PT729351E - Vesiculas com libertacao controlada de activos - Google Patents

Description

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DESCRICÃO

"Vesículas com libertação controlada de activos"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da invenção A presente invenção refere-se a vesículas de membrana sintéticas e a composições compreendendo as mesmas que são úteis como um sistema de entrega de drogas, a processos para o seu fabrico, bem como a sistemas de entrega a alvos compreendendo estas composições. 2. Antecedentes da invenção

Os lipossomas multivesiculares são um dos três principais tipos de lipossomas, preparados primeiro por Kim, et al. (Biochim, Biophys. Acta, 782:339-348, 1983), e são unicamente diferentes de outros sistemas à base de lípidos de entrega de drogas como os lipossomas unilamelares (Huang, Biochemistry, 8:334-352, 1969; Kim, et aí., Biochim. Biophys. Acta, 646:1-10. 1981) e multilamelares (Bangham, et al., J. Mol. Bio., 13:238-252, 1965). Em contraste com os lipossomas unilamelares, as partículas multivesiculares contêm múltiplas câmaras aquosas por partícula. Em contraste com os lipossomas multilamelares, as múltiplas câmaras aquosas nas partículas multivesiculares não são concêntricas. A arte anterior descreve várias técnicas para a produção de lipossomas unilamelares e multilamelares; por exemplo, as Patentes dos E.U.A. No. 4 522 803 de Lenk; 4 310 506 de Baldeschwieler; 4 235 871 de Papahadjopoulos; 4 224 179 de Schneider;·, 4 078 052 de Papahadjopoulos; 4 394 372 de Taylor; 4 308 166 de Marchetti; 4 485 054 de Mezei; e 4 508 703 de Redziniak. A arte anterior descreve também métodos para a produção de lipossomas multivesiculares que se provaram instáveis em fluidos biológicos (Kim, et a!., Biochim. Biophys. Acta, 728:339-348. 1983). Para uma revisão exaustiva dos vários métodos de preparação de lipossomas unilamelares e multilamelares, refira-se a Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:465-508, 1980.

No método de Kim, et al., {Biochim^Biophys. Acta, 728:339-348. 1983), a eficiência de encapsulação de moléculas pequenas, tais como 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 2

citosina-arabinósido, foi baixa, e houve uma rápida taxa de libertação em fluidos biológicos. Estudos subsequentes (Kim, et a!., Câncer Treat. Rep., 71:705-711 . 1987) mostraram que a rápida taxa de libertação das moléculas encapsuladas em fluidos biológicos pode ser melhorada por encapsulação na presença de um cloridrato. O tratamento óptimo com muitas drogas requer a manutenção de um nível da droga durante um período de tempo prolongado. Por exemplo, o tratamento óptimo anti-cancro com anti-metabolitos específicos do ciclo celular requer a manutenção de um nível citotóxíco de droga durante um período de tempo prolongado. A citarabina é uma droga anti-cancro altamente dependente de um calendário. Como esta droga mata células apenas quando estas estão a replicar ADN, é necessária uma exposição prolongada à concentração terapêutica da droga para uma morte celular óptima. Infelizmente, a sémivida da citarabina após uma dose intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) é muito curta, sendo a sémivida da ordem de algumas horas. Para se conseguir uma morte de células de cancro óptima com uma droga específica para uma fase do ciclo celular como a citarabina, é necessário ter em conta dois requisitos principais: primeiro, o cancro tem que ser exposto a uma concentração elevada da droga sem prejudicar irreversivelmente o hospedeiro; e em segundo lugar, o tumor tem que ser exposto durante um período de tempo prolongado para que todas ou quase todas as células de cancro tenham tentado de sintetizar ADN na presença da citarabina.

Até ao momento, o controlo da taxa de libertação foi inflexível, e a escolha de agentes modificadores da taxa de libertação foi limitada principaimente a hidro-halogenetos. Para um sistema de entrega de drogas é altamente vantajoso ser flexível no controlo da taxa de libertação das substâncias encapsuladas e ter uma ampla escolha de agentes modificadores da taxa de libertação.

Assim, é um objectivo da presente invenção proporcionar uma preparação de depósito de libertação lenta que proporcione uma exposição prolongada e sustentada de uma substância biologicamente activa a uma concentração terapêutica, com uma taxa de libertação controlada. \

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ΕΡ Ο 729 351/PT 3 É um objectivo adicional da presente invenção proporcionar um método de preparação de tais preparações de depósito.

Outros e adicionais objectivos, características e vantagens da invenção estão a ela inerentes e surgem da descrição e reivindicações. É conhecida de EP-A-0280503 a diminuição da taxa de libertação dè substâncias farmacêuticas a partir de lipossomas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As composições de acordo com a presente invenção compreendem vesículas de membrana sintéticas, i.e. vesículas lipídicas com múltiplas câmaras aquosas internas formadas por camadas não concêntricas e em que as câmaras contêm um ou mais agentes modificadores da taxa de libertação que não hidro-halogenetos, eficazes para diminuir a taxa de libertação das substâncias biologicamente activas encapsuladas. A presente invenção proporciona também métodos de preparação de tais composições. A invenção refere-se também à utilização de um composto biologicamente activo encapsulado nas vesículas anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica.

