί ij 3’-AAGAGGAGGAGGAGACGAGC-AGGGCTAGGGAGCAGG-5 ’
I
Sequência do olígnonucleótido sintético paralelo I 3’-TXGTGGTGGTGGTGTGCTGGTGGGGTTGGGTGGTGG-5* (EG?R3par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo ♦-.TTGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGGGTTGGGTGGIGC—31 (EGFR3anti) jD„ Sequência Pretendida: Domínio sensível à nuclease para 1 a expressão EG7R 'ADN duplex alvo ί
-363 -338 >5 »-TTCTCCTCCCTCCTCCTCGCATTC?CC?CCTCCTCT-3’
3’-AAGAGGAGGGAGGAGGAGCGTAAGAGGAGGAGGAGA-5‘
Ί !Sequência do oligonucleótido sintético paralelo í
'3 »-TTGTGGTGGGTGGTGGTGGGTGGGTGGTGGTGGTGT-5’ (EG7R4par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
I [
| 5-tTTGTGGTGGGTGGlGGTGGGIGGGTGGTGGTGGTGT-3' (GFR4anti)
SaSííPLO 8
Gene GSTpi
A superexpressão da enzima gluthtiona-s-traneferase pi ten sido implicada ccmo sendo responsável pela resistência da dro ga num intervalo lato que se desenvolve em vários cancros.
Os oligonucleótidos sintéticos abaixo descritos são designados para reprimir a expressão do GST-pi, 3en3ibilizando consequentemente os tecidos cancerosos para quimioterapia por droga tradicional.
A. Sítio Pretendido: 0 domínio pretendido compreende as sequências de ligação consenso para os factores de acti—
vação da transcrição A?1 & Spl. Os oligonucleótidos sintétiicos pretendidos contra este reprimirá a transcrição GS7 Pi (por meio de competição com A?1 e Spl.
ADN duplex pretendido j -Ó8 -39 í
5’-GAC7CAGCAC7GGGGCGGAGCGGGGCGGGA-3’ ι
;3 »-ClGAGTCGIGACCCCGCCTCGCCCCGCCCT-5’ !Sequência do oligonucleótido sintético paralelo j 5'-GTGTGTGGTGTGGGGGGGTGGGGGGGGGGT-3' (GSTlpar)
JSequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo ii '!
3f—GTGTGTGGTGTGGGGGGGTGGGGGGGGGGT-5* (CS.lanti) |3. Sítio pretendido: Uma sequência aumentadora-semelhante ! à polipurina. Um oligonucleótido sintético pretendido contra este sítio reprimirá a transcrição G37 pi por neio de competição coe o auraentador.
I ! -227 -204
I *—GGGGACCTGGGAAAGAGGGAAAGG—3’ ·—CCCCTGGACCCTTTCTCCCTTTCC-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
5’-CCGGTGGTGGGTTIGTGGGI~TGG-3' (GST2par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo 3*-GGCGTGGTGGGTTTGTGGGITTGG-5’ (GSTSanti)
BAD ORIGINAL
Um segmento ADX repetitivo não usual. Ainda não foi descrito qualquer função para este segmento. .Xo entanto, está no domínio do controlo e pode desempenhar um papel na iniciação da transcrição.
ADN duplex pretendido
-499 -410
5AAAATAAAATAAÂAxAÀAATAAAATAAAAT—3’ r—ΤΤΓΤΑΤΤαΤΑΤΤΤΤΑΤΪ'ΤΤΑΤχΤΤΑΤχΤΤΑ—5 ’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
5»-ΤΤΤΤΤΤΤ?ΤΤ?ΤΪΤΤΤΤΤΤΤΤΤϊΤϊΤΤΤΤΪ-3’ (GS?3?ar)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo x— > < vo X jtíLnXX )
DdSUPLO 9 gene redutase ddOOoA é a enzima que define a proporção que limita a fase de biosíntese de colesterol. A sua genética molecular tem sido estudada para se compreender o controlo da síntese do colesterol. Cs oligonucleótidos sintéticos descritos irão intervir no programa da síntese do colesterol por meio da modulação da transcrição do HLCCoA
A. Sítio da sequência pretendida:
A sequência é o sítio de ligação para uma proteína de repressor que parece mediar a inibição do produto-extremidade, da transcrição pelo colesterol. 0 oligonucleótido sintético é um repressor sintético da expressão do TiUGCoA, como um agonista do repressor celular.
^AD ORIGINAL w
ADN duplex pretendido
-167 -135 »-GGlGAGAGATGGTGCGGTGCCCGTTCTCCGCCC-3’ *—CCACTCTCTACCACGCCACGGGCAAGAGGCGGG—5 *
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo '3’-GGTGTGTGTTGGTGGGGTGCGGGTTGTGGGGGG-5’ (HEGCOApar)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo »-GGxGTGTGTTGGIGGGGTGGGGGTTGTGGGGGG-3 ’ (HiSGCOAlanti)
B. Sítio Pretendido: 0 sítio pretendido é um sítio de ligaí ção para a proteína que parece activar a transcrição do HYGGGA, p0 oligonucleótido sintético contra este sítio é um repressor í sintético de expressão do HTGCCA, como um antagonista da proil teína celular que se liga ao sítio pretendido.
il í!
ι ADN duplex pretendido
I I
-134 -1C4 ; 5 f-GGGTGCGAGCAGTGGGCGGT?GTTAAGGCGA—31 »- CCCACGCTCGTCACCCGCCAACAATICCGCT—5'
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo ; 5*—GGGTGGGTGGTGTGGGCGGTTGTTTTGGGGT—3 * (:-i;.'GC0A2par)
Sequência do oligonucleótido sintético »-GGGTGGGTCGTGTGGGGGG?TGTT?TGGGGT-5’ anti-paralelo (SU GC0A2anti)
BAP original
G. Sítio pretendido: 0 sítio pretendido é um sítio de ligação para uca proteína que parece activar a transcrição do i IDJGCoA ligando-se ao domínio caixa TAUA. Uc agonista ?F0 |deste sítio é designado coco sendo uc repressor sintético da [j expressão do Hl-GCoA, como agonista de proteína celular que ee liga à caixa TA GA pretendida.
