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PT2277551E - Polímeros à base de ciclodextrina para a administração de medicamentos ligados por ligação covalente - Google Patents

Polímeros à base de ciclodextrina para a administração de medicamentos ligados por ligação covalente Download PDF

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PT2277551E
PT2277551E PT101848844T PT10184884T PT2277551E PT 2277551 E PT2277551 E PT 2277551E PT 101848844 T PT101848844 T PT 101848844T PT 10184884 T PT10184884 T PT 10184884T PT 2277551 E PT2277551 E PT 2277551E
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PT
Portugal
Prior art keywords
polymer
cyclodextrin
quot
cpt
solution
Prior art date
Application number
PT101848844T
Other languages
English (en)
Inventor
Mark E Davis
Jianjun Cheng
Kay T Khin
Original Assignee
Cerulean Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31982363&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT2277551(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cerulean Pharma Inc filed Critical Cerulean Pharma Inc
Publication of PT2277551E publication Critical patent/PT2277551E/pt

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Description

DESCRIÇÃO
POLÍMEROS À RASE DE CICLODEXTRINA PARA A ADMINISTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS LIGADOS POR LIGAÇÃO COVALENTE
Antecedentes da invenção 0 fornecimento de alguns agentes terapêuticos de molécula pequena tais como camptotecina, tem sido problemático devido aos seus precários perfis farma-cológicos. Estes agentes terapêuticos têm, frequentemente, baixa hidrossolubilidade, suas formas bioativas existem em equilíbrio com uma forma inativa, ou então as altas concentrações sistémicas dos agentes levam a efeitos colaterais tóxicos. Para contornar o problema do seu fornecimento algumas abordagens consistiram em se conjugar o agente diretamente a um polímero hidrossolúvel, tal como o metacrilato de hidroxipropila (HPMA), polietileno glicol e ácido poli-L-glutâmico. Em alguns casos, tais conjugados foram bem sucedidos na solubilização ou na estabilização da forma bioativa do agente terapêutico, ou na obtenção de um preparado de libertação sustentada que contornava as complicações associadas com altas concentrações sistémicas do agente.
Uma outra abordagem do problema de fornecimento de medicamentos tem sido a formação de complexos de inclusão hospedeiro/hóspede entre o agente terapêutico e ciclodex-trinas ou derivados seus. As ciclodextrinas (α, β, γ) e suas formas oxidadas têm propriedades físico-químicas especificas, tais como uma boa hidrossolubilidade, baixa toxicidade e baixa resposta imune. Até agora, a maior parte dos estudos de fornecimento de medicamentos com ciclodextrinas se centralizaram na sua capacidade de formar complexos supramo-leculares, em que as ciclodextrinas formam complexos de inclusão hospedeiro/hóspede com moléculas terapêuticas e assim alteram as propriedades fisicas, químicas e/ou biológicas destas moléculas hóspedes. A patente U.S. N° 5.276.088 descreve um processo para se sintetizar polímeros contendo ciclodextrina ou fazendo-se reagir álcool polivinílico ou celulose ou derivados seus com derivados de ciclodextrina ou copolimerizando-se um derivado de ciclodextrina com acetato de vinila ou metacrilato de metila. A patente U.S. N° 5.855.900 descreve um polímero biodegradável contendo ciclodextrina. A patente descreve um conjunto polimérico biodegradável estruturado supramolecular compreendendo uma mL de ciclodextrinas α, β, γ modificadas por medicamento e uma cadeia polimérica se infiltrando na cavidade estrutural das ciclodextrinas. A WO 00/1734 descreve copolímeros de ciclodextrina lineares que podem ser usados como veículo de entrega para agentes terapêuticos. A W099/67296 revela polímeros para a entrega de óxido nítrico in vivo.
Yano et al (Journal of Controlled Release, 2002, Vol. 79, páginas 103-112), Hristova-Kazmierski et al (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1993, vol. 3, No. 5, páginas 831-834), Tanaka et al (The Journal of Antibiotics, 1994, vol. 47, No. 9, páginas 1025-1029) e Yano et al (Journal of Pharmaceutical Sciences, 2001, vol. 90, No. 12, páginas 2103-2112), revelam conjugados compreendendo uma porção de ciclodextrina ligada covalentemente a um agente terapêutico. 2
Kang et al (European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2002, Volume 15, páginas 163-170) discute a influência de complexos de ciclodextrina na solubilidade, estabilidade e citoxicidade da camptotecina.
Continua a haver necessidade de novas abordagens para o fornecimento de agentes terapêuticos de molécula pequena que têm perfis farmacológicos precários tais como a camptotecina, paclitaxel, doxorobucina e ciclosporina A.
Sumário da invenção
De acordo com a presente invenção, é proporcionado um processo para produzir uma ciclodextrina linear contendo um polimero, compreendendo o processo a reação de um polímero formado pela unidade de repetição de fórmula geral B:
O
(8) em que
representa um radical de ciclodextrina; e 3 ο
m representa um polietileno glicol; com um composto de Fórmula C:
em que o polímero formado pela unidade de repetição com a Fórmula B e o composto de Fórmula C se fazem reagir, na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). A presente invenção também proporciona um polímero contendo ciclodextrina linear obtido pelo referido processo. A presente invenção proporciona também uma preparação farmacêutica compreendendo a referida ciclodextrina linear contendo um polímero ou um éster farmaceuticamente aceitável, um seu sal ou hidrato, e um excipiente 4 farmacêutico. Os compostos intermediários úteis na síntese do referido polímero contendo ciclodextrina linear são também fornecidos.
Mais geralmente, a presente invenção refere-se a novas composições de conjugados poliméricos definidos como materiais poliméricos ligados por covalência a agentes terapêuticos/bioativos, tais como veículos para o fornecimento de agentes terapêuticos. Num aspecto, a presente invenção propõe conjugados poliméricos hidrossolúveis, biocompatíveis, compreendendo um polímero biocompatível hidrossolúvel ligado a porções bioativas por meio de ligações que são clivadas em condições biológicas para a libertação de porções bioativas. Em determinadas tais modalidades, o polímero compreende porções cíclicas que se alternam com porções de ligante que conectam as estruturas cíclicas, isto é, formando polímeros lineares ou ramificados, de preferência polímeros lineares. 0 polímero pode ser um policátion, poliânion, ou um polímero não iônico. 0 agente bioativo, que pode ser um agente terapêutico, um agente diagnóstico ou um adjuvante, constitui de preferência, até pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ou até mesmo 35% em peso do conjugado. Em determinadas modalidades, a taxa de libertação do medicamento depende principalmente da taxa de hidrólise. Em determinadas outras modalidades, a taxa de libertação do medicamento depende principalmente da clivagem enzimática. A presente invenção propõe compostos poliméricos contendo ciclodextrina para emprego no fornecimento de medicamento destes agentes terapêuticos. A invenção também propõe compostos para emprego no fornecimento controlado de 5 medicamento que sejam capazes de liberar um agente terapêutico a uma taxa direcionada, previsível e controlada.
Consequentemente, um aspecto da presente invenção consiste em um conjugado polimérico compreendendo porção de ciclodextrina, um agente e um agente opcional de ligante de alve j amento. 0 polímero pode ser de cadeia reta ou ramificada, e pode ser formado por meio de policondensação de monómeros contendo ciclodextrina, copolimerização entre um ou mais monómeros contendo ciclodextrina e um ou mais comonómeros que não contém porções ciclodextrina. Além disso, a presente invenção também propõe polímeros contendo ciclodextrina formados por enxerto de porções ciclodextrina em um polímero já formado. As porções ciclodextrina propostas pela presente invenção incluem, sem limitação, ciclodextrinas α, β e γ e suas formas oxidadas. Dependendo da relação medicamento/polímero desejada, o agente terapêutico pode ser ligado a um monómero por meio de um ligante opcional antes da etapa de polimerização ou pode ser subsequentemente enxertado no polímero por meio de um ligante opcional. De modo análogo, o ligante de alvejamento pode ser ligado a um monómero por meio de um ligante opcional antes da etapa de polimerização, ou pode ser subsequentemente enxertado ao polímero por meio de um ligante opcional, ou pode ser ligado ao polímero como um complexo de inclusão ou por interações hospedeiro-hóspede.
Para ilustrar mais detalhadamente, uma modalidade da invenção consiste num composto polimérico representado pela Fórmula I: 6 (çD) rn
Li n (I) em que P representa uma cadeia polimérica reta ou ramificada; CD representa uma porção cíclica tal como uma porção ciclodextrina;
Li, L2 e L3, a cada ocorrência independentemente podem estar ausentes ou representar um grupo ligante; D, independentemente para cada ocorrência, representa um agente terapêutico ou um promedicamento seu; T, independentemente a cada ocorrência, representa um ligante de alvejamento ou seu precursor; a, m e v, independentemente para cada ocorrência, representam números inteiros na faixa de 1 a 10 (preferencialmente de 1 a 8, de 1 a 5, ou mesmo, de 1 a 3); b representa um número inteiro na faixa de 1 a aproximadamente 30000 (preferencialmente <25000, <20000, <15000, <10000, <5000, <1000, <500, <100, <50, <25, <10, ou mesmo, <5) ; e n e w, independentemente para cada ocorrência, representam um número inteiro na faixa de 0 a 30000 (preferencialmente <25000, <20000, <15000, <10000, <5000, <1000, <500, <100, <50, <25, <10, ou mesmo, <5), 7 em que a cadeia polimérica compreende porções de ciclodextrina ou n é pelo menos 1.
Outro aspecto da presente descrição é um composto representado pela Fórmula II:
0 GD em que P representa uma unidade de monómero de um polímero; T, independentemente em cada ocorrência, representa um ligando alvo ou um seu precursor; L6í L7, Lg, L9í e L10, independentemente em cada ocorrência, pode estar ausente ou representa um grupo ligante; CD, independentemente em cada ocorrência, representa um grupo ciclico tal como um radical de ciclodextrina ou um seu derivado; D, independentemente em cada ocorrência, representa um agente terapêutico ou uma sua forma de pró-fármaco; 8 m, de forma independente, em cada ocorrência, representa um número inteiro no intervalo de 1 a 10 (de preferência 1 a 8, 1 a 5, ou mesmo de 1 a 3); o representa um número inteiro no intervalo de 1 a cerca de 30000 (de preferência <25000 <20000 <15000 <10000 <5000 <1000, <500, <100, <50, <25, <10, ou mesmo <5); e p, n e q, independentemente em cada ocorrência, representa um número inteiro no intervalo de 0 a 10 (de preferência de 0 a 8, 0-5, 0-3, ou mesmo cerca de 0 a 2), em que CD e D estão, de preferência, presente em cada um de pelo menos um local (de preferência pelo menos 5, 10, 25, 50 ou mesmo 100> locais) no composto.
Outro exemplo da presente descrição é um composto representado pela Fórmula III:
CD representa um radical ciclico tal como um radical de ciclodextrina ou um seu derivado; 9 L4, I5, L6, e L7, independentemente em cada ocorrência, pode estar ausente ou representar um grupo ligante;
De D', independentemente em cada ocorrência, representa o mesmo ou diferente agente terapêutico, ou pró-fármacos dos mesmos; T e Τ', independentemente em cada ocorrência, representa o mesmo ligando alvo ou diferente, ou um seu precursor; f e y, independentemente, para cada ocorrência, representa um número inteiro no intervalo de 1 a 10 (de preferência 1 a 8, 1 a 5, ou mesmo de 1 a 3) ; g, e z, independentemente em cada ocorrência, representa um número inteiro na gama de 0 e 10 (de preferência de 0 a 8, de 0 a 5, 0 a 3, ou mesmo de 0 a cerca de 2); e h representa um número inteiro no intervalo de 1 e 30000 (de preferência <25000 <20000 <15000 <10000 <5000 <1000, <500, <100, <50, <25, <10, ou mesmo <5), em que pelo menos uma ocorrência (e, de preferência, pelo menos, 5, 10, ou mesmo pelo menos 20, 50 ou> 100 ocorrências) de g representa um número inteiro maior do que 0.
Um outro aspecto da presente invenção consiste num método para a preparação dos conjugados poliméricos terapêuticos contendo ciclodextrina descritos aqui.
Um outro aspecto da presente invenção consiste em uma composição farmacêutica compreendendo um composto ou polímero conforme descrito acima. 10
Um outro aspecto da presente invenção consiste numa forma de dosagem farmacêutica compreendendo um conjugado polimérico conforme descrito agui.
Um outro aspecto da presente invenção consiste num método para o tratamento de um paciente gue compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de qualquer um dos conjugados poliméricos descritos aqui.
Um outro aspecto da presente invenção consiste num método de se conduzir um negócio farmacêutico compreendendo a fabricação, concessão de licença ou distribuição de kits contendo qualquer um dos conjugados poliméricos descritos aqui ou relacionados com eles.
Em determinadas modalidades, estes conjugados poliméricos terapêuticos melhoram a estabilidade e/ou solubilidade de medicamento do agente terapêutico quando usados in vivo. Além disso, selecionando-se de uma variedade de grupos ligante, os conjugados poliméricos apresentam processos para a libertação controlada dos agentes terapêuticos e/ou bioativos, ou melhoram a segurança in vivo e/ou a eficácia terapêutica do agente terapêutico/bioativo. Em determinadas modalidades, os conjugados poliméricos são bioerodiveis ou biodegradáveis.
Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra as estratégias para se fazer variar os conjugados poliméricos para modular as suas características. A Figura 2 demonstra o efeito do comprimento da amarração do peptideo sobre a taxa de libertação do medicamento para o polímero de CD carregado de medicamento. 11 A Figura 3 apresenta o efeito que a amarração da camptotecina tem sobre a intensificação da estabilidade da camptotecina, tal como na inibição da abertura do anel de lactona, por exemplo. A Figura 4 mostra os estudos de abertura do anel de lactona no tampão KH2PO4 de pH 7,4. A Figura 5a e 5b mostra o controlo de polimerização por ajuste do tempo de polimerização. A Figura 6 ilustra a libertação de CPT de HG6 e de HGGG6 a 37°C depois de 24 h em soluções tampão com pHs variando de 1,1 a 13,1. A Figura 7 mostra a análise por HPLC da degradação do
Polimero CD-BisCys-SS-Peg3400. A Figura 8 mostra a curva do crescimento tumoral como uma função de tempo para D5W, CPT, irinotecan, LGGG10 à sua dose máxima não tóxica testada (18 mg de CPT/kg) e os outros três conjugados com polimero de alto peso molecular (HGGG6, HG6, HGGG10) nas suas MTDs em ratos xeno-enxertados. A Figura 9 apresenta as curvas de crescimento tumoral médio para HGGG6, HG6 e HGGG10 em ratos xeno-enxertados. A Figura 10 apresenta as curvas do crescimento tumoral médio para LGGG10 e HGGG10 cada um dosado a 9 mg de CPT/kg em ratos xeno-enxertados. A Figura 11 apresenta as perdas em peso corporal médio (MBW) como uma função do tempo lançado para D5W, CPT, irinotecan e os três conjugados contendo polimero de alto peso molecular nas suas MTDs em ratos xeno-enxertados. A Figura 12 mostra a correlação da concentração de CPT (ng/mg de tecido) para o tamanho de tumor (em mg) em ratos xeno-enxertados. 12
Descrição detalhada da invenção I. Visão Geral A presente invenção refere-se a novas composições de compostos poliméricos terapêuticos contendo ciclodextrina projetados para o fornecimento de medicamento de agentes terapêuticos. Em determinadas modalidades, estes polímeros contendo ciclodextrina melhoram a estabilidade e/ou solubilidade do medicamento e/ou reduzem a toxicidade, e/ou melhoram a eficácia do agente terapêutico de pequena molécula quando usado in vivo. Em determinadas modalidades, os polímeros podem ser usados para o fornecimento de agentes terapêuticos tais como camptotecina, taxol, doxorubicina e anfotericina. Além disso, selecionando-se de uma variedade de grupos de ligante, e/ou ligantes de alvejamento, a taxa de libertação do medicamento a partir dos polímeros pode ser atenuada para um fornecimento controlado. A invenção também se refere a processos de tratamento de pacientes com as composições terapêuticas descritas no presente. A invenção além disso refere-se a processos para a condução de um negócio farmacêutico compreendendo a fabricação, concessão de licença ou distribuição de kits contendo os compostos poliméricos descritos aqui.
Em linhas mais gerais, a presente invenção propõe conjugados poliméricos biocompatíveis hidrossolúveis compreendendo um polímero biocompatível hidrossolúvel ligado por covalência a porções bioativadas através de ligações que são clivadas em condições biológicas para liberar as porções bioativas. Em determinadas tais modalidades, o polímero compreende porções cíclicas alternando com porções de ligante que conectam as estruturas cíclicas, em polímeros lineares ou ramificados, 13 por exemplo, de preferência, polímeros lineares. As porções cíclicas podem ser quaisquer estruturas cíclicas adequadas, tais como ciclodextrinas, éteres de coroa (18-coroa-6, 15-coroa-5, 12-coroa-4 etc., por exemplo), oligopeptídeos cíclicos (compreendendo de 5 a 10 resíduos de aminoácidos, por exemplo), criptandos ou criptatos (criptando [2,2,2], criptando-2,1,1, e seus complexos, por exemplo), calixarenes ou cavitandos, ou qualquer combinação deles. É preferível que a estrutura cíclica seja (ou seja modificada para ser) hidrossolúvel. Em determinadas modalidades, onde se deseja um polímero linear, por exemplo, a estrutura cíclica é selecionada d modo tal que em condições de polimerização, exatamente duas porções de cada estrutura cíclica sejam reativas com as porções de ligante, de modo tal que o polímero resultante compreende (ou consista essencial em) uma série alternante de porções cíclicas e porções de ligante, tal como pelo menos quatro de cada tipo de porção. As porções cíclicas difuncionalizadas adequadas incluem muitas das que são disponíveis no comércio e/ou fáceis de serem preparadas empregando-se protocolos publicados. Em determinadas modalidades, os conjugados são hidrossolúveis até uma concentração de pelo menos 0,1 g/mL, de preferência de pelo menos 0,25 g/mL. O polímero pode ser um policátion, polianião, ou um polímero não iónico. Um polímero policatiónico ou polianiónico tem pelo menos um sítio que tem uma carga positiva ou negativa, respectivamente. Em determinadas tais modalidades, pelo menos uma da porção de ligante e da porção cíclica compreende um tal sítio de modo que cada ocorrência dessa porção inclui um sítio com carga. 14 0 agente bioativo, que pode ser um agente terapêutico, um agente diagnóstico ou um adjuvante (tal como um rádio-sensibilizador, ou um composto que carece de uma atividade significativa quando administrados sozinho, mas que potencializa a atividade de um outro agente terapêutico), constitui, de preferência, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou mesmo 35% em peso do conjugado. Nas modalidades preferidas, a administração do polimero a um paciente resulta na libertação do agente bioativo durante um período de pelo menos 6 horas, de preferência pelo menos 12 ou 18 horas. O agente pode ser liberado, por exemplo, durante um período de tempo que varia de 6 horas a um mês, de 6 horas a duas semanas, de 6 horas a 3 dias etc. Em determinadas modalidades, a taxa de libertação do medicamento depende principalmente na taxa de hidrólise (ao contrário da clivagem enzimática), a taxa de libertação sofre alteração, por exemplo, de menos de um fator de 5, de preferência de menos de um fator de 2, na presença de enzimas hidrolíticas. Em outras modalidades, a taxa de libertação do medicamento pode depender principalmente da taxa de clivagem enzimática.
Os conjugados poliméricos da presente invenção podem ser úteis para melhorar a solubilidade e/ou estabilidade de um agente bioativo/terapêutico, reduzir as interações de medicamento a medicamento, reduzir interações com elementos sanguíneos inclusive de proteínas plasmáticas, reduzir ou eliminar a imunogenicidade, proteger o agente do metabolismo, modular a cinética de libertação do medicamento, melhorar o tempo de circulação, melhorar a meia vida do medicamento (no soro, ou em tecidos selecionados, tais como tumores, por exemplo), atenuar toxicidade, melhorar a eficácia, normalizar o metabolismo do medicamento em pacientes de diferentes espécies, etnicidades, e/ou raças 15 e/ou proporcionar um fornecimento direcionado a células ou a tecidos específicos. Os compostos de solubilidade precária e/ou tóxicos podem se benéficos especialmente da incorporação a compostos poliméricos da invenção 11. Definições (a) Termos Gerais
Um "adjuvante", conforme o termo é usado no presente, é um composto que tem pouco ou nenhum valor terapêutico próprio, mas que aumenta a eficácia de um agente terapêutico. Os adjuvantes exemplares incluem rádio-sensibilizadores, agentes que intensificam a transfecção (tais como cloroquina e seus análogos), agentes quimiotáticos e quimioatraentes, peptideos que modulam a adesão celular e/ou a mobilidade celular, agentes permeabilizadores de células, inibidores de resistência multi-medicamentosa e/ou bombas de efluxo etc. 0 termo "agonista", conforme empregado no presente, se refere a um agente que simula ou supra-regula (potencializa ou suplementa, por exemplo) a bioatividade de uma proteina de interesse ou um agente que facilita ou promove (potencializa ou suplementa, por exemplo) uma interação entre polipeptideos ou entre um polipeptídeo e uma outra molécula (um esteróide, hormônio, ácidos nucléicos, moléculas pequenas etc., por exemplo). Um agonista pode ser uma proteina do tipo nativo ou derivado seu tendo pelo menos uma bioatividade da proteina do tipo nativo. Um agonista pode também ser uma molécula pequena que supra-regula a expressão de um gene ou que aumenta pelo menos uma bioatividade de uma proteina. Um agonista pode também ser uma proteina ou molécula pequena que aumenta a interação de 16 um polipeptídeo de interesse com uma outra molécula, um peptídeo alvo ou ácido nucléico, por exemplo. "Antagonista", conforme empregado no presente, se refere a um agente que infra-regula (suprime ou inibe, por exemplo) a bioatividade de uma proteína de interesse ou um agente que inibe/suprime ou reduz (desestabiliza ou reduz, por exemplo) a interação entre polipeptídeos ou outras moléculas (esteróides, hormônios, ácidos nucléicos, por exemplo, etc.). Um antagonista pode também ser um composto que infra-regula a expressão de um gene de interesse ou que reduz a quantidade da proteína do tipo nativo presente. Um antagonista pode também ser uma proteína ou molécula pequena que reduz ou inibe a interação de um polipeptídeos de interesse com uma outra molécula, um peptídeo alvo ou ácido nucléico, por exemplo.
Os termos "polímero biocompatível" e "biocompatibilidade" quando usados em conexão com polímeros são reconhecidos na técnica. Os polímeros biocompatíveis incluem, por exemplo, polímeros que não são, nem eles mesmos tóxicos ao hospedeiro (m animal ou ser humano, por exemplo) nem se degradam (se o polímero se degradar) a uma taxa que produza subunidades monoméricas ou oligoméricas ou outros produtos secundários a concentrações tóxicas no hospedeiro. Em determinadas modalidades da presente invenção, a biodegradação geralmente abrange a degradação do polímero em um organismo, tal como em suas subunidades monoméricas, que pode ser conhecido como sendo efetivamente não tóxico. Os produtos oligoméricos intermediários que resultam de tal degradação podem ter propriedades toxicológicas diferentes, no entanto, ou a biodegradação pode abranger a oxidação ou outras reações bioquímicas que geram moléculas diferentes das subunidades 17 monoméricas do polímero. Consequentemente, em determinadas modalidades, a toxicologia de um polímero biodegradável destinado a uso in vivo, tal como implantação ou injeção em um paciente, podem ser determinadas depois de uma ou mais análises de toxicidades. Não é necessário que qualquer composição objeto da invenção tenha uma pureza de 100% para ser considerada biocompatível. Portanto, uma composição objeto da presente invenção pode compreender 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, ou mesmo menos, dos polímeros biocompatíveis, incluindo,por exemplo, polímeros e outros materiais e excipientes descritos no presente, continuando a ser biocompatível.
Para se determinar se um polímero ou outro material é biocompatível, pode ser necessário se conduzir uma análise da toxicidade. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Um exemplo de tal ensaio pode ser conduzido com células vivas de carcinoma, tais como células tumorais GT3TKB do seguinte modo: a amostra é degradada em NaOH a 1M a 37°C até ser observada uma degradação completa. A solução é então neutralizada com HC1 a 1M. Colocam-se aproximadamente 200 pL de diversas concentrações dos produtos de amostra degradada em placas de cultura tecidual de 96 cavidades e semeadas com células humanas de carcinoma gástrico (GT3TKB) a uma densidade de 104/cavidade. Os produtos da amostra degradada são incubados com as células GT3TKB durante 48 horas. Os resultados do ensaio podem ser lançados em gráfico como% de crescimento relativo pela concentração da amostra degradada na cavidade de cultura tecidual. Além disso, polímeros e preparados da presente invenção podem também ser avaliados por estes in vivo bem conhecidos, tais como implantações subcutâneas em ratos para confirmar que eles não produzem 18 níveis significativos de irritação ou inflamação nos sítios de implantação subcutânea. 0 termo "biodegradável" é reconhecido na técnica, e inclui polímeros, composições e preparados, tais como os descritos no presente, que são destinados a se degradar durante do uso. Os polímeros biodegradáveis tipicamente diferente de polímeros não biodegradáveis pelo fato de que os primeiros podem ser degradados durante o uso. Em determinadas modalidades, tal uso abrange o uso in vivo, tal como terapia in vivo e em outras determinadas modalidades, tal uso abrange o uso in vitro. Em geral, a degradação que pode ser atribuída à biodegradabilidade abrange a degradação de um polímero biodegradável nas suas subunidades componentes, ou digestão, por um processo bioquímico, por exemplo, do polímero em subunidades menores não poliméricas. Em determinadas modalidades, dois tipos diferentes de biodegradação podem ser geralmente identificados. Um tipo de biodegradação, por exemplo, pode abranger a clivagem de ligações (quer covalente ou outras) na estrutura polimérica. Em tal biodegradação, tipicamente resultam monómeros e oligômeros e ainda mais tipicamente tal biodegradação ocorre por clivagem de uma ligação que conecta uma ou mais das subunidades de um polímero. Por outro lado, um outro tipo de biodegradação pode abranger a clivagem de uma ligação (quer covalente ou outra) interna à cadeia lateral ou que conecta uma cadeia lateral à estrutura polimérica. Um agente terapêutico, por exemplo ou outra porção química ligada como uma cadeia lateral à estrutura polimérica pode ser liberada por biodegradação. Em determinadas modalidades, um ou outro ou os dois tipos gerais de biodegradação podem ocorrer durante do uso de um polímero. 19
Conforme empregado no presente, o termo "biodegradação" abrange os dois tipos gerais de biodegradaçao. A taxa de degradação de um polímero biodegradável frequente-mente depende em parte de uma variedade de fatores inclusive da identidade química da ligação responsável por qualquer degradação, do peso molecular, cristalinidade, bioestabili-dade e do grau de reticulação de tal polímero, das características físicas (formato e tamanho, por exemplo) de um implante e do modo e local da administração. Quanto maior for o peso molecular, por exemplo, maior o grau de cristalinidade e/ou quanto maior for a bioestabilidade, a biodegradação de qualquer polímero biodegradável é geralmente mais lenta. 0 termo "biodegradável" é destinado a abranger materiais e processos também denominados "bioerodíveis".
Em determinadas modalidades em que o polímero biodegradável também tem um agente terapêutico ou um outro material associado com ele, a taxa de biodegradação de tal polímero pode ser caracterizada por uma taxa de libertação de tais materiais. Em tais circunstâncias, a taxa de biodegradação pode depender não somente da identidade química e das características físicas do polímero, mas também da identidade do(s) material (ais) incorporados a ele. A degradação das composições objeto da presente invenção inclui não somente a clivagem das ligações intramoleculares, por oxidação e/ou por hidrólise, por exemplo, mas também a destruição de ligações intermoleculares, tais como a dissociação de complexos hospedeiro/hóspede por formação de complexo competitivo com hospedeiros estranhos de inclusão.
Em determinadas modalidades, os preparados poliméricos da presente invenção se biodegradam dentro de um período que é 20 aceitável na aplicação desejada. Em determinadas modalidades, tal como em terapia in vivo, tal degradação corre em um período que é geralmente inferior a aproximadamente cinco anos, um ano, seis meses, três meses, um mês, quinze dias, cinco dias, três dias, ou mesmo um dia por exposição a uma solução fisiológica com m pH entre 6 e 8 tendo uma temperatura entre 25 e 37°C. Em outras modalidades, o polímero se degrada dentro de um período entre aproximadamente uma hora e diversas semanas dependendo da aplicação desejada.
Conforme empregue no presente, o termo "bioerodível" se refere a polímeros que fornecem quantidades efetivas sustentadas de agente terapêutico ao tecido alvo durante períodos de tempo extensos desejados. Assim, um polímero de acordo com a invenção no ambiente biológico do tecido do hospedeiro e semelhantes, em um aspecto é submetido a enzimas hidrolíticas e espécies oxidantes nos termos da resposta inflamatória do hospedeiro, e proporcio-nalmente a ela. Isto resulta na libertação do agente terapêutico por meio da quebra das ligações por covalência. Assim, em determinadas modalidades, os materiais da invenção utilizam o processo de reparação de cicatrização do próprio mamífero sendo degradados por ele, conforme já descrito no presente.
Os polímeros biodegradáveis de ácido polilático, de ácido poliglicólico e o copolímero de acido polilático-glicólico (PLGA), já foram investigados exaustivamente para a preparação de nanopartículas. Estes polímeros são poliésteres que, depois de implantados no corpo, sofrem uma simples hidrólise. Os produtos de tal hidrólise são porções biologicamente compatíveis e metabolizáveis (em ácido lático e ácido glicólico, por exemplo), que são eventualmente 21 removidas do corpo pelo ciclo do ácido cítrico. Os produtos da biodegradação dos polímeros são formados a uma taxa muito lenta, e portanto não afetam a função celular normal. Diversos estudos com implantes com estes polímeros provaram ser seguros nas aplicações de fornecimento de medicamento, usados na forma de matrizes, micro-esferas, materiais de implante ósseo, suturas cirúrgicas e também nas aplicações contraceptivas para efeitos a longo prazo, estes polímeros são também usados como materiais de enxerto para órgãos artificiais e recentemente como membranas de base nas investigações de engenharia de tecidos. Nature Med. 824-826 (1996) . Assim estes polímeros foram testados pelo tempo em diversas aplicações e provaram ser seguros para uso humano. 0 que é muito importante é que estes polímeros são aprovados pelo FDA para uso humano.
Quando os polímeros são usados para o fornecimento de agentes farmacologicamente ativos in vivo, é essencial que os polímeros propriamente ditos sejam não tóxicos e que eles se degradem em produtos de degradação não tóxicos à medida que o polímero é erodido pelos fluidos corporais. Muitos polímeros biodegradáveis sintéticos, no entanto, produzem oligômeros e monómeros depois da erosão in vivo que interagem de modo adverso com o tecido circundante. D. F. Williams, J. Mater. Sei. 1233 (1982). Para se minimizar a toxicidade do veículo polimérico intacto e dos seus produtos de degradação, foram projetados polímeros baseados nos metabólitos que ocorrem na natureza. É provável que os exemplos mais exaustivamente estudados de tais polímeros sejam os poliésteres derivados do ácido lático ou do ácido glicólico e poliamidas derivadas de aminoácidos. 22
Uma série de polímeros bioerodíveis ou biodegra-dáveis são conhecidos e usados para a libertação controlada de substâncias farmacêuticas. Tais polímeros são descritos, por exemplo, nas patente U.S. N° 4.291.013; patente U.S. N 4.347.234 ; patente U.S. N° 4.525.495; patente U.S. N 4.570.629 ; patente U.S. N° 4.572.832; patente U.S. N 4.587.268 ; patente U.S. N° 4.638.045; patente U.S. N 4.675.381 ; patente U.S. N° 4.745.160; e patente U.S. N 5.219.980
Uma ligação bio-hidrolisável (éster, amida, carbonato, carbamatos ou imida, por exemplo) refere-se a uma ligação que é clivada (um éster é clivado para formar uma hidroxila e um ácido carboxílico, por exemplo) em condições fisiológica. As condições fisiológicas incluem os ambientes ácidos e básicos do trato digestivo (estômago, intestinos etc., por exemplo), o ambiente ácido de um tumor, clivagem enzimática, metabolismo, e outros processos biológicos, e se refere, de preferência, a condições fisiológicas em um vertebrado, tal como num mamífero.