As presentes composições de vesículas de membranas sintéticas têm elevada eficiência de encapsulação, taxa de libertação controlada da substância encapsulada, distribuição de tamanhos reprodutível, bem definida, formato esférico, tamanho médio ajustável que pode ser facilmente aumentado ou diminuído, e número e dimensão das câmaras internas ajustáveis. O processo para a produção destas composições compreende (1) a mistura de um ou mais solventes orgânicos voláteis e um componente lipídico contendo pelo menos um lípido neutro e pelo menos um lípido anfipático possuindo uma ou mais cargas negativas totais; (2) a adição ao. solvente orgânico de um primeiro componente aquoso imiscível contendo uma ou mais substâncias biologicamente activas a encapsular; (3) a adição, a cada um ou a ambos, do solvente orgânico e do primeiro componente aquoso, de um agerrte modificador da taxa de libertação eficaz para retardar a taxa de libertação das substâncias biologicamente activas encapsuladas; (4) a formação de uma emulsão de água em óleo a partir dos dois componentes imiscíveis; (5) a imersão da emulsão de água em óleo num segundo componente aquoso 4 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ imiscível; (6) a dispersão da emulsão de água em óleo para formar esférulas de solvente contendo múltiplas gotículas do primeiro componente aquoso; e (7) a remoção dos solventes orgânicos, por exemplo por evaporação, das esférulas de solvente para formar as vesículas de membrana sintéticas. A adição de um ou mais agentes modificadores da taxa de libertação eficazes para diminuir a taxa de libertação das substâncias biologicamente activas encapsuladas para fluidos biológicos e in vivo é essencial. A invenção refere-se também a um processo de produção de vesículas de membrana sintéticas compreendendo os passos de: (a) formação de uma emulsão de água em óleo a partir de dois componentes imiscíveis contendo pelo menos um solvente orgânico, água, pelo menos uma substância biologicamente activa, e pelo menos um agente modificador da taxa de libertação que não hidro-halogènetó; (b) dispersão da emulsão de água em óleo num componente aquoso para formar,esférulas de solvente; e (c) remoção do solvente orgânico das esférulas de solvente para formar as vesículas de membrana sintéticas contendo gotículas aquosas corri a substância biologicamente activa e o agente modificador da taxa de libertação nele dissolvidos.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO A Figura 1 é um gráfico que apresenta a taxa de libertação de uma droga a partir de vesículas de membrana sintéticas suspensas em plasma humano a 37°C. Os símbolos utilizados indicam o agente modificador da taxa de libertação empregue e estão identificados na Tabela 2.

DESCRIÇÃO DA CONCRETIZAÇÃO PREFERIDA A expressão "vesículas de membrana sintéticas" utilizada na descrição e nas reivindicações significa vesículas lipídicas microscópicas feitas pelo homem que consistem em membranas lipídicas em bicamadas, encerrando múltiplas câmaras aquosas não concêntricas. Em contraste, os lipossomas unilamelares possuem uma única câmara aquosa; e os lipossomas multiíamelares possuem 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 5

múltiplas membranas concêntricas do tipo "casca de cebola", entre as quais se dispõem compartimentos aquosos concêntricos do tipo concha. A expressão "esférula de solvente" aqui utilizada na descrição e nas reivindicações significa uma gotícula esferóide microscópica de solvente orgânico, no interior da qual estão múltiplas gotículas mais pequenas de solução aquosa. As esférulas de solvente estão suspensas e totalmente imersas numa segunda solução aquosa. A expressão "lípido neutro" significa óleo ou gorduras que não têm capacidade para formar membranas por si mesmas e não têm um grupo de "cabeça" hidrófilo. A expressão "lípidos anfipáticos" significa as moléculas que têm um grupo de "cabeça" hidrófilo e um grupo de "cauda" hidrófobo e têm capacidade para formar membranas. A expressão "agente modificador da taxa de libertação" significa moléculas que não hidro-halogenetos adicionadas durante o processo de preparação ou fabrico das vesículas de membrana sintéticas que são eficazes para retardar ou acelerar a taxa de libertação das substâncias biologicamente activas encapsuladas, a partir das vesículas de membrana sintéticas.

Em resumo, o método de acordo com a invenção compreende a preparação de uma emulsão de "água em óleo" por (1) dissolução de lípidos anfipáticos em um ou mais solventes orgânicos voláteis para o componente lipídico, (2) adição ao componente lipídico de um primeiro componente aquoso imiscível e uma substância biologicamente activa a encapsular, e (3) adição a cada um ou a ambos, do solvente orgânico e do primeiro componente aquoso, de um agente modificador da taxa de libertação eficaz para retardar a taxa de libertação das substâncias biologicamente activas encapsuladas a partir das vesículas de membrana sintéticas, e depois a emulsão mecânica da mistura.

Na emulsão, as gotículas de água suspensas no solvente orgânico formarão as câmaras aquosas internas, e a monocamada de lípidos anfipáticos que envolve as câmaras aquosas tornar-se-á uma folha da membrana em bicamada no produto final. A emulsão é então imersa num segundo componente

85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 6 aquoso contendo um ou mais agentes osmóticos não iónicos e um agente neutralizante de ácido de baixa força iónica, tal como um aceitador de protões, preferivelmente seleccionado de entre a base livre lisina, a base livre histidina ou uma sua combinação. Depois a emulsão é agitada mecanicamente, por energia ultra-sónica, atomizações por estreitamentos, e semelhantes, ou por suas combinações, para formar esférulas de solvente suspensas no segundo componente aquoso.

As esférulas de solvente contêm múltiplas gotículas aquosas com a substância a encapsular nelas dissolvida. O solvente orgânico é removido das esférulas, preferivelmente por evaporação de um solvente volátil, por exemplo por passagem de uma corrente de gás sobre a suspensão. Quando o solvente é completamente removido, as esférulas convertem-se em vesículas de membrana sintéticas. Os gases representativos satisfatórios para utilização na evaporação do solvente incluem azoto, hélio, árgon, oxigénio, hidrogénio e dióxido de carbono. O agente modificador da taxa de libertação é qualquer molécula que seja eficaz para retardar a taxa de libertação das substâncias biologicamente activas encapsuladas a partir das vesículas de membrana sintéticas para fluidos biológicos e in vivo, com o resultado de que a taxa de libertação das substâncias seja menor do que a das vesículas de membrana sintéticas na ausência de um tal agente modificador da taxa de libertação. Os agentes modificadores da taxa de libertação incluem, mas não se lhes limitam, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e suas combinações. As quantidades dos agentes modificadores da taxa de libertação utilizadas são eficazes para proporcionar uma taxa de libertação prolongada, sustentada e controlada em níveis terapêuticos das substâncias biologicamente activas encapsuladas. Por exemplo, a concentração do agente modificador da taxa de libertação no solvente orgânico ou no primeiro componente aquoso ao qual é adicionado está na gama de cerca de 0,1 mM a cerca de 0,5 M e preferivelmente de cerca de 10 mM a cerca de 200 mM.