ADN duplex pretendido t -41 -ó
5♦-AGGCGATCGGACGATCCTTTCTTATTGGCGGCCCT-3’ ' 3 *-?CCGCTAGCC7GCTAGGAAAGAATAACCGCCGGGA-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo ,-IGGGGTTGGGTGGTTGGITTGTTTTTGGGGGGGGT—5’ (tll'GCOA3par) ί
i i
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
I »-TGGGGTTGGGTGGTTGGTTTGTTTTTGGGGGGGGT-3 ’ (riUGC0A3anti) íi : 10
Receptor do Crescimento dos Nervos ί
! ι gene NGFR codifica um receptor de superfície celular requerido para a proliferação de células nervosas. Está sobreexpresra em neuroblastornas e melanomas. Gs oligonucleótidos de estrutura triplex são designados para reprimir o crescimento dos tecidos cancerosos. A activação do gene será uma pré-condição à activação de regeneração de células nervosas. 0 sítio de início do ARNm é a -122 neste esquema numérico.
k. Sequência Pretendida: sítio de ligação Spl consenso
ADN duplex pretendido | -323 -290 í
5*—GGGAAC1GGGTACCAGGGCGGGATGGGTGAGAGG-3’ *—CCCTTGACCCATGGTCCCGCCCTACCCACTCTCC-5’ í
'Sequência do oligonucleótido sintético paralelo íí
L h5 »-CGGITGTGGGTTGGTGGGGGGGTTGGGTGTGTGG- 3'
I .
| i (NCFElpar)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-parelelo í 3 *-GC-G?TGTGGGTTGGTGGGGGGGTTGGGTGTGTGG-5 ‘ KGPRlap i
! 3. Sequência Pretendida; Sítio de ligação Spl consenso j
: ADN duplex pretendido
-3C9 -275 í 5 ,-AGGGCGGGATGGC-TCAGAGGCIC?AAGGGACAAGG-3 ’ *-TCCCGCCCTACCCACTCTCCGAGATTGCC2GTTCC-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
I 5 ’-?GGGGGGGT2GGGTGTGTC-C-GTG?2TGGGTGTTCG-3' i!
{(NG?H2par) {Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo í
3TGGGGGGGTTGGGTGTGTGGGTGTTTGCGTGTTCG-5 ’ (NCFR2anti) ι C. Sítio Pretendido: Sítio de ligação Sol concenso flanqueaBAD ORIGINAL A
dos pelo domínio.
ADN duplex pretendido
-285 -248
5*-AAGGGACAAGGCAGGGAGAAGCGCACGGCTGCCGGAA-3‘
3»-T2CCCTGTTCCGTCCC~CTTCGCG2GCCCACGCCC?T-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
I
5*-TTGGGTGTTGGGTGGGxGTTGGGGTGGGGTGGGGGTT-3* (!IGFR3par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo »-T?GGG2GTTGGGTGGGTGTTGGGGTGGGGTGGGGGC'r±-5 ’ (NGFR3anti)
3. Sequência pretendida; sítios de ligação Spl consenso que flanqueiam o domínio
ADN duplex pretendido
-243 -215
5'-CCCTCCCT2TGCC2C2GC22CCCACGCC-3’
3'-GGGkGGGkkkCGGkGkCCkkGGGTGGGG-S*
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo *-GGG?GC-GTTTGGGTGTCCi’TGGGTGGCC—3 ’ (NCFR4par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo »-GGGTGGGTTTGGG7GTGG'ITGGGTGGGG-5 ’ (NGFR4anti)
Sítio pretendido: sítio de ligação Spl consenso
ADN duplex pretendido
-187
-154 »-GGGGG2GGGCGGGCTGGCGGGGCGGAGGCGGGGC-3' *-CCCGCACCCGCCCGACCGCCUCGCC‘TCCGCCCCC-51
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo »-CGGGG7GGGGGGGGIGGCGGGGGGGIGCGGGGGG-3' í (NGFR5par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo »-GGGGGTGGGGGGGTGGGGGGGGGGIGGGGGGGGG-5*
J (NGFR5anti) n DXKPLO 11 í H3RP2S SLVPLFX VIRUS 1: ADN polimerase e proteínas ligados a ADN l· i· G KSV-1 é o responsável por uma variedade de lesóes da pele li e outras infecções. C oligonucleótido triplex é designado paí! ra se ligar directamente à região promotora dos genes que cojj dificam o ADN polimerase virai e a o ADN que se liga a pro— !| teínas retendo consequentemente a replicação virai. Ambos os ;! genes ocorrem a G,4 map unidades e flanqueiam a origem da replicação oriL. A nun;ração abaixo está expressa em termos do sítio do início do solipéptido para cada gene il i
ί A. Sítio Pretendido: ete sítio encon.tra-3e na sequência ! flanco 5’ do gene do ADN polimerase. Δ espécie Angelotti j possui três bases trocadas relativamente à espécie 17.
BAD ORIGINAL
(1) Espécie 17
ADN duplex Pretendido
-60 -26 i'5’—TTTTTCTGTTCCCCCCTCCCGACATTCCGCTCTTT-S f 3 •-AAAAAGAGAAGGGGCGAGGGGTGxAAGGGGAGAAA-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
3♦-TTTTTGTGTTGGGGC-GTGGGGxGTGGGGGGTGTTT—5* (H3V POLI 17 par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo ;5 »-TTTTTGTGTTGGCGGCGTGGGGTGTGGGGGGTGTTT-31 ί(ESVP0L17anti) ί
í(2) Espécie Angelotti
-62 -25
5’—IIIIIGICITCCCCCCCTCCCCACATCCCCCCTCIII—31 »-AAAAAGAGAAGGGGGCGAGGGGTGTAGGGGGGAGAAA-5’
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo «-TTTTTGTGTTGGGGCGGTGGCGTGTTGGCGGGTGJTT-5’ ('iSVPOLipar)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
5—T7IEIGTG2TC-GGGGGGIGGGGPG?7GGGGGGEC7E?-3 ’ (HSVTOlanti)
A. Sitio Pretendido: Este sítio está na sequência flanco 5* da gene da proteína que se liga ao ADN para a espécie 17·.
BAD ORIGINAL
-118 *—AAAATCCGGGGGGGGGCGGCGACGGTCAAGGGGAC-GG—3♦
3,-TTTTAGGCCCCCGCCCGGCGG7GCCAG?TCCGC1CCC-5·
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo »-TT7TTGGGGGGGGGGGGGGGGTGGGxGTTGGGG?GGG-3· (HSVFOL2par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
3t-T2?Tr2GGGGGGGGGGGGGGGGTGGGxGTTGGGGTC-GG-5 ’ (íISVFOL2anti)
En&TLO 12
HERPES SIEPLEÀ VIRGS 1: origem de replioação
HSV-1 é o responsável por uma variedade de lesões da pele e outras infecçoes. Cs oligonucleótidos de estrutura triplex são designados para se ligarem directamente às duas classes da origem da replioação do ADR do HSV-1, suprimindo coneequenjtemente a replicação virai. A primeira origem ocorre a C,4 map unidades e está entre e imediatamente adjacente à ADN polimerase do HSV-1 e ao ADN que se liga as genes da proteína.
