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JP3966819B2 - 毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 - Google Patents

毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 Download PDF

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Description

本発明は、新たに分離した第２ケラチノサイト成長因子類似体（keratinocyte growth factor-2 analogue、以下「ＫＧＦ―２Ａ」という）、これをコーディングする遺伝子、この製造方法及びこれらの医薬学的用途に関する。
より詳しくは、ヒトの頭皮毛嚢からＫＧＦ−２の突然変異体を新たに分離し、前記蛋白質をコーディングする遺伝子、これを含む発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換した形質転換体を製造し、この形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造するものである。本発明のＫＧＦ―２Ａは、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに利用できる。
毛嚢は成長期(anagen)、退行期(catagen)及び休止期(telogen)からなる生活史を有する表皮細胞変異体である。
毛嚢は、たとえ生活史の基礎となるメカニズムが完全に究明されてはいないが、毛嚢内の間葉細胞(mesenchymal cell)群集と上皮細胞(epithelial cell)群集間の相互作用が核心的な役割を果たすと知られている(Jahoda, C. A.& Reynolds, A. J. (1996) Dermatol. Clin. 14, 573-583)。毛嚢の生活史の進行において、最も明白な動力は乳頭性間葉(papillary mesenchyme)から由来し、特に真皮乳頭(dermal papilla)が重要な役割を行う。
乳頭性間葉から出た特定因子(factor)は小胞性上皮の生活史に誘導信号として作用する(Peus, D. & Pittelkow, M. R. (1996) Dermatol. Clin. 14, 559-572)。 具体的には毛嚢の突出部にある上皮幹細胞(epithelial stem cells)が真皮乳頭からの誘導信号に反応可能であると考えられている(Cotsarelis, G., Sun, T. T. & Lavker, R. M.(1990) Cell 61, 1329-1337)。前記の過程によって上皮幹細胞が活性化されると、突出部で幹細胞の増殖が起こり、幹細胞子孫が真皮側に下方に成長し、その後マトリックス細胞(matrix cells)の分化的成長が起こり、複合小胞性上皮(complex follicular product)、シャフト(shaft)及びそれらを取り囲んだシース(sheath)が生成される。
形質変換マウス又は遺伝子ノックアウトマウスの皮膚表現型を分析した結果、間葉細胞（真皮乳頭）と上皮細胞（ケラチノサイト）間の相互作用が胎児において毛嚢の形態発生に関与するという主張が力を得た(Gat, U. et al. (1998) Cell 95, 605-514 ; Chiang, C. et al. (1999) Dev. Biol. 205, 1-9 ; Botchkarev. V. A. et al.(1999) Nat. Cell Biol. 1, 158-164)。ところが、生後の小嚢で休止期と成長期との間に発生する生物学的スイッチに関するメカニズムは不明である。そのような因子して最も説得力のある候補者はＫＧＦ―２である。なぜなら、ＫＧＦ−２は、真皮乳頭繊維芽細胞で発見されるし、その受容体ＦＧＦＲ２IIIｂが隣接のケラチノサイトに存在するためである(Katsuoka K, Schell H, Hornstein OP, Wessel B. (1987) Br. J. Dermatol Mar 116(3), 464-5)。
ｋｇｆ−２遺伝子は繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor、以下「ＦＧＦ」という)遺伝子家族群に属するものであり、ＦＧＦは現在哺乳動物から２２種以上が発見された(Nishimura T. Nakatake Y, Konishi M. Itoh N. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1492, 203-206)。ＦＧＦはチロシンキナーゼ受容体(tyrosine kinase receptors)の一員であるＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲｓ）に結合してこれらを活性化させることにより、細胞の増殖、分化、移動及び生存を調節するものと考えられる。
２２種のＦＧＦのうち、ＫＧＦ―２はＦＧＦ―７と構造的に最も深い連関性を持っており(Yamasaki M. Miyake A. Tagashira S. Itoh N. (1996) J. Biol. Chem. 271, 15918-15921)、これらのＦＧＦは両方とも四つのＦＧＦＲｓの中でも異性体の一つであるＦＧＦＲ２IIIｂに特異的に結合すると知られている(Miki T. et al (1991) Science 251, 72-75 ; Ornitz D. M. et al.(1996) J. Biol. Chem. 271, 15292-15297 ; Igarashi M. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 13230-13235)。
また、機能的には、ＫＧＦ―２が肢芽(limb bud)のアウトグロース(outgrowth)と肺の分枝的形態発生(branching morphogenesis)に関与するものと見られる(Martin G. r. (1998) Genes Dev. 12, 1571-15869)。肢芽と肺芽(lung bud)は器官原基(organ primordia)の典型的な一例であって、器官の発生development)に上皮組織と間葉組織間の密接な相互作用が必要である。