Podem-se utilizar muitos diferentes tipos de solventes hidrófobos voláteis tais como éteres, hidrocarbonetos, hidrocarbonetos halogenados ou Freons como solvente da fase lipídica. Por exemplo, são satisfatórios éter dietílico, éter

85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 7 isopropílico e outros éteres, clorofórmio, tetra-hidrofurano, éteres halogenados, ésteres e suas combinações.

De modo a evitar que as esférulas de solvente colem umas às outras e às paredes do vaso, prefere-se que pelo menos uma razão de 1 porcento molar de um lípido anfipático com uma carga total negativa seja incluído nas esférulas, que a segunda solução aquosa de suspensão tenha uma força iónica muito baixa e, quando se utiliza um ácido, que seja adicionado um agente para a neutralização do ácido à segunda solução aquosa para formar uma concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 0,5 M para evitar a coalescência das esférulas de solvente para formar uma espuma desordenada. Em adição, podem-se utilizar opcionalmente um ou mais agentes osmóticos não iónicos, tais como tre-halose, glucose ou sacarose, na solução aquosa de suspensão para manter equilibrada a pressão osmótica no interior e no exterior das vesículas de membrana.

Podem-se utilizar vários tipos de lípidos para preparar as vesículas de membrana sintéticas, e os únicos dois requisitos são de que sejam incluídos um lípido anfipático com uma carga total negativa e um lípido neutro. São exemplos de lípidos neutros trioleína, trioctanoína, óleo vegetal tal como óleo de soja, banha, gordura de carne de vaca, tocoferol e suas combinações. São exemplos de lípidos anfipáticos com carga total negativa cardiolipina, as fosfatidilserinas, os fosfatidilgliceróis e os ácidos fosfatídicos. O segundo componente aquoso é uma solução aquosa contendo solutos de baixa força iónica tais como hidratos de carbono incluindo glucose, sacarose, lactose e aminoácidos tais como lisina, a base livre histidina e suas combinações.

Podem ser incorporados muitas e variadas substâncias biológicas e agentes terapêuticos por encapsulação nas vesículas de membrana sintéticas. A expressão "agente terapêutico" aqui utilizada para as composições da invenção inclui, sem limitação, drogas, radioisótopos e imunomoduladores. São conhecidas substâncias semelhantes ou podem ser prontamente determinadas por um perito na arte. Pode haver certas combinações de agente terapêutico com um dado tipo de vesículas de membrana sintéticas que sejam mais compatíveis do que outras. Por exemplo, o método de produção das vesículas

85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ de membrana sintéticas pode não ser compatível com a actividade biológica continuada de um agente terapêutico proteínico. Contudo, como as condições que poderão produzir um emparelhamento incompatível de um determinado agente terapêutico com um determinado sistema de dispersão são bem conhecidas, ou são facilmente determinadas, é matéria de rotina evitar estes potenciais problemas.

As drogas que podem ser incorporadas no sistema de dispersão como agentes terapêuticos incluem drogas proteínicas e não proteínicas. A expressão "drogas não proteínicas" abrange compostos que são classicamente referidos como drogas, tais como mitomicina C, daunorubicina, vinblastina, AZT e hormonas. Têm particular interesse as drogas antitumorais específicas do ciclo celular tais como citarabina, metotrexato, 5-fluoro-uracilo (5-FU), floxuridina (FUDR), bleomicina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, vincristina e vinblastina. São exemplos de materiais proteínicos que podem ser incorporados nas vesículas de membrana sintéticas ADN, ARN, proteínas de vários tipos, hormonas proteicas produzidas por tecnologia de ADN recombinante eficazes em humanos, factores de crescimento hematopoiéticos, monóquinas, linfóquinas, factor de necrose tumorai, inibina, factor de crescimento tumoral alfa e beta, substância inibitória de Mullerian, factor de crescimento de nervos, factor de crescimento de fibroblastos, factor de crescimento derivado de plaquetas, hormonas pituitária e da hipófise incluindo LH e outras hormonas de libertação, calcitonina, proteínas que servem como imunogénios para vacinação, e sequências de ADN e ARN. A Tabela 1 seguinte inclui uma listagem de substâncias biologicamente activas representativas, eficazes em humanos, que podem ser encapsuladas em vesículas de membrana sintéticas na presença de um agente modificador da taxa de libertação, e inclui também substâncias biologicamente activas eficazes para usos agrícolas. (Segue Tabela 1) 85 118 EP 0 729 351/PT 9 TABELA 1 Antiasmáticos Antiarrítmicos metaproterenol propanolol aminofilina atenolol teofilina verapamilo terbutaiina norepinefrina Antianqinas efedrina isoproterenol adrenalina dinitrato de iso-sorbido Glicósidos cardíacos Hormonas digitalina tiroxina digitoxina corticosteróides lanatósido c testosterona digoxina estrogénio progesterona mineralocorticóide Anti-hioertensores Antidiabéticos apresolina diabenese atenolol insulina clorfeniramina captoprilo reserpina Antiparasíticos antineoolásicos praziquantel azatioprina metronidazolo bleomicina pentamidina ciclofosfamida ivermectina vincristina metotrexato Ácidos nucleicos e análoaos 6-TG ADN 6-MP ARN vinblastina metilfosfonatos e análogos VP-16 ácidos nucleicos anti-sentido VM-26

Tranquilizantes clorpromazina benzodiazepina butirofenonas hidroxizinas meprobamato fenotiazinas tioxantenos

Esteróides prednisona triamcinolona hidrocortisona dexametasona betametasona prednisolona