Conforme empregado no presente, "comonómero precursor de A", "ligante", "grupo ligante" e "porção ligante" refere-se a qualquer composto de cadeia reta ou ramificada, simétrico ou assimétrico que depois de reação com um precursor monomérico de ciclodextrina ou de outra porção cíclica adequada liga duas tais porções entre si. Em determinadas modalidades, um comonómero precursor de A é um composto contendo pelo menos dois grupos funcionais através dos quais pode se obter a reação e assim a ligação dos monómeros de ciclodextrina. Exemplos de grupos funcionais que podem ser iguais ou diferentes, terminais ou interno, de cada precursor de comonómero A incluem, sem limitação, grupos amino, ácido, 23 imidazol, hidroxila, tio, acil haleto, -C=C-, ou -C=C- ou derivados seus. Em modalidades preferidas, os dois grupos funcionais são iguais e estão localizados nos terminais do comonómero. Em determinadas modalidades, um precursor do comonómero A contém um ou mais grupos pendentes tendo pelo menos um grupo funcional através do gual pode ser produzida a reação e assim a ligação do agente terapêutico ou ligante de alvejamento, ou possa ser produzida a polimerização ramificada. Exemplos de grupos funcionais, que podem ser iguais ou diferentes, terminais ou internos de cada grupo pendente de precursor do comonómero A incluem, sem limitação, grupos amino, ácido, imidazol, hidroxila, tiol, acil haleto etileno e etino e seus derivados. Em determinadas modalidades, o grupo pendente é um grupo alquila C1-C10 (de preferência Ci-C6) (não) substituído de cadeia ramificada, cíclico ou de cadeia reta, ou arilalquila contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos, tais como N, 0, S, no interior da cadeia ou do anel.
Depois da copolimerização de um precursor de comonómero A com um precursor monomérico de ciclodextrina, podendo dois monómeros de ciclodextrina ser ligados entre si ligando-se o lado de hidroxila primário de um monómero de ciclodextrina com um lado de hidroxila primário de um outro monómero de ciclodextrina, ligando-se o lado de hidroxila secundário de um monómero de ciclodextrina com o lado de hidroxila secundário de um outro monómero de ciclodextrina, ou ligando-se o lado de hidroxila primário de um monómero de ciclodextrina com o lado de hidroxila secundário de um outro monómero de ciclodextrina. Consequentemente, podem existir combinações de tais ligações no copolímero final. Tanto o precursor do comonómero A como o comonómero A do copolímero final podem ser neutros, catiônicos (contendo, por exemplo, 24 grupos protonados tais como, grupos de amónio quaternário, por exemplo) ou aniônicos (contendo, por exemplo, grupos desprotonados, tais como por exemplo, sulfato, fosfato, borato ou carboxilato) . A carga do comonómero A do copolimero pode ser ajustada ajustando-se as condições de pH. Exemplos de precursores de comonómero A adequados incluem, sem limitação, succinimida (ditiobis (propionato de succinimidila) DSP, e suberato de dissucinimidila (DSS), glutamatos e aspartatos, por exemplo).
Os polímeros contendo ciclodextrina da presente invenção podem ser lineares, ramificados ou enxertados. Conforme empregado no presente, o termo "polímero linear contendo ciclodextrina" se refere a um polímero que compreende moléculas de ciclodextrinas (α, β, ou γ) o seus derivados que são inseridos no interior de uma cadeia polimérica. Conforme empregado no presente, o termo "polímero enxertado contendo ciclodextrina" se refere a um polímero que compreende moléculas de ciclodextrina (α, β ou γ) ou derivados seus que são pendentes da cadeia polimérica. 0 termo "polímero de enxertia" conforme empregado no presente, se refere a uma molécula de polímero que tem ligadas porções adicionais em forma de grupos pendentes ao longo de um a estrutura polimérica. 0 termo "polimerização de enxertia" indica uma polimerização em que uma cadeia lateral é enxertada em uma cadeia polimérica, consistindo tal cadeia lateral em um ou diversos outros monómeros. As propriedades do copolimero de enxerto obtido tais como, por exemplo, solubilidade, ponto de fusão, absorção de água, umectabilidade, propriedades mecânica, comportamento de adsorção etc, se afastam mais ou menos acentuadamente das do polímero inicial como função do tipo e quantidade dos monómeros enxertados. 0 termo "relação de enxertia", 25 conforme empregado no presente, significa a porcentagem em peso da quantidade dos monómeros enxertados com base no peso do polimero. Conforme empregado no presente, um polímero ramificado contendo ciclodextrina se refere a uma estrutura polimérica com uma multiplicidade de pontos de ramificação, cada ponto de ramificação sendo um ponto de partida de uma outra linha da estrutura polimérica, podendo cada seção da estrutura polimérica ter uma multiplicidade de moléculas de ciclodextrina (α, β ou γ) , ou derivados seus, inseridos na cadeia ou enxertados nela. 0 termo "porção ciclodextrina" refere-se a molécula de ciclodextrina (α, β ou γ) ou derivados seus, que podem se encontrar na sua forma oxidada ou reduzida. As porções de ciclodextrina podem compreender ligantes opcionais. Os agentes terapêuticos opcionais e/ou ligantes de alvejamento podem ser ainda ligados a estas porções por meio de um ligante opcional. A ligação pode ser covalente (opcionalmente por meio de ligações bio-hidrolisáveis, como ésteres, amidas, carbamatos e carbonatos, por exemplo) ou podem ser um complexo hospedeiro-hóspede entre o derivado de ciclodextrina e o agente terapêutico e/ou ligante de alvejamento ou os ligantes opcionais de cada um. As porções ciclodextrina podem incluir ainda um ou mais porções carboidrato, de preferência simples porções de carboidrato tais como galactose, ligadas ao núcleo cíclico, quer diretamente (isto é, por meio de uma ligação carboidrato) ou por meio de um grupo ligante. 0 termo "ED50" significa a dose de um medicamento que produz 50% da sua resposta ou efeito máximo. 26
Uma "quantidade efetiva" de um composto objeto da presente invenção, n tocante ao processo da presente invenção de tratamento, se refere a uma quantidade do agente terapêutico em um preparado que, quando aplicado como parte de um regime de dosagem desejado proporciona um beneficio de acordo com os padrões clinicamente aceitáveis para o tratamento ou a profilaxia de um distúrbio especifico. 0 termo "provedores de cuidados de saúde" se refere a indivíduos ou organizações que proporcionam serviços de cuidados de saúda a uma pessoa comunidade etc. Exemplos de "provedores de cuidados de saúde" incluem médicos, hospitais, comunidades de idosos sob cuidados contínuos, instalações autorizadas de cuidados, instalações de cuidados subagudos, clínicas, clínicas de múltiplas especialidades, centros ambulatoriais autónomos, agência de saúde doméstica e HMOs. "Instrução(ões)", conforme empregue no presente, significa documentos descrevendo materiais e metodologias relevantes referentes a um kit. Estes materiais podem incluir qualquer combinação das seguintes: informações sobre antecedentes, lista de componentes e informação sobre a sua disponibilidade (informações sobre a sua aquisição etc) , protocolos sucintos ou detalhados para o emprego de kit, resolução de problemas, referências, suporte técnico e qualquer outro documento correlato. As instruções podem ser fornecidas juntamente com o kit ou como um componente membro separado, quer na forma dd papel ou em uma forma eletrónica que pode ser fornecida em dispositivo de memória que pode ser lido em computador ou ser baixado de um site da Internet, ou em forma de uma apresentação gravada. As 27 instruções podem compreender um ou mais documentos e pressupõe a inclusão de atualizações futuras. "Kit", conforme empregue no presente, significa uma coleção de pelo menos dois componentes constituindo o kit. Em conjunto, os componentes constituem uma unidade funcional para uma finalidade dada. Os componentes membros individuais podem ser acondicionados fisicamente e conjunto ou separadamente. Um kit compreendendo uma instrução para o emprego do kit, por exemplo, pode ou não incluir fisicamente a instrução com outros componentes individuais. Em vez disso, a instrução pode ser fornecida como um componente separado,d quer na forma de papel ou em uma forma eletrónica que pode ser fornecida em um dispositivo de memória que pode ser lido em computador ou baixado de um site da Internet, ou em forma de uma apresentação gravada. 0 termo "LD50" significa a dose de um medicamento que é letal em 50% de pacientes de teste.
Um "paciente" ou "sujeito" a ser tratado pelo processo da presente invenção pode significar tanto um paciente humano como um não humano.
As "polimerizações" da presente invenção incluem mecanismos radicais, aniônicos, e catiônicos, assim como reações de moléculas bifuncionais (análogas à formação de náilon, fazendo-se reagir moléculas, por exemplo, cada uma das quais porta duas ou mais porções reativas diferentes que reagem entre si (mas, de preferência, são desencorajadas de reagir intramolecularmente por restrições estéricas, conformacionais ou outras), ou fazendo-se reagir dois ou mais compostos diferentes, portando cada composto duas ou 28 mais porções reativas que reagem somente com as porções reativas de compostos diferentes (isto é, intermolecular-mente)), assim como polimerizações catalisadas por metal tais como metátese de olefinas e outras reações de polimerização conhecidas dos versados na técnica. 0 termo "profilático ou terapêutico" tratamento é reconhecido na técnica e inclui a administração ao hospedeiro de um ou mais das composições da presente invenção. Se ele for administrado antes da manifestação clinica da condição indesejável (doença ou outro estado indesejável do animal hospedeiro, por exemplo) então o tratamento é profilático, isto é, ele protege o hospedeiro contra o desenvolvimento da condição indesejável, ao passo que se ele for administrado depois da manifestação da condição indesejável, o tratamento é terapêutico, (isto é, ele pretende diminuir, melhorar ou estabilizar a condição indesejável existente ou seus efeitos colaterais). 0 termo "prevenção" é reconhecido na técnica, e quando usado em relação com uma condição tal como recorrência local (dor, por exemplo) , uma doença tal como o câncer, um complexo de sindromes tais como insuficiência cardíaca ou qualquer outra condição médica, é bem conhecido na técnica, e inclui a administração de uma composição que reduz a frequência ou retardar o aparecimento de sintomas de uma condição médica em um paciente em comparação com um paciente que não recebe a composição. Assim, a prevenção do câncer inclui, por exemplo, a redução do número de tumores cancerosos detectáveis em uma população de pacientes que recebem um tratamento profilático em comparação com uma população de controlo sem tratamento, e/ou retarda o aparecimento de tumores cancerosos detectáveis em uma população tratada em 29 comparação com uma população de controlo sem tratamento, de uma quantidade estatisticamente e/ou clinicamente significativa, por exemplo. A prevenção de uma infecção inclui, por exemplo, a redução do número de diagnósticos da infecção em uma população tratada em comparação com uma população de controlo sem tratamento e/ou retardar o aparecimento de sintomas da infecção em uma população tratada em comparação com uma população de controlo sem tratamento. A prevenção de dor inclui, por exemplo, a redução da frequência ou alternativamente retardar as sensações dolorosas experimentadas por pacientes em uma população tratada em comparação com uma população de controlo sem tratamento.
Conforme empregue no presente, "agente terapêutico" inclui qualquer composto ou composição biologicamente ativo, sintético ou que ocorre na natureza ou composição de substância, que quando administrado a um organismo (humano ou animal não humano), induz um efeito desejado farmacológico, imunogênico e/ou fisiológico por meio de ação local e/ou sistémica. 0 termo portanto abrange aqueles compostos ou substâncias químicas tradicionalmente considerados como medicamentos, vacinas e produtos biofarma-cêuticos incluindo moléculas tais como proteínas, peptídeos, hormônios, ácidos nucléicos, construções genéticas e análogos. Mais especificamente, o ermo "agente terapêutico" inclui compostos ou composições para uso em todos as áreas terapêuticas principais incluindo, sem limitação, adjuvantes; antiinfecciosos tais como agentes antibióticos e antivirais; analgésicos e combinações analgésicas, agentes anoréxicos, antiinflamatórios, anti-epilépticos, anestésicos locais e gerais, hipnóticos, sedativos, agentes antipsicóticos, agentes neurolépticos, antidepressivos, ansioliticos, 30 antagonistas agentes bloqueadores de neurônios, anticolinér-gicos, e agentes colinomiméticos, agentes antimuscarínicos e muscarínicos, antiadrenérgicos, antiarrítmicos, agentes anti-hipertensivos, hormonas e nutrientes, antiartriticos, agentes antiasmáticos, anticonvulsivos, anti-histaminas, antinauseantes, antineoplásticos, antipruriticos, antipiréticos; antiespasmódicos, preparados cardiovasculares (inclusive bloqueadores de canais de cálcio, bloqueadores beta, beta agonistas e antiarrítmicos), anti-hipertensivos, diuréticos, vasodilatadores; estimulantes do sistema nervoso central; preparados para tosse e resfriados; descongestionantes; diagnósticos; hormônios; estimulantes de crescimento ósseo e inibidores de ressorção óssea; imunossupressores; relaxantes musculares; psico-estimulantes; sedativos; tranquilizantes; proteínas, peptídeos e fragmentos seus (quer ocorrendo na natureza, quer sintetizados quimicamente ou produzidos de modo recombinante); e moléculas de ácidos nucléicos (formas poliméricas de dois ou mais nucleotídeos, quer ribonucleotídeos (RNA) quer desóxi-ribonucleotídeos (DNA) inclusive moléculas tanto de duas fitas como de uma única fita, construções genéticas, vetores de expressão, moléculas anti-sento e análogos), moléculas pequenas (de doxorubicina, por exemplo) e outras macromoléculas biologicamente ativas tais como, por exemplo, proteínas e enzimas. 0 agente pode ser um agente biologicamente ativo usado em aplicações médica, inclusive veterinárias e em agricultura, tal como com plantas assim como em outras áreas. 0 termo agente terapêutico também inclui, sem limitação, medicamentos; vitaminas; suplementos minerais; substâncias usadas para o tratamento, prevenção, diagnóstico, cura ou mitigação de doença ou mal; ou substância que afeta a estrutura ou função do corpo; ou promedicamentos, que se 31 tornam biologicamente ativos ou mais ativos depois de terem sido colocados em um ambiente fisiológico predeterminado.
Conforme empregado no presente, o termo "baixa hidrossolubilidade" refere-se a composto não hidrossolúveis tendo uma solubilidade precária em água, isto é <5 mg/mL com um pH fisiológico (6,5-7,4). É preferível que sua hidrossolubilidade seja <1 mg/mL, sendo mais preferível <0,1 mg/mL. É desejável que o medicamento seja estável em água em forma de uma dispersão; caso contrário pode ser desejável uma forma liofilizada ou sólida secada por pulverização.
Exemplos de alguns medicamentos não hidrossolúveis preferidos incluem agentes imunossupressores tais como ciclosporinas inclusive ciclosporina (ciclosporina A) , agentes imunoativos, antivirais e agentes antifúngicos, agentes antineoplásicos, analgésicos e agentes antiinflama-tórios, antibióticos, antiepilépticos, anestésicos, hipnóticos, sedativos, agentes antipsicóticos, agentes neurolépticos, antidepressivos, ansiolíticos, agentes anticonvulsivos, antagonistas, agentes bloqueadores de neurônios, agentes anticolinérgicos e colinomiméticos, agentes antimuscarínicos e muscarínicos, antiadrenérgicos e antiarrítmicos, agentes anti-hipertensivos, hormônios e nutrientes. Uma descrição detalhada destes e de outros medicamentos adequados pode ser encontrada em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. edição, 1990,. Mack Publishing Co. Filadélfia, Pa. O termo "índice terapêutico" se refere ao índice terapêutico de um medicamento definido como LD50/ED50. 32
Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" de um composto, no tocante a um método de tratamento, se refere a uma quantidade do(s) composto(s) num preparado, que, quando administrado como parte de um regime de dosagem desejado (a um mamifero, de preferência a um humano), alivia um sintoma, melhora uma condição ou retarda o aparecimento de condições mórbidas de acordo com padrões clinicamente aceitáveis para o distúrbio ou condição a ser tratada ou para fins cosméticos, com uma relação beneficio/risco razoável, por exemplo, aplicável a qualquer tratamento médico.
Uma "dosagem diária terapeuticamente efetiva" de um composto, no tocante a um método de tratamento, se refere a uma quantidade do(s) composto(s) em um preparado que, quando administrado como parte de um regime de dosagem diária desejado (a um mamifero, de preferência a um ser humano) alivia um sintoma, melhora uma condição ou retarda o inicio de condições mórbidas de acordo com padrões clinicamente aceitáveis para o distúrbio ou condição a ser tratado ou para fins cosméticos, com uma relação beneficio/risco razoável, por exemplo, aplicável a qualquer tratamento médico. (b) Termos Químicos
Uma cadeia alifática compreende as classes de alquila, alquenila e alquinila, definidos abaixo. Uma cadeia alifática reta é limitada a radicais de cadeia de carbono sem ramificação. Conforme empregado no presente, o termo "grupo alifático" se refere a um grupo hidrocarboneto alifático de cadeia reta, cadeia ramificada ou cíclico e inclui grupos alifáticos saturados e insaturados, tais como um grupo alquila, um grupo alquenila e um grupo alquinila. 33
Alquila refere-se a um radical de cadeia de carbonos totalmente saturada ramificada ou sem ramificações tendo o número de átomos de carbono especificado ou até 30 átomos de carbono se não tiver sido feita nenhuma especificação. Alquila de 1 a 8 átomos de carbono, por exemplo, refere-se a radicais tais como metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila e octila e aqueles radicais que são isómeros posicionais destes radicais. Alquila de 10 a 30 átomos de carbono incluem decila, undecila, dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, hexadecila, heptadecila, octadecila, nonadecila, eicosila, heneicosila, docosila, tricosila e tetracosila. Em modalidades preferidas. Um alquila de cadeia reta ou de cadeia ramificada tem 30 ou menos átomos de carbono na sua estrutura (Ci_C30 para cadeias retas, C3-C30 para cadeias ramificadas, por exemplo), sendo mais preferível 20 ou menos. de modo análogo os cicloalquilas preferidos têm de 3-10 átomos de carbono na estrutura de anel, sendo mais preferível que tenham 5,6 ou 7 átomos de carbono na estrutura de anel.
Além disso, o termo "alquila" (ou "alquila inferior"), conforme usado em todo o relatório, exemplos e reivindicações destina-se a incluir tanto "alquilas não substituídos" como "alquilas substituídos", referindo-se os últimos a porções alquila que têm substituintes substituindo um hidrogénio em um ou mais carbonos da estrutura do hidrocarboneto.Tais substituintes podem incluir, por exemplo, um halogênio, um hidroxila, um carbonila (tal como um carboxila, um alcóxi-carbonila, um formila ou um acila), um tiocarbonila (tal como um tioéster, um tioacetato ou um tioformiato), um alcoxila, um fosforila, um fosfato, um fosfonato, um fosfinato, um amino, um amido um amidino, um 34 ciano, um nitro, uma sulfidrila, um alquiltio, um sulfato, um sulfonato, um sulfamoíla, um sulfonamida, um sulfonila, um heterociclila, um aralquila, ou uma porção aromática ou heteroaromática. Deve ser evidente aos versados na técnica que as porções substituídas na cadeia de hidrocarboneto podem ser por sua vez substituídos, se for adequado. Os substituintes de um alquila substituído, por exemplo, podem incluir formas substituídas e não substituídas de amino, azido, imino, amido fosforila (inclusive fosfonato e fosfinato), sulfonila (inclusive sulfato, sulfonamido, sulfamoíla e sulfonato) e grupos silila, assim como éteres, alquiltios, carbonilas (inclusive cetonas, aldeídos, carboxilatos e ésteres), -CF3, -CN e análogos. Alquilas substituídos exemplares são descritos abaixo. Os cicloalquilas podem ainda ser substituídos com alquilas, alquenilas, alcoxilas, alquiltios, aminoalquilas, alquilas substituídos com carbonila, -CF3, -CN e análogos. A não ser que o número de carbonos seja especificado em contrário, "alquila inferior" conforme empregado no presente, significa um grupo alquila, conforme definido acima, mas tendo de um a dez carbonos, sendo mais preferível de um a seis átomos de carbono na sua estrutura tal como metila, etila, n-propila, isopropil,a n-butil,a isobutila, sec-butila e terc-butila. De modo análogo "alquenila inferior" e "alquinila inferior" têm comprimentos de cadeia análogos. Em todo o pedido, os grupos alquila são alquilas inferiores. Em modalidades preferidas, um substituinte designado no presente como alquila é um alquila inferior. 0 termo "alquiltio" se refere a um grupo alquila, conforme definido acima, tendo um radical de enxofre ligado a ele. Nas modalidades preferidas, a porção "alquiltio" é 35 representada por um de - (S)-alquila, - (S)-alquenila, -(S)-alquinila e - (S) - (CH2)m-Ri, sendo m e Ri definidos abaixo). Os grupos alquiltio representativos incluem metiltio, etiltio e análogos.
Alquenila refere-se a qualquer radical de cadeia de carbono insaturado ramificado ou não ramificado tendo o número de átomos de carbono especificado ou até 26 átomos de carbono, se nenhum limite tiver sido especificado ao número de átomos de carbono; e tendo 1 ou mais ligações duplas no radical. Alquenila de 6 a 26 átomos de carbono é exemplificadas por hexenila, heptenila, octenila, nonenila, decenila, undecenila, dodenila, tridecenila, tetradecenila, pentadecenila, hexadecenila, heptadecenila, octadecenila, nonadecenila, icosenila, henicosenila, docosenila, tricosenila e tetracosenila, em suas diversas formas isoméricas, podendo a(s) ligação (ões) insaturada(s) estar localizada(s) em qualquer ponto no radical e pode ter tanto uma configuração (Z) como (E) ao redor da(s) ligação (ões) dupla(s).
Alquinila refere-se a radicais hidrocarbila dentro do âmbito da alquenila, mas tendo 1 ou mais ligações triplas no radical.
Os termos "alcoxila" ou "alcóxi", conforme empregado no presente, se refere a um grupo alquila, conforme definido abaixo, tendo um radical oxigenado ligado a ele. Os grupos alcoxila representativos incluem metóxi, etóxi, propóxi, terc-butóxi e análogos. Um "éter" consiste em dois hidrocarbonetos ligados por covalência por um oxigénio. Consequentemente, o substituinte de um alquila que transforma aquele alquila em éter é um alcoxila ou é 36 semelhante a ele, de modo tal que pode ser representado por um de -O-alquila, -O-alquenila, -O-alquila, -0- (CH2)m-R!, sendo m e Ri descritos abaixo.
Os termos "amino" e amina"são reconhecidos na técnica e se referem tanto a aminas não substituídas como a substituídas, uma porção que pode ser representada pelas fórmulas gerais:
em que cada um de R3, R5 e R6 representa independentemente um hidrogénio, um alquila, um alquenila, -(CH2)m-Ri ou então R3 e R5 tomados em conjunto com o átomo de N ao qual eles estão ligados completam um heterociclo que tem de 4 a 8 átomos na estrutura de anel; Ri representa um alquenila, arila, cicloalquila, um cicloalquenila, um heterociclila e/ou um policiclila; e m é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 8. Em modalidades preferidas, somente um de R3 ou R5 pode ser um carbonila, R3, R5 e o nitrogénio em conjunto não formam uma imida, por exemplo. Em modalidades ainda mais preferidas, cada um de R3 e R5 (opcionalmente R6) independentemente representam um hidrogénio, um alquila, um alquenila ou -(CH2) m-Ri .Assim, o termo "alquilamino", conforme empregado no presente, significa um grupo amino, conforme definido acima, tendo um alquila substituído ou não substituído ligado a ele, isto é, pelo menos um de R3 e R5 é um grupo alquila. Em determinadas modalidades, um grupo amino ou um alquilamino é básico, significando que tem um pKa>7,00. As formas protonadas destes grupos funcionais têm pKas em relação a água acima de 7,00. 37 0 termo "carbonila" é reconhecido na técnica e inclui tais porções que podem ser representadas pela fórmula geral:
O
em que X e uma ligação ou representa um oxigénio ou um enxofre e R7 representa um hidrogénio, um alquila, um alquenila, -(CH2)m_Ri ou um sal farmaceuticamente aceitável, R8 representa um hidrogénio, um alquila, um alquenila ou -(CH2)m-Rií sendo m e Ri conforme definido acima. Nos casos em que X é um oxigénio e R7 ou R8 não é hidrogénio, a fórmula representa um "éster". Nos casos em que X é um oxigénio e R7 é conforme definido acima, refere-se à porção no presente, como um grupo carboxila, e especialmente nos casos em que R7 é um hidrogénio, a fórmula representa um "ácido carboxilico". Nos casos em que X é um oxigénio, e R8 é hidrogénio, a fórmula representa um "formiato". Em geral, nos casos em que o átomo de oxigénio da fórmula acima é substituído por enxofre, a fórmula representa um grupo "tiocarbonila". Nos casos em que X é um enxofre e R7 ou R8 não é hidrogénio, a fórmula representa um grupo "tioéster". Nos casos em que X é um enxofre e R7 é hidrogénio, a fórmula representa um grupo "ácido tiocarboxílico". Nos casos em X é um enxofre e R8 é hidrogénio, a fórmula representa um grupo "tioformiato". Por outro lado, nos casos em que X é uma ligação e R7 não é hidrogénio, a fórmula acima representa um grupo "cetona". Nos casos em que X é uma ligação e R7 é hidrogénio, a fórmula acima representa um grupo "aldeído". 0 termo "derivado" se refere à modificação química de moléculas. As modificações químicas podem ser artificiais 38 tal como a formação de medicamentos, natural tal como a formação de metabólitos. 0 artesão perito reconheceria facilmente a variedade de modos como as moléculas podem ser modificadas tal como por oxidação, redução, substituição eletrófila/nucleófila, alquilação, formação éster/amida e análogos. As ciclodextrinas, por exemplo, da presente invenção podem ser modificadas quimicamente por aminação tosilação ou por iodação antes de se ligar as mesmas por covalência à matriz polimérica. De modo análogo, os agentes terapêuticos podem ser quimicamente modificados por preparação de promedicamento (glicina-camptotecina, por exemplo). 0 termo "heterociclila" ou "grupo heterocíclico" se refere a estruturas de anel tendo de 3-10 membros, sendo mais preferível anéis com 3 a 7 membros, incluindo as suas estruturas de anel um a quatro heteroátomos. Os heterociclos podem também ser policiclos. Os grupos heterociclila incluem, por exemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxantina, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazan, fenoxazina, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina, lactonas, lactamas, tais como azetidinonas e pirrolidinonas, sultamas, sultonas e análogos. O anel heterocíclico pode ser substituído em uma ou mais posições com tais substituintes conforme descrito acima, tal como por exemplo, halogênio, alquila, aralquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, hidroxila, amino, nitro, 39 sulfidrila, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonila, carboxila, silila, sulfamoíla, sulfinila, éter, alquiltio, sulfonila, cetona, aldeído, éster, um heterociclila, uma porção aromática ou heteroaromática,-CF3, -CN ou análogos.
Conforme empregue no presente, o termo "substituído" destina-se a incluir todos os substituintes permissíveis de compostos orgânicos. Em um aspecto amplo, os substituintes permissíveis incluem substituintes acíclicos e cíclicos, ramificados e não ramificados, carbocíclicos e heterocíclicos, aromáticos e não aromáticos de compostos orgânicos. Os substituintes ilustrativos incluem, por exemplo, os descritos no presente acima. Os substituintes permissíveis podem ser um ou mais e iguais ou diferentes para os compostos orgânicos. Para os fins da presente invenção, os heteroátomos, tais como nitrogénio, podem ter substituintes de hidrogénio e/ou qualquer substituinte permissível dos compostos orgânicos descritos no presente que satisfaçam as valências dos heteroátomos. A presente invenção não se destina a ser limitada de nenhum modo pelos substituintes permissíveis de compostos orgânicos. 0 termo "hidrocarbila" se refere a um radical hidrocarboneto monovalente composto por cadeias ou anéis de carbono tendo até 26 átomos de carbono aos quais são ligados átomos de hidrogénio. 0 termo inclui grupos alquila, cicloalquila, alquenila, alquinila e arila, grupos que têm uma mistura de ligações saturadas e insaturadas, anéis carbocíclicos e inclui combinações de tais grupos, ele pode se referir a estruturas de cadeia reta, cadeia ramificada, cíclica ou combinações delas. 40 0 termo "hidrocarbileno" se refere a um radical hidrocarbila divalente. Os exemplos representativos incluem alquileno, fenileno ou ciclo-hexileno. É preferível que a cadeia de hidrocarbileno seja totalmente saturada e/ou tenha uma cadeia de 1-10 átomos de carbono.
Conforme empregue no presente, o termo "nitro" significa -NO2; o termo "halogênio" designa -F, -Cl, -Br ou -I; o termo "sulfidrila" significa -SH; o termo "hidroxila" significa -OH; e o termo sulfonila" significa -S02-.
Deve ficar subentendido que "substituição" ou "substituído com" inclui a condição implícita de que tal substituição está de acordo com a valência permitida do átomo substituído e do substituinte, e que a substituição resulta em um composto estável, que não sofre, por exemplo, espontaneamente uma transformação tal como por rearranjo, ciclização, eliminação etc.
Podem ser feitas substituições análogas a grupos alquenila e alquinila para produzir, por exemplo, amino-alquenilas, aminoalquinilas, amidoalquenilas, amido-alqui-nilas, iminoalquenilas, iminoalquinilas, tioalquenilas, tioalquinilas, alquenilas ou alquinilas carbonil-subs-tituídas.
Conforme empregue no presente, a definição de cada expressão, tal como alquila, m, n, por exemplo, etc., quando ocorre mais de uma vez em qualquer estrutura é considerada independente da sua definição em outro ponto na mesma estrutura. 41
Os termos triflila, tosila, mesila e nonaflila são reconhecidos na técnica e se referem aos grupos triflúor-metano-sulfonila, p-tolueno-sulfonila, metano-sulfonila e nonaflúor-butano-sulfonila, respectivamente. Os termos triflato, tosilato, mesilato e nonaflato são reconhecidos na técnica e se referem aos grupos funcionais do éster triflúor-metano-sulfonato, éster p-tolueno-sulfonato, éster metano-sulfonato e éster nonaflúor-butano-sulfonato e a moléculas que contém tais grupos, respectivamente.
As abreviaturas Me, Et, Ph, Ms representam metila, etila, fenila e metano-sulfonila, respectivamente. Uma lista mais abrangente das abreviaturas utilizadas pelos químicos orgânicos versados na técnica aparece no primeiro exemplar de cada volume do Journal of Organic Chemistry; esta lista é tipicamente apresentada em uma tabela intitulada Standard List of Abbreviations. As abreviaturas contidas na citada lista e todas as abreviaturas utilizadas por químicos orgânicos versados na técnica são pelo presente incorporadas ao presente documento a título de referência.
Determinados compostos da presente invenção podem existir em formas específicas geométricas ou estereoisoméri-cas. A presente invenção contempla todos tais compostos, incluindo cis e trans isômeros, (R) e (S) enantiômeros, diastereoisômeros (d)-isômeros, (1)-isômeros, misturas racêmicas deles e outras misturas suas, como incidindo no âmbito da invenção. Os átomos de carbono assimétricos adicionais podem estar presentes em um substituinte tal como um grupo alquila. Todos tais isômeros, assim como suas misturas, são destinados a serem incluídos nesta invenção. 42
Se, por exemplo, um enantiômero específico de um composto da presente invenção for desejado, ele pode ser preparado pro síntese assimétrica, ou por derivação com um auxiliar quiral, em que a mistura diastereoisomérica resultante é separada e o grupo auxiliar é clivado para proporcionar os enantiômeros puros desejados. Alternativa-mente, nos casos em que a molécula contém um grupo funcional básico, tal como um grupo amino, ou um grupo funcional ácido, tal como carboxila, podem ser formados sais diastereoisoméricos com um ácido ou base oticamente ativo adequado, seguido pela resolução dos diastereoisômeros deste modo formados por cristalização fracionada ou meio cromatográficos bem conhecidos na técnica, e pela recuperação subsequente dos enantiômeros puros.