上皮−間葉の相互作用において、間葉から出た信号は直接的に上皮組織に伝えられて発芽的形態発生又は分枝的形態発生(budding or branching morphogenesis)による特異構造を形成し、両組織間の相互作用はその以後の発生中にも維持されることが確実である。
米国特許第５,１８４,６０５号、第５,８２４,６４３号及び第５,９６５,５３０号には、ＫＧＦがケラチノサイト以外にも上皮組織の様々な細胞で増殖、成長及び分化を刺激する活性があって、ＫＧＦを、真皮付属器、肝、肺及び胃腸管のような組織及び器官を苦しめる疾病状態又は医療状況の治療に使用することができることと、この際、真皮内の付属器要素が皮脂腺、汗腺及び毛嚢であることなどが記載されている。
ところが、ＫＧＦは傷回復(wound healing)次元の上皮再生(reepithelialization)活性のみが確認され、化学療法によって誘発された脱毛症(chemotherapy-induced alopecia)にのみ適用可能であると説明されているだけで、遺伝的な原因により発病する脱毛症には適用の余地が全くない。
また、米国特許第６,０７７,６９２号には、ＫＧＦ―２のアミノ酸序列及びこれをコーディングする塩基序列を分離し、その傷回復、抗炎症活性、肝細胞の分化及び増殖を促進させ且つ肺の損傷を防止する活性を確認することにより使用できることが開示されている。
ところが、前記文献にはＫＧＦ―２が毛嚢の増殖を促進する効果があるか否かを実験的に確認して記載されていない。
前記に引用された文献はその全体が参考として本明細書に含まれる。
本発明者は、脱毛症の原因になれる分子的因子(molecular factor)を見出そうとしている中、脱毛症患者の毛嚢ではＫＧＦ―２と類似している蛋白質の発現が制限されることを発見し、これを分離してそのアミノ酸序列を確認した結果、ＫＧＦ−２の新しい突然変異型蛋白質であること及び前記ＫＧＦ―２Ａが頭皮毛嚢細胞の増殖を促進することを確認して本発明を完成した。
本発明は、脱毛症患者の頭皮毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進する新規のＫＧＦ―２Ａを分離提供し、これを脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに用いる用途を提供することをその目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、ＫＧＦ―２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたＫＧＦ―２Ａを提供する。この際、ＫＧＦ−２Ａはヒトの頭皮毛嚢細胞から分離したＫＧＦ―２の新しい突然変異型蛋白質であって、序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含み、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２が糖鎖などの結合した成熟蛋白質(mature protein)の形態であってもよい。
また、本発明は、ＫＧＦ−２Ａをコーディングする遺伝子を提供する。本発明のｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流(upstream)に開始コドンをさらに含むことができる。
具体的に、序列番号２の４番から６２７番まで、或いは１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことができ、その塩基序列の上流に開始コドンをさらに含むことができる。
本発明は、ＫＧＦ−２Ａの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、ｋｇｆ―２ａ遺伝子を発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に形質転換させて形質転換体を得た後、前記形質転換体を培養する段階を含む。この際、前記ｋｇｆ―２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
また、本発明は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を提供する。この際、ＫＧＦ−２Ａは、１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むか、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２Ａが糖鎖などの結合した成熟蛋白質の形態であってもよい。
ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
前記薬学的組成物は、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに使用できる。
本発明は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた脱毛症の治療又は予防方法を提供する。前記方法はＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分として含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。
本発明の第１態様は、ＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたＫＧＦ−２Ａに関するものである。この際、ＫＧＦ−２Ａはヒトの頭皮毛嚢細胞から分離したＫＧＦ−２の新しい突然変異型蛋白質である。
まず、本発明では、ＫＧＦ−２Ａを分離、確認するために、ヒトの頭皮毛嚢細胞から総ｍＲＮＡを抽出した後、ＫＧＦ−２のＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲを施してｃＤＮＡを得、その塩基序列を決定することにより、アミノ酸序列を推論し決定した。
その結果、得られたアミノ酸序列は既存のＫＧＦ−２とは８７番アミノ酸が相異し、これを序列番号１に開示した。本発明者は、ＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された新しい蛋白質をＫＧＦ−２Ａと命名した。