As duas origens idênticas do segundo tipo (oriS) ocorre a C,82 e 0,97 map unidades, A numeração abaixo apresentada está expressa em termos da posição relativa ao duplo eixo de simetria de cada origem.
BAD ORIGINAL
À. Sítio Pretendido: origem oriL
1. ADN duplex pretendido
-48 -IC ! 5,-AGGACAAAGTGCGAACGC7?CGCGTTCTCACTT?17Z7-3 ’
3♦-T2TTTTT0ACTCTTGCGCTICGCAAGCGTGAAACAGGA-5·
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
I ~ »-T7TTTTTGTGIGTTGGGGTTGGGTTGGGTG7ITGIGGT-3’
- (HSVORLlpar) í;
iSequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo [3 ’-TTT7TTTGTGTGTxGCGGi7CGGTTGGGTGTI2G7GGT-5· | (HSVCRLlanti)
Ί 2. ADN duplex pretendido j 10 47 i:
:5,-ACGACAAACTGCGAAOGCrãOGCGT2CTCAC71'.7J'x7-3' :! 3 ’-TCCTCT1TCTCGCT7GGGAAGGGCAAGAGTGAAAAAAA—5 ’
ÍJ
-Sequência do oligonucleótido sintético paralelo !i ii jí3*-TGGTG7TTGIGGG7TGGGTTGGGGTTGTGTGTGT7TTIT-5* (EGVriLZpar)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo ^‘-TGGTGTxTGTGGGddGGGTlGGGGTTGlGTGGlllliddií(HSVORL2anti)
3’ i
! Istes dois sítios pretendidos estão dentro da origem oriL. Estes oligonucleótidos de estrutura triplex podem também interferir com a transcrição destes dois genes porque o oriL comipreende o domínio flanqueado 5* do ADN polimerase do iSV-1 e í a proteína que se liga ao ADN maior do HSV-1.
B. Sítio pretendido; oriS orgão
ADN duplex pretendido i
ί -69 -34 i; 5 »-ÀAGGGGGCGGGGCCGCCGGGTAAAAGAAGIGAGAA-3 ’ jl 'j 3 *—TTCCCCCGCCCCGGCGGCCOAxTTTCTTCACTCTD—5 ’ .· Sequência do oligonucleótido sintético paralelo ij 5 •-TTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTGTTGTGIGTT—31 jí (HSVORSlpar) jí '! Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
N jj 3'-TTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTITO2GITGTGfG!Í-5 ‘ h (HSVOHSlanti).
i DZDLTIO 13 |í 7V- - Ί “' í1 i Globlna Beta Humana í 0 gene da globina beta humana codifica uma das proteínas que j compreende a hemoglobina do adulto. A mutação neste gene é ' responsável pela beta talasémia e células anémicas.
Os oligonucleótidos de estrutura triplex marcados para este gene são designados como inibidores do gene da globina beta em pacientes com talacémia ou com células -.némicas, para ser ’bAD ORlG‘Nnu \---
í substituída pela proteína delta que ocorre naturalmente. Duas classes de oligonucleótidos de estrutura triplex T70 são descritas, que estSo marcadas versus o agente de aumento 5* ou o i
! promotor que codifica o domínio. A numeração é relativa ao sí: tio de início do ARNm principal.
ί
I A. ADN duplex pretendido ί
j -912 —886 íi »-CCTTTTCCCCTCCTACCCCTÀCTTTCT-3»
3«-GGAAAAGGGGAGGATGGGGATGAAAGA-5·
Sequência do oligonueleótido sintético paralelo
J 3*—GGTTTTGGGGTGGTTGGGGTTGTTTGT-5* (GLlpar)
Sequência do oligonueleótido sintético anti-paralelo
J 5*-GGTTTTGGGGTGGTTGGGGT7GTTTGT-3» (GLlanti)
B. ADN duplex .pretendido
-63 ' -25 • 5’—AGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAG—3· μ 3 *—TCCTCGTCCCTCCCGTCCTCGGTCCCCACCCGTATTTTC—5’ i :
Sequência do oligonueleótido sintético paralelo h
5»—TGGTGGTGGGTGGGGTGGTGGGTGGGGTGGGGTTTTTTG—3 * (GL2par) ! Sequência do oligonueleótido sintético anti-paralelo |i 3 »-TGGTGGTGGGTGGGGTGGTGGGTGGGGTGGGGTTTTT7G-5' ξ (GL2anti) i
c.