Os equivalentes propostos dos compostos descritos acima incluem compostos que correspondem de outro modo a eles, e que têm as mesmas propriedades gerais deles, em que uma ou mais simples variações de substituintes feitas não afetam de modo adverso a eficácia do composto. Em geral, os compostos da presente invenção podem ser preparados pelos métodos ilustrados nos esquemas de reação geral tais como, por exemplo, os descritos abaixo, ou por modificações deles, empregando-se materiais de partida facilmente disponíveis, reagentes e procedimentos de síntese convencionais. Nestas reações, é também possível se utilizar variantes que são conhecidas por si, mas que não são mencionadas no presente.
Para os fins da presente invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67a. Ed., 1986-87, capa interna. Também para os fins da presente invenção, o termo "hidrocarboneto" se destina a 43 incluir todos os compostos permissíveis que têm pelo menos um átomo de hidrogénio e um átomo de carbono. Em um aspecto amplo, os hidrocarbonetos permissiveis incluem compostos orgânicos aciclicos e ciclicos, ramificados e não ramificados, carbociclicos e heterociclicos, aromáticos e não aromáticos que podem ser substituídos ou não. III. Aplicações Exemplares do Método e Composições (a) Composições Exemplares A presente invenção inclui conjugados poliméricos tais como conjugados poliméricos contendo ciclodextrina, em que um ou mais agentes terapêuticos/bioativos são ligados por covalência. Em determinadas modalidades, o agente terapêutico é uma molécula pequena, uma macromolécula um anticorpo, um peptideo, uma proteina, uma enzima, um ácido nucléico, ou um polimero que tem função terapêutica. Os polímeros incluem polímeros lineares ou ramificados contendo ciclodextrina e polímeros enxertados com ciclodextrina. Exemplos de polímeros contendo ciclodextrina que podem ser modificados do modo descrito no presente são objeto de instruções na patente U.S. N° 6.509.323, na pedido U.S. publicado N° 20020151523 e pedidos de patente U.S. nós de série 60/417373 e 10/372723. Estes polímeros são úteis como veiculos para o fornecimento de agentes terapêuticos de pequena molécula, e podem melhorar a estabilidade e solubilidade do medicamento quando usados in vivo.
Consequentemente, uma modalidade da presente invenção consiste num composto polimérico representado pela Fórmula I: 44
em que P representa uma cadeia polimérica reta ou ramificada; CD representa uma porção cíclica tal como uma porção ciclodextrina;
Li, L2 e L3, a cada ocorrência independentemente podem estar ausentes ou representar um grupo ligante; D, independentemente para cada ocorrência, representa um agente terapêutico ou um promedicamento seu; T, independentemente a cada ocorrência, representa um ligante de alvejamento ou seu precursor; a, m e v, independentemente para cada ocorrência, representam números inteiros na faixa de 1 a 10 (de preferência de 1 a 8, 1 a 5 ou mesmo 1 a 3); n e w, independentemente para cada ocorrência, representam um número inteiro na faixa de 0 a aproximadamente 30.000 (de preferência < 25.000, < 20.000, < 15.000, < 10.000, < 5.000, < 1.000, < 500, < 100, < 50, < 25, < 10, ou mesmo < 5) ; e b representa um número inteiro na faixa de 1 a aproximadamente 30.000 (de preferência < 25.000, < 20.000, < 15.000, < 10.000, < 5.000, < 1.000, < 500, < 100, < 50, < 25, < 10, ou mesmo < 5), 45 sendo que, ou P compreende porções de ciclodextrina ou n é pelo menos 1.
Em determinadas modalidades, P contém uma multi-plicidade de porções ciclodextrina no interior da cadeia polimérica e não porções ciclodextrina enxertadas a grupos pendentes para fora da cadeia polimérica. Assim em determinadas modalidades, a cadeia polimérica da fórmula I compreende ainda n' unidades de U, em que n' representa um número inteiro na faixa de 1 a aproximadamente 30.000 (de preferência < 25.000, < 20.000, < 15.000, < 10.000, < 5.000, < 1.000, < 500, < 100, < 50, < 25, < 10, ou mesmo < 5); e U é representado pela fórmula geral:
em que CD representa uma porção ciclica, tal como uma porção de ciclodextrina, ou um seu derivado; L4, L5, L6 e L7, independentemente a cada ocorrência, podem estar ausentes ou representar um grupo ligante; D e D' , independentemente a cada ocorrência, representam o mesmo agente terapêutico ou agentes terapêuticos diferentes, ou formas de promedicamentos seus; 46 T e Τ' , independentemente a cada ocorrência, representam o mesmo ligante de alvejamento ou ligantes de alvejamento diferentes, ou precursor seu; f e y, independentemente a cada ocorrência, representam um número inteiro na faixa de 1 a 10; g e z, independentemente a cada ocorrência, representam um número inteiro na faixa de 0 a 10.
Em modalidades preferidas L4 e L7 representam grupos ligante.
Em determinadas modalidades, o polímero pode ser selecionado dentre polissacarideos, e outros polímeros biocompatíveis não protéicos e suas combinações, que contêm pelo menos um grupo hidroxila terminal, tal como polivinilpirrolidona, poli(oxietileno)glicol (PEG), anidrido polissuccinico, ácido polissebácico, PEG-fosfato, poligluta-mato, polietilenimina, éter divinilico do anidrido maléico (DIVMA), celulose, pululans, inulina álcool polivinilico (PVA), N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA), dextrano e amido hidroxietilico (HES), e têm grupos pendente opcionais para a enxertia de agentes terapêuticos, ligantes de alvejamento e/ou porções de ciclodextrina. Em determinadas modalidades, o polímero pode ser biodegradável tal como poli(ácido lático), poli(ácido glicólico), poli(2-ciano-acrilatos de alquila), polianidridos e poliorto-ésteres ou bioerodíveis tais como copolímeros de polilactídeo-glicolídeo, e seus derivados, poliaminoácidos não peptídicos, poliimino- carbonatos, poli alfa-aminoácidos, polialquil-ciano acrilato, polifosfazenos ou copolímeros de poliaspartato e de poliglutamato de acilóxi-metila e suas misturas. 47
Uma outra modalidade da invenção é um composto polimérico representado pela fórmula II:
° (II) em que P representa uma unidade monomérica de um polímero; T, independentemente a cada ocorrência, representa um ligante de alvejamento ou um precursor seu; L6, L7, L8, L9 e Lio, independentemente a cada ocorrência, podem estar ausentes ou representar um grupo ligante; CD, independentemente a cada ocorrência, representa uma porção cíclica tal como uma porção ciclodextrina ou um seu derivado; D, independentemente a cada ocorrência, representa um agente terapêutico ou uma forma de um seu promedicamento; m, independentemente a cada ocorrência, representa um número inteiro na faixa de 1 a 10 (de preferência 1 a 8, 1 a 5, ou mesmo 1 a 3); o representa um número inteiro na faixa de 1 a aproximadamente 30.000 (de preferência < 25.000, < 20.000, < 15.000, < 10.000, < 5.000, < 1.000, < 500, < 100, < 50, < 25, < 10, ou mesmo < 5); e 48 ρ, η e q, independentemente a cada ocorrência, representa um número inteiro na faixa de 0 a 10 (de preferência de 0 a 8, 0 a 5, 0 a 3, ou mesmo de 0 a aproximadamente 2), sendo que cada um de CD e D está de preferência presente em pelo menos um local (de preferência pelo menos 5, 10, 25, ou mesmo 50 ou 100 locais) no composto.
Uma outra modalidade da invenção é um composto representado pela Fórmula III
em que CD representa uma porção cíclica tal como uma porção de ciclodextrina, ou um seu derivado; L4, L5, Lê e L7, independentemente a cada ocorrência, podem estar ausentes ou representar um grupo ligante; D e D' , independentemente a cada ocorrência, representam o mesmo agente terapêutico ou diferente ou seus promedicamentos; T e T' , independentemente a cada ocorrência, representam o mesmo ligante de alvejamento ou ligantes de alvejamento diferentes ou precursor seu; 49 f e y, independentemente a cada ocorrência, representam um número inteiro na faixa de 1 a 10 (de preferência de 1 a 8, 1 a 5 ou mesmo 1 a 3); g e z, independentemente a cada ocorrência, representam um número inteiro na faixa de 0 a 10 (de preferência de 0 a 8, 0 a 5, 0 a 3, ou mesmo de 0 a 2) ; e h representa um número inteiro na faixa de 1 a aproximadamente 30.000 (de preferência < 25.000, < 20.000, < 15.000, < 10.000, < 5.000, < 1.000, < 500, < 100, < 50, < 25, < 10, ou mesmo < 5), sendo que, pelo menos uma ocorrência (e de preferência pelo menos 5, 10 ou mesmo de pelo menos 20, 50 ou 100 ocorrências) de g representa um número inteiro acima de 0.
Em modalidades preferidas L4 e L7 representam grupos ligante.
Em determinadas modalidades, os polímeros subjacentes são polímeros lineares contendo ciclodextrina, a estrutura polimérica inclui, por exemplo, porções de ciclodextrina. O polímero pode ser, por exemplo, um polímero linear de ciclodextrina hidrossolúvel produzido proporcio-nando pelo menos um derivado de ciclodextrina modificado de modo a conter um sítio reativo em cada uma de exatamente duas posições e fazendo-se o derivado de ciclodextrina reagir com um ligante que tem exatamente duas porções reativas capazes de formar uma ligação covalente com os sítios reativos em condições de polimerização que promovem a reação dos sítios reativos com as porções reativas, para formar ligações por covalência entre o ligante e o derivado de ciclodextrina, sendo então produzido um polímero linear compreendendo unidades alternantes de derivados de ciclodextrina e ligantes. Alternativamente, o polímero pode ser um polímero 50 linear hidrossolúvel de ciclodextrina tendo uma estrutura polimérica linear, compreendo o polímero uma multiplicidade de porções ciclodextrina substituídas ou não e porções ligante na estrutura polimérica linear, sendo cada uma das porções ciclodextrina, distinta de uma porção ciclodextrina no terminal de uma cadeia polimérica, é ligada a duas das citadas porções ligante, ligando cada porção ligante por covalência duas porções ciclodextrina. Em uma outra modalidade ainda, o polímero é um polímero hidrossolúvel linear de ciclodextrina compreendendo uma multiplicidade de porções ciclodextrina ligados por covalência entre si por uma multiplicidade de porções ligante, sendo cada porção ciclodextrina, distinta de uma porção ciclodextrina no terminal de uma cadeia polimérica, ligada a duas porções ligante para formar um polímero linear de ciclodextrina. 0(s) grupo(s) ligante podem consistir numa cadeia alquileno, uma cadeia polietileno glicol (PEG), um anidrido polissuccínico, ácido poli-L-glutâmico, poli(etilenoimina), um oligossacarídeo, uma cadeia de aminoácidos, ou qualquer outra ligação adequada. Em determinadas modalidades, o grupo ligante propriamente dito pode ser estável em condições fisiológicas, tal como uma cadeia alquileno, ou pode ser clivável em condições fisiológicas, por uma enzima, por exemplo (a ligação contém, por exemplo, uma sequência de peptídeo que é um substrato para uma peptidase) ou por hidrólise (a ligação contém, por exemplo, um grupo hidrolisável, tal como um éster ou tioéster). Os grupos ligante podem ser biologicamente inativos, tal como um PEG, ácido poliglicólico ou cadeia de ácido polilático ou pode ser biologicamente ativos tal como um oligopeptídeo ou polipeptídeo que, quando clivado das porções,se liga a um receptor, desativa uma enzima etc. Diversos grupos ligante 51 oligoméricos que são biologicamente compatíveis e/ou bioerodíveis são conhecidos na técnica e a seleção da ligação pode influenciar as propriedades finais do material, tal como a possibilidade dele ser durável quando implantado a possibilidade dele se deformar ou encolher gradualmente depois da implantação, ou da possibilidade dele se degradar gradualmente e ser absorvido pelo corpo. 0 grupo ligante pode ser ligado às porções por qualquer ligação adequada ou grupo funcional, incluindo ligações carbono-carbono, ésteres, éteres, amidas, aminas, carbonatos, carbamatos, sulfonamidas etc.
Em determinadas modalidades, o(s) grupo(s) ligante da presente invenção representa(m) um grupo hidrocarbileno, em que um ou mais grupos metileno é opcionalmente substituído por um grupo Y (desde que nenhum dos grupos Y esteja adjacente a um outro grupo Y), sendo cada Y, independentemente para cada ocorrência, selecionado dentre arila substituído ou não, heteroarila, cicloalquila, hetero-cicloalquila, ou -0-, C (=X) (em que X é NRi, 0 ou S) , -0C (0) -, -C(=0)0, -NRi-, -NRiCO-, -C(0)NRi-, -S(0)n- (em que n é 0, 1 ou 2), -0C(0)-NRi, -NRi-C (0) -NRi-, -NRi-C (NRi) -NRi-, e -B(ORi)-; e Ri, independentemente a cada ocorrência, representa H ou um alquila inferior.
Em determinadas modalidades, o grupo ligante representa um aminoácido derivado ou não derivado. em determinadas modalidades, grupos ligante com um ou mais grupos carboxila terminais podem ser conjugados ao polímero. Em determinadas modalidades uma ou mais destes grupos carboxila terminais pode ser capeado por uma ligação covalência deles a um agente terapêutico, uma porção alvejante, ou uma porção ciclodextrina por meio de uma ligação (tio)éster ou amida. 52
Em outras modalidades ainda, os grupos ligante tendo um ou mais grupos terminais hidroxila, tiol ou amino podem ser incorporados ao polímero. Em modalidades preferidas, um ou mais destes grupos hidroxila terminais pode ser capeado ligando-se os mesmos por covalência a um agente terapêutico, uma porção de alvejamento ou uma porção ciclodextrina por meio de uma ligação (tio)éster, amida, carbonato, carbamato, tiocarbonato ou tiocarbamato. Em determinadas modalidades, estas ligações (tio)éster, amida, (tio)carbonato ou (tio)carbamato podem ser bio-hidrolisáveis, isto é, capazes de ser hidrolisadas em condições biológicas.
Em determinadas modalidades, os polímeros conforme descritos acima têm polidispersabilidades inferiores a aproximadamente 3 ou até mesmo inferiores a aproximadamente 2.
Em determinadas modalidades, o agente terapêutico é uma molécula pequena, um peptídeo, uma proteína, ou um polímero que tem função terapêutica. Em determinadas modalidades, o agente é um agente terapêutico anticance-rígeno (tal como camptotecina ou derivados correlatos) , antifúngico, antibacteriano, antimicótico ou antiviral. Em determinadas modalidades, o agente é um agonista de receptor. Em determinadas modalidades, o agente é um antagonista de receptor. em determinadas modalidades, o agente terapêutico é um inibidor de protease. Além disso, um polímero da presente invenção pode conter um tipo de agente terapêutico ou pode conter mais de um tipo de agente terapêutico. Dois ou mais medicamentos anticancerígenos diferentes, por exemplo, ou um medicamento anticancerígeno e um imunossupressor, ou um agente antibiótico e um antiinflamatório, podem ser enxertados no polímero por meio de ligantes opcionais. Selecionando-se ligantes diferentes 53 para medicamentos diferentes, pode ser atenuada a libertação de cada medicamento para se obter a dosagem e eficácia máximas.
Uma modalidade da presente invenção proporciona um fornecimento melhorado de determinados agentes terapêuticos de pequena molécula hidrófobas conjugando-se os mesmos por covalência aos polímeros contendo ciclodextrina. Tal conjugação melhora a hidrossolubilidade e consequentemente a biodisponibilidade dos agentes terapêuticos. Consequentemente, em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico é um composto hidrófobo com um log P> 0,4, >0,6, > 0,8, > 1, >2, >3, >4, ou mesmo > 5. Em outras modalidades, um agente terapêutico hidrófobo tal como camptotecina, pode ser conjugado a um outro composto, tal como um aminoácido, antes de se ligar por covalência o conjugado ao polímero. Exemplos de moléculas de camptotecina derivadas com aminoácidos são ilustrados no Esquema V.
Os conjugados poliméricos da presente invenção têm, de preferência, pesos moleculares na faixa de 10.000 a 500.000; 30.000 a 200.000; ou mesmo 70.000 a 150.000 amu.
Em determinadas modalidades, as porções ciclodextrina constituem pelo menos aproximadamente 2%, 5% ou 10% em peso, até 20%, 30%, 50% ou mesmo 80% do polímero modificado por ciclodextrina em peso. Em determinadas modalidades, os agentes terapêuticos, ou os ligantes de alvejamento constituem pelo menos aproximadamente 1%, 5%, 10% ou 15%, 20%, 25%, 30% ou mesmo 35% do polímero modificado por ciclodextrina em peso. O peso molecular médio numérico (Mn) pode também variar muito, mas geralmente incide entre os limites de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 500.000 54 daltons, de preferência, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 200.000 daltons e, ainda mais preferível, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000. O mais preferível é que Mn varie entre aproximadamente 12.000 e 65.000 daltons. Em determinadas outras modalidades, Mn varia entre aproximadamente 3.000 e aproximadamente 150.000 daltons. Dentro de uma amostra dada de um polimero da presente invenção, pode e encontrar presente uma ampla faixa de pesos moleculares. As moléculas dentro da amostra, por exemplo, podem ter pesos moleculares que diferem de um fator de 2, 5, 10, 20, 50, 100 ou mais ou que diferem do peso molecular médio de um fator de 2, 5, 10, 20 50, 100 ou mais. As porções ciclodextrina exemplares incluem estruturas ciclicas que consistem essencialmente em 7 a 9 porções sacarideo, tais como ciclodextrina e ciclodextrina oxidada. Uma porção ciclodextrina compreende opcionalmente uma porção ligante que forma uma ligação por covalência entre a estrutura ciclica e a estrutura do polímero. de preferencialmente tendo de 1 a 20 átomos na cadeia, tal como cadeias alquila, incluindo derivados de ácido dicarboxílico (tal como derivados do ácido glutárico, derivados do ácido succínico e análogos) e cadeias heteroalquila, tais como cadeias de oligoetileno glicol.
As ciclodextrinas são polissacarídeos cíclicos contendo unidades de D-(+)-glicopiranose de ocorrência na natureza em uma ligação a-(1,4). As ciclodextrinas mais comuns são a ( (a) -ciclodextrinas, e (β)-ο iclodextrinas e gama (γ) -ciclodextrinas que contêm, respectivamente, seis, sete ou oito unidade glicopiranose. Estruturalmente, a natureza cíclica de uma ciclodextrina forma um trapézio ou um formato em rosca que tem uma cavidade interna apoiar ou hidrófoba, os grupos hidroxila secundários situados em um lado do 55 trapézio de ciclodextrina e os grupos hidroxila primários situados do outro. Assim, empregando-se (β)-ciclodextrina como um exemplo, uma ciclodextrina é frequentemente representada esquematicamente do modo abaixo.
0 lado em que os grupos hidroxila secundários estão localizados tem um diâmetro maior do que o lado em que se localizam os grupos hidroxila primários. A presente invenção propõe ligações covalentes às porções ciclodextrina nos grupos hidroxila primários e/ou secundários. A natureza hidrófoba da cavidade interna da ciclodextrina permite complexos de inclusão hospedeiro-hóspede de uma variedade de compostos, tais como adamantano, por exemplo (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press (1996); T. Cserhati, Analytical Biochemistry, 225:328-32 (1995); Husain et al., Applied Spectroscopy, 46:652-658 (1992); FR 2 665 169). Métodos adicionais para a modificação de polímeros são descritos em 56
Suh, J. e Noh, Y., Bioor. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 1327- 1330 .
Em determinadas modalidades, as presente invenção contempla polímeros lineares, hidrossolúveis contendo ciclodextrina, em que uma multiplicidade de porções bioativas são ligadas por covalência ao polímero através de ligações que são clivadas em condições biológicas para liberar as porções bioativas, em que a administração do polímero a um paciente resulta na libertação do agente bioativo durante um período de pelo menos 2, 3, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 24, 36, 48 ou mesmo 72 horas.
Em determinadas modalidades, a presente invenção contempla a atenuação da velocidade de libertação do agente terapêutico pela introdução de diversos grupos de ligação entre o agente terapêutico e/ou o ligante de alvejamento e o polímero. Assim, em determinadas modalidades a substância terapêutica polimérica da presente invenção consiste em composições para o fornecimento controlado de agentes terapêuticos. Os versados na técnica reconhecerão também que, rotulando-se o agente terapêutico e/ou o ligante de alvejamento com rádio-núcleos ou formando-se complexos de núcleos ativos para RMN, tais com tecnécio, gadolínio, ou disprósio, os polímeros da presente invenção podem atingir uma utilidade dupla diagnóstica/terapêutica.
Em outras modalidades, os compostos poliméricos estabilizam a forma bioativa de um agente terapêutico que existe em equilíbrio entre uma forma ativa e inativa. A conjugação do agente terapêutico aos polímeros da presente invenção, por exemplo, pode deslocar o equilíbrio entre duas formas tautoméricas do agente para o tautômero bioativo. Em uma 57 outra modalidade, os compostos poliméricos podem atenuar o equilíbrio entre formas lactônicas e ácidas de um agente terapêutico.
Um método para se determinar o peso molecular é por cromatografia de permeação de gel ("GPC"), colunas de leito misto, solvente de CH2C12, detetor de dispersão de luz e dn/dc off-line. Outros métodos são conhecidos na técnica.
Em outras modalidades, o conjugado polimérico da invenção pode ser um material flexível ou que pode escorrer. Quando o polímero usado é em si capaz de escorrer, a composição polimérica da invenção, mesmo quando viscosa, não precisa incluir um solvente biocompatível para poder escorrer, embora possam ainda estar presentes aços ou quantidades residuais de solventes biocompatíveis.
Embora se j a possível que o polímero biodegradável ou o agente ativo biologicamente possa ser dissolvido em uma pequena quantidade de um solvente que não é tóxico para produzir de modo mais eficiente uma distribuição amorfa, monolítica ou uma dispersão fina do agente biologicamente ativo na composição flexível ou capaz de escorrer. É uma vantagem da invenção o fato de que, em uma modalidade preferida, nenhum solvente seja necessário para formar uma composição que pode escorrer. Além disso o uso de solventes é de preferência, evitado, pois, uma vez a composição polimérica contendo solvente é colocada total ou parcialmente no interior do corpo, o solvente se dissipa ou se difunde afastando-se do polímero e deve ser processado e eliminado pelo corpo, colocando um peso extra sobre a capacidade de eliminação do corpo num momento em que a doença (e/ou outros 58 tratamentos para a doença) possa já ter afetado de modo deletério o mesmo.
No entanto, quando um solvente é usado para facilitar a mistura ou para manter a capacidade de escorrimento do conjugado polimérico da invenção, ele deve ser não-tóxico, ou de outro modo qualquer biocompativel e deve ser usado em quantidades relativamente pequenas. Os solventes que são tóxicos não devem ser usados em qualquer material a ser colocado ainda que parcialmente no interior do corpo vivo. Tal solvente também não deve causar uma irritação tecidual substancialmente nem necrose no sitio da administração.
Exemplos de solventes biocompativeis adequados, quando usados, incluem N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, etanol, propileno glicol, acetona, acetato de metila acetato de etila, metil etil cetona, dimetilformamida, dimetilsul-fóxido, tetraidrofurano, caprolactama, ácido oléico, ou 1-dodecilazaciclo-heptanona. Os solventes preferidos incluem N-metil pirrolidona, 2-pirrolidona, dimetil sulfóxido e acetona, devido à sua capacidade de solvatação e a sua biocompatibilidade.
Em determinadas modalidades, os conjugados poliméricos da presente invenção são solúveis em um ou mais dos solventes orgânicos habituais para fins de facilidade de fabricação e processamento. Solventes orgânicos habituais incluem tais solventes com clorofórmio, diclorometanol, dicloroetano, 2-butanona, acetato de butila, butirato de etila, acetona, acetato de etila, dimetilacetamida, N-metil pirrolidona, dimetilformamida, e dimetilsulfóxido. 59
Um aspecto da presente invenção contempla a ligação de um agente terapêutico hidrófobo tal como (S)-20-camptotecina a polímeros ramificados contendo ciclodextrina para um melhor fornecimento do medicamento. Foi constatado que (S)-20-camptotecina (CPT), um alcaloide isolado de Camptitheca accuminata em fins de 1950, apresenta atividade anticancerigena por inibição da ação de topoisomerase 1 durante a fase S do ciclo celular. Sua aplicação no tratamento para câncer humano, no entanto, é limitada, devido a diversos fatores, especialmente a suas interações indesejáveis com a albumina sérica humana, à instabilidade da forma de lactona bioativa, e a uma precária hidrossolubilidade. A fim de se contornar tal problema, foram desenvolvidos muitos análogos de CPT para melhorar a estabilidade da lactona e a sua hidrossolubilidade. Topotecan e irinotecan são análogos de CPT que já foram aprovados por FDA para o tratamento de câncer humano. A presente invenção descreve diversos tipos de polímeros lineares, ramificados ou enxertados contendo ciclodextrina em que a (S)-20-camptotecina é ligada por covalência ao polimero. Em determinadas modalidades, o medicamento é ligado por covalência por meio de uma ligação bio-hidrolisável selecionada dentre um éster, amida, carbamatos ou carbonato.
Um esquema sintético exemplar para a ligação por covalência de um derivado CD a 20(S)-camptotecina é mostrado no Esquema I. 60
Esquema I
Sem se desejar limitar o âmbito da invenção, uma estratégia geral para a sintese de polímeros lineares, ramificados ou enxertados contendo ciclodextrina (Polímero de CD) para se carregar um agente terapêutico tal como camptotecina e um ligante de alvejamento opcional é mostrado no Esquema II.
Esquema II
Monõmeros de ciclodextrina exemplares para polímeros lineares, ramificados ou enxertados contendo ciclodextrina
Para ilustrar com mais detalhes, sem se destinar a ter caráter limitante, os precursores do comonómero A, as 61 porções ciclodextrina, agentes terapêuticos e/ou ligantes de alvejamento podem ser montados do modo mostrado nos Esquemas Ila-IIb. Observe que nos esquemas Ila-b, em qualquer reação dada, pode haver mais de um precursor de comonómero A, porção ciclodextrina, agente terapêutico ou ligante de alvejamento que é do mesmo tipo ou de tipos diferentes. Além disso, antes da polimerização, um ou mais dentre precursor de comonómero A, porção ciclodextrina, agente terapêutico ou ligante de alvejamento pode estar ligado por covalência um com outro em uma ou mais etapas separadas.
Esquema lia: Esquema geral para polímeros de enxertia. 0 precursor de comonómero A, porção ciclodextrina, agente terapêutico e ligante de alvejamento são conforme definido acima. Além disso, os versados na técnica podem escolher dentre uma variedade de grupos reativos, tais como hidroxilas, carboxilas, haletos, aminas e etenos, etinos ativados ou grupos aromáticos a fim de se obter a polimerização. Para outros exemplos de grupos reativos são descritos em Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 5a. Edição, 2000. 62
+
+ OPCIONALMENTE
Esquema Ilb: Esquema geral de preparação de polímeros de cadeia reta contendo ciclodextrina. Os versados na técnica reconhecerão que escolhendo um precursor de comonómero A que tem uma multiplicidade de grupos reativos pode se obter a ramificação do polímero. 63
+ OPCIONALMENTE
Grupo Reativo Linker Opcional Agente Terapêutico E/OU Grupo Reativo Linker Opcional Ligante de Alvejamento
Polimerização u
_s_ Linker Opcional Porção Ciclodextrina Precursor de comonômero A j R
Em que R é um agente terapêutico e/ou ligante de alvejamento que pode estar ausente ou presente
Exemplos para os diferentes modos de sintetização de polímeros de cadeia reta contendo CPT-ciclodextrina são mostrados nos esquemas III-VIII. 64
Esquema III
em que r o W representa um grupo de ligação opcional; e R representa W-CPT ou O”)
Esquema IV OBz OBz
OBzNH, °*Ht \ 7 i r OBz
IZ
\N-CPT
VV-CPT W-CPT
em que W representa um grupo linker opcional 65
Esquema V
° Vo" o
'Çr' rÓH
OjUXPT CTTor Gly-CPT, V^1 O k^OCPT o o
OH
W representa um grupo de ligação opcional, tal como um resíduo de glicila
Esquema VI
Esquema VII
67
Esquema VIII
OCPT
OCPT
Exemplos para se enxertar ciclodextrinas nas cadeias laterais das subunidades de polímeros contendo CPT são mostrados nos Esquemas IX-XII. Cada subunidade pode se repetir qualquer número de vezes, e uma subunidade pode ocorrer com uma frequência substancialmente igual, mais frequentemente, ou menos frequentemente do que uma outra subunidade, de modo que as duas subunidades podem estar presentes aproximadamente da mesma quantidade, ou a quantidades diferentes, que podem diferir ligeiramente ou apresentar uma grande disparidade, uma subunidade, por exemplo, está presente praticamente a ponto de excluir a outra.
Em determinados casos, os polímeros são copolimeros aleatórios, em que as unidades diferentes e/ou outras unidades monoméricas são distribuídas aleatoriamente em toda 68 a cadeia polimérica. Deste modo, no caso em que aparece a fórmula Xm-Yn-Z0, em que X, Y e Z são subunidades poliméricas, estas subunidades podem se encontrar dispersas aleatoriamente em toda a estrutura polimérica. Em parte o termo "aleatório" pretende se referir à situação em que a distribuição ou incorporação especifica das unidades monoméricas em um polimero que tem mais de um tipo de unidades monoméricas não é dirigida ou controlada diretamente pelo protocolo sintético, resultando em vez disso de caracteristicas inerentes ao sistema polimérico, tal como reatividade, quantidades de subunidades e outras caracteristicas da reação sintética ou de outros métodos de fabricação, processamento ou tratamento.
Esquema IX \
/ \ AJ(Í5í)-HiQ^ 0 0 -*- O^H CH3 o CHj I \ _ci / lII I _V_ -0-CH-CH2~ od--—f—p o-CH-GHj—0-f— ' ' | ' n
Ct
CPT
HnN
NíiOH CH3
-^-P—O-CH-CH;— -P „ΝΗ
CH3I O-CH-CHj OCPT CH2 \ ! I! ) \ :— O·)- 1 1P— O- CH- CHj—0“)— ' ΙΠ ' 1 ‘ ΓΪ 69
Esquema X
70
Esquema XII
Η,Ν
A presente invenção propõe ainda polimeros de CD sintetizados empregando-se o monómero CD-biscisterna e um éster di-NHS tal como PEG-DiSPA ou PEG-BTC como mostrado nos Esquemas XIII-XIV. 71
Esquema XIII
72
Em determinadas modalidades, as presente invenção descreve diversas estratégias para aumentar a carga de medicamento conforme mostrado na Figura 1. (b) Ligante de alvejamento
Conforme mencionado acima, um aspecto da presente invenção contempla a ligação de um agente terapêutico aos conjugados poliméricos descritos no presente.