本発明に係るＫＧＦ−２Ａは、序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むか、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。
具体的に、本発明のＫＧＦ−２Ａは、ヒトの頭皮毛嚢から分離されたもので、脱毛症患者の頭皮では正常人とは異なる発現様相を示す。
まず、本発明では、正常人と脱毛症患者の毛嚢におけるＫＧＦ−２ＡのｍＲＮＡ発現を比較分析するために、正常人と脱毛症患者の頭皮から形態発生学的に生成期の構造的特性を有する毛嚢をそれぞれ分離した。前記毛嚢から総ＲＮＡ(total RNA)を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って得たｃＤＮＡをアガロースゲル上で分離して比較分析した。
その結果、本発明のＫＧＦ−２Ａは、ＫＧＦ−２Ａ受容体のＦＧＦＲ２IIIｂとは異なり、正常人と脱毛症患者において相異した発現様相を示した。すなわち、正常人の毛嚢ではＫＧＦ−２Ａが一定の程度発現される反面、脱毛症患者の毛嚢ではその発現が制限されることを確認した（図３参照）。従って、本発明のＫＧＦ−２Ａは脱毛を調節する分子的因子である可能性が高い。
本発明の第２態様はＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子に関するものである。
ＫＧＦ−２ＡはＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたアミノ酸序列を有するものである。このため、ＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子は、前記アミノ酸序列を暗号化する全ての可能な場合のコドンから構成できる。また、前記遺伝子はｇＤＮＡ又はｃＤＮＡであり、よって、ｇＤＮＡの場合はコーディング部位内にイントロンのような非コーディング部位を含むことができる。
本発明のｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。
具体的に、序列番号２の４番から６２７番まで或いは１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことができ、その塩基序列の上流に開始コドンをさらに含むことができる。この際、コドンのデジェネラシー(degeneracy)による変形が可能なのは当業者間には周知の事実である。
まず、本発明ではｋｇｆ−２ａ遺伝子を得るためにヒトの頭皮毛嚢細胞から総ＲＮＡを抽出した。当業者間に周知されているように、細胞から分離した総ＲＮＡは、増幅させようとする遺伝子の塩基序列に相応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを介して特定の遺伝子のｃＤＮＡに転換される。
本発明では、序列番号２の１番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子を増幅させるためには序列番号３及び序列番号４のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子を増幅させるためには序列番号９及び序列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
具体的に、毛嚢から抽出した総ＲＮＡから逆転写を行ってｃＤＮＡを得、これから前記序列番号３及び序列番号４又は序列番号９及び序列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基序列を確認した結果、既存のヒトのＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ序列において８７番コドンがリジンからグルタミン酸に置換された新規のｃＤＮＡ序列を決定した（図１及び序列番号２参照）。
これをｋｇｆ−２ａ遺伝子と命名し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａで表示し、２００１年５月１９日付で韓国科学技術研究院の生命工学研究所付設の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）。
本発明の第３態様はＫＧＦ−２Ａの製造方法に関するものである。
ＫＧＦ−２Ａは、公知のアミノ酸序列、すなわち序列番号１のアミノ酸序列に応じて目的の序列を直接合成する方法で製造することができ、ヒトの頭皮毛嚢から精製することもでき、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた組換え方法によって発現、精製して製造することもできる。
本発明では、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いてこれをベクター内にクローニングした後、得られた組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換させて形質転換体を得、前記形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造する。この際、前記ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
追加的な塩基序列としては、蛋白質の発現後に区画化(compartmentalization)のためのシグナルや膜挿入(anchor)序列などが結合することもでき、免疫源性決定基などが融合することができ、蛋白質の分離精製を容易にするためのタグ(tag)を挿入することもでき、融合部位に酵素特異切断序列が挿入されることができる。このような追加的な塩基序列はその目的に応じて蛋白質の発現、精製後に酵素などによって切断可能である。
まず、組換えプラスミドを得るために、ｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＥＴ９ｃ又はｐＧＥＸ−２Ｔのような市販の発現ベクター内にサブクローニングする。この際、ｐＥＴ９ｃはＴ７プロモータを含むもので、標的遺伝子の発現を強く誘導し、ｐＧＥＸ−２ＴはグルタチオンＳ−転移酵素（glutathion S-transferase、以下「ＧＳＴ」という）をコーディングする序列が標的遺伝子の挿入位置の上流に含まれているため、ＧＳＴ−融合蛋白質の形態で発現される。