Anti-histaminas piribenzamina difen-hidramina

Sedativos e analgésicos morfina dilaudido codeína

Sintéticos tipo codeína demerol oximorfina fenobarbital barbituratos fentanilo cetorolac

cisplatina 5-FU FUDR 10 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ fosfato de fludarabina

Antibióticos penicilina tetraciclina amicacina eritromicina cefalotina imunomoduladores interferão interleucina-2 gamaglobina anticorpos monoclonais

Vasopressores dopamina dextroanfetamina imipenem cefotaxima carbenicilina ceftazidima antifúnqicos anfotericina b miconazolo dipéptido de muramilo canamicina tobramicina ampiciiina gentamicina cefoxitina cefadroxilo clotrimazolo cetoconozolo fluconazolo itraconazolo

Antivirais aciclovir e derivados ganciclovir e fosfatos Winthrop-51711 ribavirina rimantadina/amantadina azidotimidina & derivados arabinósido de adenina inibidores de protease do tipo amidina cefazolina outros aminoglicósidos amoxicilina moxalactama piperacilina vancomicina ciprofloxacina outras quinolonas

Vacinas outras vacinas recombinantes, mortes e vivas e material antigénico para utilização como vacinas material antigénico para o tratamento de alergias influenza

vírus de sincícios respiratórios vacina de HIV vacinas de influenza hemófilo

vacinas de hepatite A, B e C papeira rubéola sarampo tétano

85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 11 vacinas de malária herpes vacinas de cancro vacina anti-leu-3a

Anticorpos monoclonais (humanos, de ratinho e outros derivados de espécies e/ou recombinantes e/ou fusões e/ou seus fragmentos OKT3 0KT4

HA-1A

Anticorpos anti-antigénios carcinoembrionários

Anticorpos anti-gangliósidos: anti GD2, anti GM2, anti GD3, anti GM3 Anticorpos relacionados com antigénios associados ao tracto urinário Anti-Receptor de IL-2 Anti-Leu-2 quimérico Anti-Leu-2

Anti-l_eu-3a quimérico L6 quimérico Mab-L6 L6 marcado radioactivamente

Centorex

Centoxina

Panorex®

Anti-LPS

Imunotoxina

Anti-Factor de necrose tumoral Anti-pseudomonas Anti-factor de necrose tumoral OncoRad 103®

OncoScint CR103®

OncoScint OV103®

OncoScint PR356®

OncoTher 130®

KS 1/4-DAVLB Agente ADCC

Anticorpos monoclonais de murino para linfomas humanos de células B (anti-idiotipos) Anticorpo monoclonal de murino (1Melpg1) (anti-idiotipo) contra o anticorpo monoclonal de murino para antigénio associado a melanoma Anti-ricina bloqueada com B4 Anti-ricina bloqueada com My9

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ImmuRaid-CEA MAb contra cancros colorrectal, do ovário e do pulmão MAb de rénio-186 Orthoclone OKT® E5™

LYM-1 TNT

XomaZyme®-791 XomaZyme®-CD5 Plus XomaZyme®-CD7 Plus XomaZyme®-Mel

Herbicidas Triazina Cloroacetamida Cianazina Bentazona Roundup®

Rodeo®

Butaclor CNP

Clometoxinilo Simetrina Atrazina Alaclor Cianazina Metolaclor Metribuzina

Herbicidas fenoxi: 2,4-D [ácido (2,4-diclorofenoxi)acético], 2,4-D amina (dimetilamina do ácido 2,4-diclorofenoxiacético), 2,4-D isooctil (éster isooctílico do ácido 2,4-diclorofenoxiacético), 2,4,5-T amina (trimetilamina do ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético) Outros herbicidas de triazina Outros herbicidas de cloroacetamida Outros herbicidas de fenoxiácido

Pesticidas Abamectina Outras avermectinas Atrazina Lindano

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Diclorvos

Dimetoato

Warfarina

ρ,ρ'-DDD

ρ,ρ'-DDE

HCH

DMDT

Aldrina

Dieldrina

Aldicarb

EDB

DCP

DBCP

Simazina

Cianazina

Toxina do BaciHus thuringiensis Bacillus thuringiensis var. kurstaki Bis(tri-n-butilestanho)óxido (TBTO)

Outros pesticidas de organocloro

Proteínas e glicoproteínas Linfóquinas

Interleucinas - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Citóquinas

GM-CSF

M-CSF

G-CSF factor de necrose tumoral inibina factor de crescimento tumoral substância inibidora de mullerian factor de crescimento dos nervos factor de crescimento de fibroblastos factor de crescimento derivado de plaquetas factores de coagulação (e.g., VIII, IX, VII) insulina activador de plasminogénio tissular antigénio de histocompatibilidade produtos oncogénicos proteína básica de mielina

85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 14 colagénio fibronectina laminina outras proteínas preparadas por tecnologia de ADN recombinante eritropoietina proteínas de fusão de IL-3/GM-CSF anticorpos monoclonais anticorpos policlonais proteínas de fusão anticorpo-toxina conjugado anticorpo-radionuclido interferões fragmentos e análogos peptídicos, e análogos de fragmentos de proteínas, péptidos e glicoproteínas factor de crescimento epidérmico receptor CD4 e outros receptores recombinantes outras proteínas isoladas da natureza hormona antidíurética oxitocina hormona adrenocorticotropina calcitonina hormona estimulante de folículos hormona de libertação da hormona luteinizante hormona luteinizante gonadotropina factores de crescimento de transformação estreptoquinase hormona de crescimento humana, somatotropinas para outras espécies, incluindo, mas não se lhes limitando: 1. porcina, 2. bovina, 3. galinha, 4. ovelha, 5. peixe, hormonas de libertação da hormona de crescimento para humanos e várias espécies animais, glucagon, desmopressina, hormona de libertação da tiróide, hormona tiróide, secretina.