Em determinadas modalidades, o conjugado polimérico compreende ainda um ligante de alvejamento. Assim, em determinadas modalidades, um ligante de alvejamento de receptor, célula e/ou tecido ou um precursor seu é acoplado a um conjugado polimérico. Conforme empregado no presente o termo "ligante de alvejamento" se refere a qualquer material ou substância que pode promover o alvejamento de receptores, células e/ou tecidos in vivo ou in vitro com as composições da presente invenção. 0 ligante de alvejamento pode ser sintético, semi-sintético ou ocorrendo na natureza. Os materiais ou substâncias que podem servir como ligantes de alvejamento incluem, por exemplo, proteínas, inclusive anticorpos, fragmentos de anticorpos, hormônios, análogos de hormônios, glicoproteínas e lectinas, peptídeos, polipeptí-deos, aminoácidos, açúcares, sacarídeos, inclusive monossacarídeos e polissacarídeos, carboidratos, pequenas moléculas, vitaminas, esteróides, análogos de esteróides, hormônios, co-fatores, agentes bioativos e material genético, inclusive nucleosídeos, nucleotídeos, construções de ácido de nucleotídeos e polinucleotídeos. Conforme empregado no presente, o termo "precursor" a um ligante de alvejamento se refere a qualquer material ou substância que pode ser convertido em um ligante de alvejamento. Tal 73 conversão pode abranger, por exemplo, ancoragem de um precursor a um ligante de alvejamento. As porções de precursor de alvejamento exemplares incluem grupos maleimida, grupos dissulfeto, tais como orto-piridil dissulfeto, grupos vinil sulfona, grupos azida e grupos a-iodo acetila. A ligação do ligante de alvejamento ou de seu precursor ao polímero pode ser obtida de diversos modos incluindo, sem limitação, quelação, ligação por covalência ou formação de complexos hospedeiro-hóspede. Em determinadas modalidades, um grupo ligante opcional pode se encontrar presente entre o ligante de alvejamento ou seu precursor e o polímero, sendo o grupo ligante ligado ao polímero por quelação, ligação por covalência ou formar complexos hospedeiro/hóspede. Uma extremidade terminal de um grupo ligante, por exemplo, pode ser ligada ao ligante de alvejamento ao passo que a outra pode ser ligada a um grupo adamantano, ou outro tal porção hidrófoba, que forma um complexo hospedeiro/hóspede com a porção ciclodextrina. Deste modo, o ligante de alvejamento pode ser ligado a um a porção ciclodextrina enxertada a uma porção ciclodextrina no interior da cadeia polimérica, ou à cadeia polimérica propriamente dita. 0 número de ligantes de alvejamento por cadeia polimérica pode variar de acordo com vários fatores incluindo, sem limitação, a identidade do agente terapêutico, natureza da doença, tipo de cadeia polimérica. As estruturas de grupos ligante possíveis são as mesmas que as dos grupos ligante definidas em outros pontos deste pedido. (c) Composições Farmacêuticas, Preparados e Dosagens
Em parte, uma composição polimérica biocompativel da presente invenção inclui um polimero biocompativel e opcionalmente biodegradável, tal como um que tenha unidades monoméricas repetidas mostradas em uma das fórmulas acima, opcionalmente incluindo qualquer outro polimero biocompativel e opcionalmente biodegradável mencionado acima ou conhecido na técnica. Em determinadas modalidades, as composições são não-pirogênicas, não desencadeias a elevação da temperatura corporal de um paciente de uma quantidade acima da clinicamente aceitável, por exemplo.
As composições da presente invenção podem conter um "medicamento", "agente terapêutico", ou "substância bioativa" que são substâncias biológica, fisiológica ou farmacologicamente ativas que atuam localmente ou sistemicamente no corpo humano ou animal. Uma composição da presente invenção pode incluir, por exemplo, qualquer um dos outros compostos discutidos acima.
Podem ser usadas diversas formas dos medicamentos ou de materiais biologicamente ativos que são capazes de serem liberados da matriz polimérica para o interior de tecidos adjacentes ou fluidos. Elas podem consistir em moléculas hidrófobas, moléculas neutras, moléculas polares ou complexos moleculares capazes de ligação hidrogénio. Elas podem se encontrar na forma de éteres, ésteres, amidas e análogos, inclusive de promedicamentos que são biologicamente ativados quando injetados no corpo humano ou animal por clivagem de um éster ou amida, por exemplo. Um agente terapêutico em uma composição da presente invenção pode variar amplamente com a finalidade da composição. 75
Agentes plastificantes e estabilizantes conhecidos na técnica podem ser incorporados aos polímeros da presente invenção. Em determinadas modalidades, aditivos tais como agentes plastificantes e estabilizantes são selecionados para a usa biocompatibilidade. Em determinadas modalidades, os aditivos são tensoativos pulmonares, tais como 1,2-dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) e L-a-fosfatidil colina (PC) .
Uma composição da presente invenção pode ainda conter um ou mais substâncias adjuvantes tais como cargas, agentes espessantes ou análogos. Em outras modalidades, os materiais que servem como adjuvantes podem estar associados com a matriz polimérica. Tais materiais adicionais podem afetar as características da matriz polimérica que resulta.
As cargas, por exemplo, tais como albumina sérica boina (BSA) ou albumina sérica murina (MSA) podem estar associadas com a matriz polimérica. Em determinadas modalidades, a quantidade de carga pode variar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50% ou mais em peso da matriz polimérica ou aproximadamente 2,5, 5, 10, 25, ou 40 por cento. A incorporação de tais cargas pode afetar a biodegradação do material polimérico e/ou a velocidade de libertação sustentada de qualquer substância encapsulada. Outras cargas conhecidas dos versados na técnica, tais como carboidratos, açúcares, amidos, sacarídeos, celulose e polissacarídeos, inclusive manitose e sacarose, podem ser usados em determinadas modalidades da presente invenção.
Em outras modalidades, os intensificadores de esferonização facilitam a produção de matrizes poliméricas da presente 76 invenção que tem geralmente um formato esférico. As substâncias tais como zeína, celulose microcristalina ou celulose microcristalina co-processada com carboximetil celulose sódica podem conferir plasticidade às composições da presente invenção assim como implantar resistência e integridade. Em modalidades especificas, durante a esferonização, os extrusados que são rigidos mas não plásticos, resultam na formação de implantes em formato de halteres e/ou uma grande proporção de partículas finas, e os extrusados que são plásticos, mas não rígidos tendem a aglomerar e formar implantes excessivamente grandes. Em tais modalidades, um equilíbrio entre rigidez e plasticidade é desejável. A porcentagem de intensificador de esferonização num preparado tipicamente varia de 10 a 90% (peso/peso).
Em determinadas modalidades, uma composição da presente invenção inclui um excipiente. Um excipiente específico pode ser selecionado com base no seu ponto de fusão, solubilidade em um solvente selecionado (tal como um solvente que dissolve o polímero e/ou o agente terapêutico, por exemplo), e as características resultantes das micropartícuias.
Os excipientes podem constituir alguns por cento, aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais das composições da presente invenção.
Podem ser incorporados tampões, ácidos e bases às composições da presente invenção para se ajustar o seu pH. Podem também ser incluídos agentes para aumentar a distância de difusão dos agentes liberados da matriz polimérica.
Os desintegrantes são substâncias que, na presença de líquido, promovem a desintegração das composições da 77 presente invenção. Os desintegrantes são empregados com grande frequência em implantes, em que a função do desintegrante consiste em se opor ou neutralizar o efeito de qualquer material de ligação usado no preparado da presente invenção. Em geral, o mecanismo da desintegração consiste no material insolúvel absorver a umidade e inchar.
Exemplos de desintegrantes incluem croscarmelose sódica e crospovidone, que, em determinadas modalidades, podem ser incorporadas ás matrizes poliméricas dentro de limites de aproximadamente 1-20% do peso total da matriz. Em outros casos, podem também ser acrescentadas cargas solúveis tais como açúcares (manitol e lactose) para facilitar a desintegração dos implantes.
Outros materiais podem ser usados para melhorar ou controlar a velocidade de libertação desejada de um agente terapêutico para um protocolo de tratamento especifico. Se a libertação sustentada for demasiada para uma aplicação especifica, por exemplo, pode ser acrescentado um agente formador de poros para gerar poros adicionais na matriz. Qualquer material hidrossolúvel biocompatível pode ser usado como agente formador de poros. Eles podem ser capazes de se dissolver, se difundir ou se dispersar para fora do sistema polimérico formado sendo então gerados no sistema poros e canais microporosos. A quantidade de agente formador de poros (e o tamanho das partículas dispersas de tal agente formador de poros, se for adequado) no interior da composição deve afetar o tamanho e o número dos poros no sistema polimérico.
Os agentes formadores de poros incluem qualquer substância orgânica ou inorgânica farmaceuticamente aceitável que seja substancialmente miscivel em água e nos fluidos corporais e 78 que se dissipará a partir da matriz em formação e formada para dentro do meio aquoso ou os fluidos corporais ou para substância imisciveis em áqua que rapidamente se degradam em substâncias hidrossolúveis.
Os agentes formadores de poros adequados incluem, por exemplo, açúcares tais como sacarose e dextrose, sais tais como cloreto de sódio e carbonato de sódio e polimeros tais como hidróxi-propil-celulose, carbóxi-metil-celulose, polietileno glicol e PVP. Pode-se fazer variar o tamanho e a extensão dos poros, alterando-se o peso molecular e a porcentagem do agente formador de poros incorporados ao sistema polimérico. A carga, caráter lipófilo ou hidrófilo de qualquer matriz polimérica da presente invenção podem ser modificadas ligando-se de um modo qualquer um composto adequado à superfície da matriz. Podem ser usados, por exemplo, tensoativos para aumentar a umectabilidade de composições de fraca solubilidade ou hidrófobas. Exemplos de tensoativos adequados incluem dextrano, polissorbatos e lauril sulfato de sódio. Em geral os tensoativos são usados a baixas concentrações, geralmente abaixo de aproximadamente 5%.
Aglutinantes são materiais adesivos que podem ser incorporados aos preparados poliméricos para ligar e manter a integridade da matriz. Os aglutinantes podem ser acrescentados em forma de um pó seco ou em forma de solução. Açúcares e polimeros naturais e sintéticos podem atuar como aglutinantes.
Os materiais acrescentados especificamente como aglutinantes são geralmente incluídos na faixa de aproxima-damente 0,5%- 79 15% peso/peso do preparado da matriz. Determinados materiais tais como celulose microcristalina também usada como um intensificador de esferonização, também têm propriedades adicionais aglutinantes.
Diversos revestimentos podem ser aplicados para modificar as propriedades das matrizes.
Três tipos exemplares de revestimento são reves-timento de vedação, brilho e entérico. Outros tipos de revestimento tendo diversas propriedades de dissolução ou erosão podem ser usados para modificar ainda mais o comportamento das matrizes da presente invenção, e tais revestimentos são conhecidos dos versados na técnica. 0 revestimento de vedação pode impedir a absorção de umidade excessiva pela matriz durante a aplicação de revestimentos entéricos aquosos. 0 revestimento de brilho geralmente melhora a manipulação das matrizes acabadas. Os materiais hidrossolúveis tais como hidroxipropil celulose podem ser usados para aplicar revestimento de vedação e revestimento de brilho nos implantes. 0 revestimento de vedação e o revestimento de brilho são geralmente pulverizados sobre as matrizes até se observar um aumento de peso entre aproximadamente 0,5% e aproximadamente 5%, frequentemente de aproximadamente 1% para o revestimento de vedação e de aproximadamente 3% para o revestimento de brilho.
Os revestimentos entéricos consistem em polímeros que são insolúveis no pH baixo (abaixo de 3,0) do estômago, mas são solúveis no pH elevado (acima de 4,0) do intestino delgado. Os polímeros tais como EUDRAGIT™, RohmTech, Inc., Malden, Mass., e AQUATERIC™, FMC Corp., Filadélfia, Penn., podem 80 ser usados e são aplicados em camadas em forma de membranas delgadas sobre os implantes a partir de uma solução ou suspensão aquosa ou por um método de secagem por pulverização. 0 revestimento entérico é geralmente pulverizado até um aumento de peso de aproximadamente 1% até aproximadamente 30%, de preferência, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15% e pode conter adjuvantes tais como plastificantes, tensoativos, agentes de separação que reduzem a pegajosidade dos implantes durante o revestimento e ajustadores de permeabilidade de revestimento.
As composições da presente invenção podem além disso conter um ou mais aditivos opcionais tais como reforço fibroso, colorantes, perfumes, modificadores de borracha, agentes modificadores etc. Na prática, cada um destes aditivos opcionais deve ser compatível com o polímero resultante e com o seu uso final. Exemplos de reforço fibroso adequado incluem microfibrilas de PGA, microfibrilas de colágeno, microfibrilas celulósicas e microfibrilas olefínicas. A quantidade de cada um destes aditivos opcionais empregados na composição é uma quantidade necessária para se obter o efeito desejado.
Os conjugados poliméricos terapêuticos conforme descritos no presente podem ser administrados em diversos preparados farmacêuticos, dependendo do distúrbio a ser tratado e a idade, condição e peso corporal do paciente, conforme é bem conhecido na técnica. Nos casos em que os compostos devem ser administrados oralmente, por exemplo, eles podem ser preparados em forma de comprimidos, cápsulas, grânulos, pós ou xaropes; ou para administração parenteral, eles podem ser preparados em forma de injeções (intravenosas, intramusculares ou subcutâneas), preparados de infusão de 81 gotejamento ou supositórios. Para a aplicação pela via de membrana mucosa oftálmica, eles podem ser preparados em forma de gotas oculares ou unguento ocular. Estes preparados podem ser preparados por meio convencionais e, se for desejado, o ingrediente ativo pode ser misturado com qualquer aditivo convencional, tal como um excipiente, um aglutinante, um agente desintegrante, um lubrificante, um corretor, um agente solubilizante, um auxiliar de suspensão, um agente emulsificante ou um agente de revestimento. Embora a dosagem variará dependendo dos sintomas, idade e peso corporal do paciente, a natureza e a severidade do distúrbio a ser tratado ou prevenido, a via de administração e a forma do medicamento, em geral uma dosagem diária de 0,01 a 2000 mg do agente terapêutico é recomendada para um paciente adulto humano e isto pode ser administrado em uma única dose ou em doses divididas. O momento preciso da administração e/ou a quantidade do conjugado polimérico terapêutico que resultará nos resultados mais eficazes em termos de eficácia de tratamento em um dado paciente, dependerá da atividade, farmacocinética e biodisponibilidade de um composto especifico, da condição fisiológica do paciente (incluindo idade, sexo, tipo e estágio da doença, condição fisica geral, resposta a uma dosagem dada e tipo de medicação) , da via de administração etc. No entanto, as diretrizes acima podem ser usadas como base para a modulação fina do tratamento, para a determinação do momento ótimo e/ou quantidade ótima de administração, por exemplo, o que não exigirá mais do que a experimentação rotineira que consiste no monitoramento do paciente e no ajuste da dosagem e/ou do momento da sua administração. 82 A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada no presente para se referir àqueles conjugados poliméricos terapêuticos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito de bons critérios médicos, adequadas para usar em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem uma excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, compatível com uma relação razoável de benefício/risco. A expressão "veículo farmaceuticamente aceitável" conforme empregado no presente, significa um material, composição ou veículo, tal como uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante, implicados na condução ou transporte da substância química da presente invenção de um órgão, ou porção do corpo a outro órgão ou porção do corpo, material, composição ou veículo este que seja farmaceuticamente aceitável. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os demais ingredientes do preparado e não sejam nocivos ao paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de caroço de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propileno glicol; (11) polióis, tais com glicerina sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) agar; (14) agentes tampão, tais como hidróxido de magnésio e 83 hidróxido e alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirógenos; (17) solução salina isotónica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) solução de tampão de fosfato; e (21) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas nos preparados farmacêuticos. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a sais de adição de ácido inorgânicos e orgânicos relativamente não tóxicos dos conjugados poliméricos terapêuticos. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos conjugados poliméricos terapêuticos, ou fazendo-se reagir separadamente um polímero purificado na sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado e isolando-se o sal assim formado. Os sais representativos incluem os sais bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, valeriato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naftilato, mesilato, glico-heptonato, lactobionato e laurilsulfonato e análogos (Veja, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66:1-19).
Em outros casos, os conjugados poliméricos terapêuticos úteis nos métodos da presente invenção podem conter um ou mais grupos funcionais ácidos e, assim, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com bases farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" nestes casos se refere a sais de adição de base relativamente não tóxicos inorgânicos e orgânicos do(s) polímero(s). Estes sais podem também ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais do(s) polímero(s) ou fazendo-se reagir separadamente o(s) 84 polímero(s) purificado(s) na sua forma ácida livre com uma base adequada, tal como hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um cátion farmaceuticamente aceitável com amónia, ou com uma amina primária, secundária ou terciária orgânica farmaceuticamente aceitável. Os sais alcalinos ou alcalino-terrosos representativos incluem os sais de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio e análogos. As aminas orgânicas representativas para a formação dos sais de adição de base incluem etilamina, dietilamina, etileno diamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina e análogos (veja, por exemplo, Berge et al., supra).
Agentes humectantes, emulsificantes e lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes colorantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, adoçantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas composições.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes hidrossolúveis tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e análogos; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidróxi-anisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galiato de propila, alfa-tocoferol e análogos; e (3) agentes quelantes metálicos tais como ácido cítrico, ácido etileno diamina tetra-acético (EDTA), sorbiton, ácido tartárico, ácido fosfórico e análogos.
Os preparados úteis nos métodos da presente invenção incluem aqueles para a administração oral, nasal, tópica (inclusive oftálmica, ótica, bucal e sublingual), retal, vaginal, em 85 aerossol e/ou parenteral. Os preparados podem ser convenientemente apresentados na forma de dosagem unitária e podem ser preparados por qualquer método bem conhecido na técnica farmacêutica. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veiculo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro que estiver sendo tratado, do modo especifico de administração. A quantidade do ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veiculo para produzir uma forma de dosagem única geralmente será aquela quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, esta quantidade variará de aproximadamente 1 por cento a aproximadamente noventa e nove por cento do ingrediente ativo, de preferência de aproxima-damente 5 por cento a aproximadamente 70 por cento, sendo o mais preferível de aproximadamente 10 por cento a aproximadamente 30 por cento.
Os métodos de preparação destes preparados ou composições incluem a etapa de se colocar em associação um conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) com o veículo e opcionalmente, com um ou mais ingredientes acessórios. em geral, os preparados são preparados colocando uniforme e intimamente em associação um conjugado polimérico terapêutico com veículos líquidos, ou com veículos sólidos finamente divididos ou com ambos, e em seguida, se for necessário, dando formato ao produto.
Os preparados adequados para a administração oral podem se encontrar na forma de cápsulas, cachês, pílulas, comprimidos, gomas, pastilhas (usando uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto), pós, grânulos ou em forma de uma solução ou de uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso ou em forma de uma emulsão líquida de 86 óleo em água ou de água em óleo, ou em forma de um elixir ou xarope ou em forma de pastilhas (usando uma base inerte, tal como elatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguante bucal e semelhantes, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) como um ingrediente ativo. Um composto pode também ser administrado em forma de um bolo, eletuário ou pasta.
Um comprimido pode também ser preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos preparados por compressão podem ser preparados empregando-se aglutinante (gelatina ou hidroxipropil metil celulose, por exemplo), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (glicolato de amido sódico, ou carboximetil celulose sódica reticulada, por exemplo), agente tensoativo ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser preparados moldando-se em uma máquina adequada uma mistura do peptídeo peptidomimético em pó umedecido com um diluente liquido inerte.
Os comprimidos e outras formas de dosagem sólida, tais como drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser opcionalmente riscados ou preparados com revestimentos ou cascos, tais como revestimento entérico e outros revestimentos conhecido na técnica de preparação de produtos farmacêuticos. Eles podem também ser preparados de modo tal que proporcionem uma libertação lenta ou controlada do ingrediente ativo em seu interior, empregando-se, por exemplo, hidroxipropil metil celulose em proporções variáveis para prover o perfil de libertação desejado, outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas. Eles podem ser esterilizados, por exemplo, por filtração 87 através de um filtro retentor de bactérias, ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas em água estéril ou algum outro meio injetável estéril imediatamente antes do uso. Estas composições podem também conter opcionalmente agentes opacificantes e podem ser de uma composição tal que eles liberem o(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, ou de preferência, em uma porção determinada do trato gastrintes-tinal, opcionalmente, de um modo retardado. Exemplos de composições de engaste que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. 0 ingrediente ativo pode também se encontrar na forma micro-encapsulada, se for adequado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.
As formas de dosagem liquida para a administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem liquida podem conter diluentes inertes habitualmente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etilico, álcool isopropilico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzilico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (mais especificamente, óleos de caroço de algodão, de amendoim, de milho, germe de trigo, oliva, mamona e gergelim), glicerol, álcool tetraidrofurilico, polietileno glicóis e ésteres de ácido gordo de sorbitan, e suas misturas.
Além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes humectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes e conservantes.
As suspensões, além dos conjugados poliméricos terapêuticos ativos podem conter agentes de suspensão, tal como, por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitan, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, agar-agar e tragacanto e suas misturas.
Os preparados para a administração retal ou vaginal podem ser apresentados em forma de um supositório, que pode ser preparado misturando-se um ou mais conjugados terapêuticos poliméricos com um ou mais excipientes adequados não irritantes ou veículos compreendo, por exemplo, manteiga de cacau, polietileno glicol, uma cera para supositórios ou um salicilato, e que é sólido à temperatura ambiente, mas líquido à temperatura corporal, e, portanto, fundirá no reto ou na cavidade vaginal e liberará o agente ativo.
Os preparados que são adequados para a administração vaginal também incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas e preparados para pulverização contendo tais veículos que são conhecidos na técnica como sendo adequado.
As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de um conjugado(s) polimérico(s) terapêutico (s) inclui pós, pulverizações, unguentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inalantes. 0 componente ativo pode ser misturado em condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com quaisquer preservativos, tampões ou propelentes que possam ser necessários. 89
Os unguentos, pastas, cremes e géis podem conter, além do(s) ligante(s), excipientes, tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto,derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, ácido silicico, talco e óxido de zinco ou suas misturas.
Os pós e pulverizações podem conter, além de um conjuga(s) polimérico(s) terapêutico(s), excipientes tais como lactose, ácido silicios, hidróxido de aluminio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. As pulverizações podem além disso conter propelentes habituais tais como cloroflúor-hidrocarbonetos e hidrocarbonetos voláteis não substituídos tais com butano e propano. 0(s) conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) pode(m) ser alternativamente administrado(s) por aerossol. Isto se obtém preparando-se um aerossol aquoso, preparado lipossômico ou partículas sólidas contendo o composto. Poderia ser usada uma suspensão não aquosa (de propelente fluorcarbono, por exemplo). Nebulizadores sónicos são preferidos pois eles minimizam a exposição do agente a cisalhamento que pode resultar na degradação do composto.
Habitualmente, um aerossol aquoso é produzido preparando-se uma solução aquosa ou suspensão do agente juntamente com veículos e estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis convencionais. Os veículos e estabilizantes variam com as exigências do composto específico tipicamente incluindo tensoativos não iônicos (Tweens, Pluronics ou polietileno glicol), proteínas inócuas como albumina sérica, ésteres de sorbitan, ácido oléico, lecitina, aminoácidos tais como glicina, tampões, sais açúcares ou álcoois de açúcares. Os 90 aerossóis são geralmente preparados a partir de soluções isotónicas.
Os adesivos transdermais têm a vantagem adicional de proporcionar um fornecimento controlado de um conjugado (s) polimérico(s) terapêuticos) ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser preparadas dissolvendo-se ou dispersando-se o agente no meio adequado. Os intensificadores de absorção podem também ser usados para aumentar o fluxo do ligante através da pele. A velocidade de tal fluxo pode ser controlada quer proporcionando uma membrana controladora da velocidade ou dispersando-se o peptidomimético numa matriz polimérica ou gel.
Os preparados oftálmicos, unguentos oculares, pós, soluções e análogos incidem também no âmbito da presente invenção.
As composições farmacêuticas da presente invenção adequadas para a administração parenteral compreendem um ou mais conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) em combinação com um ou mais soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas isotónicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveis estéreis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam o preparado isotônico com o sangue do receptor destinado ou agentes de suspensão ou espessantes.
Exemplos de veículos aquosos ou não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêu-ticas da presente invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e análogos) e 91 tais como óleo de oliva e misturas suas, óleos vegetais, ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, empregando-se materiais de revestimento, tais como lecitina, mantendo-se o tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e com o uso de tensoativos.
Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsi-ficantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada com a inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, tais como parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, por exemplo e análogos. Pode ser também desejável se incluir agentes isotônicos tais como açúcares, cloreto de sódio e análogos nas composições. Além disso pode ser produzida uma absorção prolongada da forma farmacêutica injetável incluindo-se agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Em algumas casos, a fim de se prolongar o efeito de um medicamento é desejável se retardar a absorção do medicamento a partir da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser obtido empregando-se uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo que tenha uma hidrossolubili-dade precária. A velocidade de absorção do medicamento então depende da sua velocidade de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho dos cristais e da forma cristalina. Alternativa, a absorção retardada de uma forma de medicamento administrada por via parenteral é obtido dissolvendo-se ou suspendendo-se o medicamento num veículo oleoso. 92
As formas de deposição injetáveis são preparadas formando-se matrizes microencapsuladas do(s) conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) em polímeros biodegradáveis tais como de polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da relação de medicamento para polímero, e da natureza do polímero específico empregado, a velocidade de libertação do medicamento pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Os preparados injetáveis de deposição são também preparados aprisionando-se o medicamento em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com o tecido corporal.
Quando o(s) conjugado(s) polimérico(s) terapêutico (s) da presente invenção é (são) administrado(s) como produtos farmacêuticos, a seres humanos ou a animais eles pode ser dados isoladamente ou em forma de uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, de 0,1 a 99,5% (sendo mais preferível de 0,5 a 90%) do ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Os preparados de agentes podem ser administrados por via oral, parenteral, tópica ou retal. Eles são naturalmente administrados por formas adequadas a cada via de administração. Eles são administrados em forma de comprimidos ou cápsulas, por injeção, inalação, loção ocular, unguento, supositório, infusão, por exemplo; topicamente por loção ou unguento; e por via retal por supositórios. A administração oral é a preferida.
As expressões "administração parenteral" e "administrado por via parenteral" conforme empregado no presente significa modo de administração distintos da enteral e tópica administração, geralmente por injeção e inclui, sem 93 intramuscular, intraorbital, transtraqueal, subcapsular, limitação, injeção e infusão intravenosa, intraarterial, intratecal, intracapsular, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subaracnóide, intra-espinhal e intraesternal. A expressão "administração sistémica, "administrado sistemicamente", administração periférica" e "administrado perifericamente", conforme empregado no presente significa a administração de um conjugado polimérico terapêutico, medicamento ou outro material de modo diferente do diretamente no sistema nervoso central, de modo tal gue entre no sistema do paciente e assim, seja sujeito a metabolismo e a outros processos, tal como por administração subcutânea, por exemplo.
Este(s) conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) pode(m) ser administrado(s) a seres humanos e a outros animais por terapia pro gualguer via adeguada de administração, inclusive por via oral, nasal, tal como, por exemplo, em forma de uma pulverização, por via retal, intravaginal, parenteral, intracisternal e topicamente, em forma de pós, unguentos ou gota, incluindo por via bucal e sublingual.
Independentemente da via de administração selecio-nada, o(s) conjugado(s) polimérico(s) terapêutico(s) gue pode(m) ser usados em uma forma hidratada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são preparados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por processos convencionais conhecidos dos versados na técnica.
Pode se fazer variar os niveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da 94 presente invenção de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja efetiva para se atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração específicos sem ser tóxico ao paciente. (c) Estruturas Físicas das Composições da Presente Invenção
Os polímeros da presente invenção podem ser formados em uma variedade de formato. Em determinadas modalidades, por exemplo, as matrizes poliméricas da presente invenção podem se apresentar na forma de micropartículas ou nanopartículas. As microesferas tipicamente compreendem uma matriz polimérica biodegradável que incorpora um medicamento. As microesferas podem ser formadas por uma ampla variedade de técnicas conhecidas dos versados na técnica. Exemplos de técnicas de formação de microesferas incluem, sem limitação, (a) separação de fases por emulsificação e subsequente evaporação do solvente orgânico (incluindo métodos de emulsão complexa tais como emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo e emulsões de água-óleo-água) ; (b) separação de fase de coacervação; (c) dispersão no estado fundido; (d) deposição interfacial; (e) polimerização in situ; (f) secagem por pulverização e congelamento por pulverização; (g) revestimento por suspensão no ar; e (h) revestimento de panela e pulverização. Estes métodos, assim como as propriedades e características de microesferas são descritas na patente U.S. N° 4.652.441; patente U.S. N° 5.100669; patente U.S. N° 4.526.938; WO 93;24150; EPA 0258780 A2; patente U.S. N° 4.438.253; e patente U.S. N° 5.330.768. 95
Para se preparar as microesferas da presente invenção, podem ser empregados diversos métodos dependendo da aplicação desejada dos veículos de fornecimento. Os métodos adequados incluem, sem limitação, secagem por pulverização, secagem por congelamento, secagem ao ar, secagem a vácuo, secagem por leito fluidificado, trituração, co-precipitação e extração de fluido crítico. No caso de secagem por pulverização, secagem por congelamento, secagem ao ar, secagem a vácuo, secagem em leito fluidificado e extração de fluido crítico, os componentes (poliol estabilizador, material bioativo, tampões etc.) são primeiro dissolvidos ou suspensos em condições aquosas. No caso de trituração, os componentes são misturados na forma seca e triturados por qualquer método conhecido na técnica. No caso de co-precipitação, os componentes são misturados em condições orgânicas e processados do modo descrito abaixo. A secagem por pulverização pode ser usada para carregar o poliol de estabilização com o material bioativo. Os componentes são misturados em condições aquosas e secados empregando-se bicos de precisão para produzir gotículas extremamente uniformes em uma câmara de secagem. As máquinas de secagem por pulverização adequadas incluem, sem limitação, secadores de pulverização Buchi, NIRO,APV e Lab-plant usados de acordo com as instruções dos fabricantes. 0 formato de micropartículas e nanopartículas pode ser determinado por microscopia eletrónica. As nano-partícuias de formato esférico são usadas em determinadas modalidades, para circulação pela corrente sanguínea. Se for desejado, as partículas podem ser fabricadas empregando-se técnicas conhecidas em outros formatos que sejam mais úteis para uma aplicação específica. 96
Além do fornecimento intracelular de um agente terapêutico, é também possível que partículas das composições da presente invenção, tais como micropartículas ou nano-partículas possam sofrer endocitose, obtendo assim acesso à célula. A frequência de tal processo de endocitose dependerá provavelmente das dimensões de qualquer partícula.
Em determinadas modalidades, pode ser usados artigos sólidos úteis na definição do formato e para conferir rigidez e resistência estrutural às matrizes poliméricas. Um polímero, por exemplo, pode ser formado sobre uma tela ou outra trama para implantação. Um polímero pode também ser fabricado em forma de uma sonda ou de uma derivação, adaptado para manter abertas áreas no interior dos tecidos corporais ou para drenar fluido de uma cavidade ou luz corporal para outra. Além disso um polímero pode ser fabricado em forma de um dreno ou de um tubo adequado para a remoção de fluidos de um sítio pós operativo e em algumas modalidades adaptável para ser usado com sistemas de drenagem de seção fechada tais como drenos Jackson-Pratt e análogos como é habitual na técnica.
As propriedades mecânicas do polímero podem ser importantes para a processabilidade de se produzir artigos moldados ou prensados para a implantação. A temperatura de transição vítrea, por exemplo, pode variar muito, mas deve ser suficientemente mais baixa do que a temperatura de decomposição para acomodar técnicas de fabricação convencionais, tais como moldagem por compressão, extrusão ou moldagem por injeção. 97 (d) Biodegradabilidade e Características de Libertação
Em determinadas modalidades os polímeros e misturas da presente invenção, depois de contato com os fluidos corporais, sofrem uma degradação gradual. A vida de um polimero biodegradável in vivo depende, dentre outras coisas, do seu peso molecular, da sua cristalinidade, bioestabilidade e do grau de reticulação. Em geral quanto maior o peso molecular, quanto mais alto o grau de cristalinidade e quanto maior a bioestabilidade, tanto mais lenta será a biodegradação.
Se uma composição da presente invenção for preparada com um agente terapêutico ou com outro material, geralmente resulta a libertação de um tal agente ou outro material durante um período de tempo sustentado ou prolongado em comparação com a libertação de uma solução salina isotônica. Um tal perfil de libertação pode resultar em um fornecimento prolongado (durante, digamos de 1 a aproximadamente 2.000 horas, ou alternativamente aproximada-mente 2 a aproximadamente 800 horas) de quantidades efetivas (aproximadamente 0,0001 mg/kg/hora, por exemplo até aproximadamente 10 mg/kg/hora) do agente ou de qualquer outro material associado com o polímero.
Uma variedade de fatores pode afeta a velocidade desejada de hidrólise de polímeros da presente invenção, a maciez e flexibilidade desejada da matriz sólida resultante, velocidade e extensão da libertação do material bioativo. Alguns tais fatores incluem a seleção/identidade de diversas subunidade a pureza enantiomérica ou diastereoisomérica das subunidades monoméricas, homogeneidade das subunidades encontradas no polímero e comprimento do polímero. A 98 presente invenção inclui heteropolimeros com diversos ligações, por exemplo, e/ou a inclusão de outros elementos monoméricos no polimero a fim de controlar, por exemplo, a velocidade de biodegradação da matriz.