具体的に、序列番号２において信号序列(signal sequence)をコーディングする部位である１番から１１７番までの塩基序列を除き、１１８番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＧＥＸ−２Ｔ内にサブクローニングして組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａを得た。
前記のような方法で得られたｋｇｆ−２ａ遺伝子を含む組換えプラスミドを、リン酸カルシウム(calcium phosphate)沈澱方法、リポソーム(liposome)媒介方法、マイクロインジェクション(microinjection)、エレクトロポレーション(electroporation)を用いたトランスフェクション(transfection)方法などの公知の方法で大腸菌のような宿主細胞を形質転換させて形質転換体を製造する。
本発明では、宿主細胞として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を用いた。具体的に、前記組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換させて形質転換体を得た。
形質転換体から蛋白質を分離精製するために、形質転換体を適当な時間だけ培養し細胞を破砕した後、クロマトグラフィ、透析及び／又は濾過を施してＫＧＦ−２Ａを精製することにより、ＫＧＦ−２Ａを純粋分離する。
本発明では、前記過程で得た大腸菌形質転換体を４８時間以上培養した後、細胞を破砕し、濃度勾配ＮａＣｌ溶液で溶離するヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィを施してＫＧＦ−２Ａを分離精製した。
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａのような組換えプラスミドで形質転換された形質転換体の場合には、ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質が生成されるので、グルタチオンカラムクロマトグラフィを用いて選択的にＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質を分離することができる。前記融合蛋白質はトロンビン処理で簡単にＧＳＴを標的蛋白質から除去することができる。蛋白質の分離精製時に適切なカラムの選択と適用は、当業者が容易に変形することができる。
また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子を発現ベクター内にサブクローニングした場合には、必要に応じて蛋白質の発現後にトリプシンのような酵素を用いて切断して除去することができる。
本発明において、アガロースゲル上で確認した蛋白質の分子量は、ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａが約４５ｋＤａ、ＫＧＦ−２Ａが約２０ｋＤａであった。これは予想の分子量と一致するものであった（図２参照）。
本発明の第４態様は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物に関するものである。この際、ＫＧＦ−２Ａは１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２Ａは糖鎖などが結合した成熟蛋白質の形態であってもよい。
ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
本発明では、ＫＧＦ−２Ａの生物学的活性を確認するために、ＫＧＦ−２Ａのヒトの頭皮毛嚢細胞における増殖促進能を測定した。具体的に、ヒトの頭皮から分離した毛嚢細胞にＫＧＦ−２Ａを処理して一定の時間経過後にＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。
その結果、図５に示すように、ＫＧＦ−２Ａ３０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示し、陰性対照区１００％対比約１４０％の著しい増殖活性を示した（図５参照）。
また、内在的ＫＧＦ−２の原因を除去するために、真皮乳頭が外科的に除去されたヒトの頭皮毛嚢にＫＧＦ−２Ａを処理し、一定時間の経過後、ＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。
その結果、真皮乳頭の除去されていない毛嚢に比べて、真皮乳頭の除去された毛嚢で細胞の増殖が一層著しいことを確認した（図６ａ及び図６ｂ参照）。
ＫＧＦ−１はＦＧＦ家族群においてＫＧＦ−２と密接した一員である。従って、ＫＧＦ−２Ａの刺激効果はＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２と比較できる。
本発明では、ヒトの頭皮から分離した毛嚢細胞にそれぞれＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａを処理し、一定の時間経過後、ＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。また、内因性因子による影響を除去するために、真皮乳頭を除去したヒトの頭皮毛嚢にそれぞれＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａを処理し、毛嚢細胞の増殖程度を確認した。
その結果、真皮乳頭の除去の如何を問わず、ＫＧＦ−２ＡがＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２に比べて著しく毛嚢細胞増殖を促進することを確認した（図７ａ及び図７ｂ参照）。
従って、本発明に係るＫＧＦ−２Ａは、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるため、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛髪再活を促進させる薬学的組成物に有効成分として利用できる。