ADN duplex pretendido βο
I / 4 -^7 (^Λ**** j
ι
-36 -9
5’-AGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAG—3·
I 3 ’—TCCCGACCCGTATTTTCAGTCCCGTCTC—5 *
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
5»-TGGGGTGGGGTTTTTTGTGTGGGGTGTG-3* (GL3par) p Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo [I ; 3 ’—TGGGGTGGGGTTTTTTGTGTGGGGTGTG—5* (GL3anti) l· í, D. ADN duplex pretendido
514 534 p 5 ’—CCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCT—3’ li ’ 3’—GGGAACTACAAAAGAAAGGGGAÂGAAAAGA—5· | Sequência do oligonucleótido sintético paralelo i 3*—GGGTTGTTGTTTTGTTTGGGGTTGTTTTGT—5’ (GL4par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo 5‘-GGGTTGTTGTTTTGTTTGGGGTTGTTTTGT-3* (GL4anti)
E. ADN duplex pretendido i
I
693 719
5’-TTCTTGCITTCTTTTTTTTTC'l'TCTCC—3’ ♦—AAGAACGAAAGAAAAAAAAAGAAGAGG—5»
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo TTGTTGGTTTGTTTTTTTTTGTTGTGG-5’ (GL5par)
[Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo »-TTGTTGGTTTGTTTTTTTTTGTTGTGG-3» (GL5anti) i
i
ABN duplex pretendido i
í
874 900 \5 »-CTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTT-3 * *-GAGGGATGAAA?AAAAGAAAATAAAAA—5*
Sequência do oligonucleótido sintético paralelo
3’—GTGGGTTGTTTTTTTTGTTTTTTTTTT—5’ (GL5par)
Sequência do oligonucleótido sintético anti-paralelo
5*-GTGGGTTGTTTTT?TTGTTTTTTTTTT-3· (GLóanti)
EXEMPLO 14
Ensaio sobre o efeito do oligonucleótido que se liga a células. Os efeitos dos oligonucleótidos que formam uma estrutura triplex são estudados em culturas de células. Os olignonucleótidos são administrados a linhas de células humanas, que são então ensaiadas para levantamento do oligonucleótido e para uma alteração no nível do estado de equilíbrio do ARN mensageiro associado ao ADN pretendido. Como um exemplo, os processos para o gene Cmyc são apresentados. Um perito na técnica será prontamente capaz de generalizar a qualquer gene dentro duma cultura de células.
Células Hela cresceram num suporte sólido (100 yul volume totâl), foram tratadas com o oligonucleótido marcado com e enilo incubadas em função do tempo e de concentração. As
BAD ORIGINAL
células foram separadas do soro por centrifugação e lavagem exaustiva, são rompidas para desproteinização e ensaiadas quantitativamente num gel de sequência a 8 ¢. Esta técnica
Jide ensaio originou as seguintes características:
[A. 0 coeficiente de partição aparente para o levantamento do oligonucleótido en células Hela.
b. A taxa de levantamento, isto é, a constante tempo para alcançar um estado de equilíbrio no que se refere ao le— j vantamento do oligonucleótido.
' i
c. 0 tempo-médio para a degradação do oligonucleótido no soro e em células Hela.
;
A partir destes dados, tedermina-se o tempo de curso optimizado e o intervalo de titulação para o tratamento oligonucleóí tido de células.
i li i!
I A inibição da transcrição é ensaiada pela variação do ensaio !i i de protecção do RNase, que é o ensaio padrão para quantificar os níveis de ARNm no estado de equilíbrio em células de mamíferos. 0 ARN celular total é extraído de células HeLa tratadas com o oligonucleótido, e então hibridizado para transcrição do ARN anti—sentido marcado uniformemente, gerado pela ' acção da polimerase T7 no fragmento C—myc humano do Smal—Pvull em pSPTl9.
Esta amostra de Smal-PvuII é complementar a primeira myc exon e sequências que compreendem ambos os sítios de início de transcrição 1 e P2 do myc. Quando a amostra é hibridizada em excesso sobre a transcrição myc, um limite de digestão de RANASE I produz ou uma estrutura duplex 0,6 kb (transcrição do Pl, que é a origem preferida nas células Hela) ou uma estrutura duplex 0,4 kb (transcrição que ocorre por exemplo a
BAD original
partir de ?2, que é usada nas células HeLa sob condições de escassez de soro).
tamanho e a quantidade das estruturas duplex resistentes à RNase são então determinadas por autoradiografia quantitativa numa matriz gel acrilamida a 5 Este sistema de ensaio pode quantificar os níveis de ARN no estado de equilíbrio com uma precisão de 20 o que é suficiente para o propósito da análise.
efeito destas titulações celulares é analisado no contexto de duas experiências de controlo. A primeira é uma comparação de resposta dose dos oligonucleótidos que se ligam selectivamente ao gene pretendido e a resposta dose de oligonucleótido que não estão relacionadas. Se a repressão mediada pelo oligonucleótido da transcrição do C-myc se dever à formação de estruturas triplex específicas do sítio na célula, então o oligonucleótido não relacionado não promeverá qualquer afecção, sobre um intervalo de concentração equivalente.
segundo controlo dirige-se à especificidade do gene do efeito. Mo ensaio de protecção RNase, os dados são sempre normalizados para a concentração de ARN global na célula. Como tai), alterações no nível do estado de equilíbrio da transcrição myc são cheias de significado no seu direito próprio. No entanto para confirmar que tais efeitoc do oligonucleótido que se liga são específicos ao gene C-myc ensaiámos também o efeito do tratamento com o oligonucleótido específico ao myc sobre os estados de equilíbrio de mensagem da histona 2A (H2A) em células HeLa, mostrando que o ARN complementa com um ARN anti-sentido H2A gerado a partir duma construção que, como para as sequências myc, têm sido cionadas nua vector de expressão ARN. Quando repressão mediada yelo oligonucleótido é específica ao gene myc, a transcrição Π2Α nas células HeLa não será afectada, sobre um intervalo de concentração equivalente.
BAD ORIGINAL, d
A uma concentração acima de 1 a 50 micromolares, 03 oligonucleótidos que se ligam à região controlo do gene C-myc humano reprimem selectivamente a transcrição C-myc numa célula HeLa intacta. C trabalho preliminar con outros oligonucleótidos descritos nos exemplos começou a revelar una selectividade semelhante.
Um perito na técnica reconhecerá que a aplicação destes processos é prontamente generalizada para qualquer gene em qualquer linha de células e apenas é limitado pela disponibilidade das construções do gene clonado, os dados de sequência ADN e um comprimento rudimentar da genética molecular do gene sob investigação. Presentemente, tal bateria de informação está disponível para várias centenas de genes humanos, e para vários milhares de genes de outras espécies.
Os processos podem também ser aplicados, sem modificação significativa para o uso de variantes de oligonucleótidos quimicamente alterados, tais como os de agrupamentos químicos adicionados às extremidades 3* e 5*» os oligonucleótidos com ume. cadeia principal fosfodiéster alterada ou aqueles con bases diferentes de G e T (isto é, iodo- G ou x).