Para ilustrar ainda mais, pode se obter uma ampla faixa de velocidades de degradação ajustando-se os graus de hidrofobicidade das estruturas principais ou das cadeias laterais dos polímeros, mantendo ao mesmo tempo uma biodegradabilidade suficiente para o uso pretendido para qualquer tal polímero. Um tal resultado pode ser atingido fazendo-se variar os diversos grupos funcionais do polímero. A combinação de uma estrutura principal hidrófoba com uma ligação hidrófila por exemplo, produz uma degradação heterogénea, pois encoraja-se a clivagem ao passo que se resiste à penetração da água.
Um protocolo geralmente aceite no campo e que pode ser usado para determinar a velocidade de libertação de qualquer agente terapêutico ou de outro material com que se carregam as matrizes poliméricas da presente invenção abrange da degradação de qualquer tal matriz em uma solução de PBS a 0,1M (pH 7,4) a 37°C, um ensaio conhecido na técnica. Para os fins da presente invenção, o termo "protocolo PBS" é usado no presente para se referir a tal protocolo.
Em determinados casos, as velocidades de libertação de sistemas poliméricos diferentes da presente invenção podem ser comparada, submetendo-se as mesmas a tal protocolo. Em determinados casos, pode ser necessário se processar sistemas poliméricos do mesmo modo para permitir que se façam comparações diretas e relativamente precisas de diferentes sistemas. A presente invenção instrui sobre meios 99 diferentes diversos de preparação das matrizes poliméricas da presente invenção, por exemplo. Tais comparações podem indicar que qualquer um sistema polimérico libera o material incorporada a uma velocidade de aproximadamente 2 a menos de aproximadamente 1000 ou mais vezes mais rápido que um outro sistema polimérico.
Alternativamente, uma comparação pode revelar uma diferença de velocidades de aproximadamente 3, 5, 7, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou 750 vezes. Diferenças mais altas ainda entre velocidades incidem no âmbito da presente invenção e nos protocolos de velocidade de libertação.
Em determinadas modalidades, quando preparados de um modo determinado, a velocidade de libertação para sistemas poliméricos da presente invenção pode apresentar como monofásicos ou bifásicos. A libertação de qualquer material incorporado à matriz polimérica, que é frequentemente provida em forma de uma microesfera, pode ser caracterizada em determinados casos por uma velocidade de libertação inicial aumentada, o que pode liberar de aproximadamente 5 a aproximadamente 50% ou mais de qualquer material incorporado, ou alternativamente aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, ou 40%, seguido por uma velocidade de libertação de grau inferior. A velocidade de libertação de qualquer material incorporado pode também ser caracterizada pela quantidade de tal material liberado pro dia por mg da matriz polimérica. em determinadas modalidades, por exemplo, a velocidade de libertação pode variar de aproximadamente 1 ng ou menos de qualquer material incorporado por dia por mg do sistema 100 polimérico a aproximadamente 500 ou mais ng/dia/mg. Alternativamente, a velocidade de libertação pode ser de aproximadamente 0,05, 0,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 ng/dia/mg. Em outras modalidades ainda, a velocidade de libertação de qualquer material incorporado pode ser de 10.000 ng/dia/mg ou ainda mais alta. Em determinados casos, os materiais incorporados e caracterizados por tais protocolos de velocidade de libertação podem incluir agentes terapêuticos, cargas e outras substâncias.
Em um outro aspecto, a velocidade de libertação de qualquer material de qualquer matriz polimérica da presente invenção pode ser apresentada como a meia vida de tal material na matriz.
Além da modalidade que abrange protocolos para a determinação de velocidades de libertação in vitro, protocolos in vivo, em que em determinados casos podem ser determinadas as velocidades de libertação para sistemas poliméricos incidem também no âmbito da presente invenção. Outros ensaios úteis para a determinação da libertação de qualquer material dos polímeros do sistema da presente invenção são conhecidos na técnica. (e) Implantes e Sistemas de Fornecimento
Na sua forma mais simples, um sistema de fornecimento biodegradável para um agente terapêutico consiste em uma dispersão de tal agente terapêutico em uma matriz polimérica. Em outras modalidades, um artigo é usado para o implante, injeção ou de outro modo colocado total ou parcialmente no interior do corpo, compreendendo o artigo as 101 composições da presente invenção. É especialmente importante que um tal artigo resulte em um minimo de irritação aos tecidos quando implantado ou injetado no tecido vascularizado.
Os sistemas de fornecimento biodegradáveis, e os artigos deles, podem ser preparados de uma variedade de modos conhecidos na técnica. 0 polimero da presente invenção pode ser processado no estado fundido empregando-se técnicas convencionais de extrusão ou de moldagem por injeção, ou então estes produtos podem ser preparados dissolvendo-se os mesmos em um solvente adequado, seguindo-se da formação do dispositivo e a remoção subsequente do solvente por evaporação ou extração.
Quando um sistema ou artigo de implante se encontra em seu lugar, ele deve permanecer pelo menos em contato parcial com um fluido biológico, tal como sangue, secreções de órgãos interno, membranas mucosas, fluido cérebro-espinhal e análogos, para permitir a libertação sustentada de qualquer agente terapêutico encapsulado. (f) Métodos de Fabricação
Geralmente, os compostos da presente invenção podem ser preparados de um de dois modos: monómeros portando agentes terapêuticos, ligantes de alvejamento e/ou porções de ciclodextrina podem ser polimerizados, ou então as estruturas principais do polimero podem ser derivadas com agentes terapêuticos, ligantes de alvejamento e/ou porções de ciclodextrina. 102
Assim, numa modalidade, a presente invenção contempla a sintese de compostos da invenção fazendo reagir os monómeros M-L-CD e M-L-D (e opcionalmente M-L-T), em que CD representa uma porção cíclica, tal como um molécula de ciclodextrina, ou derivado seu; L, independentemente a cada ocorrência, pode estar ausente ou representa um grupo ligante; D, independentemente para cada ocorrência, representa agentes terapêuticos iguais ou diferentes ou seus promedicamentos; e T, independentemente a cada ocorrência, representa ligantes de alvejamento iguais ou diferentes ou seu precursor; e M representa uma subunidade monomérica portando uma ou mais porções reativas capazes de sofrer uma reação de polimerização com um ou mais de outros M nos monómeros na mistura de reação, em condições que produzem a polimerização dos monómeros.
Em determinadas modalidades, a mistura de reação pode ainda compreender monómeros que não portam porções CD, T ou D, tal como para separar as unidades monoméricas derivadas em todo o polímero.
Numa modalidade alternativa, a invenção contempla a síntese de um composto da presente invenção fazendo um polímero P (o polímero que porta uma multiplicidade de grupos reativos, tais como ácidos carboxílicos, álcoois, tióis, aminas, epóxidos etc) reagir com os agentes de enxertia X-L-CD e Y-L-D (e opcionalmente, Z-L-T), em que CD representa uma porção ciclica, tal como um molécula de ciclodextrina, ou derivado seu; L, independentemente a cada ocorrência, pode estar ausente ou representa um grupo ligante; 103 D, independentemente a cada ocorrência, representa agentes terapêuticos iguais ou diferentes ou promedicamentos seus; T, independentemente a cada ocorrência, representa ligantes de alvejamento iguais ou diferentes ou seus precursores; X, independentemente a cada ocorrência, representa um grupo reativo, tal como ácidos carboxilicos, álcoois, tióis, aminas, epóxidos etc., capazes de formar uma ligação covalente com um grupo reativo do polímero; e Y e Z, independentemente a cada ocorrência, representam hospedeiros de inclusão ou grupos reativos, tais como ácidos carboxilicos, álcoois, tióis, aminas, epóxidos etc., capazes de formar uma ligação covalente com um grupo reativo do polímero ou complexos de inclusão com porções CD enxertadas no polímero, em condições que façam os agentes de enxertia formar ligações por covalência e/ou complexos de inclusão, conforme for adequado, com o polímero ou com porções enxertadas no polímero.
Se o polímero incluir, por exemplo, álcoois, tióis, ou aminas como grupos reativos, os agentes de enxertia podem incluir grupos reativos que reagem com eles, tais como isocianatos, isotiocianatos, cloretos ácidos, anidridos ácidos, epóxidos, cetenas, cloretos de sulfonila, ácidos carboxilicos ativados (ácidos carboxilicos tratados com um agente de ativação tal como PyBrOP, carbonildiimi-dazol ou um outro reagente que reage com um ácido carboxílico para formar uma porção suscetível a um ataque nucleófilo) ou outras porções nucleófilas conhecidas dos versados na técnica. Em determinadas modalidades, um catalisador pode ser necessário para produzir a reação (um ácido de Lewis, por exemplo, um catalisador de metal de transição, uma base amina etc., conforme será compreendido pelos versados na técnica. 104
Em determinadas modalidades, faz-se reagir os agentes de enxertia diferentes com o polímero simultaneamente ou substancialmente simultaneamente (em uma reação de um recipiente, por exemplo), ou faz-se reagir em sequência com o polímero (opcionalmente com uma etapa de purificação e/ou de lavagem entre as reações).
Um outro aspecto da presente invenção consiste num método para a fabricação de polímeros lineares ou ramificados contendo ciclodextrina representados pelas fórmulas I-III. Embora a discussão abaixo se concentre na preparação de moléculas lineares de ciclodextrina os versados na técnica reconhecerão com facilidade que os métodos descritos podem ser adaptados para a produção de polímeros ramificados escolhendo-se um precursor adequado para o comonómero A.
Consequentemente, uma modalidade da presente invenção consiste num método de preparação de um copolímero linear de ciclodextrina. De acordo com a invenção, um copolímero linear de ciclodextrina da invenção pode ser preparado copolimerizando-se um precursor de monómero de ciclodextrina di-substituído com um grupo de saída adequado com um precursor de comonómero A capaz de deslocar os grupos de saída. 0 grupo de saída, que pode ser o mesmo ou diferente, pode ser qualquer grupo de saída conhecido na técnica que possa ser deslocado por copolimeri-zação com um precursor de comonómero A. Em uma modalidade preferida, um copolímero linear de ciclodextrina pode ser preparado tratando-se com iodo um precursor de monómero de ciclodextrina para formar um precursor de monómero de ciclo-dextrina diiodado e copolimerizando-se o precursor de monómero diiodado de ciclodextrina com um precursor de comonómero A para formar 105 um copolímero linear de ciclodextrina tendo uma unidade repetida de fórmula II ou III ou uma combinação delas, cada uma de acordo com o descrito acima. Embora os exemplos apresentados abaixo discutam porções de ciclodextrina iodadas, os versados na técnica reconhecerão prontamente que a presente invenção contempla e abrange porções de ciclodextrina em que outros grupos de saida tais com alquil e aril sulfonato possa estar presente em vez de grupos iodo. Em uma modalidade preferida, um método de preparação de um copolímero linear de ciclodextrina da presente invenção por tratamento com iodo de um precursor de monómero de ciclodextrina conforme descrito acima para formar um precursor de monómero de ciclodextrina diiodado da fórmula IVa, IVb, IVc ou uma mistura deles:
]Vb
IVc A ciclodextrina diiodada pode ser preparado por qualquer meio conhecido na técnica (Tabushi et al., J. Am. Chem. 106, 5267-5270 (1984); Tabushi et al., J. Am. Che. 106, 4580-4584 (1984)). Pode-se fazer reagir a β-ciclodextrina, por exemplo, com cloreto de bifenil-4,4'-dissulfonila na presença de piridina anidra para formar uma β-ciclodextrina capeada com cloreto de bifenil-4,4'-dissulfonila que se pode então fazer reagir com iodeto de potássio para produzir 106 diiodo-p-ciclodextrina. 0 precursor de monómero de ciclodextrina é iodado em duas posições somente. Copolimerizando-se o precursor de monómero de ciclodextrina diiodada com um precursor de comonómero A, conforme descrito acima, pode ser preparado um polímero linear de ciclodextrina tendo uma unidade repetida da Fr (a, (b ou uma combinação delas, também conforme descrito acima. Se for adequado, o iodo ou os grupos iodo podem ser substituídos com outros grupos de saída conhecidos.
Também de acordo com a invenção, os grupos iodo ou outro grupo de saída adequado podem ser deslocados com um grupo que permita a reação com um precursor com um comonómero A, conforme definido acima. Um precursor de monómero de ciclodextrina diiodada da fórmula IVa, IVb, IVc, por exemplo, ou uma mistura deles pode ser aminada para formar um precursor de monómero de ciclodextrina diaminada da fórmula Va, Vb, Vc ou uma mistura deles: NH2 nh2
nh2 nh2 nh2
nh2 107 0 precursor de monómero de ciclodextrina diaminada pode ser preparado por qualquer meio conhecido nas técnica (Tabushi et al. Tetrahedron Lett. 18:11527-1530 (1977); Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662 (1975)). Pode-se fazer reagir uma diiodo-p-ciclodextrina, por exemplo, com azida sódica, reduzindo-se então para formar uma diamino-p-ciclodextrina) . 0 precursor de monómero de ciclodextrina é aminado em duas posições somente. O precursor de monómero de ciclodextrina diaminado pode então ser copolimerizado com um precursor de comonómero A, conforme descrito acima,para produzir um copolimero linear de ciclodextrina tendo uma unidade repetida da fórmula II-III ou uma combinação delas, também conforme descrito acima. No entanto, a funcionalidade amino de um precursor de monómero de ciclodextrina diaminada não precisa estar diretamente ligado à porção ciclodextrina. Alternativamente a funcionalidade amino ou outra funcionalidade nucleófila pode ser introduzida pelo deslocamento do iodo ou de outros grupos de saida adequados de um precursor de monómero de ciclodextrina com porções contendo grupos amino tais como, por exemplo, HSCH2CH2NH2 (ou uma molécula di-nucleófila mais geralmente representada por HW-(CRiR2) n“WH em que W, independentemente a cada ocorrência, representa O, S ou NRi; Ri e R2, independentemente a cada ocorrência, representam H, alquila substituído ou não, arila substituído ou não, heteroalquila substituído ou não, heteroarila substituído ou não) com uma base adequada tal como hidreto de metal, álcali ou carbonato alcalino ou amina terciária para formar um precursor de monómero de ciclodextrina diaminada da fórmula Vd, Ve, Vf ou uma mistura deles: 108
Ve
H2N'
Um copolímero linear oxidado contendo ciclodextrina da presente invenção pode ser também preparado oxidando-se um copolímero linear reduzido contendo ciclodextrina da invenção conforme descrito abaixo. Este método pode ser conduzido desde que o comonómero A não contenha uma porção ou grupo sensível a oxidação tal como, por exemplo, um tiol.
De acordo com a invenção, um copolímero linear de ciclodextrina da invenção pode ser oxidado de modo a introduzir pelo menos um monómero oxidado de ciclodextrina no copolímero, de modo tal que o monómero oxidado de ciclodextrina seja uma parte integrante da estrutura principal do polímero. Um copolímero linear de ciclodextrina que contém pelo menos um monómero oxidado de ciclodextrina é definido como um copolímero linear oxidado de ciclodextrina ou um polímero oxidado linear contendo ciclodextrina. 0 monómero de ciclodextrina pode ser oxidado ou do lado da hidroxila secundária ou da primária da porção ciclodextrina. Se mais de um monómero oxidado de ciclodextrina estiver presente em um copolímero linear oxidado de ciclodextrina da presente invenção, podem estar presentes monómeros de ciclodextrina iguais ou diferentes oxidados ou no lado da hidroxila primária, no lado da hidroxila secundária ou em 109 ambos os lados. Para os fins de ilustração um copolimero linear oxidado de ciclodextrina com grupos hidroxila secundários oxidados tem, por exemplo, pelo menos uma unidade da fórmula Via ou VIb:
Nas fórmulas Via e VIb, C é um monómero oxidado substituido ou não de ciclodextrina e A é uma ligação comonómero, isto, é ligada por covalência, à ciclodextrina C oxidada. Além disso nas fórmulas Via e VIb, a oxidação dos grupos hidroxila secundários leva à abertura do anel da porção ciclodextrina e à formação de grupos aldeido.
Um copolimero linear oxidado de ciclodextrina pode ser preparado por oxidação de um copolimero linear de ciclodextrina conforme discutido acima. A oxidação de um copolimero linear de ciclodextrina da presente invenção pode ser obtida por técnicas de oxidação conhecidas na técnica. (Hisamatsu et al., Starch 44: 188-191 (1992)). É preferível se empregar um oxidante tal como, por exemplo, periodato de 110 sódio. Deve ser evidente aos versados na técnica que em condições de oxidação padrão o grau de oxidação pode variar, ou pode se fazê-lo variar, de copolímero a copolímero. Assim, em uma modalidade da invenção, um copolímero linear oxidado da invenção pode conter um monómero oxidado de ciclodextrina. Em uma outra modalidade, substancialmente todos os monómeros de ciclodextrina do copolímero estariam oxidados.
Um outro método de preparação de um copolímero oxidado linear de ciclodextrina da presente invenção abrange a oxidação de um precursor de monómero de ciclodextrina diiodado ou diaminado, conforme descrito acima, para formar um precursor de monómero oxidado diiodado ou diaminado de ciclodextrina e a copolimerização do precursor de monómero oxidado diiodado ou diaminado de ciclodextrina com um precursor de comonómero A. Em uma modalidade preferida, um precursor de monómero oxidado diiodado de ciclodextrina da fórmula Vila, Vllb, VIIc ou uma mistura deles:
O O
111 pode ser preparado oxidando-se um precursor de monómero diiodado de ciclodextrina das fórmulas IVa, IVb, IVc ou uma mistura delas, conforme descrito acima. Em uma outra modalidade preferida, um precursor de monómero oxidado diaminado de ciclodextrina da fórmula VlIIa, VlIIb, VIIIc ou uma mistura deles:
VUIa
VlIIb
pode ser preparado pela aminação de um precursor de monómero oxidado diiodado de ciclodextrina das fórmulas Vila, Vllb, VIIc, ou uma mistura delas, conforme descrito acima. Em uma outra modalidade ainda preferida, um precursor de monómero oxidado diaminado de ciclodextrina da fórmula IXa, IXb, IXc, ou uma mistura delas: 112
pode ser preparado pelo deslocamento do iodo ou de um outro grupo de saída adequado de um precursor de monómero oxidado de ciclodextrina di-substituído com um iodo ou outro grupo de saída adequado com o grupo amino ou outro grupo nucleófilo contendo porção tal como, por exemplo, HSCH2CH2NH2 (ou uma molécula di-nucleófila mais geralmente representada por HW- (CRiR2) n-WH em que W, independentemente a cada ocorrência, representa 0, S ou NRi; Ri e R2, independentemente a cada ocorrência, representa H, alquila substituído ou não, arila substituído ou não, heteroalquila substituído ou não, heteroarila substituído ou não) com uma base adequada tal como hidreto de metal, álcali ou carbonato alcalino ou amina terciária.
Alternativamente um precursor de monómero oxidado diiodado ou diaminado de ciclodextrina, conforme descrito acima, pode ser preparado oxidando-se um precursor de monómero de ciclodextrina para formar um precursor de monómero oxidado 113 de ciclodextrina, diiodando-se e/ou diaminando-se em seguida o monómero oxidado de ciclodextrina, conforme descrito acima. Conforme foi discutido acima, a porção ciclodextrina pode ser modificada com outros grupos de saida diferentes dos grupos iodo e de outras funcionalidades contendo o grupo. 0 precursor de monómero oxidado diiodado ou diaminado de ciclodextrina pode então ser copolimerizado com um precursor de comonómero A, conforme descrito acima, para formar um copolimero linear oxidado de ciclodextrina da invenção.
Um copolimero linear oxidado de ciclodextrina pode também ser ainda mais modificado ligando-se pelo menos um ligante ao copolimero. 0 ligante é conforme descrito acima.
De acordo com a invenção, um copolimero linear de ciclodextrina ou um copolimero linear oxidado de ciclodextrina pode ser ligado ou enxertado a um substrato. 0 substrato pode ser qualquer substrato conforme é reconhecido pelos versados na técnica. Em uma outra modalidade preferida da invenção, um copolimero linear de ciclodextrina ou um copolimero linear oxidado de ciclodextrina pode ser reticulado em um polimero para formar respectivamente, um copolimero reticulado de ciclodextrina ou um copolimero reticulado oxidado de ciclodextrina. 0 polimero pode ser qualquer polimero capaz de reticulação com um copolimero linear ou linear oxidado de ciclodextrina da invenção (tal como polimero de polietileno glicol (PEG), polimero de polietileno). O polimero pode também ser o mesmo copolimero linear de ciclodextrina ou copolimero linear oxidado de ciclodextrina ou um diferente. Assim, um copolimero linear de ciclodextrina, por exemplo, pode ser reticulado em um polimero incluindo, sem limitação, ele mesmo, um outro copolimero linear de ciclodextrina e um copolimero linear 114 oxidado de ciclodextrina. Um copolímero reticulado linear de ciclodextrina da invenção pode ser preparado fazendo-se reagir um copolimero linear de ciclodextrina com um polimero na presença de um agente de reticulação. Um copolimero reticulado linear oxidado de ciclodextrina da invenção pode ser preparado fazendo-se reagir um copolimero linear oxidado de ciclodextrina com um polimero na presença de um agente de reticulação adequado. 0 agente de reticulação pode ser qualquer agente de reticulação conhecido na técnica. Exemplos dos agentes de reticulação incluem diidrazidas e dissulfetos. Em uma modalidade preferida, o agente de reticulação é um grupo instável de modo que um copolimero reticulado pode ser desreticulado se for desejado.
Um copolimero linear de ciclodextrina e um copolimero linear oxidado de ciclodextrina da invenção pode ser caracterizado por qualquer meio conhecido na técnica. Tais métodos de caracterização ou técnica incluem, sem limitação, cromatografia de permeação de gel (GPC), espectrometria de massa de tempo de vôo de ionização de dessorção de laser assistido por matriz (MALDI-TOF Mass spec) , RMN 1H e C13, dispersão de luz e titulação. A invenção também propõe uma composição de ciclodextrina contendo pelo menos um copolimero linear de ciclodextrina e pelo menos um copolimero linear oxidado de ciclodextrina da invenção conforme descrito acima. Consequentemente, ou tanto o copolimero linear de ciclodex-trina como o copolimero linear oxidado de ciclodextrina ou um deles pode estar reticulado em um outro polimero e/ou ligado a um ligante conforme descrito acima. As composições terapêuticas de acordo com a invenção contêm um agente terapêutico e um copolímero linear de ciclodextrina ou um copolímero linear 115 oxidado de ciclodextrina, incluindo copolímeros reticulados, da invenção. Um copolímero linear de ciclodextrina, um copolimero linear oxidado de ciclodextrina e seus derivados reticulados são conforme descrito acima. 0 agente terapêutico pode ser qualquer agente terapêutico biologicamente ativo sintético ou natural incluindo aqueles conhecidos na técnica. Exemplos de agentes terapêuticos adequados incluem, sem limitação, antibióticos, esteróides, polinucleotideos (DNA genômico, DNAc, RNAm, RNA de duas fitas e oligonucleotideos anti-senso, por exemplo), plasmideos, peptídeos, fragmentos de peptídeos, moléculas pequenas (doxorubicina, por exemplo) e outras macromoléculas biologicamente ativas tais como, por exemplo, proteínas e enzimas. (g) Métodos de Negócios
Outros aspectos da invenção propõem determinados métodos de se conduzir negócios. Mais especificamente, a colocação em prática dos métodos da invenção pode permitir composições terapêuticas inéditas e preparados melhorados delas. Esta etapa técnica quando combinada com uma ou mais etapas adicionais proporciona abordagens inéditas para se conduzir um negócio farmacêutico ou de preferência um negócio de bio-ciências. Produtos terapêuticos preparados pelo método da invenção, por exemplo, podem ser estados para eficácia como agentes terapêuticos em uma variedade de modelos de doenças, sendo então as composições terapêuticas potenciais para toxicidade e outros perfis de segurança antes de se formular, acondicionar e subsequentemente comercializar o preparado resultante para o tratamento da doença. Alternativamente, os direitos de se desenvolver e 116 comercializar tais preparados ou para conduzir tais etapas podem ser objeto de licença a um terceiro para consideração.
Consequentemente, em determinadas modalidades, a presente invenção propõe um método de se conduzir um negócio farmacêutico que compreende: a. fabricação de um preparado ou kit que inclui uma composição farmacêutica de qualquer um dos compostos de Fórmulas I a III; e b. comercialização a provedores de cuidados de saúda dos benefícios do emprego do preparado ou do kit no tratamento de uma doença ou distúrbio.
Em outras modalidades, a presente invenção descreve um método para a condução de um negócio farmacêutico que compreende: a. a provisão de uma rede de distribuição para a venda de uma composição farmacêutica de qualquer um dos compostos de Fórmulas I a III; e b. provisão de material de instrução a pacientes ou a clinicos para o uso do preparado no tratamento de uma doença ou distúrbio.
Em determinadas modalidades, a presente invenção propõe um processo para a condução de um negócio farmacêutico que compreende: a. a determinação de um preparado e dosagem adequados de uma composição farmacêutica de qualquer um dos compostos de Fórmula I a III; b. a condução de levantamento do perfil de preparados identificados na etapa (a) , para eficácia e toxicidade em animais; e 117 c. a provisão de uma rede de distribuição para a venda de um preparado ou preparados identificados na etapa 9b) como tendo um perfil terapêutico aceitável.
Uma etapa adicional da modalidade compreende a provisão de um grupo de vendas para a comercialização do preparado a provedores de cuidados de saúde.
Em, outras modalidades ainda, a presente invenção propõe um método para a condução de um negócio farmacêutico que compreende: a. a determinação de um preparado e dosagem de uma composição farmacêutica de qualquer um dos compostos de Fórmula I a III; e b. concessão de licença, a uma terceira pare, dando direitos para desenvolvimento e venda subsequentes do preparado.
Exemplificação
Materiais. β-Ciclodextrina, "β-CD" (Cerestar USA, Inc. de Hammond, IN) foi secado a vácuo (<0,013 kPa (<0,1 mTorr)) a 120°C durante 12 h antes de ser usada. 118
β-CD
β-CD
Todos os solventes anidros, solventes de categoria HPLC e outros solventes orgânicos habituais foram adquiridos de fornecedores comerciais e usados sem outra purificação. Recristalizou-se cloreto de bifenil-4,4'-dissulfonila (Aldrich Chemical Company, Inc. de Milwaukee, WI) a partir de clorofórmio/hexanos. Pulverizou-se iodeto de potássio com um almofariz com pilão e secou-se em um forno a 200°C. A polietileno glicol dipropanóico-succinimida (PEG-DiSPA, PM 3400), polietileno glicol dibutanóico succinimida (PEG-DiSBA, PM 3400) e dibenzotriazol carbonato de polietileno glicol (PEG-DiBTC, PM 3400) foram adquiridos de Nektar (Huntsville, AL) . Polietileno glicol di-p-nitrofenol carbonato (PEG-DiNPC, PM 3400) foi adquirido de Sigma (St. Louis, MO). CPT foi adquirido de Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Alemanha). O plasma humano foi adquirido de Sigma e reconstituído com água Dl. O plasma murino foi preparado por remoção por centrifugação de células sanguíneas de amostras de sangue fresco coletadas de ratos BALB/C fêmeas (Charles River) . 6a, 6D-diiodo-6A, 6D-didesóxi-p-ciclo- dextrina (CDDI, Esquema 2) foi sintetizado de acordo com um procedimento relatado anteriormente por Hwang et al. (Bioconjugate Chem. 12, 280-290). A água deionizada (18-ΜΩ- 119 cm) foi obtida fazendo-se passar água deionizada no local através de um sistema de purificação Barnstead E-pure. Os espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro Bruker AMX de 500 MHz ou Varian de 300 MHz. A análise espectral de massa (MS) foi conduzida empregando-se ou um espectrômetro de massa de eletropulverização dotado com um alçapão de ions LCQ (Thermo Finnigan) e equipado com uma fonte de ionização de eletropulverização ou com um espectrômetro de massa MALDI-TOF (Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) . Os PMs das amostras de polímeros foram analisados em um sistema GPC equipado com uma bomba Hitachi L-6200 Intelligent Pump, um detetor Asnpec RI (ERC-7512, Erma, Inc.), um detetor DLS de Precision Detectors (PD 2020) e com colunas duplas de permeação de gel (PL-aquagel-OH-40 8 pm 300 mm x 7,5 mm, Polymer Laboratory) calibradas empregando-se padrão de polietileno glicol e eluidas empregando-se PBS (1 x) a uma concentração de 20-50 mg/mL e a uma velocidade de fluxo de 0,7 mL/min à temperatura ambiente. Os derivados de CD foram analisados com uma coluna de fase inversa C-18 em um sistema HPLC equipado com um detetor de UV (detetor System Gold 168, Beckman Coulter) e um detetor de dispersão evaporativa de luz (ELS) (Sedex 75, Sedere, França). CPT, derivados de CPT e conjugados de polimero-CPT foram analisados nos sistemas HPLC com uma coluna de C-18 de fase inversa (HIRPB-4438, 4, 6 x 150 mm,
Richard Scientific) equipada com um detetor de fluorescência (FD-500, GTI/Spectro Vision, Groton Technology, Inc.) empregando-se um gradiente de tampão de fosfato de potássio (pH 4,1) e acetonitrila. Os comprimentos de onda de excitação e emissão do detetor de fluorescência foram ajustados para 370 nm e 440 nm, respectivamente. 120
Exemplo de referência 1: β-Ciclodextrina capeado com bifenil-4,4'-dissulfonil-A,D, 1 (Tabushi et al. J. Am. Che. Soc. 106, 5267-5270 (1984)).
Esquema XV
1
Um frasco de fundo redondo de 500 mL equipado com uma barra de agitação magnética, um adaptador Schlenk e um septo foi carregada com 7,92 g (6,98 mmol) de β-ciclodextrina seca e 250 mL de piridina anidra (Aldrich Chemical Company, Inc.). A solução resultante foi agitada a 50°C sob nitrogénio enquanto se acrescentava 2,204 g (6,28 mmol) de cloreto de bifenil-4,4'-dissulfonila em quatro porções iguais a intervalos de 15 min. Depois de se agitar a 50°C durante outras 3 h, removeu-se o solvente a vácuo e o resíduo foi submetido a cromatografia de coluna de fase inversa usando-se uma eluição em gradiente de 0-40% de acetonitrila em água. As frações foram analisadas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e as frações adequadas foram combinadas. Depois da remoção da maior parte da acetonitrila em um evaporador rotativo, a suspensão aquosa resultante foi liofilizada até secar. Com isso obteve-se 3,39 g (38%) de 1 em forma de um sólido incolor. 121
Exemplo de referência 2: 2 (Tabushi et 6a, 6D-Diiodo-6A, 6D-didesóxi-p-ciclodextrina, al. J. Am. Chem. 106, 4580-4584 (1984))
Esquema XVI
KJ
2
Um tubo de centrifugação de 40 mL equipado com uma barra de agitação magnética, um adaptador Schlenk e um septo foi carregado com 1,02 g (7,2 mmol) de 1, 3,54 g (21,3 mmol) de iodeto de potássio em pó seco (Aldrich) e 15 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) anidra (Aldrich). A suspensão resultante foi agitada a 80°C sob nitrogénio durante 2 h. Depois de ser resfriada até a temperatura ambiente, os sólidos foram separados pro filtração e o sobrenadante foi coletado. O precipitado sólido foi lavado com uma segunda porção de DMF anidro e os sobrenadantes foram combinados e concentrados a vácuo. O resíduo foi então dissolvido em 14 mL de água e resfriado em um banho de gelo antes de se acrescentar 0,75 mL (7,3 mmol) de tetracloroetileno (Aldrich) com uma agitação rápida. O produto precipitado foi filtrado em um frita de vidro média e lavado com uma pequena porção de acetona antes de ser secado a vácuo sobre P2O5 durante 14 horas. Com isto obteve-se 0,90 g (92%) de 2 em forma de um sólido branco. 122
Exemplo de referência 3: 6a, 6d-Bís- (2-aminoetiltio) -6a, 6D-didesóxi-p-ciclodextrina, 3 (Tabushi, I; Shimokawa, K; Fugita, K. Tetrahedron Lett. 1977, 1527-1530)
Esquema XVII
3
Um frasco Schlenk de 25 mL equipado com uma barra de agitação magnética e um septo foi carregado com 0,91 mL (7,37 mmol) de uma solução a 0,81 M de 2-aminoetil-etiolato de sódio em etanol (Fieser, L.F.; Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis; Wiley: Nova York, 1967; Vol.. 3, pp. 265-266) . Fez-se evaporar a solução até secar e o sólido foi redissolvido em 5 mL de dm anidro (Aldrich). Acrescentou-se 6a, 6D-diiodo-6A, 6D-didesóxi-p-ciclodextrina (2) (100 mg, 7,38 x 10-5 mol), sendo a suspensão resultante agitada a 60°C sob nitrogénio durante 2 h. Depois de se resfriar até a temperatura ambiente, concentrou-se a solução a vácuo e redissolveu-se o residuo em água. Depois de se acidificar com HC1 a 0,1N, aplicou-se a solução a uma coluna de troca de ions Toyopearl SP-650M (forma de NH4"1") , eluindo-se o produto com um gradiente de bicarbonato de amónio de 0 a 0,4M. As frações adequadas foram combinadas e liofilizadas até secar. Obteve-se 80 mg (79%) de 3 em forma de um pó branco. 123 Síntese Alternativa de dicisteamina β-CD 3 A uma solução de 4,69 g (3,17 mmol) de 2 em 100 mL de água com o gás extraído, acrescentaram-se 0,489 g (6,34 mmol) de cisteamina recém sublimada. A solução foi agitada com refluxo durante 2 horas. Depois de se resfriar até a temperatura ambiente e de se acidificar com HC1 a IN, a solução foi aplicada a uma coluna de troca de íons Toyopearl SP-650M (forma de NH4"1") e eluiu-se o produto com um gradiente de bicarbonato de amónio de 0 a 0,2 M. As frações adequadas foram combinadas e liofilizadas até secar. Com este procedimento obteve-se 1,87 g (39% de rendimento) de um sólido branco. O sólido foi caracterizado por TLC (gel de sílica, n-Pr0H-Ac0Et-H20-NH3aq 5/3/3/1, detecção por ninidrina) e apresentou um ponto principal correspondendo a 3. o espectro de massa de tempo de vôo (TOF) dessorção/ionização a laser assistido por matriz (MALDI) foi registrado no instrumento ELITE de 2 metros fornecido por PerSeptive Biosystems, Inc. MALDI-TOF m/z calcd para 3: 1252, encontrado 1253,5 [M+H]+, 1275,5 [M+Na]\ 1291,4 [M+K]+. RMN 13C (Bruker 500 MHz, D20) δ ppm: 32,1 (S-CH2) e 38,8 (CH2-NH2), 32,9 (C6 adjacente a S) , 60,2 (C6 adjacente a OH), 70,8, 71,4, 72,5 (C2, C3, C5), 81,8 (C4), 101,7 (Cl).