また、ＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子は、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛髪再活を促進させる遺伝子治療剤として利用できる。
本発明において、前記薬学的組成物は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を薬剤学的に許容される通常の賦形剤又は補助剤と混合し、通常の薬剤学的製剤方法で製剤化して製造できる。この際、通常の薬剤学的製剤方法には、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を遺伝子治療用ベクターに挿入して用いることが含まれる。
本発明の第５態様は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた脱毛症治療又は予防方法を提供する。前記方法はＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。
具体的に、前記ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を含有する薬学的組成物は、経口的又は非経口的に、例えば静脈内、皮下、筋肉内、経皮又は直腸内に投与することができるが、 頭皮に直接投与する経皮投与が好ましい。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を制限するものではない。
〔実施例1〕毛嚢の分離
正常人と脱毛症患者の頭皮から、形態発生学的に生成期の構造的特性をもつ毛嚢をそれぞれ分離した。
〔実施例２〕ヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡの分離
トリゾール(Gibco BRL)を用いて毛嚢から抽出した総ＲＮＡをもって逆転写を行った。
具体的に、ヒトの毛嚢の総ＲＮＡ（１μｇ）を、モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素３００ｕｎｉｔｓ、ヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤１５ｕｎｉｔｓ及び無作為ヘキサデオキシヌクレオチドプライマー０.５μｇを含む反応混合物（２０μｌ）と共に３７℃で６０分間培養して逆転写を行ってｃＤＮＡ溶液を得た。得られた前記ｃＤＮＡ溶液からヒトＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ切片を増幅させるために、ｃＤＮＡ溶液と０.０５ｕｎｉｔ／μｌのＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び序列番号３のセンスプライマーと序列番号４のアンチセンスプライマーをそれぞれ４ｐｍｏｌ／μｌ含む反応混合物(reaction mixture)でＰＣＲを３０回行った。前記プライマーはヒトＫＧＦ−２の１番から２０８番までのアミノ酸序列に相応するものである。ＰＣＲの条件は９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間とした。ＰＣＲ機器はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６００(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)を使用した。
その結果、得られたＰＣＲ産物はヒトＫＧＦ−２の１番から２０８番までのアミノ酸序列に相応する全ての可能なコドンであり、６２７塩基対(base pairs)の予想サイズのＤＮＡクローンが主要増幅産物であった。
５つのクローンを無作為に選択してこれらの塩基序列を決定した。具体的に、前記予想サイズに増幅されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ ＤＮＡ(Promega Biotech)内にクローニングした後、クローニングされたＤＮＡの塩基序列をジデオキシ終結循環序列(Applied Biosystems)を用いてアプライドバイオシステムモデル３７７ＤＮＡシーケンサー(Perkin-Elmer)で確認した。
その結果、前記５つのクローンのうち１つから、既存のヒトＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ序列で８７番コドンがリジンからグルタミン酸に置換された序列を確認した。これは既存のＫＧＦ−２蛋白質の突然変異型類似体をコーディングするもので、ｋｇｆ−２ａ遺伝子と命名した。ヒトｋｇｆ−２ａ ｃＤＮＡのコーディング部位は６２７個のヌクレオチドからなり、序列番号２に表示される。これはｋｇｆ−２の塩基序列とは９９.５％の相同性を示した。
前記で分離したｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａで表示し、２００１年５月１９日付で韓国科学技術研究院の生命工学研究所付設の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）（図４参照）。ｐＧＥＭ−ＴベクターはＴ７ Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼ二重プロモータ（−１７〜＋３）とｌａｃオペレータ（operator、２００〜２１６）を持っている。
序列番号２のｋｇｆ−２ａ遺伝子塩基序列は、完全なＫＧＦ−２Ａの２０８個のアミノ酸からなるアミノ酸序列をコーディングし、４番から１１７番までの塩基序列は、ＫＧＦ−２Ａの信号序列をコーディングする。ＫＧＦ−２Ａのアミノ酸序列を序列番号１に表示した。
〔実施例３〕ＲＴ−ＰＣＲによるＫＧＦ−２Ａ及びＦＧＦＲ２IIIｂ ｍＲＮＡ発現分析
序列番号５及び序列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行ってＫＧＦ−２Ａ ｍＲＮＡの発現を分析した。
序列番号５のセンスプライマー及び序列番号６のアンチセンスプライマーは、ＫＧＦ−２のコーディング序列のうち、４２７塩基対からなる序列（１１９〜６２７）に隣接して連結(flanking)される序列である。