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ΕΡ Ο 729 351/PT 15 magaininas, integrinas, péptidos de adesão, incluindo, mas se lhes limitando, os que possuem a sequência Arginina-Glutamina-Ácido Aspártico,

Superóxido-dismutase,

Defensinas,

Receptores de células T,

Antagonistas de bradiquinina,

Pentigetido, Péptido T,

Anti-inflaminas,

Componentes do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e péptidos direccionados para o MHC,

Inibidores de protease,

Lipressina,

Buserelina,

Leuprolido,

Nafarelina,

Deslorelina,

Goserelina,

Historelina,

Triptorelina,

Antagonistas de LHRH, HOE-2013,

Detirelix,

Org-30850, ORF-21243, Péptido inibidor da enzima de conversão de angiotensina, Péptidos inibidores de renina,

Ebiratido (HOE-427), DGAVP,

Agonistas e antagonistas do receptor de opiados, incluindo, mas não se lhes limitando: 1. Encefalinas, 2. Endorfinas, E-2078, DPDPE, Péptido intestinal vasoactivo, Péptido natriurético auricular, Péptido natriurético cerebral,

Inibidores da depuração de péptido auricular,

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Radiocontrastes Quelatos de gadolínio lo-hexol Etiodol lodexinol 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ

Hirudina,

Inibidores de oncogenes.

Outros factores estimulantes de colónias,

Radionuclidos Tecnécio índio ítrio Gálio

Neurotransmissores

Dopamina

Epinefrina

Norepinefrina

Acetilcolina Ácido gama-aminobutírico

Outros bloqueadores de receptores da superfície celular O termo "terapeuticamente eficaz", enquanto ligado às composições da invenção, significa que está presente um agente terapêutico na fase aquosa no interior das vesículas numa concentração suficiente para atingir um efeito médico particular para o qual se destina o agente terapêutico. Exemplos, sem limitação, de efeitos médicos desejáveis que se podem atingir são a quimioterapia, a terapia antibiótica e regulação de metabolismo. As dosagens exactas variarão dependendo de factores tais como o agente terapêutico particular e o efeito médico desejável, bem como de factores ligados ao paciente tais como a idade, o sexo, a condição geral, e similares. Os peritos na arte tomarão em conta prontamente estes factores e utilizá-los-ão para estabelecer as concentrações terapêuticas eficazes sem recurso a experimentação indevida.

De um modo geral, contudo, a gama de dosagens apropriada para utilização humana inclui a gama de 0,1 -6000 mg/m2 de área da superfície corporal. Para algumas aplicações, tais como administração subcutânea, a dose necessária pode ser bastante pequena, mas para outras aplicações, tais como administração intraperitoneal, a dose desejada a utilizar pode ser muito grande. Embora possam ser dadas doses fora da gama de doses anterior, esta gama abrange a amplitude de utilização para praticamente todas as substâncias biologicamente activas.

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As vesículas de membrana sintéticas podem ser administradas para aplicações terapêuticas por qualquer via desejada; por exemplo, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, subcutânea, intravenosa, intralinfática, oral e submucosa, sob muitos diferentes tipos de epitélios incluindo os epitélios bronquiais, os epitélios grastrintestinais, os epitélios urogenitais e várias membranas mucosas do corpo.

Em adição, as vesículas de membrana sintéticas da invenção podem ser utilizadas para encapsular compostos úteis em aplicações agrícolas, tais como fertilizantes, pesticidas e semelhantes. Para utilização na agricultura, as vesículas de membrana sintéticas podem ser vaporizadas ou dispersas sobre uma área de solo onde irão crescer plantas e o composto eficaz para o fim agrícola contido nas vesículas será libertado por contacto com chuva e águas de irrigação. Alternativamente, as vesículas de libertação lenta podem ser misturadas em águas de irrigação para serem aplicadas a plantas e colheitas. Um perito na arte será capaz de seleccionar uma quantidade eficaz do composto útil nas aplicações agrícolas para realizar o objectivo particular desejado, tal como a morte de pestes, a nutrição de plantas, etc.

As vesículas de membrana sintéticas podem ser modificadas de modo a conferir especificidade para órgãos ou células alvo, por exemplo através da sua incorporação num sistema de entrega direccionado. Estas modificações podem ser particularmente relevantes para utilização das vesículas de membrana sintéticas da invenção para administrar drogas que sejam altamente tóxicas ou capazes de induzir graves efeitos laterais, tais como o taxol. O direccionamento das vesículas de membrana sintéticas é classificado com base em factores anatómicos e mecanísticos. No direccionamento anatómico, a vesícula de membrana sintética é direccionada para uma localização corporal específica, por exemplo, direccionamento específico para um órgão, especialmente para células e específico para organelos. O direccionamento mecanístico pode ser distinguido com base no facto de ser passivo ou activo. O direccionamento passivo utiliza a tendência natural das vesículas de membrana sintéticas da invenção para se distribuírem em células do sistema reticulo-endotelial (RES) em órgãos que contêm capilares sinusoidais. No direccionamento activo, por outro lado, a vesícula de membrana sintética é incorporada num sistema de entrega direccionado através do seu acoplamento a

um ligando específico, tal como um anticorpo monoclonal, açúcar, glicolípido ou proteína, ou variando a composição ou a dimensão das vesículas de membrana sintéticas de modo a conseguir o direccionamento para órgãos e tipos de células que não os locais de ocorrência natural de localização (veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gannaro, A.R., ed., Mack Publishing, 18a Edição, p. 1691-1693, 1990).