Exemplo 4: 6a, 6d-Bís- (2-amino-2-carboxiletiltio) -6a, 6D-didesóxi-p-ciclodextrina, 4 (CD-BisCys) 124
Esquema XVIII
4 167 mL de tampão de carbonato de sódio a 0,1M tiveram o gás extraido durante 45 minutos em um frasco de fundo redondo de 2 gargalos de 500 mL equipado com uma barra de agitação magnética, um condensador e um septo. A esta solução acrescentou-se 1,96 g (16,2 mmol) de L-cisteina e 10,0 g (73,8 mmol) de diiodo, desóxi-p-ciclodextrina 2. A suspensão resultante foi aquecida a uma temperatura de refluxo durante 4,5 h até a solução ficar transparente (incolor). A solução foi então resfriada até a temperatura ambiente e acidificada a pH 3 empregando-se HC1 a IN. O produto foi precipitado acrescentando-se lentamente acetona (3 vezes a relação em peso da solução). Com isso obteve-se 9,0 g de material bruto contendo CD-biscisteina (90,0%) de ciclodextrina que não reagiu, CD-mono-cisteina e cistina. O sólido resultante foi submetido a cromatografia de coluna de troca aniónica (SuperQ650M, Tosoh Bioscience) empregando-se uma eluição de gradiente de bicarbonato de amónio de O 1 o Todas as frações foram analisadas por HPLC. As frações desejadas
foram combinadas e o solvente foi reduzido a 100 mL a vácuo. O produto final ou foi precipitado acrescentando-se acetona ou acrescentando-se metanol (3 vezes a relação em peso da solução) . 4 foi obtido com um rendimento de 60-90%. RMN 1H (D20) δ (m, 7H, CD-2-CH), 3,79-3,94 (m, 30H, CD-3,4-CH, CD- CH2, Cys-CH) , 3,49-3, 62 (m, 14H, CD-5, 6-CH) , 2, 92-3, 30 (m, 125 4Η, Cys-CH2) . RMN 13C (D20) δ 172,3, 101, 9, 83, 9, 81, 6, 81,5, 73,3, 72,2, 72,0, 60,7, 54,0, 34,0, 30,6. ESI/MS (m/z): 1342 [M]+, 1364 [M+Na]+. Pureza de 4 foi confirmada por HPLC.
Exemplo 5: 6a, 6d-Bís- (carboxilmetiltio) -6a, 6D-didesóxi-p-ciclodextrina, 5 (CDDM)
Esquema XIX v
o o
Uma solução de 5 0 mL de carbonato de sódio a 0,1M teve os gases extraídos durante 2 horas em um frasco de fundo redondo de 100 mL de 3 gargalos equipado com uma barra de agitação magnética, um condensador e um septo. Acrescen-tou-se ao frasco com seringa ácido mercapto-acético (0,46 mL, 6,64 mmol) e ajustou-se pH para 9,3 com hidróxido de sódio a IN. A esta solução resultante acrescentou-se 3,00 g (2,21 mmol) de diiodo-p-ciclodextrina 2 e aqueceu-se a 80°C durante uma hora. A temperatura da solução foi aumentada de 10°C a cada hora até atingir 100°C. Depois de 3 h. à temperatura de refluxo, a solução incolor transparente foi resfriada à temperatura ambiente e acidificada até pH 3,5 empregando-se HC1 a IN. O produto bruto foi extraído com a lenta adição de acetona (3 vezes a relação em peso da solução). O sólido resultante foi submetido a cromatografia de coluna de troca aniónica empregando-se uma solução de bicarbonato de amónio com um gradiente de 0-0,4M. Obteve-se assim 1,8 g (63,4%) de 5 em forma de um sólido incolor. 126 ESI/MS (m/z): 1281[M]+. Pureza deste composto foi confirmada com HPLC.
Exemplo de referência 6:
CD-Bis(Ácido glutâmico-Y-éster benzilico)6 Esquema XX
O O 6
Um frasco de fundo redondo de 50 mL equipado com uma barra de agitação magnética, um condensador e um septo foi carregado com 0,101 g (0,425 mmol) de H-Glu(Obzl)-OH e 0,15 g (0,106 mmol) de diiodo β ciclodextrina 2 em 5 mL de solução de carbonato de sódio a 0,1 M com os gases extraídos. A mistura em solução foi aquecida a 100°C durante 2 h. Resfriou-se então a solução até a temperatura ambiente e acidificou-se até pH 4 antes de se submeter a diálise em membranas MWCO 50 0 durante 24 h. O rendimento de 6 foi de 0,142 g (83,6%).
Exemplo de referência 7: CD-BisLys(Z) 7 127
Esquema XXI ΠΝ'
CBZ
H,N
^X^OH
V
O
CBZ 0 7 o
Um frasco de fundo redondo de 50 mL equipado com uma barra de agitação magnética, um condensador e um septo foi carregado com 0,124 g (0,443 mmol) de H-Lysina (Z)-OH e 0,15 g (0,111 mmol) de diiodo-p-ciclodextrina 2 em 5 mL de solução de carbonato de sódio com os gases extraídos a 0,1M. A mistura em solução foi aquecida a 100°C durante 4 h. A solução foi filtrada, sendo o pH do filtrado ajustado para 8,5 antes de se submeter o mesmo a diálise em membranas MWCO 500 durante 24 h. O rendimento de 7 foi de 0,124 g (68,9%).
Exemplo de referência 8: Síntese de tosilato de β-ciclodextrina, 8 (Melton, L.D., e Slessor, K.N., Carbohydrate Research, 18, p. 29 (1971))
Esquema XXII
Cloreto de Tosila
Tosila 128 8
Um frasco de fundo redondo de 500 mL equipado com uma barra de agitação magnética, um adaptador de vácuo e um septo foi carregado com uma solução de β-ciclodextrina seco (8,530 g, 7,51 mmol) e 200 mL de piridina seca. A solução foi resfriada até 0°C antes de se acrescentar 1,29 g (6,76 mmol de cloreto de tosila. Deixou-se a solução resultante se aquecer até a temperatura ambiente de um dia para o outro. A piridina foi removido na medida do possível a vácuo. O resíduo resultante foi então recristalizado duas vezes a partir de 40 mL de água quente, obtendo-se 7,54 g (88%) de um sólido cristalino branco 8.
Exemplo de referência 9: Síntese de iodo-p-ciclodextrina, 9
Esquema XXIII kl
Tosila
i
Um frasco de fundo redondo com uma barra de agitação magnética e um adaptador Schlenk é carregado com 8, 15 equivalentes de iodeto de potássio e DMF. A mistura resultante á aquecida a 80 °C durante 3 h, quando se deixa a mistura de reação se resfriar até a temperatura ambiente. A mistura é então filtrada para remover o precipitado e faz-se evaporar o filtrado até secar, redissolvendo-se o mesmo em água a 0°C. Acrescenta-se tetracloroetileno e agita-se a pasta resultante vigorosamente a 0°C durante 20 minutos. O sólido 9 é coletado em uma frita de vidro média, triturado com acetona e armazenado sobre P2O5. 129
Exemplo de referência 10: Síntese de Cisteamino-p-ciclodextrina, 10
Esquema XXIV
HS
10 A uma solução de 9 em 100 mL de água com os gases extraídos, acrescentou-se 1 eq. de cisteamina recém sublimada. A solução é agitada com refluxo durante 2 h. Depois de resfriada até a temperatura ambiente e acidificada com HC1 a IN, aplica-se a solução a uma coluna de troca de íons Toyopearl SP-650M (forma de NH4+) , eluindo-se o produto com um gradiente de bicarbonato de amónio. As frações adequadas são combinadas e liofilizadas até secar, obtendo-se 10.
Exemplo 11: Síntese de Gly-CPT 11 (Greenwald et al., Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 551-562)
Esquema XXV
11 35O mL de α à esta
Dissolveu-se t-Boc-glicina (0,9 g, 4,7 mmol) em 3~> cloreto de metileno anidro à temperatura ambiente e 130 solução acrescentou-se DIPC (0,75 mL, 4,7 inmol) , DMAP (382 mg, 3,13 mmol) e camptotecina (0,55 g, 1,57 inmol) a 0°C. Deixou-se gue a mistura de reação se aquecesse até a temperatura ambiente e deixou-se durante 16 h. A solução foi lavada com HC1 a 0,1N secou-se e fez-se evaporar a pressão reduzida obtendo-se um sólido branco que foi recristalizado a partir de metanol obtendo-se camptotecin-20-éster de t-Boc-glicina: RMN 3Η (DMSO-de) δ 7,5-8,8 (m) , 7,3 (s), 5,5 (s) , 4 (m) , 2,1 (m) , 1,6 (s) , 1,3 (d), 0,9 (t) . Camptotecin-20-éster de t-Boc-glicina (0,595 g, 1,06 mmol) foi dissolvido em uma mistura de cloreto de metileno (7,5 mL) e TFA (7,5 mL) e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se o solvente e recristalizou-se o residuo a partir de cloreto de metileno e éter, obtendo-se 0,45 de 11. RMN 1H (DMSO-d6) δ 7,7-8,5 (m) , 7,2 (s) , 5,6 (s) , 5,4 (s) , 4,4 (m) , 2,2 (m) , 1,6 (d), 1,0 (t) . RMN 13C (DMSO-d6) δ 168,6, 166, 6, 156, 5, 152,2, 147, 9, 146, 2, 144,3, 131,9, 130, 6, 129, 7, 128,8, 128, 6, 128,0, 127,8, 119, 0, 95, 0, 77, 6, 66, 6, 50,5, 47,9, 30,2, 15,9, 7,9. ESI/MS (m/z) esperado 405; encontrado 406 (M+H).
Exemplo 12:
Sintese de GlyGlyGly-CPT 12 Esquema XXVI
131 t-Boc-GlyGlyGly (1,359 g, 4,7 mmol) foi dissolvido em 350 mL de cloreto de metileno anidro à temperatura ambiente e a esta solução acrescentou-se DIPC (0,75 mL, 4,7 mmol), DMAP (382 mg, 3,13 mmol) e camptotecina 90,55 g, 1,57 mmol) a 0°C. Deixou-se que a mistura de reação se aquecesse até a temperatura ambiente e deixou-se durante 16 h. A solução foi lavada com HC1 a 0,1 N, secada e fez-se evaporar a pressão reduzida, obtendo-se um sólido branco, que foi recristalizado a partir de metanol, obtendo-se o camptotecin -20-éster de t-Boc-GlyGlyGly: RMN ΧΗ (DMSO-d6) δ 8,40 (s) , 8,25 (d), 7,91 (d), 7,78 (m) , 7,65 (t) , 7,26 (s), 7,05 (br, s) , 5,65 (d), 5,40 (d), 5,25 (s) , 5,10 (br, s) , 3,75-4,42 (m), 2,15-2,35 (m), 1,45 (s), 0,95 (t) . Dissolveu-se o camptotecin-20-éster de t-Boc-GlyGlyGly (1,5 g, 1,06 mmol) em uma mistura de cloreto de metileno (10 mL) e TFA (10 mL) e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se o solvente a vácuo e redissolveu-se o residuo em cloreto de metileno. A solução foi vertida em éter, obtendo-se o precipitado do composto titulo (amarelo). O precipitado foi filtrado e lavado com éter frio, obtendo-se 1,31 g de 12. RMN (DMSO-de) δ 8,79 (s) , 7,75-8,61 (m) , 7,10 (s) , 5,55 (s) , 3, 90-4,37 (m) , 3,86 (s) , 3,54 (s) , 2,11-2,23 (m) , 0,95 (t) . ESl/MS (m/z) esperado 519, encontrado 520 (M+H).
Estabilidade da ligação éster de DPT-peptideo 11 e 12 foram dissolvidos em tampão de PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente para se preparar uma solução de aproximadamente 500 μg/ΐaL. Esta solução foi ainda mais diluida em H3PO4 a 8,5% até 10 μρ/πϋΐ. A taxa de hidrólise foi analisada empregando-se HPLC equipado com uma coluna RP (fase inversa) C18 e um detetor de fluorescência empregando- 132 se um tampão de acetonitrila/fosfato de potássio a 50/50 (v/v) (pH 4,1). O pico de 11 (ou de 12) e a CPT liberada (em forma de lactona) foram integrados. A estabilidade da ligação éster na solução aquosa é dependente do comprimento do peptideo. Assim a taxa de libertação de medicamento (taxa de hidrólise) pode ser modulada, ajustando-se o comprimento do peptideo. Veja Figura 2.
Estabilidade de Lactona de CPT, 11 e 12 em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) CPT, 11 ou 12 foi dissolvido em DMSO a 1 mg/mL, sendo então diluido até 1 μg/mL com PBS (1 x, pH 7,4) . Injetaram-se 30 pL de solução em HPLC à temperatura ambiente a intervalos de tempo selecionados. A área pico da forma CPT lactona de CPT, 11 ou 12) foi integrada A velocidade da abertura de anel de lactona para 11, 12 e CPT foi estudada em tampão PBS (pH 7,4) . Tanto 11 como 12 foram muito estáveis contra a abertura do anel e nenhuma forma carboxilato de 11 e 12 foi detectada durante todo o estudo (7 horas) . Por outro lado, mais de 60% da de CPT lactona foram transformados na sua forma carboxilado durante o mesmo periodo de tempo (Veja Figura 3).
Exemplo de referência 13:
Sintese de Lys(Bis CBZ)-CPT 13 133
Esquema XXVII
13
Dissolveu-se N,N-BisCBZ-Lisina (311 mg, 0,75 mmol) em 56 mL de cloreto de metileno a temperatura ambiente. A esta solução acrescentou-se DIPC (0,12 mL, 0,75 mmol), DMAP (0,61 mg, 0,5 mmol) e camptotecina (0,087 g, 0,25 mmol) a 0°C. Deixou-se que a mistura de reação se aquecesse até a temperatura ambiente e deixou-se repousar durante 16 h. A solução foi lavada com HC1 a 0,1N, secada e fez-se evaporar a pressão reduzida, obtendo-se um sólido amarelo claro que foi recristalizado a partir de metanol, obtendo-se camptotecin-20-éster de N,N-BisCBZ-Lys 13. A purificação de 13 foi satisfatória com base em análise de TLC e HPLC. A hidrólise de 13 em solução aquosa é muito lenta e não pode ser detectada empregando-se HPLC equipada com um detetor de UV. A velocidade de hidrólise da ligação éster da CPT-ligante de peptideo pode ser modulada não somente por ajuste do comprimento do peptideo, conforme mostrado no Exemplo 12, mas também empregando-se diferentes aminoácidos ligados diretamente ao 20-OH de CPT. A transformação da forma lactona em foram carboxilato de CPT e 13 foi também testada em tampão PBS. Foi constatado que a transformação da forma lactona em forma carboxilado do 134 composto 13 era muito mais lenta do que a da CPT livre, indicando que a forma de lactona (forma ativa do medicamento) pode ser estabilizada pela formação de um éster com o -OH de CPT na sua posição 20 (Veja Figura 4)
Exemplo de referência 14:
Sintese Lys-Gly-CPT 14 11 é dissolvido em clorofórmio. N,N-Dioc-Lys-NH (1,0 eq) é acrescentado, sendo seguido por trietilamina (1,0 eq.) A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 16 horas e extraída duas vezes com água, sendo então secada com MgS04. O solvente é removido sob alto vácuo, obtendo-se N,N-DiBoc-Lys-Gly-CPT. A este composto acrescentou-se uma mistura de igual volume de CH2CI2 e TFA e agita-se à temperatura ambiente durante 1 h. O solvente é então removido a vácuo. O resíduo é redissolvido em CHCI3. Acrescenta-se éter à solução para extrair o produto 14. O precipitado é lavado diversas vezes com éter, sendo então secado a vácuo. Ele é purificado empregando-se cromatografia de coluna com gel de sílica, obtendo-se 14 na forma de sal puro de TFA.
Exemplo de referência 15: Síntese de Suc-Gly-CPT 15
Uma solução de anidrido succínico é misturada com 11 (1 eq.) em CHCI3 seco na presença de uma quantidade catalítica de DMAP e DIEA (1 eq.). A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, obtendo-se 15. 15 é purificado por cristalização.
Exemplo de referência 16: Síntese de Glu-Suc-Gly-CPT 16 135 15 é convertido no seu éster de NHS empregando-se método DCC/NHS tradicional. Faz-se então o éster NHS de 15 reagir com ácido glutâmico (1,0 eq.) em DMSO na presença de trietilamina. A solução é acrescentada a éter para precipitar 16. 16 é purificado por cristalização.
Exemplo de referência 17:
Sintese de Glu-Bis(GlyCPT) 17 11 e Boc-Glu(NHS)-NHS (0,4 3eq.) são misturados em CHCI3 sob argônio antes de se acrescentar trietilamina (1 eq.) à mistura. A solução é agitada à temperatura ambiente durante 16 h e em seguida lavada com água ácida. A fase orgânica é secada e em seguida o solvente é removido a vácuo. O composto resultante é purificado empregando-se cromatografia de coluna de gel de sílica. O composto purificado é então dissolvido em uma mistura de volume igual de TFA e CH2CI2. A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 1 h, sendo então vertida em éter. O precipitado 17 é lavado com éter e secado a vácuo.
Exemplo de referência 18: Síntese de Ciclodextrina-Camptotecina 18
Esquema XXVIII
136
Submeteu-se CPT (197 mg, 0,566 mmol) a vácuo durante 30 minutos. Acrescentou-se clorofórmio seco (100 mL) sob argônio. Acrescentou-se fosgênio (1,34 mL, solução a 20% em tolueno) a 0°C. 0 banho de gelo foi removido e a solução foi aquecida até a temperatura ambiente. Duas horas mais tarde removeu-se o solvente a alto vácuo. Acrescentou-se DMSO seco (50 mL) ao resíduo, e em seguida 200 mg de CD-NH2 (Cyclodextrin Technology, Inc.) e trietilamina (4 mL, excesso). 16 horas mais tarde, a solução foi vertida em 200 mL de éter. O precipitado foi lavado com éter exaustivamente e em seguida secado. Obteve-se 167 mg de pó amarelo (18) (62% de rendimento). A análise TLC (gel de sílica) de 18: Rf = 0 (revelado com CHCl3/MeOH v/v = 5/1) . A análise TLC de CPT: Rf = 0,65 (revelado com CHCls/MeOH v/v = 5/1) .
Solubilidade >10 mg/mL em água. Isto indica que a solubilidade de CPT em água pode ser substancialmente aumentada quando ele é ligado por covalência à molécula de ciclodextrina (hidrossolubilidade de CPT livre < 0,004 mg/mL).
Exemplo de referência 19: Síntese de Copolímero de CDDC-Dianidrido 19, 21 e do seu conjugado com CPT 20,22 137
Esquema XXIX
ο ο 19
O^^OGIyCPT TFA^GlyCPT
O O
γΛ N O M o 20
TFÀ*GlyCPT ->
OΛ CP7-GJy-
Vo
Gly-CPT A: Dianidrido tetracético de etilenodiamina (35,6 mg, 0,1 mmol) e CDDC (3, 125,3 mg, 0,1 mmol) foram dissolvidos em 2 mL de DMSO seco. A solução foi aquecida a 50°C durante 72 h. Acrescentou-se água à mistura, e em seguida acrescentou-se NaOH a IN até um pH de aproximadamente 12. O polimero foi submetido a diálise em membrana de MWCO 10.000 durante 24 h. Foi observada precipitação na membrana de diálise. O sólido foi removido e a solução restante foi novamente submetida a diálise em membrana de MWCO 10.000 durante 24 h. Obteve-se depois da liofilização um pó branco 19 (75 mg). 11 é acrescentado à solução de polimero (19)/DMSO na presença de EDC (2 eq.), NHS (1 eq.) e de DIEA (1,0 eq.). A solução foi agitada durante 16 h sendo então vertida em éter. O precipitado é lavado com CH2CI2 exaustivamente até 138 não ser observado nenhum medicamento livre na solução de lavagem. 0 composto 20 é obtido depois de secar a alto grande vácuo. B: Dianidrido pentacético de dietileno-triamina (8,5 mg, 0,024 mmol) e CDDC, 3 (30 mg, 0,024 mmol) foram dissolvidos em l-metil-2-piridinona (2 mL). A mistura foi agitada a 64°C durante 4 dias, sendo então submetida a diálise em membrana MWCO 10.000 durante 2 dias. Obteve-se depois da liofilização um pó branco 21 (3 mg). 11 é acrescentado à solução de polimero (21/DMSO na presença de EDC (2 eq.), NHS (1 eq.) e DIEA (1,0 eq.). A solução é agitada durante 16 horas, sendo então precipitada em éter. O precipitado é lavado exaustivamente com CH2CI2 até não ser observado nenhum medicamento livre na solução de lavagem. O composto 22 é obtido depois de secar a alto vácuo.
Exemplo de referência 20:
Sintese de Copolimero de CCD-Cys 23 e seu conjugado com CPT 24 Esquema XXX
GIYCPT 139
Dissolveram-se CCD 1 (141,3 mg, 0,1 mmol) e cistina (24 mg, 0,1 mmol) em DMSO seco (0,3 Ml) e piridina (0,1 Ml) . A mistura foi agitada sob argônio de um dia para o outro a 72°C. Acrescentou-se água (10 Ml). O precipitado foi filtrado e o filtrado foi submetido a diálise em membrana de 10.000 MWCO (Spectra/Por 7) durante 48 h. Foi obtido um pó branco 23 (8 mg). 11 é misturado com 23 em DMSO. Acrescentou-se EDC (2 eq.), NHS (1 eq.), e DIEA (1,0 eq.) à solução. A solução foi agitada durante 16 h, sendo então precipitada com éter. O precipitado foi lavado exaustivamente com CH2C12 até não ser observado nenhum medicamento livre na solução de lavagem. O composto 24 foi obtido depois de secar a grande vácuo.
Exemplo de referência 21:
Sintese de Copolímero de CD-BisGlu-Diamina 25 e seu conjugado com CPT 26
Esquema XXXI
CD-Bis(éster γ-benzilico do ácido glutâmico) 6 e etileno-glicolbis-etilamina são dissolvidos em DMSO seco Acrescenta-se EDC (3 eq.) e Sulfo-NHS (2 eq.) à mistura. Agita-se a solução sob argônio durante 2 dias à temperatura ambiente. A 140 solução é então transferida a uma membrana de diálise de 10.000 MWCO e submetida a diálise durante 48 horas. Depois da liofilização obtém-se um pó branco. O sólido é então dissolvido em mistura de solventes DMSO e metanol e tratado com H2 na presença do catalisador Pd a 10%/C durante 24 horas. A solução é vertida em éter para extrair o produto. 25 é obtido depois de se secar a vácuo. 11 é misturado com 25 em solução de DMSO. Acrescentam-se EDC (2 eq.), NHS (1 eq.) e DIEA (1,0 eq.) à solução. A solução é aqitada durante 16 horas, precipitando-se então com éter. O precipitado é lavado com CH2C12 exaustivamente até não ser observado nenhum medicamento livre na solução de lavagem. Obtém-se o composto 26 depois de se secar a grande vácuo.
Exemplo de referência 22;
Sintese de Polimero CDDM-Lys(GlyCPT) 27
Esquema XXXII
OCPT
CDDM, 5, e Lys-Gly-CPT, 14, são dissolvidos em DMSO seco, EDC (3 eq.) e Sulfo-NHS (2 eq.) são acrescentados à mistura. 141
Agitou-se a solução sob argónio durante 2 dias à temperatura ambiente. A solução é então vertida em éter. 0 precipitado 27 é secado a vácuo.
Exemplo de referência 23:
Sintese de Copolimero CDDC-Cys(Boc) 28, Copolimero CDDC-Cys 29 e seu Conjugado com CPT 30
Esquema XXXIII
>
HCI CDDC (3) e N, N-DiBoc-Cistina são dissolvidos em DMSO seco. EDC (3 eq.) e Sulfo-NHS (2 eq.) foram acrescentados à mistura. A solução foi agitada sob argônio durante 2 dias à temperatura ambiente. A solução foi então transferida a uma membrana de diálise de 10.000 MWCO e submetida a diálise durante 48 horas. Depois de liofilização obteve-se um pó branco, polímero CDDC-Cys(Boc), 28. A este pó branco 28 acrescentou-se uma mistura de HC1 e solução de DMSO. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, e submeteu-se então as diálise contra água durante 24 horas empregando-se membrana de MWCO 10.000. Obteve-se 29 em forma de um sólido branco. 142
Suc-Gly-CPT 15 é misturado com 29 em solução de DMSO. EDC (2 eq.) , NHS (1 Eq.), e DIEA (1,0 eq.) são acrescentados à solução. Agita-se a solução durante 16 h sob argônio precipitando-se então com éter. O precipitado é lavado co éter até não ser mais observado nenhum medicamento livre na solução de lavagem. Obtém-se o composto 30 depois de secar a grande vácuo.
Exemplo de referência 24:
Sintese de Polimero de CD-Polifosfoéster 1 e seus conjugados a CPT 2
Esquema XXXIV
A sintese do polifosfoéster biodegradável pode ser encontrada em Wang J. et al., JACS, 2001, 123, 9480-9481. O polifosf oéster é misturado com 10 (0,5 eq. de unidades
repetidas) em DMSO, EDC (2eq.), NHS (12 eq.) e DIEA (1,0 eq.) são acrescentados à solução. A solução é agitada durante 16 horas, sendo então precipitada com éter. O CD-polifosfoéster 31 é dissolvido em DMSO. À solução acrescentou-se 11 (0,5 eq. de unidades repetidas), EDC (2 eq.), NHS (1 eq.) e DIEA (1,0 eq.). A solução é agitada durante 16 horas, sendo então precipitada com éter. O precipitado é 143 lavado exaustivamente com éter até não ser observado nenhum medicamento na solução de lavagem. 0 composto 32 é obtido depois de secar a alto vácuo.
Exemplo de referência 25:
Sintese de conjugado Copolimero CD-CPT 33 com estrutura de polietileno por meio de polimerização radical
Esquema XXXV
Os monómeros acrilato de CPT, monometil éter trietileno glicólico e CD-monocistamina podem ser sintetiza-dos a partir de N-acrilóxi-succinimida (Polysciences, Inc.). Estes monómeros são misturados numa relação de 1:1:1 em DMSO seco. Acrescenta-se AIBN à mistura sob argônio. A solução é agitada à temperatura ambiente durante 24-48 horas até a solução se tornar viscosa. 0 conjugado polímero-CPT 33 é precipitado com éter e secado a vácuo.
Exemplo de referência 26:
Sintese de CD-enxerto-poli(etileno-alt-anidrido maléico)-GlyGlyGly CPT 34 144
Esquema XXXVI
0 poli (etileno-alt-anidrido maléico) (Aldrich) é dissolvido em DMSO. 10 (0,4 eq. da unidade repetida) e 12 (0,4 eq. da unidade repetida) são acrescentados. A solução é aquecida a 70°C durante 16 horas, sendo então precipitada com éter. O CD-enxerto-poli(etileno-alt-anidrido maléico)-GlyGlyGlyCPT 34 é secado a alto vácuo.
Exemplo 27: Síntese do Conjugado Poliglutamato-CD-CPT 35 145
Esquema XXXVII
Mistura-se poliglutamato (de SigmaAldrich) com 10 (0,5 eq. de unidade repetida) e 11 (0,5 eq. de unidade repetida) em DMSO. EDC (3 eq.), NHS (2 eq.) e DIEA (1,0 eq.) são acrescentado à solução A solução é agitada durante 16 horas, sendo então precipitado com éter. Depois de secar a alto vácuo, obtém-se o conjugado poliglutamato-CD-CPT 35.
Exemplo 28:
Sintese e Caracterização de Copolimeros CD-BisCys-Peg3400 36 e seus Conjugados com CPT 37. A. Sintese e Caracterização dos Copolimeros CD-BisCys-Peg3400 36 146
Esquema XXXVIIIa tai tai'
OH
IK?V rx
PEG-DiSr A (toW = J4iid kDn) DMSO/DIEA, TEA ou DMAP "•V?" *«··'·'»,“ -A. " [V ui a ..y ·ίι 36;ι~Γ
PolMCDDCvs ΓΛ PEO)
Abr. PA = ligação propanolcamida entre PEG e CD
Esquema XXXVIIlb
r" R^, " PCG-Di SB A <MW = 1400 kDaj ί^;£,γ',Ή.-' PEG-DiDTC (MW = 3-100 kDa) PEfi.DiWC(MVi' = 3400 teu) > \ 'Ύ <> 36g R- ,,'.Ν ,-£t> 36b R-- xr 3<ii R·.