ＲＴ−ＰＲは、具体的に、前記実施例２で毛嚢から分離した総ＲＮＡ（１μｇ）に、モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素１５ｕｎｉｔｓと前記序列番号５及び序列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれた反応混合物を用いて９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間を４０回繰り返し行った後、最後に７２℃で５分間反応させた。その結果、得られたＲＴ−ＰＣＲの産物は１.５％のアガロースゲルで分析した。
また、ＫＧＦ−２Ａの受容体であるＦＧＦＲ２IIIｂ ｍＲＮＡの発現を分析するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、序列番号７のセンスプライマーと序列番号８のアンチセンスプライマーを使用したが、これはヒトＦＧＦＲ２IIIｂのコーディング序列のうち、３５０塩基対からなる序列（６９９〜１０４９）に隣接して連結される序列に相応するものである。
ＰＣＲは９４℃で１分間１回行った後、９４℃で１分間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５回繰り返し行い、７２℃で５分間行った。
β−アクチンｍＲＮＡの発現水準を分析して内部対照区として用いた。
図３に示すように、ＫＧＦ−２Ａは、正常人の毛嚢では発現される一方、脱毛症患者の毛嚢では検出されなかった。反面、ＫＧＦ−２Ａの受容体であるＦＧＦＲ２IIIｂは正常人と脱毛症患者の両者の毛嚢から全て検出された。
また、表１より、脱毛症患者の場合には、例外なくＫＧＦ−２Ａの発現が制限される一方、正常人の場合には、５７％のみ正常的に発現され、４３％はその発現が制限されることが分る（ｐ＜０.０５）。
Figure 0003966819
これは、外見上に正常人と見られる場合でも、遺伝的な原因によりＫＧＦ−２Ａの発現が制限される保因者が存在することを示し、このような保因者は向後脱毛症の発病可能性が高いものと解釈可能である。
〔実施例４〕組換えＫＧＦ−２Ａの製造
まず、ヒトＫＧＦ−２Ａの４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするｃＤＮＡを増幅するために、ヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び序列番号９と序列番号１０のプライマーを用いて２５回ＰＣＲを行った。増幅された部位は、信号序列の分泌及び切断部位の下流に連結される成熟なＫＧＦ−２Ａをコーディングする部位に相当するものであった。
次に、増幅産物をｐＥＴ９ｃプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングして組換えプラスミドｐＥＴ９ｃ−ＫＧＦ−２Ａを製造し、これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた。
前記過程から得た形質転換体を４８時間培養して大腸菌形質転換体でＴ７遺伝子のプロモータから組換えＫＧＦ−２Ａを発現させた後、細胞を破砕してトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を前処理し、ヘパリン−セファロースカラムに注入した。その後、カラムからＮａＣｌの濃度を増加させ、溶離した連続的な分画を分析した結果、１.０ＭのＮａＣｌ分画からヒトのＫＧＦ−２Ａが殆ど溶出されたことを確認し、これをさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、シルバーステイニングを行って確認した。０.８Ｍ及び１.２ＭのＮａＣｌ分画からもＫＧＦ−２Ａが一部溶出された。
溶出された蛋白質の分子量は約２０ｋＤａであり、これは予想の分子量と一致するものであった。１.０ＭのＮａＣｌ分画から溶出された蛋白質サンプルでアミノ酸分析を行って本質的に純粋なＫＧＦ−２Ａを得ることを確認した。
〔実施例5〕ＧＴＳ−融合システムを用いた組換えＫＧＦ−２Ａの製造
前記実施例４の方法でヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡを増幅し、増幅された産物を制限酵素ＥｃｏＲI及びＢａｍＨIで切断し、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲI／ＢａｍＨI位置に連結させて得た
組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を４２℃で３０秒間熱衝撃を加えて形質転換させた。
前記過程から得た形質転換体を４８時間培養した後、細胞を破砕して５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）で予め平衡化したグルタチオンカラムに直接注入した。グルタチオンビードに結合した蛋白質は５０ｍＭのＴｉｒｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）でグルタチオンと共に溶出した。
ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質を含む分画は、さらにヘパリンカラム(Pharmacia Biotech.)にトロンビン２μｇを添加して１時間反応させることによりＧＳＴを切断した後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶かした０〜２.０Ｍの濃度勾配ＮａＣｌで溶出した。その後、リン酸塩−緩衝塩溶液(phosphate-buffered saline)に対して一晩中透析し、次にＰｙｒｏＳｅｐ−Ｃ(Tanabe Pharmaceuticals, Japan)に適用して内毒素を除去して純粋なＫＧＦ−２Ａ蛋白質を分離した。
アガロースゲル上で確認した蛋白質の分子量は、ＧＳＴ−ＫＧＦ−２Ａが約４５ｋＤａ、ＫＧＦ−２Ａが約２０ｋＤａであった。これは予想の分子量と一致するものであった（図２参照）。
〔実施例６〕組換えＫＧＦ−２Ａの分裂誘発活性の検証
ヒトの頭皮から毛嚢を分離し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン及び７５μｇ／ｍｌの牛脳下垂体抽出物の補充されたＫＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）が各ウェル当たり１ｍｌずつ入った２４ウェルプレートに仕込み、５％ＣＯ2／９５％空気の大気下で維持させた。