Por último, a importância destes exemplos é o de mostrar que uma classe completa de moléculas de oligonucleótidos de cadeia simples 6ão prontamente removidos por células eucarióticas, sem manipulação exógena de qualquer tipo. 0 mecanismo de levantamento é até ao momento desconhecido, mas na maioria das células, é eficiente e, aparenteaente, independente da p
sequência do oligonucleótido ( 'ppstein D.A., Scheyver Β. B. ífc farsh Y.V.(1986) J. Biol. Chem. 261, 5999). Consequentemente, no sentido mais gerai, as propriedades de levantamento globais, de tais oligonucleótidos não são significativamente diferentes em relação a outras drogas potentes. Por este critério, é certo que un ligando oligonucleótido designado para
Intervir selectivamente no processo da expressão do gene aprs sentará efeitos farmacológicos na célula intacta.
[No passado, estes conceitos de levantamento de células foram asados para explicar a eficácia dos oligonucleótidos do ARN como drogas que aumentam o efeito do tratamento com o Interferon (Eppstein D. A., Schryver Β. B. & larsh Υ. V. (1965) |J. Biol. Chem. 261, 5999) e da capacidade dos oligonucleótidos ”anti-sentido ou junção anti-fragmentação” para inibir selectivamente o processamento do ARNm na célula (Heikkile R. et al., (1967) Satura 328, 445 e Bppstein D. A., Schryver B.
S B. & ífarsh Υ. V. (196) J. Biol. Chem. 261, 5999). Parece que li o mesmo processo de levantamento é a base para o uso dos oligonucleótidos que formam estruturas triplex como drogas para ;; regularem selectivamente a iniciação da transcrição ou para destruir selectivamente um gene pretendido.
I ij 0 processo de padrão aqui descrito pode ser usado para proi jectar um oligonucleótido ADN sintético, que se ligará espeii cificamente a qualquer cadeia ADN pretendida, de interesse. 0 ! t ! complexo ADN de estrutura duplex-oligonucleótido resultante ι é descrito de melhor forma como uma estrutura triplex. Na esil í trutura triplex a molécula do oligonucleótido ocupa o recesso Ί maior da estrutura duplex. 0 complexo é estabilizado pela liI ' l gação base-hidrogénio de base à superfície do recesso maior, deixando o par »'atson-Crick intacto. Como um resultado, a estabilidade e a especificidade do sítio do oligonucleótido sintético não são afectadas significativamente pela modificação da ligação fosfodiéster ou pela codificação química do ί extremo do oligonucleótido. Consequentemente, estes oligonucleótidos podem ser quimicamente modificados; aumentando a estabilidade de ligação global, aumentando a estabilidade qu« ' se refere à degradação química, elevando a taxa à qual os oligonucleótidos são transportados em células, e conferindo reac ; tividade química às moléculas.
i
Baseando no processo de padrão aqui descrito, é possível fazer o projecto dos oligonucleótidos que são prontamente ele-
BAO OR'G'NAL
L
_ vadas pelas células eucarióticas e, una vez na célula, pode j ser marcada para sítios específicos dentro de um genoma. Consequentemente, a especificidade do sítio e a estabilidade da interacção oligonucleótido-sítio pretendido são tão toas quanto as interacções de ligação anticorpo monoclonal correnteantigene.
Esta nova classe de moléculas específicas ao sítio pode ser usada como reagentes específicos ao gene com capacidade para controlar o processo de transcrição na produção do gene-espeli r cífico. Este controlo é efectivo em ambos os genes somáticos e genes virais que infectarem uma célula hospedeira. Quando ’ os oligonucleótidos sintéticos são apropriadamente acoplados para um complemento químico reactivo, é possível criar uma j molécula híbrida com a capacidade de destruir selectivamente ; um gene pretendido de interesse.
I!
Um perito na técnica apreciará prontamente que a presente | i ij invenção está bem adaptada para levar a cabo os objectivos e 'ί atingir os fins e vantagens aqui mencionadas.
!,· Os ollgnnucleótidos, compostos, processos e técnicas aqui des !j critas são presentemente representativos das realizações preferidas, têm como objectivo constituirem exemplos, e não se pretende que sejam limitativos do âmbito da invenção. Altera— í ções deste e doutros usos ocorrerão aos peritos na técnica í que são abarcados no espírito da invenção ou definidos no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (4)

  1. íls. - Processo para a preparação de oligonucleótidos sintéticos que ligam uma sequência pretendida de ADN duplex formando uma estrutura triplex colinear por ligação ao recesso maior, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em
    a) se explorar o AON genémico duplex e se identificarem as sequências de nucleótidos sintéticos complementares da mencionada sequência pretendida identificada, tendo o citado oligonucleótido sintético um resíduo G (guanosina) quando a localização complementar ao ADN duplex tem um par de bases GC (guanosina / citiâna) e tendo uma 7 (ribotimidina) quando a localização complementar no ADN duplex tem um par de bases AT (adenosina / ribotimidina).
  2. 2fc. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido oligonucleótido ser escolhido do grupo que consiste num oligonucleótido orientado no sentido 3* para 5* θ se liga anti paralelamente a cerca de 65 £ da purina da cadeia e num oligonucleótido orientado no sentido 5r para 3* e se liga paralelamente a cerca de pelo menos 65 £ da purlna da cadela.
  3. 3a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadc pelo facto de se formar uma estrutura triplex colinear com uma sequência pretendida num ADN duplex quando a mencionada sequência pretendida é constituída ou por cerca de pelo menof 65 de bases de purina ou cerca de pelo menos 65 ? de bases de pirimidina, compreendendo uma sequência de nucleótidos coc pelo menos cerca de 20 nucleótidos que inclui resíduos G e T,
    en que G é usada quando a localização complementar no ADN du!plex é um par de bases GC e T é usada quando a localização complementar no ADN duplex é um par de bases ΑΪ e consistindo a citada sequência escolhida do grupo nun oligonucleótido ori entado no sentido 3f para 5’ e ligando—se antiparalelamente a cerca de 65 % da purina da cadeia da sequência pretendida de ADN duplex e num oligonucleótido orientado no sentido 5* ipara 3* e que ee liga paralelamente a cerca de pelo menos 65% de purina da cadeia da sequência pretendida de ADN.
    V. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado
    I :pelo facto de se obter um nucleótido sintético com pelo menos um resíduo T ser substituído por um substituinte escolhido do jgrupo que consiste em X, derivados halogenados de X, I, e derivados halogenados de I.