Poli (CDDCys-BA-PECJ)
PolÍ(í:DDti.vC:B-PEG) Poii<t:nncys-Cíi-PEG)
Abr. BA = ligação butanoicamida; CD = ligação carbamato Síntese de Poli(CDDCys-PA-PEG), 36a: Secou-se 4 (depois de precipitação com acetona, 63 mg, 0,047 mmol) e PEG-DiSPA (peso molecular 3400, 160 mg, 0,047 mmol) a vácuo durante 8 horas. Acrescentou-se DMSO anidro (1,26 mL) à mistura sob argônio. Depois de 10 minutos de agitação, acrescentou-se diisopropiletilamina anidra (DIEA, 19 pL, 2,3 eq.) sob argônio. A mistura de reação foi agitada sob argônio durante 120 h. A solução contendo o polimero foi submetida a diálise empregando-se uma membrana de MWCO 10.000 (Spectra/Por 7) 147 contra água durante 48 h e liofilizada obtendo-se 196 mg de 36a (90%, Tabela 1). Mw= 57,4 kDa, Mn = 41,7 kDa, Mw/Mn = 1,38. RMN (D20) δ 5,08 (m, CD-2-H) , 4,27 (m, Cys-CH) , 2,72-3, 76 (m, CD-3,4,5, 6-CH, CD-CH2, PEG-CH2) , 2,44 (m, Cys- CH2) . A síntese de outros poli(CDDCys-PA-PEG) (36b-f),
Poli(CDDCys-BA-PEG) (36 g) Poli(CDDCys-CB-PEG) (36h-i) foram obtidos em condições de polimerização análoga à de 36a. Os detalhes para as condições de polimerização, seleção de monómeros, peso molecular dos polímeros, polidispersabilidade e rendimentos são relacionados na tabela 1. 36g: RMN ΧΗ (D20) δ 5,10 (M, CD-2-H), 4,25-4,37 (m, Cys-CH), 2,72 (m, CD-3,4,5,6-CH , cd-ch2, PEG-CH2) , 2,21 (m, Cys-CH2) . i: RMN XH (D20) δ 5,05 (m, CD-2-H), 4,56 (m, Cys-CH), 3,93 (m, CD-3, 4,5, 6-CH, CD-CH2, PEG-CH2) , 2,38 (m, -OCH2CH2 CH2C (Ο) -NH-) , 2,34 (m, Cys-CH2) , 1,90 (m, -OCH2CH2CH2C (Ο) -NH-) . A adição de uma base orgânica não-nucleófila (tal como DIEA) foi essencial para esta polimerização, uma vez que não foi observada nenhuma alteração na viscosidade das soluções de polimerização depois de 48 horas quando não tinha sido acrescentada nenhuma base. Quando foram acrescentados 2,3 eq. de DIEA, a viscosidade da solução de polimerização aumentou dramaticamente depois de 4-6 horas de reação. O DIEA desprotona os grupos amino de 4, tornando-os mais nucleófilos para acoplamento com PEG-DiSPA. Não havia essencialmente nenhuma diferença nas polimerizações se outras bases, tais como TEA ou DMAP fossem usadas (36b-c, Tabela 1). A polimerização empregando 4 recuperado pelos dois métodos de precipitação diferentes (acetona e metanol) produziu polímeros com pesos moleculares diferentes. 4 que 148 foi purificado pelo método de precipitação por metanol (não contém nenhuma cistina livre) resultou em um polímero com peso molecular mais alto (36d-e) em comparação com o 4 menos puro que foi obtido pelo método de precipitação por acetona (36a). A polimerização de 4 com PEG-DiSPA tipicamente resulta em rendimentos de polímeros acima de 90%. 4 foi polimerizado com outros monómeros ativados tais como PEG-DiSBA, PEG-DiBTC e PEG-DiNPC. A reação de 4 com PEG-DiSBA deu como resultado o polímero 36b com ligações análogas às de 36a-f (ligação amido, mas um grupo -CH2 mais do que 36a-f no ligante) com Mw acima de 100 kDa, ao passo que a reação de 4 com PEG-DiBTC e PEG-DiNPC gerou polímeros 36h e 36i, respectivamente, com porção de ligação carbamato e Mws acima de 50 kDa (Tabela 1). 149
Tabela 1. Polimerização de 4 com PEG difuncionalizado CPD Comonómer o PEG Base Tempo de Polime rização (h) M„ (kDa) Mn (kDa) M„/Mn Rendi mento (%) 3 6aa PEG-DiSPA DIEA 120 57,4 41,7 1,38 90 3 6ba PEG-DiSPA DMAP 120 54,2 38,1 1,42 91 3 6ca PEG-DiSPA TEA 120 57,4 42, 6 1,35 91 3 6db PEG-DiSPA DIEA 120 93, 6 58,0 1,48 96 3 6eb PEG-DiSPA DIEA 144 97,3 58,0 1, 67 94 3 6fb PEG-DiSPA DIEA 2 35,3 25, 6 1,38 95 36g PEG-DiSPA DIEA 120 114,7 77, 9 1,47 96 3 6h PEG-DiBTC DIEA 120 67, 6 39, 4 1,47 95 36i PEG-DiNPC DIEA 120 86, 5 57,2 1,51 96 a 4 foi lavado com acetona antes da polimerização b 4 foi lavado com metanol antes da polimerização
Os polimeros 36a-i são extremamente solúveis em solução aquosa. Eles podem ser facilmente dissolvidos em água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a concentrações de pelo menos 200 mg/mL. A solubilidade destes polimeros em solução aquosa a concentrações acima de 200 mg/mL não foi tentada devido à grande viscosidade. Estes polimeros são 150 também solúveis em DMF, DMSO e metanol, ligeiramente solúveis em CH3CN e CHC13 mas insolúveis em THF e éter etílico.
Controlo do Peso Molecular dos Polímeros de CD 4 (depois da precipitação com metanol) (5,2 mg, 0,0419 mmol) e PEG-DiSPA (147 mg, 0,0419 mmol) foram secados a vácuo durante 4-8 horas. À mistura acrescentou-se DMSO seco (1,1 mL) sob argônio. Depois de 10 minutos de agitação acrescentou-se DIEA (16 pL, 2,22 eq.) sob argônio. Uma porção da solução de polimerização (150 pL) foi removida e precipitada com éter a tempos selecionados (2 h, 18 h, 43 h, 70 h, 168 h, e 288 h). Os pesos moleculares dos polímeros precipitados foram determinados do modo descrito acima.
Conforme mostrado nas Figuras 5a e 5b, os pesos moleculares de 36 podem ser controlados ajustando-se o tempo de polimerização. B. Síntese de Conjugados Poli(CDDCys-PA-PEG)-CPT (HGGG6, LGGG10, HG6, HGGG10) 151
Esquema
XXXIX
V
Síntese de Poli(CDDCyS-PA-PEG)-GlyGlyGly-CPT (HGGG6)
Dissolveu-se 36e (l,37g, 0,30 mmol de unidade repetida) em DMSO seco (136 mL). A mistura foi agitada durante 10 minutos. 12 (419 mg, 0,712 mmol, 2,36 eq.), DIEA (0,092 mL, 0,712 mmol, 2,36 eq.), EDC ( (172 mg, 0,903 mmol, 3 eq.) e NHS (76 mg, 0, 662 mmol, 2,2 eq.) foram acrescentados à solução polimérica e agitados durante aproximadamente 15 horas. O polímero foi precipitado com éter etílico (1 L). O éter foi vertido fora e o precipitado foi lavado com CH3 CN (3 x 100 mL) . O precipitado foi dissolvido em 600 mL de água. Parte do sólido insolúvel foi filtrado através de filtros de 0,2 pm. A solução foi submetida a diálise empregando-se membrana de 25.000 MWCO (Spectra/Por 7) 152 durante 10 h a 10-15°C em água Dl; A água da diálise foi mudada a cada 60 minutos. A solução do conjugado polimero-medicamento foi esterilizada fazendo-se passar a mesma através de filtros de 0,2 μιη. A solução foi liof ili-zada, obtendo-se um sólido amarelo HGGG6 (1,42 g, rendimento de 85%) . Síntese de Poli(CDDCys-PA-PEG)-GlyGlyGly-CPT (LGGG10) A conjugação de 12 a 36f foi conduzida de um modo análogo ao usado para produzir HGGG6 exceto que este conjugado foi submetido a diálise com membrana de 10.000 MWCO (Spectra/Por 7) em vez de ser com membrana de 25.000 MWCO. O rendimento de LGGG10 foi de 83%. Síntese de Poli(CDDCys-PA-PEG)-Gly-CPT (HG6) A conjugação de 1 a 36e foi conduzida de modo análogo ao empregado para produzir HGGG6. O rendimento de HG6 foi de 83%. Síntese de Poli(CDDCys-PA-PEG)-GlyGlyGly-CPT (HGGG10) 36e (1,5 g, 0,33 mmol da unidade repetida) foi dissolvido em DMSO seco (150 Ml) . A mistura foi agitada durante 10 minutos. 12 (941 mg, 1,49 mmol, 4,5 eq.), DIEA (0,258 mL, 1,49 mmol, 4,5 eq.), EDC (283 mg, 1,49 mmol, 4,5 eq.) e NHS (113 mg, 0,99 mmol, 3 eq.) foram acrescentados à solução polimérica e agitados durante aproximadamente 24 horas. Uma outra porção de EDC (142 mg, 0,75 mmol, 2,3 eq.) e NHS (56 mg, 0,5 mmol, 1,5 eq.) foram acrescentados à solução de conjugação. O polímero foi agitado durante outras 22 horas. O procedimento de preparação foi o mesmo que o usado para a síntese de HGGG6. O rendimento de HGGG10 foi de 77%.
Determinação de % em peso de CPT nos conjugados Solução de estoque de HGGG6, LGGG10, HG6 e HGGG10 foram preparadas a 153 uma concentração de 10 mg/mL em DMSO. Uma alíquota da solução de estoque correspondente foi diluída até 100 μρ/ηϋΐ empregando-se NaOH a IN. CPT foi completamente hidrolisado nesta solução básica e transformado na sua forma de carboxilato dentro de 2 h à temperatura ambiente, uma alíquota desta solução foi diluída até 10 μρ/πΛ empregando-se H3P04 a 8,5%, e CPT na forma de carboxilato foi transformado na sua forma de lactona. 30 pL desta solução foram injetados na HPLC. A área de pico proveniente de CPT na forma de lactona foi integrado e comparado a uma curva padrão. 11 e 12 foram conjugados a 36e ou 36f (Tabela 2) empregando-se métodos de acoplamento convencionais. Devido à instabilidade do ligante éster de 11 e 12 em solução aquosa, a conjugação foi conduzida em DMSO anidro sob argônio. Uma base orgânica era necessária para desprotonar os sais de TFA de 11 e 12 para facilitar o acoplamento. Para a conjugação do polímero com 12, a porcentagem em peso (% em peso) do carregamento do medicamento variou aproximadamente de 6-10%. A carga teórica máxima do medicamento é de aproximadamente 13% empregando-se PEG com peso molecular de 3400 Da; os valores máximos podem ser aumentados reduzindo-se o peso molecular dos segmentos de PEG. As solubilidades de todos os conjugados em água ou em PBS eram acima de 200 mg/mL (equivalente a 12-20 mg de CPT/mL para uma carga de medicamento de 6-10% em peso, respectivamente). Detalhes para HGG6, LGGG10, HG6 e HGGG10 estão resumidos na Tabela 2. 154
Tabela 2. Propriedades dos conjugados polímero-CPT
Conjugado"
Mw polímero progenitor (x IO'3) do
Mw/Mnb CPT Ligante (% peso) em HGGG6 97 1,7 Triglicin a 6,1 LGGG10 35 1,6 Triglicin a 10,2 HG 6 97 1,7 Glicina 00 kO HGGG10 97 1,7 Triglicin 9, 6 a Abreviaturas: H = Polímero de alto Mw (97 kDa) , L = Polímero de baixo Mw (35 kDa) , GGG = ligante de triglicina, G = ligante de glicina, 6 = carregamento de medicamento de aproximadamente 6% em peso, 10 = carregamento do medicamento de aproximadamente 10% em peso b Polidispersabilidade do polímero conforme medida por técnicas de dispersão de luz (26). C. Libertação de CPT de HGGG6 e de HG6
Libertação de CPT em PBS. HGGG6 e HG6 foram preparados a 1 mg/mL em PBS (1 x, pH 7,4) . Uma alíquota de 100 pL da solução foi transferida para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e incubada a 37°C. As amostras incubadas foram extintas a intervalos de tempo selecionados e armazenadas a -80°C até a 155 análise. Cada solução foi diluída com H3P04 até um volume total de 5 mL em um frasco volumétrico. 30 pL de tal solução foram injetados na HPLC. A área de pico da CPT em forma de lactona foi integrada e comparada a uma curva padrão.
As análises para a libertação de CPT de HGGG6 e HG6 em PBS contendo acetil colinesterase (uma esterase, 100 unidades/mL) em tampão de KH2P04 (pH 6,1, 0,1M) e no tampão de KH2PO4 (pH 6,1, 0,1M) contendo catepsina B (uma cisteína proteinase, 200 pm, pré-ativada sobre gelo durante 30 minutos neste tampão contendo DTT a 2 mM e EDTA a 1 mM) foram conduzidas de um modo análogo ao descrito acima para PBS sozinha.
Libertação de CPT em Plasma Humano. Uma alíquota de solução estoque de cada um de HGGG6 e HG6 foi diluída até uma concentração final de 0,5 mg/mL em PBS (1 x, pH 7,4). Esta solução foi acrescentada a um pó liofilizado de plasma humano para reconstituir plasma humano a 100% pela quantidade recomendada. A solução foi dividida em volume igual (250 pL) em tubos Eppendorf de 1,5 mL, incubada a 37°C e extinta a ponto selecionado no tempo. As amostras foram armazenadas a -80°C até a análise. As amostras foram separadas do plasma por colunas de extração de fase sólida. 0 cartucho de extração de fase sólida (cartucho Oásis HLB de 1 cc de Waters) foi pré-condicionada com 1 mL de acetonitrila e em seguida com 1 mL de H3PO4 a 8,5% antes de ser carregada. As amostras foram acidificadas com volume igual de H3PO4 a 8,5% antes de serem carregadas. Depois da solução acidificada ter sido carreada no cartucho o leito foi lavado com 3 x 1 mL de água. A CPT liberada e o conjugado polimérico foram eluídos com 3 x 1 mL de uma mistura de soluções de acetonitrila e tampão de fosfato de 156 potássio (pH 4,1) (v/v 60/40). A solução eluída foi diluída até um volume total de 5 mL em um frasco volumétrico de 5 mL. 30 pL de cada solução foram injetados na HPLC. A área de pico da CPT na forma de lactona foi integrada e comparada a uma curva padrão. A libertação de CPT de HGGG6 e de HG6 em PBS contendo 4% de plasma humano (PBS/solução de plasma humano reconstituído -96/4 (v/v)), em plasma murino e em albumina humana reconstituída (solução em PBS) foram conduzidas de um modo análogo ao descrito acima para o plasma humano puro.
Em PBS (1 x, pH 7,4), as meias-vidas (ti/2) para a libertação de CPT de HG6 e HGGG6 forma de 59 h e 32 h, respectivamente. As meias-vidas caíram para 25 h e 22 h, respectivamente, na presença de plasma humano a 4% e para 1,7 h e 1,6 h, respectivamente em plasma humano a 100% ("HP") e para 2,6 h e 2,2 h respectivamente, em plasma murino a 100% ("MP"). As taxas de libertação de CPT tanto de HG6 como de HGGG6 na presença de albumina ("Alb") ou de acetil colinesterase ("Ac Co") forma da mesma ordem de magnitude como em PBS. Em uma solução tampão a um pH inferior ao de PBS (pH 6,1) com ou sem a enzima catepsina B (ativa a pH 6,1) menos de 50% do total de CPT conjugado foram liberados tanto de HG6 como de HGGG6 para tempos de até 144 h (Tabela 3). 157
Tabela 3. Meia vida (ti/2, em hora) da libertação de CPT de HG6 e de HGG6a
Conj ugado PBSb 4% HPC HPd MPe Albf Ac Chog Cath B pH 6, 1 h (pH tampao 6,1)1 HG6 59 25 1,7 2, 6 62 33 >144 >144 HGGG6 32 22 1,6 2,2 73 43 >144 >144 a 11/2 é definido como tempo (horas) para a libertação da metade do total de CPT conjugado.
Abreviaturas: HP significa plasma humano, MP significa plasma murino b Tampão PBS lx, pH 7,4. c Plasma humano reconstituído misturado com PBS (v/v = 4/96). d Plasma humano reconstituído e Plasma murino fresco f Em tampão de PBS com albumina humana reconstituída g Na presença de acetil colinesterase em solução em PBS (100 unidades/mL) h tampão de fosfato pH 6,1 (0,1M)
1 tampão de fosfato pH 6,1 na presença de Catepsina B
Libertação de CPT em Solução a pHs Diferentes. HGGG6 e HG6 foram preparados em solução tampão a 1 mg/mL com pHs variando de ácido (ph = 1,2) a básico (pH - 13,1) e incubados a 37°C durante 24 h. Uma alíguota de cada solução 158 foi diluída com 8,5% de H3PO4 até aproximadamente 100 μρ/ιηΐ,. 30 pL de tal solução foram injetados em HPLC. A área de pico da forma de lactona de CPT foi integrada e comparada a uma curva padrão. O pH da solução aquosa tem um efeito significativo sobre as taxas de libertação de CPT tanto de HG6 como de HGGG6. As quantidades de CPT liberadas de HG6 e HGGG6 a 37°C depois de 24 h em soluções tampão com pHs variando de 1,1 a 13,1 são ilustradas na Figura 6. As ligações glicinila-éster de CPT tanto em HG6 como em HGGG6 eram muito estáveis no pH ácido (1,1 a 6,4), uma vez que menos de 7% de CPT foram liberados em 24 h. IC50 por meio de Ensaio MTT. A linhagem de células A2780 de carcinoma ovariano humano foi obtida da European Collection of Cell Cultures (Salisbury, Wiltshire, Reino unido). As linhagens de células HT29 de adenocarcinoma colo-retal humano, PC-3 de carcinoma de próstata humano, e LS174T de adenocarcinoma colônico humano foram obtidas da American Type Cultures Collection (Rockville, MD) . As células foram semeadas em placas de 96 cavidades com 5000 células/cavidade e cultivadas em meio contendo soro fetal bovino a 10% a 37°C durante 24 h em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%. O meio foi substituído com meio fresco contendo CPT, 36e, HGGG6 ou HG6 a concentrações variando de 1 nM a 10 μΜ de CPT e 36e (CPT equivalente para HGGG6 e HG6) . A cada concentração foram tratadas três cavidades por placa. O efeito dos compostos sobre o crescimento celular foi medido por ensaio MTT depois de 72 h. O meio foi removido, as células foram enxaguadas com PBS, a solução de MTT foi adicionada a uma concentração de 0,5 mg/mL e as placas foram incubadas durante 4 h a 37 °C. O meio foi removido e os 159 cristais de formazan foram solubilizados em DMSO.A absorvên-cia foi medida a 560 nm empregando-se um leitor de polacas SPECTRAFluor Plus (Tecan, Durham, NC) . A porcentagem de sobrevivência das células foi calculada em relação a células sem tratamento, e os valores de IC50 foram determinados a partir de gráficos de dose por sobrevivência de células. Os dados de IC50 de CPT, 36e, HGGG6 ou HG6 estão relacionados na Tabela 4.
Tabela 4. IC50 de CPT, polímero 36e não conjugado e HG6 e HGGG6 conjugados a CPT em diversas linhagens de células
Linhagem de Células 36e (μΜ) CPT (μΜ) HG 6 (μΜ) HGGG6 (μΜ) LS174T >300 0,005 0,050 0,010 HT2 9 300 0,020 0,050 0,030 A27 8 0 100 0,007 0,025 0,020 PC3 >300 0,075 0,25 0,15
Exemplo de referência 29: Poli-CD-BisCys-Peg3400-Ala-CPT 37 36e (54 mg, 0,012 mmol da unidade repetida) foi dissolvido em DMSO seco (226 mL) e agitado durante 10 minutos. TFA-Ala-CPT que é preparado de modo análogo ao 11 (15 mg, 0,028 mmol, 2,36 eq.), DIEA (4,88 mL, 0,028 mmol, 2,36 eq.), DCC (24,52 mg, 0,12 mmol, 10 eq.) e NHS (13,6 mg, 0,12 mmol, 10 eq.) foram acrescentados à solução do polímero. A mistura foi agitada durante aproximadamente 16 horas. O polímero foi precipitado com éter (40 mL) e lavado com éter (2 x 30 mL) e com CH3CN (2 x 10 mL). Ele foi então redissolvido em solução aquosa a pH 4 (10 mL) e submetido a diálise a temperatura 160 ambiente durante 48 h empregando-se membrana de 25.000 MWCO. Fez-se então passar a solução através de um filtro esterilizado de 0,1 pm e liofilizou-se, obtendo-se 37 (46 mg, 85%) . A porcentagem em peso do carregamento do medicamento foi calculada como sendo de 5,5% empregando-se HPLC equipada com um detetor de fluorescência antes de se liberar de CPT de 37 usando-se uma base. CPT livre em 37 constituía < 1%.
Exemplo de referência 30:Poli-CD-BisCys-Peg3400-Leu-CPT 38 36e (54 mg, 0,012 mmol da unidade repetida) foi dissolvido em DMSO seco (226 mL) e agitado durante 10 minutos. TFA-Leu-CPT que é preparado de modo análogo a 11 (16 mg, 0,028 mmol, 2,36 eq.), DIEA (4,88 mL, 0,028 mmol, 2,36 eq.), DCC (24,52 mg, 0,12 mmol, 10 eq.) e NHS (13,6 mg, 0,12 mmol, 10 eq.) foram acrescentados à solução do polímero. A mistura foi agitada durante aproximadamente 16 horas. O polímero foi precipitado com éter (40 mL) e lavado com éter (2 x 30 mL) e com CH3CN (2 x 10 mL). ele foi então redissolvido em solução aquosa de pH 4 (10 mL) e submetido a diálise à temperatura ambiente durante 48 h, empregando-se membrana de 25.000 MWCO. Fez-se então passar a solução através de um filtro esterilizado de 0,1 pm e liofilizou-se obtendo-se 38 (42 mg, 78%). A porcentagem em peso do carregamento com medicamento foi calculada como sendo de 5,0% empregando-se HPLC equipada com um detetor de fluorescência depois da libertação de CPT de CPT empregando-se base. CPT livre em 38 era < 1%.
Exemplo de referência 31:Síntese de CD-BisCys-BisPeg-FITC 39 161
Esquema XXXX
39 4 (25 mg, 0,0186 mmol) e FITC-Peg5000-NHS (Shearwater, 186 mg, 0,0373 mmol) foram dissolvidos em DMSO seco (2 mL) . DIEA (,0094 mL, 0,056 mmol, 3 eq.) foi acrescentado à mistura. A mistura foi mantida no escuro e agitada durante 24 horas. Acrescentou-se então água (10 Ml) e a solução foi submetida a diálise no escuro empregando-se 10.000 MWCO durante aproxi-madamente 48 horas. Depois da liofilização obteve-se um polímero amarelo 39. O polímero foi caracterizado por EM e 1H NMRN. de Bis-succinimidil CD-Bis-Cys-SS-Peg3400 CPT 41
Exemplo de referência 32: Síntese succinato Peg3400 (Bis-SS-PEG) (40a) e biodegradável (40b)e o seu conjugado a 162
Esquema XXXXI J—\ ° °
DMAP I li O O
(tor^°V^OH ° l
Um frasco de fundo redondo de 100 mL equipado com uma barra de agitação magnética e um septo foi carregado com 10 g (2,99 mmol) de polietileno glicol peso molecular 3350, 2,0 g (20 mmol) de anidrido succinico e 50 mL de piridina anidra. Depois de se agitar a solução a 50°C durante 16 h, o solvente foi removido por evaporador rotativo. O resíduo foi redissolvido em 30 mL de água e extraído com 10 mL de clorofórmio três vezes. A fase orgânica foi secada sobre MgS04 e filtrada. O solvente foi então concentrado e precipitado fora em éter dietílico. Isto resultou em 9,6 g de bis-succinimidil Peg3400 com um rendimento de 90,6%. O produto foi analisado por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho em coluna de fase inversa.
Um frasco de fundo redondo de 100 mL equipado com uma barra magnética de agitação e um septo foi carregado com 2 g (0,56 mmol) de bis-succinimidil Peg 3400 e 10 mL de diclorometano anidro. A esta solução acrescentou-se 0,324 g (2,82 mmol) de 163 N-hidroxil succinimida. A mistura em solução foi então resfriada em um banho de gelo e acrescentou-se 0,58 g (2,82 mmol) de 1,3-diciclo-hexil-carbodimida. Depois de se deixar repousar à temperatura ambiente durante 24 horas, a solução foi filtrada e precipitada fora em 150 mL de éter dietilico. A dissolução em 10 mL de diclorometano e a precipitação em éter dietilico foi repetida duas vezes. Obteve-se assim 1,74 g (82,9%) de Bis-SS-PEG 40a. Ele foi analisado por Cromatografia Liquida de Alto Desempenho em coluna de fase inversa.
Polímero CD-BisCys-SS-Peg3400 40b
Um frasco em forma de pérola de 50 mL foi carregado com 100 mg (0,0746 mmol) de 4 e 254 mg 90,0746 mmol) de 40a. Os sólidos combinados foram secados a vácuo durante 24 horas antes da adição de 1 mL de DMSO anidro e 2,2 equivalente (0,164 mmol) de DIEA. A mistura em solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias, sendo então precipitada em éter dietilico. Obteve-se assim 100% de 40b. O peso molecular foi analisado em um sistema HPLC de Hitachi equipado com um detetor Anspec RI, um detetor DLS de
Precision Detectors e uma coluna Progel-TSK G3000PWxL empregando-se como eluente PBS a 0,1M a uma taxa de fluxo d 0,7 mL.min-1. Mw = 93.000, Mn = 61.0 00 e Mw/Mn = 1,5.
Conjugado CD-Bis-Cys-SS-pEG3400-GlyGlyGly-CPT 41 40b (201,8 mg, 0,044 mmol de unidade repetida), TFA-
GlyGlyGly-CPT 12 (66 m, 0,105 mmol, 2,36 eq.), EDC (25,5 mg, 0,133 mmol, 3 eq.) e NHS (11 mg, 0,0977 mmol, 2,2 eq.) foram dissolvidos em DMSO seco (6 mL) e agitados durante 30 minutos. Acrescentou-se DIEA (19 pL, 0,105 mmol, 2,36 eq.) à 164 solução do polímero. A mistura foi agitada durante aproximadamente 41 horas. 0 polímero foi extraído com éter dietílico (250 mL) e lavado com acetonitrila (3 x 25 mL) . Ele foi então redissolvido em água de pH 4 (10 mg/mL) e submetido a diálise à temperatura ambiente durante 24 horas empregando-se membrana de 10.000 MWCO. Fez-se então a solução passar através de um filtro esterilizado de 0,2 μιη, liofilizando então para se obter 41 (128 mg, 52%). A porcentagem em peso do carregamento de medicamento foi calculada como sendo 6, 95% empregando-se HPLC equipado com um detetor de fluorescência depois da libertação de CPT de 41 empregando-se uma base. A hidrólise de 41 foi ajustada em plasma humano (solução a 100%) a 1 mg/mL. As soluções de alíquotas (100 mL) foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5 mL e incubadas em banho de água a 37°C. Em seguida, as amostras foram acidificadas com 100 pL de H3PO4 a 8,5% e carregadas em cartucho de extração de fase sólida pré-condicionado. Ele foi eluido com tampão de acetonitrila: KH2PO4 a 60:40 (v/v) . CPT livre (em forma de lactona) foi analisado em HPLC/detetor de fluorescência empregando-se tampão de acetonitrila/KH2PC>4. A meia vida foi determinada como sendo de 3 h.
Degradação do Polímero CD-Bis-Cys-SS-Peg3400 40b 50 mg/mL de solução de 40b foram preparados em plasma humano reconstituído em solução de PBS (pH 7,4) . Alíquotas de 100 mL foram incubadas a 37°C. Cada tubo de amostra foi tirado em um ponto específico no tempo e extraído em 900 pL de metanol frio. A solução foi centrifugada e o sobrenadante foi analisado em um HPLC/detetor de ELS. O espectro resultante é mostrado na Figura 7. 165 Métodos para se aumentar a porcentagem de carregamento em peso do medicamento
Método I. Síntese do Copolímero CD-BisCys-Peg com uma ligação Peg curta e seu conjugado com GlyCPT
Exemplo 33: Síntese de CD-BisCys-Peg (PEG curto, Peg200-Peg2000, por exemplo) e o seu Conjugado com CPT 42
Esquema XXXXII
A síntese do conjugado de polímero e do medicamento 42 é igual a 36, 376 e 38 no Exemplo 28. Método II. Síntese do Copolímero CD-BisCys-Peg com uma multiplicidade de moléculas de medicamento em cada sítio de carregamento
Exemplo 34: Síntese de CD-BisCys-Peg e do seu Conjugado GluBis(GlyCPT) 43 166
Esquema XXXXIII
36 e Glu-Bis (Gly-CPT) 17 são dissolvidos em DMSO. EDC (3 eq.)/ NHS (2,2 eq.) e DIEA (2,2 eq.) são acrescentados à solução. CD-BisCys-Peg-GluBis(GlyCPT) 43 é precipitado com CH3CN e lavado como mesmo solvente até não ser detectado nenhum medicamento livre empregando-se UV ou TLC. 43 é secado sob alto vácuo.
Exemplo de referência 35: Síntese de conjugado PEI-CD-CPT 44 (Polímero de CD ramificado com conjugados com CPT) 167 A: Sintese do polímero ramificado PEI-ciclodextrina
Esquema XXXXIV
NH PEI (29 mg, Aldrich peso molecular 25.000) foi dissolvido em DMSO seco (2 mL) . Monotosilato de ciclodextrina (448 mg, Cyclodextrin Technologies Development, Inc.) foi acrescentado à solução sob N2. A solução turva ficou transparente depois da mistura ter sido agitada a 70°C durante aproximadamente hora. A solução ficou ligeiramente amarela depois de 48 horas a tal temperatura sob N2. A solução foi transferida a uma membrana Spectra/Por MWCO 10.000 e submetida a diálise contra água durante 4 dias. A água foi então removida por liofilização. Obteve-se um pó branco (120-140 mg) depois da solução ter sido liofilizada. A relação ciclodextrina/PEI foi calculada com base na integração de prótons de 1R NMR.
B: Sintese de conjugado ramificado PEI-CD-CPT 168
Esquema XXXXV
Nli NI]. M| U <> HN i Mil s s I1J4
EDC/NHS
IKJ
NI! MIL Nll
44
PEI-CVD e Suc-Gly-CPT 15 (1,0 eq.) são dissolvidos em DMSO. EDC (3 Eq.O, NHS (2,2 eq.)e DIEA (1 eq.) são acrescentados à solução. PEI-CD-Gly-CPT 4 é precipitado com éter, lavado exaustivamente com este solvente e secado a alto vácuo.
Exemplo 36: Síntese de Ad-PEG34oo~Ad 45
Esquema XXXXVI
O
0 0 o. II II / NU, + Γ N—O—C—CH.-CH,—O—PEG340—O—CH2-CH— C—O—'N \ W / O o
o o
H 11 II H -N-C—CH2-CH2—O-PEG3400—O—CH2~CH2—C—Ν Α 45 240 mg de 1-aminoadamantano (1,60 mmol, Aldrich) e 272 mg de PEG3400 (SPA) 2 (0,080 mmol, Shearwater Polymers) foram acrescentados a um frasco de vidro equipado com uma barra de 169 agitação. A isto acrescentaram-se 5 mL de diclorometano, agitando-se a solução de um dia para o outro. No dia seguinte, filtrou-se a solução para remover o produto secundário n-hidróxi-succinimida e removeu-se o diclorometano a vácuo. 0 resíduo foi dissolvido em água e centrifugado para remover o excesso de 1-aminoadamantano. 0 sobrenadante foi então submetido a diálise de um dia para o outro em Slide-A-Lyzer de Pierce com MWCO = 3500. A solução foi então liofilizada, obtendo-se 248 mg de um sólido pulverulento branco de Ad-PEG3400-Ad 45.
Exemplo de referência 37: Sintese de DiCiclodextrina PEG 46 362 mg de CD-NH2 (0,32 mmol, Cyclodextrin Technology, Inc.) e 436 mg de PEG3400 (SPA) 2 (0,128 mmol, Shearwater Polymers) foram acrescentados a um frasco de vidro equipado com uma barra de agitação. A este frasco foram acrescentados 4,36 mL de DMSO, e agitou-se a solução durante 72 horas. A solução foi submetida a diálise empregando-se membrana de 2000 MWCO durante 4 dias em água. 46 (603 mg, 86%) foi obtido em forma de um pó branco depois de liofilização.
Exemplo de referência 38: Síntese de Inclusão de polímero 47 empregando-se DIAD-Peg 45 e DiCD-PEG 46 46 (54, 6 mg, 0,01 mmol) e 45 (34 mg, 0,01 mmol) foram misturados em água (0,27 mL) e agitados de um dia para o outro. A solução é muito viscosa. O polímero 47 foi extraído com éter e secado a vácuo.