本発明では、毛嚢細胞の成長程度をＭＴＳ比色測定法で測定した。具体的に、ＭＴＳ分析を行う前に前記毛嚢細胞培養液にＫＧＦ−２Ａを１０、３０及び１００ｎｇ／ｍｌ濃度でそれぞれ処理して４８時間培養した。この際、ＫＧＦ−２Ａとしては前記実施例４で製造した蛋白質を使用した。
次に、９６ウェルマイクロタイター内に各ウェル当たり一つの毛嚢を入れ、４時間経過後に製造社（Ｐｒｏｍｅｇａ）で指示する方法に従ってＭＴＳ比色測定法を用いて細胞増殖を確認した。各実験は８回繰り返し行った。データ値は平均±標準偏差（Ｓ.Ｅ.）で表示した。陰性対照区としては非処理毛嚢細胞を用いた。
図５に示すように、ＫＧＦ−２Ａの添加は容量−依存的にヒト毛嚢細胞の増殖を促進させた結果、最大促進活性を示す濃度は３０ｎｇ／ｍｌであった。
〔実施例7〕ＫＧＦ−２Ａ活性の分子的メカニズムの確認
歯(tooth)或いは羽芽の発生の如き、毛嚢形態発生は、上皮−間葉の相互作用によって左右され、具体的に毛髪板(hair placode)ケラチノサイトと間葉凝縮下部(underlying mesenchymal condensations)の繊維芽細胞間の相互作用によるものと知られている。
したがって、本発明者は、具体的な器官培養で毛嚢細胞増殖にＫＧＦ−２Ａの投与が及ぼす影響を評価し、ＫＧＦ−２Ａの分子的メカニズムを確認しようとした。
すなわち、正常人の頭皮毛嚢にはＫＧＦ−２Ａが存在することに着目し、ＫＧＦ−２Ａの分裂促進活性で内因性ＫＧＦ−２による影響を除去するために、正常人の毛嚢を分離して真皮乳頭を外科的に除去した後、実施例６と同様の方法でこれを含む培養培地にＫＧＦ−２Ａを処理し、細胞増殖の程度を測定した。
その結果、図６ａ及び図６ｂに示すように、ＫＧＦ−２Ａは、真皮乳頭を含む毛嚢細胞における細胞増殖（１２５％±１１.０）と比較して、真皮乳頭が除去された毛嚢細胞の増殖を１３５％±１１.１（Ｐ＜０.０５）まで増加した値に促進させることを確認した。
〔実施例８〕ＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２の分裂促進活性との比較
本発明に係るＫＧＦ−２Ａの活性をＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２と比較した。具体的に、脱毛症患者の毛嚢を分離してそれぞれＫＧＦ−１、ＫＨＧ−２及びＫＧＦ−２を処理し、実施例６と同様にその細胞増殖活性を測定した（８回反復）。この際、実施例７のように内因性因子の影響を排除するために真皮乳頭を除去した後、同一の実験を行った。
その結果、図７ａに示すように、ＫＧＦ−２ＡはＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２に比べて有意的に脱毛症患者の頭皮から分離された毛嚢細胞の増殖を促進させた（ＫＧＦ−１：１１２％±６.９；ＫＧＦ−２：１２６％±８.６；ＫＧＦ−２Ａ：１３５％±７.８）。ＫＧＦ−２Ａの活性は真皮乳頭の除去された毛嚢細胞においても有意的に現われた（図７ｂ参照）。
以上述べたように、本発明のＫＧＦ−２Ａは、既存のＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された新規の突然変異型蛋白質であって、ヒトの毛嚢から分離したもので、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるに利用できる。
図１はヒトＫＧＦ−２と本発明のＫＧＦ−２Ａとのアミノ酸序列を比較して示す図である。 図２はＧＳＴ−ＫＧＦ２ＡとＫＧＦ−２Ａとを分離してアガロースゲル上でその分子量を確認した結果を示す図である。 図３は正常人と脱毛症患者の頭皮から分離した毛嚢における本発明のＫＧＦ−２ＡとＫＧＦ−２Ａ受容体の発現様相を比較分析した結果を示す図である。 図４は序列番号２の塩基序列を含むＫＧＦ−２ＡのＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入して得た組換えプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａ（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）の制限酵素地図である。 図５はＫＧＦ−２Ａの毛嚢細胞増殖活性をＭＴＳ比色分析法で確認した結果を示す図である。 図６ａは正常人の頭皮毛嚢から真皮乳頭を除去した後ＫＧＦ−２Ａを処理した結果、細胞増殖に及ぼす効果を確認した図である。 図６ｂは正常人の頭皮毛嚢から真皮乳頭を除去していない毛嚢にＫＧＦ−２Ａを処理した結果、細胞増殖に及ぼす効果を確認した図である。 図７ａは脱毛症患者の毛嚢にＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａをそれぞれ処理した後細胞増殖活性を確認した図である。 図７ｂは脱毛症患者の毛嚢から真皮乳頭を除去した後、ＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａをそれぞれ処理してその細胞増殖活性を確認した図である。

Claims (30)

  1. 第２ケラチノサイト成長因子のアミノ酸序列で８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  2. 序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含む第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  3. Ｎ末端にメチオニンをさらに含むことを特徴とする請求項２記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  4. 序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列を含む第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  5. Ｎ末端にメチオニンをさらに含むことを特徴とする請求項４記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  6. ヒトの頭皮毛嚢から分離されたことを特徴とする請求項２又は４記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  7. 成熟蛋白質であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