    59. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético em que pelo menos um resíduo G é substituído por um derivado halogenado de G.
    6s. — Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético em que pelo menos uma base é substituída na posição da furanose 2* por um grupo volumoso não carregado.
    73. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido grupo volumoso não carregado ser escolhido do grupo que consiste en radicais alquilo ramificados, açúcares e açúcares ramificados.
    8S. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado
    BAD ORIGINAL pelo facto de a cadela principal ser ue análogo de fosfodiésíter que não é facilmente hidrolizado por nucleases celulares.
    «I lí j;
    !9δ· - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado jpelo facto de se obter um oligonucleótido sintético em que o mencionado análogo de fosfodiéster é escolhido do grupo que consiste em fosforotisato, fosforoseleniato, metilfosfato, j 1 ífosforamida, fosfotrléster e o enantiómero alfa de fosfodiéster de ocorrência natural.
    ílO*. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético que inclui.
    ainda um grupo encadeador numa extremidade.
    íí i
    lis. _ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteriízado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético em ;que o citado grupo encadeador está inserido na extremidade jí 3 · θ é escolhido do grupo que consiste em uma base análoga !i com uma amina primária fixada ao plano da base por meio de uma ligação alquilo e uma base análoga com um reáíduo sulfidrilo fixado ao plano da base por intermédio de uma ligação alquilo.
    i !:123. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri- j í; zado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético em ' I que o referido grupo encadeador inserido na exti-emídade 5* e :é escolhido do grupo que consiste numa base análoga com uma amina primária fixada ao plano da base por meio de uma ligação alquilo, uma amina de cadela comprida acoplada directai mente ao grupo 5’ hidrcxilo do oligonucleótido e um grupo i tiol de cadeia comprida acoplado directamente ao grupo hidro[í xilo 5 ’ do oligonucleótido.
    ι ι
    133. - Frocesso de acordo com as reivindicações 10, 11 ou 12, caracterizado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético que compreende ainda un grupo de modificação ligado ao mencionado encadeador ligando-se o citado grupo de modificação a ADN duplex e sendo escolhido do grupo de moléculas que consistem num intercalador, numa molécula que se liga ao recesso, uma amina catiónica e um polipéptido catiónico.
    14*. - Processo de acordo con as reivindicações 10, 11 ou 12, l·caracterizado pelo facto de se obter um oligonucleótido sintético que inclui un grupo de modificação ligado ao referido grupo encadeador em que o mencionado grupo de modificação da[ nifica o ADN e é escolhido do grupo de moléculas que consisjtem num oxidante catalítico azoto-mostarda, agente alquilador, i agente reticulador fotoquímico, agente sensibilizador fotoquíii mico de oxigénio singlet e reagentes capazes de danificação Η fotoquímica directa.
    15a. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteri! zado pelo facto de o citado agente sensibilizador fotoquímico do oxigénio singlet ser eosina, azul de metileno, laranja de acridina ou 9-aminoacridina.
    ;í
    H
    16a. - Processo de acordo con a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o referido reagente ser etidio ou derivados do pireno.
    I
    17s. - Processo para inibir o desenvolvimento de células, caj racterizado pelo facto de se administrar o oligonucleótido i
    ί sintético de acordo com a reivindicação 3, numa quantidade í suficiente para a absorção celular e para se ligar à sequên-
    BAD ORIGINAL d** cia pretendida, de maneira preferível, de modo a obter-se uma concentração compreendida dentro do intervalo de 1 a 50 mi— cromolar, e se ligar à sequência pretendida, sendo a mencionada sequência pretendida posicionada dentro do domínio de ADN ajacente à origem da transcrição de ARN.
    18®. - Procçsso de acordo com a reivindicação 17, para inibição de células cancerosas, caracterizado pelo facto de o (oligonucleótido ser específico para o gene C-myc.
    I
    I (;1SS. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri,zado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em j
    ii 3 »-7GGTGTGTGGGTT?TGTGGGGGGTGGGGGGGTTTTTTTTGGGTGGG-5 * , i! 5 GTGG7GGGGTGGTTGGGGTGGGTGGGGTGGG7GGGGT-3 , it (! 3 *—TGTGGTGGGGTGGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG—5 *, j' 5 ’-TTTGGTGTGGGGGTGGGGGT7TTGTTTTTTGT-3 ’ , i 3 »-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGGGT-5',
    I 5 »-GGTTGGGGIGGGTGGGGTGGGTGGGGT-3 *, ; i i
    ;5 »-TI?GGTGTGGGGGTGGGGG2T??GTTTTT?GT-3’ ι ί e seus fragmentos e análogos.
    r i i ί ι
    20^. — Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o referido oligonucleótido incluir um gru' po de encadeamento e de codificação.
    i ·; 21s. - Processo para Inibir o desenvolvimento de agentes patogénjcos compreendendo a administração do oligonucleótido ísintético de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo ί
    facto de se empregar una quantidade suficiente para a absorI ção celular e a ligação à sequência pretendida, de preferência, de modo a obter-se una concentração compreendida entre cerca de 1 e 50 micronolar, ligando-se a mencionada sequência dentro do domínio de ácido nucleico ajacente à origem de trans crição do ARN.
    j: 223. - Processo para inibir o desenvolvimento de virus HIV-1, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético estar dentro da origem LTP virai.
    233. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri' zado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido ί do grupo que consiste em i:'
  4. 5 »-TTTTGTTTIGGGGGGTGTGGTTGGG-5 *,
    I ι 3 TTTTGTTTTGGGGGGTGTGGTTGGG-5’, i i
    5 '-TGTGTTGGTTGTTGTGGGGTTTGTTGGTGTGTT-3’,
    3 ’-IGTGTTGGTTGTTGTGGGGTTTGTTGGTC-TGTT-5f, ! 5»-GGGT?GGTGGTGGGGGTG7TTGTTG-3*,
    I
    3 ’-GGGTTGGTGGTGGGGG7G?TTG7?G-5 ', : i ' 3 »-TGGGTGGGGTGGGGTGGGGGGGIGTGCCCTCTGGGG-5’,
    5 »_GTTTTTGGG?GTTGTGGGTGTGTGTGGTTTG-3 ',
    3'-GTTTTTGGGTGTTGTGGGTGTGTGTGGTT-õ’,
    I 5 ·-TGGGTGGGGTGGGGIGGGGGGGTGTGGGGTGTGGGGTG—3 ·, e os seus fragmentos e análogos.
    i
    J
    24B. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o citado oligonucleótido incluir um grupo de encadeamento e de modificação
    25a. - Processo para a manipulação do teor de proteína estrutural do tecido da epiderme, caracterizado pelo facto de compreender a operação de se administrar os oligonucleótidos sintéticos de acordo com a reivindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida, de preferência de modo a obter-se uma concentração entre cerca de 1 e 50 micromolar.