Em geral, os compostos a ligar à superfície das vesículas de membrana sintéticas serão ligandos e receptores que permitem que o sistema de dispersão se "aloje" de forma activa no tecido desejado. Um ligando pode ser qualquer composto de interesse que se ligará especificamente a outro composto, referido como receptor, tal que o ligando e o receptor formem um par homólogo. A superfície do sistema de entrega direccionado pode ser modificada de várias maneiras. Por exemplo, podem-se incorporar grupos lipídicos na bicamada lipídica das vesículas de membrana sintéticas de modo a manter o ligando direccionante em associação estável com a bicamada lipídica. Podem-se utilizar vários grupos de ligação para juntar as cadeias lipídicas ao ligando direccionante (Mannino, et a!., Bio Techniques, 6(7):682, 1988). Os compostos ligados à superfície das vesículas de membrana sintéticas podem variar de pequenos haptenos de p.m. de cerca de 125-200 Dalton até antigéhios muito maiores com pesos moleculares de pelo menos cerca de 6000 Dalton, mas geralmente inferior a 1 milhão de Dalton. Os ligandos e receptores proteínicos têm particular interesse.

Em geral, as proteínas de membrana de superfície que se ligam a moléculas efectoras específicas são referidas como receptores. Na presente invenção, os receptores preferidos são anticorpos. Estes anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser seus fragmentos tais como Fab, F(ab')2, e Fv, que são capazes de ligação a um determinante epitópico. As técnicas para ligação de proteínas, tais como anticorpos, a vesículas de membrana sintéticas são bem conhecidas (veja-se, por exemplo, U.S. 4 806 466 e U.S. 4 857 735.

Os anticorpos podem ser utilizados para direccionar as vesículas de membrana sintéticas a ligandos específicos na superfície de células. Por exemplo, certos antigénios expressos especificamente sobre células tumorais, referidos como antigénios associados a tumores (TAA) podem ser explorados 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 19

com ο fim de direccionar vesículas de membrana sintéticas contendo anticorpos, directamente para tumores malignos. Uma vez que a composição incorporada nas vesículas de membrana sintéticas pode ser indiscriminada na sua acção no que diz respeito ao tipo de células, as vesículas de membrana sintéticas direccionadas oferecem uma melhoria significativa sobre a injecção aleatória de vesículas de membrana sintéticas não específicas. Podem ser empregues vários procedimentos para ligar de modo covalente os anticorpos monoclonais ou policlonais a uma bicamada das vesículas de membrana sintéticas. As vesículas de membrana sintéticas direccionadas com anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais ou policlonais ou seus fragmentos tais como Fab ou F(ab')2, desde que se liguem eficientemente ao epítopo antigénico nas células alvo. As vesículas de membrana sintéticas podem também ser direccionadas para células que expressam receptores para hormonas ou outros factores séricos (Malone, et a!., Proc. Nat'f. Acad. Sei. USA, 86:6077, 1989; Gregoriadis, Immunology Today, J_1_(3):89, 1990). EXEMPLO 1

Passo 1) Num cilindro de vidro limpo (2,5 cm de diâmetro interno X 10,0 cm de altura) colocam-se 5 ml de uma solução contendo 46,5 pmole de dioleoilfosfatidileolina, 10,5 pmole de dipalmitoilfosfatidilglicerol, 75 pmole de colesterol, 9,0 pmole de trioleína em colofórmio (a fase lipídica).

Passo 2) Adicionam-se ao cilindro de vidro anterior contendo a fase lipídica, 5 ml de fase aquosa, citarabina (20 mg/ml) dissolvida em ácido perclórico 0,136 N, um agente modificador da taxa de libertação. A osmolaridade da solução aquosa é de cerca de 274 ± 20 mOs/kg. Para outros agentes modificadores da taxa de libertação, nomeadamente ácido nítrico, ácido fórmico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido tricloroacético e ácido trifluoroacético, prepararam-se soluções a 20 mg/ml de citarabina com estes agentes para obter soluções aquosas que são praticamente isotónicas em relação ao meio de armazenagem final, nomeadamente solução salina normal (cloreto de sódio a 0,9%).

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Passo 3) Para preparar a emulsão de água em óleo, utilizou-se um homogeneizador (AutoHomoMixer, Modelo M, Tokushu Kika, Osaka, Japão) misturando durante 8 minutos a uma velocidade de 9000 rpm.

Passo 4) Para preparar as esférulas de clorofórmio suspensas em água, depositou-se uma camada de 20 ml de uma solução contendo 4 porcento de dextrose e lisina 40 mM no topo da emulsão de água em óleo, e depois misturou-se durante 60 segundos a uma velocidade de 4000 rpm para formar as esférulas de clorofórmio.

Passo 5) Verteu-se a suspensão de esférulas de clorofórmio do cilindro de vidro no fundo de um balão de Erlenmeyer de 1000 ml contendo 30 ml de água, glucose (3,5 g/100 ml) e base livre lisina (40 mM). Fez-se passar uma corrente de azoto gasoso a 7 l/minuto através do frasco para evaporar lentamente o clorofórmio ao longo de 20 minutos a 37°C. Adicionaram-se ao frasco 60 ml de solução salina normal (cloreto de sódio a 0,9%). Isolaram-se então as vesículas de membrana sintéticas por centrifugação a 600 x g durante 10 minutos. Decantou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se a pelete em 50 ml de solução salina normal. Ressuspendeu-se a pelete em solução salina para obter uma concentração final de 10 mg de citarabina por ml de suspensão. O diâmetro médio ponderado para o comprimento médio das vesículas de membrana sintéticas resultantes estava na gama de 12-16 μιτι. A percentagem de captura de citarabina é dada na TABELA 2. A utilização de diferentes agentes modificadores da libertação teve uma influência marcada na taxa de libertação de citarabina a partir das vesículas de membrana sintéticas incubadas em plasma humano. A percentagem de citarabina retida nas vesículas de membrana sintéticas após incubação a 37°C em plasma humano para os diferentes ácidos está representada em função do tempo de incubação na Figura 1. A semivida de libertação de droga, calculada assumindo um modelo exponencial simples para os dados mostrados na Figura 1, é dada na TABELA 2. Os dados na TABELA 2 são a média e o desvio padrão de três experiências. (Segue Tabela 2) 21 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ TABELA 2