Exemplo de referência 39: Síntese de Inclusão do Conjugado de Polímero CPT 48 entre DiCD-PEG 46 e um composto CPT-Di-AD 170 reticulador Síntese do adamantil)etil)fosfato de diadamantano:
Bis- (2 (1- (Zhang et al., J.Am.Chem.Soc.1997, 119, 1676-1681)
Esquema XXXXVII
Piridina anidra (10 mL, Aldrich, Milwaukee, WI) foi resfriada em um banho de gelo e acrescentou-se dicloro-fosfato de metila (1,488 g, 10 mmmol, Aldrich, Milwaukee, WI) gota a gota. A mistura foi mantida fria durante outros 15 minutos. Durante este período formou-se um precipitado diclorofosfato de N-metilpiridínio. Acrescentou-se 1- adamantano etanol (4,758 g, 26,4 mmol, Aldrich, Milwaukee, WI), e a mistura lacrada foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Ela foi então vertia em uma solução de NaHCCb a 10% (50 mL) e fez-se evaporar a piridina a vácuo. O sólido ligeiramente amarelo foi dissolvido em 1 L de água e extraído com éter (três porções de 150 mL). A fase aquosa foi acidificada com HC1 a 2N até um pH de 1, sendo então extraída com três porções de 150 mL de CHCl3:n-BuOH (7:3). A fase orgânica combinada (éter e CHC13:n-BuOH) foi lavada com água e formou-se um precipitado ligeiramente amarelo nos solventes misturados, fazendo-se neste ponto evaporar os solventes a vácuo. Formou-se um sólido ligeiramente amarelo que foi recristalizado a partir de acetona/hexano. O sólido foi secado a vácuo, rendimento de 60%. 171
Esquema XXXXVIII
Fosfato de bis-(2(1-adamantil)etila) e 11 foram misturados em DMSO. Acrescentou-se EDC (3 eq.) , NHS (2,2 eq.), e DIEA (1 eq.) à solução. A solução foi agitada sob argônio durante 16 horas. Precipitou-se fosfato de bis-(2(1-adamantil)etila)-Gly-CPT com éter, lavou-se exaustivamente com este solvente e secou-se a grande vácuo. Este composto e Di-CD-PEG 46 são misturados em DMSO para formar o conjugado de inclusão polímero-CPT 48.
Exemplo de referência 40: Síntese de Foliato de AD-Peg 49 O procedimento abaixo é a síntese de Foliato de AD-Pegsooo· Este método pode ser adaptado para a síntese de qualquer moléculas de três componentes Molécula hóspede-Ligante-Ligante. 1. Síntese de AD-Peg-NH2 266 mg de FMOC-PEG50oo-NHS (78,2 pmol, Shearwater Polymers, Huntsville AL) foram acrescentados a um frasco de vidro equipado com uma barra de agitação magnética. Acrescentaram-se 10 eq. de 1-adamantano-metilamina (1,5 mmol, Aldrich) 172 dissolvido em 3 mL de diclorometano e a solução foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. 0 solvente foi removido a vácuo e acrescentou-se água à solução restante para dissolver o produto de PEG. A solução foi centrifugada a 20K rcf durante 10 minutos, quando a fase de adamantano-metilamina se separou em forma de um liquido mais denso. A porção aquosa foi coletada e a água removida a vácuo. O liquido viscoso restante foi redissolvido em piperidina a 20% em DMF para a desproteção de FMOC e agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente. O solvente foi removido a vácuo, lavado diversas vezes co DMF, redissolvido em água e passado por uma coluna de troca de ânions apara remover o PEG que não reagiu. As primeiras frações foram coletadas e liofilizadas, obtendo-se 222 mg de um pó pulverulento branco (rendimento de 76%) do produto desejado que foi confirmado por análise MALDI-TOF. 2. Síntese de Foliato de N-hidróxi-succinimida (NHS- foliato)
Esquema XXXXIX
NHS-foliato é sintetizado de acordo com o método de Lee e Low (Lee, R.J.; Low, P.S. J. Biol. Chem. 1994, 269, 3198-3204). Dissolve-se ácido fólico (5 g, 11,3 mmol; Sigma) em DMSO (100 mL) e trietilamina (2,5 mL) e faz-se reagir com, N-hidróxi-succinimida (2,6 g, 22,6 mmol) e diciclo-hexil- 173 carbodiimida (4,7 g, 22,7 mmol) de um dia para o outro à temperatura ambiente. A solução é filtrada e concentrada a pressão reduzida. Precipita-se o NHS-foliato empregando-se éter dietilico (precipitado amarelo-laranja) e lava-se 2-3 vezes em éter anidro, seca-se a vácuo e armazena-se a -20°C. 3. AD-Peg50oo~Foliato
Esquema L
AD-Peg5000-NH2 e NHS-foliato são misturados a 1:1 eq. em solução de DMSO. Acrescenta-se DIEA (2 eq.). Deixa-se a mistura se agitando à temperatura ambiente de um dia para o outro. A solução de DMSO é então submetida a diálise contra membrana de 35000 MWCO (Spectra/Por 7) durante 48 horas. Obtém-se AD-peg-5000-Foliato 49 depois de liofilização.
Exemplo de referência 41:Preparação do AD-Peg-Foliato e de um conjugado CD-Polímero-CPT
Um procedimento típico: Um conjugado CD-polímero CPT é dissolvido em um tampão D5W. Uma solução de D5W contendo 0,1-1 eq. (mols de unidade repetida)da solução de AD-Peg-Foliato é acrescentada à solução do polímero. Os tamanhos de partícula do polímero são medidos antes e depois da adição de AD-Peg-Foliato empregando-se dispersão de luz. Esta solução é usada ou em teste in vitro ou in vivo para a análise dos efeitos de alvejamento do foliato. 174
Exemplo de referência 42: Ligação por covalência de um ligante de alvejamento (foliato, por exemplo) a um conjugado de polímero de CD-CPT (tal como PEI-CD-GlyCPT) 50
Esquema LI
50 PEI-CD-GlyCPT 44 e Foliato-NHS (0,1-0,5 eq.) são misturados em DMSO e agitados durante 24 horas. O polímero é extraído com éter e lavado exaustivamente com este solvente até não poder ser detectada nenhuma molécula livre de foliato. O conjugado resultante de foliato de polímero de CD-CPT 50 é secada a vácuo.
Exemplo de referência 43: Reticulação do polímero de CD-CPT empregando-se Ad-Peg-Ad. 51
Um procedimento típico: Misturam-se AD-Peg-AD 45 (0,01-1 eq. de unidade repetidas de polímero de CD) e conjugado de polímero de CD com CPT em uma quantidade mínima de DMSO. A solução viscosa resultante é precipitada com éter e secada a 175 vácuo, obtendo-se um polímero ligeiramente reticulado 51. 51 deve ainda manter um tamanho de partícula pequeno em solução, ter boa hidrossolubilidade e ter peso molecular mais alto do que o conjugado de polímero de CD com CPT progenitor.
Exemplo 44: Testes in vivo de conjugados de polímero e camptotecina HGGG6, LGGG10, HG6 e HGGG10 (Sintetizados de acordo com o Exemplo 28) A. Toxicidade In vivo e Análise da Química do Sangue a partir de Dosagem com Polímero 36e Progenitor A toxicidade de 36e e os seus efeitos sobre a química do sangue foram avaliados em ratos nus Charles River fêmeas 913-14 semanas de idade). Quatro grupos de tratamento de seis ratos cada foram tratados com uma solução em D5W de 36e numa dose de 240 mg/kg, 160 mg/kg, 80 mg/kg ou D5W sozinho por injeção i.v. na veia da cauda nos Dias 1, 5 e 9, respectivamente. O volume da dosagem foi determinado com base em uma relação de 200 pL para um camundongo de 20 g e foi ajustado correspondendo ao peso corporal real dos ratos. Os pesos corporais dos ratos foram observados diariamente durante os primeiros 5 dias e em seguida duas vezes por semana. As amostras sanguíneas (150-200 pL) foram coletadas de cada camundongo por sangria retro-orbital sob isofluorano no Dia 12. As amostras provenientes de três ratos em cada grupo foram usadas para análises de contagem de sangue completa (CBC), ao passo que as amostras sanguíneas provenientes dos três ratos restantes em cada grupo eram processadas para análises de química do sangue. O estudo foi interrompido no Dia 23. Todos os ratos sofreram eutanásia por punção cardíaca sob CO2, e o sangue de cada camundongo 176 foi coletado para análise de CBC e de química do sangue do mesmo modo como no Dia 12. Não houve nenhuma diferença significativa em perda do peso corpora, CBC ou dados de química do sangue entre qualquer um dos grupos tratados por 36e e o grupo de controlo que recebeu D5W em todo o estudo, e nenhum efeito dependente de tempo foi observado durante os 23 dias para todos os grupos tratados. 36e foi bem tolerado por ratos com o tratamento à dose máxima (240 mg/kg).
B. Determinação da Dose Máxima Tolerável (MTD) para os conjugados de CDP-CPT A MTD foi determinada empregando-se ratos Charles River nus fêmeas (15-15 semanas de idade) para HG6, LGGG10, HGGG10.
Uma solução a 5% (peso/volume) de dextrose (D5W) dos conjugados de polímero-CPT foi preparada de fresco antes de cada injeção. Doses para os grupos de tratamento variavam de 2,25 mg de CPT/kg a 54 mg de CPT/kg. A dosagem foi administrada por via intravenosa (i.v.) por injeção na veia da cauda nos Dias 1, 5 e 9. O volume de dosagem foi determinado com base em uma relação de 200 pL para um camundongo de 2 0 g e foi ajustada de acordo com o peso corporal real (BW) dos ratos. Três a cinco ratos foram usados em cada grupo de tratamento. Os pesos corporais dos ratos foram acompanhados diariamente durante os primeiros 5 dias e em seguida duas vezes por semana. A MTD foi definida como a dose mais alta administrada que resultasse em uma redução do peso corporal médio do grupo de menos de 20% ou a dose mais alta administrada que não resultasse na morte de qualquer animal naquele grupo. A perda máxima de peso corporal médio e as mortes relacionadas com o tratamento 177 para todos os grupos tratados estão relacionadas na Tabela 5.
Tabela 5.Resposta a tratamento para o estudo de MTD. Ratos nus (n = 3-6) foram tratados por via i.v. por meio de injeção na veia da cauda
Agente mg/Kga Perda máxima em % do peso corporal; Diab ntr/nc D5W - -2,5%; Dia 3 0/6 3 6e 240 -2,0%; Dia 3 0/6 3 6e 160 -3,5%; Dia 13 0/6 3 6e 80 -2,35%; Dia 3 0/6 LGGG10 54 -20,6%; Dia 3 3/3 LGGG10 36 -9,3%; Dia 13 0/3 LGGG10 18 0 0/3 LGGG10 9 0 0/5 LGGG10 4,5 -0,8%; Dia 13 0/5 HG6 54 -28,5%; Dia 3 3/3 HG6 36 -23,9%; Dia 3 3/3 HG6 18 -22,1%; Dia 3 3/3 HG6 9 -6,1%; Dia 9 0/5 HG6 4,5 -4,4%/ Dia 5 0/5 HG6 2,25 -2,9%; Dia 9 0/5 HGGG10 54 — 3/3 178 HGGG10 36 -34%; Dia 5 3/3 HGGG10 18 -16%; Dia 3 1/3 HGGG10 9 -3,3%; Dia 9 0/5 HGGG10 4,5 -2,5%; Dia 9 0/5 a Mg de CDP/kg para o polímero de CDP e mg de CPT/kg para os três conjugados testados. b Perda máxima de peso corporal (BW) observada após inj eção 0 Número de mortes relacionadas com tratamento (NTR) para o número de ratos tratados (N) A MTD de LGGG10, HG6 e HGGG10 foram determinadas como sendo 36 mg de CPT/kg, 9 mg de CPT/kg e 9 mg de CPT/kg, respectivamente. Com base nas similaridades estruturais entre HGGG6 e HGGG10 espera-se que a MTD para estes dois grupos seja similar. Portanto, a MTD de HGGG6 (não testado) foi presumida como sendo de 9 mg de CPT/kg. C. Estudo de Eficácia Antitumoral O estudo de eficácia antitumoral foi conduzida empregando-se ratos Charles River nus fêmeas (15-16 semanas de idade). Um fragmento (1 mm3) de tecido de carci-noma de cólon humano LS174T foi implantado subcutaneamente (s.c.) no flanco direito de cada camundongo de teste aproximadamente 14-18 dias antes da dosagem. 0 volume tumoral foi determinado medindo-se o tumor em duas dimensões com calipes e calculado empregando-se a fórmula: volume do tumor = (comprimento x largura2)/2. 0 volume do tumor foi convertido em peso do tumor presumindo-se que 1 mm3 seja igual a 1 mg de tumor em 179 peso. 0 tratamento foi iniciado quando o tamanho do tumor médio atingia aproximadamente 60-100 mg (Dia 1). Os animais foram distribuidos em doze grupos. Cada grupo consistia em sete ratos com tamanhos de tumor que variavam de 62,5-144,0 mg com tamanhos médios de tumor no grupo de 88,6-90,7 mg. Os ratos em cada grupo foram tratados de acordo com o protocolo relacionado na Tabela 6. Todos os tratamentos com conjugados foram administrados por via intravenosa por injeção na veia da cauda. Os tamanhos de tumores foram medidos duas vezes por semana durante todo o decorrer do experimento. NO fim do estudo, os tumores provenientes de cada camundongo eutanasiado foi coletado e resfriado a -80°C.
Tabela 6. Protocolo de dosagem para o estudo de eficácia3
Grupo Agente Dose (mg CPT/kg)b Viac Programad 1 D5W - i. v. Q4D x 3 2 CPT 9 i.p. Q4D x 2e 3 Irinotecan 100f i.p. Qwk x 3 4 HGGG6 9 i. V . Q4D x 3 5 HGGG6 4,5 i. V . Q4D x 3 6 LGGG10 36 i. V . Q4D x 3 7 LGGG10 18 i. V . Q4D x 3 8 LGGG10 9 i. V . Q4D x 3 9 HG 6 9 i. V . Q4D x 3 10 HG 6 4,5 i . V . Q4D x 3 180 11 HGGG10 9 i.v. Q4D x 3 12 HGGG10 4,5 i.v. Q4D x 3 a Sete ratos foram usados em cada grupo b Doses são equivalentes de CPT exceto o grupo 3 0 i.p. = intraperitoneal, i.v. = intravenosa d Programas de administração foram abreviados como Q4D x 3 três injeções com intervalos de quatro dias,
Qwk x 3 = três injeções com intervalo de uma semana, a primeira dose foi iniciada no dia 1 para todos os grupos e A terceira dose programada não foi dada devido à toxicidade emergente f 100 mg de irinotecan/kg
Cada animal foi eutanasiado quando o peso tumoral atingiu o tamanho final predeterminado (1.500 mg). O ponto final no tempo (TTE) para cada camundongo foi calculado a partir da equação: TTE = (log(ponto final-b))m, sendo que bem são a interseção e a inclinação, respectivamente, da linha obtida pela regressão linear de um conjunto de dados de crescimento tumoral transformado por log constituído da primeira observação que excedeu o volume final do estudo e das três observações consecutivas que imediatamente precederam o volume final. Os animais que não atingiram o ponto final receberam um valor TTE igual ao último dia do estudo (114 dias) . Os animais classificados como tendo mortes relacionadas com tratamento (TR)tiveram atribuído um valor de TTE igual ao do dia da morte. Os animais classificados como tendo morte não relacionada com tratamento (NTR) são excluídos dos cálculos de TTE. O retardamento do crescimento tumoral (TGD) definido como o aumento no tempo médio até o ponto final (TTE) em um grupo de tratamento comparado com o 181 grupo de controlo, foi um parâmetro investigado para se avaliar a eficácia do tratamento. TGD é calculado como a diferença entre o TTE médio para um grupo de tratamento e o TTE médio do grupo de controlo (TGD = T - C) e é expresso em dias, e em forma de uma porcentagem do TTE médio do grupo de controlo; % de TGD = (T - C)/C em que T é igual ao TTE médio para um grupo de tratamento e C é igual ao TTE para o controlo, Grupo 1.
Toxicidade. Os animais foram pesados diariamente nos Dias 1-5, em seguida duas vezes por semana. Os ratos foram examinados frequentemente para sinais claros de qualquer efeito colateral adverso relacionado com o medicamento. A toxicidade aceitável para medicamentos contra câncer em ratos é definida pela NCI como uma perda média de peso corporal no grupo inferior a 20% durante o estudo e não mais de uma morte tóxica dentre sete animais tratados.
Os resultados para este estudo de eficácia que inclui valores TTE médios, carga tumoral média no dia 114, resposta a tratamento e morte estão resumidos na Tabela 7.
Tabela 7
Grup 0 TTE Médio a T-Cb o o TGD0 Carga Tumoral Médio em mg (Nsd) NtrVNntr f /Neu5 P vs D5Wh P vs CPT1 1 34, 9 - - -(0) 0/1/6 - - 2 51,4 \—1 LO 47% - (0) 2/0/5 0,212 8 - 182 3 68,7 33, 8 97% 1152 (3) 0/0/4 0,000 2 0, 025 3 4 114, 0 79, 1 227 o 0 256 (5) 1/0/1 0,004 0 0,011 5 5 65, 6 30, 7 88% 566 (2) 0/1/4 0,004 6 0,136 9 6 100,0 65, 1 187 o 0 666 (3) 4/0/0 0,027 2 0,028 9 7 75, 6 40, 7 117 o. Ό 221 (3) 0/0/4 0,001 8 0,060 1 8 63,2 28, 3 81% 700 (1) 1/0/5 0,000 6 0,106 4 9 114, 0 79, 1 227 O 0 394 (4) 0/0/3 0,000 2 0,002 8 10 74,2 39, 3 113 o "O 668 (2) 1/1/3 0,001 6 0,067 3 11 114,0 79, 1 227 0, "O 500 (5) 1/0/1 0,004 0 0,005 0 12 78,0 43, 1 123 o "O 1010 (2) 0/0/6 0,000 6 0,039 2 a TTE = Tempo (Dias) até o ponto final (1500 mg) b T-C = Diferença entre TTE (Dias) de grupo ratado contra o grupo de controlo 0 % de TGD = [ (T-C)/C] d Ratos sobreviventes e Ntr = Número de mortes relacionadas com tratamento f Nntr = Número de mortes não relacionadas com tratamento 183
Neu = Número de ratos eutanasiados depois de atingido o ponto final h Valor de P em relação ao grupo de tratamento com D5W (Grupo 1) 1 Valor de P em relação ao grupo de tratamento com CPT (Grupo 2) g
Uma morte NTR foi observada no dia 72 nos animais de controlo tratados com D5W. Os tumores nos demais seis ratos de controlo cresceu até o tamanho de ponto final de 1500 mg, resultando em um TTE médio de 34,9 dias (Tabela 7)
Duas mortes relacionadas com tratamento foram relatadas no Dia 9 para CPT a 9 mg/]kg. Deste modo CPT deve ser considerado como sendo tóxico a esta dose neste experimento. O TTE médio para este grupo foi de 51,4 dias, correspondendo a uma T-C de 16,5 dias e um TGD de 47%, em relação aos ratos de controlo sem tratamento (não significativo). Nenhum animal no Grupo 2 sobreviveu ao dia 114. O Grupo 3 recebeu irinotecan i.p. a 100 mg/kg (Qwk x 3) . O TTE médio para o Grupo 3 foi de 68,7 dias, correspondendo a uma T-C significativa de 33,8 dias e um TGD de 97%, em relação aos ratos de controlo (P < 0,01) . Três animais sobreviveram ao Dia 114 com uma carga tumoral média de 1.152 mg. Nenhuma regressão foi registrada.
Os Grupos 4 e 5 receberam HGGG6 i.v. Q4D x3a9e4,5mgde CPT/kg, respectivamente. Uma morte relacionada com tratamento foi observada no Dia 16 no Grupo 4, e uma morte NTR foi registrada no dia 37 no Grupo 5. O TTE médio para o Grupo 4 foi de 114 dias, valor máximo possivel neste estudo. 184
Este valor TTE corresponde a uma T-C significativa de 79,1 dias e um TGD de 227%, em relação ao controlo (P<0,01). Os tumores em cinco ratos do Grupo 4 não atingiram o ponto final de 1.500 mg. Estes cinco ratos tinham uma carga tumoral média de 256 mg no Dia 114. O TTE médio para o Grupo 5 foi de 65,6 dias, e corresponde a uma T-C significativa de 30,7 dias e um TGD de 88% em relação ao controlo (P<0,01).
Os Grupos 6-8 foram tratados com LGGG10 i.v. Q4D x 3 a 36, 18 e 9 mg de CPT/kg, respectivamente. Embora não tivesse sido observada nenhuma morte no estudo de MTD empregando-se este conjugado em ratos não portadores de tumores as 36 mg de CPT/kg (Tabela 5), quatro mortes relacionadas com tratamento foram registradas no Grupo 6 quando os ratos portadores de tumores receberam esta dose, dois no Dia 16 e um cada nos Dias 75 e 100. Estes resultados indicam que 36 mg de CPT/kg é provavelmente acima de MTD de LGGG10. Conforme se vê na Tabela 5, nenhuma perda significativa de peso corporal foi registrada no estudo de MTD quando os ratos receberam doses de 18 mg de CPT/kg, indicando que esta dose está abaixo de MTD. Portanto, a MTD de LGGG10 se encontra em algum ponto entre 18 e 36 mg de CPT/kg. O TTE médio para o Grupo 7 (18 mg de CPT/kg) foi de 75,6 dias.
Este valor de TTE corresponde uma T-C significativa de 40,7 dias e um TGD de 117%, em relação aos ratos de controlo
(P<0,01). Três ratos neste grupo tinham uma carga tumoral média de 221 mg no Dia 114. Uma morte TR tardia foi registrada no Dia 103 no Grupo 8 (9 mg de CPT/kg) . 0 TTE médio para o grupo 8 foi de 63,2 dias. Este valor de TTE corresponde a uma T-C significativa de 28,3 dias e um TGD de 81%, em relação aos ratos de controlo sem tratamento (P<0,01) . O camundongo restante neste grupo tinha uma carga tumoral de 700 mg no Dia 114. 185
Os Grupos 9 e 10 receberam HG6 i.v. Q4D x 3 a 9 e 4,5 mg de CPT/kg, respectivamente. Uma morte TR e uma morte NTR foram registradas no Grupo 10 nos Dias 47 e 84 respectivamente. O TTE médio para o Grupo 9 foi o máximo, 114 dias. Este valor TTE corresponde a uma T-C significativa de 79,1 dias e um TGD de 227%, em relação aos ratos de controlo sem tratamento (P<0,01). Quatro ratos no Grupo 9 tinham uma carga tumoral média de 394 mg no Dia 114. O TTE médio para o Grupo 10 foi de 74,2 dias. Este valor de TTE corresponde uma T-C significativa de 39,3 dias e um TGD de 113%, em relação aos ratos de controlo (P<0,01) . Os dois ratos restantes no Grupo 10 tinham uma carga tumoral média de 668 mg no Dia 114.
Os grupos 11 e 12 receberam HGGG10 i.v. Q4D x 3 a 9 e 4,5 mg de CPT/kg, respectivamente. Uma morte relacionada com tratamento foi registrada no Dia 16 no Grupo 11. O TTE médio para os Grupos 11 e 12 foi de 114 dias e 78 dias, respectivamente. 0 valor de TTE para o Grupo 11 corresponde a uma T-C significativa de 79,1 dias e a um TGD de 227%, em relação aos ratos de controlo (P<0,01). Os tumores em cinco ratos no Grupo 11 não atingiram o ponto final; estes cinco ratos tinham uma carga tumoral média de 500 mg no Dia 114. O valor TTE do Grupo 12 corresponde a uma T-C significativa de 43,1 dias e um TGD de 123%, em relação aos ratos de controlo (P <0,01). Os dois ratos restantes neste grupo tinham uma carga tumoral média de 1,010 mg no Dia 114. A curva de crescimento tumoral como uma função de tempo para D5W, CPT, irinotecan, LGGG10 na sua dose não tóxica mais alta estada (18 mg de CPT/kg) e os outros três conjugados com polimero de alto peso molecular (HGG6, HG6, HGGG10) nas suas MTDs são apresentados na Figura 8. Os três conjugados 186 de alto peso molecular administrados às suas MTDs apresentaram uma inibição do crescimento tumoral mais prolongada comparados a D5W, CPT e irinotecan. As curvas do crescimento tumoral médio para HGG6, HG6 e HGGG10 que são ilustradas na Figura 9 mostram que há uma resposta a dose distinta para todos estes três polímeros quando recebem doses às suas MTDs e á metade de suas MTDs. As curvas de crescimento tumoral médio para LGG10 e HGG1, cada um recebendo 9 mg de CPT/kg conforme ilustrado na Figura 10, demonstram que o conjugado polímero de alto peso molecular medicamento tem um efeito antitumoral maior quando comparadas aos conjugados de baixo peso molecular, presume-se que devido ao seu acúmulo intensificado (efeito EPR) e a uma eliminação renal reduzida.
Perda de Peso Corporal Médio de Ratos. As perdas de peso corporal médio (MBW) como uma função do tempo são lançadas para D5W,, CPT, irinotecan e para os três conjugados contendo polímero de alto peso molecular às suas MTDs (Figura 11). As perdas máximas de MBW observadas no Grupo 2 (CPT) e os dois conjugados com o ligante triglicina administrados às suas MTDs (Grupos 4 e 11) eram de 13,1%, 18,3% e 12,6%, respectivamente. A perda máxima de MBW de HG6 (3,4%), o único conjugado com um ligante de glicina, foi análoga à perda máxima de MBW registrada para irinotecan (5,0%). Perdas máximas desprezíveis de peso corporal médio em grupo foram registradas em todos os outros grupos de tratamento e no grupo D5W. O peso corporal médio voltou aos níveis de linha de base para todos os grupos de tratamento depois da interrupção da terapia. 187 D. Correlação entre o tamanho do tumor do camundongo eutanasiado e a concentração de CPT no tumor correspondente
Cada tumor coletado de ratos no término do estudo de ratos com xeno-enxerto de LS174t foi descongelado e colocado em um tubo de lise de 2 mL (Lysing Matrix D, Qbiogen) . 300 pL de reagente de lise (Cellytic-MT Lise de Tecido de
Mamifero/Reagente de extração) foi acrescentado a cada tubo. 0 tecido foi homogeneizado em um homogeneizador FastPrep FP12 (Qbiogen) a 5 m/s durante 40 seg. A homogeneização foi repetida seis vezes com um intervalo de 10 min. entre as homogeneizações sucessivas. A solução homogeneizada foi centrifugada a 14000 g durante 15 min. a 10°C. 90 pL da solução foi retirada com seringa sendo a ela acrescentados 10 pL de NaOH a IN. Uma alíquota de 500 pL de MeOH à esta solução depois de se permitir que a solução homogeneizada repousasse durante 2 h à temperatura ambiente;. A solução foi centrifugada durante 15 minutos a 14.000 g. O sobrenadante (270 pL) foi misturada com 30 pL de HC1 a IN e injetada em uma HPLC para análise. A correlação da concentração de CPT (ng/mg de tecido) como tamanho do tumor (em mg) é ilustrada na figura 12. A concentração de CPT foi correlacionada inversamente com o tamanho do tumor.
Exemplo de referência 45: Síntese de Poli(CDDC-PEG)-Amfotericina B 52 por meio de ligante amida
Esquema LII
52
Poli(CDDC-PEG) (788 mg) e 1,1'-carbonil diimidazol (CDI, 1,45 g, 50 eq.) foram agitados em DMSO anidro (10 mL) na presença de DMAP (429 mg, 20 eq.) durante 16 horas. Acrescentou-se éter 9200 mL) à mistura para precipitar poli(CDDC-PEG)-carbonil-imidazol. O sólido amarelo resultante foi lavado com éter 2 x 200ml e secada a vácuo. O sólido foi dissolvido em DMSO anidro (15 mL) , acrescentando-se em seguida AmB (332 mg, 2 eq.)e DMAP (43,0 mg, 2 eq.) . A solução foi agitada no escuro durante 48 horas e submetida a diálise em água empregando-se uma membrana MWCO 25000 durante 3 dias. A solução foi então filtrada empregando-se um filtro de 0,2 μιη e liofilizada. Um sólido amarelo (920 mg) 52 foi obtido. A% em peso de AmB é de aproximadamente 13%.
Exemplo de referência 46: Síntese de Poli(CDDC-PEG)-
Amfotericina B 53 por meio de ligante imina
BlnfeC-7-ΜΡ
189 3 e PEG-DiSPA (relação 1:1) foram secados a vácuo a temperatura ambiente. Acrescentou-se DMSO (10 mg de 3/mL DMSO) ao sólido e em seguida acrescentou-se DIEA (2 eq.) à mistura. O polimero foi extraído com éter em excesso 5 dias mais tarde e submetido a diálise empregando-se uma membrana MWCO 25000 durante 48 horas. O rendimento de poli(CDDC-PEG) é de 80-95%. O peso molecular do polímero foi determinado empregando-se GPC para ser de 70-100 kDa.
Poli(CDDC-PEG) (1,124 g, 0,25 mmol) foi dissolvido em água (55 mL) , NaI04 (0,264 , 5 eq.) foi acrescentado. A solução foi agitada no escuro à temperatura ambiente durante 20 minutos e armazenada a 4°C durante 24 horas no escuro. Acrescentou-se uma solução de BaCl2 (5,05 eq.) à solução resultando na imediata precipitação de Ba(I04)2.0 precipitado foi filtrado. Acrescentou-se uma solução saturada de Na2C03 para se ajustar o pH para 11. Acrescentou-se então anfotericina B (343 mg, 1,5 eq.) à solução e agitou-se à temperatura ambiente no escuro durante 48 horas. O pH da solução foi mantido em 11 acrescentando-se NaOH (0,1N) durante toda a reação. A solução foi submetida a diálise a 4°C durante 48 horas empregando-se MWCO 25000 e liofilizada, obtendo-se 1,03 g de conjugado de polímero-AmB 53 em forma de um pó amarelo. A% em peso de AmB é determinada como sendo 18 empregando-se um espectrômetro de UV a 405 nm. D. Referências
Outros polímeros contendo ciclodextrina que podem ser modificados de acordo com as instruções da presente invenção, assim como métodos de preparação de tais polímeros, são descritos nos pedidos de patentes U.S. 190
09/203.556, (publicados 7166302 e US 09/339.818, 09/43.707, 10/021 como US 6509323, US 7091192 7018609, respectivamente).
294 e 10/021.312 US 7375096, US 191

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para produzir uma ciclodextrina contendo polímero linear, o processo compreendendo a reacção de um polímero formado a unidade de repetição de fórmula geral B:
    em que representa um radical de ciclodextrina; e /m representa um polietileno glicol; com um composto de Fórmula C:
    (c); 1 em que o polímero formado da unidade de repetição com a Fórmula B e o composto de Fórmula C se fazem reagir, na presença de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS).
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o radical de ciclodextrina é um radical β-ciclodextrina.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o processo compreende ainda a formação de uma preparação farmacêutica compreendendo o polímero contendo ciclodextrina linear.
  4. 4. Polímero linear contendo ciclodextrina obtido pelo processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  5. 5. Preparação farmacêutica compreendendo o polímero da reivindicação 4, ou um éster farmaceuticamente aceitável, um seu sal ou hidrato, e um excipiente farmacêutico.
  6. 6. Polímero da reivindicação 4, para utilização como uma substância terapêutica.
  7. 7. Polímero formado a unidade de repetição de fórmula geral B:
    2 em que
    representa um radical de ciclodextrina; e /m representa um polietileno-glicol.
  8. 8. Polímero de acordo com a reivindicação 7, em que o radical de ciclodextrina é um radical de β-ciclodextrina.
  9. 9. Processo para a produção do polímero D da reivindicação 7, em que o processo compreende a reação de um composto de Fórmula D: H2N
    NH2 HO O O^OH (D) em que representa um radical de ciclodextrina; com um composto de Fórmula E: 3 ο ο.
    ο ο (ε) em que
    representa um polietileno-glicol; em que o composto de Fórmula D e o composto de Fórmula E são feitos reagir na presença de dimetil sulfóxido (DMSO) e diisopropiletilamina (DIEA).
  10. 10. Composto de Fórmula D:
    em que
    representa um radical de ciclodextrina.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 10, em que o radical de ciclodextrina é um radical de β-ciclodextrina. 4
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