    2o®. - Processo para inibir o gene do colagéneo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em
    3 ’—TGGGTTGGGTGGTGGTGGGGGTGTGGTTTGGTTG?GGGTTTT?-5',
    3 *—GGGTTGGGTGTGGTTTGGGGTGGGGTTTGG-5·,
    3 *—GTGGGTT3GGTGGTGG?GGGGGTGTGGTTTGG-5 ’ e os seus fragmentos e análogos.
    27 - Processo para inibir o gene do colagéneo, caracterizado pelo facto de se empregar um nucleótido sintético escolhido do grupo que consiste em
    5*GGTxGGGCTTGGTGTGTTTTTTTTGTGTGGGTG—3»,
    5'-fTGTGGTfGI?TTTfTGGTTG7GlGTGI-3’ !
    e os seus fragmentos e análogos.
    202. - Processo para inibir permanentemente a expressão de um gene, caracterizado pelo facto de se administrar um oligonucleótido sintético de acorde com a reivindicação 14 em quantiBAD ORIGINAL :dade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida, de preferência, de maneira que a concentração esteja de preferência compreendida entre cerca de 1 e 50 micromolar.
    29°. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido ,;i do grupo que consiste em isotiocianato de eosina, derivados de psoraiina quelatos metálicos, etidio e derivados do pireno«
    30a. - Processo para alterar as características das proteínas : dos músculos de animais para fins alimentares, caracterizado j pelo facto de compreender a administração de um oligonucleó' tido sintético em quantidade suficiente para a absorção celui| lar e a ligação à sequência pretendida, de preferência, de menelr» que a concentração esteja compreendida entre cerca de ' 1 e 50 micromolar.
    í l· <
    31â. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em , 5 *-GT7T?T7GGGTGGGGGGGGGGGGGGGG—3 ’ e os seus fragmentos e análogos.
    i
    32a. — Processo para inibir o receptor da cadeia de interleuceno 2 alfa, caracterizado pelo facto de se administrar o olli gonucleótido sintético de acordo com a reivindicação 3 em j quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida de maneira que, de preferência, a sua concentração esteja compreendida entre cerca de 1 e 50 micromolar.
    •β j33δ. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido ί do grupo que consiste em j5’—TTGGGGTGGGGTTTGTGGGTGTGGTTTT—3 *, i
    3 *TTGGGCTGGGCTTTGTGGGTGTGGTTTT—5 ♦ e os seus fragmentos e análogos.
    34a. - Processo para evitar a formação de placas na doença de Alzheiner, caracterizado pelo facto de se administrar o oligofnulcéotido de acordo com a reivindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida de maneira que se obtêm uma concentração, de preferência compreendida entre 1 e 50 micromolar.
    35a. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido ser escolhido do grupo que consiste em
    5*-TTTTTGTTTGTTTTTTTTTCTTTCTTTCTTTT—3’,
    3 »-TTTTTGTTTGTTTTTTTTTTCTTTCTTTCTTT-5 *,
    3 *—TGGTGGGGGTTGGTGGTTTGGTTGGTTGT—5 *,
    5»-TGGTGGGGGTTGGTGGTTTGGTTGGTTGT-3’,
    3 *—TTGTGTTTGTGTTGGTGTTTGGGGTGGGGGTGGTGTGG—5 *,
    5’—TTGTGTTTGTGTTGGTGTTTGGGGTGGGGGTGGTGTGG—31,
    5 ·—GTGTGTTTTTTGGTTTTGGGGTTTTTTT-3’,
    3 '-GTGTGTTTTTTGGTTTTGGGGTTTTTTT-5 *,
    3 «-GTGTGGTTTGGGTGTTGGTGGTGGGTGGGTGTGGT-5 *,
    5·—GTGTGGTTTGGGTGTTGGTGGTGGGTGGGTGTGGT—3 *,
    3*-GGGTGGGTGTGGTGGGGGGTGTGTGTGGGTGGG-5',
    5 *—GGGTGGGTGTGGTGGGGGGTGTGTGTGGGTGGG—31,
    5 *—GGGGTGGGGTGGGGGGGGGTGGGG—3’,
    3 »-GGGGTGGGGTGGGGGGGGGTGGGG-51 ,
    3 *—GTGGGGTGGGTGTGTGGGGGGGGGGGGGGGTG-5 *,
    5 *-GTGGGGTGGGTGTGTGGGGGGGGGGGGGGGTG—3 * e os seus fragmentos e análogos.
    36®. - Processo para suprimir a expressão do gene do factor de crescimento da epiderme, caracterizado pelo facto de se administrar um oligonucleótido sintético de acordo com a reivindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida, de maneira que de preferência se obtenha uma concentração compreendida entre cerca de 1 e 50 micromolar.
    37a. - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em
    3 »-TGGTGGGGGTTGGTGGTTTGGTTGGTTGT-5»,
    5‘-TGGTGGGGGTTGGTGGTTTGGTTGGTTGT-3 *,
    3'-TGGGTGGTGGTGGGGGGGTGGGTGGG-5’,
    5’-7GGGTGGTGGTGGGGGGGTGGGTGGG-3’,
    3 f-TTGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGGGTTGGGTGGTGG—5»,
    5 *-TTGTGGIGG?GGTG?GGTGGTGGGGTTGGGTGGTGG—3 *,
    3 *—TTGTGGTGGGTGGTGGTGGGTGGGTGGTGGTGGTGT-5 *,
    5 »-TTGTGGTGGGTGGTGGTGGGTGGGTGGTGGTGGTGT-3’ e os seus fragmentos e análogos.