Percentagem de Semivida em dias Símbolo na Ácido captura de citarabina para libertação de citarabina Fiaura 1 Ácido clorídrico 49 + 5 65,7 ± 4,4 ♦ Ácido perclórico 45 + 5 37,2 ± 8,0 ▼ Ácido nítrico 44 ±3 54,5 ± 5,7 Ácido fosfórico 72 ± 1 6,5 ± 0,2 ▲ Ácido fórmico 37 ±2 5,6 ±0,2 0 Ácido tricloroacético 29 ± 1 5,5 ±0,6 V Ácido acético 30 ±2 4,8 ±0,5 □ Ácido trifluoroacético 35 ± 1 3,4 ± 0,4 Δ Ácido sulfúrico 57 ±4 1,6 ±0,5 O

Foi surpreendente e inesperado que a natureza do ácido tivesse um efeito profundo sobre as taxas de libertação de citarabina em plasma humano. A utilização de ácidos inorgânicos monopróticos, nomeadamente, ácido clorídrico, ácido nítrico e ácido perclórico, resultou na taxa de libertação mais lenta para a citarabina. Os ácidos dipróticos e tripróticos, i.e., ácido sulfúrico e ácido fosfórico, resultaram em taxas de libertação mais rápidas. Os ácidos orgânicos, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético e ácido tricloroacético, resultaram também em taxas de libertação rápidas.

Assim, a presente descrição proporciona preparações de "depósito" de amplas aplicação e utilização, em que substâncias biologicamente activas são encapsuladas em quantidades relativamente grandes, proporciona exposição ou entrega prolongadas a concentrações terapêuticas destas substâncias para resultados óptimos, e a taxa de libertação da substância é controlada variando a natureza do ácido utilizado na formulação. A presente invenção é portanto bem adequada e adaptada para atingir as finalidades e objectos e tem as vantagens e características mencionadas bem como outras aqui inerentes.

Lisboa, 13. SEI 2000

Por SkyePharma Inc. - O AGENTE OFICIAL -

ANTÓNIO tÕWffir FERRESRA:

Of. Pr. Ind.

Rua das Flores, 74 = 4/ 1600 LISBOA

Claims (43)

1. 85 118 ΕΡ Ο 729 351 /ΡΤ 1. Composição compreendendo uma vesícula de membrana sintética compreendendo membranas em bicamadas lipídicas que encerram múltiplas câmaras aquosas não concêntricas contendo uma ou mais substâncias biologicamente activas aí encapsuladas e um ou mais agentes modificadores da taxa de libertação que não hidro-halogenetos.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os agentes modificadores da taxa de libertação são seleccionado de entre o grupo que consiste em ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fórmico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido tricloroacético e ácido trifluoroacético e seus sais ou combinações.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o agente modificador da taxa de libertação é um ácido inorgânico monoprótico.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que os ácidos são neutralizados com um aceitador de protões.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a substância biologicamente activa é uma droga.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que as substâncias biologicamente activas são seleccionadas de entre o grupo que consiste em antibióticos, vacinas, drogas antivirais, antifúngicas, antitumorais, proteínas e glicoproteínas.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que a droga antitumoral é citarabina.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que as substâncias biologicamente activas são seleccionadas de entre o grupo que consiste em herbicidas e pesticidas.
9. 9. Sistema de entrega direccionada compreendendo uma composição de acordo com a reivindicação 1 com um ligando direccionante a si ligado.

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10. 10. Sistema de entrega direccionada de acordo com a reivindicação 9, em que o ligando direccionante é um anticorpo ou seu fragmento.
11. 11. Sistema de entrega direccionada de acordo com a reivindicação 10, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
12. 12. Sistema de entrega direccionada de acordo com a reivindicação 9, em que são incorporados grupos lipídicos na bicamada lipídica das vesículas de membrana sintéticas. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a vesícula de membrana sintética é anatomicamente direccionada.
13. 14. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a vesícula de membrana sintética é mecanisticamente direccionada. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a vesícula de membrana sintética é direccionada de forma passiva. 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a vesícula de membrana sintética é direccionada de forma activa.
14. 17. Composição de acordo com a reivindicação 16, em que a vesícula de membrana sintética é direccionada de forma activa por acoplamento com uma porção seleccionado de entre o grupo que consiste em um açúcar, um glicolípido e uma proteína.
15. 18. Vesícula de membrana sintética de acordo com a reivindicação 1 produzida pelo método que compreende: (a) formação de uma emulsão de água em óleo a partir de dois componentes imiscíveis contendo pelo menos um solvente orgânico, água, pelo menos uma substância biologicamente activa, e pelo menos um agente modificador da taxa de libertação que não hidro-halogeneto; (b) dispersão da referida emulsão de água em óleo num componente aquoso para formar esférulas de solvente; e (c) remoção do solvente orgânico das esférulas de solvente para formar a vesícula de membrana sintética.

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16. 19. Processo para a produção de vesículas de membrana sintéticas compreendendo os passos de: (a) formação de uma emulsão de água em óleo a partir de dois componentes imiscíveis contendo pelo menos um solvente orgânico, água, pelo menos uma substância biologicamente activa e pelo menos um agente modificador da taxa de libertação que não hidro-halogeneto; (b) dispersão da emulsão de água em óleo num componente aquoso para formar esférulas de solvente; e (c) remoção do solvente orgânico a partir das esférulas de solvente para formar as vesículas de membrana sintéticas contendo gotículas aquosas com a substância biologicamente activa e o agente modificador da taxa de libertação nelas dissolvidos.
17. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a concentração do agente modificador da taxa de libertação que não hidro-halogeneto está presente na gama de cerca de 0,1 mM a cerca de 0,5 M.
18. 21. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que é adicionado um agente neutralizante de ácido numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 0,5 M durante o passo (b).
19. 22. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o solvente orgânico tem um componente lipídico dissolvido contendo pelo menos um lípido anfipático com uma carga total negativa e pelo menos um lípido neutro.
20. 23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o componente lipídico é seleccionado de entre o grupo que consiste em um fosfolípido e uma mistura de fosfolípidos.
21. 24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que os fosfolípidos são seleccionado de entre o grupo que consiste em fosfatidilcolina, cardiolipina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina, lisofosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico.
22. 25. Processo de acordo com a reivindicação 24, em que pelo menos um dos fosfolípidos tem pelo menos uma carga total negativa.