  8. 請求項１の第２ケラチノサイト成長因子類似体をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
  9. 序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
  10. 序列番号２の４番から６２７番までの塩基序列を含むことを特徴とする請求項９記載の遺伝子。
  11. 序列番号１の１番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
  12. 序列番号２の１番から６２７番までの塩基序列を含むことを特徴とする請求項１１記載の遺伝子。
  13. 序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
  14. 序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことを特徴とする請求項１３記載の遺伝子。
  15. 序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含み、そのＮ−末端にメチオニンが結合したアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサト成長因子類似体遺伝子。
  16. 序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含み、その５’−末端の上流に開始コドンをさらに含むことを特徴とする請求項1５記載の遺伝子。
  17. 前記遺伝子はｃＤＮＡ型であることを特徴とする請求項８ないし１６のいずれか１項に記載の遺伝子。
  18. 前記遺伝子はｇＤＮＡ型であることを特徴とする請求項８ないし１６のいずれか１項に記載の遺伝子。
  19. 第２ケラチノサイト成長因子のアミノ酸序列で８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された第２ケラチノサイト成長因子類似体をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子をベクターにクローニングした後、宿主細胞に形質転換させて形質転換体を得、前記形質転換体を培養することを特徴とする第２ケラチノサイト成長因子類似体の製造方法。
  20. 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングすることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
  21. 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーティングすることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
  22. 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は、序列番号２の第２ケ ラチノサイト成長因子類似体遺伝子の全部、序列番号２の４番から６２７番までの塩基序列、又は序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含み、付加的なＤＮＡ序列をさらに含んでいる融合遺伝子の形態であることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
  23. 第２ケラチノサイト成長因子のアミノ酸序列で８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された第２ケラチノサイト成長因子類似体又は該第２ケラチノサイト成長因子類似体をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子を有効成分とする脱毛症予防及び治療又は毛髪成長及び毛嚢再活促進用薬学的組成物。
  24. 第２ケラチノサイト成長因子類似体は序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことを特徴とする請求項２３記載の薬学的組成物。
  25. 第２ケラチノサイト成長因子類似体は序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことを特徴とする請求項２３記載の薬学的組成物。
  26. 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体のアミノ酸序列それぞれのＮ−末端にメチオニンをさらに含むことを特徴とする請求項２４又は２５記載の薬学的組成物。
  27. 第２ケラチノサイト成長因子のアミノ酸序列で８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された第２ケラチノサイト成長因子類似体は成熟蛋白質形態であることを特徴とする請求項２３記載の薬学的組成物。
  28. 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングすることを特徴とする請求項２３記載の薬学的組成物。
  29. 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングすることを特徴とする請求項２３記載の薬学的組成物。
  30. 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号２の第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子の全部、序列番号２の４番から６２７番までの塩基序列、又は序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含み、付加的なＤＮＡ序列をさらに含んでいる融合遺伝子の形態であることを特徴とする請求項２３記載の薬学的組成物。
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