    'í38a. - Processo para suprimir o gene GSTpi, caracterizado í
    pelo facto de se administrar um oligonucleótido sintético de • acordo com a reivindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida de forma a obter-se de preferência uma concentração compreendida entre cerca de 1 e 50 micromolar.
    39a. - Processo para suprimir o gene GSTpi, de acordo com a j reivindicação 38, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em } 5 ί
    Ί ; 5 ίί 3 ι;
    . ι ί' 5 [Í ί,'
    Η 3 •-GTGTGTGGTGTGGGGGGGTGGGGGGGGGGT-3’ »-GTGTGTGGTGTGGGGGGGTGGGGGGGGGGT-5* •-GGGGTGGTGGGTTTGTGGGTTTGG-3·, •-GGGGTGGTGGGT7TGTGGGTTTGG-5 *, i^TTTTTTTT^TTTT^TTTTT^TTTTTTTTTT—S* h e os seus fragmentos e análogos.
    40a. - Processo para intervir no programa de síntese do co! lesterol mediante a modulação de IIUGCoA, caracterizado pelo i| facto de se administrar um oligonucleótido sintético de acorj do coc a reivindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida, de forauL a obter—se uma concentração de preferência compreendida entre í cerca de 1 e 50 micromolar.
    | 41®. - Processo para a modulação da transcrição de HKGCoA, de acordo cõc a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em
    3’-GGTGTGTGTTGGTGGGGTGGGGGTSGTGGGGGG—5 *, ί
    5 *-GGTG7GTGTTGG7GGGGTGGGGGTTGTGGGGGG—31, ! 5 *-GGGTGGGTGGTGTGGGGGGTTGTTTTGGGGGT—3», | 3 *-GGGTGGGTGG7GTGGGGGGTTGTTTTGGGGGT-5» ΐ
    3'-TGGGGTIGGGTGGTTGGTTTGTTTTTGGGGGGGGT—5 *,
    5 *-TGGGGTTGGGTGGTTGGTTTGTTTT7GGGGGGGGT—3’ e os seus fragmentos e análogos.
    i!
    42a. - Processo para a supressão da expressão do receptor do factor de crescimento dos nervos, caracterizado pelo facto de se administrar um nucleótido sintético de acordo com a reiJ vindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção ce·’ lular e a ligação à sequência pretendida, de forma que se |; obtém uma concentração de preferência compreendida entre cerί ca de 1 e 50 micromolar.
    ί ί
    J 43à. - Processo para a supressão do gene que codifica o reí !| ceptor do factor de crescimento dos nervos, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em
    5 *-GGGTTGTGGGTTGGTGGGGGGGTTGGGTGTGTGG—3’, ii 3 *-GGGTTGTGGGTTGGTGGGGGGGTTGGGTGTGTGG-51, ι ί í 5 »-TGGGGGGGTTGGGTGTGTGGGTGTT7GGGTGT7GG-3 *, !
    3 »-TGGGGGGGTTGGGTGTGTGGGTGTTTGGGTGTTGG-51,
    5·-7TGGGTGTTGGGTGGGTGTTGGGGTGGGGTGGGGGTT—3 *, i 3 *—T7GGGTGTTGGGTGGGTGTTGGGGTGGGGTGGGGGGTT—5» ; 5 *—GGGTGGG2TTGGGTGTGGTTGGGTGGGG—3’, i
    3 «-GGGTGGGTTTGGG7GTGGTTGGGTGGGG-5 *»
    5·—GGGGGTGGGGGGGGTGGGGGGGGGGTGGGGGGGG-3·,
    3’—GGGGGTGGGGGGGGTGGGGGGGGGGTGGGGGGGG—5 *, e os seus fragmentos e análogos.
    443. - Processo para deter a replicação final do Virus 1 de Herpes Sinplex, caracterizado pelo facto de se administrar um oligonucleótido sintético de acordo com a reivindicação 3, numa quantidade suficiente para a absorção celular e a ligação à sequência pretendida, de forma a obter-se uma concentração de preferência compreendida entre cerca de 1 e 50 micromolar.
    453. - Processo para deter a replicação final de virus, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido ser escolhido do grupo que consiste em
    3 »-TTTTTGTGTTGGGGGGTGGGGTGTGGGGGGTGTTT-5’,
    5 »-TTTTTGTGTTGGGGGGGTGGGGTGTGGGGGGTGTTT-3 *, e os seus fragmentos e análogos.
    46». - Processo para suprimir a síntese de genes de beta-globina na anemia talassémica e falciforme, caracterizado pelo facto de compreender a administração dum oligonucleótido sintético de acordo com a reivindicação 3, numa qaantidade suficiente para a absorção celular e a combinação com a sequência pretendida de maneira a obter-se uma concentração compreendida entre cerca de 1 a 50 micromolar.
    473. - Processo para suprimir a síntese de genes de beta-globina de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fac to de o oligonucleótido sintético ser escolhido do grupo que consiste em
    3 *-GGTTTTGGGGTGGTTGGGGTTGTTTGT—5 *,
    5 »-GGT7TTGGGGTGGTTGGGGTTG?TTGT-3’,
    5 *—TGGTGGTGGGTGGGGTGGTGGGTGGGGIGGGGTTTTTTG—3’, 3·—TGGTGGTGGGTGGGGTGGTGGGTGGGGTGGGGTTTTT7G-5 * , 5·-TGGGGTGGGGTTTTTTGTGTGGGGTGTG-3·,
    3 *—TGGGGTGGGGTTTTTTGTGTGGGGTGTG—5 * *
    3 »-GGGTTGTTGTTTTGTITGGGGTTGTTTTGT-5’,
    5 ’—GGGTTGTTGTTTTGTTTGGGGTTGTTTTGT—3’,
    3*—TTGTTGGITTGTTTTTTTTTGTTGTGG—5 *,
    5·—TTGTTGGTTTGTTTTTTTTTGTTGTGG—3f »
    3'-GTGGGTTGTTTTTTTTGTTTTTTTTTT-5',
    5 '-GTGGGTTGITTTTTTTGTTTTTTTTTT-3 * e os seus fragmentos e análogos
PT92640A 1988-12-20 1989-12-20 Processo para a preparacao de oligonucleotidos sinteticos que se ligam especificamente em sitios pretendidos de moleculas de adn duplex formando uma estrutura triplex colinear PT92640B (pt)

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