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23. 26. Processo de acordo com a reivindicação 24, em que o fosfolípido é proporcionado em mistura com colesterol.
24. 27. Processo de acordo com a reivindicação 24, em que o fosfolípido é proporcionado em mistura com estearilamina.
25. 28. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que é proporcionado um material biologicamente activo lipofílico em mistura com o componente lipídico.
26. 29. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o lípido neutro é seleccionado de entre o grupo que consiste em trioleína, trioctanoína, óleo vegetal, banha, gordura de carne de vaca, tocoferol e suas combinações.
27. 30. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o solvente orgânico é seleccionado de entre o grupo que consiste em éteres, hidrocarbonetos, hidrocarbonetos halogenados, éteres halogenados, ésteres e suas combinações.
28. 31. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o material biologicamente activo é hidrófilo.
29. 32. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a emulsão é formada utilizando um método seleccionado de entre o grupo que consiste em agitação mecânica, energia ultra-sónica e atomização por estreitamentos.
30. 33. Processo de acordo com a reivindicação 32, em que o tamanho médio das vesículas de membrana sintéticas e o número das câmaras aquosas no seu interior são determinados pelo tipo, intensidade e duração do método de emulsão seleccionado.
31. 34. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o agente modificador da taxa de libertação é um ácido inorgânico monoprótico, e o componente aquoso contém pelo menos um agente neutralizante.

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32. 35. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que o agente neutralizante é seleccionado de entre o grupo que consiste em base livre lisina, base livre histidina e uma sua combinação.
33. 36. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que o componente aquoso é uma solução aquosa contendo solutos seleccionados de entre o grupo que consiste em hidratos de carbono e aminoácidos.
34. 37. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que o componente aquoso é uma solução aquosa contendo solutos seleccionados de entre o grupo que consiste em glucose, sacarose, lactose, base livre lisina, base livre histidina e suas combinações.
35. 38. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que as esférulas de solvente são formadas utilizando um método seleccionado de entre o grupo que consiste em agitação mecânica, energia ultra-sónica, atomização por estreitamentos, e suas combinações.
36. 39. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que o tamanho médio da vesícula de membrana sintética é determinado pelo tipo, intensidade e duração da energia utilizada.
37. 40. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o solvente orgânico é removido por passagem de gás sobre o componente aquoso.
38. 41. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a substância biologicamente activa é seleccionada de entre o grupo que consiste em antiasmáticos, glicósidos cardíacos, anti-hipertensores, antiparasíticos, ácidos nucleicos e análogos, antibióticos, vacinas, antiarrítmicos, antianginas, hormonas, antidiabéticos, antineoplásicos, imunomoduladores, antifúngicos, tranquilizantes, esteróides, sedativos e analgésicos, vasopressores, antivirais, anticorpos monoclonais, herbicidas, pesticidas, proteínas e glicoproteínas, neurotransmissores, radionuclidos, radiocontrastes e suas combinações.
39. 42. Vesícula de membrana sintética preparada de acordo com a reivindicação 32 ou 33, em que a substância biologicamente activa é seleccionada de entre o grupo que consiste em antiasmáticos, glicósidos

    85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 6/7 cardíacos, anti-hipertensores, antiparasíticos, ácidos nucleicos e análogos, antibióticos, vacinas, antiarrítmicos, antianginas, hormonas, antidiabéticos, antineoplásicos, imunomoduladores, antifúngicos, tranquilizantes, esteróides, sedativos e analgésicos, vasopressores, antivirais, anticorpos monoclonais, herbicidas, pesticidas, proteínas e glicoproteínas, neurotransmissores, radionuclidos, radiocontrastes, e suas combinações.
40. 43. Utilização de um composto biologicamente activo encapsulado numa vesícula de membrana sintética compreendendo membranas em bicamadas lipídicas encerrando múltiplas câmaras aquosas não concêntricas, na presença de um agente modificador da taxa de libertação que não hidro-halogeneto, para a preparação de uma composição farmacêutica.
41. 44. Utilização de uma vesícula de membrana sintética de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, para a preparação de uma composição farmacêutica.
42. 45. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a substância biologicamente activa é seleccionada de entre o grupo que consiste em herbicidas e pesticidas.
43. 46. Vesícula de membrana sintética de acordo com a reivindicação 1 produzida por um método que compreende: a) formação de uma emulsão de água em óleo a partir de dois componentes imiscíveis, sendo os dois componentes imiscíveis 1) um componente lipídico compreendendo pelo menos um solvente orgânico volátil, pelo menos um lípido anfipático, e pelo menos um lípido neutro que não tenha um grupo de cabeça; e 2) um primeiro componente aquoso; compreendo adicionalmente a emulsão de água em óleo pelo menos um ácido que não hidro-halogeneto e pelo menos uma substância biologicamente activa, sendo o referido ácido que não hidro-halogeneto e a referida substância biologicamente activa independentemente incorporados no componente lipídico, no primeiro componente aquoso, ou em ambos; b) mistura da emulsão de água em óleo de a) com um segundo componente aquoso para formar esférulas de solvente; e 85 118 ΕΡ Ο 729 351/ΡΤ 7/7 c) remoção do solvente orgânico das esférulas de solvente para formar lipossomas multivesiculares; em que a concentração de ácido que não hidro-halogeneto na emulsão de água em óleo é seleccionada de modo a proporcionar a libertação controlada da substância biologicamente activa dos lipossomas. Lisboa, Por SkyePharma Inc. - O AGENTE OFICIAL -